Analyse on Condensin-Komplexen in
D osophila melanogas e
Cha ak e isie ung de Un e einhei CapG und
Iden i izie ung on In e ak ionen
Disse a ion
zu E langung des G ades eines
-Dok o s de Na u wissenscha en-
-D . e . na .-
de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en
de Uni e si ä Bay eu h
o geleg on
Sabine He zog
Bay eu h 2011
2
Die o liegende A bei wu de in de Zei on Juni 2007 bis Augus 2011 an de Uni e si ä
Bay eu h am Leh s uhl ü Gene ik, un e de Be euung on PD D . S e an Heidmann
ange e ig .
Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de
Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines
Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na .).
Disse a ion einge eich am: 17. 08. 2011
Zulassung du ch P ü ungskommission: 29. 09. 2011
Wissenscha liches Kolloquium: 09. 12. 2011
Am ie ende Dekan:
P o . D . Bea e Lohne
P ü ungsausschuss:
PD. D . S e an Heidmann (E s gu ach e )
P o . D . Benedik Wes e mann (Zwei gu ach e )
P o . D . Ola S emmann (Vo si z)
P o . D . Wul Blanken eld
PD. D . S e an Geime
Gliede ung
3
Gliede ung
Zusammen assung……………………………………………………………………………………………..……………………..7
Summa y…………………………………………………………………………………………….……………..…………………..….9
1. Einlei ung……………………………………………………………………………………………………….………………….…11
1.1. De Zellzyklus……………………………………………………………………………………….……………………….11
1.1.1. Die In e phase……………………………………………………………………………….………………………….12
1.1.2. Die Mi ose……………………………………………………………………………….……………………………..…12
1.2. Die Ch oma ins uk u ie ung im Ve lau des Zellzyklus…………………….…………………………13
1.2.1. Die Ch oma ins uk u wäh end de In e phase…………………….………………………..………13
1.2.2. DNA-Replika ion und E ablie ung de Kohäsion…………………….…………………………….…..14
1.2.3. Ch omosomenkondensa ion und Resolu ion de Ch oma iden…………………….…….……16
1.2.4. Mechanismen de Ch omosomenkondensa ion…………………….…………………………………16
1.2.5. Ch omosomenseg ega ion…………………………………………….……………………………..……….…18
1.3. De Condensin-Komplex…………………………………………….…………………………………….……….….19
1.3.1. Iden i ika ion des Condensin…………………………………………….………………………………………19
1.3.2. Au bau de Condensin-Komplexe …………………………………………….………………………………20
1.3.3. E olu ionä e Konse ie ung de Condensin-Komplexe………….……………………….…………21
1.3.4. Subzellulä e Lokalisa ion und Ch oma inassozia ion de Condensin-Komplexe………..21
1.3.5. Funk ionen des Condensin ü Ch omosomenkondensa ion und –seg ega ion……..…22
1.3.6. Die Condensin abhängige Ablösung des Kohäsin-Komplexes……………………………………23
1.3.7. Mechanismen de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung………….………...24
1.3.8. Die Regula ion de Condensin-Komplexe………….……………………………….………….…………26
1.3.9. Wei e e Funk ionen de Condensin-Komplexe………….…………………………………..….....…28
1.3.10. Besonde hei des Condensin-Komplexes in D osophila melanogas e …………..…...…..30
1.4. Zielse zung………………………………………….…………………………………………….……………….…..….…31
2. E gebnisse…………………………………………….…………………………………………….….……………………………33
2.1. S uk u - und Funk ionsanalyse on CapG………………………………………………………….………..33
2.1.1. CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in………………………….…….35
2.1.2. Die Ch oma inassozia ion on CapGNM-EGFP is nich am Zen ome ………………….……38
2.1.3. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG e mi eln biologische Funk ionali ä ….……41
2.1.4. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el en
Ve zöge ung de Mi ose…………………….…………………………………………….….……..……………44
Gliede ung
4
2.1.5. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG sind essen iell ü In e ak ion mi den
wei e en Condensin-Un e einhei en …………………….………………………………………………..45
2.1.6. CapG lieg in de Fliege in un e schiedlichen Iso o men o ……………………………….……47
2.1.7. CapG wi d wäh end des Zellzyklus phospho ylie ………………………………………..…………51
2.1.8. Lokalisa ion und Funk ionali ä on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen….…54
2.1.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen……….………59
2.2. Komposi ion de Condensin-Komplexe in D. melanogas e …………………………………………61
2.2.1. Gene ische In e ak ionss udien.………………………………………………………………………..……62
2.2.1.1. Disassemblie ung on poly änem Näh zellch oma in in O a ien…………….……………62
2.2.1.2. Disassemblie ung on poly änem Speicheld üsench oma in in La en………..………66
2.2.2. In i o Iden i ika ion de Condensin II- Komponen en in D. melanogas e …………….68
2.2.2.1. Condensin II-spezi ische Un e einhei en we den du ch CapG nich p äzipi ie .…69
2.2.2.2. Die P äzipi a ion Condensin II-spezi ische Un e einhei en is auch du ch
SMC4 nich e möglich ……………..…………………………………………………………………………73
2.2.2.3. Die P äzipi a ion de Condensin-Ke nun e einhei en is du ch CapH2
e möglich ……..……………..…………………………………………………………………………………....76
2.2.2.4. Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-
silencing Signalweges kann nich bes ä ig we den……………………………………..………81
2.2.3. In i o Assay zu Analyse de In e ak ionen einzelne
Condensin-Un e einhei en………………………………………………………………………………………82
2.2.3.1. In e ak ionen de Condensin I-Komponen en we den im
in i o Assay bes ä ig …………………………………………………………………………………………83
2.2.3.2. CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3………………………………………..……………84
2.2.3.3. Eine di ek e In e ak ion on CapH2 und CapD3 is im
in i o Assay nachweisba …………………………………………………………………………………..86
2.2.3.4. Bildung eines e nä en Komplexes is nu du ch Condensin I-spezi ische
Un e einhei en e möglich ………………………………………………………………………….………87
3. Diskussion…………………………………………………………………………………….………………………………………90
3.1. Die Domänens uk u on CapG in D. melanogas e …………………….…………………………………90
3.2. CapG lieg wäh end de In e phase am He e och oma in lokalisie o …………………..…….91
3.3. Regula ion on CapG du ch g aduelle Phospho ylie ung…………………………………………………94
3.4. Biologische Funk ionali ä de N- e minalen zwei-D i el on CapG……………………..…………95
3.5. Die ini iale Ch oma inassozia ion on CapG muss nich zwingend am
Zen ome s a inden……………………………………………………………………………………………………95
Gliede ung
5
3.6. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el e
Ve zöge ung de Mi ose…………………………………………………………………………………………………96
3.7. CapG lieg in de Fliege in e schiedenen Iso o men o , welche gleiche maßen du ch
Phospho ylie ung egulie we den ………………………………………………………………………….……97
3.8. Lokalisa ion und Funk ion on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen……………….……98
3.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen…………………….100
3.10. Gene ische In e ak ion on CapG mi CapH2 und CapD3 …………….…………….………………..101
3.11. Die Komposi ion lösliche Condensin-Komplexe …………….…………….…………….….……………103
3.12. Iden i ika ion on In e ak ionspa ne n de Condensin-Un e einhei en.………………………105
3.13. In i o Rekons i u ion de Condensin-Komplexe…………….…………….……………………..………106
4. Ma e ialien und Me hoden………………………………………………………………………………………………109
4.1. Ma e ial…………………………………………………………………………………………………………….…..……109
4.1.1. cDNA-Plasmide…………………………………………………………………………………………………….…109
4.1.2. Vek o en…………………………………………………………………………………………………………………109
4.1.3. Oligonukleo ide………………………………………………………………………………………………………109
4.1.4. Fliegens ämme………………………………………………………………………………………….……………110
4.1.5. An ikö pe ………………………………………………………………………………………………………………112
4.2. Umgang mi D osophila melanogas e ………………………………………………………….……………113
4.2.1. S anda dme hoden…………………………………………………………………………………….…………113
4.2.2. T ans o ma ion on D. melanogas e -Emb yonen du ch Mik oinjek ion und
Ka ie ung on T ansgeninse ionen……………………………………………………….……………113
4.2.3. Emb yonenkollek ion……………………………………………………………………………………………113
4.2.4. Immun luo eszenz ä bung on Emb yonen …………………………………………………….……113
4.2.5. Immun luo eszenz ä bung on Speicheld üsen, Fliegeno a ien und Tes is .…………114
4.3. Mik oskopie und Bildbea bei ung………………………………………………………………………………114
4.4. Molekula biologische Me hoden……….………………………………………….……………………………115
4.4.1. Polyme ase-Ke en eak ion (PCR)…………………………………………………………………………115
4.4.2. DNA-F agmen ie ung du ch Res ik ionsendonukleasen……………….………..……………115
4.4.3. Enzyma ische Dephospho ylie ung on DNA-F agmen en………………….…………………115
4.4.4. Enzyma ische Liga ion on DNA-F agmen en…………………………….….…………..…………115
4.4.5. T ans o ma ion on Plasmid-DNA in E. coli-Bak e ien……………..……….…………………..115
4.4.6. Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli-Bak e ien…………………………….……………………116
4.4.7. Aga osegelelek opho ese und Ex ak ion on DNA-F agmen en………..………….……116

Gliede ung
6
4.4.8. P äpa a ion genomische DNA aus Fliegenemb yonen………………………………...………116
4.4.9. P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben und Re e se T ansk i ion……………………116
4.4.10. Sequenzie ung und Sequenz e gleiche…………………………………..…………………….………116
4.5. P o einbiochemische Me hoden…………………………………………………………………………………117
4.5.1. He s ellung on A ini ä sma izes au Basis on P o ein A-Sepha ose……….…………117
4.5.1.1. Kopplung polyklonale An ikö pe …………………………………………………….………………117
4.5.1.2. Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden………………….…………117
4.5.2. He s ellung na i e P o einex ak e aus D. melanogas e -Geweben
und anschließende Immunp äzipi a ion……………………………………………………………….117
4.5.3. P o einp äpa a ion on D. melanogas e -Emb yonen
in e schiedenen Phasen de Mi ose 14…………………………………………………………………118
4.5.4. Demecolzinbehandlung on D. melanogas e -Emb yonen……………………..…….………119
4.5.5. Phospha asebehandlung on D. melanogas e -Emb yonen………………………....………119
4.5.6. He s ellung dena u ie ende Ex ak e aus D. melanogas e -Geweben…….…..………119
4.5.7. SDS-Polyac ylamidgelek opho ese (SDS-PAGE) ……………………………………..…..…….…119
4.5.8. Wes e nblo und immunologische Nachweis (Immunblo ) ………………….……..………120
4.5.9. De ek ion on P o einen im SDS-Gel du ch Au o adiog a ie…..…………….………………120
4.5.10. Silbe ä bung on SDS-Gelen…………………………………………………………………..……………120
4.5.11. Kolloidale Coomassie-Blau-Fä bung on SDS-Gelen………………………….…..……..………120
4.5.12. Massenspek ome ische Analyse………………………………………………………………………..121
4.6. In i o-In e ak ionsassay……………………………………………………………………………………………121
4.6.1. Übe p ü ung des P o einmodells on CapD3………….…………….……………………….…….…121
4.6.2. In i o T ansla ion (IVT) und Immunp äzipi aion ….………………….……………………………122
4.7. P og amme zu Vo he sage on P o eins uk u und Phospho ylie ungss ellen……….123
4.8. Pu e und Lösungen……………………………………………………………………………………………………123
5. Abkü zungs e zeichnis………………………………………………………………………………………………………126
6. Re e enzen…………………………………………………………………………………………………………..……….……128
7. Anhang…………………………………………………………………………………………………………………………….…137
8. Danksagung……………………………………………………………………………………………………………………….160
9. Lebenslau ………………………………………………………………………………………………………………….………161
Zusammen assung
7
Zusammen assung
Die akku a e Ve eilung de Ch omosomen wäh end de Mi ose is essen iell ü die gene ische
S abili ä de Zellen. De he e open ame e Condensin-Komplex is hie bei an de S uk u ie ung
de Ch omosomen und de en physikalische S abili ä wäh end de Seg ega ion maßgeblich
be eilig . In höhe en Euka yo en konn en zwei diese Komplexe (Condensin I und Condensin II)
iden i izie we den, die ih e sei s eine dis ink e subzellulä e Lokalisa ion wäh end de
In e phase und auch Beladung an das mi o ische Ch oma in au weisen. Die beiden Komplexe
haben die S uc u al main enance o ch omosomes (SMC) Un e einhei en SMC2 und SMC4
gemein, wäh end sie sich in den nich -SMC-Un e einhei en un e scheiden: In Condensin I inde
man die Komponen en Ch omosome associa ed p o ein D2 (CapD2), CapG und CapH und in
Condensin II die e wand en P o eine CapD3, CapG2 und CapH2. Wäh end in Ve eb a en die
Rolle beide Condensin-Komplexe wäh end de Mi ose kla e ablie is , zeichne sich in
D osophila melanogas e ein ande es Bild ab. Mu an en in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen
keine mi o ischen Phäno ypen und ein zu CapG2 homologes P o ein konn e bishe nich
iden i izie we den. Da CapG aus D osophila ein ähnliches Lokalisa ions e hal en wie die
Condensin II-Un e einhei en de Ve eb a en au weis , wi d CapG als Komponen e beide
Condensin-Komplexe disku ie .
Im Rahmen diese A bei wu den die Funk ion und die Regula ion on CapG in D osophila
melanogas e , p imä du ch die Analyse on EGFP- usionie en P o ein a ian en, nähe
un e such . Es konn e gezeig we den, dass de C-Te minus on CapG neben den
haup sächlichen Phospho ylie ungss ellen auch Ke nimpo sequenzen en häl , welche die
subzellulä e Lokalisa ion des P o eins wäh end des Zellzyklus egulie en. Wäh end de
In e phase zeig CapG im Zellke n eine Kolokalisa ion mi dem He e och oma in-bindenden
P o ein HP1, was au eine di ek e Ch oma inassozia ion on CapG hinweis und mögliche
Ch oma in-s uk u ie ende Funk ionen bes ä igen wü de. Diese He e och oma in-spezi ische
Lokalisa ion kann om C- e minalen D i el on Cap-G e mi el we den, de ande e sei s ü
die gene elle Ch oma inassozia ion wäh end de Mi ose, die In e ak ion mi den ande en
Condensin I-Un e einhei en und ü die Funk ionali ä on CapG wäh end de soma ischen
Mi osen en beh lich is . Da ein P o ein agmen en sp echend de N- e minalen Zwei-D i el on
CapG (CapGNM) wäh end de In e phase haup sächlich zy oplasma isch lokalisie is , kann die
p ä e en ielle Ke nlokalisa ion on CapG wäh end de In e phase, und auch die Phospho-
Zusammen assung
8
Regula ion des P o eins, ü die En wicklung om Beginn de emb yonalen zygo ischen
Exp ession bis hin zum adul en S adium nich essen iell sein. Die in diese A bei nachgewiesene
Lokalisa ion on CapG und ande en Condensin Un e einhei en in Geweben de weiblichen und
männlichen Keimbahn leg die Ve mu ung nahe, dass CapG, e en uell im Kon ex mi den
ande en Condensin-Un e einhei en, eine Rolle bei de Game ogenese zukomm . Konsis en
hie mi is die Beobach ung, dass Weibchen s e il sind, die in ih en Keimbahnzellen keine
unk ionelle CapG-Va ian e exp imie en. Die In eg i ä de O a ien in diesen Tie en sp ich ü
eine Funk ion on CapG bei de Rei ung des Oozy enke ns ode den meio ischen Teilungen.
Die P äsenz on CapG in löslichen Komplexen mi den bekann en Condensin I-Un e einhei en
konn e in diese A bei du ch Koimmunp äzipi a ionen mi nach olgende
massenspek oskopische Bes immung de assoziie en P o eine bes ä ig we den. Eine
Assozia ion mi Condensin II-spezi ischen Un e einhei en wu de dagegen nich ge unden. Ebenso
assemblie eine ek opisch exp imie e, unk ionelle Va ian e on CapH2 nich in einem löslichen
Komplex mi CapG. Auch die Analyse di ek e P o ein-P o ein-In e ak ionen in einem in i o-
Sys em e gab keine Hinweise au eine Assozia ion on CapG mi Condensin II-spezi ischen
Un e einhei en. Dagegen konn en in diesem Sys em die In e ak ionen nach ollzogen we den,
die ü Condensin I und Condensin II aus ande en Sys emen publizie und somi e wa e sind.
Expe imen e zu gene ischen In e ak ion de Condensin-Un e einhei en o enba en bei
Anwesenhei on CapG-Mu a ionen eine Supp ession des Phäno yps, de nach Übe exp ession
on CapH2 in Speicheld üsen e hal en wi d. In einem ezip oken Ansa z üh en CapG-
Mu a ionen zu eine Ve s ä kung des CapH2-mu an en Phäno yps in den Näh zellen on
O a ien. CapH2 und CapG scheinen also au gene ische Ebene mi einande zu in e agie en.
Zusammengenommen legen die E gebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwa nich in di ek e
Assozia ion mi Condensin II-spezi ischen Komponen en o lieg , abe pa allel an de
S uk u ie ung on Ch oma in be eilig is und unk ionell zum Teil mi den Au gaben de
Condensin II-spezi ischen Komponen en übe lapp .
Summa y
9
Summa y
The ai h ul seg ega ion o sis e ch oma ids du ing mi osis is essen ial o he inhe i ance o he
genome. He e, he he e open ame ic condensin complex is impo an o a obus s uc u e o
he ch omosomes and o hei accu a e seg ega ion du ing anaphase. Two ela ed complexes,
condensin I and condensin II, ha e been iden i ied in highe euka yo es. The wo complexes
exhibi dis inc localiza ion pa e ns du ing he cell cycle and a dis inc associa ion wi h mi o ic
ch oma in. Bo h complexes a e buil on a amewo k o he wo s uc u al main enance o
ch omosomes (SMC) subuni s SMC2 and SMC4, and a dis inc se o non-SMC-subuni s:
Condensin I con ains Ch omosome associa ed p o ein D2 (CapD2), CapG and CapH, condensin II
he ela ed p o eins CapD3, CapG2 and CapH2. Whe eas o bo h complexes clea unc ions
could be es ablished du ing mi osis in e eb a es, he si ua ion in D osophila melanogas e is
ambiguous. In D osophila, mi osis is undis u bed in he absence o CapH2 o CapD3, and so a
no homolog o CapG2 could be iden i ied. Howe e , he localiza ion pa e n o CapG is simila o
he e eb a e Condensin II speci ic subuni s. Hence i is specula ed, ha CapG can be pa o
bo h condensin complexes o D osophila melanogas e .
In his s udy, he unc ion and egula ion o CapG in D osophila melanogas e was sc u inized by
analyzing a se o EGFP- used p o ein a ian s. I was shown, ha he C- e minal pa o CapG
con ains he majo phospho yla ion si es and also nuclea impo sequences, he eby egula ing
he subcellula localiza ion o CapG du ing he cell cycle. Fu he mo e, du ing in e phase,
colocalisa ion o CapG wi h he he e och oma in binding p o ein HP1 was shown, which implies
a di ec ch oma in binding o CapG and suppo s a p e iously epo ed ole o CapG in he
egula ion o he e och oma ic gene exp ession. The a ge ing o he e och oma in is media ed by
he C- e minal pa o CapG. Su p isingly, his p o ein agmen is nei he essen ial o ch oma in
associa ion du ing mi osis, no o he in e ac ion wi h he o he condensin I subuni s, no o
he unc ion o CapG du ing he soma ic cell di isions in D osophila emb yos. Con a iwise, a
p o ein agmen consis ing o he N- e minal wo- hi ds o CapG (CapGNM) is able o p o ide he
p o ein unc ion equi ed o he de elopmen om an emb yo o an adul ly, a e he
exhaus ion o ma e nal con ibu ion. Thus, he subcellula localiza ion o CapG du ing in e phase
and also i s C- e minal phospho- egula ion a e no essen ial o p o ein unc ion du ing hese
s ages o de elopmen . Fu he mo e, a unique localiza ion o CapG and i s condensin I binding
pa ne CapD2 was shown in ge mline issues o adul lies, which implies a speci ic unc ion o
condensin I du ing game ogenesis. Consis en wi h his no ion, emales lacking a unc ional
Einlei ung
16
1.2.3. Ch omosomenkondensa ion und Resolu ion de Ch oma iden
Da die Schwes e ch oma iden zu Beginn de Mi ose noch massi e wickel und auße dem im
gesam en Zellke n e eil sind, wä e es unmöglich, sie in solch eine Fo m e olg eich zu
seg egie en. De Ein i in die Mi ose geh dahe mi eine massi en Ums uk u ie ung de
Ch omosomen einhe . Diese müssen kompak ie und indi idualisie we den.
Eine Kompak ie ung wi d du ch die Ch omosomenkondensa ion e mi el , bei welche das
Ch oma in in obus e, s aba ige S uk u en gepack wi d. Diese physikalische Ve dich ung
e möglich eine Ke n eilung inne halb de Dimension eine biologischen Zelle. Du ch die
Replika ion und die Ausdehnung des Ch oma ins wäh end de In e phase en s ehen auße dem
Ve knüp ungen zwischen den Schwes e ch oma iden abe auch zwischen benachba en
Ch omosomen. Diese Ve knüp ungen müssen au gelös und eo ganisie we den, man sp ich
on de Ch oma iden esolu ion. Es en s ehen le z lich kompak ie e, seh de inie e abe
o zdem dynamische Ch omosomens uk u en, welche den K ä en de mi o ischen Spindel in
de Anaphase s andhal en und du ch diese ebenso e olg eich seg egie we den können.
1.2.4. Mechanismen de Ch omosomenkondensa ion
Die G undeinhei de DNA-Ano dnung s ell das Nucleosom da . 147 Basenpaa e de DNA
we den hie bei inne halb 1,67 linksged eh e Windungen um ein Ok ame aus His onp o einen
(jeweils zwei Kopien H2A, H2B, H3 und H4) gewickel (Eickbush und Moud ianakis, 1978). Diese
His onok ame e sind en lang de DNA in einem Abs and on e wa 200 Basenpaa en angeo dne .
Die Pe lenke ens uk u ode auch 10 nm-Fase bewi k eine 3- ache Ve kü zung de DNA-
Moleküle (Richmond e al., 1984). Eine wei e e 6- bis 7- ache Kompak ie ung wi d bis hin zu
sogenann en 30 nm-Fase e eich . Hie bei könn e die Anlage ung des His on H1, welches die
DNA an Be eichen auße halb des His on-Ke ns binde , eine Rolle spielen (Oude e al., 1975;
Suau e al., 1979). Nach Deple ion on H1 in Xenopus lae is-Eizellex ak en (Ohsumi e al., 1993),
ode des H1-Gens in Te ahymena (Shen e al., 1995) konn e alle dings o zdem eine no male
Ch omosomenkondensa ion beobach e we den, was die Rolle on H1 wiede um in F age s ell .
Neue e S udien weisen da au hin, dass die 30 nm-Fase n du ch In e ak ionen de Nucleosomen
selbs gebilde we den könn en (zusammenge ass in Li und Reinbe g (2011).
Bis hin zu Mi ose muss eine wei e e 200- bis 500- ache Kompak ie ung de 30 nm-Fase
bewe ks ellig we den. De genaue Mechanismus is hie bei bishe nich olls ändig au geklä ,
es we den abe e schiedene Modelle o geschlagen.

Einlei ung
17
Basie end au dem coiled/ adial loop-Modell wü de die 30 nm-Ch oma in ase en lang eines
axialen Ch omosomenge üs s in Schlau en gewickel (Ma sden und Laemmli, 1979; Paulson und
Laemmli, 1977). Dieses Ge üs is aus e schiedenen nich -His on P o einen au gebau ,
einschließlich Topoisome ase II (Topo II) (Ea nshaw e al., 1985; Gasse e al., 1986; Lewis und
Laemmli, 1982) und SMC2, eine Ke nun e einhei des Condensin-Komplexes (Lewis und
Laemmli, 1982; Sai oh e al., 1994). An de Ve anke ung de Ch oma inschlei en könn en
wiede um spezi ische AT- eiche Sequenzen de DNA wich ig sein. Diese we den als sca old
associa ed egion (SAR) bezeichne (Mi ko i ch e al., 1984; Razin, 1996). Konsis en zu diesem
Modell wu den nach P äzipi a ion on Me aphase-Ch omosomen Topo II (Ea nshaw und Heck,
1985; Gasse e al., 1986) und SMC2 (Sai oh e al., 1994) als haup sächlich assoziie e P o eine
e hal en. Auch wei e e Expe imen e deu e en au eine zen ale Rolle beide P o eine bei de
Ch omosomenkondensa ion hin. So konn e nach Inhibi ion de Topo II eine e minde e
Ch omosomenkondensa ion beobach e we den (Go bsky, 1994). Du ch Hinzu ügen des
Condensin-Komplexes konn e eine in i o Ch omosomenkondensa ion in mi o ischen X. lae is-
Eizellex ak en e mi el we den (Hi ano e al., 1997). Wei e hin wu de du ch
Immun luo eszenz ä bung de Condensin-Un e einhei en (Maeshima und Laemmli, 2003; Ono e
al., 2003) und di ek e in i o Mik oskopie de EGFP-ma kie en Topo II (Ta o mina e al., 2002)
eine axiale Lokalisa ion diese P o eine an na i en Me aphase-Ch omosomen bes ä ig . Dem
Modell wiede sp echend, konn e du ch spä e e in i o S udien gezeig we den, dass Topo II und
SMC2 e s wäh end de spä en P ophase am Ch oma in lokalisie en (Ki ee a e al., 2004;
Maeshima und Laemmli, 2003), zu einem Zei punk , an dem die Kondensa ion be ei s wei
o gesch i en is . Auße dem konn e gezeig we den, dass auch nach Deple ion bzw. knockdown
on Topo II (Ca pen e und Po e , 2004; Sakaguchi und Kikuchi, 2004) ode SMC2 (Hudson e al.,
2003) eine Ch omosomenkondensa ion möglich is .
Ein wei e es Modell is das hie a chical olding-Modell. Gemäß diesem Modell wi d eine wei e e
s u enweise Au al ung de 10 nm und 30 nm-Fase n in eine de inie e Hie a chie höhe -
geo dne e Ebenen o geschlagen. Die en s ehenden Fase n könn en sich dann wei e zu den
Me aphase-Ch omosomen au winden (Belmon e al., 1987; Seda und Manuelidis, 1978;
Za sepina e al., 1983).
Beide besch iebenen Modelle we den im hie a chical olding axial glue-Modell e einig
(Abbildung 3). Hie is die ini iale Fal ung de Ch oma in ase n in ühe P ophase-Ch omosomen
ge olg on eine wei e en Fal ung in dich e Ch oma iden on ca. 200-300 nm bis zu mi le en
P ophase. Eine wei e e Ve d illung diese Ch oma ide bis zu P ome aphase bewi k eine
zusä zliche Kompak ie ung, was zu Ausbildung de Me aphase-Ch omosomen üh . Diese
Einlei ung
18
könn en einen seh dynamischen Ke n en hal en, welche aus einem Ge lech an e ne z em
Ch oma in und ebenso aus nich -His on P o einen wie Topo II und SMC2 au gebau sein könn e.
Eine Ch omosomenkompak ie ung könn e so auch ohne Topo II und SMC2 e mi el we den,
zu S abili ä und Funk ion de Me aphase-Ch omosomen hingegen wä en diese P o eine
essen iell (Ki ee a e al., 2004).
Abbildung 3: Da s ellung des hie a chical olding axial glue-
Modells. Die 30 nm-Fase n de In e phase-Ch omosomen
we den zu 100-130 nm-Fase n au ge al e , welche in de
mi le en P ophase zu 200-250 nm Ch oma iden e d ill
we den. Bis zu Me aphase wi d eine maximale
Kompak ie ung on 500-750 nm e eich . Im axialen Ke n
de Ch oma iden inden sich Condensin und Topo II ( o e
Kugeln), welche die Ch oma iden als eine A axiale „Klebe “
s abilisie en könn en. En nommen aus Ki ee a e al. (2004).
Du ch 4-dimensionale Mik oskopie on Säuge zellen, welche ein EGFP-ma kie es His on 2B
exp imie en, konn e die Kondensa ion de Ch omosomen in lebenden Zellen e olg und de en
Volumen quan i izie we den (Mo a-Be mudez e al., 2007). Wie e wa e konn e eine
Reduk ion dieses Volumens on de In e phase übe die P ophase zu Me aphase beobach e
we den. Übe aschende weise wa in de Me aphase noch keine maximale Kompak ie ung de
Ch omosomen e eich . E s wäh end de Anaphase wu de das Minimal olumen de
Ch omosomen du ch ein maximal-axiales Ve kü zen de einzelnen Ch oma iden bewi k .
Wäh end die Lokalisa ion de Au o a B Kinase an den Spindelmik o ubuli essen iell ü diese
Anaphasen-Kompak ie ung is , konn en keine E ek e nach Deple ion de Condensin-Komplexe
beobach e we den. Diese wei e e Kompak ie ungsmechanismus wäh end de Anaphase bie e
e en uell eine zusä zliche Möglichkei noch bes ehende Ch oma id e wicklungen au zulösen um
die Ch oma iden un e seh seg egie en zu können (Mo a-Be mudez e al., 2007).
1.2.5. Ch omosomenseg ega ion
Die Kohäsion zwischen den Schwes e ch oma iden muss im Wesen lichen bis zu de en
Seg ega ion in de Anaphase e hal en bleiben. In höhe en Euka yo en e olg die Au hebung de
Kohäsion in zwei Sch i en. Ein G oß eil des Kohäsins wi d be ei s in de P ophase on den
Einlei ung
19
Ch omosomena men abgelös (Losada e al., 1998; Suma a e al., 2000; Waizenegge e al.,
2000). Diese Vo gang, de als P ophaseweg bezeichne wi d, wi d du ch die Kinase Polo-like
kinase 1 (Plk1) e möglich (Hau e al., 2005; Lena e al., 2007; Suma a e al., 2000). Plk1
phospho ylie die mi o ische Kohäsin-Un e einhei Scc3 (Hau e al., 2005), wodu ch
wah scheinlich de Kohäsin-Komplex dissoziie . De g undlegende Mechanismus is hie bei
nich bekann , es wi d abe eine Funk ion de P o eine Wings apa -like (Wapl) und Pds5
e mu e (Gandhi e al., 2006; Ha man e al., 2000; Panizza e al., 2000). Ein Teil des Kohäsins
bleib an den Zen ome en de Ch omosomen e hal en. Ve an wo lich hie ü is ein am
Zen ome -assoziie es P o ein, das als Shugoshin bezeichne wi d. Dieses wi k de Plk1-
abhängigen Phospho ylie ung on Scc3 du ch Rek u ie ung de P o ein-Phospha ase 2A (PP2A)
en gegen (Ki ajima e al., 2006). E s nach ko ek e Anlage ung de Spindelmik o ubuli an den
Kine ocho en de Schwes e ch oma ide kann die zwei e Phase de Kohäsinabspal ung einse zen
und die Schwes e ch oma iden können zu en gegengese z en Zellpolen gezogen we den. Dies
wi d mi els p o eoly ische Spal ung de Kohäsin-Un e einhei Scc1 du ch die konse ie e
Cys ein-P o ease Sepa ase e möglich (Uhlmann e al., 2000; Waizenegge e al., 2000). Die
Sepa ase muss hie bei bis zum Einse zen de Anaphase inak i bleiben. Dies wi d eine sei s
du ch den inhibi o ischen Ko ak o Secu in e möglich , de die Sepa ase du ch eine di ek e
Bindung inak i ie , bis alle Kine ocho e de Schwes e ch oma iden ko ek an de Mi o ischen
Spindel angelage sind (Ciosk e al., 1998; Yamamo o e al., 1996; Zou e al., 1999). E s zum
Ein i in die Anaphase wi d die Inhibi ion de Sepa ase du ch Deg ada ion on Secu in
au gehoben (Cohen-Fix e al., 1996; Zou e al., 1999). Auße dem wi d die phospho ylie e Fo m
de Sepa ase du ch Bindung an den Ckd1-Cyclin B1-Komplex egulie (Go e al., 2005;
S emmann e al., 2001).
1.3. De Condensin-Komplex
1.3.1. Iden i ika ion des Condensin
E s mals wu de Condensin nach Expe imen en in zell eien Eizellex ak en aus X. lae is
besch ieben. Nach Deple ion on X-CapC/SMC4 du ch spezi ische An ikö pe konn e gezeig
we den, dass dieses P o ein wich ig ü die Ch omosomenkondensa ion abe auch ü den E hal
mi o ische Ch omosomen in i o is (Hi ano und Mi chison, 1994). SMC4 bilde zusammen mi
SMC2 einen Ke nkomplex aus, de mi d ei wei e en P o einen assoziie (Kimu a und Hi ano,
1997). Diese Komplex is in de Lage, eine in i o Ch omosomenkondensa ion zu e mi eln
Einlei ung
20
(Hi ano e al., 1997) und wu de dahe als Condensin benann . Du ch die A bei sg uppe um
Hi ano konn e da übe hinaus gezeig we den, dass de Condensin-Komplex in i o an DNA
binden und abhängig on Topoisome ase I (Topo I) und ATP posi i e Windungen in die DNA
ein ügen kann (Kimu a und Hi ano, 1997). Spä e wu de auch de humane Condensin-Komplex
iden i izie , welche ebenso posi i e Windungen in die DNA ein ügen konn e und soga be ähig
wa , in mi o ischen X. lae is-Eizellex ak en eine Ch omosomenkondensa ion zu e mi eln
(Kimu a und Hi ano, 2000). Das deu e e au eine hohe Konse ie ung und Bedeu ung des
Condensin-Komplexes hin. In HeLa-Zellen (menschliche Epi helzellen eines Ze ixka zinoms) und
auch im X. lae is-Eizellex ak konn e schließlich noch ein wei e e Condensin-Komplex
iden i izie we den, de ch onologisch als Condensin II bezeichne wu de (Ono e al., 2003;
Yeong e al., 2003).
1.3.2. Au bau de Condensin-Komplexe
Analog zum Kohäsin-Komplex wi d auch de Ke n de Condensin-Komplexe in Euka yo en aus
einem He e odime on SMC-P o einen gebilde . Neben diesem zen alen SMC2/SMC4-
He e odime sind die Condensin-Komplexe aus 3 wei e en Un e einhei en au gebau (Abbildung
4). Cha ak e is isch ü den Condensin I-Komplex sind hie bei CapH, CapG und CapD2, ü den
Condensin II-Komplex CapH2, CapG2 und CapD3. CapH und CapH2 gehö en wie auch das Scc1
P o ein des Kohäsin-Komplexes, zu Familie de Kleisine (Schlei e e al., 2003). Cha ak e is isch
ü CapG, CapG2, CapD2 und CapD3 sind wie auch ü das Scc3 des Kohäsin-Komplexes, HEAT-
Repea -Domänen (Neuwald und Hi ano, 2000).
Abbildung 4: Schema ische Da s ellung de Condensin-
Komplexe. Die Basis beide pen ame e Komplexe bilde
ein He e odime de P o eine SMC2 und SMC4, welches
an den Scha nie domänen beide P o eine ausgebilde
wi d. Die Te mini beide P o eine bilden eine
ka aly ische ATPase Domäne aus. Hie binden auch die
jeweiligen Kleisine, CapH im Condensin I und CapH2 im
Condensin II. Diese e b ücken die In e ak ion zu den
HEAT-Repea - P o einen CapG und CapD2 (Condensin I)
bzw. CapG2 und CapD3 (Condensin II). En nommen aus
Hudson e al. (2009).
Die genaue Geome ie de Condensin-Komplexe wu de am Beispiel de humanen Komplexe
un e such . Einzelne Un e einhei en wu den hie bei in ekombinan en Exp essionssys emen
Einlei ung
21
he ges ell und dann au ih e Wechselwi kungen hin un e such (Onn e al., 2007). In diese
A bei konn e gezeig we den, dass beide SMC-P o eine an den Kop domänen du ch die Kleisin-
Un e einhei CapH e b ück we den. Die beiden HEAT-Repea -Un e einhei en CapG und CapD2
in e agie en nu schwach mi einande und nich mi den SMC-Un e einhei en. Es konn e eine
s a ke In e ak ion on CapH mi CapG und CapD2 es ges ell we den. Die N- e minale Häl e des
CapH e b ück CapD2 mi SMC2, die C- e minale Häl e hingegen CapG mi SMC4 (Abbildung 4).
Obwohl die Aminosäu esequenzen de nich -SMC-Un e einhei en beide Condensin-Komplexe
seh di e gen sind, konn e ein analoge Au bau auch ü den Condensin II-Komplex gezeig
we den (Onn e al., 2007).
1.3.3. E olu ionä e Konse ie ung de Condensin-Komplexe
Auch in Bak e ien wu den un e schiedliche Klassen on Condensin-Komplexen iden i izie .
Diese sind alle dings aus einem SMC-Homodime und nu zwei wei e en akzesso ischen
Un e einhei en au gebau (Niki e al., 1991; Pe ushenko e al., 2011; Volko e al., 2003;
Yamazoe e al., 1999). Modello ganismen, wie Schizosaccha omyces pombe, S. ce e isiae,
Aspe gillus nidulans und Neu ospo a c assa, die wenige s a k kondensie e Me aphase-
Ch omosomen au weisen, besi zen nu den Condensin I-Komplex. Höhe e Euka yo en haben
hingegen zwei Condensin-Komplexe, weshalb spekulie wu de, dass ein wei e e Condensin-
Komplex O ganismen mi komplexe en Ch omosomen wei e e Ebenen de S uk u ie ung diese
e möglichen könn e (Hi ano, 2005). In Caeno habdi is elegans konn e noch ein wei e e
Condensin I-ähnliche Komplex iden i izie we den, de Dosage Compensa ion Complex
(Condensin IDC) (Hags om und Meye , 2003). Diese wi d aus dem SMC2 Homolog MIX1, eine
SMC4-Va ian e (DPY27) und 3 wei e en P o einen, DPY26, DPY28 und CapG1, gebilde
(Csanko szki e al., 2009). De DCC-Komplex spiel alle dings keine Rolle in de Mi ose, e wi d
ielmeh zu X-Ch omosomalen Dosiskompensa ion de He maph odi en benö ig (Hags om
und Meye , 2003).
1.3.4. Subzellulä e Lokalisa ion und Ch oma inassozia ion de Condensin-Komplexe
Die subzellulä e Lokalisa ion de Condensin-Komplexe wäh end de In e phase a iie inne halb
de e schiedenen Euka yo en. De Condensin-Komplex in S. ce e isiae lokalisie wäh end des
gesam en Zellzyklus im Ke n (Bhalla e al., 2002; F eeman e al., 2000). In S. pombe we den die
zy oplasma isch lokalisie en Condensin-Un e einhei en wäh end de Mi ose in den Ke n

Einlei ung
22
anspo ie (Su ani e al., 1999). In Ve eb a en un e scheiden sich die Condensin-Komplexe in
ih e In e phasenlokalisa ion und ih e Rek u ie ung an das Ch oma in. Die Condensin I-
spezi ischen Un e einhei en sind wäh end de In e phase im Zy oplasma lokalisie und e hal en
einen Zugang zum mi o ischen Ch oma in e s nach dem Zusammenb uch de Ke nhülle (NEBD)
zum Ende de P ophase (Hi o a e al., 2004; Ono e al., 2003). Die Condensin II-spezi ischen
Un e einhei en sind be ei s wäh end de In e phase im Ke n lokalisie (Hi o a e al., 2004; Ono
e al., 2003; Yeong e al., 2003). So wi d dem Condensin II eine spezi ische Rolle bei de ini ialen
Ch omosomenkondensa ion zugesp ochen. Condensin I, nich abe Condensin II, wi d hingegen
ü die olls ändige Ablösung des Kohäsins en lang de Ch omosomena me, ü die
Ch omosomen e kü zung und ü einen zei lich-no malen Ablau du ch die P ome a- und
Me aphase benö ig (Hi o a e al., 2004). Es konn e auße dem eine oneinande unabhängige
Ch oma inassozia ion beide Komplexe und eine al e nie ende Lokalisa ion mi eilweise
übe lappenden Be eichen am Ch oma in gezeig we den (Hi o a e al., 2004; Ono e al., 2004).
1.3.5. Funk ionen de Condensin-Komplexe bei Ch omosomens uk u ie ung
und -seg ega ion
Übe aschende weise konn e auch in Abwesenhei de Condensin-Un e einhei en in ielen
Sys emen, wie D. melanogas e , S. pombe, C. elegans und Gallus gallus eine wei gehend no male
Ch omosomenkondensa ion beobach e we den (Bha e al., 1996; Dej e al., 2004; Gie und
Glo e , 2001; Hags om e al., 2002; Hudson e al., 2003; Jäge e al., 2005; Saka e al., 1994;
Sa idou e al., 2005). Nach diesen S udien muss e die Be eiligung des Condensin-Komplexes an
de Ch omosomenkondensa ion pe se in F age ges ell we den. In all diesen A bei en wu den
hingegen massi e De ek e bei de Schwes e ch oma idenseg ega ion besch ieben.
Die obus e S uk u de Me aphase-Ch omosomen schein in Abwesenhei on Condensin
ges ö zu sein. Diese sind wenige esis en gegen physikalischen S ess, de expe imen ell
du ch einen Wechsel e schieden-ionische Pu e nachges ell we den konn e (Hudson e al.,
2003). Ebenso konn e eine Fehllokalisa ion e schiedene nich -His on P o eine wie Topo II und
INCENP nach Deple ion on SMC2 ode SMC4 gezeig we den (Hudson e al., 2008; Hudson e
al., 2003).
Auch bei de De ini ion und O ganisa ion des zen ome en Ch oma ins und olglich bei de
S uk u ie ung de Zen ome e könn e Condensin eine Rolle spielen. In HeLa-Zellen (Ono e al.,
2004), C. elegans (Hags om e al., 2002) und auch D. melanogas e (S e ensen e al., 2001)
wu de eine An eiche ung de Condensin-Un e einhei en am Zen ome de Ch oma iden
Einlei ung
23
beobach e . In D. melanogas e konn e wei e hin eine ini iale Beladung de nich -SMC-
Un e einhei en des Condensin am Zen ome beobach e (Fische , 2010; Naga ka , 2010;
Oli ei a e al., 2007) und soga eine di ek e In e ak ion on CapG mi de Zen ome -spezi ischen
His on H3 Va ian e CID nachgewiesen we den (Jäge e al., 2005). In HeLa-Zellen wu de zudem
gezeig , dass du ch eine Deple ion des Condensin die Inko po a ion des Zen ome -spezi ischen
His on H3 (CenpA) eduzie is (Samoshkin e al., 2009). Da übe hinaus konn e nach Deple ion
des Condensin eine unde inie e Ano dnung de Ch omosomen inne halb de
Me aphasenpla e, De ek e bei de Anlage ung de Mik o ubuli an den Kine ocho en und auch
me o elische Anlage ungen de Spindelmik o ubuli in S. ce e isiae (Yong-Gonzalez e al., 2007),
C. elegans (Hags om e al., 2002), D. melanogas e (Oli ei a e al., 2005), X. lae is-
Eizellex ak en (Wignall e al., 2003) und HeLa-Zellen (Ono e al., 2004) beobach e we den.
Nach Deple ion on SMC2 in humanen Zellen wu de beispielsweise eine ungewöhnlich wei e
Ve eilung on P o einen des inne en und äuße en Kine ocho s und eine e minde e Ak i i ä
de Au o a B Kinase am Zen ome au gezeig (Samoshkin e al., 2009). Basie end au diesen
E gebnissen wu de in diese A bei pos ulie , dass eine Condensin-Deple ion eine pa ielle
Dekondensa ion des zen ome en Ch oma ins zu Folge ha . Es käme zum ehle ha en Anlage n
de Mik o ubuli an diese ungeo dne en Kine ocho s uk u en. Dadu ch wä e auch de An eil an
Zen ome -lokalisie e Au o a B-Kinase und de en Ak i i ä am Zen ome e minde und
ehle ha angelage e Mik o ubuli könn en nich meh ko igie we den (Samoshkin e al.,
2009). Eine Folge wä en Seg ega ionsde ek e wäh end de Anaphase.
In Condensin deple ie en DT40-Zellen (B-Zelllinie on G. gallus) hingegen e schien die
Kine ocho s uk u wei gehend no mal. Jedoch konn en abno male, unkoo dinie e
Bewegungen de Schwes e kine ocho e nach Anlage ung de Spindelmik o ubuli beobach e
we den. Diese E gebnisse könn en dadu ch e klä we den, dass in diesem Sys em allgemein
wenige Mik o ubuli am Kine ocho anlage n und somi auch wenige Zugk ä e am Zen ome
en s ehen (Ribei o e al., 2009).
1.3.6. Die Condensin-abhängige Ablösung des Kohäsin-Komplexes
Um die lokale Seg ega ion einzelne Ch oma idena me wäh end de Mi ose zu beobach en,
wu den e schiedene Loci en lang de Ch omosomena me in S. ce e isiae isualisie und
mik oskopie (Renshaw e al., 2010). Anhand de E gebnisse konn e ein Modell ü die
Be eiligung des Condensin-Komplexes an de En e nung des Kohäsins on den
Schwes e ch oma idena men au ges ell we den. Demnach we den du ch den Zug de
Einlei ung
24
Spindelmik o ubuli in de Anaphase die Schwes e ch oma iden sch i weise on den
Zen ome en hin zu den Telome en seg egie . Noch an den Ch oma idena men e bliebene
Kohäsinmoleküle üh en zu egionalen Spannungen im Ch oma in. Um die S abili ä de
Ch omosomen zu e hal en, muss diesen Spannungen du ch spezi ische Ve d illung des
Ch oma ins en gegengewi k we den, was wiede um du ch den Condensin-Komplex e mi el
we den könn e. Du ch diese Ch oma inumlage ungen wü den e bleibende Kohäsin-Moleküle
om Ch oma in abgelös . Ohne einen unk ionellen Condensin-Komplex könn en diese
Ums uk u ie ungen des Ch oma ins nich s a inden und die lokalen Spannungen wü den
schließlich zu Beschädigung ode ga zum Ze eißen de Ch omosomen üh en (Renshaw e al.,
2010). Auch mi diesem Modell könn en die beobach e en Seg ega ionsde ek e de Condensin-
Mu an en e klä we den.
In HeLa-Zellen konn e nach Deple ion de Condensin I-Un e einhei CapD2 du ch RNAi eben alls
ein Bes ehen de Kohäsion an den Ch omosomena men besch ieben we den (Hi o a e al.,
2004). In S. ce e isiae wu de eine Condensin abhängige Kohäsin-En e nung auch wäh end de
Meiose beobach e (Yu und Koshland, 2005). In diese A bei wu de gezeig , dass Condensin ü
die Dissozia ion des Kohäsins be ei s zwischen P ophase I und Me aphase I benö ig wi d,
wah scheinlich übe eine Ak i ie ung de Polo-like Kinase (Cdc5).
1.3.7. Mechanismen de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung
Die Condensin-Komplexe sind also zu S uk u ie ung de Ch omosomen essen iell, abe wie
kann diese S uk u ie ung e mi el we den? Es is mi le weile e ablie , dass de s uk u ell
seh ähnliche Kohäsin-Komplex DNA-S änge ing ö mig umschließ und somi zusammenhäl
(Hae ing e al., 2008). Eine Reihe on S udien sp ich alle dings dagegen, dass auch de
Condensin-Komplex DNA-S änge ode auch Ch oma in ase n opologisch umschließen und
somi s uk u ie en und egulie en kann (Ande son e al., 2002; Baze -Jones e al., 2002;
Hudson e al., 2008). So zeigen elek onenmik oskopische Au nahmen des humanen Condensin-
Komplexes eine ehe geschlossene Fo ma ion au , bei de das SMC2/SMC4-He e odime seh
eng ge al e e schein , wäh end die nich -SMC-Un e einhei en globulä anlage n (lollipop-
S uk u ) (Ande son e al., 2002). Fü den Kohäsin-Komplex konn e in de selben S udie eine
e meh o ene Fo ma ion beobach e we den, bei de die coiled-coil Be eiche des
SMC1/SMC3-He e odime s eine o ene V-Fo m ausbilden. Da übe hinaus konn e gezeig
we den, dass de Kohäsin-Komplex nach ek opische P o eolyse on SMC3 om Ch oma in
gelös we den kann, wobei die Schwes e ch oma iden ennung a i iziell ini iie wi d (G ube e
Einlei ung
25
al., 2003). De Condensin-Komplex blieb alle dings nach p o eoly ischem Schneiden on SMC2
inne halb de coiled-coil Region wei gehend in ak und konn e auch nich om Ch oma in
abgelös we den (Hudson e al., 2008). Auße dem konn e eine di ek e In e ak ion de Kleisin-
Un e einhei Cnd2/CapH mi den His onen H2A und H2A.Z in S. pombe und auch eine di ek e
In e ak ion des CapH mi dem His on H2A in HeLa-Zellen gezeig we den (Tada e al., 2011).
Auch elek onenspek oskopische Au nahmen implizie en eine di ek e Bindung de SMC-
Kop domänen an das Ch oma in (Baze -Jones e al., 2002). So wä e eine S uk u ie ung des
Ch oma ins du ch eine di ek e Bindung einzelne Condensin-Un e einhei en denkba , indem
e schiedene Ch oma inbe eiche mi einande e knüp und eine ge al e e S uk u de
Ch oma in ase ixie wü de (Abbildung 5A) (Cuylen und Hae ing, 2011).
Abbildung 5: Modell de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung. A) Du ch di ek e Bindung
einzelne Condensin-Un e einhei en an die DNA könn en zwei Ch omosomenbe eiche mi einande e knüp
we den. B) Al e na i könn e de Condensin-Komplex zwei Ch oma in ase n opologisch umschließen, wobei
ebenso eine di ek e Bindung einzelne Condensin-Un e einhei en an die DNA möglich wä e, um eine Fixie ung
de S uk u zu e mi eln. C) Du ch die Condensin-Komplexe könn e le z lich eine s uk u elle Ve es igung de
Ch omosomen e eich we den. En nommen aus Cuylen und Hae ing (2011).
Du ch Cuylen e al. konn e kü zlich gezeig we den, dass de Condensin-Komplex dennoch ähig
is , DNA-Moleküle opologisch zu umschließen (Cuylen e al., 2011). In diese A bei wu de die
Bindung des Condensin-Komplexes an a i izielle Minich omosomen im Ve gleich zu de des
Kohäsin-Komplexes in S. ce e isiae un e such . Sowohl nach Linea isie ung de
Minich omosomen mi Res ik ionsenzymen als auch nach p o eoly ische Spal ung de
Condensin-Un e einhei en B n4/CapH ode SMC4 konn e eine Dissozia ion de
Minich omosomen om Condensin-Komplex e mi el we den. Im Un e schied zu Dissozia ion
des Kohäsin-Komplexes, wu den ü eine Ablösung de Minich omosomen om Condensin-
Komplexes alle dings höhe e Salzkonzen a ionen benö ig. Das könn e au die Exis enz wei e e
Einlei ung
32
Zen ome ini iie wi d ode al e na i en lang de gesam en Ch omosomen e olgen kann.
Mi els Immunp äzipi a ion einzelne EGFP-ma kie e CapG-F agmen e soll e auße dem
he ausgea bei e we den, welche Domänen on CapG wich ig ü die In e ak ion mi den
wei e en Condensin-Un e einhei en sind. Hie bei könn e ein Zusammenhang zu
Ch oma inassozia ion bzw. zu biologischen Funk ionali ä de einzelnen Domänen he ges ell
we den. Um die Regula ion de Condensin-Komplexe nähe zu cha ak e isie en, soll e auße dem
gep ü we den, ob auch die Condensin-Un e einhei en in D. melanogas e wäh end des
Zellzyklus phospho ylie we den und welche Domänen inne halb on CapG die haup sächlichen
Phospho ylie ungss ellen en hal en.
Du ch Mik oskopie en sp echende Fliegengewebe, in denen ein luo eszenzma kie es CapG-
Kons uk un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e on CapG exp imie wi d,
soll e zudem die Lokalisa ion on CapG in den Zellen de weiblichen und männlichen Keimbahn
de Fliege analysie we den, um e en uelle Funk ionen des P o eins in diesen Geweben zu
e a bei en.
Im zwei en Teil diese A bei soll du ch e schiedene expe imen elle F ages ellungen die
mögliche Assemblie ung on CapG inne halb eines Condensin II-Komplexes gezeig ode
al e na i ein Kandida ü CapG2 iden i izie we den. Es wu de be ei s gezeig , dass die
Condensin II-spezi ischen Un e einhei en die Disassemblie ung on poly änen
Ch omosomens uk u en inne halb de o a ialen Näh zellen und auch de la alen
Speicheld üsen ini iie en können. Du ch gene ische In e ak ionss udien soll e hie bei eine
Be eiligung on CapG an diesen P ozessen un e such we den. Die Immunp äzipi a ion eines
mRFP1-ma kie en CapG aus Emb yonen- und O a ienex ak en und Analyse de P äzipi a e
könn e wei e hin eine mögliche physikalische In e ak ion on CapG mi Condensin II-spezi ischen
Un e einhei en bes ä igen. Mi els Immunp äzipi a ion de Epi op-ma kie en Un e einhei en
SMC4 und CapH2 in O a ienex ak en und anschließende massenspek ome ische Analyse de
P äzipi a e wä e hingegen die Iden i ika ion de Condensin II-Un e einhei CapG2 e möglich .
Diese soll e in Analogie zu den CapG2-Un e einhei en höhe e Euka yo en ein Molekula gewich
on e wa 100 kDa au weisen und HEAT-Repea -Domänen en hal en. Abschließend könn en
di ek e In e ak ionen zwischen den einzelnen Condensin-Un e einhei en du ch ein in i o Assay
wei e üh end e i izie und somi die Geome ie de Condensin-Komplexe on D.
melanogas e e a bei e we den.

E gebnisse
33
2. E gebnisse
2.1. S uk u - und Funk ionsanalyse on CapG
Um Domänen inne halb on CapG zu iden i izie en, welche ü die Ke nlokalisa ion wäh end de
In e phase und auch ü die Lokalisa ion des P o eins am Ch oma in e an wo lich sind, wu de
be ei s in o ausgehenden S udien das Ve hal en einzelne CapG-F agmen e im Ve lau de
Mi ose un e such . Hie zu wu den C- e minal EGFP-ma kie e P o ein agmen e on CapG
he ges ell und ansgene Fliegen gene ie , in welchen diese F agmen e un e Kon olle eines
UAST-P omo o s exp imie we den konn en (F ank, 2008; He zog, 2007). Wäh end diese A bei
wu de ein wei e es EGFP-ma kie es CapG-Kons uk (UAST-CapGNM5-EGFP) he ges ell und
mi els P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion in das Fliegengenom eingeb ach . Es
konn en hie bei d ei un e schiedliche T ansgeninse ionen e hal en we den (Tabelle 11).
Die Lokalisa ion de e schiedenen P o ein agmen e wu de du ch in i o Mik oskopie lebende
Emb yonen wäh end de 14. epide malen Mi ose beobach e (F ank, 2008; He zog, 2007; sowie
diese A bei ). Die gewonnenen E kenn nisse wu den in diese A bei zusammenge ass und mi
compu e gene ie en S uk u analysen de Aminosäu esequenz on CapG du ch die P og amme
PSORT und SMART e glichen. Du ch PSORT o he gesag e Ke nlokalisa ionssequenzen
inne halb des C- e minalen Be eichs on CapG (Abbildung 6, o e Balken) konn en auch
expe imen ell bes ä ig we den. Alle F agmen e, die den C-Te minus on CapG en hal en
(CapGFL-EGFP, CapGMC-EGFP und CapGC-EGFP), wa en wäh end de In e phase im Ke n
ange eiche . Fü CapGC-EGFP konn e eine as ausschließliche Ke nlokalisa ion beobach e
we den ( e gleiche Abbildung 7B). Du ch PSORT wu de auch eine Ke nexpo sequenz im Be eich
de Aminosäu eposi ion 898 o he gesag (Abbildung 6, blaue Balken). Die in i o Mik oskopie
e gab jedoch, dass auch F agmen e, die diesen Aminosäu ebe eich nich en hal en (CapGN-EGFP,
CapGNM1-EGFP und CapGNM2-EGFP) wäh end de In e phase o angig im Zy oplasma
lokalisie en. Diese Ta sache könn e die Exis enz eine wei e en Expo sequenz im N-Te minus
on CapG implizie en. CapGNM-EGFP, CapGNM1-EGFP, CapGM-EGFP und CapGN-EGFP wä en somi
om Ke n ausgeschlossen, da diesen P o ein agmen en die C- e minalen Ke nimpo sequenzen
ehlen und Expo sequenzen im Be eich de N- e minalen zwei-D i el des P o eins zum T agen
kommen. CapGC-EGFP wä e wäh end de In e phase ausschließlich ke nlokalisie , da dieses
F agmen Ke nimpo sequenzen, hingegen abe keine Ke nexpo sequenzen en häl .
E gebnisse
34
Abbildung 6: Schema ische Da s ellung de un e such en CapG-F agmen e und de en Lokalisa ions e hal en
wäh end de 14. epide malen Mi ose. Es sind o he gesag e HEAT-Repea -Domänen du ch osa Balken
(SMART: Be eich de Aminosäu en 90-553), Ke nimpo sequenzen du ch o e Balken (PSORT: Aminosäu en
1072, 1162, 1210), sowie Ke nexpo sequenzen du ch blaue Balken da ges ell . Eine diese Expo sequenzen
wu de du ch PSORT an Aminosäu e 898 o he gesag , eine wei e e wi d au G und des Lokalisa ions e hal ens
de F agmen e im N- e minalen Be eich e mu e .
HEAT-Repea -Domänen wu den du ch SMART im N- e minalen Be eich on CapG zwischen den
Aminosäu en 90 und 553 o he gesag (Abbildung 6, osa Balken). Diese Sequenzen e mi eln
P o ein-P o ein-In e ak ionen (Neuwald und Hi ano, 2000) und könn en dahe auch wich ige
Be eiche zu Regula ion on CapG da s ellen. P o ein-P o ein-In e ak ionen könn en
beispielsweise den T anspo on CapG wäh end des Zellzyklus e mi eln. Da CapGC-EGFP keine
HEAT-Repea -Regionen en häl , o zdem abe seh e izien im Ke n ange eiche we den kann,
soll en en sp echende P o ein-P o ein-In e ak ionen ehe beim Ke nexpo als beim Ke nimpo
zum T agen kommen. Ta sächlich e scheinen die F agmen e, denen ein g oße Be eich de
HEAT-Repea -Domänen ehl (CapGNM4-EGFP und CapGNM5-EGFP), wäh end de In e phase
wei gehend gleichmäßig in de Zelle e eil . CapGM-EGFP s ell hie bei eine Ausnahme da , da
dieses F agmen anscheinend ohne HEAT-Repea - e mi el e In e ak ionen aus dem Ke n
expo ie we den kann. E en uell is de Expo dieses F agmen s du ch dessen ge inge e G öße
auch ohne en sp echende P o ein-P o ein-In e ak ionen möglich. Allgemein schein die
E gebnisse
35
subzellulä e Lokalisa ion on CapG wäh end de In e phase du ch ein Gleichgewich on
P o einexpo und –impo egulie zu sein, welches du ch die An- bzw. Abwesenhei de
einzelnen P o eindomänen e schoben wi d.
Die N-Te minalen zwei-D i el (CapGNM-EGFP) on CapG e scheinen hingegen wich ig, um die
Ch oma inlokalisa ion wäh end de Mi ose zu e möglichen. Nach Zusammenb uch de
Ke nhülle, e häl CapGNM-EGFP Zugang zu DNA und lokalisie im wei e en Ve lau de Mi ose
wie auch das olle-Länge P o ein am Ch oma in (He zog, 2007 und Abbildung 9A bis E). Nach
wei e e Ve kü zung dieses P o einbe eichs (CapGNM1-EGFP, CapGNM2-EGFP CapGNM3-EGFP,
CapGNM4-EGFP, CapGNM5-EGFP, CapGN-EGFP und CapGM-EGFP) kann keine lei Lokalisa ion am
Ch oma in beobach e we den. Fü die Ch oma inassozia ion wäh end de Me aphase e schein
somi de gesam e Be eich de N- e minalen zwei-D i el essen iell.
Auch CapGMC-EGFP und CapGC-EGFP können am Ch oma in assoziie en, alle dings e s wäh end
de Anaphase. Zu diesem Zei punk delokalisie en das endogene CapG und die beiden ande en
nich -SMC Condensin I-Un e einhei en be ei s om Ch oma in (Fische , 2010; Naga ka , 2010;
Oli ei a e al., 2007). Das wü de ü eine al e na i e DNA-Bindung diese CapG-F agmen e
auße halb des Condensin-Komplexes sp echen, die be o zug e möglich is , wenn das
endogene CapG be ei s nich meh am Ch oma in lokalisie .
2.1.1. CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in
CapG is wäh end de In e phase nich homogen im Zellke n e eil . In eigene
o ausgegangene A bei konn e du ch in i o Mik oskopie on Emb yonen, welche UAST-
CapGFL-EGFP wäh end Mi ose 14 exp imie en, gezeig we den, dass lokale An eiche ungen des
P o eins inne halb de Zellke ne o handen sind (He zog, 2007). Diese lokalen An eiche ungen
inne halb de In e phase-Zellke ne sind ü CapGC-EGFP noch deu liche (Abbildung 7B). Um zu
un e suchen, ob es sich hie bei um eine Lokalisa ion de Fusionsp o eine speziell an
He e och oma inbe eichen de Ch omosomen wäh end de In e phase handel , wu de die
Lokalisa ion de CapG-EGFP-F agmen e zusammen mi dem mRFP1-ma kie en HP1 un e such .
HP1 wu de in D. melanogas e als ein mi He e och oma in-spezi ischen DNA-Sequenzen
assoziie es P o ein besch ieben (James und Elgin, 1986). Auch die Ch oma inassozia ion dieses
P o eins wu de be ei s un e such . HP1 e schein wäh end de In e phase egional am
Ch oma in konzen ie , dissoziie alle dings mi beginnende Ch omosomenkondensa ion und
is wäh end in de Me aphase schließlich gleichmäßig in de Zelle e eil (Kellum e al., 1995).
E gebnisse
36
Um eine Exp ession de UAST-CapG-EGFP-Kons uk e zusammen mi mRFP1-HP1 zu e mi eln,
wu den die T ansgeninse ionen UAST-CapGFL-EGFP II.2 und UAST-CapGC-EGFP II.3 jeweils mi
eine T ansgeninse ion eines mRFP1-ma kie en HP1-Kons uk es ekombinie . Die Exp ession
on mRFP1-HP1 wi d hie bei un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e des
HP1-Genlokus e mi el . Du ch in i o Mik oskopie on Emb yonen, in denen die Exp ession de
UAST-CapG-EGFP-T ansgeninse ionen du ch α4 ub-Gal4-VP16 e mi el wu de, konn e die
Lokalisa ion on CapGFL-EGFP und CapGC-EGFP in Bezug zu de on mRFP1-HP1 wäh end des
Zellzyklus beobach e we den. Die du ch Kellum e al. 1995 besch iebene Lokalisa ion on HP1
konn e ü das mRFP1-ma kie e HP1 in lebenden Emb yonen bes ä ig we den (Abbildung 7 und
Abbildung 8). Wäh end de In e phase we den lokal konzen ie e Be eiche on CapGFL-EGFP
deu lich, welche mi mRFP1-HP1 übe lappen (Abbildung 7A, gelbe P eil). Es können ebenso
Be eiche beobach e we den, in denen nu CapGFL-EGFP (Abbildung 7A, g üne P eil) ode abe
nu mRFP1-HP1 lokal ange eiche o liegen (Abbildung 7A, o e P eil).
Abbildung 7: CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in. A) Lebende Emb yonen, die
UAST-CapGFL-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) wäh end de Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4-
VP16/UAST-CapGFL-EGFP II.2, mRFP1-HP1 II.1). Wäh end de In e phase e en lokal konzen ie e Be eiche on
CapGFL-EGFP au , die mi mRFP1-HP1 übe lappen (gelbe P eil). In de Übe lage ung we den auch lokale
An eiche ungen on CapGFL-EGFP deu lich, welche nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (g üne P eil); ebenso
lokale An eiche ungen on mRFP1-HP1, die nich mi CapGFL-EGFP übe lappen ( o e P eil). B) Lebende
Emb yonen, die UAST-CapGC-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-
Gal4-VP16/UAST-CapGC-EGFP II.3, mRFP1-HP1 II.1). Wäh end de In e phase zeig sich hie eine seh
ausgep äg e Lokalisa ion on CapGC-EGFP im Ke n. Alle lokal konzen ie en Be eiche on mRFP1-HP1
übe lappen auch mi CapGC-EGFP (gelbe P eil). In de Übe lage ung we den abe auch lokale An eiche ungen
on CapGC-EGFP deu lich, die nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (g üne P eil). Die Maßs absbalken en sp echen
5 μm.
E gebnisse
37
Die Kolokalisa ion on CapGFL-EGFP und mRFP1-HP1 wu de wei e hin auch im Ve lau de Mi ose
e olg (Abbildung 8A bis G). Beginnend mi de Ch omosomenkondensa ion in de P ophase
inde eine Beladung on CapGFL-EGFP an das Ch oma in s a (Abbildung 8B), wäh end mRFP1-
HP1 beginn , sich gleichmäßig in de gesam en Zelle zu e eilen (Abbildung 8C). CapGFL-EGFP
e bleib bis hin zu Anaphase am Ch oma in lokalisie , mRFP1-HP1 hingegen bleib di us in de
Zelle e eil (Abbildung 8D bis E). E s wäh end de In e phase de Mi ose 15 kann wiede um
eine lokale Konzen a ion on mRFP1-HP1 beobach e we den (Abbildung 8G). Es inde be ei s
hie eine Kolokalisa ion mi dem CapGFL-EGFP s a .
CapGC-EGFP zeig wäh end de In e phase eine seh deu liche Ke nlokalisa ion (Abbildung 7B).
Alle lokal konzen ie en Be eiche on mRFP1-HP1 übe lappen hie auch mi CapGC-EGFP
(Abbildung 7B, gelbe P eil). In de Übe lage ung we den abe auch lokale An eiche ungen on
CapGC-EGFP deu lich, welche nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (Abbildung 7B, g üne P eil). Im
Ve lau de Mi ose (Abbildung 8H bis O) können wäh end de spä en P ophase noch lokal
konzen ie e Be eiche on CapGC-EGFP beobach e we den, wäh end mRFP1-HP1 beginn in die
gesam e Zelle zu di undie en (Abbildung 8K). Nach dem NEBD sind beide P o eine di us in de
ganzen Zelle e eil (Abbildung 8L). Wäh end de Anaphase is CapGC-EGFP in de Lage, am
Ch oma in zu lokalisie en (Abbildung 8M). Ku z danach we den hie CapGC-EGFP-
An eiche ungen deu lich, in denen auch eine beginnende Kolokalisa ion des mRFP1-HP1
beobach e we den kann (Abbildung 8N).
Die Kolokalisa ion on CapGFL-EGFP bzw. CapGC-EGFP mi mRFP1-HP1 leg eine
Ch oma inlokalisa ion on CapG wäh end de In e phase p ä e en iell am He e och oma in de
Ch omosomen nahe. Diese Beobach ung könn e au eine Funk ion on CapG beispielsweise zu
S uk u ie ung des He e och oma ins wäh end de In e phase hinweisen. Auße dem is de
G oß eil des He e och oma ins pe izen isch und äg zu Ausbildung de Zen ome e de
Ch omosomen bei. Wäh end de Mi ose e scheinen CapG, Ba en und CapD2 o e s an den
Zen ome en ange eiche und e s spä e en lang de gesam en Ch omosomena me e eil
(Fische , 2010; Naga ka , 2010; Oli ei a, 2007). So könn e ein Teil on CapG wäh end des
gesam en Zellzyklus am He e och oma in assoziie e bleiben, um bei de Beladung de
wei e en Condensin-Un e einhei en als Zen ome -spezi ische Docking-si e zu ungie en.
Konsis en hie zu konn e ü CapGFL-EGFP keine Delokalisa ion de konzen ie en Be eiche on
de In e phase hin zu P ophase beobach e we den.

E gebnisse
38
Abbildung 8: He e och oma inlokalisa ion on CapG im Ve lau de Mi ose. A bis G) Lebende Emb yonen, die
UAST-CapGFL-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) wäh end de Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4-
VP16/UAST-CapGFL-EGFP II.2, mRFP1-HP1 II.1). H bis O) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGC-EGFP (g ün)
zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4-VP16/UAST-CapGC-EGFP II.3, mRFP1-
HP1 II.1). Die besch iebenen Ke ne sind jeweils du ch P eilspi zen ma kie . Die Zei punk e de jeweiligen
Au nahmen sind in jedem Bild angegeben. De Zei punk =0 en sp ich dem le z en au genommenen Bild o
Ein e en de Anaphase. Die Maßs absbalken en sp echen 10 μm.
2.1.2. Die Ch oma inassozia ion on CapGNM-EGFP is nich am Zen ome ini iie
Eine zei lich dem endogenen CapG en sp echende Ch oma inbeladung konn e ü keines de
e kü z en CapG-EGFP F agmen e beobach e we den ( gl. Abbildung 6). CapGNM-EGFP is
wäh end de In e phase wei gehend zy oplasma isch lokalisie (Abbildung 9A), kann abe nach
dem Zusammenb uch de Ke nhülle am Ch oma in anlage n (He zog, 2007). Um zu un e suchen,
E gebnisse
39
ob auch diese e spä e e Assozia ion on CapGNM-EGFP, gemäß de des endogenen P o eins,
en lang de zen ome en Region de Ch omosomen ini iie wi d, wu de eine in i o Mik oskopie
du chge üh . Hie bei wu den Emb yonen mik oskopie , welche UAST-CapGNM-EGFP e mi el
du ch α4 ub-Gal4-VP16 zusammen mi einem mRFP1-ma kie en His on exp imie en (α4 ub-
Gal4-VP16, His-2A D-mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFP III.2/+). Die Exp ession on His-2A D-
mRFP1 wi d hie bei un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e des His-2A D-
Genlokus e mi el . Zum Zei punk des NEBD kann eine gleichmäßige Ve eilung on CapGNM-
EGFP in de Zelle beobach e we den (Abbildung 9B). Eine Ch oma inlokalisa ion inde im
Folgenden gleichmäßig en lang de gesam en Ch omosomen s a (Abbildung 9C). Es können
keine lokal ange eiche en Be eiche on CapGNM-EGFP zu Beginn de Ch omosomenassozia ion
e gleichba zu denen on CapGFL-EGFP beobach e we den ( e gleiche Abbildung 9C und
Abbildung 8C). Die Anlage ung on CapGNM-EGFP wäh end de Me aphase soll e somi en lang
de gesam en Ch omosomena me ini iie we den können.
E s wäh end de Me aphase we den lokale An eiche ungen on CapGNM-EGFP am Ch oma in
deu lich (Abbildung 9D). Um zu un e suchen, ob es sich hie bei um An eiche ungen des
P o ein agmen s an den Zen ome en de Ch omosomen handel , wu de eine an i-CID Fä bung
de UAST-CapGNM-EGFP exp imie enden Emb yonen o genommen. CID is die Zen ome -
spezi ische His on H3 Va ian e in D. melanogas e , die homolog zum CENP-A P o ein on
Ve eb a en is (Heniko e al., 2000). Die lokal konzen ie en Be eiche on CapGNM-EGFP
übe lappen jedoch nu eilweise mi den CID-spezi ischen Signalen (Abbildung 9F bis I), was au
eine nich ausschließlich Zen ome -spezi ische Konzen a ion dieses P o ein agmen s hinweis .
CapGNM-EGFP könn e wei e hin auch an den He e och oma inbe eichen de Ch omosomena me
lokal ange eiche o liegen. Um diese F age nachzugehen, wu den Fä bungen on Emb yonen
e schiedenen Al e s o genommen. Die lokalen An eiche ungen on CapGNM-EGFP am
Ch oma in konn en hie bei sowohl wäh end de Mi ose 11 als auch wäh end de Mi ose 14
beobach e we den ( e gleiche Abbildung 9G und I). Die ühe Emb yonalen wicklung in D.
melanogas e is du ch eine Phase seh schnelle Zellzyklen in einem syncy ialen Blas ode m
gekennzeichne , in denen das Ch oma in seh homogen e schein und kaum T ansk ip ion
s a inde (Edga e al., 1986). Mi dem Einse zen de T ansk ip ion emb yonale Gene se z
auch eine T ansi ion im E scheinungsbild des Ch oma ins ein, es e schein zunehmend
he e ogen. Diese T ansi ion inde wäh end de Mi osen 10 – 14 s a (Edga und Schubige ,
1986). Die Mi ose 11 inde somi zu einem Zei punk s a , an dem die
E gebnisse
40
He e och oma inbe eiche de Ch omosomen noch wei gehend unde inie sind, was eine
o angigen Konzen a ion on CapGNM-EGFP am He e och oma in wiede um en gegen sp ich .
Abbildung 9: Die ini iale Beladung on CapGNM-EGFP e olg nich übe das Zen ome . A bis E) Lebende
Emb yonen, die UAST-CapGNM-EGFP (g ün) zusammen mi His-2A D-mRFP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en
(α4 ub-Gal4-VP16, His-2A D-mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFPIII.2/+). Die Zei punk e de jeweiligen
Au nahmen sind in jedem Bild angegeben. De Zei punk =0 en sp ich dem le z en au genommenen Bild o
Ein e en de Anaphase. F) bis I) UAST-CapGNM-EGFP exp imie enden Emb yonen (α4 ub-Gal4-VP16, His-2A D-
mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFP III.2/+) wu den sowohl wäh end Mi ose 11 (F und G) als auch wäh end
Mi ose 14 (H und I) ixie und mi Kaninchen-an i-CID An ikö pe n sondie . In den Übe lage ungen is die
Au o luo eszenz on CapGNM-EGFP in g ün und die an i-CID-Fä bung in o da ges ell . In G) und I) sind jeweils
einzelne mi o ische Figu en de in F) und H) da ges ell en epide malen Regionen gezeig . Die Maßs absbalken
en sp echen 5 μm.
Zusammen assend konn e gezeig we den, dass die Beladung on CapGNM-EGFP e s nach dem
Zusammenb echen de Ke nhülle e olg und nich wie ü das endogene CapG am Zen ome
ini iie is . Es inde eine gleichmäßige Assozia ion des P o ein agmen es en lang de
Ch omosomena me s a . Bis hin zu spä en Me aphase e schein CapGNM-EGFP alle dings
inhomogen am Ch oma in e eil .
E gebnisse
41
2.1.3. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG e mi eln biologische Funk ionali ä
Mu a ionen in CapG sind in D. melanogas e be ei s im Emb yonals adium le al. Um die
physiologische Rele anz de einzelnen P o eindomänen on CapG zu un e suchen, wu de
gep ü , ob de CapG-mu an e Phäno yp du ch die Exp ession de e schiedenen UAST-CapG-
EGFP-T ansgeninse ionen komplemen ie we den kann. Hie bei wu den d ei un e schiedliche
CapG-mu an e Allele eingese z (CapG1, CapG6 und CapGEP2346). CapG1 und CapG6 en hal en
Punk mu a ionen, welche jeweils ein o zei iges S opkodon an S elle de T iple s de
Aminosäu en 343 (CapG1) und 77 (CapG6) ein üh en (Jäge e al., 2005). Bei CapGEP2346 handel es
sich um eine P-Elemen -Inse ion in de 5`UTR, 17 bp s omau wä s des S a kodons on CapG
(Dej e al., 2004). Alle diese Mu a ionen sind homozygo emb yonal le al und die mu an en
Emb yonen weisen wäh end de Mi ose 15 massi e Anaphasenb ücken au (Dej e al., 2004;
Jäge e al., 2005).
Die un e schiedlichen UAST-CapG-EGFP-T ansgene soll en du ch die ubiqui ä exp imie enden
T eibe da-Gal4 (Woda z e al., 1995) bzw. ubP-Gal4 (O'Donnell e al., 1994) in e schiedenen
anshe e ozygo CapG-mu an en Fliegen exp imie we den. Hie zu wu den Jung auen de
Geno ypen CapG1/CyO; da-Gal4/da-Gal4 ode TM3,Se bzw. CapG1/CyO; ubP-Gal4/TM3,Se mi
Männchen de Geno ypen CapG6/CyO; UAST-CapGX-EGFP/UAST-CapGX-EGFP ode TM3,Se bzw.
CapGEP2346/CyO; UAST-CapGX-EGFP/UAST-CapGX-EGFP ode TM3,Se gek euz und de en
Nachkommen analysie . Nachkommen, welche den anshe e ozygo CapG-mu an en Geno yp
komplemen ie en, konn en anhand de Abwesenhei des dominan en Ma ke s Cy selek ie
we den. Tabelle 1 zeig den p ozen ualen An eil de a sächlich au ge e enen Fliegen, die den
anshe e ozygo CapG-mu an en Geno yp komplemen ie en können, on den nach den
Mendelschen Regeln heo e isch e wa e en Fliegen des jeweiligen Geschlech s.
Das olle-Länge Kons uk is in de Lage, die physiologische Funk ion on CapG in CapG1/CapG6
anshe e ozygo CapG-mu an en Indi iduen zu e mi eln. Übe aschende weise konn en auch
adul e Fliegen e hal en we den, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleiniges unk ionelles CapG-
Allel exp imie en. Keines de wei e en un e such en Kons uk e wa in de Lage, die Funk ion
on CapG in den CapG1/CapG6 anshe e ozygo CapG-mu an en Fliegen zu komplemen ie en.
Im Ve suchsansa z e laub in homozygo CapG-mu an en Indi iduen zunächs (bis einschließlich
Mi ose 14) die ma e nale Kon ibu ion eine unges ö e P oli e a ion. Wei e hin kann die
Exp ession de UAST-CapG-EGFP-T ansgene, beding du ch den da-Gal4 T eibe , e s im spä en
Zellzyklus 14 e mi el we den. So konn e eine Funk ionali ä de T ansgeninse ionen, beding
du ch den Ve suchsau bau, wäh end de e s en 14 Zellzyklen nich un e such we den. Da UAST-
E gebnisse
48
(Rei hinge , 2009). Hie zu wu de ein N- e minales F agmen on CapG in Bak e ien exp imie ,
ge einig und zu Immunisie ung on Mee schweinchen und Kaninchen eingese z . Die
e hal enen An ikö pe wu den a ini ä sge einig und cha ak e isie (Rei hinge , 2009).
In Immunblo s on P o einex ak en aus w1-Emb yonen bzw. O a ien können nach Ve wendung
on diesen polyklonalen An ikö pe n aus Kaninchen (Abbildung 12A) und auch aus
Mee schweinchen (Rei hinge , 2009) zwei Banden im e wa e en G ößenbe eich on CapG
de ek ie we den. Beide P o einbanden sind spezi isch ü das endogene CapG, da sie in
P o einex ak en on Fliegeno a ien, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleinig unk ionelles CapG-
Allel exp imie en, nich nachgewiesen we den können (Abbildung 12A, CapGNM-Rescue-O a ien).
Alle dings we den in diesen P o einex ak en auch ü das CapGNM-EGFP zwei Banden de ek ie .
Abbildung 12: In de Fliege können e schiedene Iso o men on CapG nachgewiesen we den. A)
P o einex ak e on 3-6 S unden al en w1-Emb yonen und O a ien, sowie aus O a ien on Fliegen, welche
UAST-CapGNM-EGFP als allein unk ionelles CapG-Allel exp imie en (CapGNM-Rescue = CapG6/CapG1; UAST-
CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4), wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . De Immunblo
wu de mi Kaninchen-an i–CapG(N) An ikö pe n sondie . B) P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1-
Emb yonen und aus einem in i o ansk ibie en und ansla ie en cDNA-Plasmid (pCS2-CapG) on CapG
(CapG-IVT) wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn , geblo e und mi Kaninchen-an i-CapG(N)-
An ikö pe n sondie . C) Ein P o einex ak aus ansgenen Fliegen, welche ein C- e minal EGFP-ma kie es
CapG exp imie en, das basie end au de ü CapG-kodie enden genomischen DNA he ges ell wu de (gCapG-
EGFP) sowie ein P o einex ak aus ansgenen Fliegen, welche ein C- e minal EGFP-ma kie es CapG
exp imie en, das basie end au de cDNA on CapG gene ie wu de (CapGFL-EGFP= α4 ub-Gal4-VP16/+; UAST-
CapGFL-EGFP III.2/+), wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn , geblo e und mi Kaninchen-an i-
EGFP-An ikö pe n sondie . D) P o einex ak e on 3-6 S unden al en w1-Emb yonen, O a ien und Hoden
sowie aus O a ien und Hoden de CapGNM-Rescue-Fliegen, wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn
und geblo e . De Blo wu de nacheinande mi Kaninchen-an i-CapG(N), an i-Ba en, an i-CapD2 und an i-
Tubulin als Ladekon olle sondie .

E gebnisse
49
In P o einex ak en aus ansgenen Fliegenemb yonen, in welchen ein C- e minal EGFP-
ma kie es CapG exp imie wi d, das au Basis de genomischen DNA on CapG gene ie
wu de, we den du ch Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe ebenso zwei Banden en sp echende
G öße e ass (Abbildung 12C, gCapG-EGFP). Im P o einex ak aus Emb yonen ansgene
Fliegen, in denen UAST-CapGFL-EGFP un e Kon olle eines Gal4-P omo o s exp imie wi d
(UAST-CapGFL-EGFP), kann du ch Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe im Immunblo jedoch nu eine
Bande de ek ie we den (Abbildung 12C, CapGFL-EGFP). Die Mig a ion diese Bande im SDS-Gel
en sp ich de jenigen de höhe -molekula en Bande im Ex ak aus gCapG-EGFP Emb yonen. Die
UAST-CapG-EGFP Kons uk e wu den au de Basis on cDNA (SD10043) on CapG gene ie . Mi
diese cDNA wu de ebenso ein Plasmid he ges ell (pCS2-CapG), mi welchem CapG in i o
ansk ibie und ansla ie we den konn e. Nach T ansk ip ion und T ansla ion des pCS2-CapG
im Re ikulozy enlysa konn e ü das e hal ene P o ein im Immunblo , nach Sondie ung mi
Kaninchen-an i-CapG-An iköpe n ebenso nu eine Bande de ek ie we den (Abbildung 12B,
CapG-IVT). Die Mig a ion diese Bande en sp ich wiede um de jenigen de höhe -molekula en
Bande aus dem Ex ak de w1-Emb yonen, e schein alle dings leich nach un en e schoben.
Übe aschende weise konn e in P o einex ak en aus Hoden on w1-Fliegen du ch den
Kaninchen-an i-CapG An ikö pe nu eine einzelne Bande de ek ie we den (Abbildung 12D, w1-
Hoden). Diese Männchen-spezi ische Iso o m on CapG weis wiede um ein modi izie es
Lau e hal en im SDS-Gel e glichen zu den beiden Iso o men on CapG on Emb yonen und
O a ien au .
De he ges ell e Blo wu de wei e hin auch mi An ikö pe n sondie , welche gegen die beiden
wei e en nich -SMC Condensin I-Un e einhei en Ba en und CapD2 ge ich e sind (Abbildung
12D). Ba en konn e im P o einex ak aus Hoden on w1-Fliegen nich nachgewiesen we den.
Auch das Signal on CapD2 is in den P o einex ak en de Hoden schwäche als in denen de
O a ien. Au allend is wei e hin, dass sowohl Ba en als auch CapD2 in den O a ienex ak en
de Fliegen, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleiniges unk ionelles CapG-Allel exp imie en
(CapGNM-Rescue-O a ien), wenige abundan sind als in den O a ienex ak en de w1-Fliegen
(Abbildung 12D). Auch nach Ab eiche ung on Ba en bzw. CapD2 du ch RNAi in S2 D osophila-
Zellen ode auch in Ba en bzw. SMC4 homozygo -mu an en Emb yonen konn e eine Reduk ion
de P o einle el de wei e en Condensin I-Un e einhei en beobach e we den (Oli ei a e al.,
2005; Sa idou e al., 2005). Diese E ek kann ü die P o einp oben aus den Fliegenhoden
nich bes ä ig we den. Alle dings is anhand de α-Tubulin-Sondie ung zu e kennen, dass sich
die Lademengen de P oben hie nich en sp echen.
E gebnisse
50
Bei de niede molekula en P o einbande on CapG könn e es sich um eine Iso o m des P o eins
handeln, welche du ch T ansla ion eine al e na i gespleiß en mRNA en s eh . Nich ganz
konsis en hie bei is das Au e en de Doppelbande in P o einex ak en UAST-CapGNM-EGFP
exp imie ende Fliegen, da auch dieses Kons uk basie end au de cDNA on CapG he ges ell
wu de. Sowohl bei De ek ion des endogenen P o eins du ch an i-CapG(N)-An ikö pe , als auch
bei De ek ion des au genomische DNA basie enden, C- e minal ma kie en CapG-EGFP du ch
an i-EGFP-An ikö pe , kann eine Doppelbande de ek ie we den. Die p ä-mRNA on CapG soll e
demzu olge in e n p ozessie we den. Das Übe sp ingen on Exons (Exon-skipping) ode das
Benu zen al e na i e 5' bzw. 3' Spleißs ellen könn en hie bei in eine e kü z en mRNA
esul ie en.
Abbildung 13: Die p ä-mRNA on CapG wi d in Emb yonen nich al e na i gespleiß . A) Da s ellung de CapG
kodie enden Gen egion. Die osa Balken en sp echen den 6 Exons on CapG. Angegeben sind die
Oligonukleo id-Paa e, welche zu PCR-Analyse eingese z wu den, um ein mögliches al e na i es Spleißen de
CapG-mRNA nachzuweisen. B) Gelelek opho e ische-Analyse de PCR zum Nachweis eines al e na i en
Spleißens de p ä-mRNA on CapG. Als Ma ize ü die PCR wu de das cDNA-Plasmid SD10043 und eine cDNA
eingese z , welche du ch e e se T anskip ion eine aus Fliegenemb yonen he ges ell en mRNA gewonnen
wu de (cDNA Emb yonen). Die e wa e en P oduk e nach Ampli ika ion de cDNA sind angegeben.
Um eine e en uell e kü z e mRNA on CapG nachzuweisen, wu de eine PCR-Analyse
du chge üh . Die genomische DNA on CapG en häl 6 Exons und 5 In ons (Abbildung 13A). Es
E gebnisse
51
wu den die in Abbildung 13A angegebenen P ime paa e e wende , um e schiedene Be eiche
on CapG zu ampili izie en. Als Ma ize wu de zum einen das cDNA-Plasmid SD10043 eingese z ,
welches auch ü die Klonie ung de UAST-CapG-EGFP Kons uk e und des pCS2-CapG genu z
wu de. Zum ande en wu de du ch e e se T ansk ip ion eine mRNA aus w1-Fliegenemb yonen,
eine cDNA he ges ell und als Ma ize eingese z . Bei einem Fehlen on in e nen Exonsequenzen
soll en nach Ampli ika ion de en sp echenden he ges ell en cDNA aus Fliegenemb yonen auch
kleine e F agmen e im Aga osegel nachweisba sein. Die jeweils e hal enen Ampli ika e de
cDNA, die aus de mRNA de Emb yonen gewonnen wu den, en sp echen abe ohne Ausnahme
denen des cDNA-Plasmides SD10043 (Abbildung 13B).
Die E gebnisse de PCR-Analyse legen nahe, dass die im Immunblo au e ende Doppelbande
nich au ein al e na i es Spleiße gebnis de p ä-mRNA on CapG zu ückzu üh en is . So soll en
in de Fliege un e schiedliche Iso o men on CapG o handen sein, die au eine Modi ika ion des
P o eins zu ückzu üh en sind.
2.1.7. CapG wi d wäh end des Zellzyklus phospho ylie
In un e schiedlichen Geweben de Fliege e en auch un e schiedliche Iso o men on CapG au .
Das könn e da au hinweisen, dass CapG du ch en sp echende Modi ika ionen gewebsspezi isch
egulie we den kann. Wei e hin wu de un e such , ob eine en sp echende Regula ion
auße dem auch zellzyklusspezi isch s a inden kann. Hie zu wu den Emb yonen on Fliegen des
Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/TM3,Se wäh end de Mi ose 14 du ch Hi zeschock
synch onisie (siehe Ma e ialien und Me hoden 4.5.3). Anschließend wu den Emb yonen
so ie , in welchen sich alle Zellen in de G2-Phase ( o Mi ose 14), P ophase, Me aphase,
Anaphase ode Telophase be anden. Es wu den P o einex ak e de so ie en Emb yonen
he ges ell und du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn . Im Immunblo konn en zwei Banden
ü CapG wäh end de e schiedenen Phasen de Mi ose gleiche maßen in ensi nachgewiesen
we den (Abbildung 14A), was au eine Funk ionali ä beide Iso o men des P o eins wäh end de
Mi ose schließen läss . Das Lau e hal en beide Banden im SDS-Gel schein jedoch wäh end de
Me aphase e zöge zu sein. Die Zuo dnung de Emb yonen zu Ana-und Telophase konn e
hie bei im Immunblo du ch eine an i-Cyclin B-Sondie ung bes ä ig we den (Abbildung 14A).
Es is be ei s bekann , dass die Condensin-Un e einhei en e schiedene O ganismen wäh end
de Mi ose du ch Phospho ylie ung egulie we den (zusammenge ass in Bazile e al. (2010). So
könn en auch in D. melanogas e beide Iso o men on CapG wäh end de Me aphase
E gebnisse
52
phospho ylie o liegen, was die Ve zöge ung de gelelek opho e ischen Au ennung de
P o ein o men im SDS-Gel e klä en wü de. Im Folgenden wu den dahe die Phospho ylie ung
on CapG und die de wei e en nich -SMC Condensin I-Un e einhei en wäh end de Mi ose
un e such . 1-2 S unden al e syncy iale w1-Emb yonen wu den in eine Mischung aus Hep an
und Schneide s-Medium inkubie , dem Demecolzin zugese z wu de. Demecolzin hemm die
Ausbildung de Mi k o ubuli de mi o ischen Spindel, wodu ch die Zellen in de P ome aphase
a e ie en. So konn e ein P o einex ak aus Me aphase-a e ie en und somi Zellzyklus-
synch onen Emb yonen e hal en we den (+Deme). Es wu de auße dem ein na i e
P o einex ak on 2-4 S unden al en, nich Zellzyklus-synch onen w1-Emb yonen he ges ell . Ein
Teil dieses Ex ak s wu de du ch λ-Phospha ase in i o dephospho ylie (+λ). Ein wei e e Teil
des Ex ak s wu de nich mi λ-Phospha ase behandel (-λ), einem le z en Teil wu de λ-
Phospha ase zugegeben und unmi elba danach dena u ie (+λ†). Nach SDS-Gelelek opho ese
wu de ein Immunblo ange e ig und mi an i-CapG(N), an i-CapD2, an i-Ba en und an i-α-
Tubulin-An ikö pe n sondie (Abbildung 14B).
Im P o einex ak aus nich synch onisie en Emb yonen (-λ) können beide Iso o men on CapG
im SDS-Gel schnelle wande n als die Iso o men aus Me aphase-a e ie en, synch onen
Emb yonen (+Deme) (Abbildung 14B). Nach zusä zliche Dephospho ylie ung des Ex ak s aus
nich synch onisie en Emb yonen (+λ) kann eine wei e e Beschleunigung des Lau e hal ens
beide Banden beobach e we den (Abbildung 14B). Das deu e da au hin, dass CapG wäh end
des gesam en Zellzyklus phospho ylie o lieg , wäh end de Me aphase alle dings zusä zliche
Phospho ylie ungen s a inden können.
Das Phospho ylie ungsmus e on CapG un e scheide sich auße dem on dem de wei e en
Condensin I-Un e einhei en CapD2 und Ba en. Auch ü CapD2 kann nach
Phospha asebehandlung des P o einex ak s aus nich -synch onen Emb yonen (+λ) ein
beschleunig es Lau e hal en im SDS-Gel beobach e we den (Abbildung 14B). Es kann jedoch
kein Un e schied im Lau e hal en on Me aphase-a e ie en, synch onen Emb yonen (+Deme)
zu nich synch onisie en Emb yonen (-λ) es ges ell we den (Abbildung 14B). Eine Mi ose-
spezi ische Phospho ylie ung on CapD2 is dahe unwah scheinlich. Im Gegensa z dazu is ü
Ba en in Me aphase-a e ie en Emb yonen (+Deme) im Ve gleich zu nich synch onisie en
Emb yonen (-λ) ein e zöge es Lau e hal en im SDS-Gel es zus ellen (Abbildung 14 B).
E gebnisse
53
Abbildung 14: CapG wi d wäh end de Me aphase phospho ylie , die haup sächlichen Phospho ylie ungs-
s ellen be inden sich inne halb des C-Te minus. A) Phospho ylie ung on CapG im Ve lau de Mi ose.
Emb yonen on Fliegen des Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/TM3,Se wu den wäh end de Mi ose 14
synch onisie . Es wu den Emb yonen so ie , in welchen sich alle Zellen in de G2-Phase ( o Mi ose 14),
P ophase (P o), Me aphase (Me a), Anaphase (Ana) ode Telophase (Telo) de 14. Mi ose be anden. Nach SDS-
Gelelek opho ese de P o einex ak e wu de ein Immunblo ange e ig und diese nacheinande mi
Kaninchen-an i-CapG(N), Maus-an i-Cyclin B und Maus-an i-α-Tubulin-An ikö pe n sondie . Cyclin B wu de
hie bei als Kon olle ü die Zuo dnung de Emb yonen zu den angegebenen Phasen de Mi ose und α-Tubulin
als Ladekon olle eingese z . B) 1-2 S unden al e, syncy iale w1-Emb yonen wu den du ch Demecolzin-
Behandlung wäh end de Me aphase a e ie (+Deme). Es wu de auße dem ein na i e P o einex ak on 2-4
S unden al en, nich Zellzyklus-synch onen w1-Emb yonen he ges ell (-λ). Ein Teil dieses Ex ak s wu de mi λ-
Phospha ase behandel (+λ), ein wei e e mi λ-Phospha ase behandel und unmi elba in SDS-P obenpu e
au gekoch (+λ†). Nach SDS-Gelelek opho ese wu de ein Immunblo ange e ig , de nacheinande mi
Kaninchen-an i-CapG(N), Kaninchen-an i-Ba en, Kaninchen-an i-CapD2, und Maus-an i-α-Tubulin-An ikö pe n
zu Ladekon olle sondie wu de. C) Es wu den na i e P o einex ak e on 3-6 S unden al en Emb yonen, die
UAST-CapGNM-EGFP (α4 ub-Gal4-VP16/+; UAST-CapNM-EGFP III.1/+) ode UAST-CapGC-EGFP (α4 ub-Gal4-
VP16/+; UAST-CapC-EGFP III.1/ +) exp imie en, he ges ell (-λ). Ein Teil diese Ex ak e wu de mi λ-Phospha ase
behandel (+λ), ein wei e e mi λ-Phospha ase behandel und di ek in SDS-P obenpu e au gekoch (+λ ).
Nach SDS-Gelelek opho ese de P o einex ak e wu de ein Immunblo ange e ig und diese nacheinande
mi Kaninchen-an i-EGFP und Kaninchen-an i-CapG(N)-An ikö pe n sondie . D und E) Vo he sagen de
Phospho ylie ungss ellen on CapG du ch die Web-basie en P og amme SCANSITE (D) und NETPHOS(E). Beide
P og amme sagen Phospho ylie ungss ellen o angig im C- e minalen Be eich on CapG o aus.

E gebnisse
54
Du ch Phospha asebehandlung (+λ) kann hie alle dings keine Beschleunigung des
Lau e hal ens on Ba en im SDS-Gel beobach e we den (Abbildung 14B), was au eine
Me aphase-spezi ische Phospho ylie ung on Ba en hinweis . Die nich -SMC Un e einhei en des
Condensin I-Komplexes scheinen dahe wäh end des Zellzyklus un e schiedlich phospho ylie
und somi indi iduell kon ollie we den zu können.
Die Phospho ylie ungss ellen inne halb on CapG wu den im Wei e en nähe ka ie . Du ch die
Web-basie en P og amme SCANSITE und NETPHOS wu den Phospho ylie ungss ellen on CapG
ü den C- e minalen Be eich des P o eins o he gesag (Abbildung 14D und E). Na i e
P o einex ak e aus UAST-CapGNM-EGFP und UAST-CapGC-EGFP exp imie enden Emb yonen
wu den mi λ-Phospha ase behandel und das Lau e hal en de e schiedenen CapG-F agmen e
wäh end SDS-Gelelek opho ese mi dem de F agmen e aus unbehandel en P o einex ak en
e glichen (Abbildung 14C). Im Immunblo wu den Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe zu
De ek ion de EGFP-ma kie en F agmen e und Kaninchen-an i-CapG(N) An ikö pe zu Kon olle
de Phospha aseak i i ä eingese z . Fü CapGC-EGFP konn e nach Phospha asebehandlung ein
schnelle e Gellau beobach e we den, nich abe ü CapGNM-EGFP. Es konn e somi die
Vo he sage eine haup sächlichen Lokalisa ion de Phospho ylie ungss ellen im C- e minalen
Be eich on CapG bes ä ig we den.
Es is zusammenzu assen, dass beide Iso o men on CapG wäh end de Mi ose gleiche maßen
abundan au e en und auße dem auch beide wäh end de Me aphase phospho ylie we den
können. Dies sp ich eine Zellzyklus-spezi ischen Funk ion eine de beiden Iso o men und eine
un e schiedlichen Phospho-Regula ion en gegen. Die Phospho ylie ungss ellen ih e sei s liegen
o angig im C- e minalen Be eich on CapG.
2.1.8. Lokalisa ion und Funk ionali ä on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen
Es konn e sowohl eine Funk ionen de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und
CapD3 bei de Ch oma ins uk u ie ung (Ha l e al., 2008a) als auch eine Rolle on CapG
wäh end de Meiose in de weiblichen Keimbahn besch ieben we den (Resnick e al., 2009). Um
die de aillie e Lokalisa ion on CapG in den Fo p lanzungso ganen adul e Weibchen nähe zu
un e suchen, wu den O a ien aus Fliegen des Geno yps gCapG-EGFP III.1, His-2A D-mRFP1
III.1/TM3,Se p äpa ie , in denen ein C- e minal EGFP-ma kie es CapG zusammen mi dem
mRFP1-ma kie en His on 2A D exp imie wi d (Naga ka , 2010). Das C- e minal EGFP-
ma kie e CapG wi d in diesen Fliegen un e Kon olle de genomischen, egula o ischen
E gebnisse
55
Elemen e des CapG-Genlokus exp imie und konn e be ei s als unk ionell besch ieben we den
(Naga ka , 2010).
Die O a ien de Fliege bes ehen aus einzelnen O a iolen, welche wiede um aus Eikamme n
e schiedene En wicklungss adien au gebau sind. Die Eikamme n sind ih e sei s on
Epi helzellen soma ischen U sp ungs (Follikelzellen) umgeben. Im an e io en Teil jede O a iole
be inde sich das Ge ma ium. Hie sind die Keimbahns ammzellen angesiedel . Nach de en
mi o ische Teilung we den wiede um eine Keimbahns ammzelle und eine Zys oblas enzelle
gebilde . Die Zys oblas enzelle du chläu 4 mi o ische Teilungen, wo aus 15 Näh zellen und eine
Oozy e he o gehen (de Cue as e al., 1997).
Abbildung 15: Lokalisa ion on CapG in de weiblichen Keimbahn. Au o luo eszenz de O a ien on
Weibchen, welche gCapG-EGFP (g ün) zusammen mi His-2A D-mRFP1 ( o ) exp imie en (gCapG-EGFP III.1,
His-2A D-mRFP1 III.1/TM3,Se ). A) Übe sich on Eikamme n e schiedene En wicklungss adien. B) Eikamme
im S adium 10 und e g öße e Au nahme de G enzzellen diese Eikamme . Die Maßs absbalken be agen 10
µm.
Es konn e eine Lokalisa ion on gCapG-EGFP sowohl in den Ke nen de Zellen des Ge ma iums,
de Follikelzellen als auch de Näh zellen beobach e we den (Abbildung 15). Die In ensi ä de
EGFP-Fluo eszenz nimm hie bei nach dem En wicklungss adium 6 de Eikamme n ab. Eine
wei e e in e essan e Beobach ung is die Lokalisa ion on CapG-EGFP in den Ke nen de
G enzzellen (bo de cells). Die G enzzellen gehen aus den epi helialen Follikelzellen he o ,
ollziehen dann alle dings eine Mo phologieände ung und we den zu Mesenchymzellen
E gebnisse
56
(Mon ell, 2001). Somi we den sie beweglich und können du ch die Näh zellen hindu ch zum
an e io en Ende de Oozy e gelangen. Die G enzzellen agen wäh end de Oogenese zu
Ausbildung de Mik opyle bei, welche spä e zum Eind ingen de Spe mien geb auch wi d
(Mon ell e al., 1992). Sie spielen ebenso eine Rolle bei de Spezi izie ung on Zellen des
an e io en und pos e io en Be eiches on Ei und Emb yo (S e ens e al., 1990). Eine Lokalisa ion
on CapG im Ke n diese G enzzellen könn e au eine pos mi o ische Funk ion des P o eins bei
de G enzzellen wicklung ode auch -mig a ion hinweisen. Ebenso könn e CapG an de
Ausbildung de Mik opyle ode an de Zellspezi izie ung be eilig sein.
In diese A bei konn e be ei s gezeig we den, dass Fliegenweibchen, welche UAST-CapGFL-EGFP
ode auch UAST-CapGNM-EGFP als alleinig unk ionelle CapG-Allele e mi el du ch da-Gal4
exp imie en, lebens ähig, abe s e il sind und nu seh wenige Eie legen (Tabelle 1). Da UAST-
Vek o en in Keimbahn-spezi ischen Zellen nich exp imie we den (B and und Pe imon, 1993),
könn e die S e ili ä de Weibchen da au zu ückzu üh en sein, dass in diesen Zellen nich
aus eichend P o ein zu Ve ügung s eh . Du ch diese Weibchen konn en olglich mögliche
Phäno ypen on Zellen de weiblichen Geschlech so gane bei unzu eichende P o einmenge on
CapG un e such we den. In Abbildung 16 sind die O a ien on Weibchen des Geno yps
CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 gezeig . Diese we den im Folgenden als CapGNM-
Rescue-Weibchen bezeichne . Anhand de Au o luo eszenz on CapGNM-EGFP konn e eine
Exp ession des P o ein agmen s in den O a ien diese Weibchen o allem in Zellen
soma ischen U sp ungs (Follikel- und G enzzellen) bes ä ig we den (Abbildung 16B). Die
In ensi ä des EGFP-Signals a iie hie s a k on Zelle zu Zelle, was au eine nich gleichmäßige
Exp ession de UAST-CapGNM-EGFP-Kons uk s hinweis . Du ch die Hoechs 33258-Fä bung
konn e auch das E scheinungsbild de G enzzellen de En wicklungss adien 9 und 10 beobach e
we den. Auch in den G enzzellen zeig sich eine ungleichmäßige Exp ession des UAST-CapGNM-
EGFP (Abbildung 16B). Das P o ein agmen is in den G enzzellen sowie auch in den
Follikelzellen haup sächlich im Zy oplasma lokalisie (Abbildung 16B), was konsis en zu
subzellulä en Lokalisa ion on CapGNM-EGFP in Emb yonen is (Abbildung 9A). Mi els de DNA-
Fä bung konn en alle dings keine une wa e en Phäno ypen in Bezug au die Anzahl de
G enzzellen, de en G uppie ung ode auch Mig a ion es ges ell we den ( gl. Abbildung 16A mi
15B).
Da die G enzzellen auch an de Ausbildung de Mik opyle be eilig sind, welche eine Funk ion
beim Eind ingen de Spe mien ha , könn en die on CapGNM-Rescue-Weibchen abgeleg en Eie
schlich weg nich be uch ungs ähig sein. Um dies zu übe p ü en, wu den en sp echende
E gebnisse
57
Weibchen mi w1-Männchen gek euz . Die abgeleg en Eie wu den mi einem an i-Spe m ail-
An ikö pe sondie und mi Hoechs 33258 ge ä b (Abbildung 16D und E). De hie bei
ange ä b e Schwanz de Spe mien is inne halb de Emb yonen zu beobach en, was eine
Be uch ungs ähigkei de abgeleg en Eie beleg .
Das E scheinungsbild de G enzzellen und auch die Be uch ungs ähigkei de Emb yonen on
Weibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGFL-EGFP III.3/da-GAL4 (CapGFL-Rescue) wu den
wäh end diese A bei in analoge Weise un e such . Auch hie konn en in Bezug au die Anzahl,
G uppie ung ode Mig a ion de G enzzellen keine Phäno ypen es ges ell we den. Von diesen
Weibchen abgeleg e Eie können ebenso du ch w1-Männchen be uch e we den (Da en nich
gezeig ).
Abbildung 16: Mo phologie de G enzzellen und des Synap onemalen Komplexes in de weiblichen
Keimbahn nach Ab eiche ung on CapG. A bis C) Eikamme n des S adiums 10 aus einem O a on
Fliegenweibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4. A) DNA-Fä bung mi Hoechs
33258. B) CapGNM-EGFP konn e anhand de Au o luo eszenz isualisie we den. C) In de Übe lage ung is
CapGNM-EGFP in g ün und die Hoechs 33258-Fä bung in o da ges ell . Da ges ell sind Eikamme n des
En wicklungss adiums 10 und e g öße e Au nahmen de en G enzzellen. D und E) Fliegenweibchen des
Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 wu den mi w1-Männchen gek euz . Die abgeleg en
Eie wu den mi einem Maus-an i-Spe m ail-An ikö pe sondie , um die Be uch ungs ähigkei de Eie
nachzuweisen (E), und mi Hoechs 33258 ge ä b (D). F bis H) O a ien on Fliegenweibchen des Geno yps
CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 wu den p äpa ie , mi einem an i-C(3)G-An ikö pe (g ün)
sondie , um den SC da zus ellen und mi Hoechs 33258 ( o ) ge ä b . Es is jeweils auch eine Ve g öße ung
de C(3)G-Fä bung da ges ell . Es zeig sich eine Assemblie ung des SC en lang de Ch omosomen im
Ge ma ium (F) und dessen g aduelle Dissozia ion on den Ch omosomen in das Zy oplasma om S adium 5 (G)
bis hin zum S adium 7 (H). Die Maßs absbalken be agen 10 µm.
E gebnisse
64
zusä zliche CapG1–Allel en hal en, bleib de An eil an Eikamme n mi schwach poly änem
Näh zellch oma in as gleich, alle dings is de An eil de Eikamme n mi poly änem
Näh zellch oma in hie hin zu denen mi e s ä k poly änem Näh zellch oma in e schoben
(Abbildung 18B, Balken 2). In Weibchen, welche das zusä zliche CapG6–Allel en hal en, e schein
de An eil an Eikamme n mi e s ä k poly änem Näh zellch oma in gegenübe den
anshe e ozygo CapD3-Mu an en nich e ände , alle dings is hie de An eil de Eikamme n
mi schwach poly änem Ch oma in hin zu denen mi poly änem Ch oma in e schoben
(Abbildung 18, B Balken 3).
Du ch das Einb ingen eines zusä zlich CapG-mu an en Allels kann de poly äne Phäno yp des
Näh zellch oma ins in anshe e ozygo CapD3-mu an en Fliegen also insgesam wei e e s ä k
we den. Fü beide CapG-Allele konn en un e schiedliche E ek e beobach e we den, was du ch
zusä zliche Mu a ionen au den Ch omosomen mi den CapG-Allelen e klä we den könn e.
Es wu de gleiche maßen un e such , ob die Poly änie des Ch oma ins de Näh zellke ne in
O a ien on anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen ebenso du ch Einb ingen eines
zusä zlich mu an en CapG-Allels wei e e s ä k we den kann. Hie bei wu den eine
ch omosomale Dele ion (CapH2D (3R)Exel6159) und zwei un e schiedliche CapH2-Allele eingese z .
Bei CapH2PL00617 lieg eine pBac-Inse ion im e s en In on on CapH2 o , bei CapH2TH2 hingegen
handel es sich um eine Dele ion inne halb de 5´-Region on CapH2 (Ha l e al., 2008a). Da
be ei s ü die e schiedenen CapH2-Allelkombina ionen un e schiedliche Phäno ypen bezüglich
de Mo phologie des Näh zellch oma ins beobach e we den konn en, wu den die Phäno ypen
de e schiedenen anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen ge enn ge ach e . So wu den
o e s O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159 und CapG1/+;
CapH2PL00617/ CapH2D (3R)Exel6159 p äpa ie , mi Hoechs 33258 ge ä b und die Mo phologie des
Näh zellch oma ins in Eikamme n des S adiums 10 bes imm . Auch hie wu de die Poly änie des
Näh zellch oma ins in meh e en Eikamme n ausgewe e und e schiedenen Klassen
zugeo dne (Abbildung 19A). E wa die Häl e de Eikamme n de anshe e ozygo CapH2-
mu an en Weibchen weisen einen schwach poly änen Phäno yp des Näh zellch oma ins au , in
44,8% e schein das Ch oma in poly än und in nu 3,4% s a k poly än (Abbildung 19B, Balken 1).
Weibchen, welche ein zusä zliches CapG-mu an es Allel (CapG1) en hal en, zeigen eine
Ve inge ung an Eikamme n mi schwach poly änem Näh zellch oma in und eine Zunahme an
Eikamme n mi poly än bzw. e s ä k poly änem Ch oma in (Abbildung 19B, Balken 2).

E gebnisse
65
Abbildung 19: Du ch ein zusä zlich CapG-mu an es Allel kann die Poly änie de o a ialen Näh zellen on
he e ozygo CapH2-mu an en Weibchen wei e ges eige we den. A) Hoechs 33258 ge ä b e O a ien on
Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159 (Zeile 1) und CapG1/+; CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159
(Zeile 2). C) Hoechs 33258 ge ä b e O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2TH2 (Zeile 1) und
CapG6/+; CapH2PL00617/CapH2TH2 (Zeile 2). Du ch Mik oskopie konn e die Poly änie des Ch oma ins de
Näh zellen in Eikamme n des S adiums 10 un e such und in die angegebenen Phäno ypenklassen einge eil
we den. In de Tabelle sind die Gesam zahl de ausgezähl en Eikamme n (n) und de p ozen uale An eil de
Eikamme n, die den en sp echenden Phäno ypenklassen (schwach poly än, poly än und e s ä k poly än)
zugeo dne wu den, da ges ell . Un e den jeweiligen Spal en sind Beispiele on Eikamme n de einzelnen
Phäno ypenklassen da ges ell . B) G a ische Da s ellung de E gebnisse aus A). D) G a ische Da s ellung de
E gebnisse aus C). Die einzelnen Balken en sp echen jeweils den da übe angegebenen Geno ypen. Die
Phäno ypenklassen de Eikamme n sind in un e schiedlichen Fa ben da ges ell (blau: schwach poly än, o :
poly än, g ün: e s ä k poly än) und en sp echen denen de Da s ellungen in A) und C).
Eine analoge Analyse wu de mi O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2TH2
und CapG6/+; CapH2PL00617/CapH2TH2 o genommen (Abbildung 19C). 72% de Eikamme n de
anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen diese Allelkombina ion weisen einen schwach
poly änen Phäno yp des Näh zellch oma ins au , in 28% e schein das Ch oma in poly än
(Abbildung 19D, Balken 1). Weibchen, welche ein zusä zliches CapG-mu an es Allel (CapG6)
E gebnisse
66
en hal en, zeigen ebenso eine Ve inge ung an Eikamme n mi schwach poly änem
Näh zellch oma in und eine Zunahme an Eikamme n mi poly änem Ch oma in (Abbildung 19D,
Balken 2). Eikamme n mi e s ä k poly änem Ch oma in konn en hie nich beobach e
we den.
Auch de poly äne Phäno yp de Näh zellke ne on anshe e ozygo CapH2-mu an en Fliegen
kann du ch das Einb ingen eines mu an en-CapG Allels wei e ges eige we den. Du ch diese
gene ischen In e ak ionss udien wi d eine Funk ion on CapG bei de Disassemblie ung des
poly änen Ch oma ins de Näh zellke ne on Fliegeno a ien im Zusammenspiel mi CapH2 und
CapD3 nahegeleg .
2.2.1.2. Disassemblie ung on poly änem Speicheld üsench oma in in La en
Auch in den Ke nen on Speicheld üsen aus La en können poly äne Ch oma ins uk u en
beobach e we den (Abbildung 20A). Im Gegensa z zu den Näh zellke nen de O a ien, bleiben
diese gebände en S uk u en hie alle dings wäh end de En wicklung e hal en. Wäh end in
CapH2-mu an en O a ien de poly äne S a us de Näh zellke ne länge als no mal pe sis ie ,
üh in einem komplemen ä em Ansa z die Übe exp ession on CapH2 in den no male weise
poly änen Speicheld üsenzellen zu eine Dispe sion des poly änen Ch oma ins (Ha l e al.,
2008a). Um die mögliche gene ische In e ak ion on CapG mi den Condensin II-Un e einhei en
zu e i izie en, wu de wei e hin un e such , ob auch CapG zu Disassemblie ung des
Speicheld üsench oma ins bei agen kann. Hie ü wu den 2 e schiedene UASP-CapG-
T ansgene e mi el du ch F4-Gal4 in den Speicheld üsen on Fliegenla en übe exp imie .
Nach Übe exp ession on CapG (Abbildung 20C und D), konn e hie eine Disassemblie ung des
poly änen Ch oma ins de Speicheld üsen beobach e we den. Nach analoge Übe exp ession
de Condensin I-Un e einhei Ba en wu de hingegen keine e gleichba e Ch oma indispe sion
beobach e (Abbildung 20E).
Im Fall eine gene ischen In e ak ion de Condensin-Un e einhei en, soll e die CapH2-
Übe exp ession in CapD3 ode auch he e ozygo CapG-mu an en La en supp imie we den
(Ha l e al., 2008a). Dahe wu den die E ek e de Übe exp ession on CapH2 auch in
he e ozygo CapD3-mu an en La en, he e ozygo CapG-mu an en La en sowie
anshe e ozygo CapD3/CapG-mu an en La en un e such . Nach F4-Gal4 e mi el e
Übe exp ession des unk ionellen T ansgens UASP-mche y-CapH2 III.2 (2.2.2.3.) kann eben alls
eine Disassemblie ung des Ch oma ins de Speicheld üsenke ne beobach e we den (Abbildung
E gebnisse
67
20B). In he e ozygo CapD3-mu an en La en wi d diese Disassemblie ung supp imie
(Abbildung 20F). Auch das Ch oma in on he e ozygo CapG-mu an en La en kann nach
Übe exp ession on mche y-CapH2 nich olls ändig disassemblie we den und e schein wie
auch nach mche y-CapH2 Übe exp ession in he e ozygo CapD3-mu an en La en noch
eilweise poly än (Abbildung 20G und H). Nach CapH2-Übe exp ession in anshe e ozygo
CapD3/CapG-mu an en La en kann jedoch keine wei e e Supp ession de Ch oma in-
disassemblie ung beobach e we den ( e gleiche Abbildung 20I und K mi F, G und H).
Du ch diese Expe imen e konn e gezeig we den, dass CapG e gleichba zu CapH2 be ähig is ,
eine Disassemblie ung des poly änen Speicheld üsench oma ins zu induzie en. Es wu de auch
hie ein Zusammenspiel on CapG und CapH2 nachgewiesen, da die E ek e de CapH2-
Übe exp ession du ch ein CapG ode auch CapD3-mu an es Allel supp imie we den konn en.
Ob CapG, CapH2 und CapD3 die Dispe sion des Speicheld üsench oma ins als Un e einhei en
inne halb eines Condensin II-Komplexes e mi eln ode ob CapG unabhängig on einem
Condensin II-Komplex eine Ch oma in eo ganisa ion ausüben kann, konn e du ch die
gene ischen In e ak ionss udien alle dings nich di e enzie we den.
Abbildung 20: Funk ionali ä on CapG bei de Disassemblie ung de poly änen Speicheld üsen-
ch omosomen. Hoechs 33258 ge ä b e Ke ne de Speicheld üsen on La en im S adium 3. A) Wild yp (w1). B)
CapH2-Übe exp ession (F4-Gal4/+; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). C) CapG-Übe exp ession (F4-Gal4/+; UASP-
CapG III.2/+) und D) (F4-Gal4/+; UASP-CapG-mRFP1 III.1/+). E) Ba en-Übe exp ession (F4-Gal4/ UASP-Ba en-
EGFP III.2). F) CapH2-Übe exp ession in he e ozygo CapD3-mu an en La en (F4-Gal4/CapD3EY00456; UASP-
mche y- CapH2 III.2/+). G) CapH2-Übe exp ession in he e ozygo CapG-mu an en La en (F4-Gal4/CapG1;
UASP-mche y-CapH2 III.2/+) und H) (F4-Gal4/CapG6; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). I) CapH2-Übe exp ession in
anshe e ozygo CapD3/CapG-mu an en La en (F4Gal4/CapD3EY00456, CapG1; UASP-mche y-CapH2 III.2/+)
und K) (F4-Gal4/CapD3EY00456, CapG6; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). De Maßs absbalken en sp ich 5 µm.
E gebnisse
68
2.2.2. In i o Iden i ika ion de Condensin II-Komponen en on D. melanogas e
2.2.2.1. Condensin II-spezi ische Un e einhei en we den du ch CapG nich p äzipi ie
Die Fähigkei on CapG, eine Disassemblie ung on poly änen Ch omosomens uk u en im
Zusammenspiel mi CapH2 und CapD3 zu induzie en, zeig eine gene ische In e ak ion on CapG
mi den Condensin II-spezi ischen Un e einhei en au . Die F age, ob diese gene ische In e ak ion
au die P äsenz on CapG und CapH2 bzw. CapD3 in einem gemeinsamen Komplex
zu ückzu üh en is , könn e du ch den Nachweis physikalische In e ak ionen diese Condensin-
Un e einhei en bean wo e we den.
Um diese F age nachzugehen, wu den P o einex ak e on Emb yonen und O a ien, in denen
ein C- e minal du ch mRFP1-ma kie es CapG-T ansgen un e Kon olle de genomischen,
egula o ischen Elemen e des CapG-Genlokus exp imie wi d (gCapG-mRFP1), du ch
Immunp äzipi a ion mi Kaninchen-an i-mRFP1-Sepha ose analysie . Die Funk ionali ä des
CapG-mRFP1 Fusionsp o eins in de Fliege wa be ei s gezeig wo den (Naga ka , pe s.
Mi eilung). Zu Kon olle wu den Ex ak e aus w1-Emb yonen und O a ien on w1-Fliegen
he ges ell und in analoge Weise analysie . Um unspezi ische Kop äzipi a ionen du ch Bindung
an die mRFP1-Ma kie ung zu kon ollie en, wu de einem Teil diese na i en P o einex ak e
bak e iell exp imie es mRFP1 P o ein zugese z . Du ch Immunblo en konn e eine
Kop äzipi a ion de Condensin I-spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 du ch CapG-
mRFP1 nachgewiesen we den (Abbildung 21B). Die P äzipi a e wu den ebenso du ch SDS-
Gelelek opho ese au ge enn und anschließend eine Silbe ä bung un e zogen. Es konn en
hie dis ink e Banden in den P äzipi a en de CapG-mRFP1 en hal enden P o einex ak e, nich
abe in denen de w1-O a ien nachgewiesen we den (Abbildung 21A, P eilspi zen), was da au
hinweis , dass spezi ische In e ak o en on CapG-mRFP1 kop äzipi ie we den konn en. Um die
Iden i ika ion de kop äzipi ie en P o eine übe Massenspek ome ie zu e möglichen, wu de
ein wei e es SDS-P o eingel de Massenspek ome ie-kompa iblen Fä bung mi els kolloidalem
Coomassie un e zogen. Da du ch diese Fä beme hode nu wenige dis ink e Banden ange ä b
we den konn en, wu den die gesam en Spu en de P äzipi a e in Be eiche au ge eil (Abbildung
21C und D, o e Käs chen), und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els
Massenspek ome ie iden i izie .
E gebnisse
69
Abbildung 21: Die Un e einhei en des Condensin I-Komplexes können du ch gCapG-mRFP1 p äzipi ie
we den. Na i e P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen und O a ien on w1-Weibchen, sowie aus
3-6 S unden al en Emb yonen und Fliegenweibchen des Geno yps gCapG-mRFP1]/TM3,Se wu den du ch
Immunp äzipi a ion un e Ve wendung on Kaninchen-an i-mRFP1-Sepha ose analysie . Zum Teil wu de den
w1-Ex ak en bak e iell exp imie es mRFP1 (1 ng/µl) zugese z . A) P oben de Elua e (IP) de
Immunp äzipi a ionen wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und anschließend eine Silbe ä bung
un e zogen. B) P oben de P o einex ak e o Immunp äzipi a ion (INPUT), de Übe s ände nach P äzipi a ion
(ÜB) und de Elua e nach P äzipi a ion (IP) de Immunp äzipi a ionen aus Emb yonenex ak en wu den übe
SDS-Gelelek opho ese au ge enn und du ch Immunblo en un e Ve wendung on Kaninchen-an i-mRFP1,
Kaninchen-an i-CapD2 und Kaninchen-an i-Ba en An ikö pe n analysie . C) P oben de Elua e (IP) de
Immunp äzipi a ionen aus w1-bzw. gCapG-mRFP1 Emb yonenex ak en wu den du ch SDS-Gelelek opho ese
au ge enn und kolloidal-Coomassie ge ä b . Die gesam en Gelspu en de P äzipi a e wu den in jeweils 10
Be eiche au ge eil ( o e Käs chen) und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els
Massenspek ome ie iden i izie . D) P oben de Elua e (IP) de Immunp äzipi a ionen aus w1- bzw. gCapG-
mRFP1 O a ienex ak en wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und kolloidal-Coomassie ge ä b .
Die gesam en Gelspu en de P äzipi a e wu den in jeweils 6 Be eiche au ge eil ( o e Käs chen) und die
Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie . Du ch die P eilspi ze is die
Bande des bak e iell exp imie en mRFP1 gekennzeichne , welches dem Ex ak de w1-O a ien o de
P äzipi a ion zugese z wu de.
Die Massenspek ome ie und p imä e Analyse de Da en wu den in de Biochemie co e acili y
des Max Planck Ins i u s in Ma ins ied du chge üh . In den P äzipi a en de gCapG-mRFP1
Emb yonenex ak e konn en insgesam 168 D. melanogas e -P o eine iden i izie we den, in
denen aus gCapG-mRFP1 exp imie enden O a ien 545 P o eine. In den P äzipi a en de w1-
Emb yonen wu den 234 P o eine und in denen de w1-O a ien 899 P o eine iden i izie . Eine
wei e e Analyse de Da en wu de on mi o genommen. Die iden i izie en P o eine wu den

E gebnisse
70
o e s nach ih em unique and azo co e age so ie , de ein Maß ü die Spezi i ä de
Pep idmassenzuo dnung da s ell . Es wu den alle P o eine e wo en, de en unique and azo
co e age kleine als 5 wa . Es wu den ebenso ibosomale P o eine und P o eine dele ie , denen
nu 1 spezi isches Pep id zugeo dne we den konn e. Alphabe isch geo dne e Tabellen de
e bliebenen P o eine inden sich im Anhang (A1) CapG-mRFP1-Emb yonen O bi_0112 und A2)
CapG-mRFP1-O a ien O bi_1060). Um die P o eine zu iden i izie en, die eben alls aus w1-
O a ienex ak en p äzipi ie wu den, wu den die in de Nega i kon olle iden i izie e P o eine
analog so ie und zusammenges ell (Anhang: A3) w1-O a ien O bi_1060).
Tabelle 2: Zusammens ellung de mi höchs e In ensi ä du ch CapG-mRFP1 p äzipi ie en P o eine.
Da ges ell sind die 30 mi höchs e In ensi ä iden i izie en P o eine (sowie CapG) aus P äzipi a en on CapG-
mRFP1 exp imie enden Emb yonen (A) und O a ien (B), bzw. aus w1-Emb yonen (A) und w1-O a ien (B) nach
Immunp äzipi a ion mi Kaninchen-an i-mRFP1 Sepha ose. Den Ex ak en de w1-O a ien wa bak e iell
exp imie es mRFP1-P o ein zugese z wo den. Angegeben sind die iden i izie en P o eine, die Spezi i ä ih e
Pep idmassenzuo dnung (Co e age), ih Molekula gewich (MW), de gemi el e We des Gelbe eiches, in
dem die meis en Pep ide iden i izie wu den (SA), die Anzahl de Pep ide, die dem en sp echendem P o ein
zugeo dne we den konn en (PEP), sowie die In ensi ä mi de die Pep ide iden i izie wu den (INT). In g ün
sind die iden i izie en Condensin I-Un e einhei en da ges ell . In blau sind die We e de P oben de CapG-
mRFP1 P äzipi a ionen he o gehoben.
A
P o ein
Co e age
[%]
MW
[kDa]
SA
PEP
CapG
PEP
w1
INT
CapG
INT
w1
1
SMC4
48,8
160
2,2
198
1
126540000
0
2
SMC2
48,5
134
4,2
121
4
101560000
93326
3
CAPD2
37,5
158
3,5
158
1
84385000
25022
4
Hsc70-4
54,2
71
5,1
52
56
36548000
37354000
5
Ba en
34,6
83
5,2
34
0
29572000
0
6
S ess-sensi i e B
32,1
33
7,8
17
13
11578000
7376300
7
CG11700;CG32744;Ubi-p63E
22,6
34
5,4
22
20
4574000
3875400
8
be aTubulin 56D
45,4
50
5,7
33
60
4094900
31003000
9
Hsc70-3
25,8
72
5,0
18
17
4011800
3941500
10
polyA-binding p o ein
33,1
70
5,3
25
26
3823800
5736900
11
Yolk p o ein 3
26
46
6,7
15
14
3387200
4325100
12
Recep o o ac i a ed
p o ein kinase C 1
25,5
36
7,0
10
9
3236700
3220900
13
P o ein-L-isoaspa a
O-me hyl ans e ase
27
25
8,0
8
11
2749500
7217600
14
S uba is a
33,3
30
7,0
10
12
2597500
4642000
15
Ribosomal p o ein S2
15
29
7,3
6
8
2591400
4090400
16
Dacapo
6,1
27
5,5
10
10
2295500
1982100
17
alphaTubulin 84B
31,1
50
5,5
14
24
2258500
10668000
18
Yolk p o ein 2
30,3
52
6,5
17
15
2094400
2932200
19
CG8010
23
44
5,0
9
10
1798000
2724800
20
Ac in 5C
41,2
42
6,6
17
57
1660500
27681000
21
E 1alpha 48D
23,3
50
6,6
9
19
1653600
7225300
22
CLIP-190
20,9
189
2,3
2
47
1644500
4116600
23
Quemao
14,7
26
7,9
5
5
1541000
2027200
24
Jagua
32,2
144
3,7
14
89
1440200
22498000
25
Yolk p o ein 1
22,6
49
6,5
12
10
1386200
1991500
26
Rudimen a y
6,1
247
1,6
13
13
1331600
1576100
27
E 2b
10
94
5,0
9
4
1188700
478270
28
Cla h in hea y chain
17
191
3,0
15
26
1092100
3492100
29
T opomyosin 1
8,7
29
5,6
10
10
1037200
994390
30
CapG
5,8
154
3,6
11
0
971730
0
E gebnisse
71
B
P o ein
Co e age
[%]
[kDa]
SA
PEP
CapG
PEP
w1
INT
CapG
INT
w1
1
Hsc70-4
63,3
71
3,88
86
101
133400000
269390000
2
SMC2
52,2
134
5
105
0
101770000
0
3
SMC4
47,3
160
5,9
104
0
100370000
0
4
Zippe
65,1
237
5,5
160
537
76121000
118880000
0
5
E 1alpha 48D
39,1
50
3,27
39
47
63100000
73740000
6
be aTubulin 56D
57,9
50
3,46
83
51
58024000
35158000
7
CAPD2
34,4
158
5,76
85
0
56621000
0
8
Cul-2
56,8
87
4,04
49
64
34056000
60057000
9
Jagua
60,7
145
4,88
71
225
34039000
428380000
10
Ba en
41,5
83
4,52
58
0
33304000
0
11
P o ein in e ac ing wi h APP
ail-1
39,8
79
4,01
40
48
31463000
45880000
12
Yolk p o ein 3
68,3
46
3,52
46
55
28376000
90561000
13
Alpha Tubulin 84D
53,1
50
3,27
37
26
26099000
24056000
14
PolyA-binding p o ein
60,3
70
3,75
49
67
25549000
78034000
15
La a lamp
60,3
316
5,8
103
230
21780000
154450000
16
Hsc70-3
45,1
72
3,99
27
40
18853000
43022000
17
Ribosomal p o ein S2
50,6
29
2,07
18
26
16997000
46994000
18
S uba is a
60,7
35
2,87
20
25
16498000
44612000
19
S ess-sensi i e B
59,6
34
2,02
19
28
16205000
45981000
20
Didum
59,7
208
5,58
67
275
15956000
375100000
21
Quemao
38,8
28
2,1
22
19
15263000
33973000
22
Rack1
63,5
36
2,16
25
31
14793000
58550000
23
Yolk p o ein 2
50,9
50
3,48
34
61
14614000
72422000
24
Ma e nal exp ession a 31B
66,4
52
3,12
35
42
13635000
32885000
25
Yolk p o ein 1
43,7
49
3,88
45
67
13410000
53108000
26
Myosin 61F
53,1
121
4,61
34
131
12823000
134940000
27
T aile hi ch
38,8
69
4,04
23
28
11865000
21185000
28
DnaJ-like-2
44,7
45
3
19
15
10761000
8311900
29
Pon in
47,1
50
3,56
18
16
10504000
6327800
30
Hsp26
53,8
23
2
14
15
9501100
24070000
108
CapG
4,5
154
6
6
0
922630
0
Nach Dele ion de T e e mi nied ige Signi ikanz konn en 65 mögliche In e ak o en on gCapG-
mRFP in Emb yonalex ak en und 260 mögliche In e ak o en in den Ex ak en de O a ien
e hal en we den. Diese wu den schließlich nach de In ensi ä de in den P äzipi a en
de ek ie en Pep ide geo dne . Die Da en de jeweils 30 mi höchs e In ensi ä kop äzipi ie en
P o eine und die de Condensin-Un e einhei en sind in Tabelle 2 da ges ell . Pep ide de
Condensin-Ke nun e einhei en SMC4 und SMC2 sowie die de Condensin I-spezi ischen
Un e einhei en Ba en und CapD2 konn en konsis en zu du chge üh en Immunblo -Analyse
(Abbildung 21B) mi hohe Spezi i ä (co e age) und In ensi ä in den P äzipi a en de CapG-
mRFP1 en hal enden Ex ak e, nich abe in denen de Nega i kon olle iden i izie we den
(Tabelle 2, g ün ma kie ), was gene ell ü eine e ek i e P äzipi a ion du ch CapG-mRFP1
sp ich . Dem CapG selbs konn en une wa e e weise nu wenige Pep ide mi ge inge Spezi i ä
und In ensi ä zugeo dne we den. Fü die Massenspek ome ie wu den die P o eine in den
en sp echenden Gels ücken mi T ypsin in Pep ide geschni en und anschließend analysie . Wie
iele Pep ide so gene ie we den, und wie gu diese dann in de Massenspek ome ie
E gebnisse
72
iden i izie we den können, häng on de Aminosäu esequenz de en sp echenden P o eine
ab. Somi können nich alle P o eine gleich gu du ch diese Me hode p ozessie und iden i izie
we den. Wei e e P o eine, de en Pep ide mi hohe In ensi ä im P äzipi a de CapG-mRFP1
exp imie enden Emb yonen bzw. de CapG-mRFP1 O a ienex ak e iden i izie wu den, wu den
alle dings mi ähnlich hohe In ensi ä auch im P äzipi a de Nega i kon olle ge unden und sind
somi nich spezi isch. Pep ide de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapD3 und CapH2
konn en in de Gesam hei de in den P äzipi a en iden i izie en P o eine nich de ek ie
we den, was eine In e ak ion diese P o eine mi CapG in den un e such en löslichen Lysa en
unwah scheinlich mach .
Obwohl die Funk ionali ä des mRFP1-ma kie en CapG in de Fliege nachgewiesen we den
konn e, könn en spezi ische P o ein-P o ein-In e ak ionen du ch die C- e minale Fusion mi
mRFP1-Ma kie ung behinde sein. Dahe wu de auße dem eine Immunp äzipi a ion on CapG
aus w1-Emb yonen un e Ve wendung on Kaninchen-an i-CapG(N)-Sepha ose du chge üh .
Hie bei konn e eine Kop äzipi a ion de Condensin I-spezi ischen Un e einhei en CapD2 und
Ba en du ch das endogene CapG kla nachgewiesen we den, nich abe eine Kop äzipi a ion des
Condensin II-spezi ischen CapH2 (Abbildung 22).
Abbildung 22: CapH2 kann du ch das unma kie e,
endogene CapG nich p äzipi ie we den. Na i e
P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen
wu den du ch Immunp äzipi a ion mi Kaninchen-
an i-CapG(N)-Sepha ose bzw. An ikö pe - eie -
Sepha ose (Sepha ose) analysie . P oben de
P o einex ak e o Immunp äzipi a ion (INPUT), de
Übe s ände nach P äzipi a ion (ÜB) und de Elua e
nach P äzipi a ion (IP) wu den übe SDS-
Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . De
ange e ig e Blo wu de nacheinande mi Kaninchen-
an i-CapG(N), Kaninchen-an i-Ba en, Kaninchen-an i-
CapD2 und Ra e-an i-CapH2 An ikö pe n sondie .
CapG konn e sowohl im P o einex ak aus Emb yonen als auch aus O a ien in einem löslichen
Condensin I-Komplex e e en nachgewiesen we den, nich abe in einem löslichen Condensin
II-Komplex. Es konn en auße dem keine wei e en, bishe nich bekann en In e ak o en on CapG
iden i izie we den.
E gebnisse
73
2.2.2.2. Die P äzipi a ion Condensin II-spezi ische Un e einhei en kann auch du ch
SMC4 nich e eich we den
Die bishe du chge üh en Koimmunp äzipi a ionsexpe imen e weisen nich da au hin, dass
CapG in einem Condensin II-Komplex assemblie en kann. Al e na i könn e auch in D.
melanogas e ein bishe nich cha ak e isie es CapG2-P o ein exis ie en. Mögliche Kandida en
ü CapG2 könn en hie bei du ch Immunp äzipi a ion de Condensin-Ke nun e einhei SMC4 und
anschließende massenspek ome ische Analyse de P äzipi a e iden i izie we den.
Da in D. melanogas e eine Lokalisa ion und Funk ion de Condensin II-spezi ischen
Un e einhei en in de weiblichen Keimbahn gezeig we den konn e (Ha l e al., 2008a), soll e
eine P äzipi a ion eines Condensin II-Komplexes aus O a ienex ak en möglich sein. Dahe
wu de ein na i e P o einex ak aus O a ien he ges ell , in denen UASP-SMC4-EGFP II.1 bzw.
UASP-SMC4-EGFP III.1 un e Kon olle on α4 ub-Gal4-VP16 ek opisch exp imie wu den. Diese
Ex ak wu de du ch Immunp äzipi a ion un e Ve wendung on Kaninchen-an i-EGFP-
Sepha ose analysie . Obwohl die olls ändige biologische Funk ionali ä on SMC4 in
anshe e ozygo SMC4-mu an en Fliegen du ch Exp ession de UASP-SMC4-EGFP-T ansgene
nich e mi el we den konn e, wu de eine Lokalisa ion des EGFP-ma kie en SMC4 en lang de
zen alen Achse de Me aphase-Ch omosomen konsis en zu de des endogenen SMC4 bes ä ig
(Oli ei a, 2007). Im Immunblo konn e wei e hin eine Kop äzipi a ion de Condensin I-
spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 du ch SMC4-EGFP gezeig we den (Abbildung
23A), was insgesam da ü sp ich , dass das Fusionsp o ein dennoch e ek i in einem
Condensin-Komplex assemblie we den kann. Die Immunp äzipi a e wu den auße dem du ch
SDS-Gelelek opho ese au ge enn und anschließend kolloidal-Coomassie ge ä b . Da hie auch
in de Spu de Heißelu ion dis ink e Banden kenn lich wa en (Abbildung 23B, IP Heiß), wu den
die Spu en de P äzipi a e beide Elu ionssch i e in Be eiche au ge eil , und die Gesam hei de
Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie (Abbildung 23B, o e
Käs chen). Da be ei s im o he igen Expe imen eine Analyse des P äzipi a s de
Nega i kon olle o genommen wu de, wu de diese hie nich analysie .
Die Massenspek ome ie und P imä analyse de Da en wu den analog zum o ausgegangenen
Expe imen o genommen. Die Lis e de insgesam 731 iden i izie en P o eine de P äzipi a e
wu de wie be ei s besch ieben on mi p ozessie . Eine alphabe isch geo dne e Tabelle de
e bliebenen 278 po en iellen SMC4-In e ak o en is im Anhang da ges ell (EGFP-SMC4-O a ien
O bi_0231). Diese P o eine wu den schließlich nach de In ensi ä de in den P äzipi a en
E gebnisse
80
Die Condensin-Ke nun e einhei en SMC2 und SMC4 konn en du ch beide CapH2-
Fusionsp o eine p äzipi ie we den, alle dings nich mi höchs e P io i ä (Tabelle 4, g ün
ma kie ). E en uell konn e eine P äzipi a ion on SMC2 und SMC4 du ch das Übe angebo an
CapH2 hie s imulie ode soga e zwungen we den. Un e de Gesam hei de p äzipi ie en
P o eine inden sich keine ü CapG spezi ischen Pep ide, was ein e neu e Hinweis da au is ,
dass CapG nich in beiden Condensin-Komplexen assoziie en kann. Beme kenswe e weise wa
auch CapD3 un e den insgesam 1280 iden i izie en P o einen nich e e en, was eine
In e ak ion on CapD3 und CapH2 an sich und im Rahmen eines Condensin II-Komplexes,
zumindes in löslichen Ex ak en aus O a ien, wiede um in F age s ell .
Wei e hin wu de un e such , ob ein bishe nich iden i izie es CapG2 du ch CapH2 p äzipi ie
we den konn e. Die be ei s iden i izie en CapG2 P o eine höhe e Ve eb a en haben ein
Molekula gewich on ca. 100 kDa und en hal en cha ak e is ische HEAT-Repea -Domänen. Die
in den P äzipi a en on CapH2 iden i izie en P o eine wu den dahe nach ih em
Molekula gewich so ie und en sp echende Kandida en du ch NETPHOS und SCANSITE
analysie . So konn e die Exis enz on HEAT-Domänen und wei e en S uk u elemen en, bzw.
Sequenzhomologien zu bekann en P o einen un e such we den. Es konn e hie nu ein HEAT-
Domänen en hal endes P o ein he ausgea bei e we den (CG32164), welches alle dings eine
signi ikan e Homologie zu Impo inen abe keine Ve wand scha zu CapG2-Ve e e n au weis .
Auße dem s ell sich die F age, ob un e den gewähl en expe imen ellen Bedingungen eine
P äzipi a ion on CapG2 du ch CapH2 e wa e we den kann, wenn auch keine P äzipi a ion on
CapD3 du ch CapH2 e eich wu de.
Du ch die Immunp äzipi a ionen einzelne Condensin-Un e einhei en konn e die Exis enz eines
löslichen Condensin I-Komplexes in de Fliege nachgewiesen we den. Es konn en hingegen keine
Hinweise au eine Assozia ion on CapG in einem Condensin II-homologen Komplex e hal en
we den. Da auch nich alle e wa e en In e ak ionen de Komponen en des Condensin II-
Komplexes nach ollzogen we den konn en, muss die Exis enz und Rele anz eines löslichen
Condensin II-Komplexes in D. melanogas e in F age ges ell we den.

E gebnisse
81
2.2.2.4. Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des
RNA-silencing Signalweges kann nich bes ä ig we den
E s kü zlich konn e in D. melanogas e eine Funk ion de RNA-Helikase Vasa wäh end de
Mi ose gezeig und ein Modell ü die Regula ion des Condensin I-Komplexes du ch
Komponen en des piRNA-Signalwegs in de weiblichen Keimbahn au ges ell we den (Pek und
Kai, 2011). Die Au o en konn en eine di ek e In e ak ion on Vasa mi den Condensin I-
spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2, nich abe mi CapD3 zeigen. Auch du ch die hie
du chge üh en massenspek ome ischen Analysen konn en in den P äzipi a en de Condensin-
Un e einhei en Komponen en des RNA-silencing Signalweges iden i izie we den, alle dings
nich mi hohe P io i ä (siehe Tabellen im Anhang, en sp echende Da en sind g au
he o gehoben).
Die In e ka ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-silencing Signalweges
wu de du ch eine Immunblo -Analyse de P äzipi a e einzelne Condensin-Un e einhei en un e
Ve wendung on An ikö pe n, welche gegen die RNA-silencing-Komponen en Vasa und
A gonau e 2 (Ago2) ge ich e sind, wei e üh end übe p ü . Hie zu wu den na i e
P o einex ak e aus gCapG-EGFP und gCapG-mRFP1 exp imie enden Emb yonen mi els
Immunp äzipi a ion, un e Ve wendung eine en sp echend An ikö pe -gekoppel en Sepha ose,
analysie . Auße dem wu den UASP-SMC4-EGFP III.1 und UASP-EGFP-CapH2 II.4 e mi el du ch
ubP-Gal4 in O a ien übe exp imie und P o eine de na i en Ex ak e aus diesem Gewebe
du ch an i-EGFP-Sepha ose immunp äzipi ie . Zu Kon olle wu de eine sei s ein Ex ak aus
EGFP-Pch2 exp imie enden Emb yonen he ges ell und mi els Immunp äzipi a ion un e
Ve wendung on an i-EGFP-Sepha ose analysie . Ande e sei s wu de ein na i e P o einex ak
aus wild ypischen (w1) Emb yonen he ges ell und diesem o de Immunp äzipi a ion du ch
an i-mRFP1-Sepa ose, bak e iell exp imie es mRFP1-P o ein zugese z . Die P äzipi a e wu den
du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und im Immunblo mi an i-SMC2, an i-Vasa und an i-
Ago2-An ikö pe n sondie (Abbildung 26).
Fü CapG-EGFP, CapG-mRFP1 und SMC4-EGFP konn e de E olg de Kop äzipi a ion du ch den
Nachweis de P äzipi a ion on SMC2 bes ä ig we den. Eine e gleichba e ek i e P äzipi a ion
on SMC2 du ch EGFP-CapH2 konn e hingegen nich gezeig we den. Diese Ta sache bes ä ig ,
dass die In e ak ionen zwischen den einzelnen Un e einhei en inne halb eines Condensin I-
Komplexes wesen lich s ingen e sind, als die inne halb de Condensin II-Komplexe. Fü Vasa
konn e eine gewisse P äzipi a ion be ei s du ch EGFP-Pch2 beobach e we den, was au eine
unspezi ische In e ak ion des P o eins mi de EGFP-Ma kie ung ode abe de eingese z en
E gebnisse
82
A ini ä sma ix hinweis . Eine me klich spezi ische Kop äzipi a ion on Vasa konn e alle dings
du ch keine de Condensin-Un e einhei en e eich we den. Auch eine In e ak ion on Ago2 mi
den hie eingese z en Condensin-P o einen wu de du ch dieses Expe imen nich bes ä ig .
Eine physikalische In e ak ion on SMC4, CapG ode CapH2 mi den RNA-silencing Komponen en
Vasa und Ago2 konn e somi nich e i izie we den, wodu ch in diese A bei keine Hinweise
au eine mögliche Regula ion de Condensin-Komplexe du ch den RNA-silencing Signalweg
e hal en we den konn en.
Abbildung 26: Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-silencing
Signalweges konn e nich bes ä ig we den. A) Na i e P o einex ak e aus EGFP-CapH2 (UASP-EGFP-CapH2
II.4/+; ubP-Gal4/+) und SMC4-EGFP (UASP-EGFP-SMC4 III.1/ ubP-Gal4) en hal enden O a ien, sowie aus 3-6
S unden al en Emb yonen des Geno yps (gCapG-EGFP III.1/TM3,Se ) wu den du ch Kaninchen-an i-EGFP-
Sepha ose immunp äzipi ie . Als Nega i kon olle wu den P o eine aus Ex ak en on 3-6 S unden al en
Emb yonen des Geno yps s yα-Gal4, UAS-EGFP-Pch2 analog p äzipi ie . B) Ein na i e P o einex ak on 3-6
S unden al en Emb yonen des Geno yps (gCapG-mRFP1/TM3,Se ) wu de du ch Kaninchen-an i-mRFP1-
Sepha ose p äzipi ie . Als Nega i kon olle wu de einem Ex ak aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen
bak e iell exp imie es mRFP1 zugese z und dieses analog p äzipi ie . Na i e P o einex ak e o P äzipi a ion
(INPUT), Übe s ände nach P äzipi a ion (ÜB) und P äzipi a e nach Heißelu ion mi SDS-P obenpu e (IP)
wu den du ch Immunblo en un e Ve wendung on Kaninchen-an i-EGFP-An ikö pe n, Kaninchen-an i-
mRFP1-An ikö pe n, Kaninchen-an i-SMC2-An ikö pe n, Ra e-an i-Vasa-An ikö pe n und Maus-an i-Ago2-
An ikö pe n analysie .
2.2.3. In i o Assay zu Analyse de In e ak ionen einzelne Condensin-Un e einhei en
Une wa e e weise konn e du ch die bishe igen E gebnisse keine s ingen e In e ak ion de
Condensin II-Komponen en gezeig we den, was die Exis enz eines löslichen Condensin II-
Komplexes in D. melanogas e insgesam in F age s ell . Um di ek e In e ak ionen de
Un e einhei en in einem möglichen Condensin II-Komplex in einem wei e en unabhängigen
expe imen ellen Ansa z nachzu ollziehen, wu de basie end au den Expe imen en de
A bei sg uppe on Hi ano (Onn e al., 2007), ein in i o In e ak ionsassay e ablie . Hie bei
E gebnisse
83
wu den einzelne Condensin-Un e einhei en in i o ansk ibie und ansla ie und de en
di ek e In e ak ion du ch anschließende Koimmunp äzipi a ionsexpe imen e un e such .
2.2.3.1. In e ak ionen de Condensin I-Komponen en we den im in i o Assay bes ä ig
Vo e s wu de die Funk ionali ä des in i o Assays anhand de be ei s besch iebenen
In e ak ionen de Condensin I-Un e einhei en in D. melanogas e gep ü . In den olgenden
Expe imen en wu de mi dem SP6-gekoppel en-Re ikulozy enlysa -Sys em on P omega
gea bei e , um die kodie enden Be eiche ü die en sp echenden Condensin-Un e einhei en
ansk ibie en und ansla ie en zu können. Es wu de eine C- e minale His-Flag-Ma kie ung an
Ba en (Ba en-HFHF) ange üg , um eine P äzipi a ion du ch Maus-an i-Flag-Aga ose zu
e möglichen. Eine an en sp echende Posi ion ange üg e EGFP-Ma kie ung des P o eins konn e
in de Fliege als unk ionell besch ieben we den (Oli ei a e al., 2007). Als Nega i kon olle
wu de eine His-Flag-ma kie e Va ian e des humanen Secu ins e wende , welches nich mi den
Condensin-Un e einhei en in e agie en soll e. Un e schiedliche Kombina ionen de einzelnen
Kons uk e wu den im Lysa ko ansk ibie , in Gegenwa on [35S]Me hionin ko ansla ie und
eine Koimmunp äzipi a ion un e zogen. Es wu den Aliquo s de Reak ionen o de
P äzipi a ion, om Übe s and nach P äzipi a ion und om Elua de P äzipi a ion du ch SDS-
Gelelek opho ese und übe anschließende Au o adiog a ie analysie . Hie bei konn e eine
P äzipi a ion on CapG und CapD2 du ch Ba en-HFHF gezeig we den (Abbildung 27).
Des Wei e en wu de die In e ak ion de Kleisin-Un e einhei en Ba en und CapH2 mi de
Condensin-Ke nun e einhei SMC4 un e such . Hie bei wu de eine C- e minale His-Flag-
Ma kie ung analog zu de on Ba en an CapH2 usionie . Nach Du ch üh en des be ei s
besch iebenen In e ak ions-Assays konn e eine P äzipi a ion on SMC4 du ch Ba en-HFHF
gezeig we den (Abbildung 27). Auch CapH2-HFHF is in de Lage, SMC4 zu p äzipi ie en, nich
abe mi e gleichba e E ek i i ä . Ba en schein also s ingen e mi SMC4 in e agie en zu
können als CapH2 mi SMC4.
Mi dem e wende en Assay wa es somi möglich, In e ak ionen de Condensin-Un e einhei en
on D. melanogas e in i o zu ekons uie en. Diese In e ak ionen en sp echen den be ei s
e ablie en Modell o s ellungen de Condensin-Komplexe (Onn e al., 2007). De Assay kann
somi zu wei e üh enden In e ak ionss udien de Condensin-Un e einhei en eingese z we den.
E gebnisse
84
Abbildung 27: E ablie ung eines in i o Assays zu In e ak ionsanalyse de Condensin Un e einhei en. Die
angegebenen P o einkombina ionen wu den in i o ko ansk ibie und in Gegenwa on [35S]Me hionin
ko ansla ie . Die Reak ionen wu den un e Ve wendung on Maus-an i-Flag-Aga ose (Sigma)
immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and nach P äzipi a ion (ÜB) und
Elua e nach P äzipi a ion (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und du ch Au o adiog a ie
analysie .
2.2.3.2. CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3
Du ch den e ablie en In e ak ions-Assay konn e wei e hin un e such we den, ob CapG di ek
mi CapH2 beziehungsweise CapD3 in e agie en kann. Es wu den die His-Flag-ma kie en
Kons uk e ü Ba en und CapH2 e wende , ü die be ei s eine Kop äzipi a ion on SMC4
gezeig we den konn e. Auße dem wu de auch in diesem Expe imen das His-Flag-ma kie e
humane Secu in als Nega i kon olle he angezogen. Da CapH2 und CapG bei SDS-
Gelelek opho ese eine ähnliche Mig a ion au weisen, wu den die Un e einhei en zunächs
einzeln ansk ibie und ansla ie . [35S]Me hionin wu de hie bei nu zu Ma kie ung on CapG
eingese z . Die einzelnen Reak ionen wu den gemisch und di ek du ch Maus-an i-Flag-Aga ose
p äzipi ie . Aliquo s de Reak ionsgemische o P äzipi a ion, de Übe s ände nach P äzipi a ion
und de Elua e nach P äzipi a ion wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und
zunächs geblo e . Die E izienz de P äzipi a ionen konn e du ch die Ve wendung on
Kaninchen-an i-Flag An ikö pe n zu Iden i ika ion de Flag-ma kie en P o eine im Immunblo
gezeig we den (Abbildung 28A). Im P äzipi a de Reak ion on Ba en-HFHF und CapG i
neben de e wa e en Bande on Ba en-HFHF noch eine wei e e Bande en sp echend des
Molekula gewich s on Secu in-HFHF au (Abbildung 28A). Da diese Reak ion kein Secu in-HFHF
zugegeben wu de (INPUT), soll e es sich hie bei um ein Abbaup oduk on Ba en-HFHF handeln.
Die Au o adiog a ie des Blo s zeig wei e hin, dass CapG du ch Ba en-HFHF kop äzipi ie
we den konn e, nich abe du ch CapH2-HFHF (Abbildung 28A).
E gebnisse
85
Um eine mögliche In e ak ion on CapG und CapD3 zu un e suchen, wu de ein N- e minal
6xmyc-ma kie es CapD3 eingese z . Ebenso wu de die In e ak ion on CapG und CapD2
un e such . CapD2 wu de analog du ch eine N- e minale 6xmyc-Ma kie ung gekennzeichne . Fü
ein an en sp echende Posi ion EGFP-ma kie es Fusionsp o ein wa be ei s eine biologische
Funk ionali ä in de Fliege gezeig wo den (Fische , 2010). Als Nega i kon olle wu de hie die
N- e minal 6xmyc-ma kie e ka aly ische Un e einhei de humanen Phospha ase PP2A
(PP2A(C)) e wende . Die einzelnen Un e einhei en wu den auch in diesem Expe imen zunächs
indi iduell ansk ibie und ansla ie , gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-myc-
Sepha ose p äzipi ie . Die In e ak ionsanalyse e olg e auch hie du ch SDS-Gelelek opho ese
und Wes e nblo , ge olg du ch einem Nachweis mi Maus-an i-myc-An ikö pe n. Hie bei konn e
eine wenig s ingen e Kop äzipi a ion on CapG du ch myc-CapD2 nich abe du ch myc-CapD3
bzw. myc-PP2A(C) nachgewiesen we den (Abbildung 28B).
Abbildung 28: CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3. CapG wu de in Gegenwa on [35S]Me hionin in
i o ansla ie . Die angegebenen Epi op-ma kie en P o eine wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in
Abwesenhei on [35S]Me hionin. Die Reak ionen wu den gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-Flag-
Aga ose (A) bzw. Kaninchen-an i-myc-Aga ose (B) immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion
(INPUT), Übe s and (ÜB) und Elua e de P äzipi a e (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und
geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ionen zu bes immen, wu den die Wes e nblo s zunächs mi
Kaninchen-an i-Flag (A) bzw. Maus-an i-myc (B) An ikö pe n sondie . Du ch die anschließende Au o adiog a ie
(AR) de Blo s konn e die Kop äzipi a ion on CapG un e such we den.
Un e den gewähl en expe imen ellen Bedingungen konn e eine di ek e In e ak ion on CapG
mi den Condensin I-spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2, nich abe mi denen des
Condensin II-Komplexes gezeig we den. Eine di ek e Assemblie ung on CapG inne halb eines
Condensin II-Komplexes schein somi wei e unwah scheinlich.

E gebnisse
86
2.2.3.3. Die di ek e In e ak ion on CapH2 und CapD3 is im in i o Assay nachweisba
Eine zen ale F age, die du ch den in i o In e ak ions-Assay bean wo e we den soll e, is die
de In e ak ions ähigkei de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und CapD3. Um
diese F age nachzugehen, wu den die zu un e suchenden P o eine myc-CapD3 und CapH2
zunächs ge enn ansk ibie und ansla ie . [35S]Me hionin wu de wiede um nu zum
Ma kie en de möglichen In e ak o en eingese z . Die myc-ma kie e ka aly ische Un e einhei
de humanen PP2(A) wu de e neu als Nega i kon olle he angezogen. Als wei e e
Nega i kon olle soll e die P äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD3 dienen. Die P äzipi a ion
e olg e un e Ve wendung on Kaninchen-an i-myc-Aga ose. En nommene P oben wu den
du ch SDS-Gelelek opho ese und anschließendem Wes e nblo un e Ve wendung on Maus-
an i-myc-An ikö pe n analysie . Danach wu de eine Au o adiog a ie des Blo s du chge üh .
Es konn e eine Kop äzipi a ion on CapH2 du ch myc-CapD3 gezeig we den. Ebenso wu de eine
Kop äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD3 nachgewiesen. Ba en konn e alle dings auch
du ch myc-PP2(A) p äzipi ie we den (Abbildung 29A). Eine spezi ische In e ak ion on Ba en
mi de hie eingese z en ka aly ischen Un e einhei de humanen PP2A(C) konn e du ch
Ve wendung eine wei e en Kon olle ausgeschlossen we den. So wu de eine e gleichba e
Kop äzipi a ion on Ba en auch du ch ein N- e minal myc-ma kie es Kons uk de humanen
Kohäsin-Un e einhei Scc1 un e Ve wendung eine Maus-an i-myc-Sepha ose beobach e
(Da en nich gezeig ), was insgesam au eine unspezi ische In e ak ion on Ba en mi den
eingese z en A ini ä sma izes ode mi dem myc-Epi op de P o eine hinweis . Die Spezi i ä
de In e ak ion on Ba en und CapD3 muss somi in F age ges ell we den.
In einem wei e en Expe imen wu de die Kop äzipi a ion on CapD3 du ch die be ei s
e wende en C- e minal His-Flag-ma kie en P o eine CapH2 und Ba en un e such . Es wu de
auch ein N- e minal-Flag ma kie es CapH2 e wende , um mögliche Beein äch igungen de
P o einin e ak ionen du ch die C- e minale Ma kie ung auszuschließen. Ein an en sp echende
Posi ion EGFP-ma kie es P o ein konn e un e Punk 2.2.2.3. als unk ionell besch ieben
we den. Als Nega i kon ollen wu den das His-Flag-ma kie e humane Secu in und das His-Flag-
ma kie e Ba en eingese z . Die einzelnen Un e einhei en wu den auch in diesem Expe imen
zunächs indi iduell ansk ibie und ansla ie , gemisch und un e Ve wendung on Maus-
an i-Flag-Sepha ose kop äzipi ie . Die In e ak ionsanalyse e olg e du ch SDS-Gelelek opho ese
und anschließendem Wes e nblo du ch Ve wendung on Kaninchen-an i-Flag-An ikö pe n. In
de Au o adiog a ie des Blo s kann eine Kop äzipi a ion on CapD3 be ei s du ch Secu in
E gebnisse
87
beobach e we den (Abbildung 29B), was au eine gewisse unspezi ische In e ak ion on CapD3
mi de eingese z en A ini ä sma ix ode de His-Flag-Ma kie ung hinweis . Eine s ingen e e
Kop äzipi a ion on CapD3 kann du ch das C- e minal His-Flag-ma kie e CapH2-Kons uk , abe
auch du ch Ba en-HFHF nachgewiesen we den (Abbildung 29B).
Abbildung 29: In e ak ionen de Condensin II spezi ischen Un e einhei en. A) Myc-PP2A(C), CapH2 und Ba en
wu den in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ansla ie . Myc-CapD3 wu de ebenso in i o ansla ie ,
alle dings in Abwesenhei on [35S]Me hionin. B) CapD3 wu de in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o
ko ansla ie . Die angegebenen Flag-ma kie en P o eine wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in
Abwesenhei on [35S]Me hionin. Die Reak ionen wu den en sp echend gemisch und un e Ve wendung on
Maus-an i-myc-Sepha ose (A) bzw. Maus-an i-Flag-Aga ose (B) immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o
P äzipi a ion (INPUT), Übe s and (ÜB) und Elu ion (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und
geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ion zu bes immen, wu den die Wes e nblo s zunächs mi
Maus-an i-myc (A) bzw. Kaninchen-an i-Flag-An ikö pe n (B) sondie . Du ch die Au o adiog a ie (AR) de Blo s
konn e eine mögliche Kop äzipi a ion de adioak i ma kie en Un e einhei en un e such we den.
Zusammen assend konn e im e wende en in i o Assay eine di ek e In e ak ion on CapH2 und
CapD3 gezeig we den. Wei e hin wu de auch eine une wa e e In e ak ion de Condensin I-
Un e einhei Ba en mi de Condensin II-Un e einhei CapD3 beobach e , de en Spezi i ä
alle dings nich kla he ausgea bei e we den konn e.
2.2.3.4. Die Bildung eines e nä en Komplexes is nu du ch Condensin I-spezi ische
Un e einhei en e möglich
Im Gegensa z zu P äzipi a ion on CapH2 aus Geweben de Fliege, konn e im in i o Assay eine
In e ak ion on CapH2 und CapD3 nachgewiesen we den. Ebenso konn en du ch den Assay
une wa e e In e ak ionen zwischen Condensin I und Condensin II-spezi ischen Un e einhei en
E gebnisse
88
gezeig we den. Es s ell sich nun abe die F age, ob diese in i o In e ak ionen nu du ch das
geziel e Zusammenb ingen einzelne Un e einhei en e möglich sind ode auch eine
physiologische Rele anz haben. Diese F age könn e du ch die in i o Rekons i u ion e nä e
Komplexe bean wo e we den. Nach de bishe igen Modell o s ellung wi d eine In e ak ion
on CapD2/CapD3 mi de Ke nun e einhei SMC4 du ch die Kleisine Ba en/CapH2 e b ück .
Im olgenden Ve suchsansa z wu de demzu olge un e such , ob du ch die Gegenwa de
Kleisine eine Kop äzipi a ion on SMC4 du ch die myc-ma kie en P o eine CapD2
beziehungsweise CapD3 e b ück we den kann.
Abbildung 30: Die In e ak ion on CapD2 und SMC4 wi d du ch Ba en s imulie . SMC4, CapH2 und Ba en
wu den in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ko ansla ie . Die myc-ma kie en P o eine myc-CapD2 (A)
und myc-CapD3 (B) wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in Abwesenhei on [35S]. Die Reak ionen
wu den en sp echend gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-myc-Sepha ose immunp äzipi ie .
P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and (ÜB) und Elu ion (IP) wu den übe SDS-
Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ion zu bes immen, wu den
die Wes e nblo s wu den zunächs mi Maus-an i-myc An ikö pe n sondie . Du ch die Au o adiog a ie de
Blo s (AR) konn e eine mögliche Kop äzipi a ion de adioak i ma kie en Un e einhei en un e such we den.
Die eingese z en P o eine wu den wiede um ge enn ansla ie , anschließend gemisch und
eine P äzipi a ion an Maus-an i-myc-Sepha ose un e zogen. Die E izienz de P äzipi a ionen
wu de du ch Wes e nblo s un e Ve wendung on Maus-an i-myc-An ikö pe n gezeig . In
Abbildung 30A sind in allen P äzipi a en (IP) Banden im Molekula gewich sbe eich on myc-
PP2A(C) e kennba . Da diesen Reak ionen kein myc-PP2A(C) zugese z wu de (INPUT), soll e es
sich hie bei um Abbaup oduk e on myc-CapD2 handeln. Die Au o adiog a ie beide Blo s
mach wiede um eine gewisse Kop äzipi a ion on Ba en du ch die Nega i kon olle myc-
E gebnisse
89
PP2A(C) deu lich. Ve glichen zu diese unspezi ischen P äzipi a ion kann alle dings eine s a ke
Kop äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD2 (Abbildung 30A), nich abe du ch myc-CapD3
(Abbildung 30B) beobach e we den. Ebenso wu de die Bildung eines e nä en Komplexes
zwischen myc-CapD2, Ba en und SMC4 e möglich (Abbildung 30A), was de bishe igen
Modell o s ellung eines Condensin I-Komplexes en sp echen wü de. Eine nachweisba e
P äzipi a ion on SMC4 du ch myc-CapD3 konn e du ch Ba en nich e b ück we den
(Abbildung 30B). Auch CapH2 wu de du ch myc-CapD2 p äzipi ie , konn e abe keine
nachweisba e In e ak ion mi SMC4 e mi eln (Abbildung 30A). Ebenso konn e du ch die wenig
s ingen e In e ak ion on CapH2 mi CapD3 keine, dem Modell des Condensin II-Komplexes
en sp echende, P äzipi a ion mi SMC4 e b ück we den.
In den du chge üh en Expe imen en konn e die bishe ige Modell o s ellung des Condensin I-
Komplexes auch in de Fliege bes ä ig we den. Es wu de ebenso eine schwache di ek e
In e ak ion de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und CapD3 gezeig .
Übe aschend wu de eine e gleichsweise schwache In e ak ion auch zwischen Condensin I und
Condensin II-spezi ischen Komponen en beobach e . Da die Bildung eines e nä en Komplexes
on SMC4, CapH2 und CapD3 jedoch nich s imulie we den konn e, muss die Exis enz eines
löslichen Condensin II-Komplexes in D. melanogas e e neu in F age ges ell we den.
Diskussion
96
emb yonalen zygo ischen Exp ession bis hin zum adul en S adium gewäh leis e we den. Diese
Ta sache läss da au schließen, dass die Ch oma inassozia ion on CapG o dem NEBD
wäh end diese En wicklungss adien nich essen iell ü dessen P o ein unk ion is und auch
nich am Zen ome ini iie we den muss. Vielmeh konn e eine seh schnelle und o allem
gleichmäßige Anlage ung on CapGNM-EGFP en lang de gesam en Ch omosomen gezeig
we den.
Es wu de be ei s nachgewiesen, dass CapD2 und Ba en zum Zei punk des NEBD e wa
halbmaximal am Ch oma in angelage sind (Fische , 2010; Oli ei a e al., 2007). So könn e die
Assemblie ung eines P ä-Condensin-Komplexes wäh end de P ophase in Abwesenhei on CapG
s a inden und CapGNM-EGFP dann nach dem NEBD di ek en lang de gesam en Ch omosomen
an diesem P ä-Komplex assemblie en. Al e na i wä e eine Beladung des gesam en Condensin-
Komplexes, de schon im Zy oplasma assemblie sein könn e, e s nach dem NEBD e möglich .
Diese wä e dann nich meh am Zen ome ini iie . Die Lokalisa ion on CapGNM-EGFP wu de in
den hie du chge üh en Expe imen en du ch eine α4 ub-Gal4-VP16 e mi el e Exp ession des
UAST-CapGNM-EGFPIII.2 T ansgens in CapG-wild ypischen Fliegen analysie . Die e spä e e
Lokalisa ion on CapGNM-EGFP könn e dahe auch en lang de Ch omosomena me an
assemblie e Condensin-Komplexe du ch einen Aus ausch on be ei s Condensin-gebundenem
endogenen CapG mi ungebundenem CapGNM-EGFP e olgen. Du ch FRAP-Analysen wu de
alle dings gezeig , dass CapG ech s abil am Ch oma in assoziie bleib und nu e wa 17,5% des
P o eins wäh end de Me aphase gegen mobiles CapG ausge ausch we den (Naga ka , 2010).
Um abschließend es zus ellen, ob eine Beladung on CapG übe das Zen ome s a inden
muss, soll e die Assozia ion on CapGNM-EGFP am Ch oma in in CapG-mu an en
Fliegenemb yonen wäh end de Mi ose 16 un e such we den, wenn die ma e nale Kon ibu ion
des endogenen CapG au geb auch is . In diesen Emb yonen könn e du ch die Analyse de
Ch oma inassozia ion ande e Epi op-ma kie e Condensin-Un e einhei en auch geklä
we den, ob de en ini iale Ch oma inbeladung auch ohne CapG am Zen ome ini iie we den
kann.
3.6. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el e
Ve zöge ung de Mi ose
Obwohl dem Condensin eine wesen liche Rolle bei de S uk u ie ung des Zen ome be eichs
de Ch omosomen zugesp ochen wi d (siehe 1.3.5), is die Ak i ie ung des SAC nach Mu a ion
de Condensin-Un e einhei en aglich. Wäh end in S. ce e isiae eine Ak i ie ung und

Diskussion
97
Au ech e hal ung des SAC in Condensin-Mu an en s a inde (Yong-Gonzalez e al., 2007), is
die E hal ung de SAC-Ak i i ä in SMC2-deple ie en Humanzellen nich gewäh leis e
(Samoshkin e al., 2009). Im hie du chge üh en Expe imen konn e eine Ak i ie ung des SAC
nich nach Ab eiche ung de Condensin-Un e einhei en, sonde n du ch ek opische Exp ession
e kü z e F agmen e on CapG zusä zlich zu dem endogenen CapG beobach e we den.
Wäh end CapGNM-EGFP im Condensin-Komplex angelage we den kann, könn e eine
Assemblie ung de e kü z en F agmen e im Condensin-Komplex nich e möglich sein.
Konsis en hie zu konn en SMC2, SMC4, Ba en und CapD2 du ch CapGNM-EGFP, nich abe
du ch CapGNM4-EGFP p äzipi ie we den. So könn en die e kü z en CapGNM-EGFP-F agmen e
nach ek opische Exp ession in de Zelle ange eiche o liegen und dominan -nega i e E ek e
he o u en. Es wu de be ei s eine di ek e In e ak ion de Zen ome -spezi ischen
His onkomponen e CID mi CapG gezeig , die haup sächlich du ch den N- e minalen Be eich on
CapG e mi el wi d (Jäge e al., 2005). De Einbau on CID in das zen ome e Ch oma in, de
be ei s wäh end de Me aphase s a inden kann (Mellone e al., 2011), könn e hie bei du ch
eine In e ak ion mi den e kü z en CapGNM-EGFP F agmen e behinde sein. Demzu olge könn e
das zen ome e Ch oma in ehle ha de inie we den und le z lich eine Si ua ion en s ehen, die
eine Ak i ie ung des SAC he o u . Al e na i könn en du ch wei e e dominan -nega i e
E ek e, Komponen en, die zu Regula ion de SAC-P o eine nö ig sind, behinde we den. De
e zöge en Me aphase schloss sich alle dings eine appa en no male Anaphase an. Es konn en
somi keine wei e en zy ologischen E ek e nach Übe exp ession de e kü z en CapG-
F agmen e beobach e we den. Alle dings wu den nach gewebsspezi ische ek opische
Exp ession diese F agmen e im sich en wickelnden Auge du chaus o ensich liche Phäno ypen
e zeichne (F ank, 2008).
3.7. CapG lieg in de Fliege in e schiedenen Iso o men o , welche gleiche maßen du ch
Phospho ylie ung egulie we den
In P o einex ak en aus wild ypischen Emb yonen und O a ien konn en im Immunblo jeweils
zwei Banden im e wa e en G ößenbe eich on CapG de ek ie we den, die nich au
al e na i e Spleiße eignisse de CapG-p ä-mRNA zu ückzu üh en sind. Es konn e alle dings
wede eine Zellzyklus-spezi ische Funk ion noch eine un e schiedliche Phospho-Regula ion de
beiden Iso o men in Emb yonen nachgewiesen we den. In P o einex ak en aus Hoden konn e
im Immunblo hingegen nu eine Bande ü CapG nachgewiesen we den, welche wiede um
einen modi izie en Gellau e glichen zu den Iso o men de Emb yonen und O a ien au weis .
Diskussion
98
In de Fliege soll en also e schiedene Iso o men on CapG o liegen, welche au eine
Modi ika ion des P o eins be uhen. Beach lich is hie bei, dass die en sp echende Modi ika ion
in Emb yonen und O a ien eine e höh e Mobili ä on CapG wäh end de SDS-
Gelelek opho ese he o u . So könn e CapG beispielsweise p o eoly isch p ozessie we den.
Eine en sp echende P ozessie ung soll e alle dings in e n s a inden, da die Doppelbande zum
einen du ch polyklonale An ikö pe de ek ie we den kann, welche gegen den N-Te minus on
CapG gene ie wu den (Kaninchen-an i-CapG(N)). Zum ande en we den auch C- e minale CapG-
Fusionsp o eine du ch An ikö pe , welche gegen die C- e minale Ma kie ung ge ich e sind, als
Doppelbande de ek ie . Auch ü das cDNA-basie e CapGNM-EGFP, nich abe CapGFL-EGFP,
konn e sowohl du ch Sondie ung mi an i-EGFP als auch mi an i-CapG(N) An ikö pe n, eine
Doppelbande im Immunblo nachgewiesen we den. Wü de bei dem kleine en CapGNM-EGFP eine
analoge hypo he ische p o eoly ische P ozessie ung o liegen wie bei dem genomischen
Kons uk olle -Länge, wü de man e wa en, dass de Abs and de beiden P o einbanden im
Gel e g öße wi d. De Abs and beide CapGNM-EGFP Banden is alle dings ge inge als de , de
beiden Banden des endogenen CapG, was wiede um gegen eine p o eoly ische Modi ika ion on
CapG sp ich . Da die gene ie en UAST-CapGNM-EGFP-T ansgeninse ionen die P o ein unk ion
on CapG om Beginn de emb yonalen zygo ischen Exp ession bis hin zum adul en S adium
besse komplemen ie en können als die UAST-CapGFL-EGFP-T ansgeninse ionen, könn e die
besag e Modi ika ion dennoch einen Ein luss au die Funk ionali ä on CapG haben. Die
molekula e G undlage diese Modi ika ion soll e dahe in wei e üh enden Expe imen en nähe
un e such we den.
3.8. Lokalisa ion und Funk ion on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen
Es konn e eine spezi ische Lokalisa ion on CapG in den Ke nen de Zellen des Ge ma iums, de
Näh zellen, de Follikelzellen und auch de G enzzellen gezeig we den, was au eine Funk ion
des P o eins in diesen Zellke nen hinweis . Auße dem sind Weibchen, welche UAST-CapGNM-
EGFP (CapGNM-Rescue) ode auch UAST-CapGFL-EGFP (CapGFL-Rescue) als alleinig unk ionelle
CapG-Allele e mi el du ch da-Gal4 exp imie en s e il, was da au zu ückzu üh en is , dass
UAST-Kons uk e in de weiblichen Keimbahn nich exp imie we den (B and und Pe imon,
1993; Ro h, 1998). Da in diesen Weibchen jedoch die Exp ession on CapGNM-EGFP bzw. CapGFL-
EGFP du ch den ubiqui ä en Gal4-T eibe (da-Gal4) in den soma ischen Geweben gewäh leis e
is , kann hie die Konsequenz de komple en Abwesenhei on CapG wäh end de Oogenese
Diskussion
99
s udie we den. In Weibchen, welche spezielle hypomo phe CapG-Allele agen, die eben alls zu
weibliche S e ili ä üh en, wu de eine e zöge e Disassemblie ung des SC besch ieben
(Resnick e al., 2009). In den hie un e such en CapGNM-Rescue und CapGFL-Rescue-Weibchen
konn e jedoch sowohl ein akku a e Assemblie ung als auch Disassemblie ung des SC beobach e
we den, was eine ges ö e S uk u des SC als G und ü die S e ili ä unwah scheinlich mach .
Wei e hin in e essan schien die Lokalisa ion on CapG im Ke n de pos mi o ischen G enzzellen.
T o z de o angig zy oplasma ischen Lokalisa ion on CapGNM-EGFP in den G enzzellen de
CapGNM-Rescue-Weibchen, konn en alle dings keine Au älligkei en bezüglich de Anzahl,
G uppie ung ode Mig a ion diese Zellen beobach e we den. Auße dem wa en die Eie de
CapGNM-Rescue-Weibchen be uch ungs ähig, was insgesam gegen eine beein äch ig e
Funk ion de G enzzellen in den CapGNM-Rescue-Weibchen sp ich . Somi konn en bishe keine
spezi ischen Phäno ypen inne halb de weiblichen Keimbahn nach Ab eiche ung on CapG
he ausgea bei e we den. Es is möglich, dass CapG in spä en S adien de Oogenese, z.B. bei den
meio ischen Teilungen nach de Be uch ung eine Rolle spiel . Die ge inge Anzahl on ei en
Oozy en und abgeleg en Eie n in den CapGNM-Rescue- und CapGFL-Rescue-Weibchen haben eine
genaue Analyse diese P ozesse nich e möglich .
Wei e hin konn e, beding du ch die Ve wendung on UAST-Kons uk en, nich un e such
we den, ob die N- e minalen zwei-D i el on CapG auch die Funk ionali ä on CapG wäh end
de Oogenese gewäh leis en können. Um diese F age zu bean wo en, soll e das en sp echende
CapGNM-EGFP-F agmen un e Kon olle de CapG- egula o ischen genomischen Sequenzen
exp imie , ode in einen UASP-Vek o klonie we den. De UASP-Vek o en häl eine
modi izie e UAS-Exp essionskase e, die auch in de weiblichen Keimbahn ak i ie we den kann
(Ro h, 1998). Du ch P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion könn en en sp echende
Kons uk e in das Fliegengenom eingeb ach und schließlich die Funk ionali ä on CapGNM-EGFP
in CapG-mu an en Fliegenweibchen un e such we den. Die du ch diese Weibchen e en uell
abgeleg en Eie wü den es schließlich auch e lauben, eine Funk ionali ä on CapGNM-EGFP in
den ühen syncyi ialen Teilungen zu un e suchen. Die subzellulä e Lokalisa ion ode auch
Phospho-Regula ion on CapG könn e nämlich du chaus wich ig sein, um die schnellen Zyklen im
Syncy ium zu e lauben. Du ch analoge Analysen en sp echend nich -EGFP-ma kie e CapGNM-
Kons uk e könn e auch hie de Ein luss de EGFP-Ma kie ung un e such we den.
Diskussion
100
3.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen
Da anshe e ozygo CapD3-mu an e Fliegenmännchen s e il sind (Sa idou e al., 2005) und
auße dem eine Funk ion on CapH2 und CapD3 bei de Ausbildung de Ch omosomen e i o ien
in den p imä en Spe ma ozy en gezeig we den konn e (Ha l e al., 2008b), wu de bishe
e mu e , dass dem Condensin II-Komplex speziell eine Rolle wäh end de Spe ma ogenese on
D. melanogas e zukommen soll e. Hingegen wu de die Lokalisa ion de Condensin I-
Un e einhei en in den Hoden on Fliegenmännchen in de hie du chge üh en A bei e s mals
besch ieben. Wäh end eine Lokalisa ion on CapG in den Zellke nen de apikalen Hodenspi ze
gezeig we den konn e, wa diese in den p imä en Spe ma ozy en nich nachweisba . Das deu e
ehe au eine Rolle on CapG wäh end de mi o ischen gonialen Teilungen, als eine Be eiligung
des P o eins an de Ausbildung de Ch omosomen e i o ien in den Ke nen de p imä en
Spe ma ozy en im Zusammenspiel mi CapH2 und CapD3 hin.
Übe aschend konn e abe eine An eiche ung on CapG am Ch oma in de ei enden
Spe ma idenke ne gezeig we den. Eine seh ausgep äg e Lokalisa ion zeig sich hie auch ü
CapD2, das dem Ch oma in s ab ö mig au zuliegen schein . Die un e schiedlichen
Lokalisa ionsmus e beide P o eine könn en dadu ch e klä we den, dass im e s en Fall die
Au o luo eszenz on CapG-EGFP zusammen mi de on His-2A D-mRFP1 und im zwei en Fall
an i-CapD2 übe indi ek e Immun luo eszenz zusammen mi de DNA-Fä bung du ch Hoechs
33258 analysie wu de. So muss in wei e üh enden Expe imen en die Spezi i ä des an i-
CapD2-An ikö pe s in männlichen Hoden gezeig we den, die wäh end diese A bei nich
übe p ü wu de. Wei e hin könn e die Kolokalisa ion zweie un e schiedlich Epi op-ma kie e
Condensin-Un e einhei en in diesem Gewebe un e such we den.
Dami das Ch oma in in den ei en Spe mien hoch kompak ie und ansk ip ionsinak i
o liegen kann, muss es wäh end de Spe ma iden ei ung eo ganisie we den. Da
en sp echende Funk ionen ü den Condensin-Komplex in ande en Geweben be ei s gezeig
we den konn en, könn en CapG und CapD2 en wede unabhängig ode inne halb eines
Condensin-Komplexes zu Reo ganisa ion des Spe ma idench oma ins und somi zu Ausbildung
des ei en Spe miench oma ins bei agen. Du ch spezi ische Ab eiche ung de P o eine in den
Hoden de Fliegen und Analyse au e ende Phäno ypen könn en en sp echende Funk ionen
de Condensin-Un e einhei en wei e üh end un e such we den.
Diskussion
101
3.10. Gene ische In e ak ion on CapG, CapH2 und CapD3
Wäh end je d ei nich SMC-Un e einhei en beide Condensin-Komplexe in Ve eb a en (Ono e
al., 2003; Yeong e al., 2003), P lanzen (Fujimo o e al., 2005) und auch C. elegans (Csanko szki e
al., 2009) besch ieben we den konn en, wu de in D. melanogas e bishe kein CapG2-Homolog
iden i izie . So wu de be ei s spekulie , dass CapG analog zu den SMC-Un e einhei en, in
beiden Condensin-Komplexen de Fliege assemblie we den kann (Longwo h e al., 2008;
Resnick e al., 2009).
Fü die Condensin II-spezi ischen Un e einhei en on D. melanogas e wu de gezeig , dass diese
eine Disassemblie ung on poly änen Ch oma ins uk u en e mi eln können. So pe sis ie das
poly äne Ch oma in de o a ialen Näh zellke ne in CapH2- und auch CapD3-mu an en
Fliegenweibchen bis hin zum En wicklungss adium 10 (Ha l e al., 2008a). Wäh end diese
A bei konn e nach Ab eiche ung on CapG inne halb de Näh zellke ne hingegen keine
e zöge e Disassemblie ung des Ch oma ins beobach e we den. In den hie bei analysie en
CapGNM-Rescue-Weibchen wi d die Funk ion on CapG allein du ch die CapGNM-EGFP-
T ansgeninse ion e mi el , die alle dings bei den e wende en Exp essionssys emen in den
Keimbahngeweben, zu denen auch die Näh zellen gehö en, nich exp imie wi d. Somi
sp echen diese Resul a e zunächs gegen eine Rolle on CapG bei de Disassemblie ung des
Näh zellch oma ins. Du ch gene ische In e ak ionsanalysen konn e hingegen gezeig we den,
dass CapH2, CapD3 und CapG eine gemeinsame Funk ionali ä zu Disassemblie ung des
Näh zellch oma ins auszuüben scheinen. So wu de de poly äne Phäno yp des
Näh zellch oma ins sowohl in anshe e ozygo CapD3-mu an en Weibchen, als auch in
anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen du ch das Einb ingen eines zusä zlich CapG-
mu an en Allels wei e e s ä k . F aglich bleib , ob CapG, CapH2 und CapD3 eine Funk ion als
Un e einhei en inne halb eines Condensin II-Komplexes e mi eln ode ob CapG unabhängig
on einem Condensin II-Komplex eine Funk ion zu Ch oma in eo ganisa ion ausüb .
CapG e mi el kla eine P o ein unk ion auch inne halb des Condensin I-Komplexes. Da
Mu an en in den Genen ü die Condensin I-spezi ischen Komponen en üh in de En wicklung
s e ben, konn en bishe keine Phäno ypen bezüglich de Mo phologie des Näh zellch oma ins in
Condensin I-Mu an en un e such we den. Wei e üh end könn e abe in einem analogen
Expe imen die Poly änie des Näh zellch oma ins in anshe e ozygo CapH2- ode CapD3-
mu anen Fliegen nach Einb ingen eines zusä zlichen Ba en- ode CapD2-mu an en Allels
un e such we den.

Diskussion
102
Wäh end in CapH2-mu an en O a ien de poly äne S a us des Näh zellch oma ins länge als
no mal pe sis ie , kann in einem komplemen ä en Ansa z du ch die Übe exp ession on CapH2
in den no male weise poly änen la alen Speicheld üsenzellen eine Disassemblie ung des
Ch oma ins induzie we den (Ha l e al., 2008a). Wä e CapH2 in einem Condensin II-Komplex
ak i , soll en die wei e en Condensin II-Un e einhei en im Übe schuss o handen sein.
Konsis en mi diese Annahme, kann de du ch die CapH2-Übe exp ession e zeug e Phäno yp in
CapD3-Mu an en supp imie we den. Auch in CapG-mu an en La en konn e de du ch die
Übe exp ession on CapH2 e zeug e Phäno yp supp imie we den, was wiede um ein Hinweis
au eine Assemblie ung on CapG im Condensin II-Komplex wä e. Alle dings wu de auch nach
Übe exp ession on CapG eine Disassemblie ung des poly änen Ch oma ins beobach e . Wä e
CapG inne halb eines Condensin II-komplexes ak i , soll e wiede um o ausgese z sein, dass die
wei e en Condensin II-Un e einhei en im Übe schuss o handen sind. Diese Folge ung is nich
schlüssig, da ja CapH2 ebenso übe exp imie we den muss, um eine Disassemblie ung des
Ch oma ins he o zu u en.
Al e na i könn e CapG auße halb eines Condensin II-Komplexes nach Übe exp ession die
Ch oma ins uk u de Speicheld üsench omosomen beein lussen. Nach Übe exp ession de
Condensin I-spezi ischen Un e einhei Ba en konn e keine Dispe sion des poly änen
Speicheld üsench oma ins on Fliegenla en beobach e we den. Un e de Annahme, dass die
Menge an CapG in den Speicheld üsen limi ie end is , wä e diese Beobach ung konsis en zu
Condensin I- e mi el en E ek en nach Übe exp ession on CapG.
Die zu Übe exp ession de P o eine genu z en ansgenen Fliegen wu den du ch P-Elemen
e mi el e Keimbahn ans o ma ion e zeug . Da hie eine zu ällige T ansgeninse ion in das
Fliegengenom s a inde , häng die Exp essionss ä ke de T ansgeninse ionen auch on de en
Inse ionso inne halb des Fliegengenoms ab. Die Exp essionsle el de un e schiedlichen
T ansgeninse ionen wu den wäh end diese A bei nich e glichen. Es könn e dahe auch
möglich sein, dass die genu z en UASP-CapH2 und UASP-CapG-T ansgeninse ionen s ä ke
exp imie we den als die UASP-Ba en-T ansgeninse ion. Um die E ek e de Übe exp ession
einzelne Condensin-Un e einhei en zu e i izie en, soll en in olgenden Analysen die
Exp essionsle el de eingese z en T ansgeninse ionen gegeneinande abgeglichen we den.
Beispielsweise könn e die In eg a ion un e schiedliche T ansgeninse ionen basie end au dem
phiC31-In e g ase-In eg a ionssys em an de inie en Posi ionen des Fliegengenoms ges eue
we den (Bischo e al., 2007), was Inse ions-abhängige Exp essionsun e schiede ausschließen
wü de. Wei e hin könn e auch die Fähigkei wei e e Condensin I-Komponen en un e such
we den, eine Disassemblie ung on poly änen Ch oma ins uk u en zu e mi eln. So könn en in
Diskussion
103
gene ischen In e ak ionss udien die E ek e de Übe exp ession on CapH2 in Ba en-
he e ozygo mu an en Fliegenla en un e such we den. Fü eine Analyse de Übe exp ession
on CapH2 in CapD2-he e ozygo mu an en Fliegenla en müss en o e s CapD2-mu an e Allele
e zeug we den.
3.11. Die Komposi ion lösliche Condensin-Komplexe
Du ch die gene ischen In e ak ionss udien konn e gezeig we den, dass neben CapH2 und CapD3
auch CapG an de S uk u ie ung on poly änem Ch oma in be eilig is . Eine mögliche
Assemblie ung on CapG inne halb eines Condensin II-Komplexes wu de du ch
Immunp äzipi a ion einzelne Condensin-Un e einhei en und massenspek ome ische Analyse
de jeweiligen P äzipi a e nähe un e such . Insgesam konn e in den P äzipi a en de
Condensin-P o eine, abe auch in denen de jeweiligen Kon ollen, eine Vielzahl on Pep iden
de ek ie und möglichen P o einen zugeo dne we den. Diese Ta sache is au die Sensi i i ä
de gewähl en Analyseme hode mi els eines O bi ap-Massenspek ome e s zu ückzu üh en.
Die Spezi i ä de In e ak o en is du ch die Anzahl de ihnen zugeo dne en Pep ide im
Ve häl nis zu Spezi i ä diese Pep idmassenzuo dnung (unique and azo co e age) bes imm .
Die Rele anz de einzelnen In e ak o en konn e du ch die Anzahl de insgesam iden i izie en
Pep ide und de en In ensi ä no mie zu den en sp echenden We en de Nega i kon olle
e mi el we den. So konn en nach Immunp äzipi a ion on CapG aus P o einex ak en on
Emb yonen und auch O a ien alle ande en Komponen en des Condensin I-Komplexes als
spezi ische In e ak o en iden i izie we den. Neben diesen P o einen konn en alle dings keine
wei e en signi ikan en In e ak o en on CapG, insbesonde e nich CapH2 und CapD3,
iden i izie we den. Da eine Assemblie ung on CapG im Condensin II-Komplex somi nich
wah scheinlich e schien, soll e ein mögliche CapG2-Kandida in D. melanogas e du ch
P äzipi a ion on SMC4 iden i izie we den.
In den P äzipi a en on SMC4 konn en insgesam meh Pep ide als in denen des CapG de ek ie
und en sp echenden P o einen zugeo dne we den. Umso übe aschende wa die Ta sache,
dass in den 731 analysie en In e ak o en wiede um wede CapH2 noch CapD3 en hal en wa en.
Die P äzipi a ionen on CapG und SMC4 wu den in O a ienex ak en on Fliegen o genommen.
In diesem Geweben wu de sowohl eine Exp ession on CapH2 als auch Funk ionali ä on CapH2
und CapD3 nachgewiesen (Ha l e al., 2008a). Falls diese Funk ionen du ch einen Condensin II-
Komplex e mi el we den, soll e so auch dessen P äzipi a ion aus Ex ak en dieses Gewebes
möglich sein.
Diskussion
104
Nach Übe exp ession und P äzipi a ion zweie un e schiedlich Epi op-ma kie e Va ian en de
Condensin II-Un e einhei CapH2 aus O a ienex ak en konn e ande e sei s eine Kop äzipi a ion
de Condensin-Ke nun e einhei en e eich we den. SMC2- und SMC4-spezi ische Pep ide
wu den hie alle dings nich mi höchs e In ensi ä nachgewiesen. Obwohl die einzelnen
P äzipi a ionsexpe imen e nich di ek mi einande e glichen we den können, wa en die jeweils
ande en Condensin I-Un e einhei en nach P äzipi a ion du ch CapG und SMC4 un e den 30 mi
höchs e In ensi ä iden i izie en P o eine en hal en. Eine Ausnahme bilde hie nu CapG, das
wah scheinlich du ch die Me hode de Massenspek ome ie nich e ek i p ozessie bzw.
analysie we den kann. So konn en soga nach P äzipi a ion on CapG selbs nu seh wenige
Pep ide des P o eins in den P äzipi a en ge unden we den. Du ch P äzipi a ion on CapH2
konn en SMC2 und SMC4 hingegen nich einmal un e den 100 mi höchs e In ensi ä
kop äzipi ie en P o eine ge unden we den. Eine In e ak ion on SMC4 und CapH2 konn e somi
nu nach Übe exp ession und P äzipi a ion on CapH2, nich abe im komplemen ä en
Expe imen nachgewiesen we den. Du ch das Übe angebo an CapH2 könn en zusä zliche
Condensin II-Komplexe gebilde und olglich eine In e ak ion des CapH2 mi SMC2 und SMC4
s imulie we den. Vo ausgese z wi d hie bei, dass SMC2 und SMC4 be ei s im Übe angebo
o handen sind ode abe dass CapH2 Ba en aus be ei s assemblie en Condensin I-Komplexen
e d ängen könn e.
Wenn CapH2 nach Übe exp ession im Condensin II-Komplex unk ionie , soll en SMC2, SMC4,
CapD3 und ein mögliches CapG2 im Übe schuss o liegen, da be ei s du ch die Übe exp ession
on CapH2 allein Phäno ypen gene ie we den können. So konn e zumindes nach
Übe exp ession on CapH2 in Speicheld üsen on Fliegenla en eine Disassemblie ung des
poly änen Ch oma ins in wild yischen La en, nich abe in CapD3-mu an en La en beobach e
we den (Ha l e al., 2008a). Obwohl die Pep ide de P äzipi a e on CapH2 insgesam 1280
P o einen zugeo dne we den konn en, was imme hin as einem Zehn el des gesam en
Fliegenp o eoms en sp ich , wu de CapD3 hie nich iden i izie . Die N- e minal an CapH2
ange üg en EGFP- bzw. mche y-Ma kie ungen soll en eine In e ak ion mi CapD3 hie bei nich
behinde n. So konn e eine sei s die biologische Funk ionali ä de ü die
P äzipi a ionsexpe imen e eingese z en N- e minal mche y- bzw. EGFP-ma kie en T ansgene
du ch Komplemen a ionsanalysen nachgewiesen we den (Punk 2.2.2.3). Zum ande en wu de
eine di ek e In e ak ion eines an analoge Posi ion N- e minal His-Flag-ma kie en CapH2 mi
CapD3 im in i o Assay gezeig (Punk 2.2.3.3).
Auch CapG konn e in den P äzipi a en on CapH2 nich nachgewiesen we den, was sowohl
gegen eine physikalische In e ak ion on CapG und CapH2 als auch gegen eine Anlage ung dieses
Diskussion
105
P o eins im Condensin II-Komplex sp ich . Un e de Vielzahl de kop äzipi ie en P o eine
konn e wei e hin auch kein o ensich liche Kandida ü ein mögliches CapG2 on D.
melanogas e he ausgea bei e we den. Hie bei is alle dings aglich, ob un e den gewähl en
expe imen ellen Bedingungen eine In e ak ion on CapH2 mi CapG2 e wa e we den kann,
wenn auch die In e ak ion on CapH2 und CapD3 nich s a inde .
3.12. Iden i ika ion on In e ak ionspa ne n de Condensin-Un e einhei en
Du ch die Immunp äzipi a ion de einzelnen Condensin-Un e einhei en und de massenspek o-
me ischen Analyse de jeweiligen P äzipi a e konn en neben den Condensin-Un e einhei en
selbs keine wei e en o ensich lichen In e ak o en de Condensin-Komponen en iden i izie
we den. Alle dings konn en die in den P äzipi a en iden i izie en P o eine mi den be ei s in de
Li e a u disku ie en In e ak o en de Condensin-Un e einhei en e glichen we den. So wu de
in D. melanogas e eine di ek e In e ak ion on Ba en mi Topo II gezeig (Bha e al., 1996).
Topo II-spezi ische Pep ide konn en in diese A bei nu in den P äzipi a en on CapH2, nich
abe in denen on CapG und SMC4 nachgewiesen we den (siehe Tabelle im Anhang, g au
ma kie ). Dies könn e eine spezi ische In e ak ion on Topo II mi den Kleisin-Un e einhei en
implizie en.
Fü die humanen Condensin II-spezi ischen Un e einhei en (Yeong e al., 2003) wie auch die des
X. lae is (Takemo o e al., 2009) konn e wei e hin eine di ek e In e ak ion mi de
P o einphospha ase PP2(A) nachgewiesen we den. Da Pep ide de PP2(A) auch wäh end diese
Analysen speziell in P äzipi a en on CapH2 iden i izie wu den (siehe Tabelle im Anhang, g au
ma kie ), könn e PP2(A) auch in de Fliege eine egula o ische Funk ion bezüglich de
Condensin II-Un e einhei en übe nehmen.
E s kü zlich konn e in D. melanogas e eine Funk ion de RNA-Helikase Vasa wäh end de
Mi ose demons ie , sowie eine Regula ion des Condensin I-Komplexes du ch den piRNA-
Signalweg naheleg we den. Es wu de eine di ek e In e ak ion on Vasa mi den Condensin I-
spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 gezeig , nich abe mi de Condensin II-
spezi ischen Un e einhei CapD3 (Pek und Kai, 2011). Bei den hie du chge üh en P äzipi a ions-
expe imen en konn e Vasa alle dings auch speziell in den P äzipi a en on CapH2 nachgewiesen
we den. Neben Vasa wu den auch wei e e Komponen en des RNA-silencing Signalweges in den
P äzipi a en de Condensin-Un e einhei en iden i izie (siehe Tabellen im Anhang, g au
ma kie ). In D. melanogas e wu den 5 A gonau -E ek o P o eine besch ieben, welche
Ma e ialien und Me hoden
112
In Tabelle 11 sind die Fliegens ämme au gelis e , welche wäh end diese A bei he ges ell wu den.
Tabelle 11: Wäh end diese A bei he ges ell Fliegens ämme
Geno yp
He s ellungsa
pUAST-CapGNM5-EGFP II.1
P-Elemen e mi el e
Keimbahn ans o ma ion
pUAST-CapGNM5-EGFP III.1
pUAST-CapGNM5-EGFP III.2
pUAST-CapGFL-EGFP II.2, g-mRFP1-HP1 II.1/ CyO, P[ y+, z lacZ]
Rekombina ion einzelne Allele
pUAST-CapGC-EGFP II.3, g-mRFP1-HP1 II.1/ CyO, P[ y+, z lacZ]
pUAST-CapGN-EGFP III.1, pUAST-CapGMC-EGFP III.2
w*; CapG1, P{EPgy2}Cap-D3EY00456/ CyO, P[ y+, z lacZ]
w*; CapG6, P{EPgy2}Cap-D3EY00456/ CyO, P[ y+, z lacZ]
4.1.5. An ikö pe
Tabelle 12: Ve wende e An ikö pe .
P imä e An ikö pe
Blo
Immun-
luo eszenz
Re e enz/ Quelle
Kaninchen-an i-EGFP(IS28)
1:3000
1:3000
Dü , 2004
Kaninchen-an i-mRFP1
1:3000
1:3000
Schi enhelm e al., 2007
Kaninchen-an i-CapG(N)
1:3000
Rei hinge , 2009
Kaninchen-an i-SMC2(IS04),
unge einig es Se um
1:3000
S. Heidmann,
pe sönliche Mi eilung
Kaninchen-an i-Ba en
1:4000
Bha e al., 1996
Kaninchen-an i-CapD2
1:10000
1:1000
Sa idou e al., 2005
Kaninchen-an i-CID(IS1)
1:500
Jäge e al., 2005
Kaninchen-an i-C(3)G
1:3000
Geschenk on M. Lily
Kaninchen-an i-Flag
1:2000
Sigma
Maus-an i α- ub
1:80000
Sigma Ald ich
Maus-an i-spe m ail
1:20
Ka , 1991
Maus-an i-Cyclin B (F2)
1:40
Knoblich und Lehne , 1993
Maus-an i-GFP
(Clone #71 hyb idoma supe na an )
1:200
Geschenk on P. Heun (MPI, F eibe g)
un e ö en lich ,
ge einig on M. He mann
Maus-an i myc
(9E10 hyb idoma supe na an )
1:100 –
1:1000
E an e al., 1985
Maus-an i-Ago-2
un e dünn
Miyoshi e al., 2005
Mee schweinchen-an i-CapG(N)
1:3000
Rei hinge , 2009
Ra e-an i-CapH2
1:500
Oli ei a, 2007
Ra e-an i-Vasa
1:1000
De elpomen al S udies Hyb idoma Bank
Sekundä e An ikö pe
POD-Ziege-an i-Kaninchen
1:3000
Jackson Immunochemicals
POD-Ziege-an i-Mee schweinchen
1:3000
Jackson Immunochemicals
POD-Ziege-an i-Maus
1:3000
Jackson Immunochemicals
POD-Ziege-an i-Ra e
1:3000
Jackson Immunochemicals
Cy3- Ziege-an i-Kaninchen
1:600
Jackson Immunochemicals
Cy5- Ziege-an i-Kaninchen
1:600
Jackson Immunochemicals

Ma e ialien und Me hoden
113
4.2. Umgang mi D osophila melanogas e
4.2.1. S anda dme hoden
Hal ung on D. melanogas e und K euzungsexpe imen e e olg en wie bei (G eenspan, 1997),
(Robe s, 1998) und (Sulli an, 2000) besch ieben. In o ma ionen zu den Mu a ionen, die als
phäno ypische Ma ke dien en, zu Balancie ch omosomen sowie zu gene ischen Nomenkla u
inden sich bei (Lindsley, 1992) ode bei FlyBase (FlyBase Conso ium, 2003).
4.2.2. Keimbahn ans o ma ion on D. melanogas e -Emb yonen du ch Mik oinjek ion
und Ka ie ung on T ansgeninse ionen
T ansgene Fliegen wu den du ch P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion on D.
melanogas e w1-Emb yonen e zeug (Sp adling und Rubin, 1982). Eine de aillie e Besch eibung de
Vo gehensweise de Injek ion inde sich bei He zig (1999). Als Injek ionsappa a u wu de ein
Fem oje (Eppendo ) genu z . Eine de aillie e Besch eibung de Ka ie ung und E ablie ung
ansgene Fliegens ämme inden sich bei K ame (1999).
4.2.3. Emb yonenkollek ionen
Fü Emb yonenkollek ionen wu den adul e Fliegen in Flugkä igen bei eine Inkuba ions empe a u
on 25°C gehal en. Die Flugkä ige wu den mi He e bes ichenen Ap elsa aga pla en e schlossen.
Zum Ablegen zu ückgehal ene Emb yonen, wu de s e s eine 1-s ündige Vo kollek ion du chge üh .
Fü die eigen liche Kollek ion wu den Ap elsa aga pla en en sp echend de Kollek ionsdaue
gewechsel , die Emb yonen en sp echend de Kollek ionsdaue bei 25°C zu Al e ung inkubie und
anschließend mi NaCl-Tx on de Ap elsa aga pla e gewaschen. Nach eine 3-minü igen
Decho ionisie ung mi 50% Klo ix ( / ; Colga e Palmoli e GmbH) wu den die Emb yonen mi NaCl-Tx
gewaschen und en sp echend wei e behandel .
4.2.4. Immun luo eszenz ä bung on Emb yonen
Nach Kollek ion und Decho ionisie ung (siehe 4.2.3) wu den die Emb yonen in eine 1:1 Mischung
aus Me hanol und Hep an (je 700 µl) ü 5 min un e Ro a ion ixie . Nach de Fixie ung wu den die
Emb yonen zue s d eimal mi 1 ml Me hanol und dann d eimal mi 1 ml PBTx gespül und d eimal
ü 10 min mi 500 µl PBTx un e Ro a ion bei RT gewaschen. Die Emb yonen wu den dann ü 1h in 1
ml PBTx (10% NGS, no mal goa se um ode 10% FBS, e al bo ine se um) un e Ro a ion bei RT
inkubie , um unspezi ische An ikö pe bindes ellen zu blockie en und anschließend übe Nach mi
dem p imä en An ikö pe in 1 ml PBTx (10% NGS ode 10% FBS) bei 4°C un e Ro a ion inkubie .
Danach wu den übe schüssige An ikö pe du ch 3-maliges Spülen und 2-maliges Waschen in je 1 ml
PBTx en e n und die Emb yonen mi dem sekundä en An ikö pe in 500 µl PBTx (5% NGS ode 5%
FBS) ü 2h bei RT un e Ro a ion inkubie . Nach de An ikö pe inkuba ion wu de d eimal mi 1 ml
PBTx gespül und einmal mi 1 ml PBTx ü 5 min un e Ro a ion gewaschen. Anschließend e olg e
die Fä bung de DNA du ch den in e kalie enden Fa bs o Hoechs 33258. Hie zu wu den die
Emb yonen 5 min lang un e Ro a ion mi 1 ml PBS/Hoechs 33258 (1 μg/ml Hoechs 33258 in PBS)
inkubie . Nach Abziehen de Fä belösung wu den die Emb yonen mi 1 ml PBS gespül und 5 min in
1 ml PBS un e Ro a ion gewaschen. Die Emb yonen wu den anschließend au einen Objek äge
übe üh , übe schüssiges PBS abpipe ie , in Mon ie medium au genommen und mi einem
Deckglas ixie .
Ma e ialien und Me hoden
114
4.2.5. Immun luo eszenz ä bung on Speicheld üsen, Fliegeno a ien und Hoden
Fü die P äpa a ion on Speicheld üsen wu den D osophila-La en des d i en La ens adiums in PBS
übe üh und de en Ve dauungs ak mi eine Pinze e he aus p äpa ie . Fü die P äpa a ion on
O a ien und Hoden wu den die Fliegen mi CO2 be äub und in PBS übe üh . Mi els eine Pinze e
wu de das Abdomen geö ne und die O a ien bzw. die männlichen Rep oduk ionso gane he aus
p äpa ie . Soll e eine di ek e Mik oskopie olgen, konn en die e hal enen Gewebe di ek au einen
Objek äge gegeben, in Mon ie medium sezie und du ch ein Deckglas ixie we den. Al e na i
wu den die e hal enen Gewebe in ein Gemisch aus 150 µl Fixie ungslösung und 300 µl Hep an
ans e ie und 20 min un e Ro a ion ixie . Nach meh achem Waschen mi PBST wu de eine
Immun luo eszenz ä bung de Gewebe analog zu de on ixie en Emb yonen o genommen (siehe
4.2.4), mi dem Un e schied, dass sowohl die Waschsch i e als auch die An ikö pe e dünnungen in
PBST s a PBTx o genommen wu den. Al e na i wu de di ek nach dem Waschen eine Hoechs
33258-Fä bung (analog zu de ixie e Emb yonen) de Gewebe o genommen. Die ge ä b en
Gewebe wu den abschließend au einen Objek äge übe üh , mi Mon ie medium übe schich e ,
un e dem Mik oskop (Zeiss, S emi 2000) sezie und mi einem Deckglas ixie .
4.3. Mik oskopie und Bildbea bei ung
Zu mik oskopischen Analyse wu de ein Fluo eszenzmik oskop des Typs Axioplan 2 on Zeiss genu z .
Es wu de eine 16- ache bzw. 20- ache Objek i -Ve g öße ung e wende . Mik oskopische
Au nahmen wu den mi de AxioCam MRm-Kame a ange e ig und mi de So wa e AxioVision 3.1
(Zeiss) e s ell .
Kon okale Lase mik oskopie e olg e am Lase -Scanning-Mik oskop on Leica (Leica Con ocal TCS
SP5) mi de LCS-So wa e. Soll en hie bei lebende Emb yonen mik oskopie we den (in i o
Mik oskopie), wu den diese nach Decho ionisie ung au einem Ap elsa aga block au ge eih und
mi ig au ein mi Klebs o (Hep anex ak on Packe klebeband) e sehenes Deckglas übe üh .
Zum Schu z o Aus ocknung wu den die Emb yonen mi einem saue s o du chlässigem,
hoch iskosen Öl (Vol ale 10 S, el a ochem) übe schich e . Zu An egung de Fluo eszenz a bs o e
Hoechs 33258, EGFP, mRFP1, Cy3 sowie Cy5 wu den einen Dioden UV-Lase 405
(An egungswellenlänge 405 nm), ein A gonlase (An egungswellenlänge 458-514 nm), ein DPSS561-
Lase (An egungswellenlänge 561 nm) und ein Helium/Neon-Lase (An egungswellenlänge 633 nm)
eingese z . Fü die Fluo eszenzau nahmen wu den ein 40- aches und ein 60- aches Öl-Objek i
e wende . Fü Zei eihen wu de alle 15s bzw. 20s ein Bild au genommen. Die Eins ellungen de
Blenden und des Pho omul iplie s wu den den en sp echenden P äpa a en bzw. de expe imen ellen
Zielse zung angepass . Bei hohem Hin e g undsignal, wu den die luo eszenzmik oskopischen
Au nahmen mi eine 2- bis 4- achen Ab as e ung au genommen. Die Bildbea bei ung e olg e mi
Hil e de So wa e ImageJ 1.41 (Na ional Ins i u e o Heal h, USA) und mi dem P og amm Adobe
Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.).
Ma e ialien und Me hoden
115
4.4. Molekula biologische Me hoden
4.4.1. Polyme ase-Ke en eak ion (PCR)
Fü PCR-Reak ionen wu den das „Expand Long Range dNTPack“ (Roche), ode P u-DNA-Polyme ase
(Fe men as) ode eine selbs he ges ell e Taq-DNA-Polyme ase e wende . Als Templa e wu den 50-
500 ng Plasmid-DNA eingese z . Genomische DNA ode cDNA aus Fliegen wu de zu je 1 µl en wede
un e dünn ode in eine Ve dünnung on 1:3 bis 1:10 eingese z . Den 25–50 µl PCR-Ansä zen wu de
wei e hin de jeweilige PCR-Pu e in eine 1- achen Endkonzen a ion, Desoxy ibonukleo idmix und
PCR-P ime nach Angaben de jeweiligen He s elle zugegeben. Bei Ve wendung de Taq-DNA-
Polyme ase wu den 1,5 mM MgCl2; 0,1 mM Desoxy ibonukleo idmix, 0,4 µM PCR-P ime , sowie
PCR-Pu e in eine 1- achen Endkonzen a ion eingese z . Die PCR-Reak ionen wu den in den PCR-
Maschinen RoboCycle G adien 96 Ho Top Combo (S a agene) und Pe kin Elme Ce us Gene Amp
PCR Sys em 9600 du chge üh . Eine En salzung de PCR-Reak ionen wu de mi els des „Qiagen PCR
pu i ica ion Ki “ (Qiagen) nach den Angaben des He s elle s o genommen.
4.4.2. DNA-F agmen ie ung du ch Res ik ionsendonukleasen
Die enzyma ische Res ik ion on DNA wu de mi Res ik ionsendonukleasen de He s elle NEB,
Fe men as und Roche en sp echend de Angaben des jeweiligen He s elle s du chge üh . Es wu den
0,5 bis 3 μg Plasmid-DNA mi 2 bis 10 U des/de jeweiligen Res ik ionsenzyms/-enzyme in einem
Gesam olumen on 10 bis 50 μl gemisch . Gleichzei ig wu de eine 1- ache Konzen a ion des
en sp echenden Reak ionspu e s (10x) sowie gegebenen alls on Rinde se um-Albumin (BSA)
einges ell . De Res ik ionsansa z wu de bei de enzymspezi ischen Tempe a u ü mindes ens 1h
inkubie .
4.4.3. Enzyma ische Dephospho ylie ung on DNA-F agmen en
Um eine Religa ion on Vek o -DNA wäh end de enzyma ischen Liga ion zu e meiden, wu den
Vek o en nach de enzyma ischen Res ik ion an ih en 5’-Enden dephospho ylie . Dazu wu den die
Res ik ionsansä ze nach Hi ze-Inak i ie ung de Res ik ionsenzyme (15 min bei 65°C) en salz , eine
1- ache Konzen a ion an SAP-Pu e einges ell und 1 bis 5 U Alkalische Ga nelen-Phospha ase (SAP;
Fe men as) zugese z . Die Reak ionsansä ze wu den ü 30 min bei 37°C inkubie und anschließend
Hi ze-inak i ie (15 min bei 65°C).
4.4.4. Enzyma ische Liga ion on DNA-F agmen en
Zu Gene ie ung on Plasmiden wu de ein klonie es und mi Res ik ionsenzymen geschni enes
DNA-F agmen un e Ve wendung on T4-DNA-Ligase (Fe men as/ NEB) in einen Vek o klonie . Die
en sp echende Reak ion wu de in einem Volumen on 10 μl mi 1 μl des om jeweiligen He s elle
angegebenen Reak ionspu e s (10x) sowie 1 µl T4-DNA-Ligase angese z und ü mindes ens 3h bei
Raum empe a u inkubie . Nach de Liga ion wu den die Ansä ze ü 15 min bei 65°C inkubie um
die Ligase zu inak i ie en.
4.4.5. T ans o ma ion on Plasmid-DNA in E. coli-Bak e ien
Zu T ans o ma ion on Plasmid-DNA in Esche ichia coli wu den 50 μl chemisch kompe en e E. coli-
Bak e ien mi 10 μl eines Liga ionsansa zes gemisch und ü mindes ens 10 min au Eis inkubie .
Danach wu de ein Hi zeschock (45s bei 42°C) o genommen, ge olg on eine e neu en Inkuba ion
ü 2 min au Eis. Nach Zugabe on 500 µl LB-Medium wu den die Bak e ien ü e wa 30 min bei 37°C
Ma e ialien und Me hoden
116
un e schü eln inkubie . Die Bak e ien wu den anschließend au LB-Aga pla en ausgeb ach , die
Ampicillin in eine Konzen a ion on 100 μg/ml en hiel en, und übe Nach bei 37°C inkubie .
4.4.6. Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli-Bak e ien
Zu P äpa a ion on Plasmid-DNA wu den de „QIAp ep Spin Minip ep Ki “ und de „QIA il e Plasmid
Midi Ki “ de Fi ma Qiagen nach Anweisung des He s elle s e wende .
4.4.7. Aga osegelelek opho ese und Ex ak ion on DNA-F agmen en
Zu analy ischen und zu p äpa a i en Au ennung on DNA-F agmen en wu den 1%-ige
Aga osegele au T is-Bo a -Basis e wende (Samb ook, 1989). P o 100 ml lüssige Aga ose wu den
3 μl E hidiumb omid (10 mg/ml) zugegeben, um die DNA spä e im UV-Lich sich ba zu machen.
Soll e eine P äpa a ion de DNA-F agmen e aus de Aga ose e olgen, wu den diese mi einem
Skalpell un e UV-Lich ausgeschni en und anschließend mi dem „Gel-Ex ac ion Ki “ (Qiagen) nach
den Angaben des He s elle s ex ahie .
4.4.8. P äpa a ion genomische DNA aus Fliegenemb yonen
Zu P äpa a ion de genomischen DNA aus D. melanogas e wu den 4 bzw. 30 adul e Fliegen mi
CO2-be äub und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Die Fliegen wu den in 100 μl bzw. 400 μl
Pu e A homogenisie und das Homogena anschließend 30 min bei 65°C inkubie . Dann wu den
120 μl bzw. 900 μl eine Li hiumchlo id/Kaliumace a -Lösung zugegeben und de Ansa z 30 min au
Eis inkubie . Nach 15-minü ige Zen i uga ion (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 16000g, RT)
wu de de Übe s and in ein neues Reak ionsge äß ans e ie , die DNA du ch Zugabe on 100 μl
bzw. 540 μl Isop opanol ge äll und du ch Zen i uga ion (15 min, 60000g, RT) sedimen ie .
Anschließend wu de das DNA-Pelle mi 70%igem E hanol gewaschen, ge ockne und in 20 µl bzw.
50 µl TE-Pu e au genommen.
4.4.9. P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben und Re e se T ansk i ion
Zu P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben wu de de „RNeasy Mini Ki “ (Qiagen) nach dem
P o okoll „Pu i ica ion o To al RNA om Animal Tissues“ genu z . Um RNA aus w1-Emb yonen zu
e hal en, wu den diese nach en sp echende Kollek ion on de Ap elsa aga pla e gesammel ,
decho ionisie , mi NaCl-Tx gewaschen und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Übe schüssige
Waschpu e wu de quan i a i abgezogen und das Volumen de Emb yonen du ch eine skalie e
Kapilla e bes imm . Es wu den 20–100 µl Emb yonen eingese z . Diese wu den zu Lage ung in
lüssigen S icks o einge o en und dann di ek in RTL-Pu e (Qiagen) au gea bei e . Zu P äpa a ion
on RNA aus adul en w1-Fliegen wu den jeweils 20 Männchen ode Weibchen be äub und di ek in
RTL-Pu e (Qiagen) au gea bei e . Zu e e sen T ansk ip ion wu den de „Omnisc ip RT Ki “
(Qiagen) ode eine Re e se T ansk ip ase (Fe men as) nach den Angaben des jeweiligen He s elle s
eingese z . Es wu de je 1 µl (300-400 ng) de p äpa ie en RNA-P oben p o T ansk ip ions eak ion
eingese z . Hie bei wu den sowohl Oligo-dT als auch Hexame p ime zu je 10 µM p o
T ansk ip ions eak ion eingese z .
4.4.10. Sequenzie ung und Sequenz e gleiche
Alle Sequenzie ungen wu den on de Fi ma Sequencing Labo a o ies Gö ingen du chge üh . DNA-
P oben wu den nach den Angaben de Fi ma o be ei e . Sequenzanalysen wu den mi den
P og ammen SeqBuilde (DNA S a So wa e) und Mul align (Mul iple sequence alingmen by
Flo ence Co pe ; h p://bioin o.genopole- oulouse.p d. /mul alin/mul alin.h ml) du chge üh .
Ma e ialien und Me hoden
117
4.5. P o einbiochemische Me hoden
4.5.1. He s ellung on A ini ä sma izes au Basis on P o ein A-Sepha ose
4.5.1.1. Kopplung polyklonale An ikö pe
Fü die Immunp äzipi a ion aus na i en D. melanogas e -P o einex ak en wu den ausschließlich
selbs he ges ell e A ini ä sma izes e wende . Hie ü wu den die polyklonalen An ikö pe ,
Kaninchen-an i-EGFP(IS28), Kaninchen-an i-mRFP1, Kaninchen-an i-mche y ode Kaninchen-an i-
CapG(N) ko alen an P o ein A-Sepha ose (A i-P ep P o ein A, BIORAD) gekoppel . Die P o ein A-
Sepha ose wu de o e s d eimal mi dem 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH 9,0) gewaschen.
Schließlich wu den p o 100 µl gese z e P o ein A-Sepha ose 50 µl a ini ä sge einig e, polyklonale
An ikö pe lösung e dünn in 1 ml 50 mM Bo ax (pH 9,0) zugegeben. Nach eins ündige Inkuba ion
un e Ro a ion (RT) wu de de Übe s and nach Zen i uga ion (Tischzen i uge, VWR Galax Mini, 20
sek) on de Sepha ose abge enn , diese zweimal mi dem 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH
9,0) gewaschen und im 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH 9,0) au genommen. Zu ko alen en
Kopplung de An ikö pe an die Sepha ose wu de es es Dime hylpimelida in eine
Endkonzen a ion on 20 mM zugeben. Nach 30-minü ige Inkuba ion un e Ro a ion (RT) wu de de
Übe s and abgenommen. Zu Blockie ung on nich eagie em Dime hylpimelimida wu de die
Sepha ose mi dem 10- achen Volumen an 200 mM E hanolamin (pH 8) gewaschen und wei e e 2h
im 10- achen Volumen an 200 mM E hanolamin (pH 8) un e Ro a ion bei RT inkubie . Die
Sepha ose wu de anschließend mi dem 10- achen Volumen an 100 mM Glycin (pH 3) gewaschen
und zweimal ü 10 min im 10- achen Volumen an 100 mM Glycin (pH 3) un e Ro a ion (RT)
inkubie . Nach d eimaligem Waschen mi dem 10- achen Volumen an PBS konn e die e hal ene
A ini ä sma ix im 10- achen Volumen an PBS (0,01% Thime osal) bei 4°C gelage we den.
4.5.1.2. Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden
Die Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden an P o ein A-Sepha ose e olg e im
Wesen lichen wie un e 4.5.1.1 besch ieben, alle dings un e Hochsalzbedingungen. Hie zu wu de
dem 50 mM Bo ax NaCl in eine Endkonzen a ion on 3 M zugese z wu de. Dem
Hyb idomaübe s and wu de o de Kopplung NaCl in eine Endkonzen a ion on 3 M zugese z
sowie de pH-We mi els 1 M NaOH au 9,0 einges ell . Zu Kopplung wu den 2 ml
Hyb idomaübe s and p o 100 µl P o ein A-Sepha ose eingese z . Wäh end diese A bei wu de ein
an i-myc Hyb idomaübe s and (mAB 9E10 an i-myc) zu He s ellung eine en sp echenden
A ini ä sma ix eingese z .
4.5.2. He s ellung na i e P o einex ak e aus D. melanogas e -Geweben
und anschließende Immunp äzipi a ion
Emb yonen wu den wie un e Punk 4.2.3 besch ieben e hal en und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß
übe üh . Nach Bes immen de Emb yonenmenge (in µl) wu de de übe schüssige Pu e en e n .
Fü eine länge e Lage ung konn en die Emb yonen in lüssigem S icks o einge o en und bei -80°C
gelage we den. Um na i e P o einex ak e aus O a ien he zus ellen, wu den diese aus
Fliegenweibchen p äpa ie (siehe Punk 4.2.5) und in Po ionen on ja 20-30 O a ienpaa en in 1,5
ml-Reak ionsge äße übe üh . Nach En e nen des übe schüssigen Pu e s wu den auch die O a ien
in lüssigem S icks o einge o en. In ge o ene Fo m konn en schließlich meh e e Aliquo s e ein
we den. Die Ex ak he s ellung wu de bei 4°C du chge üh . Hie bei wu den die Fliegengewebe
du ch Zugabe on gekühl em Lysepu e (mi P o easeinhibi o en) in einen Glashomogenisa o
(Kon es) übe üh . De Au schluss e olg e du ch ein Te lon-Pis ill (Kon es), das du ch eine

Ma e ialien und Me hoden
118
Boh maschine (Bosch) ange iebenen wu de (ca. 10mal au und ab, bei mi le e D ehzahl). Es
wu den je 400 µl Lysepu e p o 100 µl Emb yonen bzw. 100 O a ienpaa en eingese z . Die
Homogena e wu den schließlich zen i ugie (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 15 min, 16000g,
4°C). Die mi le e Phase mi löslichen P o einen wu de mi els eine Pas eu pipe e abgenommen
und in ein isches 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Nach Zen i uga ion (15 min, 16000g, 4°C)
konn e du ch e neu es Abnehmen de mi le en Phase de na i e P o einex ak e hal en we den.
Diesem wu den 20 µl en nommen und in 10 µl SDS-P obenpu e au gekoch (INPUT). De es liche
Ex ak wu de dann mi eine An ikö pe -gekoppel en A ini ä sma ix (4.5.1.1) ü 3-4h bei 4°C un e
Ro a ion inkubie . P o 200-400 µl na i em P o einex ak wu den 30 µl A ini ä sma ix eingese z ,
welche o he d eimal mi je 1 ml Lysepu e gewaschen wu de. Nach de Inkuba ion wu de de
Übe s and du ch Zen i uga ion abge enn (1 min, 16000g, 4°C), diesem 20 µl en nommen und in 10
µl SDS-P obenpu e au gekoch (ÜB). Die A ini ä sma ix wu de d eimal mi 1 ml Lysepu e
gewaschen und wei e e 10 min in 1 ml Lysepu e un e Ro a ion bei 4°C inkubie . Um unspezi ische
In e ak o en on de Ma ix abzu ennen, konn e diese je nach Expe imen du ch wei e e Pu e
(WPS und olgend WPD) je einmal gespül und ü 10 min un e Ro a ion bei 4°C inkubie we den.
Nach Abnehmen des Waschpu e s olg e die Elu ion. Diese konn e o e s mi els Elu ionspu e
e olgen. Hie bei wu de die Ma ix in 40 µl Elu ionspu e ü 5 min bei 37°C inkubie , diese
schließlich nach Zen i uga ion (1 min, 16000g, 4°C) abgenommen, mi wei e en 20 µl SDS-
P obenpu e e se z und gekoch (IP). Anschließend konn e die A ini ä sma ix in 40 µl SDS-
P obenpu e ü 5 min bei 95°C inkubie und nach Zen i uga ion (1 min, 16000g, 4°C) und
Abnahme des Übe s andes ein wei e es Elua e hal en we den (IP, Heißelu ion). Al e na i konn e
die Ma ix nach dem le zen Waschsch i auch in eine Mobicol-Säule (Mobi ec) übe üh und du ch
Zen i uga ion (Tischzen i uge, VWR, Galax mini, 20 sek) om Pu e abge enn we den. In diesem
Fall wu de die Elu ion di ek du ch Zugabe on 40 µl SDS-P obenpu e (ohne β-Me cap oe hanol)
und 5-minü ige Inkuba ion bei 95°C o genommen. Du ch Zen i uga ion (Tischzen i uge, 20 sek)
wu de das Elua schließlich on de A ini ä sma ix abge enn und nach Zugabe on 4 µl β-
Me cap oe hanol (14,4M) e neu ü 10 min gekoch (IP).
Fü die Immunp äzipi a ionen on CapG-mRFP1 und SMC4-EGFP (siehe E gebnisse, Abschni e
2.2.2.1 und 2.2.2.2) wu de eine zweis u ige P äzipi a ion o genommen. Fü die P äzipi a ionen on
mche y-CapH2 und EGFP-CapH2 (siehe E gebnisse, Abschni 2.2.2.3) wu den die A ini ä sma izes
di ek in SDS-P obenpu e gekoch . Die P oben on INPUT und ÜB wu den schließlich so e dünn ,
dass 20 Emb yonen bzw. 2,5 O a ien p o 10 µl SDS-P obenpu e en hal en wa en. Fü die SDS-
Gelelek opho ese wu den jeweils 10 µl ü INPUT und ÜB und 5–15 µl de Elua e eingese z .
4.5.3. P o einp äpa a ion on D. melanogas e -Emb yonen in e schiedenen Phasen
de Mi ose 14
Fliegen des Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/ TM3,Se wu den in Flugkä igen (siehe Punk 4.2.3)
gehal en. Emb yonen wu den jeweils ü 30 min gesammel und wei e e 160 min bei 25°C geal e . In
eine solchen Kollek ion (160-190 min) be inden sich die Zellen eine Meh zahl de Emb yonen in de
G2-Phase des Zellzyklus 14 und können du ch eine ek opische Exp ession de Phospha ase
Cdc25/s ing synch on in die Mi ose ge ieben we den (Saue e al., 1995). Um eine Exp ession des
Hs-s ing zu e mi eln, wu den die Ap elsa aga pla en ü 20 min bei 37°C im Wasse bad inkubie
und anschließend ü 5 min, 8 min, 12 min ode 15 min bei 25°C geal e . Die Emb yonen wu den
decho ionisie und in eine 1:1 Mischung aus Me hanol (1mM Vanada ) und Hep an (je 700 µl) ü 5
min un e Ro a ion ixie . Anschließend wu den die Emb yonen d eimal mi Me hanol (1mM
Vanada ) und zweimal mi EB-Pu e (0,5% Tween 20 (w/ )) gewaschen und 5 min un e Ro a ion mi
Ma e ialien und Me hoden
119
Hoechs 33258 (1 μg/ ml in EB) ge ä b . Nach zweimaligem Waschen in EB-Pu e konn en die
Emb yonen in EB (60% Glyce in) bei -20°C gelage we den. Die Emb yonen wu den schließlich mi
Hil e eines in e sen Mik oskops (Axio e 25; Ca l Zeiss) au einem Objek äge anhand de
Mo phologie ih e DNA den un e schiedlichen Zellzyklusphasen de Mi ose 14 zugeo dne .
En sp echende Emb yonen wu den e einig , in kEB homogenisie und 5 min bei 95°C gekoch .
4.5.4. Demecolzinbehandlung on D. melanogas e -Emb yonen
Um einen Zellzyklusa es inne halb de Mi ose zu bewi ken, wu den Emb yonen nach
en sp echende Kollek ion und Decho ionisie ung (Punk 4.2.3) in eine 1:1 Mischung aus Schneide s-
Medium (Gibco) (10 µM Demecolzin) und Hep an (je 300-700 µl, en sp echend de
Emb yonenmenge) übe üh und 20 min bei RT un e Ro a ion inkubie . In einem pa allelen Ansa z
wu den Emb yonen in eine Mischung aus Schneide s-Medium und Hep an ohne Demecolzin
inhibie . Nach de Inkuba ion wu den die Emb yonen zweimal mi Lysepu e (mi
P o easeinhibi o en) gewaschen, in eine en sp echenden Menge an Lysepu e (mi
P o easeinhibi o en) homogenisie und nach Zugabe on SDS-P obenpu e 5 min bei 95°C gekoch .
Um den E olg des Me aphasena es es zu übe p ü en, wu de ein Teil de Emb yonen nach de
Inkuba ion du ch Me hanol/Hep an ixie (Punk 4.2.4) und de en DNA du ch 5-minü ige Inkuba ion
in Hoechs 33258 (1 μg/ml in PBS) ge ä b .
4.5.5. Phospha asebehandlung on Emb yonalex ak en
Zu Phospha asebehandlung wu den Emb yonen nach dem Absammeln on de Ap elaga pla e
(Punk 4.2.3) decho ionisie und mi NaCl-Tx gewaschen. Die Anzahl de Emb yonen wu de du ch
eine skalie e Kapilla e bes imm . Es wu den jeweils 300 Emb yonen in 150 µl λ-Lysepu e (mi
P o easeinhibi o en) homogenisie . 50 µl des Homogena es wu den mi 1 µl λ-Phospha ase (NEB)
ü 15 min bei 30°C inkubie (+λ). Wei e e 50 µl des Homogena es wu den ohne Zugabe on λ-
Phospha ase analog inkubie (-λ). Anschließend wu den je 25 µl SDS-P obenpu e zugegeben und
die Ex ak e ü 5 min bei 95°C gekoch . Dem le z en Teil des Homogena es wu den λ-Phospha ase
und SDS-P obenpu e gleichzei ig zugegeben und unmi elba au gekoch (+λ†).
4.5.6. He s ellung dena u ie ende Ex ak e aus D. melanogas e -Geweben
Zu He s ellung dena u ie ende P o einex ak e on Emb yonen wu den diese nach de Kollek ion
(Punk 4.2.3) gesammel , decho ionisie , mi NaCl-Tx gewaschen und die Anzahl de Emb yonen
du ch eine skalie e Kapilla e ges imm . Nach Zugabe on 50 µl SDS-P obenpu e p o 100
Emb yonen wu den diese homogenisie und 5 min bei 95°C gekoch . Zu He s ellung
dena u ie ende P o einex ak e aus O a ien und Hoden wu den diese o e s in PBS p äpa ie
(siehe Punk 4.2.5), anschließend in Lysepu e (mi P o easeinhibi o en; 50 µl Lysepu e je 10
O a ien bzw. 25 Hodenpaa e) homogenisie und nach Zugabe on SDS-P obenpu e ü 5 min bei
95°C gekoch . Nach 1-minü ige Zen i uga ion (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 16000g, RT)
wu den die Ex ak e bis zu wei e en Ve wendung bei -20°C gelage .
4.5.7. SDS-Polyac ylamidgelelek opho ese (SDS-PAGE)
P o einex ak e wu den en wede du ch selbs he ges ell e 10%ige SDS-Polyac ylamidgele ode
du ch G adien engele (SERVAGel™ Neu al pH 7.4 G adien ) de Fi ma Se a au ge enn . Die
Elek opho ese and in en sp echenden Gelkamme n bei 100 bis 140 V in SDS-Lau pu e s a . Als
Molekula gewich ss anda d wu den PageRule P es ained P o ein Ladde (10-170°kDa Fe men as)
und PageRule Uns ained P o ein Ladde (Fe men as) eingese z .
Ma e ialien und Me hoden
120
4.5.8. Wes e nblo und immunologische Nachweis (Immunblo )
De T ans e de gelelek opho e isch au ge enn en P o eine au eine Hybond-ECL-Ni ozellulose
Memb an (GE Heal hca e) e olg e du ch Elek oblo en. Das Blo en wu de 1h bei 100 V in
T ans e pu e du chge üh . Die Memb an wu de nach dem T ans e mi Ponceau S ge ä b und die
Ma ke banden gg . mi einem Kugelsch eibe gekennzeichne . Du ch Spülen de Memb an in H2Odd
wu de die Fä belösung wiede en e n . Unspezi ische P o einbindungss ellen wu den du ch
eins ündiges Schwenken de Memb an bei RT in Milchpu e blockie . Anschließend e olg e die
Inkuba ion mi dem p imä en An ikö pe in Milchpu e (0,02% (w/ ) Na iumazid) übe Nach bei
4°C. Die Memb an wu de dann d eimal ku z und zweimal 30 min un e Schü eln mi Milchpu e
gewaschen. Nach 2-s ündige Inkuba ion de Memb an mi dem en sp echenden sekundä en
An ikö pe in Milchpu e , wu de diese e neu d eimal mi Milchpu e gespül und d eimal 15 min
gewaschen. Zule z wu de die Memb an d eimal ku z mi PBST gespül und zweimal 15 min in PBST
gewaschen. De Nachweis de Mee e ich-Pe oxidase gekoppel en sekundä en An ikö pe e olg e
du ch die ECL-De ek ionssys eme „ECL Plus Wes e n Blo ing De ec ion Reagen s“, ECL Ad ance
Wes e n Blo ing De ec ion Reagen s“ (GE Heal hca e) und „Two Bo le Subs a e“ (p.j.k.) nach den
Angaben des jeweiligen He s elle s. Die Signalde ek ion e olg e mi dem Luminescen Image
Analyze LAS-4000 (Fuji Co p.) mi de dazugehö igen So wa e Image Reade LAS-4000 2.0. Zu
wei e en Bea bei ung wu de Mul i Gauge (Fuji ilm) und Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.)
e wende . Die Blo s konn en nach „Ve gi en“ de Pe oxidaseak i i ä des sekundä en An ikö pe s
mi els 1-s ündige Inkuba ion de Blo s in Michpu e (0,02% (w/ ) Na iumazid) mi wei e en
p imä en An ikö pe n sondie we den.
4.5.9. De ek ion on P o einen im SDS-Gel du ch Au o adiog a ie
Zu De ek ion on adioak i ma kie en P o einen wu den diese wie besch ieben mi els SDS-PAGE
au ge enn . Nach Inkuba ion des Gels ü 1h in En ä belösung wu de dieses au Wha manTM Papie
(Schleiche & Schuell) ge ockne und du ch Au legen eines Phosphoimage -Schi ms (Fuji Co p.) ü
mindes ens 4h exponie . Die au o adiog aphische En wicklung e olg e un e Ve wendung eines FLA
7.000 Phosphoimage s (Fuji Co p.). Die wei e e Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe
Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) o genommen.
4.5.10. Silbe ä bung on SDS-Gelen
Zu Silbe ä bung on SDS-Gelen wu den diese nach de Elek opho ese meh mals mi H2Odd
gespül und anschließend mi dem „PageSil e Sil e S aining Ki “ (Fe men as) nach Angaben des
He s elle s ge ä b . Die Digi alisie ung de Gele e olg e du ch di ek es scannen (HP, Scanne ), die
Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.)
o genommen.
4.5.11. Kolloidale Coomassie-Blau-Fä bung on SDS-Gelen
Die Fä bung on SDS-Polyac ylamidgelen mi kolloidalem Coomassie e olg e nach (Candiano e al.,
2004). Dabei wu den SDS-Gele nach de Elek opho ese meh mals mi H2Odd gespül und dann übe
Nach in kolloidalem Coomassie, dem ku z o Geb auch Me hanol in eine Konzen a ion on 20%
( / ) zugese z wo den wa , bei RT inkubie . Die En ä bung e olg e du ch meh ägige Inkuba ion in
H2Odd. Die Digi alisie ung de Gele e olg e du ch di ek es scannen (HP, Scanne ), die
Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.)
o genommen.
Ma e ialien und Me hoden
121
4.5.12. Massenspek ome ische Analyse
Zu massenspek ome ischen Analyse wu den die P o einp oben zunächs du ch SDS-
Gelelek opho ese au ge enn und kolloidal Coomassie ge ä b (Punk 4.5.11). Die Gele wu den
du ch Scannen (HP, Scanne ) digi alisie und mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3
(Adobe Sys ems Inc.) bea bei e . So konn en Be eiche ma kie we den, welche spä e analysie
we den soll en. Die Gele wu den schließlich in H2Odd ge üll e En so gungsbeu el (Roche)
eingeschweiß und zu Mass Spec ome y Co e Facili y des Max Planck Ins i u s nach Ma ins ied
e schick , wo eine NanoLC-MS/MS-Analyse du chge üh wu de. Hie bei wu den die P o eine aus
dem SDS-Gel ex ahie , yp isch e dau , du ch on-line nanoLC sepa ie und du ch elec osp ay
andem Massenspek ome ie mi els eines LTQ O bi ap Massenspek ome e s analysie .
4.6. In i o In e ak ions-Assay
4.6.1. Übe p ü ung des P o einmodells on CapD3
Fü den in i o Assay wu de die einzelnen Condensin-Un e einhei en in i o ansk ibie und
ansla ie . Hie zu muss en en sp echende, in i o ansk ibie ba e Plasmide he ges ell we den. Da
im in i o-Sys em kein mRNA-Spleißen s a inde , muss en die Klonie ungen ausgehend on cDNA-
Klonen de einzelnen Condensin-Un e einhei en du chge üh we den. Zu Ampli ika ion on SMC4
wu de hie bei selbs he ges ell e cDNA aus 4-8 S unden al en Emb yonen (T unze , pe sönliche
Mi eilung) e wende . Fü die Ampli ika ion de wei e en Condensin-Komponen en wu den die in
Tabelle 5 au ge üh en cDNA-Plasmide eingese z . Fü CapH2 und CapD3 sind bei lybase
(www. lybase.o g) e schiedene P o einmodelle o geschlagen, die au un e schiedlichen
T ansk ip ionsmodellen be uhen. Die Klonie ung on CapH2 wu de basie end au dem P o einmodell
PA du chge üh . En sp echend diesem Modell wu den auch die UASP-mche y-CapH2 und UASP-
EGFP-CapH2 ansgenen Fliegen gene ie (P ei e , 2009; Hä ne , 2009), de en Funk ionali ä in
diese A bei bes ä ig we den konn e (siehe E gebnisse, Abschni 2.2.2.3). Fü CapD3 sind d ei
e schiedene T ansk ipi ionsmodelle sowie de en ko espondie ende P o eine o geschlagen
(Abbildung 32). Modell A und B un e scheiden sich hie bei nu im Be eich de 5’UTR (un ansla ed
egion), die ko espondie enden P o eine CapD3-PA und CapD3-PB sind iden isch. Dem Modell RC zu
Folge soll e on einem e kü z en T ansk ip die T ansla ionsini ia ion e s im Exon 2 e olgen, wobei
ein N- e minal e kü z es P o ein gebilde wü de (CapD3-PC).
Um die P äsenz de CapD3-T ansk ip e in D. melanogas e zu p ü en, wu den mRNA´s aus
e schiedenen wild ypischen Fliegengeweben (w1-Emb yonen un e schiedlichen Al e s, w1-
Fliegenweibchen, w1-Fliegenmännchen) p äpa ie und mi els e e se T ansk ip ion in cDNA
umgesch ieben (Punk 4.4.9). Diese cDNA´s wu den schließlich als Ma izen ü PCR-Reak ionen
eingese z . Anhand de Ampli ika ion de cDNA ü RpL32 (Ribosomal p o ein L32), welches in allen
Geweben gleich abundan ansk ibie we den soll e, konn en die e hal enen cDNA´s de
un e schiedlichen Fliegengewebe no mie we den. Es wu den ebenso de CapD3 cDNA-Klon
RE74832 und aus adul en w1-Fliegen p äpa ie e, genomische DNA (Punk 4.4.8) als Ma izes ü die
PCR eingese z . Zu PCR-Ampli ika ion wu den die in Abbildung 32 angegebenen P ime eingese z ,
welche an e schiedenen Be eichen des CapD3 anlage n. Du ch Ampli ika ion mi dem
Oligonukleo id-Paa SaHe18/SaHe19 konn e ein P oduk in den cDNA-P oben de ühen Emb yonen
und ein seh schwaches P oduk in den cDNA-P oben de Fliegenmännchen e hal en we den, dessen
G öße eine Ampli ika ion on cDNA gemäß de T ansk ipi ionsmodelle RA bzw. RB en sp ich . Die
Klonie ung de CapD3-Kons uk e wu de dahe basie end au dem T ansk ip ionsmodell RA bzw. RB
o genommen, de en P o einmodelle übe eins immen.
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128
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ch oma id sepa a ion inhibi o in ol ed in ans o ma ion and umo igenesis. Science.
285:418-422.
Anhang
137
7. Anhang
Zusammens ellung de du ch die Massenspek ome ie iden i izie en P o eine de un e such en P äzipi a e
in alphabe ische Reihen olge. Iden i izie e P o eine nach Immunp äzipi a ion aus CapG-mRFP1-
Emb yonenex ak en (A1), CapG-mRFP1-O a ienex ak en (A2) und w1-O a ienex ak en (A3) du ch
Kaninchen-an i-mRFP Sepha ose. Den Ex ak en de w1-O a ien wa bak e iell exp imie es mRFP1-P o ein
zugese z wo den. Iden i izie e P o eine nach Immunp äzipi a ion aus EGFP-SMC4 en hal enden
O a ienex ak en du ch Kaninchen-an i-EGFP Sepha ose (A4), sowie nach Immunp äzipi a ion aus mche y-
CapH2 und EGFP-CapH2 en hal enden O a ienex ak en du ch Kaninchen-an i-mche y Sepha ose bzw.
Kaninchen-an i-EGFP Sepha ose (A5). Die du ch die Massenspek ome ie e ass en Da en de in den
P äzipi a en iden i izie en P o eine wu den wie in Abschni (siehe E gebnisse 2.2.2.1) p ozessie . Angegeben
sind alle e bliebenen P o eine in alphabe ische Reihen olge, die Spezi i ä ih e Pep idmassenzuo dnung
(Co e age), ih Molekula gewich (MW), de gemi el e We des Gelbe eiches, in dem die meis en Pep ide
iden i izie wu den (SA), die Anzahl de Pep ide, die dem en sp echendem P o ein zugeo dne we den
konn en (PEP), sowie die In ensi ä mi de die Pep ide iden i izie wu den (INT). In g au sind die im Tex
e wähn en P o eine he o gehoben.
A1) CapG-mRFP1-Emb yonen O bi_0112
P o ein
Co e age [%]
MW[kDa]
SA
PEP CapG
PEP w1
INT CapG
INT w1
Ac 5C-PA
41,2
42
6,6
17
57
1660500
27681000
alphaTub67C-PA
19,7
51
5,0
3
7
539520
1183600
alphaTub84B-PA
31,1
50
5,5
14
24
2258500
10668000
ATPsyn-be a-PA
40
54
6,0
8
16
619220
2259300
ba -PA;ba -PB
34,6
83
5,2
34
29572000
0
be aTub56D-PB
45,4
50
5,7
33
60
4094900
31003000
blw-PA
20,5
59
6,2
8
11
590120
2405000
CAP-D2-PA;bnl-PA
37,5
158
3,5
158
1
84385000
25022
Cap-G-PA
5,8
132
3,6
11
971730
0
Cc gamma-PA
17,5
59
5,0
4
10
326840
790040
CG11700-PA;CG32744-PA;Ubi-p63E-PA
22,6
34
5,4
22
20
4574000
3875400
CG15092-PA
11,6
36
6,6
3
9
347000
892580
CG6439-PA
7,8
40
7,0
2
3
121650
384930
CG6459-PA
7,2
29
8,0
2
1
625080
66440
CG6842-PA
5,4
50
3,3
7
9
828710
810100
CG6904-PA
9,9
82
5,0
6
4
482910
344180
CG8010-PA
23
44
5,0
9
10
1798000
2724800
CG8258-PA
7,7
59
5,0
2
2
97323
93201
CG8863-PA;
9,4
45
6,3
2
5
135860
535960
CG9461-PA
6,9
125
4,3
11
7
891880
525910
Chc-PA
17
191
3,0
15
26
1092100
3492100
CLIP-190-PA
20,9
189
2,3
2
47
1644500
4116600
cul-2-PA;cul-2-PB
13,8
87
5,0
8
11
833400
1411900
dap-PA
6,1
27
5,5
10
10
2295500
1982100
didum-PA
27,2
207
2,3
6
64
841530
12049000
E 1alpha48D-PA
23,3
50
6,6
9
19
1653600
7225300
E 2b-PA
10
94
5,0
9
4
1188700
478270
gammaTub37C-PA
19,9
51
6,0
5
11
322620
2260900
glu-PA
48,8
160
2,2
198
1
126540000
0
His2A:CG31618-PA
7,3
13
6,0
3
4
777640
605240
His2B:CG17949-PA
20,3
14
8,8
2
3
115230
63971
His4:CG31611-PA
17,5
11
7,4
2
5
165190
349330
Hsc70-3-PA;
25,8
72
5,0
18
17
4011800
3941500
Hsc70-4-PA
54,2
71
5,1
52
56
36548000
37354000
Hsc70-5-PA
7,1
74
6,1
8
8
772400
618480
Hsp26-PA
17,3
23
8,0
2
3
102560
219150
Hsp83-PA
10,2
82
5,0
6
6
896170
636140
Imp-PA
10,1
62
5,0
4
1
300780
27498
Ja ac1-PA;Ja ac1-PB
5,7
22
5,2
9
6
556250
381910
ja -PA
32,2
144
3,7
14
89
1440200
22498000
l(1)G0022-PA
12,2
58
5,0
5
5
410100
871480
l(1)G0156-PA;CG32026-PA
25,4
39
7,0
8
12
706560
2112500
mod(mdg4)-PF;mod(mdg4)-PA
13,6
59
5,0
7
6
421560
753840
Nap1-PA
13
43
5,6
3
6
200650
1003400
oho23B-PA
62,7
9
9,4
3
4
338160
492760
pAbp-PA
33,1
70
5,3
25
26
3823800
5736900
Pa 1-PA
7,3
79
5,0
3
8
419550
1209100
Pcm -PA
27
25
8,0
8
11
2749500
7217600
piwi-PA
5,9
97
5,0
5
2
569770
188080
pon -PA
16
50
5,0
3
7
324970
683170
Qm-PA;Qm-PB
14,7
26
7,9
5
5
1541000
2027200
Rack1-PA
25,5
36
7,0
10
9
3236700
3220900
-PA; -PB
6,1
247
1,6
13
13
1331600
1576100
sesB-PA
32,1
33
7,8
17
13
11578000
7376300
SMC2-PA
48,5
134
4,2
121
4
101560000
93326
Anhang
144
eEF1del a;CG4912
12,1
29
2
2
386290
E 1alpha48D;EF1B;F1;CG8280;E 1alpha100E;EF1a;F
2;CG1873
39,1
50
3,27
47
73740000
E 1be a;CG6341
23,4
29
2
6
2750700
E 1gamma;E 1g;CG11901
24,8
49
3
10
4941000
E 2b;CG2238
44,5
94
4,12
42
20037000
EG:118B3.2;CG13366
18,6
122
4,79
24
3809000
EG:25E8.1;CG2918;Dmel_CG2918
11,3
103
5
9
1638500
EG:34F3.8;CG12467;CG7359
9,5
25
2
2
238560
eIF-3p40
16,6
38
3
3
546390
eIF-3p66;CG10161
9,5
64
4
4
1365600
eIF3-S10;CG9805
20,3
134
5
24
4109100
eIF3-S8;Dmel_CG4954
11,1
106
4,71
16
1689600
eIF3-S9;Dmel_CG4878
16,8
80
4
11
2378800
eIF-4a;eIF4A;l(2L)162;CG9075
15,1
46
3
5
1625700
eIF4AIII;CG7483
34,8
46
3,12
17
5694100
eIF-4E;Dmel_CG4035
41,7
29
2,88
11
2709600
eIF-4G;Dmel_CG10811
32,3
211
5,52
102
29368000
eIF6;CG17611
10,6
26
2
2
315720
Elongin-B;CG4204;Dmel_CG4204
64,4
13
1
7
1704500
Elongin-C;CG9291;Dmel_CG9291
41
13
1
8
1157400
epsilonCOP;BcDNA.LD29885;epsilon-COP;CG9543
13,7
35
2,2
4
972730
ERp60;CG8983;Dmel_CG8983
7
55
3,25
3
430470
exba;Dmel_CG2922
7,6
49
3
3
263880
exu;CG8994
31,2
58
3,96
17
17366000
Fas1;CG6588
5
74
4
2
475630
Fcp26Aa;CG9050
10,8
41
4,25
8
8962700
Fcp26Ac;CG13997;Dmel_CG13997
7,7
19
1
2
115550
Fe 1HCH;Fe 1
12,7
23
1,5
2
166010
Fe 2LCH;CG1469
12,3
25
1,88
5
412070
Fib;CG9888
41
35
2,96
16
6782900
Fim;CG8649;Dmel_CG8649
15
72
3,15
13
1807800
FK506-bp1;FKBP39;CG6226
28,3
39
3,12
19
3399500
liI;CG1484
18,1
144
4,91
23
6307700
Flo-2;FLODm-2;CG32593
8
48
3
3
271020
lw;PP1-9C;PP1-BETA-9C;CG2096
5,9
51
3
2
354180
Fm 1;FXR;CG6203
20,8
76
4
12
3631200
on;CG15825;Dmel_CG15825
15,1
58
3,83
5
1070900
s(1)M3; s(1)ph
16,5
207
5,37
38
9953000
s(1)N;EG:8D8.1;CG11411
19,9
239
5,36
56
13438000
Fs(2)Ke ;CG2637
12,1
99
4
9
2399900
gammaCop
18,1
98
4
16
4012900
gammaTub37C;TubG2;TubG37C;CG17566
34,4
51
3,39
20
8515800
Gbp;CG5519
5
55
3,25
3
284750
Gel;CG1106
16,6
98
3,13
14
4484700
Gl ;CG9280
17,5
119
5,05
20
10591000
gnu;CG5272;Dmel_CG5272
7,5
27
2
2
340490
gp210;Dmel_CG7897
24,7
210
6
36
12001000
G ip71;CG10346
9,9
72
4
4
923750
G ip75;75p;CG6176
8,8
75
4
6
1011300
G ip84;Dmel_CG3917
13
107
4
11
2963200
g owl;CG14648
48,1
60
4
23
13785000
His2A:CG31618;His2A:CG33808;His2A:CG33814;His
2A:CG33817;His2A:CG33820;His2A:CG33823;His2A:
CG33826;His2A:CG33829;His2A:CG33832;His2A:CG
33835;His2A:CG33838
37,1
13
2,21
10
15891000
His2B;His2B:CG17949;CG33868;CG33870;His2B:CG3
3872;His2B:CG33874;His2B:CG33876;His2B:CG3387
8;His2B:CG33880;His2B:CG33882;His2B:CG33884;Hi
s2B:CG33886
43,1
14
1,52
15
15253000
His3.3A;CG5825;His3.3B;CG8989;His3:CG31613;His3
:CG33803;His3:CG33806;His3:CG33809;His3:CG338
12;His3:CG33815;His3:CG33818;His3:CG33821;His3:
CG33824;His3:CG33827;His3:CG338
15,4
15
2,33
6
3204300
His4;H4;His4 ;H4 ;CG3379;His4:His4:CG33869;His4:
CG33871;His4:CG33873;His4:CG33875;His4:CG3387
7;His4:CG33879;His4:CG33881His4:CG33883His4:C
G33885;His4:CG33887
51,5
11
1,65
13
12667000
hkl;CG10473
5,5
84
5
3
379010
hoip;CG3949
36,2
14
1
3
1987100
H b27C;h p48;Rbp7;CG10377
30,4
45
3
19
6216300
H p59;CG9373
9,7
67
4
5
798360
Hsc70-3;Hsc3;CG4147
45,1
72
3,99
40
43022000
Hsc70-4;Hsc4;CG4264
63,3
71
3,88
101
269390000
Hsc70-5;Hsc5;CG8542
32,9
74
3,85
23
8339900
Hsp26;CG4183
53,8
23
2
15
24070000
Hsp27;CG4466
54,5
24
2
14
12144000
Hsp60;Mmp-P1;CG12101
36,5
61
3,97
21
6335200
Hsp83;Hsp82;CG1242
36,7
82
4,07
23
9275100
h s;Dmel_CG9325
52,2
128
3,79
101
67233000
hyx;CG11990;Dmel_CG11990
5,9
61
4
2
166710
ik2;CG2615
11,7
82
4
8
1880100
Imp;CG1691
28,3
62
4
16
3370400
In 6;CG9677
11
51
3
5
1214000
i d5;DIK;CG4201
16,2
86
4
14
2217500
Ja ac1;TPX-1;CG1633
10,8
22
2,43
2
286940
Ja ac2;CG1274;Dmel_CG1274
31,8
27
2
7
2116400
ja ;Mhc95F;CG5695
60,7
145
4,88
225
428380000
Kap-alpha3;Kap-alpha-3;CG9423
5,8
57
3,33
2
432520
kek5;Kek5
11,3
102
4,6
10
1003300
key;IKKGAMMA;CG16910
15
44
3
4
593680
Klp3A;EG:BACR25B3.9;CG8590
12,5
136
5
13
1611300
ks ;Dmel_CG12008
17,3
497
5,93
71
17536000
l(1)dd4;CG10988
14,5
104
4,18
12
3152200
l(1)G0022;CG8231;Dmel_CG8231
16,9
58
4
9
2667800
l(1)G0156;CG12233
46,9
41
2,94
19
9215200
l(1)G0222;Dmel_CG8465
7,4
129
5
10
1700800

Anhang
145
l(2)03709;CG15081;Dmel_CG15081
11,5
37
2
3
370130
l(2) id;CG5504
18,3
56
3
5
968000
Lam;CG6944
28,9
71
4
16
4871200
LamC;CG10119
8,2
70
4
4
402400
LanA;lamA;CG10236
6,2
411
5,79
15
1991700
LanB1;lamB1;CG7123
16,3
198
5,8
27
6354200
LanB2;LAMC1;LAMG1;CG3322
23,4
182
5,33
34
10478000
la p;Dmel_CG14066
13,2
151
5,78
17
2931900
Lasp;CG3849
7,2
74
4
4
576540
lic;MKK3;p38MAPKK;CG12244
15,3
38
3
2
304740
lig;CG8715
9
139
5,12
7
1294000
l a;CG6450
60,3
316
5,8
230
154450000
mbo;Nup88;CG6819
14,7
79
4
10
1521700
Mbs;CG32156
11,5
124
5
11
1622600
Mc ;CG7586;Dmel_CG7586
6,6
203
6
10
1649300
me31B;CG4916
66,4
52
3,12
42
32885000
Men
18,9
85
4,08
11
3245000
Mlc1;MLC-ALK;CG5596
23,2
18
1
4
2345000
Mlc2;CG2184
50
24
1,92
22
9451300
Mlc-c;CG3201
52,4
17
1,05
13
31469000
mod;CG2050
10,1
60
4
4
879950
Moe;Dmel_CG10701
40,2
76
3,95
40
21020000
mRpL17;CG13880;Dmel_CG13880
9,7
21
1
2
131720
msk
5,2
119
5
5
524010
M o ;Dmel_CG8274
11,6
262
5,82
21
3183400
m m;anon-D52;CG18543
29,5
25
2
5
1088600
m SSB;lopo;CG4337
63
16
1
13
7455600
mud
11,5
289
6
20
4627500
Myo31DF;CG7438
27,3
117
4,75
30
5261600
Myo61F;Dmel_CG9155
53,1
121
4,61
131
134940000
Nap1;CG5330
38,1
43
3,31
30
34601000
Ndg;Dmel_CG12908
12,6
151
5,41
19
4647400
ndl;CG10129
25,2
292
5,34
128
123150000
NHP2;CG5258
18,1
18
1
4
715920
ni o;BcDNA.GH11110;CG2910
8,4
89
4
6
596550
Nlp;CRP1;CG7917
23,7
17
2
4
1000800
nop5;Dnop5;CG10206
49,3
57
3,96
21
9200600
Nop56;CG13849
24
55
3,3
14
7093100
Nop60B;m l;CG3333
13
57
3,6
12
2188300
N g;CG1634
7,5
144
5
9
1329100
Nup133;CG6958
10,2
135
5
13
2754400
Nup154;CG4579
19,7
154
5
27
5969400
Nup170;CG6743
17,6
97
4
14
4077900
Nup358;CG11856
16,3
296
5,54
55
14955000
Nup75;CG5733
12,9
77
4
8
2688700
Nup98;CG10198
8,6
210
4,4
19
3265900
oho23B; pS21;CG2986;Dmel_CG2986
63,9
9
1
7
4442200
O e;CG5581
6,1
47
3,33
2
212750
p24-
2;CG33105;Dmel_CG33105;eca;CG9443;CG33104;
8,6
28
2
3
303960
P5c ;CG6009
8,9
30
2
3
128590
pAbp;CG5119
60,3
70
3,75
67
78034000
Pa 1;CG10695;Dmel_CG10695
39,8
79
4,01
48
45880000
Pdi;CG6988
9,7
56
3,33
4
507810
pen;CG1685
8,5
81
4,11
7
1235200
Pen;CG4799
13
58
3,89
6
811780
pgan 5;CG9152/CG31651
8,3
72
4
4
387420
piwi;CG6122
39,3
97
4
34
10232000
pix;CG5651;Dmel_CG5651
11,8
69
4
6
1242400
pon ;CG4003
47,1
50
3,56
16
6327800
po in;POR-1;VDAC;CG6647
21,3
31
2
4
458310
Pp1-87B;CG5650;Pp1-13C;CG9156
48
35
2,06
16
9071100
Pp2A-29B;CG17291
10,3
65
3,83
6
772050
PpV;PPPV6A;CG12217
6,6
35
2
2
187960
P m;CG5939
54,2
102
4,15
60
24411000
P os26.4;P26s4;CG5289
10,5
49
3,43
4
294200
P os26;CG4097
14,5
26
2
2
208340
P os28.1;PROS-28.1;CG3422
14,5
28
2
3
246420
P os29;PROS-29;CG9327
7,6
29
2
3
432240
P os54;PROS-54;CG7619
7,1
43
3
2
228650
P osalpha6;CG18495
32,8
27
2
5
873540
P osalpha7;CG1519
16,6
28
2
3
288530
p p8;Dmel_CG8877
7,6
280
6
17
3123400
pU 68;h p;CG12085
11,8
68
4
6
1413000
PyK;CG7070
27,8
57
3,79
3
586980
qk 58E-1;CG3613
9,6
45
3
3
350580
Qm;RpL10;CG17521
38,8
28
2,1
19
33973000
qua;CG6433
48,8
101
4,29
74
92756000
;CG18572
23,1
247
5,91
37
11827000
Rab1;CG3320;Dmel_CG3320
10,2
23
2
2
104630
Rack1;CG7111
63,5
36
2,16
31
58550000
Rae1;CG9862
11
39
3
3
473120
an;Ran10A;CG1404
33,8
25
2
6
1414500
Ranbp9;CG5252;Dmel_CG5252
11,4
114
5
11
1462300
RanGap;Sd;CG9999
18
66
4
8
2295600
Anhang
146
dx;HIB;CG12537
9,2
90
3
7
1327100
ep ;CG9750
35,3
54
3,49
16
5573400
R aBp
15,1
373
5,4
42
9904200
hea;Talin;CG6831
10,2
307
6
23
3874400
RhoGEF2;Dmel_CG9635
9,8
281
5,86
22
3766800
ig;CG30149
5,7
138
5
5
678800
in;CG9412;Dmel_CG9412
17,8
75
4
12
3939300
Rm62;Dmel_CG10279
15,2
79
3,43
10
1500700
Roc1a;CG16982
22,2
13
1
2
691190
Sap- ;CG12070
15,1
106
4,88
16
2861900
Sc2;CG10849
18,9
34
2
5
851850
Scsalpha;CG1065
15,5
34
2,8
3
295060
Scs- p;CG17246
13,2
72
4
6
852260
scu;CG7113
10,6
27
2
2
187920
sec13
6,5
40
3
2
568890
sec23;CG1250
20,7
87
4
15
2700200
sesB;A/A-T;CG16944
59,6
34
2,02
28
45981000
SF2;p28/SF2;CG6987;Dmel_CG6987
40
28
2
13
2476400
shg;gp150;CG3722
7,4
170
4,27
11
1251200
sho ;Dmel_CG18076
9,7
990
5,87
85
16243000
sh b;Vps32;CG8055;Dmel_CG8055
28,3
25
3
7
3473900
skpA;D edd;EG:115C2.4;CG16983
22,2
19
1
3
404180
sli ;CG11128;Dmel_CG11128
8,3
66
4,07
14
2200200
slmb;slimb;CG3412
8
59
3,33
4
327090
SmB;CG5352
22,1
21
1,73
7
1479000
SmD3;gu 2;CG8427
12,6
16
1
2
1102600
sn ;D25; s(1)1621;liz;CG4528
8,3
25
2
2
604610
snRNP69D;CG10753
19,4
14
1
2
305750
sop;RpS2;CG5920
50,6
29
2,07
26
46994000
spi ;p150-Spi ;CG10076
6
115
5
5
356780
Spn;CG16757
12
233
5,79
29
5361700
sqh;CG3595
64,9
20
1,11
21
18501000
S p68;CG5064
5,3
69
4
4
302090
ssh;CG6238
13,5
132
5
15
2968600
s a;CG14792
60,7
35
2,87
25
44612000
Su( a )3-9;KMT1;CG6476
20
51
3
7
965210
Su 4;Su -4;CG6202
12,6
31
2
3
451770
swa;CG3429
60,2
62
3,98
42
22583000
Tango1;CG11098
10,3
159
5,88
16
2861600
T-cp1;CCT-1;Tcp-1;CG5374
22,8
60
4
9
2275700
TER94;CG2331
9,4
89
4
6
1040000
TFAM;Dmel_CG4217
7,7
33
2
3
179590
Thiolase;CG4581
21,7
51
3
10
3294200
imeou ;Dmel_CG7855
14,1
159
5,05
19
2762700
Tm2;TmI;CG4843
71,5
33
2,77
75
86344000
mod;SPDO;spdo;CG1539
27,4
59
3,14
21
13972000
TpnC47D;TnC47D;CG9073
19,4
18
1
4
522530
TpnC73F;TnC73F;CG7930
65,2
18
1
20
8802600
TppII;CG3991
11,5
159
5,04
16
1792700
al;BEST:GH08269;CG10686
38,8
69
4,04
28
21185000
T ip1;DmTRIP;CG8882
17,5
36
3
4
598990
Tsp74F;CG5492;Dmel_CG5492
16,1
26
2
5
591350
s ;Cad ;CG4254
31,1
17
1
4
1078600
Tudo -SN;CG7008
5,1
103
5
4
343880
um;Dmel_CG13345
5,6
70
4
3
580120
w ;CG3172
7,9
39
3
2
171160
U2A;CG1406
10,2
30
2
3
232720
unc-115;CG9489;dunc-115l;CG31332;CG31352
38,6
90
4,14
43
12529000
up;in ;CG7107
41,2
47
3,19
36
72997000
up;in ;CG7107
9,6
47
3,2
3
5852700
Vap-33-1;Dmel_CG5014
15,2
29
2
4
503540
Vha100-2;CG18617;Dmel_CG18617
22,4
95
4,05
22
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Vha26;CG1088
28,8
26
2
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1597400
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11,2
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3,33
7
1201300
Vha68-2;VHAA2;CG3762
30,3
68
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VhaAC39;CG2934
17,7
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3
4
1464900
VhaM9.7-2;CG7625
28,1
10
1
2
188200
Vinc;CG3299
5
106
1,5
6
465380
Vm32E
26,7
12
1
3
578540
wupA;HDP;TnI;CG7178
38,9
24
1,97
22
42672000
xl6;9G8;Dxl6;CG10203;Dmel_CG10203
9,7
28
2
2
274870
yellow-g;Dmel_CG5717
28,2
43
3
9
3097500
yellow-g2;Dmel_CG13804
8,4
43
2,6
4
1265400
yl;CG1372
24,8
220
5,74
75
46672000
Yp1;CG2985
43,7
49
3,88
67
53108000
Yp2;CG2979
50,9
50
3,48
61
72422000
Yp3;CG11129
68,3
46
3,52
55
90561000
yps;CG5654
41,8
38
3,47
17
6062500
Zeelin1;z1
11,8
42
1,8
5
511270
zip;CG15792
65,1
237
5,5
537
1188800000
zpg;inx4;CG10125
11,7
43
2,14
7
1063400
19,6
168
4,82
33
9348000
Anhang
147
A4) EGFP-SMC4-O a ien O bi_0321
P o ein Desc ip ions
Co e age [%]
[kDa]
SA
PEP E1
PEP ho E
INT E1
INT ho E
>14-3-3epsilon-PA
24
30
5
12
5
1543800
2265900
>14-3-3ze a-PA
11
28
5
1
2
77975
384060
>26-29-p-PA
14
62
5
8
7
1854500
1592600
>Aa s-ile-PA
5
141
3
5
2
1568200
445480
>Aa s-lys-PA
7
65
4
3
0
572960
0
>Ac 57B-PA
23
42
5
30
11
115920000
22962000
>Ac 5C-PA
71
42
5
102
67
667910000
244950000
>Ac 87E-PA
6
42
5
2
2
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430640
>alphaCop-PA
19
139
3
24
6
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2360000
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25
278
1
63
16
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9590300
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22
51
5
8
4
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45
50
5
30
17
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>A c-p34-PA
8
35
5
0
2
0
325150
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14
64
4
7
0
1511600
0
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35
54
5
13
10
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23
33
6
4
3
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>aub-PA
16
99
4
15
4
5418400
910620
>awd-PA
25
19
7
3
2
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305960
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30
83
3
47
28
66636000
28864000
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29
85
4
25
7
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2349400
>ben-PA
10
17
7
2
0
194000
0
>be aCop-PA
14
107
4
13
4
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878890
>be a'Cop-PA
10
103
3
11
3
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1154400
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16
266
1
39
8
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7415700
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35
50
5
38
27
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>be aTub97EF-PA
13
59
5
11
3
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>BicC-PA
11
98
3
13
4
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655710
>bi -PB
7
130
3
10
4
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19
59
5
10
7
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4315100
>bo -PA
9
68
4
7
3
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10
47
5
3
1
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234130
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63
17
7
15
13
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2579000
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42
158
2
128
86
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125160000
>Cap-G-PA
18
132
2
34
17
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5900600
>ca hD-PA
19
42
5
5
2
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7
69
4
3
0
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0
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22
88
4
15
7
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2582100
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21
35
5
4
4
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3
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>CG10306-PA
22
26
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2
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13
33
5
3
2
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935860
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22
43
5
7
3
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343560
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10
83
4
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1
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9
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1
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3
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3
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0
>CG11999-PA
10
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6
2
1
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3
3
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946170
>CG12264-PA
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51
5
4
0
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0
>CG13084-PA
8
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5
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1
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569060
>CG14309-PA
8
107
4
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2
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4
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5
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2
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2
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3
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20
6
2
0
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0
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28
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2
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6
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>CG3061-PA
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2
2
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2
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9901700
>CG31012-PA
7
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3
3
0
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0
>CG32164-PA
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7
0
2
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1
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193920
>CG3394-PA
6
77
4
3
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318910
0
>CG3428-PA
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5
4
1
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637410
>CG3909-PA
8
36
5
2
2
730680
442030
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33
110
3
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30
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33403000
>CG4164-PA
13
40
5
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406020
>CG4169-PA
20
45
5
5
0
3488700
0
>CG4389-PA
8
84
4
5
1650700
0
Anhang
148
>CG4692-PA
21
12
7
2
1
336440
297000
>CG4849-PA
9
111
3
6
1
1998800
202780
>CG5214-PA
8
50
5
2
1
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131520
>CG5366-PA
10
139
2
9
10
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3214800
>CG5525-PA
6
57
5
3
1
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318570
>CG5599-PA
12
50
5
4
1
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283520
>CG5604-PA
6
302
1
12
1
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576510
>CG5641-PA
8
44
5
3
0
922560
0
>CG5642-PA
7
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5
3
1
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402750
>CG6439-PA
18
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5
3
6
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2263800
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7
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5
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0
>CG7519-PA
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0
>CG7911-PA
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1
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143770
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2
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2
1
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108320
>CG8507-PA
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2
1
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113110
>CG8578-PA
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1264600
>CG8863-
35
45
5
15
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9492600
>CG8885-PA
18
28
6
3
1
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77203
>CG8963-PA
8
63
4
4
0
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0
>CG9050-PA
6
41
4
4
2
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10
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4
5
0
1663400
0
>CG9281-PB
19
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4
15
3
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1239400
>CG9911-PA
10
47
5
4
0
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0
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14
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4
1
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>CG9953-PA
7
57
5
3
0
1180500
0
>Chc-PA
12
191
2
17
9
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2585100
>che -PA
12
239
3
33
10
12207000
1852100
>CkIalpha-PA
10
40
5
1
3
623050
503620
>CkIIalpha-PA
12
40
5
4
3
2773700
761220
>ck-PA
14
250
2
27
8
24216000
3745800
>CLIP-190-PA
30
189
2
48
14
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10801000
>co o-PA
9
57
4
5
3
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1296000
>Cp19-PA
57
19
7
6
4
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1819000
>Cp36-PA
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5
10
6
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1910700
>Cp38-PA
20
30
6
15
12
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9603900
>cpb-PA
16
31
5
5
3
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1097600
>c p-PA
63
10
7
3
4
774620
1519300
>cul-2-PA
16
87
4
10
1
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149900
>cup-PA
30
127
3
45
22
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10973000
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18
179
5
47
10
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>del aCOP-PA
17
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4
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187580
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31
12
7
3
5
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1340300
>Dhod-PA
7
44
5
2
0
407130
0
>didum-PA
43
207
2
127
73
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108860000
>D p1-PA
8
83
4
4
1
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265120
>E 1alpha48D-PA
24
50
4
30
26
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42901000
>E 1be a-PA
9
29
6
2
2
808610
574660
>E 1gamma-PA
11
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5
4
1
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291520
>E 2b-PA
23
94
4
18
5
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2805400
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7
75
4
4
0
1709200
0
>eIF3-S10-PA
8
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1722300
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5
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14
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2
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1768300
>eIF-4E-PA
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5
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2007700
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39
150
2
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25631000
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8
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5
3
3
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998280
>Elongin-B-PA
32
13
7
2
1
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179430
>emb-PA
7
123
3
7
0
1463200
0
>eRF1-PA
12
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1
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>ERp60-PA
5
55
5
2
0
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0
>exu-PA
14
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4
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>Fib-PA
30
35
5
10
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4817000
> i -PA
9
14
7
1
3
41596
468810
>FK506-bp1-PA
8
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6
4
5
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> liI-PA
5
144
3
6
1
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134910
>Fm 1-PA
11
76
4
5
0
967660
0
>gammaCop-PA
5
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6
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1130700
>gammaTub37C-PA
29
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>Gl -PA
15
119
2
17
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4429600
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57
160
2
149
387
189860000
2967800000
>Gp93-PA
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90
4
5
0
4533000
0
>G ip71-PA
6
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4
3
0
914090
0
>G ip75-PA
8
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4
4
0
2079700
0
>G ip84-PA
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1281500
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28
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3741700
>His4:CG31611-PA
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6
11
13
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>hoip-PA
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14
7
4
2
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792180
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28
72
4
26
21
95719000
38608000
>Hsc70-4-PA
50
71
4
114
80
523510000
342220000
>Hsc70-5-PA
24
74
4
16
4
9528800
553860
Anhang
149
>Hsp26-PA
75
23
6
34
29
97334000
91928000
>Hsp27-PA
50
24
6
26
25
50469000
57367000
>Hsp60-PA
19
61
4
9
3
1714600
488650
>Hsp83-PA
12
82
4
9
4
12905000
3514300
>h s-PA
18
128
4
16
4
4528900
894400
>ida-PA
5
89
4
3
0
821070
0
>Imp-PA
15
62
4
10
1
3657800
150530
>In 6-PA
7
51
5
2
0
1005000
0
>Ja ac1-PA
19
22
5
3
6
796710
1093500
>ja -PA
41
144
3
131
68
287500000
147120000
>Kap-alpha3-PA
6
57
5
2
2
932140
337870
>Ka ybe a3-PA
6
124
3
5
1
1090000
301990
>Klp3A-PA
6
136
3
6
2
2062800
268980
>ks -PA
8
472
1
26
1
6012100
293380
>l(1)dd4-PA
13
104
4
10
1
5995700
62310
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58
4
10
3
4432600
874620
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48
41
5
22
15
33424000
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>l(1)G0230-PA
10
17
7
2
0
152910
0
>l(1)G0334-PA
6
44
5
1
2
256440
282750
>LanA-PA
16
411
1
62
27
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19690000
>LanB1-PA
13
198
2
25
7
22797000
5125300
>LanB2-PA
22
182
2
34
10
40350000
8194100
>la p-PC
8
151
2
14
4
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1898500
>lic-PA
13
38
5
2
3
422540
603770
>l a-PC
46
316
1
204
77
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92671000
>me31B-PA
50
52
5
28
16
53301000
15772000
>Mhc-PJ
52
224
2
175
101
525440000
208140000
>Mlc1-PA
17
18
6
5
5
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3982400
>Mlc2-PA
51
24
6
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5986100
>Mlc-c-PA
62
17
7
15
16
25830000
11910000
>Moe-PA
10
75
4
7
1
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366180
>Mpcp-PA
15
39
5
5
4
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1177300
>msk-PA
6
119
3
6
2
2666400
1033200
>m s-PA
8
35
5
2
1
174160
98406
>m SSB-PA
15
16
7
4
3
1994700
919390
>Myo31DF-PA
22
117
3
21
10
13107000
3110900
>Myo61F-PD
36
121
3
60
40
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56883000
>Nap1-PA
18
43
5
13
11
23216000
8893300
>Ndg-PA
11
149
2
15
1
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230660
>Nlp-PA
15
17
6
2
0
1164900
0
>Nop56-PA
17
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5
7
3
3688000
915330
>nop5-PA
24
57
4
12
2
6151700
660370
>Nop60B-PA
9
57
5
5
2
1203500
165870
>oho23B-PA
51
9
7
5
5
4812000
1858800
>pAbp-PA
45
70
4
56
29
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34964000
>Pa 1-PA
7
79
4
3
2
1907900
760020
>Pcm -PA
45
25
6
24
14
14161000
9690900
>Pen-PA
10
58
5
5
2
867050
241850
>Pep-PB
9
78
3
7
1
1402400
434730
>piwi-PA
22
97
4
20
5
12113000
1625900
>pon -PA
18
50
5
6
5
3462800
1173000
>Pp1-87B-PA
16
35
5
7
4
1082400
799290
>PpV-PA
13
35
6
5
1
1682400
563890
>P m-PA
24
102
3
17
7
6971100
1626500
>P os45-PA
10
46
5
3
1
1876800
305370
>pU 68-PA
11
68
4
5
0
1483800
0
>PyK-PA
16
57
5
6
2
3282800
758300
>Qm-PA
10
26
6
3
4
1055000
1380300
>qua-PA
18
101
4
15
5
8489900
1551300
>Rack1-PA
29
36
5
19
11
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14077000
>Ranbp9-PA
17
114
3
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4141100
>REG-PA
13
28
6
5
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3535800
> ep -PA
7
54
5
3
1
2054300
417470
>R aBp-PA
8
373
2
24
6
8885000
1575700
>R C38-PA
6
41
5
2
1
721860
257300
>R C3-PA
8
37
5
2
0
1209700
0
> -PA
6
247
2
11
2
5633700
265940
>Sc2-PA
11
34
6
4
3
857580
951860
>Scsalpha-PA
9
34
5
2
0
245630
>scu-PA
11
27
6
1
2
209950
238520
>sec13-PA
7
40
5
2
0
595420
0
>sesB-PA
46
33
6
25
27
25593000
36515000
>SF2-PA
15
28
6
2
1
317930
321550
>sho -PA
5
628
1
23
1
4216000
128450
>skpA-PA
9
19
6
3
1
375010
62090
>SmB-PA
11
21
6
2
2
406950
600390
>SMC2-PA
58
134
3
300
172
1095500000
647100000
>SmD3-PA
6
16
7
2
1
1805900
395200
>snRNP69D-PA
9
14
7
2
0
495780
0
>sop-PA
34
29
6
11
7
9996100
5643000
>sqd-PA
15
35
5
2
2
934980
463540
>sqh-PA
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20
6
25
16
17236000
6573300
>Ssb-c31a-PA
18
12
7
2
1
411950
188950
>s a-PA
36
30
5
22
20
79298000
40815000

Anhang
150
>Su( a )3-9-PB
6
51
5
2
1
792410
69995
>swa-PA
10
62
4
5
0
2122200
0
>Tbp-1-PA
6
48
5
2
1
757900
216010
>T-cp1-PA
16
60
4
11
3
3515700
637450
>TER94-PA
9
89
4
6
2
3196800
287290
>Thiolase-PA
14
51
5
5
2
4070500
1498900
>Tm1-PA
55
29
5
32
24
51294000
33745000
>Tm2-PA
55
33
5
32
24
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> mod-PA
25
41
5
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2363300
>Tom70-PA
14
66
4
7
2
3041900
600050
> o p4a-PA
6
38
5
1
2
496990
717790
>TpnC47D-PA
12
18
7
3
0
490970
0
>TpnC73F-PA
46
18
6
18
7
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2013200
> al-PA
22
69
4
13
5
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2652000
>T ip1-PA
15
36
5
4
4
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402030
>Up 1-PA
7
130
3
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0
1422100
0
>up-PA
10
47
5
6
1
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940160
>up-PF
25
47
5
27
13
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18928000
> as-PA PA
7
72
4
4
1
1683700
102300
> kg-PA
5
194
1
5
9
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19000000
>wal-PA
8
34
5
1
2
56545
196340
>wupA-PA
16
24
6
9
10
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6776700
>yellow-g2-PA
15
43
5
5
7
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2846300
>yellow-g-PA
20
43
5
5
6
5121100
4481500
>yl-PA
6
215
2
16
4
17627000
3040200
>Yp1-PA
32
49
4
20
14
29402000
12356000
>Yp2-PA
31
52
4
27
15
36722000
13558000
>Yp3-PA
32
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4
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10
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>yps-PA
21
38
5
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1680500
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53
231
2
395
196
1586800000
601680000
A5) che y-CapH2 und EGFP-CapH2-O a ien O bi_0498
P o ein Desc ip ions
Co e age [%]
[kDa]
SA
PEP c y
PEP EGFP
INT c y
INT EGFP
>128up-PA
18,2
41
6,4
8
5
875350
1278300
>14-3-3epsilon-PA
59,5
30
6,4
45
37
10331000
28334000
>14-3-3ze a-PD
45,6
28
7,5
12
18
3572400
6733400
>26-29-p-PA
31,5
62
6,1
34
33
8559100
8939400
>Aa s-a g-PA
8,4
76
5,0
5
1
462270
110590
>Aa s-asp-PA
13
59
4,9
5
5
568670
465530
>Aa s-ile-PA
14,6
141
3,4
18
15
1424300
2527900
>Aa s-lys-PB
14
69
4,9
9
6
1667700
1099100
>Acp65Aa-PA
18,1
11
9,0
2
2
217300
540510
>Ac 42A-PA
9,6
42
6,7
17
15
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29487000
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266
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970700000
469680000
>Ac 5C-PA
89,9
42
6,1
726
591
3083300000
2377900000
>Ac 79B-PA
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6,3
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157480000
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13,3
42
6,4
17
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9795200
16742000
>Ac n-PA
55,1
104
4,6
87
46
33784000
25067000
>Adam-PA
9,7
27
7,0
2
1
213710
185740
>Adh-PC
26,2
28
7,6
9
5
466000
459600
>AGO2-PC
19,7
137
4,0
50
42
7792600
8794200
>Aldh-PA
5,8
57
5,2
6
3
1017600
865150
>alpha-Adap in-PA
11,2
106
3,9
14
2
1875800
238470
>alpha-Ca -PA
38,3
102
4,5
30
20
9335800
6764600
>alphaCop-PA
7,2
139
5,2
19
6
2323100
614570
>alpha-Spec-PA
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278
2,5
1098
821
1394500000
728950000
>alphaTub67C-PA
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51
5,9
23
23
4387300
5860400
>alphaTub84B-PA
43,6
50
6,1
86
58
40872000
46215000
>Aly-PA
34,6
28
7,6
25
20
4733200
7671500
>Ance-PA
35,3
71
5,2
27
13
22701000
9503000
>Ank-PA
8,2
170
3,4
13
10
1228400
1590600
>AnnIX-PB
63,6
36
7,4
41
33
46954000
70429000
>AnnX-PA
69,4
36
7,2
46
43
14407000
57804000
>Anxb11-PA
41,6
36
6,8
36
25
9133600
6607700
>Aph-4-PA
27,5
65
5,0
11
13
1030100
2291400
>a ala 1-PC
15,3
77
4,8
9
4
1277900
313590
>A c-p20-PA
48,8
20
8,5
18
14
8909500
6350500
>A c-p34-PA
56,8
35
7,0
35
21
8342200
5984700
>A d1-PA
11,7
22
8,0
2
2
261170
249290
>A 102F-PA
23,3
21
5,7
2
4
98665
1017300
>A gk-PA
15,5
61
6,2
17
9
2216400
1840300
>a m-PA
24
91
4,2
29
16
5552600
4231800
>A p11-PA
23,3
42
6,0
10
10
2490600
3617300
>A p14D-PA
17
45
4,9
10
8
3618300
2229700
>A p66B-PA
42,3
47
6,0
21
13
20014000
6976000
>A p87C-PA
52,7
43
6,5
41
31
33212000
44562000
>A pc3A-PB
48,4
22
8,5
22
17
6975100
2205700
>ATPsyn-be a-PA
56
54
5,5
70
54
24496000
32156000
>ATPsyn-b-PA
21,4
27
7,9
6
6
910850
484720
Anhang
151
>ATPsyn-d-PA
20,8
20
8,0
3
3
322680
445550
>ATPsyn-gamma-PA
32,7
33
7,6
15
12
2594100
2108800
>aub-PA
26,4
99
4,2
26
13
4947100
4050300
>awd-PA
30,2
19
8,1
13
7
829640
609170
>bai-PA
18
24
8,8
9
7
2338100
2046900
>ball-PA
7,3
66
5,0
4
4
386990
833270
>Bap-PA
25
101
4,2
27
13
5716700
3183100
>bel-PA
48,9
85
5,1
118
98
91818000
68574000
>ben-PA
29,8
17
9,0
3
3
648390
296530
>be aCop-PA
36,4
107
4,4
73
44
25004000
18401000
>be a-Spec-PA
66,1
266
2,6
805
599
890100000
448730000
>be aTub56D-PB
62,2
50
6,1
133
97
69037000
84408000
>be aTub97EF-PA
15,7
59
5,5
30
22
7394200
9034400
>BicC-PA
23,3
98
4,8
26
20
4073000
3965000
>bic-PA
78,7
18
8,2
22
19
8101100
7132200
>Bin1-PA
7,3
17
9,0
3
3
318490
309850
>blw-PA
34,8
59
6,0
41
38
17101000
21979000
>bocksbeu el-PB
6,5
44
7,8
2
4
89888
231360
>bonsai-PA
8,2
33
7,0
2
2
48103
109520
>bo -PA
50,5
68
5,2
51
40
19957000
18049000
>bs -PA
26
157
3,3
23
28
6066900
4258400
>Bsg-PG
15,8
32
6,4
3
6
334780
843190
>bu -PA
5,5
76
5,0
3
1
261790
110940
>CaBP1-PA
8,1
47
6,1
4
5
748820
1479500
>Ca 1-PA
5,8
49
5,8
2
2
266500
120710
>Cam-PA
98,7
17
8,7
55
42
112490000
67294000
>CapH2
29,9
110
4,6
109
65
42097000
14688000
>ca hD-PA
26,8
42
6,6
14
15
1837700
3930400
>Cc gamma-PA
13,1
59
5,0
8
6
971050
2222200
>cdc2-PA
11,8
34
7,0
3
3
200110
307580
>CG10031-PA
16,3
14
9,0
2
2
354620
528710
>CG10077-PA
26,8
88
5,1
36
23
6923600
7174100
>CG10116-PA
30,4
31
7,0
6
5
2579200
1677800
>CG10237-PB
31,8
38
7,1
10
8
2420100
1929800
>CG10289-PA
5,2
111
3,4
6
2
1126800
227430
>CG10306-PA
45
26
8,1
15
12
5800400
3284600
>CG10407-PA
6,2
30
8,0
2
2
140580
169530
>CG10469-PA
16,1
30
7,0
4
1
990390
0
>CG10470-PA
22,4
21
8,4
6
4
1017400
493520
>CG10472-PA
17,6
31
7,7
5
7
1537600
1520500
>CG10527-PA
35,5
32
7,1
12
13
1225100
4640900
>CG10540-PA
78
33
6,6
51
39
73322000
53643000
>CG10565-PA
13
74
4,9
9
4
1299500
421860
>CG10576-PA
19,2
43
5,9
9
7
1542500
1603500
>CG10627-PA
31,5
61
5,0
15
11
3199900
2418900
>CG10641-PA
51,2
25
8,0
7
8
1371400
1049000
>CG10664-PA
19,8
21
8,9
5
5
2366700
1725100
>CG10672-PA
25,6
34
8,0
8
9
1326900
1832600
>CG10680-PA
16,3
28
7,0
1
3
23343
291650
>CG10724-PA
32,9
67
5,0
20
13
5488600
2267400
>CG10911-PA
23,1
38
3,4
18
16
22713000
11868000
>CG10912-PA
16,2
30
4,8
6
3
2688600
2208200
>CG1091-PB
7,1
64
5,0
5
4
771310
622840
>CG10990-PA
5,1
56
4,7
4
3
378770
286810
>CG10992-PA
7,6
37
8,1
5
2
343370
194120
>CG11015-PA
20
14
9,0
2
2
228440
261850
>CG11092-PA
7,2
94
4,2
4
2
685810
448710
>CG11107-PA
12,8
83
5,0
8
7
910520
1056100
>CG11137-PA
36,1
18
8,8
5
4
373850
331180
>CG11241-PA
6,7
56
6,0
2
3
451900
658910
>CG1146-PA
7
36
9,0
2
1
162090
41862
>CG11669-PA
29,9
67
4,8
18
5
11176000
1540900
>CG11837-PA
7,5
35
7,0
2
2
265300
338220
>CG11844-PB
21,2
49
6,0
6
7
1493200
2340500
>CG11875-PA
29,1
35
7,0
6
11
967200
1947400
>CG11876-PA
26,8
39
6,9
9
9
5688600
9695300
>CG11909-PA
25,6
75
5,0
16
8
5969000
1061100
>CG11999-PA
16,7
24
8,0
3
3
659540
837270
>CG12042-PA
45,5
58
5,6
23
19
4875400
5713800
>CG12079-PA
14,7
30
8,0
3
3
305950
205510
>CG12114-PA
11,5
41
7,1
8
6
380240
750130
>CG12128-PA
12,4
54
5,1
5
4
508360
545750
>CG12139-PB
6,4
506
1,6
22
29
1793600
2705800
>CG12163-PA
13,4
69
6,9
13
13
2516300
2053600
>CG12206-PA
8,4
63
8,9
6
4
549100
257090
>CG12262-PA
7,6
46
6,4
6
6
1019900
10907000
>CG12264-PA
16,5
51
6,7
15
6
1584800
1960800
>CG12304-PA
10,2
37
7,0
3
2
205770
298980
>CG12400-PA
22,4
13
9,0
2
2
348360
237390
>CG1249-PA
63
14
9,0
8
8
2412300
2723200
>CG12534-PA
22,3
22
8,4
6
6
381770
334300
>CG12602-PA
6,5
93
7,8
8
4
1000100
977630
>CG12883-PA
17,8
18
8,7
3
4
85103
266300
>CG1307-PB
19,4
20
8,0
3
3
340020
355650
Anhang
152
>CG13083-PB
6
35
6,3
3
1
739000
687520
>CG13084-PA
14,5
51
5,2
21
18
3211500
4111700
>CG13117-PA
73,6
12
8,7
10
7
2838700
2052400
>CG13220-PA
24,8
16
9,0
4
1
2456900
244130
>CG13277-PA
23,6
12
9,0
2
1
180920
105500
>CG13298-PA
19
14
9,0
2
2
48943
63041
>CG13321-PA
67,1
31
7,5
30
19
9733700
8519300
>CG13335-PA
33,2
46
6,3
28
12
56594000
3376700
>CG13392-PA
9
25
8,0
2
2
78227
110460
>CG13472-PA
5
92
4,6
6
4
493340
701150
>CG13492-PB
8,5
321
2,1
39
22
8286700
2562000
>CG1381-PA
26,2
29
7,0
6
5
590120
835010
>CG13887-PB
10,1
26
8,0
2
3
585230
298120
>CG13997-PA
22,1
19
8,7
2
1
133320
47008
>CG14120-PA
9,4
151
2,0
13
13
1832900
1615600
>CG14207-PA
47,5
21
8,1
9
7
3012400
3017400
>CG14213-PA
11,8
34
7,0
2
3
195170
673180
>CG14224-PA
8,2
59
5,0
3
3
235780
356560
>CG14309-PA
21,7
107
6,3
31
26
7308400
10157000
>CG1444-PA
13,4
35
7,0
3
3
127730
242930
>CG14516-PB
6,3
115
3,6
7
9
910860
1673700
>CG14544-PA
18,3
35
7,0
4
2
434570
198670
>CG14648-PA
50,6
60
5,3
52
33
34224000
34711000
>CG14816-PA
38,1
33
7,2
18
11
2668200
2220000
>CG14820-PA
14,9
48
7,0
3
3
383650
409950
>CG14872-PB
7,1
35
7,0
1
2
31259
150780
>CG15019-PA
19,9
17
8,8
3
2
156310
112330
>CG15092-PA
16,2
36
6,9
18
14
3201800
2260800
>CG15100-PA
10,3
112
4,0
9
4
1386300
610600
>CG15255-PA
29,1
29
8,1
12
9
4241700
3649600
>CG15293-PA
12,3
37
6,7
2
4
235940
786780
>CG15347-PA
16,4
23
6,6
5
5
1404400
1605900
>CG15721-PA
6,3
93
1,0
4
5
772940
503320
>CG15818-PA
11,7
32
7,0
3
3
218960
294430
>CG15820-PA
6,5
35
8,3
3
1
142390
169750
>CG15825-PB
20,6
58
5,0
5
6
372550
1110500
>CG1623-PA
13,8
48
7,5
14
13
2091500
2198600
>CG16749-PA
15,5
28
7,0
4
4
744770
800020
>CG16817-PA
25
21
8,0
2
4
30972
344700
>CG16935-PA
7,3
39
6,5
2
2
284440
407720
>CG17018-PD
20,2
148
3,8
53
34
18585000
8842800
>CG17033-PA
25,7
36
6,9
9
6
1270900
1534500
>CG17266-PA
19,1
20
8,9
5
3
236910
221960
>CG17272-PA
70,5
17
9,0
23
18
30127000
8352000
>CG17280-PA
22,9
12
9,0
2
1
448000
269560
>CG17347-PA
25,4
20
8,1
5
5
1033000
1686300
>CG1749-PA
11,9
44
5,9
7
6
2427800
2077900
>CG1751-PA
30,2
22
7,9
8
5
405310
401520
>CG17556-PA
25,5
33
7,0
5
6
600660
958810
>CG17593-PA
6,3
54
5,6
5
4
560730
535380
>CG17768-PA
14,3
17
9,0
4
4
236940
299450
>CG17838-PD
5,9
77
5,0
2
4
2262300
4179200
>CG18067-PA
20,8
26
8,0
5
4
670400
646420
>CG18178-PA
15,2
43
5,9
6
5
1159600
1823000
>CG18190-PA
18,2
27
7,0
4
4
84816
386930
>CG18212-PG
7,4
99
4,1
6
2
848360
281510
>CG1837-PA
22,1
47
5,8
9
6
2141700
1827200
>CG18493-PA
7,5
54
5,7
5
4
630780
813450
>CG18591-PA
27,7
11
9,0
4
4
1849500
2082200
>CG18811-PA
11,9
104
4,9
20
20
3530400
2427200
>CG1893-PA
14,4
30
7,5
6
6
1003000
1049700
>CG1939-PA
13,6
27
8,1
4
3
219160
227230
>CG1962-PA
17,6
90
5,3
39
21
4838500
4317900
>CG1973-PA
6
97
4,6
7
1
608280
51157
>CG2081-PB
20,6
18
9,0
2
2
76158
169940
>CG2185-PA
27
22
8,1
6
5
529890
519810
>CG2233-PA
14,3
47
6,1
6
4
1645700
1571200
>CG2246-PA
10,1
45
6,0
2
2
567310
536430
>CG2358-PA
11,9
21
9,0
2
2
197680
201100
>Cg25C-PA
6,5
174
3,1
34
39
45884000
36780000
>CG2789-PA
9,2
20
9,0
2
2
174830
192810
>CG2791-PA
26
63
4,8
10
13
1042300
2558100
>CG2982-PA
46,1
73
5,1
44
42
20713000
23068000
>CG3004-PA
15,7
35
7,0
3
3
466290
641200
>CG30069-PA
13
420
3,0
9
14
398630
1717800
>CG30159-PA
23,8
28
8,3
7
5
1482300
1655600
>CG30185-PA
14,5
20
8,3
4
2
306480
254980
>CG30360-PA
17,3
69
5,2
12
9
7466800
2944400
>CG30382-PA
26,6
27
7,3
5
7
531450
891680
>CG30492-PE
12,4
103
3,7
18
15
2723900
1928100
>CG3074-PA
57,5
49
6,6
50
37
24694000
28649000
>CG31012-PC
5,3
92
4,6
7
5
578870
668170
>CG31195-PA
18,1
96
4,0
16
9
2625000
1801300
>CG31198-PA
46,1
107
3,5
70
46
64192000
77940000
Anhang
153
>CG31233-PA
40,9
107
4,1
42
27
30572000
26369000
>CG31249-PA
50,8
28
8,0
14
13
2392200
2569600
>CG31266-PA
14,7
28
8,0
3
3
191330
263420
>CG31343-PA
27,6
108
4,1
60
42
38060000
35826000
>CG31352-PA
38
90
5,1
84
60
17844000
14657000
>CG3164-PA
5,7
78
6,6
15
11
1819600
2217600
>CG31739-PA
9,5
122
3,3
7
8
578330
1011700
>CG31938-PA
20,3
25
8,0
4
3
408430
153970
>CG32147-PA
21
25
8,0
5
4
974520
1237700
>CG32165-PA
23,4
121
4,5
39
20
7731400
3645500
>CG32177-PA
7,5
29
7,9
4
3
145310
276460
>CG3226-PA
10,9
26
8,0
1
2
130360
117420
>CG32306-PB
6,5
237
5,7
27
24
3352400
5711700
>CG32473-PA
14,7
113
3,8
22
18
2037200
3862400
>CG3249-PC
10,2
67
5,2
6
4
708770
730360
>CG32633-PA
66,7
31
7,3
27
23
12875000
14288000
>CG32644-PB
7,4
63
3,2
2
3
113870
495300
>CG32671-PA
5,6
23
5,3
1
2
22398
927680
>CG3305-PA
5,3
35
5,3
2
1
209440
198020
>CG33105-PA
18,9
28
8,0
5
5
664870
823420
>CG33123-PA
10,8
135
3,4
12
9
628540
1536100
>CG33127-PA
38
31
7,2
16
10
6029600
3963900
>CG33303-PA
7,2
52
6,0
3
3
686750
1116900
>CG3394-PA
5,8
77
5,0
2
1
241530
70491
>CG34039-PA
11,2
22
8,0
2
1
115580
34367
>CG3428-PA
22
36
7,0
9
8
1111900
1363900
>CG3430-PA
8,6
68
5,1
6
5
770420
1105900
>CG3501-PA
21,2
23
8,1
4
4
400110
613720
>CG3529-PB
18,4
58
5,1
11
10
2668700
4246100
>CG3564-PA
28,8
23
8,3
9
7
1380400
1510100
>CG3566-PB
24,8
13
9,0
3
3
127470
146590
>CG3662-PA
10
36
7,0
3
2
63852
154150
>CG3672-PA
7,7
30
6,6
2
3
51850
210030
>CG3734-PA
20,3
53
6,0
7
4
3457400
1064800
>CG3800-PA
43,6
18
8,9
9
9
1428400
1443700
>CG3841-PA
9,9
63
5,0
4
3
2023200
1101100
>CG3884-PB
68,2
31
7,2
31
13
9626100
6516000
>CG3902-PA
6
45
6,0
2
1
383320
170740
>CG3906-PA
5
28
7,2
3
2
161270
51363
>CG3909-PA
25,4
36
7,0
9
7
668140
999130
>CG3940-PA
6,9
34
7,0
2
2
143620
358600
>CG3957-PA
7,9
36
7,0
1
2
43212
120600
>CG3983-PA
8,1
66
5,0
4
4
361690
460920
>CG3999-PA
37,2
110
4,0
2
46
41410
28330000
>CG4009-PA
10,4
71
5,0
5
4
649730
455760
>CG4038-PA
31,2
23
8,0
13
8
3214100
1960200
>CG4164-PA
11
40
6,3
4
2
308620
489350
>CG4169-PA
30,9
45
7,0
26
17
4424000
3590900
>CG4279-PA
23,4
16
9,0
2
2
155030
156110
>CG4289-PA
5,4
31
6,8
3
2
651150
1023500
>CG4363-PA
37,2
21
9,0
6
3
1026200
259430
>CG4365-PC
12,9
39
7,0
4
4
219910
537110
>CG4377-PA
26,8
25
8,1
5
2
971480
208560
>CG4389-PA
26,1
84
5,2
28
21
4862500
4104300
>CG4572-PA
22,4
54
5,0
6
6
1283400
1496800
>CG4586-PA
39,9
77
5,0
19
20
5563900
8191100
>CG4611-PA
7
80
5,0
3
3
530830
733640
>CG4612-PA
24,8
34
7,4
13
12
1787200
2555900
>CG4619-PA
18,8
64
5,0
10
10
2016800
2077800
>CG4643-PA
23,1
29
8,0
5
5
1259700
1178500
>CG4653-PA
10,2
27
7,3
3
3
858990
1068300
>CG4658-PA
9,9
58
5,3
4
5
456660
459860
>CG4679-PA
8
74
4,9
3
4
299030
314790
>CG4692-PA
39,3
12
9,0
4
4
889510
951400
>CG4827-PA
11,7
65
5,0
3
3
929760
635870
>CG4858-PA
17,7
28
8,0
2
3
731010
697440
>CG4951-PA
17,2
36
6,8
1
4
70393
385500
>CG5064-PA
13,6
69
5,0
8
8
1075800
946340
>CG5073-PA
29,8
24
7,9
9
9
1699600
2014800
>CG5174-PB
25,9
39
7,7
12
12
1235200
1981500
>CG5190-PA
6,1
53
6,0
2
1
462090
172170
>CG5214-PA
15,2
50
6,5
14
9
3739500
3806100
>CG5261-PB
5,1
54
5,9
4
3
288620
376680
>CG5317-PA
8,2
29
7,0
1
2
36874
124060
>CG5366-PA
10
139
4,3
28
15
3147700
3300200
>CG5434-PA
11,4
73
5,0
6
5
755270
490830
>CG5447-PA
12,6
17
9,0
2
2
168560
225600
>CG5525-PA
15
57
5,3
14
8
2382700
2984500
>CG5558-PA
6,2
49
6,0
2
1
1266900
371150
>CG5599-PA
12,8
50
6,0
1
4
83495
986280
>CG5641-PA
14,6
44
6,3
6
5
1538800
2840300
>CG5642-PA
31,5
63
5,3
27
16
9018600
4760500
>CG5726-PA
14
87
4,4
13
14
1445700
3851700
>CG5733-PA
29,6
77
5,0
15
14
3288600
2869200