Metabolismo del ácido mevalónico en vegetales

ARS PHARMACEUTICA 229 DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA METABOLISMO DEL ACIDO MEV ALONICO EN VEGETALES EDUARDO GARCIA PEREGRIN RESUMEN En expe iencias lle adas a cabo con plán ulas de Pinus pinas e se ha demos ado la sin esis "in i o" de linalool y 4- e pineol a pa i de ácido me alónico (MVA-2-14C). Po o a pa e se ha es udiado "in i o" la inco po ación de MVA- 2-14C a os ome alónico (MV AP� y pi o os ome alónico (MVAPP) po ex ac os lib es de células de P. pinas e y Chlo ella usca, así como po ex ac os lib es de células y ex ac os de pol os ace ónicos d,e di e en es ó ganos de Aga e ame icana. Se han es ablecido algunas de las p opiedades ísicas, químicas y ciné icas de la me alona o cinasa de P. pinas e y de A. ame icana: in luencia de e ec o es de g upos -SH, eque imien os nucleo ídicos, pH óp imo de ac uación, e ec o de algunos iones me álicos di alen es, alo es de Km, e c. La can idad de MVAP o mado en las eacciones depende de la con c·en ación de p o einas en el medio y del iempo de incubación. Du an e co os pe íodos de incubación, el MVAP o mado aumen a con la con cen ación p o eica, mien as que en incubaciones p olongadas 1-6 h hay una disminución del MV AP cuando se sob e!)asa una de e minada con cen ación de p o eínas, obse ándose en es e caso un aumen o pa alelo del MV A, lo cual sugie e que el MV AP o mado es hid olizado po una os a asa p esen e en los ex ac os. Es a a,c i idad hid olí ica es elimi nada po calen amien o, así como du an 'e el p oceso de pu i icación en zimá ica. La me alona o cinasa se ha pu i icado pa cialmen e po p ecipi a ción con sul a o amónico, c oma og a ia en columna de Sephadex G-100 y a·ccionamien o a a és de DEAE-Sephadex A-50 y DEAE-celulosa. Po c oma og a ía en columna de Sephadex G-100 se sepa an pe ec a men e dos acciones con ac i idad me alon�, o cinasa, an o a pa i de ex ac os de P. pinas e como de A. ame icana. Ello pa ece demos a la exis encia en las especies ege ales en es udio de dos isoenzimas cuya a·c i ldad es mani ies a al mismo alo de pH (7.9). Po úl imo, median e écnicas de aislamien o en medio a,cuoso, se han pues o de mani ies o A s Pha macéu ica. Tomo XVII. Núm. 2-3. 1976. 230 ARS PHARMACEUTICA las ac i idades me alona o cinasa y os ome alona o cinasa in aclo o plas ídicas. ABSTRACT The syn hesis "in i o" o linalool and 4- e pineol om me alonic a.cid (MVA-2-14C) by Pinus pinas e seeding¡, has been demons a ed. Cell- ee ex ac s om P. pinas e seedling and Chlo ella usca as well as cell- ee ex ac s and ace one powd,e p epa a íons om Aga e ame icana phospho yla c MV A o phosphome alonic acid (MVP A) and py ophosphome alonic acid (MV APP). So ne p ope ies o me alona ,e ldnase om P. pinas e and A. ame icana ha e been s udíed : in iuence o so ne e ec o s o -SR g oups, nucleo ide eque imen s, op imum pR, e ec o so ne di alen ' ca ions, Km. alues, e c. The amoun o MVAP o med depends on p o ein concen a ion and incuba ion ime. Du ing sho incuba ions, he MV AP o med inc eases as p o ,ein concen a ion ose, whe eas du ing p olonged incuba ions 0-6 h) he e is a dec ease in he MV AP o med when a ce ain amoun o p o ein is exceeded. A concomi an inc ease o he emaining MV A is also obse  ed, sugges ing ha MVAP o med is hyd olyzed hy a phospha ase p esen in he ex ac s. This in e ,e ing ac i i y is elimina ed when me alona e kinase is pa ially pu i ied. The me alona e kinase om P. pinas e and A. ame icana has been pa ially pu i ied by ammonium sulpha e p ,ecipi a ion, Sephadex G-IOO il a ion and DEAE-Sephadex A-50 and DEAE-cellulose ac iona ion. Two ac ions wi h me alona e kinase a. c . i i y om P. pinas e seedlings and A. ame icana lea es ha ,e been isola ed by Sephadex G-IOO. This ound seems o sugges he p esence o wo isoenzymes, bo h being ac i e a he same pR alue (7.9). By using an aqueous me hod, he occu ence o in achlo oplas idic me alona e kinase and phosphome alona e kinase is epo ed. RESUMÉ On a mon é la o ma ion "in i o" de linalool e 4- e pineol á pa i de l'acide mé alonique (MV A-2-14C) pa les 'plan e� de Pinus pinas e . On a s udié "in i o" l'inco po a ion de MVA-2-14C á me alonyl-phos pha e (MV AP) e me alonyl-py ophos a e (MVAPP) pa l'ex ac lib e de cellules de Pinus pinas e , Aga e ame icana e Chlo ella u,sca, s ablissan quelques-unes des p opié es physiques, chimiques e ciné iques de la mé alona e-kinase de P. pinas e e A. ame icana: in iuence des g oupes -SR, nucleo ides, pR, ion s me alliques, Km, e c. La quan i é de MVAP o mé depende de la concen a ion de p o eines e de la du ée de l'incuba ion. Les esul a s sugge ,en la possibili é que le MVAP es hyd olysé pa une phospha ase p esen e dans les ex ac s. Ce e ARS PHARMACEUTICA 231 ac i i é hyd oly ique es eliminée pa echau emen d,e meme que pendan la pu i ica ion enzyma ique. La me alona e-kínase a e é pu i iée pa p ecipi a ion a ec sul a e d'ammonium e ac ionnemen su Sephadex G-100, DEAE-Sephadez A-50 e DEAE-cellulose. Pa il a ion su colonne de Sephadex G-100 on a demon é la sepa a Lon de deux alc ions a ec l'ac i i é mé alona e kinase chez P. pinas e e chez A. ame icana. Ces ac ions son ac i es a pH 7.9. A l'issue d'une se ie de sepa a ions employan S'ol an s aqueux on a mon é les ac i i és me alona e-kinase e phosphome alona e kinase ln acholoplas iques. INTRODUCCION El ácido me alónico ocupa un pues o cen al en el me abolismo de los compues os isop enoides. Todos ellos se sin e izan siguiendo un cauce común a pa i del MV A y me ced a la ac uación de las enzimas me alona o dnasa (E.C. 2.7.1.36), os ome alona o cinasa (E.C. 2.7.4.2) y pi o os ome alona o desca boxilasa (E.C. 4.1.1.33). La p ime a hipó esis sob e la biosín esis de los isop enoides se debe a Ruzicka (1), quien en 1953 supuso ya un papel unda men al pa a la unidad básica de 5 á omos de ca bono. Po o a pa  e, Bloch y Ri embe g (2) ue ,on los p ime os en demos a que el' esquele o ca bonado de un compues o isop enoide, el coles e ol, de i a del ace a o. Es os dos hechos conduje on al descub imien o po Folke y col. (3, 4), del ácido me aló!lico como compues o cla e de es e p oceso. Las expe iencias ealizadas con hígado de a a de mos a on que el 43 po cien o del MV A-2-14C acémico pod ía con e i se en coles e ol, mien as que la adiac i idad del MVA-1-14C se pe día en o ma de 14C02 (5, 6). Finalmen e la unidad básica pen aca bonada ue iden i icada como el isopen enil pi o os a o (Ip.-PP), o mado a a és de los de i ados os o ilados de MV A: os ome alónico y pi o os ome alónico. Los es udios sob e la inco po ación del MV A en plan as cons i uyen uno de los emas más amplios en Bioquímica Vege al. Del mismo modo que los abajos de Popjak y col. son undamen ales en la biosín esis de isop enoides en ejidos animales, las del g upo de Goodwin lo son en ege ales. Así Goodwin y col. han es udiado la inco po ación de 14C02, ace a o-2-14C y MV A-2-14C en el 3-ca o eno de plán ulas de maíz e ioladas (7), en la cadena la e al i ólica de la clo o ila (8, 9) y en el escualeno y p incipales i os e oles de las hojas de maíz y guisan e (10). Recien emen e, Po y y col. (11-14) 232 ARS PHARMACEUTICA han es udiado el me abolismo del MV A en elación con la biosín esis de mono e penos en na anja. El mismo ema ha sido es udiado en pé alo.s de osa po F ancis y col. (15). La p ime a de las eacciones de inco po ación del MV A es ca alizada po la me alona o cinasa, enzima que ue pues a de ma ni ies o po p ime a ez en au olisados de l,e adu a (16) y en hí gado de a a (17) y de conejo (18) y pos e io men e demos ada en plan as supe io es (19, 20) Y mic oo ganismos (21). En el lá ex de He ea b asiliensis Wílliamson y Kekwick (22) pusie .on de mani ies o la o mación de MV AP a pa i de MV A po la me alona o cinas3, lle ando a cabo su pu i ic,ación y -el es udio de la Km pa a el MV A y l.os nucleó idos, así como el e ec o de iones me álicos. La o mación de de i ados os o ilados del MV A ue pues a de mani ies o en píno po Valenzuela y col. (23), si bien la me alona o cinasa no pudo se ex aida en ,es e o igen en los p ime os abajos de es e g upo. En es udios pos e io es, Valenzuela y col. (24) pu die on demos a la p esencia de me alona o cinasa en ex ac os lib es de células de Pinus adia a., median e la iden i icación del MV AP o mado a pa i del MV A-2-KC. En cuan o a la egulación de la biosín esis de isop enoides en ege ales, se ha es udiado undamen almen e a ni el de su compa  imen ación celula . El p oceso iene una pa e común has a el é  mino C-15 ( a nesil pi o os a o) que puede o ma se an ó den o co mo ue a de los clo oplas os y p�ede con e i se en ge anil-ge anil pi o os a o en ambas localizaciones. Sin ,emba go ex aclo oplas ídi camen e ambién puede con e i �,e en escualeno, pues o que la en zima que ca aliza e.s a eacción solo se encuen a en es e compa i men o. Roge s y col. (25, 26) han e idenciado la alidez de la hipó esis de la compa imen ación con una se ie de abajos de ipo en zimá ico. De a.cue do con es a hipó esis, la me alona o cinasa debe encon a se den o y ue a de los clo oplas os, mien as que la mem b ana de es os o gánulos debe se esencialmen e impe meable en am bas di ecciones al MV A. En e ec o, es os au o es (27) han demos ado la p esencia de la me alona o cinasa den o y ue a de los clo oplas os, poni.endo de mani ies o el eque imien o de un pH óp imo di e en e pa a cada una de las dos isoenzimas. Es a posibi lidad ue suge ida po Loomis (19), quien mencionó que el pH óp imo de la me alona o cinasa del ci oplasma de plán ulas de cala baza 'e a 5.5 en con as e con la enzima de clo .oplas os cuyo pH óp imo e a de 7.5. Roge s y ,col. (28) han demos ado la p esencia ARS PHARMACEUTICA 233 de dos isoenzimas de la me alona o cinasa en hojas e des y e io ladas de Phaseolus ulga is con un pH óp imo simila al encon a do en calabaza. Todos es os hechos e idencian la hipó esis de la compa imen ación de la biosín esis de isop enoides en plan as (29). En nues o Depa amen o s,e ha ,es udiado du an e los úl imos años la inco po ación y me abolismo del MVA ,en plán ulas de P. pinas e y de A. ame icana. Se han elegido es as dos especies ege ales po su dis in o con enido en isop enoides. En el p ime caso, los mono e penos cons i uyen la mayo pa e de sus acei es esenciales, po 10 que la di e si icación me abólica se es ablece a ni el del é mino C-10 o ge aníl pi o os a o. En el caso del Aga, e sus p incipales isop enoides pe enecen al g upo de los i e penos, lo que signi ica un mayo cauce biosin é ico común que se p olonga has a el é mino C-30 o escualeno. En P. pinas e se ha demos ado "in i o" la sín esis de los alcoholes e pénícos linalool y 4- e pineol a pa i de MVA-2-14C (30). Se han es udiado ambién las eacciones de os o ilación del MV A "in i o" po ex ac os de P. pinas e y de A. ame i.cana poniendo de mani ies o las 'condiciones óp imas del p oceso y los eque i mien os que p esen a espec o a pH, concen ación de p o eínas, iempo de incubación, e ec o es, e c. (31-37). En ambos o ígenes se ha log ado su pu i icación pa cial (38, 39), así como la sepa ación de dos acciones con ac i idad me alona o' cinasa, ambas ac i as a pH 7.9 (40.). Asimismo, median e écnicas de aislamien o en medio acuoso (41) se han pues o de mani ies o las ac i idades me alona o cinasa y os ome alona o cinasa in aclo oplas ídicas (42). Po úl imo, ecien emen e se ha comenzado el es udio de la os o ilación del MV A en algas unicelula es, conc e amen e en Chlo e Ila usca, o igen en el que se conoce muy poco sob 'e el me abolismo del MV A y especialmen e sob e las p ime as eacciones que lo in co po an a es e oles y ca o enoídes, p incipales cons i uyen es de ipo isop enoide (43). Los p ime os esul ados han pe mi ido es a blece las pa icula idades de las enzimas de os o ilación del MV A en cuan o a pH y iempo óp imos' de ac uación, 'e ec o es me áli cos, e ,c.. (44). MATERIAL y METonos Como ma e ial biológico se han u ilizado plán ulas de P. pinas e de 25-60 días, ob enidas a pa i de semillas p e iamen e es a- 234 ARS PHARMACEUTICA i icadas a 5° du an e 6 semanas (45), plan as de A. ame icana c e cidas sub espon áneamen e y células de C. usc.a Shihi a e K aus :¿ll.l5 de la colección de P ingsheim, Go ingen, c ecidas au o o_ icamen e con ni a o po ásico como uen e de ni ógeno (43). Pa a los ensayos de aislamien o de clo oplas os se han u ilizado ambién hojas de Spinacia ole acea de o igen come cial (41). La me odología de allada ha sido desc i a an e io men e (30�43). En las expe iencias "in i o" la esencia se aisló en un apa a o Neo Cle enge modi icado (45) y los alcoholes ue on iden i icados me dian e adio c oma og a ía gaseosa (30). Las eacciones enzimá icas se han lle ado a cabo incubando los ex ac os a 37° du an e iempo a iable y en p esencia de MV A-2-14C y o o.s e ec o es (31, 37). Los p oduc os de las eacciones (MV AP y MV APP) se han iden i icado po adioc oma og a ía en papel. La pu i icación enzimá ica se ha lle ado a cabo po p ecipi a ción ,con sul a o amónico y sul a o de p o amina, c oma og a ía en columna de Sephadex G-I00 y accionamien o a a és de DEAE Sephadex A-50 y DEAE-celulosa. Como c i e io de pu eza se ha empleado la elec o o esis en gel de políac ilamida (37). RESULTADOS y DISCUSION l.-Expe iencias "in i o" La esencia ob enida a pa i de plán ulas de P. pinas e que se habían incubado oceadas con MV A-2-14C du an e 24 h p esen aban una cla a adiac i idad en el sis ema de de ,ección di ec a RGC-170. Cuando una mues a de la misma esencia ue some ida a adioc o ma og a ía gaseosa se puso de mani ies o la exis encia de dos alco holes e pénicos cuyo iempo de e ención coincidía con los del li nalool y 4- e pineol, alcoholes cuya signincaCÍ'ón biológica no es á bien es abl,ecida (30). En e ec o, en el mecanismo biosin é ico gene al que conduce a los mono e penos, cons i uyen es' de los acei es esenciales del géne o Pinus, se ha demos ado (46, 47) que el ne il pi o os a o ocupa un pues o cla e, a pa i del cual se an a o igina los dis in os e penos cíclicos. Za a in (48) ha p opues, o una se ie de in e media ios en es e p oceso biosin é ico según una hipó esis que no ha podido se demos ada enzimá icamen e has a el momen o. Sin emba go, las a iaciones es acionales obse adas po noso os en la composición e pénica de Pinus halepensis y Pinus syl es is ARS PHARMACEUTICA' 235 (49) pa ec-en con i ma la. A la misma demos a-ción se pa ece habe llegado en o as especies ege ales (50-52). 2.-E'x pe iencias "in i o" Fos o ilación del MVA po di e en es p epa aciones enzi,má icas. Los p ime os es udios lle ados a cabo con p. pinas e pusie on de mani ies o las condiciones óp imas pa a la ob ención de ex ac os con ac i idad enzimá ica a pa i de plán ulas c ecidas du an e 25-100 días. Tan o los ex ac os lib es de -células como los ob enidos po edisolucÍón de pol os ace ónicos de plán ulas de pino mues an su capacidad pa a os o ila el MV A según una se ie de eacciones en que apa ecen como p oduc os MVAP, MVAPP e Ip-PP. Los ex ac os lib es de células de hoja de A. ame icana os o ilan el MV A a MV AP y MV APP sin que en la adio c oma og a ía se de ec e ningún o o me aboli o pos e io . Resul ados simila es se ob ienen a pa i de ex ac os p epa ados po edísolución de pol os ace ónkos. Las p epa aciones enzimá icas ob enidas a pa i de la co eza de hoja de Aga e p esen an el máximo de ac i idad. El pa énquima es p ác icamen e inac i o. Po úl imo, an o las suspensiones celula es como los ex ac os lib es de células de C. usca p esen an ac i idad os o ilan e del MVA. In luencia de algunos e ec o es de g upos -SH. La suplemen ación de glu a ion o de cis eina lO-2M a ,ex ac os lib es de células de plán ulas de P. pina.s e p oduce un da o inc emen o en la can idad de de i ados os o ilados del MV A. Resul ados semejan es se ob ienen en ex ac os de A. ame icana. No obs an e, la suplemen a ción de es os u o os p o ec o es de g upos -SR como el ,B-me cap oe anol al ampón u ilizado pa a la p epa ación de los ex ac os aumen a consíde ablemen e la o mación de MV AP y MV APP, p o bablemen e g acias a la acción p o ec o a de dichos e ec o es sob e los g upos -SR de las enzimas implicadas en las eacdones en es udio. Po o a pa e, se ha in es igado el e ec o de di e sos agen es que bloquean los g upos -SR, suplemen ándolos a los ex ac os lib es de células de P. pinas e (Tabla 1). Tan o la iodoace amida como el p-hid oxime cu íbenzoa o y la e ilmaleimida a concen a ción lO-2M inhiben p ác icamen e la os o ilación del MV A. A una concen ación lO-3M el e ec o a ía según el agen e bloquean e, TABLA l.-E ec o de algunos inhibido es de g upos -SH sob e la c mación de MVAP y MVAPP po ex ac os de P. pinas e MVAP (dpm) MVAPP (dpm) Ab e ia u as: l.A. leimida. 280 400 E ec o es adicionados G-SH 1.6 x 10-3 G-SH 1.6 x 10-3 G-SH 1.6 x 10-3 LA. l.A. p-HMB p-HMB E.M. E.M. 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 100 50 650 650 100 200 250 500 1150 300 400 450 500 50 150 iodoace amida; G-SH glu a ion; p-HMB pa ahid oxime cu ibenzna o; E.M. e ilma- E. Ga cia-pe eg ín Y F. Mayo . Re . Esp. Fisiol. 26, 209-216 (1970). 1>.:) c.> O) ;.. :>l n ." g: � ¡;:: ;.. o l':I � � ;.. ARS PHARMACEUTICA 237 siendo más ac i os la iodoa·ce amida y el p-hid oxime cu ibenzoa o. La adición conjun a de glu a ion 1.66 X lO-3M e ie e la inhibi ción p 'Üducida po los bloquean es a lO-3M pe o no iene ningún e ec o ·en e a es os agen es suplemen ados a concen ación lO-2M. Es os esul ados coinciden con los eseñados en la bibliog a ía, ya que, con la excepción de los ex ac os de le adu a (16) y de l'Üs He ea (22) que no p ecisan la supl.emen ación de agen e educ o alguno pa a la sín esis de isop enoides a pa i de MVA an o en condiciones ae óbicas como anae óbicas, od'Üs los abajos que se han ocupado de es e ema .empleando los más di e sos o ígenes en zimá icos coinciden con el e ec 'Ü a o ecedo de los agen es educ o es y, en la mayo ía de los casos, se señala su p ·esencia como im p escindible. E ec o del pH. La o mación de MVAP po ex ac os de pol os ace ónicos de plán ulas de P. pinas e ha sido es udiada en un ma  gen de pH 4-8 usando dis in os ampones. A pH Ín e io a 7.0 no ha sido posible en ningún caso la os o ilación del MV A. Sin emba  bo, a pH supe io apa e'ce y se inc emen a ápidamen e la ac i idad me alona o cinasa, log ándose un máximo a pH 7.9 en ampón T is HCl. Resul ados semejan es se han ob enido con la enzima de A. ame icana. En ex ac os lib es de células de C. usca la o mación de MV AP y de MV APP pa ece 'Ocu i mejo a alo es supe io es de pH (8.2-8.4). La me alona o cinasa de hígado de ce do (53) y de conejo (20), de la as de Sa cophaga bulla a (54) y de la ex de He ea (22) ie ne simila es alo es de pH óp imo, mien as que la de le adu a (16) y de na anja. (11) iene alo .es más ácidos. Asimismo, Valenzuela y col. (24) encon a on la máxima ac i idad os o ilan e del MV A po ex ac os de Pinus adia a a pH 6.0 en ampón T is-sucdna o. En Phaseolus, Roge s y col. (27, 28) encon a on dos iso enzimas de la me alona o cinasa, una localizada en los clo oplas os y o a ue a de ellos, con pH óp imo de 7.5 y 5.5, espec i amen e, y con an e io idad, Loomis y Ba aille (19) habían encon ado ac i idad me alona o cinasa a pH óp imo 5.5 en co iledones e iolados de plán u las de calabaza. Reque imien os nucleo ídicos de la me CLlona o cinasa. La .enzi ma de P. pinas e solo puede u iliza ATP com'Ü nucleó ido os o i lan e, siendo inac i os el GTP, U' P e ITP a concen aciones 1-5 X lO-3M. La suplemen ación de ADP en es os úl imos casos no log a 244 ARS PHARMACEUTICA A. ame icana, an o con los ex ac os de pol os ace ónicos como con la enzima pa cialmen e pu i icada: 5 X 10-5M pa a el MV A y 1.4 X 10-4M pa a el ATP. Pu i icación pa cial de la me a:lona o cinasa. Los , esul ados ob enidos sob e la pu i icación de la me alona o cinasa se esumen en la abla V pa a la enzima de P. pinas e yen la abla VI pa a TABLA V.-Pu i icación de la me alona 'O cinasa de P. pinas e Ac i idad P o eínas Ac i idad especí ica Cmg/ml) (dpm x 10-3) (dpmx 10-3/ Pu i icación mg) Ex ac o de pol os ace ónicos 7.1 48 7 1.0 Sob enadan e sul a o de p o amína 6.8 69 10 1.5 P ecipi ado sul a o amónico (30-45 %) 6.2 154 25 3.6 Sephadex G-100 O.' acción) 1.8 229 127 18.8 Sephadex G-100 (2.' acción) 1.6 211 132 19.5 D. Suá ez, E. Ga cía-Pe eg ín y F .• Mayo . Phy ochemis y, 13, 1059-1063, (971). TABLA VI.-Pu i icación de la me alona o cinasa de A. ame icana Ex ac o de pOl os ace ónicos P ecipi ada sul a o amónico (30-45%) Sephadex G-100 (1." acción) DEAE-Sephadex A-50 Sephadex G-100 (2.' acción) P o eínas (mg/ml) 13.70 10.00 0.30 0.15 0.15 Ac i idad Ac i idad especí ica (dpm x 10-3) (dpm x 10-3/ mg) 216 15.8 316 31.6 109 363.3 788 520.0 87 580.0 Pu i icación 1 2 23 33 37 D. Suá ez y E. Ga cía-Pe eg ín. Phy ochemis y (1976) (en p ensa). ARS PHARMACEUTICA 245 la enzima de A. ame icana. La p ecipi a,ción con sul a o de p o a mina, empleada con buenos esul ados pa a la -enzima de hígado de ce do (53), sólo p oduce una pu i icación de 1.5 eces en el caso de la enzima de pino. Po ello se ha sup imido es e paso p e io en la ma' cha gene ,al seguida pa a la pu i icación de la enzima de hoja de A. ame icana. La p ecipi ación con sul a o amOnICO sí ha conducido a esul ados sa is a'c o ios. Como en la mayo pa e de los o ígenes es u diados, la me alona o cÍnasa queda e enida en muy ele ado an o po cien o en la acción p ,ecipi ada con sul a o amónico en e el 30-45 po cien o de sa u ación. Una pequeña ac i idad es a as ada po el p ecipi ado ob enido en e el 0-30 po cien o de sa u ación, quedando sólo lige os indícios en el sob ,enadan e de la p ecipi a- . ción al 45 po cien o de sa u ación. El g ado de pu i ica,ción espec o al -ex ac o de pol os ace ónicos log ado en la acción 30-45% di ie e en la enzima de Pinus y Aga e, si bien en el p ime caso suele se siemp e más ele ada, en con as e con los esul ados de Valenzuela y col. (24) que demos a on la posibílidad de concen ación de la enzima po p ecipi ación con sul a o amónko al 55 po cien o de sa u ación pe o sin inc emen o alguno en la ac i idad especí ica de la misma. El accionamien o po columna de Sephadex G-200 es muy em pleado pa a la pu i icación de la me alona o cÍnasa de dis in os o ígenes, an o animales como ege ales. Sin emba go, los ensayos ealizados con la enzima de P. pi,nas e no han dado los esul ados deseados especialmen e en cuan o a la sepa ación de las p o eínas de los ex ac os, mien as que el accionamien o po Sephadex G-IOO sí p odujo una buena sepa ación p o eica, con un lige o des plazamien o de los máximos de con enido p o eico y ac i idad en zimá ica. El g ado de pu i icación log ado po es e p ocedimien o e a supe io al mencionado pa a la enzima de o os .o ígenes (22, 54). Tan o las expe iencias lle adas a cabo con p epa aciones de p. pinas e como las de A. ame icana pusie on de mani ies o la se pa ación de dos acciones con ac i idad me alona o cinasa (Fig. 4) Con la pa icula idad de que el g ado de pu i icación de la segunda acción de Ag'a e e a muy supe io al de la mÍsma acción de Pinus. Ambas ac i idades di ie en ambién en su es abilidad, siendo sumamen e ines able la segunda incluso conse ada a 40 y en p e sencia de ,B-me cap oe anol O.Q.IM. 246 E e o o N o o ci 10 5 ARS PHARMACEUTICA ,-e, ! • I .. *, * I I I I I J. ! , , . , : . � 1 .' ".' I I � � .-.• ¡-.,.-........ 1, . , O.5G LÍ' 25 .: I ,: " I I .. l' • •• * ! � aL--»o .. . � ' . "/ � '" 10 20 30 40 50 FRACCION 60 x E el. U Fig. 4.-Sepa ación de dos acciones con ac i idad me alona o cinasa po Sephadex G-100 a pa i de ex ac os de A. ame icana. (e--e) densidad óp ica a 280 nm; (*---*) ac i idad me alona o cinasa. E. Ga cia-Pe eg in, D. Suá ez y F. Mayo . FEBS Le . 30, 15-17, (1973). Como eíamos an es, Roge s y col. (28) es udiando la compa  imen ación de la biosín esÍs de e penoides en ege ales, demos a on la exis encia de dos isoenzimas de la me alona o cinasa en plán ulas de Phaseolus ulga is, una de ellas localizada en el in e io de los clo oplas os y la o a ue a. El pH de la enzima in a clo oplas ídica ue de 7.5, mien as que la ex aclo oplas ídica al canzaba un máxÍmo en su ac i idad a pH 5.5 siendo inac i a a pH igual o supe io a 7.0. Sin emba go, en nues o caso las dos ac ciones sepa adas po Sephadex G-IOO, an o en Pinus como en Aga e, son ac i as a pH 7.9 al cual pH se alcanza ambién el má ximo de o mación de MVAP po los ex ac os ob enidos po diso lución de los pol os ace ónicos en ambos o ígenes. Todo -ello pa ece demos a que se a a de dos isoenzimas que equÍe en simila es ARS PHARMACEUTICA 247 alo es de pH pa a su ac uación y cuya localización in acelula puede se semejan e a la encon ada en judía y calabaza. En es e sen ido y en un p ime paso pa a es udia la posible iden i icadón de la enzima in aclo oplas ídica con alguna de las dos acciones ac i as sepa adas po Sephadex G-IOO, hemos demos ado la p e sencia de la me alona o cinasa y de la os ome alona o cinasa, ac i as sólo a pH supe io es a 7.0, en clo oplas os aislados de Spinacia ole acea, P. pinas e y A. ame icana (Tabla VII). TABLA VII.Fos o ilación del MVA po di e en es p epa aciones enzimá cas de hoja de A. ame icana Ex ac o c udo Sob enadan e 1.0 la ado Sob ·enadan e 2.° la ado Clo oplas os o os hipo ónicamen e Clo oplas os o os hipo ónica men e y al USo Ac i idad especi ica (dpm x 10-3/mg) MVAP MVAPP 7.9 7.8 5.7 42.0 54.0 0.4 0.4 0.3 6.0 6.4 E. Ga cia-Pe eg in, A. Coloma y F. Mayo . Plan Sci. Le . 1, 367-373, (973). El accionamien o po DEAE-Sephadex y DEAE-celulosa son dos p ocedimien os muy u ilizados en la pu i i·cación enzimá ica. Cuando noso os hemos aplicado la p ime a acción ac i a sepa ada po Sephadex G-lQ.O a una columna de DEAE-celulosa, la elu ció n con un g adien e de KCl nos ha pe mi ido ob ene una ac ción con ac i idad me alona o cinasa a una concen ación de KCl ap oximadamen e 0.2M pe o con una ac i idad especí ica in e io a la de la mues a inyec ada. En cambio, la aplicación de la misma acción ac i a ob enida po Sephadex G-IOO a una columna de DEAE-Sephadex A-50 nos ha p opo cionado una mayo pu i icación de la enzima de Aga e. Resul ados simila ·es ue on ob enidos po Williamson y col. (54) con la enzima de He ea que no podía habe sido pu i icada po DEAE-celulosa. En A. ame icana la mayo pa  e de la ac i idad ue eluida ,con KCl 0.2M, pe o las eacciones en zimá icas ealizadas con es a Rcción pusie on de mani ies o am bién la o mación de una pequeña can idad de MV APP, lo cual indica la exis encia de la os ome alona o cinasa jun o a la me a- 248 ARS PHARMACEUTICA lona o cinasa pa cialmen e pu i icada. Median e 'elec o o esis en gel de poliac ilamida se han sepa ado dos bandas ,en la acción eluida con KCl O.2M del DEAE-Sephadex A-50, lo ,cual co obo a la exis encia de al menos o a p o eína jun o a la me alona o ci nasa. En el caso de la enzima de P. pinas e , el accionamien o po DEAE-Sephadex A-50 no conduce a un mayo g ado de pu i ica ción, ya que la acción eluida con ac i idad me alona o cinasa p esen a una ac i Ídad especí ica es eces in e io a la de la mues a aplicada a la columna. La pu i icación pa cial y la ca ac e ización de la me alona o cinasa cons i uye un paso signi ica i o en el conocimien o de una de las p ime as enzimas del p oceso de biosín esÍs de los isop enoi des en los o ígenes es udiados. La demos ación de que la mayo pa e de la enzima apa ece en la acción clo oplas ídica y el ais lamien o po Sephadex G-100 de dos acdones ac i as con di e en e es abilidad pa ece suge i la p esencia de dos Ísoenzimas, am bas ac i as al mismo pR. Sin emba go, Rill y Roge s (57) han in en ado ecien emen e sepa a dis in as especies molecula es de la me alona o cinasa de co iledones de Phaseolus ulga is median e elec oen oque, ob enÍendo a ios picos po es e p ocedimien o. Po odo ello, pa ece con enien e con inua las in es igaciones en es e campo, pa a la de e minación de o os pa áme os molecu la es y de la ,compa imen ación de es as isoenzimas con obje o de dilucida el papel de la me aloha o cinasa en la egulación de la biosín esis de los compues os Ísop enoides en ege ales. AGRADECIMIENTOS Mi since o ag adecimien o al P o . F. Mayo po su cons an e o ien ación y guía en la ealización del p ,esen e abajo. Es a in es igación se ha lle ado a cabo con ayuda de una Beca de Fo mación del Pe sonal In es igado del Minis e io de Educación y Ciencia. BIBLIOGRAFIA l.-RuzICKA, L. : Expe ien ia 9, 357-367 (1953) 2.-BLOCH, K. and RITTEMBERG, D.: J. Biol. Chem. 155, 243-249 (1944). 3.-FoLKERS, K., SHUNK, C. H., LINN, B. O., ROBINSON, F. M., WITTREICH, P. E., HUFF, H. W., GILFILLAN, J. L. and SKEGGS, H. R. : "Ciba Foun da ion Symposium on he Biosyn hesis o Te penes and S e ols". Ed. G. E. W. Wols enholme and O'Conno . Chu chill L d., London (1959), p. 20. 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