Células madre en la tiroides postnatal: identificación y función

TESE DE DOUTORAMENTO
CÉLULAS MADRE EN LA
TIROIDES POSTNATAL:
IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN
Fe nando O oz Gonja
ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL
PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN ENDOCRINOLOGÍA
SANTIAGO DE COMPOSTELA / LUGO
ANO 2020
DECLARACIÓN
DO AUTOR/A DA TESE
CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES POSTNATAL:
IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN
D.
Fe nando O oz Gonja
P esen o a miña ese, seguindo o p ocedemen o axei ado ao Regulamen o, e decla o que:
1) A ese aba ca os esul ados da elabo ación do meu aballo.
2) De selo caso, na ese aise e e encia ás colabo acións que i o es e aballo.
3) A ese é a e sión de ini i a p esen ada pa a a súa de ensa e coincide coa e sión
en iada en o ma o elec ónico.
4) Con i mo que a ese non inco e en ningún ipo de plaxio dou os au o es nin de
aballos p esen ados po min pa a a ob ención dou os í ulos.
En San iago de Compos ela., 21 de junio de 2020
Asdo.
..
AUTORIZACIÓN
DO
DIRECTOR
/
TITOR DA
TESE
CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES POSTNATAL:
IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN
D./Dna. Cla a Ál a ez Villama ín
INFORMA/N:
Que a p esen e ese, co espóndese co aballo ealizado po D/Dna. Fe nando O oz Gonja ,
baixo a miña di ección, e a
u o izo
a súa
p esen ación
, conside ando
que eúne os
equisi os
esixidos no R
egulamen o
de Es udos de
Dou o amen o da USC,
e
que
como di ec o des a
non inco e nas causas de
abs ención es ablecidas
na Lei 40/2015.
En San iago de Compos ela, 21 de junio de 2020
Asdo.
...........

DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES
El doc o ando decla a que no iene ningún con lic o de in e és.
Es e es udio ha sido inanciado po la Agencia Es a al de In es igación y Fondo Social
Eu opeo, P oyec os BFU2013-46109-R y BFU2016-76973-R FEDER Ti ulado: Implicaciones
isiopa ológicas de los mecanismos de ecambio y p oli e ación, benigna y maligna, de las
células olicula es i oideas humanas y de glándulas endoc inas, siendo in es igado p incipal
la P o . Cla a V Ál a ez.
El doc o ando Fe nando O oz Gonja ha sido inanciado po una beca F.P.I. adsc i a al
p oyec o BFU2013-46109-R FEDER, con el código BES-2014-071031
AGRADECIMIENTOS

Índice
17
ÍNDICE ............................................................................................................................. 15
ABREVIATURAS ........................................................................................................... 22
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 28
1 LA GLÁNDULATIROIDES ....................................................................................... 30
ANATOMÍA ............................................................................................................... 30
EL FENOTIPO TIROIDEO .............................................................................................. 32
ACCIONES Y METABOLISMO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS ...................................... 32
SÍNTESIS DE HORMONAS TIROIDEAS .......................................................................... 34
EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-TIROIDES ....................................................................... 36
2 PATOLOGÍAS TIROIDEAS POR HIPERPLASIA BENIGNA: EL BOCIO ....... 39
BREVE RESUMEN DE LOS TUMORES DE LA GLÁNDULA TIROIDES ............................... 39
BOCIO MULTINODULAR (MNG) ................................................................................ 41
EL HIPOTIROIDISMO. MODELOS ANIMALES DE HIPOTIROIDISMO PRIMARIO ............... 42
3 CÉLULAS MADRE ADULTAS (ASC) ..................................................................... 44
NICHO DE CÉLULAS MADRE ...................................................................................... 44
RUTAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN EL COMPORTAMIENTO DE LAS ASCS ....... 46
MARCADORES COMUNES EN ASCS ........................................................................... 48
ASCS EN ÓRGANOS ENDOCRINOS ............................................................................. 49
ASCS EN TIROIDES .................................................................................................... 51
CANCER STEM CELLS (CSCS) EN TIROIDES ................................................................ 52
4 SOX2 .............................................................................................................................. 53
CARACTERÍSTICAS GENERALES ................................................................................. 53
FUNCIONES DE SOX2 EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE DIFERENTES TEJIDOS .... 54
SOX2 ES ESENCIAL PARA EL MANTENIMIENTO DE LA CAPACIDAD “STEM” DE LAS
CÉLULAS. ............................................................................................................................... 54
REGULACIÓN DE SOX2 .............................................................................................. 56
MOLÉCULAS REGULADAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE SOX2 .................................. 56
OBJETIVOS .................................................................................................................... 59
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 63
1 EXPERIMENTOS IN VIVO ....................................................................................... 65
ASPECTOS ÉTICOS DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ........................................... 65
MODELO DE RATÓN B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J Y B6-
129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J ................................................................................................ 65
GENOTIPADO DE RATONES ........................................................................................ 67
Geno ipado pa a B6;129S-Sox2 m1(c e/ERT2)Hoch/J ............................................... 67
Geno ipado pa a Ra ón B6-129G (ROSA)26So m2Sho/J .................................. 68
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE TAMOXIFENO ................................................. 69
ADMINISTRACIÓN DE EDU (5-ETINIL-2’-DEOXIURIDINA) ......................................... 70
EXTRACCIÓN DE SUERO Y MEDICIÓN DE PESOS ......................................................... 70
HIPOTIROIDISMO MEDIADO POR PTU (PROPYLTHIOURACIL). ..................................... 70
PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES Y RECOGIDA DE MUESTRAS Y TEJIDOS ....................... 71
18
P epa ación de las mues as pa a inmuno luo escencia ................................... 72
P epa ación de mues as pa a el análisis del ARN. ......................................... 72
MODELO DE DESARROLLO DE LA TIROIDES .............................................................. 73
MODELO DE HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL ........................................................... 73
2 CULTIVO CELULAR ................................................................................................ 74
CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS FOLICULARES TIROIDEAS HUMANAS .................. 74
Aspec os é icos ................................................................................................. 74
Cul i os celula es humanos ............................................................................. 74
Cul i os celula es de ejido de i oides de a ón. Fo mación de i os e as e
inmuno luo escencia aplicada a las mismas. ................................................................... 75
3 ESTUDIO DE PROTEÍNAS ....................................................................................... 77
WESTERN BLOT ........................................................................................................ 77
Ex acción de p o eína ..................................................................................... 77
Mé odo de ex acción de p o eína con SDS y ampón de Shlessinge ..... 77
Mé odo de ex acción de p o eína de ejido de a ón ................................ 78
Cuan i icación de la concen ación de p o eína ............................................... 78
Elec o o esis y ans e encia de p o eínas ...................................................... 79
Inmunode ección .............................................................................................. 80
INMUNOFLUORESCENCIA E INMUNOHISTOQUÍMICA .................................................. 82
Inmuno luo escencia en ejidos de i oides de a ón ........................................ 82
Inmuno luo escencia en cul i o. ...................................................................... 83
Inmunohis oquímica en ejido de i oides de a ón .......................................... 84
Inmuno luo escencia con el uso de TSAs (Ty amide Signal Ampli ica ion) ... 85
ELISA .............................................................................................................. 85
MICROSCOPÍA .......................................................................................................... 86
Mic oscopía óp ica ........................................................................................... 86
Mic oscopía con ocal ....................................................................................... 86
Mic oscopía Ligh -Shee .................................................................................. 86
4 ESTUDIOS DE ADN ................................................................................................... 88
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE CULTIVO/TEJIDO ................ 88
GENOTIPADO DE RATONES ....................................................................................... 88
Ex acción de ADN .......................................................................................... 88
5 ESTUDIOS DE ARN ................................................................................................... 88
EXTRACCIÓN ARN ................................................................................................... 88
SÍNTESIS DE ADNC A PARTIR DE ARN MEDIANTE RETROTRANSCRIPCIÓN. .............. 89
PCR CUANTITATIVA ................................................................................................. 89
6 ANALISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................ 90
TEST PARAMÉTRICOS ............................................................................................... 91
TEST NO PARAMÉTRICOS .......................................................................................... 91
RESULTADOS ............................................................................................................... 93
1 CARACTERIZACIÓN DE LA POBLACIÓN SOX2 EN RATONES NORMALES
.................................................................................................................................................. 95
EXPRESIÓN DE SOX2 A NIVEL DE ARN. .................................................................. 95
Índice
19
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE SOX2 ............................ 96
Exp esión de Sox2 median e Wes e n-Blo en a ones ........................................
................................................................................................................................... 97
Es anda ización de la inción de secciones de ejido de a ón hemb a de 90 días
po IHQ con di e en es an icue pos de Sox2 .................................................................... 97
Colocalización de di e en es ma cado es en las células Sox2 posi i as en a ones
hemb as de 90 días. .......................................................................................................... 99
DISTRIBUCIÓN POSICIONAL DE LA POBLACIÓN SOX2 EN LA GLÁNDULA TIROIDES
COMPLETA ........................................................................................................................... 110
DISTRIBUCIÓN DE LA POBLACIÓN SOX2 A TRAVÉS DE MICROSCOPÍA LIGHT-SHEET.
............................................................................................................................................ 111
2 MODELOS DE RECLUTAMIENTO DE CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES:
TRACEADO DE LA POBLACIÓN SOX2 EN EL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-
EGFP ...................................................................................................................................... 113
CARACTERIZACIÓN EN LA TIROIDES DEL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP TRAS
TAMOXIFEN (TAM) A TIEMPO CORTO O LARGO. .................................................................. 113
Inmunohis oquímica de SOX2 con amoxi en a lo la go del iempo en e a
con oles en la áquea .................................................................................................... 113
Inmuno luo escencia pa a GFP en la áquea y en la i oides as amoxi en en
a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP ...................................................................................
................................................................................................................................. 117
MODELO DE RECLUTAMIENTO INDUCIDO POR HIPOTIROIDISMO FARMACOLÓGICO .. 117
El hipo i oidismo inducido en a ones hemb a median e PTU disminuye la
can idad de T4 lib e en sang e alcanzando ni eles de hipo i oidismo mode ado. ......... 118
Aumen o en la exp esión del ARN de SOX2 en a ones hipo i oideos de 3, 6 y
12 días ............................................................................................................................. 119
El hipo i oidismo de 12 días en a ones hemb a C57BL/6 aumen a la exp esión
de la p o eína SOX2 ....................................................................................................... 121
Expansión de la población de células SOX2 en a ones hipo i oideos de 12 días.
........................................................................................................................................ 122
TRAZAMIENTO DE CÉLULAS SOX2 EN RATONES HIPOTIROIDEOS FRENTE A CONTROLES
EN EL MODELO B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J « RATÓN B6-129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J
(SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP) ......................................................................................... 124
3 HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL ...................................................................... 128
4 MODELOS DE DESARROLLO DE LA GLÁNDULA TIROIDES ..................... 138
5 GENERACIÓN DE TIROSFERAS ......................................................................... 146
GENERACIÓN DE TIROSFERAS PRIMARIAS ............................................................... 146
GENERACIÓN DE TIROSFERAS SECUNDARIAS Y TERCIARIAS .................................... 148
INMUNOFLUORESCENCIA EN TIROSFERAS ............................................................... 149
DIFERENCIACIÓN TIROSFERAS ................................................................................ 149
6 EXPRESIÓN DE SOX2 EN TEJIDO Y CULTIVO CELULAR DE TIROIDES
HUMANO .............................................................................................................................. 152
EXPRESIÓN DE SOX2 TANTO EN CULTIVOS CELULARES DE TIROIDES NORMAL (T-NT)
Y BOCIOS MULTINODULARES (T-MNG) COMO EN SUS PROPIOS TEJIDOS A NIVEL DE ARN
MENSAJERO, PERO NO HAY DIFERENCIAS ENTRE ELLOS. ....................................................... 152
20
AUMENTO EN LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA SOX2 EN CULTIVOS HUMANOS DE BOCIO
MULTINODULAR (T-MNG), COMPARADO CON TIROIDES NORMAL (T-NT) .......................... 154
Es udio de la exp esión de p o eína Sox2 en cul i os p ima ios humanos .... 154
Es udio de la exp esión de p o eína Sox2 en cul i os p ima ios de i oides
humano ........................................................................................................................... 155
DISCUSIÓN .................................................................................................................. 161
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 173
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 177
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 182

22
ABREVIATURAS
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
24
ABCG2: anspo ado de memb ana ATP-binding casse e anspo e G2.
ASCs: Adul S em Cells. Células mad e adul as.
ATC: Undi e en ia ed o Anaplas ic Thy oid Ca cinoma. Ca cinoma Indi e enciado
de Ti oides
BMP Bone Mo phogene ic P o ein.
B dU B omo-deoxiu idina.
BSA: Bo ine Se ic Albumin. Albúmina de sue o bo ino.
D1/D2/D3: Desyodasa 1, 2 y 3, espec i amen e.
DPPA4: De elopmen al plu ipo ency Associa ed 4.
DTC: Di e en ia ed Thy oid Ca cinoma. Ca cinoma di e enciado de i oides.
DUOX: Dual Oxydase.
Edu: 5-e inil-2’-deoxiu idina.
EGFP: Enhanced G een Fluo escen P o ein.
EGFR: Epide mal g ow ac o ecep o . Recep o del ac o de c ecimien o epidé mico.
ESCs: Emb yonic S em Cells. Células mad e emb iona ias.
FGSC: Female ge mline s em cell. Célula mad e ge minal emenina.
GFAP: Glial Fib illa y Acidic P o ein. P o eína Ácida Fib ila Glial.
GFR
a
2: GDNF Family Recep o
a
-2.
Gli1: Zinc inge p o ein Gli1.
GMO: Gene ically Modi ied O ganism. O ganismo Gené icamen e modi icado.
HMG: High-mo ili y g oup. G upo de al a mo ilidad. Dominio del ADN capaz de
mo e se ápidamen e pa a egula el genoma.
HFSCs: Hai ollicle s em cells. Células mad e del olículo piloso.
HNF4
a
: Hepa ocy e nuclea ac o
a
4. Fac o nuclea hepá ico a4.
HSCs: Hema opoie ic S em Cells. Células Mad e Hema opoyé icas.
IAP: Inhibi o o apop osis.
iPSs: Induced Plu ipo en S em Cells. Células Mad e Plu ipo en es Inducidas.
ISCs: In es inal S em Cells. Células Mad e In es inales.
Kl 4: K uppel-like ac o 4.
LHX2: LIM homebox 2. Regulado ansc ipcional.
MCT8/MCT10: Monoca boxyla e T anspo e . T anspo ado es de ho monas
i oideas.
Ab e ia u as
25
MIT/DIT: Mono-yodo i onina / Di-yodo i onina.
MNG: Mul inodula Goi e . Bocio Mul inodula .
NIS: Na+/I- Sympo e . Simpo ado basal de yodo.
NPY: Neu opep ide Y.
NSCs: Neu al S em Cells.
OATP1C1: O ganic Anion T anspo e Polypep ide. Polipép ido T anspo ado de
Aniones O gánicos.
Oc 4/POU5F1: Oc ame -binding T ansc ip ion Fac o 4.
OSCs: Oogonial S em Cells.
PAX8: Pai ed Box Gene-8 P o ein. Fac o de ansc ipción de e minan e de la i oides.
PCR: Polyme ase Chain eac ion. Reacción en cadena de la polime asa.
PDTC: Poo ly Di e en ia ed Thy oid Ca cinoma. Ca cinoma de Ti oides Pob emen e
Di e enciado.
P op1: P ophe o Pi 1. Fac o de ansc ipción de e minan e de la hipó isis.
PTH: Pa a hy oid Ho mone. Ho mona Pa a i oidea.
PTU: P opil iou acilo
SCs: Sa elli e Cells. Células sa é i e muscula es.
SDS: Sodium Dodecyl Sul a e. Dodecilsul a o sódico.
S 1: S e oidogenic ac o 1.
SHH: Sonic Hedgehog.
Sox2: SRY-box 2.
S y: Sex-de e mining egión Y. Región de e minan e del sexo Y.
SVZ/SGZ: Sub en icula /Subg anula Zone. Zona sub en icula y Zona Subg anula .
Regiones ce eb ales donde se localizan células mad e adul as neu onales.
TAM: Tamoxi eno.
T3/T4: T iyodo i onina / Te ayodo i onina (Ti oxina).
TBG: Thy oxine-binding Globulin, p o eína anspo ado a de ho monas i oideas.
TCF4: ac o de ansc ipción T-cell ac o 4.
Tg: Ti oglobulina.
TPO: Ti ope oxidasa
TRH: Thy o opin-Release Ho mone. Ho mona libe ado a de Ti o opina.
TSH: Thy oid-S imula ing Ho mone. Ho mona es imulado a de Ti oides.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
32
EL FENOTIPO TIROIDEO
Pa a la o mación de las ho monas i oideas, T4 o i oxina y T3 o iyodo i onina, son necesa ios
dos componen es p incipales: la i oglobulina (Tg), p o eína sin e izada po las células
olicula es y sec e ada po el polo apical hacia la luz del olículo, y el yodo (I), p oceden e del
o en e sanguíneo en o ma de ion yodu o (I-) y cap ado po es as células pa a concen a lo
ambién en la luz olicula (imagen 1). Además de dichas moléculas, exis en ac o es de
ansc ipción igualmen e necesa ios pa a el co ec o desa ollo y uncionamien o de la glándula.
NKX2.1 (cuya p o eína es clásicamen e llamada ac o de ansc ipción de i oides 1 o
TTF1) es un ac o homeobox que se ha desc i o como esencial pa a que la es uc u a de la
glándula se desa olle co ec amen e después de la especi icación inicial en el endode mo, así
como pa a su madu ación5,6,7. El a ón knockou pa a TTF1 no desa olla ni el epi elio olicula
ni p esen a células C, siendo imp escindible pa a ambas.
PAX8 (Pai ed box gene-8 p o ein) es o o ac o de ansc ipción esencial pa a la
di e enciación de las células i oideas pe enecien e a la amilia pai ed-box que se exp esa en
el epi elio olicula 8. Se ha demos ado que la al a de dicho gen impide el desa ollo de las
células que o man el epi elio de los olículos i oideos pe o no a ec a a las células de
calci onina9.
FOXE1 (Fo head box p o ein E1)/TTF2, es un ac o de la amilia o khead que se exp esa
desde el inicio del desa ollo de la glándula10. Pa ece esencial en la especi icación inicial de la
glándula i oides en el endode mo, ya que el a ón knockou p esen a agenesia de i oides y
palada hendido11.
Es os es ac o es de ansc ipción no son especí icos de ejido i oideo, pe o su co-
exp esión simul ánea en dicho ejido hace que la célula pueda di e encia se en célula olicula
de i oides y pueda eje ce su unción como p oduc o a y libe ado a de ho monas i oideas.
O as p o eínas y enzimas ambién juegan un papel esencial pa a que el i oci o uncione
co ec amen e. Los dos co- anspo ado es de yodu o, el simpo ado de Na+/I- llamado NIS o
el an ipo ado de Cl-/I- Pend ina se equie en pa a el paso del yodu o al in e io de la célula y
después al coloide desde el o en e sanguíneo. (imagen 1). El complejo enzimá ico de la
Ti ope oxidasa (TPO) jun o a DUOX2 o gani ican el yodu o y hacen que dicho yodo se
inco po e a la molécula de i oglobulina en la luz del coloide. Po úl imo, cabe des aca ambién
el ecep o de la ho mona es imulado a de la i oides (TSHR), p incipal egulado an o de la
sín esis, ac i ando la exp esión de odas es as p o eínas del eno ipo, como de la sec eción de
las ho monas, además de se esponsable del o ismo del epi elio en cuan o a núme o de
células.
ACCIONES Y METABOLISMO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS
Las ho monas i oideas egulan p ocesos me abólicos esenciales en el c ecimien o y desa ollo;
en la ida adul a, son las p incipales egulado as del me abolismo basal12 (imagen 2)15. Es á
muy bien es ablecido que los ni eles de ho monas i oideas se encuen an di ec amen e
elacionadas con la masa co po al y el gas o ene gé ico13. Las ho monas i oideas egulan
p ocesos como el me abolismo del coles e ol y los hid a os de ca bono, ac i an el p oceso de
ß-oxidación de ácidos g asos y p omue en la e mogénesis. Son esenciales en el desa ollo del
SNC du an e la emb iogénesis, ya que la al a de es as ho monas p oduce as o nos se e os en
el ce eb o de indi iduos neona os14.

In oducción
33
Imagen 2. Vis a gene al de los di e en es ejidos donde las ho monas i oideas eje cen su acción.
Rep oducido con el pe miso de Mullu
e al
., 2014 15. Copy igh © 2014 Ame ican Physiological Socie y.
La mayo ía de las acciones de las ho monas i oideas sob e los ejidos se ealizan median e
ecep o es nuclea es que econocen es as ho monas llamados THR (Thy oid Ho mone
Recep o ), miemb os de una supe amilia de ac o es de ansc ipción nuclea es que esponden
a ho monas12 (imagen 2)15. Todos ellos compa en una es uc u a simila con un mo i o de dedo
de Zinc como dominio de unión al ADN, así como un dominio c- e minal que une coac i ado es
y co ep eso es12. Exis en dos ipos de THR, la iso o ma a y la ß; es os a su ez pueden su i
modi icaciones pos aduccionales (como la sumoilación) que, dependiendo del ejido, ha án
que las ho monas eje zan una acción u o a (algunas de ellas, dependiendo de la iso o ma del
THR, con e ec os o almen e opues os)16.
Como se mencionó an e io men e, las ho monas i oideas son el p incipal egulado del
me abolismo ene gé ico, ac i ando la os o ilación oxida i a mi ocond ial median e la
ac i ación de genes OXPHOS. Cuando la ho mona se une a su ecep o y o ma un complejo,
son capaces de uni se a secuencias especí icas del ADN nuclea que ambién es án p esen es
en el ADN de las mi ocond ias, ac i ando así en ambos genomas muchos de es os genes
OXPHOS esenciales pa a que se p oduzca la os o ilación oxida i a17.
La egulación especí ica de ejido pa a es as ho monas, además se ealiza se median e la
exp esión de di e en es iso o mas de sus ecep o es, ambién se p oduce g acias a la in e acción
en e los ni eles de ho monas ci culan es y la con e sión en el p opio ejido de T4 a T3 y su
anspo e den o de la célula diana. Po ejemplo, la espues a al ío modulada po el ejido
adiposo pa do implica la ac i ación de ecep o es ß3-ad ené gicos. Es os p omue en en el
ejido un es ado de “hipe i oidismo celula ” p oducido po la ac i ación de enzimas desyodasas
ipo 2, implicadas en la con e sión de T4 a su o ma más ac i a T3. Todo es o p oduce la
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
34
ac i ación de la ansc ipción de p o eínas como UCP-1 que, en úl ima ins ancia, desacoplan el
p oceso de gene ación de ATP en la os o ilación oxida i a en a o de la p oducción de calo 18.
Las acciones de las ho monas i oideas sob e el me abolismo ene gé ico es án bas an e
cla as desde hace ya a ias décadas; sin emba go, has a hace solo diez años no se sabía que el
SNC es aba muy implicado en es os e en os. Es udios en a as demos a on que el hipo álamo
es el p incipal egulado del balance ene gé ico de odo el o ganismo a a és de la acción de
las ho monas i oideas en la u a de AMPK. Pa a demos a lo, u iliza on a as hipo i oideas y
a as eu i oideass a las que se les adminis aba T3 di ec amen e al ce eb o; en ambos casos
disminuía la ac i idad de AMPK, lo que inc emen aba a su ez la ac i idad del Sis ema
Ne ioso Simpá ico (SNS) ac i ando ma cado es e mogénicos en el ejido adiposo ma ón
(BAT, B own Adipose Tissue). Si se inhibía la u a e mogénica del núcleo en omedial
(VHM, Ven omedial Nucleus) del hipo álamo, la ac i ación del BAT median e ho monas
i oideas no se p oducía, e i iéndose la pé dida de peso asociada al hipe i oidismo. El
mecanismo egula o io depende o almen e de AMPK, ya que la inhibición gené ica de es a
p o eína en el VHM de a as eu i oideas induce pé dida de peso independien e de la
alimen ación, aumen ando ambién la exp esión de ma cado es e mogénicos en BAT19,20.
SÍNTESIS DE HORMONAS TIROIDEAS
El yodo que iaja po el o en e sanguíneo es cap ado po las células olicula es i oideas a
a és de un mecanismo de anspo e ac i o mediado po NIS (SLC5A5). Es a glicop o eína
se encuen a p esen e en la memb ana basal de los i oci os, es deci , la pa e celula en con ac o
con los capila es sanguíneos21. Además de exp esa se en i oides, NIS se exp esa en o os
ejidos como en las glándulas sali ales, mucosa gás ica o en la glándula mama ia en pe iodo
de lac ancia; dependiendo del ejido donde se exp ese, NIS puede su i di e en es
modi icaciones pos aduccionales22,23.
Aunque NIS enga una al a a inidad po el yodu o, ambién se ha demos ado que es
capaz de media el anspo e de o os aniones, en e ellos pe clo a o24,25. Las Na+/K+ ATPasas
son las esponsables de que haya una di e encia de g adien e de Na+, el cual se encuen a mucho
más concen ado en el ex e io de la célula. Así, dos á omos de Na+ pasa án a a és de NIS al
in e io celula a a o de g adien e jun o con uno de yodu o en con a21. Pa a la co ec a
unción de NIS es imp escindible su localización en el polo basal. Recien emen e se ha
iden i icado en el ex emo ci oplasmá ico C- e minal de NIS el mo i o de aminoácidos
esponsable de es a localización, basado en Leucinas y aminoácidos ácidos (DD y EE), y
conse ada en odos los mamí e os26.
Pend ina es el anspo ado enca gado de que el yodo a a iese el polo apical de la célula
olicula y llegue al coloide27. Es a p o eína de memb ana ac úa como an ipo ado Cl-/I-, ya
que expulsa iones yodo desde la célula a la luz del coloide a cambio de in oduci un á omo de
Cl- al ci oplasma de la misma28. Pend ina se exp esa exclusi amen e en el oído in e no, i oides
y iñón. Mu aciones en el gen de es a p o eína anspo ado a o iginan el sínd ome de Pend ed,
en e medad ca ac e izada po so de a con mal o maciones en el oído in e no y apa ición de
bocios en e apas ce canas a la pube ad29,30. No malmen e los pacien es adul os son
no mo i oideos y no p esen an ni eles ele ados en sang e de TSH. Hace algunos años, es e
labo a o io log ó demos a que i oci os de pacien es con sínd ome de Pend ed e an capaces
de almacena has a cinco eces más yodo en su in e io que células de i oides no mal. La
ausencia de al e aciones ho monales elacionadas con es e e en o se explica ía debido a que
es as células son capaces de anspo a el exceso de yodo hacia el coloide a a és de la
pend ina mu ada o de o os anspo ado es, aunque de mane a mucho más len a31.
In oducción
35
El yodo, una ez llega al in e io del olículo, se une a esiduos de i osina si uados en
cadenas la e ales de la molécula de i oglobulina median e eacción enzimá ica. Pa a que es e
p oceso pueda lle a se a cabo, el yodo se oxida nada más en a al coloide median e una
eacción ca alizada po la enzima i ope oxidasa o TPO, u ilizando H2O2 como sus a o. La
ac i idad enzimá ica de TPO es dependien e de su asociación con un g upo hemo32,33, ya que
la inac i ación química de su g upo p os é ico inac i a la enzima y su ecombinación con o a
p o eína con g upo hemo es au a de nue o su unción34. TPO unciona como un díme o y se
p oponen a ias posibles o ien aciones de sus dos cen os ac i os –dominios mielope oxidasa-
en Cis o en T ans, pe o aún no esuel as35. Exis en a ios modelos animales en los que TPO
deja de se uncional, causando hipo i oidismos se e os; los desc ibi emos más adelan e, en un
apa ado dedicado a dichos modelos.
La p oducción de H2O2 necesa ia pa a el p oceso la ealizan dos enzimas NADPH-
dependien es llamadas DUOX 1 y 2 (Dual Oxidase 1 y 2 o THOX), descubie as casi
simul áneamen e en dos labo a o ios independien es36,37. DUOX1 y DUOX2 son dos genes
con iguos en el c omosoma 15 jun o con o os dos genes, DUOXA1 y DUOXA2, que son
ac o es de madu ación pa a que las oxidasas lleguen al polo apical38. El hecho de que DUOX2
es á muy exp esada en i oides, que sólo las mu aciones de DUOX2 y DUOXA2 causan
hipo i oidismo congéni o en humanos, y que en modelos de a ón sólo la pé dida de Duox2 pe o
no Duox1 causa hipo i odismo indica que la enzima cla e en i oides es DUOX238. De hecho,
algunas mu aciones de DUOX2 incluso es án asociadas a disgénesis de la glándula i oidea39.
Sin emba go, ecien emen e se ha desc i o un caso con mu ación bialélica de DUOX2 y DUOX1
o iginando un eno ipo de hipo i oidismo muy ma cado, sugi iendo que la ac i idad de DUOX1
compense la al a de DUOX2, y es po ello que las mu aciones de DUOX1 den un eno ipo más
benigno que mu aciones en o os genes40. Tan o TPO como DUOX son glicop o eínas que se
localizan en la memb ana apical de las células olicula es de la i oides.
La Ti oglobulina (Tg) (330 kDa) es la p o eína más abundan e en la glándula i oides, y
especialmen e en el coloide. La concen ación en la luz del olículo puede llega a alcanza los
300 g/L y su p incipal unción es la de p o ee a la glándula de ese o io pa a la sín esis y
acumulación de ho monas i oideas41. Su p oducción es á egulada po los mismos ac o es de
ansc ipción especí icos de i oides que egulan la exp esión de TPO: TTF1/NKx2.1,
TTF2/FOXE2 y PAX842. La Ti oglobulina es una p o eína glucosilada en 17 esiduos dis in os,
con iene 60 puen es disul u o in aca ena ios y o ma un díme o en el coloide adqui iendo un
al o peso molecula y mucha es abilidad43. La Tg iene 66 i osinas en su secuencia pe o sólo
30 de ellas se acoplan a yodo, y de es as úl imas muy pocas an a se donan es de su anillo
yodado pa a la conjugación, y sólo cua o an a se acep o as pa a o ma i oninas44,45. Pa a la
sín esis de ho monas i oideas (T3 y T4) es necesa ia la o mación p e ia de dos i osinas
yodadas den o de la Tg que, dependiendo si se unen uno o dos á omos de yodo p e iamen e
oxidado, se llama án MIT (monoyodo i osina) o DIT (diyodo i osina), espec i amen e.
Muchos es udios han in en ado demos a el p oceso exac o median e el cual TPO ca aliza la
oxidación del yodo y su pos e io unión al anillo de i osina, pe o el mecanismo oda ía no es á
cla o46,47,48. El paso inal es el acoplamien o en e dos moléculas de DIT pa a o ma la T4 o
una molécula de MIT y una DIT pa a o ma la T3. La eacción, como ya se dijo an e io men e,
es ca alizada po TPO y dependien e de H2O2, además de se es ic amen e dependien e de la
es uc u a de la Tg49.
Muy ecien emen e, se ha ob enido la es uc u a idimensional po c io-mic oscopía
elec ónica del díme o de Ti oglobulina, y se ha con i mado ayudándose de un es udio
mu acional y de sín esis in i o50. Cada monóme o end á un NTD-Co e-Flap-A y CTD que
se pliegan como o mando un eslabón de una cadena. La es uc u a se basa en la dime ización
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
36
de los dominios C- e minales (CTD) de ambos monóme os, de o ma que un NTD con ac a con
odos los dominios del monóme o con a io. Se con i man 4 i osinas acep o as (A-Y24, B-
Y2573, C-Y2766, y D-Y1310) y 5 i osinas donan es (Y234 y Y149 donan es pa a A, Y2540
pa a B, Y2766 pa a C and Y108 pa a D). El si io A es á den o del NTD, el si io B y C quedan
den o del CTD, y el si io D ace ca el Flap del monóme o con a io al NTD del p ime o. De
cada díme o se ob ienen 7 moléculas de T4, ya que el si io C sólo es ac i o como acep o en
uno de los dos monóme os, mien as que los donan es pa ecen eni de ambos. Es e abajo
seminal iene sin emba go algunas cosas sin explica , como po ejemplo que no hayan
conseguido sin e iza T3 en su modelo.
El mecanismo po el cual los olículos i oideos gene an las ho monas i oideas uncionales
a pa i de las ese as de Tg madu a es án muy bien es udiados. Los i oci os cap an las
moléculas de Tg median e agoci osis, aunque ambién se han p opues o o os mecanismos
pa ecidos como la mic o y la mac opinoci osis51,52. Una ez den o del i oci o, las Tg se
usionan con lisosomas que co an los esiduos de i oninas (p incipalmen e T4 pe o ambién
T3) median e escisión p o eolí ica. Se ha demos ado que las p incipales enzimas esponsables
de es e p oceso son las ca epsinas, siendo las D, H y L las iso o mas capaces de co a moléculas
de Tg53,54,55. La in e nalización de la Tg median e endoci osis es á egulada po la TSH52.
La i oxina iene una ida media la ga y una al a concen ación en plasma sanguíneo. Es o
es debido a su unión (jun o con la T3 y o as yodo i oninas) con las 3 p incipales p o eínas
anspo ado as de ho monas i oideas: TBG ( hy oxine-binding globulin), TTR ( ans hy e in)
y HSA (Human Se um Albumin); es as ho monas ambién pueden uni se a o as p o eínas de la
sang e ales como las lipop o eínas de al a densidad, pe o sin apenas ele ancia biológica56.
Du an e muchas décadas se pensaba que las ho monas i oideas e an capaces de en a a
las células diana median e di usión pasi a dada su na u aleza lipo ílica. Sin emba go,
e idencias publicadas a pa i de los años 70 si ie on pa a escla ece que debía habe algún
ipo de anspo ado especí ico y que la di usión pasi a hacia las células de la ho mona, si la
hubie a, se ía limi ado57,58. Has a inales de los 90 no se empeza on a es udia a ni el molecula
el p oceso median e el cual las ho monas i oideas a a iesan la memb ana plasmá ica,
momen o en el que se descub ie on los p incipales anspo ado es: MCT8 y MCT10
(monoca boxyla e anspo e ), OATP1C1 (O ganic Anion T anspo e Polypep ide) y, más
ecien emen e, SLC17A459,60,61,62.
Las desyodasas (DIO), enzimas ansmemb ana con su dominio ca alí ico o ien ado hacia
el ci osol63, son p o eínas muy implicadas en las e apas inales del me abolismo de las ho monas
i oideas, así como de su inac i ación en algunos casos. DIO1 y DIO2 son las enca gadas de
ca aliza la con e sión de T4 en T3, mucho más ac i a, pe o con una ida media más co a que
la p ime a. DIO3, po el con a io, se enca ga de inac i a ambas ho monas64.
EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-TIROIDES
El eje hipo álamo-hipó isis- i oides es el p incipal ci cui o egulado de la sín esis y sec eción
de ho monas i oideas (imagen 3). Es e sis ema iene como pun o inicial el hipo álamo y sus
neu onas p oduc o as de TRH (Ho mona Es imulado a de Ti o opina), que además de se el
p incipal es imulado de la libe ación de TSH po pa e de la adenohipó isis, in e iene en o os
p ocesos como el compo amien o en e a la comida o la e mogénesis65. Exis en a ias zonas
en el ce eb o con neu onas p oduc o as de TRH, pe o solo aquellas localizadas en el núcleo
pa a en icula del hipo álamo son las esponsables del con ol del eje. Las ho monas i oideas
eje cen una e oalimen ación nega i a sob e las neu onas TRH, ya que al os ni eles de es as
ho monas en sang e inhiben la sec eción de más TRH, como se demos ó en modelos
In oducción
37
animales66. Además del con ol egula o io nega i o de las ho monas i oideas, o os elemen os
elacionados con la nu ición, el me abolismo o el con ol de la empe a u a ambién in e ienen
en la p oducción de TRH; en e ellos, en e ellos el neu opép ido Y (NPY), la lep ina o la
ho mona es imulado a de melanoco ina (a-MSH)67,68,69.
La hipó isis, más conc e amen e la adenohipó isis o hipó isis an e io , es el segundo
componen e de es e sis ema y p incipal egulado de odo el sis ema endoc ino. Las células
i o opas son las enca gadas de p oduci TSH cuando llegan es ímulos de TRH po pa e del
hipo álamo. La TSH ac i a odos los pasos de la sín esis y sec eción de ho monas i oideas:
aumen a la cap ación de yodo po los i oci os, inco po ación de es e yodo a la Tg y p oducción
de H2O2 po los mismos, co ac o esencial pa a la biosín esis de ho monas. La endoci osis del
coloide y la pos e io hid ólisis de la Tg ambién se encuen an muy es imuladas po la TSH70.
Además, la TSH iene un papel esencial en la es imulación del c ecimien o y madu ación de los
i oci os70,71.
El úl imo componen e del sis ema, la p opia glándula i oides, eje ce una po en e inhibición
sob e en el hipo álamo en la libe ación de TRH y sob e la hipó isis en la libe ación de TSH. En
es e úl imo caso, conc e amen e, las ho monas i oideas egulan nega i amen e ambas unidades
que con o man la TSH: la subunidad al a y TSHß72.

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
38
Imagen 3. Eje hipo álamo-hipó isis- i oides. Las lechas en ojo indican egulación nega i a y en e de
egulación posi i a. Rep oducido de O iga-Ca alho
e al.,
20164. Copy igh © 2016 Ame ican
Physiological Socie y.
En cuan o a los ecep o es, ya se habló de las acciones mediadas po la amilia de ecep o es
nuclea es THR ( ecep o de ho monas i oideas) en apa ados an e io es, undamen almen e de
sus acciones sob e el genoma ac uando como ac o que egula muchos p ocesos
ansc ipcionales. Es os ecep o es se localizan en el núcleo, donde se uni án al ADN median e
secuencias llamadas THEs (Thy oid Ho mone Responsi e elemen s) p e ia unión de ellos
mismos con sus ligandos con una al a a inidad y especi icidad12,73. El ecep o de TSH (TSHR)
In oducción
39
pe enece a la amilia de ecep o es acoplados a p o eínas G y se localiza en la memb ana
basola e al de los i oci os74. Dependiendo de la concen ación de THS en el mic oambien e, su
mecanismo de acción puede encamina se a la sín esis y sec eción de ho monas i oideas o a la
ac i ación de p oli e ación celula . En el p ime caso, la TSH se uni á a su ecep o p oduciendo
la ac i ación de la subunidad Gs de la p o eína G, la cuál a su ez ac i a la adenilciclasa que
aumen a á los ni eles de cAMP con la consecuen e ac i ación de PKA. Es a u a de
señalización es la esponsable de la mayo ía de los e ec os que eje ce la TSH en el o ganismo4.
Cuando la concen ación de TSH llega a ni eles más ele ados, la ía de señalización cambia y
en es e caso se ac i an subunidades Gq que ac i a án a su ez la u a del IP3 (Inosi ol i os a o)-
DAG (Diacilglice ol), aumen ando el Ca2+ in acelula y la ac i ación de PKC. Es a ía es
esponsable de la egulación del lujo de I-, la inco po ación del mismo a la Tg y la gene ación
de H2O270.
2 PATOLOGÍAS TIROIDEAS POR HIPERPLASIA:
EL BOCIO
BREVE RESUMEN DE LOS TUMORES DE LA GLÁNDULA TIROIDES
Los umo es p ima ios pueden se benignos o malignos, excep uando si la neoplasia se o igina
en células C en cuyo caso el umo solo puede se maligno (aunque solo el 3% ap oximadamen e
co esponde ía a es e ipo de umo )75. Los benignos, ambién llamados adenomas olicula es
(más del 95% del o al), ep esen an la mayo pa e de los ipos de umo es i oideos en la
población76.
Los umo es malignos más comunes den o de los ó ganos endoc inos co esponden a
umo es i oideos77; además, su incidencia ha aumen ado un 4% en los úl imos 20 años78,79. En
é minos gene ales en cuan o a su incidencia, es el segundo ipo de cánce más común en
muje es y el sép imo en homb es en población de en e 20 y 49 años; en la población gene al,
se ía el quin o en incidencia en muje es y el decimosex o en homb es80.
Según la clasi icación in e nacional de la OMS y dependiendo de dónde se o igine, los
umo es i oideos pueden se p ima ios, si se gene an en la p opia glándula i oides o
secunda ios, si se o iginan en o os ejidos y median e me ás asis in aden el ejido
i oideo75(imagen 4).
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
40
Imagen 4. Modi icado a pa i del lib o de la clasi icación de umo es i oideos de la OMS (Lloyd
e al
.,201776).
Pe mi ido po IARC.
Los ca cinomas de epi elio olicula se di iden en 3 g upos a endiendo a sus ca ac e ís icas
his ológicas y clínicas:
• Ca cinoma di e enciado (DTC “Di e en ia ed Thy oid Ca cinoma”), con un
c ecimien o len o y buena espues a a la ci ugía y al a amien o con yodo adioac i o.
Según el ipo de c ecimien o, pueden di idi se, a su ez, en dos ipos.
o Ca cinoma papila , que ep esen a el 80% de odos los cánce es de i oides y los
p incipales esponsables del aumen o de incidencia de es a pa ología. Sus
núcleos son muy ca ac e ís icos, suelen c ece en papilas e in aden po ía
lin á ica.
o Ca cinoma papila , que c ece en olículos e in ade po ía sanguínea.
In oducción
41
• Ca cinoma pob emen e di e enciado (PDTC, “Poo ly Di e en ia ed Thy oid
Ca cinoma”) y
• Ca cinoma indi e enciado o anaplásico (ATC, “Undi e en ia ed o Anaplas ic Thy oid
Ca cinoma”). Tiene una baja incidencia (2-5%), pe o es el más ag esi o de odos ( la
mi ad de los pacien es diagnos icados ya ienen me ás asis). La media de supe i encia
son 6 meses y iene un 100% de mo alidad.
BOCIO MULTINODULAR (MNG)
El c ecimien o excesi o de a ias á eas de la glándula i oides y su ans o mación es uc u al
y/o uncional se conoce en clínica como bocio mul inodula (MNG, mul inodula goi e ). Se
ha desc i o que has a el 50% de la población gene al pod ía ene nódulos i oideos aunque la
mayo ía no se ían de ec ables po palpación y se ía necesa io el uso de o as écnicas como los
ul asonidos81,82.
La e iología de la en e medad iene una pa e gené ica y una espo ádica. En cuan o a la
apa ición de la en e medad po causas gené icas, aunque se ha demos ado en a ias ocasiones
la ag egación amilia 83,84, los es udios en dichas amilias no han podido demos a si la
en e medad es debida al componen e gené ico que compa en es as amilias o al componen e
ambien al. El MNG es la pa ología más común de la glándula i oides; incluso en egiones no
endémicas de bocio di uso po de iciencia de yodo, puede p esen a se has a en el 4% de la
población gene al mayo de 30 años85.
El ac o ambien al más impo an e que con ibuye a la apa ición de bocio en casos
espo ádicos es la de iciencia de yodo85,86; de hecho, el amaño de la glándula es in e samen e
p opo cional a la exc eción de yodo en la o ina87. O os ac o es como el géne o ambién es án
cla amen e implicados, ya que el a io muje es-homb es de bocio mul inodula puede
sob epasa el 5:1 e incluso el 10:1, lo que deja muy cla o que es mucho más ecuen e en
muje es que en homb es. Exis en más agen es de iesgo como pod ían se el abaco88, el es és
emocional89 o cie as d ogas90.
En endoc inología y según su isiopa ología, los bocios pueden di idi se en non oxic goi e
y TNG (Toxic Nodula Goi e ). El p ime o co esponde a una expansión nodula o di usa sin
p ocesos de in lamación o neoplasia y que no al e a la unción i oidea no mal. La e olución
del non oxic goi e a ía a lo la go del iempo: en ases iniciales, se p oduce una hipe plasia
epi elial olicula de mane a uni o me (bocio di uso) que aumen a la masa de la glándula; si el
deso den pe sis e, la a qui ec u a i oidea pie de uni o midad y se desa ollan á eas ib osas
in e caladas con á eas de hipe plasia ocal (a lo que se le conoce como MNG o bocio
mul inodula ). El TNG es el o o ipo de bocio en el que sí se p oduce una hipe uncionalidad
de la glándula. Es a en e medad aba ca desde la apa ición de un único nódulo hipe uncionan e
den o de una i oides mul inodula a una glándula con múl iples á eas con hipe unción (de ahí
que pueda habe a ian es gené icas en e nódulos). Po an o, el c ecimien o na u al de los
MNGs ae como consecuencia la apa ición de a ios nódulos. Si alguno de ellos adquie e
ca ac e ís icas hipe uncionan es (no malmen e po mu aciones somá icas en la i o opina o en
la TSH) es a íamos hablando de un TNG; si no uese el caso, co esponde ía con un non oxic
goi e 91,92.
La p esencia de MNG en humanos siemp e se ha asociado a un iesgo mucho más bajo de
desa olla cualquie ipo de neoplasia maligna en la i oides que en casos donde se p esen a un
único nódulo. En los úl imos años se ha demos ado que el iesgo de cánce de i oides es muy
pa ecido an o en indi iduos con un solo nódulo i oideo como en aquellos que p esen an algún
ipo de MNG. De ahí que se deban moni o iza de la misma mane a ambos casos ya que el
iesgo de neoplasias es muy pa ecido93. Las causas que gene an dicha hipe plasia oda ía no
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
48
muscula es pa a muchas en e medades y en o os p ocesos inhe en es al en ejecimien o, como
la sa copenia146.
MARCADORES COMUNES EN ASCS
Una de las es a egias más u ilizadas en la iden i icación de nue as ASCs es median e la
u ilización de ma cado es p o eicos que las di e encien del es o de células di e enciadas
p esen es en el ejido. Pa ece se que algunos ac o es de ansc ipción muy p esen es en el
desa ollo emb iona io ambién lo es a ían en las ASCs de algunos ejidos.
Sox2 es un ac o de ansc ipción pe enecien e a la amilia de genes SOX que se iden i icó
jun o con el descub imien o del ac o de e minan e del sexo en mamí e os, S y (Sex-
de e mining egión Y)147,148 Se habla á más en de alle en el apa ado especí ico pa a es a
p o eína.
Oc 4 (Oc ame -binding ansc ip ion ac o 4), ambién conocido como POU5F1 (POU
domain, class5, ansc ip ion ac o 5), es un ac o de ansc ipción implicado en el
man enimien o de la plu ipo encia de células mad e emb iona ias (ESC)149 y el desa ollo
emb iona io. Oc 4 con ola impo an es pun os de no e o no pa a o ma el epiblas o y los
di e en es p ecu so es del endode mo150,151. Oc 4 ambién es uno de los ep og amado es
cen ales pa a la o mación de células mad e plu ipo en es inducidas (iPSCs, induced
plu ipo en s em cells) y ambién conocido como uno de los 4 ac o es de Yamanaka152. En
ejidos adul os se han encon ado poblaciones de células Oc 4 posi i as en los olículos
pilosos153 o en el endome io humano154.
Kl 4 (K üppel ansc ip ion ac o 4) es un ac o de ansc ipción ca ac e izado po ene
en su es uc u a 3 mo i os de dedos de Zinc en la secuencia ca boxilo e minal155 y es una
p o eína muy implicada en di e sos p ocesos celula es como el c ecimien o celula ,
p oli e ación y di e enciación. Su egulación se p oduce an o a ni el ansc ipcional como a
ni el pos ansc ipcional. Va ios es udios mues an que la hipe me ilazión de Kl 4 en su
p omo o y la me ilación de algunas his onas modulan su ac i idad en a ios ipos de
cánce 156,157,158. Mic o-RNAs ambién son impo an es modulado es de Kl 4 en células mad e y
p ogeni o as, en la eo ganización del sis ema ca díaco y en p ocesos de
umo ogénesis159,160,161.
No podemos habla de es os 3 ac o es de ansc ipción sin ene en cuen a Nanog; jun o
con Sox2, Oc 4 y Kl 4 o man lo que se conoce como “ ac o es de Yamanaka”, las cua o
p o eínas esenciales pa a que células di e enciadas se con ie an en células plu ipo en es
capaces de gene a cualquie ipo de ejido, las llamadas iPSs (induced Plu ipo en S em
cells)152.
Exis en muchos ma cado es asociados a ASCs, aunque pocos son comunes a más de un
ejido adul o. Además, dependiendo del es ado de di e enciación en el que se encuen en, las
ASCs pueden i pe diendo ma cado es y ganando o os p og esi amen e a la ez que se p oduce
dicha di e enciación162. Se ha demos ado que dis in os ni eles en la exp esión de CD150 y
cKi de e minan di e en es poblaciones de HSCs163. Las células mad e epi eliales del olículo
piloso (HFSCs, Hai ollicle s em cells) se ca ac e izan po p esen a al os ni eles de in eg inas
(a4ß4 y a3ß1), ke a inas (K5, K14 y K15) y o os ma cado es de supe icie celula como CD34,
Lg 5 o TCF4 (T-cell ac o 4)164,165,166. Es as células ambién exp esan ac o es de ansc ipción
ales como SOX9 o LHX2 (LIM homebox 2); es udios de pé dida de unción mues an que es os
ac o es son esenciales pa a man ene las ca ac e ís icas de célula mad e en es as
poblaciones167,168,169. En in es ino de a ón, una p o eína an es mencionada, Lg 5, es el p incipal

In oducción
49
ma cado de las ISCs (localizadas en la pa e in e io de la c ip a)125. A pesa de las g andes
di e encias en e las IPSs y las HFSCs, compa en ma cado es como el ya mencionado Lg 5 y
o os como SOX9 y TCF4. También compa en u as de señalización como la que implica a
BMP (que p omue e la quiescencia de es as células) o Wn (c ucial pa a la ac i ación de las
ISCs)170,171. Las células sa éli e del músculo (SCs) p esen an a PAX7 (Pai ed box p o ein 7)
como su ma cado po excelencia172,173, aunque ambién se u ilizan o os ma cado es celula es
pa a aisla las como CD34 (del que ya hemos hablado en las HFSC) o CXCR4174. Po úl imo,
en los nichos del SNC ambién podemos encon a algunos ma cado es ya mencionados como
Sox2, p o eína que no deja de exp esa se has a e apas a días del p oceso de di e enciación de
las ASCs en ce eb o; o os ma cado es especí icos que ca ac e izan a es as células son GFAP
(Glial ib illa y acidic p o ein) y Nes ina175.
Algunas enzimas implicadas en el me abolismo de las ho monas i oideas ambién es án
muy p esen es en nichos de células mad e ya desc i os y juegan un papel cla e en su egulación.
Es e es el caso de las enzimas DIO2 y DIO3 p esen es en las SCs enca gadas de la egene ación
del músculo. Al p incipio no se dio mucha impo ancia a la unción de es as dos desyodasas ya
que su exp esión en el ejido es muy pob e, pe o más adelan e se obse ó que es án al amen e
exp esadas en las células mad e muscula es. Conc e amen e, la exp esión de DIO2 aumen a en
los p ime os pasos en la di e enciación de las SCs y su ac i idad ca alí ica es esencial pa a la
co ec a o mación y usión de nue as mio ib illas, como se demos ó en a ones DIO2-
knockou en los que se p oducía un e aso agudo en es os p ocesos de di e enciación. DIO3,
en cambio, se exp esa en ases oda ía más emp anas ya que es esencial pa a la inac i ación
de la T3, p oceso esencial en la p oli e ación p e ia di e enciación de las SCs107.
ASCS EN ÓRGANOS ENDOCRINOS
Han sido muchas las e idencias de poblaciones de ASCs en los di e en es ó ganos endoc inos.
En algunos como el hipo álamo o la hipó isis es as poblaciones ya es án muy bien
ca ac e izadas y es udiadas; en o os, como el pánc eas o la i oides, no se han encon ado
muchas e idencias que apoyen la exis encia de nichos de células enca gados de su eno ación
y man enimien o.
La hipó isis es el p incipal componen e del sis ema endoc ino ya que egula el
me abolismo, la ep oducción, la espues a al es és, el c ecimien o y o as muchas espues as
isiológicas a a és de la sec eción de di e sos ipos de ho monas169,176. Un g an núme o de
abajos han es udiado y ca ac e izado poblaciones de ASCs en la glándula. En 2005 se publicó
el p ime abajo que desc ibía la exis encia de células mad e en la adenohipó isis; en él se
desc ibe una población posi i a pa a OCT4, Nanog y Sca1 con capacidad pa a bombea el
Hoesch ue a de la célula y que o man clones de es e as en cul i o177. En 2008, se p opuso
una población Sox2+ en hipó isis de a ón que gene aba es e as en cul i o mezcladas con
células di e enciadas. En 2009, nues o g upo demos ó an o en a ones como en humanos que
ese nicho de ASCs localizado en la adenohipó isis coexp esaba es de los cua o ac o es de
Yamanaka (Sox2- Oc 4 y KLF4) jun o a dos ma cado es muy especí icos, GFRa2 (GDNF
Family Recep o s a-2) y P op1 (P ophe o Pi 1), además de o os como ß-Ca enina y E-
cadhe inas de una mane a muy ca ac e ís ica, sugi iendo una pola ización del nicho128. Es as
células ambién e an capaces de o ma es e as en cul i o que pueden se di e enciadas en
células p oduc o as de dis in os ipos de ho monas hipo isa ias128.Desa o unadamen e, las
células Sca1 e an ambién Sox2+, aunque no se co espondías con las ASCs hipo isa ias y el
mismo g upo que las había p opues o ecapi uló después sumándose a las e idencias del nues o
con ma cado es como Sox2, Sox9, CD34 y CD133131.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
50
El có ex ad enal, luga po excelencia donde se p oducen los compues os es e oideos,
libe a glucoco icoides enca gados de egula el me abolismo de la glucosa o las espues as al
es és o la in lamación y mine aloco icoides, implicados en el con ol del olumen ex acelula
de luidos, en el me abolismo del Na+ y es án muy implicados en el con ol de la p esión
sanguínea. Se han iden i icado células en es a glándula endoc ina capaces de au o eno a se
median e el uso de a ones ansgénicos178. Más adelan e se desc ibie on células Gli1(+) (Zinc
inge p o ein Gli1) alojadas en los compa imen os capsula y subcapsula del có ex de
a ones179 y a as180. Las células más ce canas al lími e con el có ex pueden pe de su espues a
a SHH (Sonic Hedgehog) y adqui i la exp esión de S 1 (S e oidogenic ac o 1) (ya desc i o
como esencial pa a el desa ollo de la glándula du an e la emb iogénesis181). Es as células
p ogeni o as pueden con e i se en células madu as de las di e en es capas que con o man el
có ex ad enal: pueden mig a a la Zona Glome ulosa (ZG) y sec e a aldos e ona o a la Zona
Fascicula y Re icula (ZG) y con e i se en célula sec e o a de glucoco icoides179.
En el es ículo el p oceso de o mación de espe ma ozoides a pa i de células p ogeni o as
es á bien iden i icado. Según la eo ía ac ual, conocido como el modelo “As”, exis en 3 ipos
de células Tipo A clasi icadas según su mo ología (que ep esen a ía su es ado de
di e enciación): células As (células aisladas), Ap (cadenas de dos células conec adas) y Aal
(cadenas de 4, 8, 16 o más células). Las SSCs se ían las células As (que no sob epasa ían el
0,03% de la población o al) que se di iden en 2 células hijas Ap las cuales se di iden pa a da
luga a células Aal182,183. Las espe ma ogonias Aal son la uen e de los espe ma ozi os p ima ios
que da án median e di isiones haploides, en úl ima es ancia, los espe ma ozoides madu os184.
En el o a io se pensó du an e muchísimos años que los indi iduos nacen con odos los
ooci os o mados que i án libe ando du an e su ida; sin emba go, en 2004, in es igado es
cambia on es e concep o ya que obse a on que el núme o de olículos sanos y a ésicos de
a ones hemb as no cuad aba con la eo ía ac ual. Así se empezó a asen a la eo ía de que
pod ía habe células mad e ge minales emeninas (FGSCs, Femile ge mline s em cells y
ambién conocidas como OSCs, oogonial s em cells)185. Más adelan e un g upo de
in es igado es iden i ica on FGSCs en a ones neona os y adul os median e
inmuno luo escencia analizando la inco po ación de B dU (B omodeoxiu idina). Después
consiguie on asila es as células y man ene las en cul i o du an e dos meses mien as que
exp esaban ma cado es de línea ge minal. El ma caje de es as poblaciones celula es median e
GFP y su implan ación en a ones es é iles demos ó median e análisis his ológico la p esencia
de muchos ooci os en di e en es e apas del desa ollo, algunos de ellos ma cados con es e
GFP186. Median e el uso de asplan es in agonadales de las FGSCs se consiguó es au a la
unción o á ica y que los a ones pudie an ene c ías de nue o186,187,188.
En el pánc eas exis en muchos es udios con di e en es eo ías ace ca de la capacidad de
egene ación y de la exis encia o no de ASCs en el mismo. Algunos in es igado es pos ulan
que la egene ación panc eá ica ocu e a a és de la au o eno ación de sus p opias células
donde las células ß gene a ían nue as células ß y las demás células acina es ha ían lo p opio
ellas mismas189,190,191,192 (algo pa ecido a lo que ocu e en el hígado cuando se p oduce daño
hepá ico). Es udios más ecien es han mos ado una al a he e ogeneidad en las células ß de los
islo es panc eá icos, iden i icando algunas mas inmadu as y con más capacidad p oli e a i a
que o as. Es a di e sidad pod ía explica po qué algunas células ß p esen an esa capacidad an
al a de di isión mien as que o as no193,194. Algunos es udios oda ía más ac uales desc iben
poblaciones en el ejido duc al del pánc eas que son capaces de gene a células p oduc o as de
insulina en a ones, sugi iendo que exis en poblaciones no endoc inas que pueden di e encia se
a p oduc o as de insulina195.
In oducción
51
ASCS EN TIROIDES
Los p ime os es udios o ien ados en iden i ica células mad e en la i oides adul a se diseña on
en a ones. En ellos se iden i icó una pequeña población que exp esaban Oc 4, nucleos emina
y ABCG2 (ATP-binding casse e anspo e G2) (que más a de se iden i icó po su capacidad
pa a bombea el ma cado nuclea Hoe ch), mien as exp esaban ma cado es eno ípicos a
ni eles muy bajos como Tg, el ecep o de TSH, TPO o TTF1. A es a población se le denominó
Side Popula ion (SP)196.
En humanos se ealiza on es udios his ológicos y cul i os celula es de bocios que
mos aban una población celula ambién posi i a pa a Oc 4 y pa a o os ma cado es de
endode mo como Ga a4 y HNF4a (Hepa ocy e nuclea ac o a4) mien as e an nega i os pa a
o os de eno ipo como Tg197. En base a es os es udios, se aisla on células p oceden es de bocios
humanos median e ci ome ía de lujo que mos aban ca ac e ís icas de ASCs: pequeño amaño
con un núcleo ela i amen e g ande compa ado con su ci oplasma. También p esen aban
pe iles de exp esión compa ibles con poblaciones celula es no di e enciadas. Es as células
ep esen aban el 0,1% de la población o al y ue on capaces de di e encia las in i o en
i oci os madu os median e a amien os con TSH (5mU/mL) pe o sin p e ia pu i icación.
De ec a on median e análisis de RT-PCR los ma cado es ADCG2 y Oc 4, aunque no ue on
capaces, en cambio, de de ec a los median e FACS; además, es a población e a nega i a pa a
ma cado es de eno ipo i oideo como Tg, NIS, TSHR y TPO96. En 2008, in es igado es
gene a on i os e as en cul i o a pa i de dispe siones celula es de ejido i oideo humano
cul i adas con EGF y BFGF198 .Es as es e as enían capacidad au o eplican e y e an CD34+
CD45- TSHR-. Algunas de es as es e as ya e an posi i as pa a ho monas an es de la
di e enciación mien as que o as e an nega i as. E an capaces de p oduci ho monas i oideas
cuando se las a aba con medio de di e enciación pe o el p opio medio con enía sue o bo ino
que con iene T4198. También se di e enciaban a adipoci os o células ß3- ubulina clase III
posi i as, sugi iendo quizá una mezcla de poblaciones198.
O os es udios basados en i oidec omías pa ciales en a ones mos a on egiones
p oli e a i as en ambos lóbulos. Se diseña on mic oa ays pos e io es que e ela on u as de
señalización emb iogénicas que suge ían la exis encia de células mad e o p ogeni o as
esiden es en la glándula. La ho mona T4, que disminuía sus ni eles después de la
i oidec omía, ecupe aba sus ni eles isiológicos en unas semanas; aco de con es o se
de ec a on aumen os en los ni eles de TSH en los días pos e io es a la in e ención
qui ú gica199. Es os es udios, sin emba go, no acla aban si la egene ación de la i oides enía
de una población de ASCs, del p opio epi elio i oideo ac i ado o de una población ajena no
esiden e en la i oides.
O os abajos se cen a on en obse a la capacidad egene a i a de la glándula en
pa ologías como la i oidi is au oinmune (EAT, Expe imen al Au oimmune Thy oidi is).
U ilizando a ones a los que se les ep odujo es a pa ología, de ec a on ni eles muy al os del
ma cado CD24 du an e la epa ación del ejido y ni eles ambién ele ados de Oc 4 a los 100
días pos e io es al EAT. In en a on demos a que CD24 es esencial pa a la egene ación de la
i oides en a ones CD24 null, pe o encon a on que la capacidad egene a i a e a aún mayo .
La conclusión a la que llega on ue que, p obablemen e, el aumen o de los ni eles de CD24 e a
debido a la al a in il ación de lin oci os ci culan es que se p oducía cuando se inducía la
en e medad a los a ones200.
Es udios de inmuno luo escencia en ejidos de bocios humanos obse a on la p esencia de
algunas células Oc 4 posi i as, así como de células Oc 4+/Ga a-4+/HNF4a en cul i os
celula es de i ados de bocios humanos adul os, sugi iendo la p esencia de células p ecu so as
de endode mo197. También se ha desc i o una Side Popula ion (SP) en humanos con una a io
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
52
ele ado núcleo/ci oplasma ( ípico de célula mad e), siendo posi i as pa a Oc 4 y que
con o maban el 0,1% de la población o al. Además, dicha población e a más ele ada en bocios
que en i oides no mal. Sin emba go, la SP no exp esaba los ma cado es de célula p ecu so a
de endode mo an es mencionados (Ga a-4 o HNF4a), ni ampoco ac o es de di e enciación
i oideos como Tg, NIS, TPO o TSHR (que sí ue on de ec ados en la población de ejido
es an e). La SP e a capaz de c ece y o ma olículos en p esencia de colágeno, añadiendo al
medio EGF y FGF. Es os olículos es aban o mados de has a el 5% de células ABCG2+/Oc -
4+ (población SP) o Ga a-4+/HNF4a (población no SP), ambas denominadas células mad e
i oideas en es e abajo. En espues a a sue o y a TSH, las células in i o comenzaban a
exp esa ma cado es de eno ipo i oideos (Pax8, NIS, TPO, TSHR y Tg) y deja on de exp esa
los ma cado es de célula p ogeni o a de endode mo y de s emcell96.
CANCER STEM CELLS (CSCS) EN TIROIDES
Las CSCs son g upos de células p esen es en muchos ipos de cánce que, po sus ca ac e ís icas
(pa ones de compo amien o y exp esión de ma cado es), se c ee que son las esponsables del
c ecimien o y man enimien o de la mayo ía de los umo es. Además, muchas de ellas pa ecen
se las más esis en es a a amien os con quimio e ápicos.
La exis encia de CSCs en i oides no ha sido demos ada, pe o hay muchas e idencias que
apoyan es a eo ía. Así, exis en es eo ías pa a explica el o igen de las CSCs en i oides:
• Los i oci os di e enciados, a a és de una se ie de mu aciones, adquie en la capacidad
de desdi e encia se (p obablemen e median e una ansición de célula epi elial a célula
mesenquimal) y o ma es as CSCs201,202.
• O a p opues a es que las CSCs p o ienen de células emb iona ias esiduales, que ienen
ma cado es de célula mad e y que esiden en nichos sólidos en la glándula201,203.
• La e ce a eo ía y la más apoyada es que es as CSCs p o ienen de ASCs p opias de la
i oides que, median e una se ie de mu aciones, pie den su capacidad egulado a y
comienzan a c ece sin con ol204. Es a úl ima eo ía es la más acep ada ya que combina
el concep o de CSCs con el modelo de que múl iples mu aciones gené icas conducen a
cánce . Además, es a eo ía explica ía po qué en los es udios de los sub ipos de cánce
de i oides más ag esi os se encuen an más al e aciones gené icas, lo que se aduce en
un compo amien o más ag esi o.
Hay es udios que e idencian una elación en e la ía de Wn con las CSCs en i oides; con
es o además se quie e explica la mayo asa de cánce en muje es que en homb es, ya que se
piensa que la ía de Wn ambién puede se ac i ada a a és de los es ógenos. Algunos
es udios obse an que los es ógenos ci culan es inc emen an las pa ologías i oideas en
muje es a a és de la ac i ación de la u a de PI3K y la consecuen e ep esión de p27205. Es os
abajos c een que los es ógenos pod ían se egulado es de la unción de las CSCs, ya que
obse an una mayo o mación de i os e as en cul i os de bocios humanos compa ado con
i oides no mal, en p esencia de 17ß-es adiol (E2), aunque no se desc ibe muy bien cómo
de inen o gene an dichas i os e as. O o mecanismo po el que los es ógenos es a ían
implicados en las di e encias en cuan o a sexo de la p e alencia de es as pa ologías es median e
la ía de Wn , ya que se han desc i o conexiones en e las ß-ca eninas y el ecep o ER-a.
Conc e amen e, es e g upo demos ó que es as dos p o eínas son capaces de o ma
inmunocomplejos, además de se eclu ados ecíp ocamen e a los p omo o es de sus genes
diana206. En base a es os es udios, o os sugie en que la es imulación ía E2 se asocia con el
In oducción
53
inc emen o en los ni eles de ß-ca enina, así como con el inc emen o de la in asión y mig ación
de umo es i oideos207.
En los in en os de iden i ica la población esponsable del c ecimien o y esis encia de los
umo es i oideos, algunos in es igado es han aislado pequeñas poblaciones celula es
p o enien es de PTCs (cánce papila de i oides, el más común) a las que llama on es e as
umo ales. Es as es e as podían c ece in i o inde inidamen e y e an mucho más esis en es a
los quimio e ápicos que el es o de la población umo al208. En o os es udios u iliza on líneas
celula es cance osas y cul i os celula es de pacien es con cánce de i oides pa a pos ula la
p esencia de CSCs. En ambos, obse a on pequeñas poblaciones celula es que e an capaces de
e ene inciones nuclea es (ca ac e ís ico de CSCs) y que exp esaban el ma cado SSEA-1
(S age-speci ic Emb yonic An igen 1), además de o os ma cado es de célula mad e como Oc 4,
Sox2 y Nanog. También obse a on que e an esis en es a los agen es quimio e ápicos y enían
capacidad mul ipo en e209.
Pa a e mina , ambién hay es udios in en ando elaciona la población SP encon ada en
ejido de i oides de a ón con las CSCs. Median e mic oa ays de ejido en a ones, obse a on
que la exp esión de la p o eína es aniocalcina 1 (STC1) es aba p esen e en la población SP y
ausen e en la población no-SP, po lo que decidie on es udia su exp esión en líneas celula es
humanas y de a ón de i adas de cánce de i oides. Así, demos a on una al a exp esión de
STC1 an o en líneas celula es cance osas de humanos como de a ón; el pa ón de exp esión
de STC1 se co elacionaba in e samen e con el es ado de di e enciación de cada célula210.
En esumen, odos los es udios publicados has a aho a p oponiendo la exis encia de ASCs
pa enquima osas en i oides no mal de modelos de oedo o en humano o en hipe plasia son de
calidad media y poco mecanís icos. Las poblaciones no se han pu i icado ni ca ac e izado
su icien emen e con mé odos acep ados en el campo de las s em cells y no ha habido un as eo
de es as poblaciones en la i oides de modelos animales. Se sabe que la me odología en el campo
de las células mad e es muy impo an e ya que hay muchas poblaciones de células mad e que
engloban células endo eliales, mesenquimales y neu ales además de las epi eliales
pa enquima osas.
F en e a la exis encia de ASCs, la o a posibilidad p opues a es que el p opio epi elio
i oideo es capaz de esponde a la acción de TSH p oli e ando du an e oda la ida y no necesi a
de ASCs. El epi elio i oideo en condiciones no males iene un bajo índice de p oli e ación y
se calcula que cada célula se di ide sólo cinco eces a lo la go de a ida del indi iduo211. Pe o
como se ha comen ado más a iba, es posible que algunas poblaciones epi eliales di e enciadas,
como las in es inales, se desdi e encien cuando hay una he ida g a e y e omen ma cado es de
células s em, compo ándose como ales pa a la epa ación isula 204.
4 SOX2
CARACTERÍSTICAS GENERALES
Sox2 es un ac o de ansc ipción pe enecien e a la amilia de genes SOX que se iden i icó con
el descub imien o del ac o de e minan e del sexo en mamí e os, S y (Sex-de e mining egión
Y)147,148. S y iene un dominio ca ac e ís ico de al a mo ilidad (HMG, High-mo ili y g oup)
que se une al ADN de mane a muy especí ica. Básicamen e, cualquie p o eína que con enga
un domino HMG con una secuencia de aminoácidos que compa a, al menos, un 50% con la
secuencia del HMG de S y pe enecen a la amilia SOX (S y- ela ed HMG box). Exis en 20
genes di e en es de SOX en e humanos y a ones, los cuales se clasi ican en di e en es g upos

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
54
de la A a la H212. SOX2 es miemb o de la amilia Sox2B1 y es el miemb o mejo es udiado de
es a. Funcionalmen e, Sox2 es á in oluc ado en plu ipo encialidad, de e minación del des ino
celula y cánce .
Sox2 egula la au o eno ación en células mad e emb iona ias (ESCs) an o de humano
como de a ón. También es muy impo an e pa a el man enimien o de la capacidad plu ipo en e
de muchas ASCs, como ocu e en el SNC o en la piel; además es uno de los ac o es c í icos
pa a gene a las IPSs median e el cóc el de Yamanaka152.
La exp esión ec ópica de es e ac o de ansc ipción se ha asociado con la apa ición y
desa ollo de dis in os ipos de cánce en ejidos adul os como el de mama o el de pulmón213.
FUNCIONES DE SOX2 EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE DIFERENTES TEJIDOS
Sox2 se exp esa inicialmen e en el o oec ode mo y en el blas ocis o, aunque más adelan e
queda á es ingido a es e úl imo214. Si es e ac o de ansc ipción se elimina en el zigo o, se
p oduce una mue e epen ina del emb ión debido a allos en la o mación del epiblas o215.
Después de la gas ulación, Sox2 se uel e a es ingi y solo se exp esa en cie os ejidos:
neu oec ode mo, a cos b aquiales, endode mo del ac o diges i o y células ge minales
p imo diales215,216,217.
A pa e de la impo ancia de Sox2 en el sis ema ne ioso, ambién es á muy p esen e en el
desa ollo de o os muchos ó ganos. En el desa ollo del sis ema senso ial, Sox2 es cla e pa a
el desa ollo del oído in e no eje ciendo de mediado en la señal po No ch, lo cual sugie e que
el des ino de cada célula en es e ó gano es de inido po No ch y, a su ez, egulado po Sox2.
Además, Sox2 ac úa como señalizado , en iando señales a a ios e ec o es con unciones
c í icas en el desa ollo de es e sis ema218. En la lengua, Sox2 se exp esa en las células
epi eliales basales pa a egula la di e enciación de células p ogeni o as de endode mo en
células senso iales del gus o o en di e en es ipos de ke a inoci os219.
Sox2 ambién se exp esa en el endode mo que o igina el ac o diges i o, el esó ago y la
pa e an e io del es ómago, donde es e ac o de ansc ipción se exp esa a al os ni eles. Tiene
un papel c í ico en los lími es pa a la o mación del epi elio escamoso del esó ago y es ómago
an e io y la pa e g anula del es ómago pos e io de mane a di ec a o indi ec a, ep imiendo
genes en el epi elio220.
Du an e el desa ollo de la piel, Sox2 se exp esa inicialmen e en células mesenquimales
llamadas en es e caso “condensados de males”, p ecu so es del olículo piloso que o ma án de
mane a e en ual ainas y papilas de males221.
SOX2 ES ESENCIAL PARA EL MANTENIMIENTO DE LA CAPACIDAD “STEM” DE LAS
CÉLULAS.
Es udios in i o demos a on que la deleción de pa e del gen de Sox2 esul a en una
di e enciación muy emp ana de las células asociadas al o oec ode mo, indicando que Sox2
es esencial pa a el man enimien o de las ESCs222. En e apas emp anas del desa ollo, Sox2
di ige a algunas ESCs en el desa ollo del ec ode mo, mien as que Oc 4 y Nanog p omue en
la di e enciación de las ESCs a mesode mo223.
En el SNC, conc e amen e en la e ina, Sox2 con ola la p oli e ación y di e enciación de
sus células median e la ac i ación di ec a del gen No ch224. La pé dida de exp esión de Sox2
en células p ogeni o as de la e ina de iene la p oli e ación y es imula la di e enciación,
mien as que un desequilib io en sus ni eles de exp esión conduce a pa ologías como la
mic o almia225.
In oducción
55
En algunos casos, Sox2 ambién p omue e la di e enciación celula . En la o mación de
oligodend oci os, Sox2 es imula el aumen o de los ni eles de exp esión de miR145, que inhibe
la apa ición de de e minados ac o es de di e enciación pa a a o ece así la exp esión de o os,
lo que se aduce en úl ima ins ancia en la o mación de los oligodend oci os226. En células de
Schwann, Sox2 es imula la mielinización de axones en el Sis ema Ne ioso Pe i é ico227. En
los úl imos años se ha demos ado que Sox2 ambién es cla e en los p ocesos de mielinización
y emielinización en la e apa adul a, ya que es un egulado esencial pa a las OPCs
(oligodend ocy es p ecu so cells). Si se elimina selec i amen e es e ac o de ansc ipción en
las OPCs, disminuye su densidad y el núme o de OPCs p oli e an es, así como la can idad de
nue os oligodend oci os211.
En 2011 ealiza on un mapeado con algunos ó ganos pa a e alua la exp esión de Sox2 en
ejidos adul os228. Con i ma on la exp esión del ac o de ansc ipción en algunas zonas del
ce eb o, la e ina, lengua, áquea y epi elio b onquial. La exp esión de Sox2 ambién en
es ículo, cé ix, es ómago glandula y epi elio escamoso ue o almen e inespe ado. Pa a
comp oba la impo ancia de Sox2 en es os ejidos, gene a on un modelo de a ón en el que se
p oducía la ablación del gen de Sox2 en un mecanismo inducido po TAM. Es o condujo a una
apop osis masi a de células Sox2+, con e ec os d amá icos en la homeos asis de los ejidos que
enía como consecuencia la mue e del a ón a las dos semanas de ida. De es a mane a se
comp obó la impo ancia de Sox2 pa a el man enimien o de muchas ASCs228.
Como ya dijimos, Sox2 es un ma cado di e encial pa a las ASCs localizadas en la SVZ y
SGZ del ce eb o122. Cuando se elimina la exp esión de es a p o eína se al e a la au o eno ación
y p oli e ación de las NSCs, ya que es imula la salida del ciclo celula y, en consecuencia,
di e enciación229. La glía de Mülle se conside a que son las NSCs de la e ina, ya que pueden
een a en ciclo celula y man ene el po encial de di e enciación de neu onas en adul os. La
exp esión de Sox2 en es e ipo celula en la e apa pos na al man iene sus ca ac e ís icas
p ogeni o as, po lo que se deduce que la exp esión de Sox2 en la glía de Mülle después del
nacimien o es c ucial pa a p omo e la quiescencia de es as células230. En es udios más
ecien es se ha demos ado que el núme o de células de Müle Sox2 posi i as disminuye con el
en ejecimien o y que la haploinsu iciencia de Sox2 causa pé dida de isión en a ones. Además
obse an que Sox2 es esencial pa a la ansmisión de la in o mación en e conos y bas ones, lo
que sugie e que es a p o eína se ía c ucial en el en ejecimien o de las células que o man la
e ina231.
El nicho de células mad e desc i o en hipó isis (células GPS, llamadas así po la
coexp esión de GFRa2 y P op1 y po su capacidad S em) ambién exp esa Sox2 como ac o
de ansc ipción esencial pa a el man enimien o de es e nicho, jun o con Sox9 y Oc 4. En es e
caso, aún siendo Sox2 esencial pa a el man enimien o del nicho, no es exclusi o del mismo, ya
que ambién se exp esa en células di e enciadas128. Es e hallazgo es o a p ueba más de que los
nichos se de inen po la coexp esión de un conjun o de ma cado es que, sepa ados, pueden es a
p esen es en células mad e en di e en es es ados de di e enciación o incluso en células ya
di e enciadas. Es udios de as eo celula en los que se u iliza on modelos de a ón simila es a
los de es e abajo demues an que, du an e el desa ollo, las di e en es líneas celula es que se
o man en la hipó isis p o ienen de células Sox2-Sox9 posi i as alojadas en el nicho. En a ones
adul os, es e nicho puede mo iliza se y di e encia se en el ipo de célula endoc ina que se
equie a en ese momen o232.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
56
REGULACIÓN DE SOX2
En las p ime as e apas del desa ollo del sis ema ne ioso, los ni eles de exp esión de Sox2 son
c í icos pa a el des ino neu onal de a ias poblaciones de ESCs. STAT3 egula di ec amen e la
exp esión de Sox2 y, en e ambos, egulan a su ez la de Nes ina, lo cual conduce al
comp omiso de las ESCs a con e i se en p ogeni o as del sis ema ne ioso233. La expansión
de es os p ogeni o es neu onales ambién se egula median e Sox2, pe o en es e caso a a és
de un loop de EGFR-Sox2-EGFR (Epide mal g ow ac o ecep o ) que es imula la di isión de
es as células en el desa ollo de emb iones de a ón234. En ce eb o adul o de a ones se encon ó
que los egulado es de ciclo celula E2 3a y E2 3b egulan a su ez los ni eles de Sox2,
con olando así la p oli e ación de NSCs235. El ep eso p21 se une al p omo o de SOX2 en
NSCs y di ec amen e anula su exp esión; de mane a inespe ada, el aumen o de la exp esión de
Sox2 en a ones K.O. pa a p21 se aduce en daño al ADN con la consiguien e apa ición de
genes sup eso es de umo es como p53 o p19a , lo cual p o oca mecanismos que p omue en
senescencia de las NSCs235,236.
Fac o es ex ínsecos p esen es en el mic oambien e pueden egula ambién la exp esión
de Sox2. La hipoxia, po ejemplo, es conocida como un ac o ac i ado en la exp esión de
Sox2; como esul ado, se p oduce una ac i ación de CD133 que conduce a cánce de pulmón237.
Se han iden i icado 3 si ios donde Sox2 puede se os o ilado: S249, S250 y S251. También
se ha comp obado que es a os o ilación p omue e la sumoilación, e i ando así la unión de la
p o eína con el ADN238,239. Los esul ados sob e las consecuencias de es as modi icaciones
pos ansc ipcionales son con usos ya que algunos es udios a i man que la os o ilación de Sox2
aumen a la e iciencia en la inducción de iPSCs240, lo que esul a ía con adic o io.
Se iden i icó un esiduo de lisina ace ilada como esponsable de la anslocación de Sox2
del núcleo al ci oplasma. Bloqueando la ace ilación de es a lisina se p oduce la e ención de
Sox2 en el núcleo, sos eniendo su exp esión en los genes diana241.
Po úl imo, se ha encon ado un nue o egulado esencial pa a Sox2 que pod ía ene
muchas implicaciones en el u u o: PARP1 (poly(ADP- ibose) polyme ase I), p o eína con
unciones esenciales en la emodelación de la c oma ina y los si ios accesibles de la misma;
ambién unciona como enzima pa a a ias modi icaciones pos ansc ipcionales. En es e
abajo se demues a que PARP1, además de sus unciones ya desc i as, ac úa como egulado
pa a muchos p ocesos ansc ipcionales en los que es á implicado Sox2, p oponiendo una nue a
o ma de uni es e ac o de ansc ipción al ADN242. Así, Sox2 ya no solo se uni ía al DNA a
a és de sus mo i os de unión ípicos, sino que se ab i ía un campo o almen e nue o en el que
Sox2 pod ía in e ac ua con muchas o as egiones de la doble cadena.
MOLÉCULAS REGULADAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE SOX2
Desde el descub imien o de es a p o eína, aunque muchos es udios se han cen ado en
iden i ica egulado es de la misma, o os lo han hecho en los mecanismos que es a molécula
es capaz de egula . Las moléculas cla e pa a el man enimien o de la plu ipo encialidad de las
ESCs, como son Oc 4, Nanog o DPPA4 (De elopmen al plu ipo ency Associa ed 4) es ás
eguladas di ec amen e po Sox2243.
Recien emen e se ha demos ado que Sox6, una p o eína de la sub amilia SoxD implicada
en la egulación de los p ecu so es de los oligodend oci os, es una diana di ec a pa a Sox2 en
el SNC. Es udios ealizados in i o en a ones con i ma on a Sox6 como diana molecula de
Sox2; jun os o man un complejo que se enca ga de inhibi la di e enciación p ema u a du an e
la neu ogénesis244
Sox2 con ola el nicho de NSCs en el hipocampo de a ones neona os man eniendo su
supe i encia median e mecanismos pa ac inos egulando di ec amen e SHH245. O os es udios
In oducción
57
apoyan es a idea del papel cla e de Sox2 en la supe i encia de las NSCs. Po ejemplo, se ha
iden i icado que Sox2 ac i a la exp esión de un gen llamado su i ina, miemb o de la amilia
IAP (Inhibi o o apop osis), pa a p e eni la mue e p og amada de las NSCs median e la
in e acción con XIAP (X-linked IAP), o a p o eína de la amilia IAP246.
También se han demos ado in e acciones en e Sox2 y ß-ca enina pa a es imula la
exp esión de la Ciclina D1 en células de cánce de mama, p omo iendo ambién la p oli e ación
celula y la umo ogénesis247. Es os hallazgos ue on apoyados pos e io men e median e o os
es udios que a i maban que la p opia ß-ca enina es capaz de aumen a la p opia exp esión de
Sox21.

Ma e iales y Mé odos
65
1 EXPERIMENTOS IN VIVO
ASPECTOS ÉTICOS DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Los p ocedimien os ealizados con animales ue on lle ados a cabo bajo la supe isión del
Comi é bioé ico de la Uni e sidad de San iago de Compos ela (p ocedimien o de la P o eso a
Cla a Ál a ez Villama ín: 15003/14/005) y siguiendo la no ma i a igen e:
Ley 6/2013, de 11 de junio, de modi icación de la Ley 32/2007, de 7 de no iemb e, pa a
el cuidado de los animales, en su explo ación, anspo e, expe imen ación y sac i icio
(BOE de 12 de junio de 2013).
Dec e o 296/2008 del 30 de diciemb e, elacionada con la p o ección de animales
u ilizados pa a expe imen ación y o os ines cien í icos, incluida la docencia, y po el que
se c ea el Regis o de los cen os de c ía, de suminis ado es y usua ios, así como la
Comisión Gallega de Bienes a de los Animales de Expe imen ación.
Di ec i a 2010/53/UE del Pa lamen o Eu opeo y del Consejo del 22 de sep iemb e,
adop a on la Di ec i a 2010/63/UE, ela i a a la p o ección de los animales u ilizados pa a
ines cien í icos.
Real dec e o 53/2013 del 6 de junio, en el que se es ablecen las no mas básicas
aplicables pa a la p o ección de los animales u ilizados en expe imen ación y o os ines
cien í icos, incluyendo la docencia.
O den ECC/566/2015 del 20 de ma zo, po la que se es ablecen los equisi os de
capaci ación que debe cumpli el pe sonal que maneje animales u ilizados, c iados o
suminis ados con ines de expe imen ación y o os ines cien í icos, incluyendo la
docencia.
Du an e el desa ollo de es e abajo se han enido en cuen a el bienes a animal, in en ando
educi el es és, el dolo o el daño du ade o en los animales. De acue do con a iculo 4 del eal
dec e o 53/2013, se implemen a el P incipio de las “3 e es”, es deci , eemplazo, educción y
e inamien o de los p ocedimien os. De es a mane a se ha in en ado educi el núme o de
expe imen os ealizados con animales y e i ando el uso innecesa io de animales den o de los
mismos, sin que a ec e o comp ome a el esul ado de los expe imen os.
Pa a pode lle a a cabo los expe imen os con animales se ob u o el í ulo co espondien e:
Cu so de Expe imen ación Animal Ca ego ía B según RD1201/2005, RD 53/2013 y 2010/63
UE, ac edi ado po la Comunidad de Mad id.
MODELO DE RATÓN B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J Y B6-
129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J
Pa a es udia el compo amien o de las células SOX2 posi i as en i oides de oedo es se
u iliza on es os dos modelos de a ón gené icamen e modi icado GMO (gene ically modi ied
o ganism) que, c uzados en e ellos, gene an un nue o modelo en el que las células que
exp esen SOX2 pueden segui se a lo la go del iempo g acias al epo ado EGFP (p o eína
e de luo escen e).
Pa a en ende mejo el modelo de a ón ob enido, se habla á p ime o de sus p ogeni o es
(imagen 7):
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
66
Þ Ra ón B6;129S-Sox2 m1(c e/ERT2)Hoch/J
Uno de los dos alelos del gen Sox2 se sus i uye po la lec u a pa a la ansc ipción de una
p o eína quime a, C eERTT2. Es a ac úa como C e- ecombinasa, una enzima capaz de
in e ac ua con si ios LoxP en el genoma con di e en es esul ados dependiendo la
disposición y el núme o de dichas secuencias LoxP. Además, la C e- ecombinasa en es e
modelo de a ón es inducible po Tamoxi eno (T-5648, Sigma), lo que signi ica que la
enzima C e solo se ac i a cuando es e compues o es adminis ado al animal.
Dado que es a secuencia genómica al e a de mane a signi ica i a el locus del gen
Sox2, los a ones mu an es homozigo os no son iables ya que SOX2 es una p o eína
esencial en el desa ollo del indi iduo. Po an o, es os a ones siemp e han de man ene se
en he e ozigosis.
Þ Ra ón B6-129G (ROSA)26So m2Sho/J
Es e modelo iene el gen pa a la p o eína EGFP inse ado en el locus de un alelo del gen
129G (ROSA)26So , un ARN no codi ican e (ARNnc) exp esado en la amplia mayo ía de
células. Además, posee en su secuencia un codón de STOP lanqueado po dos si ios LoxP
en e el p omo o de 129G (ROSA)26So y EGFP.
Es e modelo puede man ene se en homozigosis, es deci , con los dos alelos mu ados,
ya que los a ones gene ados son iables, é iles, no males en amaño y no p esen an
ninguna ano malidad ísica o de compo amien o.
Þ Ra ón B6;129S-Sox2 m1(c e/ERT2)Hoch/J
«
Ra ón B6-129G (ROSA)26So m2Sho/J
Es e es el esul ado del c uce en e los dos modelos de a ón explicados an e io men e.
Cuando se adminis a amoxi eno al indi iduo, la C e-Recombinasa se ac i a (en aquellas
células donde SOX2 se exp ese su icien emen e) y eje ce una acción de co e y empalme
cuando encuen a dos si ios LoxP en la misma cadena de ADN (imagen 7).
Como esul ado, el codón de STOP que había en e los dos si ios LoxP se elimina y la
p o eína EGFP comienza a sin e iza se. Desde el pun o de is a isiológico, es o se aduce
en que odas las células que en el momen o de la adminis ación de amoxi eno es én
exp esando SOX2, comenza án a p oduci ambién EGFP de mane a cons i u i a y,
sob e odo, ya independien e de la exp esión de SOX2.
Ma e iales y Mé odos
67
Imagen 7. Esquema simpli icado de la gene ación de a ones GMO dobles mu an es y mecanismo median e
el cual las células Sox2 exp esa án la p o eína GFP de mane a cons i u i a man engan o no la exp esión de
dicho SOX2. Cuando a un a ón GMO doble mu an e se le adminis a TAM, la C e-R es a á p esen e sólo en
células que exp esen SOX2 en ese momen o y, po an o, solo en ellas co a á los dos si ios LoxP pa a que
la p o eína EGFP se exp ese cons i u i amen e g acias a su asociación con el p omo o ue e
ROSA26
.
Po an o, podemos a i ma con segu idad que cualquie célula p oduc o a de EGFP o bien
exp esa SOX2 o bien lo ha exp esado en algún momen o de su ida.
Los a ones ienen un backg ound gené ico p o enien e de a ones C57BL/6J, la cepa de
oedo más usada en in es igación. Po eso, odos los a ones wild ype usados como con ol
se án C57BL/6J.
GENOTIPADO DE RATONES
Como ya se explicó p e iamen e en el modelo de a ón GMO, no odos los a ones gene ados
exp esan el geno ipo de nues o in e és. Pa a u iliza solo a ones dobles mu an es y, o bien
desca a o bien u iliza como con ol nega i o aquellos que no lo sean, se co a un pedazo de
cola pa a su pos e io geno ipado.
Geno ipado pa a B6;129S-Sox2 m1(c e/ERT2)Hoch/J
Pa a es e gen en conc e o, los a ones que engan mu ado un alelo de Sox2 ( eco demos
que los dos mu ados hacen que el a ón sea in iable) p esen a án una banda de 100pb. La
elec o o esis se ealiza en un gel de aga osa al 3% y el p o ocolo de la PCR es el que sigue:
• 2.5 µL bu e 10x
• 0.5 µL DNTPS 10 Mm
• 0.2 µL Fas Gene® Taq DNA Polyme ase LS21
• 19.9 µL H2O mQ
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
68
• 0.5 µL o wa d 10 µM
• 0.5 µL e e se 10 µM
El cóc el con odos los componen es se in oduce en un e mociclado (T100™ The mal
Cycle 1861096 BIORAD) y se con igu a de la siguien e mane a ( abla 1):
Tabla 1 Con igu ación del e mociclado pa a el geno ipado de a ones GMO Sox2-C e
Paso
Tempe a u a, ºC
Tiempo
Núme o de
ciclos
Desna u alización inicial
95
3 min
1
Desna u alización
94
30 seg
40
Hib idación
52
30 seg
Ex ensión
72
1 min
Ex ensión inal
72
10 min
Los cebado es usados pa a dicha eacción es án o mados po es as secuencias de
nucleó idos ( abla 2).
Tabla 2. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación del gen en cues ión
Cebado es
Secuencia 5’/3’
Fo wa d
GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC
Re e se
GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT
Aquellas calles que p esen en una banda de 100pb co esponde án con indi iduos mu an es
pa a dicho gen, es deci , posee án un alelo de Sox2 con la p o eína quime a SOX2-C e; en las
calles donde no se ap ecie banda se á po que dicho indi iduo es de ipo wild ype (imagen 8).
Imagen 8. Imagen de un gel de aga osa co espondien e al geno ipado de a ones Sox2-C e
Geno ipado pa a Ra ón B6-129G (ROSA)26So m2Sho/J
Es e gen, en cambio, puede albe ga el cons uc o LoxP-EGFP en ambos alelos y los indi iduos
se án pe ec amen e iables; el modelo unciona an o con un alelo mu ado como con los dos.
La elec o o esis en es e caso se ealiza en un gel de aga osa al 1,8% y el p o ocolo de la PCR
es simila al an e io :
• 2.5 µL bu e 10x
• 0.5 µL DNTPS 10 Mm
• 0.2 µL Fas Gene® Taq DNA Polyme ase LS21
• 18.8 µL H2O mQ
• 0.5 µL o wa d 10 µM
Ma e iales y Mé odos
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• 0.5 µL o wa d 10 µM
• 1 µL e e se común 10 µM
El cóc el con odos los componen es se in oduce en un e mociclado (T100™ The mal
Cycle 1861096) y se con igu a de la siguien e mane a ( abla 3):
Tabla 3 Con igu ación del e mociclado pa a el geno ipado de a ones GMO LoxP-EGFP
Paso
Tempe a u a, ºC
Tiempo
Núme o de
ciclos
Desna u alización inicial
95
3 min
1
Desna u alización
94
30 seg
40
Hib idación
58
30 seg
Ex ensión
72
1 min
Ex ensión inal
72
10 min
Los cebado es usados pa a dicha eacción es ás o mados po es as secuencias de
nucleó idos.
Tabla 4. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación del gen en cues ión
Cebado es
Secuencia
Fo wa d mu an e
3’-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-5’
Fo wa d wild ype
3’-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-5’
Re e se común
3’-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-5’
Como se puede obse a en la imagen 9, se de ec an dos ipos de bandas en el gel de
elec o o esis: aquellas o madas po 320pb que co esponde ían a indi iduos con el alelo
mu ado LoxP-EGFP y aquellas con 600pb pa a los wild ype. Si en una calle especí ica se
obse an ambas bandas, es e a ón se ía he e ocigo o (imagen 9).
Imagen 9. Imagen de un gel de aga osa co espondien e al geno ipado de a ones LoxP-EGFP
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE TAMOXIFENO
Se pesa el amoxi eno (T5648, SIGMA), dependiendo de la can idad que se quie a p epa a ,
pa a deja lo a una concen ación inal de 20 mg/mL en acei e de maíz (C8267, SIGMA).
Su adminis ación puede se an o ía subcu ánea como in ape i oneal; noso os
escogimos es a úl ima debido a que obse amos mejo es esul ados. En el caso de la
adminis ación de amoxi eno en neona os, escogimos la ía subcu ánea debido a que el
pe i oneo del a ón ecién nacido es muy pequeño. Se adminis a on 5 dosis en días
consecu i os y, en odos los casos, dicha dosis ue de 0,2 mg/g de peso del a ón. En los

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
70
expe imen os con neona os la dosis se edujo a la mi ad y se adminis ó du an e 2 días
consecu i os.
ADMINISTRACIÓN DE EDU (5-ETINIL-2’-DEOXIURIDINA)
El EdU es un compues o análogo al B dU (5-B omo-2’-deoxiu idina) y que, po an o, ac úa
in e calándose en e las bases de ADN cuando una célula en a en ase S de ciclo celula .
De es a mane a, adminis ando el compues o al a ón, se pod á de ec a pos e io men e
median e inmuno luo escencia y así obse a células que han en ado en di isión.
El compues o se disuel e en agua des ilada (20mg/mL) y se adminis a al animal ía
in ape i oneal a una concen ación de 0,2mg/g de peso, con dos inyecciones 12 y 24 ho as
an es del momen o de su sac i icio.
EXTRACCIÓN DE SUERO Y MEDICIÓN DE PESOS
Los pesos de los animales se ecogie on median e una báscula de p ecisión (Ke n EMB 1200-
1) y se oma on el día del inicio de cada expe imen o, el día del sac i icio y el día si uado en e
el inicio y el inal. En expe imen os de 3 días solo se ecogen peso el día inicial y el inal.
La sang e se ex ae di ec amen e del en ículo izquie do del co azón del animal con
una je inguilla (aguja de 25G x 5/8”) has a ob ene un olumen ap oximado de 1 mL.
Pa a a o ece la coagulación, las mues as de sang e se incuban du an e 30 minu os a
empe a u a ambien e.
Se cen i ugan a 13000 pm du an e 30 minu os a 4ºC. Se ecoge el sob enadan e que
co esponde al sue o y se hacen alícuo as que se almacenan a -20ºC pa a su pos e io
análisis.
Aquellos sue os hemolizados o con aminados con glóbulos ojos se desca an de dichos
análisis pa a e i a que in e ie an con la medición y la co ec a in e p e ación de los esul ados.
Pa a moni o iza el peso de los a ones en los expe imen os de hipo i oidismo, se midie on
es os alo es el p ime y úl imo día del expe imen o, así como a la mi ad del mismo. Po
ejemplo, pa a a ones a los que se les indujo un hipo i oidismo de 12 días, los pesos se
ecogie on el día 1, 6 y 12 median e una báscula de p ecisión.
HIPOTIROIDISMO MEDIADO POR PTU (PROPYLTHIOURACIL).
El PTU (P3755, SIGMA) es una molécula capaz de inhibi la p oducción de ho monas i oideas
median e su in e e encia con la enzima TPO ( i ope oxidasa), enca gada de media la
inco po ación de iones yodo (I-) a la molécula de i oglobulina (Alexande , 1959). Además, se
ha desc i o que el PTU ac úa como un po en e inhibido de la deionidasa 1 (DIO1) en
mamí e os, siendo sus e ec os nulos pa a las deionidasas 2 y 3 (La sen 1995 Annu Re ).
El PTU se adminis a a los a ones a a és del agua de bebida a una concen ación del
0.1%. Debido al mal sabo que gene a es e compues o, se añade ambién un modi icado de
sabo al 0.2% (Tang®, sabo u as del bosque). Se debe moni o iza el consumo de agua en
los animales a ados pa a asegu a nos que beben can idades de agua adecuadas.
El diseño del expe imen o consis e en induci hipo i oidismo de dis in a du ación (3 días,
6 días y 12 días) a a ios g upos de a ones con sus espec i os con oles. A es os con oles se
les adminis a á agua de bebida con el modi icado de sabo , pe o sin PTU.
Cada g upo se compone de 6 a ones hemb as de 90 días de edad con agua y comida ad
libi um. La inducción del hipo i oidismo se ealiza á en 3 expe imen os independien es: uno
pa a ex acción de ARN y el es udio del ansc ip oma, o o pa a el es udio de p o eínas
median e Wes e n-Blo y, po úl imo, o o pa a inmuno luo escencia que di idi emos, a su ez,
Ma e iales y Mé odos
71
en dos g upos ( a ones no males pa a es udia las células SOX2 y a ones GMO pa a segui
dichas células median e la exp esión de EGFP).
Imagen 10. Esquema de los di e en es expe imen os ealizados a los g upos de a ones a ados con PTU
pa a la inducción del hipo i oidismo
Hay que ene en cuen a que en el expe imen o en el que se u ilizan los a ones Sox2-C e-
ERT2/LoxP-EGFP, además del PTU, debe adminis a se amoxi eno pa a así induci el
mecanismo de la C e-Recombinasa y que las células SOX2 comiencen a exp esa EGFP.
En la imagen 10 se mues a un esquema del diseño expe imen al pa a una mejo
comp ensión del mismo.
PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES Y RECOGIDA DE MUESTRAS Y TEJIDOS
Una ez inalizado el expe imen o en cues ión, los a ones se e i an de la sala de es abulado y
se anes esian ( abla 5) an es de in oduci los en una campana de ex acción pa a comenza el
p oceso de pe usión. Pa a asegu a nos de que los a ones es án bajo los e ec os de anes esia
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
72
p o unda, se u iliza el e lejo palpeb al. El p oceso se ealiza en una campana debido a la
oxicidad de la o malina.
Tabla 5. Componen es u ilizados pa a la p epa ación de anes esia pa a a ón
Componen es
Volumen
S ock
Re e encia
Ke amina (Ke amido )
1mL
100mg/mL
Rich e pha ma
Hid oclo u o de xilacina (Rompun)
250µL
20mg/mL
Baye
Sue o isiológico
6mL
0,9% NaCl
Vi ulia
Los animales se pe unden con 50mL de sue o glucosado al 5% pa a elimina oda la sang e
y que es a no in e ie a con los esul ados debido a su al a asa de au o luo escencia. A
con inuación, se pe unden con o os 50mL de o malina amponada al 10% pa a la ijación de
los ejidos. Dependiendo del amaño del ejido, es e debe á pe manece más o menos iempo en
o malina. En el caso de ejido de i oides de a ón, se deja 24 ho as en es e compues o pa a
comple a el p oceso de ijado.
P epa ación de las mues as pa a inmuno luo escencia
El p ocedimien o de pa a inado es ealizado po el Se icio de His ología del CIMUS y se
desc ibe a con inuación:
Las i oides que es án en una solución de 10% de o malina, se incuban du an e al menos
24h en e anol al 70% y se colocan en dis in os “casse es” debidamen e e ique ados.
Las mues as se incluyen en pa a ina median e el sis ema de Leica TP1020 Semi-
Enclosed Bench op Tissue P ocesso , donde se an mo iendo au omá icamen e las
mues as a dis in as cube as con dis in as soluciones y cuyos pasos son:
! Deshid a ación: 70% e anol (1ho a), 96% e anol (3 incubaciones de 1ho a y media) y
100% e anol (3 incubaciones de 1ho a y media).
! La ado: xileno, 2 incubaciones de 2 ho as.
! In il ación con pa a ina: pa a ina, 2 incubaciones de 2 ho as.
Se e i an los casse es y se o man los bloques de pa a ina usando el EG1150H Modula
Tissue Embedding Cen e . Las mues as pueden se gua dadas a empe a u a ambien e
has a su uso.
Unos minu os an es de p ocede al seccionamien o de la mues a se dispone el bloque
de pa a ina en hielo pa a acili a el co e de la mues a y po lo an o, el man enimien o de
las es uc u as.
Se ealizan secciones de 3-4 µm de g oso y se colocan en un baño a 55ºC.
Po úl imo, es as secciones se mon an en los po aobje os, p ocu ando pone en el
mismo las mues as que se quie an compa a .
La cuan i icación de las imágenes ob enidas de las inmuno luo escencias se ealiza con el
p og ama Fiji-Image J 1.51 y CellP o ile 3.1.9.
P epa ación de mues as pa a el análisis del ARN.
Con los a ones p o undamen e anes esiados, se p ocede a e i a la pa e de la áquea en la que
se localiza la i oides. Se coloca oda la pieza en una lupa binocula y con ayuda de unas
mic o ije as se sepa an los lóbulos i oideos de la áquea. Ambos lóbulos se colocan en un
eppendo con T izol™ (15596026, In i ogen) que p e iamen e es a á en hielo. Pa a la
Ma e iales y Mé odos
73
áquea, se ex ae la mucosa aspando el ejido con ayuda de un bis u í. Las mues as se gua dan
a -20ºC has a su p ocesamien o.
MODELO DE DESARROLLO DE LA TIROIDES
Se inyec ó TAM (0,1 mg/g de peso del a ón) a a ias camadas de a ones Sox2-C e-
ERT2/LoxP-EGFP el día pos na al P1 median e ía subcu ánea, ya que la ca idad pe i oneal es
demasiado pequeña y co emos el iesgo de pincha algún ó gano. Los neona os pe manecen
con sus mad es igual que las camadas no males y, en el momen o del des e e (28 días), se ex ae
un pedazo de cola pa a su geno ipado. Los a ones que no poseen en ninguno de sus alelos la
p o eína ecombinan e SOX2-C e se desca an, ya que no ienen alidez en el expe imen o. Los
indi iduos con los dos genes modi icados (ya desc i o en el apa ado 5.2) se sac i ican a la edad
de 90 días, una ez han alcanzado plena madu ez.
Pa a los con oles de es e expe imen o se u ilizó o o g upo de a ones Sox2-C e-
ERT2/LoxP-EGFP aplicándose el mismo p ocedimien o, pe o es os se sac i ica on a los 2 días
desde el momen o de la inyección con TAM, es deci , en P3 (día 3 desde su nacimien o).
MODELO DE HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL
Los animales ue on anes esiados median e ke amina-xilacina, como ya imos en apa ados
an e io es.
• Una ez anes esiado, el animal se coloca boca a iba sob e la supe icie de una lupa
es e eoscópica (2,5x de aumen os), ajus ando el campo de isión a la zona del cuello.
• Se ealiza una incisión longi udinal en el cuello de unos 2 cm de longi ud y se sepa a la
piel con cuidado. Se coloca un ó ceps pa a man ene la piel abie a.
• Median e un co e e ical se e i an las glándulas submaxila es has a llega al músculo
de la áquea.
• Con ayuda de unas mic opinzas y un bis u í se le an a el músculo aqueal pa a co a lo
longi udinalmen e sin ompe el ca ílago de la áquea, ya que se ía causa de mue e
pa a el animal. El co e de dicho músculo se ealiza únicamen e pa a localiza el lóbulo
de la i oides; una ez ealizado el p ocedimien o, el músculo de la áquea se uel e a
jun a y es e cica iza á sin necesidad de su u a.
• Se localiza el lóbulo de echo de la i oides y se p ocede a e i a lo máximo posible del
mismo con unas mic o ije as.
• Cuando se haya ex aído la mayo pa e posible del lóbulo, se uel en a coloca lo mejo
posible las glándulas submaxila es, se e i a el ó ceps que suje aba la piel y se p ocede
a su u a al animal.
• Pa a una mejo ecupe ación, los animales ya ope ados se alojan en una cama é mica a
37ºC y, una ez despie os, se uel en a es abula en sus espec i as cajas. Du an e la
moni o ización del indi iduo mien as se despie a, se le adminis a desin ec an e e
ibup o eno en pomada pa a e i a posibles in ecciones y mejo a el p oceso de
ecupe ación.
Se adminis a una dosis de TAM po día du an e 5 días consecu i os, dándose la p ime a
dosis en el momen o de inaliza la in e ención qui ú gica, cuando el a ón oda ía es á bajo
los e ec os de la anes esia.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
80
Se ca gan las mues as en el gel con ampón de ca ga 1X (S ock 5X: 50% glice ol, 10% ß-
Me cap oe anol, 0,5% azul de b omo enol, 0,4M T is-HCl pH 6,8 y 10%SDS) has a un
olumen máximo de 20µLpa a el peine de 15 o 18 pocillos y 40µLpa a el peine de 10 pocillos.
El gel se coloca en la cube a con 1L de ampón de elec o o esis 1X (S ock 10X 2L: 60g
T is-Base, 288g de Glicina y 20g SDS) Se p ocede a ealiza la elec o o esis del gel a un
ampe aje cons an e de 15mA du an e 2 ho as y media.
A con inuación, se ealiza la ans e encia del gel a una memb ana (Immun-Blo PVDF
0,2µm, 162-0177, Bio ad) median e el sis ema de ans e encia semiseco (Z34 050-2, Sigma).
Los ampones pa a la ans e encia se p epa an como se indica en la abla 12.
Tabla 12. Tampones pa a la ans e encia de geles SDS-PAGE
Tampones
Reac i os
Pa a 1L
C
0,25M T is
200mL
20% Isop opanol
200mL
Agua des ilada
Has a 1L
B
1,25M T is
20mL
20% Isop opanol
200mL
Agua des ilada
Has a 1L
A
0,4M Ácido 6-aminocap oico en T is 0,25M
100mL
20% Isop opanol
200mL
Agua des ilada
Has a 1L
Se co a 1 memb ana de un amaño de 10x8cm y se incuba en me anol du an e 1 minu o
en agi ación cons an e.
Pa a hid a a la memb ana se incuba du an e 5 minu os en agua en agi ación cons an e.
Se es abiliza en ampón de ans e encia ( ampón B) du an e 5 minu os.
El gel se incuba du an e 3 minu os en ampón A.
Se co an papeles wha man del mismo amaño que la memb ana. Se mojan 3 en ampón
C y se colocan en el sis ema de ans e encia.
Encima de es os, se colocan dos papeles mojados en B, la memb ana, el gel y 4 papeles
mojados en A.
Se cie a co ec amen e el sis ema de ans e encia y se co e a un ol aje cons an e de
0,8mA/cm2 du an e 2 ho as.
Inmunode ección
Una ez inalizada la ans e encia se la a la memb ana du an e 5 minu os en agua
des ilada pa a elimina los es os del gel de ac ilamida y de los ampones.
A con inuación, se bloquea la memb ana du an e 2 ho as a empe a u a ambien e en
agi ación ( abla 13). La solución de bloqueo u ilizada ha de se la misma que la eque ida
po cada an icue po p ima io.

Ma e iales y Mé odos
81
Tabla 13. Soluciones de bloqueo u ilizadas en la inmunode ección
Soluciones
de bloqueo
Reac i os
Re e encias y S ock
I-Block™
2g/L I-Block™
T2015, The mo Fishe Scien i ic
1X TBS
S ock 10X TBS (0,2M T is, 1,37M NaCl). Se ajus a el pH a 7,6.
Se calien a en agi ación sin que llegue a he i has a su comple a disolución
Wes Vision™ Block and
Diluen
Ready o use
SP-7000, Vec o Labo a o ies
Los an icue pos p ima ios u ilizados poseen condiciones especí icas en cuan o al iempo
de incubación, empe a u a de es a y concen ación adecuada en una de las soluciones de
bloqueo p e iamen e desc i as. Así, en la abla 114 se ecogen las di e en es condiciones
pa a cada uno.
Tabla 14. Relación de an icue pos p ima ios u ilizados en la inmunode ección
An icue po
p ima io
Re e encia y
p o eedo
Epi opo
Concen ación
Solución
Incubación
Especie
huesped
SOX2
sc-59730, S a
C uz Bio ech
(SCBT)
To al
1:5000
Wes Vision™
8h a 4ºC y
1h a 25ºC
R
TTF1 (SPT-24)
NCL-L-TTF-1,
Leica
Biosys ems
123aa
(N- e minal)
1:1000
I-Block™
8h a 4ºC y
1h a 25ºC
M
GAPDH (6C5)
CB1001, Me k
Millipo e
To al
1:5000
I-Block™
1h 25ºC
M
ß-Ac ina (AC-74)
A5316, Sigma
To al
1:5000
I-Block™
1h 25ºC
M
Se la a la memb ana 3 eces a in e alos de 5minu os en solución de la ado (1X TBS
y 0,3% Tween20® (P9416, Sigma)).
La memb ana se incuba du an e 1 ho a con el an icue po secunda io especí ico ( abla
15) en la misma solución u ilizada en el bloqueo y en la incubación con el p ima io. El
an icue po secunda io u ilizado iene de e minado po el ipo de huésped en el que se
gene ó el an icue po p ima io y pe mi e de ec a y ampli ica la señal del mismo.
Tabla 15. Relación de an icue pos secunda ios u ilizados en la inmunode ección. La solución en la
que se incuban los secunda ios se á I-Block excep uando las incubaciones con Sox2, en la que el
an icue po secunda io ambién se diluye en Wes Vision™
An icue po Secunda io
Re e encia
Concen ación
Solución
Incubación
Polyclonal Goa An i-Rabbi IgG-HRP
A0545, Sigma
1:10000
I-Block™
1ho a 25ºC
Polyclonal Rabbi An i-Mouse
Inmunoglobulins-HRP
P0260, Dako
1:5000
I-Block™
1ho a 25ºC
Se la a la memb ana 3 eces a in e alos de 5minu os en solución de la ado.
La memb ana se coloca sob e una supe icie lisa y se añade un olumen adecuado de
sus a o quimioluminiscen e Pie ce ECL Wes e n (32106 The mo Scien i ic). Es e
olumen de ECL depende del amaño de la memb ana: 0,125mL de ECL cada cm2 de
memb ana. Los dos eac i os que componen el ECL deben mezcla se en el momen o de su
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
82
uso en p opo ción 1:1; uno de ellos es o o eac i o, po lo que debe p o ege se de la luz
en odo momen o.
Se incuba la memb ana du an e 1 minu o a empe a u a ambien e.
Pa a de ec a la luz emi ida esul an e de la eacción del sus a o con la pe oxidasa, se
coge la memb ana con unas pinzas, se e i a el exceso de ECL y se coloca en un casse e de
au o- adiog a ía.
Se u ilizan películas o og á icas (FUJI Medical X-Ray Film nº8U) y se e elan a
dis in os iempos en unción de la señal ob enida con e elado y ijado en una sala oscu a.
En algunos casos se equie e incuba la misma memb ana con dis in os an icue pos
p ima ios sucesi os, po lo que se ealiza un p ocedimien o que e i a el an icue po an e io sin
al e a la de ección del siguien e:
Se la a la memb ana 4 eces a in e alos de 5minu os en solución de la ado.
En un baño calien e a 55ºC se incuba la memb ana con 25mL de solución de es ipado
(62,5mM T is-HCl pH6,8, 2%SDS y 100mM ß-Me cap oe anol) du an e 30 minu os.
La memb ana se la a 10 eces con solución de la ado en agi ación du an e 30 minu os.
Se p ocede con el bloqueo de la memb ana y la incubación con o o an icue po di e en e,
al e nando siemp e an icue pos de dis in as especies.
INMUNOFLUORESCENCIA E INMUNOHISTOQUÍMICA
Inmuno luo escencia en ejidos de i oides de a ón
Todas las inmuno luo escencias se ealiza on en secciones de ejido de a ón de 4 µm de g oso ,
p e iamen e ijado con o malina e incluido en pa a ina (FFPE) según el p o ocolo u ilizado en
clínica g acias al sis ema EnVision FLEX Sys em (Dako). El mé odo de pe usión de animales
e inclusión de sus ejidos en pa a ina se a ó en el apa ado de “expe imen os in i o”.
Cuando los co es del ejido se han colocado en el po aobje os, se p ocede al despa a inado
del mismo. Es o se ealiza colocando la mues a en una es u a a 37 ºC du an e al menos una
ho a. Debido a que la pa a ina es un compues o hid ó obo, el ejido p e iamen e se iene que
deshid a a y, una ez despa a inado, ol e a ehid a a se. Los p ocesos de deshid a ación y
ehid a ación de las mues as se ealizan sume giendo el ejido en concen aciones cada ez
mayo es o meno es de alcohol, espec i amen e.
Una ez inalizado el p oceso de ecupe ación an igénica median e PTLink (DAKO,
Agilen ) y en ampón TE (T is-EDTA), las mues as se la an con PBS pa a elimina cualquie
es o de pa a ina que oda ía pudie an con ene . A con inuación, las mues as se incuban en
una cáma a húmeda a 4ºC du an e 8 ho as con el an icue po p ima io co espondien e. En la
siguien e abla se ecogen los di e en es an icue pos u ilizados en el abajo, así como sus
espec i as concen aciones y ampones u ilizados pa a su incubación ( abla 16).
Tabla 16. An icue pos p ima ios u ilizados en las inmuno luo escencias
An icue po p ima io
Re e encia y
p o eedo
Especie
Incubación
Tejido
Cul i o
SOX2
Se en-Hills
Bio eagen s
R
1:1000
50% NHS
8h 4ºC
1:2000
20% NHS
8h 4 ºC
GFP
A esLab, GFP-1010
C
1:1500
20% NHS
8h 4 ºC
TTF1 (SPT-24)
CB1001, Me k
Millipo e
M
1:500
8h 4 ºC
1:200
8h 4 ºC
Ma e iales y Mé odos
83
An icue po p ima io
Re e encia y
p o eedo
Especie
Incubación
Tejido
Cul i o
PAX8 (MRQ-50)
363M, Cell-Ma que
M
1:200
8h 4 ºC
1:100
8h 4 ºC
Ti oglobulina
GA509, Agilen DAKO
R
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
NIS
HPA049055, Me k
R
1:300
8h 4 ºC
AECK (Ci oke a inas
o ales)
M3515, Agilen DAKO
M
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
p63
IR662 , Agilen DAKO
M
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
ß-ca enina
GA70261
M
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
E-cadhe ina
GA05961
M
R u
8h 4 ºC ó 1h RT
Una ez acabada la incubación con el an icue po p ima io, las mues as se la an con PBS
du an e 5 min 3 eces pa a e i a el exceso de an icue po y a con inuación de incuban con el
an icue po secunda io. Después de ealizan o os 3 la ados con PBS, se añade medio de
mon aje (Fluo o-Gel, 17985-10, Elec on mic oscopy Sciences) con 2mg/mL de DAPI (D9542,
Sigma) y se mon a el cub eobje os.
La mayo ía de las imágenes de las mues as se ob ienen con el mic oscopio con ocal Leica
TC SP5-AOBS. En los casos es an es, se ob ienen con el mic oscopio de luo escencia
Olympus IX51/U-RFL-T/TH4-200 acoplado a la cáma a Olympus DP72.
Inmuno luo escencia en cul i o.
El p o ocolo lle ado a cabo es simila an o pa a los cul i os celula es de i oides humano como
pa a los cul i os de i os e as y su pos e io di e enciación.
Se e i a el medio de cul i o a las células y se la an con PBS.
Se añade o malina al 5% diluída en PBS y se deja a empe a u a ambien e 20 min.
3 la ados con PBS de 5 min cada uno.
Se incuba con PBS + T i on™ X-100 0,1% du an e 1h.
3 la ados con PBS de 5 min cada uno.
Incubación con el an icue po p ima io.
3 la ados con PBS de 5 min cada uno.
Incubación con el an icue po secunda io.
La ado y mon aje de la mues a.
En la abla 17 se ecogen los an icue pos secunda ios u ilizados en ambos mé odos. Cabe
des aca que siemp e se u ilizan an icue pos p eabso bidos F(ab’)2: en ellos, se ealiza una
diges ión enzimá ica p e ia pa a elimina pa e de la acción cons an e del an icue po. De es a
mane a, el an icue po es mucho más pequeño que el o iginal sin pe de p opiedades de adhesión
a su an ígeno (ya que la acción que econoce el epí opo no se oca), po lo que aumen a su
capacidad de pene ación.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
84
Tabla 17. An icue pos secunda ios u ilizados pa a inmuno luo escencia
An icue po secunda io
Re e encia y
p o eedo
Incubación (diluidos en
PBS)
Tejido
Cul i o
Alexa Fluo ® 488 A iniPu e F(ab')2 F agmen
Donkey An i- Mouse IgG (H+L)
Jackson
ImmunoResea ch,
715-546-151
1:1000
1h RT
1:600
1h RT
Cy™3 A iniPu e F(ab')2 F agmen Donkey An i-
Rabbi IgG (H+L)
Jackson
ImmunoResea ch,
711-166-152
1:1000
1h RT
1:600
1h RT
Alexa Fluo ® 488 A iniPu e F(ab')2 F agmen
Donkey An i- Chicken IgY (IgG) (H+L)
Jackson
ImmunoResea ch,
703-546-155
1:1000
1h RT
1:600
1h RT
Alexa Fluo ® 647 A iniPu e F(ab')2 F agmen
Donkey An i- Mouse IgG (H+L)
Jackson
ImmunoResea ch,
715-606-150
1:1000
1h RT
1:600
1h RT
Inmunohis oquímica en ejido de i oides de a ón
Las mues as se despa a inan y se les ealiza el p e a amien o con el PTLink (DAKO,
Agilen ) de la misma mane a que las inmuno luo escencias.
Las mues as se la an una ez con PBS y se bloquean con pe oxidasa al 3% du an e 10
minu os.
3 la ados du an e 5 minu os con PBS.
Incubación con an icue po p ima io 30 minu os a empe a u a ambien e (RT).
Las mues as se la an una ez con PBS.
Incubación con el mismo an icue po secunda io (Agilen , DAKO EnVision™ Sys em,
HRP) du an e 30 minu os a empe a u a ambien e.
Se la an las mues as con PBS.
Re elado de mues as con DAB (3,3-Diaminobencidina).
A con inuación, se con a iñe con Hema oxilina de Maye du an e 10 minu os.
Po úl imo, se deshid a an las mues as y se ealiza el mon aje de es as.
§ Es e p oceso es álido únicamen e cuando se u ilizan an icue pos de
a ón o conejo, ya que el an icue po secunda io solo econoce es as dos
inmunoglobulinas. Pa a la inción con el an icue po de Sox2 p oceden e
de cab a, se añade un paso más: se u iliza un an icue po Conejo-
an iCab a que econoce á el an icue po de Sox2 y, a su ez, pod á se
econocido po el an icue po secunda io IgG an i-conejo/ a ón (Agilen ,
DAKO EnVision™ Sys em, HRP), conjugado con un políme o ma cado
con pe oxidasa.
Tabla 18. An icue pos p ima ios u ilizados en las inmunohis oquímicas
An icue po p ima io
Re e encia y
p o eedo
Especie
Sox2
Se en-Hills Bio eagen s
R
Sox2
A esLab, GFP-1010
C
GFP
Abcam, ab6556
R
Ma e iales y Mé odos
85
Inmuno luo escencia con el uso de TSAs (Ty amide Signal Ampli ica ion)
Es a écnica se basa en los abajos p e ios de nues o g upo en mic oscopía con ocal128,129 y
de los g upos de Mezey, que p opuso la u ilización de mic oondas po p ime a ez250, y de
Gin y y S ack que u iliza on la écnica pa a colocaliza REa (Recep o de Es ógenos al a) y
RA (Recep o de And ógenos) en es ículo o cánce de mama po mic oscopía óp ica,
espec i amen e251,252. En ellos se in en a la inmuno luo escencia múl iple u ilizando di e en es
an icue pos secunda ios o u ilizando secunda ios no alidados clínicamen e. En nues a écnica,
las secciones ue on some idas a una écnica de doble inmuno luo escencia en ciclos, usando
siemp e el mismo an icue po secunda io alidado clínicamen e, lo que supone una
modi icación sob e las écnicas habi uales de inción. La doble inción se ealizó sob e la misma
sección de ejido despa a inada, incubando en ciclos sucesi os con los dis in os an icue pos
p ima ios y el mismo secunda io, odos ellos clínicamen e alidados. El ma caje se hizo
median e Ty amide Signal Ampli ica ion (TSAs), moléculas sus a o de la enzima HRP con la
que es á ma cado el an icue po secunda io. HRP une co alen emen e TSA a la cadena la e al
del aminoácido i osina253,254. De es a o ma, se o man aduc os co alen es O-O` de i osina
que esis en calo y pH, al con a io que los enlaces iónicos ca ac e ís icos de las uniones de los
an icue pos. T as cada ciclo de ma caje se ealiza un paso de desna u alización median e calo
y pH250. Es o libe a los an icue pos unidos median e enlace iónico, pe o man iene las TSAs
unidas co alen emen e a las p o eínas.
En nues o caso, solo u ilizamos es a écnica pa a localiza las células Sox2 posi i as y
células p oduc o as de Calci onina en la misma sección de ejido. Debido a que los dos
an icue pos uncionan pe ec amen e po sepa ado (la Calci onina, de hecho, es á alidada
clínicamen e), decidimos u iliza los jun os median e la écnica de TSAs (ya que los dos
an icue pos p oceden de conejo y no pod íamos hace una inmuno luo escencia no mal).
El p o ocolo es simila al u ilizado pa a las inmunohis oquímicas, pe o se modi ica a pa i
de la adición del an icue po secunda io:
Después de incuba con el an icue po secunda io conjugado con HRP, se ealizan dos
la ados de 5 minu os con TBS 1X + 0,1% Tween20.
Incuba 5 minu os con TSA Fluo escein (NEL760001KT, Pe kin Elme , Wal ham)
1:200 diluido en 1X plus Ampli ica ion Diluen (Pe kin Elme , Wal ham) a empe a u a
ambien e du an e 5 min. Aquí se es á ealizando el ma caje de Calci onina, ya que ue
el p ime an icue po u ilizado.
T es la ados de 5 minu os con TBS 1X + 0,1% Tween20.
Coloca los po aobje os sob e el ondo de un ecipien e de plás ico (12x9x6 cm)
(To h e al, 2007) lleno con 200 ml de ampón TE 10 mM, pH 9.0. Calen a en el
mic oondas (700W) du an e 2 min 25 seg al 100% de po encia, has a lle a al pun o
de ebullición, pe o sin he i . Inmedia amen e, baja la po encia al 20% du an e 15
min. Deja en ia en el ampón du an e 30 min a empe a u a ambien e.
Se epi en odos los pasos exac amen e igual, u ilizando el segundo an icue po, en
nues o caso Sox2. Se añade TSA Cyanine 3 (NEL760001KT o NEL744001KT,
Pe kin Elme , Wal ham) 1:200 diluida en 1X plus Ampli ica ion Diluen (Pe kin
Elme , Wal ham) a empe a u a ambien e du an e 5 min.
ELISA
Se ealizó un ELISA pa a de e mina la can idad de ho mona T4 lib e en el sue o de a ones
a ados pa a hipo i oidismo a di e en es días, con sus espec i os con oles.
El p o ocolo u ilizado ue el desc i o po el p o eedo sal o una a iación: se incuba on
los pocillos p e a ados de la placa del ELISA con los sue os de los a ones media ho a an es

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
86
de empeza el p o ocolo. Es o acili a que las p o eínas que ienen que se de ec adas engas
más opo unidad de en a den o de la cu a.
MICROSCOPÍA
Hay que acla a que odas las o og a ías mos adas de inmuno luo escencia ue on omadas
con mic oscopía con ocal, a excepción de la di e enciación de i os e as, que no ue posible.
Es as úl imas, jun o con las o os de inmunohis oquímica, se adqui ie on con mic oscopía
óp ica. Los ideos de ejidos en 3D que se mos a án en la p esen ación ue on adqui idos
median e mic oscopía ligh -shee .
Mic oscopía óp ica
Se u ilizó un mic oscopio Olympus IX70/IX51, con obje i os de 20X y 40X. El so wa e
u ilizado ue CellSense® 1.6.
Mic oscopía con ocal
Pa a la adquisición de imágenes cin es a écnica se u ilizó un mic oscopio con ocal de
banda ancha (Leica TC SP5-AOBS) con láse blanco (470-670 nm) y láse ul a iole a, a a és
del obje i o seco 20X y a a és del obje i o 63X oil con 1,4 de ape u a numé ica. El so wa e
pa a el a amien o de imágenes ue el LAS AF (Leica Applica ion Sui e Ad anced
Fluo escence), donde se omaban planos se iados de 0,5 µm de o ma secuencial bidi eccional.
En la siguien e abla se ecogen los di e en es canales u ilizados con sus espec i as
ca ac e ís icas.
Tabla 19. Ca ac e ís icas de cada canal u ilizado en mic oscopía con ocal.
Canal
Fluo ó o o
λEx (nm)
λEm (Rang, nm)
Pasadas(Line/F ame a e age)
Ch01
DAPI
405
414-479
2/2
Ch02
Alexa Fluo 488
492
499-547
4/3
Ch03
Cyanine 3
552
565-624
3/2
Ch04
Cyanine 5
594
609-648
2/2
Ch05
T ansiluminación DIC
(Di e en ial in e e ence con as )
Mic oscopía Ligh -Shee
Es e ipo de mic oscopía se basa en la adquisición de imágenes 3D de un ó gano en e o o
una pa e de es e g acias a la p oyección de seis hojas de luz que inciden sob e la mues a, es
a cada lado. Median e una cáma a de al a esolución sCMOS localizada pe pe dicula men e a
las hojas de luz y mo iendo la mues a a a és de dichas hojas, se gene an las imágenes 3D
que se ían imposibles median e mic oscopía con ocal debido a su baja capacidad de pene ación
en la mues a. El mic oscopio u ilizado en es e abajo ue el Ligh -Shee Ul amic oscope II
(Mil enyi), con una con igu ación de obje i o 2X (Olympus MVPLAPO) combinado con un
único zoop óp ico (Olympus MVX-10 zoom) y una cáma a CMOS (Ando Neo NEOCM).
Hay que des aca que pa a u iliza es a ecnología se debe cla i ica la mues a p e iamen e,
es deci , hace la anspa en e. Pa a ello se pueden u iliza di e en es écnicas basadas en
mé odos acuosos u o gánicos; la u ilización de uno u o o depende á del ipo de
inmuno luo escencia que se quie a ealiza en el ejido o del g ado de conse ación de las
es uc u as que lo componen255,256.
Ma e iales y Mé odos
87
Después de ealiza muchas p uebas con di e en es mé odos de cla i icación, an o acuosos
como o gánicos, nos decan amos po uno de los mé odos o gánicos que, además, se p oduce de
mane a come cial, e i ando así posibles p oblemas que puedan ene o os p o ocolos que no
es án an es anda izados. Los componen es es án basados en un compues o come cial llamado
VISIKOL®. El p o ocolo pa a ealiza el p ocedimien o de cla i icado se ob iene de la página
web www. isikol.com, donde dependiendo del ó gano, de la especie y del amaño del mismo,
la página e gene a un p o ocolo indi idualizado que a noso os, pe sonalmen e, nos uncionó
bas an e bien.
Así, el p o ocolo u ilizado po noso os ue el siguien e:
• P epa ación de la mues a:
o E anol 50% - 30 min.
o E anol 25% - 30 min.
o E anol 10% - 30 min
o PBS – 1 ho a (x2)
o Pe meabili a ion bu e (VISIKOL) – 90 min.
o PBS – O/N (o e nigh )
• Pe meabilización
o PBS – 30 min.
o Me anol 50%/PBS – 45 min.
o Me anol 70%/dH2O – 45 min.
o Me anol 100% - 2 h.
o Me anol 80%/DMSO – 1 h (x2)
o Me anol 80%/ dH2O – 45 min.
o Me anol 50%/PBS – 45 min
o PBS – 30 min (x2)
o PBS/1%T i onX-100 – 45 min (x2)
o Tampón de pe meabilización(1)
• Tinción
o Tampón de bloqueo(2)
o An icue po p ima io* [1:100] (diluído en ampón de an icue pos(3)) – 3 días
o Tampón de la ado(4)
o An icue po secunda io* [1:600] (diluído en ampón de an icue pos) – 3 días
• Cla i icado
o Me anol 50%/PBS
o Me anol 70%/PBS
o Me anol 100%
o Visikol-HISTO™
o Visikol-HISTO2™ (conse a aquí la mues a inde inidamen e)
(1)PBS/0,2% T i onX-100/0,3M Glicina/20% DMSO
(2) PBS/0,2% T i onX-100/6% NHS (No mal Ho se Se um)/10%DMSO
(3)PBS/0,2% Tween®20/Hepa ina 10µg/µL/ 3% NHS/5% DMSO
(4)PBS/0,2 Tween®20/Hepa ina 10µg/µL
*Los An icue pos ue on los mismos que se u iliza on pa a las inmuno luo escencias
( abbi SOX2 – Se en Hills) (Donkey an iRabbi Cy™3 – Jackson ImmunoResea ch), ya ci ados
en la Tabla 16 y 17
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
88
4 ESTUDIOS DE ADN
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE CULTIVO/TEJIDO
Pa a la ex acción de ADN de los cul i os celula es p ima ios de i oides se u iliza el ki DNeasy
blood & issue ki 50 (Ca .69504, QIAGEN). En el caso de ejidos, el ki u ilizado es Allp ep
DNA/RNA Mini ki 50 (Ca . 80204, QIAGEN).
Pa a la cuan i icación an o de ejido como de cul i o celula el ki u ilizado ue el
Quan i ile TM Human DNA Quan i ica ion Ki (Ca .4343895, The mo Fishe Scien i ic). A
con inuación, dicha cuan i icación se mide con el equipo 7500 Real-Time PCR Sys em
(Applied Biosys ems).
GENOTIPADO DE RATONES
Ex acción de ADN
Se p epa an 200 mL pa a hace el s ock de ail bu e a pa i de los componen es e e idos en
la abla 19. Tabla 20. Componen es pa a la p epa ación del
ail bu e
Reac i os
ail bu e
Re e encia
4mL de NaCl 5M
S9888, Sigma
2mL T is 1M pH 9,5
---
400µL EDTA 0,5M pH8
E9884, Sigma
20 mL SDS 10%
L4509, Sigma
Se añade agua miliQ has a un olumen inal de 200mL
Añadimos en el eppendo que con iene la cola del a ón que se quie e geno ipa 150µL de
ail bu e y o os 5µL de P o einasa K (EO0491, The mo Scien i ic).
Se coloca la mezcla en el e moblock a 55ºC, has a que la cola es é comple amen e
deshecha. A con inuación, se cen i ugan du an e 5 minu os a 2000 pm.
Se ecoge 90 µL de sob enadan e y se desca a lo demás. Se añade a dicho sob enadan e el
doble de e anol absolu o ío (en es e caso, 180 µL). A con inuación, se cen i ugan du an e 5
minu os a 10000 pm.
Se decan a el sob enadan e a mano ya que el p ecipi ado de ADN queda á adhe ido al
ondo del eppendo . Se deja seca unos 10 minu os.
Se añaden 50µL de agua miliQ y se aplica un ó ex. Pa a la ealización de la PCR se usa á
1µL.
5 ESTUDIOS DE ARN
EXTRACCIÓN ARN
La ex acción de ARN de ejidos humanos se ealiza median e el ki Allp ep DNA/RNA Mini
ki 50 (Ca . 80204, QIAGEN).
Pa a la ex acción de ARN de cul i os p ima ios humanos se usa TRIzol™ (15596026,
In i ogen) y se siguen las indicaciones desc i as po el p o eedo . El RNA ob enido se a a
con 1U de DNasaI lib e de RNAasas (EN0521, The mo Fishe ) du an e 30 min a 37 ºC. Después
se pu i ica median e el ki GeneJET RNA Cleanup and Concen a ion Mic o ki (K0842,
The mo Fishe ).
Ma e iales y Mé odos
89
Pa a la ex acción de ARN a pa i de ejidos o cul i os de a ón ambién se usa TRIzol,
pe o el ARN ob enido no se pu i ica, ya que debido a la pequeña can idad de células no es
posible alcanza un endimien o adecuado de la columna.
Una ez ex aído, se de e mina la can idad de ARN p esen e en la mues a y se p ocede a
su cuan i icación con la ayuda de un espec o o óme o (Nanod op 2000, The mo Fishe ) ( a io
deseable A260/280=2-2,2).
SÍNTESIS DE ADNC A PARTIR DE ARN MEDIANTE RETROTRANSCRIPCIÓN.
En p ime luga , hacemos un p e a amien o de la mues a con ADNasa (es independien e del
p ime p e a amien o desc i o más a iba; es o se ealiza pa a asegu a nos que el ADN queda
o almen e eliminado:
Se incuba 1µg de ARN o al con 1 U de ADNasaI lib e de ARNasas (EN0521, The mo
Fishe ), 1µL de ampón 10X con MgCl2 y agua has a un olumen inal de 10µL a 37ºC
du an e 30 minu os.
Pa a inac i a la ADNasaI se añade 1µL de EDTA y se incuba a 65ºC du an e 10
minu os en un e moblock.
La sín esis de ADN complemen a io (ADNc) se ealiza median e una ansc ipción in e sa
(RT-PCR) del ARN de pa ida:
Se añaden 1,5µL de 10mM dNTPs, 0,1 µL de cebado es alea o ios y agua des ilada
has a un olumen inal de 30µL.
Se incuba du an e 10 minu os a 65ºC.
Se añaden 6µl del ampón 5X Fi s -S and, 3 µL
de 0,1M DTT, 1µL de RNaseOUT™
Recombinan Ribonuclease Inhibi o (40 U/µL) y se incuba a 37ºC du an e 2 minu os.
Se añaden 1,5µL de 300 UI MMLV (28025-013, In i ogen, USA).
En un e mociclado se aplica el p o ocolo desc i o en la abla 20.
Tabla 21. P o ocolo u ilizado pa a la RT-PCR
Tempe a u a (ºC)
Tiempo
25
10 min
37
50 min
42
30 min
95
5 min
PCR CUANTITATIVA
Pa a cuan i ica la exp esión de ARN una ez sin e izado el ADNc, se ealiza una PCR
cuan i a i a (qPCR); las can idades de eac i os a ían dependiendo de si los cebado es son
come ciales, diseñados po el g upo o cebado es B illian III Ul a-Fas SYBR Mas e Mix
(600882, Agilen Technologies) alidados p e iamen e ( abla 21).
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
96
Figu a 1. La exp esión del ARNm de
Sox2
pe o no de
Tsh
se inc emen a as la pube ad en la glándula
i oides de a ones hemb as, pe o no de machos. Exp esión del ARNm de Sox2 (A, C) y Tsh (B, D) en hemb as
y machos a 15, 30, 60 y 90 días. Se u ilizó el epi elio de la áquea como con ol posi i o de la exp esión de Sox2.
A) Exp esión de Sox2 en la i oides de a ones de di e en es edades. Izquie da: a ones hemb as de 15, 30, 60 y
90 días. De echa: a ones machos de 30, 60 y 90 días. B) Exp esión de Tsh en los mismos g upos de edad. C)
Compa ación de la exp esión de Sox2 en e sexos en g upos de la misma edad. D) Compa ación de la exp esión
de Tsh en e sexos en g upos de la misma edad. En las g á icas se ep esen an la media±el e o es ánda de
Taqman qRT-PCR con un amaño mues al (n) mos ado encima de cada ba a. Se u iliza un es de K uskal-Wallis
pa a los apa ados A y C; y un es de Mann-Whi ney pa a los apa ados B y D; *p≤0,05, **p≤0,01 y ***p≤0,001.
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE SOX2
Exp esión de Sox2 median e Wes e n-Blo en a ones
No siemp e las di e encias encon adas en la cuan i icación del ARNm de un gen coinciden
con la de la exp esión de su p o eína en un ejido. Pa a comp oba los esul ados ob enidos en
el apa ado an e io , cuan i icamos la exp esión de la p o eína o al de SOX2 en a ones
indi iduales de ambos sexos a dos edades dis in as median e wes e n blo (Figu a 2). Como se
puede obse a , la p o eína SOX2 se de ec a al peso co ec o median e compa ación con el
epi elio de la áquea, omado como con ol posi i o po su abundancia (Figu a 2A). El wes e n
se ehib idó pa a ß-ac ina, una p o eína de ci oesquele o omada como con ol de ca ga en cada
calle. Cuan i icamos la exp esión ela i a de SOX2 (Figu a 2B). Pudimos obse a cómo SOX2
es signi ica i amen e más abundan e en i oides de a ones hemb as compa adas con machos
de la misma edad. Lo más des acado es que el esul ado en adul os (90 días) con i ma el
esul ado ob enido pa a el ARNm.
0
10
20
160
200
DmRNA/Tbp
n=5
n=4 n=4 n=9
n=6
n=6
Hemb as Machos
15 30 60 90 30 60 90
2x
n=7
*
*
Sox2
Ti oidesT áquea
Días
0
1
2
3
4
DmRNA/Tbp
n=4
n=9
30 días
ns
0
1
2
3
4
5
DmRNA/Tbp
n=5
n=3 n=4
n=6
n=9 n=5
n=6
Hemb as Machos
15 30 60 90 30 60 90
Días
2x
Tsh
Ti oidesT áquea
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
DmRNA/Tbp
n=3 n=9
30 días
ns
0
5
10
15
DmRNA/Tbp
n=4
n=6
60 días
ns
Sox2
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
DmRNA/Tbp
n=4 n=5
60 días
ns
Tsh
0
5
10
15
20
25
DmRNA/Tbp
n=7
n=6
90 días
**
macho
hemb a
0
1
2
3
4
DmRNA/Tbp
n=6
n=6
90 días
macho
hemb a
ns
A B
C
D

Resul ados
97
Figu a 2. La exp esión de la p o eína SOX2 en la glándula i oides es signi ica i amen e mayo en a ones
hemb as que en machos. Exp esión de p o eínas en a ones indi iduales machos y hemb as de 30 y 60 días. El
epi elio de la áquea se u ilizó como con ol posi i o. A) Wes e n blo pa a SOX2 y la p o eína de ci oesquele o
a- ubulina. B) Cuan i icación de la exp esión especí ica de SOX2 en i oides compa ando el g upo de hemb as y
machos a cada una de las dos edades. Se ep esen a la media±el e o es ánda de la in ensidad de las bandas a
pa i del wes e n blo , con un amaño mues al (n) mos ado encima de cada ba a. Se u iliza un es de Mann-
Whi ney. *p≤0,05.
En conjun o, nues os esul ados pod ían suge i que las hemb as adul as pod ían ene más
población celula SOX2+ que los machos adul os. Es o pod ía es a elacionado con unos
mayo es eque imien os uncionales de la i oides en el sexo emenino inducidos bien po
ac o es ho monales o gené icos, como ha sido desc i o p e iamen e en humanos270,271,272. A
pa i de ese momen o, y sabiendo la impo ancia del sexo en la pa ología hipe p oli e a i a
benigna y maligna de la i oides, ealizamos nues os siguien es expe imen os
undamen almen e en hemb as.
Es anda ización de la inción de secciones de ejido de a ón hemb a de 90 días
po IHQ con di e en es an icue pos de Sox2
Nues o siguien e paso ue localiza qué células exp esaban SOX2 en la glándula i oides
pa a e dónde se localizaban y cómo se disponían en el ejido. Median e écnicas de
inmunohis oquímica en secciones de ejido ijado y pa a inado (Fo malin- ixed Pa a in-
embedded, FFPE) ealizamos una p ime a es anda ización de la inción de SOX2 en la i oides
de a ones, un ejido que al ene coloide lleno de i oglobulina glicosilada p o oca cie os
p oblemas écnicos en la de ección de p o eínas.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
98
Pa a ello u ilizamos dos an icue pos an i-SOX2: uno p oceden e de conejo y o o de cab a.
Con ambos an icue pos obse amos una inción nuclea cla a del epi elio de la áquea, omado
como con ol posi i o (Figu a 3A, as e iscos). En la i oides, la inción no ue an abundan e ni
in ensa. Sin emba go, con ambos an icue pos obse amos una inción especí ica de células
indi iduales que es aban si uadas po el ex e io de los olículos, y algunas en ín imo con ac o
con el epi elio olicula (Figu a 3B). Con ambos an icue pos u imos el mismo esul ado
(compa a en la Figu a 3B, la de echa con la izquie da).
Figu a 3. Las células SOX2+ son dis in as al epi elio olicula , pe o es án ín imamen e asociadas con és e.
Inmunohis oquímica en a ones hemb a de 90 días (ma ón) con a eñido con hema oxilina diluida pa a e ela
los núcleos (azul). Se u iliza on dos an icue pos de SOX2 de dis in a especie: conejo ( SOX2) y cab a (gSOX2). A)
Las secciones de áquea (as e iscos) mues an que el epi elio es comple amen e posi i o, con una inción
nuclea , pa a SOX2 con el an icue po SOX2 (izquie da) y con el an icue po gSOX2 (de echa). En la i oides no se
de ec a inción en el epi elio olicula . B) En las secciones de i oides, a mayo aumen o, se obse a el ma caje
posi i o con ambos an icue pos de células Sox2 (señaladas con as e iscos); es as células se disponen no malmen e
en la zona in e olicula .
Resul ados
99
Aunque an o el an icue po de cab a273,274 como el de conejo275,276 es án ci ados en li e a u a
y ambos son álidos pa a es as écnicas, nos decan amos po es e úl imo debido a que en la
inción con el an icue po de cab a apa ecía señal di usa de mane a inespecí ica en pa es de
es os de sang e en asos sanguíneos, e incluso a eces se unía al coloide (no mos ado), dando
una señal de ondo moles a que con el an icue po de conejo no eníamos. Es o no pasaba cuando
incubábamos con el an icue po secunda io sólo, po lo que dedujimos que e a backg ound
p o enien e del goa -an i-SOX2.
Colocalización de di e en es ma cado es en las células Sox2 posi i as en
a ones hemb as de 90 días.
Pa a ca ac e iza las células SOX2 encon adas es udiamos ma cado es que pudie an
coexp esa se con SOX2 median e inciones dobles po inmuno luo escencia. U ilizamos el
an icue po de SOX2 jun o con ma cado es de ipo celula ( ilamen os in e medios), eno ipo de
epi elio endoc ino de la i oides y o os ma cado es ípicos ya desc i os en poblaciones de
células mad e de o os ó ganos.
Nues a p ime a inción ue iden i ica el ipo celula de la población SOX2. La
colocalización con ci oke a inas ue de ini o ia, como se pudo obse a al eñi con AECK, una
mezcla de dos an icue pos (AE1 y AE3) que de ec a muchos ipos de que a inas. El an icue po
AE1 de ec a ci oke a inas de la sub amilia A (CK10, CK13, CK14, CK15, CK16 y CK19); el
an icue po AE3 de ec a ci oke a inas de la sub amilia B (CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6,
CK7 y CK8) (Figu a 4A). Obse amos que el epi elio olicula es posi i o pa a ci oke a inas,
como se espe a ya que es epi elial, pe o en las células SOX2 se colocalizan ambas inciones
demos ando que la población SOX2 es epi elial. La in ensidad del ma caje es mayo en las
células SOX2 compa ada a las células olicula es, aunque puede habe di e encias de amaño
en e las dos poblaciones celula es que o iginen una di e encia apa en e.
En es a ca ac e ización inicial es udiamos la colocalización con o as p o eínas asociadas
a la memb ana plasmá ica como son ß-ca enina y E-Cadhe ina. La ß-ca enina es una p o eína
asociada a la ca a ci oplasmá ica de la memb ana, mien as que E-Cadhe ina es una p o eína
ansmemb ana donde se anclan los ilamen os del ci oesquele o pa a o ma uniones en e
células epi eliales como desmosomas y bandas de adhesión. En esul ados an e io es de nues o
p opio g upo, demos amos que las células mad e GPS de la hipó isis co-exp esan de o ma
in ensa ambas p o eínas128,129. Las células SOX2 exp esaban ß-ca enina, que odeaba el ma caje
nuclea (Figu a 4B). Ninguno de es os ma cajes colocalizaba subcelula men e, pues o que
SOX2 e a nuclea , y las o as dos p o eínas es án elacionadas con la memb ana plasmá ica.
Pe o pudimos obse a alguna célula con núcleo SOX2 posi i o comple amen e odeada de b-
ca enina. Las células SOX2 colocaliza on con E-Cadhe ina, aunque es e ma cado se exp esaba
de o ma poco in ensa en compa ación con su exp esión ue e en el epi elio olicula , nega i o
pa a SOX2 (Figu a 4C).
El siguien e paso ue eñi pa a los dos ac o es de ansc ipción de eno ipo i oideo, TTF1
y PAX8, que colocalizan en el epi elio olicula desde el desa ollo emb iona io. Las células
SOX2 posi i as lo e an ambién pa a TTF1, aunque con mucha menos in ensidad que el epi elio
olicula i oideo (Figu a 5A-B). Noso os de inimos es as células a pa i de aho a como
SOX2+/TTF1low pa i de aho a. Es as células SOX2+/TTF1low e an nega i as pa a PAX8
(Figu a 5C-D).
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
100
Figu a 4. Las células SOX2 exp esan ci oke a inas,
b
-Ca enina y E-Cade ina. Inmuno luo escencias dobles
es udiadas con mic oscopía con ocal pa a iden i ica a las células Sox2 posi i as (ma caje nuclea , ojo) en e
a las p o eínas asociadas a la memb ana (ma caje ci oplasmá ico, e de). A) SOX2 colocaliza con ci oke a inas
que ambién se exp esan en el epi elio olicula . La inción pa ece más in ensa en las células SOX2. B) Las células
SOX2+ coexp esan ß-ca enina que odea el ma caje nuclea . C) SOX2 colocalizan con E-cadhe ina, aunque no la
sob eexp esan como ocu ía en el caso de ci oke a inas, y el ma caje pa ece más in enso en el epi elio olicula .
Resul ados
101
Figu a 7 (pa e 2)
Figu a 4 (pa e 2)

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
102
Figu a 5. Inmuno luo escencia pa a es udia la colocalización de SOX2 con los ac o es de ansc ipción
ca ac e ís icos de epi elio olicula . A) Las células SOX2+ co-exp esan el ac o de ansc ipción TTF1
ca ac e ís ico de i oides. Es e ma caje siemp e es más débil que las demás células que componen el ejido,
ca alogadas po noso os como “Sox2+TTF1low” e indicadas con lechas. B) Campo a meno aumen o pa a da una
isión global de es e esul ado en el lóbulo i oideo. C) Las células Sox2+ son nega i as pa a PAX8, aunque las
células del epi elio olicula de la glándula son PAX8+, algunas con más in ensidad que o as po azones de la
sección. D) O o campo dis in o en o o lóbulo i oideo demos ando de nue o que las células SOX2 no exp esan
PAX8.
Resul ados
103
Figu a 5 (pa e 2)
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
104
En la glándula i oides hay dos poblaciones epi eliales endoc inas, el epi elio olicula
sec e o de ho monas i oideas de o igen endodé mico y las células C p oduc o as de
Calci onina cuyo o igen emb iona io es apa en emen e la c es a neu al según expe imen os
clásicos en emb ión de pollo277, aunque hay cie o deba e sob e ello con expe imen os más
ecien es p oponiendo que su o igen emb iona io es endodé mico278,279. Nues o siguien e paso
ue es udia si las células SOX2 e an células C. Como se puede obse a en la Figu a 6, ninguno
de los campos o og a iados p esen ó co-localización en e Calci onina y SOX2. Se puede
obse a además que las zonas de la i oides donde hay abundancia de células C ienen pocas
células SOX2, y ice e sa.
p63 es una p o eína nuclea que en epi elios glandula es exoc inos se exp esa en células
basales, que son las células mad e (po ejemplo, p ós a a o mama). También, en el epi elio de
ías aé eas las células p63 se conside an las células mad e desde la época emb iona ia, más
es ingidas en su po encialidad as el nacimien o280,281. En la i oides, p63 es el ma caje
encon ado en los llamados “nidos sólidos” en i oides humano que se p opusie on como
ag upaciones de células mad e de i oides282,283,284. En la base de da os Human P o ein A las,
es an icue pos alidados pa a inción en FFPE de i oides humano, de ec aban p63 en mayo
o meno po cen aje de células (desde <25% has a >75%)
(h ps://www.p o eina las.o g/ENSG00000073282-TP63/ issue/ hy oid+gland).
Nues o esul ado ue muy in e esan e. p63 mos ó un ma caje nuclea abundan e en el
epi elio olicula i oideo nega i o pa a SOX2 (Figu a 7). Pe o en e la población SOX2
pudimos obse a una sub-población donde SOX2 y p63 colocalizaban, mien as que o a sub-
población e a absolu amen e nega i a pa a p63 (Figu a 7). Ambas poblaciones es aban
en emezcladas, con alguna célula aislada an o SOX2+p63- como SOX2+P63+.
Resul ados
105
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
112
Vídeo 1. SOX2· en glándulas i oides de a ones
C57BL6/J
hemb a adul a (>90 días) median e mic oscopía
3D Ligh -shee . Se mues a un esquema de la al u a a la que se han ex aído con Ima is las secciones mos adas
a pa i del ídeo egis ado en el mic oscopio Ligh -Shee . La luo escencia oja mues a la inción de células o
g upos de células con SOX2, con inción conocida en el epi elio de la áquea que ac úa como con ol posi i o y
no a ía en las di e en es al u as.

Resul ados
113
2 MODELOS DE RECLUTAMIENTO DE CÉLULAS MADRE EN
LA TIROIDES: RASTREO DE LA POBLACIÓN SOX2
EN EL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP
Una ez ca ac e izada en lo posible la población SOX2 quisimos hace es udios uncionales.
Pa a ello, nues o siguien e g upo de expe imen os u ilizó el modelo de as eo con GFP con la
ob ención del a ón Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP a pa i del c uce de la cepa Sox2-CRE-ERT2
+/-228 y la cepa LoxP-EGFP +/+286. Si odo uncionase co ec amen e, las células SOX2 no
exp esa ían EGFP en ausencia de a amien o induc o , a pesa de exp esa C e-ERT2. Cuando
se inyec a Tamoxi en (TAM) la p o eína C e-ERT2 que es ci oplasmá ica e inac i a se uel e
dimé ica y nuclea al ac i a se el agmen o de i ado del ecep o de es ógenos (ERT2). La
pa e ecombinasa ac úa sob e los locus LoxP pe mi iendo la exp esión de EGFP bajo la
exp esión del p omo o del locus ROSA26, de exp esión ubicua en a ones287. El iempo que se
necesi a desde la inyección de TAM has a la de ección de GFP en células SOX2 depende mucho
del ó gano y ejido es udiado, y debe ca ac e iza se cuidadosamen e.
CARACTERIZACIÓN EN LA TIROIDES DEL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP TRAS
TAMOXIFEN (TAM) A TIEMPO CORTO O LARGO.
Inmunohis oquímica de SOX2 con amoxi en a lo la go del iempo en e a
con oles en la áquea
An es de odo quisimos comp oba que el modelo de a ón uncionaba co ec amen e. Pa a
ello, adminis amos a a ones adul os la misma concen ación de TAM ( ía in ape i oneal) en
una inyección al día y en días consecu i os, pe o a iando el núme o de dosis. Así, llamamos
iempo co o cuando adminis amos dos dosis de TAM y iempo la go cuando se adminis an
cua o dosis. Los a ones ue on sac i icados al día siguien e a la adminis ación de la úl ima
inyección y las secciones se iñe on pa a GFP que de ec a ambién la p o eína EGFP.
El epi elio de la áquea es á compues o po una capa de células en la que la mayo ía de las
células son posi i as pa a SOX2. G acias a es a nume osa exp esión de SOX2 ue ácil
comp oba el co ec o uncionamien o del modelo. Como se ap ecia en la Figu a 9,
comp obamos que ambién exp esaban g an can idad de GFP en la áquea cuando a los a ones
se les adminis aba TAM y que, además, es a can idad de GFP a iaba dependiendo del núme o
de dosis de TAM, siendo la inción con GFP menos nume osa o en pa ches cuando se
adminis aban dos dosis (Figu a 9A, izquie da), y más nume osa o con inua cuando se
adminis aban cua o dosis (Figu a 9B, izquie da).
Al es udia la glándula i oides de es os a ones, ambién pudimos obse a células eñidas
pa a GFP, aunque menos in ensas que la áquea y muy aisladas, demos ando de nue o que
es e ejido iene células SOX2, pe o que és as son mucho menos abundan es que en el ejido
espi a o io (Figu a 9A-B, de echa). Al no hace una inción exhaus i a de las glándulas
comple as, y debido a la desigual dis ibución de la población SOX2 en la i oides y se el
núme o de células de ec ado po sección pequeño no encon amos di e encias cuan i a i as en
la i oides en e el a amien o co o y la go (Figu a 9A-B, de echa). Sin emba go, la inción
ue especí ica de la exis encia de ecombinación gené ica ya que a ones no males inyec ados
con TAM po cua o días no p esen a on inción pa a GFP ni en la áquea ni en la i oides
(Figu a 9C).
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
114
Figu a 9. Nues o
Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP
es un modelo cuan i a i o pa a es udia la exp esión de SOX2.
Se mues an secciones eñidas pa a inmunohis oquímica de GFP con a eñidas pa a hema oxilina en a ones a
los que se les inyec ó TAM du an e un a amien o co o (2 días) o la go (4días). A) Izquie da: T as un a amien o
co o con TAM, el epi elio de la áquea se uel e posi i o pa a GFP en o ma de pa ches alejados en e sí
in e pues os con células nega i as. De echa: en la i oides se de ec an células GFP en localizaciones compa ibles
con nues a población SOX2. B) Izquie da: T as un a amien o la go con TAM, el epi elio de la áquea apa ece
de o ma p ác icamen e con inua eñido pa a GFP. De echa: En la i oides, se obse a un núme o de células GFP
disc e o que no apa en a ene a iaciones con el a amien o co o debido al bajo núme o de células SOX2. C)
Las secciones de a ones con geno ipo no mal wild ype son nega i as pa a GFP an o en la áquea como en la
i oides a pesa de ecibi el mismo a amien o con TAM, demos ando la alidez del modelo.
Resul ados
115
Inmuno luo escencia pa a GFP en la áquea y en la i oides as amoxi en en
a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP
Como la inmunohis oquímica no nos pe mi e ealiza dobles y iples inciones, es anda izamos
la doble inción de GFP asociada a SOX2 po inmuno luo escencia pa a e la elación de las
células SOX2 con las GFP. En la áquea emos una ez más cómo hay una al a exp esión de
SOX2 nuclea y su consecuen e elación di ec a con la exp esión de GFP ci oplasmá ica (Figu a
10A). El ma caje ue especí ico pues o que animales del mismo geno ipo en ausencia de TAM,
no pudimos de ec a células GFP+SOX2 dobles posi i as en la áquea (Figu a 10B).
En la i oides no ocu ía lo mismo, ya que ue di ícil encon a células SOX2 posi i as que
ambién lo ue an pa a GFP. Di ec amen e uimos a la zona de la i oides donde sabíamos que
SOX2 e a muy abundan e (medio-supe io ). Incluso en es as secciones, donde había un
po cen aje al o de células SOX2, la exp esión doble de GFP y SOX2 ue escasa (Figu a 10C).
Se obse a que de las cua o células GFP mos adas, dos ienen su núcleo comple o den o
de la sección de ec ado po la in ensidad del DAPI. Sólo es as dos células ue on doble posi i as
pa a SOX2 y GFP. La inción ue especí ica, ya que si omi imos los an icue pos p ima ios no
de ec amos señal de GFP ni de SOX2 (Figu a 10D).
Nues a conclusión es que la exp esión del locus ROSA26 en la mayo pa e de las células
SOX2 de la i oides es baja, bien po que en i oides no se exp ese ese p omo o de o ma
in ensa, o bien po que la mayo ía de las células SOX2 pe manecen en un es ado de baja
ac i idad. De cualquie modo, las células SOX2 que sí exp esan GFP pudie an ene un
ecambio ápido como lo indica el hecho de que dos de las es células GFP con núcleo no
exp esen SOX2, aunque una explicación al e na i a como hemos apun ado a iba es que el
núcleo no es é incluido comple amen e en la sección (Figu a 10C).
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
116
Figu a 10. Ma caje SOX2-GFP en la áquea y en la glándula i oides as el a amien o con TAM.
Inmuno luo escencia doble pa a GFP y SOX2 en secciones de a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP a los que se les
adminis ó TAM o Vehículo du an e 4 días. A) En la áquea, p ác icamen e odo el epi elio mues a SOX2 en el
núcleo y GFP en el ci oplasma. B) Es o no sucede si se inyec a ehículo en ez de TAM, y el epi elio de la áquea
SOX2 posi i o no exp esa GFP. C) En la i oides se buscó una sección con abundancia de células SOX2 ( e cio
medio-supe io ) pe o sólo cua o de esas células son GFP. Las dos células en las que el DAPI demues a que la
sección con iene el núcleo comple o, son doble posi i as pa a SOX2 (nuclea ) y GFP (ci oplasmá ico). D) Si
omi imos los an icue pos p ima ios, no se ob iene ma caje (Con ol nega i o).
Resul ados
117
Figu a 10 (pa e 2)
MODELO DE RECLUTAMIENTO INDUCIDO POR HIPOTIROIDISMO FARMACOLÓGICO

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
118
Has a es e momen o habíamos ca ac e izado una pequeña población SOX2 odeando al epi elio
i oideo, cuyos ma cado es TTF1+low/PAX8-neg/p63+/- e an compa ibles con células mad e,
y que eníamos un modelo con el que podíamos as ea las, decidimos es udia sus
implicaciones uncionales. Pa a ello, y dada la di icul ad de ob ene a ones con el geno ipo
adecuado y po la egla de las 3R de la expe imen ación animal, decidimos ealiza en pa alelo
el es udio del ecambio no mal de la glándula adul a con el es udio del eclu amien o as un
es ímulo. Nos p egun amos en onces, si en una si uación de eque imien o uncional de la
glándula i oides, es a población se ac i aba.
El hipo i oidismo inducido en a ones hemb a median e PTU disminuye la
can idad de T4 lib e en sang e alcanzando ni eles de hipo i oidismo mode ado.
Basándonos en los p o ocolos desc i os en la li e a u a decidimos u iliza el hipo i oidismo
(HT) a macológico inducido po p opil iou acilo (PTU), como modelo conocido de
eque imien o uncional en la i oides109,110,111. Nues o obje i o e a es ablece un
hipo i oidismo ela i amen e mode ado compa ible con un buen uncionamien o del eje
hipo álamo-hipo iso- i oideo. Y pa a ello, comenzamos es udiando qué pasaba con la población
SOX2 en a ones no males as hipo i oidismo inducido con PTU.
Pa a es anda iza el p o ocolo a amos a ones C57BL/6J hemb a de 90 días de edad,
du an e días p og esi os (Figu a 11) y se les ex ajo sang e pa a su pos e io medición median e
un ELISA de T4 lib e en sue o (FT4; Figu a 12). Nues o ki conside a la no malidad pa a
población humana en e 0,8-2 ng/dL. En oedo es no hay ango admi ido, pe o se asumen
ni eles equi alen es.
Figu a 11. P o ocolo de hipo i oidismo inducido po PTU. Esquema empo al de los expe imen os de
hipo i oidismo (HT) inducido con PTU ealizados en a ones no males C57BL/6J.
Resul ados
119
Se obse a una disminución p og esi a de es a ho mona con o me pasan los días con el
a amien o, compa ado con los con oles (Figu a 12). Aunque a día 3 la FT4 oda ía es á en
alo es inmedia amen e po debajo de la no malidad, ya ha disminuido signi ica i amen e. A
pa i del día 6 de a amien o los a ones en an en ni eles de hipo i oidismo anco que se
man iene has a los 12 días donde e mina el expe imen o.
Figu a 12. La FT4 desciende p og esi amen e en a ones hemb a as el a amien o con PTU. ELISA de T4
lib e en a ones hemb a C57BL/6 as a amien o con PTU (p opil iou acilo). G acias a la acción inhibido a de
es e compues o en e a la p o eína TPO, la glándula es incapaz de uni el yodu o (I-) a la i oglobulina y la
sín esis de ho monas no se p oduce co ec amen e. En la g á ica se ep esen a la media±el e o es ánda con
un amaño mues al (n=6). Se u iliza un es ANOVA de una ía seguido de una co ección de Dunne ; *p≤0,05,
**p≤0,01 y ***p≤0,001.
Aumen o en la exp esión del ARN de SOX2 en a ones hipo i oideos de 3, 6 y
12 días
Cuando se comp obó que el PTU uncionaba co ec amen e disminuyendo la can idad de FT4
en sang e y o iginando así a ones hemb a C57BL/6 HT, se quiso obse a la exp esión de
genes ca ac e ís icos del epi elio olicula , los de eno ipo i oideo (Tsh , Nis (Slc5a8), Pds
(Slc26a4), Tg, Tpo, Duox2) en e a la exp esión de Sox2, que ep esen a ía a la población
celula no olicula que es amos in es igando (Figu a 13).
PTU inhibe la o gani icación de yodu o a yodo, y la yodación de la Ti oglobulina po
inhibición del complejo Tpo/Duox2288. Además, inhibe a la enzima Desyodasa D1 impidiendo
la con e sión de T4 a T3 en los g andes ó ganos (hígado, iñón), pe o ambién la deg adación
de T3 a T2, y la gene ación de T3288. Como e a de espe a , inmedia amen e (3 días) as el
comienzo de la adminis ación de PTU los genes del ecep o de Tsh y de los anspo ado es
de yodu o (Nis, Pds) se inducen, p obablemen e pa a in en a compensa la al a de ho mona
median e una mayo espues a uncional a la Tsh en el epi elio olicula (Figu a 13A). Mien as
que el Tsh sigue aumen ado a medida que p osigue el a amien o a 6 y 12 días, no así lo hacen
los genes de anspo ado es, p obablemen e po un e ec o Wol -Chaiko an es el exceso de
Yodu o lib e no o gani icado289.
Po el con a io, no obse amos ningún inc emen o signi ica i o de exp esión en Tg, Tpo
o Duox2 excep o una pequeña inducción inicial (Figu a 13B). Es o pod ía se po que al habe
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
120
su icien e enzima, o incluso un acúmulo de Tg no yodada, aunque no sea uncional, no se pueda
ac i a ningún mecanismo de inducción de es os genes.
Figu a 13. Inc emen o especí ico en la exp esión de ARNm de Sox2 a la go plazo as el hipo i oidismo
inducido con PTU. Exp esión en glándula i oides de a ones hemb a C57BL/6 hipo i oideos de 3, 6 y 12 días de
cada ARN mensaje o de genes de in e és (ba as azules o ojas) en elación al gen con ol housekeeping Tbp. A)
Genes de memb ana plasmá ica del polo basal como Tsh , Slc5a (Nis) y Slc26a4 (Pend in), B) Genes de polo apical
como Tg, Tpo y Duox2. C) el gen Sox2 (ba as ojas). D) En la hipó isis midió la exp esión del ARNm de Tshb Se
obse a que dicha exp esión es signi ica i a en indi iduos con hipo i oidismo de 12 días. En las g á icas se
ep esen an la media±el e o es ánda de Taqman qRT-PCR con un amaño mues al (n) mos ado encima de
cada ba a. Pa a las compa aciones globales se u iliza un K uskal-Wallis seguido de una co ección de Dunne ;
pa a la compa ación de dos g upos se u iliza Mann-Whi ney; *p≤0,05, **p≤0,01.
En elación con la can idad de exp esión de Sox2 en la i oides, se puede obse a que PTU
induce un aumen o a dío signi ica i o y muy ma cado a los 12 días de hipo i oidismo (Figu a
13C).
Resul ados
121
Cuando obse amos lo que pasa en la hipó isis, podemos e que inicialmen e, 3 días, no
hay ningún inc emen o de exp esión, pe o a los 6 días se inc emen a mucho la exp esión del
gen Tshb, que con inúa pos e io men e aumen ado (Figu a 13D). Jus o después, a los 12 días
es cuando apa ece el inc emen o en Sox2 en la i oides, sugi iendo que pueda es a elacionado.
El hipo i oidismo de 12 días en a ones hemb a C57BL/6 aumen a la exp esión
de la p o eína SOX2
Pa a es udia si los da os ob enidos de ARN coinciden con la exp esión de SOX2 en p o eína,
se ex ajo la p o eína o al de ejidos de i oides de a ones hipo i oideos de 12 días jun o con la
p o eína o al de a ones con oles. Todo ello se midió median e la écnica Wes e n-Blo (Figu a
14A).
Figu a 14. Inc emen o de la p o eína SOX2 en hipo i oidismo de 12 días. A) Wes e n blo pa a la p o eína
SOX2 de ex ac os p o eicos de i oides a ados con ehículo (Con ol) o PTU (HT) du an e 12 días. La memb ana
se ehib idó pa a ß-ac ina omado como con ol de ca ga o housekeeping. B) Cuan i icación ela i a de la
p o eína SOX2 espec o de ß-ac ina. En la g á ica se ep esen a la media±el e o es ánda con un amaño
mues al (n=6). Se u iliza un es de Mann-Whi ney bila e al; *p≤0,05, **p≤0,01 y ***p≤0,001.
Se p oduce un aumen o signi ica i o de la de ección de la p o eína SOX2 en a ones
hemb a C57BL/6J a los que se les ha inducido hipo i oidismo du an e 12 días en compa ación
con los a ones con ol (Figu a 14B). En conjun o los da os de ARNm (Figu a 13C) y de
p o eína (Figu a 14) nos es án indicando que o bien se induce especí icamen e es e gen Sox2
como esul ado del hipo i oidismo, o bien lo que es amos obse ando es una expansión de la
población celula SOX2 posi i a que nos lle a a un aumen o ela i o espec o al epi elio
olicula .
A
B
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
128
3 HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL
La di e enciación de células GFP a epi elio olicula as 12 días de as eo e hipo i oidismo
exis ía, pe o no e a una di e encia an ma cada comp ada con los a ones con ol. Pensamos
que pod ían es a pasando dos cosas. O bien el ecambio e a muy len o pa a pode se obse ado
con an sólo 12 días, o bien el p opio a amien o con PTU pod ía in e e i con dicho ecambio,
al inhibi la enzima TPO en la i oides (y la DIO1), pudiendo se es as mismas enzimas cla es,
de alguna o ma, pa a el p oceso de di e enciación a i oci o madu o. Po o a pa e, una e ce a
al e na i a se ía que se necesi e una can idad mayo de T3 localmen e pa a que pueda habe
di e enciación e minal a i oci o a pa i de células mad e.
Figu a 20. Modelo de hemi i oidec omía pa cial (HemiTx) en a ón
Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP.
A) Esquema a
lo la go del iempo en el que se incluyen odas las e apas, desde la esección qui ú gica de media glándula
i oides de echa (HemiTx), el a amien o con TAM y el acing du an e los siguien es 10 días. B) Fo o de uno de
los a ones donde mues a la ía qui ú gica de llegada al lóbulo de echo de la i oides y se obse a que la ci ugía
no a ec a a los músculos del lado izquie do, y dis ienden sin lesiona la mayo ía de los músculos del lado de echo.
En los a ones hemi oidec omizados (HemiTx) se ex ajo con un co e y una pequeña pinza la mayo pa e del
lóbulo de echo de la i oides. En los animales con oles (Sham) solamen e

Resul ados
129
Pa a in en a esol e la ele an e cues ión de si nues a población SOX2 de la i oides
pa icipan en el ecambio uncional de la glándula (Cell Tu no e ) decidimos comple a nues o
es udio con o o modelo en el que se indujese ecambio, pe o sin comp ome e la di e enciación
ni las concen aciones locales de T3 ac i a. Decidimos en onces emplea un modelo de daño
mecánico pa cial pa a eemplaza al modelo químico de PTU y así e i a la in e e encia de
cualquie compues o ex e no al p oceso de egene ación y di e enciación de la glándula. Se
sabe que la hepa ec omía pa cial290 o la panc ea ec omía pa cial291, ac i an el ese o io de
células mad e induciendo su eclu amien o y di e enciación.
En la Figu a 20A se de alla nues o complejo diseño expe imen al, que incluye una nue a
écnica qui ú gica no desc i a p e iamen e en la li e a u a. Lo p ime o que hicimos es diseña
un p o ocolo qui ú gico de i oidec omía pa cial en a ones, que man u iese in ac os los
músculos de la deglución y acceso ios de la ía espi a o ia elacionados con la la inge. (Figu a
20B).
Una ez adqui ida la des eza pa a ealiza la hemi i oidec omía, se u iliza on a ones
hemb as adul as Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP a los que se les aplicó una hemi i oidec omía
pa cial del lóbulo de echo seguida de la adminis ación de TAM in ape i oneal pa a la
ac i ación del modelo gené ico (Figu a 20A). Los a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP
i oidec omizados y sham ue on sac i icados el día 15 después de la ci ugía (Figu a 19A).
Como se adminis an 5 inyecciones de TAM en días consecu i os nada más inaliza la
ope ación se implemen a, po an o, un acing de 10 días (Figu a 20A).
Cuando se analizó median e inmuno luo escencia pa a GFP el acing en la hemi- i oides
izquie da de las a onas con HemiTx de echa, se obse a on g andes poblaciones de células
GFP posi i as, con una media supe io al 30% de las células de cada i oides (Figu a 21). En
los a ones Sham la can idad de células GFP e a p ác icamen e inde ec able (Figu a 21).
Figu a 21. Acumulación masi a de células GFP en la i oides izquie da de a ones hemb a Sox2-C e-
ERT2/LoxP-EGFP 10 días as hemi i oidec omía (HemiTx) del lado de echo. Po cen aje de células GFP
posi i as en hemb as de 90 días a las que se les ealizó una hemi i oidec omía pa cial del lóbulo de echo,
compa adas con a ones a los que se les ealizó el mismo p oceso qui ú gico, pe o sin ex acción de i oides
(Sham). En la g á ica se ep esen a la media±el e o es ánda con un amaño mues al (n) ep esen ado encima
de cada ba a. Se u iliza un es de Mann-Whi ney bila e al; **p≤0,01.
El siguien e paso ue es udia si esas células GFP exp esaban SOX2 o si po el con a io
exp esaban ma cado es de di e enciación. (Figu a 22). Como podemos obse a , el núme o de
células SOX2 se man u o bajo, aunque las células SOX2+GFP apa ecían en pa ejas, como si
se hubie an di idido. Las células GFP+ nega i as pa a SOX2 ue on abundan es.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
130
Figu a 22. Colocalización de GFP y SOX2 en la i oides de a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP 10 días as
hemi i oidec omía (HemiTx). Campos ep esen a i as del lóbulo i oideo izquie do de a ones hemb a Sox2-
C e-ERT2/LoxP-EGFP hemi i oidec omizados.
Resul ados
131
Figu a 22 (pa e 2)
Pa a demos a que las células GFP posi i as se habían di e enciado a i oci o madu o y
e an uncionales, u ilizamos ma cajes pa a Tg y NIS en inmuno luo escencias dobles con GFP
de la hemi- i oides izquie da pa a es udia la colocalización de dichos ma cado es.
En las Figu as 23 y 24 se obse a que la mayo ía de las células GFP posi i as, an
abundan es, encon adas en las i oides de a ones hemb a Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP diez
días después de la hemi i oidec omía son doble posi i as pa a GFP y Tg (Figu a 23) y pa a GFP
y NIS (Figu a 24) como se deduce de su in enso pseudocolo ama illo en la suma de canales.
En ambas igu as se puede obse a cómo la inción de GFP es ci oplasmá ica, la inción de Tg
iene e ue zo de memb ana en polo apical y iñe ambién el coloide, y la inción de NIS iene
e ue zo en polo basal donde se concen a es a p o eína. Pues bien, en la usión de colo es se
obse a el colo ama illo en el polo apical cuando la usión es con Tg pe o en cambio en el polo
basal cuando la usión es con NIS, y po ue a se e una línea oja que co esponde a la
memb ana plasmá ica sólo con NIS y no con GFP como es lógico. Es o indica que odas esas
células GFP se han di e enciado a epi elio olicula .
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
132
Figu a 23. Di e enciación de células GFP en epi elio olicula sec e o de Tg po su polo apical en la i oides
de a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP 10 días as hemi i oidec omía (HemiTx). Campos ep esen a i as del
lóbulo i oideo izquie do de a ones hemb a Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP hemi- i oidec omizados de su lado
de echo y con oles (Sham), as diez días de acing. Se obse a coexp esión de GFP ( e de) con Tg ( ojo) dando
un colo ama illo en la usión de canales que se concen a en el polo apical del epi elio olicula , indicando que
células Sox2 se han di e enciado y comienzan a p oduci y sec e a dicha Tg. La Tg sec e ada se acumula en el
coloide ue a de las células.
Resul ados
133
Figu a 25 (pa e 2)

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
134
Figu a 24. Di e enciación de células GFP en epi elio olicula cap ado de yodu o a a és de NIS po su polo
basal en la i oides de a ones Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP 10 días as hemi i oidec omía (HemiTx). Campos
ep esen a i as del lóbulo i oideo izquie do de a ones hemb a Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP hemi-
i oidec omizados de su lado de echo y con oles (Sham), as diez días de acing. Se obse a coexp esión de
GFP ( e de) con NIS ( ojo) dando un colo ama illo en la usión de canales que se concen a en el polo basal del
epi elio olicula , indicando que células Sox2 se han di e enciado en células que cap an yodu o de la sang e. Los
olículos con epi elio ama illo, aun así, se en odeados de una delgada línea oja que co esponde al NIS
localizado en la memb ana plasmá ica del polo basal.
Resul ados
135
Figu a 24 (pa e 2)
En conclusión, de es os expe imen os, se demues a que la i oides de a onas adul as es
capaz de esponde a daño mecánico es imulando una pequeña población de células SOX2
capaces de p oli e a y, en úl ima ins ancia, di e encia se a células olicula es i oideas que
además son uncionales.
Nues o úl imo azonamien o ino de la siguien e p egun a. Si as la HemiTx se eclu an
células SOX2 pa a luego di e encia se, es as debe ían ac i a se de alguna o ma pa a empeza
a p oli e a an es de la di e enciación.
Pa a comp oba que quisimos comp oba si el aumen o en el po cen aje de células Sox2
posi i as e a consecuencia de su ac i ación y p oli e ación. Pa a pode esponde a es a
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
136
p egun a u ilizamos a ones hemb a C57BL/6 en los que 3 días as la HemiTx se inyec a on
dos pulsos de EdU, uno cada 12 ho as, an es del sac i icio (Figu a 25).
Figu a 25. Inc emen o de la p oli e ación de la población SOX2 inmedia amen e as la HemiTx. Campos
ep esen a i as de a ones hemb a 3 días después de la HemiTx (A) y Sham (B) con ma cajes dobles pa a EdU
( e de) y SOX2 ( ojo) que dan un colo ama illo en la combinación. Se ap ecian células dobles posi i as pa a Sox2
Resul ados
137
y EdU en indi iduos HemiTx. No se encon a on es os ma cajes dobles en indi iduos Sham. C) Epi elio del esó ago,
donde se p oduce un al o ecambio celula , hay muchas células dobles posi i as SOX2-EdU.
Figu a 25 (pa e 2)
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
144
Figu a 29. T acing co o a dia P3 de neona os inyec ados con TAM a P1 demues an que sólo pa e de la
población SOX2 exp esa GFP. Campos ep esen a i as de i oides de a ones hemb a Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP
a dia P3, dos días después de la inyección de TAM. A) Casi la o alidad de la glándula es á exen a de exp esión
de GFP; sólo algunas células SOX2 posi i as lo e an ambién pa a GFP. B) Como p ime con ol nega i o se mues a
un a ón al que no se le adminis ó TAM a P1, y po an o es nega i o pa a GFP. C) Como segundo con ol se
mues a una sección de a ón Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP inyec ado con TAM en el que se omi ió an icue po
p ima io de SOX2, y po an o no mues a ma caje en el canal ojo. Se ma ca on algunos olículos con líneas
na anjas en la combinación con DIC, pa a indica la si uación de las células SOX2 y GFP, o las dobles.

Resul ados
145
Figu a 29 (pa e 2)
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
146
Todos los con oles ealizados salie on co ec os, an o el con ol del a ón no inyec ado
con TAM que no iene GFP, como el con ol del a ón en el que se omi ió el an icue po p ima io
pa a SOX2, que no p esen a ma caje SOX2 (Figu a 29). Es o indica que el ma caje gené ico
inicial a P1 del modelo Sox2-C e-ERT2/LoxP-EGFP -TAM es exclusi o de las células SOX2
y que de ellas de i an odas las encon adas en el adul o.Pa a demos a que las células SOX2
se ac i an y son las esponsables del desa ollo de la i oides, se sac i ica on ambién a ones a
día P3 pa a e que únicamen e las células SOX2 en ese momen o e an posi i as pa a GFP,
como se obse a en la igu a 29.
5 GENERACIÓN DE TIROSFERAS
Las células mad e adul as deben cumpli cie as ca ac e ís icas pa a se conside adas como
ales. Po una pa e, in i o en el ó gano deben p esen a ma cado es de células mad e;
man ene se quiescen es, pe o pode se ac i adas an e un eque imien o uncional; se capaces
de di e enciación e minal al pa énquima de ese ejido. Po o a pa e, in i o as se pu i icada
la población, las células mad e deben pode c ece en ausencia de sue o, en o ma de es e as
con el medio más común que incluye los dos suplemen os come ciales N2 y B27115,128. Esas
es e as deben conse a los ma cado es p esen es en la población o iginal, se capaces de c ece
en una dilución muy baja, se capaces de au o eno ación y, po úl imo, se capaces de
di e enciación in i o.
Nues a población Sox2 de la i oides cumplía bien las ca ac e ís icas de célula mad e
adul a in i o. P ocedimos en onces a explo a sus ca ac e ís icas in i o.
GENERACIÓN DE TIROSFERAS PRIMARIAS
Desg aciadamen e, ca ecíamos de un ma cado de supe icie que nos pe mi iese pu i ica
nues a población SOX2+ po so e o po mé odos magné icos (se in en a on ambas cosas
basándonos en a ios ma cajes uncionales como EGFP y amaño, pe o el po cen aje e a an
bajo que no u imos éxi o). P ocedimos en onces a ealiza los expe imen os con una dispe sión
celula de oda la i oides de a ones hemb a de 30 días, asumiendo que la población de células
mad e SOX2+ se ía la que o ma ía i oes e as, y la que pod ía di e encia se a epi elio olicula .
Pa a ello se disg ega on a célula única i oides de a ón hemb a y se semb a on en placas con
el medio de cul i o de c ecimien o de es e as de células mad e adul as, a una densidad baja de
1000-500 células po pocillo de pla o mw6, lo que supone 500-250 células/mL espec i amen e.
Pasados es días desde el semb ado, la mayo ía de las células semb adas comenzaban a
p esen a e en os de mue e celula excep o alguna célula que e a capaz de man ene se i a y
c ece a lo la go de los subsiguien es días, gene ando es uc u as es é icas a las que hemos
llamado “ i os e as” (Figu a 30A). Dichas i os e as seguían c eciendo con o me pasaban los
días. En los días 7 y 9 es as es e as habían duplicado e, incluso, iplicado su amaño y núme o
de células que las con o maban (Figu a 30A). Nues o núme o encon ado de es e as en cul i os
epe idos ue al ededo de 5 es e as/pocillo, independien emen e de sí semb ábamos 500 o 1000
células/mL (Figu a 31A). Si calculamos que el po cen aje de células SOX2 en la i oides adul a
no mal nos sale po debajo del 0,3%, más bien ce cano al 0,25% en a ones hemb a de 30 días
(Figu a 8, con aje de po cen aje de células SOX2 en a ones hemb a de 30 días; Figu a 15,
con aje en el expe imen o de hipo i oidismo a a ones hemb a con oles a ados con ehículo)
pod íamos espe a un máximo de 7 es e as en 1000 células/mL y 4 es e as en 500 células/mL.
Po lo an o, la e iciencia de es e as ob enidas coincide en su mayo pa e con lo espe ado, po
lo que sugie e que las i os e as de i an de nues a población SOX2+. El po cen aje de es e as
Resul ados
147
ob enidas sob e células o ales semb adas ue más e icaz en la meno concen ación (Figu a
31B). Quizás el exceso de g umos de células mue as más nume osos en 1000 células/mL
condicione el c ecimien o de las i oes e as.
Figu a 30. C ecimien o de Ti oes e as en cul i o in i o a pa i de una dispe sión de células i oideas de
a ón hemb a adul a (90 días). Mic oscopía de con as e de ases con un obje i o de 40X en el seguimien o de
i os e as i as en di e en es es adíos. A) C ecimien o de las es e as a lo la go de los días. B) Ti os e as
secunda ias gene adas median e disg egación de las es e as p ima ias. C) Ti os e as e cia ias gene adas
median e disg egación de las es e as secunda ias. D) Cul i os de i ados de Ti os e as semb adas con sue o y
medio de di e enciación (TSH). Tienen aspec o de i oci os en cul i o y o man es uc u as olicula es 3D.
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
148
Figu a 31. Ob ención de Ti oes e as en cul i o in i o a pa i de una dispe sión de células i oideas de
a ón hemb a adul a (90 días). A) Ti os e as o ales gene adas po pocillo a pa i del semb ado de 1000 ò 500
en cél/mL con 3 mL po pocillo. B) Fo mación de i os e as exp esado en po cen aje sob e células o ales
semb adas.
GENERACIÓN DE TIROSFERAS SECUNDARIAS Y TERCIARIAS
A con inuación, se quiso comp oba si las células que con o maban es as es e as e an capaces
de ol e a gene a más i os e as a pa i de una única célula.
Pa a ello, se disg ega on mecánicamen e has a consegui células indi idualizadas y se
ol ie on a semb a en un medio simila al usado en la o mación de las es e as p ima ias
(Figu a 30B). Se semb a on unas 10 células/pocillo mw6 (~3 células/mL) y se ob u ie on as
9 días has a 10 es e as po pocillo. Repi iendo exac amen e el mismo p ocedimien o, se
comp obó que es as células e an capaces de ol e a gene a es as es uc u as es é icas con
o mación de es e as e cia ias (Figu a 30C).
n=6
n=6
n=6 n=6
n=6 n=6 n=6 n=6
Día 3 Día 5 Día 7 Día 9
0
2
4
6
8
Nº Ti os e as/pocillo
Ti os e as o ales
1000 cél.
500 cél
n=6 n=6 n=6 n=6
n=6 n=6 n=6 n=6
Día 3 Día 5 Día 7 Día 9
0.0
0.5
1.0
1.5
% i os e as sob e
cél. semb adas
% Ti os e as
1000 cél.
500 cél.
A
B
Resul ados
149
INMUNOFLUORESCENCIA EN TIROSFERAS
Nues o siguien e paso ue comp oba si es as i os e as, -que c ecían en medio de cul i o de
s em-cell sin sue o, y con la o ma espe ada de s em-cell adul as (es e as lo an es) y el núme o
espe ado si c eciesen a pa i de nues a población SOX2 de la i oides-, exp esaban los mismos
ma cado es que habíamos encon ado en el es udio de ejido, sob e odo el ac o de
ansc ipción SOX2.
Pa a ello hicimos inciones de es as i os e as median e inmuno luo escencias. Pudimos
obse a que las i os e as exp esan SOX2 (Figu a 32A). Las es e as exp esaban bajos ni eles
de TTF1, compa ando con alguna célula olicula aislada que seguía i a al ededo (Figu a
32B). Y las es e as e an absolu amen e nega i as pa a Tg (Figu a 32C).
Figu a 32. Ca ac e ización de las Ti os e as median e exp esión de ma cado es. Es udio po mic oscopía
con ocal de la exp esión de SOX2 (A), TTF1 (B) y TG (C) de i os e as ob enidas 9 días en cul i o.
DIFERENCIACIÓN TIROSFERAS
Una siguien e condición que al aba es demos a que esas es e as de células SOX2+ pe o
nega i as pa a ma cado es de epi elio olicula , e an capaces de di e encia se in i o. Pa a
induci la di e enciación añadimos un medio con sue o, que induce adhe encia al pla o a las
pocas ho as, y ho monas impo an es pa a el man enimien o del eno ipo olicula i oideo en e
las que se encuen a la TSH, ho mona hipo isa ia que man iene el o ismo en la i oides.
Se pipe eó una es e a indi idualizada en pla o mul ipocillo de plás ico. T as la adición del
medio de di e enciación, las i os e as comienzan a adhe i se al pla o. Las células se
man u ie on con ese medio du an e 14 días. T as es e pe íodo los pocillos se ija on y iñe on
pa a Ti oglobulina (Figu a 33).

FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
150
Figu a 33. Di e enciación de Ti oes e as a epi elio olicula . Fo os ep esen a i as de inmuno luo escencia de
i os e as di e enciadas as 14 días en medio con TSH y ho monas. Las células se ija on y iñe on pa a TG y
TTF1. A) Se mues an di e en es campos de di e en es cul i os. Se obse a cómo las i os e as se han adhe ido
a la placa de cul i o y comienzan a o ma es uc u as pa ecidas a olículos. Además, exp esan ma cado es de
eno ipo di e enciado i oideo como TTF1 y Tg. B) La omisión de an icue pos p ima ios no dio señal (Cneg 1º).
Resul ados
151
Figu a 33 (pa e 2)
FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR
152
Como se obse a en la igu a 33, las células ob enidas a pa i de i os e as SOX2/lowTTF1
nega i as pa a Ti oglobulina se con ie en en células de in enso ma caje nuclea pa a TTF1,
capaces de exp esa es a p o eína cla e de la unción i oidea as su di e enciación.
6 EXPRESIÓN DE SOX2 EN TEJIDO Y CULTIVO CELULAR DE
TIROIDES HUMANO
EXPRESIÓN DE SOX2 TANTO EN CULTIVOS CELULARES DE TIROIDES NORMAL (T-NT) Y
BOCIOS MULTINODULARES (T-MNG) COMO EN SUS PROPIOS TEJIDOS A NIVEL DE ARN
MENSAJERO, PERO NO HAY DIFERENCIAS ENTRE ELLOS.
Una ez ca ac e izadas y desc i as es as poblaciones de células mad e p esen es en la glándula
i oides de a ones, quisimos obse a si exis e una población análoga en ejido de i oides
humano. Es udios ya publicados en nues o labo a o io demues an que, en la hipó isis, o a
glándula endoc ina, se conse a la localización, es uc u a ana ómica y ma cado es exp esados
de células mad e en e oedo es y humanos115,128,. Noso os eníamos la en aja de posee la
colección TIROCHUS que eúne ejidos y cul i os del mismo pacien e p oceden es de ci ugía
de i oides de nues o hospi al.
Comenzamos po analiza la exp esión de SOX2 y genes de eno ipo i oideo a ni el de
ARN mensaje o en una se ie de ejidos humanos de i oides no mal (TH-NT) y bocio
mul inodula (Mul inodula Goi e o MNG, TH-MNG). Las ca ac e ís icas de la se ie en cuan o
a sexo (M=muje ; H=homb e) y edad ue on enidas en cuen a, pe o co esponden a la
dis ibución del núme o de pacien es que a on an ci ugía po en e medad hipe plásica benigna
de i oides, en su mayo ía muje es80. Es a se ie cons aba de 15 TH-NT (11 M+ 4H) y de 18 TH-
MNG (19M + 3H). La edad media en e ambos g upos ue de 48,5±4 años en TH-NT y 51,2±3,4
años en TH-MNG y no p esen ó di e encias signi ica i as (p=0,615, dis ibución no mal de las
a iables con el es D’Agos ino & Pea son; - es pa amé ico).
El ARNm de SOX2 se exp esaba de o ma de ec able en ejido i oideo no mal y en bocio
mul inodula (Figu a 33A de echa), pe o no hay di e encias en e ambos g upos en cuan o a su
exp esión.
Al mismo iempo, es udiamos si exis ía posi i idad pa a SOX2 en cul i os p ima ios
es ablecidos a pa i de esos ejidos (T-NT y T-MNG). Es impo an e indica que en nues os
cul i os la p opo ción de células de epi elio olicula es supe io al 95%248.En es e caso nues a
se ie consis ía en 15 cul i os T-NT y 22 T-MNG. Las edades de ambos g upos, aunque
ce canas, sí que u ie on di e encias signi ica i as siendo 43,8±3,9 pa a T-NT y 53,4±2,4 pa a
T-MNG (p=0,035; dis ibución no mal de las a iables con el es D’Agos ino & Pea son; - es
pa amé ico).
Resul ados
153
Figu a 34. De ec able exp esión del ARNm de
SOX2
en mues as de glándula i oides y cul i os de epi elio
olicula i oideo. La se ie se compone de ejidos no males (TH-NT) y de bocio mul inodula (TH-MNG), y cul i os
de i ados de ejidos no males (T-NT) y de bocio mul inodula (T-MNG). A) Exp esión ela i a del ARNm de SOX2.
B) Exp esión ela i a del ARNm de PAX8. C) Exp esión ela i a del ARNm de TTF. Se ep esen a la media±el e o
es ánda de Taqman qRT-PCR con un amaño mues al (n) mos ado encima de cada ba a. Se u iliza un es de
Mann-Whi ney. **p≤0,01.
Se encon ó exp esión de SOX2 en los cul i os, ma cadamen e meno que en los ejidos.
Pe o no se encon a on di e encias en la exp esión del ARNm de SOX2 en e ambos g upos de
cul i os (Figu a 33A cen o). La exp esión del ARNm de SOX2 no se co elacionó
signi ica i amen e con la edad del pacien e: de Pea son=0.133, p=0.318 (n=15) pa a TH-NT,
y =-0.189, p=0.226 (n=18) pa a TH-MNG. Los da os de es a co elación sugie en que si
Δ PAX8/TBP mRNA
T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Come cial no mal
hy oid issue
6X
n=15 n=22
n=15
n=18
0.0192
*
0.0784
PAX8
Δ SOX2/TBP mRNA
T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Come cial no mal
hy oid issue
6X
n=15 n=22
n=15 n=18
SOX2
Δ TTF1/TBP mRNA
T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Come cial no mal
hy oid issue
6X
n=15 n=22
n=15
n=18
0.0044
**
TTF1
A A
B
A
B
C