Novel procedures of viral quantification: development, optimization and validation of ex vivo and in vivo techniques

TESE DE DOUTORAMENTO
NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION:
DEVELOPMENT, OPTIMIZATION AND VALIDATION OF
EX
VIVO
AND
IN VIVO
TECHNIQUES
Diego Vázquez Rod íguez
ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL
PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN CIENCIAS CIENCIAS MARIÑAS,
TECNOLOXÍA E XESTIÓN
SANTIAGO DE COMPOSTELA
ANO 2019
DECLARACIÓN
DO AUTOR DA TESE
NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION:
DEVELOPMENT, OPTIMIZATION AND VALIDATION OF
EX VIVO
AND
IN VIVO
TECHNIQUES
D.
Diego Vázquez Rod íguez
P esen o a miña ese, seguindo o p ocedemen o axei ado ao Regulamen o, e decla o que:
1) A ese aba ca os esul ados da elabo ación do meu aballo.
2) De selo caso, na ese aise e e encia ás colabo acións que i o es e aballo.
3) A ese é a e sión de ini i a p esen ada pa a a súa de ensa e coincide coa e sión
en iada en o ma o elec ónico.
4) Con i mo que a ese non inco e en ningún ipo de plaxio dou os au o es nin de
aballos p esen ados po min pa a a ob ención dou os í ulos.
En San iago de Compos ela, 23 de Se emb o de 2019
Asdo
AUTORIZACIÓN
DO
DIRECTOR
/
TITOR DA TESE
NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION OF
EX VIVO
AND
IN VIVO
TECHNIQUES
D. Ca los Pe ei a do Pazo
INFORMA:
Que a p esen e ese, co espóndese co aballo ealizado po D. Diego Vázquez Rod íguez, baixo a miña
di ección, e a
u o izo
a súa
p esen ación, conside ando
que eúne os
equisi os
esixidos no R
egulamen o
de Es udos de
Dou o amen o da USC,
e
que
como di ec o des a
non inco e nas causas de
abs ención es ablecidas
na Lei 40/2015.
De aco do co a igo 41 do Regulamen o de Es udos de Dou o amen o, decla a amén que a p esen e ese de
dou o amen o é idónea pa a se de endida en base á modalidade de COMPENDIO DE PUBLICACIÓNS
, nos
que a pa icipación do/a dou o ando/a oi decisi a pa a a súa elabo ación.
A u ilización des es a igos nes a memo ia, es á en coñecemen o dos coau o es, an o dou o es
como non dou o es. Ademais, es es úl imos eñen coñecemen o de que ningún dos aballos aquí
eunidos pode á se p esen ado en ningunha ou a ese de dou o amen o.
En San iago de Compos ela, 23 de Se emb o de 2019
Asdo

COMPETING INTERESTS
The PhD s uden decla e ha he has no compe ing in e es s in ela ion wi h he
hesis p esen ed.
Ag adecimien os
En es e apa ado quie o ag adece a odos los que en mayo o en
meno medida me han ayudado en es e iaje.
Du an e odo es e iempo, mi amilia ha jugado un papel c ucial, ya
que, aunque no son coau o es de ningún a ículo, sin ellos no hab ía llegado
has a el inal, po eso quie o ag adece a mis pad es y he mano su apoyo
incondicional y po c ee en mí siemp e.
A mis dos amo es, Mónica y Leo, po se la uen e de ene gía que me
le an a cada día, llena de elicidad cada minu o de mi iempo y po apoya me
en es e la go camino. Sin oso os no lo hubiese log ado.
A mis pad inos Consuelo, Al onso y Begoña, po su cons an e ayuda,
ca iño y ameniza me los iajes a San iago ;)
A mi di ec o Ca los P. Dopazo que, g acias a la opo unidad o ecida
hace ya unos cuan os años, pude inicia es a esis doc o al. Po ello, y po habe
apoyado es a esis has a el inal, quie o ap o echa es as líneas pa a ag adece le
el iempo dedicado a es e p oyec o.
A Juan M. Cu ín po habe sido un g an apoyo en mis inicios,
o eciéndome siemp e con una son isa, su ayuda y buen consejo. A Jose G.
Ol ei a y Ca men López-Vazquez po compa i conmigo ho as de abajo y
ayuda me con mis “ us aciones” en el labo a o io. A Ma ia, Sand a, Noelia y
Alián, po habe o ecido su iempo y es ue zo de mane a desin e esada, y po
an os y buenos a os en e “PCR” y “PCR”.

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Chap e 1
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In oduc ion and Objec i es o his Thesis
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Diego Vázquez Rod íguez
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1 INTRODUCTION
The wo ldwide de elopmen o aquacul u e in he las decades is
unques ionable. In 2016, he wo ld aquacul u e p oduc ion eached 80 million
ons, wi h an es ima ed i s -sale alue o US$232 billion, consis ing o
54.1 million ons o in ish (US$138.5 billion), 17.1 million ons o molluscs
(US$29.2 billion), 7.9 million ones o c us aceans (US$57.1 billion), and 938500
ones o o he aqua ic animals such as u les, sea cucumbe s, sea u chins, ogs
and edible jelly ish (US$6.8 billion) (FAO, 2018). This si ua ion has been
p omo ed by he in ensi ica ion o he cul u e p ocesses.
Howe e , he in ensi e ish and shell ish p oduc ion is h ea ened by
epidemic ou b eaks a ec ing no only he “domes ic” popula ions bu also he
wild s ocks (Tompkins e al., 2015). Among he di e en pa hologies a ec ing
ish aquacul u e, i al diseases ha e one o he highes economic impac s due o
hei i ulence, apid dispe sion and absence o ea men and e ec i e accines,
wha makes hei comple e e adica ion di icul . The e o e, esea ch is ocused
no only o he de elopmen o p ophylac ic p o ocols and he design o new
and mo e e icien accines, bu also o he imp o emen o diagnos ic
p ocedu es o he apid con ol o ou b eaks. Addi ionally, an inc easing e o
is being applied on heal h su eillances o cul u ed and wild ish popula ions,
which has led o he disco e y o se e al i uses which we e no known o
scien is s; some o hem a e endemic among na i e popula ions and
oppo unis ically spill-o e o in ec ish in aquacul u e acili ies (Walke and
Win on, 2010). In addi ion, hey ha e also p o ided impo an in o ma ion on
he dis ibu ion and i ulence o o he p e iously known i uses.
Fo he p esen s udy, ocused on he de elopmen , op imiza ion and
alida ion o i al quan i ica ion p ocedu es, any o hose i uses could ha e
been chosen o be used as a model. Why was he in ec ious panc ea ic nec osis
i us (IPNV) chosen among all? The same gap ega ding he gene al aim o his
s udy a ec s o all ish i uses in he li e a u e, bu o IPNV lowe biosa e y
es ic ions, oge he wi h he high a ailabili y and di e si y o s ains, make his
pa hogen a g ea candida e o hese ypes o s udies.
Chap e 1
In oduc ion and Objec i es
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21!
2 OBJECTIVES OF THE PRESENT STUDY
The pu pose o he p esen s udy was he e alua ion, design and alida ion
o di e en echniques o i us quan i ica ion, using he in ec ious nec osis
panc ea ic i us (IPNV) as a gene al model. The inal goal o he s udy was, in
la e s age, he ans e ence o he echnology alida ed o he s anda d ope a o
p ocedu es o he Aquacul u e ins i u e om he Uni e sidad de San iago de
Compos ela.
F om his gene al objec i e he sub-goals we e:
• The analysis o cu en me hodologies a ailable and e ision o he
li e a u e o iden i y oppo uni ies o imp o emen in he cu en p ocesses o
he labo a o y.
• The design, op imiza ion and alida ion o qPCR o de ec ion and
quan i ica ion o he In ec ious Panc ea ic Nec osis Vi us
• To de elop and alida e a p o ocol o quan i ica ion o i al p o eins
exp essed in salmon cell lines using luo escence ac i a ed cell so ing.
• The design, op imiza ion and alida ion o i us i a ion using mic o
low cy ome y.
Diego Vázquez Rod íguez
22!
3 REFERENCES
FAO, 2018. The S a e o Wo ld Fishe ies and Aquacul u e 2018 - Mee ing he
sus ainable de elopmen goals, ao.o g. Rome.
Tompkins, D.M., Ca e , S., Jones, M.E., K košek, M., Ske a , L.F., 2015.
Eme ging in ec ious diseases o wildli e: a c i ical pe spec i e. T ends
Pa asi ol. 31, 149–159. h ps://doi.o g/10.1016/j.p .2015.01.007
Walke , P.J., Win on, J.R., 2010. Eme ging i al diseases o ish and sh imp.
Ve . Res. 41, 51. h ps://doi.o g/10.1051/ e es/2010022
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Chap e 2
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Vi us Quan i ica ion: A Gene al Re iew
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Diego Vázquez Rod íguez
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1 THE IMPORTANCE OF VIRUS
QUANTIFICATION
In mos i ology s udies, one o he c i ical in o ma ion is he concen a ion
o o al o in ec ious pa icles in a sample. Hence, i is c ucial o know he
eplica ion cycle o a i us o s udy he le el o i ulence o new isola es, o assess
he an i i al ac i i y o chemo he apeu ic agen s, o moni o ing he s age and
e iciency o a i us pu i ica ion in indus ial p ocesses o simply o e alua e i us
pa hogenici y (Hie holze and Killing on, 1996). In any expe imen in ol ing
cells inocula ion wi h i us, he mul iplici y o in ec ion (MOI; being he numbe
o i al pa icles pe cell) is c ucial since i ep oducible o un eliable MOIs,
caused by inaccu a e es ima ion o he i al i e o he inoculum, ha e a
p o ound impac on he pe o mance and ba ch consis ency o he assay (Roldão
e al., 2009). Fo his eason, accu a e quan i a i e me hods a e manda o y.
The clinical u ili y o he i al quan i ica ion has been deeply e iewed in
human medicine. Howe e , in he e e ina y ield, and mo e p ecisely in ish
i ology, mos echniques and me hodologies ha e been adap ed om p e ious
ad ances in human i ology. In spi e o i s ele ance, jus a couple o e iews
ha e been published in ecen yea s ( Heide and Me zne , 2014; Pankaj, 2013) .
Following he classi ica ion made by Heide and Me zne (2014), i us
quan i ica ion me hods can be b oadly classi ied in ou di e en ca ego ies
depending on wha a e hey based on: i) in he le els o in ec i i y, ii) in de ec ion
o i al p o eins, iii) in de ec ion o i al nucleic acid, o i ) in coun ing o i al
pa icles
2 METHODS FOR VIRUS QUANTIFICATION
2.1 Vi us in ec i i y
The mos basic and adi ional p ocedu es o know he i al concen a ion
in a sample a e based on he assessmen o he i al in ec i i y. An in ec i i y
assay measu es he i e ( he concen a ion) o an in ec i e i us in a specimen
o a p epa a ion. These me hods can be addi ionally classi ied in hose based on
he esponse o he inocula ed subjec o an in ec ion –called quan al– and hose
elying on he de ec ion and coun ing o oci o in ec ion known as ocal o
quan i a i e assays.
a) Quan al assay
The end poin dilu ion assays a e de ini ely one o he mos used me hods
o quan i ica ion o i us. Thei objec i e is o ind he i al dose yielding a
esponse in 50 pe cen o he inocula ed subjec s. Depending on he ype o
subjec used o he inocula ion, he inal i e alue could be named di e en ly:
issue cul u e in ec ious dose 50 (TCID50), i cell cul u es a e used; le hal dose 50
Chap e 2
Vi us quan i ica ion: A gene al e iew
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25!
(LD50), using expe imen al animals, o egg in ec i e dose 50 (EID50), using
emb yona ed chicken eggs. The gene al p ocedu e always begins wi h se ial
dilu ion o he s ock sample, and he subsequen in ec ion o inocula ion o he
subjec s.
The es ima ion o he i e by TCID50 is, by a , one o he mos used in he
ish i ology ield. TCID50 is gene ally de ined as he lowes i al dilu ion whe e
he 50% o a gi en ba ch o cells a e demons a ed o be in ec ed, demons a ion
being a ained by he isualiza ion o cy opa hic e ec (CPE) in he cell
monolaye . Then he es ima ion o he i e can be pe o med using di e en
nonpa ame ic me hods like Spea man and Ka be (SK), Reed and Muench (RM),
D ags ed and Beh ens (DA), Li ch ield and Wilcoxon (LW), and mo ing
a e age (MA) (Finney, 1952; Hamil on, 1991), o by pa ame ic p ocedu es as
he maximum likelihood (ML) based on he single hi Poisson esponse (Mye s
e al., 1994). To answe he immedia e ques ion o which me hod should be
chosen, Finney (1952); a e wa ds suppo ed by Hamil on, 1991) a gued ha
nei he RM, DA o LW a e as powe ul as he SK p ocedu e, and hei con inued
use in some a eas is “mo i a ed only by adi ion”; in ac , he Spea man-Ka be
me hod is ecommended by FAO because “ is s a is ically ma kedly supe io and
in ol es ela i ely simple calcula ion” (Li amoi e al., 1996) Howe e , when he
concen a ion is low bu measu able (i.e i e s below app oxima ely 0.8 log10 o
uni s pe ml, using s anda d pla es), SK me hod p oduces inc easingly biased
es ima es o i e s. Mo eo e , he me hodology has an absolu e equi emen : ha
he se ial dilu ions p o ide bo h 100% and 0% in ec i i y, bu his c i e ia is
di icul o mee wi h low le els o i us in he sample (Da ling e al., 1998).
The e o e, ei he ML o SK me hods ha e been ecommended o be used a
mos i us concen a ions; bu , a low i us concen a ions ML is p e e ed
(B ownie e al., 2011). Howe e , al hough sp eadshee algo i hms a e a ailable
o ca y ou he ML calcula ions one sample a a ime, i is somehow ha de o
au oma e ba ch p ocessing o mul iple samples because he i e a i e solu ion o
an equa ion is equi ed. The e o e, he use o he SK me hod is mo e ex ended
because calcula ions can be easily implemen ed in a sp eadshee o ma . This
acili a es he s anda diza ion o compu a ions ac oss labo a o ies, when la ge
numbe s o assays a e conduc ed (B ownie e al., 2011).
b) Quan i a i e assay
Quan i a i e assays a e hose in which oci o in ec ion a e coun ed
somehow (Plaques, luo escen oci, e c.). Plaques a e localized as disc e e oci
o in ec ion, deno ed by zones o cell lysis o CPE wi hin a monolaye o
o he wise heal hy issue cul u e cells (Hie holze and Killing on, 1996). The
plaque assay was i s ly de eloped o animal i uses ( he Wes e n equine
encephalomyeli is i us) by Rena o Dulbecco in 1952 (Dulbecco, 1952), as an
adap a ion o he me hod al eady used o calcula ing bac e iophage s ocks i e s.
Diego Vázquez Rod íguez
26!
Since hen, he me hod has been adap ed o mul iple animal i us including
hose a ec ing ishes, like he i al haemo hagic sep icaemia i us (VHSV),
IPNV, he in ec ious haema opoie ic nec osis i us (IHNV), he channel ca ish
i us (CCV), and he lymphocis is disease i us (LV) (Bu ke and Mulcahy, 1980;
Espinoza and Kuzna , 2002; Wol e al., 1973). Plaque assays a e pe o med in
wo di e en ways: suspension assays (cells and i us a e seeded a he same ime
a e adso p ion), o monolaye assay (whe e he i us suspension is added o a
con luen issue cul u e cell monolaye ). Some i uses, such as he pes i uses and
pox i uses, may be plaque-assayed unde s anda d liquid cul u e medium,
because di ec cell- o-cell sp ead o hese i uses ensu es o ma ion o localized
plaques. Howe e , many o he i uses equi e a iscous o e lay medium o
p e en seconda y in ec ions. Wha e e he me hod chosen, i should be adap ed
o he pa icula condi ion o he i us used, and some aspec s in he
op imiza ion p ocess should be aken in o accoun since hey could a ec he
inal i e , as: (i) he abili y o he i us o cause a de ec able CPE in issue cul u e,
since some clinical isola es may ail o induce CPE o o m plaques
(Hamma lund e al., 2012); (ii) he ime equi ed o each speci ic i us o adso b
o he cells; (iii) he ype o o e lay used, because some can cause an inhibi o y
e ec on he eplica ion o he i us (Ma oso ich e al., 2006); (i ) he incuba ion
ime needed o plaques o ma ion; ( ) he sensi i i y o i us in ec ion o he
cell chosen (Lo enzen e al., 1999), and ( i) he cell concen a ion –o monolaye
con luency– a he ime o in ec ion (Roldão e al., 2009). As a esul o he
in ec ion o he cell by – heo e ically, bu no necessa ily– a single i ion, a plaque
is inally o med, and he numbe o plaques o med in he cell monolaye wi h
each dilu ion will be p opo ional o he concen a ion o in ec ious i al pa icles
used o he in ec ion. Fo s a is ical easons, 20-100 plaques pe monolaye a e
ideal o coun ing, al hough he ac ual numbe is o en dependen on he size o
he plaque and he size o he lask o plaque used o he assay (Hie holze and
Killing on, 1996). The inal i e is exp essed as plaque o ming uni s pe millili e
(p u/mL). Al hough his me hodology, as he quan al assay desc ibed be o e, is
ela i ely simple, due o he long incuba ions equi ed o ob ain esul s (no mally
be ween 3 and 10 days, depending o he i us and cells used) i is conside ed
ime consuming.
A di ec equi alence be ween TCID50 and p u i e s does no exis . In he
publica ion headed by B yan (1957), he au ho inds ha he p u/TCID50 a io
mus be a ound ln(2) ≈0.69, and using Mon e Ca lo simula ion, i was
demons a ed ha he ela ion is abou 0.56 when using he SK calcula ion
me hod (Wul e al., 2012). A compa a i e e alua ion o bo h echniques o he
i a ion o ilo i us, sugges ed a ela ion alue o a ound 0.1(PFU/TCID50)
(Smi he e al., 2013). On he o he hand, hese au ho s also ound a g ea e
ep oducibili y wi h he plaque assay han wi h he end poin dilu ion me hod,
esul s which a e in conco dance wi h o he s in he li e a u e epo ing
di e ences in e ms o s anda d e o be ween plaque assay (coe icien o
Chap e 2
Vi us quan i ica ion: A gene al e iew
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33!
di e en ia e ac i e e sus pe sis en in ec ion (Mackay e al., 2002). Many eal
ime-qPCR p o ocols o he de ec ion o mic obial a ge s ha e been published,
and comme cial assays a e a ailable o a numbe o clinically impo an human
i uses (Ra cli e al., 2007). In e e ina y diagnos ics, and mo e speci ically in
ish i ology, his echnique has been success ully implemen ed o de ec ing and
quan i ying many i al pa hogens, including VHSV (Ga e e al., 2011; Jons up
e al., 2013), IHNV (O e u e al., 2001; Pu cell e al., 2013), ISAV (Snow e al.,
2006; Wo kenhe e al., 2008), o IPNV (Bowe s e al., 2008; Calleja e al., 2012).
Howe e , he e is s ill a lack o p ope ly alida ed s anda ds o be implemen ed
in ish i us quan i ica ion. Comme cial ki s a e usually alida ed using a la ge
coho o clinical samples. De elopmen o in-house assays may be achie ed i
an app op ia e s uc u ed alida ion p ocedu e is implemen ed (Ra cli e al.,
2007).
b) Digi al PCR
The i s e e ence o digi al PCR (dPCR)was in he 1990s (Sid ansky e al.,
1992; Vogels ein and Kinzle , 1999). The s uggle wi h he design, alida ion and
p ese a ion o he s anda ds needed o he p e ious echnique has been
o e come wi h he ad en o he dPCR. One o he g ea es bene i s o his
echnology is he di ec measu emen o i al nucleic acid concen a ion,
p o iding he absolu e numbe o copies/ml wi hou he need o a s anda d
cu e. The chemis y used in digi al PCR is he same as qPCR, bu he
ampli ica ion is de ec ed by a di e en me hod. The luo escen quan i ica ion is
made by dilu ing he sample and pa i ioning i in o indi idual eac ions
(d ople s), in a manne ha each eac ion ideally con ains one (ne e mo e han
2) o no copies o he DNA o in e es (Sedlak and Je ome, 2014). The absolu e
numbe o a ge nucleic acid molecules in he sample is calcula ed di ec ly om
he a io o posi i e o o al pa i ions using binomial Poisson s a is ics (Pinhei o
e al., 2012). In a ecen s udy, he compa a i e e alua ion be ween RT-dPCR
and RT-qPCR de ec ing he main i uses esponsible o oodbo ne ou b eaks
human No o i uses (NoV) and Hepa i is A i us (HAV), e ealed ha he RT-
dPCR is 1 log10 mo e sensi i e. Mo eo e , RT-dPCR may p o ide mo e accu a e
measu emen s han RT-qPCR as i is no dependen on ampli ica ion e iciency
(Coud ay-Meunie e al., 2015). In o he s udy, he au ho s quan i ied GB Vi us
Type-C (GBV-C), an occul RNA i us associa ed wi h HIV-1 in ec ion. They
obse ed ha , e en a e emo ing he po en ial e o o a mass-based s anda d
cu e using a digi al PCR calib a ed s anda d cu e, RT-qPCR had, on a e age,
a lowe epea abili y; mo e p ecisely, dPCR had an a e age coe icien o
a ia ion o 11.7±2.2% o he i al load es ed, while s anda d qPCR had an
a e age CV o 25.8±4.9% (Whi e e al., 2012). Ano he key ad an age o his
echnology is ha he e iciency o he e e se ansc ip ion and he kine ics o

Diego Vázquez Rod íguez
34!
he ampli ica ion, ele an p inciples in qPCR, ha e no impac on he inal digi al
PCR quan i ica ion. In a wo k published by Veach e al. (2015), he au ho s
obse ed ha he ex ac ed RNA does no need o be pu i ied om he eagen s
used o lyse he i us; hey ound a high co ela ion o he dPCR me hod wi h
o he quan i ica ion p ocedu es o in luenza i us like ELISA, HA and Vi us
Coun e . RT-dPCR demons a es highe p ecision and epea abili y o
quan i ying wa e bo ne i uses, a hei cha ac e is ic low concen a ions:
54.4±2.6 and 6±1 o a i us copies/10 µL eac ion (Rački e al., 2014). Digi al
PCR is unlikely o supplan qPCR in he sho e m, bu ins ead will be a
complemen a y app oach in ce ain applica ions (Ru sae e al., 2018; Sedlak and
Je ome, 2014). Recen ly, i s eliabili y in quan i ica ion o impo an pa hogens
o he aquacul u e indus y like VHSV and IHNV (Jia e al., 2017; Pa šič e al.,
2016) has been p o en.
2.4 Vi us pa icles
Al hough he echnical ad ances in Vi ology has p o ided a di e se a ie y
o me hodologies o i al quan i ica ion, he u h is ha coun ing o i al
pa icles was adi ionally pe o med by he use o he ansmission elec on
mic oscope (TEM). In a ecen e iew by Heide and Me zne (2014), he
au ho s include desc ip ion o he a omic o ce mic oscopy (AFM), lase ligh
sca e ing applica ions such as mul iple-angle lase ligh sca e ing (MALLS) (o
nanopa icle acking analysis; NTA), unable esis i e pulse sensing (TRPS)– a
me hod based on he Coul e p inciple–, and low cy ome y (FC) a ian s like
he Vi us Coun e (VC). In addi ion, liquid ch oma og aphy has been e alua ed
o he quan i ica ion o i us pa icles (T ans igu acion e al., 2015).
a) Elec on mic oscopy
Al hough i has been g adually eplaced by mo e sensi i e me hods such as
PCR and immuno luo escen assays (IFA), ansmission elec on mic oscopy
(TEM) has ce ainly ep esen ed a majo con ibu ion o i ology, because i
acili a es he diagnosis o i al in ec ions, suppo s he in es iga ion on i us–
hos cell in e ac ions, and has led o he disco e y o new i uses (Roingea d,
2008). The basic i al quan i ica ion p ocedu e using TEM is buil upon nega i e
s aining (mainly wi h u anyl ace a e, phospho ungs ic acid o ammonium
molybda e) o he i al pa icles and i s coun ing along wi h s anda d la ex
pa icles o known concen a ions (Reid e al., 2003; Wa son e al., 1963; Zheng
e al., 1996). TEM quan i a ion is a quicke han in ec ious i a ion and i also
allows a quali a i e obse a ion o he i al mo phology. Howe e , he de ec ion
limi do no allows i o be used wi h samples wi h a concen a ion lowe han
105 pa icles/mL (Maleno ska, 2013; Reid e al., 2003).
Chap e 2
Vi us quan i ica ion: A gene al e iew
! !
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b) Vi us Coun e
Based on a p o o ype epo ed some yea s ago by S o el e al.,(2005),
Vi oCy (2013; h p://www. i ocy .com) has de eloped a specialized “ low
i ome e ” sui able o apid i us pa icle quan i ica ion in liquid samples. The
me hod o de ec ion is based on a dual labelling sys em, one label speci ic o
p o eins and ano he o he i al genome. In ac i us pa icles a e quan i ied by
de ec ing luo escence om pa icles con aining colocalized p o eins and nucleic
acids (S o el and Rowlen, 2005). Bo h, a ce ain size o i us (>25 nm) and a
ce ain leng h o i al genome (49000 n /bp) a e necessa y o gua an ee a
su icien le el o s aining o be de ec ed (Heide and Me zne , 2014). The
subs i u ion o a mul is ep an ibody s aining p ocedu e by a non-speci ic s aining
inc eases he simplici y o he p ocedu e o he ope a o , and educes he assay
cos s (A akelyan e al., 2013; Fe is e al., 2011). The eliable ange o
measu emen epo ed by Heide and Me zne ,( 2014) was be ween 5 Í 105 o
1 Í 109 i us pa icles/ml. In a ecen e alua ion o he me hod o ilo i us
quan i a ion, he au ho s obse ed ha he CV anged om 9.4% o 31.5% o
hose samples ha ell wi hin he linea ange o he ins umen (2.8 Í 106 o 1.0
Í 109 VP/mL)(Rossi e al., 2015). These limi s a e simila o hose ob ained o
H1N1 in luenza i us (9.8 Í 104 VP/mL) (S epp e al., 2011). High co ela ion
o he me hod wi h TEM, qPCR o TCID50 was obse ed, bu a big gap be ween
in ec ious and o al i us coun s was de ec ed (Heide and Me zne , 2014). In
quan i ica ion o pa icles di ec ly om samples wi h he high le els o
con aminan p o eins ypical o clinical samples (whole blood, se um, plasma) o
s ock p epa a ions wi h e al bo ine se um concen a ions highe han 10%, he
le el o backg ound nega i ely a ec s he coun ing; he e o e, p e ious dilu ion
o pu i ica ion o he sample is manda o y (Rossi e al., 2015).
O he echnologies like AFM, MALLS o NTA ha e been ecen ly e iewed
in de ail by Heide and Me zne (2014). Al hough p omising in hei esul s, only
a ew esea ch g oups ha e epo ed hei e alua ion. The i uses es ed a e
educed o in luenza i us, adeno i us and len i i us. All o hem ha e hei p os
and cons, bu i is oo ea ly o de e mine i hei use will be gene alized o
esea ch wi h o he i uses including hose a ec ing aquacul u e.
Diego Vázquez Rod íguez
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Bha , S., Emslie, K.R., 2012. E alua ion o a d ople digi al polyme ase

!
Chap e 4
!
!
Quan i a i e Flow Cy ome y o Measu e Vi al
P oduc ion Using In ec ious Panc ea ic Nec osis
Vi us as a Model:
A P elimina y S udy
!
!
!
!
!
!
!
!
!
The da a epo ed in his chap e was published in: Quan i a i e Flow Cy ome y o
Measu e Vi al P oduc ion Using In ec ious Panc ea ic Nec osis Vi us as a Model: A
P elimina y S udy Applied Sciences. 2018, 8, 1734; Sep embe 2018
doi:10.3390/app8101734!
!
Chap e 5
!
!
A no el p ocedu e o quan i a ion o i us based on
mic o low cy ome y analysis
!
!
!
!
!
!
!
!
!
The esul s o his s udy we e published in: A no el p ocedu e o quan i a ion o
i us based on mic o low cy ome y analysis
.
Applied Mic obiology and Bio echnology, Volume
100, Issue 5, pp 2347–2354. Ma ch 2016, doi: 10.1007/s00253-015-7228-3
!
Chap e 6
Final Discussion and Conclusions

Chap e 6
Final discussion and conclusions
120
1 FINAL DISCUSSION
Whe he i is o ou ine e alua ion o a biopha maceu ical p oduc , o
accine p oduc ion, o o alida ion o an i i al subs ances, i us quan i ica ion
is a c i ical s ep in any o hese p ocesses. The e o e, he main objec i e o he
whole s udy cons i u ing he p esen doc o al hesis was o p o ide he Fish
Vi us Uni a he Ins i u e o Aquacul u e, USC, wi h a se o s anda dized and
alida ed echniques o eliable quan i ica ion o ish i uses. In addi ion,
because in he las yea s EU esea che s ha e aimed hei e o s o he
de elopmen o diagnos ic and quan i ica ion p ocedu es o he i al
haemo hagic sep icaemia i us (VHSV) and he i al ne ous nec osis i us
(VNNV), lea ing apa ano he impo an i us: he in ec ious panc ea ic
nec osis i us (IPNV); i was he goal o he p esen s udy o p o ide addi ional
ools o igh his disease.
A e he ex ensi e e iew o he cu en me hods used o quan i ica ion
o i uses pe o med in Chap e 1, i was concluded ha , o mos o hem he
gold s anda d is, s ill he cell based me hods like plaque assay o 50% issue
cul u e in ec ious dose es ima ion by TCID50. In he pa icula case o i uses
a ec ing he ish aquacul u e indus y, cell cul u e is also he gold s anda d
me hod chosen by he Wo ld O ganiza ion o Animal Heal h (OIE). Howe e ,
ha echnique is ime consuming and exhibi s low sensi i i y which, in some
cases, makes i us quan i ica ion di icul (Dopazo and Bandín, 2011).
The e o e, al hough his one was used as e e ence, o he echniques we e
selec ed o be e alua ed o i al quan i ica ion a e p e ious op imiza ion: he
quan i ica ion o i) genomic uni s, by means o quan i a i e Polyme ase Chain
Reac ion (qPCR) (Chap e 2), ii) and i al p o eins (Chap e s 3 and 4).
Based on he la ge expe ience o he Ins i u e eam wi h he PCR based
echnologies, bo h o diagnosis and quan i ica ion o i uses (Cu ín e al., 2009;
Dopazo and Bandín, 2011; Lopez-Vazquez e al., 2015; Ol ei a 2006), qPCR was
he i s echnique selec ed o be op imized and alida ed o diagnosis and
quan i ica ion o IPNV. The qPCR is a well- ecognized echnology o nucleic
acid quan i ica ion and has been –and nowadays is– widely employed o i al
quan i ica ion, as well as o quan i y gene exp ession. Un o una ely, in some
cases hose s udies epo ing i s use did no include he alida ion o he
p ocedu e, which comp omise, o ou unde s anding, he eliabili y o he esul s.
The in i o alida ion o he qPCR p ocedu e de eloped was pe o med
using, as e e ence s anda ds, c ude i us ( i a ed by he plaque assay and he
end-poin dilu ion TCID50 me hods) and se e al in i o ansc ibed RNA
s anda ds ob ained om ep esen a i e e e ence s ains. The s anda ds es ed
we e ound in all cases highly eliable based on he co ela ion alues ob ained
(R2 always ³ 0.95) (B oede s e al., 2014). In addi ion, i s high epea abili y and
ep oducibili y con i ms he eliabili y o he p ocedu e o i al quan i ica ion.
Chap e 6
Final discussion and conclusions
122
e ms o quan i ica ion o IPNV p o ein syn hesis. Al hough qFC is no a new
echnique (Schwa z e al., 2002; Se ke e al., 1998; Wang e al., 2002) i s
applica ion o quan i a i ely s udy i us eplica ion has been limi ed (Ga es e al.,
2009; Schulze-Ho sel e al., 2008) . To his ega d, in he p esen s udy we ha e
demons a ed ha , hanks o he MARIS me hod (H a in e al., 2014), he
de eloped p ocedu e can also be applied o s udy he i al eplica ion, since i
can assess he capsid VP2 p o ein p oduc ion signi ican ly ela ed o he RNA
syn hesis.
As al eady epo ed by o he au ho s (Miz ahi e al., 2018), qFC equi es
ca e ul s anda diza ion in o de o ge meaning ul and ep oducible esul s. Such
s anda diza ion mus include e e y i em in he whole p ocess: Sample handling
– e en ype o sample: i us and cells – calib a ion beads, he cy ome e i sel , o
e en da a analysis. This was he comple e p ocess ollowed in chap e 3 o se up
ou p ocedu e. Howe e , i has been e alua ed o IPNV on BF-2 cells wi h an i-
VP2 p o ein an ibody. The e o e, he p ocedu e should be alida ed o each
pa icula i us o s ablish indi idual p o ocols sui able o each di e en case.
On he o he hand, in spi e o he ac ha low cy ome y has been e ealed
as a aluable ool o i us quan i ica ion, i equi es highly expe ience ope a o s,
and e y expensi e equipmen and eagen s o ob ain eliable da a. The e o e, o
e alua e o he al e na i es, an easy o use app oach based on he “Lab on a Chip”
echnology – (mic o luidic glass chips) was designed and e alua ed o i al
quan i ica ion. The op imiza ion o he p ocedu e desc ibed in chap e 4 has
demons a ed mic o low cy ome y (µFCM) o be an a o dable and eliable
al e na i e o adi ional qFC when simple analysis o i us in ec ed cells is
equi ed. The designed p ocedu e p o ided a epea able and ep oducible i al
i a ion in a minimum incuba ion ime o 16h, wi h a dynamic ange o 5 logs,
and a minimum de ec able i e o 104 TCID50/ml. I eached an imp o ed limi
o 102 TCID50/ml when he incuba ion ime was inc eased o 24h. In addi ion,
wi h his me hod, 6 samples can be analyzed wi hin he same glass chip, which
educes ime and cos s in eagen s and ma e ials.
In he s udy pe o med o chap e 4, we ha e obse ed ha , as o qFC,
µFCM is highly in luenced by se e al pa ame e s, which mus be op imized o
s anda dize he p ocedu e o each i us-cell-se a se . In ou case, he i s
pa ame e which we ealized ha in luenced he e iciency o he p ocedu e was
he i us-cell incuba ion ime, as al eady indica ed abo e. Mo eo e , he high
speci ici y o he me hod, which elies on he a ini y o he monoclonal
an ibodies o an speci ic epi ope o he i al p o ein, makes he ini ial
op imiza ion o he es condi ions c i ical. I is impo an o highligh ha
despi e he high speci ici y o he mAb (agains VP2 epi opes) employed o bo h
FACS and µFCM, i was possible o de ec di e en ypes o IPNV.
Diego Vázquez Rod íguez
123
Table 1.- Summa y o pa ame e s and cha ac e is ics o he 3 echniques
de eloped
Technique
LOD
(In /ml)
DR
Reliabili y o
i a ion
Time
Ope a o
Expe ience
qPCR
31 TCID50
50 p u
60 RNA
copies
2-9 lg TCID50 q
1.5-6.5 lg TCID50 l
102.5-1010 copies
Unde es ima ion
½ day
Medium
qFC
10 TCID50
26 p u
1-6 lg TCID50
1.4-6.4 p u
2nd-deg ee
polynomial
ela ionship
24h
High
µFCM
200 TCID50
501 p u
2-7 lg TCID50
2.7-7.7 lg p u
O e es ima ion
unde
105 TCID50
16h o
>104 TCID50
24h o
>102 TCID50
Medium
LOD, limi o de ec ion; DR, dynamic ange; R&R, epea abili y and ep oducibili y; Replic, he i us
is de ec ed associa ed o eplica ion in cell cul u e; S and., he echnique has been s anda dized;
q
, 8 logs
i a second-deg ee polynomial eg ession is applied;
l
, 5 logs i a lineal eg ession is applied
Which o he p ocedu es de eloped would be ad isable o diagnosis and
quan i ica ion? Following, we will compa e he alida ed pa ame e s and he
cha ac e is ics o he h ee p ocedu es and echnologies, hei ad an ages and
disad an ages (Table 1).
Rega ding he de ec ion capaci y in e ms o limi o de ec ion (LOD), he
bes me hod was he qFC, which was able o de ec as li le as 10 TCID50/ml (o
26 p u/ml) o i us. This alue is 1 log lowe han he da a epo ed o o he
i uses like measles (G igo o e al., 2011) o a icella (Ga es e al., 2009).
Among he h ee echnologies, he wo s sensi i i y was exhibi ed by µFCM, wi h
a LOD=2×102 TCID50/ml (50 p u/ml). The LOD ob ained wi h qPCR (a ound
30 TCID50/ml o 50p u/ml) e ealed a sensi i i y close o he qFC; howe e , we
mus say ha his alue was ob ained wi h jus one eplica, and he LOD da a
wi h 3 eplicas (480 p u/ml) was qui e simila o ha p o ided by µFCM.
The dynamic ange (DR) o quan i ica ion in e ms o TCID50 o p u was
he same o he 3 echniques: 6 log, an op imum da a, as epo ed in p e ious
guidelines (Bus in e al., 2009). Howe e , in he case o qPCR, he use o in i o
ansc ibed RNA (i RNA) p o ided a 9 logs DR; also wi h his echnology, he
DR eached 9 logs o TCID50 when a second-deg ee eg ession was applied.
A pe ec equi alence be ween adi ional i a ion and quan i ica ion by any
o he h ee p ocedu es was no obse ed. Fo ins ance, wi h µFCM an
o e es ima ion ( om 1.5 o 3 logs) was obse ed a he lowes i e s ( om 102
o 105), and almos no di e ences a he highes ones. To his ega d, I has been
Chap e 6
Final discussion and conclusions
124
epo ed ha he concen a ion alues ob ained by plaque assay o any o he
in ec i i y me hod a e lowe han me hods based in nucleic acid o p o ein
(Heide and Me zne , 2014). Howe e , in he case o qPCR, he use o i RNA as
s anda d implied an unde es ima ion o he eal i e in he whole DR, om 1.5
log o di e ence a he lowes i e s o 0.5 a he highes , wha , as discussed in
Chap e 2, could be due o he degene a ion o se e al bases in he sequence o
he p ime s. This e ec has also been obse ed in IPNV by Jo que a e al.,
(2016), al hough hey also s a ed ha degene a ed p ime s is he bes solu ion o
compensa e polymo phic si es and o e come he high mu a ion a e o hese
i uses. Only wi h qFC a clea ela ionship be ween i a ion and p o ein
quan i ica ion was obse ed, bu jus using a second-deg ee polynomial
eg ession.
Using hese pa ame e s as c i e ia and conside ing ha he 3 me hods
showed high epea abili y and ep oducibili y, he ex emely high sensi i i y o
he qFC, and he high sensi i i y and wide dynamic ange o he qPCR, makes
hem he bes candida es o be used o i al quan i ica ion. Howe e , o he
c i e ia mus be conside ed, o ins ance, he equi emen s o le el ope a o ’s
expe ience is an impo an aspec o ensu e he eliabili y o he esul s. To his
ega d, he qFC echnology equi es a highly quali ied echnician o ope a e he
equipmen and p o ide aw da a o analysis; e en, he analysis o he aw da a
mus also be pe o med wi h a dedica ed so wa e, which equi es p e ious
aining and expe ience. In e ms o simplici y, he µFCM has been ound o be
sui able o ope a o s wi h low expe ience (Chap e 4) because he equipmen
and me hod designed a e, once s anda dized, o low complexi y o p epa a ion
and pe o mance. In addi ion, in spi e o he ac ha highly ained ope a o s
ob ained be e esul s, he µFCM ha e shown o be obus when pe o med by
unexpe ienced echnicians, as obse ed om he assessmen o he
ep oducibili y o he me hod, wi h coe icien s o a ia ion (CV) lowe han
10%. Rega ding he qPCR, he s anda diza ion o he p ocedu e i sel is
complex, as i is o qFC and µFCM bu , once s anda dized, i is expec ed o be
ep oducible be ween di e en labo a o ies and echnicians o di e en le els o
expe ience (Dopazo and Bandín, 2011).
The e a e wo addi ional pa ame e s ha mus also be conside ed: ime and
i al ac i i y. Taking he second one unde conside a ion, qPCR should no be
aken in o accoun because only qFC and µFCM ely on he in ec ion o cell
monolaye s by i uses. Howe e , conside ing he i s c i e ia – ime–, qPCR
exceeds he o he wo echniques in speed o pe o m de ec ion, iden i ica ion
and quan i ica ion.
131
RESUMEN
CAPÍTULO 1: In oducción
El desa ollo mundial de la acuicul u a en los úl imos años es
incues ionable. En 2016, la p oducción mundial de acuicul u a alcanzó 80
millones de oneladas, con un alo de p ime a en a es imado de US $ 232 mil
millones, que consis e en 54,1 millones de oneladas de peces (US $ 138,5 mil
millones), 16.1 millones de oneladas de moluscos (US $ 29,2 mil millones) , 7,9
millones de oneladas de c us áceos (US $ 57,1 mil millones) y 9385000 oneladas
de o os animales acuá icos (US $ 6,8 mil millones) (FAO, 2018). Es a si uación
ha sido p omo ida en g an pa e, po la in ensi icación de los p ocesos de cul i o.
Sin emba go, la p oducción in ensi a de peces y ma iscos es á
amenazada po b o es epidémicos que a ec an no solo a las poblaciones
"domés icas" sino ambién a las poblaciones sil es es (Tompkins e al., 2015).
En e las di e en es pa ologías que a ec an a la acuicul u a de peces, las
en e medades i ales ienen uno de los mayo es impac os económicos debido a
su i ulencia, ápida dispe sión y ausencia de a amien o y acunas e ec i as, lo
que di icul a su e adicación comple a. Po lo an o, la in es igación se cen a no
sólo en el desa ollo de p o ocolos p o ilác icos y el diseño de nue as y más
e icien es acunas, sino ambién en la mejo a de los p ocedimien os de
diagnós ico pa a acili a el con ol de los b o es. Además, se es á aplicando un
es ue zo cada ez mayo en las inspecciones del es ado de salud de poblaciones
de peces cul i ados y sil es es, lo que ha lle ado al descub imien o de i us de
peces que la ciencia desconocía has a el momen o; siendo alguno de ellos
endémicos en e las poblaciones na i as y p opagándose de mane a opo unis a
pa a in ec a peces en ins alaciones de acuicul u a (Walke y Win on, 2010).
Además, esa igilancia, ambién ha p opo cionado in o mación impo an e sob e
la dis ibución y la i ulencia de o os i us conocidos p e iamen e.
CAPÍTULO 2: Cuan i icación i al: Una e isión gene al
En la mayo ía de los es udios de i ología, uno de los p incipales da os
a conoce es la concen ación de pa ículas o ales o in ecciosas en una mues a.
Po lo an o, la cuan i icación del i us es c ucial pa a conoce en e o as cosas,
el ciclo de eplicación de un i us, pa a es udia el ni el de i ulencia de nue os
aislados, pa a e alua la ac i idad an i i al de los agen es quimio e apéu icos, pa a
moni o iza la e apa y la e iciencia de una pu i icación de i us en p ocesos
indus iales o simplemen e pa a e alua la i ulencia de un de e minado agen e
i al (Hie holze y Killing on, 1996). En cualquie expe imen o que in oluc e la
in ección de células con i us, la mul iplicidad de la in ección (MOI po sus siglas
en Inglés, que es el núme o de pa ículas i ales po célula) es el ac o más
c í ico, ya que las MOI i ep oducibles o imp ecisas, causadas po una es imación

Resumen
132
inexac a del í ulo i al del inóculo, ienen un p o undo impac o en el
endimien o y la consis encia del lo e o del ensayo (Roldão e al., 2009). Po es a
azón, es muy impo an e con a con mé odos cuan i a i os p ecisos.
La u ilidad clínica de la cuan i icación i al ha sido p o undamen e
e isada en medicina humana. Sin emba go, en el campo e e ina io, y más
conc e amen e en la i ología de peces, la mayo ía de las écnicas y me odologías
se han adap ado de an e io es a ances en i ología humana. A pesa de su
ele ancia, solo un pa de e isiones se han publicado en los úl imos años (Heide
y Me zne , 2014; Pankaj, 2013).
En es a línea, y siguiendo la clasi icación ealizada po Heide y Me zne ,
los mé odos de cuan i icación de i us pueden clasi ica se en cua o ca ego ías
di e en es dependiendo de en qué se basen: i) en los ni eles de in ec i idad, ii)
en la de ección de p o eínas i ales, iii) en la de ección de ácido nucleico i al, y
i ) en la enume ación de pa ículas i ales.
En es e capí ulo se han e isado en de alle las siguien es écnicas de
cuan i icación basándonos en la clasi icación desc i a an e io men e:
• In ec i idad: Ensayos quan ales y cuan i a i os.
• De ección de P o eínas Vi ales: Ensayo de Foci Fluo escen es, ELISA,
Ensayo de inmunodi usion Radial Simple (SRID), C oma og a ía liquida
de al a p ecisión (HPLC), Ensayos de Hemaglu inación, Ci ome ía de
Flujo.
• De ección de ácido nucleico i al: PCR en iempo eal PCR digi al
• Enume ación de pa ículas i ales: Mic oscopia elec ónica, Con ado
de Vi us
Pa a el p esen e es udio, cen ado en el desa ollo, la op imización y la
alidación de los p ocedimien os de cuan i icación i al, cualquie a de los i us
que a ec an ac ualmen e a la indus ia de la acuicul u a pod ía habe se elegido
como modelo. ¿Po qué se eligió en e odos el i us de la nec osis panc eá ica
in ecciosa (IPNV, po sus siglas en Inglés)? La misma b echa con espec o al
obje i o gene al de es e es udio a ec a a odos los i us de peces en la li e a u a,
pe o las es icciones de biosegu idad del IPNV, jun o con la al a disponibilidad
y di e sidad de cepas, hacen de es e pa ógeno un g an candida o pa a es e ipo
de es udios. Po lo an o, el p opósi o del p esen e es udio ue la e aluación,
diseño y alidación de di e en es écnicas de cuan i icación de i us, u ilizando el
i us de nec osis in ecciosa panc eá ica (IPNV) como modelo gene al. El
obje i o inal del es udio ue, en una e apa pos e io , la ans e encia de las
ecnologías desa olladas en es a esis a los p o ocolos es ánda del Ins i u o de
Acuicul u a de la Uni e sidad de San iago de Compos ela.
Diego Vázquez Rod íguez
133
CAPÍTULO 3: Diseño y alidación de un p ocedimien o RT-
qPCR pa a el diagnós ico y cuan i icación de la mayo ía de los
ipos de i us panc eá icos in ecciosos u ilizando un solo pa de
cebado es degene ados
Es incues ionable que una de las mayo es e oluciones de la biología
molecula en el siglo pasado ue la eacción en cadena de la polime asa (PCR), y
pos e io men e se impulsó con la posibilidad de segui la e olución de la
ampli icación en iempo eal, PCR en iempo eal o qPCR (po sus siglas en
Inglés); y su capacidad pa a p oduci e dade os da os cuan i a i os (Higuchi e
al., 1992, 1993; Wi we e al., 1997). Aunque la mayo ía de los p o ocolos de
diagnós ico de PCR publicados inicialmen e son cuali a i os, en la ac ualidad, la
ecnología de la PCR en iempo eal, basada en la de ección y cuan i icación de
un amplicón o sonda luo escen e (Bus in, 2000), es á eemplazando
p og esi amen e al uso de la PCR adicional. La li e a u a sob e es e ema es
muy abundan e y se ha e isado en p o undidad en an e io es publicaciones
(Bus in e al., 2009; Ho mann e al., 2009; Kubis a e al., 2006; Mackay e al.,
2002).
El desa ollo de la PCR en iempo eal ha lle ado la e dade a
cuan i icación de los ácidos nucleicos i ales a los labo a o ios de diagnós ico
(Mackay e al., 2002). La cuan i icación de la concen ación de una mues a (ARN
o ADN) se puede ealiza siguiendo dos es a egias: qPCR absolu a o ela i a. La
cuan i icación absolu a elaciona la señal de PCR con los núme os de copia de
en ada u ilizando una cu a de calib ación, mien as que la cuan i icación
ela i a se basa en los ni eles de exp esión de un gen obje i o en e a un gen de
e e encia o con ol (P a l, 2004). En gene al, la cuan i icación ela i a
p opo ciona in o mación su icien e y es más ácil de desa olla . Sin emba go,
cuando se ealiza el seguimien o del p og eso de una in ección, la cuan i icación
absolu a es ú il pa a exp esa los esul ados en unidades, que son comunes an o
pa a los cien í icos como pa a los clínicos en di e en es pla a o mas. La
cuan i icación absolu a ambién puede se necesa ia cuando al an mues as con
una e apa conocida de la in ección pa a demos a cambios en los ni eles de
i us, cuando no hay disponibles eac i os de e e encia es anda izados
adecuadamen e, o cuando se usa la ca ga i al pa a di e encia la in ección ac i a
en e a la pe sis en e ( Mackay e al., 2002). Se han publicado muchos p o ocolos
de qPCR en iempo eal pa a la de ección de en e medades mic obianas, y se
dispone de ki s come ciales pa a a ios i us humanos clínicamen e impo an es
(Ra cli e al., 2007). En diagnós icos e e ina ios, y más especí icamen e en
i ología de peces, es a écnica se ha implemen ado con éxi o pa a de ec a y
cuan i ica a ios pa ógenos i ales, incluyendo (en sus siglas en Inglés): VHSV
(Ga e e al., 2011; Jons up e al., 2013), IHNV (O e u e al., 2001; Pu cell
e al., 2013), ISAV (Snow e al., 2006; Wo kenhe e al., 2008), o IPNV (Bowe s
e al., 2008; Calleja e al., 2012). Sin emba go, oda ía al an es ánda es alidados
Resumen
134
adecuadamen e pa a se implemen ados en la cuan i icación de i us de peces.
Los ki s come ciales gene almen e se alidan u ilizando una g an coho e de
mues as clínicas. El desa ollo de ensayos in e nos se puede log a si se
implemen a un p ocedimien o de alidación es uc u ado ap opiadamen e
(Ra cli e al., 2007).
Hoy en día, la PCR cuan i a i a es á eemplazando a o os mé odos
adicionales po que p opo ciona in o mación adicional sob e la ca ga i al, lo
cual es impo an e pa a ene una mejo comp ensión del ni el de eplicación del
i us y de la e apa de la in ección y su ni el de iesgo. El p incipal p oblema
adica en la g an di e sidad del i us de nec osis panc eá ica in ecciosa, que
puede comp ome e la iabilidad del diagnós ico. Como pa e de es a esis
doc o al, hemos diseñado un p ocedimien o RT-qPCR pa a el diagnós ico y la
cuan i icación de IPNV basado en un único pa de cebado es di igidos al
segmen o B del genoma del i us. El p ocedimien o ha sido alidado, in i o e in
i o, p obando dos ipos di e en es de es ánda es en e a sie e geno ipos de
e e encia y 23 aislados de campo de di e en es geno ipos.
El p o ocolo p esen ado en el Capí ulo 3 es ap opiado pa a la de ección
de cualquie geno ipo del i us IPNV, con un lími e de de ección de 31
TCID50/mL, 50 p u/mL o 66 copias de RNA/mL, según el es ánda con que
se ealice la cuan i icación. Todas las cu as es ánda mos a on una al a
iabilidad (R2> 0,95). Los esul ados p esen ados en el capí ulo 3 espaldan la al a
iabilidad de es e nue o p o ocolo pa a el diagnós ico y cuan i icación de IPNV.
CAPÍTULO 4: Ci ome ía de lujo cuan i a i a pa a medi la
p oducción i al u ilizando el i us de la nec osis panc eá ica
in ecciosa como modelo: un es udio p elimina .
Los p ocedimien os clásicos pa a la cuan i icación de i us, basados en
la medición de la in ec i idad desc i os en de alle en el Capí ulo 1 de es a esis
(ensayo in ec i idad y cuan i icación de placas), equie en que en el cul i o de
células suscep ibles se desa olle un e ec o ci opá ico isible (CPE , en sus síglas
en Inglés). Como consecuencia, esos p ocedimien os equie en en e 3 y 12 días,
dependiendo del i us que se es é analizando y del ni el eque ido de e aluación
del CPE; Po lo an o, se conside a que, has a ob ene un esul ado inal
median e ambos ipos de cuan i icación, es necesa io in e i mucho iempo.
Además, algunas células no p oducen CPE isible, y algunas no admi en la
o mación de placa. Po ejemplo, algunos aislamien os clínicos de cie os i us
como la ieb e ama illa pueden se más di íciles de cuan i ica po que no
p o ocan la o mación de placa o no inducen un CPE medible. Se han obse ado
p oblemas simila es con o os la i i us como el i us del dengue, ya que los
aislamien os clínicos a menudo no inducen e ec o ci opá ico, ni o man placas
(Hamma lund e al., 2012, Li e al., 2011). Pa a supe a es as limi aciones, se han
desa ollado algunas al e na i as a los mé odos adicionales.
Diego Vázquez Rod íguez
135
Algunas de las es a egias se basan en la e aluación de la p oducción
i al median e la de ección ela i a y la cuan i icación de an ígenos o p o eínas
i ales especí icas. Es e alo pod ía co elaciona se con la ca ga i al, sin
emba go, no p opo ciona la concen ación ac ual de pa ículas i ales
in ecciosas, ya que la p esencia de algunos an ígenos lib es o p o eínas disociadas
pod ía a ec a la medición.
La ci ome ía de lujo (FCM) se basa en la medición de las ca ac e ís icas
ísicas y / o químicas de las células mien as pasan a a és de un apa a o de
medición en una sola ila en una co ien e de luido (Shapi o, 2003). Mcsha y
e isó a ondo los usos de la ci ome ía de lujo en i ología en 1994 y 2000. La
cuan i icación del i us median e ci ome ía de lujo ha e olucionado
eno memen e debido a las mejo as en la ecnología. Los p o ocolos de
cuan i icación i al usando ci ome ía de lujo publicados en los úl imos años,
pueden clasi ica se en dos g upos p incipalmen e: po un lado, la cuan i icación
di ec a de i us en solución usando inciones luo escen es y, po o o, las
es a egias basadas en la de ección y cuan i icación de an ígenos o p o eínas
i ales en células o ejidos, u ilizando écnicas de inmuno luo escencia.
La es a egia desc i a en el Capí ulo 4 se conoce como ci ome ía de lujo
cuan i a i o (qFCM en sus siglas en inglés). Se ha econocido que la in ensidad
de la señal luo escen e es p opo cional a la can idad de an icue po unido po
célula y, po lo an o, es á elacionada con la can idad de an ígeno exp esados.
Es a elación hace que la ci ome ía de lujo, al menos eó icamen e, sea capaz
de cuan i ica la exp esión del an ígeno en é minos de moléculas po célula
(Mahe y Fle che , 2005). Liu y colabo ado es en 1997 demos a on la u ilidad
del análisis median e ci ome ía de lujo cuan i a i a de CD38 como ma cado
p onós ico en la in ección po VIH. Aunque se han desa ollado muchos
mé odos pa a es anda iza las mediciones de QFCM, los más áciles son aquellos
que u ilizan es ánda es basados en mic oes e as luo escen es (Mahe y Fle che ,
2005). El uso del es ánda de luo escencia p opo ciona la cla e pa a con e i
unidades de in ensidad ela i a a bi a ias en unidades de luo escencia
cuan i a i as es ánda , in o mando moléculas cuan i a i as de equi alencias de
luo oc omo soluble (MESF, po sus siglas en Inglés) e incluso núme os de
an icue pos unidos a la célula (capacidad de unión del an icue po; ABC)
(Schwa z e al. al., 1998). Como ejemplo, la de ección cuan i a i a de la in ección
po el i us de la in luenza equina en las pa ículas calib adas de células MDCK
median e la ans o mación de in ensidades de luo escencia a bi a ias en las
unidades es anda izadas MESF, pe mi e compa aciones de las in ensidades de
señal no solo den o de las mues as eñidas en un g upo sino ambién den o de
di e en es g upos de inción.
Hemos diseñado un es udio p elimina pa a e alua la iabilidad de
qFCM pa a es udia la eplicación i al, u ilizando IPNV como modelo. Además,
hemos adap ado la me odología FACS desc i a po H a in y colabo ado es en
Resumen
136
2014 pa a la cuan i icación de la eplicación i al en las células clasi icadas
posi i as.
En el capí ulo 4 an es de e alua el uso de qFCM pa a la cuan i icación
de componen es i ales, p ime o ealizamos unas p uebas p elimina es del
p o ocolo pa a ga an iza su iabilidad y endimien o pa a disc imina en e las
concen aciones i ales, y hemos con i mado la co elación en e las dosis i ales
(MOI) y luo escencia (MFI), y en e es os y el núme o de copias de ARN en las
células posi i as.
Pa a ello hemos usado mic oes e as con una emisión de luo escencia
conocida (que se usan como e e encia pa a ans o ma las unidades de
luo escencia a bi a ias en MESF), y se demos ó que son iables basándonos
en los alo es de CV po debajo del 10%, en odos los casos, y en los alo es de
co elación signi ica i os (R2> 0,99).
El mé odo ue p obado en el capí ulo 4 pa a es udia la eplicación i al.
Pa a es e p opósi o, se es udió la ciné ica de exp esión de la p o eína VP2 du an e
las p ime as 24 h de la in ección po IPNV analizando MFI a pa i de e en os
de ec ados FITC +. Pa a es udia la p oducción de ARN i al, se aplicó el
mé odo MARIS desc i o po H a in e al. (2014)
Los esul ados e ela on e idencia de la in e nalización de las pa ículas
de IPNV, ya que las células analizadas jus o después de la adso ción mos a on
un aumen o de luo escencia con espec o a las células in ec adas simuladas.
Luego, se obse ó un pico impo an e de p oducción de VP2 a las 12 h pos
in ección (p.i). Cu iosamen e, es e pico en la p oducción de VP2 coincide
cla amen e con el de la p oducción de ARN, y debemos des aca que los
cebado es de PCR ue on diseñados pa a la secuencia de VP2.
Espinoza y colabo ado es publica on p e iamen e esul ados simila es
usando mic oscopía de luo escencia y an icue pos monoclonales con a VP2 en
el año 2000, quienes obse a on una al a acumulación de g andes g upos
es é icos de p o eínas VP2 en una ubicación pe inuclea , apa ecie on señales
ue es a las 8 h p.i. Sin emba go, el esul ado más impo an e de es e ensayo ue
el hecho de que hemos demos ado que los da os de qPCR se co elaciona on
signi ica i amen e (R2 = 0.9514) con la p oducción de ARN (secuencia VP2).
El p o ocolo desc i o en el capí ulo 4 ha demos ado se epe ible y ep oducible
a un ni el acep able, aunque pa a ga an iza la ep oducibilidad, el uso de un
es ánda en cada análisis es ine i able. Respec o a su uso pa a la cuan i icación
i al, se obse ó una elación di ec a (po una eg esión polinómica de segundo
g ado) en e los í ulos í icos y las Moléculas de Fluo oc omo Soluble
Equi alen e (MESF). Los esul ados apoyan el uso de es a ecnología, no solo
pa a cuan i icación de i us, sino ambién pa a es udia la eplicación i al desde
un en oque cuan i a i o.

Diego Vázquez Rod íguez
137
Sin emba go, como ya se indicó p e iamen e en es e abajo, los
p o ocolos desc i os en es a esis se han e aluado pa a un conjun o especí ico de
células y i us. Po lo an o, el p ime pun o que debe íamos asumi como c ucial
es que, si es a me odología desea aplicase en o o ámbi o, la ecuali icación
debe ía ex ende se a o os i us y / o líneas celula es pa a cub i la mayo ía de
las necesidades en in es igación y diagnós ico de i us.
CAPÍTULO 5: Un nue o p ocedimien o de cuan i icación de
i us basado en análisis de ci ome ía de mic o lujo
O o en oque u ilizado pa a la cuan i icación de la ca ga i al en una
mues a dada es, median e la inción de inmuno luo escencia de an ígenos i ales
o p o eínas exp esadas en las células in ec adas, es ablece una co elación en e
la concen ación de an ígeno o p o eína i al medida, y la concen ación eal de
i us. A es e espec o, se ha demos ado una al a co elación en e el po cen aje
de células in ec adas y la ca ga i al de una mues a (D ayman e al., 2010;
G igo o e al., 2011; Lonsdale e al., 2003). No malmen e, las i ulaciones se
ealizan sob e células de cul i o in ec adas con una mues a i al diluida en se ie.
Luego, las células in ec adas se incuban con an icue pos policlonales o
monoclonales con a algún an ígeno i al, exp esado ex a o in acelula men e.
Es os an icue pos pueden ma ca se con algún colo an e luo escen e o pueden
de ec a se indi ec amen e po un an icue po secunda io ma cado luo escen e
(McSha y, 2000). Finalmen e, los í ulos ob enidos se exp esan gene almen e
como unidades in ecciosas luo escen es po mL de solución, unidades
in ecciosas / mL o células in ec adas / mL. Los de alles ma emá icos de los
di e en es ensayos publicados has a la echa es án ue a del alcance de es a
e isión, pe o en gene al: el í ulo se calcula median e la ó mula T = [% de
células posi i as] x [núme o de células in ec adas] / [ olumen de in ección]
mues a de i us]. La ep oducibilidad del mé odo, de e minada a pa i del CV
(como po cen aje), se ha demos ado en e el 7% y el 31% (Hamma lund e al.,
2012; Roldão e al., 2009). El ensayo FCM solo se puede u iliza con mues as
con un í ulo supe io a 1x104 unidades in ecciosas / ml (G igo o e al., 2011;
Lambe h e al., 2005) o 5x103 p u / mL (Ga es e al., 2009). Es a es una limi ación
del ensayo FCM en compa ación con el ensayo de placa, que es más sensible
(Lambe h e al., 2005).
Aunque debido a la apidez de análisis y iabilidad, la i ulación po
ci ome ía de lujo se puede con e i en una al e na i a ápida y e icien e a los
ensayos de in ec i idad como el análisis de placa o TCID50, el cos e del equipo y
los eac i os, sumado a la necesidad de pe sonal al amen e capaci ado, di icul an
la gene alización de es a ecnología. Recien emen e, los disposi i os in eg ados
“Lab-on-a-chip” han lle ado a cabo la minia u ización de es e equipo, con i iendo
la ci ome ía de lujo en una al e na i a asequible y ácil de usa , en compa ación
Resumen
138
a los ci óme os adicionales. En el p esen e es udio, hemos diseñado un
p ocedimien o de ci ome ía de mic o lujo (µFC) pa a la cuan i icación de i us,
u ilizando el i us de la nec osis panc eá ica in ecciosa (IPNV) como modelo. La
op imización de las condiciones y la alidación del mé odo se in o man en de alle
en el Capí ulo 5 de es a esis.
La iabilidad del p o ocolo desc i o en el capí ulo 5 ha quedado
demos ada po la al a epe ibilidad y ep oducibilidad, ya que los alo es de
coe icien e de a iación obse ados siemp e ue on in e io es al 10%. De hecho,
aunque los esul ados ob enidos po el ope ado más expe imen ado pa ecen
p opo ciona la mayo epe ibilidad y ep oducibilidad, los ob enidos po
écnicos con poca expe iencia ue on lo su icien e p ecisos como pa a se
conside ados iables. Además, la ecuencia de los alsos posi i os (es deci , la
sob ees imación del í ulo i al debido a la de ección de i us no in eccioso) se
ha desca ado cla amen e po que la mues a i al inac i ada se cuan i icó con
í ulos y po cen ajes ex emadamen e bajos de células in ec adas, como se
espe aba. Finalmen e, el p ocedimien o se e aluó con a ias mues as de
di e en es ipos y í ulos de IPNV, y los esul ados demos a on que los alo es
p opo cionados po el p ocedimien o µFC es án al amen e co elacionados con
los de los ensayos adicionales de dilución y placa.
CAPÍTULO 6: Discusión Final y Conclusiones
Debido a la aplicabilidad y la iabilidad de los mé odos p esen ados en
líneas an e io es, es udios de alidación adicionales pod ían de i a se de es a
esis. Se ecomienda e alua la obus ez de los p o ocolos en un ensayo de
colabo ación con o os labo a o ios y p opo ciona á in o mación aliosa sob e
el endimien o de los mé odos elacionados con la de ección y cuan i icación de
o os i us. Además, se ía alioso inclui un análisis y e aluaciones compa a i as
con el núme o de pa ículas ob enidas pa a un í ulo de inido.
Como se indicó an e io men e (Heide y Me zne , 2014; Roldão e al., 2009), no
es posible de ini una écnica única pa a la cuan i icación de la ca ga de i us que
se adap e a odos los i us y que se espe e ob ene la misma e iciencia y p ecisión
en odos de ellos. Po lo an o, un en oque gene al pa a la cuan i icación de la
ca ga de i us no es ac ible y se ecomienda segui un solo mé odo, comple a
una alidación cuidadosa de las condiciones pa a cada caso pa icula y e alua
los esul ados en e a un panel de es ánda es cali icado.
Las conclusiones de es a esis son las siguien es:
1- La impo ancia y singula idad del p o ocolo de RT-qPCR p opues o en es e
es udio pa a IPNV adica en que, po p ime a ez, se ha demos ado que un
mé odo basado en un solo pa de cebado es es iable no solo pa a el diagnós ico
Diego Vázquez Rod íguez
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de la mayo ía de los geno ipos de IPNV, sino ambién pa a la cuan i icación
simul ánea de la ca ga i al, an o ex i o como in i o.
Es e p o ocolo puede ayuda a simpli ica y educi d ás icamen e el cos o,
man eniendo la iabilidad, de los p og amas de igilancia y moni o ización, y de
cualquie es udio que equie a diagnós ico y cuan i icación de i us de ipo IPNV
sin la necesidad de un conocimien o p e io del ipo espe ado de IPNV p esen e
en la población.
2- Los esul ados del p esen e es udio espaldan el uso de la ci ome ía de lujo
en combinación con la ecnología qPCR, no solo pa a la cuan i icación de la asa
óp ima de in ec i idad del i us, sino ambién pa a es udia la eplicación i al
desde un en oque cuan i a i o
3- Nues os esul ados espaldan i memen e la p opues a del mé odo de mic o-
ci ome ía de lujo (µFC), como una al e na i a iable a los mé odos adicionales
de i ulación i al po que, incluso cuando se usan iempos de incubación de 24
h, la educción del iempo necesa io pa a cuan i ica la concen ación i al de
una mues a es incues ionable.
4- Con espec o a la aplicabilidad de las me odologías, i) µFCM debe ía usa se
pa a la i ulación i al cuando la cuan i icación ápida del i us ac i o es un
equisi o ine i able; ii) qPCR debe ía aplica se pa a la cuan i icación i al cuando
se necesi a el conocimien o del i us o al pe o el i us ac i o no es c ucial;
ambién es impo an e cuando se necesi a al a sensibilidad (po que se espe an
bajas ca gas i ales) y elocidad; iii) qFC y qPCR, combinados, se aconsejan en
es udios de eplicación i al, ya que ambos p opo cionan da os complemen a ios
(sín esis de p o eínas y ARN) pa a comp ende odo el ciclo i al.