Interceptación de señales de comunicación bacteriana tipo "N"-Acilhomoserín Lactonas (AHLs) en bacterias aisladas del medio marino

In e cep ación de señales de comunicación
bac e iana ipo N-acilhomose ín lac onas (AHLs)
en bac e ias aisladas del medio ma ino
Memo ia pa a op a
al G ado de Doc o en Biología que p esen a
Manuel Rome o Be ná dez
San iago de Compos ela, Mayo de 2010
Fdo: Manuel Rome o Be ná dez
Ana Ma ía O e o Casal, P o eso a Ti ula del Depa amen o de Mic obiología y
Pa asi ología de la Facul ad de Biología, de la Uni e sidad de San iago de Compos ela.
HACE CONSTAR:
Que la memo ia i ulada “In e cep ación de señales de comunicación bac e iana ipo N-
acilhomose ín lac onas (AHLs) en bac e ias aisladas del medio ma ino”, que p esen a
D. Manuel Rome o Be ná dez pa a op a al G ado de Doc o en Biología, ue ealizada
bajo su di ección en el Depa amen o de Mic obiología y Pa asi ología de la
Uni e sidad de San iago de Compos ela, y au o iza su p esen ación.
Y pa a que así cons e, i ma la p esen e en San iago de Compos ela, Mayo 2010
Fdo: D a. Ana Ma ia O e o Casal
A mis pad es y a mi he mana

El abajo con enido en la p esen e memo ia ha sido pa cialmen e inanciado po el
p oyec o i ulado “In e cep ación de Quo um: Una nue a ap oximación al a amien o
de las in ecciones bac e ianas en acuicul u a”, 2006-2009, de la Di ección Xe al de I+D,
Xun a de Galicia.
Manuel Rome o Be ná dez ha sido beca io p edoc o al del p og ama de Fo mación de
P o eso ado Uni e si a io (FPU), en el pe íodo 2005-2009 y beca io de in es igación de
la Dipu ación de A Co uña, en el pe íodo 2009-2010.
Se ag adece al Ins i u o Español de Oceanog a ía, Cen o Oceanog á ico de Vigo, el uso
de in aes uc u a necesa ia pa a la ecogida de mues as de agua de ma oceánica.
ix
AGRADECIMIENTOS
En es os momen os si echo la is a a ás se me ocu en un mon ón de pe sonas que me
han ayudado en odos es os años an o a ni el p o esional como pe sonal po eso me
gus a ía da las g acias:
A mi di ec o a Ana Ma ía O e o Casal, po habe me dado la opo unidad de inicia con
ella el es udio de la comunicación bac e iana que an o nos apasiona. Ag adece le po
habe me guiado y o ien ado odo es e iempo de mane a an cons uc i a poniéndome
los pies en la ie a algunas eces y animándome en o as en las que no es aba an
con encido. Su modo de e la in es igación y su igo cien í ico han sido y se án un
ejemplo a segui pa a mí.
A Jaime Fáb egas Casal, po ab i me las pue as de su labo a o io en el Depa amen o
de Mic obiología y Pa asi ología de la Facul ad de Fa macia donde inicié mi
in es igación. Además de da me una isión más amplia de la ciencia y las posibles
aplicaciones de los esul ados de mi in es igación.
A Miguel Cáma a y Alicia Mu o Pas o po acoge me en mis dos es ancias en sus
labo a o ios de No ingham y Se illa donde he pasado momen os muy especiales y
elices en un ambien e es upendo pa a abaja .
A Ana Belén po sus apo aciones e impo an es consejos como expe a en
bioin o má ica, a pesa de la época complicada en la que ue on solici ados po su
a anzado emba azo.
A mis pad es Mª Ca men y Al edo, a mi he mana Paula y a mi abuela Geno e a, po
se las pe sonas más impo an es y ce canas que me han apoyado siemp e, sin ellos nada
de es o se ía posible (aunque yo no con a a demasiado…). También g acias a oda mi
amilia po es a an unidos y siemp e ahí.

x ii
Ab e ia u as
AHL N-acilhomose ín lac ona
AI Au oinduc o
AIP Pép ido au oinduc o
AM Aga ma ino
CCE Ex ac o celula c udo
CDP Dipép ido cíclico
CFB Ci o aga-Fla obac e ium-Bac e oides
CM Caldo ma ino
DSF Fac o señal di usible
FAS Agua de ma il ada y au ocla ada
FAS CAS Medio FAS suplemen ado con casaminoácidos
FAS POL Medio FAS suplemen ado con polisacá idos
FISH Hib idación de luo escencia in si u
FMM Medio Flexibac e ma i imum
GBL -bu i olac ona
GOS “Global ocean sampling”: colección de me agenomas ma inos de océano
HSL Homose ín lac ona
LB Medio Lu ia-Be ani
MRM Moni o ización de múl iples eacciones
N m Hid olasas N- e minales
PAME Me il-és e del ácido 3-hid oxipalmí ico
PON Pa oxonasa
PQS Señal quinolona de Pseudomonas
PTE Dominio os o ies e asa
QQ Quo um quenching
QS Quo um sensing
QSIS Biosenso de QQ “quo um sensing inhibi o selec o ”
SAM S-adenosilme ionina
TLC C oma og a ía en capa ina
TSA-I Aga de ip ona y soja con 1% de NaCl
UFC Unidades o mado as de colonias
INTRODUCCIÓN
In oducción
3
1. Comunicación bac e iana dependien e de densidad celula o quo um sensing
1.1 De inición de quo um sensing
Las bac e ias han sido conside adas du an e años, sal o a as excepciones como
las Mixobac e ias, como o ganismos no di e enciados y no coope a i os, desca ándose
cualquie posibilidad de que exis iesen mecanismos de comunicación in e celula en
o ganismos unicelula es. Sin emba go, se sabe que las bac e ias han desa ollado
so is icados mecanismos que les pe mi en de ec a y esponde a las condiciones
ambien ales, que incluyen es ímulos clásicos como los cambios de empe a u a, la
disponibilidad de nu ien es, p esión, oxígeno y pH.
Sólo ecien emen e se ha descubie o que las bac e ias ambién p oducen y
esponden a señales ex acelula es p oducidas po o as bac e ias. Es os mecanismos de
comunicación in e celula pe mi en a las bac e ias desa olla compo amien os
coope a i os. La de ección de quo um o “quo um sensing” (QS) (Fuqua e al., 1994)
desc ibe la capacidad de un mic oo ganismo pa a pe cibi y esponde a la densidad
poblacional median e la egulación de la exp esión gené ica, siendo así capaz de
desa olla un compo amien o social coo dinado. Es e p oceso desdibuja la línea en e
p oca io as y euca io as, ya que pe mi e a las bac e ias compo a se como un o ganismo
mul icelula . Las bac e ias comunican su p esencia a las demás usando pequeñas
moléculas de señalización química denominadas au oinduc o es (AIs) o e omonas.
Especí icamen e, libe an, de ec an y esponden a la acumulación en el medio de esas
moléculas (Figu a 1). La de ección de AIs pe mi e a la bac e ia dis ingui en e una al a
o baja densidad de población. A medida que c ece la población bac e iana se inc emen a
el ni el ex acelula de la molécula señal, has a que se alcanza una concen ación
umb al que equi ale a un censo mínimo o quó um que desencadena una a iación de la
exp esión génica en espues a a cambios en el núme o de células. Es e p oceso, que
pe mi e a la población bac e iana coo dina la exp esión génica de oda la comunidad,
ue desc i o po p ime a ez en la bac e ia ma ina simbion e bioluminiscen e Vib io
ische i (Nealson, 1977; Nealson y Has ings, 1979). Es a bac e ia sólo emi e luz en
cul i o cuando se alcanza una densidad celula mínima o quó um.
Las células de V. ische i de ec an la densidad celula median e la p oducción de
una pequeña molécula de la amilia de las N-acilhomose ín lac onas (AHLs), que

In oducción
4
di unde lib emen e a a és de la memb ana y se acumula en el medio de cul i o. Una
ez alcanzada la concen ación umb al de au oinduc o comienza la gene ación de luz.
En la na u aleza es a concen ación umb al sólo se puede alcanza en el ambien e
ce ado del ó gano luminoso del huésped simbion e. De es a o ma V. ische i e i a el
gas o ene gé ico de la emisión de luz a menos que la concen ación de bac e ias sea la
su icien e como pa a epo a un bene icio al huésped. En su momen o es e enómeno se
conside ó anómalo y, en gene al, no se c eía posible que las bac e ias u ilizasen
sis emas de comunicación in e celula , sólo desa ollados po euca io as. Casi 10 años
más a de se descub ió que un mecanismo simila , mediado po dis in as moléculas
señal es aba implicado en la egulación gené ica de p ocesos an di e sos como la
p oducción de an ibió icos, la libe ación de ac o es de i ulencia, la ans e encia
conjugacional de plásmidos, lo que inició una se ie innume able de descub imien os que
nos han b indado una nue a isión del mundo mic obiano. Hoy en día sabemos que los
sis emas de QS in e ienen además en el con ol de muchas o as unciones isiológicas
bac e ianas, en e las que se encuen a el c ecimien o en “enjamb e” o “anillos”
(“swa ming”), o mación de endospo as, madu ación de biopelículas, e c. (Swi e al.,
2001, Williams e al., 2007) (Tabla 1).
Se han p opues o explicaciones al e na i as que cues ionan que los p ocesos de
QS cons i uyan un sis ema de comunicación bac e iano, como la hipó esis de “di usión
sensing/e iciency sensing” (Red ield, 2002; Boye y Wisniewski-Dyé, 2009). Es as
hipó esis explican la p oducción de moléculas de QS como un medio que las bac e ias
poseen pa a pe cibi el g ado de di usión y mezcla de me aboli os en el medio que las
odea, lo que les pe mi i ía de e mina los bene icios de sec e a moléculas que implican
mayo gas o ene gé ico. De es e modo e i a ían un despil a o de ecu sos, po ejemplo,
p oduciendo y libe ando enzimas ex acelula es como p o easas; ac o es de i ulencia o
o mación de biopelículas, si el medio que las odea las diluye a inmedia amen e.
Aunque el é mino QS ue acuñado en un p incipio pa a desc ibi los enómenos
de espues a a densidad celula mediados po AHLs en bac e ias G am-nega i as, es e
é mino se ha ex endido a sis emas que u ilizan moléculas señal dis in as a las AHLs. Se
han descubie o un g an núme o de moléculas dis in as que se ag upan en a ias
amilias.
In oducción
5
Figu a 1. Modelo de la de ección de quo um (“quo um sensing”, QS). Con bajas densidades celula es (1)
la concen ación del au oinduc o (pen ágonos) en el medio es muy baja, no ac i ando los sis emas
dependien es de quó um. Cuando se alcanza una ele ada densidad celula (2), la concen ación de
au oinduc o alcanza el ni el umb al de de ección, iniciándose la exp esión de genes cuyos p oduc os
(cí culos) pueden ac ua en el in e io o en el ex e io de la bac e ia (B). En un modelo al e na i o, la
de ección de quó um esul a en la ep esión de la exp esión génica.
O
SC
YSTCDFIM
OCH
3
HO
HO
O
B
O
HO OH
O
N
O
H
H O
A B C
Figu a 2. P incipales ipos de señales de quo um en bac e ias. (A) Las bac e ias G am-nega i as usan
moléculas de la amilia de las N-acilhomose ín lac onas (AHLs), que di ie en en la cadena la e al. Se
mues a la N-oxohexanoil-L-homose ín lac ona (OC6-HSL) de Vib io ische i. (B) Las bac e ias G am-
posi i as u ilizan pép idos co os, que en algunos casos p esen an modi icaciones. Se mues a uno de los
au oinduc o es de S aphylococcus au eus, que p esen a un puen e iolac ona en e el aminoácido e minal
y una cis eína in e na. (C) El diés e u anosil bo a o o AI-2 es u ilizado an o po G am-posi i as como
po G am-nega i as.
1.2 Señales de quo um sensing
Exis en es ipos p incipales de señales de QS (Figu a 2):
1. Las bac e ias G am-nega i as p oducen gene almen e AHLs basadas en un
anillo lac ona (HSL) al que se une, median e enlace amida, un ácido g aso que
In oducción
6
cons i uye la cadena la e al. Poseen una ele ada di e sidad con o macional, di i iendo
en la longi ud de cadena la e al, que no malmen e con iene en e 4 y 18 ca bonos,
sa u ada o insa u ada y con o sin sus i uciones oxo- o hid oxi- en el e ce ca bono
(Whi ehead e al., 2001). Las AHLs se iden i ica on po p ime a ez en bac e ias
bioluminiscen es ma inas, donde ienen un papel undamen al en el con ol de la
emisión de luz en simbion es, como V. ische i (Figu a 3), que cons i uye el pa adigma
de los ci cui os de con ol gené ico po QS en G am-nega i as. Cada sis ema de ec o
puede se ac i ado solamen e po su AI co espondien e, aunque algunos p esen an un
pequeño g ado de inespeci icidad. Se ha especulado con que las AHLs ue an
p oducidas exclusi amen e po un núme o ela i amen e bajo de especies pe enecien es
a α-, - y γ-P o eobac e ias (Whi ehead e al., 2001; Fuqua y G eenbe g, 2002; Williams
e al., 2007), pe o ecien emen e ha sido desc i a la p esencia de es as señales en o os
phyla como en la cianobac e ia colonial Gloeo hece (Sha i e al., 2008) y en miemb os
de Ci o aga-Fla obac e ium-Bac e oides (CFB), ambién conocidos como Bac e oide es
(Huang e al., 2008; Rome o e al., 2010, Anexo 2.2), lo que e ue za la impo ancia del
papel de los sis emas de QS en las poblaciones na u ales.
2. En bac e ias G am-posi i as la coo dinación in e celula se ealiza median e la
acción de moléculas señal de na u aleza pep ídica. Se a a de pép idos de bajo peso
molecula , que su en modi icaciones pos - aduccionales y son conocidos como
pép idos au oinduc o es (AIPs). Su amaño a ía en e 5 y 34 esiduos aminoacídicos y
gene almen e poseen una a qui ec u a compleja no usual (Figu a 2). Se conocen es
amilias di e en es de AIPs: (i) los oligopép idos lan ibió icos, como la Nisina de
lac ococos, ca ac e izados po la p esencia de ioé e es mac ocíclicos y aminoácidos
deshid ogenados (Quad i, 2002); (ii) pép idos de iolac ona, como el AIP-1 de
es a ilococos (Chan e al., 2004) y (iii) los pép idos de ip ó ano isop enilado, en los
que ComX y sus a ian es de Bacillus sub ilis y o os Bacillus son los únicos miemb os
conocidos (Okada e al., 2005). Es as señales se expo an ac i amen e al medio y la
e omona pep ídica sec e ada es econocida po el dominio senso de una p o eína
senso a de memb ana, componen e de un pa ípico de ansduc o es de señal de dos
componen es. Es os sis emas egulado es de dos componen es, que consis en en una
p o eína senso a de memb ana y una p o eína egulado a de espues a u ilizan la
os o ilación como medio pa a ansmi i la señal que culmina en la ac i ación de una
In oducción
7
p o eína que modula la ansc ipción de los genes diana, con olando p ocesos como la
sec eción de ac o es de i ulencia, espo ulación y compe encia (Klee ebezem e al.,
1997; Lazazze a e al., 1997).
Figu a 3. Bac e ia bioluminiscen e ma ina V. ische i, pa adigma de con ol de exp esión gené ica po
quo um mediado po AHL.
3. Un e ce ipo de au oinduc o denominado AI-2, cuya es uc u a es un diés e
u anosil bo a o (Figu a 2), combina ambos ipos de comunicación. Es e au oinduc o se
iden i icó po p ime a ez en o o ib io ma ino bioluminiscen e, V. ha eyi. Mien as
que las AHLs y los au oinduc o es pep ídicos son al amen e especí icos y se u ilizan
pa a la comunicación in e celula den o de la misma especie, AI-2 se encuen an an o
en bac e ias G am-posi i as como G am-nega i as, lo que indica que pod ía ac ua
como lenguaje químico in e especí ico más uni e sal, ya que en muchos casos ambos
ipos de sis emas de de ección con i en (Mille y Bassle , 2001; Fede le y Bassle ,
2003). En la ac ualidad se conocen dos ipos de señal AI-2 iden i icadas en V. ha eyi y
Salmonella yphimu ium. En el p ime o el AI-2 es un (2S,4S)-2-me il-2,3,3,4-
e ahid oxi e ahid o u ano-bo a o (Chen e al., 2002), mien as que en S. yphimu ium
se a a de un (2R,4S)-2-me il-2,3,3,4- e ahid oxi e ahid o u ano (Mille e al., 2004).
La p o eína sin e izado a del AI-2 es LuxS (Xa ie y Bassle , 2003) y la búsqueda en
In oducción
14
Debido a la especi icidad de es os sis emas es aconsejable la u ilización
simul ánea de a ias de es as cepas biosenso as pa a de ec a un amplio ango de
amaños de AHL. También es ecomendable el uso de c oma og a ía en capa ina (TLC)
pa a sepa a y e i a p oblemas po in e e encia con sus ancias inhibido as que puedan
encon a se en el medio de cul i o y que in e ie an con el biosenso . Además, la
aplicación de c oma og a ía-líquida combinada con espec ome ía de masas (HPLC-
MS) pe mi e la con i mación e iden i icación de las señales.
2.3 Quo um sensing y biopelículas
De en e los p ocesos con olados po QS, uno de los de mayo impac o
económico y clínico es la o mación de biopelículas. Exis en nume osas e idencias
epidemiológicas que elacionan las biopelículas con dis in os p ocesos in ecciosos en
humanos (Wilson, 2001; Cos e on e al., 1999). Los mecanismos po los que la
biopelícula p oduce los sín omas de la en e medad oda ía no es án comple amen e
es ablecidos, pe o se ha suge ido que las bac e ias de la biopelícula pueden p oduci
endo oxinas, se pueden libe a g upos de bac e ias al o en e sanguíneo, las células de
la biopelícula se uel en esis en es a la acción agoci a ia de las células del sis ema
inmune y po o o lado, cons i uyen un nicho pa a la apa ición de bac e ias esis en es a
los a amien os an ibió icos (Donlan y Cos e on, 2002). Las biopelículas p oducen una
g an can idad de polisacá idos ex acelula es, esponsables de su apa iencia iscosa, y
se ca ac e izan po una g an esis encia a agen es an ibió icos. Es a esis encia puede
debe se a que la ma iz ex acelula en la que se encuen an embebidas las bac e ias
p opo ciona una ba e a en e a la pene ación de biocidas. O a posibilidad es que la
mayo ía de las células de la biopelícula c ecen muy len amen e, en un es ado de
p i ación de nu ien es, po lo que no son suscep ibles al e ec o de los agen es
an imic obianos. Un e ce aspec o pod ía es a elacionado con que las células en la
biopelícula adop asen un eno ipo dis in o, po ejemplo, median e la exp esión de
bombas sec e o as de á macos (Donlan y Cos e on, 2002).
Además de su impo ancia clínica, es común la con aminación biológica de
supe icies po biopelículas, pudiendo desa olla se sob e supe icies hid ó obas,
hid ó ilas, bió icas o abió icas, lo que conduce a la deg adación del ma e ial, libe ación

In oducción
15
de p oduc os de con aminación, bloqueo mecánico e impedancia de la ans e encia de
calo en p ocesos acuá icos. Las biopelículas son ambién la p ime a causa de la
con aminación biológica de sis emas de dis ibución de agua po able, y o as
conducciones, siendo especialmen e impo an e el con ol de biopelículas en los
sis emas an iincendios. El es ablecimien o de bac e ias adhe idas a los alimen os o a las
supe icies en con ac o con los alimen os conlle a se ios p oblemas higiénicos e incluso
casos de oxiin ecciones alimen a ias, así como nume osas pé didas económicas po los
p oduc os que se llegan a desecha (Ca pen ie y Ce , 1993). En acuicul u a iene
especial ele ancia la o mación de biopelículas en es uc u as sume gidas ales como
jaulas, edes y con enedo es; o equipamien o ales como cañe ías, bombas, il os y
anques colec o es, y pa a especies de cul i o, como mejillones, iei as, os as, e c. Es a
colonización que si e de base pa a el c ecimien o de o ganismos supe io es se conoce
como bio ouling (Railkin, 2004) y a ec a a odos los sec o es de la acuicul u a eu opea
esul ando en sus anciales pé didas económicas.
Figu a 6. 1) Diag ama de madu ación de una biopelícula de Pseudomonas ae uginosa. Las células
bac e ianas se ijan a la supe icie donde p oli e an o mando mic ocolonias. Las mic ocolonias de al a
densidad desa ollan biopelículas madu as median e un mecanismo dependien e de señal N-
oxododecanoil-L-homose ín lac ona (OC12-HSL). 2) Reducción en el desa ollo de biopelícula po un
mu an e de P. ae uginosa incapaz de p oduci AHL (de echa) espec o a cepa sal aje (izquie da).
Tomado de Pa sek y G eenbe g (2000).
AHL
+
AHL
-
AHL
+
AHL
-
1
2
In oducción
16
Con ecuencia el QS y la o mación de biopelículas es án es echamen e
elacionados (Nadell e al., 2008). Así, muchas especies, incluido el pa ógeno P.
ae uginosa, ac i an la p oducción de polisacá idos ex acelula es únicamen e cuando la
población alcanza una al a densidad (Da ies e al., 1998; Saku agi y Kol e , 2007)
(Figu a 6). Es e mecanismo e i a el cos e de p oducción de exopolisacá ido en ase
planc ónica (Xa ie y Fos e , 2007). Se han cuan i icado al as concen aciones de AHLs
en biopelículas: Cha l on e al. (2000) encon a on 4,5 eces más can idad de señal N-
oxododecanoil-L-homose ín lac ona (OC12-HSL) de P. ae uginosa en biopelículas de
la bac e ia que en medio líquido. En o o es udio, Huang e al. (2007) desc iben la
p esencia de muy al as concen aciones de N-dodecanoil-L-homose ín lac ona (C12-
HSL) (3,36 mM) en una biopelícula, indicando que las AHLs se acumulan den o de
es as es uc u as y pod ían se más es ables den o de las biopelículas. Al con ola la
o mación de biopelículas y o os ac o es de i ulencia, la in e cep ación de los
p ocesos de QS se ha con e ido en una es a egia bio ecnológica cuya explo ación
p esen a un ele ado in e és.
3. In e cep ación de quo um sensing: quo um quenching
3.1 Es a egias de quo um quenching
Aunque la sín esis de quimio e ápicos a i iciales y el descub imien o y mejo a
de los an ibió icos han supues o en el siglo pasado una au én ica e olución médica en
el a amien o de en e medades in ecciosas, el desa ollo de esis encia a an ibió icos
po pa e de algunas bac e ias pa ógenas es un g a e p oblema mundial, que obliga a la
indus ia a macéu ica a desa olla nue as gene aciones de an ibió icos más po en es, y
que puede o igina cepas mul i esis en es en las que el a amien o es más la go y con
ecuencia ine icaz. Debido a que la comunicación bac e iana juega un papel c í ico en
la egulación de nume osas unciones isiológicas mic obianas, incluyendo las
elacionadas con la pa ogenicidad en plan as y animales, exis e un eno me in e és en el
diseño e implemen ación de es a egias de inac i ación de los sis emas de QS, ambién
denominadas “quo um quenching” (QQ, Zhang, 2003), que puedan unciona como
In oducción
17
nue as ó mulas de lucha an imic obiana (Dong y Zhang 2005; Dong e al., 2007).
Mien as que los agen es an imic obianos adicionales esul an en la mue e celula del
pa ógeno, la u ilización de sis emas que in e ie an con la comunicación bac e iana
adop a una es a egia menos ag esi a y que no es aba disponible has a el momen o:
a enua la i ulencia del pa ógeno de modo que no sea capaz de adap a se al ambien e
del huésped y pueda se eliminado po las de ensas inna as de és e. La iden i icación de
sis emas que inac i en el sis ema de QS se ía impo an e en el caso de pa ógenos
opo unis as como P. ae uginosa, cuyo éxi o depende de la o ganización de un “a aque”
coo dinado que supe e las de ensas del huésped (Finch e al., 1998; de Kie i e
Iglewski, 2000; Zhang, 2003; Hen ze y Gi sko , 2003).
Aunque la inac i ación de o os sis emas de QS es igualmen e in e esan e, has a
el momen o los sis emas de QQ mejo conocidos se e ie en a la inac i ación de las
señales ipo AHL en G am-nega i as. Exis en a ios ipos de es a egias de QQ
posibles, que incluyen a) la inhibición de la gene ación de señal AHL, b) el bloqueo de
la diseminación de la señal y c) an agoniza la ecepción de la AHL.
a) Aunque la inhibición de LuxI y po an o el bloqueo de la gene ación del AI,
se ía el mé odo más e icaz de in e cep ación de la comunicación bac e iana, exis en en
la ac ualidad escasos es udios que hayan explo ado es a posibilidad. Así, se han
cons uido mu an es en lasI (homólogo de luxI) en P. ae uginosa que esul a on casi
o almen e de icien es en cuan o a p oducción de ac o es de i ulencia (Shih y Huang,
2002). También se ha obse ado que a ios análogos de SAM como la S-
adenosilhomocis eína, S-adenosilcis eína o sine ungin son po en es inhibido es de la
sín esis de AHL en P. ae uginosa (Pa sek e al., 1999). Aunque el SAM es
in e media io en o as muchas u as me abólicas de p oca io as y euca io as, debido a
que la eacción de sín esis de AHL mediada po LuxI pa ece se única, exis e la
espe anza de que es os análogos de SAM pod ían se u ilizados de o ma especí ica
como inhibido es de QS mediado po AHLs, sin a ec a a las enzimas euca io as que
usan SAM como sus a o. También se ha desc i o un e ec o inhibi o io sob e la sín esis
de AHLs po an ibió icos del g upo de los mac ólidos cuando se suminis a on en
concen aciones no le ales (Ta eda e al., 2001; Peche e, 2001). Aunque el e ec o de
es os an ibió icos se ha iden i icado como inhibido de la sín esis p o eica a ni el del
ibosoma, oda ía no es á cla o el mecanismo de inhibición de es os compues os sob e
In oducción
18
la p oducción de señales AHL (Peche e, 2001). Debido a que en la ac ualidad es án
desc i as las es uc u as c is alog á icas de a ias p o eínas ipo LuxI, és as pod ían se
u ilizadas como guía pa a el diseño de inhibido es sin é icos (Pappas e al., 2004).
b) La comunicación bac e iana puede se bloqueada po una disminución de la
concen ación de AHL ac i a en el medio. Así, las AHLs se deg adan de modo
espon áneo po hid ólisis alcalina a pHs ele ados (Ya es e al., 2002), aunque es a
disminución de la concen ación de AHL puede ambién debe se a mecanismos
enzimá icos. Algunas bac e ias han sido desc i as como capaces de deg ada señales
AHL (Dong y Zhang 2005), po lo que las bac e ias esponsables pod ían se u ilizadas
en el bloqueo de comunicación bac e iana y sus enzimas ienen g an in e és pa a su uso
en aplicaciones bio ecnológicas. Debido a que el é mino QQ se u ilizó po p ime a ez
pa a desc ibi es e mecanismo, algunos au o es es ingen su uso a es a aplicación.
c) El bloqueo del la ansducción de la señal de QS se puede log a po la
p esencia de un an agonis a de la AHL capaz de compe i o in e e i con la unión de la
señal a su ecep o LuxR. Los an agonis as compe i i os se ían lo su icien emen e
simila es, es uc u almen e, a las AHLs pa a pe mi i su unión al ecep o pe o no
ac i a ían la ansducción de señal pos e io , mien as que los an agonis as no
compe i i os mos a ían baja o ninguna simili ud es uc u al con las AHLs, ya que se
uni ían a si ios dis in os del ecep o LuxR. Se ha obse ado que los an agonis as
pueden acele a la deg adación de LuxR po la célula cuando se unen a es a (Mane ield
y Tu ne , 2002). En la ac ualidad exis e bas an e conocimien o sob e la elación
es uc u a- unción de las señales AHL, lo que pe mi i á ealiza una búsqueda e ec i a
de po en es an agonis as de QS. Así, en el caso de la cadena acil de las AHLs, se ha
is o que una educción o aumen o del amaño de la cadena de la señal de E winia
ca o o o a en únicamen e una unidad me il educía la ac i idad de la señal en un 90% y
50% espec i amen e (Chhab a e al., 1993).
Una de las p ime as es a egias de an agonismo de las señales de QS ipo AHL
desc i as es la u ilización de AHLs homólogas que bloquean el ecep o . Debido a la
ele ada especi icidad de muchos gene ado es de espues a dependien es de AHL, la
p esencia de AHLs con cadena la ga (más de 10 ca bonos) puede esul a en el bloqueo
de la espues a, po lo que han sido p opues as como an agonis as de la señal mediada
po AHLs en algunos pa ógenos. Sin emba go, el po encial de la u ilización de
In oducción
19
moléculas de AHLs de cadena la ga como agen es an imic obianos, uncionando como
an agonis as en p ocesos de in ección, es limi ado ya que algunas AHLs poseen
po en es e ec os modulado es sob e el sis ema inmune. Así, se ha desc i o que la OC12-
HSL de P. ae uginosa puede al e a la espues a inmune del huésped haciéndola menos
e ec i a (Rice e al., 1999) y además su p esencia ac i a la p oducción de in e leucina-8,
a a és de la ansc ipción del ac o nuclea NF-κB en las células epi eliales del sis ema
espi a o io (Zimme mann e al., 2006), ac i ando la espues a in lama o ia y po lo
an o ac uando como un ac o de i ulencia po si mismo (Pesci e Iglewski, 1999;
Smi h e Iglewski, 2003). También se han desc i o e ec os apop ó icos sob e líneas
celula es de la señal OC12-HSL (Ta eda e al., 2003; Ho ikawa e al., 2006; Shine e
al., 2006). Debido a es as obse aciones la u ilización de AHLs como agen es
an imic obianos es á ue emen e limi ada.
3.2 Deg adación enzimá ica de AHLs: Acilasas y lac onasas
Tal y como e a de espe a , en la na u aleza se han desa ollado po pa e de
euca io as sis emas de lucha pa a impedi la in asión o colonización bac e iana
median e la in e cep ación de los p ocesos mediados po QS y ambién las p opias
poblaciones bac e ianas han desa ollado es a egias de compe encia pa a lucha con
o as bac e ias median e la inac i ación de sus sis emas de QS (Tabla 2). Una de es as
es a egias incluye la deg adación enzimá ica de las señales AHL. La es uc u a química
de las AHLs implica que su deg adación enzimá ica pod ía ocu i median e cua o
eacciones di e en es (Figu a 7A). Dos de ellas implica ían la o u a del anillo HSL y
es a ían mediadas po enzimas ipo lac onasa o desca boxilasa. Las o as dos sepa a ían
el ácido g aso del anillo HSL median e la acción de una acilasa (amidasa) o una
deaminasa (Dong y Zhang, 2005). Únicamen e dos de las cua o ipos de enzimas
mencionadas han sido iden i icadas has a la echa: lac onasas y acilasas.
Se ha desc i o la inac i ación enzimá ica de las moléculas señal en nume osas
bac e ias (Dong y Zhang 2005), como las especies del géne o Bacillus, que son capaces
de deg ada las AHLs median e la acción de un gen especí ico, aiiA (Au oInduce
Inac i a o ), que codi ica una enzima lac onasa que inac i a la AHL al hid oliza el
anillo HSL (Figu a 7B). De es a o ma las lac onasas in e cep an las señales

In oducción
20
inac i ándolas y esul ando en una posible en aja a la ho a de coloniza nue os
ambien es (Pa k e al., 2008). Se ha p obado que plan as modi icadas gené icamen e con
el gen de la lac onasa de Bacillus p esen an una mayo esis encia al a aque de
pa ógenos cuya i ulencia depende de la u ilización de AHLs como señal, como E.
ca o o o a (Dong e al., 2001; Zhang, 2003) (Tabla 2). También se ha desc i o la
p esencia de una lac onasa en A h obac e sp. codi icada po el gen ahlD (Pa k e al.,
2003). Debido a que las AHLs son u ilizadas exclusi amen e po G am-nega i as, no es
ex año que es as bac e ias G am-posi i as hayan desa ollado un sis ema pa a inac i a
es as señales. Sin emba go, es e ipo de enzimas ambién han sido iden i icadas en
Ag obac e ium ume aciens, que u iliza ía las lac onasas BlcC (an e io men e A M) y
AiiB (Zhang e al., 2002; Ca lie e al., 2003) pa a inac i a su p opio sis ema de QS
(Zhang, 2003) aunque BlcC pa ece es a in oluc ada en el me abolismo de GBLs
(Ca lie e al., 2004; Khan y Fa and, 2008), o en Klebsiella pneumoniae que p oduce la
lac onasa AhlK (Pa k e al., 2003).
El segundo ipo de enzimas inac i ado as de QS se encon ó en o a bac e ia
G am-nega i a aislada del suelo, Va io o ax pa adoxus. Es a bac e ia puede u iliza las
AHLs como única uen e de ene gía y ni ógeno (Leadbe e y G eenbe g, 2000). En
es e caso se a a de una acilasa que ompe el enlace amida en e la HSL y el ácido g aso
(Figu a 7B), que es u ilizado como uen e de ene gía, aunque el gen esponsable oda ía
no ha sido clonado. Una enzima simila , denominado AiiD, que libe a la cadena la e al
del HSL, ha sido clonada de o a P o eobac e ia o mado a de biopelículas, Rals onia
sp. (Lin e al., 2003; Taga y Bassle , 2003). P. ae uginosa PAOI ambién p oduce dos
acilasas: P dQ y QuiP con las que pod ía egula su sis ema de QS (Sio e al., 2006;
Huang e al., 2006). Las acilasas AhlM de S ep omyces sp. (Pa k e al., 2005), AiiC de
Anabaena sp. PCC7120 (Rome o e al., 2008), AaC de Shewanella sp. (Mo ohoshi e
al., 2008b) y Comamonas sp. (gen no iden i icado) (U oz e al., 2003) comple an la lis a
de enzimas de ipo acilasa que se conocen has a la ac ualidad (Tabla 2). En
Acine obac e sp., Bosea sp., Och obac um sp., Sphingomonas sp., Del ia
acido o ans, Ma inobac e ium sp. y Glaciecola sp. ambién ha sido desc i a ac i idad
QQ de ipo enzimá ico pe o el ipo de ac i idad acilasa o lac onasa no ha sido desc i o
has a la ac ualidad (Kang e al., 2004; D’Angelo-Pica d e al., 2005; Ja a e al., 2006;
Tai e al., 2009) (Tabla 2).
In oducción
21
Especie Ac i idad QQ Gen Au o es G upo
Ag obac e ium
ume aciens
Lac onasa
Lac onasa
blcC
aiiB
Zhang e al., 2002
Ca lie e al., 2003
Bosea sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Pica d e al., 2005
Och obac um sp. (n.d.) (n.d.) Ja a e al., 2006
Sphingomonas sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Pica d e al., 2005
Sphingopyxis sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Pica d e al., 2005
-P o eobac e ia
Va io o ax
pa adoxus Acilasa (n.d.) Leadbe e y G eenbe g, 2000
Rals onia sp. Acilasa aiiD Lin e al., 2003
Comamonas sp. Acilasa (n.d.) U oz e al., 2003
Del ia acido o ans (n.d.) (n.d.) Ja a e al., 2006
-P o eobac e ia
Pseudomonas
ae uginosa
Acilasa
Acilasa
p dQ
quiP Huang e al., 2003; 2006
Klebsiella
pneumoniae Lac onasa ahlK Pa k e al., 2003
Shewanella sp. Acilasa
Lac onasa
aaC
(n.d.)
Mo ohoshi e al., 2008b
Tai e al., 2009
Acine obac e sp. (n.d.) (n.d.) Kang e al., 2004
Ma inobac e ium sp. (n.d.) (n.d.) Tai e al., 2009
Glaciecola sp. (n.d.) (n.d.) Tai e al., 2009
-P o eobac e ia
Bacillus sp. Lac onasa aiiA Dong e al., 2000; 2002
Bacillus mega e ium Oxidasa P450B
M-3 Chowdha y e al., 2007
Halobacillus salinus An agonis as
( ene ilamidas) (n.d.) Teasdale e al., 2009
Fi micu es
Rhodococcus
e y h opolis
Lac onasa/Acilasa/Oxid
o educ asa qsdA U oz e al., 2005; 2008; Pa k
e al., 2006
S ep omyces sp. Acilasa ahlM Pa k e al., 2005
A h obac e sp. Lac onasa ahlD Pa k e al., 2003
Ac inobac e ia
Anabaena PCC7120 Acilasa aiiC Rome o e al., 2008 Cianobac e ia
Riñón Acilasa (n.d.) Xu e al., 2003
Epi elio espi a o io (n.d.) PON2 S ol z e al., 2007 Mamí e o
Lu a iella a iabilis An agonis as
(Manoalidos) (n.d.) Skinde soe e al., 2008 Esponja
Flus a oliacea An agonis as
(Alcaloides) (n.d.) Pe e s e al., 2003 B iozoo
Sco zone a
sand asica An agonis as (n.d.) (n.d.) Bosgelmez-Tinaz e al., 2007
Medicago unca ula An agonis as (n.d.) (n.d.) Gao e al., 2003
Pisum sa i um An agonis as (n.d.) (n.d.) Tepli ski e al., 2000
Lo us co nicula us (n.d.) (n.d.) Delalande e al., 2005
Plan as
Lamina ia digi a a Halope oxidasa (n.d.) Bo cha d e al., 2001
Ahn el iopsis
labelli o mis
An agonis as
( lo idósido, be onicina
y ácido ise iónico)
(n.d.) Kim e al., 2007
Delisea pulch a An agonis as
( u anonas) (n.d.) Gi sko e al., 1996
Algas
Penicillium spp. An agonis as (ácido
penicílico y pa ulín) (n.d.) Rasmussen e al., 2005 Hongo
Tabla 2. Lis ado de bac e ias y o ganismos euca io as en los que se ha desc i o ac i idad QQ sob e
señales del ipo AHL an o enzimá ica (somb eado en g is) como median e an agonis as. No de e minado
(n.d.).
In oducción
22
Figu a 7. A) Cua o posibles modos de deg adación enzimá ica de AHLs. Los núme os en ojo indican la
posición de co e de las enzimas: 1) Lac onasa; 2) Desca boxilasa; 3) Deaminasa y 4) Acilasa. B) Modo
de acción de los dos ipos p incipales de enzimas de QQ conocidos. Las lac onasas hid olizan el anillo
HSL de la AHL mien as que las acilasas ompen el enlace amida en e el anillo HSL y el ácido g aso.
De modo in e esan e, las especies bac e ianas en las que se ha descubie o
ac i idad enzimá ica deg adado a de señales de ipo AHL pe enecen a cua o phyla
di e en es del eino Bac e ia (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /Taxonomy/): Ac inobac e ia
(A h obac e sp.), Fi micu es (Bacillus), P o eobac e ia (A. ume aciens, K.
pneumoniae, P. ae uginosa, Ralsonia sp. y V. pa adoxus) y Cianobac e ia (Anabaena
sp.). Es a amplia dis ibución sugie e que los genes codi icado es de enzimas
deg adado as pod ían es a conse ados en muchos o ganismos p oca io as. La
di e sidad axonómica de es as especies bac e ianas se e leja ambién en las secuencias
de los genes de las enzimas deg adado as que p oducen. Así las acilasas de Rals onia
sp. y P. ae uginosa p esen an baja homología, con ap oximadamen e un 39% de
iden idad a ni el pep ídico (Huang e al., 2003; Lin e al., 2003). Del mismo modo, en
las lac onasas ambién se obse a una impo an e a iación en las secuencias
aminoacídicas. Las lac onasas se pueden ag upa en dos g upos, uno ep esen ado po la
lac onasa AiiA que con iene las secuencias de las especies de Bacillus, que compa en
un 90% de iden idad en sus secuencias pep ídicas (Dong e al., 2002; Lee e al., 2002;
Ul ich, 2004). El o o es el g upo de BlcC que incluye las lac onasas de A. ume aciens,
Klebsiella pneumoniae y A h obac e sp., y que compa en en e un 30 y un 58% de
iden idad. So p enden emen e las lac onasas de ambos clús e compa en menos del
A
B
O
N
HO
O
R
n
OH
N
HO
O
R
nOH O
H
2
N
O
OR
nOH
+
AcilasasLac onasas
O
N
HO
O
R
n
O
N
HO
O
R
n
OH
N
HO
O
R
nOH
OH
N
HO
O
R
nOH O
H
2
N
O
OR
nOH
+
O
H
2
N
O
O
H
2
N
O
OR
nOH
O
R
nOH
+
AcilasasLac onasas
O
N
HO
O
R
n
O
N
HO
O
R
n
1
2
34
In oducción
23
25% de homología, como en el caso de AiiA y BlcC (Zhang e al., 2002), aunque odas
p esen an un dominio al amen e conse ado: HXDH~H~D, se a a del dominio de
unión a Zn ca ac e ís ico de las me alo--lac amasas, que se ha comp obado esencial
pa a la ac i idad AHL-lac onasa (Dong e al., 2002; Wang e al., 2004). Recien emen e
se ha descubie o en Rhodococcus e y h opolis la lac onasa QsdA (U oz e al., 2008),
que no p esen a homología con la amilia de me alo--lac amasas a la que pe enecen
las an e io es, sino que p esen a el dominio os o ies e asa (PTE) de unión a Zn.
Además de ac i idades enzimá icas ipo lac onasa y acilasa se han desc i o dos
ac i idades oxidasa- educ asa en bac e ias capaces de modi ica la cadena acil de las
AHLs. Aunque es as ac i idades no suponen la deg adación de la señal, las
modi icaciones en el ácido g aso de la AHL pod ían a ec a la especi icidad y po an o
el econocimien o de la molécula po el ecep o . La p ime a ac i idad oxidasa-
educ asa ue desc i a en Rhodococcus e y h opolis W2. Es a bac e ia educe la AHLs
oxo-sus i uidas en el e ce ca bono a sus o mas hid oxi, siendo inac i a en e a las
AHLs no sus i uidas o con sus i uciones hid oxi- (U oz e al., 2005). La segunda
ac i idad ue desc i a en Bacillus mega e ium y es la monooxigenasa P450,
an e io men e descubie a como oxidado a de ácidos g asos y aminoácidos unidos a
ácido g aso. Es a enzima oxida AHLs de cadena la ga en las posiciones -1, -2 y -3,
siendo más ac i a sob e AHLs oxo- sus i uidas (Chowdha y e al., 2007).
Además de bac e ias, se ha encon ado que plan as como Lo us co nicula us
(Delalande e al., 2005) y las células de mamí e os ambién pueden in e e i con las
señales AHL (Chun e al., 2004). Aunque Chun e al. (2004) no iden i ica on las
enzimas esponsables de la inac i ación de las AHL po células de epi elio espi a o io
humano, obse a on que aquéllas se encon aban asociadas a las células. En es udios
pos e io es se iden i ica on como los candida os más p obables a las p o eínas
ci oplásmicas de la amilia de las pa axonasas (PONs): PON1, PON2 y PON3
(D agano e al., 2005; Khe sonsky y Taw ik, 2005). Es as enzimas es án in oluc adas
en mecanismos de de oxi icación de muchos o gano os a os y ac úan como lac onasas.
De las es PONs desc i as, la más ac i a en e a AHL pa ece se PON2 debido a que se
ha obse ado que lisados de células de epi elio espi a o io de a ones mu an es en es a
enzima no deg adaban OC12-HSL, y su sob eexp esión aumen ó la ac i idad
In oducción
30
búsqueda de homólogos de luxI y luxR en las secuencias de me agenomas ma inos
disponibles dio como esul ado un núme o muy bajo de candida os, es ando es os
me agenomas p incipalmen e ep esen ados po genomas de bac e ias planc ónicas
debido a la des iación gene ada po el sis ema de il ación de agua de ma usado (Case
e al., 2008). Po el con a io, se había ob enido un po cen aje al o de cepas p oduc o as
de AHLs en mues as p oceden es de biopelículas de la zona in e ma eal (Huang e al.,
2008; Tai e al., 2009), esponjas (Mohamed e al., 2008) y, aunque con meno
ecuencia, ambién en nie e ma ina y aislados mic oalgales (G am e al., 2002).
Exis en o as e idencias que demues an que el QS mediado po AHL es
ecuen e en el medio ma ino, de ec ándose ac i idad AHL en ce ca de un 60% de las α-
P o eobac e ia aisladas de di e en es mues as ma inas, incluyendo especies
planc ónicas y bac e ias asociadas a algas (Wagne -Doble e al., 2005). Las señales
AHL pa ecen ambién ene un papel impo an e en las in e acciones en e euca io as y
p oca io as en el hábi a ma ino, como demues a la necesidad de p esencia de AHLs
pa a la selección de supe icies con biopelículas bac e ianas pa a la ijación pe manen e
de zoospo as del alga e de Ul a (Tai e al., 2005; 2009), pa a la libe ación de espo as
del alga oja Ac ochae ium sp. (Weinbe ge e al., 2007) y pa a el asen amien o inicial
de la as en el polique o Hyd oides elegans (Huang e al., 2007). Además, la
p oducción de AHLs es habi ual en bac e ias pa ógenas de peces incluyendo:
Ae omonas salmonicida, A hyd ophila, Ye sinia ucke i, Vib io salmonicida, V.
ulni icus, V. ha eyi, V. anguilla um o Edwa dsiella a da (F eeman y Bassle , 1999;
Swi e al., 1999; C oxa o e al., 2002; Buch e al., 2003; Kim e al., 2003; B uhn e al.,
2005; Mo ohoshi e al., 2004) (Tabla 3). Debido a que es as señales con olan la
exp esión de impo an es ac o es de i ulencia en es os pa ógenos, la posibilidad del
uso de p ocesos de in e cep ación de QS se ha p opues o como al e na i a a la
u ilización de an ibió icos pa a el con ol de in ecciones en acuicul u a (De oi d e al.,
2004) y la iabilidad de es a ap oximación ya ha sido demos ada en di e en es abajos
(Rasch e al. 2004; Tinh e al., 2008).
La in o mación disponible ace ca de la exis encia de p ocesos de QQ en el
medio ma ino es oda ía escasa, aunque algunas e idencias indi ec as indican que es os
enómenos pod ían se ecuen es. Así, se sabe que las AHLs se deg adan más
ápidamen e en agua de ma na u al que en agua de ma a i icial y es as obse aciones

In oducción
31
se han elacionado con la p esencia ac i idad QQ debida a enzimas en el agua (Hmelo y
Van Mooy, 2009). O a e idencia es que cuando se añaden AHLs a los medios de
cul i o se inc emen a la e iciencia de cul i o de poblaciones bac e ianas ma inas (B uns
e al., 2002).
Tabla 3. Lis ado de bac e ias pa ógenas ma inas en las que se ha desc i o la p oducción de señales de
quo um y las unciones con oladas po QS.
Mien as que exis e un núme o conside able de es udios que desc iben la
p esencia de ac i idad QQ en mues as de suelo, incluyendo búsquedas de genes
homólogos a los codi icado es de enzimas de QQ en me agenomas de suelo
(Williamson e al., 2005; Riaz e al., 2008; Schippe e al., 2009), que han pe mi ido el
aislamien o de a ias cepas bac e ianas capaces de deg ada AHLs y el es ablecimien o
de la p e alencia de los p ocesos de QQ en es as mues as (Leadbe e y G eenbe g,
2000; Pa k e al., 2003; U oz e al., 2003; Wang y Leadbe e , 2005), no hay es udios
sob e ac i idad QQ de AHLs en bac e ias ma inas que nos pe mi an e alua la
impo ancia ecológica de es os p ocesos en el medio ma ino, ni el desa ollo de
aplicaciones bio ecnológicas especí icas basadas en cepas ma inas con ac i idad QQ.
Sólo ecien emen e Tinh e al. (2007) han aplicado con éxi o cul i os de
en iquecimien o pa a demos a la capacidad de conso cios bac e ianos p oceden es de
in es ino de cama ón de acuicul u a pa a deg ada AHLs, aunque la mues a no sea
es ic amen e de o igen ma ino ni las bac e ias iden i icadas ni el ipo de ac i idad
Especie Señal Genes Fac o es egulados Au o es
Vib io ha eyi OHC4-HSL y AI-2 luxLM/luxN
P oducción de
side ó o os, oxinas,
sis ema de sec eción III,
luminiscencia
Bassle e al., 1993
Vib io
anguilla um
OC10-HSL, C6-
HSL y OC6-HSL
anI/ anR
anM/ anN
Me alop o easa,
pigmen o, biopelícula
Mil on e al., 1997;
2001
Vib io
ulni icus C4-HSL y AI-2 ? P o easa, hemolisina Valien e e al.,
2009
Vib io
salmonicida
C6-HSL y OC6-
HSL ? Desconocidos B uhn e al., 2005
Ae omonas
hyd ophila C4 y C6-HSL ahyI/ahyR P o easas y
me alop o easas Swi e al., 1997
Ae omonas
salmonicida C4 y C6-HSL asaI/asaR Exop o easa,
biopelícula Swi e al., 1997
Edwa dsiella
a da C6 y C7-HSL edwI/edwR Desconocidos
Mo ohoshi e al.,
2004
Ye sinia
ucke i
C8-HSL y OC8-
HSL ? Desconocidos B uhn e al., 2005
In oducción
32
enzimá ica sob e AHLs ca ac e izada. También ecien emen e Halobacillus salinus ha
sido desc i o como p oduc o de me aboli os secunda ios an agonis as de AHLs
(Teasdale e al., 2009) y una Shewanella sp. aislada de biopelícula ma ina como
deg adado a de AHLs (Tai e al., 2009). Es po lo an o necesa io la ealización de un
es udio que nos pe mi a e alua el po encial del medio ma ino como uen e de aislados
con ac i idad QQ.
OBJETIVOS/OBJECTIVES
Obje i os/Objec i es
35
Los p incipales obje i os de es e abajo ue on:
1) Es udia la exis encia y es ima la ecuencia de bac e ias cul i ables capaces de
in e e i con sis emas de quo um sensing mediados po AHLs en di e en es hábi a s
ma inos:
a) Comunidades bac e ianas densas de o igen cos e o expues as a una
ele ada ca ga o gánica: el sedimen o de un anque de cul i o de peces, una
biopelícula de anque ese o io de agua de ma il ada y el alga Fucus
esiculosus.
b) Mues as agua de ma de es ua io y de al a ma a 0 y 10 me os de
p o undidad.
2) Ca ac e ización de los aislados ob enidos con al a ac i idad QQ con a AHLs pa a
e alua su po encial uso bio ecnológico.
The main objec i es o his wo k we e:
1) The s udy o he p esence and es ima ion o he equency o cul i able bac e ia
capable o in e e ing wi h AHL quo um sensing sys ems in di e en ma ine
en i onmen s:
a) Bac e ial communi ies ob ained om si es wi h high o ganic load: he
sedimen om a ish cul u e ank, a bio ilm om a il e ed seawa e
ese oi ank and he ma ine algae Fucus esiculosus.
b) Ma ine wa e samples om es ua y and ocean a 0 and 10 me e dep h.
2) Cha ac e iza ion o he ob ained isola es wi h high QQ ac i i y agains AHLs in o de
o e alua e i s bio echnological po en ial.

MATERIALES Y MÉTODOS
Ma e iales y Mé odos
39
1. Quo um quenching en el medio ma ino
1.1 Me odología de cuan i icación de bac e ias cul i ables y aislamien o
Pa a la de ección de bac e ias ma inas con ac i idad QQ sob e AHLs se p ocedió
al aislamien o, con ma e ial es e ilizado, de cepas p oceden es de mues as de di e en es
medios ma inos. Las mues as ue on seleccionadas en unción de su ca ga o gánica y
bac e iana:
- Una mues a de sedimen o de anque de cul i o de peces con ci cui o ce ado de agua
de ma en la Uni e sidad de San iago (Junio 2007).
- En Illa de A ousa (N 42º.33’.45” W 8º.53’.08”) se ob u o una mues a p oceden e de
biopelícula sume gida de pa ed de un anque ex e io de cemen o (25.000 L), que si e
como ese o io de agua de ma il ada pa a una es ación de acuicul u a y en el que el
agua e a eno ada de o ma cons an e (Junio 2007).
- En el mismo luga se omo una mues a de alga Fucus esiculosus de ocas de la zona
in e ma eal. Un g amo del alga escu ida se oceó y esuspendió en 10 mL de agua de
ma es e ilizada (Junio 2007).
- También en Illa de A ousa se omó una mues a de agua de ma de es ua io (Ene o
2010).
- En al a ma , en e las ías de Vigo y Pon e ed a (N 42º.17’.07” W 8º.53’.27”) se
oma on mues as de agua a 0 y 10 me os de p o undidad (Ene o 2010).
Los medios sólidos empleados pa a el aislamien o incluye on medios con al a
concen ación de nu ien es como: aga de ip ona y soja con 1% NaCl (TSA-I) y aga
ma ino (AM, Di co), adecuados pa a bac e ias eu ó icas, y ambién medios con baja
concen ación de nu ien es como: aga ma ino en dilución 1/100 (AM 1/100), agua de
ma il ada y au ocla ada (FAS, Schu e al., 1993) suplemen ada con 1 g/L de
casaminoácidos (FAS CAS) y medio FAS suplemen ado con 0,5 g/L de los políme os
aga osa, qui ina y almidón (FAS POL) (B uns e al., 2002). Se p epa a on 3 diluciones
en ó denes de 10 (1/10, 1/100 y 1/1000) en agua de ma es e ilizada pa a cada una de las
mues as y se semb a on en placas con los medios de cul i o ci ados. Las placas ue on
incubadas a 15 y 22ºC du an e 15 días. Pa a la es ima de la densidad bac e iana se
selecciona on las placas que con enían en e 30-300 colonias. Se aisla on un o al de
Ma e iales y Mé odos
46
e apo a on bajo lujo de ni ógeno. El ex ac o seco ob enido se esuspendió en 200 μL
de ace oni ilo y se p ocedió a la cuan i icación de las AHLs po HPLC-MS. De la
misma o ma se ex aje on mues as con ol con 500 μL de CM y CM + AHL 50 μM.
Pa a de ec a ac i idad enzimá ica deg adado a de AHLs ipo lac onasa en T.
discolo 20J se lle a on a cabo dos ipos de ensayos. Duplicados de los sob enadan es
an e io men e desc i os de C4 y C12-HSL se acidi ica on has a pH 2 con HCl 1M y se
incuba on 24 ho as más en las mismas condiciones pa a la pos e io ex acción de
AHLs y cuan i icación po HPLC-MS. También se ealizó un bioensayo en medio
sólido con C. iolaceum CV026 pa a la señal C6-HSL 20 M y con C. iolaceum
VIR07 pa a C10 y C12-HSL 20 M, con y sin acidi icación has a pH 2. En es e caso
as la deg adación de las señales po cul i os de T. discolo 20J se ealiza on
ex acciones o gánicas de los sob enadan es y sob enadan es acidi icados de los cul i os
y los ex ac os secos se esuspendie on en agua pa a pos e io ensayo en pocillo con los
biosenso es de C. iolaceum co espondien es
4.2 Ciné ica de deg adación de AHLs
Se incuba on a 22ºC y 200 pm 60 mL de CM inoculados con T. discolo 20J.
T as 24 ho as, el cul i o ue di idido y cen i ugado (10.000 pm, 5 min), y el pelle se
la ó dos eces con 10 mL de PBS pH 6,5. En las dos suspensiones celula es así
ob enidas se añadió C4 ó C12-HSL a una concen ación inal de 30 μM. Las mezclas de
eacción se incuba on a 22ºC y 200 pm du an e 24 ho as, omándose mues as de 500
μL a di e en es iempos desde el iempo 0 h. Es as mues as se ex aje on, y las
concen aciones de C4 ó C12-HSL es an es en cada mues a se de e mina on po
HPLC-MS con la me odología desc i a.
4.3 Localización de la ac i idad deg adado a de AHLs
Pa a de e mina la localización de la ac i idad deg adado a de AHLs, se
ob u ie on el sob enadan e y ex ac o celula c udo (CCE) de cul i os de 24 ho as de
Tenacibaculum discolo 20J en 15 mL de CM. Los cul i os se cen i uga on du an e 5
minu os a 10.000 pm pa a sepa a la biomasa del medio de cul i o. El sob enadan e se

Ma e iales y Mé odos
47
il ó a a és de un il o de 0,22 μm y se almacenó a 4ºC, p e io uso. El pelle se la ó
con 15 mL de PBS pH 6,5, se esuspendió en o os 5 mL del mismo ampón, se sonicó
median e pulsos de 30 seg, du an e 5 minu os en hielo y se cen i ugó a 12.000 pm
du an e 30 min a 4ºC. El CCE así ob enido se il ó a a és de un il o de 0,22 μm y se
almacenó a 4ºC (U oz e al., 2005). Con el sob enadan e y el CCE de T. discolo 20J se
ealiza on dos ensayos:
- Un ensayo en medio sólido con C. iolaceum CV026 y VIR07 como se desc ibió
an e io men e. Se incuba on 500 μL de sob enadan e y de CCE du an e 24 ho as con C6
ó C10-HSL 20 μM a 22ºC y 200 pm. Los con oles se incuba on de la misma o ma,
con 500 μL de CM o PBS + AHL 20 μM.
- Cuan i icación po HPLC-MS de ex ac os ob enidos de 500 μL de sob enadan e y de
CCE incubados 24 ho as con C4 ó C12-HSL 50 μM a 22ºC y 200 pm con o sin
acidi icación has a pH 2 con HCl 1M (24 ho as más a 22ºC y 200 pm). Las
concen aciones de las AHLs as es e ensayo ue on cuan i icadas po HPLC-MS como
se desc ibió an e io men e. Los esul ados se compa a on con la deg adación del cul i o
comple o (bac e ia i a) incubado en las mismas condiciones y con con oles de CM
esco con C4 ó C12-HSL 50 μM.
4.4 PCR pa a lac onasas y acilasas
Pa a de e mina si los genes esponsables de ac i idad QQ sob e AHLs en T.
discolo 20J codi icaban lac onasas o acilasas se ealiza on PCRs con cebado es
degene ados diseñados pa a las secuencias más conse adas de es as enzimas. Las
secuencias de cebado es pa a lac onasas ue on: 5’-GAGGATCCCA
YCTICAYKYNGAYCA y 5’-ATGAATTCGGIGTRTGNCCNGGNGT (Pa k e al.,
2003). Pa a acilasas: 5’- GSIAAYCCNCAYTTYCCNTGG y 5’-
TCIGCNGCDATIGTRTTNACCCANGG (Pa k e al., 2005). Las eacciones de PCR se
ealiza on en las condiciones: 30 ciclos de desna u alización a 94ºC du an e 45 seg,
hib idación a 50 ó 55ºC du an e 45 seg, ex ensión a 72ºC du an e 45 seg. P ecedidos de
5 minu os de desna u alización a 95ºC y seguidos de 10 min de ex ensión a 72ºC.
Ma e iales y Mé odos
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4.5 Clonación de genes de quo um quenching de Tenacibaculum discolo 20J
Se lle ó a cabo un in en o de clonación de los genes de QQ esponsables de las
ac i idades deg adado as de AHLs p esen es en T. discolo 20J. Median e la
cons ucción de una lib e ía gené ica en plásmido y su exp esión en una cepa de
Pseudomonas ae uginosa PAOI en la que sólo los clones capaces de elimina la
ac i idad AHL pueden sob e i i . Pa a ello se ealizó una ex acción de ADN de T.
discolo 20J con Genomic DNA pu i ica ion ki (P omega). El ADN genómico (20 g)
se incubó a 37ºC du an e 10 min en diluciones se iadas con la enzima de es icción
Sau3A1 (P omega), ob eniéndose una diges ión pa cial de ADN. El esul ado de la
diges ión de ADN se c oma og a ió en gel de aga osa (1%), de donde se ex aje on
bandas co espondien es a agmen os de ADN de amaño en e 2 y 4 kb con Geneclean
III ki (Qbiogene). Los agmen os de ADN se liga on luego en el plásmido pME6000
(po ado de un gen de esis encia a e aciclina) (Mau ho e e al., 1998), dige ido con
BamHI y de os o ilado con os a asa alcalina (P omega) pa a e i a su
eci cula ización. Se ans o mó P. ae uginosa PAOI po ado a del plásmido pMH655
(con gen de esis encia a gen amicina) (Rasmussen e al., 2005) con la lib e ía gené ica
así ob enida. La ans o mación se ealizó de la siguien e o ma: 1,5 mL de un cul i o
de 12 h de P. ae uginosa PAOI pMH655 a 42ºC en 5 mL de LB + gen amicina 20
μg/mL, se cen i ugó 5 min a 10.000 pm. El pelle ob enido se la ó dos eces con un 1
mL de MOPS 1 mM / Glice ol 10% a pH 7,2 (4ºC) y se esuspendió con el olumen de
en ase del pelle . La suspensión celula así ob enida se elec opo ó con 2 μL de lib e ía.
El plásmido pMH655 p esen a una usión del p omo o de lasB y el gen sacB
codi icado de la le anosaca asa de Bacillus sub ilis (S einme z e al., 1983). Se a a de
un biosenso de QQ denominado “quo um sensing inhibi o selec o ” (QSIS)
(Rasmussen e al., 2005), el gen lasB codi ica la elas asa B de P. ae uginosa, gen
in oluc ado en su pa ogenicidad cuya exp esión es a con olada po QS basado en AHL
de es a bac e ia. La le anosaca asa SacB sec e ada po Bacillus sub ilis ca aliza una
hid oxilación de la saca osa p opiciando la o mación del políme o bac e icida le ano
(Gay e al., 1983). Como esul ado, en p esencia de AHLs y saca osa se p oduci á la
exp esión de sacB y la p oducción de le ano, p o ocando la mue e de la bac e ia. Sólo
aquellos clones po ado es de un gen de QQ p od án sob e i i .
Ma e iales y Mé odos
49
El medio u ilizado pa a la de ección de clones con ac i idad QQ se p epa ó de la
siguien e o ma: LB sólido (15% de aga ), saca osa 60 mg/mL, ci a o sódico 40 mM,
OC12-HSL 200 nM, C4-HSL 200 nM, Gen amicina 80 g/mL y Te aciclina 125
g/mL. Las placas selec i as se inocula on con 100 L de suspensión bac e iana
ans o mada y se incuba on a 37ºC. T as 24 ho as se obse ó c ecimien o. El núme o
de clones analizados po cada ans o mación se de e minó median e placas con ol sin
saca osa donde se con a on el núme o de colonias ob enidas. Pa a conoce el núme o
mínimo de clones que se debían analiza pa a asegu a , con un 99% de p obabilidad,
que se ha analizado el gen o genes esponsables de la ac i idad QQ en T. discolo 20J se
u ilizó la ó mula: N = ln(1 - P)/ln(1 - ). Donde P es la p obabilidad asignada (0,99),
es la p opo ción del genoma ep esen ada en un único clon y N es el núme o de
ecombinan es a analiza pa a ob ene P. Se conside ó que la bac e ia analizada end ía
ap oximadamen e 7000 genes, con lo que el alo de = 1/7000 y pa a P = 0,99 implicó
el análisis de 32000 ecombinan es.
Pa a comp oba la alidez de la me odología u ilizada se ealizó una
ans o mación del mismo biosenso QSIS P. ae uginosa PAOI pMH655 con el
plásmido pME6000 po ado del gen aiiA codi icado de lac onasa de Bacillus sp. El
biosenso de QQ P. ae uginosa PAOI pMH655 ue p opo cionado po el P o . Michael
Gi sko del Depa men o In e na ional Heal h, Immunology and Mic obiology de la
Uni e sidad de Copenhague (Dinama ca).
4.6 Análisis de pa ogenicidad de Tenacibaculum discolo 20J
Con el obje i o de de e mina si la cepa 20J de T. discolo aislada en es e abajo
pod ía ene aplicaciones bio ecnológicas pa a acuicul u a se comp obó si és a e a
pa ógena de peces. Pa a ello se ealizó una in ección expe imen al de ju eniles de
odaballo (25 g amos de peso medio) man enidos en un lujo cons an e de agua de ma a
15ºC con ni eles de oxígeno supe io es a 8 mg/L y 32 ‰ de salinidad. Pa a los ensayos
de pa ogenicidad los peces ue on aclima ados a las condiciones an e io es du an e 5
días y luego ue on in ec ados median e inoculación in ape i oneal de 100 L de una
suspensión bac e iana de T. discolo 20J en solución salina (109 células po milili o).
Ma e iales y Mé odos
50
Se es ableció un g upo con ol inoculado con 100 L de solución salina. Se examinó la
mo alidad du an e 21 días.
4.7 Deg adación de AHLs en el géne o Tenacibaculum
Pa a comp oba si la ac i idad deg adado a de AHLs de ec ada en T. discolo
20J e a común en el géne o Tenacibaculum, se ealiza on ambién ensayos con los
biosenso es C. iolaceum CV026 (McClean e al., 1997) y VIR07 (Mo ohoshi e al.,
2008a) pa a di e en es especies (Tabla 4). Vein e mic oli os de soluciones s ock de C6
ó C10-HSL se añadie on a cul i os de 24 ho as de las di e en es especies del géne o
Tenacibaculum en CM, con una concen ación inal de 10 M, e incubadas 24 ho as a
22ºC. Además, en la cepa ipo T. ma i imum NCIMB 2154T se añadió la misma
can idad de AHLs al sob enadan e il ado (0,22 μm) de un cul i o de 24 ho as en CM.
La deg adación de AHL se de e minó po la p oducción de iolaceína en ensayo en
placas de LB con pocillos, como ha sido desc i o an e io men e.
Tabla 4. Cepas de dis in as especies del géne o Tenacibaculum ensayadas pa a deg adación de AHLs.
Pa a e alua el ipo de ac i idad deg adado a de AHLs p esen e en T. ma i imum
NCIMB 2154T se es ablecie on dos ma aces con 15 mL de CM suplemen ado con C10-
Cepas Aislamien o O igen
T. discolo 20J Sedimen o de anque de cul i o Es e abajo
T. discolo DSM 18842 Solea senegalensis , España D a. Ysabel San os
T. discolo LC073.2.2 Solea senegalensis , España D a. Ysabel San os
T. discolo R016.8.1 Pse a maxima, España D a. Ysabel San os
T. gallaicum R006.0.1 Pse a maxima, España D a. Ysabel San os
T. gallaicum A37.1 Agua de anque de cul i o, España D a. Ysabel San os
T. li o eum JCM13039 Sedimen o de zona in e ma eal,
Co ea
Japanese Collec ion Riken BCR
(Hi osawa, Japón)
T. ma i imum NCBI 2154T Pa gus majo , Japón The Na ional Collec ion o
Indus ial, Food and Ma ine
Bac e ia L d. (Abe deen, UK)
T. soleae LL0412.1.7 Solea senegalensis , España D a. Ysabel San os
T. soleae 567/06.1 Dicen a chus lab ax, España D a. Ysabel San os
Ma e iales y Mé odos
51
HSL en concen ación 10 M. Uno de los ma aces ue inoculado con 1 mL de un
cul i o de 48 ho as de T. ma i imum NCIMB 2154T e incubado a 22ºC en agi ación
sua e (110 pm), mien as que el o o se man u o en las mismas condiciones como
con ol. T as 24 ho as, 500 μL de sob enadan e no mal y acidi icado (pH 2) se
ex age on es eces con el mismo olumen de ace a o de e ilo, se e apo a on y
esuspendie on en 200 μL de ace oni ilo pa a análisis po HPLC-MS. Se ex aje on
ambién 500 μL de CM + C10-HSL y la concen ación de C10-HSL ob enida se u ilizó
pa a calcula el po cen aje de deg adación.
5. Señales de quo um sensing en Tenacibaculum
5.1 Cepas u ilizadas y condiciones de cul i o
Además de las bac e ias del géne o Tenacibaculum de las que ya se disponía en
el labo a o io y que habían sido u ilizadas pa a comp oba la ac i idad QQ en el géne o
(Tabla 4), pa a la de ección de AHLs se analiza on ambién 8 nue as cepas pa ógenas
de Tenacibaculum ma i imum: NCIMB 2153 y 2158, ob enidas de The Na ional
Collec ion o Indus ial, Food and Ma ine Bac e ia L d. (Abe deen, UK) y 6 cepas
aisladas en el depa amen o de Mic obiología de la Uni e sidad de San iago
p oceden es de peces en e mos de es aciones de acuicul u a de España y Po ugal. Es as
cepas pe enecen al los p incipales se o ipos y líneas clonales de es a bac e ia
(A endaño-He e a e al., 2004; 2006) y ue on con i madas como T. ma i imum po
análisis PCR (Toyama e al., 1996) (Tabla 5). Pa a el análisis de p oducción de AHLs
las cepas se cul i a on u ina iamen e a 22ºC en medio Flexibac e ma i imum (FMM)
sólido y caldo (Pazos e al., 1996) o en AM/CM, con agi ación sua e a 110 pm en caso
de medio líquido. También se analizó la p oducción de AHLs en Fla obac e ium
psych ophilum PT4.1, que se c eció u ina iamen e en aga “Anacke and O dal” en las
mismas condiciones (To anzo y Ba ja, 1993).
Se u iliza on es biosenso es basados en lux de E. coli JM109 (Swi e al.,
1997; Winson e al., 1998) pa a la de ección de AHLs en sob enadan es y ex ac os de
las di e en es especies del géne o Tenacibaculum. Las es cepas biosenso as pe mi en
la de ección de odo el ango de amaños de AHL debido a que p esen an ecep o es con

Ma e iales y Mé odos
52
dis in a especi icidad pa a las señales AHL. E. coli JM109 pSB401, con el gen
codi icado del ecep o de AHL luxR (V. ische i), se u ilizó pa a de ección de AHLs de
amaño in e medio; E. coli JM109 pSB536, con ahyR de Ae omonas hyd ophila, pa a
AHLs co as y E. coli JM109 pSB1075, con lasR de Pseudomonas ae uginosa, pa a
AHLs de cadena la ga. Los es biosenso es se cul i a on a 37ºC en LB suplemen ado
con el an ibió ico adecuado (Swi e al., 1997; Winson e al., 1998).
Cepas Aislamien o Se o ipo(*)
NCIMB 2154T Pa gus majo , Japón O1/O2 (O2)
NCIMB 2158 Solea solea, UK O2
NCIMB 2153 Acan hopag us schlegeli, Japón O1/O2 (O1)
ACR104.1 Scoph halmus maximus, España O2
PC424.1 Scoph halmus maximus, España O2
PC503.1 Solea senegalensis, España O1
PC538.1 Spa us au a a, España O1
LgH35-O3 Solea senegalensis, España O3
ACC6.1 Scoph halmus maximus, Po ugal O3
Tabla 5. Cepas de Tenacibaculum ma i imum u ilizadas pa a la de ección de señales AHL. (*) Se o ipos
según el esquema de ipado de A endaño-He e a e al. 2006.
5.2 Toma de mues as y ex acción de AHLs
Se oma on mues as de 40 mL de sob enadan es de cul i os de las di e en es
cepas de Tenacibaculum en FMM a 24 y 48 ho as después de su inoculación. Se
il a on (0,22 m) y ese a on 10 mL a -20ºC y el es o se acidi ica on a pH 2 con
HCl 1M y se incuba on 24 ho as a 25ºC a 200 pm. Pos e io men e se ealizó una doble
ex acción o gánica de AHLs con el mismo olumen de diclo ome ano y se e apo ó en
o a apo a 40ºC has a ob ene el ex ac o seco que se esuspendió en 1 mL de
ace oni ilo. Los ex ac os así ob enidos se man u ie on a -20ºC pa a pos e io es
análisis.
Pa a es udia el e ec o del medio de cul i o en la p oducción de AHL, se
seleccionó la cepa ipo de T. ma i imum (NCIMB 2154T). Se cul i ó la bac e ia en
Ma e iales y Mé odos
53
FMM o CM y se oma on mues as de 40 mL a di e en es iempos as inoculación: 12,
24, 48 y 75 ho as. Las AHLs se ex aje on como se explicó an e io men e pa a pos e io
análisis con biosenso es en luminóme o y HPLC-MS. Con el obje i o de ep oduci la
me odología u ilizada po o os au o es que no pudie on de ec a la p esencia de AHLs
en el pa ógeno pe enecien e al g upo de los Bac e oide es Fla obac e ium
psych ophilum, ambién se ealiza on ex acciones de AHLs de medio sólido FMM y
AM de T. ma i imum NCIMB 2154T y Fla obac e ium psych ophilum PT4.1 cul i ado
en Anacke y O dal aga . Pa a ello se ans i ie on co es de aga con colonias a ubos
de c is al donde se homogeneiza on con dis up o con 3 mL de ace a o de e ilo ( es
eces). Se sepa ó el sol en e po cen i ugación a 3.000 pm y se e apo ó bajo lujo de
ni ógeno. Se econs i uyó el ex ac o seco ob enido con 1 mL de ace oni ilo pa a su
pos e io análisis (B uhn e al., 2005).
Pa a de e mina si se p oducían cambios en el modo de c ecimien o en
biopelícula de T. ma i imum NCIMB 2154T se añadió la señal C4-HSL en
concen aciones: 1; 2,5; 5 y 10 g/mL a cul i os de la bac e ia en 15 mL de FMM o
CM. La inción de biopelícula se ealizó con 500 L de solución c is al iole a-oxala o
(Pan eac).
5.3 De ección e iden i icación de AHLs
5.3.1 C oma og a ía en capa ina (TLC)
Dos mic oli os de cada ex ac o o gánico de sob enadan es de cul i o se
ca ga on sob e placas de TLC de gel de sílica C18 de ase e e sa. Las mues as se
c oma og a ia on con me anol/agua (60/40% / ) como ase mó il (Shaw e al., 1997).
También se ca ga on 2 L de AHL sin é ica p oceden es de s ock con 10 g/mL (50
μM) de concen ación como con oles. Las AHLs u ilizadas ue on C4-HSL pa a E. coli
JM109 pSB536, C8-HSL pa a E. coli JM109 pSB401 y C12-HSL pa a E. coli JM109
pSB1075. Las placas de TLC se seca on a empe a u a ambien e y cub ie on con 3 mL
de LB blando (8% de aga ) inoculado con 30 L de un cul i o de 12 ho as de cada
biosenso . T as la solidi icación del LB blando, las placas se incuba on a 37ºC y cada
Ma e iales y Mé odos
54
ho a se coloca on placas de adiog a ía sob e las TLCs pa a la de ección de emisión de
luz po los biosenso es.
5.3.2 Luminóme o
Los es biosenso es de E. coli JM109 ambién se u iliza on pa a la de ección de
AHLs en sob enadan es “c udos” (no some idos a ex acción) y en ex ac os o gánicos
en ace oni ilo. Los ensayos se lle a on a cabo en líquido en placas mic o i e neg as
Fluo o Nunc F96 Mic oWellTM. Pa a sob enadan es c udos, se mezcla on 100 μL con
150 μL de una dilución 1/100 en LB de un cul i o de 12 ho as de los biosenso es. Se
es ablecie on es pocillos po mues a y como con oles posi i os se añadie on AHLs
sin é icas en concen ación inal 1 μg/mL (5 μM) ajus ando el olumen a 100 μL con
LB. Como con oles nega i os se es ablecie on pocillos con 100 μL de medio de cul i o
esco (FMM o CM).
En el caso de ex ac os de sob enadan es, se e apo a on 100 μL de cada ex ac o
di ec amen e en las placas mic o i e . Los ex ac os secos se esuspendie on luego en
150 μL de una dilución 1/100 en LB de un cul i o de 12 ho as de biosenso . Del mismo
modo se es ablecie on con oles posi i os y nega i os e apo ando 100 μL de AHLs
sin é icas o ace oni ilo. Las placas mic o i e se incuba on a 37ºC du an e 4 ho as y se
midió la p oducción de luz en luminóme o Ul a E olu ion X luo 4be a E 4.51e (Tecan
T ading AG, Suiza). Los alo es de bioluminiscencia se no maliza on con los alo es
ob enidos pa a los con oles nega i os.
5.3.3 HPLC-MS
Los ex ac os de sob enadan es que ac i a on los biosenso es de AHL ue on
analizados pos e io men e po HPLC-MS pa a iden i icación de sus AHLs. Los análisis
po HPLC-MS se lle a on a cabo en dos labo a o ios, en No ingham (Reino Unido) y
en San iago de Compos ela, usando di e en es equipos con condiciones simila es. En
No ingham el equipo HPLC u ilizado ue un Shimadzu se ies 10AD VP equipado con
bombas bina ias, un desgasi icado de acío y un au osample SIL-HTc (Shimadzu,
MD, EEUU). La columna usada ue una Phenomenex Gemini C18, 150 x 2 mm (5 m
Ma e iales y Mé odos
55
de amaño de pa ícula) a 45ºC. La ase mó il se es ableció con 0,1% de acido ó mico
en agua (A) y 0,1% de ácido ó mico en ace oni ilo (B). La asa de lujo empleada ue
de 0,45 mL/min. Las condiciones de elución ue on: 1 min con 0% de B, g adien e
lineal has a 50% de B en 0,5 min, g adien e lineal desde 50% has a 90% de B du an e 4
min, luego has a 99% de B du an e 2 min y uel a a condiciones iniciales en 0,2 min. La
columna se eequilib ó du an e 4 min. Se inyec a on alícuo as de 10 L de cada mues a
en la columna. Los análisis median e MS se lle a on a cabo con un 4000 QTRAP
hyb id iplecuad upolo de ampa de iones lineal (Applied Biosys em, CA, EEUU)
equipado con una uen e Tu boIon u ilizada en elec osp ay de ion posi i o y en modo
de moni o ización de múl iples eacciones (MRM). Se u iliza on como es ánda es las
AHLs con o sin sus i uciones oxo- o hid oxi- y de amaños de cadena la e al en e 4 y
14 ca bonos: C4-HSL, N-oxobu anoil-L-homose ín lac ona (OC4-HSL), N-
hid oxibu anoil-L-homose ín lac ona (OHC4-HSL), C6-HSL, OC6-HSL, N-
hid oxihexanoil-L-homose ín lac ona (OHC6-HSL), N-hep anoil-L-homose ín lac ona
(C7-HSL), C8-HSL, OC8-HSL, N-hid oxioc anoil-L-homose ín lac ona (OHC8-HSL),
C10-HSL, N-oxodecanoil-L-homose ín lac ona (OC10-HSL), N-hid oxidecanoil-L-
homose ín lac ona (OHC10-HSL), C12-HSL, OC12-HSL, N-hid oxidodecanoil-L-
homose ín lac ona (OHC12-HSL), N- idecanoil-L-homose ín lac ona (C13-HSL), N-
oxo idecanoil-L-homose ín lac ona (OC13-HSL), N-hid oxi idecanoil-L-homose ín
lac ona (OHC13-HSL), C14-HSL, N-oxo e adecanoil-L-homose ín lac ona (OC14-
HSL) y N-hid oxi e adecanoil-L-homose ín lac ona (OHC14-HSL). Las AHLs en las
mues as ue on iden i icadas po compa ación de iempos de elución y espec os de
picos ob enidos pa a las es ánda .
En San iago de Compos ela el equipo y condiciones u ilizadas ue on las mismas
que las desc i as p e iamen e (sección 1.3 de ma e iales y mé odos).
5.4 De ección de AHLs in i o
Se ealiza on in ecciones expe imen ales de ju eniles de odaballo (25 g amos
de peso medio) man enidos en un lujo cons an e de agua de ma a 15ºC con ni eles de
oxígeno supe io es a 8 mg/L y 32 ‰ de salinidad. Pa a los ensayos de pa ogenicidad los
peces ue on aclima ados a las condiciones an e io es du an e 5 días y luego ue on
Resul ados y Discusión
62
cepas, la cepa 20J, con ac i idad enzimá ica QQ sob e las AHLs p esen es en el medio
de cul i o.
0
20
40
60
80
100
C+
5
6
7
20J
89
90
91
92
100
101
102
103
104
105
106
107
112
113
114
115
124
125
Aislado
10
3
x RLU
Figu a 11. Diag ama de ba as ob enido po cuan i icación de bioluminiscencia de E. coli JM109
pSB1075, en el ensayo de deg adación de C12-HSL (50 µM) en medio líquido pa a la de ección de cepas
ma inas con ac i idad QQ. Las cepas 5, 20J, 100 y 124 pa ecen deg ada o an agoniza la acción de C12-
HSL as 24 ho as ya que inhiben la p oducción de luz del biosenso , pe o las cepas 100 y 124 esul a on
alsos posi i os en el ensayo sólido con C. iolaceum CV026. Los alo es de luminiscencia son la media
de es pocillos de placa mic o i e . Con ol (C+): C12-HSL 50 µM en CM. RLU: unidades ela i as de
luz.
La ele ada can idad de cepas nega i as pa a deg adación de AHLs en el análisis
con HPLC-MS de las seleccionadas en el bioensayo en medio líquido, mo i ó el
desa ollo de un nue o ensayo en medio sólido con C. iolaceum CV026 pa a con i ma
la posible p oducción de an agonis as. Es e nue o ensayo nos pe mi ió di e encia de
mane a di ec a las cepas con inhibición de c ecimien o sob e biosenso de las cepas con
ac i idad QQ eal. Así, en odas las cepas posi i as con doble ac i idad ob enidas en el
ensayo en medio líquido que no pudie on se con i madas po HPLC-MS se obse ó la
p oducción de un halo de inhibición de c ecimien o de C. iolaceum CV026.
P obablemen e es a inhibición de c ecimien o ue la esponsable de la no de ección de

Resul ados y Discusión
63
bioluminiscencia con los biosenso es basados en lux. La mayo ía de es as cepas
p ocedían de la mues a de F. esiculosus y p esen aban un c ecimien o en swa ming
ca ac e ís ico (Figu a 12). En el ensayo con C. iolaceum CV026 en medio sólido se
iden i ica on 24 cepas con ac i idad QQ, lo que ep esen ó un 14,5% de las cepas
aisladas (Tabla 6). Se con i ma on de es e modo 10 cepas con QQ de las iden i icadas
con E. coli JM109, siendo 7 ac i as en e a C4-HSL en el ensayo líquido, y se
de ec a on 10 nue as cepas capaces de deg ada C6-HSL.
Figu a 12. Imagen del c ecimien o en swa ming e inhibición de c ecimien o de a ios aislados ma inos en
ensayo de de ección de QQ en medio sólido con C. iolaceum CV026.
No se obse a on di e encias es adís icamen e signi ica i as en e los medios
u ilizados pa a el aislamien o de cepas con ac i idad QQ (Tabla 6, es Chi cuad ado,
p>0,05). Ap oximadamen e el 50% de las cepas ac i as se aisla on a 22ºC y po an o el
e ec o de la empe a u a sob e el aislamien o de bac e ias con ac i idad QQ ampoco ue
signi ica i o ( es exac o de Fishe , p>0,05). Po el con a io se obse a on impo an es
di e encias sob e el aislamien o de cepas con ac i idad QQ dependiendo de la mues a
u ilizada (Tabla 6, es Chi cuad ado, p<0,05). Mien as que las cepas aisladas de los
anques p esen aban un po cen aje de ac i idad QQ en e el 6 y 9% (Tabla 6), casi un
40% de las cepas aisladas de la mues a de F. esiculosus ue on ac i as en e a C6-
HSL (Tabla 6).
Las 24 cepas capaces, apa en emen e, de bloquea la ac i idad C6-HSL se
analiza on ambién pa a in e cep ación de C10-HSL con el mismo ensayo en medio
sólido usando el biosenso C. iolaceum VIR07. De és as, solamen e 15 ue on capaces
Resul ados y Discusión
64
de in e cep a comple amen e en 24 ho as la ac i idad C6 y C10-HSL (Figu a 13) y po
an o es as cepas ue on seleccionadas pa a ca ac e ización de su ac i idad QQ e
iden i icación. De es os aislados, 7 p ocedie on de mues a de F. esiculosus, 7 de
sedimen o de anque y 1 de biopelícula de anque de agua de ma (Tabla 7).
Pa alelamen e se ealizó un ensayo con C. iolaceum CV026 pa a de ec a la
p oducción de AHLs po los aislados que nos pe mi iese es ima la p e alencia de
bac e ias p oduc o as de AHLs en las mues as y pe mi i de ec a posibles
in e e encias en ensayos de QQ. Sin emba go no se de ec ó p oducción de AHLs en
es e ensayo con ninguno de los aislados ma inos ensayados debido a la ela i a al a
concen ación de AHLs necesa ia pa a se de ec ados po los biosenso es de C.
iolaceum.
Figu a 13. Fo o de un ensayo en medio sólido pa a la de ección de ac i idades QQ en cepas ma inas con
los biosenso es de AHLs C. iolaceum CV026 (A) y C. iolaceum VIR07 (B). Las cepas ma inas capaces
de deg ada o an agoniza la acción de C6 y C10-HSL (10 µM) as 24 ho as impiden la o mación del
halo de iolaceína en los biosenso es. El pocillo cen al se co esponde con el con ol de AHL (10 µM).
También se es ablecie on con oles nega i os pa a QQ con la bac e ia Vib io anguilla um.
Además, en es as cepas se comp obó la capacidad de deg adación de la AHL
sus i uida OC12-HSL u ilizando un ensayo en placa con el biosenso E. coli JM109
pSB1075 (Figu a 14). Diez de las 15 cepas ue on capaces de sup imi comple amen e
la AHL sus i uida de ec able po el biosenso (Tabla 7), indicando que es os aislados
pueden inac i a un amplio ango de AHLs.
A B
168 168
20J 20J
176 176
Con ol
C6-HSL
Con ol
C10-HSL Vib io
anguilla um
Vib io
anguilla um
Resul ados y Discusión
65
Figu a 14. Fo o de un ensayo en medio sólido pa a la de ección de ac i idad QQ sob e OC12-HSL en
cepas ma inas con el biosenso E. coli JM109 pSB1075. Las cepas ma inas capaces de deg ada o
an agoniza la AHL as 24 ho as impiden la p oducción de luz po el biosenso . El pocillo cen al se
co esponde con el con ol de AHL (10 M), los pocillos a la izquie da se co esponden con aislados
nega i os pa a deg adación de OC12-HSL (Cepas 30 y 33).
1.1.3 Con i mación de la ac i idad deg adado a de AHLs po HPLC-MS
Las 15 cepas capaces de in e cep a C6 y C10-HSL en ensayo en placa con
medio sólido ue on capaces de educi signi ica i amen e la concen ación de C4 y
C12-HSL cuan i icada po HPLC-MS (Figu a 15). El pH inal de los cul i os as 24
ho as de ensayo de deg adación es u o, en odos los casos, po debajo de 7,0 y po an o
se pudo desca a una ape u a espon ánea del anillo HSL de las señales debido a pHs
básicos. Es e esul ado indicó la p esencia de ac i idad enzimá ica deg adado a de
AHLs en odas las cepas. El aspec o del halo de iolaceína en C. iolaceum pe mi ía ya
adelan a la p esencia de ac i idad QQ de ipo enzimá ico ya que, con la concen ación
de AHLs u ilizada, la deg adación enzimá ica de señales se mos a ía como ausencia o
educción del diáme o del halo iole a al ededo de los pocillos, mien as que un
an agonis a de AHLs gene almen e se mues a como un halo mas cla o de iolaceína
odeado po un segundo halo de iolaceína más in enso, como ocu e con la di usión de
u anonas de D. pulch a (Figu a 9).
Resul ados y Discusión
66
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CM
C12
2 5 168 172 173 176 177 20J 24 30 33 50 97-1 97-2 61
Cepa
% AHL
C12 C12 acidi icado
Fucus Sedimen o Biopelícula
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CM
C4
2 5 168 172 173 176 177 20J 24 30 33 50 97-1 97-2 61
Cepa
% AHL
C4 C4 acidi icado
Biopelícula
Fucus Sedimen o
Figu a 15. Análisis HPLC-MS de deg adación de C4 y C12-HSL (50 µM) as 24 ho as po las 15 cepas
QQ posi i as seleccionadas. Se acidi icó a pH 2 pa a ecupe a el anillo lac ona (ba as e des)
Resul ados y Discusión
67
O igen Cepa Bac e ia cul i ada más ce cana 16S
% ID G am TSA-I OC12 Posible
secuencia
2 Hyphomonas sp. DG895 99 - - +++
Acilasa y
lac onasa
5 S appia sp. 98 - - + lac onasa
168 Al e omonas sp. BCw156 99 - - +++ acilasa
172 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa
173 Rhodococcus e y h opolis PR4 100 + + +++ lac onasa
176 S appia sp. 98 - - +++ lac onasa
Fucus esiculosus
177 Phaeobac e sp. NH52F 96 - - +++
20J Tenacibaculum discolo DSM
18842 99 - - +++
24 Bacillus ci culans cepa X3 98 + + +++ lac onasa(1)
30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa
33 Halomonas aeanensis BH539 99 - - -
50 Rhodococcus e y h opolis MM30 99 + + +++ lac onasa
97-1 S appia sp. 98 - - +++ lac onasa
Sedimen o
97-2 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa
Biopelícula
61 Roseo a ius aes ua ii SMK-122 99 - - +++
Tabla 7. Iden i icación de las 15 cepas con ac i idad QQ de amplio espec o en base a las secuencias de
sus genes de ARN 16S. También se mues a la inción de G am según mé odo adicional de las cepas, la
capacidad de c ecimien o en medio sin sales ma inas (TSA-I) y la capacidad de deg ada AHL sus i uida
(OC12-HSL), así como la p esencia y ipo de posibles secuencias de enzimas deg adado as de AHL en
los genomas secuenciados. (1) Basado en la p esencia común de lac onasas en los genomas disponibles
del géne o Bacillus.
La mayo ía de las cepas deg ada on comple amen e C4 y C12-HSL a pesa de
que los bioensayos con las que se selecciona on o iginalmen e ue on con las señales C6
y C10-HSL. La ecupe ación de AHL debido a la acidi icación del medio de cul i o a

Resul ados y Discusión
68
pH 2, que pe mi e la eci cula ización del anillo HSL causada po ac i idades lac onasa,
ue más ecuen e pa a C4-HSL. Únicamen e en las cepas 2, 24, 168 y 177, que
deg ada on casi comple amen e las AHLs co a y la ga, la acidi icación no ecupe ó la
concen ación de las señales indicando que la ac i idad enzimá ica p esen e en es os
aislados no se debe a una lac onasa. Va ias cepas como 20J p esen a on un pe il de
deg adación di e en e pa a AHL co a y la ga indicando la posible p esencia de más de
un ipo de ac i idad enzimá ica, mien as que o as como las cepas 5, 30, 33, 97-1, 97-2,
172 y 176 pa ecen ene lac onasas con amplio espec o de deg adación de AHLs,
debido a que la concen ación de ambas AHLs se ecupe a pa cialmen e as la
acidi icación del medio de cul i o (Figu a 15).
1.1.4 Iden i icación de aislados
Se ob u ie on las secuencias del gen de ARN ibosómico 16S (Anexo 1) de las
15 cepas seleccionadas y, pa a su iden i icación axonómica, se ealizó una búsqueda
compa a i a median e BLAST en las secuencias disponibles de ARN 16S del
GenBank. La bac e ia más p óxima a cada aislado se mues a en la Tabla 7. De los 15
aislados, dos pe enecen a γ-P o eobac e ia (33 y 168), seis a α-P o eobac e ia (5, 97-1,
176, 2, 61 y 177), cua o a Fi micu es (24, 30, 97-2 y 172), dos a Ac inobac e ia (50 y
173) y una a Bac e oide es (20J).
De las 15 cepas ma inas aisladas únicamen e es: la cepa 24 (iden i icada como
Bacillus ci culans al 98% con el iden idad) y las cepas 50 y 173 (Rhodococcus
e y h opolis con un 99 y 100% de iden idad espec i amen e), pe enecen a géne os en
los que aislados del medio e es e habían sido desc i os como capaces de deg ada
AHLs (Dong e al., 2002; U oz e al., 2003). Aunque B. ci culans ha sido aislado es as
mues as (Das e al., 2008) la p esencia de especies de Bacillus no es común en
mues as del medio ma ino (I ano a e al., 1999). Debido a que el aislado 24 p ocede de
un sedimen o de anque de un ci cui o ce ado de agua de ma pa a cul i o de peces en
unas ins alaciones lejanas al ma (San iago de Compos ela), es posible que su o igen sea
e es e.
Resul ados y Discusión
69
‐P o eobac e ia
‐P o eobac e ia
Fi micu es
Ac inobac e ia
Bac e oide es
Cepas aisladas en es e abajo
Cepas con N-acilhomose ín lac ona acilasas
Cepas con ac i idad quo um quenching no ca ac e izada
Cepas con lac onasas
‐P o eobac e ia
Cianobac e ia
Shigella sp. 5 219944573
Klebsiella pneumoniae 342 206575712
Shewanella sp. MIB015 161408102
Pseudoal e omonas a lan ica T6c 109896322
Al e omonas sp. BCw156 229892555
168
Gamma p o eobac e ium HTCC5015 254449402
Endosymbion o Lucinoma sp. 209869711
Gamma p o eobac e ium NOR5-3 218703224
Ch omohalobac e salexigens DSM 30439402
Halomonas aeanensis BH539 50236441
33 Azo obac e inelandii DJ 226942170
Pseudomonas ae uginosa PAO1 110645304
Pseudomonas pu ida KT2440 26986745
Pseudomonas sy ingae B728a 66043271
Pseudomonas luo escens P 0-1 255961261
Acine obac e sp. C1010 34484363
Rals onia solanacea um GMI1000 17544719
Rals onia picke ii 12D 241661625
Comamonas sp. D1 33329791
Va io o ax pa adoxus VAI-C 11385580
Sphingopyxis wi la iensis W-50 253680762
61
Roseo a ius aes ua ii 182892404
177
Phaeobac e sp. NH52F 209981527
Rhodobac e aes ua ii 161513025
2
Hyphomonas sp. DG895 32441397
97-1
5
176
Rhodobac e aceae bac e ium MEBiC05066 1828924041
Bosea hiooxidans KB13-VS 6273428
B ady hizobium sp. BTAi1 CP000494
Ag obac e ium ume aciens s . C58 1591184118
Rhodococcus e y h opolis MM30 190351101
173
50
A h obac e sp. IBN110 31558965
S ep omyces sp. M664 49781330
Anabaena sp. PCC 7120 39010
Bacillus hu ingiensis 49476684
Bacillus sp. A24 225921123
24
Bacillus ci culans X3 190364844
Oceanobacillus caeni 115551759
30
Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611
172
97-2 Fla obac e ium aqua ile 87116142
20J
Tenacibaculum discolo 151416868
100
100
95
100
100
99
94
78
67
100
100
96
82
100
100
100
100
100
100
100
99
84
100
100
100
74
100
91
98
100
99
100
96
99
84
57
98
95
90
74
0.02
‐P o eobac e ia
‐P o eobac e ia
Fi micu es
Ac inobac e ia
Bac e oide es
Cepas aisladas en es e abajo
Cepas con N-acilhomose ín lac ona acilasas
Cepas con ac i idad quo um quenching no ca ac e izada
Cepas con lac onasas
‐P o eobac e ia
Cianobac e ia
Shigella sp. 5 219944573
Klebsiella pneumoniae 342 206575712
Shewanella sp. MIB015 161408102
Pseudoal e omonas a lan ica T6c 109896322
Al e omonas sp. BCw156 229892555
168
Gamma p o eobac e ium HTCC5015 254449402
Endosymbion o Lucinoma sp. 209869711
Gamma p o eobac e ium NOR5-3 218703224
Ch omohalobac e salexigens DSM 30439402
Halomonas aeanensis BH539 50236441
33 Azo obac e inelandii DJ 226942170
Pseudomonas ae uginosa PAO1 110645304
Pseudomonas pu ida KT2440 26986745
Pseudomonas sy ingae B728a 66043271
Pseudomonas luo escens P 0-1 255961261
Acine obac e sp. C1010 34484363
Rals onia solanacea um GMI1000 17544719
Rals onia picke ii 12D 241661625
Comamonas sp. D1 33329791
Va io o ax pa adoxus VAI-C 11385580
Sphingopyxis wi la iensis W-50 253680762
61
Roseo a ius aes ua ii 182892404
177
Phaeobac e sp. NH52F 209981527
Rhodobac e aes ua ii 161513025
2
Hyphomonas sp. DG895 32441397
97-1
5
176
Rhodobac e aceae bac e ium MEBiC05066 1828924041
Bosea hiooxidans KB13-VS 6273428
B ady hizobium sp. BTAi1 CP000494
Ag obac e ium ume aciens s . C58 1591184118
Rhodococcus e y h opolis MM30 190351101
173
50
A h obac e sp. IBN110 31558965
S ep omyces sp. M664 49781330
Anabaena sp. PCC 7120 39010
Bacillus hu ingiensis 49476684
Bacillus sp. A24 225921123
24
Bacillus ci culans X3 190364844
Oceanobacillus caeni 115551759
30
Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611
172
97-2 Fla obac e ium aqua ile 87116142
20J
Tenacibaculum discolo 151416868
100
100
95
100
100
99
94
78
67
100
100
96
82
100
100
100
100
100
100
100
99
84
100
100
100
74
100
91
98
100
99
100
96
99
84
57
98
95
90
74
0.02
Figu a 16. Á bol ilogené ico cons uido po el mé odo del ecino más p óximo (“neighbou -joining”)
mos ando las elaciones axonómicas basadas en secuencias de genes de ARN 16S de los 15 aislados
seleccionados en es e abajo (en ojo) y especies an e io men e desc i as con ac i idad quo um
quenching. El código que sigue a cada axón se co esponde con el núme o de acceso a su espec i a
secuencia del 16S. Se mues an los po cen ajes mayo es del 50% de homología en el análisis neighbou -
joining. Ba a de escala: 0,02 sus i uciones po posición nucleo ídica.
Resul ados y Discusión
70
Dos aislados, ob enidos de di e en e mues a, la cepa 50 de sedimen o y la cepa
173 de F. esiculosus, ue on iden i icados como R. e y h opolis (Tabla 7), indicando
que es a especie es un ep esen an e común en e las bac e ias ma inas con ac i idad
QQ. El géne o Rhodococcus es á ampliamen e dis ibuido en hábi a s acuá icos y
e es es y a ias especies son conocidas po su al a capacidad deg adado a de
compues os o gánicos complejos (Good ellow y Maldonado, 2006). Va ias especies de
es e géne o deg adan AHLs, pe o has a la echa odas son p oceden es de mues as de
o igen e es e (U oz e al., 2008).
Todos los aislados con ac i idad QQ no desc i a p e iamen e pe enecen a
géne os ípicos de ambien es ma inos aunque muchos ue on capaces de c ece en TSA-
I (NaCl 1%) (Tabla 7). La α-P o eobac e ia S appia sp. (cepas 5, 176 y 97-1), un géne o
que incluye a ias especies ma inas clasi icadas an e io men e como pe enecien es al
géne o Ag obac e ium, y el Fi micu e Oceanobacillus sp. (cepas 172, 30 y 97-2), un
géne o que incluye muchas especies ma inas alcaló ilas acul a i as, pa ecen se
abundan es y ubicuos, ya que ep esen an es de ambos géne os pudie on se aislados
a ias eces de mues as de muy di e en e o igen (F. esiculosus y sedimen o de
anque).
De en e las cepas aisladas de mues a de F. esiculosus, Hyphomonas sp. (cepa
2) pe enece al g upo de los p os ecados, bac e ias ípicamen e epibion es de algas
(Poindex e , 2006), mien as que Al e omonas sp. (cepa 168) es un géne o de γ-
P o eobac e ias ma inas que son aisladas con ecuencia de a ios ambien es ma inos,
incluyendo algas (Gau hie y B ei maye , 1992). Ambas especies ue on incapaces de
c ece en TSA-I indicando que se a a de cepas con o igen es ic amen e ma ino (Tabla
7). Finalmen e, la cepa 177 (Cepa obje o de pa en e, Anexo 2.4) ep esen a una nue a
especie de α-P o eobac e ia que es á elacionada (ID 96%) con Phaeobac e sp., un
géne o de bac e ias ma inas p óximo al g upo de las Roseobac e ias (Ma ens e al.,
2006; Figu a 16), aunque las secuencias más p óximas ilogené icamen e a es e aislado
se co esponden con bac e ias no cul i ables (Jones e al., 2007). En cuan o a los
aislados p oceden es de sedimen o de anque de peces, la cepa 20J p esen ó un 99% de
iden idad en su secuencia del gen de ARN 16S con el pa ógeno de peces
Tenacibaculum discolo . El géne o Tenacibaculum pe enece al g upo Bac e oide es,
Resul ados y Discusión
71
que cons i uye uno de los g upos dominan es de bac e ias he e ó o as en los ambien es
acuá icos e incluye a ias especies causan es de la enacibaculosis/ lexibac e iosis o
“gliding bac e ial disease” en peces. So p enden emen e, la cepa 20J ue aislada en
TSA-I, una ca ac e ís ica que la exclui ía de la especie Tenacibaculum discolo
(Piñei o-Vidal e al., 2008). La cepa 33 se iden i icó como miemb o del géne o
Halomonas (ID 99%), un g upo de γ-P o eobac e ias gene almen e ma inas que incluye
a ias cepas halo ílicas mode adas. La única cepa con ac i idad QQ aislada de
biopelícula de anque de agua de ma (cepa 61) ue iden i icada como Roseo a ius
aes ua ii (ID 99%). El géne o Roseo a ius comp ende α-P o eobac e ias es ic amen e
ma inas (Lab enz e al., 1999). Es a especie pe enece al linaje de Roseobac e ias que,
se es ima, comp ende del 20 al 30% de las secuencias de genes ARN 16S de la zona
ó ica de los hábi a s ma inos (Wagne -Doble y Biebl, 2006).
Las elaciones en e las secuencias de ARN 16S de los 15 aislados y las de o as
cepas con ac i idad QQ desc i as con an e io idad (Ca lie e al., 2003; Kang e al.,
2004; U oz e al., 2007) se mues an en el dend og ama de la Figu a 16. Aunque Del ia
sp. A317 y Och obac um sp. A44 p esen an ac i idad QQ (Ja a e al., 2006), no
ue on incluidas en el análisis debido al escaso amaño de la secuencia de ARN 16S
disponible en las bases de da os.
1.1.5 Genes de quo um quenching en colecciones de me agenomas ma inos
Aunque la p esencia de lac onasas ya ha sido desc i a en colecciones de
me agenomas de mues as de suelo p oceden es de una planicie del ío Tanana en
EEUU y de una ie a de pas os en F ancia (Williamson e al., 2005; Riaz e al., 2008;
Schippe e al., 2009), no se han ealizado búsquedas de genes QQ en o os hábi a s.
Pa a de e mina si es e ipo de enzimas (lac onasas y acilasas) son an comunes en el
medio ma ino como la ac i idad QQ encon ada en bac e ias ma inas cul i ables
aisladas en es e es udio, se analiza on las secuencias de colecciones de me agenomas
ma inos pa a de ec a homólogos de las secuencias de lac onasas y acilasas conocidas.
Resul ados y Discusión
78
m, lo que se ha denominado “dis ancia de llamada”. Po an o, la di usión molecula a
la gas dis ancias, como la espe ada en comunidades bac e ianas ma inas de ida lib e,
lle a ía mucho iempo y supond ía mucho gas o ene gé ico.
En el caso de que las ac i idades QQ es u ie an gene almen e asociadas a
ma e ia pa iculada y po an o a supe icies en el medio ma ino, se ía de espe a una
mayo ecuencia de secuencias de genes QQ en las colecciones me agenómicas
p oceden es de biomasa de esquele os de ballenas (75 Mpb, T inge e al., 2005), que no
p esen an des iaciones po il ación. Aunque no se encon a on posibles secuencias de
genes QQ cuando se aplica on las condiciones más es ic i as, la ecuencia de
secuencias de QQ ob enidas en los esquele os de ballena ue on signi ica i amen e
mayo es que la ob enida pa a colecciones GOS cuando se aplicó el c i e io menos
es ic o, lo que apoya ía la asociación en e la ma e ia pa iculada y los p ocesos de QS
y QQ. De odas o mas, cualquie compa ación en e los esul ados de búsqueda en las
colecciones me agenómicas GOS y de esquele o de ballena debe oma se con
p ecaución debido a la di e encia de amaños de secuencia disponible en cada una de
ellas.
O a hipó esis que explica ía la disc epancia en la ele ancia de los sis emas de
QS y QQ en las bac e ias ma inas cul i ables y las bases de da os de me agenomas
ma inos es el núme o limi ado de secuencias de las que disponemos pa a enzimas
p oduc o as y deg adado as de AHLs. La mayo ía de las sin e asas de AHL que han
sido iden i icadas son homólogos de LuxI pe enecien es a α-, β- y γ-P o eobac e ia
(Williams e al., 2007). La amplia a iedad axonómica de P o eobac e ias ma inas
p oduc o as de AHLs jun o con el ecien e descub imien o de p oducción de AHLs po
aislados ma inos de Bac e oide es (Huang e al., 2008; Rome o e al., 2010, Anexo 2.2),
pod ía es a indicando la exis encia de una mayo di e sidad molecula de sin e asas y
ecep o es de AHLs cuya p esencia no se ía e elada po el uso de las secuencias de
luxI y luxR en las colecciones de me agenomas. El mismo p oblema se ía aplicable a las
secuencias de QQ. Así, ecien emen e se ha clonado una nue a clase de lac onasa de R.
e y h opolis (U oz e al., 2008), que no p esen a homología con la amilia de lac onasas
bien ca ac e izadas que compa en un dominio de unión a Zn (HXDH~H~D) y es án
ep esen adas po AiiA de Bacillus sp. (Dong e al., 2000). También se han iden i icado
dos nue as lac onasas en un es udio de me agenoma de suelo (Schippe e al., 2009) y el

Resul ados y Discusión
79
p esen e abajo ha pe mi ido la iden i icación de bac e ias con ac i idad QQ
pe enecien es a 8 nue os géne os en los que es a ac i idad no había sido desc i a con
an e io idad, incluyendo una nue a especie de α-P o eobac e ia (cepa 177) y un
miemb o de Bac e oide es (cepa 20J), lo que segu amen e amplia á el núme o de
secuencias disponibles pa a es as enzimas. La baja homología de las secuencias de
enzimas de QQ hace necesa io educi los po cen ajes de simili ud en las búsquedas en
colecciones de me agenomas y genomas, lo que esul a en un impo an e inc emen o en
la can idad de secuencias con posible ac i idad acilasa o lac onasa (Figu a 18)
disminuyéndo la disc epancia de esul ados ob enidos con la ac i idad de las bac e ias
cul i ables.
O o esul ado signi ica i o de i ado del análisis de me agenomas ma inos es la
cla a di e gencia encon ada en e la dis ibución espacial de lac onasas y acilasas
(Figu a 17). Las lac onasas p esen an homología con la amilia de -lac amasas pe o
pa ecen se enzimas al amen e especí icas sin o con baja ac i idad sob e o as moléculas
(Dong e al., 2007). La única excepción la ep esen a la lac onasa BlcC de
Ag obac e ium ume aciens, cuyo gen o ma pa e del ope ón blcABC, que p esen a
ac i idad sob e -bu i olac ona (GBL) y de hecho le con ie e a la bac e ia capacidad de
c ecimien o con GBL como única uen e de ca bono (Ca lie e al., 2004; Khan y
Fa and, 2008). Po o o lado, las acilasas p esen an homología con acilasas de
ce alospo inas, hid olasas N- e minales (N m) (Dong e al., 2007) y en algunos casos
son capaces de ca aliza la hid ólisis de Penicilina G como la acilasa AhlM de
S ep omyces sp. (Pa k e al., 2005). Debido a es as di e encias de especi icidad en e
los dos ipos p oca io as de enzimas deg adado as de AHLs desc i os has a la
ac ualidad, se puede hipo e iza con que la mayo abundancia de las acilasas,
deg adado as de AHLs en las mues as de me agenomas cos e os, es el e lejo de un
ambien e más ico y complejo en el que las acilasas pod ía ac ua como bloqueado es de
QS mediado po AHLs, así como con o as unciones como de ensa con a la
p oducción de an ibió icos po compe ido es.
A pa e del mayo po cen aje de aislados con ac i idad QQ, la di e sidad
axonómica de bac e ias deg adado as de AHL ob enidas en es e abajo es mucho
mayo que la encon ada en mues as de suelo y asociadas a plan as. Se aisla on
miemb os de 10 géne os di e en es pe enecien es a α-, γ-P o eobac e ia,
Resul ados y Discusión
80
Ac inobac e ia, Fi micu es y Bac e oide es (Figu a 16) incluida la iden i icación de una
nue a especie elacionada con Phaeobac e (cepa 177). Casi odos los aislados ma inos
ac i os pe enecen a géne os comúnmen e o exclusi amen e ma inos, excluyendo un
posible o igen e es e de las cepas, a pesa del ca ác e cos e o de las mues as.
Únicamen e es de los aislados pe enecen a géne os (Bacillus y Rhodococcus) en los
que habían sido desc i o p e iamen e ep esen an es e es es con ac i idad QQ (Dong
e al., 2002; U oz e al., 2003). En con as e con nues os esul ados, en la búsqueda de
QQ ealizada en 800 cepas p oceden es de suelo odos los aislados ac i os
ca ac e izados pe enecie on al géne o Bacillus (Dong e al., 2002). En o o es udio con
di e en es cepas de Bacillus sp. y α-P o eobac e ias p oceden es de mues a de izos e a
de abaco, únicamen e se ob u ie on cepas deg adado as pa a especies de Bacillus
(D’Angelo-Pica d e al., 2005), indicando una meno a iedad de los ep esen an es con
ac i idad QQ en e las bac e ias de suelo, o al menos en e aquellas cul i ables.
Aunque los esul ados de los bioensayos excluían a p io i la posibilidad de que
las cepas seleccionadas p oduje an AHLs o an agonis as que pudie an bloquea los
ecep o es pa a AHL del biosenso , la ac i idad enzimá ica de las 15 cepas
seleccionadas se con i mó median e me odología HPLC-MS (Figu a 15). Los esul ados
de HPLC-MS demos a on que los 15 aislados seleccionados deg ada on ac i amen e
an o C4-HSL como C12-HSL. La acidi icación de los medios de cul i o as el ensayo
de deg adación pe mi ió la iden i icación de posibles ac i idades lac onasa en las cepas,
ya que el anillo lac ona puede se eci cula izado a pHs bajos (Ya es e al., 2002).
La ac i idad lac onasa pa ece es a muy ex endida en el géne o Bacillus (Dong
e al., 2002), sin emba go la acidi icación de los medios as deg adación de AHLs en
nues o aislado de B. ci culans no ecupe ó la ac i idad C12-HSL y sólo un poco de C4-
HSL (Figu a 15) indicando un ipo de ac i idad enzimá ica di e en e de la lac onasa
desc i a has a aho a pa a es e géne o. Se á necesa io con i ma si una posible ac i idad
oxidasa sob e AHLs como la desc i a pa a B. mega e ium (Chowdha y e al., 2007;
Ci ou e al., 2009) es la esponsable de la capacidad QQ de B. ci culans cepa 24.
R. e y h opolis W2 es una cepa pa icula pues se ha demos ado que es capaz de
inac i a un amplio ango de AHLs usando es mecanismos enzimá icos di e en es: una
lac onasa, una acilasa y una oxido educ asa que educe las oxo-AHLs a sus
equi alen es hid oxilados (Pa k e al., 2006; U oz e al., 2008). Es a combinación única
Resul ados y Discusión
81
no pudo se encon ada en o as cepas e es es de R. e y h opolis, en los que
únicamen e se ha descubie o ac i idad lac onasa sob e las AHLs (U oz e al., 2008).
Es a impo an e di e sidad en cuan o ac i idad enzimá ica en el ni el in aespecie ya
había sido desc i a pa a cepas de R. e y h opolis p oceden es de egiones geog á icas
muy alejadas (B andão e al., 2003). Aunque es necesa io ealiza es udios más
de allados de las ac i idades enzimá icas p esen es en nues os aislados ma inos de R.
e y h opolis, los análisis po HPLC-MS de deg adación de la señal C12-HSL
demues an que el pico de concen ación de AHL no se ecupe a as acidi icación del
medio de cul i o y po an o una ac i idad enzimá ica di e en e de la de lac onolisis
debe ía es a p esen e en ambos aislados. Po el con a io, la señal C4-HSL pudo
ecupe a se pa cialmen e as el a amien o de acidi icación (Figu a 15), y po an o se
p opone la p esencia de un complejo sis ema enzimá ico pa a la deg adación ac i a de
AHLs en nues os aislados ma inos, simila al desc i o pa a R. e y h opolis W2 (U oz e
al., 2008). Es e sis ema me ece á mayo ca ac e ización pues los dos aislados ma inos
de R. e y h opolis ob enidos en es e abajo ambién inac i an la AHL oxo- sus i uida
OC12-HSL (Tabla 7).
Uno de los aislados p oceden es de sedimen o de anque de cul i o de peces, la
cepa 33 iden i icada como Halomonas sp. (99%) y el único aislado ac i o ob enido de la
biopelícula de anque de agua de ma , iden i icado como Roseo a ious aes ua ii (99%)
pe enecen a géne os que habían sido desc i os como p oduc o es de señales AHL
p e iamen e (Llamas e al., 2005, Wagne -Doble e al., 2005). R. aes ua ii pe enece al
linaje ma ino de las oseobac e ias, que ha sido p opues o como el más nume oso de
en e las bac e ias p oduc o as de AHL en el hábi a ma ino, al menos den o de los
g upos bac e ianos cul i ables (Cici elli e al., 2008). La p oducción de AHLs ambién
ha sido desc i a pa a cie as cepas p oduc o as de polisacá idos del géne o Halomonas
(Llamas e al., 2005), ca ac e ís ica que pod ía es a elacionada con su capacidad pa a
p omo e o inhibi el asen amien o la al en o ganismos ma inos como polique os y
b iozoos (Holms om y Kjellebe g, 2000). Po an o, la p esencia de un amplio espec o
de ac i idad deg adado a de señales AHL en es as especies pod ía ep esen a un
mecanismo de au omodulación de los ni eles de señal, como ya ha sido desc i o pa a
Ag obac e ium ume aciens (Zhang e al., 2002), o ambién como sis ema de
in e e encia con las señales de posibles compe ido es (Pa k e al., 2008). Las posibles
Resul ados y Discusión
82
di e encias en cuan o a p oducción de señales AHL y su deg adación en es os géne os,
pod ía cons i ui una buena he amien a expe imen al pa a el es udio de la impo ancia
de las AHLs en la o mación de biopelículas y p ocesos de bio ouling en el medio
ma ino (Dob e so e al., 2009).
La búsqueda de genes de QQ en los genomas bac e ianos secuenciados
disponibles en las bases de da os y con la me odología menos es ic i a (30/70%),
e eló la p esencia de secuencias homólogas en a ias de las especies con ac i idad QQ
iden i icadas en es e abajo (Tabla 7; Figu a 18). En algunos casos, como en las cepas
de S appia sp., que p esen a on una cla a ac i idad lac onasa, la secuencia ob enida de
los genomas del géne o secuenciados coincidió con los esul ados p elimina es del
análisis po HPLC-MS. Po el con a io, en el caso de Oceanobacillus spp., los análisis
po HPLC-MS indica on la p esencia de ac i idad ipo lac onasa, mien as que en el
genoma sólo se de ec ó una secuencia homóloga a acilasas conocidas. La clonación de
las enzimas esponsables de la ac i idad QQ en es os nue os aislados ex ende á muy
p obablemen e nues o conocimien o sob e la a iabilidad y modos de acción de es as
enzimas y pe mi i á una in e p e ación ecológica más comple a de los p ocesos de QQ
de i ada de búsquedas más p ecisas en me agenomas. Además, una ca ac e ización
p o unda de es os aislados y de sus ac i idades pod ía conduci al desa ollo de
he amien as bio ecnológicas pa a el a amien o y p e ención de in ecciones en las que
in e ienen p ocesos de QS mediados po AHLs, especialmen e en el campo de la
acuicul u a (De oi d e al., 2007).
El al o po cen aje de cepas con ac i idad QQ aisladas en el p esen e abajo
pa ece indica que el QQ es una es a egia comúnmen e adop ada po las bac e ias
ma inas cul i ables con el in de ob ene en ajas compe i i as, al menos en medios
ma inos cos e os icos en nu ien es. Es a ac i idad es especialmen e impo an e pa a las
bac e ias aisladas de mues a de F. esiculosus, indicando la exis encia de ue es
in e acciones bac e ianas en la supe icie de las algas. La llama i a di e encia
encon ada pa a los po cen ajes de cepas con QQ en e las bac e ias cul i ables y la baja
ecuencia de genes de QQ en las secuencias de me agenomas ma inos me ece es udios
en más p o undidad pa a de e mina si exis en e dade as di e encias en e la
p e alencia de es as ac i idades en los hábi a s ma inos cos e os y oceánicos o, po el
Resul ados y Discusión
83
con a io, se de i an de las me odologías empleadas en la ob ención de las secuencias
de me agenomas.

Resul ados y Discusión
85
Resul ados y Discusión
87
Capí ulo 2. Quo um quenching en agua de ma de es ua io y ma
abie o
2.1 Resul ados
2.1.1 Aislamien o bac e iano
Con el obje i o de de e mina si las disc epancias encon adas en e el
aislamien o de cepas con ac i idad QQ en comunidades mic obianas densas de o igen
ma ino y la ecuencia de genes de QQ en me agenomas ma inos (Capí ulo 1) e lejaban
di e encias eales en e ambos hábi a s, se epi ió la búsqueda de aislados con capacidad
de in e e i con comunicación mediada po AHLs en mues as ma inas no asociadas a
supe icies y con meno ca ga o gánica consis en es en agua de es ua io ob enida en la
misma localización que las mues as de Fucus esiculosus y biopelícula de anque
ese o io de agua de ma (Ría de A ousa, Capí ulo 1) y ma abie o a 0 y 10 me os de
p o undidad. En es as nue as mues as el núme o de UFCs ob enido ue en e dos y es
ó denes de magni ud in e io a las ob enidas pa a mues as de comunidades mic obianas
ma inas densas (Figu as 10 y 19). La mues a con mayo población bac e iana ue la de
es ua io, alcanzando 4x104 UFCs/mL, un o den de magni ud supe io a las mues as de
al a ma (Figu a 19). En aguas de al a ma la can idad de UFCs ob enida ue simila
pa a ambas p o undidades, y no se encon a on di e encias en e los dis in os medios y
empe a u as u ilizados, alcanzándose alo es máximos con medios de cul i o más
oligo o os como AM 1/100 (Figu a 19), mien as que en agua de es ua io exis ió más
a iabilidad en e medios de cul i o, al igual que ocu ía en las mues as de
comunidades mic obianas densas de o igen ma ino (Figu as 10 y 19). El medio más
e ec i o pa a aislamien o de bac e ias cul i ables en agua de es ua io ue el AM (Figu a
19).
Se selecciona on un o al de 132 aislados en base a mo ología y colo ación de
las colonias pa a la mues a de agua de ma de es ua io y 166 pa a cada una de las
mues as de al a ma (Tabla 9).
Resul ados y Discusión
94
2.1.4 Iden i icación de aislados
Se selecciona on las 4 cepas (138E, 131, 139 y 160) con ac i idad deg adado a
con i mada pa a C4, C6, C10 y C12 pa a su iden i icación axonómica. Pa a ello se
ob u ie on las secuencias del gen de ARN ibosómico 16S (Anexo 1) de las cepas y se
ealizó una búsqueda compa a i a median e BLAST en las secuencias disponibles de
ARN 16S del GenBank. La bac e ia más p óxima a cada aislado se mues a en la Tabla
10. Los aislados 131 y 160 pe enecie on a la misma especie: Salinicola sala ius
(Halomonas sala ia) (Kim e al., 2007) con un po cen aje de simili ud del 98,4% y
99,9% espec i amen e con la secuencia del gen ARN 16S. La ac i idad QQ sob e
AHLs pa ece es a conse ada en especies del g upo de las Halomonas, pues S.
sala ius, que había sido clasi icada has a hace poco como Halomonas sala ia (De la
Haba e al., 2010), es muy p óxima a uno de los aislados con ac i idad QQ de mues a
de sedimen o de anque del capí ulo an e io que ambién se iden i icó como o a
especie de es e géne o (Cepa 33, Halomonas aeanensis 99%). Tan o en el caso de los
dos aislados de Halomonas de al a ma como el ob enido a pa i de sedimen o de
anque del capí ulo an e io , el análisis po HPLC-MS del p oduc o de deg adación
después de acidi icación e ela la p esencia de ac i idad lac onasa (Figu as 15 y 23), lo
que con i ma la obus ez de la me odología empleada.
O igen Cepa Bac e ia cul i ada más ce cana 16S % ID Medio aislamien o
Es ua io
138E Olleya ma ilimosa 99,9 FAS POL
131 Salinicola sala ius
(Halomonas sala ia) 98,4 AM
139 Ma ibac e ul icola 94,7 AM
Al a ma (10 m)
160 Salinicola sala ius
(Halomonas sala ia) 99,9 AM 1/100
Tabla 10. Iden i icación de las 4 cepas con ac i idad QQ en base a sus secuencias de los genes de ARN
16S. Se mues a el o igen y el medio de aislamien o de cada cepa.

Resul ados y Discusión
95
A pesa de que los po cen ajes de iden idad de secuencias de genes de ARN
16S no ue on iguales, el aislamien o de dos cepas de S. sala ius a pa i de la misma
mues a indica ía la posibilidad de que alguno de los 82 aislados posi i os de mues as
de al a ma uesen el esul ado de múl iples aislamien os de la misma cepa. En espe a de
un es udio en p o undidad pa a la ca ac e ización axonómica del es o de las especies
de o igen oceánico con ac i idad, la obse ación mo ológica de las colonias pe mi e
ag upa las en a ias ipologias que indican que e ec i amen e, algunas de las cepas
pod ían habe sido aisladas más de una ez.
Las cepas 138E y 139 aisladas de agua de ma de es ua io y agua de al a ma de
10 m de p o undidad pe enecen al phylum Bac e oide es. En el caso del aislado 138E la
especie más p óxima es Olleya ma ilimosa (99,9%). Es a especie ue aislada de ma e ia
pa iculada de Océano An á ico (Nichols e al., 2005). El géne o Olleya incluye dos
especies Olleya ma ilimosa y Olleya aquima is, aislada de agua de pue o en Co ea
(Lee e al., 2010). La cepa 139 ep esen a ía una nue a especie ya que p esen a un
po cen aje de iden idad del 94,7% con Ma ibac e ul icola. Las especies más p óximas
a las cua o bac e ias seleccionadas son de o igen es ic amen e ma ino, po lo que se
puede desca a una con aminación en la oma de mues as. Ninguna especie de los 3
géne os aislados en es e es udio había sido desc i a p e iamen e como deg adado a de
AHLs o con capacidad inhibi o ia de QS mediado po AHLs.
2.2 Discusión
En el abajo desc i o en es e capí ulo se ealizó una búsqueda de cepas ma inas
con ac i idad QQ en mues as de agua de ma de es ua io y al a ma a 0 y 10 me os de
p o undidad, con el obje i o de compa a los esul ados con las mues as ob enidas en
comunidades bac e ianas densas cos e as. Como se espe aba, en es as mues as se
ob u o una meno densidad de bac e ias cul i ables que en las comunidades bac e ianas
densas u ilizadas con an e io idad pa a los medios seleccionados, aunque el núme o de
UFCs ue conside ablemen e mayo (un o den de magni ud) en aguas de es ua io que en
aguas oceánicas, p obablemen e debido a su mayo ca ga o gánica (Figu a 19).
Como ya sucedie a con mues as del capí ulo an e io , la al a ac i idad
in e cep o a de comunicación po señales AHL encon ada en es os aislados ma inos
Resul ados y Discusión
96
mani ies a que el QQ es un p oceso común en e bac e ias en es e medio. El po cen aje
medio de cepas aisladas capaces de bloquea la ac i idad AHL ob enido en mues as de
agua de ma ue de un 18,3% (Tabla 9), muy simila al de mues as de comunidades
mic obianas densas (14,4%; Tabla 6) y mucho mayo que los po cen ajes ob enidos en
o os es udios pa a mues as de suelo y plan as. Es a ac i idad es especialmen e
signi ica i a en e las bac e ias planc ónicas ob enidas de agua de ma oceánica,
alcanzando al menos un 20% de ac i idad, independien emen e de la p o undidad de la
mues a (Tabla 9). Debido a que en la me odología de búsqueda de ac i idad QQ se
e i ó el uso de cul i os de en iquecimien o, se ha podido ob ene un aislado bac e iano
con posible ac i idad an agonis a de AHLs (cepa 147) (Figu as 21 y 22). Aunque los
esul ados ob enidos oda ía son p elimina es, su con i mación supond ía que la cepa
147 se ía el segundo aislado bac e iano ma ino desc i o con ac i idad inhibi o ia de QS
mediado po AHL, pues o que ecien emen e se ha desc i o un aislado ma ino de
Halobacillus salinus como p oduc o de dos ene ilamidas con es uc u a simila a la de
las AHLs y con capacidad de an agoniza la unión de las señales con sus ecep o es
(Teasdale e al., 2009). La cepa 147 p esen a ía an agonismo sob e AHLs co as pues se
ob u o deg adación comple a de C12-HSL medida po HPLC-MS (Figu a 20). La
ac i idad an agonis a especí ica sob e cie os ipos de AHL ya ha sido desc i a debido a
la di e sidad es uc u al de las señales (Ni e al., 2009), de es e modo es án desc i as
moléculas capaces de an agoniza la ecepción de AHLs co as pe o con escasa
ac i idad sob e AHLs de cadena la e al la ga y ice e sa (Smi h e al., 2003). Aunque
debido a que la deg adación de AHLs la gas po la cepa 147 impide la de ección de
ac i idad an agonis a sob e és as.
Al igual que pa a las mues as de comunidades bac e ianas cos e as no se
encon a on di e encias signi ica i as en e el núme o de cepas con ac i idad QQ
ob enido dependiendo del medio de cul i o o empe a u a u ilizados pa a su aislamien o,
pe o sí en cuan o al o igen de la mues a, con un po cen aje mucho mayo en mues as
de al a ma , 27,7 y 21,7% pa a 0 y 10 me os espec i amen e, en e a sólo un 2,3% en
agua de es ua io, po cen aje que ap oxima a es a mues a al de las mues as de suelo.
Como sucedie a en las mues as de comunidades bac e ianas cos e as, el po cen aje de
aislados con ac i idad QQ pa ece inc emen a se signi ica i amen e en mues as ma inas
con meno núme o de UFCs, como la supe icie del alga F. esiculosus y mues as de
Resul ados y Discusión
97
al a ma (0 y 10 me os). Pa ece exis i una co elación nega i a en e el núme o de
UFCs y ac i idad QQ, ya que las mues as con mayo ac i idad son aquellas que
p esen an meno núme o de bac e ias cul i ables. La mues a de F. esiculosus y las de
al a ma pueden p esen a simili ud en cuan o a la disponibilidad de uen es de ca bono
complejas que impliquen una mayo compe encia po ecu sos.
Un esul ado signi ica i o de i ado del análisis po HPLC-MS es la ele ada
ac i idad deg adado a sob e C12-HSL egis ada po los 85 aislados seleccionados a
pa i de bioensayo con C. iolaceum (Figu a 20), mien as que únicamen e 4 ue on
capaces de deg ada comple amen e la señal co a C4-HSL (Figu a 21). Es e esul ado
con as a con el hecho de que se ha obse ado una meno asa de deg adación de AHLs
la gas espec o co as en agua de ma il ada, que ha sido a ibuida a la exis encia de
enzimas de QQ (Hmelo y Van Mooy, 2009). Además, cuan o mayo sea la cadena
la e al de las AHLs más es able es la molécula, de es e modo las AHLs más la gas son
más es ables a pHs alcalinos (Ya es e al., 2002). Po an o nues as obse aciones
indica ían que las bac e ias ma inas pod ían u iliza p e e en emen e señales AHLs de
cadena la e al la ga como moléculas con mayo uen e de ca bono. A pesa de que los
ensayos de deg adación se ealiza on en medio ico en nu ien es (CM) la deg adación
de AHLs pa ece exp esa se cons i u i amen e en es os aislados, independien emen e de
la disponibilidad de o as uen es de ca bono.
El p incipal obje i o del abajo desc i o en es e capí ulo ue de e mina si las
disc epancias encon adas en e el aislamien o de cepas con ac i idad QQ en mues as
de comunidades mic obianas densas de o igen cos e o y la ecuencia de genes de QQ
en me agenomas ma inos se debía a di e encias en la signi icación ecológica de es e
p oceso en dis in os ambien es ma inos o se de i aba de p oblemas me odológicos. Las
mues as de agua de ma analizadas en es e capí ulo ue on simila es a las u ilizadas
pa a la cons ucción de lib e ías me agenómicas, aunque se e i ó el il ado que se
aplica en algunas de las mues as de me agenomas (0,1-0,8 μm) (Rusch e al., 2007), y
po lo an o se espe aba una meno ac i idad QQ en sus aislados que en los aislados de
supe icies cos e as, po el bajo núme o de secuencias homólogas a acilasas y lac onasas
halladas en me agenomas. Sin emba go, de nue o la ac i idad egis ada ue simila o
incluso mayo que la ob enida pa a mues as de comunidades bac e ianas densas,
especialmen e en las mues as de agua de ma abie o.
Resul ados y Discusión
98
Es po an o más ac ible la segunda hipó esis enunciada en el capí ulo an e io ,
que explica ía la disc epancia en la ele ancia de los sis emas de QS y QQ en las
bac e ias ma inas cul i ables y las bases de da os de me agenomas ma inos en base al
núme o limi ado de secuencias pa a enzimas p oduc o as y deg adado as de AHLs
disponibles. La mayo ía de las sin e asas de AHL que han sido iden i icadas son
homólogos de LuxI pe enecien es a α-, β- y γ-P o eobac e ia (Williams e al., 2007). La
amplia a iedad axonómica de P o eobac e ias ma inas p oduc o as de AHLs jun o con
el ecien e descub imien o de p oducción de AHLs po aislados ma inos de
Bac e oide es (Huang e al., 2008; Rome o e al., 2010, Anexo 2.2), apoya ía la
exis encia de una mayo di e sidad de sin e asas y ecep o es de AHLs cuya p esencia
no se ía e elada po el uso de las secuencias de luxI y luxR en las colecciones de
me agenomas. El mismo p oblema se aplica pa a las secuencias de QQ, pues o que de
los 4 pun os posibles de co e de la es uc u a de las AHL (Figu a 7A, Dong y Zhang,
2005), únicamen e se han desc i o enzimas con ac i idad sob e dos de ellos, po lo que
no se puede desca a que además de exis i secuencias ma inas con baja homología
pa a las acilasas y lac onasas conocidas, exis an o os ipos de enzimas oda ía no
desc i os con es os ipos de ac i idad. Además exis en di e en es amilias de enzimas
con un mismo ipo de ac i idad. Así, ecien emen e se ha clonado de R. e y h opolis una
nue a clase de lac onasa (U oz e al., 2008), que no p esen a homología con la amilia
de lac onasas bien ca ac e izadas que compa en un dominio de unión a Zn
(HXDH~H~D) y es án ep esen adas po AiiA de Bacillus sp. (Dong e al., 2000).
También han sido iden i icadas dos nue as lac onasas en un es udio de me agenoma de
suelo (Schippe e al., 2009). La baja homología exis en e en e las secuencias de las
enzimas de QQ hace necesa io disminui los pa áme os de es icción en las búsquedas
pa a la ob ención de secuencias en los genomas bac e ianos secuenciados (Figu a 18).
La aplicación de es os mismos pa áme os en la búsqueda en colecciones de
me agenomas esul a en un impo an e inc emen o en la can idad de secuencias con
posible ac i idad acilasa o lac onasa disminuyéndose la disc epancia de esul ados
ob enidos con la ac i idad de las bac e ias cul i ables. El p esen e abajo ha pe mi ido
la iden i icación de un o al de 19 bac e ias con ac i idad QQ pe enecien es a 10
nue os géne os en los que es a ac i idad no había sido desc i a con an e io idad,
incluyendo una nue a especie de α-P o eobac e ia (cepa 177) y Bac e oide es (cepa
Resul ados y Discusión
99
139), lo que segu amen e pe mi i á la iden i icación de nue as secuencias de enzimas
deg adado es de AHLs.
O a explicación que oda ía no puede se o almen e desca ada, debido a la
u ilización de mues as de agua de ma no il adas en es e capí ulo, es que la
me odología u ilizada pa a la cons ucción de lib e ías me agenómicas excluye la
ma e ia pa iculada a la que se asocian nume osas bac e ias. La asociación de los
p ocesos de QS y QQ a comunidades bac e ianas asociadas a ma e ia pa iculada (G am
e al., 2002; Cici elli e al., 2008; Hmelo y Van Mooy, 2009; Tai e al., 2009), excluida
de los me agenomas, explica ía ambién la baja ecuencia de genes de QS y QQ
obse ada en és os. Un da o que apoya es a hipó esis es que la cepa 138E, con ele ada
ac i idad QQ sob e AHLs, ob enida en es e abajo se co esponda con Olleya
ma ilimosa, Bac e oide e aislado o iginalmen e de ma e ia pa iculada del océano
An á ico (Nichols e al., 2005).
El océano es un ecosis ema ex emo debido a la baja concen ación de
nu ien es, ya que elemen os como ni ógeno, ós o o y hie o es án ecuen emen e a
concen aciones muy bajas o casi inde ec ables, lo que ocu e en el 70% de los océanos
(Michaels e al., 1994). Es as condiciones limi an en g an medida la abundancia de
bac e ias en aguas oceánicas. La abundancia bac e iana en el océano es un ema
con o e ido debido a las disc epancias ob enidas dependiendo de las écnicas
u ilizadas. Median e écnicas molecula es gene almen e es a densidad se si úa en 105
bac e ias/mL en la supe icie de los océanos (0-300m) (Ducklow, 2000), mien as que
median e cul i o con medios mic obiológicos es ánda únicamen e el 0,1% de és as son
cul i ables (Fe guson e al., 1984), lo que limi a en g an medida las conclusiones
ecológicas que se pueden ob ene a pa i de las bac e ias cul i ables ob enidas de
mues as oceánicas. A pesa de es o, la u ilización de écnicas de ilogenia molecula ,
basadas en la simili ud en las secuencias de genes como el del ARN 16S (Pace e al.,
1986; Woese, 1987) aplicadas a los análisis me agenómicos que secuencian de mane a
alea o ia po ciones de los genomas p esen es en la mues as y de es e modo mues an la
habilidades uncionales de los mic oo ganismos de un de e minado hábi a (Ven e el
al., 2004), han pe mi ido es ima las abundancias ela i as de las di e en es di isiones y
phyla de los mic oo ganismos en el océano. El phylum dominan e de bac e ias en
mues as de océano, an o en mues as cul i ables como en los análisis me agenómicos,

Resul ados y Discusión
100
son las P o eobac e ias (sob e odo - y -P o eobac e ias) cons i uyendo
ap oximadamen e el 60% de las secuencias de RNA 16S en colecciones de los
me agenomas (Gio anonni y S ingl, 2005; Rusch e al., 2007). O o g upo impo an e
del bac e ioplanc on ma ino lo cons i uye el phylum Bac e oide es que, de acue do con
los análisis de hib idación de luo escencia in si u (FISH), cons i ui ía la mi ad de las
células del bac e ioplanc on po encialmen e hib idadas en una mues a ma ina (Co ell
y Ki chman, 2000). Es os esul ados con as an con la baja ecuencia de clones
pe enecien es a Bac e oide es de ec ados en lib e ías de RNA 16S de mues as de
océano. Se ha hipo e izado con que es as disc epancias se pod ían debe a una
des iación apa en e con a es e g upo po los cebado es u ilizados habi ualmen e en la
cons ucción de es as lib e ías (Wea e e al., 2003), sin emba go la ela i a baja
ecuencia de es e phylum en es udios de colecciones me agenómicas ealizados has a la
echa sugie e que los análisis FISH no son comple amen e ep esen a i os (5-13% de
miemb os de Bac e oide es; Gio anonni y S ingl, 2005; Rusch e al., 2007).
Aunque los esul ados de es udios con bac e ias ma inas cul i ables deben
oma se con cau ela y el bajo núme o de ep esen an es con ac i idad QQ limi a la
gene alización de es os esul ados, la di e sidad de bac e ias ob enidas en es e es udio
no e leja los po cen ajes de p e alencia de los dis in os g upos de i ados de las
écnicas molecula es, ya que la mi ad de los aislados seleccionados con ac i idad QQ de
amplio espec o pe enecie on al phylum Bac e oide es (Cepa 138E: Olleya ma ilimosa
y Cepa 139: nue a especie p óxima a Ma ibac e ul icola) mien as que la p e alencia
de es e g upo en mues as oceánicas según lib e ías de secuencias de ARN 16S es
mucho meno . Se piensa que es e g upo cons i uye uno de p incipales deg adado es de
ma e ia o gánica del bac e ioplanc on (Riemann e al., 2000), po an o es posible que
en e la amplia a iedad de es a egias deg adado as en es e g upo, se incluya la
u ilización de señales AHL como uen e de ene gía adicional.
Con la excepción del al o po cen aje de QQ ob enido pa a la mues a de F.
esiculosus, los esul ados ob enidos en es e abajo pa ecen indica que los enómenos
de QQ son más abundan es en aguas oceánicas. En espe a del es udio axonómico de las
82 cepas ob enidas de agua oceánica, los Bac e oide es pa ecen se el g upo
p edominan e en e los aislados de aguas oceánicas con es a ac i idad y po an o pa ece
Resul ados y Discusión
101
exis i una meno di e sidad axonómica en e los aislados con ac i idad QQ de amplio
espec o en el ma abie o espec o a mues as de supe icies cos e as.
Resul ados y Discusión
103
Capí ulo 3. Ca ac e ización de Tenacibaculum discolo 20J, una cepa
ma ina con ele ada ac i idad deg adado a de AHLs
3.1 Resul ados
3.1.1 Especi icidad de la ac i idad quo um quenching
De las cepas con ac i idad QQ iden i icadas en las mues as ma inas, se
seleccionó pa a un p ime es udio de ca ac e ización de la ac i idad la cepa
Tenacibaculum discolo 20J, po se un aislado con al a ac i idad deg adado a sob e las
cinco AHLs es adas inicialmen e (C4, C6, C10, C12 y OC12-HSL), po su ápido
c ecimien o y po se cul i able en medios ma inos y e es es. Po es as ca ac e ís icas
es a cepa ha sido obje o de pa en e y ac ualmen e se encuen a en ase de ap obación
in e nacional (Anexo 2.3). Pa a es a cepa se de e minó, median e HPLC-MS en cul i os
de mayo olumen (20 mL), el ipo de ac i idad QQ que p esen aba y su capacidad de
deg ada odo el ango de AHLs de dis in a longi ud de cadena la e al de las que
disponíamos en el labo a o io. Es a écnica analí ica pe mi e comp oba de o ma
inequí oca la deg adación de las AHLs. Las señales ensayadas ue on: C4, C6, C8, C10,
C12 y C14-HSL en concen ación 50 M. Pa a C4 y C12-HSL se acidi ica on los
sob enadan es pa a la de ección de posible ac i idad lac onasa (Ya es e al., 2002). T as
24 ho as T. discolo 20J eliminó o almen e odas las AHLs no sus i uidas p obadas
demos ando po an o posee ac i idad deg adado a al amen e inespecí ica (Figu a 24).
Como sucedie a en cul i os de 1 mL (Figu a 15), cuando se acidi ican a pH 2 los
sob enadan es de cul i os de mayo olumen de T. discolo 20J se ecupe a
ap oximadamen e la mi ad de la concen ación de la señal co a (Figu a 24). Es e
esul ado indica la posible p esencia de una lac onasa esponsable de, al menos, la mi ad
de la ac i idad deg adado a sob e C4-HSL. En el caso de C12-HSL, no se pudo
ecupe a la molécula señal as acidi icación, po an o la ac i idad enzimá ica de T.
discolo 20J sob e AHLs la gas no puede se explicada po la p esencia de una
lac onasa, debiendo se analizado median e la écnica de dansilación si se a a de una
acilasa (U oz e al., 2005). Es os da os indican po an o que el aislado 20J p esen a
Resul ados y Discusión
110
mayo es (40 kb) y que se á exp esada en E. coli DH5, pa a la que se ha pues o ya a
pun o la me odología pa a la de ección de clones con ac i idad QQ.
3.1.6 Análisis de pa ogenicidad de Tenacibaculum discolo 20J
Con el obje i o de de e mina si la cepa 20J de T. discolo aislada en es e abajo
pod ía ene aplicaciones bio ecnológicas di ec as en el campo de la acuicul u a se
comp obó si e a pa ógena pa a peces. Pa a ello se ealizó una in ección expe imen al de
ju eniles de odaballo, median e inoculación in ape i oneal de 100 L de suspensión
bac e iana de T. discolo 20J en solución salina (109 células po milili o). A pesa de la
ele ada concen ación bac e iana u ilizada pa a la inoculación de los peces no se
egis ó mo alidad de los ju eniles al cabo de 21 días po lo que se desca a la
posibilidad de que es a cepa sea pa ógena pa a odaballo en las condiciones ensayadas.
Es necesa io sin emba go comp oba la pa ogenicidad de es a cepa en o as especies y
en condiciones de es és, an es de pasa a comp oba la iabilidad de su u ilización
como p obió ico en co-inoculaciones con pa ógenos.
3.1.7 Ac i idad quo um quenching en el géne o Tenacibaculum
Adicionalmen e se p oba on o as cepas de dis in as especies del géne o
Tenacibaculum (Tabla 4) pa a de e mina si p esen aban ac i idad deg adado a de
AHLs. Se u iliza on los biosenso es de C. iolaceum CV026 pa a de ec a ac i idad QQ
sob e C6-HSL y C. iolaceum VIR07 pa a C10-HSL. Se obse ó deg adación comple a
de ambas señales as 24 ho as cuando se añadie on a cul i os de odas las especies de
Tenacibaculum ensayadas, con la excepción de T. ma i imum NCIMB 2154T, que no
eliminó la señal co a (Figu a 29A) (Anexo 2.2). Co obo ando esul ados an e io es
que apoyaban la hipó esis de que la lac onasa esponsable de deg adación de AHLs
co as se encon aba en sob enadan es, mien as que la enzima que ac úa sob e la gas se
encuen a ía unida a biomasa, la ac i idad QQ de T. ma i imum sob e AHLs la gas
es a ía asociada a la biomasa, debido a que no se obse ó una educción signi ica i a de
ac i idad C10-HSL cuando la señal se añadió a sob enadan es il ados de la bac e ia
(Figu a 29B).

Resul ados y Discusión
111
T. ma i imum
T. ma i imum
T. ma i imum
T. ma i imum
T. ma i i m um
Sob enadan e
Sob enadan e
CM +
C6-HSL
CM +
C6-HSL
CM +
C10-HSL
CM +
C10-HSL
CM
T. discolo
20J
T. discolo
DSM18842
T. ma i imum
T. l i o eum
T. di sc olo
DSM18842
T. discolo
20J
T. l i o eum
C10-HSL
C6-HSL
A
B
CM
Figu a 29. Fo og a ías de ensayos de QQ en placa con los biosenso es C. iolaceum CV026 (izquie da) y
VIR07 (de echa). A) Ensayo de deg adación de C6 y C10-HSL po cul i os de 24 ho as de T. ma i imum
NCIMB 2154T, T. discolo DSM 18842, T. discolo 20J y T. li o eum JCM13039. Como con oles se
añadie on 2 μg/mL (10 µM) de C6 ó C10-HSL en CM o di ec amen e a pocillo. B) Ensayo de QQ en T.
ma i imum NCIMB 2154T y sob enadan e de un cul i o de 24 de T. ma i imum NCIMB 2154T. Como
con oles se añadie on 2 μg/mL (10 µM) de C6 ó C10-HSL en CM o CM sin AHL.
La ealización del ensayo pa a de e mina el ipo de ac i idad deg adado a
p esen e en T. ma i imum NCIMB 2154T median e análisis en HPLC-MS con i mó que
la bac e ia deg adaba el 90% de la señal C10-HSL as 24 ho as de exposición, pe o no
Resul ados y Discusión
112
se ecupe ó la señal as acidi icación del medio de cul i o, lo que desca a ía una
ac i idad ipo lac onasa en es a cepa (Figu a 30).
Figu a 30. Cuan i icación po HPLC-MS de C10-HSL as 24 ho as en FMM y FMM inoculado con T.
ma i imum NCIMB 2154T, en ex ac os de sob enadan es de cul i o sin acidi icación (ba as e des) o
acidi icados a pH 2 (ba as ojas). Los da os es án exp esados como po cen aje de la concen ación inicial
de AHL (2 μg/mL=10 µM).
3.1.8 De ección e iden i icación de AHLs en el géne o Tenacibaculum y e ec o de
adición de C4-HSL en Tenacibaculum ma i imum NCIMB 2154T
Du an e los ensayos de de ección de QQ con las dis in as cepas de especies
pe enecien es al géne o Tenacibaculum se obse a on halos enues de ac i ación de
iolaceína con el biosenso C. iolaceum CV026 pa a sob enadan es de T. ma i imum
NCIMB 2154T. Es os esul ados pod ían indica la p oducción de AHLs po es os
miemb os de un géne o pe enecien e al g upo Bac e oide es, que cons i uye uno de los
g upos dominan es de bac e ias he e o ó icas en los ambien es acuá icos. Es a
obse ación signi icaba la p ime a desc ipción de la p oducción de AHLs po una no-
p o eobac e ia, ya que has a ese momen o las AHLs sólo habían sido iden i icadas en ,
0
20
40
60
80
100
FM
M
T. ma i imum
% C10-HSL
Resul ados y Discusión
113
 y -P o eobac e ias. Además, en es e caso, se a aba de una bac e ia pa ógena del
g upo Bac e oide es.
Con el obje i o de con i ma es os esul ados p elimina es ob enidos con C.
iolaceum CV026, se u iliza on ambién los es biosenso es de E. coli JM109 con
mayo sensibilidad pa a la de ección de amplio ango de amaños de AHL. Pa a ello se
analiza on sob enadan es c udos (no ex aídos o gánicamen e) ob eniéndose ac i ación
de E. coli JM109 pSB536 en luminóme o lo que indica ía la p esencia de señales AHL
de cadena co a en los sob enadan es del cul i o (no se mues an los da os). Debido a
que la ac i ación de biosenso es pod ía debe se a compues os di e en es de señales ipo
AHL p esen es en los medios de cul i o de Tenacibaculum, se ex aje on o gánicamen e
mues as de mayo olumen (40 mL) de sob enadan es de cul i o omadas a 24 y 48
ho as as inoculación. De nue o es os ex ac os se analiza on median e luminóme o y
TLC con las es cepas biosenso as de E. coli JM109.
Tabla 11. Ac i ación de biosenso de AHLs co as E. coli JM109 pSB536 po ex ac os o gánicos de
sob enadan es de cul i o de di e en es cepas del géne o Tenacibaculum ecogidos después de 24 y 48
ho as de cul i o.
CEPA 24h 48h
T. discolo 20J + ++
T. discolo DSM 18842 + ++
T. discolo LC073.2.2 + ++
T. discolo R016.8.1 + ++
T. gallaicum R006.0.1 + ++
T. gallaicum A37.1 + ++
T. li o eum JCM13039 + ++
T. ma i imum NCBI 2154T + ++
T. ma i imum NCIMB 2153 ++ +
T. ma i imum NCIMB 2158 ++ +
T. ma i imum ACC6.1 + ++
T. ma i imum ACR104.1 +++ +
T. ma i imum LGH35-03 - +++
T. ma i imum PC424.1 + ++
T. ma i imum PC503.1 ++ +++
T. ma i imum PC538.1 ++ +
T. soleae LL0412.1.7 + ++
T. soleae 567/06.1 + ++
Resul ados y Discusión
114
En ambos ensayos se con i mó ac i ación con E. coli JM109 pSB536 an o pa a
las mues as de 24 como 48 ho as pa a odas la cepas del géne o Tenacibaculum
p obadas, aunque con di e encias en el iempo máximo de ac i ación (Tabla 11).
Figu a 31. De ección de ac i idad AHL en ex ac os de medio de cul i o de 24 y 48 ho as de T.
ma i imum NCIMB 2154T en ensayo con TLC. Las TLC ue on cubie as con E. coli JM109 pSB536 y la
luz emi ida po el biosenso ue egis ada median e elado de placas de adiog a ía.
Además, debido a que el ensayo con TLC pe mi e una iden i icación pa cial de
la señal p esen e en los ex ac os po compa ación de mig ación con la de AHLs
sin é icas, se iden i icó el compues o ac i ado como una p obable C4-HSL (Figu a 31).
Los análisis po HPLC-MS iden i ica on de mane a inequí oca la p esencia de C4-HSL
en los ex ac os po compa ación de los espec os de masas con los de la AHL sin é ica
(Figu as 32 y 33). Es os análisis se ealiza on en dos labo a o ios con dos equipos
di e en es y condiciones c oma og á icas lige amen e dis in as pa a a i ica la bondad
de la iden i icación, debido a que se a aba de la p ime a desc ipción de Bac e oide es
pa ógenos como p oduc o es de señales AHL.
C+
C4 HSL 48h 24h
Resul ados y Discusión
115
Figu a 32. C oma og amas de iones ob enidos a pa i de ansición 172.1 > 102.1 (C4-HSL) de MRM
(Mul iple Reac ion Moni o ing) de ex ac os de medio de cul i o de 48 ho as de T. ma i imum NCIMB
2154T en FMM, C4-HSL sin é ica y medio de cul i o FMM.
T. ma i imum NCIMB 2154T
C4-HSL sin é ica
FMM

Resul ados y Discusión
116
In ensi y, cps
m/z, amu
In ensi y, cps
m/z, amu
C4-HSL Sin é ica
C4-HSL T. ma i imum 2154
T
Figu a 33. Iden i icación de C4-HSL. Picos del espec o de masas ob enido pa a C4-HSL sin é ica y el
co espondien e pa a ex ac os de medio de cul i o de T. ma i imum NCIMB 2154T.
Pa a es udia el e ec o del medio de cul i o en la p oducción de C4-HSL, se
seleccionó la cepa T. ma i imum NCIMB 2154T. Se cul i ó la bac e ia en FMM o CM y
se oma on mues as a di e en es iempos as inoculación pa a es udia la p oducción de
señal a lo la go de la cu a de c ecimien o median e luminóme o con el biosenso E.
coli JM109 pSB536. En ambos medios se de ec ó ac i idad C4-HSL, siendo las cu as
de p oducción de la AHL bas an e di e en es. Aunque el máximo de p oducción de
señal de ec ado en ambos medios se si uó a las 48 ho as as inóculo, és e ue más
acusado en medio FMM, debido a que en el CM la p oducción de AHL ya ue ele ada
en mues as emp anas (Figu a 34). También se ob u o una cu a de p oducción de C4-
HSL muy simila a pa i de los mismos ex ac os de medio FMM en HPLC-MS (Figu a
34) con i mando la alidez de la me odología de cuan i icación de señal median e
biosenso basado en lux.
Resul ados y Discusión
117
0
100
200
300
400
500
600
12 24 48 75
Milla es
T (h)
RLU
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
ng/mL
Figu a 34. Cu as de p oducción de C4-HSL po T. ma i imum NCIMB 2154T ob enidas a pa i de
ex ac os de cul i os en medio FMM o CM. Las cuan i icaciones se ealiza on en luminóme o con el
biosenso E. coli JM109 pSB536 (unidades ela i as de luz, RLU) o po HPLC-MS (ng/mL). C4-HSL en
FMM (--; -●-), C4-HSL en CM (-□-).
Se hipo e izó que la p esencia de un pico de p oducción de C4-HSL a las 48
ho as de cul i o de T. ma i imum NCIMB 2154T pod ía es a elacionado con las
ca ac e ís icas de c ecimien o de es a especie. Inicialmen e Tenacibaculum ma i imum
c ece en hilos y ag egados o mando biopelícula en las pa edes y ondo de los ma aces
y as 48 ho as de cul i o pasa de mane a ab up a al medio c eciendo de mane a densa
(Figu a 35), una ca ac e ís ica de madu ación de biopelículas que ha sido co elacionada
con p ocesos de QS. Sin emba go es a ca ac e ís ica no ue obse ada pa a ninguna de
las es an es especies del géne o Tenacibaculum es udiadas a pesa de p oduci ambién
C4-HSL. Pa a de e mina de modo sencillo si exis ía algún con ol po QS de la
o mación de biopelícula en es a bac e ia se añadió C4-HSL en concen ación: 1, 2,5, 5
ó 10 g/mL a ma aces de FMM o CM inoculado con T. ma i imum NCIMB 2154T. De
modo in e esan e, odas las concen aciones de C4-HSL empleadas eduje on de mane a
signi ica i a la o mación de biopelícula, obse able as inción con c is al iole a, en
compa ación con el con ol (Figu a 36).
Resul ados y Discusión
118
Figu a 35. Biopelícula de un cul i o de 24 ho as de T. ma i imum NCIMB 2154T en FMM incubado a
22ºC y 110 pm.
Figu a 36. Fo og a ía mos ando biopelículas de T. ma i imum NCIMB 2154T eñidas con c is al iole a
adhe idas a ma aces. En las imágenes se obse a la meno p oducción de biopelícula en medio FMM a
22ºC y 110 pm con adición ex e na de 10 g/mL C4-HSL (de echa) con espec o a con oles sin adición
de C4-HSL (izquie da).
CONTROL + C4-HSL
Resul ados y Discusión
119
Debido que con an e io idad o os au o es a a on sin éxi o de de ec a la
p esencia de AHLs en medios de cul i o de o os Bac e oide es, ex ayendo a pa i de
medio sólido de di e en es cepas de Fla obac e ium psych ophilum (B uhn e al., 2005),
se u ilizó la misma me odología pa a in en a de ec a C4-HSL en FMM sólido y AM de
T. ma i imum NCIMB 2154T y Fla obac e ium psych ophilum PT4.1 cul i ado en
Anacke y O dal aga . Los ex ac os ob enidos se analiza on po luminóme o con los
biosenso es de E coli JM109, obse ándose ac i ación pa a E. coli JM109 pSB536 en
ex ac os de T. ma i imum NCIMB 2154T, mien as que los ex ac os de Fla obac e ium
psych ophilum PT4.1 ac i a on el biosenso de señales la gas E. coli JM109 pSB1075
(No se mues an los da os).
Rodaballo Mues a C4-HSL (nmol/Kg) Recupe ación de bac e ia
Sang e 0,00 -
Bazo 0,00 -
Riñón 0,00 -
No in ec ado
(n=10)
Hígado 0,00 -
Sang e 0,46 +
Bazo 1,12 +
Riñón 0,49 +
Asin omá ico
(n=8)
Hígado 0,37 +
Sang e 0,00 +
Bazo 0,29 +
Riñón 0,04 +
Mo ibundo
(n=18)
Hígado 0,09 +
Sang e 0,00 -
Bazo 1,84 +
Riñón 0,09 +
Mue o
(n=8)
Hígado 1,40 +
Tabla 12. Concen aciones de C4-HSL p esen es en ejidos de peces in ec ados con T. discolo DSM
18842 y ecupe ación de la bac e ia. Resul ados ob enidos en colabo ación con el labo a o io de la P o .
Ysabel San os.
Resul ados y Discusión
126
pa ogénesis en la enacibaculosis. Los ni eles de p oducción de AHL obse ados en los
peces ambién se encuen an den o de los angos no males de p oducción desc i os pa a
o os pa ógenos (Buch e al., 2003). El sis ema de QS en T. ma i imum ambién pod ía
con ola el modo de c ecimien o en es a especie ya que la adicción ex e na de C4-HSL
inhibió la o mación de biopelícula ca ac e ís ica de es a especie (Figu as 35 y 36). Un
compo amien o simila ya había sido obse ado en el pa ógeno de humanos V.
chole ae. Es e en e opa ógeno comienza la p oducción de biopelícula inmedia amen e
as la adhesión y ijación a una supe icie y únicamen e bloquea la p oducción de
exopolisacá ido cuando se alcanza una al a densidad que implica el umb al de QS de la
bac e ia. La sín esis de exopolisacá ido es á con olada po el gen ps, cuya exp esión
puede se egulada po el homólogo de LuxR en V. chole ae, HapR, que lo ep ime
(Hei ho y Mahan, 2004).
Se habían publicado con an e io idad algunos esul ados con adic o ios a ce ca
de la p oducción de AHLs en el géne o Fla obac e ium, ambién pe enecien e al g upo
Bac e oide es. Mien as que había sido de ec ada ac i idad ipo AHL en un aislado
planc ónico de Fla obac e ium sp., usando el biosenso E. coli MT102 con el plásmido
pJBA132 basado en lux y po ado de luxR de V. ische i como senso de AHLs, la
p esencia de AHLs no pudo se demos ada po me odología GC-MS (Wagne -Döble
e al., 2005). Tampoco se de ec ó p oducción de AHLs en F. psych ophilum u ilizando
los biosenso es C. iolaceum CV026 y Ag obac e ium ume aciens NT1 (B uhn e al.,
2005). En el p esen e abajo se de ec ó AHL cuando se analiza on ex ac os de F.
psych ophilum con el biosenso de AHLs la gas E. coli JM109 pSB1075. Las
di e encias en las obse aciones es án, p obablemen e, elacionadas con la me odología
de ensayo y los biosenso es u ilizados. En nues a expe iencia, los esul ados basados en
e aluación di ec a de medios de cul i o de bac e ias ma inas, ecuen emen e CM,
deben de se in e p e ados con p ecaución ya que la composición de es e medio de
cul i o pod ía inhibi el c ecimien o o emisión de bioluminiscencia de es os
biosenso es, que son undamen almen e de o igen e es e. Además, como ha sido
demos ado en es e abajo, exis e in luencia de los medios de cul i o sob e el pe il de
p oducción de las AHLs (Figu a 32). O os ac o es ambién in luyen en la de ección de
las AHLs, como el pH de los cul i os o la empe a u a y pod ían explica que las AHLs
no hayan sido de ec adas po o os au o es en es e g upo (Ya es e al., 2002). Po o o

Resul ados y Discusión
127
lado, debido a la capacidad de di e en es compues os de ac i a los biosenso es de
AHLs (Holden e al., 1999), los esul ados posi i os deben se con i mados po mé odos
analí icos.
Aunque los p ocesos isiológicos bajo con ol de QS en Tenacibaculum deben
se in es igados en mayo p o undidad, la p oducción de C4-HSL en es e géne o jun o
con la ecien e de ección de AHLs en aislados de biopelícula ma ina pe enecien es a
Bac e oide es (Huang e al., 2008), ex iende el pa adigma de sis emas de QS mediado
po AHLs más allá de P o eobac e ias. Debido a que los p ocesos con olados po
señales de ipo AHL habían sido desc i os únicamen e en un núme o limi ado de
géne os de α-, β- y γ-P o eobac e ias, muchos de ellos pa ógenos (Williams e al.,
2007), la signi icación ecológica de los sis emas de QS había sido cues ionada como un
ac o cla e de egulación de la exp esión génica den o de las poblaciones bac e ianas
en la na u aleza (Mane ield y Tu ne , 2002). El hecho de que géne os ue a de
P o eobac e ia p oduzcan las mismas moléculas señal, y que exis an mecanismos de
deg adación en bac e ias G am-posi i as, G am-nega i as, Cianobac e ias (Dong y
Zhang, 2005; Rome o e al., 2008), Bac e oide es (Rome o e al., 2010) y células de
mamí e o (Chun e al., 2004); e ue za la impo ancia ecológica de los p ocesos de QS
mediados po AHL.
La exis encia de AHLs ue a de P o eobac e ias no es un esul ado so p enden e
ya que un es udio ilogené ico de los genes luxI y luxR sugi ió que los mecanismos de
QS se es ablecie on muy p on o en la e olución bac e iana, aunque la ans e encia
ho izon al pudo habe jugado un papel impo an e en la dis ibución de es os genes
(Le a y Mo an, 2004). Po an o la clonación de los genes esponsables de la sín esis y
de ección de C4-HSL en el géne o Tenacibaculum apo a á sin duda nue a in o mación
pa a en ende la his o ia e olu i a del QS.
Po p ime a ez ha sido demos ada simul áneamen e en miemb os del g upo
Bac e oide es, la p oducción de AHL y p esencia de ac i idad QQ, incluidos
ep esen an es pa ógenos. Debido a la impo ancia ecológica de es e clús e ,
especialmen e en el ambien e ma ino, el descub imien o de p ocesos de QS mediados
po AHL en sus miemb os pe mi i á a anza en la comp ensión de las in e acciones
mic obianas en es os complejos ecosis emas. Además, los enómenos de comunicación
bac e iana debe án se conside ados en o os hábi a s en los que los Bac e oide es
Resul ados y Discusión
128
ambién juegan un papel impo an e, como la lo a in es inal o la placa den al. En el
caso de las cepas pa ógenas, el descub imien o de es os p ocesos ab e una nue a ía
pa a el a amien o de es as en e medades.
CONCLUSIONES/CONCLUSIONS
Conclusiones/Conclusions
131
1) El quo um quenching (QQ) pod ía se una ac i idad de ele ada p e alencia en el
medio ma ino en e las bac e ias cul i ables, como demues a la ele ada ecuencia de
aislados con capacidad de deg adación enzimá ica de señales de quo um sensing (QS)
ipo AHL, ob enidos an o de comunidades bac e ianas cos e as como de mues as de
agua de ma . De un o al de 630 bac e ias aisladas, 109 p esen aban ac i idad
enzimá ica deg adado a al menos sob e una de las AHLs p obadas, lo que ep esen a un
17,3% del o al de los aislados analizados, po cen aje casi un o den de magni ud más
ele ado que el desc i o pa a aislados de suelo.
2) Sólo ha sido posible iden i ica un aislado capaz de an agoniza la ac i idad AHL sin
deg ada la, aunque es a ac i idad debe se oda ía ca ac e izada. Sin emba go, la
ele ada concen ación de AHL u ilizada en los bioensayos pa a la de ección de
ac i idad QQ no pe mi e conclui que la p oducción de inhibido es de p ocesos de QS
mediados po AHLs sea un p oceso poco común en el medio ma ino.
3) El medio de cul i o y la empe a u a no a ec an al núme o de bac e ias aisladas con
ac i idad QQ, mien as que el o igen de la mues a a ec a ue emen e a la ac i idad,
siendo mayo en el alga Fucus esiculosus (39,4% de especies ac i as) y en mues as de
al a ma a 0 y 10 me os de p o undidad (27,7 y 21,7% espec i amen e). Pa ece exis i
una co elación nega i a en e el núme o de UFCs/mL y el po cen aje de cepas con
ac i idad QQ en las mues as analizadas.
4) Se han iden i icado 19 aislados capaces de deg ada un amplio espec o de AHLs, 15
de ellos de comunidades bac e ianas densas y 4 de agua de ma , en su mayo ía
pe enecien es a géne os es ic amen e ma inos. Además de se más ecuen es, los
aislados con ac i idad QQ de amplio espec o p esen a on una mayo a iabilidad
axonómica en e los aislados de comunidades bac e ianas cos e as, pe eneciendo a 10
géne os encuad ados en los phyla α-; γ-P o eobac e ia (6, incluyendo una nue a especie
p óxima a Phaeobac e ); Ac inobac e ia (1); Fi micu es (2) y Bac e oide es (1). Los
aislados de agua de ma pe enecie on a -P o eobac e ia (1) y Bac e oide es (2),
incluyendo una nue a especie p óxima a Ma ibac e .

Conclusiones/Conclusions
132
5) Exis e una ue e disc epancia en e el núme o de aislados con ac i idad QQ en aguas
ma inas y la ecuencia de las secuencias homólogas a enzimas de QQ conocidos en
me agenomas del medio ma ino. Es a disc epancia puede se a ibuida a la baja
homología exis en e en e secuencias de enzimas de QQ, a la exis encia de ac i idades
enzimá icas oda ía no desc i as y/o a la me odología u ilizada pa a la cons ucción de
lib e ías me agenómicas, que exclui ía las bac e ias asociadas a ma e ia pa iculada.
6) La ca ac e ización de la ac i idad QQ del aislado 20J, ob enido de la mues a de
sedimen o de anque de cul i o de peces e iden i icado como Tenacibaculum discolo
(99% ID), e ela que es a cepa p esen a dos ipos de ac i idad de ipo enzimá ico,
siendo una de ellas una lac onasa que se exc e a al medio de cul i o. La enzima
lac onasa es más ac i a sob e AHLs de cadena co a. Es a ac i idad QQ de amplio
espec o sob e AHLs es á conse ada en las especies del géne o Tenacibaculum, con la
excepción de T. ma i imum NCIMB 2154T que únicamen e deg ada AHLs la gas.
7) Miemb os del géne o Tenacibaculum, pe enecien es al phylum Bac e oide es,
p oducen C4-HSL. Es a AHL pod ía con ola el modo de c ecimien o en biopelícula de
T. ma i imum NCIMB 2154T y puede se de ec ada in i o en el pa ógeno T. discolo
DSM 18842.
Conclusiones/Conclusions
133
1) Quo um quenching (QQ) could be a common ac i i y among cul i able ma ine
bac e ia, as demons a ed by he high equency o AHL-signals deg ada ion ac i i y
ound among coas al and open ocean ma ine bac e ia isola es. Ou o 630 bac e ial
isola es, 109 we e con i med as being able o enzyma ically deg ade a leas one o he
AHLs es ed, which ep esen s a 17.3% o he analysed isola es. This pe cen age is
almos an o de o magni ude highe han ha epo ed o soil bac e ia isola es.
2) Only one o he selec ed isola es was able o an agonize he AHL ac i i y wi hou
enzyma ic deg ada ion, al hough his ac i i y is s ill o be cha ac e ized. Ne e heless,
he high concen a ion o AHL used in he bioassays o he de ec ion o QQ ac i i y
does no allow o ca ego ically conclude ha he p oduc ion o inhibi o s o AHL
media ed QS p ocesses is no a common p ocess in he ma ine en i onmen .
3) The cul u e media and empe a u e had no e ec on he numbe o QQ ac i e
bac e ia. On he con a y, a s ong e ec o he o igin o he sample was ound, being
highe o Fucus esiculosus su ace sample (39.4%) and in open ocean samples o 0
and 10 me e s dep h (27.7 and 21.7% espec i ely). A nega i e co ela ion among
numbe o CFUs and pe cen age o QQ s ains seems o be p esen in he analysed
samples.
4) 19 new ma ine isola es capable o deg ading a wide-spec um o AHLs we e
iden i ied om dense ma ine communi ies (15) and sea-wa e (4), almos all o hem
belonging o s ic ly ma ine gene a. Besides being mo e equen , wide-spec um QQ
isola es om coas al bac e ial communi ies p esen ed a highe axonomic di e si y,
belonging o 10 gene a loca ed wi hin he phyla α-; γ-P o eobac e ia (6, including a new
species close o Phaeobac e ); Ac inobac e ia (1); Fi micu es (2) and Bac e oide es (1).
Sea-wa e isola es belonged o he -P o eobac e ia (1) and Bac e oide es (2), including
a new species ela ed wi h Ma ibac e .
5) A s ong disc epancy was obse ed in he numbe o ma ine isola es wi h QQ ac i i y
and he equency o sequences homologous o known QQ enzymes ound in ma ine
me agenomic collec ions. This disc epancy could be explained on he basis o he low
Conclusiones/Conclusions
134
homology among QQ enzymes sequences, he exis ence o unknown enzyma ic
ac i i ies and/o he me hodology used o he cons uc ion o me agenomic lib a ies,
which excludes bac e ia associa ed o ma ine pa icula ed-ma e .
6) The cha ac e iza ion o he QQ ac i i y in he s ain 20J, isola ed om he sedimen
o a ish ank and iden i ied Tenacibaculum discolo (99% ID), e ealed ha his s ain
has wo di e en enzyma ic ac i i ies, one o hem being a lac onase which is sec e ed
in o he media. The lac onase enzyme is mo e ac i e agains sho chain AHLs. The
wide QQ ac i i y agains AHLs is conse ed among species o he genus
Tenacibaculum, excep o T. ma i imum NCIMB 2154T ha only deg ades long chain
AHLs.
7) Membe s o he genus Tenacibaculum, belonging o he phylum Bac e oide es,
p oduce C4-HSL. This AHL could be in ol ed in con olling he mode o g ow h o T.
ma i imum NCIMB 2154T bio ilm and could also be de ec ed in i o in he pa hogenic
s ain T. discolo DSM 18842.
RESUMEN/SUMMARY

Anexos/Annexes
239
RESEARCH LETTER
Acylhomose ine lac one p oduc ion and deg ada ion by he ¢sh
pa hogen
Tenacibaculum ma i imum
, a membe o he
Cy ophaga^Fla obac e ium^Bac e oides
(CFB) g oup
Manuel Rome o
1
, Rub´
en A enda ˜
no-He e a
1
, Bea iz Maga i ˜
nos
1
, Miguel C ´
ama a
2
& Ana O e o
1
1
Depa amen o de Mic obiolog´
ıa, Facul ad de Biolog´
ıa-CIBUS, Uni e sidad de San iago de Compos ela, San iago, Spain; and
2
School o Molecula
Medical Sciences, Cen e o Biomolecula Sciences, Uni e si y Pa k, Uni e si y o No ingham, No ingham, UK
Co espondence: Ana O e o, Depa amen o
de Mic obiolog´
ıa, Facul ad de Biolog´
ıa-CIBUS,
Uni e sidad de San iago de Compos ela,
15782 San iago, Spain. Tel.: 134 98 156
3100, ex . 16967; ax: 134 98 159 2210;
e-mail: [email p o ec ed]
P esen add ess:Rub´
en A enda ˜
no-He e a,
Depa amen o de ciencias biol ´
ogicas,
Facul ad de ciencias biol ´
ogicas, Uni e sidad
de And ´
es Bello, San iago, Chile.
Recei ed 29 Sep embe 2009; e ised 9
Decembe 2009; accep ed 15 Decembe 2009.
Final e sion published online Feb ua y 2010.
DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.01889.x
Edi o : C aig Shoemake
Keywo ds
quo um sensing; quo um quenching;
acylhomose ine lac one;
Cy ophaga–Fla obac e ium–Bac e oides
.
Abs ac
Tenacibaculum ma i imum ( o me ly Flexibac e ma i imus) is a filamen ous,
biofilm- o ming membe o he Cy ophaga–Fla obac e ium–Bac e oides g oup (o
Bac e oide es), which causes he widely dis ibu ed ma ine fish disease enacibacu-
losis. A sea ch o N-acylhomose ine lac ones (AHLs) quo um-sensing (QS)
signals in he cul u e media o nine ep esen a i e s ains o his species using
di e en biosenso s ains e ealed he p esence o sho - ype AHL ac i i y in all o
hem. N-bu y yl-
L-homose ine lac one (C4-HSL) was iden ified in T. ma i imum
NCIMB2154
T
by LC-MS. A deg ada ion ac i i y o long-acyl AHLs (C10-HSL)
was subsequen ly demons a ed in T. ma i imum NCIMB2154
T
. The acidifica ion
o he cul u e medium a e deg ada ion did no allow he eco e y o C10-HSL,
which indica es a possible acylase- ype deg ada ion ac i i y. E en hough he
physiological p ocesses unde he con ol o AHL-media ed QS in T. ma i imum
need o be u he cha ac e ized, his disco e y ex ends he pa adigm o AHL-
media ed QS signalling beyond he P o eobac e ia and ein o ces i s ecological
significance.
In oduc ion
Many bac e ial species coo dina e esponses o en i onmen-
al changes using complex cell–cell communica ion me-
chanisms in a cell-densi y-dependen manne . This
phenomenon is known as quo um sensing (QS) and elies
on he accumula ion o signal molecules in he su ounding
en i onmen o h eshold concen a ions a which a ge
s uc u al genes a e ac i a ed (Williams e al., 2007). Se e al
communica ion sys ems exis ha use di e en signal mole-
cules, also known as au oinduce s (Wa e s & Bassle , 2005;
Williams e al., 2007). In G am-nega i e bac e ia, he mos
in ensi ely s udied QS sys ems ely on he use o N-
acylhomose ine lac ones (AHLs), a amily o signal mole-
cules di e ing in he leng h and subs i uen s o he acyl
chain. The use o hese molecules as QS signals has been well
es ablished, and hei ole in he con ol o impo an
physiological p ocesses such as bioluminescence, biofilm
o ma ion, plasmid conjuga ion, p oduc ion o exoenzymes
and i ulence ac o s, swa ming, e c., has been shown in a
numbe o P o eobac e ia, including se e al impo an ani-
mal and plan pa hogens (Williams e al., 2007). The
p oduc ion o AHLs has so a been limi ed o a ew gene a
wi hin he P o eobac e ia (Williams e al., 2007), which has
aised ques ions wi h ega d o he ecological significance o
hese molecules (Manefield & Tu ne , 2002). Ou side P o-
eobac e ia, he p oduc ion o AHLs has been ecen ly
demons a ed o he colonial cyanobac e ium Gloeo hece
PCC6909 and o se e al s ains o Bac e ioide es isola ed
om ma ine biofilms, al hough he physiological p ocesses
unde he con ol o he QS sys em we e no comple ely
elucida ed (Sha i e al., 2008; Huang e al., 2009). AHL-like
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139 c2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
MICROBIOLOGY LETTERS
Anexos/Annexes
240
ac i i y was also ound in he haloalkalophilic a chaeon
Na onococcus occul us (Paggi e al., 2003), bu he biochem-
ical na u e o he signal has no been confi med. Sho -chain
AHL- ype ac i i y was also ound in Fla obac e ium sp., a
membe o he Cy ophaga–Fla obac e ium–Bac e oides
(CFB) clus e , bu he p esence o AHL could no be
confi med by GC-MS (Wagne -D¨
oble e al., 2005).
QS seems o be o special significance in he ma ine
en i onmen . AHL signal molecules a e p oduced by mo e
han hal o he ma ine Alphap o eobac e ia isola ed om
a ious ma ine habi a s (Wagne -D¨
oble e al., 2005). Mo e-
o e , he p oduc ion o AHLs is common among ma ine
and fish pa hogenic P o eobac e ia (B uhn e al., 2005;
Wagne -D¨
oble e al., 2005), con olling he exp ession o
key i ulence ac o s (De oi d e al., 2005). Because o he
p e alence o QS sys ems among hese pa hogens, he
inhibi ion o hese p ocesses has been p oposed as an
al e na i e o he use o an ibio ics in aquacul u e (De oi d
e al., 2004). The inhibi ion o AHL-media ed QS p ocesses
was fi s desc ibed in he ma ine alga Delisea pulch a
(Gi sko e al., 1996) and has now been desc ibed in se e al
euka yo es and bac e ia o e es ial o igin ( e iewed by
Dong & Zhang, 2005). The isola ion and cha ac e iza ion o
ma ine bac e ial s ains capable o inhibi ing QS, a p ocess
known as quo um quenching (QQ), ei he enzyma ically o
h ough he p oduc ion o inhibi o s o an agonis s may
help o de elop new bio echnological ools. Se e al esul s
indica e he iabili y o his app oach o he ea men o
in ec ions in aquacul u e (Rasch e al., 2004).
The ma ine bac e ia Tenacibaculum ma i imum ( o me ly
Flexibac e ma i imus) (Suzuki e al., 2001) is a filamen ous
membe o he CFB g oup causing he fish ‘gliding bac e ial
disease’ o enacibaculosis/flexibac e iosis (A enda˜
no-He -
e a e al., 2004). Tenacibaculum ma i imum belongs o he
CFB clus e , which is also known as Bac e oide es (Ludwig &
Klenk, 2001), and cons i u es one o he dominan he e o-
ophic bac e ial g oups in aqua ic habi a s. The ac ha T.
ma i imum shi s ab up ly om a biofilm o a plank onic
mode o g ow h, a cha ac e is ic ha could be ela ed o a
QS-con olled p ocess (Rice e al., 2005; Wagne -D¨
oble
e al., 2005), led us o in es iga e he possible p oduc ion
and deg ada ion o AHLs by his fish pa hogen.
Ma e ials and me hods
S ains and cul u e condi ions
The T. ma i imum s ains NCIMB2154
T
, NCIMB2153 and
NCIMB2158 we e ob ained om The Na ional Collec ions
o Indus ial, Food and Ma ine Bac e ia L d (Abe deen,
UK). In addi ion, six s ains isola ed in ou labo a o y om
fish a m disease ou b eaks om Spain and Po ugal we e
used. These s ains belong o he main se o ypes and clonal
lineages desc ibed wi hin his pa hogen (Table 1)
(A enda˜
no-He e a e al., 2004, 2006), and we e confi med
as T. ma i imum by PCR-based analysis (Toyama e al.,
1996). The s ains we e ou inely cul u ed a 20 1ConF.
ma i imus medium (FMM) aga o b o h (Pazos e al., 1996)
and on ma ine b o h (MB, Di co) o some o he expe i-
men s. Liquid cul u es we e inocula ed wi h a 10% olume
o a 24-h liquid cul u e and main ained in a shake a
100 .p.m. Cul u es we e double-checked o pu i y on
Ma ine Aga (Di co) and FMM be o e and a e each
expe imen .
Th ee lux-based Esche ichia coli JM109 AHL biosenso
s ains ha espond o AHLs wi h di e en side chain
leng hs we e used o he de ec ion o AHL p oduc ion
(Swi e al., 1997; Winson e al., 1998). The biosenso
s ains we e g own a 37 1C in Lu ia–Be ani (LB) b o h o
aga supplemen ed wi h he adequa e an ibio ics.
Table 1. AHL ac i i y in acidified cul u e media ex ac ed wi h dichlo ome hane (1 : 1 / ) o nine di e en isola es o Tenacibaculum ma i imum as
de ec ed by TLC using he lux-based epo e s ain Esche ichia coli JM109 pSB536 (specific o sho -leng h AHLs)
Bac e ial isola e Hos species O igin Se o ype

AHL ac i i y (senso Esche ichia coli pSB536)
24 h 48 h
NCIMB2154
T
Pag us majo Japan O1/O2 (O2) 111
NCIMB2158 Solea solea UK O2 11 1
ACR104.1 Scoph halmus maximus Spain O2 111 1
PC424.1 Scoph halmus maximus Spain O2 111
NCIMB2153 Acan hopag us schlegeli Japan O1/O2 (O1) 11 1
PC503.1 Solea senegalensis Spain O1 11 111
PC538.1 Spa us au a a Spain O1 11 1
LgH35-O3 Solea senegalensis Spain O3 111
ACC6.1 Scoph halmus maximus Po ugal O3 111
Samples we e ex ac ed 24 and 48 h a e inocula ion. Ac i i y was e alua ed in compa ison wi h he in ensi y o he spo s ob ained o he ype s ain
Tenacibaculum ma i imum NCIMB2154
T
(Fig. 1).

Se o ypes ollow he yping schema o A enda ˜
no-He e a e al. (2006).
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139
c2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
132 M. Rome o e al.
Anexos/Annexes
241
Addi ionally, he AHL biosenso s ains Ch omobac e ium
iolaceum CV026 (McClean e al., 1997) and C. iolaceum
VIR07 (Mo ohoshi e al., 2008) we e used o he AHL-
deg ada ion assays in solid pla es as explained below
(McClean e al., 1997). These s ains we e ou inely cul u ed
on LB medium supplemen ed wi h kanamycin (50 mgmL
1
)
a 30 1C.
Sampling and AHL ex ac ion
Samples (100 mL) om cul u es o nine di e en s ains o
T. ma i imum g own in liquid FMM we e ob ained 24 and
48 h a e inocula ion, acidified o pH 2 wi h HCl 1 M in a
shake a 200 .p.m. o 12 h a 20 1C, o ensu e he absence
o any AHL lac onolysis p oduc s, and ex ac ed wi h
dichlo ome hane as desc ibed p e iously (Ya es e al.,
2002). D ied ex ac s we e econs i u ed in 1 mL e hyl
ace a e and s o ed a 20 1C un il u he analysis.
Thin-laye ch oma og aphy (TLC) de ec ion
assays o ex ac ed samples
Two mic oli es o he e hyl ace a e ex ac s ob ained om
he spen cul u e media we e un on e e sed-phase hyd o-
ca bon-imp egna ed C18 silica gel pla es using me hanol :
wa e 60 : 40 / as he mobile phase (Shaw e al., 1997). Two
mic oli es o syn he ic AHLs (Sigma, s ock concen a ion
50 mgmL
1
) we e un as con ols: N-oc anoyl-
L
-homose ine
lac one (C8-HSL) o E. coli JM109 pSB401, N-bu y yl-
L
-
homose ine lac one (C4-HSL) o E. coli JM109 pSB536 and
N-dodecanoyl-
L
-homose ine lac one (C12-HSL) o E. coli
JM109 pSB1075 (Winson e al., 1998). Pla es we e d ied and
o e laid wi h 3 mL o semi-solid LB medium (8% aga )
inocula ed wi h 30 mL o an o e nigh cul u e o he
co esponding senso s ain. Pla es we e incuba ed a 37 1C
and e e y hou , adiog aphic pla es we e laid o e hem o
de ec he emission o bioluminescence.
LC-MS AHL iden i ica ion
LC-MS analyses we e ca ied ou simul aneously in he
labo a o ies in No ingham and San iago using di e en
equipmen and sligh ly di e en condi ions o confi m he
p esence o AHLs unequi ocally. In No ingham, a Shimad-
zu se ies 10AD VP equipped wi h bina y pumps, a acuum
degasse and an SIL-HTc au osample and column o en
(Shimadzu, Ri e D i e, MD) was used as he LC sys em. As
column a Phenomenex Gemini C18, 150 2mm (5mm
pa icle size), a 45 1C was used. The mobile phase was buil
by 0.1% o mic acid in wa e (A) and 0.1% o mic acid in
ace oni ile (B). The flow a e was 0.45 mL min
1
. The
elu ion condi ions we e as ollows: 1 min 0% B, linea
g adien o 50% B o 0.5 min and hen a linea g adien
om 50% o 90% B o e 4 min, hen 2.5 min 99% B o e
2 min, hen amped back o he s a ing condi ions in
0.2 min. The column was e-equilib a ed o a o al o
4 min. Samples we e edissol ed in 50 mL ace oni ile be o e
use and a 10-mL olume was injec ed on o he column
(O o i e al., 2007). Pa allel analyses we e ca ied ou using
an HPLC 1100 se ies (Agilen , San a Cla a, CA) equipped
wi h a C8 p ecolumn (2.1 12.5 mm, 5 mm pa icle size)
and a ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1 150 mm (5 mm
pa icle size) column. Tempe a u e and mobile phases we e
he same as abo e, bu he flow a e was se a
0.22 mL min
1
. In his equipmen , he elu ion condi ions
we e as ollows: 0 min 35% B, linea g adien o 60% B in
10 min and hen a linea g adien om 60% o 95% B o e
5 min, hen 5 min 95% B and hen in 1 min, amped back o
he s a ing condi ions in 9 min. The column was e-
equilib a ed o a o al o 5 min. A 2-mL olume was injec ed
on o he column.
The MS expe imen s shown we e conduc ed in San iago
on an API 4000 iple-quad upole mass spec ome e (Ap-
plied Biosys ems, Fos e Ci y, CA) equipped wi h a Tu bo-
Ion sou ce using posi i e ion elec osp ay, mul iple eac ion
moni o ing (MRM) mode. The MRM signals we e used o
gene a e ela i e quan ifica ion in o ma ion and o igge
subsequen quali y p oduc ion spec a (p oduc ion PI,
MS2). The condi ions o he gene a ion o he MRM-
igge ed spec a we e as ollows: DP amped om 35 o 57,
CE 14-28, CXP 8. Analyses we e confi med on a 4000
QTRAP hyb id iple-quad upole linea ion ap mass
spec ome e (Applied Biosys ems) equipped wi h a Tu -
boIon sou ce used in posi i e ion elec osp ay, MRM mode.
In his case, he condi ions o he gene a ion o he MRM-
igge ed spec a we e as ollows: DP amped om 25 o 50,
CE 15-45, CXP 12.
AHL wi h o wi hou a 3-oxo o a 3-hyd oxy subs i u ion
andwi hanacylsidechainleng ho 4(C4-HSL,3-oxo-C4-
HSL and 3-hyd oxy-C4-HSL), 6 (C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL and
3-176 hyd oxy-C6- HSL), 7 (C7-HSL), 8 (C8-HSL, 3-oxo-C8-
HSL and 3-hyd oxy-C8-HSL), 10 (C10-HSL, 3-oxo-C10-HSL
and 3-hyd oxy-C10-HSL), 12 (C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL and
3-hyd oxy-C12-HSL), 13 (C13-HSL, 3-oxo-C13-HSL and 3-
hyd oxy-C13-HSL) o 14 (C14-HSL, 3-oxo-C14-HSL and 3-
hyd oxy-C14-HSL) we e used as s anda ds. Acyl-HSLs we e
iden ified and confi med by compa ing bo h he elu ion ime
and he spec a om any peaks ob ained wi h hose o he
s anda ds.
AHL-deg ada ion ac i i y assay
Ch omobac e ium iolaceum-based solid pla e assays
(McClean e al., 1997) we e ca ied ou o de ec AHL
deg ada ion ac i i y in T. ma i imum NCIMB2154
T
.Two
di e en senso s ains we e used o de ec AHL deg ada-
ion. Ch omobac e ium iolaceum CV026 (McClean e al.,
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139 c2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
133Quo um sensing in Tenacibaculum ma i imum
Anexos/Annexes
242
1997) was used o measu e he deg ada ion o C6-HSL and
C. iolaceum VIR07 was used o measu e he deg ada ion o
C10-HSL (Mo ohoshi e al., 2008). Twen y mic oli es o
s ock solu ions o C6-HSL o C10-HSL we e added o
500 mL o an o e nigh cul u e o T. ma i imum
NCIMB2154
T
in MB (final concen a ion 2 mgmL
1
) and
incuba ed o 24 h a 20 1C. The same amoun o AHL was
added o 500 mL o spen cul u e medium ob ained om a
24-h-old cul u e by fil a ion h ough 0.22 mm. The amoun
o emaining AHL in he cul u e media o T. ma i imum was
e alua ed in LB pla es o e laid wi h 5 mL o semi-solid LB
aga seeded wi h 500 mL o o e nigh cul u es o C. iola-
ceum CV026 o C6-HSL o C. iolaceum VIR07 o C10-
HSL. Fi y mic oli es o cul u e supe na an s we e loaded in
wells and adjus ed o 100 mL wi h dis illed wa e . S e ile MB
and MB plus C4 o C10-SHLs we e se as con ols. The same
expe imen was ca ied ou in FMM b o h (da a no
shown). Pla es we e incuba ed o 12–24 h and he p oduc-
ion o iolacein was examined.
To e alua e he possible ype o AHL deg ada ion ac i i y,
wo flasks wi h 15 mL o FMM we e supplemen ed wi h
C10-HSL o a final concen a ion o 2 mgmL
1
. One o hem
was inocula ed wi h 1 mL o a 48-h cul u e o T. ma i imum
NCIMB2154
T
and he o he was main ained as con ol.
Flasks we e incuba ed in a shake a 22 1C unde so
agi a ion (110 .p.m.). A e 24 h, 500 mL o no mal and
acidified cul u e media we e ex ac ed h ee imes wi h e hyl
ace a e, dehumidified on o MgSO
4
, e apo a ed unde ni o-
gen flux and esuspended in ace oni ile o LC-MS analysis
as desc ibed abo e. Be o e inocula ion, 500 mLo
FMM1C10-HSL we e also ex ac ed and he alue o C10-
HSL ob ained was used o calcula e he pe cen age o
deg ada ion.
Resul s and discussion
The p esence o AHLs was in es iga ed in e hyl-ace a e
ex ac s o acidified cul u e media o he ype s ain T.
ma i imum NCIMB2154
T
ob ained a 24 and 48 h using he
h ee E. coli JM109 lux-based biosenso s ains ca ying
pSB536, pSB401 o pSB1075 o de ec a wide ange o AHLs
di e ing in he leng h o hei acyl chain. TLC analysis
e ealed he p esence o sho -chain AHLs using he E. coli
JM109 pSB536 biosenso (Fig. 1). A sea ch o AHL- ype QS
signals in ex ac s ob ained om he cul u e media o
ano he eigh ep esen a i e isola es o T. ma i imum using
he same echnique e ealed he p esence o sho -chain AHL
ac i i y in all o hem, al hough di e ences we e eco ded in
ela ion o hei peak in ac i i y (Table 1). LC-MS analysis
confi med he p esence o N-bu y yl-
L
-homose ine lac one
(C4-HSL) in he cul u e media o T. ma i imum
NCIMB2154
T
g own in bo h FMM (Fig. 2) and MB (da a
no shown). This AHL was unequi ocally iden ified by
compa ison o i s mass spec a wi h hose o pu e s anda ds
(Fig. 3). As his is he fi s desc ip ion o he p oduc ion o
AHLs by a pa hogenic membe o he CFB clus e , he
analyses we e ca ied ou simul aneously in bo h labo a o ies
using di e en ch oma og aphic condi ions. The esul s
confi med unequi ocally he p esence o he C4-HSL.
So a , no physiological ole o he han as QS signals has
been assigned o AHLs, excep as a chela o , o e amic
acid (a de i a i e o 3-oxo-C12) o an ibio ic ac i i y o
bo h 3-oxo-C12-HSL and e amic acid (Kau mann e al.,
2005; Sche ze e al., 2009). In addi ion, a ole as biosu ac-
an has been a ibu ed o long-chain AHLs (Daniels e al.,
2006). The e o e, e en hough he physiological ea u es
unde he con ol o hese molecules in T. ma i imum
emain o be in es iga ed, he p oduc ion o C4-HSL by T.
ma i imum s ains ex ends he pa adigm o AHL-media ed
QS beyond he P o eobac e ia. As he physiological p ocesses
unde he con ol o AHL-media ed QS ha e so a been
desc ibed o a limi ed numbe o gene a o he Alpha-,
Be a- and Gammap o eobac e ia, many o hem human o
plan pa hogens (Williams e al., 2007), he ecological
significance o AHL-media ed QS has been ques ioned as a
key swi ch con olling gene exp ession wi hin bac e ial
popula ions in na u e (Manefield & Tu ne , 2002). The ac
C+
C4 HSL 48h 24h
Fig. 1. De ec ion o AHL ac i i y in he cul u e media o Tenacibaculum
ma i imum NCIMB2154
T
wi h he TLC assay. TLCs o e hyl ace a e
ex ac s o acidified cul u e media ob ained a e 24 and 48 h we e
co e ed wi h he lux-based senso s ains, ollowed by exposu e o X- ay
films. Posi i e esul s we e ob ained wi h he senso s ain Esche ichia
coli JM109 pSB536, specific o he de ec ion o sho -leng h AHLs.
Con ol (C1): C4-HSL.
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139
c
2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
134 M. Rome o e al.
Anexos/Annexes
243
ha gene a ou side he P o eobac e ia p oduce he same
signal molecules, and ha AHL-deg ading ac i i y has been
ound in G am-posi i e, G am-nega i e and Cyanobac e ia
(Dong & Zhang, 2005; Rome o e al., 2008) and in mamma-
lian cells (Chun e al., 2004), ein o ces he ecological
significance o AHL-media ed QS p ocesses. The p esence
o AHL-media ed QS beyond he P o eobac e ia is no
su p ising, as a phylogene ic s udy based on he LuxI/LuxR
genes sugges ed ha QS mechanisms we e es ablished e y
ea ly in he e olu ion o bac e ia, al hough ho izon al
ans e may ha e also played an impo an ole in he
dis ibu ion o QS genes, a leas wi hin his g oup (Le a &
Mo an, 2004). The cloning o genes esponsible o he
syn hesis and de ec ion o AHLs in T. ma i imum will
undoub edly p o ide new insigh s in o he e olu iona y
his o y o QS.
The p oduc ion o AHLs was demons a ed o all isola es
o T. ma i imum analysed (Table 1), he e o e being a
conse ed ai wi hin his species, which is no he case in
some o he ma ine pa hogens such as Ae omonas salmonici-
da (B uhn e al., 2005). Some con adic o y esul s ha e
been published p e iously ega ding he p oduc ion o
AHLs by he genus Fla obac e ium belonging o he Bac e -
oide es g oup. While AHL-like ac i i y was de ec ed in a
plank onic isola e o Fla obac e ium sp. using E. coli MT102
ca ying he biosenso plasmid pJBA132 based on he luxR
gene om Vib io fische i, he p esence o AHLs could no be
demons a ed by GC-MS (Wagne -D¨
oble e al., 2005).
Fu he mo e, no AHL ac i i y was ound in di e en
pa hogenic s ains o Fla obac e ium psych ophilum using
he senso s ains C. iolaceum CV026 and Ag obac e ium
ume aciens NT1 (B uhn e al., 2005). The di e ences in he
In ensi y, cps In ensi y, cpsIn ensi y, cps
1.3e5
1.2e5
1.1e5
1.0e5
9.0e4
8.0e4
7.0e4
6.0e4
5.0e4
4.0e4
3.0e4
2.0e4
1.0e4
0.0
2.6e5
2.4e5
2.2e5
2.0e5
1.8e5
1.6e5
1.4e5
1.2e5
1.0e5
8.0e4
6.0e4
4.0e4
2.0e4
0.0
5.0e4
4.0e4
3.0e4
2.0e4
1.0e4
0.0
4.09
0.11
12345678
87654321
0.99
1.12
1.28
1.80
3.60
1.47
1.54
2.24
2.40
1234
3.53
3.82
4.29 4.37
4.65
5
5.38
678
Time, min
Time, min
Time, min
T. ma i imum 2154
48h Sample
Blank FMM
C4-HSL S anda d
3.54
4.67
5.28
3.22
3.23
1.66
1.02
3.28
2.61
Fig. 2. Ex ac ion ion ch oma og ams o he
MRM ansi ion 172.1 4102.1 (C4 HSL) o
ex ac s o acidified cul u e media o
Tenacibaculum ma i imum NCIMB2154
T
(48-h
sample), C4-HSL s anda d and FMM b o h.
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139 c2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
135Quo um sensing in Tenacibaculum ma i imum

Anexos/Annexes
244
AHL ac i i y desc ibed p obably depend on he assay con-
di ions and he senso s ain u ilized. In ou expe ience, da a
based on he di ec e alua ion o cul u e media o ma ine
bac e ia, usually MB, should be in e p e ed wi h cau ion, as
he media composi ion could esul in inhibi ion o g ow h
o bioluminescence p oduc ion by he senso s ain (un-
published da a). On he o he hand, due o he abili y o
di e en compounds o ac i a e he AHL biosenso s (Hol-
den e al., 1999), he esul s should be iewed wi h cau ion
unless he p esence o AHLs can be confi med by analy ical
chemical me hods. On he basis o ou esul s and as he
de ec ion o he QS ac i i y is s ongly dependen on he
biosenso s ain used and on he cul u e condi ions, i is
possible ha AHL-based QS sys ems a e mo e widesp ead
han desc ibed so a (Wagne -D¨
oble e al., 2005).
An in i o deg ada ion assay was ca ied ou using
wo biosenso s ains o C. iolaceum.Ch omobac e ium
iolaceum CV026 was used o de ec deg ada ion o sho
AHLs (C6-HSL), and C. iolaceum VIR07 was used o de ec
deg ada ion o long AHLs (C10-HSL). Comple e deg ada-
ion o C10-HSL was obse ed a e 24 h, bu no changes in
C6-HSL ac i i y we e obse ed (Fig. 4a). The ac i i y should
1.30e6
1.20e6
1.10e6
1.00e6
9.00e5
8.00e5
7.00e5
6.00e5
5.00e5
4.00e5
3.00e5
2.00e5
1.00e5
43.1
74.1
90.0
102.1
108.1
113.0
110.2
126.0 131.0
134.9
144.1149.0
154.1
172.1
50 60
70 80 90 110 120 130 140
170
m/z, amu
C4-HSL s anda d
1.10e6
1.00e6
8.00e5
9.00e5
7.00e5
1.00e5
6.00e5
5.00e5
4.00e5
3.00e5
2.00e5
57.2 71.0
60.2
84.9
89.9
100.2
102.1
112.1
126.0
130.9
131.8
130.1
142.2
144.1
148.9
154.1
155.1
172.1
40 50 60 70 80 90 100 120 140 150 160 170
C4-HSL T. ma i imum 2154 24 h
m/z, (amu)
In ensi y, cpsIn ensi y, cps
180
130
150 160 180100
40
56.4
71.0
85.0
84.1
103.0
43.1
74.0
70.2
95.0
113.1
116.1
110
(a)
(b)
Fig. 3. P oduc ion spec um o syn he ic
C4-HSL (a) and he co esponding peak (b) in
he ch oma og ams o ex ac s o spen cul u e
medium o Tenacibaculum ma i imum
NCIMB2154
T
.
0
20
40
60
80
100
FMM
% C10-HSL
(a) (b)
T. ma i imum
Supe na an
+ C10-HSL
MB
MB
+C6-HSL
T. ma i imum
+ C6-HSL
T. ma i imum
+ C10-HSL
Su pe na an
+ C6-HSL
MB
+C10-HSL
MB
Fig. 4. Aga pla e assay o he de ec ion o AHL deg ada ion ac i i y in Tenacibaculum ma i imum NCIMB2154
T
. (a) Comple e deg ada ion o C10-HSL
( igh ) and no deg ada ion o C6-HSL (le ) was ound a e 24 h o exposu e. The deg ada ion o C10-HSL was moni o ed using Ch omobac e ium
iolaceum VIR07 ( igh ), and he deg ada ion o C6-HSL was moni o ed using he biosenso s ain C. iolaceum CV026 (le ). As nega i e con ols, AHL
incuba ed in cul u e media we e used (cen al wells). (b) HPLC quan i a ion o C10-HSL a e 24 h in FMM and FMM inocula ed wi h T. ma i imum
NCIMB2154
T
. Spen cul u e media (open ba s) and acidified spen cul u e media (g ey ba s) we e ex ac ed. Da a a e exp essed as he pe cen age o he
ini ial C10-HSL concen a ion (2 mgmL
1
).
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139
c
2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
136 M. Rome o e al.
Anexos/Annexes
245
be cell bound, as no significan deg ada ion was ob ained
when he C10-HSL was added o cell- ee spen cul u e
medium (Fig. 2a). HPLC analysis o he deg ada ion o C10-
HSL e ealed ha 90% o he AHL was deg aded a e 24 h
o exposi ion o T. ma i imum cul u es, and no eco e y o
he AHL could be achie ed by medium acidifica ion, which
may disca d a lac onase- ype deg ading enzyme (Fig. 4b).
Fu he analyses a e equi ed o confi m an acylase- ype
ac i i y. The p esence o AHL deg ada ion enzymes has been
desc ibed in G am-nega i e bac e ia, possibly as a mechan-
ism o ou compe e G am-posi i e neighbou s (Roche e al.,
2004). In G am nega i es, hese enzymes can be used o he
sel -modula ion o he le el o he signals as al eady ound in
A. ume aciens (Zhang e al., 2002). In he case o he
bac e oide e T. ma i imum, he p esence o a QQ enzyme
o long AHLs may ep esen an exclusion mechanism o
in e e e wi h he QS sys ems o compe i o s (Dong &
Zhang, 2005).
E idence is beginning o accumula e indica ing ha QS
and QS inhibi ion p ocesses, including enzyma ic deg ada-
ion o he signal o QQ, a e impo an in he ma ine
en i onmen . Besides he well-cha ac e ized phenomenon
o he p oduc ion o u anones by he ed alga D. pulch a o
a oid su ace coloniza ion by G am-nega i e biofilm o -
me s (Gi sko e al., 1996), QS sys ems media ed by AHLs
ha e been ound in many species o ma ine pa hogenic
bac e ia (B uhn e al., 2005). AHLs also seem o play an
impo an ole in he euka yo ic–p oka yo ic in e ac ions in
he ma ine en i onmen , as demons a ed by he impo -
ance o he p oduc ion o AHLs by ma ine biofilms o he
su ace selec ion and pe manen a achmen o zoospo es o
he g een alga Ul a (Tai e al., 2005), o spo e elease o he
ed alga Ac ochae ium sp. (Weinbe ge e al., 2007), and o
some ini ial la al se lemen beha iou s in he polychae e
Hyd oides elegans (Huang e al., 2007). As mos o he
isola es in ol ed in algal mo phogenesis belong o he CFB
g oup (Hanzawa e al., 1998; Ma suo e al., 2003), he
disco e y o he p oduc ion and deg ada ion o AHLs by
membe s o his g oup p o ides he possibili y o new
in e ac ions be ween bac e ia and euka yo es in he ma ine
en i onmen .
Fo he fi s ime, he p oduc ion o AHL- ype QS signals
and QQ ac i i y has been demons a ed simul aneously in a
pa hogenic membe o he CFB g oup. Because o he
ecological significance o he Cy ophaga–Fla obac e ium
clus e , especially in he ma ine en i onmen , he disco e y
o AHL-media ed QS p ocesses among hei membe s will
ad ance ou unde s anding o he mic obial in e ac ions in
complex ecosys ems. Mo eo e , cell- o-cell communica ion
phenomena should be econside ed in o he habi a s in
which he Bac e oide es play an impo an ole, such as
in es inal flo a o den al plaque. As QS con ols he exp es-
sion o impo an i ulence ac o s in many pa hogenic
bac e ia, he dis up ion o QS mechanisms in T. ma i imum
and o he fish pa hogenic bac e ia may ep esen a new
s a egy o he ea men o in ec ions in aquacul u e.
Acknowledgemen s
This wo k was financed by a g an om Conselle ´
ıa de
Inno aci´
on e Indus ia, Xun a de Galicia, Spain (PGI-
DIT06PXIB200045PR). M.R. is suppo ed by an FPU
ellowship om he Spanish Minis y o Science and Educa-
ion. We would like o hank Noemi Lad a (Uni e si y o
San iago) and Ca he ine O o i (Uni e si y o No ingham)
o LC-MS analysis. The senso Ch omobac e ium iolaceum
VIR07 was kindly p o ided by P o . T. Mo ohoshi.
Re e ences
A enda˜
no-He e a R, Maga i˜
nos B, L´
opez-Romalde S, Romalde
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137Quo um sensing in Tenacibaculum ma i imum
Anexos/Annexes
246
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c
2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
138 M. Rome o e al.
Anexos/Annexes
247
Williams P, Winze K, Chan WC & C´
ama a M (2007) Look who’s
alking: communica ion and quo um sensing in he bac e ial
wo ld. Philos T Roy Soc B 362: 1119–1134.
Winson MK, Swi S, Fish L, Th oup JP, Jø gensen F, Chhab a SR,
Byc o BW, Williams P & S ewa GSAB (1998) Cons uc ion
and analysis o luxCDABE-based plasmid senso s o
in es iga ing N-acylhomose ine lac one-media ed quo um
sensing. FEMS Mic obiol Le 163: 185–192.
Ya es EA, Philipp B, Buckley C e al. (2002) N-acylhomose ine
lac ones unde go lac onolysis in a pH-, empe a u e-, and acyl
chain leng h-dependen manne du ing g ow h o Ye sinia
pseudo ube culosis and Pseudomonas ae uginosa.In ec Immun
70: 5635–5646.
Zhang HB, Wang LH & Zhang LH (2002) Gene ic con ol o
quo um-sensing signal u no e in Ag obac e ium ume aciens.
P Na l Acad Sci USA 99: 4638–4643.
FEMS Mic obiol Le 304 (2010) 131–139
c
2010 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
139Quo um sensing in Tenacibaculum ma i imum
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254

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295
2.4 Solici ud de pa en e nacional P201030892
Anexos/Annexes
302

Uso de una nue a Į-P o eobac e ia pa a Quo um Quenching
La p esen e in ención se encuen a den o de la biología, la biología molecula ,
y la acuicul u a, y especí icamen e se e ie e a una nue a Į-P o eobac e ia
capaz de deg ada N-acil-homose ín lac onas (AHLs) pa a el con ol de 
en e medades in ecciosas bac e ianas, y pa a e i a la o mación de bio ilms.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Nume osas especies bac e ianas usan un mecanismo de egulación gené ica 
coo dinada pa a esponde a cambios en el en o no. Es e mecanismo conocido
como “quo um sensing” (QS) consis e en la p oducción y libe ación de
moléculas señal al medio donde se acumulan con olando la exp esión de
múl iples genes (Fuqua e al., 1994. J Bac e iol 176: 269-275). Median e la
comunicación po QS las poblaciones bac e ianas pueden coo dina se pa a 
ejecu a impo an es unciones biológicas, muchas de ellas implicadas en la
i ulencia de impo an es pa ógenos, como: mo ilidad, “swa ming”, ag egación,
luminiscencia, biosín esis de an ibió icos, ac o es de i ulencia, simbiosis,
o mación y di e enciación de bio ilms, ans e encia de plásmidos po
conjugación,… (Williams e al., 2007. Phil T ans R Soc B 362: 1119-1134). 
Las señales de QS más es udiadas y conocidas son las N-acil-homose in
lac onas (AHLs) empleadas po nume osas bac e ias G am-nega i as (Williams
e al., 2007. Phil T ans R Soc B 362: 1119-1134). Las AHLs, ambién conocidas
como au oinduce s (AIs), son una amilia de moléculas señales usadas en el 
sis ema de QS de muchas bac e ias, p incipalmen e G am nega i as, que se
basan en un anillo lac ona con una cadena la e al acilo de amaño a iable
en e 4 y 14 ca bonos, con o sin sa u ación y con o sin sus i uciones Oxo- o
Hid oxi- en el e ce ca bono (Whi ehead e al., 2001. FEMS Mic obiol Re 25:
365-404). Como las poblaciones de especies bac e ianas coo dinadas po QS 
ob ienen impo an es en ajas compe i i as en sus múl iples in e acciones con
o os p oca io as y euca io as, sus compe ido es han desa ollado mecanismos

Anexos/Annexes
303

pa a in e e i con su comunicación po sis emas QS, a es os mecanismos se
les conoce como “quo um quenching” (QQ). Exis en dos ipos p incipales de
mecanismos de QQ: un p ime ipo se basa en la p oducción de moléculas
inhibido as/an ogonis as que mime izan las AHLs bloqueando o
deses abilizando el ecep o , como las u anonas p oducidas po el alga ma ina 
Delisea pulch a (Gi sko e al., 1996. J Bac e iol 178: 6618-6622). O a
es a egia pa a bloquea los sis emas de QS mediados po AHLs es la
deg adación enzimá ica de las moléculas señal. Has a el momen o, se han
desc i o dos ipos p incipales de enzimas que lle an a cabo es a deg adación:
las lac onasas que hid olizan el anillo lac ona y las acilasas que ompen el 
enlace en e el anillo lac ona y la cadena la e al (Dong e al., 2007, Phil T ans R
Soc B 362: 1201-1211). La ac i idad acilasa ha sido desc i a en Pseudomonas
ae uginosa PAO1, Rals onia sp., S ep omyces sp., Rhodococcus e y h opolis,
Anabaena sp. PCC 7120, Shewanella sp. y Va io o ax pa adoxus (Leadbe e
and G eenbe g, 2000, J Bac e iol 182: 6921-6926; Lin e al., 2003, Mol 
Mic obiol 47: 849-860; Pa k e al., 2005, Appl En i on Mic obiol 71: 2632-2641;
U oz e al., 2005, Mic obiol 151: 3313-3322; Huang e al., 2006, Appl En i on
Mic obiol 72: 1190-1197; Sio e al., 2006, In ec Immun 74: 1673-1682; Rome o
e al., 2008, FEMS Mic obiol Le 280: 73-80), mien as que la ac i idad
lac onasa ha sido iden i icada en dis in as cepas de los géne os Bacillus, 
A h obac e sp. y Rhodococcus, pe o ambién es á p esen e en algunos G am
nega i os como Klebsiella y Ag obac e ium (Dong and Zhang, 2005. J Mic obiol
43: 101-109; Dong e al., 2007, Phil T ans R Soc B 362: 1201-1211).
Aunque la sín esis de quimio e ápicos a i iciales y el descub imien o y mejo a 
de los an ibió icos han supues o en el siglo pasado una au én ica e olución
médica en el a amien o de en e medades in ecciosas, el desa ollo de
esis encia a an ibió icos po pa e de algunas bac e ias pa ógenas es un g a e
p oblema mundial, que obliga a la indus ia a macéu ica a desa olla nue as
gene aciones de an ibió icos más po en es, y que puede o igina cepas 
mul i esis en es en las que el a amien o es más la go y con ecuencia
ine icaz, llegando incluso a la mue e del pacien e. La p esión selec i a que se
Anexos/Annexes
304

eje ce en el ambien e mic obiano, el es ado inmuni a io del hospede o, los
mic oambien es bac e ianos y ac o es p opios de las bac e ias in oluc adas,
ienen un papel impo an e en el desa ollo de la esis encia. Es po lo an o un
obje i o p io i a io pa a la indus ia a macéu ica el desa ollo de nue as
es a egias pa a el a amien o de las in ecciones bac e ianas. 
Pues o que muchas bac e ias usan el sis ema de señales de QS pa a
sinc oniza la exp esión gené ica y coo dina su ac i idad biológica den o de
una población, con olando la i ulencia y la o mación de bio ilms en e o as
unciones biológicas, una ía pa a e i a el aumen o de mecanismos de 
esis encia de las bac e ias pa ógenas (que en muchas ocasiones di icul an el
adecuado a amien o clínico, llegando incluso a la mue e del pacien e) se ía
con ola es os sis emas de señales QS median e QQ. La posibilidad de
u ilización de la inhibición del quo um sensing pa a el a amien o de
en e medades bac e ianas ha sido e isada con an e io idad (S ephenson e 
al., 2004. Cu Med Chem 11:765-773; Hen ze e al., 2003. BioD ugs 17:241-
250; Hen ze e al., 2003. J Clin In es 112:1300-1307; Lyon e al., 2003. Chem
Biol 10:1007-1021). Debido a que g an can idad de pa ógenos humanos (p. e.:
Pseudomonas pu ida, Se a ia spp.,…), de plan as (p. e.: Ag obac e ium spp.,
E winia ca o o o a,…) y pa ógenos ma inos (p. e.: Ae omonas salmonicida, 
Vib io anguilla um,…) (Williams e al., 2007. Phil T ans R Soc B 362: 1119-
1134; B uhn e al., 2005. Dis Aqua O g 65: 43-52) emplean AHLs pa a el
con ol de la p oducción de ac o es de i ulencia, la in e e encia con es os
sis emas de comunicación cons i uye una in e esan e y p ome edo a ía pa a el
con ol de en e medades in ecciosas bac e ianas (Dong & Zhang. 2005. J 
Mic obiol 43: 101-109; Dong e al., 2007. Phil T ans R Soc B 362: 1201-1211).
Una de las ac i idades bac e ianas de mayo impo ancia clínica y ecológica en
la que in e ienen los p ocesos de “quo um sensing” es la o mación de
bio ilms, que equie e la p oducción, po pa e de los mic oo ganismos, de 
es as moléculas señal di usibles (Nadell e al., 2008. PLoS Biol 6(1): e14.
doi:10.1371/jou nal.pbio.0060014).
Anexos/Annexes
305

Los bio ilms son películas biológicas que se desa ollan y pe sis en en las
supe icies, y que suelen se es ables y di íciles de elimina debido a la
na u aleza p o ec o a de la ma iz de polisacá ido en la que es án embebidos
los mic oo ganismos. Pueden de ini se como una población bac e iana
ence ada den o de una ma iz de polisacá ido que se adhie e a las 
supe icies. Se encuen an gene almen e en las supe icies de los
equipamien os indus iales que p ocesan o anspo an líquidos, o en las
supe icies adyacen es a ales equipamien os. A menudo se encuen an en la
supe icie de los implan es médicos o en los disposi i os inse ados en el
o ganismo. También se pueden o ma en á eas del cue po que es án 
expues as al ai e; en pa icula en he idas y en la pleu a. Uno de los bio ilms
biológicos que p esen a mayo complejidad y de mayo ele ancia clínica es la
placa den al.
Los medicamen os con encionales, como po ejemplo, los an ibió icos, son 
poco e icaces en in ecciones que cu san a a és de la o mación de bio ilms,
debido a las ba e as de di usión o al es ado me abólico de los
mic oo ganismos en el bio ilm.
Po an o, mecanismos de in e e encia del QS, es deci el QQ, solos o en 
combinación con an ibió icos, cons i uyen una es a egia in e esan e en la
inhibición de la o mación de bio ilms así como en el a amien o de
en e medades in ecciosas po pa ógenos mul i esis en es, como
Pseudomonas ae uginosa, en la que es á desc i o el con ol de QS sob e
mecanismos de i ulencia (Ven u i, 2006. FEMS Mic obiol Re 30: 274-291) y 
o os pa ógenos de humanos, animales y plan as. Pseudomonas ae uginosa es
una de las bac e ias más in ec i as y p oblemá icas, al o ma bio ilms
di ícilmen e a ables con an ibió icos con encionales. En pacien es con ib osis
quís ica coloniza los pulmones causando in ecciones que son di íciles de a a
y a menudo, inalmen e a ales. También es especialmen e in e esan e pa a 
pacien es con he idas c ónicas o con quemadu as.
Anexos/Annexes
306

Po an o, es e mecanismo puede se in e esan e pa a el a amien o de
muchas en e medades bac e ianas, y exis e bas an e li e a u a sob e es e ema
(Ma ch & Ben ley, 2004.
Cu en Opinion in Bio echnology 15:495–502;
S ephenson e al., 2004. Cu Med Chem 11:765-773; Hen ze e al., 2003.
BioD ugs 17:241-250; Hen ze e al., 2003. J Clin In es 112:1300-1307; Lyon 
e al., 2003. Chem Biol 10:1007-1021). Po ejemplo, se ha is o que puede se
ú il en el a amien o de en e medades, an o en los animales como en las
plan as, p o ocadas po los géne os S aphylococcus, Pseudomonas, Bo elia,
Salmonella, Bu kholde ia, Ce a ocys is, Se a ia, Ch omobac e ium,
Pec obac e ium, E winia, Ag obac e ium, o po o as en e obac e ias (además 
de Pseudomonas).
Además, el in e és de las es a egias de QQ pa a el a amien o de
en e medades in ecciosas es que, al no a ec a di ec amen e a la supe i encia
del pa ógeno sino a la exp esión de los ac o es de i ulencia, no eje cen 
p esión selec i a e i ando la apa ición de esis encias. Po es a azón, es e ipo
de es a egia ha sido denominada “an iin ec i os” o “an ipa ogénicos” en
con as e con los “an ibió icos” o “an ibac e ianos” cuyo obje i o es la mue e
celula .

A pesa de que los p ocesos de QS y de QQ se descub ie on en o ganismos
ma inos (Nealson e al., 1970.

J Bac e iol 104: 313-322; Gi sko e al., 1996. J
Bac e iol 178: 6618-6622) se ha p es ado poca a ención a su signi icado
ecológico en el ambien e ma ino. La p oducción de AHLs es común en e las
bac e ias pa ógenas de peces ma inos, incluyendo Ae omonas salmonicida, 
Ye sinia ucke i, Vib io salmonicida, Ae omonas hyd ophila, Vib io ulni icus,
Vib io ha eyi, o Vib io anguilla um (F eeman & Bassle , 1999. Mol Mic obiol
31: 665-677; C oxa o e al., 2002. J Bac e iol 184: 1617-1629; Buch e al.,
2003. Sys Appl Mic obiol 26: 338-349; Kim e al., 2003. Mol Mic obiol 48: 1647-
1664; B uhn e al., 2005. Dis Aqua O g 65: 43-52). Po ello, la posibilidad de 
emplea los inhibido es de QS pa a con ola la in ección se ha p opues o como
una al e na i a al uso de an ibió icos en acuicul u a

(De oi d e al., 2004.
Anexos/Annexes
307

Aquacul u e 240: 69-88), y la iabilidad de la u ilización de es a es a egia ha
sido ya demos ada (Rasch e al., 2004.Sys em Appl Mic obiol 27: 350-359;
Tinh e al., 2008. FEMS Mic obiol Ecol 62: 45-

53).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 
La p esen e in ención se e ie e a una cepa de una nue a especie de Į-
P o eobac e ia a ín al géne o Phaeobac e , que es capaz de deg ada las N-
Acil-homose in lac onas (AHLs), las cuales no pueden se ecupe adas
signi ica i amen e po acidi icación, indicando una ac i idad enzimá ica 
di e en e a la lac onasa. Po an o, el empleo de es a bac e ia es ú il pa a
con ola las in ecciones bac e ianas, sin eje ce p esión selec i a sob e las
poblaciones de las bac e ias pa ógenas y e i ando así la apa ición de
esis encias. También pe mi e la inhibición de o os p ocesos de colonización
bac e iana en los que es án implicadas las señales de “quo um sensing” o QS 
ipo AHL, como la o mación de bio ilms.
Po an o, un aspec o de la in ención se e ie e a una cepa de células
bac e ianas de Į-P o eobac e ia deposi ada el 21 de mayo de 2010 en la
Colección Española de Cul i os Tipo (CECT) con núme o de depósi o CECT 
7733, de aho a en adelan e “cepa de la in ención” o “cepa 177”. Dicha cepa
pe enece al ilo de las Į-P o eobac e ia a ín al géne o Phaeobac e . Es a cepa
de la in ención c ece, p e e iblemen e, en caldo o aga ma ino, más
p e e iblemen e a una empe a u a de 22ºC y aun más p e e iblemen e du an e
24 ho as. La secuencia de polinucleó idos de la egión ibosómica 16S de dicha 
cepa de la in ención se ecoge pa cialmen e en la SEQ ID NO: 1.

Cualquie bac e ia egula su exp esión génica en espues a a di e en es
señales medioambien ales, una p opiedad esencial pa a compe i con o os
o ganismos. En el caso pa icula de bac e ias pa ógenas, la egulación génica 
es c ucial pa a pe mi i la supe i encia de la bac e ia en el pa icula ambien e
que le o ece su hospedado . Los genes de i ulencia bac e ianos es án suje os

Anexos/Annexes
308

a complejos mecanismos de egulación pa a asegu a la exp esión del gen
ap opiado en el momen o ap opiado. Las AHLs son las señales de QS más
es udiadas y conocidas, y como se ha dicho son empleadas po mul i ud de
bac e ias pa ógenas humanas, de plan as y ma inas pa a el con ol de la
p oducción de ac o es de i ulencia. 
Po an o, o o aspec o de la in ención se e ie e al uso de una célula
bac e iana cuya egión 16S del ARN p esen a una iden idad de al menos un
96% con la secuencia polinucleo ídica ecogida en la SEQ ID NO: 1, espec o a
la longi ud comple a de la SEQ ID NO: 1, de aho a en adelan e “célula 
bac e iana de la in ención”, del ex ac o celula c udo o del sob enadan e de
sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, pa a deg ada N-Acil
homose in lac onas y p o oca quo um quenching. En una ealización p e e ida
de es e aspec o de la in ención, la egión 16S del ARN de la célula bac e iana
de la in ención p esen a una iden idad de al menos un 97%, más 
p e e iblemen e de un 98%, y aún más p e e iblemen e, de un 99% con la
secuencia polinucleo ídica ecogida en la SEQ ID NO: 1, espec o a la longi ud
comple a de la SEQ ID NO: 1. En una ealización pa icula de es e aspec o de
la in ención, la egión 16S del ARN de la célula bac e iana de la in ención
p esen a la secuencia polinucleo ídica ecogida en la SEQ ID NO: 1, más 
p e e iblemen e, la célula bac e iana de la in ención es la cepa de la in ención.
Po ello, o o aspec o de la in ención se e ie e al uso de la cepa de la
in ención, del ex ac o celula c udo o del sob enadan e de sus cul i os, o
cualquie a de sus combinaciones, pa a p o oca quo um quenching. 
En la p esen e in ención se en iende po “quo um quenching” o “QQ” el
mecanismo median e el cual se in e ie e la comunicación mic obiana,
p e e iblemen e de bac e ias pa ógenas, mediada po señales basadas en un
sis ema quo um sensing o QS. Es e mecanismo QQ a ec a nega i amen e a, 
po ejemplo, aunque sin limi a nos, la exp esión de ac o es de i ulencia de la
población mic obiana sin p o oca la mue e celula .
Anexos/Annexes
309

O o aspec o de la in ención se e ie e al uso de la célula bac e iana de la
in ención, p e e iblemen e, de la cepa de la in ención, del ex ac o celula
c udo o del sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones,
los cuales son capaces de deg ada N-Acil homose in lac onas y, po an o, de
in e e i con el sis ema de señales de QS de bac e ias, pa a la elabo ación de 
un medicamen o. O o aspec o de la in ención se e ie e al uso de la célula
bac e iana de la in ención, p e e iblemen e, de la cepa de la in ención, del
ex ac o celula c udo o del sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus
combinaciones, pa a la elabo ación de un medicamen o pa a el a amien o o
p e ención de en e medades in ecciosas bac e ianas. 
La p oducción de AHLs es común en e las bac e ias pa ógenas de peces
ma inos, incluyendo, pe o sin limi a se, a Ae omonas salmonicida, Ye sinia
ucke i, Vib io salmonicida, Ae omonas hyd ophila, Vib io ulni icus, Vib io
ha eyi, o Vib io anguilla um, (F eeman & Bassle , 1999. Mol Mic obiol 31: 665-
677 ; C oxa o e al., 2002. J Bac e iol 184: 1617-1629; Buch e al., 2003. Sys
Appl Mic obiol 26: 338-349; Kim e al., 2003. Mol Mic obiol 48: 1647-1664;
B uhn e al., 2005. Dis Aqua O g 65: 43-52). Po ello, la posibilidad de emplea
los inhibido es de QS pa a con ola la in ección se ha p opues o como una
al e na i a al uso de an ibió icos en acuicul u a

(De oi d e al., 2004. 
Aquacul u e 240: 69-88), y su iabilidad ya ha sido demos ada (Rasch e al.,
2004.Sys em Appl Mic obiol 27: 350-359; Tinh e al., 2008. FEMS Mic obiol
Ecol 62: 45-

53).
Po an o, en una ealización p e e ida de es e aspec o de la in ención, la 
en e medad in ecciosa bac e iana la padece un animal acuá ico. En o a
ealización p e e ida de es e aspec o de la in ención, las en e medades
in ecciosas bac e ianas son p o ocadas po bac e ias p oduc o as de AHLs.
En es a memo ia se en iende po “animal acuá ico” cualquie animal que i a
en el agua, como po ejemplo, aunque sin limi a nos, peces, moluscos o 
c us áceos.
Anexos/Annexes
310

Los “bio ilms” o “biopelículas”, al y como se de inen en es a memo ia, son
comunidades de mic oo ganismos que c ecen embebidos en una ma iz de
exopolisacá idos y adhe idos a una supe icie ine e o un ejido i o. Es una
comunidad de bac e ias (de una única especie o a ias), que se adhie e a una
supe icie sólida. La inhibición de las AHLs pe mi e inhibi la o mación de 
biopelículas o madas po p ocesos con olados po QS.
Los bio ilms p oducen una g an can idad de polisacá idos ex acelula es,
esponsables de la apa iencia iscosa, y se ca ac e izan po una g an
esis encia a agen es an ibió icos. Es a esis encia puede debe se a que la 
ma iz ex acelula en la que se encuen an embebidas las bac e ias
p opo ciona una ba e a en e a la pene ación de biocidas. O a posibilidad es
que la mayo ía de las células del bio ilm c ecen muy len amen e, en un es ado
de p i ación de comida, po lo que no son suscep ibles al e ec o de los agen es
an imic obianos. Un e ce aspec o pod ía se que las células en el bio ilm 
adop asen un eno ipo dis in o, po ejemplo, median e la exp esión de bombas
e luen es de á macos.
La con aminación biológica de supe icies es común, pudiendo desa olla se el
bio ilm sob e supe icies hid ó obas, hid ó ilas, bió icas o abió icas, y conduce a 
la deg adación del ma e ial, p oduc os de con aminación, bloqueo mecánico e
impedancia de la ans e encia de calo en p ocesos acuá icos. Los bio ilms son
ambién la p ime a causa de la con aminación biológica de sis emas de
dis ibución de agua po able, y o as conducciones, siendo especialmen e
impo an e el con ol de bio ilms en los sis emas an iincendios. El 
es ablecimien o de bac e ias adhe idas a los alimen os o a las supe icies en
con ac o con los alimen os, conlle a se ios p oblemas higiénicos e incluso
casos de oxiin ecciones alimen a ias, así como nume osas pé didas
económicas po los p oduc os que se llegan a desecha (Ca pen ie & Ce ,
1993. J App Bac e . 75:499-511). 
En acuicul u a iene especial ele ancia la o mación de bio ilm en es uc u as
Anexos/Annexes
311

sume gidas ales como jaulas, edes o con enedo es; o equipamien os ales
como cañe ías, bombas, il os y anques colec o es, y pa a especies de cul i o,
como mejillones, iei as, os as, e c. Se conoce como bio ouling y a ec a a
odos los sec o es de la acuicul u a eu opea, siendo un p oblema c ecien e
debido a la aplicación de la Di ec i a de P oduc os Biocidas EC 98/8/EC, 
esul ando en sus anciales pé didas económicas. Tiene además, epe cusiones
ecológicas impo an es po que los o ganismos acuá icos que se a ianzan a los
cascos de los ba cos como consecuencia del bio ouling acompañan a es os
na íos a donde quie a que ayan. Es o ha signi icado un p oblema ecológico
mundial, ya que los ba cos es án asladando especies in aso as hacia los 
lagos, los íos y los océanos que no son su hábi a o iginal.
Así, la ab icación de pin u as an i-inc us aciones con células bac e ianas de la
in ención, p e e iblemen e, con la cepa de la in ención, el ex ac o celula
c udo o el sob enadan e de sus cul i os,
educi ía el bio ouling en los cascos 
pin ados con ella, sin ene elemen os químicos óxicos pa a la ida ma ina.
Po an o, o o aspec o de la in ención se e ie e al uso de la célula bac e iana
de la in ención, p e e iblemen e, de la cepa de la in ención, del ex ac o celula
c udo o del sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, 
pa a inhibi la o mación de bio ilms.
Exis en nume osas e idencias epidemiológicas que elacionan los bio ilms con
dis in os p ocesos in ecciosos en humanos, como po ejemplo, aunque sin
limi a nos, los ecogidos en la abla 1 (Wilson, 2001. Sci P og 84: 235-254; 
Cos e on e al., 1999. Science, 284: 1318-1322). Los mecanismos po los que
el bio ilm p oduce los sín omas de la en e medad oda ía no es án
comple amen e es ablecidos, pe o se ha suge ido que las bac e ias del bio ilm
pueden p oduci endo oxinas, se pueden libe a g upos de bac e ias al o en e
sanguíneo, se uel en esis en es a la acción agoci a ia de las células del 
sis ema inmune y po o o lado, cons i uyen un nicho pa a la apa ición de
bac e ias esis en es a los a amien os an ibió icos. Es e úl imo aspec o puede
Anexos/Annexes
318

uncionamien o no mal y supe i encia del huésped, po lo que se cali ica al
mic oo ganismo como pa ógeno.
Po “ca ego ía axonómica” se en iende el ni el de je a quía u ilizado pa a la
clasi icación de los o ganismos. 
El é mino “polinucleó ido", al como se u iliza en es a memo ia, se e ie e a una
o ma polimé ica de nucleó idos de cualquie longi ud, sean ibonucleó idos o
desoxi ibonucleó idos. Los é minos “polinucleó ido” y “ácido nucleico” se usan
aquí de mane a in e cambiable y se e ie en exclusi amen e a la es uc u a 
p ima ia de la molécula.
El é mino “homología”, al y como se u iliza en es a memo ia, hace e e encia a
la semejanza en e dos es uc u as debida a una ascendencia e olu i a común,
y más conc e amen e, a la semejanza en e los nucleó idos de dos o más 
polinucleó idos.
El é mino “iden idad”, al y como se u iliza en es a memo ia, hace e e encia a
la p opo ción de nucleó idos idén icos en e dos polinucleó idos homólogos que
se compa an. 
El é mino “ eno ipo”, al como se u iliza en es a memo ia, se e ie e a la suma
o al de las p opiedades es uc u ales y uncionales obse ables de un
o ganismo; p oduc o de la in e acción en e el geno ipo y el medio ambien e.

El medio de cul i o empleado pa a el c ecimien o de las células bac e ianas de
la in ención, y p e e iblemen e de la cepa de la in ención, puede se cualquie
medio conocido en el es ado del a e. P e e iblemen e el medio con iene los
componen es que comp enden el medioambien e de donde se coge la mues a.
Po ejemplo, el medio de cul i o de bac e ias ma inas comp ende 
p e e iblemen e sales ma inas. El sopo e sólido pa a c ece colonias aisladas
indi iduales puede se aga , aga noble, Gel-Ri e o cualquie o o medio sólido

Anexos/Annexes
319

conocido en el es ado del a e.
A lo la go de la desc ipción y las ei indicaciones la palab a "comp ende" y sus
a ian es no p e enden exclui o as ca ac e ís icas écnicas, adi i os,
componen es o pasos. Pa a los expe os en la ma e ia, o os obje os, en ajas 
y ca ac e ís icas de la in ención se desp ende án en pa e de la desc ipción y
en pa e de la p ác ica de la in ención. Los siguien es ejemplos y dibujos se
p opo cionan a modo de ilus ación, y no se p e ende que sean limi a i os de la
p esen e in ención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Fo o del ensayo en medio sólido pa a de ec a cepas ma inas QQ
con los biosenso es pa a AHL C. iolaceum CV026 (A) y C. iolaceum
VIR07 (B). Las cepas de QQ posi i as (177, 168 y 20J) deg ada on ambas 
AHLs (10 μM) as 24 ho as, eliminando la p oducción de iolaceína compa ada
con el con ol (pocillo cen al). Se empleó una cepa de Vib io anguilla um como
con ol nega i o.
Fig. 2. Fo o de un ensayo en medio sólido pa a la de ección de ac i idad 
QQ sob e OC12-HSL con el bisenso E. coli JM109 pSB1075. Las cepas
capaces de deg ada la AHL as 24 ho as impiden la p oducción de luz po el
biosenso . El pocillo cen al se co esponde con el con ol de AHL (10 ȝM), los
pocillos a la izquie da se co esponden con aislados nega i os pa a
deg adación de OC12-HSL. 
Fig. 3. Análisis po HPLC-MS de deg adación de C4-HSL y C12-HSL en el
medio de cul i o de los 15 aislados QQ posi i os as 24 ho as. La
concen ación inicial de AHL e a de 50 μM. Los sob enadan es ue on
acidi icados has a pH 2 pa a pe mi i la ecupe ación del anillo de lac ona. CM: 
caldo ma ino.
Anexos/Annexes
320

Fig. 4. Á bol Neighbou -joining mos ando las elaciones en e los
aislados bac e ianos de los ejemplos de la in ención ( ombos oscu os) y
las especies con lac onasas (cí culos blancos) y acilasas (cí culos
oscu os) conocidas y cepas con ac i idad QQ conocida de las que no se
ha ca ac e izado la ac i idad enzimá ica ( ombos blancos) basada en el 
gen de 16S ADN . El núme o as cada nomb e axonómico es el núme o de
acceso pa a la secuencia génica co espondien e. Se mues an los alo es de
Boo s ap po encima del 50% del análisis neighbou -joining. Ba a: 0,02
sus i uciones po posición de nucleó ido.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A con inuación se ilus a á la in ención median e unos ensayos ealizados po
los in en o es, que ponen de mani ies o la especi icidad y e ec i idad de la
cepa de la in ención pa a deg ada N-Acil homose in lac onas. Es os ejemplos 
se incluyen solamen e con ines ilus a i os y no han de se in e p e ados como
limi aciones a la in ención que aquí se ei indica. Po an o, los ejemplos
desc i os más adelan e ilus an la in ención sin limi a el campo de aplicación
de la misma.

Me odología de aislamien o de las cepas bac e ianas ma inas
Pa a la de ección de bac e ias ma inas con ac i idad quo um quenching (QQ)
de señales ipo AHL se p ocedió al aislamien o de colonias p oceden es de
mues as de di e en es medios ma inos. 
Se oma on es ipos de mues as con ma e ial es é il:
-Mues a de sedimen o de un anque- ese o io de agua de ma de un
ci cui o ce ado pa a el cul i o de peces de la Uni e sidad de San iago de
Compos ela.
-Mues a de biopelícula de un anque de cemen o pa a el cul i o ma ino 
de peces en ci cui o abie o del ins i u o IGAFA (Isla de A osa).
-Mues a de alga Fucus esiculosus ob enida de un sus a o ocoso
Anexos/Annexes
321

in e ma eal en la Illa de A ousa. 1 g del alga ue oceado y diluido en 10 ml de
agua de ma es e ilizada.
Los medios sólidos empleados pa a el aislamien o ue on: Aga T ip ona soja
(TSA) 1% NaCl, Aga ma ino (MA, Di co), Aga ma ino en dilución 1/100, medio 
FAS suplemen ado con 1 g/l de casaminoácidos (FAS CAS) (Schu e al., 1993,
Appl En i on Mic obiol 7: 2150-2160) y medio FAS suplemen ado con 0,5 g/l de
los políme os aga osa, qui ina y almidón (FAS POL) (B uns e al., 2002, Appl
En i on Mic obiol 68: 3978-3987). Se p epa a on 3 diluciones (1/10, 1/100 y
1/1000) en agua de ma es e ilizada pa a cada una de las mues as y se 
semb a on en placas con los medios de cul i o nomb ados. Las placas se
incuba on a 15 y 22ºC du an e 15 días. Se aisla on un o al de 166 colonias en
unción de su di e en e mo ología y colo ación pa a el análisis de ac i idad QQ.
Pues o que las 166 cepas ob enidas p esen aban c ecimien o en MA a 22ºC,
se selecciona on es as condiciones de cul i o como mé odo de cul i o es ánda 
y pa a su man enimien o en el labo a o io.
De ección de ac i idad QQ
Las cepas aisladas ue on ensayadas pa a su ac i idad QQ u ilizando un 
ensayo en medio sólido basado en dos biosenso es de i ados de la especie
Ch omobac e ium iolaceum en los que la p oducción del exopigmen o
iolaceína es dependien e de la p esencia de AHLs en el medio de cul i o. La
cepa C. iolaceum CV026 se u ilizó inicialmen e pa a la de ección de la
deg adación de N-hexanoil-L-homose ín lac ona (C6-HSL, McClean e al., 
1997, Mic obiol 143: 3703-3711). Con pos e io idad se con i mó la capacidad
de deg adación de C10-HSL u ilizando la cepa C. iolaceum VIR07 (Mo ohoshi
e al., 2008b, FEMS Mic obiol Le 279: 124-130). Las cepas ma inas aisladas
se inocula on en ubos con 1 ml de caldo ma ino (CM) a 22ºC y 200 pm. T as
24 ho as se cen i uga on 500 μl de los cul i os a 2000 x g, du an e 5 min y se 
esuspendie on en 500 μl de CM al que se añadió C6-HSL ó C10-HSL 2 μM,
incubándose du an e o as 24 ho as. Pa a la e aluación de la deg adación de
Anexos/Annexes
322

las AHLs, se coloca on 50μl de los sob enadan es de es os cul i os en pocillos
ealizados con un sacabocados en placas de LB cubie as con LB blando
inoculado con 500μl de un cul i o de 12 ho as de C. iolaceum CV026 ó C.
iolaceum VIR07, añadiéndose 50 μl de agua des ilada es é il pa a comple a
el olumen del pocillo. T as 24 ho as de incubación a 25ºC se obse ó la 
p oducción de iolaceína (Figu a 1).
Además se analizó la capacidad de in e e i con la ac i idad de la OC12-HSL
de las cepas seleccionadas u ilizando la cepa senso a de E. coli JM109
pSB1075 (Winson MK, Swi S, Fisha L, Th oup JP, Jø gensen F, Chhab a SR, 
e al. 1998. FEMS Mic obiol Le 163:185-192). Se añadió OC12-HSL a 1 ml de
cul i o de 12 ho as de las cepas en Caldo Ma ino a una concen ación inal de
2 μg/ml y se incuba on du an e 24 ho as a 22ºC. La ac i idad AHL en el medio
de cul i o se e aluó en placas de LB cubie as con 5 ml de LB semi-sólido
inoculado con 50 μl de un cul i o de 12 ho as de la cepa senso a E. coli JM109 
pSB1075 man enida a 37ºC y 200 pm. Se pipe ea on 50 μl de cul i o en
pocillos ealizados en el aga de es as placas, u ilizándose CM es é il y CM
más OC12-HSL como con oles. Las placas se inocula on du an e 3 ho as a
37ºC, obse ándose la p oducción de luz de i ada de la ac i idad AHL (Figu a
2). 
Con i mación de la deg adación de AHL po HPLC-MS
Con las 15 cepas que mos a on inhibición de QS con a las AHLs C6 y C10, se
lle a on a cabo análisis median e HPLC-MS pa a de e mina inequí ocamen e 
su capacidad pa a deg ada AHLs (Figu a 3). A cul i os de 24h de 1 ml de las
cepas co espondien es, se añadie on las AHLs C4-HSL y C12-HSL con una
concen ación inal de 50 μM, y se incuba on es os cul i os du an e 24 h más a
22
o
C y a 200 pm. T as la cen i ugación de los cul i os (2000g, 5 min), se
di idió el sob enadan e en dos pa es iguales. Un olumen de 500 μl se 
acidi icó con HCl has a un pH de 2 y se incubó du an e 24 h a 25
o
C pa a
acili a la ecupe ación de la ac i idad AHL de i ada de la hid ólisis del anillo
Anexos/Annexes
323

de lac ona po la acción de las lac onasas. Los sob enadan es de los cul i os
se ex aje on 3 eces con un olumen igual de e ilace a o, se e apo a on bajo
lujo de ni ógeno y se esuspendie on en 200 μl de ace oni ilo pa a análisis
po HPLC-MS y cuan i icación. Las mues as de caldo ma ino suplemen adas
con la misma can idad de C4 o C12-HSL ue on p ocesadas y ex aídas de la 
misma o ma y usadas como con oles. Los análisis se lle a on a cabo con un
equipo de HPLC 1100 se ies (Agilen USA) con p ecolumna CB (2,1x12,5 mm,
5 ȝm de amaño de pa ícula) y columna ZORBAX Eclipse XDB-C18 2,1 x 150
mm ( amaño de pa ícula 5 ȝm) a 45
o
C. La ase mó il es aba compues a po
0,1% de ácido ó mico en agua (A) y 0,1% de ácido ó mico en ace oni ilo (B). 
La elocidad de lujo ue de 0,22 ml/min. Las condiciones de elución ue on las
siguien es: 0 min 35%B, g adien e lineal a 60%B en 10 min, g adien e lineal
desde 60% a 95% B du an e 5 min, 5 min 95% B y inalmen e uel a a las
condiciones iniciales en 9 min.

La columna ue eequilib ada du an e 5 min. El olumen de inyección ue de 2
ȝl. Los expe imen os de MS mos ados ue on lle ados a cabo en un
espec óme o de masas API 4000 iple-quad upole (Applied Biosys em, CA,
USA) equipado con una uen e de Tu bolon empleando un elec osp ay iónico
posi i o, con modo de moni o ización de eacción múl iple (MRM). La señales 
MRM se emplea on pa a gene a in o mación cuan i a i a ela i a median e
compa ación con una cu a de calib ado cons uida pa a abundancia iónica
molecula , empleando el es ánda sin é ico de AHL ap opiado (Mil on e al.,
2001, J Bac e iol 183: 3537-3547).

Iden i icación bac e iana basada en la subunidad 16S y análisis
ilogené icos
La iden i icación de las cepas se lle ó a cabo median e ampli icación y
secuenciación pa cial del gen co espondien e a la subunidad 16S del ARN . El 
ADN genómico de los dis in os aislados ue ex aído (Pu egene Tissue Co e Ki
B) y el gen de la subunidad 16S del ARN ue ampli icado empleando los

Anexos/Annexes
324

cebado es ANT1 ( o wa d) (5`AGAGTTTGATCATGGCTCAG) y S ( e e se)
(5`GGTTACCTTGTTACGACTT) (Ma inez-Mu cia and Rod iguez-Vale a, 1994,
FEMS Mic obiol Le 124: 265-269). Las eacciones de PCR se lle a on a cabo
bajo las siguien es condiciones es ánda : 35 ciclos (desna u alización a 94ºC
du an e 15 s, hib idación a 50ºC du an e 30 s, ex ensión a 72ºC du an e 2 min) 
p ecedidos po 2 min de desna u alización a 94ºC y seguidos po 7 min de
ex ensión a 72ºC. Los p oduc os de PCR ue on pa cialmen e secuenciados,
e isados y co egidos median e el p og ama BioEdi Sequence Alignmen
Edi o ( . 7.0.9.0 h p://www.mbio.ncsu.edu/BioEdi /bioedi .h ml). Un o al de
quince secuencias de la subunidad 16S del ARN ue on iden i icadas y 
compa adas con secuencias de la subunidad 16S del ARN disponibles en el
GenBank usando NCBI BLAST (Al schul e al., 1997, Nucleic Acids Res 25:
3389-3402) y el Ribosomal Da abase P ojec (h p:// dp.cme.msu.edu/h ml/).
Las secuencias de ARN 16S ue on alineadas usando MUSCLE (Edga , 2004,
Nucleic Acids Res 321792-321797) con las secuencias más ce canas 
ilogené icamen e encon adas en las bases de da os as iden i icación po
BLAST, y con aquellos aislados con ac i idad acilasa o lac onasa p e iamen e
iden i icados o con ac i idad QQ ya conocida. Pa a elimina espacios y
posiciones alineadas de modo inequí oco, se empleó Gblocks (Cas esana,
2000, Mol Biol E ol 17: 540-552), dando luga a 649 posiciones disponibles 
pa a cons ui el á bol ilogené ico. Los análisis ilogené icos se lle a on a cabo
después usando el paque e in o má ico de ilogénesis MEGA4 (Zmasek and
Eddy, 2001, Bioin o ma ics 17: 821-828; Kuma e al., 2004, B ie Bioin o m 5:
150-163) empleando los pa áme os po de ec o (Figu a 4).

RESULTADOS
C ecimien o y aislamien o bac e iano
Se ob u ie on esul ados muy dis in os en el núme o de unidades o mado as 
de colonias (CFU) dependiendo del medio de cul i o y de la empe a u a de
c ecimien o empleada pa a cada mues a. La mues a con una población de
Anexos/Annexes
325

bac e ias mayo ue la ob enida del sedimen o del anque de cul i o, llegando a
3x10
6
CFUs ml
-1
.
El mayo alo de CFU ob enido pa a la mues a de
biopelícula e a un o den de magni ud más bajo que en el sedimen o, mien as
que el núme o de bac e ias iables aisladas de F. esiculosus e a el más bajo,
llegando an sólo a 30.000 CFUs ml
-1
en el mejo de los casos. La empe a u a 
de c ecimien o y, lo que es más impo an e, el medio de cul i o empleado pa a
su aislamien o, ambién u ie on una g an in luencia sob e el núme o de
bac e ias iables aisladas. Tempe a u as más al as (22
o
C) pe mi ie on el
c ecimien o de un mayo núme o de colonias en casi odos los casos. El medio
de Aga Ma ino Diluido (MA 1/100) y el medio de FAS-CAS esul a on se los 
más e ec i os pa a la ecupe ación de CFUs en las mues as de sedimen o y
de biopelícula, mien as que en la mues a de F. esiculosus el medio de Aga
Ma ino y el de FAS-POL ue on igual de e ec i os a al as empe a u as,
esul ando en núme os de CFUs 3 eces mayo es que los o os medios de
cul i o. 
Un o al de 166 aislados ue on ob enidos de las mues as de ambien es
ma inos seleccionados pa a la búsqueda de ac i idad QQ, 85 cepas de la
mues a de sedimen o del anque de cul i o, 48 de la biopelícula y 33 de F.
esiculosus (Tabla 2). 
A pesa del mayo núme o de CFU/ml ob enidas con el medio de cul i o
oligo ó ico en las p ime as dos mues as, al ededo de la mi ad de aislados
empleados pa a la búsqueda de ac i idad QQ se ob u ie on de medios más
icos como TSA 1% NaCl y MA, debido a la mayo a iabilidad que se obse ó 
de las colonias. En el caso de la mues a de sedimen o, más del 70% de los
aislados p o enían de es os medios icos, mien as que en la mues a de
biopelícula la mayo ía de cepas habían sido aisladas en medio FAS (Tabla 2).
El núme o de cepas aisladas a las dos empe a u as dis in as que se
emplea on en el es udio ue muy simila : 91 cepas se aisla on de placas 
man enidas a 22
o
C y 75 de placas man enidas a 15
o
C.
Anexos/Annexes
326

De ección de la inhibición de la ac i idad quo um sensing median e
bioensayos
El ensayo en medo sólido en placa empleando la cepa biosenso a C.
iolaceum CV026 pe mi ió la de ección de la inhibición de la ac i idad C6-HSL 
de o ma obus a (Figu a 1). Es e ensayo pe mi ió di e encia las cepas con
ac i idad de inhibición del c ecimien o de aquéllas con una ac i idad QQ eal.
El ensayo en medio sólido con C. iolaceum CV026 pe mi ió la iden i icación de
24 cepas con ac i idad QQ, lo cual ep esen a un 14,5% de las cepas aisladas
(Tabla 2). 
Nº de cepas aisladas Cepas QQ
Sedimen o del
anque de
peces
TSA-1% NaCl 30 2
MA 31 4
MA 1/100 9 1
FAS-CAS 7 0
FAS-POL 8 1
To al 85 8
Bio ilm del
anque de agua
TSA-1% NaCl 9 0
MA 5 0
MA 1/100 7 0
FAS-CAS 17 2
FAS-POL 10 1
To al 48 3
Fucus
esiculosus
TSA-1% NaCl 9 3
MA 9 2
Anexos/Annexes
327

MA 1/100 5 3
FAS-CAS 7 3
FAS-POL 3 2
To al 33 13
Todas las mues as
TSA-1%NaCl 48 5
MA 45 6
MA 1/100 21 4
FAS-CAS 31 5
FAS-POL 21 4
To al 166 24
Tabla 2. Resumen de las cepas bac e ianas aisladas de dis in os ambien es y
medios de cul i o, mos ando el núme o y po cen aje de cepas con ac i idad de
inhibición QS con a C6-HSL ob enido empleando el ensayo en placa de C.
iolaceum CV026. MA: aga ma ino; MA 1/100: aga ma ino diluido 1/100 con 
agua de ma ; FAS-CAS: agua de ma il ada y au ocla ada suplemen ada con
casaminoácidos; FAS-POL: agua de ma il ada y au ocla ada suplemen ada
con políme os.
No se obse ó un e ec o signi ica i o del medio de cul i o empleado pa a el 
aislamien o sob e el po cen aje de cepas con ac i idad QQ (Tabla 2, es Chi
cuad ado, p>0,05). El 50% de las cepas ac i as ue on ac i adas a 22
o
C y po
an o el e ec o de la empe a u a de aislamien o no ue signi ica i o ( es de
Fishe exac o, p>0,05). Po el con a io, sí se obse ó un e ec o impo an e del
o igen de la mues a sob e el po cen aje de cepas con ac i idad QQ 
encon adas (Tabla 2, es Chi cuad ado, p<0,05). Mien as que las cepas
aisladas de los anques p esen a on un po cen aje de ac i idad QQ de en e el
6 y el 9% (Tabla 2), casi el 40% de las cepas aisladas de la mues a de F.
esiculosus esul a on ac i as con a C6-HSL (Tabla 2). Las 24 cepas que e an
apa en emen e capaces de in e cep a la ac i idad de C6-HSL se analiza on 
más a ondo, es udiando su capacidad de in e cep a C10-HSL median e el
mismo ensayo en medio sólido pe o empleando la cepa biosenso a C.
Anexos/Annexes
334

REIVINDICACIONES
1. Cepa de células bac e ianas de Į-P o eobac e ia deposi ada en la
Colección Española de Cul i os Tipo con núme o de depósi o CECT 7733.

2. Uso de la cepa según la ei indicación 1, del ex ac o celula c udo o del
sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, pa a
p o oca quo um quenching.
3. Uso de la cepa según la ei indicación 1, del ex ac o celula c udo o del 
sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, pa a la
elabo ación de un medicamen o.
4. Uso de la cepa según la ei indicación 1, del ex ac o celula c udo o del
sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, pa a la 
elabo ación de un medicamen o pa a el a amien o o p e ención de
en e medades in ecciosas bac e ianas.
5. Uso de la cepa según la ei indicación 4 donde la en e medad in ecciosa
bac e iana la padece un animal acuá ico. 
6. Uso de la cepa según la ei indicación 1, del ex ac o celula c udo o del
sob enadan e de sus cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, pa a
inhibi la o mación de bio ilms.

7. Uso de la cepa, del ex ac o celula c udo o del sob enadan e de sus
cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, según cualquie a de las
ei indicaciones 2 a 6, en combinación con an ibió icos u o os agen es
an ibac e ianos.

8. Uso de la cepa, del ex ac o celula c udo o del sob enadan e de sus
cul i os, o cualquie a de sus combinaciones, según cualquie a de las

Anexos/Annexes
335

ei indicaciones 4 a 7, donde la o mación de bio ilms y las en e medades
in ecciosas bac e ianas son p o ocadas po bac e ias p oduc o as de AHLs.
9. Composición que comp ende un elemen o seleccionado de la lis a que
comp ende: 
a. la cepa según la ei indicación 1,
b. el ex ac o celula c udo de un cul i o bac e iano de la cepa según la
ei indicación 1,
c. el sob enadan e del cul i o bac e iano de (b),

o cualquie a de sus combinaciones.
10. Uso de la composición según la ei indicación 9 como agen e
an ipa ogénico.

11. Uso de la composición según la ei indicación 9 pa a la elabo ación de un
medicamen o.
12. Uso de la composición según la ei indicación 9 pa a la elabo ación de un
medicamen o pa a el a amien o o p e ención de en e medades in ecciosas 
bac e ianas.
13. Uso de la composición según la ei indicación 12 donde la en e medad
in ecciosa bac e iana la padece un animal acuá ico.

14. Uso de la composición según la ei indicación 9 pa a inhibi la o mación de
bio ilms.
15. Uso de la composición según cualquie a de las ei indicaciones 10 a 14 en
combinación con an ibió icos u o os agen es an ibac e ianos. 
Anexos/Annexes
336

16. Uso de la composición según cualquie a de las ei indicaciones 12 a 15
donde la o mación de bio ilms y las en e medades in ecciosas bac e ianas
son p o ocadas po bac e ias p oduc o as de AHLs.

Anexos/Annexes
337



FIG. 1
FIG. 2
9LEULR
DQJXLOODUXP
9LEULR
DQJXLOODUXP
&RQWURO
&+6/
&RQWURO
&+6/
-- 


$ %
Anexos/Annexes
338

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CM
C12
2 5 168 172 173 176 177 20 24 30 33 50 97-1 97-2 61
Cepa
% AHL
C12 C12 acidi icado
Fucus esiculosus Sedimen o Biopelícula
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CM
C4
2 5 168 172 173 176 177 20 24 30 33 50 97-1 97-2 61
Cepa
% AHL
C4 C4 acidi icado
Biopelícula
Fucus esiculosus Sedimen o

FIG. 3
Anexos/Annexes
339

γ
γ
γ
γ-p o eobac e ia
α
α
α
α-p o eobac e ia
Fi micu es
Ac inobac e ia
Bac e iode es
β
ββ
β-p o eobac e ia
Cyanobac e ia
Shigella sp. 5 219944573
Klebsiella pneumoniae 342 206575712
Shewanella sp. MIB015 161408102
Pseudoal e omonas a lan ica T6c 109896322
Al e omonas sp. BCw156 229892555
168
Gamma p o eobac e ium HTCC5015 254449402
Endosymbion o Lucinoma sp. 209869711
Gamma p o eobac e ium NOR5-3 218703224
Ch omohalobac e salexigens DSM 30439402
Halomonas aeanensis BH539 50236441
33
Azo obac e inelandii DJ 226942170
Pseudomonas ae uginosa PAO1 110645304
Pseudomonas pu ida KT2440 26986745
Pseudomonas sy ingae B728a 66043271
Pseudomonas luo escens P 0-1 255961261
Acine obac e sp. C1010 34484363
Rals onia solanacea um GMI1000 17544719
Rals onia picke ii 12D 241661625
Comamonas sp. D1 33329791
Va io o ax pa adoxus VAI-C 11385580
Sphingopyxis wi la iensis W-50 253680762
61
Roseo a ius aes ua ii 182892404
177
Phaeobac e sp. NH52F 209981527
Rhodobac e aes ua ii 161513025
2
Hyphomonas sp. DG895 32441397
97-1
5
176
Rhodobac e aceae bac e ium MEBiC05066 1828924041
Bosea hiooxidans KB13-VS 6273428
B ady hizobium sp. BTAi1 CP000494
Ag obac e ium ume aciens s . C58 1591184118
Rhodococcus e y h opolis MM30 190351101
173
50
A h obac e sp. IBN110 31558965
S ep omyces sp. M664 49781330
Anabaena sp. PCC 7120 39010
Bacillus hu ingiensis 49476684
Bacillus sp. A24 225921123
24
Bacillus ci culans X3 190364844
Oceanobacillus caeni 115551759
30
Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611
172
97-2
Fla obac e ium aqua ile 87116142
20J
Tenacibaculum discolo 151416868
100
100
95
100
100
99
94
78
67
100
100
96
82
100
100
100
100
100
100
100
99
84
100
100
100
74
100
91
98
100
99
100
96
99
84
57
98
95
90
74
0.02
γ
γ
γ
γ-p o eobac e ia
α
α
α
α-p o eobac e ia
Fi micu es
Ac inobac e ia
Bac e iode es
β
ββ
β-p o eobac e ia
Cyanobac e ia
Shigella sp. 5 219944573
Klebsiella pneumoniae 342 206575712
Shewanella sp. MIB015 161408102
Pseudoal e omonas a lan ica T6c 109896322
Al e omonas sp. BCw156 229892555
168
Gamma p o eobac e ium HTCC5015 254449402
Endosymbion o Lucinoma sp. 209869711
Gamma p o eobac e ium NOR5-3 218703224
Ch omohalobac e salexigens DSM 30439402
Halomonas aeanensis BH539 50236441
33
Azo obac e inelandii DJ 226942170
Pseudomonas ae uginosa PAO1 110645304
Pseudomonas pu ida KT2440 26986745
Pseudomonas sy ingae B728a 66043271
Pseudomonas luo escens P 0-1 255961261
Acine obac e sp. C1010 34484363
Rals onia solanacea um GMI1000 17544719
Rals onia picke ii 12D 241661625
Comamonas sp. D1 33329791
Va io o ax pa adoxus VAI-C 11385580
Sphingopyxis wi la iensis W-50 253680762
61
Roseo a ius aes ua ii 182892404
177
Phaeobac e sp. NH52F 209981527
Rhodobac e aes ua ii 161513025
2
Hyphomonas sp. DG895 32441397
97-1
5
176
Rhodobac e aceae bac e ium MEBiC05066 1828924041
Bosea hiooxidans KB13-VS 6273428
B ady hizobium sp. BTAi1 CP000494
Ag obac e ium ume aciens s . C58 1591184118
Rhodococcus e y h opolis MM30 190351101
173
50
A h obac e sp. IBN110 31558965
S ep omyces sp. M664 49781330
Anabaena sp. PCC 7120 39010
Bacillus hu ingiensis 49476684
Bacillus sp. A24 225921123
24
Bacillus ci culans X3 190364844
Oceanobacillus caeni 115551759
30
Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611
172
97-2
Fla obac e ium aqua ile 87116142
20J
Tenacibaculum discolo 151416868
100
100
95
100
100
99
94
78
67
100
100
96
82
100
100
100
100
100
100
100
99
84
100
100
100
74
100
91
98
100
99
100
96
99
84
57
98
95
90
74
0.02

FIG. 4



Anexos/Annexes
340

RESUMEN
Uso de una nue a Į-P o eobac e ia pa a Quo um Quenching
La p esen e in ención se e ie e a una cepa de una nue a especie de Į-
P o eobac e ia a ín al géne o Phaeobac e , que es capaz de deg ada las N-
Acil-homose in lac onas (AHLs), las cuales no pueden se ecupe adas
signi ica i amen e po acidi icación, indicando una ac i idad enzimá ica
di e en e a la lac onasa. Po an o, el empleo de es a bac e ia es ú il pa a
con ola las in ecciones bac e ianas, sin eje ce p esión selec i a sob e las 
poblaciones de las bac e ias pa ógenas y e i ando así la apa ición de
esis encias. También pe mi e la inhibición de o os p ocesos de colonización
bac e iana en los que es án implicadas las señales de “quo um sensing” o QS
ipo AHL, como la o mación de bio ilms.
Anexos/Annexes
341
8QWLWOHGB67
/,67$'2'(6(&8(1&,$6
!8QLYHUVLGDGHGH6DQWLDJRGH&RPSRVWHOD

!8VRGHXQDQXHYDDOID3URWHREDFWHULDSDUD4XRUXP4XHQFKLQJ
!
!
!3DWHQW,QYHUVLRQ
!
!
!'1$
!&HSDEDFWHULDQDFRQQ~PHURGHGHSyVLWR&(&7
!
FDFDWJFDDJWFJDJFJFWWFDFWWFJJWJDJJDJFJJFJJDFJJJWWDJWDDFJFJWJJ
JDDFDWDFFFWWWWFWDDJJDDWDJFFDFWJJDDDFJJWJDJWDDWDFFWWDWDFJFFFW
WFJJJJJDDDJDWWWDWFJJDJDDJJDWWJJFFFJFJWWDJDWWDJDWDJWWJJWJJJJW
DDWJJFFWDFFDDJWFWDFJDWFWDWDJFWJJWWWWDJDJJDWJDWFDJFDDFDFWJJJD
FWJDJDFDFJJFFFDJDFWFFWDFJJJDJJFDJFDJWJJJJDDWFWWDJDFDDWJJJFJF
DDJFFWJDWFWDJFJDWJFFJFJWJDJWJDWJDDJJFFWWDJJJWFJWDDDJFWFWWWFJ
FFDDJJDWJDWDDWJDFDJWDFWWJJWDDDJDDJWFFFJJFWDDFWFFJWWFFDJFDJFF
JFJJWDDWDFJJDJJJJDFWDJFJWWJWWFJJDDWWDFWJJJFJWDDDJFJFDFJWDJJF
JJDWFDJDDDJWDWJJJJWJDDDWFFFDJJJFWFDDFFFWJJDDFWJFFWFDWDDDFWFF
WJJWFWWJDJWWFJDJDJDJJWJDJWJJDDWWFFJDJWJWDJDJJWJDDDWWFJWDJDWD
WWFJJDJJDDFDFFDJWJJFJDDJJFJJFWFDFWJJFWFJDWDFWJDFJFWJDJJWJFJD
DDJWJWJJJJDJFDDDFDJJDWWDJDWDFFFWJJWDJWFFDFDFFJWDDDFJDWJDDWJF
FDJWFJWFJJDWDJFDWJFWDWWFJJWJDFDFDFFWDDFJJDWWDDJFDWWFFJFFWJJJ
JDJWDFJJWFJFDDJDWWDDDDFWFDDDJJDDWWJDFJJJJJFFFJFDFDDJFJJWJJDJ
FDWJWJJWWWDDWWFJDDJFDDFJFJFDJDDFFWWDFFDDFFFWWJDFDWFFWJWJFWDF
DWFFDJDJDWJJDWJJWWFFFWWFJJJJDFJFDJWJDWFDJJWJFWJFDWJJFWJWFJWF
DJFWFJWJWF
3iJLQD
Anexos/Annexes
343
Anexo 3. O as publicaciones elacionadas
3.1 Quo um quenching ac i i y in Anabaena sp. PCC 7120: iden i ica ion o AiiC, a
no el AHL-acylase. FEMS Le . 280: 73-80.
Anexos/Annexes
350
diazo ophic cul u es and disappea ab up ly when he ea ly
s a iona y phase is achie ed (M. Rome o e al., unpublished
esul s), indica ing ha he le el o he signals could be
modula ed h ough he p esence o deg ada ion mechan-
isms. This ac encou aged a sea ch o enzymes able o
deg ade he AHLs in Anabaena sp. PCC 7120. The deg ada-
ion ac i i y ound, demons a ed o be acylase- ype by he
dansyla ion assay, can be a leas pa ially a ibu ed o
he aiiC acylase gene cloned in his pape . E en hough he
p esence o addi ional acylases in Anabaena sp. PCC 7120
canno be comple ely excluded, he simila i y be ween he
specifici y o AHL deg ada ion o he cyanobac e ial CCE
and he cloned enzyme (Table 1) seems o indica e ha AiiC
is he only enzyme esponsible o he deg ada ion o AHLs
in Anabaena sp. PCC 7120.
The 2544 bp all3924 gene, he e named aiiC, encodes an
847 amino acid p o ein. As epo ed o he homologous
quo um signal u iliza ion and inac i a ion p o ein QuiP in
P. ae uginosa PAO1, he p esence o a signal sequence and a
pu a i e ansmemb ane domain loca ed in he N- e minal
egion ( esidues 20–40) sugges s ha AiiC has a pe iplasmic
localiza ion. Acylase ac i i y has been localized p ima ily in
he cell deb is a e lysis in Rals onia sp. (Lin e al., 2003),
while in S ep omyces sp. i has been ound in he cul u e
media (Pa k e al., 2005). The p edic ed seconda y s uc u e
o AiiC and he absence o acylase ac i i y in he cell- ee
cul u e supe na an s sugges ha in he case o Anabaena sp.
PCC 7120, he enzyme is cell-bound.
Genomic sea ches wi h acylase sequences e ealed he
p esence o genes homologous o he Pseudomonas acy-
lases in he genomes o he filamen ous cyanobac e ium
N. punc i o me and in he unicellula G. iolaceus and
Synechocys is sp., indica ing ha his ac i i y could be wide-
sp ead among he Cyanobac e ia. The phylogene ic analysis
shows ha AiiC and mos o he o he cyanobac e ial
pu a i e acylases a e closely ela ed o P. ae uginosa PAO1
QuiP (Fig. 4). Only he po en ial homologous acylase o he
unicellula nondiazo ophic cyanobac e ium Synechocys is
sp. PCC 6803 is loca ed in a di e en b anch, close o he
P dQ acylase o P. ae uginosa. Ou o hese wo clus e s is
he R. e y h opolis acylase QsdA, which shows no homology
wi h he o he s. The QuiP clus e p o eins sha e in a e age
30% iden i ies be ween hem, while he P dQ clus e sha es
a mo e a iable 23–40% iden i y in hei pep ide sequences.
Despi e hei ela i ely low o e all sequence homologies,
conse ed homologous domains o 11–12 esidues can be
obse ed in bo h he QuiP clus e (GYXHAQDRLWQM)
and in he P dQ clus e (GLLLXNPHXPN). The iden i y
be ween he wo AHL-acylases clus e s is only 18%, wi hou
any no iceable conse ed mo i in hei sequences. Despi e
showing a highe simila i y o he P. ae uginosa PAO1
acylases, hose a e only able o deg ade long-chain specifi-
cally AHLs (Huang e al., 2006; Sio e al., 2006), while AiiC
can also deg ade sho -chain AHLs, (Table 1), as i has been
desc ibed o QsdA o AiiD R. e y h opolis and Rals onia sp.
o he ac i i y ound in Va io o ax pa adoxus (Leadbe e &
G eenbe g, 2000; Lin e al., 2003; U oz e al., 2005).
Because he lowes acylase ac i i y in he biomass o
diazo ophic cul u es is obse ed a he ea ly s a iona y
phase, co ela ing wi h he highes AHL concen a ion in
he biomass (M. Rome o e al., unpublished esul s), he
possibili y ha his enzyme could be di ec ly in ol ed in he
140 000
120 000
100 000
80 000
60 000
40 000
20 000
0
C12-HSL
100 μg mL
CCE DH5αCCE DH5α aiiC
RLU
Fig. 3. C12-HSL deg ada ion ac i i y o CCE o Esche ichia coli DH5a
ans o med wi h pME6032 ca ying (CCE DH5aaiiC) o no (CCE DH5a)
he aiiC gene be o e (ha ched ba s) and a e acidifica ion o pH 2.0 (solid
ba s). Luminescence alues o nega i e con ols (non ea ed biosenso o
biosenso plus sol en ) we e sub ac ed in o de o no malize he esul s.
E. coli cul u es we e ca ied ou a 28 1C and deg ada ion assays we e
ca ied ou a 30 1C.
NPR0954 Nos oc punc i o me PCC 7310
2
10 PAM
QsdA Rhodococcus e y h opolis
AiiD Rals onia sp.
AiiC Anabaena sp. PCC 7120
GLR1988 Gloeobac e iolaceus PCC 7421
SLR0378 Synechocys is sp. PCC 6803
AhIM S ep omyces sp.
P dQ Pseudomonas ae uginosa PA01
QuiP Pseudomonas ae uginosa PA01
Fig. 4. T ee showing he phylogene ic ela ionship be ween he AiiC
acylase o Anabaena sp. PCC 7120 and homologous sequences om
known o pu a i e acylases p esen in di e se bac e ia and Cyanobac e ia.
PAM, pe cen accep ed mu a ion.
FEMS Mic obiol Le 280 (2008) 73–80
c
2008 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
78
M. Rome o e al.

Anexos/Annexes
351
in acellula inac i a ion o he signals should be in es i-
ga ed. The use o he QQ enzymes o he sel -modula ion o
he le el o he signals has al eady been ound in Ag obac e -
ium ume aciens, o which he lac onase ac i i y o A M
seems o be c ucial o he inhibi ion o conjuga ion o he
Ti plasmid (Zhang e al., 2002). The hypo hesis o a possible
ole o AiiC in he egula ion o he AHLs in acellula le el
is u he suppo ed by he ac ha he AHL acylase ac i i y
could be ound only in he biomass. The con inuous
pe iplasm o filamen ous Cyanobac e ia is hough o be a
channel o he ans e o signals and nu ien s, which is
essen ial o he mul icellula na u e o hese o ganisms
(Ma iscal e al., 2007). The ans e o he signals h ough
he con inuous pe iplasm would be consis en wi h he
finding o AHLs in he biomass o Anabaena sp. PCC 7120
and a possible pe iplasmic loca ion o he acylase.
Al hough he possible physiological ole o AHLs in
Anabaena sp. PCC 7120 is no ye comple ely defined, he
p esence o AHLs only in he biomass o diazo ophic
cul u es and a s ong e ec o he addi ion o exogenous
AHLs on he ni ogenase ac i i y indica e a possible ole o
AHLs in he con ol o he e ocys di e en ia ion o any
o he p ocess ela ed o ni ogen fixa ion (M. Rome o e al.,
unpublished esul s). Ano he ac suppo ing he hypo h-
esis o a ole o AHLs and AHL-acylase in he complex
ne wo k o genes con olling ni ogen fixa ion in Anabaena
sp. PCC 7120 is he p esence o a pu a i e binding si e o
N cA a posi ion 48 in he aiiC p omo e . N cA is he
global ansc ip ion egula o belonging o he cyclic AMP
ecep o p o ein amily, which con ols a numbe o genes
in ol ed in ni ogen and ca bon me abolism and is espon-
sible o he ini ia ion o he e ocys di e en ia ion (He e o
e al., 2004).
On he o he hand, and e en hough he hypo hesis ha
AiiC could play a sel - egula o y unc ion canno be com-
ple ely excluded, he p esence o acylase ac i i y in diazo-
ophic cul u es, in which no AHLs could be de ec ed,
sugges s a mo e gene al physiological ole o AiiC. The
unicellula nondiazo ophic cyanobac e ium Synechocys is
sp. PCC 6803 also possesses a pu a i e acylase and his may
indica e an al e na i e physiological ole o his enzyme.
Because he p esence o AHLs has been demons a ed in he
na u al mic obial communi ies in which he Cyanobac e ia
a e p esen o e en domina e, such as mic obial ma s o
cyanobac e ial blooms (Bacho en & Schenk, 1998; B aun &
Bacho en, 2004), AiiC could also be in ol ed in he in e -
e ence o signalling in hese complex bac e ial sys ems.
Despi e hei ecological significance, he impo ance o
QS sys ems ha e been ques ioned due o he ela i ely low
numbe o P o eobac e ia species in which he eal physiolo-
gical unc ions con olled by he AHL-media ed QS sys em
has been iden ified (Manefield & Tu ne 2002). The in-
c easing numbe o bac e ia p esen ing AHL-deg ading
mechanisms ein o ces he iew on he ecological signifi-
cance o hese signals. In he case o Cyanobac e ia, he
p esence o AHL signals only in he biomass sugges s a
di e en usage o hese molecules ha may a he ac as
in acellula signals. E en hough some esul s indica e ha
AiiC could be in ol ed in he sel - egula ion o he AHL
le els in he diazo ophic filamen s, he cyanobac e ium
could also use he enzyme as a de ence ba ie in o de o
a oid he in e e ence o ex e nal signals wi h i s own
signalling sys em. The p esence o AHL-acylase sequences in
di e se Cyanobac e ia would suppo he la e hypo hesis.
Fu he s udies a e equi ed in o de o elucida e he possible
physiological ole o AiiC in Anabaena sp. PCC 7120.
Acknowledgemen s
This wo k was financed by a g an om Conselle ´
ıa de
Inno aci´
on e Indus ia, Xun a de Galicia PGIDIT06P-
XIB200045PR. Manuel Rome o is suppo ed by a FPU
ellowship om he Spanish Minis y o Science and Educa-
ion. The au ho s would like o hank Alex T uman o his
suppo on he HPLC analysis. The au ho s a e g a e ul o
Alicia Mu o Pas o o c i ically e iewing he manusc ip .
Re e ences
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L
-
homose ine lac one, a media o o bac e ial quo um-sensing
egula ion, exhibi s plan -dependen s abili y and may be
inac i a ed by ge mina ing Lo us co nicula us seedlings. FEMS
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FEMS Mic obiol Le 280 (2008) 73–80 c2008 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
79Quo um-quenching ac i i y in Anabaena sp. PCC 7120
Anexos/Annexes
352
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FEMS Mic obiol Le 280 (2008) 73–80
c
2008 Fede a ion o Eu opean Mic obiological Socie ies
Published by Blackwell Publishing L d. All igh s ese ed
80 M. Rome o e al.
Anexos/Annexes
353
3.2 Quo um sensing N-acylhomose ine lac one signals a ec su i al and ni ogen
ixa ion in he cyanobac e ium Anabaena sp. PCC7120 (Submi ed in FEMS
Mic obiology Le e s).
355
Fo Pee Re iew
KWWSPFPDQXVFULSWFHQWUDOFRPIHPV
4XRUXPVHQVLQJ1DF OKRPRVHULQHODFWRQHVLJQDOVDIIHFW
VXUYLYDODQGQLWURJHQIL[DWLRQLQWKHF DQREDFWHULXP
$QDEDHQDVS3&&
-RXUQDO )(060LFURELRORJ /HWWHUV
0DQXVFULSW,' 'UDIW
0DQXVFULSW7 SH 5HVHDUFK/HWWHU
'DWH6XEPLWWHGE WKH
$XWKRU QD
&RPSOHWH/LVWRI$XWKRUV 5RPHUR0DQXHO8QLYHUVLGDGGH6DQWLDJR'HSDUWDPHQWRGH
0LFURELRORJLD
0XUR3DVWRU$OLFLD&6,&,QVWLWXWR%LRTXLPLFD9HJHWDO 
)RWRVLQWHVLV
2WHUR$QD8QLYHUVLGDGGH6DQWLDJR6SDLQ'HSDUWDPHQWRGH
0LFURELRORJLD
.H ZRUGV& DQREDFWHULD$QDEDHQDTXRUXPVHQVLQJ$+/WHWUDPLFDFLG
QLWURJHQIL[DWLRQ
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FEMS Mic obiology Le e s

Anexos/Annexes
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Fo Pee Re iew
1
Quo um sensing N-acylhomose ine lac one signals a ec
1
su i al and ni ogen ixa ion in he cyanobac e ium
2
Anabaena sp. PCC7120
3
4
Manuel Rome o(1), Alicia M. Mu o-Pas o (2) and Ana O e o(1) 5
6
(1) Depa amen o de Mic obiología y Pa asi ología, Facul ad de Biología-CIBUS, 7
Uni e sidad de San iago de Compos ela. San iago de Compos ela, Spain. 8
(2) Ins i u o de Bioquímica Vege al y Fo osín esis, Consejo Supe io de In es igaciones 9
Cien í icas and Uni e sidad de Se illa. Se illa, Spain. 10
11
Co esponding au ho : Ana O e o, Dep. de Mic obiología y Pa asi ología, Fac. de 12
Biología-CIBUS, Uni . de San iago de Compos ela, 15782 San iago, Spain. Tel. +34 13
981563100 ex 16913, Fax: +34 981 528006. E-mail: [email p o ec ed] 14
15
Keywo ds 16
Cyanobac e ia, Anabaena, quo um sensing, AHL, e amic acid, ni ogen ixa ion. 17
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Fo Pee Re iew
2
Abs ac 24
Bac e ia sec e e small signal molecules in o he en i onmen ha ac inducing sel and 25
neighbou s gene exp ession. This phenomenon, e med Quo um Sensing (QS), allows 26
coope a i e beha iou s ha inc ease he i ness o he g oup. The bes s udied signal 27
molecules a e he N-acylhomose ine lac ones (AHLs), sec e ed by a g owing numbe o 28
bac e ial species including impo an pa hogen species like Pseudomonas ae uginosa. 29
These molecules ha e ecen ly been p oposed o ha e mo e han signalling p ope ies, 30
unc ioning as i on chelan s o an ibio ics. In his wo k we analyze he e ec s o 31
di e en AHLs a ying in leng h and subs i u ions on he g ow h and ni ogen 32
me abolism o he cyanobac e ium Anabaena sp. PCC7120. N-(3-oxodecanoyl)-L-33
homose ine lac one (OC10-HSL) was le hal o his diazo ophic cyanobac e ium. All 34
o he AHLs es ed did no p oduce cell lyses bu d ama ically inhibi ed ni ogen 35
ixa ion. The s ong inhibi ion o ni ogen ixa ion seems o ake place a pos -36
ansc ip ional le el, since no e ec on he e ocys di e en ia ion o in he exp ession o 37
ni ogenase was obse ed. The signi icance o hese esul s is discussed in ela ion o 38
ni ogen me abolism and non-signal p ope ies o AHLs. 39
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Fo Pee Re iew
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In oduc ion 48
The e m “quo um sensing” (QS) (Fuqua e al., 1994), desc ibes a phenomenon o 49
bac e ial communica ion ha con e s hese o ganisms he abili y o pe cei e and 50
espond o he communi y densi y h ough coo dina ed egula ion o gene exp ession, 51
hus being able o adop an ad an ageous social beha iou . Bac e ia communica e hei 52
p esence o o he s by sec e ing small chemical signals called au oinduce s, allowing he 53
indi iduals o dis inguish be ween high o low popula ion densi ies. 54
By means o QS, bac e ial popula ions can coo dina e impo an biological unc ions 55
including mo ili y, swa ming, agg ega ion, plasmid conjugal ans e , luminescence, 56
an ibio ic biosyn hesis, i ulence, symbiosis o bio ilm main enance and di e en ia ion 57
(Williams e al., 2007). While se e al chemically dis inc amilies o QS signal 58
molecules ha e now been desc ibed, he mos s udied QS signalling sys em in ol es N-59
acylhomose ine lac ones (AHLs) employed by di e se G am-nega i e bac e ia. AHLs 60
di e in he acyl side chain, which usually con ains be ween 4 and 18 ca bons in leng h, 61
wi h o wi hou sa u a ion o C3 hyd oxy- o oxo- subs i u ions (Whi ehead e al., 62
2001). AHLs ha e been ini ially desc ibed as being exclusi ely p oduced by a ela i ely 63
small numbe o Į and Ȗ-p o eobac e ia (Williams e al., 2007), bu ecen ly he 64
p oduc ion o hese signals has also been epo ed o he colonial cyanobac e ium 65
Gloeo hece (Sha i e al., 2008) and di e en ma ine Bac e oide es (Huang e al., 2008; 66
Rome o e al., 2010) which migh poin o a signi ican ole o QS sys ems in na u al 67
popula ions/en i onmen . 68
Besides i s unc ion as quo um signals, some AHLs ha e been p oposed o ha e o he 69
possible biological unc ions such as i on quelan s and an ibio ics (Kau mann e al., 70
2005; Sche ze e al., 2009). In Pseudomonas ae uginosa a na u ally occu ing 71
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deg ada ion p oduc o i s N-(3-oxododecanoyl)-L-homose ine lac one (OC12-HSL) 72
AHL signal, he e amic acid 3-(1- hyd oxydecylidene)-5-(2-hyd oxye hyl)py olidine-73
2,4-dione, exhibi s i on-binding abili y. This AHL de i a i e is able o bind i on in a 3:1 74
complex wi h an a ini y compa able o ha exhibi ed by s anda d chela o s and 75
side opho es (Sche ze e al., 2009). Also, an ibio ic p ope ies o he e amic acid 76
de i a i e o OC12-HSL ha e been desc ibed, h ough he dis up ion o memb ane 77
po en ial and p o on g adien o bac e ia, hus elimina ing he p o on mo i e o ce and 78
leading o bac e ial dea h (Lowe y e al., 2009). 79
The exis ence o QS blockage sys ems adop ed by compe i o s o des oy o inhibi he 80
unc ions o AHLs also indica es he ecological impo ance o hese molecules. The 81
di e en mechanisms o in e e ence wi h QS communica ion sys ems ha e been 82
gene ally e med as “quo um quenching” (QQ) (Dong e al., 2001). An example o QQ 83
is he enzyma ic inac i a ion o AHLs, wi h wo g oups o AHL-deg ading enzymes 84
iden i ied so a . The lac onases hyd olyse he homose ine lac one (HSL) ing o he 85
AHL molecule o p oduce acyl homose ines (Dong e al., 2007), whe eas he acylases 86
clea e he AHL amide bond gene a ing he co esponding a y acid and HSL ing 87
(Dong e al., 2007). Enzyma ic QQ ac i i y has been desc ibed in G am-posi i e and 88
nega i e bac e ia and mo e ecen ly in he cyanobac e ium Anabaena sp. PCC7120 89
(Rome o e al., 2008). 90
Anabaena sp. PCC7120 is a ilamen ous cyanobac e ium able o simul aneously 91
pe o m pho osyn hesis and dini ogen ixa ion unde ae obic condi ions. In he 92
p esence o a sou ce o combined ni ogen, ilamen s g ow as undi e en ia ed chains o 93
ege a i e cells. In con as , when Anabaena sp. PCC7120 is dep i ed o combined 94
ni ogen, app oxima ely 10% o he cells di e en ia e in o mo phologically dis inc 95
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syne gic e ec o bo h compounds on he dis up ion o memb ane po en ial, since high 240
le els o HN
4+
ha e been desc ibed o ha e such e ec in cyanobac e ia (D a h e al., 241
2008), bu i ha was he case, a simila e ec would be expec ed o OC12-HSL 242
(Sche ze e al., 2009). The e o e, he ac ha OC10-HSL signal is le hal only in he 243
p esence o combined ni ogen in liquid media should be he esul o a speci ic 244
inhibi o y e ec a some poin o he assimila ion o combined ni ogen. This e ec 245
should be highly speci ic and di e en om he an ibio ic e ec desc ibed so a o 246
e amic acids, since no cy o oxic e ec could be obse ed when Anabaena sp. 247
PCC7120 was cul i a ed in liquid BG11
0
C+NH
4+
supplemen ed wi h OC12-HSL o i s 248
e amic acid de i a i e. The hal maximal e ec i e concen a ion (EC50) is be ween 8 249
and 55 PM o he OC12-HSL-de i ed e amic acid and be ween 22.1 and 100 PM o 250
OC12-HSL i sel depending on he bac e ial s ain (Kau mann e al., 2005). These 251
anges ma ch he le hal concen a ion obse ed o OC10-HSL in BG11
0
C+NH
4+
252
cul u es o Anabaena sp. PCC7120, bu his ac i i y was mainly desc ibed o G am-253
posi i e bac e ia, in which he e is no ou e memb ane p o iding a pe meabili y ba ie 254
like in G am-nega i e bac e ia. Mo eo e , Lowe y e al. (2009) epo ed da a on he 255
an i-bac e ial ac i i ies o OC12- e amic acid and C14- e amic acid, wi h he la e 256
being much mo e po en , likely due o he inc eased hyd ophobici y o he longe acyl 257
chain, allowing be e memb ane pa i ioning o cell pene a ion. Thus, i he cy o oxic 258
e ec obse ed in Anabaena sp. PCC7120 was caused by an OC10- e amic acid 259
de i a i e, a s onge e ec would be expec ed wi h he longe OC12- e amic acid, 260
which in u n is no inac i e in his case. All hese e idences poin o he mode o ac ion 261
o OC10-HSL in Anabaena PCC7120 being di e en om ha obse ed o G am-262
posi i e bac e ia. 263
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The obse a ion ha an ibio ics canno easily each he le hal concen a ions in na u al 264
en i onmen s has led o ques ioning whe he hese molecules could ac , in subinhibi o y 265
concen a ions, as signal molecules (Da ies, 2006; Lina es e al., 2006). Low 266
concen a ions o se e al an ibio ics can al e exp ession pa e ns o bac e ia wi hou 267
any e ec on g ow h a e (Da ies e al., 2006), which esembles he mode o ac ion o 268
QS signals. Thus one possibili y is ha he AHL signals ha e an ibio ic e ec s when 269
added a highe concen a ions han hose ound in na u al en i onmen s. In ac , he 270
concen a ions epo ed in he li e a u e o AHLs in he cul u e media o he model 271
mic oo ganism Vib io ische i usually ange be ween 0.4 and 400 nM (Kaplan & 272
G eenbe g, 1985; Schae e e al., 2002; Bu on e al., 2005), signi ican ly lowe han he 273
concen a ions exhibi ing cy o oxic ac i i y. 274
275
Possible e ec s o AHLs on he e ocys di e en ia ion was also es ed wi h Anabaena 276
sp. PCC7120 s ain CSEL4a (Olmedo-Ve d e al., 2006). This s ain exp esses g p gene 277
unde he con ol o n cA p omo e , ha is he mas e egula o o ni ogen assimila ion, 278
con olling also he ea ly phases o he e ocys di e en ia ion (He e o e al., 2004). 279
Cells g own in he p esence o BG11
0
C+NH
4+
we e ans e ed o BG11
0
C + AHL 100 280
PM. No changes in he ac i i y o he n cA p omo e could be obse ed in he p esence 281
o AHLs by means o changes in GFP luo escence, indica ing ha he AHLs we e no 282
a ec ing he p ocess o he e ocys di e en ia ion (da a no shown). 283
284
Ni ogenase ac i i y 285
The e ec o he signals on he ni ogenase ac i i y was e alua ed in BG11
0
C+NH
4+
286
cul u es ans e ed o BG11
0
C o he induc ion o he e ocys o ma ion and ni ogen 287
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Anexos/Annexes
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ixa ion in he p esence o he AHLs. Ni ogenase measu emen s we e ca ied ou 20 288
hou s a e he ni ogen s ep-down ea men in o de o allow he o ma ion o ma u e 289
he e ocys s. A s ong inhibi ion o he ni ogenase ac i i y was eco ded o all AHLs 290
es ed. The lowe e hylene p oduc ion in AHL- ea ed cul u es was e iden a e 15 291
minu es om ace ylene addi ion. The inhibi ion was specially ma ked in cul u es ea ed 292
wi h OC10 and OC12-HSL, in which none o esidual ni ogenase ac i i y could be 293
de ec ed (Figu e 2). This esul is consis en wi h he inhibi ion o g ow h obse ed in 294
he cyanobac e ium wi h hese wo AHLs in solid BG11
0
C media. 295
In o de o e alua e whe he he ni ogenase ac i i y inhibi ion was due o de ec s in 296
he e ocys wall o ma ion, hus p e en ing he o ma ion o O
2
impe meable laye s and 297
a mic ooxygenic en i onmen inside he he e ocys s, ni ogenase ac i i y was also 298
measu ed unde anae obic a mosphe e. Ai inside he lasks was subs i u ed by A gon 299
and DCMU was added o he cul u es o inhibi PSII-dependen O
2
p oduc ion. Highe 300
ni ogenase ac i i y was obse ed in anae obic condi ions when compa ed o ae obic 301
ones, bu he e ec o AHL addi ion was s ill obse ed (Figu e 2). This esul indica es 302
ha he lowe ni ogenase ac i i y obse ed in he p esence o AHLs was no due o 303
al e a ions o he he e ocys en elope and con i m ha hey ha e no e ec on he e ocys 304
di e en ia ion as obse ed in AHL supplemen ed cul u es desc ibed be o e. As in 305
ae obic condi ions, OC10 and OC12-HSL we e he signals wi h he s onges inhibi o y 306
e ec on ni ogenase ac i i y (Figu e 2). 20 hou s a e he addi ion o ace ylene s ill no 307
eco e y o no mal le els o ni ogenase ac i i y o he cul u es was obse ed ei he in 308
ae obic o anae obic condi ions (da a no shown). 309
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To de e mine whe he he inhibi o y e ec o he AHLs on ni ogen ixa ion ook place 311
only in de eloping he e ocys s, ni ogenase ac i i y was also measu ed in diazo ophic 312
cul u es in which C10-HSL (100 PM) was added 24 h a e ni ogen s ep-down, when 313
ma u e he e ocys s a e al eady p esen . The amoun o e hylene p oduced in ea ly 314
samples was simila in cul u es wi h o wi hou C10-HSL bu , in e es ingly, a 315
p og essi e lowe e hylene p oduc ion was obse ed in C10-HSL ea ed cul u e, 316
esul ing in a 30 % dec ease o ni ogenase ac i i y (da a no shown). The lowe AHL 317
inhibi o y e ec in ma u e he e ocys s, could be ela ed o he impe meabili y o he 318
ma u e he e ocys s wall. The inhibi on o he ni ogenase ac i i y in acclima ed cul u es 319
would be hen ela ed o he en ance o he AHLs in he new gene a ions o he e ocys s. 320
None heless i canno be excluded ha AHLs en e h ough ege a i e walls and sp ead 321
along he ilamen s by he pe iplasmic space, ac ing a molecula le el only in newly 322
o med he e ocys s. I has been desc ibed ha Anabaena sp. PCC7120 cells a e 323
su ounded by he plasma ic memb ane and a pep idoglican laye bu he ou e 324
memb ane o he wall does no en e he sep um be ween cells, implying he exis ence 325
o a con inuous pe iplasmic space (Flo es e al., 2006; Ma iscal e al., 2007). In ha case 326
he esul s obse ed would sugges a non e e sible inhibi ion o ni ogenase in e y 327
ea ly s ages ei he a he le el o gene exp ession o on i s enzyma ic ac i i y. 328
329
Exp ession o ni ogen ixa ion genes 330
Because all es ed AHLs showed some inhibi o y ac i i y on ni ogen ixa ion only in 331
newly o med he e ocys s, in o de o s udy possible e ec s a he le el o exp ession o 332
ni ogen me abolism genes, no he n blo s we e ca ied ou do de ec changes in 333
exp ession o he dini ogenase educ ase subuni gen (ni H) and e edoxin ( dxH, 334
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Anexos/Annexes
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encoding o dini ogenase educ ase elec on dono [Razquin e al., 1995]). Exp ession 335
o bo h genes is he e ocys speci ic and hei p oduc s a e in ol ed in ni ogen ixa ion. 336
No signi ican di e ences in he exp ession o bo h genes could be de ec ed a 20 and 337
24 h a e ni ogen s ep-down (no exp ession o ni H and dxH was de ec ed a 0, 3 and 338
6 h) in o al RNA ex ac ed om C10-HSL ea ed cul u es when compa ed o con ol 339
samples (Figu e 3). This esul indica es ha AHL inhibi ion could be a ec ing ei he 340
he exp ession o o he genes ela ed o ni ogen ixa ion o ac on ni ogenase- ela ed 341
genes a a pos - ansc ip ional le el. 342
343
The AHL signal p oduced by he colony and bio ilm o ming unicellula 344
cyanobac e ium Gloeo hece PCC6909 induces an inc ease in he exp ession o 345
aminoacid syn he ases (Sha i e al., 2008), pa icula ly he glu ama e syn hase. 346
Glu ama e, oge he wi h glu amine, plays a cen al ole in ammonium assimila ion ha 347
can be di ec ly inco po a ed in o hese molecules ei he a e ni a e o a mosphe ic 348
ni ogen assimila ion, ac ing as ni ogen ca ying biomolecules. Mo eo e i has been 349
obse ed ha he exogenous addi ion o he AHL signal o Gloeo hece PCC6909 350
cul u es inc eases he exp ession o ibulose-1,5-biphospha e ca boxylase/oxygenase 351
(RuBisCo) (Sha i e al., 2008). E idences exis ha Gloeo hece sec e es aminoacids 352
when he ni ogen ixa ion a e exceeds he g ow h capabili y o he cyanobac e ium 353
(Flynn & Gallon, 1990). I is he e o e possible ha Gloeo hece egula es i s ni ogen 354
and ca bon balance depending on he popula ion densi y (Sha i e al., 2008). Pe haps 355
he e ec s obse ed when exogenous AHLs a e added o Anabaena sp. PCC7120 a e 356
ela ed o a C/N imbalance. When enough concen a ion o AHL is in oduced in liquid 357
cul u es, i could unbalance he a ailable le els o ni ogen and ca bon in he cells, 358
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which would explain he le hal e ec o OC10-HSL in non diazo ophic medium and 359
he o al ni ogenase ac i i y inhibi ion in he absence o combined ni ogen. 360
The p esence o acylase ac i i y agains AHLs desc ibed in he biomass o Anabaena 361
sp. PCC7120 (Rome o e al., 2008) could be ela ed o he nega i e e ec s o AHLs in 362
his cyanobac e ium. This AHL-deg ada ion mechanism would p o ec he ilamen s, a 363
no mal en i onmen al concen a ions, om exogenous signals wi h po en ial cy o oxic 364
and inhibi o y ac i i ies on he cyanobac e ium. 365
366
In conclusion, N-acylhomose ine lac ones do no seem o a ec he p ocess o 367
he e ocys di e en ia ion because no changes we e obse ed in he equency, pa e n o 368
di e en ia ion, pe meabili y o he he e ocys cell wall, o exp ession o egula o y 369
genes whose p oduc s a e in ol ed in di e en ia ion (n cA). The s ong inhibi ion o 370
ni ogenase ac i i y obse ed could be ela ed o ni ogen ixa ion blockage a a pos -371
ansc ip ional le el, mainly on new o ming he e ocys s, o /and o an C/N unbalance 372
a ec ing ene ge ic equilib ium o he cells. A possible new ac i i y o AHL signals was 373
ound o OC10-HSL, di e ing om hose al eady desc ibed o Oxo- subs i u ed and 374
AHL e amic acid de i a i es. 375
376
Acknowledgemen s 377
This wo k was inanced by a g an om Conselle ía de Inno ación e Indus ia, Xun a de 378
Galicia PGIDIT06PXIB200045PR. Manuel Rome o was suppo ed by a FPU 379
ellowship om he Spanish Minis y o Science and Educa ion and a p edoc o al 380
ellowship om Dipu ación de A Co uña. We would like o hank P o esso Kim D. 381
Janda and D . Gunna F. Kau mann o kindly p o iding us wi h OC12-Te amic acid. 382
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Anexos/Annexes
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17
383
Re e ences 384
Bacho en R & Schenk A (1998) Quo um sensing au oinduce s - do hey play a ole in 385
na u al mic obial habi a s. Mic obiol Res 153: 61-63. 386
Bu on EO, Read HW, Pelli e i MC & Hickey WJ (2005) Iden i ica ion o acyl-387
homose ine lac one signal molecules p oduced by Ni osomonas eu opaea s ain 388
Schmid . Appl En i on Mic obiol 71: 4906-4909. 389
Da ies J (2006) A e an ibio ics na u ally an ibio ics? J Ind Mic obiol Bio echnol 33: 390
496-499. 391
Da ies J, Spiegelman GB & Yim G (2006) The wo ld o subinhibi o y an ibio ic 392
concen a ions. Cu Opin Mic obiol 9: 445-453. 393
Dong YH, Wang LH & Zhang LH (2007) Quo um-quenching mic obial in ec ions: 394
mechanisms and implica ions. Phil T ans R Soc B 362: 1201-1211. 395
Dong YH, Wang LH, Xu JL, Zhang HB, Zhang XF & Zhang LH (2001) Quenching 396
quo um-sensing-dependen bac e ial in ec ion by an N-acyl homose ine lac onase. 397
Na u e 411: 813-817. 398
D a h M, Klo N, Ba schchaue A, Ma in K, No ak J & Fo chhamme K (2008) 399
Ammonia igge s pho odamage o pho osys em II in he cyanobac e ium 400
Synechocys is sp. s ain PCC 6803. Plan Physiol 147: 206-215. 401
Flo es E, He e o A, Wolk PC & Maldene I (2006) Is he pe iplasm con inuous in 402
ilamen ous mul icellula cyanobac e ia?. T ends Mic obiol 14: 439-443. 403
Flynn KL & Gallon JR (1990) Changes in in acellula an ex acellula D-amino acids in 404
Gloeo hece du ing N2- ixa ion and ollowing addi ion o ammonium. A ch 405
Mic obiol 153: 574-579. 406
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and he N cA ansc ip ion ac o in ilamen ous cyanobac e ia. FEMS Mic obiol 411
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Huang YL, Ki JS, Case RJ & Quian PY (2008) Di e si y and acyl-homose ine lac one 413
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Kaplan HB & G eenbe g EP (1985) Di usion o au oinduce is in ol ed in egula ion 416
o he Vib io ische i luminescence sys em. J Bac e iol 163: 1210-1214. 417
Kau mann GF, Sa o io R, Lee SH, Roge s CJ, Meijle MM, Moss JA, Clapham B, 418
B ogan AP, Dicke son TJ & Janda KD (2005) Re isi ing quo um sensing: disco e y 419
o addi ional chemical and biological unc ions o 3-oxo-N-acyl-homose ine 420
lac ones. P oc Na l Acad Sci USA 102: 309-314. 421
Lina es JF, Gus a sson I, Baque o F & Ma inez JL (2006) An ibio ics as in e mic obial 422
signaling agen s ins ead o weapons. P oc Na l Acad Sci USA 103: 19484-19489. 423
Lowe y CA, Pa k J, Gloeckne C, e al. (2009) De ining he mode o ac ion o e amic 424
acid an ibac e ials de i ed om Pseudomonas ae uginosa quo um sensing signals. J 425
Am Chem Soc 131: 14473 -14479. 426
Mackinney G (1941) Abso p ion o ligh by chlo ophyll solu ions. J Biol Chem 140: 427
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Ma iscal V, He e o A & Flo es E (2007) Con inuous pe iplasm in a ilamen ous, 429
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Anexos/Annexes
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McLean RJC, Whi eley M, S ickle DJ & Fuqua WC (1997) E idence o au oinduce 431
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Mu o-Pas o AM, Vallada es A, Flo es E & He e o A (2002) Mu ual dependence o 433
he exp ession o he cell di e en ia ion egula o y p o ein He R and he global 434
ni ogen egula o N cA du ing he e ocys de elopmen . Mol Mic obiol 44: 1377-435
1385. 436
Olmedo-Ve d E, Mu o-Pas o AM, Flo es E & He e o A (2006) Localized induc ion o 437
he n cA egula o y gene in de eloping he e ocys s o Anabaena sp. S ain PCC 438
7120. J Bac e iol 188: 6694-6699. 439
Razquin P, Schmi z S, Pelea o ML, Filla MF, Gómez-Mo eno C & Böhme H (1995) 440
Di e en ial ac i i ies o he e ocys e edoxin, ege a i e cell e edoxin, and 441
la odoxin as elec on ca ie s in ni ogen ixa ion and pho osyn hesis in Anabaena 442
sp. Pho osyn hesis Res 43: 35-40. 443
Rippka R, De uelles J, Wa e bu y JB, He dman M & S anie RY (1979) Gene ic 444
assignmen s, s ain his o ies and p ope ies o pu e cul u es o cyanobac e ia. J Gen 445
Mic obiol 111: 1-61. 446
Rome o M, Diggle SP, Heeb S, Cama a M & O e o A (2008) Quo um quenching 447
ac i i y in Anabaena sp. PCC 7120: iden i ica ion o AiiC, a no el AHL-acylase. 448
FEMS Mic obiol Le 280: 73-80. 449
Rome o M, A endaño-He e a R, Maga iños B, Cama a M & O e o A (2010) Acyl 450
homose ine lac one p oduc ion and deg ada ion by he ish pa hogen Tenacibaculum 451
ma i imum, a membe o he Cy ophaga-Fla obac e ium-Bac e oides (CFB) 452
di ision. FEMS Mic obiol le 304: 131-139. 453
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Schae e AL, Taylo TA, Bea y JT & G eenbe g EP (2002) Long-chain acyl-454
homose ine lac one quo um-sensing egula ion o Rhodobac e capsula us gene 455
ans e agen p oduc ion. J Bac e iol 184: 6515-6521. 456
Sche ze JW, Boule e ML, Whi eley M (2009) Mo e han a signal: non-signaling 457
p ope ies o quo um sensing molecules. T ends Mic obiol 17: 189-195. 458
Sha i DI, Gallon J, Smi h CJ, Dudley E (2008) Quo um sensing in Cyanobac e ia: N-459
oc anoyl-homose ine lac one elease and esponse, by he epili hic colonial 460
cyanobac e ium Gloeo hece PCC6909. ISME J 2008: 1-12. 461
Vallada es A, Maldene I, Mu o-Pas o AM, Flo es E & He e o A (2007) He e ocys 462
de elopmen and diazo ophic me abolism in e minal espi a o y oxidase mu an s 463
o he cyanobac e ium Anabaena sp. s ain PCC7120. J Bac e iol 189: 4425-4430. 464
Vioque A (1997) The RNase P RNA om cyanobac e ia: sho andemly epea ed 465
epe i i e (STRR) sequences a e p esen wi hin he RNase P RNA gene in 466
he e ocys - o ming cyanobac e ia. Nucleic Acids Res 25: 3471-3477. 467
Whi ehead NA, Ba na d AM, Sla e H, Simpson NJ & Salmond GP (2001) Quo um-468
sensing in G am-nega i e bac e ia. FEMS Mic obiol Re 25: 365-404. 469
Williams P, Winze K, Chan WC & Cáma a M (2007) Look who’s alking: 470
communica ion and quo um sensing in he bac e ial wo ld. Phil T ans R Soc B 362: 471
1119-1134. 472
Wolk CP, E ns A & Elhai J (1994) He e ocys me abolism and de elopmen . The 473
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