7(6('('28725$0(172
'567&+1&'*1/1&ı/'415&'.4'%'2614*6#&'5'41610+0#;
575/'%#0+5/15&'#%6+8#%+ĵ0'0.#(#4/#%1.1)ı#&'.#
'537+<1(4'0+#
#NDC+INGUKCU(GTPhPFG
'5%1.#&'&17614#/'061+06'40#%+10#.
241)4#/#&'&17614#/'061'0+08'56+)#%+ĵ0'
&'5'081.8'/'061&'/'&+%#/'0615
6$17,$*2'(&203267(/$
&'%.#4#%+ĵ0
&1#7614'5'
'UVWFKQFGJQOQFsOGTQUFGNTGEGRVQT*6
#
FGUGTQVQPKPC[UWU
OGECPKUOQUFGCEVKXCEKxPGPNCHCTOCEQNQIsCFGNCGUSWK QHTGPKC
''QD
$/%$,*/(6,$6)(51ī1'(=
P esen o miña ese, seguindo o p ocedemen o adecuado ao Regulamen o, e decla o que:
1) A ese aba ca os esul ados da elabo ación do meu aballo.
2) No seu caso, na ese se ai e e encia as colabo acións que i o es e aballo.
3) A ese é a e sión de ini i a p esen ada pa a a súa de ensa e coincide ca e sión en iada en
o ma o elec ónico.
4) Con i mo que a ese non inco e en ningún ipo de plaxio de ou os au o es nin de aballos
p esen ados po min pa a a ob ención de ou os í ulos.
(Q6DQWLDJRGH&RPSRVWHODGH1RYHPEURGH
$VGR
$OED,JOHVLDV
)HUQiQGH]
#7614+<#%+ĵ0
&1
&+4'%614
6+614'5'
'UVWFKQFGNJQOQFsOGTQFGNTGEGRVQT*6
#
FGUGTQVQPKPC[UWU
OGECPKUOQUFGCEVKXCEKxPGPNCHCTOCEQNQIsCFGNCGUSWK QHTGPKC
'QD
0DU D,VDEHO/R]D*DUF D
'
-RVp0DQXHO%UHD)ORULDQL
,1)250$1
4XHDSUHVHQWHWHVHFRUUHVSyQGHVHFRWUDEDOORUHDOL]DGRSRU''QD$OED,JOHVLDV)HUQiQGH]EDL[RD
PLxDGLUHFFLyQHD
XWRUL]R
DV~D
SUHVHQWDFLyQ
FRQVLGHUDQGR
TXHUH~QH RV
U
HTXLVLWRV
HVL[LGRVQR
5
HJXODPHQWR
GH (VWXGRVGH
'RXWRUDPHQWRGD86&
H
TXH
FRPRGLUHFWRUGHVWD
QRQLQFRUUH
QDV FDXVDV GH
DEVWHQFLyQHVWDEOHFLGDV
QD /HL
(Q6DQWLDJRGH&RPSRVWHODGH1RYHPEURGH
$VGR
0DU D,VDEHO/R]D
*DUF D
$VGR-RVp0DQXHO%UHD
)ORULDQL
La p esen e memo ia ha sido ealizada g acias a la inanciación o o gada po el
Minis e io de Ciencia e Inno ación (SAF2009-13609-C04-01), el Minis e io de
Economía y Compe i i idad (SAF2014-57138-C2-2R), el p oyec o Innopha ma
(PI12/00742; Minis e io de Economía y Compe i i idad) y la beca del P og ama de
Fo mación de Pe sonal In es igado (FPI) concedida po el Minis e io de Ciencia e
Inno ación.
Índice
Resumen ................................................................................................................................. 21
In oducción ......................................................................................................................... 29
1. Esquizo enia ........................................................................................................................ 31
1.1 Aspec os gene ales ...................................................................................................... 31
1.2 E iopa ología de la esquizo enia ......................................................................... 33
1.2.1 Hipó esis glu ama é gica ............................................................................ 33
1.2.2 Hipo ésis neu odegene a i a .................................................................... 33
1.2.3 Hipó esis del neu odesa ollo ................................................................... 34
1.2.4 La hipó esis clásica: la hipó esis dopaminé gica ............................... 34
1.2.5 Hipó esis se o onina-dopamina ............................................................... 36
1.2.6 Genes y p o eínas asociadas a esquizo enia ..................................... 36
1.3 T a amien o a macológico de la esquizo enia ............................................. 37
1.3.1 An ipsicó icos ípicos o de p ime a gene ación ................................. 37
1.3.2 An ipsicó icos a ípicos o de segunda gene ación .............................. 38
2. Recep o es acoplados a p o eínas G ............................................................................ 41
2.1 Ca ac e ís icas gene ales .......................................................................................... 41
2.2 Modelos de in e acción ligando- ecep o ........................................................... 46
2.3 Dime ización de GPCRs.............................................................................................. 51
2.3.1 Dominios de in e acción en díme os ...................................................... 52
2.3.2 Técnicas de de ección de díme os ........................................................... 54
2.3.2.1 Técnicas bioquímicas: complemen ación uncional y
coinmunop ecipi ación ................................................................. 54
2.3.2.1.1 Complemen ación uncional ................................................. 54
2.3.2.1.2 Coinmunop ecipi ación .......................................................... 55
2.3.2.2 Técnicas bio ísicas: ans e encia de ene gía de
esonancia y complemen ación de luo escencia
bimolecula ........................................................................................ 55
2.3.2.2.1 FRET............................................................................................... 56
2.3.2.2.2 BRET .............................................................................................. 56
2.3.2.2.3 Técnicas de complemen ación de luo escencia
bimolecula (BiFC) ................................................................... 57
2.3.2.3 Ap oximaciones a macológicas ................................................ 58
Índice
2.3.2.3.1 Inac i ación- eac i ación ...................................................... 58
2.3.2.3.2 Ligandos bi alen es ................................................................. 60
3. Recep o es de se o onina ................................................................................................. 61
3.1 Recep o 5-HT2A de se o onina ............................................................................... 62
Jus i icación, hipó esis y obje i os ................................................................................ 71
Resul ados .............................................................................................................................. 77
Publicación 1: ..................................................................................................................................... 79
De elopmen o a Mul iplex Assay o S udying Func ional Selec i i y o Human
Se o onin 5-HT2A Recep o s and Iden i ica ion o Ac i e Compounds by High
Th oughpu Sc eening
Publicación 2: ..................................................................................................................................... 91
Se o onin-2A homodime s a e needed o signalling ia bo h phospholipase A2 and
phospholipase C in ans ec ed CHO cells
Publicación 3: ................................................................................................................................... 101
Se o onin 2A ecep o disul ide b idge in eg i y is c ucial o ligand binding o
di e en signalling s a es bu no o i s homodime iza ion
Discusión .............................................................................................................................. 113
Conclusiones ....................................................................................................................... 133
Bibliog a ía .......................................................................................................................... 137
Relación de ab e ia u as
ABREVIATURAS
(±)DOB: (±)-1-(4-b omo-2,5-dime hoxyphenil)-2-aminop opane
(±)DOI: (±)-1-(2,5-dime hoxy-4-iodophenyl)-2-aminop opane
5-HT: se o onin (se o onina)
7TMR: 7 ansmemb ane ecep o s ( ecep o es con 7 dominios ansmemb ana)
AA: a achidonic acid (ácido a aquidónico)
AKT1: se ine- h eonine p o ein kinase 1 (se ina- eonina p o eína kinasa 1)
AMPc: 3’,5’-cyclic adenosine monophospha e (adenosin mono os a o 3’,5’-cíclico)
BI: balance index (índice del balance)
Bmax: maximum numbe o binding si es (núme o máximo de si ios de unión)
BRET: bioluminiscence esonance ene gy ans e ( ans e encia de ene gía de esonancia
bioluminiscen e)
BRET50: hal maximal BRET signal (mi ad de la señal de BRET máxima)
BRETmax: maximal BRET signal (señal máxima de BRET)
BSA: bo in se um albumin (albúmina sé ica bo ina)
CFP: cyan luo escence p o ein (p o eína luo escen e cian)
CHO: Chinese Hams e O a y (o a io de háms e chino)
COMT: ca echol-o-me hyl ans e ase (ca echol-o-me il ans e asa)
Cys: cys eine (cis eína)
DAG: diacylglyce ol (diacilglice ol)
DISC1: dis up ed in schizoph enia 1
DTNBP1: dys ob e in binding p o ein 1 (p o eína 1 de unión a dis ob e ina)
DTT: DL-1,4-di hio h ei ol (DL-1,4-di io ei ol)
ECL: ex acelula loop (bucle ex acelula )
Relación de ab e ia u as
Emax: maximal esponse ( espues a máxima)
ET-18-OCH3: 1-O-Oc adecyl-2-O-me hyl-sn-glyce o-3-phosphocholine
FEZ1: ascicula ion and elonga ion p o ein Ze a 1
FRET: luo escence esonance ene gy ans e ( ans e encia de ene gía de esonancia
luo escen e)
GDP: guanosine 5’-diphospha e (guanosina 5’-di os a o)
GEF: guanine nucleo ide exchange ac o ( ac o in e cambiado de nucleó idos de
guanina)
GFP: g een luo escence p o ein (p o eína luo escen e e de)
GPCRs: G p o ein coupled ecep o s ( ecep o es acoplados a p o einas G)
GR55562: 3-[3-(Dime hylamino) p opyl]-4-hyd oxy-N-[4-(4-py idinyl) phenyl]benzamide
dihyd ochlo ide
GTP: guanosine 5 ’- iphospha e (guanosina 5’- i os a o)
HA: hemaglu inin (hemaglu inina)
HTS: High h oughpu sc eening (c ibado de al o endimien o)
IC50: hal maximal inhibi o y concen a ion (mi ad de la concen ación inhibi o ia máxima)
ICL: in acelula loop (bucle in acelula )
IP3: inosi ol 1,4,5- iphospha e (inosi ol 1,4,5- i os a o)
IUPHAR: In e na ional Union o Pha macology (Unión In e nacional de Fa macología)
Kd: equilib ium dissocia ion cons an (cons an e de disociación en equilib io)
Ki: inhibi ion cons an (cons an e de inhibición)
Ko : dissocia ion a e cons an (cons an e a io de disociación)
Kon: associa ion a e cons an (cons an e a io de asociación)
LIS1: lissencephaly p o ein 1(p o eína lisence alina 1)
LSD: Lyse gic acid die hylamide (die ilamida del ácido lisé gico)
Relación de ab e ia u as
MDL 100,907: (±)-α-(2,3-Dime hoxyphenyl)-1-[2-(4- luo ophenyl)e hyl]-4-
pipe idineme hanol
NDEL1: nuclea dis ibu ion p o ein nudE-like 1
NMDA: N-me hyl-D-aspa a e (N-me il-D-aspa a o)
NRG1: neu egulin 1(neu egulina 1)
PACAP-1: pi ui a y adenylyl cyclase-ac i a ing polypep ide ype-1 ecep o ( ecep o ipo 1
del polipép ido ac i ado de adenila o ciclasa de la pi ui a ia)
PCP: phencyclidine ( enciclidina)
PDE4B: phosphodies e ase 4B ( os odies e asa 4B)
PIP2: phospha idylinosi ol 4,5-biphospha e ( os a idilinosi ol 4,5 bi os a o)
PKC: p o ein kinase C (p o eína kinasa C)
PLA2: phospholipase A2 ( os olipasa A2)
PLC: phospholipase C ( os olipasa C)
PSD95: pos synap ic densi y p o ein 95 (p o eína de densidad pos sináp ica 95)
RELN: eelin ( eelina)
RET: esonance ene gy ans e ( ans e encia de ene gía de esonancia)
RGS4: egula o o G p o ein signaling 4 (p o eína 4 egulado a de la señalización de la
p o eína G)
RHC-80267: 1,6-Bis(cyclohexyloximinoca bonyl)hexane
Rluc: Renilla luci e ase (Renilla luci e asa)
RNA: ibonucleic acid (ácido ibonucleico)
RNAi: ibonucleic acid in e e ence (ácido ibonucleico in e e en e)
SNC: sis ema ne ioso cen al
TM: ansmemb ane ( ansmemb ana)
Relación de ab e ia u as
U73122: 1-[6-[[(17β)-3-Me hoxyes a-1,3,5(10)- ien-17-yl]amino]hexyl]-1H-py ole-2,5-
dione
VC: enus p o ein C- e minus agmen ( agmen o C- e minal de la p o eína enus)
VN: enus p o ein N- e minus agmen ( agmen o N- e minal de la p o eína enus)
YFP: yellow luo escence p o ein (p o eína luo escen e ama illa)
β-ME: β-me cap oe hanol (β-me cap oe anol)
RESUMEN
La esquizo enia es una en e medad men al c ónica que a ec a al 1% de la
población mundial. Su e iología es desconocida aunque ac ualmen e se asume que
la esquizo enia su ge po la in e acción de ac o es gené icos y ambien ales. Su
a amien o a macológico se basa en el empleo de an ipsicó icos ípicos o a ípicos,
con a inidad po di e en es ecep o es acoplados a p o eínas G (GPCRs);
des acando los an ipsicó icos a ípicos po su mayo a inidad po los ecep o es 5-
HT2A de se o onina que po los D2 de dopamina.
El ecep o 5-HT2A de se o onina ue de los p ime os en los que se desc ibió el
enómeno de selec i idad uncional donde dis in os ligandos p esen an di e en es
e icacias y/o po encias en unción de la ía de señalización es udiada.
Aunque adicionalmen e los GPCRs se han conside ado en idades monomé icas,
ac ualmen e se sabe que pueden o ma díme os u oligóme os de o den supe io .
Así, pa a el ecep o 5-HT2A de se o onina se ha desc i o la o mación an o de
he e odíme os como de homodíme os, desconociéndose has a el momen o si la
dime ización es esencial pa a su ac i ación. Po ello, nues a hipó esis se basa en
que la homodime ización del ecep o 5-HT2A de se o onina condiciona su
ac i ación y su selec i idad uncional po an ipsicó icos. El mecanismo de dicha
ac i ación implica ía, al menos pa cialmen e, la exis encia de puen es disul u o en
los dominios ex acelula es del ecep o .
En es e abajo se desa olló y alidó una me odología minia u izada mul iplex de
medición simul ánea de la ac i ación de las ías de señalización os olipasa A2
(PLA2) y os olipasa C (PLC) a a és del ecep o 5-HT2A de se o onina,
de ec ándose enómenos de selec i idad uncional y coope a i idad nega i a.
Pa a es udia la unidad uncional mínima (monomé ica u homodimé ica)
eque ida pa a la ac i ación de las ías de señalización PLA2 y PLC a a és del
ecep o 5-HT2A de se o onina se siguió una ap oximación a macológica de
inac i ación- eac i ación, comp obándose que e a necesa io ac i a los dos
p o óme os del díme o pa a su señalización p esen ando, además, comunicación
alos é ica en e ellos.
Además, se ca ac e izó el e ec o que p oduce la educción de puen es disul u o del
ecep o 5-HT2A de se o onina sob e la unión de ligandos, su unción y na u aleza
homodimé ica del mismo. De es e modo, se comp obó que el puen e disul u o
23
In oducción
1. ESQUIZOFRENIA
1.1 Aspec os gene ales
La esquizo enia es una en e medad men al c ónica, mul i ac o ial y de e iología
desconocida que a ec a al 1% de la población (Tandon y cols., 2008). Se a a de
una pa ología con un al o índice de mo alidad, donde el 25-50% de los pacien es
esquizo énicos in en an suicida se y un 10% lo consiguen, así, la asa de
mo alidad es ocho eces mayo que la de la población en gene al. La espe anza de
ida puede se 20-30 años meno , no sólo debido al suicidio, sino a una
en e medad ca dio ascula p ema u a, la cual además de un componen e gené ico
puede e se ag a ada po un es ilo de ida inadecuado ( uma , die a inadecuada,
ca encia de eje cicio…) y po el a amien o con algunos an ipsicó icos (Blasco-
Fon ecilla y cols., 2010; Ray y cols., 2009; Saha y cols., 2007). Los sín omas de la
en e medad se clasi ican en cinco dimensiones: sín omas posi i os, nega i os,
cogni i os, ag esi os y dep esi os /ansiosos (Figu a 1) (S ahl, 2000).
Figu a 1. Rep esen ación de las cinco dimensiones de la esquizo enia (S ahl, 2000).
Los sín omas posi i os son conside ados un exceso de las unciones no males;
comp enden deli ios (de pe secución, g andeza, eligiosos), alucinaciones
(audi i as, isuales, ác iles), agi ación, conduc a ca a ónica, dis o sión o
exage ación en el lenguaje y la comunicación.
En los nega i os nos encon amos con al menos cinco ipos de sín omas: apa ía
a ec i a, alogia ( es icciones en la luidez y p oduc i idad del pensamien o y el
INTRODUCCIÓN
31
In oducción
habla), anhedonia ( al a de place ), al a de a ención y limi aciones en el
compo amien o di igido hacia un obje i o. Se conside a que son una educción de
las unciones no males, pudiendo ene su o igen en la p opia en e medad
(sín omas nega i os p ima ios), o se secunda ios a los sín omas posi i os de la
psicosis, a los e ec os ex api amidales p oducidos po los an ipsicó icos o como
consecuencia de los sín omas dep esi os (sín omas nega i os secunda ios).
Den o de los sín omas cogni i os podemos des aca la di icul ad pa a soluciona
p oblemas o la al a de cohe encia en el lenguaje.
Po o o lado, aunque los sín omas ag esi os pueden coincidi con los posi i os,
es os en a izan p oblemas en el con ol de impulsos; incluyen ag esión e bal o
ísica, suicidio, au olesiones y al a de con ención sexual.
Po úl imo, en cuan o a los sín omas dep esi os y ansiosos, es os ambién se
asocian ecuen emen e con esquizo enia (Tandon y cols., 2009; S ahl, 2008)
La esquizo enia, po de inición, es un as o no de al menos seis meses de
du ación, incluyendo al menos un mes de alucinaciones, deli io, habla
deso ganizada, conduc a ca a ónica o sín omas nega i os.
La mayo ía de los au o es es á de acue do en que el desa ollo de la esquizo enia
se di ide en cua o ases: p emó bida (pe iodo an e io a la apa ición de los
p ime os sín omas), p od ómica (mani es ación su il de algunos signos y sín omas
de la en e medad), una ase psicó ica y ase c ónica (Figu a 2) (Tandon y cols.,
2009).
Figu a 2. Fases de la esquizo enia (Tandon y cols., 2009).
32
In oducción
1.2 E iopa ología de la esquizo enia
La esquizo enia es una en e medad de o igen mul i ac o ial donde ac o es
gené icos y ambien ales con ibuyen al desa ollo de la misma. Exis en múl iples
hipó esis que a an de explica la, a con inuación se comen an algunas de ellas.
1.2.1 Hipó esis glu ama é gica
El p ime indicio ace ca de la pa icipación del glu ama o en la e iopa ogenia de la
esquizo enia su gió al obse a los sín omas psicó icos que sus ancias como
enciclidina (PCP) o ke amina (an agonis as de los ecep o es N-me il-D-aspa a o,
NMDA) p oducían en indi iduos sanos (Ja i y Coyle, 2004; Ja i y Zukin, 1991;
Ja i , 1987). La adminis ación sos enida de an agonis as NMDA daba luga a la
apa ición de sín omas psicó icos, a al e aciones del pensamien o, aislamien o
social y sín omas cogni i os.
En e las di e en es ías glu ama é gicas cabe des aca una que p oyec a desde las
neu onas co icales pi amidales (p incipalmen e en la lámina 5) a los núcleos
se o oniné gicos del a e, al á ea egmen al en al, a los cen os dopaminé gicos
de la sus ancia neg a y al locus ce úleo. Es a ía es la p oyección glu ama é gica
co ical- oncoence álica. Se ha desc i o que la ac i idad de las ías
glu ama é gicas in luye en la ac i idad de las ías dopaminé gicas, exis iendo una
in e conexión en e es os dos sis emas y po an o o o gándole al glu ama o un
papel modulado sob e la neu o ansmisión dopaminé gica. Po ello, es a eo ía
sugie e que la isiopa ología de la esquizo enia es á asociada a una hipo unción
glu ama é gica especí icamen e en ese á ea que, po an o, no eje ce ía su papel
inhibi o io sob e las neu onas dopaminé gicas de la ía mesolímbica
p oduciendose la hipe ac i idad de la misma (S ahl, 2008; Chinchilla, 2007;
Kon adi y Heckens, 2003; Tamminga, 1998).
1.2.2 Hipó esis neu odegene a i a
La p esencia de anomalías an o uncionales como es uc u ales demos adas en
es udios de neu oimagen de pacien es esquizo énicos sugie en un p oceso
neu odegene a i o con pé dida p og esi a de la unción neu onal. De es e modo y
como se ha desc i o an e io men e, la esquizo enia es una en e medad que
p og esa desde una ase asin omá ica la ga a una ase c ónica de la que nunca se
33
In oducción
uel e al es ado inicial. En e las di e en es causas de esa condición degene a i a
nos encon amos desde una apop osis ano mal, in ecciones o anoxia a una
exci ación excesi a eje cida po el glu ama o. Dicha sob eexci ación da luga a lo
que se conoce como “hipó esis exci o óxica de la esquizo enia” donde las
neu onas acaban mu iendo debido a los adicales lib es que se o man en el
in e io como consecuencia de la excesi a en ada de calcio (Wa kins y And ews,
2016; S ahl, 2008).
1.2.3 Hipó esis del neu odesa ollo
Según es a hipó esis la en e medad end ía su o igen en ano malidades en el
desa ollo ce eb al e al du an e los es ados emp anos de selección y mig ación
neu onal. Así, complicaciones obs é icas desde in ecciones ma e nas du an e el
emba azo (g ipe, ci omegalo i us, He pes simplex o Toxoplasma gondii) que
ac i an el sis ema inmuni a io a o o ipo de p oblemas como nacimien o
p ema u o, hipoxia o p eeclampsia, pueden con ibui al desa ollo de
esquizo enia. Es os ac o es de iesgo ienen un inal común, la educción de
ac o es de c ecimien o ne ioso, p oducción de ci oquinas p oin lama o ias y
especies eac i as de oxígeno, hipoxia o es és que p oduci ían un daño es uc u al
dando como esul ado la selección de neu onas dañadas, una mig ación inco ec a
o conexiones e óneas (Wa kins y And ews, 2016; Khandake y Dan ze , 2015;
S ahl, 2008).
1.2.4 La hipó esis clásica: la hipó esis dopaminé gica
A pesa de que la base biológica de la esquizo enia sigue siendo desconocida, se
sabe que el neu o ansmiso dopamina iene un papel cla e en los sín omas de la
en e medad, y po ello, se conside a la hipó esis dopaminé gica como la hipó esis
clásica. En el sis ema dopaminé gico ce eb al exis en cinco ías: mesolímbica,
mesoco ical, nig oes ia al, ube oin undibula y alámica (Figu a 3).
34
In oducción
Figu a 3. Vías dopaminé gicas ce eb ales. (a) ía nig oes ia al (b) ía mesolímbica (c) ía
mesoco ical (d) ía ube oin undibula (e) ía alámica (S ahl, 2008).
La ía mesolímbica se p oyec a desde los cue pos celula es dopaminé gicos
en el á ea egmen al en al a los e minales axónicos que ine an las á eas
límbicas del ce eb o como son el núcleo accumbens, hipocampo y amígdala.
Es a ía iene un papel impo an e en los sín omas posi i os, especialmen e
en las conduc as emocionales, las alucinaciones audi i as y los deli ios. Se
p opone que la hipe ac i idad de es a ía es una de las causas de los
sín omas posi i os de la esquizo enia pudiendo ambién desempeña un
papel en los sín omas ag esi os.
En la ía mesoco ical los cue pos celula es su gen del á ea egmen al
en al y p oyec an hacia á eas de la co eza p e on al. Una hipo unción de
es a ía se ía la esponsable de los sín omas nega i os y de algunos
sín omas cogni i os.
La ía dopaminé gica nig oes ia al se p oyec a desde los cue pos celula es
dopaminé gicos de la sus ancia neg a hacia los ganglios basales y es iado.
Es a ía o ma pa e del sis ema ne ioso ex api amidal po lo que
con ola los mo imien os. Así, un dé ici de dopamina en es a zona causa
as o nos mo o es como la en e medad de Pa kinson, la cual se ca ac e iza
po igidez, b adicinesia y emblo es; mien as que po o o lado, una
hipe ac i idad de la ía nig oes ia al se ía la esponsable de as o nos
35
In oducción
mo o es como la co ea de Hun ing on, discinesias y ics. El bloqueo c ónico
de los ecep o es D2 de dopamina en es a ía puede da como esul ado un
as o no mo o hipe ciné ico conocido como discinesia a día inducida po
neu olép icos.
Las neu onas dopaminé gicas que se p oyec an desde el hipo álamo a la
adenohipó isis o man la ía ube oin undibula . No malmen e es as
neu onas es án ac i as e inhiben la libe ación de p olac ina.
La ía alámica, desc i a pos e io men e, ine a el álamo en p ima es y
aunque oda ía es á siendo es udiada, pa ece ene un papel en los
mecanismos del sueño. Po el momen o no exis en e idencias de una
unción al e ada de es a ía en los pacien es esquizo énicos.
1.2.5 Hipó esis se o onina-dopamina
La hipó esis de que la se o onina (5-HT) juega un papel en la e iología de la
esquizo enia comenzó basándose en las ac i idades psicomimé icas p oducidas
po la mescalina, psilobicina y la die ilamida del ácido lisé gico (LSD), odos ellos
agonis as alucinógenos del ecep o 5-HT2A de se o onina (Ba olomeis y cols.,
2013; González-Maeso y cols., 2007). Pos e io men e, el desa ollo de los
an ipsicó icos a ípicos, cuya p incipal diana son los ecep o es 5-HT2A de
se o onina y la mayo e icacia clínica obse ada en e a los clásicos (a ibuída al
bloqueo de dicho ecep o ) hizo que la eo ía de la implicación de la se o onina en
la esquizo enia cob a a impo ancia (Mel ze y cols., 1989). Ac ualmen e sabemos
que la se o onina eje ce un papel modulado sob e las ías dopaminé gicas
inhibiendo la libe ación de dopamina en los e minales axónicos. Es e e ec o
modulado a ia á en unción del ni el de exp esión de los ecep o es 5-HT2A de
se o onina y D2 de dopamina.
1.2.6 Genes y p o eínas asociadas a esquizo enia
Hoy en día se acep a que la esquizo enia es una en e medad poligénica, donde un
único gen no es su icien e pa a p oduci la pe o la combinación de la al e ación
a ios genes jun o con ac o es ambien ales inc emen an el iesgo de desa olla la.
El gen Dis up ed in schizoph enia 1 (DISC1), descubie o en una amilia escocesa, es
uno de los genes asociados con esquizo enia, se a a de una anslocación
36
In oducción
balanceada en e el c omosoma 1 y el 11 (1:11) (q42.1;q14.3). El p oduc o de
dicho gen, la p o eína DISC1, es una p o eína sca old con una dis ibución celula
di e sa que iene un papel impo an e en di e en es unciones (debido a su
in e acción con múl iples p o eínas) como la a bo ización y mig ación neu onal,
p oli e ación celula , c ecimien o de neu i as, modulación de la unción del
ci oesquele o, ansmisión sináp ica y plas icidad. En e las p o eínas que
in e ac úan con DISC1 se incluyen la os odies e asa 4B (PDE4B), nuclea
dis ibu ion p o ein nudE-like 1 (NDEL1), lissencephaly p o ein 1 (LIS1),
ascicula ion and elonga ion p o ein Ze a 1 (FEZ1), neu egulin 1 (NRG1),
dys ob e in binding p o ein 1 (DTNBP1), pos synap ic densi y p o ein 95 (PSD95),
las cuales pa icipan en los p ocesos mencionados an e io men e y cuyos genes
han sido asociados con esquizo enia. O os genes elacionados con la en e medad
son los que codi ican las siguien es p o eínas ca ecol-o-me il ans e asa (COMT),
egula o o G p o ein signaling 4 (RGS4), eelina (RELN) y se ine- h eonine p o ein
kinase 1 (AKT1) (Va ela y cols., 2015; Balu y Coyle, 2011; Mackie y cols., 2007;
Po eous y Milla , 2006; Ross y cols., 2006; Lidow, 2003; Sawa y Snyde , 2003).
1.3 T a amien o a macológico de la esquizo enia
El a amien o de la esquizo enia iene es componen es: el a amien o
a macológico con an ipsicó icos, educación e in e ención psicosocial y
ehabili ación.
El a amien o a macológico de la esquizo enia es sin omá ico median e la
adminis ación de á macos an ipsicó icos. Es os se clasi ican en an ipsicó icos
ípicos o de p ime a gene ación y an ipsicó icos a ípicos o de segunda gene ación.
1.3.1 An ipsicó icos ípicos o de p ime a gene ación
Los p ime os á macos an ipsicó icos ue on descubie os acciden almen e en la
década de 1950, cuando se obse ó po casualidad que la clo p omazina (un
compues o con ac i idad an ihis amínica) p esen aba e ec os an ipsicó icos
cuando se adminis aba a pacien es esquizo énicos. A p incipios de la década de
1970 se comp obó expe imen almen e median e écnicas de unión de
adioligandos que su p opiedad a macológica cla e e a el an agonismo de los
ecep o es D2 de dopamina (Bu y cols., 1975; C eese y cols., 1976; Seeman y cols.,
37
In oducción
1976). Es a acción ha esul ado se la esponsable no sólo de la e icacia de los
an ipsicó icos de p ime a gene ación sino ambién de la mayo ía de sus e ec os
secunda ios. Un bloqueo de los ecep o es de dopamina en la ía dopaminé gica
mesolímbica da luga a una educción de la hipe ac i idad que p esen an los
pacien es esquizo énicos en es a ía, la cual es esponsable de los sín omas
posi i os. Los an ipsicó icos ípicos no pe mi en log a un bloqueo especí ico de
los ecep o es D2 a ni el mesolímbico sino que ambién p oducen un bloqueo en la
ía dopaminé gica mesoco ical que se encuen a hipoac i a en esquizo enia y
que es la esponsable de los sín omas nega i os y cogni i os, causando un
empeo amien o de dichos sín omas. A ni el nig oes ia al, el bloqueo de los
ecep o es D2 conlle a al e aciones en el mo imien o (mo imien os in olun a ios
hipe ciné icos) ya que es a ía o ma pa e del sis ema ex api amidal, así, los
e ec os secunda ios se conocen como sín omas ex api amidales. En cuan o a los
ecep o es D2 de la ía ube oin undibula ambién se án bloqueados y como
consecuencia se p oduce hipe p olac inemia.
Además de la clo p omazina, den o de es e g upo de an ipsicó icos ípicos se
encuen an el halope idol, io idazina y loxapina en e o os.
1.3.2 An ipsicó icos a ípicos o de segunda gene ación
Los an ipsicó icos a ípicos ep esen an la segunda gene ación de an ipsicó icos. El
p ime á maco de es e g upo ue la clozapina, la cual no p oduce sín omas
ex api amidales ni hipe p olac inemia, p esen ando baja a inidad po los
ecep o es D2 de dopamina y al a a inidad po los ecep o es 5-HT2A de se o onina
(G oss y Langne , 1966). Du an e un iempo ue e i ada del me cado debido a uno
de sus e ec os ad e sos, la ag anuloci osis, que se p oduce en e el 0.5-2% de los
pacien es (Al i y cols., 1993; Gaszne y cols., 2002). Pos e io men e, su
demos ada supe io idad clínica en esquizo enia esis en e y los pocos sín omas
ex api amidales que p oduce, hizo que se ein oduje a en el me cado aunque no
sea la p ime a línea de a amien o, conside ándola el “es ánda de o o” (gold
s anda d) de la medicación an ipsicó ica (Kane y cols., 1988).
El hecho de que los an ipsicó icos a ípicos como la clozapina p esen en una mayo
a inidad po los ecep o es 5-HT2A que po los ecep o es D2 condujo a lo que se
conoce como índice de Mel ze : una elación pKi 5-HT2A/ pKi D2 que ha sido
38
In oducción
clozapina
u ilizado como un c i e io de clasi icación de an ipsicó icos, de es a mane a si el
esul ado de la elación es meno de 1.09 el á maco se compo a como un
an ipsicó ico ípico, mien as que si es mayo a 1.12 se compo a como
an ipsicó ico a ípico (Mel ze y cols., 1989).
Sin emba go, la clozapina es conside ado un á maco “sucio” debido a su pe il
mul i ecep o ial ya que p esen a a inidad po más de una docena de ecep o es
acoplados a p o eínas G (GPCRs) como son odos los ecep o es de dopamina (D1-
D5), los ecep o es 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6 y 5-HT7 de se o onina,
ecep o es de his amina H1, ecep o es musca ínicos y ecep o es ad ené gicos.
Po ello, esul a complicado diseña un á maco clozapine-like con menos e ec os
ad e sos (Figu as 4 y Figu a 5) (Ro h y cols., 2004).
Figu a 4. Pe il mul i ecep o ial de la clozapina donde se ep esen an los di e en es
ecep o es pa a los que iene a inidad (S ahl, 2008).
39
In oducción
ARa
A+Ri
ARi
Ka
αL
2.2 Modelos de in e acción ligando- ecep o
Desde que se conoce la exis encia de los ecep o es, nume osas eo ías y modelos
ma emá icos han a ado de explica las in e acciones ligando- ecep o y a medida
que aumen aba el conocimien o, es os modelos ue on aumen ando en
complejidad.
El modelo clásico de in e acción ligando ecep o desc ibe que un agonis a (A) se
une a un ecep o en es ado inac i o (Ri) pa a o ma un complejo ARi que as un
cambio con o macional se ans o ma á en el es ado ac i o ARa.
Pos e io men e, De Lean y colabo ado es (De Lean y cols., 1980) diseña on o o
modelo en el cual se incluía la in e acción del ecep o con la p o eína G, conocido
como modelo del complejo e na io.
En 1989 Cos a y He z demos a on po p ime a ez que un ecep o podía
señaliza en ausencia de ligando, es lo que se conoce como ac i idad cons i u i a
(Cos a y He z, 1989). Po es e mo i o, ue necesa io p opone un nue o modelo
que u ie a en cuen a esa ca ac e ís ica, así, se p opuso el modelo del complejo
e na io ex endido (Samama y cols., 1993) (Figu a 11A). Es e modelo a pesa de
se el que mejo explicaba la in e acción ligando- ecep o , e a incomple o
e modinámicamen e desde el pun o de is a de la in e acción ecep o -p o eína G.
Po lo an o, se p opuso el modelo del complejo e na io cúbico que incluía la
posibilidad de que el ecep o en es ado inac i o (con ligando unido o no)
in e ac ua a con la p o eína G (Weiss y cols., 1996a, 1996b, 1996c) (Figu a 11B).
ARaG
ARa+G
A+Ri
ARi
Ka
αL
γβKg
46
In oducción
Figu a 11. Modelos de in e acción ligando- ecep o . A) Modelo del complejo e na io
ex endido. B) Modelo del complejo e na io cúbico (Kenakin, 2002).
Ac ualmen e exis en modelos aún más complejos que incluyen o as p opiedades
de los ecep o es como son el alos e ismo, coope a i idad, señalización c uzada
(c oss alk) y la o mación de díme os u oligome os (Gi aldo, 2013; Du oux, 2005).
Pa a simpli ica los modelos de sis emas p o eicos se ep esen a una única
con o mación, sin emba go, exis en e idencias expe imen ales de que los
ecep o es no exis en como una única con o mación ac i a o inac i a, sino que
exis en como colecciones de con o maciones, algunas de las cuales son capaces de
p oduci un e ec o (Pa k, 2012; Kenakin y Mille , 2010; Vaidehi y Kenakin, 2010;
Kenakin, 2002, 1995). Asimismo, ambién exis en e idencias de la exis encia
empo al de mic ocon o maciones (Figu a 12). Po ello, en la eo ía del conjun o
de con o maciones se asume que un ecep o (en ausencia de ligando) posee un
es ado de dis ibución pa icula en el espacio con o macional y que los ligandos
y/o p o eínas G cambian esa dis ibución del es ado basal después de in e ac ua .
Cuando el ligando que se une es un agonis a end á a inidad po la colección de
con o maciones ac i as, lo que p oduce una edis ibución de las mismas
desplazando el equilib io. En el caso de que el ligando sea un agonis a in e so,
p esen a á una mayo a inidad po la colección de con o maciones inac i as y el
equilib io se á desplazado en el sen ido opues o (Figu a 13) (Kenakin, 2004,
2003, 2002).
B
A
47
In oducción
Figu a 12. Rep esen ación del conjun o de mic ocon o maciones. A) En ausencia de
ligando, el ecep o posee un conjun o de dis ibuciones en el espacio con o macional. B)
T as la in e acción con el ligando esas dis ibuciones con o macionales cambian (Kenakin,
2004).
A
B
48
In oducción
A
C
D
E
F
B
Figu a 13. Di e en es conjun os de con o maciones exp esadas como dis ibuciones
Gaussianas. A) Con o maciones basal (Re ) y ac i a (G) de un ecep o . B) Redis ibución
de las con o maciones as la unión de un agonis a. Las zonas de in e sección ep esen an
la espues a. C, D) Redis ibución de las con o maciones p o ocada po la in e acción con
un an agonis a. E) Rep esen ación de un ecep o con ac i idad cons i u i a. F)
Redis ibución de las con o maciones as la unión de un agonis a in e so (Kenakin,
2002).
La obse ación de que di e en es ligandos ac uando sob e un mismo GPCR puedan
selecciona di e en es es ados con o macionales y po consiguien e ac i a
di e en es ías de señalización acopladas al mismo ecep o de un modo
di e encial, es lo que se conoce como agonis -di ec ed a icking o ecep o
s imulus (Kenakin, 1995) y se explica a a és de la eo ía de conjun os
49
In oducción
con o macionales. También se conoce como selec i idad uncional (U ban y cols.,
2007), biased agonism (Ja pe y cols., 1998) o colla e al e icacy (Kenakin, 2007).
Es a p opiedad se obse ó en los ecep o es de se o onina, dopamina, adenosina y
opioides en e o os (Figu a 14) (Liu y cols., 2015; Kenakin y Mille , 2010).
Figu a 14. Esquema ep esen a i o del enómeno de selec i idad uncional. Cuando el
agonis a A1 in e ac úa con el ecep o R, p oduce p e e encialmen e la ac i ación de la ía
de señalización E1 que de E2. El agonis a A2 unido al mismo ecep o p omue e una
ac i ación simila pa a ambas ías mien as que el agonis a A3 a o ece la ía de
señalización E2 (Be g y cols., 1998a).
Una de las p ime as obse aciones del enómeno de selec i idad uncional ue en
el ecep o ipo 1 del polipép ido ac i ado de adenila o ciclasa de la pi ui a ia
(PACAP-1) acoplado a las p o eínas Gs (p oduciendo AMPc a a és de la adenila o
ciclasa) y Gq/11 (gene ando IP3 a a és de la PLC). En dicho ecep o , los agonis as
PACAP-27 y PACAP-38 in ie en sus po encias ela i as en unción de la ía
e ec o a ca ac e izada (Spengle y cols., 1993).
Pos e io men e, en 1998, Be g y colabo ado es demos a on dicho enómeno en
los ecep o es 5-HT2C y 5-HT2A de se o onina. Es os ecep o es se encuen an
acoplados a la PLC (a a és de Gq/11 gene ando IP3 y DAG) y a la PLA2 p oduciendo
AA (Hoye y cols., 1994; Felde y cols., 1990). En los ecep o es 5-HT2C de
se o onina, se obse ó que el agonis a quipazina p oduce una espues a máxima
supe io a la del (±)1-(2,5-dime hoxy-4-iodophenyl)-2-aminop opane (±DOI) en la
ía de la PLC mien as que es e úl imo p esen a una mayo espues a a a és de la
ía de PLA2 (Figu a 15A y 15B). O os agonis as mos a on esul ados simila es
en ese ecep o (Be g y cols., 1998 a, b, c).
50
In oducción
En el caso del ecep o 5-HT2A de se o onina, agonis as como LSD o lisu ida
p oducen cla amen e una mayo ac i ación de la PLA2 que de PLC (Figu a 15C).
Figu a 15. Ejemplos de algunos agonis as que p esen an selec i idad uncional. A) El
agonis a (±)DOI p esen a una mayo espues a a a és de PLA2 que PLC en el ecep o 5-
HT2C de se o onina exp esado de o ma es able en células CHO-1C19. B) El agonis a
quipazina p esen a un e ec o con a io, una mayo espues a a a és de la PLC que de
PLA2 en el ecep o 5-HT2C de se o onina exp esado de o ma es able en células CHO-
1C19. C) Es udio de la señalización de di e en es agonis as en células CHO-FA4 que
exp esan de o ma es able el ecep o 5-HT2A de se o onina (Be g y cols., 1998a).
2.3 Dime ización de GPCRs
Los GPCRs ue on conside ados adicionalmen e como en idades monomé icas
donde un ecep o se acopla a una p o eína G con una es equiome ía 1:1. Sin
emba go, la apa ición an o de cu as de compe ición bi ásicas con coope a i idad
posi i a o nega i a (que no podían se explicadas median e el modelo adicional)
como de wes e n blo s con múl iples bandas, indicaban que los GPCR pueden
o ma oligóme os (He ick-Da is y cols., 2013; Hille y cols., 2013; Milligan, 2013;
K oege y cols., 2003; Ange s y cols., 2002). Las consecuencias de es a
oligome ización son a iadas y a di e en es ni eles, siendo un equisi o pa a el
á ico a la memb ana plasmá ica desde el luga de sín esis, modi icando las
p opiedades de in e nalización u o o gándole al díme o/oligóme o nue as
p opiedades a macológicas y ías de señalización (Smi h y Milligan, 2010; Pin y
cols., 2007).
B
A
C
51
In oducción
En el caso de díme os la asociación puede se en e p o eínas idén icas, lo que se
conoce como homodíme os, o en e p o eínas dis in as, o mando en es e caso
he e odíme os.
La IUPHAR es ableció unos c i e ios pa a que un díme o sea acep ado po la
comunidad cien í ica: 1) debe exis i una in e acción ísica (o p oximidad) de
ambos ecep o es en ejido na i o o en células p ima ias, 2) debe ene
p opiedades a macológicas especí icas 3) e idencias en animales knockou o
median e la ecnología del ácido ibonucleico in e e en e (RNAi) in i o. Así,
deben cumpli se al menos dos de los es c i e ios es ablecidos (Pin y cols., 2007).
La p ime a e idencia acep ada del signi icado uncional de un díme o iene de la
mano de un GPCR de clase C, el ecep o GABAB, el cual o ma un he e odíme o
obligado que cons a de dos subunidades, GABAB1 (une agonis as) y GABAB2 (ac i a
a la p o eína G). En ausencia de GABAB2 la subunidad GABAB1 es e enida en el
e ículo endoplasmá ico, po el con a io, GABAB2 sí es anspo ada a la
memb ana cuando se exp esa sola pe o no une GABA ni p omue e la señalización.
Únicamen e cuando ambas subunidades se coexp esan se p oduce un á ico
co ec o a la memb ana celula y la o mación de un ecep o uncional (Ma shall y
cols., 1999; Whi e y cols., 1998).
2.3.1 Dominios de in e acción en díme os
Nume osos es udios c is alog á icos y de mu agénesis di igida han a ado de
explica cuáles son los dominios de in e acción en e los p o óme os de un díme o.
El modelo de in e cambio de dominios (domain swapping model) conside a que la
unidad uncional monomé ica consis i ía en los cinco p ime os dominios
ansmemb ana (TM) de un monóme o y los dos úl imos del o o. De es e modo, si
ambos p o óme os se coexp esan se p oduce un eo denamien o y se ecupe a el
ecep o uncional. Po o o lado, en el modelo de empaque amien o la e al, el
díme o se o ma ía po con ac o a a és de los dominios ansmemb ana (Figu a
16) (Szidonya y cols., 2008).
52
In oducción
Figu a 16. Modelos de in e acción en e monóme os. A) Modelo de empaque amien o
la e al. B) Modelo de in e cambio de dominios domain swapping model (Szidonya y cols.,
2008).
Se ha demos ado que los dominios ansmemb ana IV y V o man la in e az
dimé ica en los ecep o es D2 de dopamina, hodopsina, 5-HT1A y 5-HT2A de
se o onina y mGlu2 de glu ama o (Xue y cols., 2015; Go inski y cols., 2012; Mo eno
y cols., 2012; B uno y cols., 2009; González-Maeso y cols., 2008; Fo iadis y cols.,
2004; Guo y cols., 2003). Aunque los dominios ansmemb ana y las in e acciones
hid o óbicas son conside adas las más e ec i as y p obables en el p oceso de
dime ización, las uniones co alen es en e cis eínas localizadas en las egiones
ex acelula es como po ejemplo en el N- e minal del ecep o sensible a calcio, los
ecep o es me abo ópicos de glu ama o y el ecep o de angio ensina II ipo 2 son
impo an es en la dime ización (Miu a y cols., 2005; Zhang y cols., 2001; Ray y
cols., 2000; Romano y cols., 1996). Po o o lado, se han desc i o o as
in e acciones como la coiled-coil de los ecep o es GABAB (Figu a 17) (Bu makina
y cols., 2014; Whi e y cols., 1998).
A
B
53
In oducción
Figu a 17. Dominios de in e acción en ecep o es dimé icos. A) Fo mación de díme os
median e puen es disul u o. B) Fo mación de díme os a a és del dominio C- e minal,
in e acción coiled-coil. C) Fo mación de díme os po con ac o en e los dominios
ansmemb ana (Bou ie , 2001).
2.3.2. Técnicas de de ección de díme os
Se han u ilizado múl iples écnicas bioquímicas, bio ísicas y a macológicas pa a
demos a la exis encia de díme os. A con inuación se mencionan algunas de ellas.
2.3.2.1 Técnicas bioquímicas : complemen ación uncional y
coinmunop ecipi ación
2.3.2.1.1 Complemen ación uncional
Pa a es udia las in e acciones ísicas en e GPCRs se han lle ado a cabo es udios
de complemen ación uncional donde ecep o es mu ados o quime as que no son
uncionales cuando se exp esan indi idualmen e, ees ablecen la señalización
cuando son coexp esados. Un es udio ealizado po Maggio y colabo ado es
(Maggio y cols., 1993a) u ilizó dos ecep o es quime as; uno con enía los cinco
p ime os dominios ansmemb ana del ecep o α2-ad ené gico y los dos úl imos
del ecep o musca ínico M3 y el o o ice e sa. Cuando se exp esa on
indi idualmen e es os ecep o es no ue on capaces de uni adioligandos ni de
señaliza , po el con a io, cuando se coexp esa on se ecupe ó pa cialmen e la
unción sugi iendo una in e acción ísica en e ambas quime as c eando
ecep o es uncionales. Resul ados simila es se obse a on en el ecep o de
A
B
C
54
In oducción
angio ensina II ipo 1 y ambos apoyaban el modelo de dime ización domain
swapping (Monno y cols., 1996).
O a ap oximación un an o di e en e en la que se u iliza on mu an es, en es e caso
del ecep o D2 de dopamina, demos ó la complemen ación uncional en e un
ecep o mu ado en coexp esión con el ecep o na i o (Han y cols., 2009).
Po el con a io, en o os GPCRs la dime ización en e ecep o es mu ados y
na i os no ees ablece la unción, es o se conoce como e ec o dominan e nega i o
pe o ambién demos a ía la in e acción en e ambos (He ick-Da is y cols., 2005).
2.3.2.1.2 Coinmunop ecipi ación
Una de las écnicas bioquímicas más u ilizada pa a es udia la dime ización ha sido
la coinmunop ecipi ación de ecep o es ma cados con epí opos di e en es. El
p ime ecep o es udiado con es a ap oximación ue el ecep o β2-ad ené gico.
Pa a ello se ma ca on unos ecep o es con hemaglu inina (HA) y o os con c-MYC y
se coexp esa on en células S 9. Finalmen e se inmunop ecipi a on con un
an icue po an i-myc y el díme o ue de ec ado con el an icue po an i-HA (Hebe y
cols., 1996).
Median e es a egias simila es se ha demos ado la homodime ización de o os
ecep o es como los 5-HT2A, 5-HT2C y 5-HT4 de se o onina o el musca ínico M3
en e o os (B ea y cols., 2009; Be houze y cols., 2005; He ick-Da is y cols., 2004;
Zeng y Wess, 1999). También se han demos ado nume osos he e odíme os como
5-HT2A-D2, D1-D2 o el GABAB1-GABAB2 (Albizu y cols., 2011; Lukasiewicz y cols.,
2010; Lee y cols., 2004; Whi e y cols., 1998).
Aunque es a écnica es muy u ilizada pa a es udia in e acciones p o eína-
p o eína, la coinmunop ecipi ación de ecep o es equie e la solubilización con
de e gen es que puede se p oblemá ica cuando se a a de p o eínas al amen e
hid o óbicas como es el caso de GPCRs, pudiendo o ma ag egados y po lo an o
díme os a e ac uales.
2.3.2.2 Técnicas bio ísicas: ans e encia de ene gía de esonancia y
complemen ación de luo escencia bimolecula
A pesa de que la coinmunop ecipi ación es una écnica muy u ilizada, no pe mi e
el es udio de díme os en células i as ni en iempo eal. Es e incon enien e se
sol en ó con la apa ición de écnicas basadas en la ans e encia de ene gía de
55
In oducción
Dicho neu o ansmiso eje ce su unción a a és de 7 ipos de ecep o es de 5-HT
(5-HT1 a 5-HT7) clasi icados en base a su secuencia gené ica, mecanismos de
ansducción de señales y a inidades po agonis as/an agonis as selec i os, de los
cuales odos, sal o el 5-HT3 que es un canal iónico dependien e de ligando, son
GPCRs de clase A o odopsina α. A su ez, es os ecep o es ue on clasi icados en
14 sub ipos y 13 de ellos es án acoplados a di e en es ías de señalización,
p incipalmen e a a és de p o eínas G como son Gi, Gq/11, Gs (McCo y y Ro h,
2015; Hoye y cols., 1994). Pa a los ecep o es de se o onina ipo 5-HT1 (5-HT1A,
5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E y 5-HT1F) y 5-HT5 (5-HT5A y 5-HT5B) la ía más conocida
implica a Gi, p oduciendo una inhibición de la adenila o ciclasa y po lo an o una
disminución del AMPc.
Los ecep o es de se o onina ipo 5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C) es án acoplados
p incipalmen e a Gq/11 y ac i an la PLC p oduciendo IP3, DAG y aumen ando los
ni eles in acelula es de calcio. También exis en e idencias del posible
acoplamien o a Gi po pa e de los ecep o es 5-HT2C y 5-HT2A de se o onina
(Lucai es y cols., 1996; Ga no skaya y cols., 1995).
En los ecep o es acoplados a Gs se incluyen 5-HT4, 5-HT6 y 5-HT7 de se o onina,
que p o ocan la ac i ación de la adenila o ciclasa inc emen ando los ni eles de
AMPc. Asimismo se ha obse ado que la ac i ación del ecep o 5-HT4 de
se o onina puede esul a en un inc emen o en los ni eles de calcio posiblemen e
a a és de Gq/11 (Ponimaskin y cols., 2002).
3.1. Recep o 5-HT2A de se o onina
El ecep o 5-HT2A de se o onina es el obje o de es udio de es e abajo. En un
p incipio se le denominó ecep o 5-HT “D” po se bloqueado po el an agonis a
i e e sible dibenzylina, ambién conocido como enoxibenzamina, y
pos e io men e ue enomb ado como 5-HT2 (Pe ou ka y Snyde , 1979; Gaddum y
Pica elli, 1957). En humanos es codi icado po el gen HTR2A que se encuen a en
el c omosoma 13q14-q21 y eje ce sus unciones an o en la pe i e ia como en el
SNC. A ni el pe i é ico pa icipa en la ag egación plaque a ia y en la con acción
del músculo liso ascula , u e ino, u ina io, b onquial e in es inal. En el SNC
pa icipa en p ocesos isiológicos como la egulación del sueño y la empe a u a,
con ol de la ac i idad sexual y con ol de la libe ación de o os neu o ansmiso es
62
In oducción
y ho monas como la oxi ocina y p olac ina (Hoye y cols., 2002; Ge ha d y an
Hee ikhuizen, 1997).
Su dis ibución en el SNC ha sido ampliamen e es udiada po au o adiog a ía,
hib idación in si u e inmunoci oquímica. El empleo de los adioligandos
[3H]espipe ona, [3H]ke anse ina, [125I](±)DOI o [3H](±)-α-(2,3-Dime hoxyphenyl)-1-
[2-(4- luo ophenyl)e hyl]-4-pipe idineme hanol ([3H](±)MDL100,907) en écnicas
de au o adiog a ía han pe mi ido de ec a dicho ecep o en di e en es á eas del
ce eb o como el có ex, neocó ex, núcleo accumbens, núcleo ol a o io y en meno
medida en ganglios basales e hipocampo (López-Giménez y cols., 1997; Pazos y
cols., 1987, 1985). Se han encon ado al os ni eles de exp esión en la lámina V y
ambién es á p esen e en in e neu onas GABAé gicas, neu onas dopaminé gicas,
coliné gicas, neu onas pi amidales glu ama é gicas y as oci os (de Almeida y
cols., 2007; Dohe y y Pickel, 2000; Bu ne y cols., 1995; Mo ilak y cols., 1994,
1993; Deeche y cols., 1993).
Un g an núme o de desó denes psiquiá icos y neu odegene a i os se asocian con
a iaciones en la es uc u a, unción y exp esión del ecep o 5-HT2A de se o onina
como po ejemplo la dep esión, esquizo enia, ansiedad, as o no obsesi o-
compulsi o, sínd ome de Tou e e, desó denes alimen a ios, Pa kinson y
Alzheime (Azna y He ig, 2016; Mes e y cols., 2013). Una de las e idencias más
cla as de su elación con la esquizo enia iene de la mano del LSD y del (±)DOI,
agonis as del ecep o 5-HT2A de se o onina que p oducen alucinaciones simila es
a las obse adas en dicha pa ología. Asimismo, el desa ollo de los an ipsicó icos
a ípicos como la clozapina, la cual mues a menos e ec os ex api amidales y una
mayo e icacia clínica en el a amien o de los sín omas nega i os debido al
bloqueo de dicho ecep o , pone de mani ies o la elación 5-HT2A-esquizo enia.
Como se mencionó an e io men e, el ecep o 5-HT2A de se o onina se acopla,
en e o as, a la p o eína Gq/11 que ac i a a la PLC-β1 hid olizando el
os a idilinosi ol 4,5 bi os a o (PIP2) si uado en la memb ana en dos segundos
mensaje os, el DAG e IP3. El DAG pe manece en la memb ana plasmá ica y ac i a a
la p o eína kinasa C (PKC) mien as que el IP3 en a en el ci oplasma (ya que es
hid osoluble) y se une al ecep o de IP3 si uado en el e ículo endoplasmá ico
ac i ándolo y p o ocando la salida de calcio desde el e ículo al ci oplasma
63
In oducción
(Figu as 22 y 23). Con el obje i o de egene a el inosi ol, el IP3 en a en el ciclo
de los inosi oles os a o donde el paso inal es la con e sión de inosi ol-1- os a o a
inosi ol po la enzima inosi ol mono os a asa. Es a enzima es inhibida po el li io
(elemen o que ha sido u ilizado como a amien o en maníaco-dep esi os)
p oduciendo la acumulación de las especies de inosi ol os a o (IPs) o madas
p e iamen e, pudiendo se cuan i icadas y u ilizadas como una medida de
ac i ación del ecep o (Figu a 24) (Be idge, 2009; Hoye y cols., 1994; Maje us,
1992; Be idge, 1984). Tan o la PKC como el calcio con inua án con la cascada de
señalización. O a de las múl iples ías de señalización de es e ecep o implica la
ac i ación de PLA2, posiblemen e a a és de la p o eína Gα12/13 p omo iendo la
libe ación de AA desde la posición 2 de algunos os olípidos de memb ana
(Figu as 22 y 23) (Ku asch-O baugh y cols., 2003; Felde y cols., 1990).
Figu a 22. Esquema simpli icado de las ías de señalización del ecep o 5-HT2A de
se o onina donde se mues a la ac i ación de la PLA2 y la PLC as la unión del agonis a 5-
HT (Masson y cols., 2012).
64
In oducción
Figu a 23. Es uc u a gene al de un os olípido y luga es de acción de las di e en es
os olipasas (Cappe y cols., 2001).
Figu a 24. Esquema simpli icado del ciclo de inosi oles os a o. La ac i ación del ecep o
5-HT2A de se o onina po 5-HT p oduce la hid olisis de PIP2 en IP3 y DAG. El IP3 p oduce la
salida de calcio al ci oplasma as uni se a su ecep o en el e ículo endoplasmá ico.
Además, pos e io men e, el IP3 en a en el ciclo de inosi oles os a o pa a egene a el
inosi ol ce ando así el ciclo. La enzima inosi ol mono os a asa que ca aliza el úl imo paso
es inhibida po li io (Be idge, 2009).
El ecep o 5-HT2A de se o onina es uno de los p ime os ecep o es en los que se
obse ó el enómeno de selec i idad uncional donde di e en es ligandos
p esen an di e en es e icacias y/o po encias en unción de la ía de señalización
es udiada (PLA2 o PLC) (Figu a 15C) (Be g y cols., 1998a). En 2003 Ku asch-
O baugh y colabo ado es con i ma on dicho enómeno en o a línea celula
( ib oblas os NIH3T3) ca ac e izando dis in os ligandos agonis as, así, aunque la
ip amina no mos aba di e encias en cuan o a po encias en ambas ías de
señalización, ac uaba como agonis a o al en la ía de señalización de la PLC y
como agonis a pa cial en la ía de la PLA2 (Figu a 25A). Po el con a io, el LSD
mos ó una mayo e icacia en la señalización a a és de la PLA2 (Figu a 25B).
IP5
IP4
IP6
65
In oducción
O o compues o ca ac e izado, psilocin, no p esen o di e encias en e icacia pe o sí
en po encia, siendo es a signi ica i amen e mayo en PLA2 (86 3.9 nM en PLA2 y
2300 289 nM en PLC) (Figu a 25C) (Ku asch-O baugh y cols., 2003).
Figu a 25. Ejemplos de selec i idad uncional de di e en es agonis as en el ecep o 5-
HT2A de se o onina exp esado de o ma es able en ib oblas os NIH3T3. Los cí culos
neg os ep esen an la ía de señalización mediada po la PLC y los cuad ados blancos la
ía de señalización mediada po la PLA2 (Ku asch-O baugh y cols., 2003).
En cuan o a an agonis as, se ha demos ado la exis encia de selec i idad uncional
pa a la clozapina, ispe idona, ke anse ina y MDL 100,907, p esen ando un pe il
mono ásico en la ía mediada po la PLC y un pe il bi ásico en la libe ación de AA
as la ac i ación de la PLA2 (Figu a 26A y 26B) (B ea y cols., 2009). Es as cu as
bi ásicas ambién ue on desc i as en expe imen os de compe ición en e a los
adioligandos [3H](±)-1-(4-b omo-2,5-dime hoxyphenil)-2-aminop opane
([3H]()DOB) y [125I]()DOI siendo ca ac e ís ico de ecep o es en o ma dimé ica
que p esen an coope a i idad, p opiedad que ha sido desc i a pa a a ios GPCRs
de clase A pudiendo se posi i a o nega i a (Figu a 26C) (B ea y cols., 2009;
Albizu y cols., 2006; López-Giménez y cols., 2001).
A
B
C
66
In oducción
A
B
C
Figu a 26. Di e en es con o maciones del ecep o 5-HT2A de se o onina econocidas po
los an agonis as clozapina, ke anse ina, ispe idona y MDL100,907. A) Cu as de
inhibición de la es imulación p oducida po 5-HT 1μM en PLC (acumulación de IPs). B)
Cu as de inhibición de la es imulación p oducida po 5-HT 1μM en PLA2 (libe ación de
AA). C) Compe ición de los an agonis as en e a [3H]DOB (B ea y cols., 2009).
En el caso de los an agonis as an es mencionados, en los ecep o es 5-HT2A de
se o onina se obse ó coope a i idad nega i a, donde la unión de un ligando a uno
de los p o óme os del díme o di icul a la unión del segundo ligando al o o
p o óme o (B ea y cols., 2009; López-Giménez y cols., 2001). Además de es as
e idencias, se con i mó la homodime ización de dicho ecep o median e écnicas
de coinmunop ecipi ación y FRET (B ea y cols., 2009).
Po o o lado, o os abajos han desc i o la o mación de he e odíme os o mados
po el ecep o 5-HT2A de se o onina y el ecep o D2 de dopamina (Albizu y cols.,
2011; Bo o o-Escuela y cols., 2010; Lukasiewicz y cols., 2010) así como con el
ecep o de glu ama o mGlu2 (Mo eno y cols., 2016, 2012; F ibou g y cols., 2011;
González-Maeso y cols., 2008) y con el ecep o cannabinoide CB1 (Viñals y cols.,
2015). Ambos he e odíme os se encuen an implicados en esquizo enia y
p esen an c oss alk en e p o óme os iéndose modi icadas sus p opiedades de
unión y señalización. Albizu y colabo ado es obse a on que la coexp esión de 5-
HT2A-D2 disminuye la a inidad del agonis a (±)DOI po el ecep o 5-HT2A de
se o onina pe o po encia su señalización al inc emen a el acoplamien o a la
p o eína Gαq/11. Po el con a io, la coac i ación de los ecep o es D2 de dopamina
po el agonis a quinpi ol, p oduce el e ec o opues o inc emen ando la a inidad del
(±)DOI y disminuyendo el acoplamien o de Gαq/11 a 5-HT2A (Albizu y cols., 2011).
Como se comen ó an e io men e se ha demos ado la exis encia del he e odíme o
5-HT2A-mGlu2 po a ios mé odos, p esen ando nue as p opiedades de
67
In oducción
señalización di e en es de las que p esen an los p o óme os de mane a indi idual.
El ecep o mGlu2 de glu ama o se encuen a acoplado a Gαi mien as que el
ecep o 5-HT2A de se o onina se acopla p incipalmen e a Gαq/11 exis iendo pa a
es e úl imo dos ipos de agonis as, los alucinógenos y los no alucinógenos, los
cuales p esen an un compo amien o di e en e a ni el de señalización. Ambos
pueden ac i a di e en es ías po selecciona di e en es es ados ac i os
(con o maciones) del ecep o , así, cuando ambos ecep o es o man
he e odíme os, los agonis as alucinógenos del ecep o de se o onina ac i an an o
Gαq/11 como Gαi induciendo la exp esión de los genes c- os y eg -2 espec i amen e;
mien as que los no alucinógenos solamen e ac i an Gαq/11 p oduciendo
únicamen e la exp esión de c- os (Figu a 27). Po lo an o, eg -2 se ía un ma cado
especí ico de la señalización mediada po un alucinógeno, siendo es e hallazgo o o
caso de selec i idad uncional (González-Maeso y cols., 2008).
Figu a 27. A) Ac i ación de p o eínas G po el ecep o 5-HT2A de se o onina e inducción
de la exp esión de genes po los compues os alucinógenos (HCs) y no alucinógenos
(NHCs). B) Ac i ación de Gi/o po el ecep o de glu ama o mGlu2 as la unión de un
agonis a (Guixà-González y cols., 2012).
68
In oducción
La ac i ación de Gαq/11 po el ecep o 5-HT2A disminuye al se coexp esado con el
ecep o mGlu2 mien as que se po encia la ac i ación de Gαi po 5-HT2A. Es os
e ec os p oducidos po el ecep o mGlu2 en la egulación de Gαq/11 y Gαi po el
ecep o de se o onina ue on in e idos en p esencia del agonis a glu ama é gico
(LY379268) (Figu a 28). La modulación po pa e de mGlu2 del acoplamien o de
5-HT2A a Gαi indica que es e complejo puede se impo an e pa a la señalización de
compues os alucinógenos. La inducción de c- os po agonis as 5-HT2A
(alucinógenos y no alucinógenos) no se io a ec ada po la p esencia de LY379268
mien as que sí se io bloqueada eg -2 (González-Maeso y cols., 2008).
Figu a 28. C oss alk en e p o óme os del he e odíme o 5-HT2A-mGlu2. A) Es udio de la
ac i ación de Gαq/11 po el agonis a se o oniné gico (±)DOI en ausencia o p esencia del
ecep o mGlu2 y del agonis a glu ama é gico LY379268. B) Es udio de la ac i ación de Gαi
po el agonis a se o oniné gico (±)DOI en ausencia o p esencia de ecep o mGlu2 y del
agonis a glu ama é gico LY379268 (González-Maeso y cols., 2008).
A
B
Gαq/11
Gαi
69
In oducción
F ibou g y colabo ado es p oponen que la unión de ligandos a los ecep o es
mGlu2 y 5-HT2A del he e odíme o al e a el equilib o Gαq/11-Gαi (Figu a 29)
(F ibou g y cols., 2011). Es os cambios en la egulación indican que 5-HT2A-mGlu2
pueden es a implicados en esquizo enia y que es e complejo es po lo an o una
p ome edo a diana e apéu ica.
Figu a 29. Modulación del equilib io isiológico Balance index (BI) as la unión de
ligandos al he e odíme o 5-HT2A-mGlu2, el cual in eg a las ías de señalización que
p esen an ambos monóme os po sepa ado (Guixà-González y cols., 2012).
70
Resumen
Los ecep o es acoplados a p o einas G (GPCRs) exis en como colecciones de
con o maciones en equilib io, y la e icacia de los á macos se ha p opues o que se
asocia con sus a inidades absolu as y ela i as po las di e en es con o maciones.
El ecep o 5-HT2A de se o onina egula múl iples unciones isiológicas, es á
implicado en la pa o isiología de la esquizo enia y es una impo an e diana de los
á macos an ipsicó icos a ípicos. Es e ecep o ue uno de los p ime os GPCRs
pa a el cual se obse ó el enómeno de selec i idad uncional, donde a ios
ligandos eje cen e ec os di e enciales en las ías de señalización de la os olipasa
A2 (PLA2) y la os olipasa C (PLC). Noso os nos p opusimos desa olla un ensayo
uncional mul iplex en placas de 96 pocillos pa a medi simul aneamen e las ías
PLA2 y PLC acopladas al ecep o 5-HT2A; es a ap oximación pe mi e la de ección
de enómenos de selec i idad uncional o coope a i idad en es adíos emp anos de
c ibado de á macos. La sos enibilidad del mé odo pa a pone en ma cha
campañas de c ibado ue pues a a p ueba u ilizando la lib e ía química P es wick®,
y 22 hi s ue on con i mados con ac i idades mayo es al 90%; 11 de es os hi s
Resul ados
77
79
p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as en e las dos ías e ec o as.
Así, hemos desa ollado un ensayo mul iplex minia u izado en placas de 96
pocillos pa a medi selec i idad uncional en los ecep o es 5-HT2A en es adíos
emp anos del p oceso de descub imien o de á macos.
Palab as cla e
Recep o 5-HT2A, selec i idad uncional, mul iplex, os olipasa A2, os olipasa C
Resul ados
78
80
Resul ados
Publicación 1: De elopmen o a Mul iplex Assay o S udying Func ional
Selec i i y o Human Se o onin 5-HT2A Recep o s and Iden i ica ion o Ac i e
Compounds by High Th oughpu Sc eening
h p://jou nals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057116644162?u l_ e =Z39.
88-2003& _id=o i: id:c oss e .o g& _da =c _pub%3dpubmed
Resul ados
89
Resumen
Di e en es ligandos ac i an di e encialmen e las ías de señalización PLA2 y PLC
acopladas al ecep o de se o onina 2A (5-HT2A), un ecep o acoplado a p o eínas
G (GPCRs) de clase A. El ecep o de se o onina 5-HT2A ha sido demos ado que se
exp esa como homodíme o p esen ando algunos ligandos coope a i idad nega i a
en e p o óme os en la ía de señalización de PLA2. Noso os desa ollamos la
hipó esis de que el complejo homodimé ico es la unidad uncional mínima
eque ida pa a la ac i ación de las ías PLA2 y PLC po pa e del ecep o 5-HT2A
de se o onina. Pa a in es iga es a hipó esis, bloqueamos pa cialmen e los
ecep o es 5-HT2A de se o onina con i anse ina y medimos la ac i idad de PLA2 y
PLC simul áneamen e. Pos e io men e añadimos el an agonis a compe i i o
espipe ona pa a libe a al inac i ado a a és de un mecanismo de c oss alk
pe mi iendo al díme o ol e a un es ado eac i o. La inac i ación pa cial del
homodíme o po la unión de i anse ina disminuye la ac i idad del ecep o un
59±13% y un 70±4% en las ías de PLA2 y PLC espec i amen e (P<0.001), sin
obse a se di e encias en la po encia de la se o onina (5-HT). La pos e io unión
de la espipe ona libe a a la i anse ina debido a un mecanismo de c oss alk en e
p o óme os y ecupe a la ac i idad del ecep o has a un 74±7% y un 72±4%. La
91
coope a i idad nega i a en e los p o óme os del díme o ue man enida du an e la
libe ación de ácido a aquidónico (AA) después del bloqueo po i anse ina, como
se indica po las cu as de inhibición bi ásicas de la clozapina sob e la se o onina
1μM en es as condiciones. Es os hallazgos p opo cionan la e idencia de que los
ecep o es 5-HT2A de se o onina deben de exp esa se como homodíme os pa a
ac i a ambas ías de señalización PLA2 y PLC.
Palab as cla e
Recep o de se o onina 2A, os olipasa A2, os olipasa C, homodíme o, c oss alk,
unidad uncional mínima
Resul ados
90
92
Resul ados
Publicación 2: Se o onin-2A homodime s a e needed o signalling ia bo h
phospholipase A2 and phospholipase C in ans ec ed CHO cells
h p://www.sciencedi ec .com/science/a icle/pii/S001429991730095X? ia%3D
ihub
Resumen
El ecep o de se o onina 2A (5-HT2A) es un ecep o acoplado a p o eínas G
(GPCRs) con un puen e disul u o conse ado o mado po la Cys148 (en la hélice
ansmemb ana 3, TM3) y la Cys227 (en el loop ex acelula 2, ECL-2). Noso os
desa ollamos la hipó esis de que los puen es disul u o pueden de e mina las
unciones del ecep o 5-HT2A de se o onina como la ac i ación, selec i idad
uncional y el econocimien o del ligando. Noso os u ilizamos el agen e educ o
di hio h ei ol (DTT) pa a de e mina como la educción de los puen es disul u o
a ec an a la unión del adioligando, mo ilización de segundos mensaje os y
dime ización del ecep o . El DTT induce una disminución en el núme o de si ios
de unión (1190±63.55 mol/mg de p o eína pa a las células con ol en
compa ación con 921.2±60.84 mol/mg de p o eína pa a las células a adas con
DTT) así como en la e icacia de ambas ías de señalización ca ac e izadas, aunque
la a inidad y la po encia pe manecie on sin cambios. Ensayos de ans e encia de
Resul ados
99
101
Discusión
p o undiza en el es udio de la selec i idad uncional. Es os ensayos pe mi en
cuan i ica end-poin s como la libe ación de calcio, la acumulación de especies de
inosi ol os a o o la p oducción de AMPc, en e o os (Lunds om, 2016, 2013;
Zhang y Xie, 2012). El empleo de ensayos uncionales en los que se ca ac e iza una
única ía de señalización acoplada a un ecep o , apo a in o mación incomple a
en el caso de ligandos que p esen en selec i idad uncional, po ello los ensayos
múl iples, en los que se de e mina simul áneamen e el e ec o en di e en es ías
e ec o as en la misma población celula esuel en es e p oblema pe mi iendo e
el sesgo que se p oduce en las di e en es señales.
P e iamen e en nues o labo a o io se desa olló un ensayo múl iple en placas de
12 pocillos con el obje i o de medi simul áneamen e la ac i ación de la PLA2 y de
la PLC a a és del ecep o 5-HT2A de se o onina, cuan i icando los segundos
mensaje os AA e IPs siguiendo el p o ocolo desc i o po Be g y cols. (B ea y cols.,
2009; Be g y cols., 1999, 1998a). Sin emba go, es e ensayo enía la limi ación de
que no e a adecuado pa a un c ibado con un núme o ele ado de compues os como
equie en las amplias lib e ías químicas empleadas en la búsqueda de hi s pa a
p og amas de descub imien o de á macos; po lo an o, el p ime obje i o de la
p esen e esis doc o al ue pone a pun o un ensayo múl iple en un o ma o
minia u izado pa a placas de 96 pocillos.
Desa ollo de la nue a me odología mul iplex y alidación de la misma po
c ibado de una lib e ía química (publicación 1)
En p ime luga se es ableció una concen ación de 20.000 células po pocillo
debido a la mejo elación señal especí ica/señal de ondo. Como consecuencia de
la minia u ización, al pasa de placas de 12 a 96 pocillos, se p odujo una educción
en la señal ob enida de [3H]AA libe ado. De es e modo, se decidió inc emen a el
po cen aje de albúmina sé ica bo ina (BSA) al 2% ya que o ma complejos con los
ácidos g asos, en nues o caso con el AA, pe mi iendo inc emen a la señal al
acili a su salida desde la memb ana hacia el ex e io celula . Sin emba go, a
pesa de ob ene mejo es esul ados en cuan o a señal, a la ho a de simul anea la
cuan i icación de [3H]AA libe ado y acumulación de [3H]IPs se obse a on
in e e encias en e las dos señales ma cadas con el mismo isó opo adiac i o. Po
ello, la op imización del mé odo con inuó con un cambio en el adioisó opo y el
116
Discusión
[3H]AA ue eemplazado po [14C]AA, ob eniendo esul ados análogos a los
ob enidos con [3H]AA.
Una ez op imizada la cuan i icación de AA, se p ocedió a la op imización de la
cuan i icación de IPs. T adicionalmen e, el aislamien o de las especies de inosi ol
os a o se ealizó a a és de c oma og a ía de in e cambio iónico an o en el
o ma o de 12 como el de 24 pocillos siguiendo el p o ocolo desc i o po Be idge
y colabo ado es (Be idge y cols., 1982). Po ello, en un p ime momen o, el
aislamien o de [3H]IPs en placas de 96 pocillos ue simila , u ilizando una esina de
in e cambio aniónico AG 1-X8. La u ilización de es a esina pe mi ió lle a a cabo
la medida simul anea de [3H]IPs y [14C]AA en placas de 96 pocillos.
Los esul ados ob enidos e idencia on que la 5-HT es imula de mane a
concen ación-dependien e con un pe il mono ásico ambas ías de señalización y
con una po encia simila a la ob enida en el o ma o no minia u izado (B ea y cols.,
2009).
En cuan o a la clozapina, an ipsicó ico a ípico conside ado como el “es ánda de
o o”, p esen ó selec i idad uncional con di e en es pe iles de inhibición de la
es imulación p oducida po 5-HT en las dos ías de señalización ca ac e izadas y
con esul ados de po encia simila es a las p e iamen e desc i as (B ea y cols.,
2009). En la ía mediada po la PLC (cuan i icación de la o mación de IPs) se
obse ó un pe il de inhibición mono ásico, mien as que en la mediada po la
PLA2 (cuan i icación de la libe ación de AA) el pe il ue bi ásico. Es e pe il bi ásico
ue p e iamen e obse ado en ensayos uncionales y de unión (B ea y cols., 2009;
López-Giménez y cols., 2001) y es ca ac e ís ico de GPCRs en o ma dimé ica que
p esen an coope a i idad nega i a en e los si ios de unión de ambos p o óme os.
La unión de un ligando al cen o de unión o os é ico de uno de los p o óme os del
díme o puede eje ce e ec os alos é icos en el cen o o os é ico del o o
p o óme o esul ando en coope a i idad posi i a o nega i a (Figu a 30) (Mau ice
y cols., 2011; Bi dsall, 2010, Albizu y cols., 2006). En el caso de coope a i idad
nega i a, la unión de un ligando al cen o o os é ico de un p o óme o di icul a la
unión de un segundo ligando al o o p o óme o mos ando cu as bi ásicas y ha
sido obse ada en o os GPCRs (Mau ice y cols., 2011; Smi h y Milligan, 2010;
Albizu y cols., 2006).
117
Discusión
Figu a 30. Esquema ep esen a i o de coope a i idad nega i a o posi i a en un ecep o
dimé ico. La unión del ligando A al cen o o os é ico del p o óme o R1 del díme o
modi ica de mane a nega i a o posi i a las p opiedades de unión del ligando B al
p o óme o R2 del díme o (Mau ice y cols., 2011).
La selec i idad uncional que p esen a la clozapina en el ecep o 5-HT2A de
se o onina, capaz de selecciona di e sos es ados con o macionales y po
consiguien e ac i a las di e en es ías de señalización acopladas al ecep o
homodimé ico de un modo di e encial, se explica a a és de la eo ía de es ados
con o macionales. El modelo ma emá ico de es es ados pa a un ecep o
dimé ico se basa en la exis encia de un equilib io en e el ecep o en su o ma
dimé ica inac i a (R2) y dos es ados ac i os di e en es del ecep o [(R2)* y (R2)**].
El pe il di e encial obse ado pa a la clozapina en los ensayos uncionales, es el
esul ado de di e en es con o maciones ac i as del ecep o homodimé ico pa a
cada ía de señalización, po ejemplo (R2)* pa a la acumulación de IPs y (R2)**
pa a la libe ación de AA (B ea y cols., 2009).
Di e sos au o es han p opues o que la ac i ación de la PLA2 puede ocu i como
consecuencia de la ac i ación de la PLC en algunos sis emas. En nues o caso, pa a
la línea celula u ilizada CHO-FA4 que exp esa de o ma es able el ecep o 5-HT2A
de se o onina se ha desca ado p e iamen e es a p opues a u ilizando di e en es
inhibido es, comp obando que ambas ías son independien es. Así, as el empleo
de inhibido es de PLA2 como mepac ine o el ácido a is olóquico, la acumulación de
IPs no se io a ec ada. Del mismo modo, el empleo de inhibido es de PLC como el
compues o 1-[6-[[(17β)-3-Me hoxyes a-1,3,5(10)- ien-17-yl]amino]hexyl]-1H-
py ole-2,5-dione (U73122), el 1-O-Oc adecyl-2-O-me hyl-sn-glyce o-3-
phosphocholine (ET-18-OCH3) o el compues o 48/80 no a ec a on a la libe ación
de AA. Po lo an o, desca a on la exis encia de un c oss alk en e ambas ías de
señalización (Figu a 31) (B ea y cols., 2009; Be g y cols., 1998). Los mismos
118
Discusión
esul ados ue on ob enidos en la línea celula de ib oblas os NIH3T3, donde los
au o es han ido un poco más allá desca ando que la libe ación de AA pudie a se
el esul ado de la o u a de cadenas de AA localizado en el DAG as la acción de la
DAG lipasa o po la ac i ación de la PLA2 a a és de la PKC. Pa a ello u iliza on 1,6-
Bis(cyclohexyloximinoca bonyl)hexane (RHC-80267) como inhibido de la DAG
lipasa y es au ospo ina como inhibido de la PKC (Ku asch-O baugh y cols.,
2003).
Además, la línea celula CHO-FA4 exp esa de o ma endógena el ecep o 5-HT1B
de se o onina acoplado a la p o eína Gi/o. La posible con ibución de dicho ecep o
a ambas ías de señalización ue desca ada as el a amien o con el an agonis a
selec i o 3-[3-(Dime hylamino) p opyl]-4-hyd oxy-N-[4-(4-py idinyl)
phenyl]benzamide dihyd ochlo ide (GR55562) (Figu a 31) (B ea y cols., 2009; Be g
y cols., 1994).
119
Discusión
A
C
D
B
Figu a 31. Las ías de señalización PLA2 y PLC son independien es en el ecep o 5-HT2A
de se o onina exp esado de o ma es able en CHO-FA4 así como del ecep o 5-HT1B de
se o onina. A) E ec o de la 5-HT (1μM) en p esencia del inhibido de la PLC (compues o
48/80, 100μM), del inhibido de PLA2 (ácido a is olóquico, 10μM) o del an agonis a
selec i o del ecep o 5-HT1B de se o onina (GR55562, 10μM). B) Pe il de inhibición de la
clozapina sob e el e ec o p oducido po 5-HT en ambas ías de señalización en p esencia
del inhibido de PLC. C) Pe il de inhibición de la clozapina sob e el e ec o p oducido po
5-HT en ambas ías de señalización en p esencia del inhibido de la PLA2. D) Pe il de
inhibición de la clozapina sob e el e ec o p oducido po 5-HT en ambas ías de
señalización en p esencia del an agonis a selec i o del ecep o 5-HT1B de se o onina
GR55562 (B ea y cols., 2009).
Pese a que la u ilización de la esina AG 1-X8 pe mi ió la medida simul ánea en
placas de 96 pocillos, su empleo no pe mi ía la au oma ización del mé odo, ya que
implicaba un p oceso de la ados y il ado, po ello ue sus i uida po unas
mic oes e as imp egnadas con ce io y ca ga ne a posi i a (Y ium Silica e
120
Discusión
Scin illa ion P oximi y Assay Beads) come cializadas pa a la cuan i icación de ácido
ibonucleico (RNA) (RNA binding YSi SPA beads). Es as mic oes e as con ca ga
posi i a se uni án a las ca gas nega i as de los g upos os a o ac uando como una
ma iz de in e cambio iónico pudiendo se cuan i icados con un con ado de
adiac i idad de cen elleo líquido (B andish y cols., 2003). Ambas ap oximaciones,
esina y mic oes e as, mos a on los mismos pe iles en é minos de e icacia y
po encia pa a la 5-HT y la clozapina.
Pa a co obo a la u ilidad de la nue a me odología se lle ó a cabo una campaña
de High Th oughpu Sc eening (HTS) con la lib e ía química P es wick® como
p ueba de concep o del mé odo desc i o p e iamen e. Es a lib e ía es á compues a
po 1120 á macos y/o compues os que llega on a ases clínicas. El pun o de co e
pa a la de ección de hi s se es ableció en el alo de la media del po cen aje de
inhibición + 3 eces la des iación es ánda de odos los compues os e aluados
(Zhang y cols., 1999) ob eniéndose 38 hi s con una ac i idad supe io al 90%.
Muchos de los an agonis as iden i icados son an ipsicó icos o an idep esi os con
ac i idad conocida sob e el ecep o 5-HT2A de se o onina, alidando la
sensibilidad de la me odología. Se con i ma on 22 de ellos median e la
cons ucción de cu as dosis- espues a en ambas ías e ec o as y 11 mos a on
selec i idad uncional. Los an ipsicó icos io idazina, loxapina y me o imep azina,
los an idep esi os no ip ilina, ciclobenzap ina y imip amina así como el
an ihis amínico imep azina mos a on una mayo po encia de inhibición en la
ía de señalización de la PLA2 que en la mediada po la PLC. La clozapina mos ó
nue amen e los pe iles bi ásico (PLA2) y mono ásico (PLC) comen ados
an e io men e.
Po el con a io, el pizo i eno, el an ihis amínico pime ixeno, y el agen e
an ip olac ina, me e golina, p esen a on una mayo po encia de inhibición en la
ía de la PLC que en la de la PLA2. Po an o, la nue a me odología desa ollada en
es a esis pe mi e iden i ica compues os con selec i idad uncional en el ecep o
5-HT2A de se o onina po las ías e ec o as de la PLA2 y PLC.
121
Discusión
Es udio de la unidad uncional del ecep o 5-HT2A de se o onina
homodimé ico (publicación 2)
Una ez desa ollada la me odología y habiendo co obo ado el es ado dimé ico
del ecep o 5-HT2A de se o onina a a és de las cu as bi ásicas con
coope a i idad nega i a, se u ilizó es e mé odo pa a pode disce ni si el
homodíme o 5-HT2A es la unidad uncional mínima de señalización o po el
con a io la unión de un agonis a a uno de los p o óme os del díme o es su icien e
pa a p oduci su ac i ación.
La ap oximación a macológica empleada ue la de inac i ación- eac i ación ( e
in oducción) desc i a pa a los ecep o es 5-HT7 y 5-HT2A de se o onina en la ía
de la PLC (Tei le y He ick-Da is, 2014; Tei le y Klein, 2012; Smi h y cols., 2011;
Tei le y cols., 2010). Dicha ap oximación es ela i amen e sencilla, ya que no
equie e ecep o es mu ados y puede se lle ada a cabo en células ecombinan es
o en cul i os celula es p ima ios que exp esen un GPCR uncional. Se basa en la
inac i ación del homodíme o median e el empleo de ligandos an agonis as que se
unen de un modo pseudo-i e e sible a uno de los p o óme os, es deci , una
in e acción no co alen e de disociación len a, ene gé icamen e es able y esis en e
a la ados.
La unión de un an agonis a compe i i o al p o óme o lib e del homodíme o
pe mi e disocia al ligando pseudo-i e e sible del ecep o a a és de un
mecanismo alos é ico de c oss alk en e p o óme os, en el cual, el cambio
con o macional p oducido as la unión del an agonis a compe i i o a un
p o óme o es ansmi ido al p o óme o unido al an agonis a pseudo-i e e sible,
haciendo que esa unión se uel a e e sible y po lo an o sensible a la ados
log ando así la eac i ación del ecep o . Así, la exposición a una concen ación no
sa u an e del inac i ado i anse ina (an agonis a selec i o 5-HT2A) o ma á
di e en es poblaciones eó icas de homodíme os: un 25% de los homodíme os
end án ambos p o óme os ocupados po el an agonis a inac i ado y po lo an o
se án inac i os y no ecupe ables; un 50% end án un p o óme o ocupado y el
o o p o óme o lib e siendo inac i os pe o ecupe ables y el o o 25% end án
ambos p o óme os lib es (Figu a 32A). Los homodíme os con un solo p o óme o
ocupado son inac i os pe o pueden se ecupe ados as la incubación con un
122
Discusión
an agonis a compe i i o “ eac i ado ”, en nues o caso se ha u ilizado la
espipe ona, que se une al p o óme o lib e y a a és de un mecanismo de c oss alk
en e p o óme os p o oca la disociación del inac i ado . El agen e eac i ado es
eliminado pos e io men e po un p ocedimien o de la ados pe mi iendo al 75%
de los homodíme os es an es se ac i ados (Figu a 32B y 32C) (Tei le y Klein,
2012).
Figu a 32. Esquema ep esen a i o de las di e en es poblaciones del homodíme o 5-HT2A
de se o onina en expe imen os de inac i ación- eac i ación. A) Poblaciones del
homodíme o después de la exposición al inac i ado i anse ina. B) La unión del
an agonis a compe i i o espipe ona al p o óme o lib e p oduce un e ec o alos é ico sob e
el p o óme o ocupado po i anse ina p o ocando su disociación. C) Poblaciones del
homodime o 5-HT2A de se o onina as la eliminación del eac i ado (Tei le y Klein,
2012).
A
C
B
123
Discusión
Si odos los ecep o es ue an monóme os no pod ían uni un segundo ligando al
cen o o os é ico, ya que la i anse ina iene una disociación len a y no pod ían
se ac i ados. La azón pa a u iliza una concen ación no sa u an e de i anse ina
ce cana a su IC50 es debido a que ambos p o óme os ienen la misma p obabilidad
de unión p oduciendo de es e modo una inac i ación pa cial. Si la concen ación de
i anse ina ue a más al a se p oduci ía la ocupación de odos los p o óme os y
po lo an o una inac i ación comple a y no ecupe able.
La ap oximación a macológica de inac i ación- eac i ación u ilizada po Tei le y
Klein iene cinco p emisas sob e la unción del homodíme o 5-HT2A: (1) aunque los
monóme os, homodíme os y ecep o es oligomé icos de al o o den coexis en en
las células, solo los homodíme os son uncionales; (2) ambos p o óme os de un
homodíme o acío ienen la misma p obabilidad de in e acción con i anse ina;
(3) la unión de i anse ina a un p o óme o no cambia la p obabilidad de que el
segundo p o óme o in e accione con i anse ina; (4) un homodíme o con un
p o óme o ocupado po i anse ina es inac i o y (5) la unión de un an agonis a
compe i i o al homodíme o con un p o óme o ocupado po el inac i ado causa la
disociación de es e y la eliminación del an agonis a compe i i o uel e al
homodíme o a un es ado ac i able ( eac i a ion) (Tei le y Klein., 2012).
En p ime luga se e aluó la po encia inhibi o ia de la i anse ina en ambas ías
e ec o as (libe ación de AA y acumulación de IPs) ob eniendo una po encia (IC50)
de 0.05 μM, po ello se seleccionó como concen ación no sa u an e de i anse ina
pa a p oduci la inac i ación de los ecep o es 5-HT2A de se o onina la
concen ación de 0.1μM. T as la inac i ación con i anse ina 0.1μM, los pe iles
ob enidos pa a 5-HT y clozapina ue on los mismos que en las cu as con ol y los
p e iamen e desc i os sin de ec a se cambios en las espec i as po encias, sin
emba go, se obse a on disminuciones es adís icamen e signi ica i as en los
alo es de e icacia. Así, la 5-HT p esen ó una disminución del po cen aje de la
espues a máxima (%Emax) del 59±13% y del 71±4% en las ías de la PLA2 y PLC
espec i amen e. Del mismo modo, las cu as dosis espues a pa a la clozapina
p esen a on disminuciones del po cen aje de la e icacia, ob eniendose una Emax del
45±3% y del 23±1% (PLA2 y PLC espec i amen e), sugi iendo que solo los
ecep o es con ambos p o óme os lib es pueden señaliza .
124
Discusión
Pa a e i ica que es a señal ob enida pe enece al homodíme o 5-HT2A de
se o onina y que la uncionalidad de los homodíme os inac i ados puede se
ecupe ada, es os ue on some idos al p oceso de eac i ación con espipe ona.
T as la comple a eliminacion de la espipe ona con 4 la ados y pos e io incubación
con 5-HT y/o clozapina, los pe iles a macológicos ob enidos no p esen a on
cambios espec o al con ol y ampoco se obse a on di e encias en las po encias;
sin emba go, se ees ablecen pa cialmen e los alo es de e icacia. La Emax ob enida
pa a la 5-HT ue del 74±7% y del 72±4% (PLA2 y PLC espec i amen e) y pa a la
clozapina del 77±10% y del 71±4% (PLA2 y PLC espec i amen e). La al a de una
ecupe ación o al de la espues a máxima se a ibuye a la población de
homodíme os con los dos p o óme os ocupados po i anse ina y que po lo an o
no pueden uni espipe ona y se eac i ados.
Es o indica que en el homodíme o 5-HT2A de se o onina es necesa io ac i a ambos
p o óme os pa a señaliza a a és de la PLA2 y de la PLC. Dichos esul ados
concue dan con los obse ados p e iamen e en nues o labo a o io donde la
coexp esión del ecep o 5-HT2A de se o onina na i o con una a ian e mu ada
de icien e en unión a ligandos, 5-HT2A-S159R, educe su señalización a a és de la
PLC as la es imulación po 5-HT en un 72%, exis iendo una señalización esidual
posiblemen e debida a la o mación de díme os na i os ( esis doc o al Pa icio
A anes Juiz, h p://hdl.handle.ne /10347/9234). Los mismos esul ados ue on
obse ados en el ecep o 5-HT2C de se o onina donde la coexp esión del ecep o
na i o con o o mu ado de icien e en unión a ligandos, 5-HT2C-S138R, elimina la
ac i idad basal y disminuye d ás icamen e la p oducción de IPs as la
es imulación po 5-HT sin obse a se cambios en la po encia (He ick-Da is y
cols., 2005). Ambos au o es concluyen que la es equiome ía
ligando/díme o/p o eína G an o en el ecep o 5-HT2A como en el 5-HT2C de
se o onina se ía 2:1:1 ( esis doc o al Pa icio A anes Juiz,
h p://hdl.handle.ne /10347/9234; He ick-Da is y cols., 2005).
Tei le y Klein p opusie on el é mino alo oligomé ico pa a e e i se al núme o
de p o óme os que in e ac uan en ecep o es oligomé icos. Dicho alo iene
limi ado po el g ado de desplazamien o de las cu as concen ación espues a del
an agonis a inac i ado an es y después de la eac i ación y es indica i o del
núme o de p o óme os que in e ac úan. Es e alo puede se 1 pa a ecep o es
125
Discusión
pos e io men e como he amien a pa a con i ma que la unidad uncional mínima
de es os ecep o es es la homodimé ica, la cual p esen a coope a i idad nega i a, y
cuya unción es á condicionada po la p esencia del puen e disul u o conse ado
en e la Cys148 en el dominio TM3 y la Cys227 en el ECL-2.
132
Conclusiones
CONCLUSIONES
1. Se ha desa ollado un ensayo uncional mul iplex en placas de 96 pocillos
pa a la medición simul ánea de la ac i ación de las ías de señalización
PLA2 y PLC a a és del ecep o 5-HT2A de se o onina, que nos pe mi ió
e alua enómenos de selec i idad uncional y coope a i idad.
2. El an ipsicó ico ípico clozapina p esen ó selec i idad uncional pa a las
ías e ec o as es udiadas sob e el ecep o 5-HT2A de se o onina,
obse ándose un pe il mono ásico en la ía mediada po la PLC y un pe il
bi ásico en la ía de la PLA2, siendo ca ac e ís ico es e úl imo de ecep o es
en o ma dimé ica que p esen an coope a i idad nega i a.
3. Se ha alidado la me odología mul iplex a a és de una campaña de High
Th oughpu Sc eening (HTS) con la lib e ía química P es wick® sob e el
ecep o 5-HT2A de se o onina, donde diez compues os p esen a on
di e encias es adís icamen e signi ica i as en e las dos ías e ec o as
e aluadas, de los cuales sie e p esen a on una mayo po encia en la ía de
la PLA2 y es en la de la PLC.
4. La inac i ación pa cial del ecep o 5-HT2A de se o onina con i anse ina
0.1μM edujo el e ec o máximo de la 5-HT en o no a un 57% en la ía de la
PLA2 y en o no a un 74% en la ía de la PLC. Es a educción sugie e que
únicamen e los homodíme os que no unie on i anse ina ue on capaces de
se ac i ados po 5-HT en ambas ías e ec o as. La pos e io unión de
espipe ona al p o óme o lib e de los díme os que unicamen e unie on una
molécula de i anse ina, pe mi ió libe a a la i anse ina a a és de un
mecanismo de c oss alk, ob eniendose un e ec o máximo de la 5-HT en
o no al 75% (PLA2) y en o no al 71% (PLC). La pé dida de señal se
a ibuye a la población de homodíme os con ambos p o ome os ocupados
po i anse ina y po an o no ecupe ables.
5. El ecep o 5-HT2A de se o onina homodimé ico es la unidad uncional
mínima de ac i ación de las ías de señalización PLA2 y PLC, exis iendo
además comunicación alos é ica en e los dos p o óme os del díme o.
6. La o u a de puen es disul u o as el a amien o con DTT 20mM indujo un
descenso en la unión del LSD y modi icó la señalización de los ecep o es
135
Conclusiones
5-HT2A de se o onina en las ías de señalización de la PLA2 y PLC. Median e
es udios de BRET se demos ó que el a amien o con DTT no modi icó la
na u aleza homodimé ica del ecep o .
7. Los es udios de modelización molecula y el hecho de que el DTT
únicamen e ompe puen es disul u o accesibles al sol en e, sugie en que la
modi icación de la unión y de la unción en el ecep o 5-HT2A de se o onina
se debe a la o u a del puen e disul u o en e la Cys148 (en el dominio TM3)
y la Cys227 (en el ECL-2).
8. La p esen e esis doc o al demues a la necesidad de un es ado
homodimé ico del ecep o 5-HT2A de se o onina pa a su señalización, al
igual que la in eg idad del puen e disul u o conse ado en e el dominio
TM3 y el ECL-2. Es os esul ados pe mi i án el diseño de á macos, como
ligandos bi alen es de los bolsillos de unión o os é icos o modulado es
alos é icos en el ECL-2 más selec i os y/o po en es sob e el ecep o 5-HT2A
de se o onina homodimé ico.
136
Bibliog a ía
BIBLIOGRAFÍA
Ahn KH, Be alo i z AC, Mie ke DF, Kendall DA (2009). Dual Role o he second
ex acellula loop o he cannabinoid ecep o 1: ligand binding and ecep o localiza ion.
Mol. Pha macol. 76: 833-842.
Albizu L, Bales e MN, B e on C, Pin JP, Manning M, Mouillac B y cols. (2006). P obing he
exis ence o G p o ein-coupled ecep o dime s by posi i e and nega i e ligand-dependen
coope a i e binding. Mol. Pha macol. 70: 1783-1791.
Albizu L, Holloway T, González-Maeso J, Seal on SC (2011). Func ional c oss alk and
he e odime iza ion o se o onin 5-HT2A and dopamine D2 ecep o s. Neu opha macology.
61: 770-777.
Al i JM, Liebe man JA, Sa e man AZ, Schwimme JL, Schaa JA (1993). Clozapine-induced
ag anulocy osis. Incidence and isk ac o s in he Uni ed S a es. N. Engl. J. Med. 329: 162-
167.
Ange s S, Salahpou A, Bou ie M (2002). Dime iza ion: an eme ging concep o G
p o ein-coupled ecep o on ogeny and unc ion. Annu. Re . Pha macol. Toxicol. 42: 409-
435.
Ange s S, Salahpou A, Joly E, Hilai e S, Chelsky D, Dennis M y cols. (2000). De ec ion o
be a 2-ad ene gic ecep o dime iza ion in li ing cells using bioluminescence esonance
ene gy ans e (BRET). P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 97: 3684-3689.
A lani VA, G ego y KJ, Mo on CJ, Pa ke MW, Sex on PM, Ch is opoulos A (2007). C i ical
ole o he second ex acellula loop in he binding o bo h o hos e ic and allos e ic G
p o ein-coupled ecep o ligands. J. Biol. Chem. 282: 25677-25686.
Azna S, He ig Mel-S (2016). The 5-HT2A se o onin ecep o in execu i e unc ion:
implica ions o neu opsychia ic and neu odegene a i e diseases. Neu osci. Biobeha .
Re . 64: 63-82.
Balu DT, Coyle JT (2011). Neu oplas ici y signaling pa hways linked o he
pa hophysiology o schizoph enia. Neu osci. Bio eha . Re . 35: 848-870.
Ba ing on L, Rummel PC, Lückmann M, Pihl H, La sen O, Daug ilai e V y cols. (2016). Role
o conse ed disul ide b idges and a oma ic esidues in ex acellula loop 2 o chemokine
139
Bibliog a ía
ecep o CCR8 o chemokine and small molecule binding. J. Biol. Chem. 291: 16208-
16220.
Ba nes NM, Sha p T (1999). A e iew o cen al 5-HT ecep o s and hei unc ion.
Neu opha macology. 38: 1083-1152.
Ba olomeis A, Buonagu o EF, Iase oli F (2013). Se o onin-glu ama e and se o onin-
dopamine ecip ocal in e ac ions as pu a i e molecula a ge s o no el an ipsycho ic
ea men s: om ecep o he e odime s o pos synap ic sca olding and e ec o p o eins.
225: 1-19.
Be g KA, Cla ke WP, Sails ad C, Sal zman A, Maayani S (1994). Signal ansduc ion
di e ences be ween 5-hyd oxy yp amine ype 2A and ype 2C ecep o sys ems. Mol.
Pha macol. 46: 477-484.
Be g KA, Maayani S, Cla ke WP (1998c). In e ac ions be ween e ec o s linked o se o onin
ecep o s. Ann. N. Y. Acad. Sci. 861:111-120.
Be g KA, Maayani S, Gold a b J y cols. (1998a). E ec o pa hway-dependen ela i e
e icacy a se o onin ype 2A and 2C ecep o s: e idence o agonis -di ec ed a icking o
ecep o s imulus. Mol. Pha macol. 54: 94-104.
Be g KA, Maayani S, Gold a b J, Cla ke WP (1998b). Pleio opic beha io o 5-HT2A and 5-
HT2C ecep o agonis s. Ann. N. Y. Acad. Sci. 861:104-110.
Be g KA, S ou BD, C oppe JD e al (1999). No el ac ions o in e se agonis on 5-HT2C
ecep o sys ems. Mol. Pha macol. 55: 863-872.
Be idge MJ (1984). Inosi ol isphospha e and diacylglyce ol as second messenge s.
Biochem. 220: 345-360.
Be idge MJ (2009). Inosi ol isphospha e and calcium signalling mechanism. Biochim.
Biophys. Ac a. 1793: 933-940.
Be idge MJ, Downes CP, Hanley MR (1982). Li hium ampli ies agonis -dependen
phospha idylinosi ol esponses in b ain and sali a y glands. Biochem. J. 206: 587-595.
Be houze M, Ayoub M, Russo O, Ri ail L, Sicsic S, Fischmeis e R (2005). Cons i u i e
dime iza ion o human se o onin 5-HT4 ecep o s in li ing cells. FEBS. Le . 579: 2973-
2980.
140
Bibliog a ía
Bi dsall NJ (2010). Class A GPCR he e odime s: e idence om binding s udies. T ends.
Pha macol. Sci. 31: 499-508.
Blasco-Fon ecilla H, Baca-Ga cia E, de Leon J (2010). Do a ypical an ipsycho ic d ugs
educe he isk o ischemic hea disease and mo ali y? Possible ole o 5-HT2A ecep o
blockade. Schizoph . Res. 119: 160-163.
Bo o o-Escuela DO, Rome o-Fe nandez W, Ta akano AO, Ma cellino D, Ci uela F, Agna i
L y cols. (2010). Dopamine D2 and 5-hyd oxy yp amine 5-HT2A ecep o s assemble in o
unc ionally in e ac ing he e ome s. Biochem. Biophys. Res. Commun. 401: 605-610.
Bou ie M (2001). Oligome iza ion o G-p o ein-coupled ansmi e ecep o s. Na . Re .
Neu osci. 2: 274-286.
B andish PE, Hill LA, Zheng W y cols. (2003). Scin illa ion p oximi y assay o inosi ol
phospha es in cell ex ac s: high- h oughpu measu emen o G-p o ein-coupled ecep o
ac i a ion. Anal. Biochem. 313: 311-318.
B ea J, Cas o M, Gi aldo J y cols. (2009). E idence o dis inc an agonis - e ealed
unc ional s a es o 5-hyd oxy yp amine (2A) ecep o homodime s. Mol. Pha macol. 75:
1380-1391.
B uno A, Guadix AE, Cos an ino G (2009). Molecula dynamics simula ion o he
he e odime ic mGluR2/5HT(2A) complex. An a omis ic esolu ion s udy o a po en ial
new a ge in psychia ic condi ion.
Bu makina S, Geng Y, Chen Y, Fan QR (2014). He e odime ic coiled-coil in e ac ions o
human GABAB ecep o . P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 111: 6958-6963.
Bu ne PW, Eas wood SL, Lacey K, Ha ison PK (1995). The dis ibu ion o 5HT1A and
5HT2A ecep o mRNA in human b ain. B ain. Res. 676: 157-168.
Bu DR, Enna SJ, C eese I, Snyde SH (1975). Dopamine ecep o binding in he co pus
s ia um o mammalian b ain. P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 72: 4655-4659.
Cappe EA, Ma shall LA (2001). Mammalian phospholipases A(2): media o s o
in lamma ion, p oli e a ion and apop osis. P oq. Lipid. Res. 40: 167-197.
Ca man-K zan M (1984). The e ec o g oup selec i e eagen s N-e hylmaleimide and
di hio h ei ol on his amine H1- ecep o binding si es in he ascula smoo h muscle
memb anes. Agen s Ac ions. 14: 561-565.
141
Bibliog a ía
Liu G, F ølund B, Ozoe F, Ozoe Y (2015). Di e en ial in e ac ions o 5-(4-pipe idyl)-3-
isoxazolol analogues wi h insec γ-aminobu y ic acid ecep o s leading
o unc ional selec i i y. Insec . Biochem. Mol. Biol. 66: 64-71.
López-Gimenez JF, Canals M, Pediani JD, Milligan G (2007). The α1b-ad eno ecep o exis s
as a highe -o de oligome : e ec i e oligome iza ion is equi ed o ecep o madu a ion,
su ace deli e y, and unc ion. Mol. Pha macol. 71: 1015-1029.
López-Giménez JF, Mengod G, Palacios JM, Vila ó MT (1997). Selec i e isualiza ion o a
b ain 5-HT2A ecep o s by au o adiog aphy wi h [3H]MDL 100,907. Naunyn-
Schmeidebe g’s. A ch. Pha macol. 356: 446-454.
López-Giménez JF, Villazón M, B ea J, Loza MI, Palacios JM, Mengod G y cols. (2001).
Mul iple con o ma ions o na i e and ecombinan human 5-hyd oxy yp amine (2a)
ecep o s a e labeled by agonis and disc imina ed by an agonis s. Mol. Pha macol. 60:
690-699.
Lucai es VL, Nelson DL, Wainsco BD, Baez M (1996). Recep o sub ype and densi y
de e mine he coupling epe oi e o he 5-HT2 ecep o sub amily. Li e. Sci. 59: 1081-
1095.
Lukasiewicz S, Poli A, Ked acka-K ok S, Wedzony K, Máckowiak M, Dziedzicka-
Wasylewska M (2010). He e o-dime iza ion o se o onin 5-HT2A and dopamine D2
ecep o s. Biochim. Biophys. Ac a. 1803: 1347-1358.
Lunds om K (2013). P esen and u u e app oaches o sc eening o G-p o ein-coupled
ecep o s. 5: 523-538.
Lunds om K (2016). New winds in GPCR-based d ug disco e y. Fu u e. Med. Chem. 8:
605-608.
Mackie S, Milla JK, Po eous DJ (2007). Role o DISC1 in neu al de elopmen and
schizoph enia. Cu . Opin. Neu obiol. 17: 95-102.
Maggio R, Vogel Z, Wess J (1993a). Coexp ession s udies wi h mu an
musca inic/ad ene gic ecep o s p o ide e idence o in e molecula “c oss- alk”
be ween G-p o ein-linked ecep o s. P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 90: 3103-3107.
Maje us PW (1992). Inosi ol phospha e biochemis y. Annu. Re . Biochem. 61: 225-250.
148
Bibliog a ía
Mancia F, Assu Z, He man AG, Siegel R, Hend ickson WA (2008). Ligand selec i i y in
dime ic associa ions o he se o onin 5HT2c ecep o . EMBO. Rep. 9: 363-369.
Ma inissen MJ, Gu kind JS (2001). G-p o ein-coupled ecep o s and signaling ne wo ks:
eme ging pa adigms. T ends. Pha macol. 22: 368-376.
Ma shall FH, Whi e J, Main M, G een A, Wise A (1999). GABA(B) ecep o s unc ion as
he e odime s. Biochem. Soc. T ans. 27: 530-535.
Masson J, Eme i MB, Hamon M, Da mon M (2012). Se o one gic signaling: Mul iple
e ec o s and pleio opic e ec s. Wiley. In e discip. Re . Memb . T ansp. Signal. 1: 685-
713.
Mau ice P, Kamal M, Jocke s R (2011). Asymme y o GPCR oligome s suppo s hei
unc ional ele ance. T ends. Pha macol. Sci. 32: 514-520.
McCo y JD, Ro h BL (2015). S uc u e and unc ion o se o onin G p o ein coupled
ecep o s. Pha macol. The . 150: 129-142.
Mel ze HY, Ma suba a S, Lee JC (1989). Classi ica ion o ypical and a ypical an ipsycho ic
d ugs on he basis o dopamine D-1, D-2 and se o onin2 pKi alues. J. Pha macol. Exp.
The . 251: 238-246.
Mes e TA, Zu owski M, Fox SH (2013). 5-Hyd oxy yp amine 2A ecep o an agonis s as
po en ial ea men o psychia ic diso de s. Expe . Opin. In es ig. D ugs. 22: 411-421.
Milligan G (2013). The p e alence, main enance and ele ance o GPCR oligome iza ion.
Mol. Pha macol. 84: 158-169.
Milligan G, Kos enis E (2006). He e o ime ic G-p o eins: a sho his o y. B . J. Pha macol.
147: S46-S55.
Miu a S, Ka nik SS, Saku K (2005). Cons i u i ely ac i e homo-oligome ic angio ensin II
ype 2 ecep o induces cell signaling independen o ecep o con o ma ion and ligand
s imula ion. J. Biol. Chem. 280: 18237-18244.
Monno C, Biho eau C, Conchon S, Cu now KM, Co ol P, Clause E (1996). Pola esidues
in he ansmemb ane domains o he ype 1 angio ensin II ecep o a e equi ed o
binding and coupling. Recons i u ion o he binding si e by co-exp ession o wo de icien
mu an s. J. Biol. Chem. 271: 1507-1513.
149
Bibliog a ía
Mo eno JL, Mi anda-Azpiazu P, Ga cía-Bea A, Younkin J, Cui M y cols. (2016). Allos e ic
signaling h ough an mGlu2 and 5-HT2A he e ome ic ecep o complex and i s po en ial
con ibu ion o schizoph enia. Sci. Signal. 9: a5. doi: 10.1126/scisignal.aab0467.
Mo eno JL, Mugu uza C, Umali A, Mo illo S, Holloway T, Pila -Cuélla F y cols. (2012).
Iden i ica ion o Th ee Residues Essen ial o 5-Hyd oxy yp amine 2A-Me abo opic
Glu ama e 2 (5-HT2A·mGlu2) Recep o He e odime iza ion and I s Psychoac i e
Beha io al Func ion. J Biol Chem. 287: 44301-44319.
Mo ilak DA, Ga low SJ, Cia anello RD (1993). Immunocy ochemical localiza ion and
desc ip ion o neu ons exp essing se o onin2 ecep o s in he a b ain. Neu oscience. 54:
701-717.
Mo ilak DA, Somogyi P, Lujan-Mi as R, Cia anello RD (1994). Neu ons exp essing 5-HT2
ecep o s in he a b ain: neu ochemical iden i ica ion o cell ypes by
immunocy ochemis y. Neu opsychopha macology. 11: 157-166.
Nguyen AT, Bal os JA, Thomas T, Nguyen TD, Muñoz LL, G ego y KJ y cols. (2016a).
Ex acellula loop 2 o he adenosine A1 ecep o has a key ole in o hos e ic ligand
a ini y and agonis e icacy. Mol. Pha macol. 90: 703-714.
Nguyen AT, Vecchio EA, Thomas T, Nguyen TD, Au elio L, Scammells PJ y cols. (2016b).
Role o he second ex acellula loop o he adenosine A1 ecep o on allos e ic modula o
binding, signaling, and coope a i i y. Mol. Pha macol. 90: 715-725.
Noda K, Saad Y, G aham RM, Ka nik SS (1994). The high a ini y s a e o he be a 2-
ad ene gic ecep o equi es unique in e ac ion be ween conse ed and non-conse ed
ex acellula loop cys eines. J. Biol. Chem. 269: 6743-6752.
Noda K, Saad Y, G aham RM, Ka nik SS (1994). The high a ini y s a e o he be a 2-
ad ene gic ecep o equi es unique in e ac ion be ween conse ed and non-conse ed
ex acellula loop cys eines. J. Biol. Chem. 269: 6743-6752.
Palczewski K, Kumasaka T, Ho i T, Behnke CA, Mo oshima H, Fox BA y cols. (2000). C ys al
s uc u e o hodopsin: A G p o ein-coupled ecep o . Science. 289: 739-745.
Pa k PS (2012). Ensemble o G p o ein-coupled ecep o ac i e s a es. Cu . Med. Chem.
19: 1146-1154.
Pa k PS, Filipek S, Wells JW, Palczewski K (2004). Oligome iza ion o G p o ein-coupled
ecep o s: pas , p esen , and u u e. Biochemis y. 43: 15643-15656.
150
Bibliog a ía
Pazos A, Co es R, Palacios JM (1985). Quan i a i e au o adiog aphic mapping o se o onin
ecep o s in he a b ain. II. Se o onin-2 ecep o s. B ain. Res. 346: 231-249.
Pazos A, P obs A, Palacios JM (1987). Se o onin ecep o s in he human b ain-IV.
Au o adiog a ic mapping o se o onin-2 ecep o s. Neu oscience. 21: 123-139.
Pede sen SE, Ross EM (1985). Func ional ac i a ion o be a-ad ene gic ecep o s by hiols
in he p esence o absence o agonis s. J. Biol. Chem. 260: 14150-14157.
Pee e s MC, an Wes en GJ, Li Q, Ijze man AP (2011). Impo ance o he ex acellula loops
in G p o ein-coupled ecep o s o ligand ecogni ion and ecep o ac i a ion. T ends.
Pha macol. Sci. 32: 35-42.
Pellissie LP, Ba he G, Ga en F, Cassie E, T inque E, Pin JP y cols. (2011). G p o ein
ac i a ion by se o onin ype 4 ecep o dime s: e idence ha u ning on wo p o ome s is
mo e e icien . J. Biol. Chem. 286: 9985-9997.
Pe ou ka SJ, Snyde SH (1979). Mul iple se o onin ecep o s: di e en ial binding o [3H]5-
hyd oxy yp amine, [3H]lyse gic acid die hylamide and [3H]spi ope idol. Mol. Pha macol.
16: 687-699.
Pin JP, Neubig R, Bou ie M, De i L, Filizola M, Ja i ch JA y cols. (2007).
In e na ional Union o Basic and Clinical Pha macology. LXVII. Recommenda ions o he
ecogni ion and nomencla u e o G p o ein-coupled ecep o he e omul ime s. Pha macol.
Re . 59: 5-13.
Ponimaskin EG, P o i o ic J, Vaiskunai e R, Rich e DW, Voyno-Yasene skaya TA (2002). 5-
Hyd oxy y amine 4(a) ecep o is coupled o he galpha subuni o he e o ime ic G13
p o ein. J. Biol. Chem. 277: 20812-20819.
Po eous DJ, Milla JK (2006). Dis up ed in schizoph enia 1: building b ains and memo ies.
T ends. Mol. Med. 12: 255-261.
Po oghese PS, Ronsis alle G, La son DL, Yim CB, Say e LM, Takemo i AE (1982). Opioid
agonis and an agonis bi alen ligands as ecep o p obes. Li e. Sci. 31: 1283-1286.
Ragna sson L, Ande sson Å, Thomas WG, Lewis RJ (2015). Ex acellula su ace esidues
o he α1B-ad enocep o c i ical o G p o ein-coupled ecep o unc ion. Mol. Pha macol.
87:121-129.
Rappo MM, G een AA, Page IH (1948a). C ys alline se o onin. Science. 108: 329-330.
151
Bibliog a ía
Rappo MM. G een AA, Page IH (1948b). Pa ial pu i ica ion o he asocons ic o in bee
se um. J. Biol. Chem. 174: 735-741.
Ray K, Hauschild BC (2000). Cys-140 is c i ical o me abo opic glu ama e ecep o -1
dime iza ion. J. Biol. Chem. 275: 34245-34251.
Ray K, Hauschild BC, S einbach PJ, Goldsmi h PK, Hauache O, Spiegel AM (1999).
Iden i ica ion o he cys eine esidues in he amino- e minal ex acellula domain o he
human Ca2+ ecep o c i ical o dime iza ion. J. Biol. Chem. 274: 27642-27650.
Ray WA, Chung CP, Mu ay KT, Hall K, S ein M (2009). A ypical an ipsycho ic d ugs and
he isk o sudden ca diac dea h. N. Engl. J. Med. 360: 225-235.
Reade TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewa KM (1992). Speci ic
[3H] aclop ide binding o neos ia al dopamine D2 ecep o s: ole o disul ide and
sul hyd yls g oups. Neu ochem. Res. 17: 749-759.
Reynolds IJ, Rush EA, Aizenman E (1990). Reduc ion o NMDA ecep o s wi h
di hio h ei ol inc eases [3H]-MK-801 binding and NMDA-induced Ca2+ luxes. B . J.
Pha macol. 101: 178-182.
Rios CD, Jo dan BA, Gomes I, De i LA (2001). G-p o ein-coupled ecep o dime iza ion:
modula ion o ecep o unc ion. Pha macol. The . 92: 71-87.
Romano C, Yang WL, O'Malley KL (1996). Me abo opic glu ama e ecep o 5 is a disul ide-
linked dime . J. Biol. Chem. 271: 28612-28616.
Ross CA, Ma golis RL, Reading SA, Ple niko M, Coyle JT (2006). Neu obiology o
schizoph enia. Neu on. 52: 139-153.
Ro h BL, She le DJ, K oeze WK (2004). Magic sho guns e sus magic bulle s: selec i ely
non-selec i e d ugs o mood diso de s and schizoph enia. Na . Re . D ug. Disco . 3: 353-
359.
Ro h BL, Willins DL, K is iansen K, K oeze WK (1998). 5-Hyd oxy yp amine2-Family
ecep o s (5-hyd oxy yp amine2A, 5-hyd oxy yp amine2B, 5-Hyd oxy yp amine2C):
whe e s uc u e mee s unc ion. Pha macol. The . 79: 231-257.
Saha S, Chan D, McG a h J (2007). A sys ema ic e iew o mo ali y in schizoph enia. Is
he di e en ial mo ali y gap wo sening o e ime?. A ch. Gen. Psychia y. 64: 1123-1131.
152
Bibliog a ía
Samama P, Co ecchia A, Cos a T, Le kowi z RJ (1993). A mu a ion-induced ac i a ed s a e
o he β2-ad ene gic ecep o . Ex ending he e na y complex model. J. Biol. Chem. 368:
4625-4636.
San os R, U su O, Gaul on A, Ben o AP, Donadi RS, Bologa CG y cols. (2017). A
comp ehensi e map o molecula a ge s. Na . Re . D ug. Disco . 16: 19-34.
Sawa A, Snyde SH (2003). Schizoph enia: di e se app oaches o complex disease. Science.
296: 692-695.
Sca selli M, Li B, Kim SK, Wess J (2007). Mul iple esidues in he second ex acellula loop
a e c i ical o M3 musca inic ace ylcholine ecep o ac i a ion. J. Biol. Chem. 282: 7385-
7396.
Seeman P, Chau-Wong M, Tedesco J, Wong K (1976). Dopamine ecep o s in human and
cal b ains, using [3H]apomo phine and an an ipsycho ic d ug. P oc. Na l. Acad. Sci. USA.
73: 4354-4358.
Shi L, Ja i ch JA (2004). The second ex acellula loop o he dopamine D2 ecep o lines
he binding-si e c e ice. P oc. Na l. Acad. Sci. U S A. 101:440-445.
Shonbe g J, Scammells PJ, Capuano B (2011). Design s a egies o bi alen ligands
a ge ing GPCRs. Chem. Med. Chem. 6: 963-974.
Smi h C, Rahman T, Toohey N, Mazu kiewicz J, He ick-Da is K, Tei le M (2006).
Rispe idone i e e sible binds o and inac i a es he h5-HT7 se o onin ecep o . Mol.
Pha macol. 70: 1264-1270.
Smi h C, Toohey N, Knigh JA, Klein MT, Tei le M (2011). Rispe idone-induced
inac i a ion and clozapine-induced eac i a ion o a co ical as ocy e 5-
Hyd oxy yp amine7 ecep o s: e idence o in si u G p o ein-coupled ecep o
homodime p o ome c oss- alk. Mol. Pha macol. 79: 318-325.
Smi h NJ, Milligan G (2010). Allos e y a G p o ein-coupled ecep o homo and
he e ome s: uncha ed pha macological landscapes. Pha macol. Re . 62: 701-725.
So o AG, Smi h TH, Chen B, Bha acha ya S, Co do a IC, Kenakin T y cols. (2015). N-linked
glycosyla ion o p o ease-ac i a ed ecep o -1 a ex acellula loop 2 egula es G-p o ein
signaling bias. P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 112: E3600-E3608.
153
Bibliog a ía
Spengle D, Waebe C, Pan aloni C, Holsboe F, Bockae J, Seebu g PH y cols. (1993).
Di e en ial signal ansduc ion by i e splice a ian s o he PACAP ecep o . Na u e. 365:
170-175.
S ahl SM. Essen ial psychopha macology. Neu oscien i ic basis and p ac ical applica ions.
2nd ed. Camb idge Uni e si y P ess 2000. ISBN: 84-344-0898-8.
S ahl SM. Essen ial psychopha macology. Neu oscien i ic basis and p ac ical applica ions.
3 d ed. Camb idge Uni e si y P ess 2008. ISBN: 978-0-521-85702-4.
S i ham J, Gleim SR, Dou ille K, A eha E, Hwa J (2006). Ve sa ili y and di e en ial oles o
cys eine esidues in human p os acyclin ecep o s uc u e and unc ion. J. Biol. Chem.
281: 37227-37236.
S o johann L, Hols B, Schwa z TW (2008). A second disul ide b idge om he N- e minal
domain o ex acellula loop 2 dampens ecep o ac i i y in GPR39. Biochemis y. 47:
9198-9207.
Szidonya L, Cse zó M, Hunyady L (2008). Dime iza ion and oligome iza ion o G-p o ein-
coupled ecep o s: deba ed s uc u es wi h es ablished and eme ging unc ions. J.
Endoc inol. 196: 435-453.
Talukde I, Kazi R, Wollmu h LP (2011). GluN1-speci ic edox e ec s on he kine ic
mechanism o NMDA ecep o ac i a ion. Biophys. J. 101: 2389-2398.
Tamminga CA. Schizoph enia and glu ama e gic ansmission (1998). C i . Re . Neu obiol.
12: 21-36.
Tandon R, Nas allah HA, Kesha an MS (2009). Schizoph enia, “jus he ac s” 4. Clinical
ea u es and concep ualiza ion. 110: 1-23.
Tandon R, Kesha an MS, Nas allah HA (2008). Schizoph enia, "jus he ac s" wha we
know in 2008. 2. Epidemiology and e iology. Schizoph . Res. 102:1-18.
Tei le M, He ick-Da is K (2014). De e mining he oligome numbe o na i e GPCR using
lo escence co ela ion spec oscopy and d ug-induced inac i a ion- eac i a ion. Cu .
Pha m. Bio echnol. 15: 927-937.
Tei le M, Klein MT (2012). A new app oach o s udying GPCR dime s: d ug-induced
inac i a ion and eac i a ion o e eal GPCR dime unc ion in i o, in p ima y cul u e,
and in i o. Pha macol. The . 133: 205-217.
154
Bibliog a ía
Tei le M, Toohey N, Knigh JA, Klein MT, Smi h C (2010). Clozapine and o he compe i i e
an agonis s eac i a e ispe idone-inac i a ed h5-HT7 ecep o s: adioligand binding and
unc ional e idence o GPCR homodime p o ome in e ac ions. Psychopha macology.
212: 687-697.
Toohey N, Klein MT, Knigh J, Smi h C, Tei le M (2009). Human 5-HT7 ecep o -induced
inac i a ion o o skolin-s imula ed adenyla e cyclase by ispe idone, 9-OH- ispe idone
and o he “inac i a ing an agonis s”. Mol. Pha macol. 75: 552-559.
Unal H, Jaganna han R, Bha MB, Ka nik SS (2010). Ligand-speci ic con o ma ion o
ex acellula loop-2 in he angio ensin II ype 1 ecep o . J Biol Chem. 285: 16341-16350.
U ban JD, Cla ke WP, on Zas ow M, Nichols DE, Kobilka B, Weins ein H y cols. (2007).
Func ional selec i i y and classical concep s o quan i a i e pha macology. J. Pha macol.
Exp. The . 320: 1-13.
Vaidehi N, Kenakin T (2010). The ole o con o ma ional ensembles o se en
ansmemb ane ecep o s in unc ional selec i i y. Cu . Opin. Pha macol. 10: 775-781.
Valan C, Lane JR, Sex on PM, Ch is opoulos A (2012). The bes o bo h wo lds? Bi opic
o hos e ic/allos e ic ligands o G p o ein-coupled ecep o s. Annu. Re . Pha macol.
Toxicol. 52: 153-178.
Va ela MJ, Lage S, Ca uncho HJ, Cada id MI, Loza MI, B ea J (2015). Reelin in luences he
exp ession and unc ion o dopamine D2 and se o onin 5-HT2A ecep o s: a compa a i e
s udy. Neu oscience. 290: 165-174.
Vauquelin G, Bo a i S, Kana ek L, S osbe g AD (1979). E idence o essen ial disul ide
bonds in be a1-ad ene gic ecep o s o u key e y h ocy e memb anes. Inac i a ion by
di hio h ei ol. J. Biol. Chem. 254: 4462-4469.
Venka ak ishnan AJ, Deupi X, Lebon G, Ta e CG, Sche le GF, Babu MM (2013). Molecula
signa u es o G-p o ein-coupled ecep o s. Na u e. 494: 185-194.
Vidi PA, Wa s VJ (2009). Fluo escen and bioluminescen p o ein- agmen
complemen a ion assays in he s udy o G p o ein–coupled ecep o oligome iza ion and
signaling. Mol. Pha macol. 75: 733-739.
Vignes M, Gui amand J, Sasse i I, Recasens M (1992). Di hio ei ol speci ically inhibi s
me abo opic esponses o glu ama e and depola izing agen s in a b ain
synap oneu osomes. Neu ochem. In . 21: 229-235.
155
Bibliog a ía
Viñals X, Mo eno E, Lan umey L, Co domí A, Pas o A, de La To e R y cols. (2015).
Cogni i e impai men induced by Del a9- e ahyd ocannabinol occu s h ough
he e ome s be ween cannabinoid CB1 and se o onin 5-HT2A ecep o s. PloS. Biol. 13:
e1002194.
Wacke D, Wang S, McCo y JD, Be z RM, Venka ak ishnan AJ, Le i A y cols. (2017).
C ys al s uc u e o an LSD-bound human se o onin ecep o . Cell. 168: 377-389.
Wacke D, Wang C, Ka i ch V, Han GW, Huang XP, Va dy E y cols. (2013). S uc u al
ea u es o unc ional selec i i y a se o onin ecep o s. Science. 340: 615-619.
Wang C, Jiang Y, Ma J, Wu H, Wacke D, Ka i ch V y cols. (2013). S uc u al basis o
molecula ecogni ion a se o onin ecep o s. Science. 340: 610-614.
Wa kins CC, And ews SR (2016). Clinical s udies o neu oin lamma o y mechanisms in
schizoph enia. Schizoph . Res. 176: 14-22.
Weiss JM, Mo gan PH, Lu z MW, Kenakin TP (1996b). The cubic e na y complex ecep o -
occupancy model II. Unde s anding appa en a ini y. J. Theo . Biol. 178: 169-182.
Weiss JM, Mo gan PH, Lu z MW, Kenakin TP (1996c). The cubic e na y complex ecep o -
occupancy model III. Resu ec ing e icacy. J. Theo . Biol. 181: 381-397.
Whea ley M, Simms J, Haw in SR, Wesley VJ, Woo en D, Conne M y cols. (2007).
Ex acellula loops and ligand binding o a sub amily o Family A G-p o ein-coupled
ecep o s. Biochem. Soc. T ans. 35: 717-720.
Whea ley M, Woo en D, Conne MT, Simms J, Kend ick R, Logan RT y cols. (2012). Li ing
he lid on GPCRs: he ole o ex acellula loops. B . J. Pha macol. 165: 1688-1703.
Whi e JH, Wise A, Main MJ, G een A, F ase NJ, Disney GH y cols. (1998).
He e odime iza ion is equi ed o he o ma ion o a unc ional GABA(B) ecep o .
Na u e. 396: 679-682.
Woo en D, Reynolds CA, Smi h KJ, Moba ec JC, Koole C, Sa age EE y cols. (2016). The
ex acellula su ace o he GLP-1 ecep o is a molecula igge o biased agonism. Cell.
165: 1632-1643.
W igh M, D ummond GI (1983). Inac i a ion o he be a-ad ene gic ecep o in skele al
muscle by di hiols. Biochem. Pha macol. 32: 509-515.
156
Bibliog a ía
Xie L, Ro i a X, Scholle P, Zhao H, Liu J, Pin JP y cols. (2015). Majo ligand-induced
ea angemen o he hep ahelical domain in e ace in a GPCR dime . Na . Chem. Biol. 11:
134-140.
Xue L, Ro i a X, Scholle P, Zhao H, Liu J, Pin JP y cols. (2015). Majo ligand-induced
ea angemen o he hep ahelical domain in e ace in a GPCR dime . Na . Chem. Biol. 11:
134-140.
Zhang D, Zhao Q, Wu B (2015). S uc u al s udies o G p o ein-coupled ecep o s. Mol.
Cells. 38: 836-842.
Zhang JH, Chung TD, Oldenbu g KR (1999). A simple s a is ical pa ame e o use in
e alua ion and alida ion o high h oughpu sc eening assays. J. Biomol. Sc een, 4: 67-73.
Zhang R, Xie X (2012). Tools o GPCR d ug disco e y. Ac a. Pha macol. Sin. 33: 372-384.
Zhang Z, Sun S, Quinn SJ, B own EM, Bai M (2001). The ex acellula calcium-sensing
ecep o dime izes h ough mul iple ypes o in e molecula in e ac ions. J. Biol. Chem.
276: 5316-5322.
Zheng FY, Wess J (1999). Iden i ica ion and Molecula Cha ac e iza ion o m3 Musca inic
Recep o Dime s. J. Biol. Chem. 274: 19487-19497.
157
