ARS PHARMACEUTICA 229
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
METABOLISMO DEL ACIDO MEV ALONICO EN VEGETALES
EDUARDO GARCIA PEREGRIN
RESUMEN
En expe iencias lle adas a cabo con plán ulas de Pinus pinas e se
ha demos ado la sin esis "in i o" de linalool y 4- e pineol a pa i de
ácido me alónico (MVA-2-14C).
Po o a pa e se ha es udiado "in i o" la inco po ación de MVA-
2-14C a os ome alónico (MV AP� y pi o os ome alónico (MVAPP) po ex
ac os lib es de células de P. pinas e y Chlo ella usca, así como po
ex ac os lib es de células y ex ac os de pol os ace ónicos d,e di e en es
ó ganos de Aga e ame icana.
Se han es ablecido algunas de las p opiedades ísicas, químicas y
ciné icas de la me alona o cinasa de P. pinas e y de A. ame icana: in
luencia de e ec o es de g upos -SH, eque imien os nucleo ídicos, pH
óp imo de ac uación, e ec o de algunos iones me álicos di alen es, alo es
de Km, e c.
La can idad de MVAP o mado en las eacciones depende de la con
c·en ación de p o einas en el medio y del iempo de incubación. Du an e
co os pe íodos de incubación, el MVAP o mado aumen a con la con
cen ación p o eica, mien as que en incubaciones p olongadas 1-6 h hay
una disminución del MV AP cuando se sob e!)asa una de e minada con
cen ación de p o eínas, obse ándose en es e caso un aumen o pa alelo
del MV A, lo cual sugie e que el MV AP o mado es hid olizado po una
os a asa p esen e en los ex ac os. Es a a,c i idad hid olí ica es elimi
nada po calen amien o, así como du an 'e el p oceso de pu i icación en
zimá ica.
La me alona o cinasa se ha pu i icado pa cialmen e po p ecipi a
ción con sul a o amónico, c oma og a ia en columna de Sephadex G-100
y a·ccionamien o a a és de DEAE-Sephadex A-50 y DEAE-celulosa.
Po c oma og a ía en columna de Sephadex G-100 se sepa an pe ec a
men e dos acciones con ac i idad me alon�, o cinasa, an o a pa i de
ex ac os de P. pinas e como de A. ame icana. Ello pa ece demos a la
exis encia en las especies ege ales en es udio de dos isoenzimas cuya
a·c i ldad es mani ies a al mismo alo de pH (7.9). Po úl imo, median e
écnicas de aislamien o en medio a,cuoso, se han pues o de mani ies o
A s Pha macéu ica. Tomo XVII. Núm. 2-3. 1976.
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las ac i idades me alona o cinasa y os ome alona o cinasa in aclo o
plas ídicas.
ABSTRACT
The syn hesis "in i o" o linalool and 4- e pineol om me alonic
a.cid (MVA-2-14C) by Pinus pinas e seeding¡, has been demons a ed.
Cell- ee ex ac s om P. pinas e seedling and Chlo ella usca as
well as cell- ee ex ac s and ace one powd,e p epa a íons om Aga e
ame icana phospho yla c MV A o phosphome alonic acid (MVP A) and
py ophosphome alonic acid (MV APP).
So ne p ope ies o me alona ,e ldnase om P. pinas e and A. ame
icana ha e been s udíed : in iuence o so ne e ec o s o -SR g oups,
nucleo ide eque imen s, op imum pR, e ec o so ne di alen ' ca ions,
Km. alues, e c.
The amoun o MVAP o med depends on p o ein concen a ion and
incuba ion ime. Du ing sho incuba ions, he MV AP o med inc eases
as p o ,ein concen a ion ose, whe eas du ing p olonged incuba ions 0-6 h)
he e is a dec ease in he MV AP o med when a ce ain amoun o p o ein
is exceeded. A concomi an inc ease o he emaining MV A is also obse 
ed, sugges ing ha MVAP o med is hyd olyzed hy a phospha ase p esen
in he ex ac s. This in e ,e ing ac i i y is elimina ed when me alona e
kinase is pa ially pu i ied.
The me alona e kinase om P. pinas e and A. ame icana has been
pa ially pu i ied by ammonium sulpha e p ,ecipi a ion, Sephadex G-IOO
il a ion and DEAE-Sephadex A-50 and DEAE-cellulose ac iona ion. Two
ac ions wi h me alona e kinase a.
c
.
i i y om P. pinas e seedlings and
A. ame icana lea es ha ,e been isola ed by Sephadex G-IOO. This ound
seems o sugges he p esence o wo isoenzymes, bo h being ac i e a he
same pR alue (7.9). By using an aqueous me hod, he occu ence o in
achlo oplas idic me alona e kinase and phosphome alona e kinase is
epo ed.
RESUMÉ
On a mon é la o ma ion "in i o" de linalool e 4- e pineol á pa i
de l'acide mé alonique (MV A-2-14C) pa les 'plan e� de Pinus pinas e .
On a s udié "in i o" l'inco po a ion de MVA-2-14C á me alonyl-phos
pha e (MV AP) e me alonyl-py ophos a e (MVAPP) pa l'ex ac lib e de
cellules de Pinus pinas e , Aga e ame icana e Chlo ella u,sca, s ablissan
quelques-unes des p opié es physiques, chimiques e ciné iques de la mé
alona e-kinase de P. pinas e e A. ame icana: in iuence des g oupes
-SR, nucleo ides, pR, ion s me alliques, Km, e c.
La quan i é de MVAP o mé depende de la concen a ion de p o eines
e de la du ée de l'incuba ion. Les esul a s sugge ,en la possibili é que le
MVAP es hyd olysé pa une phospha ase p esen e dans les ex ac s. Ce e
ARS PHARMACEUTICA 231
ac i i é hyd oly ique es eliminée pa echau emen d,e meme que pendan
la pu i ica ion enzyma ique.
La me alona e-kínase a e é pu i iée pa p ecipi a ion a ec sul a e
d'ammonium e ac ionnemen su Sephadex G-100, DEAE-Sephadez A-50
e DEAE-cellulose. Pa il a ion su colonne de Sephadex G-100 on a
demon é la sepa a Lon de deux alc ions a ec l'ac i i é mé alona e
kinase chez P. pinas e e chez A. ame icana. Ces ac ions son ac i es
a pH 7.9. A l'issue d'une se ie de sepa a ions employan S'ol an s aqueux
on a mon é les ac i i és me alona e-kinase e phosphome alona e kinase
ln acholoplas iques.
INTRODUCCION
El ácido me alónico ocupa un pues o cen al en el me abolismo
de los compues os isop enoides. Todos ellos se sin e izan siguiendo
un cauce común a pa i del MV A y me ced a la ac uación de las
enzimas me alona o dnasa (E.C. 2.7.1.36), os ome alona o cinasa
(E.C. 2.7.4.2) y pi o os ome alona o desca boxilasa (E.C. 4.1.1.33).
La p ime a hipó esis sob e la biosín esis de los isop enoides
se debe a Ruzicka (1), quien en 1953 supuso ya un papel unda
men al pa a la unidad básica de 5 á omos de ca bono. Po o a pa 
e, Bloch y Ri embe g (2) ue ,on los p ime os en demos a que
el' esquele o ca bonado de un compues o isop enoide, el coles e ol,
de i a del ace a o. Es os dos hechos conduje on al descub imien o
po Folke y col. (3, 4), del ácido me aló!lico como compues o cla e
de es e p oceso. Las expe iencias ealizadas con hígado de a a de
mos a on que el 43 po cien o del MV A-2-14C acémico pod ía con
e i se en coles e ol, mien as que la adiac i idad del MVA-1-14C
se pe día en o ma de 14C02 (5, 6). Finalmen e la unidad básica
pen aca bonada ue iden i icada como el isopen enil pi o os a o
(Ip.-PP), o mado a a és de los de i ados os o ilados de MV A:
os ome alónico y pi o os ome alónico.
Los es udios sob e la inco po ación del MV A en plan as cons
i uyen uno de los emas más amplios en Bioquímica Vege al. Del
mismo modo que los abajos de Popjak y col. son undamen ales
en la biosín esis de isop enoides en ejidos animales, las del g upo
de Goodwin lo son en ege ales. Así Goodwin y col. han es udiado
la inco po ación de 14C02, ace a o-2-14C y MV A-2-14C en el 3-ca o
eno de plán ulas de maíz e ioladas (7), en la cadena la e al i ólica
de la clo o ila (8, 9) y en el escualeno y p incipales i os e oles de
las hojas de maíz y guisan e (10). Recien emen e, Po y y col. (11-14)
232 ARS PHARMACEUTICA
han es udiado el me abolismo del MV A en elación con la biosín
esis de mono e penos en na anja. El mismo ema ha sido es udiado
en pé alo.s de osa po F ancis y col. (15).
La p ime a de las eacciones de inco po ación del MV A es ca
alizada po la me alona o cinasa, enzima que ue pues a de ma
ni ies o po p ime a ez en au olisados de l,e adu a (16) y en hí
gado de a a (17) y de conejo (18) y pos e io men e demos ada en
plan as supe io es (19, 20) Y mic oo ganismos (21). En el lá ex de
He ea b asiliensis Wílliamson y Kekwick (22) pusie .on de mani
ies o la o mación de MV AP a pa i de MV A po la me alona o
cinas3, lle ando a cabo su pu i ic,ación y -el es udio de la Km pa a
el MV A y l.os nucleó idos, así como el e ec o de iones me álicos.
La o mación de de i ados os o ilados del MV A ue pues a de
mani ies o en píno po Valenzuela y col. (23), si bien la me alona o
cinasa no pudo se ex aida en ,es e o igen en los p ime os abajos
de es e g upo. En es udios pos e io es, Valenzuela y col. (24) pu
die on demos a la p esencia de me alona o cinasa en ex ac os
lib es de células de Pinus adia a., median e la iden i icación del
MV AP o mado a pa i del MV A-2-KC.
En cuan o a la egulación de la biosín esis de isop enoides en
ege ales, se ha es udiado undamen almen e a ni el de su compa 
imen ación celula . El p oceso iene una pa e común has a el é 
mino C-15 ( a nesil pi o os a o) que puede o ma se an ó den o co
mo ue a de los clo oplas os y p�ede con e i se en ge anil-ge anil
pi o os a o en ambas localizaciones. Sin ,emba go ex aclo oplas ídi
camen e ambién puede con e i �,e en escualeno, pues o que la en
zima que ca aliza e.s a eacción solo se encuen a en es e compa i
men o. Roge s y col. (25, 26) han e idenciado la alidez de la hipó
esis de la compa imen ación con una se ie de abajos de ipo en
zimá ico. De a.cue do con es a hipó esis, la me alona o cinasa debe
encon a se den o y ue a de los clo oplas os, mien as que la mem
b ana de es os o gánulos debe se esencialmen e impe meable en am
bas di ecciones al MV A. En e ec o, es os au o es (27) han demos
ado la p esencia de la me alona o cinasa den o y ue a de los
clo oplas os, poni.endo de mani ies o el eque imien o de un pH
óp imo di e en e pa a cada una de las dos isoenzimas. Es a posibi
lidad ue suge ida po Loomis (19), quien mencionó que el pH óp
imo de la me alona o cinasa del ci oplasma de plán ulas de cala
baza 'e a 5.5 en con as e con la enzima de clo .oplas os cuyo pH
óp imo e a de 7.5. Roge s y ,col. (28) han demos ado la p esencia
ARS PHARMACEUTICA 233
de dos isoenzimas de la me alona o cinasa en hojas e des y e io
ladas de Phaseolus ulga is con un pH óp imo simila al encon a
do en calabaza. Todos es os hechos e idencian la hipó esis de la
compa imen ación de la biosín esis de isop enoides en plan as (29).
En nues o Depa amen o s,e ha ,es udiado du an e los úl imos
años la inco po ación y me abolismo del MVA ,en plán ulas de
P. pinas e y de A. ame icana. Se han elegido es as dos especies
ege ales po su dis in o con enido en isop enoides. En el p ime
caso, los mono e penos cons i uyen la mayo pa e de sus acei es
esenciales, po 10 que la di e si icación me abólica se es ablece a
ni el del é mino C-10 o ge aníl pi o os a o. En el caso del Aga, e
sus p incipales isop enoides pe enecen al g upo de los i e penos,
lo que signi ica un mayo cauce biosin é ico común que se p olonga
has a el é mino C-30 o escualeno.
En P. pinas e se ha demos ado "in i o" la sín esis de los
alcoholes e pénícos linalool y 4- e pineol a pa i de MVA-2-14C (30).
Se han es udiado ambién las eacciones de os o ilación del MV A
"in i o" po ex ac os de P. pinas e y de A. ame i.cana poniendo
de mani ies o las 'condiciones óp imas del p oceso y los eque i
mien os que p esen a espec o a pH, concen ación de p o eínas,
iempo de incubación, e ec o es, e c. (31-37). En ambos o ígenes se
ha log ado su pu i icación pa cial (38, 39), así como la sepa ación
de dos acciones con ac i idad me alona o' cinasa, ambas ac i as a
pH 7.9 (40.). Asimismo, median e écnicas de aislamien o en medio
acuoso (41) se han pues o de mani ies o las ac i idades me alona o
cinasa y os ome alona o cinasa in aclo oplas ídicas (42).
Po úl imo, ecien emen e se ha comenzado el es udio de la os
o ilación del MV A en algas unicelula es, conc e amen e en Chlo e
Ila usca, o igen en el que se conoce muy poco sob 'e el me abolismo
del MV A y especialmen e sob e las p ime as eacciones que lo in
co po an a es e oles y ca o enoídes, p incipales cons i uyen es de
ipo isop enoide (43). Los p ime os esul ados han pe mi ido es a
blece las pa icula idades de las enzimas de os o ilación del MV A
en cuan o a pH y iempo óp imos' de ac uación, 'e ec o es me áli
cos, e ,c.. (44).
MATERIAL y METonos
Como ma e ial biológico se han u ilizado plán ulas de P. pinas
e de 25-60 días, ob enidas a pa i de semillas p e iamen e es a-

234 ARS PHARMACEUTICA
i icadas a 5° du an e 6 semanas (45), plan as de A. ame icana c e
cidas sub espon áneamen e y células de C. usc.a Shihi a e K aus
:¿ll.l5 de la colección de P ingsheim, Go ingen, c ecidas au o o_
icamen e con ni a o po ásico como uen e de ni ógeno (43). Pa a
los ensayos de aislamien o de clo oplas os se han u ilizado ambién
hojas de Spinacia ole acea de o igen come cial (41).
La me odología de allada ha sido desc i a an e io men e (30�43).
En las expe iencias "in i o" la esencia se aisló en un apa a o Neo
Cle enge modi icado (45) y los alcoholes ue on iden i icados me
dian e adio c oma og a ía gaseosa (30).
Las eacciones enzimá icas se han lle ado a cabo incubando los
ex ac os a 37° du an e iempo a iable y en p esencia de MV
A-2-14C
y o o.s e ec o es (31, 37). Los p oduc os de las eacciones (MV AP y
MV APP) se han iden i icado po adioc oma og a ía en papel.
La pu i icación enzimá ica se ha lle ado a cabo po p ecipi a
ción ,con sul a o amónico y sul a o de p o amina, c oma og a ía en
columna de Sephadex G-I00 y accionamien o a a és de DEAE
Sephadex A-50 y DEAE-celulosa. Como c i e io de pu eza se ha
empleado la elec o o esis en gel de políac ilamida (37).
RESULTADOS y DISCUSION
l.-Expe iencias "in i o"
La esencia ob enida a pa i de plán ulas de P. pinas e que se
habían incubado oceadas con MV A-2-14C du an e 24 h p esen aban
una cla a adiac i idad en el sis ema de de ,ección di ec a RGC-170.
Cuando una mues a de la misma esencia ue some ida a adioc o
ma og a ía gaseosa se puso de mani ies o la exis encia de dos alco
holes e pénicos cuyo iempo de e ención coincidía con los del li
nalool y 4- e pineol, alcoholes cuya signincaCÍ'ón biológica no es á
bien es abl,ecida (30). En e ec o, en el mecanismo biosin é ico gene
al que conduce a los mono e penos, cons i uyen es' de los acei es
esenciales del géne o Pinus, se ha demos ado (46, 47) que el ne il
pi o os a o ocupa un pues o cla e, a pa i del cual se an a o igina
los dis in os e penos cíclicos. Za a in (48) ha p opues, o una se ie
de in e media ios en es e p oceso biosin é ico según una hipó esis
que no ha podido se demos ada enzimá icamen e has a el momen
o. Sin emba go, las a iaciones es acionales obse adas po noso os
en la composición e pénica de Pinus halepensis y Pinus syl es is
ARS PHARMACEUTICA' 235
(49) pa ec-en con i ma la. A la misma demos a-ción se pa ece habe
llegado en o as especies ege ales (50-52).
2.-E'x pe iencias "in i o"
Fos o ilación del MVA po di e en es p epa aciones enzi,má icas.
Los p ime os es udios lle ados a cabo con p. pinas e pusie on de
mani ies o las condiciones óp imas pa a la ob ención de ex ac os
con ac i idad enzimá ica a pa i de plán ulas c ecidas du an e 25-100
días. Tan o los ex ac os lib es de -células como los ob enidos po
edisolucÍón de pol os ace ónicos de plán ulas de pino mues an su
capacidad pa a os o ila el MV A según una se ie de eacciones en
que apa ecen como p oduc os MVAP, MVAPP e Ip-PP.
Los ex ac os lib es de células de hoja de A. ame icana os o
ilan el MV A a MV AP y MV APP sin que en la adio c oma og a ía
se de ec e ningún o o me aboli o pos e io . Resul ados simila es se
ob ienen a pa i de ex ac os p epa ados po edísolución de pol os
ace ónkos. Las p epa aciones enzimá icas ob enidas a pa i de la
co eza de hoja de Aga e p esen an el máximo de ac i idad. El pa
énquima es p ác icamen e inac i o.
Po úl imo, an o las suspensiones celula es como los ex ac os
lib es de células de C. usca p esen an ac i idad os o ilan e del
MVA.
In luencia de algunos e ec o es de g upos -SH. La suplemen
ación de glu a ion o de cis eina lO-2M a ,ex ac os lib es de células
de plán ulas de P. pina.s e p oduce un da o inc emen o en la can
idad de de i ados os o ilados del MV A. Resul ados semejan es se
ob ienen en ex ac os de A. ame icana. No obs an e, la suplemen a
ción de es os u o os p o ec o es de g upos -SR como el ,B-me cap
oe anol al ampón u ilizado pa a la p epa ación de los ex ac os
aumen a consíde ablemen e la o mación de MV AP y MV APP, p o
bablemen e g acias a la acción p o ec o a de dichos e ec o es sob e
los g upos -SR de las enzimas implicadas en las eacdones en
es udio.
Po o a pa e, se ha in es igado el e ec o de di e sos agen es
que bloquean los g upos -SR, suplemen ándolos a los ex ac os
lib es de células de P. pinas e (Tabla 1). Tan o la iodoace amida
como el p-hid oxime cu íbenzoa o y la e ilmaleimida a concen a
ción lO-2M inhiben p ác icamen e la os o ilación del MV A. A una
concen ación lO-3M el e ec o a ía según el agen e bloquean e,
TABLA l.-E ec o de algunos inhibido es de g upos -SH sob e la c mación de MVAP y MVAPP po ex ac os
de P. pinas e
MVAP (dpm)
MVAPP (dpm)
Ab e ia u as: l.A.
leimida.
280
400
E ec o es adicionados
G-SH 1.6 x 10-3 G-SH 1.6 x 10-3 G-SH 1.6 x 10-3
LA. l.A. p-HMB p-HMB E.M. E.M.
10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2
100 50
650
650 100
200
250
500
1150
300
400
450
500
50
150
iodoace amida; G-SH glu a ion; p-HMB pa ahid oxime cu ibenzna o; E.M. e ilma-
E. Ga cia-pe eg ín Y F. Mayo . Re . Esp. Fisiol. 26, 209-216 (1970).
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ARS PHARMACEUTICA 237
siendo más ac i os la iodoa·ce amida y el p-hid oxime cu ibenzoa o.
La adición conjun a de glu a ion 1.66 X lO-3M e ie e la inhibi
ción p 'Üducida po los bloquean es a lO-3M pe o no iene ningún
e ec o ·en e a es os agen es suplemen ados a concen ación lO-2M.
Es os esul ados coinciden con los eseñados en la bibliog a ía,
ya que, con la excepción de los ex ac os de le adu a (16) y de l'Üs
He ea (22) que no p ecisan la supl.emen ación de agen e educ o
alguno pa a la sín esis de isop enoides a pa i de MVA an o en
condiciones ae óbicas como anae óbicas, od'Üs los abajos que se
han ocupado de es e ema .empleando los más di e sos o ígenes en
zimá icos coinciden con el e ec 'Ü a o ecedo de los agen es educ
o es y, en la mayo ía de los casos, se señala su p ·esencia como im
p escindible.
E ec o del pH. La o mación de MVAP po ex ac os de pol os
ace ónicos de plán ulas de P. pinas e ha sido es udiada en un ma 
gen de pH 4-8 usando dis in os ampones. A pH Ín e io a 7.0 no
ha sido posible en ningún caso la os o ilación del MV A. Sin emba 
bo, a pH supe io apa e'ce y se inc emen a ápidamen e la ac i idad
me alona o cinasa, log ándose un máximo a pH 7.9 en ampón T is
HCl. Resul ados semejan es se han ob enido con la enzima de A.
ame icana. En ex ac os lib es de células de C. usca la o mación
de MV AP y de MV APP pa ece 'Ocu i mejo a alo es supe io es
de pH (8.2-8.4).
La me alona o cinasa de hígado de ce do (53) y de conejo (20),
de la as de Sa cophaga bulla a (54) y de la ex de He ea (22) ie
ne simila es alo es de pH óp imo, mien as que la de le adu a (16)
y de na anja. (11) iene alo .es más ácidos. Asimismo, Valenzuela
y col. (24) encon a on la máxima ac i idad os o ilan e del MV A
po ex ac os de Pinus adia a a pH 6.0 en ampón T is-sucdna o.
En Phaseolus, Roge s y col. (27, 28) encon a on dos iso enzimas de
la me alona o cinasa, una localizada en los clo oplas os y o a ue a
de ellos, con pH óp imo de 7.5 y 5.5, espec i amen e, y con an e
io idad, Loomis y Ba aille (19) habían encon ado ac i idad me
alona o cinasa a pH óp imo 5.5 en co iledones e iolados de plán u
las de calabaza.
Reque imien os nucleo ídicos de la me CLlona o cinasa. La .enzi
ma de P. pinas e solo puede u iliza ATP com'Ü nucleó ido os o i
lan e, siendo inac i os el GTP, U' P e ITP a concen aciones 1-5 X
lO-3M. La suplemen ación de ADP en es os úl imos casos no log a
244 ARS PHARMACEUTICA
A. ame icana, an o con los ex ac os de pol os ace ónicos como con
la enzima pa cialmen e pu i icada: 5 X 10-5M pa a el MV A y
1.4 X 10-4M pa a el ATP.
Pu i icación pa cial de la me a:lona o cinasa. Los , esul ados
ob enidos sob e la pu i icación de la me alona o cinasa se esumen
en la abla V pa a la enzima de P. pinas e yen la abla VI pa a
TABLA V.-Pu i icación de la me alona 'O cinasa de P. pinas e
Ac i idad
P o eínas Ac i idad especí ica
Cmg/ml) (dpm x 10-3) (dpmx 10-3/ Pu i icación
mg)
Ex ac o de pol os
ace ónicos 7.1 48 7 1.0
Sob enadan e sul a o
de p o amína 6.8 69 10 1.5
P ecipi ado sul a o
amónico (30-45 %) 6.2 154 25 3.6
Sephadex G-100
O.' acción) 1.8 229 127 18.8
Sephadex G-100
(2.' acción) 1.6 211 132 19.5
D. Suá ez, E. Ga cía-Pe eg ín y F .• Mayo . Phy ochemis y,
13,
1059-1063,
(971).
TABLA VI.-Pu i icación de la me alona o cinasa de A. ame icana
Ex ac o de pOl os
ace ónicos
P ecipi ada sul a o
amónico (30-45%)
Sephadex G-100
(1." acción)
DEAE-Sephadex A-50
Sephadex G-100
(2.' acción)
P o eínas
(mg/ml)
13.70
10.00
0.30
0.15
0.15
Ac i idad
Ac i idad especí ica
(dpm x 10-3) (dpm x 10-3/
mg)
216 15.8
316 31.6
109 363.3
788 520.0
87 580.0
Pu i icación
1
2
23
33
37
D. Suá ez y E. Ga cía-Pe eg ín. Phy ochemis y (1976) (en p ensa).

ARS PHARMACEUTICA 245
la enzima de A. ame icana. La p ecipi a,ción con sul a o de p o a
mina, empleada con buenos esul ados pa a la -enzima de hígado de
ce do (53), sólo p oduce una pu i icación de 1.5 eces en el caso de
la enzima de pino. Po ello se ha sup imido es e paso p e io en la
ma' cha gene ,al seguida pa a la pu i icación de la enzima de hoja
de A. ame icana.
La p ecipi ación con sul a o amOnICO sí ha conducido a esul
ados sa is a'c o ios. Como en la mayo pa e de los o ígenes es u
diados, la me alona o cÍnasa queda e enida en muy ele ado an o
po cien o en la acción p ,ecipi ada con sul a o amónico en e el
30-45 po cien o de sa u ación. Una pequeña ac i idad es a as ada
po el p ecipi ado ob enido en e el 0-30 po cien o de sa u ación,
quedando sólo lige os indícios en el sob ,enadan e de la p ecipi a-
. ción al 45 po cien o de sa u ación. El g ado de pu i ica,ción espec o
al -ex ac o de pol os ace ónicos log ado en la acción 30-45% di ie e
en la enzima de Pinus y Aga e, si bien en el p ime caso suele se
siemp e más ele ada, en con as e con los esul ados de Valenzuela
y col. (24) que demos a on la posibílidad de concen ación de la
enzima po p ecipi ación con sul a o amónko al 55 po cien o de
sa u ación pe o sin inc emen o alguno en la ac i idad especí ica de
la misma.
El accionamien o po columna de Sephadex G-200 es muy em
pleado pa a la pu i icación de la me alona o cÍnasa de dis in os
o ígenes, an o animales como ege ales. Sin emba go, los ensayos
ealizados con la enzima de P. pi,nas e no han dado los esul ados
deseados especialmen e en cuan o a la sepa ación de las p o eínas
de los ex ac os, mien as que el accionamien o po Sephadex
G-IOO sí p odujo una buena sepa ación p o eica, con un lige o des
plazamien o de los máximos de con enido p o eico y ac i idad en
zimá ica. El g ado de pu i icación log ado po es e p ocedimien o
e a supe io al mencionado pa a la enzima de o os .o ígenes (22, 54).
Tan o las expe iencias lle adas a cabo con p epa aciones de
p. pinas e como las de A. ame icana pusie on de mani ies o la se
pa ación de dos acciones con ac i idad me alona o cinasa (Fig. 4)
Con la pa icula idad de que el g ado de pu i icación de la segunda
acción de Ag'a e e a muy supe io al de la mÍsma acción de
Pinus. Ambas ac i idades di ie en ambién en su es abilidad, siendo
sumamen e ines able la segunda incluso conse ada a 40 y en p e
sencia de ,B-me cap oe anol O.Q.IM.
246
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ARS PHARMACEUTICA
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Fig. 4.-Sepa ación de dos acciones con ac i idad me alona o cinasa po
Sephadex G-100 a pa i de ex ac os de A. ame icana. (e--e)
densidad óp ica a 280 nm; (*---*) ac i idad me alona o cinasa.
E. Ga cia-Pe eg in, D. Suá ez y F. Mayo . FEBS Le . 30, 15-17,
(1973).
Como eíamos an es, Roge s y col. (28) es udiando la compa 
imen ación de la biosín esÍs de e penoides en ege ales, demos
a on la exis encia de dos isoenzimas de la me alona o cinasa en
plán ulas de Phaseolus ulga is, una de ellas localizada en el in e
io de los clo oplas os y la o a ue a. El pH de la enzima in a
clo oplas ídica ue de 7.5, mien as que la ex aclo oplas ídica al
canzaba un máxÍmo en su ac i idad a pH 5.5 siendo inac i a a pH
igual o supe io a 7.0. Sin emba go, en nues o caso las dos ac
ciones sepa adas po Sephadex G-IOO, an o en Pinus como en
Aga e, son ac i as a pH 7.9 al cual pH se alcanza ambién el má
ximo de o mación de MVAP po los ex ac os ob enidos po diso
lución de los pol os ace ónicos en ambos o ígenes. Todo -ello pa ece
demos a que se a a de dos isoenzimas que equÍe en simila es
ARS PHARMACEUTICA 247
alo es de pH pa a su ac uación y cuya localización in acelula
puede se semejan e a la encon ada en judía y calabaza. En es e
sen ido y en un p ime paso pa a es udia la posible iden i icadón
de la enzima in aclo oplas ídica con alguna de las dos acciones
ac i as sepa adas po Sephadex G-IOO, hemos demos ado la p e
sencia de la me alona o cinasa y de la os ome alona o cinasa, ac
i as sólo a pH supe io es a 7.0, en clo oplas os aislados de Spinacia
ole acea, P. pinas e y A. ame icana (Tabla VII).
TABLA VII.Fos o ilación del MVA po di e en es p epa aciones enzimá cas
de hoja de A. ame icana
Ex ac o c udo
Sob enadan e 1.0 la ado
Sob ·enadan e 2.° la ado
Clo oplas os o os hipo ónicamen e
Clo oplas os o os hipo ónica men e y al USo
Ac i idad especi ica
(dpm x 10-3/mg)
MVAP MVAPP
7.9
7.8
5.7
42.0
54.0
0.4
0.4
0.3
6.0
6.4
E. Ga cia-Pe eg in, A. Coloma y F. Mayo . Plan Sci. Le . 1, 367-373, (973).
El accionamien o po DEAE-Sephadex y DEAE-celulosa son
dos p ocedimien os muy u ilizados en la pu i i·cación enzimá ica.
Cuando noso os hemos aplicado la p ime a acción ac i a sepa
ada po Sephadex G-lQ.O a una columna de DEAE-celulosa, la elu
ció
n con un g adien e de KCl nos ha pe mi ido ob ene una ac
ción con ac i idad me alona o cinasa a una concen ación de KCl
ap oximadamen e 0.2M pe o con una ac i idad especí ica in e io
a la de la mues a inyec ada. En cambio, la aplicación de la misma
acción ac i a ob enida po Sephadex G-IOO a una columna de
DEAE-Sephadex A-50 nos ha p opo cionado una mayo pu i icación
de la enzima de Aga e. Resul ados simila ·es ue on ob enidos po
Williamson y col. (54) con la enzima de He ea que no podía habe
sido pu i icada po DEAE-celulosa. En A. ame icana la mayo pa 
e de la ac i idad ue eluida ,con KCl 0.2M, pe o las eacciones en
zimá icas ealizadas con es a Rcción pusie on de mani ies o am
bién la o mación de una pequeña can idad de MV APP, lo cual
indica la exis encia de la os ome alona o cinasa jun o a la me a-
248 ARS PHARMACEUTICA
lona o cinasa pa cialmen e pu i icada. Median e 'elec o o esis en
gel de poliac ilamida se han sepa ado dos bandas ,en la acción
eluida con KCl O.2M del DEAE-Sephadex A-50, lo ,cual co obo a
la exis encia de al menos o a p o eína jun o a la me alona o ci
nasa. En el caso de la enzima de P. pinas e , el accionamien o po
DEAE-Sephadex A-50 no conduce a un mayo g ado de pu i ica
ción, ya que la acción eluida con ac i idad me alona o cinasa
p esen a una ac i Ídad especí ica es eces in e io a la de la mues
a aplicada a la columna.
La pu i icación pa cial y la ca ac e ización de la me alona o
cinasa cons i uye un paso signi ica i o en el conocimien o de una
de las p ime as enzimas del p oceso de biosín esÍs de los isop enoi
des en los o ígenes es udiados. La demos ación de que la mayo
pa e de la enzima apa ece en la acción clo oplas ídica y el ais
lamien o po Sephadex G-100 de dos acdones ac i as con di e
en e es abilidad pa ece suge i la p esencia de dos Ísoenzimas, am
bas ac i as al mismo pR. Sin emba go, Rill y Roge s (57) han in
en ado ecien emen e sepa a dis in as especies molecula es de la
me alona o cinasa de co iledones de Phaseolus ulga is median e
elec oen oque, ob enÍendo a ios picos po es e p ocedimien o.
Po odo ello, pa ece con enien e con inua las in es igaciones
en es e campo, pa a la de e minación de o os pa áme os molecu
la es y de la ,compa imen ación de es as isoenzimas con obje o de
dilucida el papel de la me aloha o cinasa en la egulación de la
biosín esis de los compues os Ísop enoides en ege ales.
AGRADECIMIENTOS
Mi since o ag adecimien o al P o . F. Mayo po su cons an e o ien
ación y guía en la ealización del p ,esen e abajo.
Es a in es igación se ha lle ado a cabo con ayuda de una Beca de
Fo mación del Pe sonal In es igado del Minis e io de Educación y
Ciencia.
BIBLIOGRAFIA
l.-RuzICKA, L. : Expe ien ia 9, 357-367 (1953)
2.-BLOCH, K. and RITTEMBERG, D.: J. Biol. Chem. 155, 243-249 (1944).
3.-FoLKERS, K., SHUNK, C. H., LINN, B. O., ROBINSON, F. M., WITTREICH,
P. E., HUFF, H. W., GILFILLAN, J. L. and SKEGGS, H. R. : "Ciba Foun
da ion Symposium on he Biosyn hesis o Te penes and S e ols". Ed.
G. E. W. Wols enholme and O'Conno . Chu chill L d., London (1959),
p. 20.
ARS PHARMACEUTICA 249
4.-SKEGGS, H. R., WRIGHT, L. E., CRESSON, E. L., McRAE, G. D. E., HOFF-
MAN, C. H., WOLF; D. E. and FOLKERS, K.: J. Bac e iol. 72, 519-526 (1956).
5.-GOULD, R. G. and POPJAK, G. : Biochem. J. 66, 51P (1957).
6.-TAVORMINA, P. A. and GIBBS, M. H. : J. Ame . Chem. Soc., 78, 6210 (1956).
7.-GOODWIN, T. W. : Biochem. J. 70, 612-617 (1958).
8.-MERCER, E. I. and GOODWIN, T. W. : Biochem. J. 85, 13P (1962).
9.-MERCER, E. 1. and GOODWIN, T. W.: Biochem. J. 85, 46P (1963).
10.-GoAD, L. J. and GOODWIN, T. W.: Biochem. J. 99, 735-746 (1966).
ll.-POTTY, V. H. and BRUEMMER, J. H.: Phy ochemis y, 9, 99-105 (1970).
12.-POTTY, V. H. and BRUEMMER, J. H.: Phy ochemis y, 9, 1001-1007 (1970).
13.-POTTY, V. H. and BRUEMMER, J. H. : Phy ochemis y, 9, 1229-1237 (1970).
14.-POTTY, V. H. and BRUEMMER, J. H.: Phy ochemis y, 9, 2319-2321 (1970).
15.-FRANCIS, M. J. O., BANTHORPE, D. V. and LePATouREL, G. N. J. : Na u e,
228, 1005-1006 (1970).
16.-TcHEN, T. T.: J. Biol. Chem. 233, 1100-1103 (1958).
17.-LEVY, H. R. and POPJAK, G., Biochem. J. 72, 35P (1956).
18.-MARKELY, K. and SMALLMAN, E. : Biochim. Biophys. Ac a, 47, 327-335
(1961).
19.-LoOMIS, W. D. and BATTAILLE, J. : Biochim. Biophys. Ac a, 67, 54-63 (1963).
20.-WILLIAMSON, l. P. and KERWICK, R. G. O. : Biochem. J. 88, 18P (1963).
21.-COOPER, C. Z. and BENEDICT, C. R.: Plan Physiol. 42, 515-519 (1967).
22.-WILLIAMSON, I. P. and KERWICK, R. G. O. :Biochem. J. 96, 862-871 (1965).
23.-VALENZUELA, P., BEYTIA, E., CORI, O. and YUDELEVICH, A.: A ch. Biochem.
Biophys. 113, 536-639 (1966).
24.-VALENZUELA, P., CORI, O. and YUELEVICH, A.: Phy ochemis y, 5, 1005-
1011 (1966).
25.-RoGERS, L. J., SHAH, S. P. J. and GOODWIN, T. W. : Biochem. J. 96, 7P-8P
(1966).
26.-RoGERS, L. J., SHAH, S. P. J. and GOODWIN, T. W. : Biochem J. 99, 381-
388 (1966).
27.-RoGERS, L. J., SHAH, S. P. J. and GOODWIN, T. W.: Biochem. J. 100, 14C-
17C (1966)
.
.28.-RoGERS, L. J., SHAH, S. P. J. and GOODWIN, T. W.: Pho osyn he ica, 2,
184-207 (1968).
29.-RoGERS, L. J., SHAH, S. P. J. and GOODWIN, T. W. : "Biochemis y o
Chlo opla s". Ed. T. W. Goodwin, Academic P ess, London, (1967),
p. 283.
30.-MACHADO, A., GARCIA-PEREGRIN, E. and MAYOR, F.: Plan Sci. Le . 2,
83-87 (1974).
31.-GARCIA-PEREGRIN, E. : Tesis Doc o al. Fa,cul ad de Fa macia, Uni e -
sidad de G anada, 1968.
32.-GARCIA-PEREGRIN, E.: A s Pha m., 11, 15-33 (1970).
33.-GARCIA-PEREGRIN, E. and MAYOR, F. : Re . Esp. Fi.siol. 26, 209-216 (1970).
34.-GARCIA-PEREGRIN, E. and MAYOR, F.: Re . Esp. Fisiol. 27, 15-22 (1971).
35.-ARAGON, M. C.: Tesina de Licencia u a. Facul ad de Fa macia, Uni-
e sidad de G anada, 1971.
36.-GARCIA-PEREGRIN, E., SUAREZ, M. D., ARAGON, M. C. and MAYOR, F.:
Phy ochemis y, 11, 2495-2498 (1972).

250 ARS PHARMACEUTICA
37.-SUAREZ, M. D. : Tesis Doc o al. Facul ad de Fa macia, Uni e sidad de
G anada, 1973.
38.-SUAREZ, M. D., GARCIA-PEREGRIN, E. and MAYOR, F. : Phy ochemis y, 13,
1059-1063 (1974).
39.-SUAREZ, M. D. and GARCIA-PEREGRIN, E.: Phy ochemis y (en p ensa).
{O.-GARCIA-PEREGRIN, E., SUAREZ, M. D. and MAYOR, F. : FEBS Le . 30, 15-
17 (1973).
4.1.-COLOMA, A.: Tesina de Licencia u a. Fa,cul ad de Fa macia, Uni e 
sidad de G anada, 19�.
4!2.-GARCIA-PEREGRIN, E., COLOMA, A. and MAYOR, F.: Plan Sci. Le . l,
367-373 (1973),
43.-LINARES, A.: Tesina de Licencia u. a. Facul ad de Ciencias, Uni e 
sidad de G anada, 1974.
44.-LINARES, A., GARCIA, J., SUAREZ, M. D. and GARCIA-PEREGRIN, E. : VI Con
g eso SEB, Se illa, abs . 51, 1975.
�5.-MoNTEOLIVA, M., FUNES, A., GARCIA-PEREGRIN, E., ZAFRA, M. F. Y HE
NARES, M. : A s Pha m. 10, 285-347 (1969).
46.-CORI, O. : A ch. Biochem. Biophys. 135, 416-418 (1969).
47.-BANTHORPE, D. V. and Le PATOUREL, G. N. J.: Biochem. J. 103, 1055-
1061 (1972).
48.-ZAVARIN, E.: Phy ochemis y, 9, 1049-1063 (1970).
4.9.-ZAFRA, M. F. and GARCIA-PEREGRIN, E. : J. Ag . Sci. 86, 1-6 (1976).
50.-ZAVARIN, E., COBB, F. W., BERGOT, J. and BARBER, H. W. : Phy ochemis-
y, 10, 3107-3114 (1971).
51.-ADAMS, R. P. : Phy ochemis y, 9, 397-402 (1970).
52.-POWELL, R. A. and ADAMS, R. P.: Ame . J. Bo ., 60, 1041-1050 (1973).
53.-LEVY, H. R. and POPJAK, G. : Biochem. J. 75, 417-428 (1960).
54.-GOODFELLOW, R. D. and BARNES, F. J. : Insec Biochem. 1, 271-282
(1971).
55.-BEYTIA, E., DORSEY, J. K., MARR, J., CLELAND, W. W. and PORTER, J. W. :
J. Biol. Chem. 245, 5450-5458 (1970)
56.-THoMAs, D. R. and STOBART, A. K.: Phy ochemis y, 9, 1443-1451 (1970).
57.-HILL, H. M. and ROGERS, L. J. : Phy ochemis y, 13, 763-777 (1974).