Uso de Nanopartículas Magnéticas y Biología Molecular para la Mejora del Diagnóstico Microbiológico

TESIS DOCTORAL
USO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS Y BIOLOGÍA
MOLECULAR PARA LA
MEJORA DEL DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
José Ja ie Rod íguez Cal iño
Depa amen o de Mic obiología y Pa asi ología
SANTIAGO DE COMPOSTELA
2015
TESIS DOCTORAL
USO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS Y BIOLOGÍA
MOLECULAR PARA LA
MEJORA DEL DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
Fdo.:
JOSÉ JAVIER RODRÍGUEZ CALVIÑO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
SANTIAGO DE COMPOSTELA
2015
BENITO JOSÉ REGUEIRO GARCÍA, CATEDRÁTICO DEL DEPARTAMENTO
DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE
SANTIAGO DE COMPOSTELA
CERTIFICA: Que la p esen e Tesis i ulada: “Uso de Nanopa ículas Magné icas
y Biología Molecula pa a la Mejo a del Diagnós ico
Mic obiológico” ha sido ealizada, bajo mi di ección, po D. José
Ja ie Rod íguez Cal iño en el Depa amen o de Mic obiología y
Pa asi ología de la Uni e sidad de San iago de Compos ela y,
es imado que se encuen a inalizada, solici a sea admi ida a
ámi e pa a su lec u a y de ensa pública.
San iago de Compos ela, 2015
Fdo.: P o . D . Beni o José Reguei o Ga cía

Es e abajo ue inanciado en pa e po el Minis e io de Ciencia e Inno ación median e
una beca FPI (BES-2009-018631) asociada al p oyec o MAT2008-06503, y po el Fondo
de In es igaciones Sani a ias median e el p oyec o PI14/00620.
AGRADECIMIENTOS
Al D . Beni o Reguei o Ga cia po da me la opo unidad de ealiza es e abajo y po guia me y
ayuda me du an e su ealización.
Al D . An onio Aguile a Gui ao po ayuda me en mis p ime os pasos den o de un labo a o io.
Al D . Edua do Va ela Ledo po habe nos enseñado y apo ado an o a odos.
A odos los compañe os del Hospi al de Conxo, Ramoni a, El i a, Pila , C uz, Lo ena, po
apoya me y anima me siemp e.
A odos los esiden es con los que coincidí en su paso po el Se icio de Mic obiología, Ángeles,
Pa icia, Sand a, Ca los, Luz, Lucía, Gema, Miguel, Dani, Paloma, Gilbe o, Ja i, Isid o, Xana,
Jose, Rocío, Tama a y Alda a, po apoya me, anima me y odos los buenos a os que pasamos
jun os.
A mis compañe os Pablo, Olaia y Ca men, po las ho as de abajo conjun o ap endiendo unos de
o os.
A odos los écnicos y acul a i os del Se icio de Mic obiología, Ma isa, Fe nanda, Manoli,
Me cedes, Mª Te esa, Ca los, Pepe, Mónica, Luz, Lupe, Tiago, Maica, Te esa, po habe me
animado y apoyado odos es os años.
A mis amigos de la acul ad, Ja ie , An onio, Gonzalo, B uno, Raquel, Raqueli a, Ma ian, Raul,
po odas las ho as jun os que nos lle a on a donde es amos hoy.
A mis amigos, Albe o, Tania, Sil ia, Ja ie , Luis, Ma a, Luis Q, Ma ín, Ja ie E, po anos
años de isas y apoyo que siemp e lle a é conmigo.
A mis pad es, Manuel y Alicia, po cuida me y apoya me, y po que sin ellos nada de es o hab ía
sido posible.
A mis he manos, Lolo y Te e, po es a siemp e ahí, y a mi cuñado Jesús.
A Tania y a Sa a, que aún siendo las úl imas en llega a mi ida, me ayuda on más de lo que
imaginan en los úl imos pasos de es e abajo.
Muchas g acias a odos po es a a mi lado, po apoya me, po cuida me, po anima me, y po
odas las cosas impo an es que ap endí con oso os y que no pod ía encon a en ningún lib o.
1.6.1 Viabilidad: ele ancia clínica ..................................................................... 40
1.6.2 Colo an es i ales: Monoazida de E idio (EMA) y Monoazida de P opidio
(PMA) 42
1.6.3 PCR de iabilidad ( -PCR) ........................................................................ 44
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 51
3. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 57
3.1 Nanopa ículas y ex acción de ácidos nucleicos (adso ción inespecí ica) ....... 59
3.1.1 Valo ación inicial del endimien o con el sis ema come cial HAMILTON
kPCR (SIEMENS) .................................................................................................... 59
3.1.2 Nanopa ículas pa a la mejo a en la ex acción de ácidos nucleicos .......... 59
3.1.3 Medios de cul i o pa a el c ecimien o de bac e ias ans o madas ............ 62
3.1.4 Enzimas de es icción ................................................................................ 63
3.1.5 Ob ención de poblaciones es ánda de ácidos nucleicos ............................ 63
3.1.6 Medida de las concen aciones de ADN pa a calcula el endimien o de las
ex acciones .............................................................................................................. 65
3.1.7 Ensayos de ex acción de ácidos nucleicos usando nue as nanopa ículas 66
3.2 Diagnós ico mic obiológico del S haphylococcus au eus esis en e a me icilina
66
3.2.1 Sis ema Mic oscan Walkaway® Plus (Siemens)........................................ 68
3.2.2 Di usión con disco de ce oxi ina ................................................................ 68
3.2.3 BDMax™ MRSA Assay (Bec on Dickinson) ............................................ 69
3.2.4 Ligh Cycle ® MRSA Ad anced Tes (Roche) ........................................... 69
3.2.5 Sis ema Vi ek®2 (bioMé ieux) .................................................................. 69
3.2.6 P ueba de la coagulasa ................................................................................ 69
3.2.7 BDMax™ S aph SR (Bek on Dickinson) ................................................... 69
3.2.8 GenoType® MRSA (Hain Li escience) ..................................................... 70
3.2.9 Fluo oType® MRSA (Hain Li escience) ................................................... 70
3.2.10 Análisis de dis ancias genómicas (Di e silab™ S aphylococcus ki
(bioMe ieux)) ............................................................................................................ 70
3.2.11 Análisis de espec ome ía de masas MALDI-TOF (MALDI Bio ype
(BRUKER)) .............................................................................................................. 71
3.2.12 Tipado en base a la egión SCCmec ........................................................... 71

3.3 De ección de mic oo ganismos median e adso ción especí ica con
nanopa ículas ............................................................................................................... 71
3.3.1 Sis emas de de ección ................................................................................. 72
3.3.2 Cepas de e e encia y medios de cul i o .................................................... 72
3.3.3 Tipos de nanopa ículas .............................................................................. 73
3.3.4 P uebas de cap u a de mic oo ganismos ..................................................... 73
3.4 Mejo a de la de ección molecula (PCR de iabilidad) ..................................... 76
3.4.1 Esquema gene al del p o ocolo de a amien o con cispla ino en el es de
iabilidad .................................................................................................................. 76
3.4.2 Cepa de e e encia y p epa ación de la mues a ......................................... 77
3.4.3 Ex acción de ácidos nucleicos y de ección median e PCR a iempo eal . 77
3.4.4 Búsqueda de sus ancias ............................................................................... 78
3.4.5 P uebas con Monoazida de E idio (EMA) .................................................. 79
3.4.6 P ueba de con ol con ADN lib e a ado con cispla ino ............................ 80
3.4.7 Condiciones iniciales de abajo con cispla ino .......................................... 81
3.4.8 P uebas de a amien o con oxalipla ino ..................................................... 81
3.4.9 P o ocolo de a amien o con cispla ino usando cen i ugación ................. 81
3.4.10 Mezcla de bac e ias ías y mue as (VM) .................................................. 83
3.4.11 P o ocolo de a amien o con cispla ino en sang e usando cen i ugaciones
83
3.5 Nanopa ículas y iabilidad (Tes de iabilidad) ............................................... 84
3.5.1 Cap u a de bac e ias mue as ...................................................................... 84
3.5.2 Sis ema au omá ico usado en los ensayos con pa ículas ........................... 84
3.5.3 P o ocolo iabilidad en solución con las nanopa ículas de NANO MR ... 85
3.5.4 P o ocolo de iabilidad en solución con las nanopa ículas ApoH ............ 86
3.5.5 P o ocolo de iabilidad en sang e usando nanopa ículas .......................... 87
3.6 Ensayo sob e bac e ias mue as po a amien o an ibió ico .............................. 88
4. RESULTADOS ........................................................................................................ 91
4.1 Nanopa ículas y ex acción de ácidos nucleicos (adso ción inespecí ica) ....... 93
4.1.1 Valo ación inicial del endimien o con el sis ema come cial HAMILTON
kPCR (SIEMENS) .................................................................................................... 93
4.1.2 Valo ación de nue as nanopa ículas en el sis ema HAMILTON kPCR
(SIEMENS) ............................................................................................................... 93
4.1.3 Compa a i a con la medida de e e encia en el HAMILTON kPCR ......... 95
4.1.4 Funcionalización de las pa ículas .............................................................. 96
4.2 Diagnós ico mic obiológico del S haphylococcus au eus esis en e a me icilina
96
4.3 De ección de mic oo ganismos median e adso ción especí ica con
nanopa ículas ............................................................................................................. 101
4.3.1 P uebas de cap u a de mic oo ganismos: pa ículas NANO MR ............. 101
4.3.2 P uebas de Cap u a de mic oo ganismos: pa ículas ApoH ..................... 104
4.3.3 Recuen os en placa de las soluciones de abajo ...................................... 106
4.4 Mejo a de la de ección molecula (PCR de iabilidad) ................................... 107
4.4.1 P uebas con Monoazida de E idio (EMA) ................................................ 107
4.4.2 P ueba de con ol de cispla ino con ADN lib e ........................................ 109
4.4.3 Condiciones iniciales de abajo con cispla ino ........................................ 109
4.4.4 P ueba de iabilidad usando cen i ugaciones .......................................... 112
4.4.5 P ueba de iabilidad en sang e usando cen i ugaciones ......................... 114
4.4.6 P ueba de iabilidad con oxalipla ino ....................................................... 115
4.4.7 P uebas con o as sus ancias con e ec o ci os á ico .................................. 116
4.5 Nanopa ículas y iabilidad ( es de iabilidad) .............................................. 118
4.5.1 P ueba de cap u a de bac e ias mue as usando nanopa ículas ............... 118
4.5.2 P ueba de iabilidad en sang e usando nanopa ículas ............................. 118
4.6 Ensayo sob e bac e ias mue as po a amien o an ibió ico ............................ 121
5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 125
5.1 Diseño de nanopa ículas pa a la mejo a de la ex acción de ácidos nucleicos127
5.2 Diagnós ico mic obiológico del S aphylococcus au eus esis en e a me icilina
130
5.3 Uso de nanopa ículas magné icas pa a la cap u a de mic oo ganismos y
pos e io de ección ...................................................................................................... 132
5.4 Diseño de un p o ocolo de iabilidad pa a la de ección di e encial de
mic oo ganismos i os y mue os .............................................................................. 137
5.5 Aplicación del p o ocolo de iabilidad en sang e ............................................ 141
5.6 Aplicación del p o ocolo de iabilidad a pa i de sang e con bac e ias usando
nanopa ículas magné icas .......................................................................................... 142
5.7 P o ocolo de iabilidad sob e bac e ias mue as po a amien o an ibió ico .. 143
6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 147
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 153
1
1. INTRODUCCIÓN

2
3
1.1 LA NANOTECNOLOGÍA EN EL ÁMBITO CLÍNICO
Desde hace iempo, la in es igación y desa ollo en el campo de los nanoma e iales
ha cob ado impo ancia, en di e en es campos de aplicación; a medida que se iban
descub iendo nue as p opiedades de dis in os ma e iales a escala nanomé ica. Es e
campo de la nano ecnología ya es conside ado po muchos como la nue a “g an
e olución”, ya que es e sal o ecnológico, pa a con ola ma e iales a escala
nanomé ica, ha conducido en los úl imos 10-15 años al desa ollo de sis emas
nanomé icos, como las nanopa ículas. Además, se han encon ado aplicaciones pa a
es as en campos que aba can desde la elec ónica y la comunicación, pasando po la
óp ica, química, ene gía y, po supues o, la biología (1). Es o la ha hecho pasa de una
especialidad p opia de ísicos y químicos, a una inicia i a cien í ica y emp esa ial en
odo el mundo (2).
Cuando hablamos de nanociencia, nos es amos e i iendo al es udio de las
p opiedades de los obje os a un amaño nanomé ico, y al o denamien o de odo ese
conocimien o. En cambio, cuando hablamos de nano ecnología, nos es amos e i iendo a
la aplicación del conocimien o o ecido po la nanociencia pa a que, aplicando es as
nue as p opiedades conocidas, pode ob ene mejo as en p oduc os y ma e iales
exis en es, o bien, p opone o os o almen e nue os. Y si es e es udio y aplicaciones de
nue os ma e iales lo enma camos en el campo medico, es a íamos hablando de
nanomedicina (3).
La nano ecnología aba ca los ma e iales, apa a os y sis emas cuya unción y
es uc u a son ele an es a pequeñas escalas de amaño, en el ango de 1-100 nm. En es e
ango de amaños encon amos, po ejemplo, es uc u as biológicas básicas como el
ADN (diáme o de 2 nm) o las memb anas celula es (g oso de ~10 nm). Aquí, cabe
des aca la capacidad de cons ui naoes uc u as a i iciales de dimensiones
compa ables, como pueden se nanopo os de ~2 nm, nanocables ino gánicos de ~10 nm
o nanopa íclas es é icas de 10 a 100 nm de diáme o (4).
Lo in e esan e de es os ma e iales, es que an a p esen a p opiedades que no
apa ece ían ue a de es e amaño nanomé ico. Se sabe que, los elec ones de la supe icie
de los ma e iales, ienen un compo amien o di e en e al de los que se encuen an en su
in e io . Y a medida que un obje o disminuye más y más su amaño, la p opo ción de
á omos que con o man su supe icie an aumen ando. Es o, lo que hace es que ayan
omando una mayo ele ancia las p opiedades y compo amien o de esos á omos,
espec o a los si uados en el in e io . Es o se mani ies a en la apa ición de es as nue as
p opiedades de los ma e iales debido a que, muchas p opiedades eléc icas, magné icas u
óp icas, se an a e modi icadas a medida que a ía el amaño del obje o/ ma e ial (3).
Po eso, si se es capaz de con ola el amaño y la o ma de un nanoobje o, se an a pode
con ola sus p opiedades con una inalidad o in ención de e minada. Teniendo es o en
3
4
cuen a, se puede deci que el obje i o de la nano ecnología es con ola la o ma, el
amaño y el o den in e no de los nanoobje os y las nanoes uc u as, pa a modi ica a
olun ad sus p opiedades, con el obje i o de c ea sis emas con una uncionalidad o
u ilidad conc e a.
Las nanopa ículas pueden hace se de una amplia a iedad de ma e iales, como
me ales (o o, pla a), óxidos me álicos (dióxido de i anio (TiO2), dióxido de sílice
(SiO2)), ma e iales ino gánicos (nano ubos de ca bono, “quan um do s”), ma e iales
polimé icos y lípidos (2, 5), gene ando así una g an a iedad de nanopa ículas con
p opiedades di e sas. Es o, lo que nos p opo ciona, son dis in as aplicaciones uncionales
que pe mi en que se es é desa ollando una g an can idad de ecnología, con a iedad de
aplicaciones en di e sos campos, donde des aca su aplicación médica con ines
diagnós icos y e apéu icos (2, 6). En la Tabla 1 se mues an ejemplos de los p incipales
ipos de nanopa ículas que nos podemos encon a en base a su na u aleza. La aplicación
de es a nue a ecnología en el ámbi o de la asis encia sani a ia, la nanomedicina, sigue
expe imen ando un g an desa ollo. Es e le b inda un po encial p ome edo pa a
e oluciona los a amien os médicos y las e apias, en á eas como imagen, diagnós ico
ápido y egene ación isula . Pe o ambién o ece muchas posibilidades en impo an es
líneas de in es igación, como las cen adas en el uso de nanopa ículas pa a el
a amien o de en e medades como el cánce , HIV y diabe es, o como anspo ado es en
la adminis ación de á macos (1, 2). De es e modo, nos encon amos con ma e iales y
apa a os de dimensiones nanomé icas (1-100 nm) que ya es án ap obados pa a su uso
clínico, así como nume osos p oduc os que es án siendo e aluados en ensayos clínicos
(7). Es a ele ancia ganada po la nano ecnología en el campo médico, es debida a la
capacidad de p oduci ma e iales de amaño educido y con e ec os di igidos de o ma
especí ica. Es o se debe a que, con amaños que an de 100-10.000 eces más pequeños
que la célula humana, y con su mayo á ea supe icial ela i a espec o a su olumen,
es os ma e iales pueden in e ac ua ácilmen e con biomoléculas (como enzimas y
ecep o es), an o en la supe icie como en el in e io celula (6). Sin emba go, ambién
hay aspec os oxicológicos y cues iones é icas que acompañan a la nanomedicina, y que
pod ían ensomb ece el p ome edo u u o de es e campo eme gen e y ena su a ance
(1).
4
5
Tabla 1: P incipales ipos de nanopa ículas y sus aplicaciones. Tabla ex aída de e a Llina MC e al (8).
1.1.1 Nanopa ículas aplicadas al diagnós ico mic obiológico
En el ámbi o del diagnós ico mic obiológico, y más conc e amen e en el uso de
écnicas de biología molecula , un pun o de g an impo ancia es la ob ención de ácidos
nucleicos a pa i de una g an di e sidad de mues as clínicas. Es as pueden se de
Nanopa ículas
o gánicas
Nanopa ículas
polimé icas
U ilizadas en aplicaciones médicas. No obs an e, p esen an una
biodis ibución no especí ica y una baja capacidad de ca ga.
Dend íme os
Mac omoléculas de inidas, que p esen an una es uc u a
al amen e ami icada o mada po un núcleo y múl iples amas.
Su es uc u a molecula les pe mi e ca ga di e en es agen es
ac i os.
Liposomas
Nanosis emas es é icos o mados po una bicapa lipídica que
pe mi en la encapsulación de á macos hid o ílicos e
hid o óbicos. A pesa de es a ampliamen e es udiados, una de
sus p incipales des en ajas es su ápida eliminación.
Micelas
Ag egados coloidales de moléculas am i ílicas. Las micelas
es án o madas po una pa e
in e na hid o óbica y una ex e na
hid o ilia que pe mi e la in e nalización de á macos de
ca ác e
apola pa a su ehiculización.
Nanopa ículas
ino gánicas
Nanopa ículas
de sílice
Las nanopa ículas de sílice son ine es, biodeg adables y
p
esen an una buena biodis ibución.
Son ácilmen e
sin e izables y se pueden ob ene de dis in a o ma y amaño.
Nanopa ículas
de o o
Nanopa ículas me álicas que p esen an unas p opiedades
óp
icas y elec ónicas que
dependen o almen e de su o ma y
amaño. No p esen an oxicidad in ínseca. Además
son
ácilmen e uncionalizables median e la o mación de puen es
Au-SR.
Nanopa ículas
de óxido de
hie o
Nanopa ículas de oxido de hie o, ípicamen e de magne i a
(Fe3O4), biocompa ibles y
ácilmen e biodeg adables. Tienen
g an po encial en biomedicina dada su capacidad
in ínseca de
se moni o izadas
in i o
po écnicas de esonancia magné ica
nuclea .
Quan um do s
(QD)
Nanopa ículas ac i as que se u ilizan gene almen e como
sondas pa a imagen, ya que
p esen an ele ados endimien os
cuán icos de luo escencia, ele ada o oes abilidad y
una
emisión luo escen e que puede se a iable median e el amaño.
Sin emba go, los
QD no son biodeg
adables ni biocompa ibles
con el o ganismo, lo que es inge bas an e
su uso en
aplicaciones médicas.
Nano ubos de
ca bono
Monocapas de g a eno en olladas en o ma de cilind os.
P esen an una ele ada supe icie
especí ica que pe mi e ancla
una amplia a iedad de moléculas e apéu icas.
5
12
1.1.2.3 Sepa ación magné ica (pu i icación po a inidad)
Cuando hablamos de un elemen o u ilizando el é mino magné ico, nos es amos
e i iendo a que es e ob iene un momen o magné ico cuando se si úa bajo la in luencia de
un campo magné ico. Lo que es o signi ica es que, pa ículas que engan es a
ca ac e í ica, an a pode se ecupe adas de un medio si se aplica un campo magné ico,
como po ejemplo un imán. Se a a de un mé odo ápido, simple y e icien e de ecupe a
las pa ículas después de la unión del ácido nucleico o as el paso de elución. En es e
caso, la pu i icación se basa en la unión po a inidad de los ácidos nucleicos a la
supe icie de nanopa ículas magné icas (unión selec i a a las pa ículas magné icas),
no malmen e ecubie as en su supe icie con sílice. Median e el uso de un imán, se
pueden e ene es as pa ículas con los ácidos nucleicos unidos du an e los dis in os pasos
de la ado, pa a inalmen e libe a los en condiciones de baja salinidad y que puedan se
ecupe ados. Pod íamos deci que se a a de una écnica en ase sólida que simpli ica la
pu i icación ya que, con un simple paso de sepa ación magné ica, se pueden emplaza
los múl iples pasos de cen i ugación, ex acciones con sol en es o gánicos y los pasos
de sepa ación de ases de los mé odos con encionales. Además, o ece la en aja de la
ácil au oma ización del p oceso, minimizando los iesgos de con aminación y
deg adación habi uales en los mé odos manuales.
1.1.3 Nanopa ículas supe pa amagné icas
Debido a sus ue es p opiedades magné icas y baja oxicidad, la aplicación de las
nanopa ículas en bio ecnología y en medicina ha ido ganando in e és. Se sabe que, las
pa ículas magné icas po debajo de ap oximadamen e 30 nm, an a ene la p opiedad
del supe pa amagne ismo. En es e pun o, pod íamos deci que es as pa ículas no son
ealmen e magné icas, si no supe pa amagné icas. Lo que es o signi ica es que solamen e
an a p esen a magne ismo cuando sean some idas a un campo magné ico, como el
gene ado po un imán (21). Es a p opiedad pe mi e que las pa ículas puedan es a de
o ma dispe sa en solución, sin la o mación de ag egados magné icos (22-24). De es e
modo, se p e iene la o mación de aglome ados y se consigue la ácil dispe sión de las
pa ículas. Po o o lado, es o nos a a pe mi i una espues a muy ápida de las pa ículas
magné icas en e a un campo magné ico, pudiendo se adso bidas de una suspensión en
cues ión de segundos (<10 seg), y dejando un sob enadan e cla o que puede se
ácilmen e e i ado. Un ejemplo de es a sepa ación aplicada a la ex acción y pu i icación
de ADN se mues a en la Figu a 1. Pe o el uso de pa ículas magné icas nos p esen a más
en ajas a la ho a de aplica las en biosepa ación, ya que pueden se u ilizadas con
mues as de un amplio ango de olúmenes (25-29). Es o nos pe mi e sol en a cie os
p oblemas, como el ene mues as con un olumen limi ado, o el se capaces de
concen a los anali os p esen es en baja can idad a pa i de g andes olúmenes de
mues a. Al mismo iempo, nos pe mi e elimina los con aminan es e inhibido es que
12

13
puedan es a p esen es. Además, es os p ocesos basados en el magne ismo ambién
ienen la en aja de se ap os pa a la au oma ización, lo que a a pe mi i minimiza la
manipulación y el iempo empleado en odo el p oceso, p opo cionándonos así una
mayo ep oducibilidad de los esul ados y su uso análisis a g an escala.
Una de las p incipales biomoléculas que es suscep ible de se analizada es el ADN (y
ácidos nucleicos en gene al). Ya sea en el es udio o el diagnós ico de mic oo ganismo, o
bien en la gené ica, una de las p incipales necesidades es la ob ención de los ácidos
nucleicos con la mayo can idad y la mejo calidad posible. Es o debe log a se a pa i de
múl iples y complejas mues as, muchas de ellas compues as po g an can idad de
elemen os, los cuales deben se eliminados pa a pode ealiza los p ocesos pos e io es.
El ADN es una molécula polianiónica debido a la p esencia de g upos os a o, po lo que
puede se cap u ada po supe icies con g upos ca gados posi i amen e (30, 31). El uso
de nue as es a egias pa a la ecupe ación de los ácidos nucleicos su ge pa a sus i ui a
los la gos y complicados mé odos adicionales, basados en el uso e enol/clo o o mo,
pasando al uso de écnicas basadas en al adso ción pa a lle a a cabo la pu i icación del
ADN/ARN. En e los sopo es más usados pa a consegui es a adso ción nos
encon amos pa ículas basadas en sílice (32, 33), ib as de id io (34), sopo es de
in e cambio iónico (35-37) y pa ículas magné icas modi icadas (38-41).
Pa a ealiza es a sepa ación se necesi an ma e iales que engan una ele ada á ea
supe icial, ya que de es e modo se consiguen pa ículas con una ele ada capacidad de
unión. Así, nos amos a encon a p incipalmen e con pa ículas es é icas (15). Las más
comunes son las pa ículas de magne i a /óxido de hie o (Fe3O4), pe o aunque es as
pa ículas desnudas ienen la capacidad de uni se al ADN, su á ea o al disponible pa a la
adso ción se a a e educida debido a la o mación de ag egados debido a las ue zas
de a acción en e las pa ículas (15). Po eso, la es a egia que se lle a a cabo se basa en
la modi icación de la supe icie con políme os de dis in a na u aleza o con g upos
eac i os, con el in de minimiza las in e acciones en e pa ículas y a o ece la unión
al ADN. Po ejemplo, el cub i es as pa ículas con una capa de sílice las hace
biocompa ibles, educiendo su oxicidad y e i ando su deg adación. Además, es a
cubie a a a pe mi i la adso ción de los ácidos nucleicos de o ma di ec a o po el
anclaje en su supe icie de g upos eac i os especí icos. O as es a egias incluyen la
modi icación de la pa ícula usando dis in as sus ancias po ado as de g upos eac i os
como pueden se el polie ilen glicol (PEG) (42), compues os amino silano (43),
alkoxisilanos (44, 45) o polie ilenamina (46, 47).
13
14
Figu a 1: Esquema de la ex acción de ácidos nucleicos usando pa ículas magné icas pa a su ecupe ación
usando un imán (15).
1.1.4 Au oma ización de los sis emas de ex acción de ácidos nucleicos
Hay muchas des en ajas en el uso de los mé odos manuales de ex acción, en e los
que es án la g an can idad de abajo manual, la necesidad de pe sonal especialmen e
en enado pa a ealiza la ex acción, endimien o limi ado, y a iabilidad in e pe sonal
en la e icacia de la ex acción. En es e sen ido, la apa ición de sis emas au omá icos pa a
la ex acción de ácidos nucleicos a pa i de mues as clínicas supone una mejo a en los
es molecula es, ya que an a sol en a los p oblemas que p esen a la ex acción manual
(9). El uso de es as pla a o mas au omá icas de ex acción supone una mejo a en la
capacidad de abajo en el labo a o io, mos ando esul ados al menos igual de buenos
que con los mé odos manuales, cuando se usan es molecula es pa a la de ección de
pa ógenos a pa i de mues as clínicas (48-58). El uso de es as pla a o mas au omá icas
supone el cambio de los mé odos adicionales, como la ex acción con enol-clo o o mo
o los mé odos basados en il os de ib a de id io, de di ícil au oma ización y uso con
g an núme o de mues as, po el uso de nanopa ículas magné icas acopladas a un
sis ema au oma izado. El uso de nanopa ículas magné icas nos pe mi e ob ene ácidos
nucleicos de mayo pu eza con una ecupe ación más cons an e que con el uso de il os
de ib a de id io, ya que el mo imien o de las pa ículas en los eac i os de ex acción
de ácidos nucleicos pe mi e una mayo e iciencia en la unión, la ados y elución.
Además, no es án suje as a la posible obs ucción de los il os, y no equie en p ocesos
de il ación a acío ni cen i ugación, haciendo muy ácil la pues a en ma cha de la
au oma ización. Pe o además de es as acilidades, el uso de las pa ículas magné icas
pe mi e la ecupe ación de los ácidos nucleicos en un pequeño olumen de elución con
una concen ación ela i amen e al a, lo que es ideal pa a pos e io es aplicaciones (59).
La implemen ación de es os sis emas implica el uso de nanopa ículas
supe pa amagné icas de óxido de hie o con una composición supe icial ap opiada, de
o ma que puedan se usadas en nume osas aplicaciones como mejo a en el con as e de
imágenes de esonancia magné ica, epa ación isula , inmunoensayos, de oxi icación de
luidos biológicos, hipe e mia, anspo e de á macos y sepa ación celula (60-69). Y
pa a que puedan se e ec i as en odas es as aplicaciones biomédicas, es necesa io que
es as nanopa ículas engan al os alo es de magne ización, amaño in e io a 100 nm y
una es echa dis ibución de amaños. Pe o ambién es impo an e la necesidad de
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15
cubie as de supe icie especiales, que ienen que se no óxicas y biocompa ibles,
además de pe mi i una dis ibución di igida de pa ículas en un á ea especí ica. De es e
modo, las pa ículas magné icas se pueden uni a á macos, p o eínas, enzimas,
an icue pos o nucleó idos, y pueden se di igidas a un ó gano, ejido o un umo usando
un campo magné ico ex e no (70). O ambién pueden se ecupe adas de un medio
complejo unidas a una biomolécula de in e és, como po ejemplo los ácidos nucleicos.
Pa a ello es c ucial la es abilización de las pa ículas de óxido de hie o, pudiendo así
ob ene e o luidos coloidales magné icos que sean es ables en e la ag egación, an o
en medios biológicos como bajo la acción de un campo magné ico.
El pode usa es as pa ículas pa a la sepa ación magné ica de ácidos nucleicos
p esen a múl iples en ajas en compa ación con el uso de o as écnicas (15):
1. Los ácidos nucleicos pueden se aislados di ec amen e a pa i de la mues a
di ec a sin p ocesa como pueden se sang e, ejidos, medios de cul i o, agua,
e c.
2. Las pa ículas son usadas en p ocesos en bloque, donde no hay g andes
es icciones espec o a los olúmenes de mues a.
3. Las pa ículas magné icas pueden se e i adas de un modo ela i amen e
ácil y selec i o, incluso a pa i de suspensiones iscosas.
4. La e iciencia de la sepa ación magné ica es a especialmen e adap ada pa a la
ex acción a g an escala.
5. Es a sepa ación si e como base pa a di e sos p ocesos au omá icos de bajo
y ele ado lujo de abajo, lo que pe mi e el aho o de iempo y dine o.
6. Se e i a el iesgo de con aminación c uzada de los mé odos adicionales.
1.2 SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
El con ol del amaño monodispe so es muy impo an e, ya que las p opiedades de
las nanoes uc u as (nanoc is ales) an a depende ue emen e de la dimensión de las
nanopa ículas.
La sín esis de nanopa ículas magné icas puede se lle ada a cabo po múl iples
p ocesos, como se indica á a con inuación. Pe o la sín esis de nanopa ículas
supe pa amagné icas es un p oceso complejo debido a su na u aleza coloidal (71). Po
eso hay a ios e os a consegui en esa sín esis. Po un lado, consegui de ini unas
condiciones expe imen ales que lle en a consegui una población monodispe sa de
pa ículas con un amaño adecuado; y po o o lado, consegui un p oceso ep oducible
que pueda se indus ializado, sin la necesidad de ningún p oceso complejo de
pu i icación como pueden se la ul acen i ugación (72), la c oma og a ía de exclusión
po amaños (73) o la il ación magné ica (67).
15
16
1.2.1 Cop ecipi ación
La cop ecipi ación química de sales de hie o es la écnica más comúnmen e
u ilizada pa a la sín esis de nanopa ículas de magne i a (74-78). Los óxidos de hie o,
an o Fe3O4 como γFe2O3, no malmen e son p epa ados po el en ejecimien o de una
mezcla es equiomé ica de sales e osas y é icas en medio acuoso.
La comple a p ecipi ación de Fe3O4 sucede a un pH en e 8 y 14, con una elación
2:1 (Fe3+/ Fe2+), y en un ambien e de no oxidación po oxígeno (79). Es a eacción de
o mación de magne i a se mues a en la Fó mula 1.
Fó mula 1: Reacción de o mación de magne i a po p ecipi ación de sales de hie o (71).
Pe o la magne i a Fe3O4 no es muy es able y es sensible a la oxidación,
ans o mándose en maghemi a (γFe2O3) en p esencia de oxígeno. Aunque ambién es án
implicadas en es a ans o mación a ias ans e encias de elec ones o iones
dependiendo del pH de la suspensión. Es a ans o mación es á ep esen ada en la
Fó mula 2.
Fó mula 2: Reacción de o mación de maghemi a po oxidación de la magne i a (71).
La p incipal en aja que iene el mé odo de la cop ecipi ación es que pe mi e la
sín esis de g an can idad de nanopa ículas. Pe o la con apa ida es que el con ol de la
dis ibución de amaño de pa ículas es limi ado, ya que los únicos ac o es que con olan
el c ecimien o de los c is ales son ac o es ciné icos. La cop ecipi ación implica dos
pasos (80-84). Po un lado, se lle a a cabo una pequeña explosión de nucleación cuando
las concen aciones de las especies alcanzan una supe sa u ación c í ica. Y es en onces
cuando se da un c ecimien o len o de los núcleos po di usión de los solu os a la
supe icie del c is al. Pa a que se p oduzcan nanopa ículas de óxido de hie o
monodispe sas, es as dos ases deben es a pe ec amen e sepa adas (85). Pa a ello, el
con ol del amaño de pa ículas monodispe sas se debe lle a a cabo, no malmen e,
du an e la e apa más emp ana de la nucleación. Es o es así po que el núme o inal de
pa ículas iene de e minado po el inal de la nucleación, y no a a cambia du an e la
ase de c ecimien o. Además, una g an a iedad de ac o es se pueden ajus a en la
sín esis de nanopa ículas de óxido de hie o pa a con ola el amaño, ca ac e ís icas
magné icas o p opiedades de supe icie (86-89).El amaño y la o ma de las
nanopa ículas puede se con olado con cie o éxi o ajus ando el pH, la ue za iónica, la
empe a u a, la na u aleza de las sales (pe clo a os, sul a os, ni aos) o la elación de
concen ación Fe2/ Fe3.
Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- → Fe3O4 + 4H20
Fe3O4+ 2H+ → γFe3O3 + Fe2+ + H20
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1.2.2 Reacciones en medios es ingidos
La idea de es e mé odo es el de usa nano eac o es sin é icos y biológicos pa a pode
c ea nanopa ículas de óxido de hie o de amaño bien de inido. Esos medios
es ingidos incluyen su ac an es an o é icos pa a c ea es uc u as micela es e e sas,
que o ma án esículas con nanopa ículas de óxido de hie o, si iendo así de sopo e
sólido pa a su o mación (90, 91). Es as moléculas su ac an es pueden gene a de o ma
espon ánea nanogo as de di e en es amaños, micelas (1-10 nm) o emulsiones agua-acei e
(10-100 nm) (92). En es as nanogo as, las soluciones acuosas de sales de hie o son
encapsuladas po una cubie a de su ac an e, lo que las sepa a de la solución o gánica
ci cundan e. Lo que implica es o es que, con es e sis ema, se pueden impone
es icciones ciné icas y e modinámicas en el p oceso de o mación de las pa ícuas.
Es os nano eac o es es abilizados po los su ac an es p opo cionan un con inamien o
que limi a la nucleación y el c ecimien o de la pa ícula. Po eso, la p incipal en aja de
es e mé odo es la a iedad de nanopa ículas que se pueden ob ene , conseguidas
a iando la na u aleza y can idad de su ac an e y cosu ac an e, la ase oleosa o las
condiciones de eacción.
1.2.3 Reacciones hid o e males y de al a empe a u a
Pa a la sín esis hid o e mal de nanopa ículas de óxido de hie o, las eacciones se
lle an a cabo en medios acuosos en eac o es o au ocla es, donde la p esión puede se
supe io a 2000 psi y la empe a u a puede es a po encima de 200 ºC. Exis en dos ías
pa a la o mación de e i as po medio de condiciones hid o e males: hid ólisis y
oxidación o neu alización de mezcla de hid óxidos me álicos (93).
Se e que, en es os p ocesos, el amaño de pa ícula de magne i a se inc emen a con
iempos p olongados de eacción, y que un mayo con enido en agua esul a en la
p ecipi ación de pa ículas de magne i a más g andes. En el p oceso hid o e mal, el
amaño de pa ícula en c is alización se con ola, p incipalmen e, median e la p opo ción
en e los p ocesos de nucleación y c ecimien o, ya que ambos compi en po las especies
(94).
La descomposición po al a empe a u a se lle a a cabo a pa i de p ecu so es
o gánicos de hie o (Fe(Cup)3, Fe(CO)5 ó Fe(acac)3) usando sol en es o gánicos y
su ac an es (95). Es e mé odo pe mi e ob ene nanopa ículas con un al o ni el de
monodispe sión y de con ol de amaño. El amaño y la mo ología de las nanopa ículas
pueden se egulados median e el con ol de los iempos de eacción y la empe a u a,
pe o ambién po la concen ación y p opo ciones de los eac i os, na u aleza del
sol en e, p ecu so es o ue zas de los complejos.
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18
1.2.4 Reacciones sol-gel
Es e p oceso se basa en la hid oxilación y condensación de p ecu so es molecula es
en solución, o iginando un “sol” de pa ículas nanomé icas. La pos e io condensación y
polime ización ino gánica lle an a la o mación de una ed idimensional del óxido de
me al denominada “gel húmedo” (96-98). Debido a que es as eacciones se ealizan a
empe a u a ambien e, se hace necesa io un a amien o é mico inal pa a alcanza un
es ado c is alino. Los p incipales pa áme os que in luencian la ciné ica, las eacciones de
c ecimien o, la hid ólisis, las eacciones de condensación, y po an o, la es uc u a y
p opiedades del gel, son: el sol en e, la empe a u a, la concen ación de los p ecu so es
salinos u ilizados, el pH y la agi ación (99-101). La p incipal en aja que o ece es e
mé odo es que se puede con ola adecuadamen e an o la es uc u a de las nanopa ículas
como sus amaños.
El p ocedimien o sin é ico puede op imiza se ácilmen e median e la inco po ación
de su ac an es a la ase de la disolución. De es a o ma se pueden con ola las e apas de
nucleación y c ecimien o c is alino, además de e i a la ag egación de las pa ículas
insolubles, dando como esul ado una dispe sión de nanopa ículas es abilizada. Sin
emba go, el uso de su ac an es puede modi ica la mo ología y la ca ga supe icial de
dichas nanopa ículas, a pesa de que la es uc u a c is alina no se ea a ec ada (102).
1.2.5 Mé odos poliol
Los p ocesos poliol (103) son una ap oximación química pa a la sín esis de nano y
mic opa ículas con o mas bien de inidas y amaños con olados (104-106). Los
sol en es como los polioles (ej, polie ilenglicol) ac úan como sol en es capaces de
disol e compues os ino gánicos, además de o ece un amplio ango ope a i o de
empe a u a (desde 25 ºC has a el pun o de ebullición) a la ho a de p epa a compues os
ino gánicos (107). Además, son muy ú iles como agen es educ o es, así como
es abilizado es pa a con ola el c ecimien o de las pa ículas y p e eni la ag egación.
En es e mé odo, un compues o p ecu so se suspende en un líquido poliol. La
suspensión es mo ida y calen ada a una cie a empe a u a, que puede alcanza el pun o
de ebullición del poliol. Du an e es a eacción, el me al p ecuso se solubiliza en el diol,
o ma un in e medio, y en onces es educido pa a o ma núcleos me álicos que
esul a án en pa ículas me álicas.
1.2.6 Sín esis po inyección en lujo
Es a écnica consis e en la mezcla con inua o segmen ada de eac i os bajo un
égimen de lujo lamina en un eac o capila . Algunas en ajas que p esen a son su al a
ep oducibilidad, una g an homogeneidad de mezcla y la posibilidad de un con ol
ex e no p eciso del p oceso (108).
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19
1.2.7 Mé odos elec oquímicos
La me odología consis e en la p oducción de iones en disolución, median e la
oxidación a co ien e o po encial con olado, de una lámina del mismo me al del que se
quie en gene a los iones me álicos. Es e mé odo se puede conside a como un mé odo de
cop ecipi ación con olado, debido a que la can idad de iones que se p oducen en la
disolución se gene an du an e el iempo de aplicación de la co ien e. El p oduc o inal es
ob enido po educción de los hid óxidos o mados. Con es e mé odo, se consigue un
con ol sob e el amaño de las pa ículas median e a iaciones en la densidad de co ien e
(109, 110).
1.2.8 Mé odos ae osol/ apo
Las ecnologías en ae osol, como son la pi olisis en esp ay y en lase , son
in e esan es po que son p ocesos químicos con inuos, lo que pe mi e una al a asa de
p oducción. En la pi olisis po esp ay, una solución de sales é icas y un agen e educ o
conjun amen e en un sol en e o gánico se pul e iza en una se ie de eac o es donde el
solu o del ae osol se condensa y el sol en e se e apo a (111). El esiduo seco esul an e
consis e en pa ículas cuyo amaño depende del amaño inicial de las go as o iginales. La
pi olisis po lase se puede usa pa a educi el olumen de eacción. El láse calien a una
mezcla gaseosa de p ecu so de hie o y una mezcla de gas, p oduciendo pequeñas
nanopa ículas de es echo amaño y no ag egadas.
1.2.9 Sonolisis
El óxido de hie o se puede p epa a median e la descomposición (po e molisis o
sonolisis) de p ecu so es o ganome álicos, y u ilizando políme os o agen es o gánicos de
e minación pa a limi a el c ecimien o de las nanopa ículas (112-114). Las
co espondien es nanopa ículas se ob ienen i adiando la disolución con ul asonidos de
al a in ensidad, bajo una a mós e a de a gón y empe a u a ambien e du an e al menos 3
h. La empe a u a an ele ada, gene ada po el ápido colapso de las ca idades o madas
po sonicación, pe mi e la con e sión de sales e osas en nanopa ículas magné icas. El
con ol sob e el amaño de las pa ículas se puede consegui cambiando el p ecu so
u ilizado o a iando la empe a u a.
1.3 ESTABILIZACIÓN DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS
La es abilización de pa ículas de óxido de hie o es c ucial pa a ob ene e o luidos
magné icos coloidales que sean es ables con a la ag egación, an o en medios biológicos
como bajo la ac uación de un campo magné ico. Además, a a impedi la apa ición de
cambios en su es uc u a o iginal, que lle a ían a la al e ación de sus p opiedades
magné icas, y e i ando ambién su ápida biodeg adación con la exposición a medios
19
20
biológicos. La es abilidad de una suspensión magné ica coloidal iene dada como
esul ado del equilib io en e ue zas de a acción y de epulsión. En eo ía, cua o ipos
de ue zas pueden con ibui al po encial in e pa ícula en el sis ema. Po un lado, nos
encon amos con las ue zas de an de Waals, que inducen a acciones iso ópicas
ue es de co a dis ancia. Apa ecen ambién las ue zas elec oes á icas de epulsión. La
desc ipción eó ica en e es as dos ue zas se conoce como la eo ía De jaguin- Landau-
Ve wey- O e beek (DLVO) (115, 116). Cuando a amos con suspensiones magné icas,
se añaden las ue zas magné icas dipola es en e dos pa ículas. Es as ue zas inducen
in e acciones aniso ópicas que pa ecen se globalmen e a ac i as. Y inalmen e,
enemos las ue zas es é icas de epulsión, que se deben ene en cuen a pa a pa ículas
no desnudas (117).
Teniendo es o en cuen a, la es abilización de pa ículas magné icas se puede
consegui jugando con una o ambas ue zas de epulsión: elec oes á ica y es é ica (118).
En la Figu a 2 se mues a un ejemplo g á ico de es as dos ue zas epulsi as.
Figu a 2: (a) Pa ículas es abilizadas po la capa elec oes á ica. (b) Pa ículas es abilizadas po epulsión
es é ica. (71).
De o ma habi ual, las nanopa ículas de óxido de hie o son cubie as con
mac omoléculas como el ácido poliac ílico (PAA) (119), dex ano (120) y
polie ilenamina (PEI) (121), o bien con cubie as ino gánicas como sílice (122),
ca bono (123) o me ales p eciosos (como o o o pla a) (124). Así, emos que se pueden
adop a dis in as es a egias pa a log a es a es abilización, basándonos en la na u aleza
de las dis in as sus ancias que se pueden u iliza en la p epa ación de es as
nanopa ículas (125).
1.3.1 Es abilizado es monomé icos
Las nanopa ículas de óxido de hie o pueden se cubie as con dis in os ma e iales
como son la sílice (126, 127) o el o o (128, 129). El uso de es as cubie as no solo
p opo cionan es abilidad a las nanopa ículas en solución, sino que ambién ayudan a la
unión de di e sos ligando biológicos a la supe icie de la nanopa ícula. Es as
nanopa ículas ienen un núcleo de óxido de hie o con una cubie a me álica ex e na de
ma e iales ino gánicos.
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1.3.1.1 Sílice
La sílice es un ma e ial que se ha usado ampliamen e como cubie a de
nanopa ículas magné icas (130-132). En gene al, una cubie a ine e de sílice en la
supe icie de nanopa ículas magné icas p e iene su ag egación en medio líquido, mejo a
su es abilidad química y p opo ciona una mejo p o ección en e a la oxicidad (133).
Es a es abilización de las pa ículas se lle a a cabo de dos o mas (134). Po un lado,
escudando la in e acción del dipolo magné ico con la capa de sílice. Po o a pa e, las
nanopa ículas de sílice es án ca gadas nega i amen e. De es e modo, la cubie a de sílice
aumen a la epulsión de coulomb de las nanopa ículas magné icas.
Hay es mé odos que se usan pa a gene a nanoes e as magné icas de sílice. El
p ime o de los mé odos se basa en el mé odo de S öbe (135). Con es e mé odo, la sílice
se o ma in si u median e la hid ólisis y condensación de un p ecu so sol-gel, como el
e ae oxio osilica o (TEOS) (136, 137).
El segundo mé odo se basa en la deposición de sílice a pa i de una solución ácida
silicídica (138,139). Algunos es udios de ienden que es e mé odo pa ece más e icien e,
cub iendo una mayo p opo ción de la supe icie de magne i a que el mé odo TEOS
(140).
El e ce mé odo es un mé odo basado en la o mación de emulsiones, en el que se
u ilizan micelas o micelas in e sas pa a con ina y limi a la cubie a de sílice. Es e
mé odo equie e un g an es ue zo a la ho a de sepa a la pa ícula cubie a de la g an
can idad de su ac an es asociados al sis ema de emulsión (141,142).
Una de las en ajas que o ece ene una supe icie en iquecida en sílice es la
p esencia de g upos silanol en supe icie, que pueden eacciona ácilmen e con a ios
agen es de unión pa a enlaza co alen emen e ligandos especí icos a esas nanopa ículas
magné icas (143, 144). Un ejemplo es la in oducción de g upos amino en la supe icie
de nanopa ículas magné icas cubie as de sílice median e la hid ólisis y condensación de
un o ganosilano como el aminop opil ie oxisilano (APTS ó APS). Es e mé odo se
conoce como silanización (145-147).
1.3.1.2 O o
El o o es una cubie a ino gánica muy ú il pa a implemen a la uncionalidad, así
como pa a mejo a la es abilidad de las nanopa ículas magné icas en dispe siones
acuosas (148). Es o se consigue g acias a dos p opiedades p incipales del o o, que son su
es abilidad química y su biocompa ibilidad (149). Cuando el o o se usa como cubie a de
las nanopa ículas magné icas, es a ac úa como una ba e a que p e iene la oxidación del
núcleo y la deg adación enzimá ica (150). Además, és a cubie a ex e io a a
p opo ciona una egión de unión pa a una pos e io uncionalización (151).
21
28
1.5.4 Va ian es de la PCR con encional
Una clasi icación ápida que se puede hace de la PCR es en base al ipo de ácido
nucleico que se usa como molde pa a la ampli icación. T adicionalmen e, la PCR
con encional e a una écnica que pe mi ía la ampli icación del ADN median e el uso de
una ADN polime asa ADN dependien e. Pe o a medida que se ue conociendo más sob e
los mecanismos de sín esis y eplicación de ácidos nucleicos, y con el descub imien o de
las ADN polime asas dependien es de ARN, se pudo lle a a cabo la ampli icación del
ma e ial gené ico de muchos o os mic oo ganismos. Como ejemplo, des aca una g an
can idad de i us con impo ancia clínica (Vi us de la Inmunode iciencia Humana (VIH),
Vi us de la Hepa i is C (VHC), g ipe, sa ampión, Vi us de la Hepa i is A (VHA).
Además, pe mi ió ambién el análisis de los ARN implicados en las dis in as u as
me abólicas, po ejemplo, en células euca io as. Es a a ian e de PCR se conoce como
PCR e e sa o PCR de e o ansc ipción (RT-PCR), ya que implica un p ime paso de
e o ansc ipción pa a pode gene a el ADN complemen a io (ADNc) de la molécula de
ARN de pa ida.
En base a es o, nos encon amos con más a ian es de la PCR en unción de los
p ime s que se usan, en base al uso de sondas pa a moni o iza la ampli icación o, po
ejemplo, en base a la es a egia de empe a u as usadas pa a consegui la co ec a
ampli icación de la diana deseada. Algunos de los ipos más usados son (189):
x mul iplex PCR: se basa en el uso, en la misma mezcla de eacción, de múl iples
pa es de p ime s pa a la ampli icación de a ias egiones diana dis in as al mismo
iempo. El núme o de pa es de p ime s que se an a pode inclui depende de las
condiciones de eacción, pe o sob e odo, de la ausencia de in e acciones en e los
p ime s indi iduales en la mezcla de eacción. Los cebado es usados son
lige amen e mayo es (23-28 nucleó idos) que los usados en la PCR es ánda con
una sola diana, y son seleccionados en base a una Tm simila y a un con enido
simila de guanosina/ ci osina (de al menos el 40%).
x PCR e e sa (PCR de e o ansc ipción): se basa en la o mación de ADNc a
pa i de ARN pa a pode lle a a cabo su ampli icación y análisis. Se usa, po
ejemplo, en la de ección y análisis de muchos i us (VIH, VHC).
x PCR con p ime s degene ados: los p ime s degene ados son una mezcla de
oligonucleó idos donde el núcleo de la secuencia es idén ica en odos. Pe o una o
más de las secuencias de los p ime s con iene cambios en uno o más nucleó idos,
en compa ación con el es o de p ime s p esen es en la mezcla. Es as mezclas se
diseñan pa a ampli ica la misma secuencia diana de ADN, pe o en la que se
espe an pequeños cambios nucleo ídicos en e di e en es aislados o indi iduos.
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x PCR a iempo eal (cuan i a i a o no): se basa en el uso se moléculas luo escen es
que se an a uni al ADN, pe mi iendo de ec a la ampli icación en cada ciclo a lo
la go de oda la eacción.
x Ho s a PCR: se basa en el uso de nue as DNA polime asas e moes ables, las
cuales equie en un mayo pe iodo de a amien o a al as empe a u as (po
ejemplo 95 ºC ± 8 minu os) pa a se ac i adas. Es o pe mi e p epa a la mezcla de
eacción al comple o sin el iesgo de la hib idación inespecí ica de los p ime s, ya
que la polime asa no es a á ac i a has a que la empe a u a es é po encima de la
empe a u a de hib idación. Es o pe mi e gene a mayo can idad de amplicones
especí icos, así como se menos sensible a la acción de inhibido es de la PCR.
x ouchdown PCR y ouch-up PCR: se a a de eacciones en las que la empe a u a
de hib idación, en una p ime a pa e de la PCR, a aumen ando o disminuyendo
( espec i amen e) has a llega a la Tm óp ima de los p ime s. El obje i o de es as
es a egias es la de aumen a al especi icidad de la eacción.
1.5.5 Análisis de los p oduc os de ampli icación de la PCR
El análisis de los p oduc os de ampli icación de la PCR (amplíme os o amplicones)
es un paso esencial a la ho a de pode de e mina an o la calidad (po ejemplo, la
p esencia o ausencia de amplicones no especí icos), como la can idad (en alo es
ela i os o exac os) del ácido nucleico diana que ha sido ampli icado. Es a de ección y
análisis se a a pode lle a a cabo as el p oceso de ampli icación, ue a de los ubos
donde se lle ó a cabo la PCR (análisis en geles de elec o o esis), o bien se puede lle a a
cabo en el mismo ubo de eacción du an e el p opio p oceso de eacción (PCR a iempo
eal). Es a de ección a iempo eal se comen a á en el pun o siguien e.
1.5.5.1 Análisis median e elec o o esis en gel
El mé odo más usado comúnmen e pa a es ablece la calidad y can idad de los
p oduc os de PCR, as inaliza la eacción, es la elec o o esis en gel de aga osa jun o
con el uso de agen es in e calan es del ADN pa a lle a a cabo la isualización (190).
Los geles de elec o o esis consis en en una ma iz po osa semisólida sob e la que se a a
ealiza una sepa ación en base al amaño. En unción de la concen ación usada, más
densa se á la ma iz del gel. Pa a consegui que nues as moléculas de ADN se desplacen
a lo la go del gel se an a usa dos elec odos, uno a cada ex emo del gel, gene ando una
di e encia de ca gas en e ambos polos. De es e modo, como la ca ga ne a global del
ADN es nega i a, se á a aído hacia el polo donde se gene an las ca gas posi i as
(ánodo), al mismo iempo que las ca gas gene adas en el polo nega i o (cá odo) lo
epelen. Así se consigue que las moléculas de ADN a a iesen el gel con una mo ilidad
que a a depende de su amaño. Aquellas de mayo amaño end án mayo di icul ad
pa a a a esa la ma iz po osa del gel, y po an o, se desplaza án más len amen e que
aquellas moléculas de meno amaño, que se mo e án más ápidamen e a a és de la
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ma iz del gel. De es e modo, se p oduce una mig ación di e encial de las moléculas de
ADN en unción a su amaño, que nos a a pe mi i sepa a las y di e encia las. Pe o pa a
pode isualiza el ADN en la elec o o esis se necesi a el uso de agen es in e calan es de
unión al ADN, siendo el b omu o de e idio el más usado. Lo que hace es in e cala se
en e los pa es de bases del ADN a lo la go de oda la molécula. En es e es ado de unión,
cuando es expues o a luz ul a iole a, emi e luo escencia. Así nos pe mi e la
isualización del ADN ampli icado en nues a PCR. Es e agen e in e calan e puede se
añadido di ec amen e al p epa a el gel, o bien puede some e se al gel as la
elec o o esis a un baño en una solución con b omu o de e idio. De ambos modos, lo que
se consigue es “ eñi ” el ADN pa a pe mi i su isualización. Además, en la
elec o o esis se usan ma cado es de peso molecula , o mados po agmen os de ADN
de amaño conocido. De es e modo, se puede calcula el amaño ap oximado de los
agmen os de ADN que que emos es udia . Pa a lle a a cabo la elec o o esis se usan
un ampón de elec o o esis con el que se cub e el gel y ambos polos, y que es el mismo
que se usa pa a disol e la aga osa a la ho a de p epa a el gel. El ipo de ampón usado
puede a ec a a la esolución de la sepa ación del ADN. El ampón TAE (T is-Ace a o-
EDTA) suele usa se pa a ob ene una mejo esolución con agmen os mayo es a 4
kilobases (kb). En cambio, el TBE (T is-Bo a o-EDTA) se suele usa pa a ob ene una
mejo esolución con agmen os que oscilan en e 0.1-3 kb. También in luye en la
mig ación la concen ación de aga osa, debido a la densidad de la ma iz que se o ma al
usa mayo o meno can idad en su p epa ación. La mayo ía de los geles de aga osa
u ilizados en biología molecula ienen una concen ación de aga osa que oscila en e 0.8
y 4 %, siendo los más ampliamen e usados los geles con una concen ación de 1% y 2%.
Es as ma ices del 1-2 % pe mi en la sepa ación de amplicones de PCR con amaños que
an desde los 100 pa es de bases has a las 10 kb. Sin emba go, la na u aleza de las
ma ices de aga osa no a a pe mi i la sepa ación de moléculas con un amaño de,
ap oximadamen e, menos de 15 nucleó idos. Además, como es os geles se uel en más
densos a mayo concen ación de aga osa, agmen os de unos 100 pa es de bases end án
di icul ad pa a a a esa la ma iz de geles con concen aciones del 4% o mayo es.
Una al e na i a al uso de los geles de aga osa, pe o usando exac amen e la misma
base de sepa ación, son los geles de poliac ilamida. Es os se ca ac e izan po ene un
mayo g ado de esolución a la ho a de sepa a amplicones de amaños simila es. Usando
ele adas concen aciones de ac ilamida, se pueden sepa a pequeños agmen os de ADN
y ARN que se di e encien en amaño solamen e en un nucleó ido.
1.5.6 PCR a Tiempo Real
La PCR en Tiempo Real es, básicamen e, una PCR con encional (o PCR a pun o
inal) en la que se a a pode moni o iza de o ma con inua, en cada ciclo, la
ampli icación. De es e modo, nos a a pe mi i la de ección a iempo eal. Así, se puede
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elimina el paso de de ección median e elec o o esis, que es necesa io pa a e la
o mación de los amplicones en la eacción. Pa a pode lle a a cabo es a de ección a
iempo eal se necesi a del uso unas moléculas, los luo ó o os, que emi i án
luo escencia du an e la eacción. Además, es necesa io el uso de e mociclado es que
lle an inco po ados lec o es de luo escencia, con lo que an a pode medi los ni eles de
es a en cualquie momen o de la eacción de ampli icación. Es o nos a a pe mi i medi
la can idad de ADN sin e izado en cada ciclo, ya que la emisión de luo escencia es
p opo cional al ADN o mado du an e la eacción. Así, el sis ema puede de ec a y
egis a en odo momen o la ciné ica de la eacción (191).
Una de las p incipales en ajas que p esen a la PCR a iempo eal es su mayo
sensibilidad. Además, la cuan i icación de la eacción no se hace en unción del p oduc o
inal (PCR con encional), ya que las a iaciones que se pueden encon a , debido a la
p opia na u aleza enzimá ica de la eacción, pueden se muy signi ica i as. Po eso, en la
PCR a iempo eal es a cuan i icación se ealiza en unción del denominado ciclo umb al
(Th eshold Cycle o C ). Es e se de ine como el ciclo a pa i del cual la luo escencia es
es adís icamen e signi ica i a supe io al uido de ondo (backg ound). Po an o, como
es e C se si úa al inicio de la eacción, no se a a e a ec ado po las a iaciones p opias
de la misma. En la Figu a 5 emos un ejemplo que explica es o, donde emos mues as
con can idad igual de ADN de pa ida con el mismo alo de C , pe o con a iaciones en
la can idad o al de ampli icado al inal de la eacción (pun o inal de la cu a) (192).
Figu a 5: Ejemplo de la ampli icación de es éplicas de la misma mues a donde se e el mismo alo de C ,
indicando el inicio de la ampli icación, pe o con un esul ado inal de la cu a de ampli icación di e en e.
Las p incipales p opiedades de es e pa áme o son:
x Como ya se indicó, nos a a de e mina el ciclo inicial de ampli icación,
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x Nos pe mi e sepa a los da os del uido de ondo,
xEs in e samen e p opo cional al núme o de copias inicial del la secuencia de ácido
nucleico diana. Es deci , a mayo can idad inicial de ácido nucleico, más bajo se á
el alo de C y ice e sa (Figu a 6).
x Se suele es ablece como 10 eces el uido de ondo.
Figu a 6: Ejemplo de la ampli icación de mues as con can idad de copias dec ecien es conocidas que nos
mues a la elación in e samen e p opo cional en e el alo del C y la can idad de pa ida de copias en una
mues a.
1.5.6.1 Mé odos de de ección y cuan i icación
Como ya comen amos, la de ección de la ampli icación en la PCR a iempo eal se
basa en la emisión y de ección de luo escencia du an e la eacción. Así, nos
encon amos que los sis emas de de ección po luo escencia empleados pueden se de
dos ipos: median e el uso de agen es in e calan es y median e el uso sondas especí icas.
Los agen es in e calan es son moléculas con a inidad pa a uni se al ADN de doble
cadena e in e cala se en e sus bases. Es os luo oc omos, además, an a e aumen ada
no ablemen e su emisión de luo escencia en es e es ado de unión. Es o nos a a pe mi i
la de ección de la ampli icación, ya que a medida que aumen en el núme o de copias,
aumen a á ambién la can idad de luo ó o o unido al ADN, y po an o, la can idad de
luo escencia en cada ciclo (193, 194). El más u ilizado es el SYBR G een I, que se
exci a a 497nm y emi e a 520nm. La des en aja de usa es os agen es in e calan es es que
se a a de un mé odo de de ección con una baja especi icidad. Es o se debe a que se an
uni de o ma indisc iminada a cualquie ADN de doble cadena p esen e en el ubo de
eacción, ya sea esul ado de una ampli icación inespecí ica o díme os de p ime s, algo
muy ecuen e en la PCR. Pa a ayuda a mejo a la especi icidad es necesa io el uso de
unas condiciones de eacción óp imas, así como una selección cuidadosa de los p ime s
pa a disminui el iesgo de o mación de díme os. Una es a egia ú il es la de inicia la
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eacción a empe a u as ele adas (ho -s a PCR), pa a disminui así de o ma no able el
iesgo de que se den ampli icaciones inespecí icas. Además, lo que se hace pa a
de e mina si las cu as de ampli icación co esponden a p oduc os especí icos de
ampli icación es de e mina la empe a u a de usión de los agmen os ampli icados.
Es o se lle a a cabo median e el análisis de una cu a de desna u alización (“mel ing
cu e”) al inal de la eacción. Es e análisis consis e en calen a la mezcla de eacción
len amen e desde 50°C has a 95°C, moni o izando con inuamen e la luo escencia. De
es e modo, la empe a u a a la cual el DNA se desna u aliza se obse a como una caída
d ás ica de la luo escencia debido a la disociación del SYBR G een I. Cada agmen o
ampli icado iene una Tm ca ac e ís ica, que a a depende sob e odo de su longi ud y de
la composición de sus bases. G acias a es o, se obse a án di e en es picos al ep esen a
la de i ada de la luo escencia espec o a la empe a u a. Podemos e un ejemplo de es e
análisis en la Figu a 7. En es as condiciones, el SYBR G een I se puede u iliza pa a
cuan i ica e incluso pa a la de ección de mu aciones pun uales (SNPs). Es o se debe a
que, has a los amplicones que di ie en en un solo nucleó ido, pueden desna u aliza se a
di e en es empe a u as. Es o nos a a pe mi i de ec a sus picos de desna u alización,
pudiendo así, po ejemplo, dis ingui mues as homocigo as (un solo pico) de mues as
he e ocigo as (dos picos) (195).
Figu a 7: Ejemplo de un análisis de picos de mel ing de mues as con ampli icación posi i a pa a
ci omegalo i us usando SYBR G een I. A la izquie da, pico de díme os de p ime s. A la de echa, picos
especí icos pa a la ampli icación de ci omegalo i us.
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Las sondas son oligonucleó idos especí icos que se an a uni una zona de la diana
de ampli icación. Es as an ma cadas con dos ipos de luo ó o os, un donado ( epo e )
y un acep o (quenche ). El p oceso se basa en la ans e encia de ene gía luo escen e
median e esonancia (FRET) en e las dos moléculas (196). Es e mecanismo de de ección
se puede di idi en dos clases en unción de las sondas, eniendo las sondas de hid ólisis
y las sondas de hib idación.
Las sondas de hid ólisis son oligonucleó idos ma cados con dos luo ó o os, donado
(ex emo 5`) y acep o (ex emo 3`), que se encuen an p óximos mien as la sonda se
man iene ín eg a (197). En es e es ado, la luo escencia libe ada po el donado es
abso bida po el acep o , impidiendo así la de ección. Cuando es a hib ida con el ADN
molde du an e la ampli icación, la ADN polime asa se desplaza a lo la go de la cadena
de ADN sin e izando la nue a cadena. Al llega a la zona donde es á la sonda, y g acias a
su ac i idad exonucleasa, la polime asa hid oliza la misma libe ando al luo ó o o
donado . De es e modo, donado y acep o ya no es án p óximos, po lo que la
luo escencia ya no puede se abso bida po el acep o , pe o sí que es de ec ada po el
luo íme o del e mociclado . Son conocidas como sondas TaqMan. El mecanismo de
acción se puede e en la Figu a 8 (198).
Figu a 8: Esquema del uncionamien o de las sondas de hid ólisis usadas en la PCR a iempo eal. Se puede e
la unión de la sonda a la egión diana especí ica (A), la hid ólisis de la misma po la acción de la polime asa (B),
y la emisión de luo escencia po el luo ó o o una ez sepa ado de la sonda.
Las sondas de hib idación ambién son oligonucleó idos ma cados con luo ó o os
en sus ex emos (199, 200). Al con a io que en las de hid ólisis, en las sondas de
hib idación la emisión y cap ación de la luo escencia se lle a a cabo con la unión de la
sonda a la secuencia diana. Es o puede pasa de dos o mas. Puede sucede po la
sepa ación de los luo ó o os, que es aban p óximos en e sí con la sonda lib e, as la
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unión (sondas molecula beacons, Figu a 9 Izquie da) (198). También puede da se
debido a la unión de dos sondas independien es, cada una ma cada con uno de los
luo ó o os, de al o ma que al uni se a la secuencia diana ambos luo ó o os queda an
p óximos. En es e momen o, la luo escencia emi ida po el donado se á cap ada po el
ecep o , que se exci a á y emi i á luo escencia en o a longi ud de onda, que se á
cap ada po el e mociclado (sondas FRET, Figu a 9 De echa) (199).
Figu a 9: Mecanismo de acción de las sondas de hib idación. Las sondas molecula beacons (izquie da), que
as la unión a la egión especí ica de la diana deja á a los luo ó o os con los que es á ma cada lo
su icien emen e sepa ados como pa a que la luo escencia emi ida po el donado no pueda se abso bida po el
ecep o , siendo así de ec ada po el sis ema de PCR. Las sondas FRET (de echa) son dos sondas indi iduales
ma cadas, una con un luo ó o o donado y o a con un ecep o . Cuando se unen a la egión diana, ambos
luo ó o os queda án p óximos, de al o ma que el donado de ene gía exci a á al ecep o , haciendo que emi a
luo escencia en o a longi ud de onda que se á de ec ada po el sis ema de PCR.
Con el uso de sondas, el inc emen o de ADN en cada ciclo se co esponde con un
aumen o de hib idación de las mismas, lo que conlle a un aumen o en igual p opo ción
de la luo escencia emi ida. El empleo de sondas ga an iza, además, la especi icidad de la
de ección, ya que mien as no haya unión de la sonda, no hab á ampli icación y ampoco
luo escencia. Del mismo modo que con los agen es in e calan es, se pueden hace
análisis de cu as de mel ing sob e los ampli icados pa a iden i ica la co ec a
ampli icación de la diana. Además, g acias a la ele ada especi icidad que o ece el uso
de las sondas, se puede lle a a cabo ampli icaciones de dis in as dianas de o ma
simul ánea (PCR múl iple o mul iplex PCR) en el mismo ubo de PCR, iden i icando
pos e io men e a cada ampli icado de o ma co ec a con el análisis de es as cu as. Las
sondas de hid ólisis no pe mi en ealiza es e ipo de análisis.
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Una de las en ajas de la PCR a iempo eal, jun o a su apidez, es que nos a a
pe mi i cuan i ica la concen ación inicial de ácido nucleico en nues a mues a, así
como iden i ica polimo ismos o mu aciones pun uales (201).
1.5.7 U ilidad de la PCR en el diagnós ico mic obiológico
Una de las g andes necesidades en el a ance del diagnós ico e a la necesidad, cada
ez mayo , de de ec a muy pequeñas can idades de cie as moléculas con ele ancia
clínica, lo que exigía una me odología con una ele ada sensibilidad. El pode de ec a
in ecciones i ales con baja i ulación, mu aciones pun uales en genes o abe aciones
gené icas en umo es empeza on a se posibles con el descub imien o de la PCR en 1983
po Ka y Mullis (202), y po el g an desa ollo pos e io que se hizo de la écnica,
consiguiendo pe ecciona la y desa ollando dis in as a ian es. La ca ac e ís ica que
hace des aca a la PCR eside en el hecho de que, a pa i de can idades ex emadamen e
pequeñas de ADN, se an a pode se ampli ica de o ma especí ica a g andes
can idades de ADN sin é ico in i o. Es o se consigue median e la eplicación con inua,
exponencial y semiconse a i a que se lle a a cabo de una egión diana, bien de inida,
p esen e en el ADN molde (189).
Si asladamos es a capacidad y su uso al campo del diagnós ico mic obiológico, nos
encon amos con una he amien a inc eíblemen e ú il a la ho a de mejo a la sensibilidad
del diagnós ico (de ección de mic oo ganismos que no c ecen o no se dan cul i ado).
También es de g an u ilidad al mejo a la capacidad de espues a pa a la iden i icación
(unas pocas ho as en e ex acción de ácidos nucleicos y PCR) espec o al cul i o y
p uebas bioquímicas (de 16-24 ho as a días de c ecimien o en medios de cul i o en
unción del mic oo ganismo) (203).
El g an desa ollo de es a écnica ha lle ado a que, en la ac ualidad, nos encon emos
con múl iples a ian es de la misma que an a pode se usadas en dis in os ámbi os del
labo a o io, no sólo clínico, en unción de las necesidades. Desde la PCR con encional
con pos e io isualización po elec o o esis en geles de aga osa, pasando po la PCR
e e sa, la PCR múl iple, la PCR de secuenciación o po la PCR a iempo eal, odas nos
an a pe mi i en el labo a o io de ec a y analiza los ácidos nucleicos con múl iples
ines. Sin es a impo ancia a las di e sas a ian es de la PCR, una de las más
implan adas en el diagnós ico mic obiológico es la PCR a iempo eal. Es a, con sus
dis in as posibilidades me odológicas, nos pe mi e mejo a el diagnós ico y, en muchos
casos, ayuda en el seguimien o de las in ecciones así como en la ca ac e ización de los
dis in os mic oo ganismos en dis in os ámbi os (10,203):
x Diagnós ico i al (VIH, g ipe, CMV, VHB)
x Diagnós ico bac e iano ( ube culosis, SARM, pneumococo, meningococo)
x Ca ga i al (seguimein o VIH, VHC)
x Mic oo ganismo con mu aciones de esis encia (SARM, ca bapenemasas)
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x Pa asi ología
x Diagnós ico de hongos
x Mic oo ganismos no cul i ables o de cul i o de bajo endimien o
x Ca ac e ización gené ica (geno ipado, es udio de mu aciones de esis encia)
Po odo es o se con ie e en una he amien a al amen e ú il en el ámbi o clínico,
pe mi iendo ob ene in o mación aliosa que ayuda á en si uaciones clínicas di e sas. Y
más conc e amen e, en el ámbi o de la mic obiología, pod íamos des aca algunos pun os
en los que se con ie e en una he amien a emendamen e ú il (10, 202, 203):
x Diagnós ico
Su p incipal en aja aquí es su g an sensibilidad y especi icidad diagnós ica si se
compa an con écnicas con encionales como la se ología y el cul i o. Además, ambién
o ece una g an apidez en la ob ención de los esul ados, ya que nos pe mi e
consegui los en cues ión de pocas ho as. Aunque ambién iene su pa e nega i a, ya que
no siemp e es ácil la in e p e ación de esul ados. Po ejemplo, su ele ada capacidad de
ampli icación se á capaz de ampli ica ambién cualquie genoma que pueda apa ece en
la mues a debido a una con aminación. Además, no siemp e es posible dis ingui un
caso clínicamen e signi ica i o de aquel que no lo es, ni a a se capaz de disc imina
aquellos casos de in ección ac i a de uno la en e.
x Seguimien o y p onós ico
En algunos ipos de in ecciones, como las in ecciones i ales po el VIH, po el
HCV, el CMV, la de e minación cuali a i a y/o cuan i a i a de la i emia puede se de
impo ancia. El ob ene es os da os a a ene una idea del p onós ico de la in ección, así
como se uno de los ma cado es de seguimien o en la p og esión de la misma. Así
mismo, en las in ecciones bac e ianas, como po ejemplo la sepsis, la de ección o no del
mic oo ganismo puede se un ma cado de seguimien o as la aplicación de un
a amien o an ibió ico.
x Epidemiología
En el escena io de un b o e in eccioso, el uso de las écnicas de PCR nos a a
pe mi i iden i ica un linaje bac e iano o í ico conc e o pa a asocia lo como el agen e
causal. Además, nos a a pe mi i de ec a el o igen de dicho b o e (204, 205). En
algunos casos nos lle a á incluso a la iden i icación de pa ógenos desconocidos has a ese
momen o.
x Resis encias a macológicas
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44
publicaciones donde indican el uncionamien o no comple o de es e a amien o o la
mejo aplicabilidad del mismo usando PMA (227).
La p ime a ez que se desc ibió el análisis selec i o de ADN, a pa i de pa ógenos
bac e ianos i os de alimen os usando colo an es i ales, ue en la de ección de E. coli
O157:H7, L. monoci ogenes y Salmonella usando EMA (228). T as a amien os
químicos y de calo , la combinación de EMA-PCR ue capaz de disc imina en e células
i as y mue as, con i iendo el uso del EMA en un p ome edo mé odo pa a la
de ección de la iabilidad. A pa i de ese momen o, se usó ampliamen e pa a la
de ección de bac e ias iables en cul i os pu os y en ma ices complejas de alimen os.
Aunque algunos es udios pos e io es mos aban que el EMA pene aba en las células
iables cuando se aplicaba en la de ección de E. coli O157:H7 (229), y ambién con o as
especies bac e ianas (230), esul ando en la pé dida pa cial de ADN y causando una
in aes imación del ecuen o de mic oo ganismos i os (231, 232). En e oda es a
con o e sia, apa ecen publicaciones mos ando la u ilidad del uso del PMA en la
de ección de la iabilidad. Lo que se empezó a de ende ue que el PMA e a más
selec i o debido a la mayo ca ga de la molécula (230), lo que le pe mi i ía pene a más
especí icamen e a a és de la memb ana dañada de las células mue as. Po o o lado,
hay quien de iende que la di e encia en e géne o bac e iano puede ene un g an impac o
en el e ec o de los colo an e i ales, especialmen e las di e encias es uc u ales en la
en uel a celula en e bac e ias G am-nega i as y G am-posi i as (233, 234). En
bac e ias G am-nega i as, la compleja es uc u a de la memb ana ex e na ep esen a la
p incipal ba e a de pe meabilidad, mien as que la co espondien e ba e a en G am-
posi i os es la capa de pep idoglicano (228). Es a di e encia acili a ía que el PMA
pene ase a a és de la memb ana dañada de bac e ias G am-nega i as mue as, y pod ía
explica la mejo ac uación del PMA en la di e enciación en e bac e ias i as y bac e ias
mue as, con la memb ana dañada, den o de es e g upo bac e iano.
Aún con odos es os da os con apues os sob e el uso y e icacia de es os colo an es
i ales, el uso de es as, la búsqueda de o as moléculas nue as y su aplicación en el
ámbi o del diagnós ico mic obiológico median e la -PCR, pod ía se una he amien a
complemen a ia muy ú il pa a el diagnós ico y el seguimien o de las in ecciones.
1.6.3 PCR de iabilidad ( -PCR)
La PCR de iabilidad ( -PCR) es, posiblemen e, el mé odo que más se ha p obado e
in es igado pa a in en a disc imina , en una mues a, los mic oo ganismos i os de los
mue os (235-237). En e la li e a u a des aca el g an in e és y aplicación de es e mé odo
en mues as alimen a ias (227), aunque de o ma indi ec a an a ene su implicación
clínica/ sani a ia, sob e odo iendo muchos de los mic oo ganismos p obados. En la
Tabla 2 y la Tabla 3 se mues an unos ejemplos de los mic oo ganismos de ec ados con
los colo an es i ales usados pa a el a amien o en es a écnica.
44

45
En gene al, los p o ocolos de -PCR consis en en la sepa ación de la mues a en dos
alícuo as, pa a a a a una de ellas con una sus ancia con a inidad a los ácidos nucleicos.
La molécula u ilizada inicialmen e en la mayo ía de los expe imen os es la monoazida de
e idio (EMA), aunque se ha ido eemplazando más ecien emen e po o a sus ancia
simila , que es la monoazida de p opidio (PMA) (230). Las concen aciones usadas en el
a amien o y las condiciones globales del p o ocolo pueden ene lige as a iaciones
en e algunos abajos pe o en gene al el p o ocolo es siemp e el mismo. T as un iempo
de incubación en oscu idad, la mues a a ada es o oac i ada po la exposición a una
lámpa a de luz isible que ac i a a la sus ancia usada, a o eciendo su unión al ADN.
Ambas alícuo as son some idas en onces a un p oceso de ex acción de ácidos nucleicos
y pos e io ampli icación median e PCR a iempo eal. Si ambas alícuo as p esen an
señales simila es de ampli icación, los mic oo ganismos en la mues a se conside a que
son mayo i a iamen e iables (memb anas in ac as). Po la con a, si la mues a a ada
p esen a una señal medible más débil, los mic oo ganismos de la mues a se conside an
mayo i a iamen e inac i ados. Esa di e encia de señal se e ie e a di e encias medibles
en el C cuando se compa an ambas alícuo as.
La iabilidad en es e con ex o se basa en el concep o de in eg idad de memb ana, de al
modo que aquellas bac e ias que es én mue as end án la memb ana dañada, y po an o
deja án de se impe meables a los colo an es i ales usados en la -PCR. Pe o a pesa de
e que en casos se mos ó la capacidad de es os colo an es pa a disc imina en e
bac e ias i as y mue as, ambién es cie o que hay algunos pun os a ene en cuen a que
explica ían, en algunos casos, el acaso de es e p ocedimien o. Los pun os que algunos
au o es ienen en cuen a se ían los siguien es:
x Que la iabilidad basada en la in eg idad de la memb ana no se ía un concep o
o almen e comple o, ya que no da una medida di ec a de bac e ias i as y mue as
(238), po que, aunque las células con memb anas pe meables a es os colo an es
pueden se asociadas a no iables, no odas las células no iables end ían dañada
su memb ana (239, 240). A pesa de que la in eg idad de la memb ana es un
c i e io incomple o pa a de ini la iabilidad de la célula, el abo daje median e la
-PCR ha conseguido esul ados posi i os en a ias publicaciones (241, 242). En
es a línea es a ían algunos au o es, que de ienden que se debe ía conside a más de
un único c i e io de iabilidad, como po ejemplo se o no cul i able, la ac i idad
me abólica y la in eg idad de memb ana (226, 243).
x La impo ancia de la g an a iedad de ma ices de las que es án o mados los
dis in os ipos de mues as en alimen ación y mues as ambien ales (244). Es as
pod ían ene un e ec o nega i o sob e la e icacia de la -PCR, debido a la
p esencia de inhibido es que pod ían in e e i en dis in os pun os del p oceso de
de ección (245, 246).
x La concen ación del mic oo ganismo o mic oo ganismos en la mues a jun o con
el lími e de de ección de la PCR. En muchos ipos de mues as, la can idad de
45
46
pa ógenos bac e ianos se encuen an en ni eles muy bajos (en e 10
2 y 10
4
células/g ) (247), mien as que en los mejo es casos, el lími e de de ección más
acep ado pa a la PCR es a ía en 103 células/g (248). Po o o lado, se e que
cuando nos encon amos con ele adas concen aciones bac e ianas en la mues a,
la de ección se a a e limi ada. Es o es debido a que, en el momen o de la
ac i ación del colo an e con la uen e de luz, es a ele ada masa bac e iana
in e e i ía en el paso de unión al ADN, bien po ensomb ece la luz o bien
compi iendo po el colo an e (249, 250).
x Ya que cuando es os colo an es en an en la célula se an a in e cala en el ADN,
pa ece mos ada la impo ancia del amaño de la secuencia diana de de ección.
Pa ece que cuan o más g ande es esa secuencia diana, mayo es la p obabilidad de
que el colo an e se in e cale en ella (251-254).
46
47
Tabla 2: Ejemplos del uso de colo an es i ales pa a la de ección di e en es bac e ias y le adu as a pa i de
dis in os p oduc os alimen a ias (adap ado de Elizaquí el P e al 2014 (227)).
Tipo de alimen o
Mic oo ganismo(s) Colo an e i al Re e encia
Ca ne
Pechuga y pa as de pollo
Campylobac e jejuni
EMA
Rudi e al (2005)
Ca casas de pollo
Campylobac e
PMA
Jose sen e al. (2010
Pollo y hue os
Salmonella
EMA
Wang and Mus apha (2010)
Pollo, e ne a y jamón
Salmonella en é ica se o a s
PMA
Yang e al (2012)
Jamón cocido
Salmonella
PMA
Ma in e al (2013)
Vege ales y zumos
Espinacas y ensalada
mix a
E. coli
O157:H7
, Salmonella, L.
monocy ogenes
PMA
Elizaquí el e al (
2012)
Lechuga
Salmonella
PMA
Liang e al (2011)
Lechuga y oma e
S. yphimu ium, E. coli
O157:H7
, L.
monoci ogenes
PMA
Yang e al (2013)
Lechuga y espinacas
E. coli O157:H7
PMA
Dinu and Bach (2013)
Toma e
S. en e ic se o a s
PMA
Yang e al (2012)
Zumos de manzana,
na anja o u as
Zygosaccha omyces bailii
EMA
Raws ho ne e al (2009)
P oduc os lác eos
Yogu
Bi idobac e ium
EMA
Men e al (2010)
Leche pas eu izada
Coli o mes o ales
EMA
Soejima e al (2012)
Leche pas eu izada
En e obac e iaceae
PMA
Soejima e al (2012)
Queso Gouda
L. monocy ogenes
EMA
Rudi e al (2005)
Leche en pol o
C onobac e sakazakii
EMA
Minami e al (2012)
Pescado
Salmón
Pho obac e ium phospho eum
PMA
Macé e al (2013)
Cama ón y salmón
B ocho ix he mosphac a
PMA
Mamlouk e al (2012)
O os
Mos o y ino
Oenococcus oeni
PMA
Vend ame e al (2013)
Supe icies de p ocesado
de alimen os
E. coli, S. au eus, L. monocy ogenes
PMA
Ma inon e al (2012)
47
48
Tabla 3: Ejemplo de abajos en los que se usa on colo an es i ales (EMA/PMA) pa a la de ección de i us.
(Adap ado de Elizaquí el P e al 2014 (227)).
Un pun o impo an e pa a pode lle a a cabo es a de ección di e encial adica en
que las sus ancias que se in en en usa sean capaces de se o almen e selec i as a ni el
de pe meablidad, y que po an o solamen e sean capaces de a a esa aquellas
memb anas que es én dañadas. En la Figu a 14 podemos e un ejemplo g á ico de lo
que nos podemos encon a en el caso de usa una molécula cuya pe meabilidad no sea la
adecuada, compa ando al uso de la PCR con encional y la -PCR. Lo que nos mues a es
que nos podemos encon a con moléculas que acaben en ando en una po ción de células
iables ( acción a) y po an o in a alo a el mic oo ganismo p esen e. Pe o ambién
puede pasa que esa sus ancia no sea capaz de pene a en odas las células mue as con
la memb ana dañada, y po an o es a de ec ando ( acción b) e sob e alo ando la
p esencia de o ganismos iables.
Figu a 14: ejemplo de la de ección con la -PCR con el uso de sus ancias incapaces de man ene una
pe meabilidad o almen e selec i a en e memb anas dañadas e ín eg as, implicando la no de ección de algunos
de los mic oo ganismos i os (a) y la de ección de algunos mic oo ganismos mue os. Basado en el a ículo
Fi ipaldi M e al 2011 (220)).
Tipo de i us
P oceso de inac i ación
Colo an e i al
Co ec a
moni o ización
Re e encia
Vi us en é icos
Coxsakie i us,
Echo i us
T a amien o con calo
PMA
Si
Pa shionika e al (2010)
VHA
T a amien o con calo
P ocesado a al a p esión
PMA
Si
Pa cial
Sanchez e al (2012)
No o i us
T a amien o con calo
PMA
Si po RT
-PCR
No po RT-qPCR
Pa shionika e al (2010)
Polio i us
T a amien o con calo
PMA/EMA
Si
Pa shionika e al (2010)
y Kim e al (2011)
O os i us
G ipe a ia
Es abilidad en agua
PMA
No
G ai e e al (2010)
Fago MS2
T a amien o con calo
PMA
Si
Kim y Ko (2012)
No o i us mu ino
T a amien o con calo
PMA
EMA
No
Si
Kim y Ko (2012)
Kim e al (2011)
Fagos T4
T a amien o con calo
PMA
No
Fi ipaldi e al (2010)
48
49
El pode desa olla un p o ocolo de iabilidad, con una sus ancia de unión al ADN
sólo de aquellas bac e ias que es én mue as, e inhibiendo su ampli icación, se ía una
he amien a muy ú il pa a mejo a la de ección de aquellos mic oo ganismos que
ealmen e puedan es a causando o puedan llega a causa una in ección.
49

50
50
51
2. OBJETIVOS
51
52
52
53
En odo p oceso de de ección de un anali o, a pa i de una de e minada mues a, son
necesa ios múl iples paso en el p ocesamien o de la misma has a pode llega al pun o
inal en la de ección. Desde la oma de mues a y el pos e io p ocesamien o, has a la
ealización de las écnicas especí icas de la de ección, odos son pasos de g an
impo ancia pa a llega a un esul ado iable. Po un lado, es impo an e posee las
écnicas ap opiadas pa a el p ocesado de la mues a o iginal, aislando si es necesa io un
anali o conc e o. Po el o o, ambién es de g an impo ancia el dispone de écnicas de
de ección con la su icien e sensibilidad y especi icidad. En conjun o, ambos ipos de
écnicas an a se de g an ayuda en el p oceso diagnós ico. En el ámbi o del diagnós ico
mic obiológico se ha e olucionado mucho, inco po ando en la u ina, jun o a las écnicas
con encionales, como el cul i o y p uebas bioquímicas, una g an a iedad de écnicas
molecula es basadas en la PCR (sob e odo en la PCR a iempo eal). Además de que la
p opia PCR sea lo su icien emen e sensible y especí ica pa a de ec a aquel o aquellos
mic oo ganismos de in e és, uno de los paso de mayo impo ancia pa a pode la lle a a
cabo es la ex acción y pu i icación p e ia. Es e paso nos a a pe mi i ob ene los ácidos
nucleicos p esen es en nues a mues a lo más pu os posible, y en una can idad su icien e
pa a que puedan se de ec ados. Los mé odos más mode nos se basan en el uso de
nanopa ículas magné icas pa a la cap ación, ecupe ación y concen ación de los ácidos
nucleicos a pa i de cualquie ipo de mues a, eliminando cualquie es o de
con aminan es, inhibido es y elemen os celula es que puedan in e e i en p ocesos
pos e io es. La PCR nos pe mi e lle a a cabo la ampli icación y de ección a pa i
can idades muy bajas de ma e ial gené ico, pe mi iéndonos una ele ada capacidad de
de ección, aunque como oda écnica iene un lími e de de ección a pa i del cual no se á
capaz. Pe o es a g an capacidad pa a pode ampli ica cualquie ácido nucleico de nues a
mues a no nos a a pe mi i disc imina si pe enece a un mic oo ganismo iable o
mue o, o incluso si se es á ampli icando ADN lib e en la mues a pe enecien e a
mic oo ganismos mue os. En es e sen ido, hay dos pun os que ayuda ían a mejo a el
diagnós ico mic obiológico. En p ime luga , consegui mejo as en los sis emas de
ex acción que pe mi an una mayo ecupe ación de ácidos nucleicos de calidad, pa a que
puedan se usados en écnicas pos e io es. En segundo luga , el pode desa olla
p o ocolos que pe mi an dis ingui median e PCR la ampli icación únicamen e de
mic oo ganismo iables y que po an o se án los causan es del cuad o clínico del
pacien e
Po es e mo i o, los obje i os que nos plan eamos ue on los siguien es:
1. Diseña y p oba nanopa ículas magné icas pa a su uso en sis emas au omá icos,
pa a in en a mejo a el paso de pu i icación de ácidos nucleicos, y ayuda así a la
mejo a en la de ección en las p uebas diagnós icas pos e io es.
53
60
FeO-2204
Desc ipción
Dispe sión acuosa de
nanopa ículas de
magne i a e es idas con
ácido poliac ílico
PAA
Dis ibución de amaño
10,5 ± 4 nm (85% pa )
Fo ma del
p oduc o
Dispe so en agua
,
pH=10
Concen ación
20.2 mg/ml
Densidad
1,00 g/ml
Densidad de pa ículas
5,25·1018
pa /l
FeO-2206
Desc ipción
Dispe sión acuosa de
nanopa ículas de
magne i a e es idas con
sílice
Dis ibución de amaño
26 ± 3 nm
10 ± 2 nm (co e)
Fo ma del p oduc o
Dispe so en agua
,
pH = 8,66
Concen ación
5,25 mg/ml
Densidad
0.99 g/ml
Densidad de pa ículas
≈2.04·1017
pa ic/l
FeO-2207
Desc ipción
Dispe sión acuosa de
nanopa ículas de
magne i a e es idas con
sílice
Dis ibución de amaño
45 ± 3 nm
10,5 ± 3 nm (co e)
Fo ma del p oduc o
Dispe so en agua
pH=9.9
Concen ación
10
mg/ml
(25-
30 % óxido de
hie o, 70
-
75%
sílice
Densidad
1,0 g/ml
Densidad de pa ículas
≈ 2.2·1015
pa ic/ml
FeO-2206-APS
Desc ipción
Dispe sión acuosa
de nanopa ículas de
magne i a e es idas de
sílice uncionalizadas
con aminop opilsilano
(APS)
Dis ibución de amaño
24,2 ± 3,4 nm
10 ± 2 nm (co e)
Fo ma del p oduc o
Dispe so en agua
,
pH = 8,22
Concen ación
4,99 mg/ml
Densidad
1.00 g/ml
Densidad de pa ículas
−
60

61
FeO-2207-APS
Desc ipción
Dispe sión acuosa de
nanopa ículas de
magne i a e es idas de
sílice uncionalizadas
con aminop opilsilano
(APS)
Dis ibución de amaño
47 ± 4 nm
10,5 ± 3 nm (co e)
Fo ma del p oduc o
Dispe so en agua
pH=9.4
Concen ación
24,86 mg/ml
Densidad
1,0 g/ml
Densidad de pa ículas
≈ 1.71·1017
pa ic/ml
Figu a 15: Imágenes ob enidas pa a la ca ac e ización de cada una de las pa ículas p obadas.
61
62
La sín esis de las pa ículas se ealizó usando como e e encia la me odología
expues a en la publicación de Kang K e al 2009 (255). Es a se lle o a cabo median e el
mé odo de eacción sol-gel a pa i de una mezcla de sales de hie o. La pos e io
cubie a de sílice se añadió usando el mé odo de S öbe (135) y omando como e e encia
la an e io publicación. Como p ecu so pa a la hid ólisis y condensación en el p oceso
de o mación de la cubie a de sílice se u ilizó el e ae oxio osilica o (TEOS), usando
cambios en su concen ación pa a consegui con ola el g oso de la cubie a. Un
esquema g á ico de la o mación de las nanopa ículas se mues a en la Figu a 16. Como
se indica en las ablas an e io es con las ca ac e ís icas de cada nanopa ícula, algunas de
ellas ue on uncionalizadas con g upos eac i os en su supe icie buscando una mejo a
en la adso ción de ácidos nucleicos. Las sus ancia usada pa a uncionaliza la cubie a de
las pa ículas ue el aminop opil ie oxisilano (APS/APTS).
Figu a 16: Esquema de los dis in os pasos e l ob ención de nanopa ículas de magne i a ecubie as de sílice y
uncionalizadas con g upos con g upos amino eac i os en su supe icie pa a la adso ción de ácidos nucleicos.
Figu a ob enida de Kang K e al 2009 (255).
Con es e mé odo de sín esis, y como se e en las ca ac e ís icas de las
nanopa ículas, se consiguió sin e iza y p oba nanopa ículas de magne i a desnudas,
nanopa ículas de magne i a ecubie as con sílice y nanopa ículas de magne i a
ecubie as con sílice con g upos uncionales en su supe icie.
También se p obó a usa una nanopa ícula en la que se u ilizó como e es imien o el
ácido poliac ílico (PAA) en ez de sílice.
3.1.3 Medios de cul i o pa a el c ecimien o de bac e ias ans o madas
Pa a la ob ención de las bac e ias, se u ilizó medio de cul i o sólido (Di coTM LB
aga , Lennox) pa a el c ecimien o inicial en placa. Pa a el pos e io c ecimien o a mayo
escala, se usó medio líquido (Di coTM LB B o h, Lennox). Todos los medios ue on
p epa ados añadiéndole ampicilina (Sigma Ald ich) p epa ada a una concen ación de
100 mg/ml.
Pa a p epa a el medio líquido (LB B o h), se añadie on 10 g de medio en 500 ml de
agua y se some ió a es e ilización en au ocla e. Una ez a empe ado el medio, se
añadie on 500 μl de una solución de ampicilina a 100 mg/ml.
62
63
Las placas con medio sólido (LB aga ) se p epa a on del mismo modo que el medio
líquido, pe o añadiendo 17,5 g de LB aga . T as añadi la ampicilina, el medio se epa ió
en placas pe i es é iles, y se deja on solidi ica a empe a u a ambien e. Una ez lis as,
se conse a on en ne e a has a su uso.
La ampicilina se p epa ó disol iendo 0,6 g de la misma en 6 ml de agua es é il pa a
inyección (Meinsol), pa a ob ene una concen ación de 100 mg/ml. Pos e io men e se
gua da on alícuo as a -20 ºC pa a conse a las has a su uso.
3.1.4 Enzimas de es icción
Pa a ealiza los co es de los plásmidos en la e apa co espondien e de
iden i icación, se usa on los enzimas de es cción Apa I, Xma I, Cla I y Hind III de la
casa come cial New England BioLabs. Los co es se hicie on en baño a 37 ºC siguiendo
las ins ucciones del ab ican e.
3.1.5 Ob ención de poblaciones es ánda de ácidos nucleicos
Pa a consegui una can idad cuan i icable de mues a y en can idad su icien e pa a
ealiza los expe imen os, se usa on s ocks congelados de E. coli DH5α ans o mada con
cinco pseudo ipos basados en el plásmido NL4.3 (256, 257). Es e plásmido con iene la
es uc u a gené ica básica del i us de la inmunode iciencia humana (VIH), lo que nos
pe mi e de de ec a lo con g an a iedad de écnicas molecula es. Es os plásmidos (Tabla
4) se di e encian en e sí po ene si ios de es icción únicos, que nos pe mi en
dis ingui los median e écnicas como la pi osecuenciación, o con el uso de enzimas de
es icción seguido de sepa ación y isualización median e elec o o esis en gel de
aga osa. Además po an inse ada en una egión del plásmido el gen de esis encia a
ampicilina.
Enzimas de es icción
Plásmido
F agmen o esul an e
Hind III
pNL4.3
1480 pb
Apa I - Cla I
p4254
2248 pb
Apa I - Xma I
p4411
2405 pb
Apa I – Xma I
p4634
2628 pb
Apa I – Cla I
p4696
2690 pb
Tabla 4: Lis ado de los plásmidos u ilizados y de los enzimas de es icción con los que se ealiza el co e
en cada uno. Se indica ambién el amaño de agmen o esul an e que se isualiza á median e elec o o esis en
gel de aga osa.
63
64
A pa i de los s ocks de glice ol, con la bac e ia ans o mada de o ma
independien e con cada uno de los plásmidos, se hizo una siemb a con asa de 10 μL en
una placa de aga con ampicilina y se incuba on oda la noche en es u a a 37 ºC. Es o nos
pe mi ió el c ecimien o solamen e de nues a bac e ia con plásmido. Desde es as placas
se selecciona on cua o colonias, que se pusie on a c ece en 4 ml de medio líquido con
ampicilina y se deja on c ece oda la noche a 37 ºC y en agi ación con inua. De es os
ubos con c ecimien o se usa on 2 ml pa a ecupe a las bac e ias po cen i ugación y
hace la ex acción del ADN plasmídico usando el ki NucleoSpin® Plasmid (Mache y-
Nagel, Re : 740588.50). Una ez ex aídos los plásmidos, se u ilizó un olumen pa a
hace el co e con el enzima de es icción co espondien e, y se some ió a elec o o esis
en gel de aga osa al 1% pa a iden i ica las bandas co espondien es a cada uno y
con i ma su iden idad. En la Figu a 17 se mues a el pe il elec o o é ico pa a cada uno
de los plásmidos.
Figu a 17: Imagen de un gel de elec o o esis con las bandas co espondien es los dis in os plásmidos as
el co e con los enzimas de es icción.
Una ez iden i icado de o ma co ec a cada plásmido, y a pa i del olumen de los
ubos con bac e ia c ecida, se hizo un nue o cul i o en medio líquido pe o a mayo
escala. Pa a eso, ans e imos 500 μL de bac e ia c ecida en un ma az con 500 ml de
medio de cul i o con ampicilina y se dejó c ece oda la noche a 37 ºC en agi ación
con inua. A con inuación, se cen i ugó odo el medio de cul i o con bac e ias en a ios
64
65
ciclos de cen i ugación (15.000 x g du an e 10 minu os) usando ubos es é iles de 50 ml
pa a p ecipi a y ecupe a las bac e ias, eliminando los es os de medio de cul i o y
sus ancias que quedan en él. En es e pun o, si no se iban a p ocesa a co o plazo, los
p ecipi ados se congela on a -40 ºC. Bien de o ma inmedia a a la p ecipi ación de las
bac e ias, o bien as la congelación, es os p ecipi ados se usa on pa a ex ae de o ma
especí ica el ADN plasmídico que po an. Pa a eso se usa on los eac i os y p o ocolo
del “Plasmid Maxi ki ” (Quiagen, e : 12162). Pos e io men e, se ealizó el mismo
a amien o con enzimas de es icción y sepa ación po elec o o esis pa a comp oba
cada uno de los plásmidos. La ecupe ación de los plásmidos y la p epa ación de odas
sus diluciones se ealiza on siemp e con ampón T.E. (pH 8).
3.1.6 Medida de las concen aciones de ADN pa a calcula el endimien o de las
ex acciones
Pa a consegui alo a la u ilidad de es as nanopa ículas en la ex acción de ácidos
nucleicos y el endimien o ob enido con las mismas se ealiza on mediciones de la
can idad de ADN p esen e en los plásmidos ob enidos en la ex acción a pa i de las
bac e ias, a pa i de las diluciones que se p epa a on de es os pa a usa como mues a en
las ex acciones con las nanopa ículas, y ambién a pa i del eluído inal ecupe ado as
los p ocesos de ex acción de ácidos nucleicos en la pla a o ma au oma izada usando
nues as nanopa ículas. Es as medidas se ealiza on median e un mé odo luo imé ico
come cial con el sis ema Qubi ® 2.0 (In i ogen) y usando los eac i os co espondien es
pa a la de ección de bajas can idades de ADN (Quan -iT dsDNA HS Assay Ki , Re :
Q32851, In i ogen) y pa a can idades al as de ADN (Quan -iT dsDNA BR Assay Ki ,
Re : Q32850, In i ogen), según la necesidad. De es e modo, pudimos sabe la can idad
de ADN en μg/ml en nues as mues as de pa ida, y compa a lo después con lo que se
ob u o al inal de las ex acciones con nues as pa ículas. Con ambos alo es
calculamos el endimien o de la ecupe ación en po cen aje. En la Figu a 18 se mues a el
sis ema de medición donde, al in oduci un ubo con el eac i o co espondien e y un
olumen conocido de nues a mues a, nos calcula á la concen ación de ADN en μg/ml
de pa ida. Al mismo iempo, usa dos calib ado es in e nos, en base a los cuales se
ealizan los cálculos. Con es e da o y con el olumen o al de mues a que se usó pa a la
ex acción, así como con el olumen en que se ecupe ó el ADN, pudimos calcula la
can idad o al de ADN in oducida, la can idad o al ecupe ada, y calcula así
endimien o de dicha ex acción.
65

66
Figu a 18: Imagen del sis ema de medición po luo ime ía usado pa a calcula la can idad de ADN
p esen e en las mues as p epa adas.
3.1.7 Ensayos de ex acción de ácidos nucleicos usando nue as nanopa ículas
Pa a lle a a cabo las ex acciones de ácidos nucleicos se u ilizó el sis ema abie o de
ex acción HAMILTON kPCR (Siemens), basado ambién en el uso de nanopa ículas
magné icas pa a la cap u a de los ácidos nucleicos en mues as biológicas. Como p ime
pun o a ene en cuen a, al se un sis ema abie o de eac i os, lo que se hizo ue sus i ui
las pa ículas p opias del apa a o po las nues as que a ábamos de p oba .
Pa a lle a a cabo las ex acciones se p epa a on diluciones se iadas, en ampón
T.E., de la mezcla de los ADN plasmídicos ob enidos de las bac e ias. Cada pun o de
concen ación se in odujo po iplicado, y se ealizó la medición de la concen ación de
ADN an es de la ex acción y al eluído ob enido as la misma. El olumen de pa ida de
cada mues a ue de 600 μl, y el del eluído inal de la ex acción ue de 50 μl. Los alo es
medios ajus ados de cada pun o inicial de ADN de las diluciones se iadas ue on de 120,
65, 38, 22, 13, 7, 4 y 2 μg o ales p esen es en los 600 μl usados po el sis ema pa a la
ex acción.
3.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STHAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A
METICILINA
Un o al de 100 aislados clínicos ue on seleccionados alea o iamen e de la colección
de cepas de nues o labo a o io. Además, se incluyó una cepa de e e encia pa a SARM,
la ATCC 43300. En es a selección alea o ia es ablecimos dos c i e ios pa a acep a las
66
67
mues as en el g upo de es udio. P ime o, los aislados debían habe sido iden i icados en
el sis ema “Mic oscan Walkaway® Plus ins umen ” (Siemens) usando el “Pos Combo
Panel ype 31”. Pos e io men e, la esis encia a me icilina debía habe sido con i mada
median e el es de suscep ibilidad po di usión con disco de ce oxi ina (30 mic og;
Oxoid). En base a es o, los 101 aislados ue on e isados pa a comp oba que cumplían
ambos c i e ios, y a pa i de ahí se ealizó la de ección median e PCR a iempo eal de
o ma pa alela con dos sis emas de de ección: el “BDMax™ MRSA Assay” (Bec on
Dickinson) y el “Ligh Cycle ® MRSA Ad anced Tes ” (Roche). Como se mues a en el
esquema de lujo de abajo de la Figu a 19, se lle a on a cabo écnicas eno ípicas y
molecula es al e na i as a aquellas mues as que p esen a on un esul ado nega i o en al
menos una de las écnicas de PCR a iempo eal, con el obje i o de asegu a la iabilidad
del esul ado. Las écnicas y sis emas usados ue on el (a) Vi ek®2 ( a je a GP;
bioMé ieux), (b) “BBL™ Coagulase Plasma Rabbi wi h EDTA” (Bec on Dickinson), (c)
BDMax™ S aph SR (Beck on Dickinson), (d) GenoType® MRSA ki (Hain Li escience)
y (e) Fluo oType® MRSA ki (Hain Li escience). Pa a el análisis e en ual de dis ancias
genómicas comple as se usó la écnica ep-PCR (Di e silab™ S aphylococcus ki
(bioMe ieux)). Además, se les ealizó un análisis po espec ome ía de masas po
MALDI-TOF usando el sis ema MALDI Bio ype (BRUKER) con dos obje i os: po un
lado, iden i ica como S. au eus a los aislados con esul ado nega i o; y po o o lado,
pa a ob ene un dend og ama donde los aislado ue an analizados y ag upados pa a
in en a descub i una posible o mación de g upos en e los dis in os aislados nega i os
pa a cada sis ema de PCR a iempo eal. Finalmen e, se ealizó un ipado de es os
aislados basado en PCR pa a asigna los a uno de los g upos de clasi icación basados en
la egión SCCmec, pa a a a de explica la posible ag upación de aislados en el
dend og ama ob enido. La PCR se ealizo usando el p o ocolo indicado en la publicación
de Milhei iço C e al 2007 (258).
67
68
Figu a 19: Flujo de abajo pa a las dis in as p uebas ealizadas pa a la ca ac e ización de los aislados de
MRSA.
3.2.1 Sis ema Mic oscan Walkaway® Plus (Siemens)
El sis ema Mic oscan Walkaway® Plus es un sis ema o almen e au oma izado en el
que se lle a a cabo la iden i icación bac e iana y la de e minación de la suscep ibilidad
an ibió ica usando el panel “Pos Combo Panel Type 31”. Todas las mues as ue on
p ocesadas siguiendo las ecomendaciones del ab ican e.
3.2.2 Di usión con disco de ce oxi ina
El es de suscep ibilidad po di usión en disco de ce oxi ina 30 Pg (Oxoid) se hizo a
las mues as pa a con i ma la esis encia a me icilina. Se p epa ó una solución 0,5
McFa land de cada aislado y se hizo una siemb a en césped en placas de aga sang e. Las
placas se incuba on a 37 ºC du an e 18 ho as y se midie on los diáme os de las zonas de
inhibición. Siguiendo la guía del CLSI (Clinical and Labo a o y S anda s ins i u e), una
zona de inhibición con un diáme o ≤ 21 mm ue conside ada como esis en e a
me icilina, y con un alo ≥ 22 mm ue conside ada como sensible (259).
68
69
3.2.3 BDMax™ MRSA Assay (Bec on Dickinson)
El es “BDMax™ MRSA Assay” es un ensayo diagnós ico cuali a i o au oma izado
in i o pa a la de ección di ec a de ADN de S. au eus esis en e a me icilina (SARM) a
pa i de hisopos nasales en pacien es con iesgo de colonización. El ensayo u iliza la
PCR a iempo eal pa a la ampli icación del ADN pe enecien e a SARM y sondas de
hib idación especí icas ma cadas con luo ó o os pa a la de ección del ampli icado. El
ensayo de ec a de o ma simul ánea la egión SCCmec y una secuencia especí ica de S.
au eus localizada en el gen o X. Todas las mues as ue on p ocesadas siguiendo las
ecomendaciones del ab ican e.
3.2.4 Ligh Cycle ® MRSA Ad anced Tes (Roche)
El es “Ligh Cycle ® MRSA Ad anced Tes ” (ROCHE) es un es diagnos ico
cuali a i o in i o pa a la de ección di ec a de colonización nasal con SARM pa a
ayuda en la p e ención y con ol de las in ecciones po MRSA en el ámbi o hospi ala io.
La p ueba es á diseñada pa a de ec a una secuencia p opia indica i a de la in eg ación de
la egión SCCmec en el c omosoma de S. au eus (unión del gen SCCmec/o X),
indicando la p esencia del ADN pe enecien e a MRSA. Todas las mues as ue on
p ocesadas siguiendo las ecomendaciones del ab ican e y la PCR a iempo eal se lle ó
a cabo en el sis ema Ligh Cycle ®.
3.2.5 Sis ema Vi ek®2 (bioMé ieux)
El Vi ek®2 es un sis ema o almen e au omá ico que ealiza la iden i icación
bac e iana y el es de suscep ibilidad an ibió ica. Todas la mues as se analiza on usando
a a je a “GP ID ca d” pa a la iden i icación de bac e ias g am-posi i as. Todas los
aislados se p ocesa on siguiendo las indicaciones del ab ican e.
3.2.6 P ueba de la coagulasa
El c i e io usado de o ma más amplia y globalmen e acep ado pa a la iden i icación
de es a ilococos asociados a una in ección aguda es á basado en la p esencia del enzima
coagulasa (260). El es “BBL™ Coagulase Plasma Rabbi wi h EDTA” (Beck on
Dickinson) se usa pa a de e mina cuali a i amen e la pa ogenicidad de los es a ilococos
usando el mé odo di ec o e ubo. Las p uebas se lle a on a cabo siguiendo las
ecomendaciones el ab ican e.
3.2.7 BDMax™ S aph SR (Bek on Dickinson)
El es “BDMax™ S aph SR Assay” es un ensayo diagnós ico cuali a i o in i o
au oma izado pa a la de ección di ec a de ADN de MRSA a pa i de hisopos nasales de
pacien es en iesgo de colonización. El es u iliza la PCR a iempo eal pa a la de ección
69
76
3.4 MEJORA DE LA DETECCIÓN MOLECULAR (PCR DE VIABILIDAD)
3.4.1 Esquema gene al del p o ocolo de a amien o con cispla ino en el es de
iabilidad
Como se indica a lo la go de los siguien es apa ados, el es de iabilidad consis e
en el a amien o de una mues a en la que hay p esen e una can idad de mic oo ganismo
i o, mue o o ambos, pa a pos e io men e se capaz de, median e PCR a iempo eal,
llega a una de ección di e encial, de al modo que sólo se lle e a cabo la ampli icación
del ADN de aquel mic oo ganismo que es é i o. En la Figu a 22 se mues a de o ma
esquema izada el desa ollo gene al de los dis in os ensayos del es de iabilidad. En los
ensayos se pa e siemp e de dos g upos de mues as en duplicado: uno o mado po
bac e ias i as y o o po bac e ias mue as, en las cuales uno de los duplicados se le
aplica el a amien o y el o o si e como con ol pa a compa a los esul ados. En los
ensayos se añade un e ce g upo de mues as en las que las bac e ias i as y mue as se
mezclan en iguales can idades y se p ocesan igualmen e en duplicado. El g upo de
mues as no a adas su e las mismas incubaciones y p ocesos de la ado, lo único que
cambia es que se les añade el mismo olumen de agua que olumen de sus ancia de
a amien o es añadida a las a adas. Una ez pasado el a amien o y el la ado/
p ocesado pa a limpia de sus ancia sob an e que pueda in e e i , se ealiza la ex acción
de ácidos nucleicos en un sis ema au omá ico y se lle a a cabo la PCR a iempo eal pa a
pode e el e ec o o no de inhibición del a amien o y pode compa a lo con los
con oles.
Figu a 22: Esquema gene al de los pasos de p o ocolo de iabilidad.
76

77
3.4.2 Cepa de e e encia y p epa ación de la mues a
Pa a lle a a cabo los di e en es ensayos se u ilizó una cepa de colección pa a S.
au eus esis en e a me icilina con e e encia ATCC 43300. Pa a su c ecimien o la
bac e ia se semb ó en placas de aga sang e y se dejó c ece a 37 ºC oda la noche.
Las soluciones bac e ianas se p epa a on en agua a pa i de la bac e ia c ecida en
placa. Pa a ello se p epa ó una solución 0.5 McFa land, que luego se diluyó pa a
consegui una solución bac e iana con una concen ación de 1E4 c u/ml. Una ez
conseguida la concen ación de abajo se ealizaba una siemb a en placa pa a comp oba
el c ecimien o y pode compa a con los esul ados.
Como pa a los di e en es ensayos es necesa io con a con dos poblaciones dis in as
de bac e ias, i as y mue as, a pa i de la solución ob enida se e i ó una pa e y se
some ió a un shock é mico en un baño a 80 ºC du an e es minu os pa a así ma a las
bac e ias, y se pasó inmedia amen e a hielo pa a a empe a la solución. Pa a es ablece
es as condiciones de incubación se ealiza on a ios expe imen os con iempos de
incubación en e 1 y 10 minu os, con inc emen os de 1 minu o, y con la pos e io
siemb a en placa de 100 μl de la solución de bac e ias e incubación du an e al menos 24
ho as pa a comp oba la p esencia o ausencia de c ecimien o.
Pa a las p uebas ealizadas a pa i de sang e, las bac e ias se ob u ie on del mismo
modo mencionado a iba, y a con inuación se añadie on a la sang e pa a ob ene la
misma concen ación eó ica de 1E4 c u/ml.
3.4.3 Ex acción de ácidos nucleicos y de ección median e PCR a iempo eal
Pa a lle a a cabo la ex acción de ADN y su pos e io de ección, se u iliza on dos
de los sis emas au omá icos de ex acción y su sis ema de PCR a iempo eal
co espondien e disponibles en nues o labo a o io pa a su uso en la u ina diagnós ica.
Po un lado se usó el sis ema de ex acción MagNA Pu e (Roche) y su sis ema
independien e pa a de ección Ligh Cycle (Roche) usando el ki de de ección múl iple de
mic oo ganismos Sep iFas (Roche).
El sis ema MagNA Pu e es un sis ema de ex acción au omá ico que u iliza la lisis
enzimá ica de la mues a y nanopa ículas magné icas pa a la cap u a de los ácidos
nucleicos. El sis ema Ligh Cycle es un e mociclado pa a ealiza PCR a iempo eal
que u iliza capila es que se calien an po co ien e de ai e. El ki de PCR Sep iFas
consis e en una mul iplex RT-PCR pa a la de ección simul ánea de 24 mic oo ganismos
con implicación en cuad os de sepsis. Pa a ello cons a de es mezclas dis in as de
eacción co espondien es a los mic oo ganismos ag upados en g am posi i os, g am
nega i os y hongos. En la ex acción se pa e de 400 μl de mues a y se ecupe an 200 μl
de eluído, de los que se usa án pa a la PCR 50 μl pa a cada pa a cada g upo de
77
78
mic oo ganismos con 50 μl de la mezcla co espondien e de PCR. Los mismos
olúmenes se usan pa a los con oles posi i os y nega i o en la misma PCR.
El o o sis ema que se usó es el BD MAX (Beck on Dikinson) es un sis ema
au omá ico con ex acción y PCR in eg ados en el mismo sis ema. El mé odo de
ex acción es á basado en la lisis enzimá ica y el uso nanopa ículas magné icas pa a la
cap u a de los ácidos nucleicos. El sis ema iene inco po ados dos e mociclado es pa a
ealiza PCR a iempo eal con pequeños olúmenes de eacción (PCR mic o luídica).
Pa a ealiza los expe imen os en es a pla a o ma se usó el ki MRSA XT (Beck on
Dikinson) pa a la de ección de S. au eus esis en e a me icilina. El olumen necesa io
pa a ealiza la p ueba es de 200 μl.
3.4.4 Búsqueda de sus ancias
Se usa on dis in as sus ancias que ue an impe meables en e a una memb ana
ín eg a, pe o con un amaño su icien e pa a se pe meables a memb anas dañadas.
Además, debían se suscep ibles de ene cie a a inidad o ac i idad sob e los ácidos
nucleicos, ya uese po unión es able a los mismos o po un e ec o de deg adación,
pudiendo así a ec a a la capacidad de se ampli icado y de ec ado median e PCR.
Dis in as sus ancias ue on p obadas sob e soluciones de bac e ias mue as compa adas
con bac e ias i as pa a comp oba el posible e ec o sob e la ampli icación median e
PCR, así como la posible oxicidad o algún e ec o de ec able en las bac e ias i as. Las
sus ancias ue on el EMA (E hidium monoazide b omide) como agen e colo an e pa a
inciones po su a inidad al ADN y dis in os ci os á icos (cispla ino, oxalipla ino,
mi omicina, ch omomicina, 5- luo acilo, camp o ecina, amsac ina, mi oxan ona,
elip icina, e oposido) con ac i idad sob e el ADN en quimio e apia.
3.4.4.1 Monoazida de E idio (EMA)
Se a a de una sus ancia colo an e in e calan e del ADN que sólo puede a a esa las
memb anas dañadas de bac e ias mue as, ya que es p ác icamen e impe meable al paso a
a és de es as, y que se une co alen emen e al ADN celula as su ac i ación con luz.
Pa a ealiza las p uebas se usó EMA suminis ado po Sigma-Ald ich (E hidium
Monoazide B omide, Re : 22028).
3.4.4.2 Cispla ino y Oxalipla ino
El cispla ino (Cis-Diamminepla inum(II) dichlo ide; e : P4394, SIGMA-
ALDRICH) y el oxalipla ino (Oxalipla in; e : O9512, SIGMA-ALDRICH) (Figu a 23)
son medicamen os usados en quimio e apia pa a el a amien o de a ios ipos de cánce .
Es os complejos basados en el pla ino son agen es alquilan es que eaccionan in i o con
el ADN celula median e puen es c uzados en e las bases, impidiendo así la eplicación
y la ansc ipción y causando la apop osis de la célula. Debido a es a a inidad po el
78
79
ADN, se p esen aban como moléculas candida as a se p obadas pa a desa olla el
p o ocolo de iabilidad. Ambos compues os ue on esuspendidos usando solución salina
al 0,9 %, que se usó ambién pa a p epa a las co espondien es diluciones.
Figu a 23: Imagen mos ando la es uc u a molecula del cispla ino (pa e supe io ) y del oxalipla ino
(pa e in e io ).
3.4.4.3 O as sus ancias con e ec o ci os á ico
El es o de sus ancias p obadas ue on suminis ados po la casa come cial Sigma-
Ald ich (ch omomicina (Re : C2659); 5- luo acilo; camp o ecina (Re : C9911);
amsac ina (Re : A9809); mi oxan ona (Re : M6545); elip icina (Re : E3380); e oposido
(Re : E1383). Pa a esuspende los se u ilizó solución salina al 0,9%. Todos ellos ue on
p obados a dis in as concen aciones (200 y 350 μg/ ml) pa a alo a su ac i idad sob e
bac e ias i as y mue as. Las incubaciones se lle a on a cabo a empe a u a ambien e
du an e 30 minu os. Los la ados pa a ecupe a las bac e ias y elimina los es os de
sus ancias se hicie on median e cen i ugación a 12.000 c du an e 5 minu os.
3.4.5 P uebas con Monoazida de E idio (EMA)
Pa a es as p uebas nos basamos en la me odología gene al disponible en un buen
núme o de publicaciones (230, 263, 252), pe o combinando algunas condiciones debido a
la a iación en e a ículos en pa áme os como la concen ación de a amien o o
iempos de incubación y exposición.
La o ma en la que se ob u ie on las bac e ias i as y mue as, así como la cepa de
e e encia de S. au eus u ilizada, son las indicadas en pun os an e io es. Siguiendo lo
iso en la li e a u a, el EMA ue esuspendido en DMSO al 20%. Las soluciones de
abajo se p epa a on a di e en es concen aciones pa a ealiza el a amien o. Las
concen aciones de a amien o inal p obadas ue on de 1.5, 5, 10 μg/ml inales de
79
80
EMA. Se usa on 750 μl de bac e ias i as y mue as po duplicado. A uno de los
duplicados de cada g upo de bac e ias se le añadió 750 μl de EMA y se deja on incuba
du an e 5 minu os en hielo y en oscu idad en uel o en papel de aluminio. A con inuación
se les qui o el papel de aluminio, y sob e el hielo se expusie on a una uen e de luz
si uada a 20 cm du an e 5 minu os. Pa a ello se usó una lámpa a halógena de 500 W. A
con inuación se cen i uga on las mues as a 12.000 c du an e 5 minu os y se
ecupe a on en el mismo olumen de pa ida de la mues a, pa a a con inuación ealiza
la ex acción de ácidos nucleicos y la pos e io de ección po PCR a iempo eal. Pa a el
sis ema de Ex acción MagNA Pu e se usa on 400 μL de mues a y el eluído se usó pa a
la PCR en el sis ema Ligh Cycle . Pa a el sis ema BD MAX se usa on 200 μL de mues a
y el sis ema ealizó de o ma au omá ica y con inuada la ex acción y la PCR a iempo
eal.
3.4.6 P ueba de con ol con ADN lib e a ado con cispla ino
An e la al a de e e encias de un uso pa ecido pa a es a sus ancia, se hizo es a
p ueba de unión a ADN lib e.
Pa a p oba la unión del cispla ino al ADN, y comp oba su posible e ec o
inhibi o io de la ampli icación median e PCR, se usó di ec amen e una solución con
ADN lib e a la que se le añadió el cispla ino. Como solución de ADN se usó uno de los
con oles posi i os de la PCR a iempo eal come cial Sep iFas (Roche) que de ec a de
o ma simul ánea has a 24 mic oo ganismos. En el ensayo de PCR se usó el cispla ino y
los con oles posi i os po sepa ado (haciendo de blanco y de con ol de ampli icación
espec i amen e), así como una se ie de mues as con dis in as p opo ciones de solución
de ADN y cispla ino, que se deja on incuba a empe a u a ambien e 10 minu os an es de
usa los pa a la ampli icación. Las mues as del expe imen o se mues an en la Tabla 6.
Tabla 6: Lis ado con las mues as usadas en la p ueba de ampli icación con cispla ino.
1
Cispla ino 1.400 μg/ml (50 μl)
2
RC G(-) (50 μl)
3
RC G(-) (50 μl)
4
50 μl RC G(-) + 10 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
5
50 μl RC G(-) + 30 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
6
50 μl RC G(-) + 50 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
7
50 μl RC G(-) + 70 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
8
50 μl RC G(-) + 90 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
9
25 μl RC G(-) + 50 μl Cispla ino 1.400 μg/ml
80
81
3.4.7 Condiciones iniciales de abajo con cispla ino
Pa a es ablece las condiciones inales de abajo se p oba on dis in as condiciones
de concen ación de a amien o con cispla ino, así como iempos y empe a u as de
incubación de dicho a amien o. Inicialmen e, se p oba on en el sis ema Ligh Cycle
unas condiciones de incubación a empe a u a ambien e, du an e 10 minu os, y con unas
concen aciones de 200 y 250 μg/ml. El siguien e paso en es e sis ema ue cambia las
condiciones amen ando la concen ación del cispla ino a 350 μg/ml con unos iempos de
incubación de 35 y 45 minu os.
En es e pun o se in en ó compa a cie as condiciones de o ma pa alela en el
sis ema BD MAX y en Ligh Cycle . Las condiciones a compa a consis ie on en un
iempo de incubación de 45 minu os, con una concen ación de cispla ino de 350 μg/ml,
y con una empe a u a de incubación de 37 ºC. El uso de es a empe a u a se basó en el
hecho de que el cispla ino iene un uso como agen e quimio e ápico en humanos
inyec ándose en sang e, y po an o es á ac uando a empe a u a co po al.
Finalmen e, se p obó en el sis ema BD MAX un aumen o de la concen ación a 700
μg/ml man eniendo el iempo (45 minu os) y la empe a u a de incubación (37ºC). Es as
condiciones son las que inalmen e se adop a on pa a el p o ocolo. Los de alles de los
dis in os pasos del p o ocolo usando es as condiciones se explican en los siguien es
apa ados.
Cuando hablamos de concen ación de cispla ino, nos e e imos siemp e a
concen ación de a amien o inal. Es deci , la esul an e as añadi el olumen de
cispla ino a la mues a con bac e ias.
3.4.8 P uebas de a amien o con oxalipla ino
T as los ensayos ealizados con el cispla ino se decidió p oba o o compues o
de i ado del mismo. En los ensayos con el oxalipla ino se usa on algunas de las
condiciones de abajo usadas con el cispla ino usando los mismos pasos.
3.4.9 P o ocolo de a amien o con cispla ino usando cen i ugación
Una ez es ablecidas las condiciones del ensayo, el p oceso comple o de de ección
selec i a de bac e ias i as se ía el siguien e:
A pa i de la bac e ia c ecida en placa (SARM ATCC 43300), se p epa ó una
solución 0,5 McFa land en agua, que luego se ajus ó haciendo una dilución 1/100 a una
concen ación ap oximada de 1E4 c u/ml. Es a solución bac e iana ue di idida en dos, y
una de esas pa es se some ió a un shock é mico poniéndola en un baño a 80ºC du an e 3
minu os pa a consegui el g upo de bac e ias mue as, pasándolas a con inuación a hielo
unos minu os pa a a empe a la solución y e i a un de e io o excesi o po acción del
calo . La o a po ción de la solución bac e iana se án las bac e ias i as. Hicimos una
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siemb a en placa de aga sang e an o de bac e ias i as (10 μl) como de las mue as (100
μl) pa a comp oba si ealmen e había o no c ecimien o, espec i amen e. A
con inuación, y pa a cada una de las dos soluciones, se ans i ió 1 ml de bac e ias a dos
ubos nue os, ob eniendo así dos mues as po cada una de las soluciones bac e ianas:
una de ellas a modo de con ol sólo con bac e ias, y el o o con bac e ias a las que se le
añadi á cispla ino pa a se a adas.
Una ez p epa adas las mues as, necesi amos p epa a una solución de cispla ino a
una concen ación adecuada pa a el a amien o pos e io . La mues a y el cispla ino se
mezcla án en olúmenes iguales, po lo que el cispla ino se p epa ó al doble de
concen ación de la eque ida pa a el a amien o. Po eso se p epa ó el cispla ino a una
concen ación de 1.400 μg/ml. Tan o pa a esuspende como pa a p epa a las diluciones
de cispla ino se debe usa solución salina al 0,9% de clo u o sódico. Una ez lis o el
cispla ino, se añadió 1 ml sólo en los ubos de las mues as que iban a se a adas,
dejando a su pa co espondien e sin cispla ino pa a usa lo como con ol. Una ez
añadido el cispla ino, mezclamos po in e sión a ias eces e incubamos en es u a a
37ºC du an e 45 minu os en un agi ado o bi al. Aquellos ubos que no lle an cispla ino
ambién se some ie on a es a incubación, y seguie on el mismo p oceso que los o os en
odo momen o.
T as la incubación, pa a elimina los es os de la solución de cispla ino y e i a su
in e e encia en la de ección, se cen i uga on los ubos a 12.000 c du an e 5 minu os,
desca ando después el sob enadan e y la ando en 1 ml de agua. A con inuación,
ol imos a cen i uga a 12.000 c du an e 5 minu os, eliminando pos e io men e el
sob enadan e y ecupe ando en 1 ml de agua. Es as cen i ugaciones se hicie on a odas
las mues as, las a adas y las no a adas con cispla ino.
Una ez ecupe adas las mues as, ya se puede ealiza la ex acción de ácidos
nucleicos pa a pode hace la de ección po PCR a iempo eal. Es e p oceso se lle ó a
cabo en dos sis emas dis in os, bien de o ma indi idual o de o ma simul ánea en ambos.
Pa a con inua con el sis ema au omá ico BD MAX ue necesa io ans e i 200 μl de
nues a solución al ubo de mues a del ki de ex acción, mezcla po o eado, coloca
los eac i os de ex acción y de PCR del ki en la i a de eacción, e in oduci lo odo en
el sis ema. En es e, odo el p oceso se lle ó a cabo de o ma au oma izada sin necesidad
de más manipulación has a el momen o de la isualización del esul ado inal. Cuando el
p oceso se con inúa haciendo con el sis ema au omá ico de ex acción MagNA Pu e, se
necesi ó aspasa 400 μl de la mues a a un ubo de mues a acío que se si ua á en el
sis ema jun o con el es o de eac i os pa a la ex acción. Una ez acabada la es a, se
ecupe ó el eluído (200 μl), y se usa on 50 μl con 50 μl del eac i o del ki de PCR a
iempo eal Sep iFas pa a ealiza la ampli icación en el e mociclado Ligh Cycle .
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3.4.10 Mezcla de bac e ias ías y mue as (VM)
Pa a comp oba el uncionamien o del p o ocolo en una mezcla he e ogénea, se
ealizó el mismo a amien o pe o a una mues a compues a po la mezcla de bac e ias
i as y mue es. Las soluciones bac e ianas se p epa a on en la misma concen ación y
del mismo modo que en el p o ocolo ya ci ado, y luego se mezcla on en olúmenes
iguales pa a cons i ui la mues a de abajo. El p o ocolo se lle ó a cabo de la o ma
habi ual, some iendo al a amien o con cispla ino sólo a uno de los duplicados de la
mues a, dejando al o o como con ol.
3.4.11 P o ocolo de a amien o con cispla ino en sang e usando cen i ugaciones
Pa a p oba el e ec o del a amien o en una mues a eal, se usó sang e de pacien es
sanos, a la que se le añadió bac e ias pa a asemeja la a una mues a clínica de un pacien e
con sepsis. Como se menciona a con inuación, las bac e ias en sang e se in en a on
ecupe a po cen i ugación p e iamen e al a amien o con cispla ino, ya que es e
mues a a inidad pa a uni se a p o eínas, además de pode in e ac ua con la acción
celula de la sang e, lo que ha ía di ícil con ola las condiciones del a amien o pa a
ealiza el es .
A pa i de la bac e ia c ecida en placa se p epa ó una solución 0,5 McFa land. A
pa i de es a, se omó pa e de la solución y se some ío a un shock é mico en un baño a
80 ºC du an e 3 minu os pa a consegui las bac e ias mue as necesa ias pa a la p ueba, y
se pasa on inmedia amen e a hielo pa a a empe a la solución. A pa i de las dos
soluciones que ob u imos aho a (bac e ias i as y mue as), se hizo una dilución
di ec amen e en sang e pa a consegui una concen ación ap oximada de 1E4 c u/ml pa a
cada una. La sang e con bac e ias se dejó en e 5-10 minu os en agi ación a empe a u a
ambien e pa a que se mezclasen las bac e ias en la o alidad de la mues a. A
con inuación, cada mues a se di idió en dos pa a que, a la ho a del a amien o con
cispla ino, añadí selo solamen e a uno de los ubos de cada g upo (a un ubo con
bac e ias i as y a un ubo con bac e ias mue as). Así nos quedamos con un duplicado
que se i á como con ol pa a cada g upo. Además, se usó ambién una po ción de la
sang e sin bac e ias que se usó como blanco. Tan o pa a la sang e con bac e ias como
pa a el blanco, el olumen o al ue de 1 ml. A con inuación, las mues as ue on
cen i ugadas a 150 c du an e 5 minu os y se ecupe a on los sob enadan es. Es os se
cen i uga on a 20.000 c du an e 2 minu os, se eliminó el sob enadan e, se
esuspendie on en 1 ml de agua y se cen i uga on de nue o (20.000 c , 2 minu os). A
con inuación se eliminó el sob enadan e y se esuspendie on en 1 ml de agua. Una ez
ecupe adas las mues as, añadimos 1 ml de cispla ino a 1.400 μg/ml a uno de los
duplicados de bac e ias i as y de bac e ias mue as, y al o o duplicado y al blanco se
les añadió 1 ml de agua pa a comple a el olumen. Todas las mues as se incuba on a 37
ºC du an e 45 minu os en un agi ado o bi al. Al inaliza la incubación, las mues as se
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cen i uga on a 12.000 c du an e dos minu os, se eliminó el sob enadan e, y se
esuspendie on en 1 ml de agua. Repe imos es e paso y ya ob u imos la mues a inal
lis a pa a el p oceso de ex acción y de ección. En es e pun o, podemos usa la mues a
pa a ex ae sólo en uno de los sis emas o po ambos a la ez. Pa a lle a a cabo la
ex acción y de ección en el sis ema BD MAX, se necesi a pone 200 μl de mues a en el
ubo de ex acción con ampón, p epa a los eac i os de ex acción y de PCR a iempo
eal del ki , y lanza el expe imen o. Pa a el sis ema MagNA Pu e se usan 400 μL de la
mues a, y pos e io men e 50 μL del ADN ex aído pa a la PRC en el sis ema
Ligh Cycle .
3.5 NANOPARTÍCULAS Y VIABILIDAD (TEST DE VIABILIDAD)
3.5.1 Cap u a de bac e ias mue as
Pa a asegu a la u ilidad de las nanopa ículas pa a la cap u a no sólo de bac e ias
i as, se ealiza on p uebas de cap u a en el mismo modo que p e iamen e se p oba a
pa a de e mina la cap u a con dis in os mic oo ganismo i os. De es o modo
ga an iza íamos la u ilidad pa a la de ección en el p o ocolo de iabilidad.
El p ocedimien o consis ió en p epa a una solución bac e iana en agua a una
concen ación eó ica de 1E4 c u/ml con la cepa de e e encia ya usada (S. au eus ATCC
43300). Pa e de es a solución se in odujo en un baño a 80 ºC du an e 3 minu os y se
pasó a hielo pa a a empe a . Tan o la bac e ia i a como la mue a se semb a on en placa
de aga sang e pa a es ima la can idad ap oximada de colonias usadas, así como pa a
comp oba la ausencia de c ecimien o, espec i amen e. En el caso de las i as se
semb a on 10 μl, y 100 μl en el caso de las mue as, y se incuba on a 37 ºC. Con ambas
pa ículas (NANO MR y ApoH) se siguió el mismo p ocedimien o de sepa ación
indicado en los apa ados an e io es y usando el sis ema au omá ico BD MAX con el ki
de de ección MRSA XT pa a la de ección po PCR a iempo eal.
3.5.2 Sis ema au omá ico usado en los ensayos con pa ículas
Pa a lle a a cabo los ensayos del es de iabilidad usando nanopa ículas
magné icas, y a pesa de que en ambos sis emas la ex acción de ácidos nucleicos y su
de ección se mos ó compa ible con el uso de ambas, inalmen e se op ó po lle a los a
cabo únicamen e en el sis ema BD MAX con el ki de de ección MRSA XT. Es a
decisión ue basada en los esul ados de los expe imen os p e ios y en la acilidad de
manejo de es e sis ema, po in eg a de o ma au omá ica en un mismo apa a o la ase de
ex acción y de ampli icación.
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3.5.3 P o ocolo iabilidad en solución con las nanopa ículas de NANO MR
Pa a lle a a cabo las p uebas se siguió el mismo p o ocolo ya desc i o, pe o
cambiando las cen i ugaciones de ecupe ación de bac e ias y de la ado del cispla ino
po el uso de nanopa ículas magné icas de unión especí ica a mic oo ganismos.
A pa i de la bac e ia c ecida en placa (S. au eus ATCC 43300), se p epa ó una
solución 0,5 McFa land en agua que luego se ajus ó a una concen ación ap oximada de
1E4 c u/ml. Es a solución bac e iana ue di idida en dos, y una de esas pa es la
some imos a un shock é mico poniéndola en un baño a 80ºC du an e 3 minu os pa a
consegui el g upo de bac e ias mue as, pasándolas a con inuación a hielo unos minu os
pa a a empe a la solución y e i a un de e io o excesi o po acción del calo . La o a
po ción de la solución bac e iana se án las bac e ias i as. Hicimos una siemb a en placa
de aga sang e an o de bac e ias i as (10 μl) como de las mue as (100 μl) pa a
comp oba si ealmen e había o no c ecimien o espec i amen e. A con inuación, y pa a
cada una de las dos soluciones, se pasó 1 ml o 500 μl (pa ículas NANO MR y ApoH,
espec i amen e) de bac e ias a dos ubos nue os, ob eniendo así dos mues as po cada
una de las soluciones bac e ianas: una de ellas a modo de con ol sólo con bac e ias, y el
o o con bac e ias a las que se le añadi á cispla ino pa a se a adas en pasos pos e io es.
En es e pun o es donde p epa amos cada una de las nanopa ículas pa a pode añadi las a
las soluciones bac e ianas pa a ecupe a las bac e ias.
Las pa ículas de NANO MR se p opo cionan en o ma de es e a sólida, po lo que
es necesa io esuspende las con 10 ml de un ampón de unión p opio del ki . Una ez en
modo líquido, se añadió 1 ml de pa ículas en cada ubo con 1 ml de bac e ias. A
con inuación se incuba on a 37 ºC du an e 35 minu os en un agi ado o bi al pa a
ga an iza que las pa ículas se mezclasen con inuamen e a a és de oda la mues a. Al
inaliza la incubación, los ubos se pusie on en un imán du an e 10 minu os a
empe a u a ambien e, y luego se e i ó el líquido. Se añadie on 2 ml de ampón de
la ado, se esuspendie on de nue o las pa ículas, y se si ua on o a ez los ubos 5
minu os en el imán. Es e paso se epi ió una ez más, y inalmen e eliminamos el líquido,
ecupe ando las pa ículas en 1 ml de agua.
Una ez ecupe adas las pa ículas con las bac e ias unidas, se semb a on 10 μl de
cada ubo pa a comp oba que seguía habiendo c ecimien o o no, según co espondiese.
Cuando se ecupe an las bac e ias unidas a las pa ículas ya se le puede añadi el
cispla ino p epa ado a 1.400 μg/ml sólo a uno de los duplicados de cada g upo de
mues as ( i as y mue as). Añadimos 1 ml de cispla ino sob e 1 ml de mues a
ecupe ada con las pa ículas. A los duplicados que no se les añadió cispla ino se les
añadió igual olumen de agua. Se mezcla on bien y se incuba onn odas las mues as a
37 ºC du an e 45 minu os con agi ación con inua en un agi ado o bi al. T as la
incubación, se pusie on odas las mues as en el imán du an e 10 minu os a empe a u a
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93
4.1 NANOPARTÍCULAS Y EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADSORCIÓN
INESPECÍFICA)
4.1.1 Valo ación inicial del endimien o con el sis ema come cial HAMILTON
kPCR (SIEMENS)
T as las ex acciones ealizadas con las mezclas de plásmidos, nos encon amos con
que en las concen aciones ele adas de nues as se ies es donde el sis ema pa ece ene
un meno endimien o y posiblemen e se sa u e la capacidad de unión de las pa ículas,
an o po su p opio amaño como po la concen ación a la que se encuen an. Aún así, se
e una ápida subida en el endimien o del ADN ecupe ado que en algunos de los
pun os alcanzó alo es en e el 18 y 20 %. De odos modos, en la Tabla 7 se mues an de
o ma esumida los alo es medios de los esul ados ob enidos en los ensayos.
Tabla 7: Tabla con un esumen de los alo es medios de las can idades de ADN in oducido y ecupe ado del
sis ema, así como del endimien o de esa ex acción.
4.1.2 Valo ación de nue as nanopa ículas en el sis ema HAMILTON kPCR
(SIEMENS)
Al ealiza las ex acciones de ADN plasmídico usando nues as nanopa ículas, y
lle a a cabo las mediciones y es ima las concen aciones de ADN ecupe ado y el
po cen aje ecupe ado pa a calcula el endimien o, nos encon amos con unos
po cen ajes muy bajos de ecupe ación. De hecho, con muchas de las pa ículas es os se
mue en po alo es in e io es al 0,1 % incluso en los pun os de concen aciones más
ele ada, aunque con una endencia a mejo a a medida que disminuía la can idad inicial
de ADN en la mues a. De odas las pa ículas mencionadas, solamen e las FeO-2206
des acan con unos alo es mayo es, que se si úan en o no al 6% (de alo medio en los
μg o ales de inicio
μg o ales de ecupe ados
Rendimien o (%)
212
1,866
0,88
86,6
1,398
1,614
39,9
1,364
3,419
18,140
1,015
5,595
8,640
0,816
9,443
4,030
0,494
12,256
1,907
0,305
15,998
0,929
0,119
12,809
0,450
0,054
11,71
0,222
0,029
13,140
0,108
0,014
13,03
93
94
mejo es casos), cuando nos ijamos en aquellas mues as con menos can idad de ADN de
pa ida. En las siguien es igu as se mues a la ep esen ación g á ica de los esul ados de
las pa ículas FeO-2206, FeO-2202 y FeO-2204. En la Figu a 24 se puede e una g á ica
compa a i a en e las es pa ículas donde se e una cla a di e encia en la can idad o al
de ADN ecupe ada, sob e odo en los pun os iniciales que co esponden a las mues as
de pa ida con más can idad inicial de ADN. Algo simila podemos e ijándonos en la
Figu a 25, donde se ep esen an los alo es medios del endimien o en la ex acción
(po cen aje ex aído) de cada una de las pa ículas. Se puede e nue amen e el mejo
uncionamien o de las pa ículas 2206 espec o a las o as, y mos ando los mejo es
po cen ajes de ecupe ación en condiciones de poca can idad de ADN de pa ida.
Figu a 24: Compa a i a de la can idad o al de ADN ecupe ado en μg o ales en e las es pa ículas. Los
alo es debajo de cada g upo de ba as se co esponden con las can idades o ales iniciales ( alo es medios) de
ADN en μg in oducidas en el sis ema en o den dec ecien e.
94
95
Figu a 25: Compa a i a del endimien o global de la ex acción (%) de ADN pa a las es pa ículas.
Las o as pa ículas, FeO-2206-APS, FeO-2207 y FeO-2207-APS, mues an alo es
aún más bajos (po debajo de 0,1% de ecupe ación), po lo que no se mues an en la
g á ica ya que no apo an más in o mación y las cu as sólo se supe pond ían como ya lo
hacen las mos adas en el g á ico.
4.1.3 Compa a i a con la medida de e e encia en el HAMILTON kPCR
Como la única pa ícula con esul ados suscep ibles de se álidos y compa ables ue
la FeO-2206, es es a la única que usa emos pa a compa a con las p uebas iniciales
ealizadas con el sis ema HAMILTON kPCR omado como e e encia. En la Figu a 26
podemos e como a la ho a de compa a el o al de ADN ex aído, las pa ículas 2206
pa ecen se lige amen e in e io es en su capacidad de ecupe ación mien as que esa
capacidad se iguala en algunos pun os, y en o os has a pa ece mejo a cuando nos
ijamos en los pun os inales co espondien es a meno es can idades de ADN de inicio.
De odos modos, si nos ijamos en los alo es numé icos en la pa e baja del g á ico, nos
encon amos con una elación bas an e pa eja en e el sis ema o iginal y el uso de las
pa ículas 2206.
95
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Figu a 26: Compa ación de los alo es de ADN o al ex aído po el sis ema HAMILTON kPCR usando sus
p opias pa ículas con el uso de las pa ículas 2206. Desde el pun o uno al ocho se ep esen a la can idad inicial
de ADN en o den dec ecien e.
4.1.4 Funcionalización de las pa ículas
Las pa ículas uncionalizadas con APS con el obje i o de mejo a la unión del ADN
y mejo a la ecupe ación se lle ó a cabo con las dos pa ículas ya desc i as y
denominadas como FeO-2206-APS y FeO-2207-APS. La p incipal di e encia en el
diseño de es as pa ículas adica en las dimensiones del núcleo de magne i a, ya que en la
FeO-2207-APS iene casi el doble de diáme o.
Como ya se mencionó en el pun o an e io , no se consiguió ealiza ex acciones con
una can idad de ADN des acable, ol iendo a encon a alo es po debajo del 0,1 % en
el caso de las FeO-2206-APS, e incluso llegando a pun os sin de ección de ADN en el
caso de las FeO-2207-APS. Po ese mo i o no se mues a ninguna g á ica con e e encia
a ningún da o numé ico.
4.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STHAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A
METICILINA
T as el p ime análisis pa a los 101 aislados de MRSA con las dos écnicas
molecula es (BDMax™ MRSA Assay y Ligh Cycle ® MRSA Ad anced Tes ) nos
encon amos con esul ados dis in os en e ambas écnicas. Se ob ienen un o al de 84
aislados posi i os po ambas écnicas, un o al de 10 aislados nega i os en ambos
96
97
sis emas, y un o al de 7 aislados ue on posi i os en el sis ema BD MAX y nega i os en
el sis ema Ligh cycle . Todos los aislados nega i os se ol ie on a epe i con ambas
écnicas pa a con i ma los esul ados. Además, pa a in en a explica es os esul ados
nega i os, se lle a on a cabo dos nue os es s a es os aislados. Es os dos ensayos ue on
el sis ema de iden i icación Vi ek®2 y el es de la coagulasa. Los esul ados ob enidos
mos a on que es de los aislados que se man enían como nega i os en el eanálisis
ue on iden i icados po el Vi ek®2 y el es de la coagulasa como S. epide midis, y po
an o se e i a on del g upo de es udio. Po o o lado, en el eanálisis con las dos écnicas
molecula es, o os es aislados esul a on posi i os po el sis ema BD MAX, pe o se
man u ie on como nega i os en el sis ema Ligh Cycle . Además, es os es aislados
ue on con i mados como SARM con los esul ados ob enidos en el Vi ek®2 y con la
p ueba de la coagulasa.
De es e modo, as el eanálisis de los aislados con esul ado disc epan e,
ob end íamos los siguien es alo es. Tend íamos un o al de 84 aislados posi i os con
ambas écnicas molecula es, un o al de 4 aislados nega i os en ambos sis emas, y un
o al de 10 aislados posi i os en BD MAX y nega i os en Ligh Cycle . Un esumen
global de es os da os se mues a en la Figu a 27.
.
Figu a 27: Resul ados globales pa a el análisis de la de ección de MRSA usando las écnicas de de los sis emas
BD Max y ROCHE.
97

98
Como ya se mencionó, se usa on o as écnicas con el obje i o de escla ece es os
esul ados nega i os ob enidos en ambos sis emas. Po un lado se usó el ki “BD MAX
S aph SR” en odos los aislados, nega i os y posi i os. Lo que nos encon amos es un
cambio en el esul ado pa a dos de ellos: uno con esul ado posi i o con el es
“BDMax™ MRSA Assay” esul a ía aho a nega i o, y uno nega i o se ía posi i o con
es e nue o es .
Al mismo iempo, se ealizó el análisis de dis ancias genómicas usando el ensayo
“Di e silab™ S aphylococcus ki ” (bioMe ieux). Con el uso de es a ecnología uimos
capaces de compa a los di e en es aislados y encon a una cie a ag upación de los
mismos. Como se e en la Figu a 28, los aislados nega i os y los posi i os usados como
con oles, es án o denados po p oximidad genómica, po pa ón elec o o é ico y con
alo es de p oximidad en po cen aje. Al con a io de lo espe ado, los g upos de mues as
nega i as (POS BD MAX/ NEG ROCHE y NEG BD MAX/ NEG ROCHE) apa ecen
mezcladas den o de los mismos g upos. De es e modo, es e análisis no nos pe mi e
disc imina di e encias gené icas cla as que puedan explica las disc epancias de
esul ados en e ambos sis emas, mos ándonos que el BD MAX puede de ec a algunas
mues as pe o no o as con al menos un 95% de homología.
Figu a 28: Análisis de dis ancias gené icas usando ep-PCR ob eniendo un dend og ama con los aislados
o denados po simili ud gené ica, po pa ón elec o o é ico y con los alo es de po cen aje de simili ud en e
ellas. En cuad os ama illos se mues an los aislados nega i os pa a ambos sis emas. En cuad os ojos los
aislados posi i os pa a BD MAX y nega i os pa a Ligh cycle . Sin cuad o se mues an mues as posi i as po
ambos sis emas usadas como con oles.
98
99
Pa a ob ene más in o mación de es os aislados, se usa on o as dos écnicas
molecula es, “GenoType® MRSA es ” y “Fluo oType® MRSA es ” (HAIN
Li escience). Con el ensayo GenoType® MRSA, odas las mues as ue on posi i as pa a
el gen meca, a pesa de su esul ado nega i o con al menos una de las écnicas iniciales.
Además, es de ellas ue on iden i icadas como SARM adqui idos en la comunidad po
la de ección del ac o PVL. Con el ensayo Fluo oType® MRSA solo es mues as
seguían siendo nega i as pa a MRSA.
El análisis ealizado median e la espec ome ía de masas iden i icó a odos los
aislados como S. au eus, con i mando lo que el es o de ensayos nos indicaban. Cuando
se ealizó el análisis de los espec os pa a cada aislado (al menos 20) pa a ob ene un
espec o único de e e encia, se pudo ealiza una compa ación de la simili ud en e
aislados con un dend og ama que nos indica ía las dis ancias en e ellos. En la Figu a 29
se mues a el dend og ama esul an e pa a los aislados disc epan es, donde las di e encias
en e ellos se ep esen an po las dis ancias en e cada ama. Lo que podemos e
cla amen e es una ag upación de los aislados. Po un lado, los cua o aislados
inicialmen e nega i os pa a ambos sis emas se encuen an en la pa e supe io del
dend og ama, cla amen e sepa ados de los aislados con esul ado posi i o pa a BD MAX
y nega i o pa a Ligh Cycle . Y ambos g upos sepa ados po la cepa de e e encia ATCC
43300 pa a MRSA. Es o pa ece indica nos una cie a di e encia en e los aislados, lo que
pod ía in lui a la ho a de la de ección en cada uno de los ensayos molecula es.
Figu a 29: Dend og ama ob enido median e el análisis de los espec os ob enidos median e espec ome ía de
masas donde se en los dos g upos de aislados con esul ado nega i o pa a MRSA cla amen e sepa ados y
ag upados.
99
100
Aunque es a in o mación pa ecía indica cie a di e encia en e es os aislados, la
posibilidad de ob ene una ca ac e ización gené ica más comple a que nos pudiese
explica los esul ados nos lle ó a ealiza un ipado basado en un ensayo de PCR pa a
de ini el ipo de SCCmec al que pe enece cada uno. T as el análisis elec o o é ico de
los ampli icados, nos encon amos con cua o ipos dis in o de SCCmec en e nues os
aislados: 2 de ellos pe enecien es el Tipo V, 2 al Tipo II, 7 al ipo IV y 2 al Tipo III.
Además, pa a dos de los aislados no ue posible asigna les a un ipo conc e o as epe i
la PCR. Es os da os se elaciona on con el dend og ama ob enido po el análisis median e
espec ome ía de masas pa a in en a iden i ica la posible o mación de g upos (Figu a
30).
En la Tabla 8 se mues a un esumen de los esul ados ob enidos pa a los aislados
disc epan es con odas las écnicas usadas.
Tabla 8: Resumen de los esul ados ob enidos en el análisis de aquellos aislados disc epan es pa a su asignación
como MRSA. En ojo se mues an los aislados que inicialmen e ue on posi i os pa a BD MAX y nega i os pa a
Ligh Cycle . En ama illo se mues an aquellos que ue on nega i os inicialmen e con ambos sis emas.
100
101
Figu a 30: Asiganción de los Tipos SCCmec ob enidos median e PCR pa a cada aislado sob e el dend og ma
ob enido median e espec ome ía de masas.
4.3 DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE ADSORCIÓN ESPECÍFICA CON
NANOPARTÍCULAS
4.3.1 P uebas de cap u a de mic oo ganismos: pa ículas NANO MR
Cuando se ealiza on las p uebas de cap u a de mic oo ganismos con es as pa ículas
se obse ó que, as in oduci la solución inal de pa ículas en el sis ema de ex acción
MagNA Pu e y ealiza la ampli icación en el sis ema Ligh Cycle usando el ki de
de ección Sep iFas , odos los mic oo ganismos usados ue on de ec ados po PCR a
iempo eal en base al análisis de las empe a u as de mel ing de los ampli icados. Lo
único nega i o a des aca es el hecho de que pa a E. aecium se ob ienen picos de mel ing
siemp e muy p óximos a la línea base indicando poca señal. Cuando es e
mic oo ganismo se p ueba de o ma indi idual, los esul ados se man ienen.
Cuando la p ueba ue ealizada en el sis ema au omá ico BD MAX con el ki de
de ección MRSA XT, se io ambién que la ampli icación e a posi i a pa a las mues as
usadas.
Lo que ambién se io con es os esul ados ue la compa ibilidad de es as pa ículas
de adso ción especí ica a mic oo ganismos pa a se usadas en ambos sis emas
au omá icos de ex acción, ambién basado en pa ículas magné icas, pe o de adso ción
inespecí ica a ácidos nucleicos. Una mues a de los esul ados ob enidos se puede e en
101
108
Figu a 39: Resumen de esul ados de ampli icación ob enidos en el sis ema Ligh Cycle pa a dis in as
concen aciones de a amien o con EMA.
Al e los esul ados ob enidos en el sis ema BD MAX (Figu a 40), emos como al
mismo iempo que se no a un cie o e ec o de inhibición sob e las bac e ias mue as,
e lejado en un a aso cla o en el inicio de la ampli icación, se no a ambién el mismo
e ec o sob e el g upo de bac e ias i as. Y es e e ec o se acen úa en ambos g upos de
bac e ias al aumen a al aumen a la concen ación de a amien o con EMA.
Figu a 40: Resumen de esul ados de ampli icación ob enidos en el sis ema BD MAX pa a dis in as
concen aciones de a amien o con EMA.
108

109
4.4.2 P ueba de con ol de cispla ino con ADN lib e
Al ealiza la p ueba de ampli icación de ADN lib e mezclado con cispla ino, lo que
nos encon amos es que ninguna de las mues as que lle an el ci os á ico es ampli icada,
así como aquellas que lle an únicamen e el ci os á ico. Además, se e que los con oles
de ADN a los que no se le añadió el cispla ino ienen una ampli icación cla a. El
esul ado se puede e en laFigu a 41.
Figu a 41: Cu as de ampli icación y picos de mel ing pa a la p ueba de ADN lib e mezclado con cispla ino.
4.4.3 Condiciones iniciales de abajo con cispla ino
Con los p ime os ensayos usando cispla ino y en la pla a o ma Lig hCycle nos
encon amos con un lige o e ec o sob e las bac e ias mue as. En la Figu a 42 se mues a
el esul ado de uno de los ensayos, en los que se usó cispla ino con incubación a
empe a u a ambien e du an e 10 minu os a concen aciones de 200 y 250 μg/ml. En la
imagen de la izquie da se mues a el g upo de bac e ias i as ( a adas y no a adas),
donde no se pe cibe e ec o de a aso en las cu as de ampli icación. En la imagen de la
de echa se puede e el g upo de bac e ias mue as, y como aquellas que ue on a adas
mues an un lige o pe o pe cep ible a aso en el pun o de inicio de la ampli icación, así
como en la al u a de las cu as. En la Tabla 10 se mues an los alo es numé icos pa a
los C de cada mues a donde se en los lige os e ec os de e a do en la ampli icación de
3 y 4 ciclos en las bac e ias mue as a adas.
Tabla 10: Valo es de C pa a las mues as en la p ueba con cispla ino a 200 y 250 μg/ml.
Mues a
Cp
Cp
Mues a
V
26.10
27.67
M
V200
26.43
30.69
M200
V250
28.10
31.90
M250
109
110
Figu a 42: Resul ado de las p uebas con cispla ino a 200 y 250 μg/ml du an e 10 minu os a empe a u a
ambien e. Se mues an en ojo las mues as que ue on a ada,s y con el núme o que indica la concen ación de
dicho a amien o. A la izquie da se mues a el g upo de las bac e ias i as. A la de echa se mues a el g upo de
las bac e ias mue as.
El o o g upo de ensayos buscando la inhibición de la ampli icación en bac e ias
mue as se hizo aumen ando la concen ación de cispla ino en el a amien o, así como
aumen ando el iempo de incubación del mismo. En la Figu a 43 se mues a el esul ado
del a amien o con cispla ino a una concen ación de 350 μg/ml du an e 35 y 45 minu os,
a empe a u a ambien e. Lo que nos encon amos espec o a las p ime as p uebas es que
ya se no a un a aso muy e iden e en el inicio de la ampli icación a ambos iempos de
a amien o, siendo más in enso pa a el a amien o a 45 minu os. En es e se e, además
del a aso, una caída muy ele ada en la al u a de la cu a. En la Tabla 11 se mues an los
alo es de C pa a las mues as, donde nos encon amos con has a diez ciclos de e a do
cuando compa amos las bac e ias mue as no a adas con aquellas bac e ias mue as
a adas du an e 45 minu os. Lo que imos ambién ue un e ec o sob e las bac e ias
i as a adas que se mani ies a en o no a los 7 ciclos si compa amos aquellas no
a adas con las a adas du an e 45 minu os.
Figu a 43: Resul ado de las p uebas con cispla ino a una concen ación de 350 μg/ml. En ojo se mues an las
mues as a adas, indicando con un núme o el iempo de a amien o al que se some ie on. A la izquie da se
mues a el g upo de las bac e ias i as. A la de echa se mues a el g upo de las bac e ias mue as.
110
111
Mues a
Cp
Cp
Mues a
V
27.93
29.67
M
V350 (35)
32.11
36.38
M350 (35)
V350 (45)
34.94
39.87
M350 (45)
Tabla 11: Valo es de C pa a las mues as en la p ueba con cispla ino a 350 μg/ml du an e 35 y 45 minu os.
El siguien e g upo de p uebas se lle ó a cabo ambién en o o sis ema de ex acción
y PCR in eg ada, el BD MAX. Las condiciones de a amien o consis ían en cispla ino a
350 μg/ml du an e 45 minu os, pe o pe o con incubación en una es u a a una empe a u a
de 37 ºC. En la Figu a 44 se mues an los esul ados compa ados en ambos sis emas. Si
nos ijamos en los esul ados ob enidos en el Ligh Cycle , emos como se man iene sólo
un lige o e ec o del a amien o sob e las bac e ias mue as, y ambién como pa ece
a enua se el e ec o inicial is o sob e las bac e ias i as. Si nos ijamos en los esul ados
ob enidos en el BD MAX, podemos e como se man iene el e ec o cla o sob e las
bac e ias mue as a adas man eniendo unos 7 ciclos de e aso espec o al con ol no
a ado, y sin mos a un e ec o signi ica i o en las bac e ias i as.
Aún así, no se consiguió la inhibición en es as condiciones. Las condiciones inales
que nos ap oximan a ese obje i o son las que se mues an usan en los pun os siguien es,
donde la concen ción de a amien o con cispla ino se es ablece en 750 μg/ml, a 37 ºC
du an e 45 minu os.
111
112
Figu a 44: Resul ados pa a el a amien o con cispla ino a 350 μg/ml du an e 45 minu os a 37 ºC. En la pa e
supe io se mues an los esul ados ob enidos en el sis ema Ligh Cycle . En la pa e in e io se mues an los
esul ados pa a el sis ema BD MAX.
4.4.4 P ueba de iabilidad usando cen i ugaciones
Una ez comp obado el e ec o inhibi o io del cispla ino y las condiciones óp imas
pa a el a amien o de las mues as, se ealiza on nue as p uebas pa a ga an iza los
esul ados del p o ocolo de a amien o p e io a la de ección. Es as condiciones consis en
el el a amien o con cispla ino a 750 μg/ml, du an e 45 minu os, a 37 ºC.
Como se menciona an e io men e, las p uebas se ealizan a pa i de una solución
bac e iana. Como se mues a en la Figu a 45 y la Figu a 46, emos que con el
a amien o que ealizamos con cispla ino conseguimos la inhibición comple a en la
ampli icación de las bac e ias mue as en la mayo ía de los casos. Mien as, en el es o,
se consigue una a aso cla amen e signi ica i o en su C si se compa a con el con ol no
a ado, o bien una combinación de a aso en la ampli icación con un descenso en la
al u a de la cu a de ampli icación. Vemos que sólo usando el sis ema BD MAX somos
capaces de log a la inhibició comple a en la ampli icación de las bac e ias mue as
a adas, o al menos un a aso muy signi ica i o en el inicio de la amli icación. Con el
sis ema Ligh Cycle no se consigue llega al e ec o inhibi o io, pe o sí que se consigue en
algunas éplicas un a aso cla o del inicio de la ampli icación acompañado de una caída
de la señal de la cu a.
112
113
Figu a 45: Resul ados pa a la ampli icación del p o ocolo de iabilidad en el sis ema BD MAX.
Figu a 46: Resul ados pa a la ampli icación del p o ocolo de iabilidad en el sis ema Ligh Cycle .
Lo que ambién emos en es as p uebas es que, cuando las bac e ias i as son
some idas a nues o a amien o, no se e e ec o signi ica i o en la mayo ía de los
ensayos, lo que es de g an impo ancia pa a pode u iliza el a amien o sin llega a
pe de señal cuando se a e una mues a clínica.
Po o o lado, se p obó ambién a ealiza la p ueba p epa ando mues as en las que
bac e ias i as y mue as se encon asen mezcladas, como pod ía da se en una mues a
eal. Es as mues as se p epa a on mezclando, en olúmenes iguales, las soluciones
bac e ianas que se usaban pa a p epa a las bac e ias i as y mue as po sepa ado. De
es e modo, aunque es amos me iendo la mi ad de concen ación de cada g upo de
bac e ias, nos si e pa a e el e ec o cla o sob e las bac e ias mue as, ya que como se
e en la igu a, los con oles sin a a ampli ican más o menos en el mismo pun o, ya
que la can idad o al de bac e ias es la misma, independien emen e de que es én i as o
mue as. Pe o si nos ijamos en la mezcla de bac e ias a las que se les aplica el
113

114
a amien o, emos como cla amen e hay un a aso en la ampli icación, ya que las
mue as se e án inhibidas, y como hay la mi ad de bac e ias i as espec o al g upo de
i as solas, se e la ampli icación más a de ambién espec o a es as. Es e e ec o lo
emos de o ma más cla a en los ensayos lle ados a cabo en el sis ema BD MAX. De
es e modo emos como podemos llega a se capaces de de ec a en una mues a, de
o ma mayo i a ia, solamen e a aquellas bac e ias que es án i as.
4.4.5 P ueba de iabilidad en sang e usando cen i ugaciones
Una ez comp obados los e ec os del a amien o con cispla ino sob e bac e ias en
solución, se a anzó al siguien e paso, donde las bac e ias ue on in oducidas en sang e
pa a simula una mues a clínica a la que pode aplica el a amien o con el es de
iabilidad pa a la de ección especi ica de bac e ias i as. Cuando se isualizan los
esul ados en ambos sis emas de de ección, se obse a que en ningún caso se consigue
inhibición o a aso e iden e en la ampli icación pa a las bac e ias mue as, consiguiendo
en muchos casos cu as de ampli icación simila es, independien emen e de que las
mues as se hubiesen o no a ado. En la Figu a 47 se mues a el esul ado de dos
expe imen os lle ados a cabo a pa i de sang e con bac e ias en el sis ema Ligh Cycle ,
donde se puede e cla amen e que no hay di e encias en e las cu as ni de bac e ias
a adas ni de las no a adas, ya que es án casi solapadas. Po ese mo i o, en la igu a no
se señala a que mues a co esponde cada cu a ya que esul a complicado señala las.
Sólo en el BD MAX (Figu a 48) pa ece habe un lige o e ec o sob e las bac e ias mue as
a adas, que las lle a a ene un C en o no a 2-3 ciclos más a díos que aquellas no
a adas, y con una lige a caída en la cu a que hace in ui el e ec o inhibi o io del
cispla ino. De odos modos, es e es un e ec o muy pequeño que no nos pe mi e la
aplicación del p o ocolo de iabilidad a pa i de mues as de sang e.
Figu a 47: Cu as de ampli icación de dos expe imen os de iabilidad en el sis ema Ligh Cycle a pa i de
bac e ias en sang e ecupe adas median e cen i ugaciones.
114
115
Figu a 48: Cu as de ampli icación de dos expe imen os de iabilidad en el sis ema BD MAX a pa i de
bac e ias en sang e ecupe adas median e cen i ugaciones.
4.4.6 P ueba de iabilidad con oxalipla ino
Con la espe anza de pode complemen a la ac i idad del cispla ino en nues o es
de iabilidad, o incluso de mejo a la acción o simpli ica las condiciones de abajo, se
lle a on a cabo p uebas con el oxalipla ino sob e g upos de bac e ias i as y mue as. Lo
que se obse a en nues os esul ados es que en la mayo ía de las condiciones, incluso sin
llega a una inhibición comple a en la de ección de las bac e ias mue as, es que es a
sus ancia p esen a un mayo e ec o oxico y con e ec o inhibi o io sob e el g upo de
bac e ias i as. De es e modo, se con ie e en una molécula que no nos pe mi e su uso,
ya que iene e ec o sob e oda la población bac e iana in e i iendo en la de ección pa a el
diagnós ico. Un ejemplo del e ec o de es a nue a sus ancia lo emos en laFigu a 49, que
mues a los esul ados de la ampli icación de las mues as en el sis ema Ligh Cycle
(ROCHE) en un ensayo en el que la concen ación de a amien o con oxalipla ino e a de
350 μg/mL du an e 45 minu os a empe a u a ambien e. Y aunque la concen ación de
oxalipla ino es ap oximadamen e la mi ad de la es ablecida pa a el cispla ino, se en los
cla os e ec os inhibi o ios a asando las cu as y disminuyendo la in ensidad de señal en
las cu as de ampli icación, an o en ba e ías i as como en bac e ias mue as.
115
116
Figu a 49: Resul ado de ampli icación en Ligh Cycle pa a el ensayo de iabilidad usando oxalipla ino en el
a amien o de las mues as.
4.4.7 P uebas con o as sus ancias con e ec o ci os á ico
Pa a ninguno de los o os ci os á icos p obados se ob iene esul ado de inhibición
comple a sob e la ampli icación de las bac e ias mue as. Si que llegamos a consegui un
cie o e ec o inhibi o io con algunos de ellos, pe o al mismo iempo ambién se e e ec o
sob e las bac e ias i as (camp o ecina, amsac ina, mi oxan ona, elip icina, e oposido).
En el es o no conseguimos ningún e ec o de inhibicón as hace los a amien os (5-
luo acilo, c omomicina). Una mues a de los esul ados se puede e en la Figu a 50 y la
Figu a 51.
116
117
Figu a 50: Mues a de los esul ados ob enidos con el a amien o con dis in o ci os á icos.
Figu a 51: Mues a de los esul ados ob enidos as el a amien o con el es o de ci os á icos.
117
124
124

125
5. DISCUSIÓN
125
126
126
127
5.1 DISEÑO DE NANOPARTÍCULAS PARA LA MEJORA DE LA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Un aspec o c í ico a la ho a de ealiza p uebas diagnós icas, es el p ocesamien o
p e io de la mues a. La manipulación ap opiada de la misma, nos a a pe mi i ealiza
de o ma segu a y iable los análisis necesa ios.
El p ocesamien o p eanali ico de la mues a, di e encia el análisis con écnicas
molecula es del es o de las ecnologías de abajo en el labo a o io de Mic obiología.
En e ec o, a la ho a de ealiza un diagnós ico usando écnicas de biología molecula
y ampli icación gené ica;
(1) es siemp e necesa io ealiza p e iamen e una ex acción de ácidos nucleicos que
pe mi a sepa a es os del es o de los elemen os de la mues a que po encialmen e puedan
in e e i las de e minaciones que amos ha ealiza .
(2) El p oceso de ex acción debe ia se i además de sis ema de concen ación de
los acidos nucleicos pa a mejo a su lími e de de ección (10,15).
(3) Es as écnicas basadas en la PCR necesi an ob ene la máxima pu eza posible
pa a pode lle a a cabo la mejo ampli icación de la egión diana del genoma del
mic oo ganismo a de ec a .
Pa a log a la ecupe ación de los ácidos nucleicos de una mues a se u ilizan
ac ualmen e casi de o ma gene alizada, mé odos au oma izados basados en el uso de
nanopa ículas magné icas, de o ma que la supe icie de es os sopo es si a como
sis ema acili ado de los la ados sucesi os que incluye la química de los p ocesos de
ex acción.
La unión de las supe icies de es as pa iculas a los ácidos nucleicos se ealiza
median e adso ción inespecí ica, pe mi iendo la ácil ecupe ación y sepa ación del es o
de elemen os de la mues a, en gene al, se ha buscado la capacidad supe pa amagne ica
en las pa ículas, pa a acili a la suspensión en liquidos al e i a se el campo magne ico
de la zona p oxima a las mismas. La apidez de es a sepa ación y su au oma ización,
pe mi en su aplicación a g an escala, log ando el p ocesado de al os núme o de mues as
di e sas, minimizando las con aminaciones y el de e io o de los ácidos nucleicos
inducido po las nucleasas (15, 59).
En nues o abajo, con el obje i o de consegui ecupe a a pa i de las mues as la
mayo can idad posible de ácidos nucleicos y así mejo a el diagnós ico, hemos
desa ollado di e sas nanopa ículas magné icas, p obadas en un p oceso de ex acción
au oma izado, alo ando su posible aplicación/ u ilidad en el ámbi o clínico.
Es as nanopa ículas, ue on diseñadas con pequeños cambios de amaño en e ellas,
con di e encias en su e es imien o y algunas se uncionaliza on en su supe icie con
127
128
g upos eac i os pa a la unión a los ácidos nucleicos, es o úl imo, como un paso en el
in en o de ace ca nos a una posible adso ción especí ica, que pudiese mejo a el p oceso
de ex acción.
Como hemos is o en los esul ados p esen ados, sólo una de nues as pa ículas
ob u o alo es signi ica i os de cap u a de ADN.
Se a a de unas nanopa ículas de magne i a de pequeño amaño (10 nm), ecubie as
de una pequeña capa de sílice y sin ningún ipo de molécula uncionalizando su
supe icie. Es as pa ículas, mos a on mejo es esul ados (a) que aquellas que no enían
ninguna cubie a, (b) que aquellas que ue on ecubie as con PAA, y (c) que aquellas
ecubie as con sílice pe o con una capa mayo .
Las pa ículas que se uncionaliza on con g upos eac i os en la supe icie de la
cubie a de sílice mos a on, so p enden emen e, unos malos esul ados a la ho a de
cap u a y ecupe a ADN.
Una posible jus i icación de es e allo, pod ía se en que aquellas pa ículas con una
mayo cubie a de sílice, pod ían no se e enidas an e icazmen e po el imán, po culpa
del g oso de la cubie a que “enmasca a ía” el magne ismo del núcleo me álico de las
pa ículas, p o ocando el a as e de las mismas du an e las ases de la ado y po an o
pe diendo el ADN que pudiesen ene unido. El dispone de imanes de mayo po encia
quizás pod ía pe mi i nos e alguna mejo a en la asa de ecupe ación de es as
pa ículas.
Como ya se comen ó, una de las en ajas de la sílice, es que p opo ciona a las
nanopa ículas, una ca ga nega i a, que les a a da g an es abilidad en suspensión,
impidiendo su ag egación, y po an o a o eciendo la unión a su supe icie de moléculas
de ADN (143, 144). De es e modo pod ía explica se el mal esul ado de las pa ículas de
magne i a desnuda en las que la posible ines abilidad y endencia a ag ega se, pod ía
di icul a su unión al ADN.
La uncionalización de la supe icie de las nanopa ículas con moléculas po ado as
de g upos eac i os, es una es a egia habi ual usada a la ho a de especializa las
unciones de es as, a o eciendo su unión a moléculas biológicas especí icas, pudiendo
así, po ejemplo, uni se a biomoléculas como p o eínas pa a su sepa ación a pa i de una
mues a biológica o incluso pa a su unión especí ica a ipos celula es conc e os, pa a
ayuda en su sepa ación y de ección, así como pa a se i de ma caje a la ho a de aplica
écnicas de imagen en diagnós ico ( esonancia magné ica), e c. (71).
Con es a idea, ue con la que diseñamos nanopa ículas que, además de su cubie a
de sílice, lle aban unidas en su supe icie moléculas po ado as de g upos eac i os con
a inidad po biomoléculas, en es e caso ADN. La molécula que se usó pa a uncionaliza
las nanopa ículas pa a in en a pasa a una adso ción especí ica del ADN, ue el
aminop opil ie oxisilano (APTS ó APS), que median e su hid ólisis y condensación en
128
129
la supe icie de las nanopa ículas nos p opo ciona g upos amino, que an a pode uni se
al ADN. Cuando las dos nanopa ículas que ue on uncionalizadas con APS, se p oba on
en la ex acción de ADN, nos encon amos que sus endimien os no e an lo espe ado, ya
que ob u imos alo es in e io es al 0,1 % o incluso con ni eles de no de ección del ADN
o no ecupe ación del mismo (pa ículas FeO-2206-APS y FeO-2207-APS). Es as
pa ículas, ni siquie a se ap oxima on en su capacidad de abso ción de acidos nucleicos a
los alo es ob enidos pa a las nanopa ículas ecubie as de sílice (FeO-2206).
Pa a las pa ículas FeO-2207-APS, pod íamos jus i ica los malos esul ados
ob enidos, en unción del mayo diáme o de las pa ículas, debido a la cubie a más
g uesa de sílice, que pod ía impedi la adecuada a acción de las mismas cuando se aplica
un campo magné ico con el imán del sis ema au omá ico. Cuando emos los esul ados
de las pa ículas FeO-2206-APS, es a explicación no nos pa ece su icien e ya que el
ango de amaño de las nanopa ículas es p ác icamen e igual al de las FeO-2206 que
mos a on mejo es esul ados y aunque el hecho de ene g upos amino en su supe icie
debe ía a o ece la unión a las moléculas de ADN, los esul ados indican que en
nues as pa ículas es a uncionalización puede no se del odo adecuada po gene a una
educción de la can idad de moléculas que se an a pode uni a las pa ículas, po una
eó ica educción de supe icie o al disponible al añadi es os g upos sob e la supe icie
de sílice de las mismas. También, se pod ía supone que las condiciones conc e as del
p oceso de ex acción, como pod ían se la composición de los dis in os ampones usados
pa a los la ados y la libe ación inal del ADN de las pa ículas pa a su ecupe ación, no
a o eciesen de la misma mane a la co ec a cap u a y pos e io libe ación del ADN,
p oduciéndose la pé dida de es e du an e los dis in os pasos del p oceso de ex acción.
La necesidad undamen al a la ho a de aplica las écnicas de biología molecula en
el diagnós ico, es el pode consegui una can idad su icien e de los ácidos nucleicos
diana, de la o ma más pu a posible, que pueda se de ec ado pos e io men e (46, 48). En
es as ex acciones de ADN lo que se es capaz de ecupe a son los ácidos nucleicos
o ales y no solamen e de los de la diana buscada, así es impo an e ob ene el máximo
endimien o posible del ADN pa a ene la mayo p opo ción de nues a diana o,
al e na i amen e, se capaces de hace una sepa ación especí ica del ADN de in e és as
la uncionalización de las pa ículas con moléculas que p esen an oligonucleó idos
especí icos pa a un ADN diana.
Nues o in en o inicial de uncionalización de nanopa ículas esul ó se poco
e ec i o.
Al compa a los endimien os ob enidos con las nanopa ículas ecubie as de sílice,
con los de un sis ema au omá ico de ex acción de ácidos nucleicos pudimos alo a la
u ilidad de nues as pa ículas. Lo que imos; ue que las pa ículas FeO-2206 enían
unos esul ados, que aunque no iguales, se ap oximaban a los alo es ob enidos po las
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pa ículas del sis ema au omá ico, al alo a las can idades o ales de ADN ex aído. Es o
nos p opo ciona unas nanopa ículas suscep ibles de modi icaciones o de ajus es en el
p oceso de ex acción, que nos pod ían p opo ciona una he amien a ú il a la ho a del
p ocesamien o p e io de nues as mues as biológicas pa a su pos e io análisis
molecula .
5.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A
METICILINA
La de ección del S. au eus esis en e a me icilina es impo an e en el cuidado de los
pacien es y en la ap opiada u ilización de los mé odos de con ol de la in ección
nosocomial (169, 173). En la ac ualidad, hay disponibles g an a iedad de ensayos
eno ípicos y molecula es pa a la de ección de MRSA. Al con a io que los ensayos
basados en el cul i o, las p uebas molecula es equie en menos iempo has a la ob ención
del esul ado, con i iéndose en una al e na i a muy ú il pa a el manejo del pacien e. El
uso de es as écnicas molecula es, a día de hoy, no implica el abandono de las écnicas
eno ípicas clásicas en el labo a o io, ya que al añadi las al ca álogo de écnicas
disponibles pa a el diagnós ico, podemos dispone de he amien as complemen a ias y
ob ene una mayo in o mación, de una o ma ápida, pa a usa la pa a el bene icio del
pacien e.
En es a pa e de nues o es udio, podemos e que incluso las écnicas molecula es
no son in alibles, bien po ene un lími e de de ección al o o po la ci culación de cepas
que no son suscep ibles de ampli icación con las sondas seleccionadas, nos podemos
encon a con alsos nega i os o disc epan es en algunas de las écnicas. Pa a e i a
encon a se en es a si uación, es ecomendable pode usa en el labo a o io écnicas, con
undamen os dis in os, que puedan complemen a se pa a pode disc imina en e aquellas
mues as ealmen e nega i as o posi i as y en caso de duda pode apoya se en da os
i mes a la ho a de comunica un esul ado, que en los casos de aplicación de a amien o
an ibió ico pueda se aplicado de o ma e ec i a, cuando sea necesa io. Po eso el uso
complemen a io de las écnicas eno ípicas clásicas (cul i o, an ibiog ama, p uebas
bioquímicas), de la p o eómica con el uso de he amien as como la espec ome ía de
masas (MALDI-TOF) y las écnicas molecula es (PCR, PCR a iempo eal, hib idación)
nos an a pe mi i ob ene más in o mación y como emos en nues o abajo, pueden
complemen a se, esol iendo algunos casos dudosos ob enidos de cualquie a de las
écnicas usadas. Además, la combinación de la in o mación ob enida con es as écnicas
nos a pe mi i ca ac e iza en p o undidad, odos aquellos mic oo ganismos de in e és,
combinando da os eno ípicos y da os geno ípicos, pe mi iendo ipa los y compa a los
en e si de una o ma más e icaz.
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Algo que ambién hay que ene en cuen a a la ho a de la de ección de es os
esul ados nega i os alsos, es la necesidad de una igilancia y ac ualización cons an e de
las écnicas de Biología Molecula .
Debido a la c ecien e a iabilidad gené ica, que se e a ec ada en e o os aspec os;
po la p esión de esis encias en muchos mic oo ganismos y la apa ición de nue os ipos
de mu an es den o de una misma especie, con pequeños cambios que a o ecen su
expansión y adap ación, con i iéndose muchas eces en un p oblema de salud. Algunas
eces, es as a ian es pueden no se de ec ables con las sondas o los algo i mos
inicialmen e desa ollados pa a el diagnós ico. De ahí la necesidad de la igilancia, en
busca de nue as a ian es de mu an es, pa a que puedan se iden i icados y
ca ac e izados los cambios gené icos implicados y pa a que puedan se inco po ados
pos e io men e a las écnicas molecula es usadas en el diagnós ico.
El hecho de encon a écnicas molecula es basadas en la PCR con esul ados
dis in os en e si (disc epan es), nos hace sub aya , la ya conocida impo ancia de la
elección de las dianas de ampli icación a la ho a de diseña una écnica de de ección. El
buen conocimien o del genoma del mic oo ganismo en cues ión, así como de los
elemen os mó iles implicados ambién en algunas esis encias y el pode ca ac e iza las
egiones conc e as implicadas en la apa ición de las esis encias, es de g an impo ancia a
la ho a de la elección de las dianas de ampli icación, ya que puede implica deja ue a de
nues a capacidad de de ección a cepas con pequeñas a iaciones en las egiones
inicialmen e seleccionadas. En nues o es udio encon amos que la écnica “BD MAX
MRSA Assay” nos da 4 esul ados alsos posi i os, en e a los 14 que nos encon amos
con la écnica “Ligh Cycle MRSA Ad anced Tes ”. Es e es un esul ado cla amen e
posi i o a a o del ensayo diseñado pa a el sis ema BD MAX, demos ándonos su
u ilidad a la ho a de pode usa lo como he amien a de c ibado en los pacien es con
sospecha clínica. Lo que emos ambién, es que a pesa de se ensayos diseñados pa a la
ampli icación de los genes implicados en la esis encia a ampicilina, sólo uno de ellos
consigue una buena cobe u a a la ho a de de ec a los dis in os ipos en los que se
pueden ag upa es as a ian es esis en es.
El uso pa alelo de las écnicas eno ípicas y o as écnicas molecula es, nos lle an a
apoya la co ec a asignación de los dis in os aislados como e dade os MRSA,
pe mi iéndonos alo a los esul ados ob enidos y demos ando la u ilidad del uso
combinado de dis in as écnicas en el labo a o io.
Pa a in en a conoce algo más de es os aislados con esul ado nega i o po alguna
de las écnicas se lle a on a cabo análisis de dis ancias; u ilizando écnicas de biología
molecula ( ep-PCR y PCR con encional), así como de espec ome ía de masas
(MALDI-TOF) pa a el análisis p o eómico. El es udio de las dis ancia gené icas
ob enido po ep-PCR nos mos ó simili udes en e los aislados nega i os, pe o no nos
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pe mi ió encon a di e encias de ag upación en e aquellas nega i as po una écnica o
las mues as nega i as po las dos écnicas. Cuando la ca ac e ización se lle ó a cabo
median e la espec ome ía de masas, compa ando los espec os p o eicos gene ados
median e un dend og ama, nos encon amos con una sepa ación cla a en e los dos
g upos de nega i os, indicándonos algún ipo de posible di e encia que pod ía es a
in luyendo en la capacidad de de ección po cada una de las écnicas.
Cuando se in en a un ipado de los aislados basado en la ca ac e ización po PCR de
los dis in os ipos de la egión SCCmec, emos una a iedad de ipos en e los aislados, e
incluso en dos de ellos no hemos sido capaces de llega a es a ca ac e ización. Es o no
nos pe mi e asigna un p oblema en la de ección asociado a un ipo conc e o, basándonos
en la egión SCCmec, si no, p obablemen e se a e de a ian es con cambios en egiones
más especí icas que pueden es a implicados en cualquie a de los dis in os ipos.
5.3 USO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS PARA LA CAPTURA DE
MICROORGANISMOS Y POSTERIOR DETECCIÓN
En el diagnós ico mic obiológico nos en en amos a dia io con g an can idad de
mues as de di e sa na u aleza y que a a se some idas a p ocesos con encionales de
c ecimien o en dis in os medios de cul i o, con el in de aisla e pos e io men e
iden i ica y ca ac e iza con o as écnicas el mic oo ganismo o mic oo ganismos
p esen es y que puedan se la causa de la pa ología en un pacien e. Lo malo de es e ipo
de p ocesos es que implican g an can idad de iempo, necesa io pa a el c ecimien o de
aquellos mic oo ganismos que se pueden cul i a ácilmen e, pe o ambién nos
encon amos con mic oo ganismos de di ícil c ecimien o o incluso que no se pueden
cul i a y en e a los que end emos que usa o as me odologías. Los p ocesos que
implican pasos de cul i o u iliza an iempos que pueden oscila en e las 18-24 ho as a
a ios días o incluso semanas, implicando un g an e aso en la asignación nominal
conc e a o no del mic oo ganismo asociado al cuad o clínico del pacien e. Lo ideal, en
es os casos, se ía pode aisla ísica y ápidamen e, a pa i de la mues a, el
mic oo ganismo o mic oo ganismos p esen es en ella, pa a pode ealiza una de ección,
po ejemplo, median e mé odos molecula es. Además, es a posibilidad de aisla el
mic oo ganismo a pa i de la mues a de o igen pod ía se de g an u ilidad pa a elimina
es os de sus ancias inhibi o ias u o os elemen os a pa i de mues as complicadas
a o eciendo el p oceso de cul i o si es necesa io, así como e i ando la in e e encia de
esas sus ancias en o as écnicas que se usa ían pos e io men e y concen ando, en es e
caso, los mic oo ganismos p esen es a pa i de los olúmenes di e sos de mues a, pa a
gana así iempo y e icacia en el diagnós ico.
Del mismo modo que en la ex acción de ácidos nucleicos hablábamos de la
posibilidad de consegui una adso ción especí ica de los ácidos nucleicos en los p ocesos
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de ex acción, la modi icación de las nanopa ículas con moléculas en su supe icie como
pueden se an icue pos u o o ipo de moléculas (ligandos de ecep o es especí icos de
memb ana) puede con e i a es as pa ículas en elemen os con unión especí ica a un ipo
celula conc e o (14, 71). Nues a in ención en es e es udio, ue la de p oba dos ipos de
nanopa ículas diseñadas pa a la unión a mic oo ganismos pa a biosepa ación. Una de las
pa ículas, las ApoH, es un p oduc o come cial de la compañía ApoH echnologies
(F ancia) que usan la unión de es a la p o eína de ase aguda ApoH (apolipop e eina H) a
la supe icie de nanopa ículas magné icas pa a ale se de su capacidad de unión a
p o eínas de la supe icie de múl iples pa ógenos (pa ási os, i us, bac e ias) (267).
La Apolipop o eína H (ApoH), ambién conocida como E2-glicop o eína I (ß2-GPI),
es una glicop o eína plasmá ica de 50 kDa. ApoH es á p esen e en el plasma humano en
una concen ación de en e 150 y 300 mg/ml (272). En sang e, la ApoH ci cula en
con o maciones lib es o ligada a lipop o eínas: quilomic ones, lipop o eínas de baja
densidad (LDL), lipop o eína de muy baja densidad (VLDL) y lipop o eínas de al a
densidad (HDL). Además, la ApoH iene una al a a inidad pa a las lipop o eínas icas en
iglicé idos. La can idad de ApoH asociado con las lipop o eínas del plasma en
indi iduos sanos a ía según los au o es del 4 al 13% has a al ededo del 40% (273,
274). La ApoH es capaz de ac i a las lipop o eín- lipasas (Lee e al., 1983). La ApoH
ue aislada de la acción de lipop o eínas plasma icas y desc i oapo p ime a ez en
1961 po HE Schul ze (275). En meno medida, ambién se asocia a acción de
globulinas ß2
La ApoH se exp esa en el hígado humano, en las células y ejidos in es inales. En
a as, se han iden i icado o os si ios de la sín esis en bajas concen aciones como el
iñón, in es ino delgado, ce eb o, ca diomioci os del co azón y en concen aciones
in e io es en el bazo, es ómago y p ós a a. La ApoH es una p o eína de ase aguda y
cuando se ac i a, ApoH enlaza, con una ela i a al a a inidad, pa ógenos o sus p o eínas,
po eso ApoH ambién se conside a como un elemen o de la espues a inmune inna a del
huésped, pa icula men e du an e la ase aguda. Es di ícil de clasi ica como p o eína de
ase aguda posi i a o nega i a. Es á p opiedad se u iliza como un medio pa a mejo a
d ás icamen e el diagnós ico de agen es pa ógenos de di e en es o ígenes, incluyendo
humanos, animales o del medio ambien e y la na u aleza, incluyendo i us en uel os o
no en uel os, pa ási os y bac e ias g am posi i as o g am nega i as. De hecho, ApoH
ac i ada unida a sopo es sólidos se ha u ilizado pa a concen a o pa a "limpia " de
pa ógenos inhibido es, algunos mé odos de de ección.
También en es e es udio p obamos las nanopa ículas de la compañía NANO MR
(USA), que en base a la misma es a egia, u ilizan la unión de an icue pos en la supe icie
de las nanopa ículas pa a uni se a moléculas de supe icie de bac e ias y hongos. Es as
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