Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen

Analyse on Condensin-Komplexen in D osophila melanogas e Cha ak e isie ung de Un e einhei CapG und Iden i izie ung on In e ak ionen Disse a ion zu E langung des G ades eines -Dok o s de Na u wissenscha en- -D . e . na .- de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de Uni e si ä Bay eu h o geleg on Sabine He zog Bay eu h 2011 2 Die o liegende A bei wu de in de Zei on Juni 2007 bis Augus 2011 an de Uni e si ä Bay eu h am Leh s uhl ü Gene ik, un e de Be euung on PD D . S e an Heidmann ange e ig . Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na .). Disse a ion einge eich am: 17. 08. 2011 Zulassung du ch P ü ungskommission: 29. 09. 2011 Wissenscha liches Kolloquium: 09. 12. 2011 Am ie ende Dekan: P o . D . Bea e Lohne P ü ungsausschuss: PD. D . S e an Heidmann (E s gu ach e ) P o . D . Benedik Wes e mann (Zwei gu ach e ) P o . D . Ola S emmann (Vo si z) P o . D . Wul Blanken eld PD. D . S e an Geime Gliede ung 3 Gliede ung Zusammen assung……………………………………………………………………………………………..……………………..7 Summa y…………………………………………………………………………………………….……………..…………………..….9 1. Einlei ung……………………………………………………………………………………………………….………………….…11 1.1. De Zellzyklus……………………………………………………………………………………….……………………….11 1.1.1. Die In e phase……………………………………………………………………………….………………………….12 1.1.2. Die Mi ose……………………………………………………………………………….……………………………..…12 1.2. Die Ch oma ins uk u ie ung im Ve lau des Zellzyklus…………………….…………………………13 1.2.1. Die Ch oma ins uk u wäh end de In e phase…………………….………………………..………13 1.2.2. DNA-Replika ion und E ablie ung de Kohäsion…………………….…………………………….…..14 1.2.3. Ch omosomenkondensa ion und Resolu ion de Ch oma iden…………………….…….……16 1.2.4. Mechanismen de Ch omosomenkondensa ion…………………….…………………………………16 1.2.5. Ch omosomenseg ega ion…………………………………………….……………………………..……….…18 1.3. De Condensin-Komplex…………………………………………….…………………………………….……….….19 1.3.1. Iden i ika ion des Condensin…………………………………………….………………………………………19 1.3.2. Au bau de Condensin-Komplexe …………………………………………….………………………………20 1.3.3. E olu ionä e Konse ie ung de Condensin-Komplexe………….……………………….…………21 1.3.4. Subzellulä e Lokalisa ion und Ch oma inassozia ion de Condensin-Komplexe………..21 1.3.5. Funk ionen des Condensin ü Ch omosomenkondensa ion und –seg ega ion……..…22 1.3.6. Die Condensin abhängige Ablösung des Kohäsin-Komplexes……………………………………23 1.3.7. Mechanismen de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung………….………...24 1.3.8. Die Regula ion de Condensin-Komplexe………….……………………………….………….…………26 1.3.9. Wei e e Funk ionen de Condensin-Komplexe………….…………………………………..….....…28 1.3.10. Besonde hei des Condensin-Komplexes in D osophila melanogas e …………..…...…..30 1.4. Zielse zung………………………………………….…………………………………………….……………….…..….…31 2. E gebnisse…………………………………………….…………………………………………….….……………………………33 2.1. S uk u - und Funk ionsanalyse on CapG………………………………………………………….………..33 2.1.1. CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in………………………….…….35 2.1.2. Die Ch oma inassozia ion on CapGNM-EGFP is nich am Zen ome ………………….……38 2.1.3. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG e mi eln biologische Funk ionali ä ….……41 2.1.4. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el en Ve zöge ung de Mi ose…………………….…………………………………………….….……..……………44 Gliede ung 4 2.1.5. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG sind essen iell ü In e ak ion mi den wei e en Condensin-Un e einhei en …………………….………………………………………………..45 2.1.6. CapG lieg in de Fliege in un e schiedlichen Iso o men o ……………………………….……47 2.1.7. CapG wi d wäh end des Zellzyklus phospho ylie ………………………………………..…………51 2.1.8. Lokalisa ion und Funk ionali ä on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen….…54 2.1.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen……….………59 2.2. Komposi ion de Condensin-Komplexe in D. melanogas e …………………………………………61 2.2.1. Gene ische In e ak ionss udien.………………………………………………………………………..……62 2.2.1.1. Disassemblie ung on poly änem Näh zellch oma in in O a ien…………….……………62 2.2.1.2. Disassemblie ung on poly änem Speicheld üsench oma in in La en………..………66 2.2.2. In i o Iden i ika ion de Condensin II- Komponen en in D. melanogas e …………….68 2.2.2.1. Condensin II-spezi ische Un e einhei en we den du ch CapG nich p äzipi ie .…69 2.2.2.2. Die P äzipi a ion Condensin II-spezi ische Un e einhei en is auch du ch SMC4 nich e möglich ……………..…………………………………………………………………………73 2.2.2.3. Die P äzipi a ion de Condensin-Ke nun e einhei en is du ch CapH2 e möglich ……..……………..…………………………………………………………………………………....76 2.2.2.4. Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA- silencing Signalweges kann nich bes ä ig we den……………………………………..………81 2.2.3. In i o Assay zu Analyse de In e ak ionen einzelne Condensin-Un e einhei en………………………………………………………………………………………82 2.2.3.1. In e ak ionen de Condensin I-Komponen en we den im in i o Assay bes ä ig …………………………………………………………………………………………83 2.2.3.2. CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3………………………………………..……………84 2.2.3.3. Eine di ek e In e ak ion on CapH2 und CapD3 is im in i o Assay nachweisba …………………………………………………………………………………..86 2.2.3.4. Bildung eines e nä en Komplexes is nu du ch Condensin I-spezi ische Un e einhei en e möglich ………………………………………………………………………….………87 3. Diskussion…………………………………………………………………………………….………………………………………90 3.1. Die Domänens uk u on CapG in D. melanogas e …………………….…………………………………90 3.2. CapG lieg wäh end de In e phase am He e och oma in lokalisie o …………………..…….91 3.3. Regula ion on CapG du ch g aduelle Phospho ylie ung…………………………………………………94 3.4. Biologische Funk ionali ä de N- e minalen zwei-D i el on CapG……………………..…………95 3.5. Die ini iale Ch oma inassozia ion on CapG muss nich zwingend am Zen ome s a inden……………………………………………………………………………………………………95 Gliede ung 5 3.6. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el e Ve zöge ung de Mi ose…………………………………………………………………………………………………96 3.7. CapG lieg in de Fliege in e schiedenen Iso o men o , welche gleiche maßen du ch Phospho ylie ung egulie we den ………………………………………………………………………….……97 3.8. Lokalisa ion und Funk ion on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen……………….……98 3.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen…………………….100 3.10. Gene ische In e ak ion on CapG mi CapH2 und CapD3 …………….…………….………………..101 3.11. Die Komposi ion lösliche Condensin-Komplexe …………….…………….…………….….……………103 3.12. Iden i ika ion on In e ak ionspa ne n de Condensin-Un e einhei en.………………………105 3.13. In i o Rekons i u ion de Condensin-Komplexe…………….…………….……………………..………106 4. Ma e ialien und Me hoden………………………………………………………………………………………………109 4.1. Ma e ial…………………………………………………………………………………………………………….…..……109 4.1.1. cDNA-Plasmide…………………………………………………………………………………………………….…109 4.1.2. Vek o en…………………………………………………………………………………………………………………109 4.1.3. Oligonukleo ide………………………………………………………………………………………………………109 4.1.4. Fliegens ämme………………………………………………………………………………………….……………110 4.1.5. An ikö pe ………………………………………………………………………………………………………………112 4.2. Umgang mi D osophila melanogas e ………………………………………………………….……………113 4.2.1. S anda dme hoden…………………………………………………………………………………….…………113 4.2.2. T ans o ma ion on D. melanogas e -Emb yonen du ch Mik oinjek ion und Ka ie ung on T ansgeninse ionen……………………………………………………….……………113 4.2.3. Emb yonenkollek ion……………………………………………………………………………………………113 4.2.4. Immun luo eszenz ä bung on Emb yonen …………………………………………………….……113 4.2.5. Immun luo eszenz ä bung on Speicheld üsen, Fliegeno a ien und Tes is .…………114 4.3. Mik oskopie und Bildbea bei ung………………………………………………………………………………114 4.4. Molekula biologische Me hoden……….………………………………………….……………………………115 4.4.1. Polyme ase-Ke en eak ion (PCR)…………………………………………………………………………115 4.4.2. DNA-F agmen ie ung du ch Res ik ionsendonukleasen……………….………..……………115 4.4.3. Enzyma ische Dephospho ylie ung on DNA-F agmen en………………….…………………115 4.4.4. Enzyma ische Liga ion on DNA-F agmen en…………………………….….…………..…………115 4.4.5. T ans o ma ion on Plasmid-DNA in E. coli-Bak e ien……………..……….…………………..115 4.4.6. Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli-Bak e ien…………………………….……………………116 4.4.7. Aga osegelelek opho ese und Ex ak ion on DNA-F agmen en………..………….……116 Gliede ung 6 4.4.8. P äpa a ion genomische DNA aus Fliegenemb yonen………………………………...………116 4.4.9. P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben und Re e se T ansk i ion……………………116 4.4.10. Sequenzie ung und Sequenz e gleiche…………………………………..…………………….………116 4.5. P o einbiochemische Me hoden…………………………………………………………………………………117 4.5.1. He s ellung on A ini ä sma izes au Basis on P o ein A-Sepha ose……….…………117 4.5.1.1. Kopplung polyklonale An ikö pe …………………………………………………….………………117 4.5.1.2. Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden………………….…………117 4.5.2. He s ellung na i e P o einex ak e aus D. melanogas e -Geweben und anschließende Immunp äzipi a ion……………………………………………………………….117 4.5.3. P o einp äpa a ion on D. melanogas e -Emb yonen in e schiedenen Phasen de Mi ose 14…………………………………………………………………118 4.5.4. Demecolzinbehandlung on D. melanogas e -Emb yonen……………………..…….………119 4.5.5. Phospha asebehandlung on D. melanogas e -Emb yonen………………………....………119 4.5.6. He s ellung dena u ie ende Ex ak e aus D. melanogas e -Geweben…….…..………119 4.5.7. SDS-Polyac ylamidgelek opho ese (SDS-PAGE) ……………………………………..…..…….…119 4.5.8. Wes e nblo und immunologische Nachweis (Immunblo ) ………………….……..………120 4.5.9. De ek ion on P o einen im SDS-Gel du ch Au o adiog a ie…..…………….………………120 4.5.10. Silbe ä bung on SDS-Gelen…………………………………………………………………..……………120 4.5.11. Kolloidale Coomassie-Blau-Fä bung on SDS-Gelen………………………….…..……..………120 4.5.12. Massenspek ome ische Analyse………………………………………………………………………..121 4.6. In i o-In e ak ionsassay……………………………………………………………………………………………121 4.6.1. Übe p ü ung des P o einmodells on CapD3………….…………….……………………….…….…121 4.6.2. In i o T ansla ion (IVT) und Immunp äzipi aion ….………………….……………………………122 4.7. P og amme zu Vo he sage on P o eins uk u und Phospho ylie ungss ellen……….123 4.8. Pu e und Lösungen……………………………………………………………………………………………………123 5. Abkü zungs e zeichnis………………………………………………………………………………………………………126 6. Re e enzen…………………………………………………………………………………………………………..……….……128 7. Anhang…………………………………………………………………………………………………………………………….…137 8. Danksagung……………………………………………………………………………………………………………………….160 9. Lebenslau ………………………………………………………………………………………………………………….………161 Zusammen assung 7 Zusammen assung Die akku a e Ve eilung de Ch omosomen wäh end de Mi ose is essen iell ü die gene ische S abili ä de Zellen. De he e open ame e Condensin-Komplex is hie bei an de S uk u ie ung de Ch omosomen und de en physikalische S abili ä wäh end de Seg ega ion maßgeblich be eilig . In höhe en Euka yo en konn en zwei diese Komplexe (Condensin I und Condensin II) iden i izie we den, die ih e sei s eine dis ink e subzellulä e Lokalisa ion wäh end de In e phase und auch Beladung an das mi o ische Ch oma in au weisen. Die beiden Komplexe haben die S uc u al main enance o ch omosomes (SMC) Un e einhei en SMC2 und SMC4 gemein, wäh end sie sich in den nich -SMC-Un e einhei en un e scheiden: In Condensin I inde man die Komponen en Ch omosome associa ed p o ein D2 (CapD2), CapG und CapH und in Condensin II die e wand en P o eine CapD3, CapG2 und CapH2. Wäh end in Ve eb a en die Rolle beide Condensin-Komplexe wäh end de Mi ose kla e ablie is , zeichne sich in D osophila melanogas e ein ande es Bild ab. Mu an en in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen keine mi o ischen Phäno ypen und ein zu CapG2 homologes P o ein konn e bishe nich iden i izie we den. Da CapG aus D osophila ein ähnliches Lokalisa ions e hal en wie die Condensin II-Un e einhei en de Ve eb a en au weis , wi d CapG als Komponen e beide Condensin-Komplexe disku ie . Im Rahmen diese A bei wu den die Funk ion und die Regula ion on CapG in D osophila melanogas e , p imä du ch die Analyse on EGFP- usionie en P o ein a ian en, nähe un e such . Es konn e gezeig we den, dass de C-Te minus on CapG neben den haup sächlichen Phospho ylie ungss ellen auch Ke nimpo sequenzen en häl , welche die subzellulä e Lokalisa ion des P o eins wäh end des Zellzyklus egulie en. Wäh end de In e phase zeig CapG im Zellke n eine Kolokalisa ion mi dem He e och oma in-bindenden P o ein HP1, was au eine di ek e Ch oma inassozia ion on CapG hinweis und mögliche Ch oma in-s uk u ie ende Funk ionen bes ä igen wü de. Diese He e och oma in-spezi ische Lokalisa ion kann om C- e minalen D i el on Cap-G e mi el we den, de ande e sei s ü die gene elle Ch oma inassozia ion wäh end de Mi ose, die In e ak ion mi den ande en Condensin I-Un e einhei en und ü die Funk ionali ä on CapG wäh end de soma ischen Mi osen en beh lich is . Da ein P o ein agmen en sp echend de N- e minalen Zwei-D i el on CapG (CapGNM) wäh end de In e phase haup sächlich zy oplasma isch lokalisie is , kann die p ä e en ielle Ke nlokalisa ion on CapG wäh end de In e phase, und auch die Phospho- Zusammen assung 8 Regula ion des P o eins, ü die En wicklung om Beginn de emb yonalen zygo ischen Exp ession bis hin zum adul en S adium nich essen iell sein. Die in diese A bei nachgewiesene Lokalisa ion on CapG und ande en Condensin Un e einhei en in Geweben de weiblichen und männlichen Keimbahn leg die Ve mu ung nahe, dass CapG, e en uell im Kon ex mi den ande en Condensin-Un e einhei en, eine Rolle bei de Game ogenese zukomm . Konsis en hie mi is die Beobach ung, dass Weibchen s e il sind, die in ih en Keimbahnzellen keine unk ionelle CapG-Va ian e exp imie en. Die In eg i ä de O a ien in diesen Tie en sp ich ü eine Funk ion on CapG bei de Rei ung des Oozy enke ns ode den meio ischen Teilungen. Die P äsenz on CapG in löslichen Komplexen mi den bekann en Condensin I-Un e einhei en konn e in diese A bei du ch Koimmunp äzipi a ionen mi nach olgende massenspek oskopische Bes immung de assoziie en P o eine bes ä ig we den. Eine Assozia ion mi Condensin II-spezi ischen Un e einhei en wu de dagegen nich ge unden. Ebenso assemblie eine ek opisch exp imie e, unk ionelle Va ian e on CapH2 nich in einem löslichen Komplex mi CapG. Auch die Analyse di ek e P o ein-P o ein-In e ak ionen in einem in i o- Sys em e gab keine Hinweise au eine Assozia ion on CapG mi Condensin II-spezi ischen Un e einhei en. Dagegen konn en in diesem Sys em die In e ak ionen nach ollzogen we den, die ü Condensin I und Condensin II aus ande en Sys emen publizie und somi e wa e sind. Expe imen e zu gene ischen In e ak ion de Condensin-Un e einhei en o enba en bei Anwesenhei on CapG-Mu a ionen eine Supp ession des Phäno yps, de nach Übe exp ession on CapH2 in Speicheld üsen e hal en wi d. In einem ezip oken Ansa z üh en CapG- Mu a ionen zu eine Ve s ä kung des CapH2-mu an en Phäno yps in den Näh zellen on O a ien. CapH2 und CapG scheinen also au gene ische Ebene mi einande zu in e agie en. Zusammengenommen legen die E gebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwa nich in di ek e Assozia ion mi Condensin II-spezi ischen Komponen en o lieg , abe pa allel an de S uk u ie ung on Ch oma in be eilig is und unk ionell zum Teil mi den Au gaben de Condensin II-spezi ischen Komponen en übe lapp . Summa y 9 Summa y The ai h ul seg ega ion o sis e ch oma ids du ing mi osis is essen ial o he inhe i ance o he genome. He e, he he e open ame ic condensin complex is impo an o a obus s uc u e o he ch omosomes and o hei accu a e seg ega ion du ing anaphase. Two ela ed complexes, condensin I and condensin II, ha e been iden i ied in highe euka yo es. The wo complexes exhibi dis inc localiza ion pa e ns du ing he cell cycle and a dis inc associa ion wi h mi o ic ch oma in. Bo h complexes a e buil on a amewo k o he wo s uc u al main enance o ch omosomes (SMC) subuni s SMC2 and SMC4, and a dis inc se o non-SMC-subuni s: Condensin I con ains Ch omosome associa ed p o ein D2 (CapD2), CapG and CapH, condensin II he ela ed p o eins CapD3, CapG2 and CapH2. Whe eas o bo h complexes clea unc ions could be es ablished du ing mi osis in e eb a es, he si ua ion in D osophila melanogas e is ambiguous. In D osophila, mi osis is undis u bed in he absence o CapH2 o CapD3, and so a no homolog o CapG2 could be iden i ied. Howe e , he localiza ion pa e n o CapG is simila o he e eb a e Condensin II speci ic subuni s. Hence i is specula ed, ha CapG can be pa o bo h condensin complexes o D osophila melanogas e . In his s udy, he unc ion and egula ion o CapG in D osophila melanogas e was sc u inized by analyzing a se o EGFP- used p o ein a ian s. I was shown, ha he C- e minal pa o CapG con ains he majo phospho yla ion si es and also nuclea impo sequences, he eby egula ing he subcellula localiza ion o CapG du ing he cell cycle. Fu he mo e, du ing in e phase, colocalisa ion o CapG wi h he he e och oma in binding p o ein HP1 was shown, which implies a di ec ch oma in binding o CapG and suppo s a p e iously epo ed ole o CapG in he egula ion o he e och oma ic gene exp ession. The a ge ing o he e och oma in is media ed by he C- e minal pa o CapG. Su p isingly, his p o ein agmen is nei he essen ial o ch oma in associa ion du ing mi osis, no o he in e ac ion wi h he o he condensin I subuni s, no o he unc ion o CapG du ing he soma ic cell di isions in D osophila emb yos. Con a iwise, a p o ein agmen consis ing o he N- e minal wo- hi ds o CapG (CapGNM) is able o p o ide he p o ein unc ion equi ed o he de elopmen om an emb yo o an adul ly, a e he exhaus ion o ma e nal con ibu ion. Thus, he subcellula localiza ion o CapG du ing in e phase and also i s C- e minal phospho- egula ion a e no essen ial o p o ein unc ion du ing hese s ages o de elopmen . Fu he mo e, a unique localiza ion o CapG and i s condensin I binding pa ne CapD2 was shown in ge mline issues o adul lies, which implies a speci ic unc ion o condensin I du ing game ogenesis. Consis en wi h his no ion, emales lacking a unc ional Einlei ung 16 1.2.3. Ch omosomenkondensa ion und Resolu ion de Ch oma iden Da die Schwes e ch oma iden zu Beginn de Mi ose noch massi e wickel und auße dem im gesam en Zellke n e eil sind, wä e es unmöglich, sie in solch eine Fo m e olg eich zu seg egie en. De Ein i in die Mi ose geh dahe mi eine massi en Ums uk u ie ung de Ch omosomen einhe . Diese müssen kompak ie und indi idualisie we den. Eine Kompak ie ung wi d du ch die Ch omosomenkondensa ion e mi el , bei welche das Ch oma in in obus e, s aba ige S uk u en gepack wi d. Diese physikalische Ve dich ung e möglich eine Ke n eilung inne halb de Dimension eine biologischen Zelle. Du ch die Replika ion und die Ausdehnung des Ch oma ins wäh end de In e phase en s ehen auße dem Ve knüp ungen zwischen den Schwes e ch oma iden abe auch zwischen benachba en Ch omosomen. Diese Ve knüp ungen müssen au gelös und eo ganisie we den, man sp ich on de Ch oma iden esolu ion. Es en s ehen le z lich kompak ie e, seh de inie e abe o zdem dynamische Ch omosomens uk u en, welche den K ä en de mi o ischen Spindel in de Anaphase s andhal en und du ch diese ebenso e olg eich seg egie we den können. 1.2.4. Mechanismen de Ch omosomenkondensa ion Die G undeinhei de DNA-Ano dnung s ell das Nucleosom da . 147 Basenpaa e de DNA we den hie bei inne halb 1,67 linksged eh e Windungen um ein Ok ame aus His onp o einen (jeweils zwei Kopien H2A, H2B, H3 und H4) gewickel (Eickbush und Moud ianakis, 1978). Diese His onok ame e sind en lang de DNA in einem Abs and on e wa 200 Basenpaa en angeo dne . Die Pe lenke ens uk u ode auch 10 nm-Fase bewi k eine 3- ache Ve kü zung de DNA- Moleküle (Richmond e al., 1984). Eine wei e e 6- bis 7- ache Kompak ie ung wi d bis hin zu sogenann en 30 nm-Fase e eich . Hie bei könn e die Anlage ung des His on H1, welches die DNA an Be eichen auße halb des His on-Ke ns binde , eine Rolle spielen (Oude e al., 1975; Suau e al., 1979). Nach Deple ion on H1 in Xenopus lae is-Eizellex ak en (Ohsumi e al., 1993), ode des H1-Gens in Te ahymena (Shen e al., 1995) konn e alle dings o zdem eine no male Ch omosomenkondensa ion beobach e we den, was die Rolle on H1 wiede um in F age s ell . Neue e S udien weisen da au hin, dass die 30 nm-Fase n du ch In e ak ionen de Nucleosomen selbs gebilde we den könn en (zusammenge ass in Li und Reinbe g (2011). Bis hin zu Mi ose muss eine wei e e 200- bis 500- ache Kompak ie ung de 30 nm-Fase bewe ks ellig we den. De genaue Mechanismus is hie bei bishe nich olls ändig au geklä , es we den abe e schiedene Modelle o geschlagen. Einlei ung 17 Basie end au dem coiled/ adial loop-Modell wü de die 30 nm-Ch oma in ase en lang eines axialen Ch omosomenge üs s in Schlau en gewickel (Ma sden und Laemmli, 1979; Paulson und Laemmli, 1977). Dieses Ge üs is aus e schiedenen nich -His on P o einen au gebau , einschließlich Topoisome ase II (Topo II) (Ea nshaw e al., 1985; Gasse e al., 1986; Lewis und Laemmli, 1982) und SMC2, eine Ke nun e einhei des Condensin-Komplexes (Lewis und Laemmli, 1982; Sai oh e al., 1994). An de Ve anke ung de Ch oma inschlei en könn en wiede um spezi ische AT- eiche Sequenzen de DNA wich ig sein. Diese we den als sca old associa ed egion (SAR) bezeichne (Mi ko i ch e al., 1984; Razin, 1996). Konsis en zu diesem Modell wu den nach P äzipi a ion on Me aphase-Ch omosomen Topo II (Ea nshaw und Heck, 1985; Gasse e al., 1986) und SMC2 (Sai oh e al., 1994) als haup sächlich assoziie e P o eine e hal en. Auch wei e e Expe imen e deu e en au eine zen ale Rolle beide P o eine bei de Ch omosomenkondensa ion hin. So konn e nach Inhibi ion de Topo II eine e minde e Ch omosomenkondensa ion beobach e we den (Go bsky, 1994). Du ch Hinzu ügen des Condensin-Komplexes konn e eine in i o Ch omosomenkondensa ion in mi o ischen X. lae is- Eizellex ak en e mi el we den (Hi ano e al., 1997). Wei e hin wu de du ch Immun luo eszenz ä bung de Condensin-Un e einhei en (Maeshima und Laemmli, 2003; Ono e al., 2003) und di ek e in i o Mik oskopie de EGFP-ma kie en Topo II (Ta o mina e al., 2002) eine axiale Lokalisa ion diese P o eine an na i en Me aphase-Ch omosomen bes ä ig . Dem Modell wiede sp echend, konn e du ch spä e e in i o S udien gezeig we den, dass Topo II und SMC2 e s wäh end de spä en P ophase am Ch oma in lokalisie en (Ki ee a e al., 2004; Maeshima und Laemmli, 2003), zu einem Zei punk , an dem die Kondensa ion be ei s wei o gesch i en is . Auße dem konn e gezeig we den, dass auch nach Deple ion bzw. knockdown on Topo II (Ca pen e und Po e , 2004; Sakaguchi und Kikuchi, 2004) ode SMC2 (Hudson e al., 2003) eine Ch omosomenkondensa ion möglich is . Ein wei e es Modell is das hie a chical olding-Modell. Gemäß diesem Modell wi d eine wei e e s u enweise Au al ung de 10 nm und 30 nm-Fase n in eine de inie e Hie a chie höhe - geo dne e Ebenen o geschlagen. Die en s ehenden Fase n könn en sich dann wei e zu den Me aphase-Ch omosomen au winden (Belmon e al., 1987; Seda und Manuelidis, 1978; Za sepina e al., 1983). Beide besch iebenen Modelle we den im hie a chical olding axial glue-Modell e einig (Abbildung 3). Hie is die ini iale Fal ung de Ch oma in ase n in ühe P ophase-Ch omosomen ge olg on eine wei e en Fal ung in dich e Ch oma iden on ca. 200-300 nm bis zu mi le en P ophase. Eine wei e e Ve d illung diese Ch oma ide bis zu P ome aphase bewi k eine zusä zliche Kompak ie ung, was zu Ausbildung de Me aphase-Ch omosomen üh . Diese Einlei ung 18 könn en einen seh dynamischen Ke n en hal en, welche aus einem Ge lech an e ne z em Ch oma in und ebenso aus nich -His on P o einen wie Topo II und SMC2 au gebau sein könn e. Eine Ch omosomenkompak ie ung könn e so auch ohne Topo II und SMC2 e mi el we den, zu S abili ä und Funk ion de Me aphase-Ch omosomen hingegen wä en diese P o eine essen iell (Ki ee a e al., 2004). Abbildung 3: Da s ellung des hie a chical olding axial glue- Modells. Die 30 nm-Fase n de In e phase-Ch omosomen we den zu 100-130 nm-Fase n au ge al e , welche in de mi le en P ophase zu 200-250 nm Ch oma iden e d ill we den. Bis zu Me aphase wi d eine maximale Kompak ie ung on 500-750 nm e eich . Im axialen Ke n de Ch oma iden inden sich Condensin und Topo II ( o e Kugeln), welche die Ch oma iden als eine A axiale „Klebe “ s abilisie en könn en. En nommen aus Ki ee a e al. (2004). Du ch 4-dimensionale Mik oskopie on Säuge zellen, welche ein EGFP-ma kie es His on 2B exp imie en, konn e die Kondensa ion de Ch omosomen in lebenden Zellen e olg und de en Volumen quan i izie we den (Mo a-Be mudez e al., 2007). Wie e wa e konn e eine Reduk ion dieses Volumens on de In e phase übe die P ophase zu Me aphase beobach e we den. Übe aschende weise wa in de Me aphase noch keine maximale Kompak ie ung de Ch omosomen e eich . E s wäh end de Anaphase wu de das Minimal olumen de Ch omosomen du ch ein maximal-axiales Ve kü zen de einzelnen Ch oma iden bewi k . Wäh end die Lokalisa ion de Au o a B Kinase an den Spindelmik o ubuli essen iell ü diese Anaphasen-Kompak ie ung is , konn en keine E ek e nach Deple ion de Condensin-Komplexe beobach e we den. Diese wei e e Kompak ie ungsmechanismus wäh end de Anaphase bie e e en uell eine zusä zliche Möglichkei noch bes ehende Ch oma id e wicklungen au zulösen um die Ch oma iden un e seh seg egie en zu können (Mo a-Be mudez e al., 2007). 1.2.5. Ch omosomenseg ega ion Die Kohäsion zwischen den Schwes e ch oma iden muss im Wesen lichen bis zu de en Seg ega ion in de Anaphase e hal en bleiben. In höhe en Euka yo en e olg die Au hebung de Kohäsion in zwei Sch i en. Ein G oß eil des Kohäsins wi d be ei s in de P ophase on den Einlei ung 19 Ch omosomena men abgelös (Losada e al., 1998; Suma a e al., 2000; Waizenegge e al., 2000). Diese Vo gang, de als P ophaseweg bezeichne wi d, wi d du ch die Kinase Polo-like kinase 1 (Plk1) e möglich (Hau e al., 2005; Lena e al., 2007; Suma a e al., 2000). Plk1 phospho ylie die mi o ische Kohäsin-Un e einhei Scc3 (Hau e al., 2005), wodu ch wah scheinlich de Kohäsin-Komplex dissoziie . De g undlegende Mechanismus is hie bei nich bekann , es wi d abe eine Funk ion de P o eine Wings apa -like (Wapl) und Pds5 e mu e (Gandhi e al., 2006; Ha man e al., 2000; Panizza e al., 2000). Ein Teil des Kohäsins bleib an den Zen ome en de Ch omosomen e hal en. Ve an wo lich hie ü is ein am Zen ome -assoziie es P o ein, das als Shugoshin bezeichne wi d. Dieses wi k de Plk1- abhängigen Phospho ylie ung on Scc3 du ch Rek u ie ung de P o ein-Phospha ase 2A (PP2A) en gegen (Ki ajima e al., 2006). E s nach ko ek e Anlage ung de Spindelmik o ubuli an den Kine ocho en de Schwes e ch oma ide kann die zwei e Phase de Kohäsinabspal ung einse zen und die Schwes e ch oma iden können zu en gegengese z en Zellpolen gezogen we den. Dies wi d mi els p o eoly ische Spal ung de Kohäsin-Un e einhei Scc1 du ch die konse ie e Cys ein-P o ease Sepa ase e möglich (Uhlmann e al., 2000; Waizenegge e al., 2000). Die Sepa ase muss hie bei bis zum Einse zen de Anaphase inak i bleiben. Dies wi d eine sei s du ch den inhibi o ischen Ko ak o Secu in e möglich , de die Sepa ase du ch eine di ek e Bindung inak i ie , bis alle Kine ocho e de Schwes e ch oma iden ko ek an de Mi o ischen Spindel angelage sind (Ciosk e al., 1998; Yamamo o e al., 1996; Zou e al., 1999). E s zum Ein i in die Anaphase wi d die Inhibi ion de Sepa ase du ch Deg ada ion on Secu in au gehoben (Cohen-Fix e al., 1996; Zou e al., 1999). Auße dem wi d die phospho ylie e Fo m de Sepa ase du ch Bindung an den Ckd1-Cyclin B1-Komplex egulie (Go e al., 2005; S emmann e al., 2001). 1.3. De Condensin-Komplex 1.3.1. Iden i ika ion des Condensin E s mals wu de Condensin nach Expe imen en in zell eien Eizellex ak en aus X. lae is besch ieben. Nach Deple ion on X-CapC/SMC4 du ch spezi ische An ikö pe konn e gezeig we den, dass dieses P o ein wich ig ü die Ch omosomenkondensa ion abe auch ü den E hal mi o ische Ch omosomen in i o is (Hi ano und Mi chison, 1994). SMC4 bilde zusammen mi SMC2 einen Ke nkomplex aus, de mi d ei wei e en P o einen assoziie (Kimu a und Hi ano, 1997). Diese Komplex is in de Lage, eine in i o Ch omosomenkondensa ion zu e mi eln Einlei ung 20 (Hi ano e al., 1997) und wu de dahe als Condensin benann . Du ch die A bei sg uppe um Hi ano konn e da übe hinaus gezeig we den, dass de Condensin-Komplex in i o an DNA binden und abhängig on Topoisome ase I (Topo I) und ATP posi i e Windungen in die DNA ein ügen kann (Kimu a und Hi ano, 1997). Spä e wu de auch de humane Condensin-Komplex iden i izie , welche ebenso posi i e Windungen in die DNA ein ügen konn e und soga be ähig wa , in mi o ischen X. lae is-Eizellex ak en eine Ch omosomenkondensa ion zu e mi eln (Kimu a und Hi ano, 2000). Das deu e e au eine hohe Konse ie ung und Bedeu ung des Condensin-Komplexes hin. In HeLa-Zellen (menschliche Epi helzellen eines Ze ixka zinoms) und auch im X. lae is-Eizellex ak konn e schließlich noch ein wei e e Condensin-Komplex iden i izie we den, de ch onologisch als Condensin II bezeichne wu de (Ono e al., 2003; Yeong e al., 2003). 1.3.2. Au bau de Condensin-Komplexe Analog zum Kohäsin-Komplex wi d auch de Ke n de Condensin-Komplexe in Euka yo en aus einem He e odime on SMC-P o einen gebilde . Neben diesem zen alen SMC2/SMC4- He e odime sind die Condensin-Komplexe aus 3 wei e en Un e einhei en au gebau (Abbildung 4). Cha ak e is isch ü den Condensin I-Komplex sind hie bei CapH, CapG und CapD2, ü den Condensin II-Komplex CapH2, CapG2 und CapD3. CapH und CapH2 gehö en wie auch das Scc1 P o ein des Kohäsin-Komplexes, zu Familie de Kleisine (Schlei e e al., 2003). Cha ak e is isch ü CapG, CapG2, CapD2 und CapD3 sind wie auch ü das Scc3 des Kohäsin-Komplexes, HEAT- Repea -Domänen (Neuwald und Hi ano, 2000). Abbildung 4: Schema ische Da s ellung de Condensin- Komplexe. Die Basis beide pen ame e Komplexe bilde ein He e odime de P o eine SMC2 und SMC4, welches an den Scha nie domänen beide P o eine ausgebilde wi d. Die Te mini beide P o eine bilden eine ka aly ische ATPase Domäne aus. Hie binden auch die jeweiligen Kleisine, CapH im Condensin I und CapH2 im Condensin II. Diese e b ücken die In e ak ion zu den HEAT-Repea - P o einen CapG und CapD2 (Condensin I) bzw. CapG2 und CapD3 (Condensin II). En nommen aus Hudson e al. (2009). Die genaue Geome ie de Condensin-Komplexe wu de am Beispiel de humanen Komplexe un e such . Einzelne Un e einhei en wu den hie bei in ekombinan en Exp essionssys emen Einlei ung 21 he ges ell und dann au ih e Wechselwi kungen hin un e such (Onn e al., 2007). In diese A bei konn e gezeig we den, dass beide SMC-P o eine an den Kop domänen du ch die Kleisin- Un e einhei CapH e b ück we den. Die beiden HEAT-Repea -Un e einhei en CapG und CapD2 in e agie en nu schwach mi einande und nich mi den SMC-Un e einhei en. Es konn e eine s a ke In e ak ion on CapH mi CapG und CapD2 es ges ell we den. Die N- e minale Häl e des CapH e b ück CapD2 mi SMC2, die C- e minale Häl e hingegen CapG mi SMC4 (Abbildung 4). Obwohl die Aminosäu esequenzen de nich -SMC-Un e einhei en beide Condensin-Komplexe seh di e gen sind, konn e ein analoge Au bau auch ü den Condensin II-Komplex gezeig we den (Onn e al., 2007). 1.3.3. E olu ionä e Konse ie ung de Condensin-Komplexe Auch in Bak e ien wu den un e schiedliche Klassen on Condensin-Komplexen iden i izie . Diese sind alle dings aus einem SMC-Homodime und nu zwei wei e en akzesso ischen Un e einhei en au gebau (Niki e al., 1991; Pe ushenko e al., 2011; Volko e al., 2003; Yamazoe e al., 1999). Modello ganismen, wie Schizosaccha omyces pombe, S. ce e isiae, Aspe gillus nidulans und Neu ospo a c assa, die wenige s a k kondensie e Me aphase- Ch omosomen au weisen, besi zen nu den Condensin I-Komplex. Höhe e Euka yo en haben hingegen zwei Condensin-Komplexe, weshalb spekulie wu de, dass ein wei e e Condensin- Komplex O ganismen mi komplexe en Ch omosomen wei e e Ebenen de S uk u ie ung diese e möglichen könn e (Hi ano, 2005). In Caeno habdi is elegans konn e noch ein wei e e Condensin I-ähnliche Komplex iden i izie we den, de Dosage Compensa ion Complex (Condensin IDC) (Hags om und Meye , 2003). Diese wi d aus dem SMC2 Homolog MIX1, eine SMC4-Va ian e (DPY27) und 3 wei e en P o einen, DPY26, DPY28 und CapG1, gebilde (Csanko szki e al., 2009). De DCC-Komplex spiel alle dings keine Rolle in de Mi ose, e wi d ielmeh zu X-Ch omosomalen Dosiskompensa ion de He maph odi en benö ig (Hags om und Meye , 2003). 1.3.4. Subzellulä e Lokalisa ion und Ch oma inassozia ion de Condensin-Komplexe Die subzellulä e Lokalisa ion de Condensin-Komplexe wäh end de In e phase a iie inne halb de e schiedenen Euka yo en. De Condensin-Komplex in S. ce e isiae lokalisie wäh end des gesam en Zellzyklus im Ke n (Bhalla e al., 2002; F eeman e al., 2000). In S. pombe we den die zy oplasma isch lokalisie en Condensin-Un e einhei en wäh end de Mi ose in den Ke n Einlei ung 22 anspo ie (Su ani e al., 1999). In Ve eb a en un e scheiden sich die Condensin-Komplexe in ih e In e phasenlokalisa ion und ih e Rek u ie ung an das Ch oma in. Die Condensin I- spezi ischen Un e einhei en sind wäh end de In e phase im Zy oplasma lokalisie und e hal en einen Zugang zum mi o ischen Ch oma in e s nach dem Zusammenb uch de Ke nhülle (NEBD) zum Ende de P ophase (Hi o a e al., 2004; Ono e al., 2003). Die Condensin II-spezi ischen Un e einhei en sind be ei s wäh end de In e phase im Ke n lokalisie (Hi o a e al., 2004; Ono e al., 2003; Yeong e al., 2003). So wi d dem Condensin II eine spezi ische Rolle bei de ini ialen Ch omosomenkondensa ion zugesp ochen. Condensin I, nich abe Condensin II, wi d hingegen ü die olls ändige Ablösung des Kohäsins en lang de Ch omosomena me, ü die Ch omosomen e kü zung und ü einen zei lich-no malen Ablau du ch die P ome a- und Me aphase benö ig (Hi o a e al., 2004). Es konn e auße dem eine oneinande unabhängige Ch oma inassozia ion beide Komplexe und eine al e nie ende Lokalisa ion mi eilweise übe lappenden Be eichen am Ch oma in gezeig we den (Hi o a e al., 2004; Ono e al., 2004). 1.3.5. Funk ionen de Condensin-Komplexe bei Ch omosomens uk u ie ung und -seg ega ion Übe aschende weise konn e auch in Abwesenhei de Condensin-Un e einhei en in ielen Sys emen, wie D. melanogas e , S. pombe, C. elegans und Gallus gallus eine wei gehend no male Ch omosomenkondensa ion beobach e we den (Bha e al., 1996; Dej e al., 2004; Gie und Glo e , 2001; Hags om e al., 2002; Hudson e al., 2003; Jäge e al., 2005; Saka e al., 1994; Sa idou e al., 2005). Nach diesen S udien muss e die Be eiligung des Condensin-Komplexes an de Ch omosomenkondensa ion pe se in F age ges ell we den. In all diesen A bei en wu den hingegen massi e De ek e bei de Schwes e ch oma idenseg ega ion besch ieben. Die obus e S uk u de Me aphase-Ch omosomen schein in Abwesenhei on Condensin ges ö zu sein. Diese sind wenige esis en gegen physikalischen S ess, de expe imen ell du ch einen Wechsel e schieden-ionische Pu e nachges ell we den konn e (Hudson e al., 2003). Ebenso konn e eine Fehllokalisa ion e schiedene nich -His on P o eine wie Topo II und INCENP nach Deple ion on SMC2 ode SMC4 gezeig we den (Hudson e al., 2008; Hudson e al., 2003). Auch bei de De ini ion und O ganisa ion des zen ome en Ch oma ins und olglich bei de S uk u ie ung de Zen ome e könn e Condensin eine Rolle spielen. In HeLa-Zellen (Ono e al., 2004), C. elegans (Hags om e al., 2002) und auch D. melanogas e (S e ensen e al., 2001) wu de eine An eiche ung de Condensin-Un e einhei en am Zen ome de Ch oma iden Einlei ung 23 beobach e . In D. melanogas e konn e wei e hin eine ini iale Beladung de nich -SMC- Un e einhei en des Condensin am Zen ome beobach e (Fische , 2010; Naga ka , 2010; Oli ei a e al., 2007) und soga eine di ek e In e ak ion on CapG mi de Zen ome -spezi ischen His on H3 Va ian e CID nachgewiesen we den (Jäge e al., 2005). In HeLa-Zellen wu de zudem gezeig , dass du ch eine Deple ion des Condensin die Inko po a ion des Zen ome -spezi ischen His on H3 (CenpA) eduzie is (Samoshkin e al., 2009). Da übe hinaus konn e nach Deple ion des Condensin eine unde inie e Ano dnung de Ch omosomen inne halb de Me aphasenpla e, De ek e bei de Anlage ung de Mik o ubuli an den Kine ocho en und auch me o elische Anlage ungen de Spindelmik o ubuli in S. ce e isiae (Yong-Gonzalez e al., 2007), C. elegans (Hags om e al., 2002), D. melanogas e (Oli ei a e al., 2005), X. lae is- Eizellex ak en (Wignall e al., 2003) und HeLa-Zellen (Ono e al., 2004) beobach e we den. Nach Deple ion on SMC2 in humanen Zellen wu de beispielsweise eine ungewöhnlich wei e Ve eilung on P o einen des inne en und äuße en Kine ocho s und eine e minde e Ak i i ä de Au o a B Kinase am Zen ome au gezeig (Samoshkin e al., 2009). Basie end au diesen E gebnissen wu de in diese A bei pos ulie , dass eine Condensin-Deple ion eine pa ielle Dekondensa ion des zen ome en Ch oma ins zu Folge ha . Es käme zum ehle ha en Anlage n de Mik o ubuli an diese ungeo dne en Kine ocho s uk u en. Dadu ch wä e auch de An eil an Zen ome -lokalisie e Au o a B-Kinase und de en Ak i i ä am Zen ome e minde und ehle ha angelage e Mik o ubuli könn en nich meh ko igie we den (Samoshkin e al., 2009). Eine Folge wä en Seg ega ionsde ek e wäh end de Anaphase. In Condensin deple ie en DT40-Zellen (B-Zelllinie on G. gallus) hingegen e schien die Kine ocho s uk u wei gehend no mal. Jedoch konn en abno male, unkoo dinie e Bewegungen de Schwes e kine ocho e nach Anlage ung de Spindelmik o ubuli beobach e we den. Diese E gebnisse könn en dadu ch e klä we den, dass in diesem Sys em allgemein wenige Mik o ubuli am Kine ocho anlage n und somi auch wenige Zugk ä e am Zen ome en s ehen (Ribei o e al., 2009). 1.3.6. Die Condensin-abhängige Ablösung des Kohäsin-Komplexes Um die lokale Seg ega ion einzelne Ch oma idena me wäh end de Mi ose zu beobach en, wu den e schiedene Loci en lang de Ch omosomena me in S. ce e isiae isualisie und mik oskopie (Renshaw e al., 2010). Anhand de E gebnisse konn e ein Modell ü die Be eiligung des Condensin-Komplexes an de En e nung des Kohäsins on den Schwes e ch oma idena men au ges ell we den. Demnach we den du ch den Zug de Einlei ung 24 Spindelmik o ubuli in de Anaphase die Schwes e ch oma iden sch i weise on den Zen ome en hin zu den Telome en seg egie . Noch an den Ch oma idena men e bliebene Kohäsinmoleküle üh en zu egionalen Spannungen im Ch oma in. Um die S abili ä de Ch omosomen zu e hal en, muss diesen Spannungen du ch spezi ische Ve d illung des Ch oma ins en gegengewi k we den, was wiede um du ch den Condensin-Komplex e mi el we den könn e. Du ch diese Ch oma inumlage ungen wü den e bleibende Kohäsin-Moleküle om Ch oma in abgelös . Ohne einen unk ionellen Condensin-Komplex könn en diese Ums uk u ie ungen des Ch oma ins nich s a inden und die lokalen Spannungen wü den schließlich zu Beschädigung ode ga zum Ze eißen de Ch omosomen üh en (Renshaw e al., 2010). Auch mi diesem Modell könn en die beobach e en Seg ega ionsde ek e de Condensin- Mu an en e klä we den. In HeLa-Zellen konn e nach Deple ion de Condensin I-Un e einhei CapD2 du ch RNAi eben alls ein Bes ehen de Kohäsion an den Ch omosomena men besch ieben we den (Hi o a e al., 2004). In S. ce e isiae wu de eine Condensin abhängige Kohäsin-En e nung auch wäh end de Meiose beobach e (Yu und Koshland, 2005). In diese A bei wu de gezeig , dass Condensin ü die Dissozia ion des Kohäsins be ei s zwischen P ophase I und Me aphase I benö ig wi d, wah scheinlich übe eine Ak i ie ung de Polo-like Kinase (Cdc5). 1.3.7. Mechanismen de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung Die Condensin-Komplexe sind also zu S uk u ie ung de Ch omosomen essen iell, abe wie kann diese S uk u ie ung e mi el we den? Es is mi le weile e ablie , dass de s uk u ell seh ähnliche Kohäsin-Komplex DNA-S änge ing ö mig umschließ und somi zusammenhäl (Hae ing e al., 2008). Eine Reihe on S udien sp ich alle dings dagegen, dass auch de Condensin-Komplex DNA-S änge ode auch Ch oma in ase n opologisch umschließen und somi s uk u ie en und egulie en kann (Ande son e al., 2002; Baze -Jones e al., 2002; Hudson e al., 2008). So zeigen elek onenmik oskopische Au nahmen des humanen Condensin- Komplexes eine ehe geschlossene Fo ma ion au , bei de das SMC2/SMC4-He e odime seh eng ge al e e schein , wäh end die nich -SMC-Un e einhei en globulä anlage n (lollipop- S uk u ) (Ande son e al., 2002). Fü den Kohäsin-Komplex konn e in de selben S udie eine e meh o ene Fo ma ion beobach e we den, bei de die coiled-coil Be eiche des SMC1/SMC3-He e odime s eine o ene V-Fo m ausbilden. Da übe hinaus konn e gezeig we den, dass de Kohäsin-Komplex nach ek opische P o eolyse on SMC3 om Ch oma in gelös we den kann, wobei die Schwes e ch oma iden ennung a i iziell ini iie wi d (G ube e Einlei ung 25 al., 2003). De Condensin-Komplex blieb alle dings nach p o eoly ischem Schneiden on SMC2 inne halb de coiled-coil Region wei gehend in ak und konn e auch nich om Ch oma in abgelös we den (Hudson e al., 2008). Auße dem konn e eine di ek e In e ak ion de Kleisin- Un e einhei Cnd2/CapH mi den His onen H2A und H2A.Z in S. pombe und auch eine di ek e In e ak ion des CapH mi dem His on H2A in HeLa-Zellen gezeig we den (Tada e al., 2011). Auch elek onenspek oskopische Au nahmen implizie en eine di ek e Bindung de SMC- Kop domänen an das Ch oma in (Baze -Jones e al., 2002). So wä e eine S uk u ie ung des Ch oma ins du ch eine di ek e Bindung einzelne Condensin-Un e einhei en denkba , indem e schiedene Ch oma inbe eiche mi einande e knüp und eine ge al e e S uk u de Ch oma in ase ixie wü de (Abbildung 5A) (Cuylen und Hae ing, 2011). Abbildung 5: Modell de Condensin- e mi el en Ch oma inkompak ie ung. A) Du ch di ek e Bindung einzelne Condensin-Un e einhei en an die DNA könn en zwei Ch omosomenbe eiche mi einande e knüp we den. B) Al e na i könn e de Condensin-Komplex zwei Ch oma in ase n opologisch umschließen, wobei ebenso eine di ek e Bindung einzelne Condensin-Un e einhei en an die DNA möglich wä e, um eine Fixie ung de S uk u zu e mi eln. C) Du ch die Condensin-Komplexe könn e le z lich eine s uk u elle Ve es igung de Ch omosomen e eich we den. En nommen aus Cuylen und Hae ing (2011). Du ch Cuylen e al. konn e kü zlich gezeig we den, dass de Condensin-Komplex dennoch ähig is , DNA-Moleküle opologisch zu umschließen (Cuylen e al., 2011). In diese A bei wu de die Bindung des Condensin-Komplexes an a i izielle Minich omosomen im Ve gleich zu de des Kohäsin-Komplexes in S. ce e isiae un e such . Sowohl nach Linea isie ung de Minich omosomen mi Res ik ionsenzymen als auch nach p o eoly ische Spal ung de Condensin-Un e einhei en B n4/CapH ode SMC4 konn e eine Dissozia ion de Minich omosomen om Condensin-Komplex e mi el we den. Im Un e schied zu Dissozia ion des Kohäsin-Komplexes, wu den ü eine Ablösung de Minich omosomen om Condensin- Komplexes alle dings höhe e Salzkonzen a ionen benö ig. Das könn e au die Exis enz wei e e Einlei ung 32 Zen ome ini iie wi d ode al e na i en lang de gesam en Ch omosomen e olgen kann. Mi els Immunp äzipi a ion einzelne EGFP-ma kie e CapG-F agmen e soll e auße dem he ausgea bei e we den, welche Domänen on CapG wich ig ü die In e ak ion mi den wei e en Condensin-Un e einhei en sind. Hie bei könn e ein Zusammenhang zu Ch oma inassozia ion bzw. zu biologischen Funk ionali ä de einzelnen Domänen he ges ell we den. Um die Regula ion de Condensin-Komplexe nähe zu cha ak e isie en, soll e auße dem gep ü we den, ob auch die Condensin-Un e einhei en in D. melanogas e wäh end des Zellzyklus phospho ylie we den und welche Domänen inne halb on CapG die haup sächlichen Phospho ylie ungss ellen en hal en. Du ch Mik oskopie en sp echende Fliegengewebe, in denen ein luo eszenzma kie es CapG- Kons uk un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e on CapG exp imie wi d, soll e zudem die Lokalisa ion on CapG in den Zellen de weiblichen und männlichen Keimbahn de Fliege analysie we den, um e en uelle Funk ionen des P o eins in diesen Geweben zu e a bei en. Im zwei en Teil diese A bei soll du ch e schiedene expe imen elle F ages ellungen die mögliche Assemblie ung on CapG inne halb eines Condensin II-Komplexes gezeig ode al e na i ein Kandida ü CapG2 iden i izie we den. Es wu de be ei s gezeig , dass die Condensin II-spezi ischen Un e einhei en die Disassemblie ung on poly änen Ch omosomens uk u en inne halb de o a ialen Näh zellen und auch de la alen Speicheld üsen ini iie en können. Du ch gene ische In e ak ionss udien soll e hie bei eine Be eiligung on CapG an diesen P ozessen un e such we den. Die Immunp äzipi a ion eines mRFP1-ma kie en CapG aus Emb yonen- und O a ienex ak en und Analyse de P äzipi a e könn e wei e hin eine mögliche physikalische In e ak ion on CapG mi Condensin II-spezi ischen Un e einhei en bes ä igen. Mi els Immunp äzipi a ion de Epi op-ma kie en Un e einhei en SMC4 und CapH2 in O a ienex ak en und anschließende massenspek ome ische Analyse de P äzipi a e wä e hingegen die Iden i ika ion de Condensin II-Un e einhei CapG2 e möglich . Diese soll e in Analogie zu den CapG2-Un e einhei en höhe e Euka yo en ein Molekula gewich on e wa 100 kDa au weisen und HEAT-Repea -Domänen en hal en. Abschließend könn en di ek e In e ak ionen zwischen den einzelnen Condensin-Un e einhei en du ch ein in i o Assay wei e üh end e i izie und somi die Geome ie de Condensin-Komplexe on D. melanogas e e a bei e we den. E gebnisse 33 2. E gebnisse 2.1. S uk u - und Funk ionsanalyse on CapG Um Domänen inne halb on CapG zu iden i izie en, welche ü die Ke nlokalisa ion wäh end de In e phase und auch ü die Lokalisa ion des P o eins am Ch oma in e an wo lich sind, wu de be ei s in o ausgehenden S udien das Ve hal en einzelne CapG-F agmen e im Ve lau de Mi ose un e such . Hie zu wu den C- e minal EGFP-ma kie e P o ein agmen e on CapG he ges ell und ansgene Fliegen gene ie , in welchen diese F agmen e un e Kon olle eines UAST-P omo o s exp imie we den konn en (F ank, 2008; He zog, 2007). Wäh end diese A bei wu de ein wei e es EGFP-ma kie es CapG-Kons uk (UAST-CapGNM5-EGFP) he ges ell und mi els P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion in das Fliegengenom eingeb ach . Es konn en hie bei d ei un e schiedliche T ansgeninse ionen e hal en we den (Tabelle 11). Die Lokalisa ion de e schiedenen P o ein agmen e wu de du ch in i o Mik oskopie lebende Emb yonen wäh end de 14. epide malen Mi ose beobach e (F ank, 2008; He zog, 2007; sowie diese A bei ). Die gewonnenen E kenn nisse wu den in diese A bei zusammenge ass und mi compu e gene ie en S uk u analysen de Aminosäu esequenz on CapG du ch die P og amme PSORT und SMART e glichen. Du ch PSORT o he gesag e Ke nlokalisa ionssequenzen inne halb des C- e minalen Be eichs on CapG (Abbildung 6, o e Balken) konn en auch expe imen ell bes ä ig we den. Alle F agmen e, die den C-Te minus on CapG en hal en (CapGFL-EGFP, CapGMC-EGFP und CapGC-EGFP), wa en wäh end de In e phase im Ke n ange eiche . Fü CapGC-EGFP konn e eine as ausschließliche Ke nlokalisa ion beobach e we den ( e gleiche Abbildung 7B). Du ch PSORT wu de auch eine Ke nexpo sequenz im Be eich de Aminosäu eposi ion 898 o he gesag (Abbildung 6, blaue Balken). Die in i o Mik oskopie e gab jedoch, dass auch F agmen e, die diesen Aminosäu ebe eich nich en hal en (CapGN-EGFP, CapGNM1-EGFP und CapGNM2-EGFP) wäh end de In e phase o angig im Zy oplasma lokalisie en. Diese Ta sache könn e die Exis enz eine wei e en Expo sequenz im N-Te minus on CapG implizie en. CapGNM-EGFP, CapGNM1-EGFP, CapGM-EGFP und CapGN-EGFP wä en somi om Ke n ausgeschlossen, da diesen P o ein agmen en die C- e minalen Ke nimpo sequenzen ehlen und Expo sequenzen im Be eich de N- e minalen zwei-D i el des P o eins zum T agen kommen. CapGC-EGFP wä e wäh end de In e phase ausschließlich ke nlokalisie , da dieses F agmen Ke nimpo sequenzen, hingegen abe keine Ke nexpo sequenzen en häl . E gebnisse 34 Abbildung 6: Schema ische Da s ellung de un e such en CapG-F agmen e und de en Lokalisa ions e hal en wäh end de 14. epide malen Mi ose. Es sind o he gesag e HEAT-Repea -Domänen du ch osa Balken (SMART: Be eich de Aminosäu en 90-553), Ke nimpo sequenzen du ch o e Balken (PSORT: Aminosäu en 1072, 1162, 1210), sowie Ke nexpo sequenzen du ch blaue Balken da ges ell . Eine diese Expo sequenzen wu de du ch PSORT an Aminosäu e 898 o he gesag , eine wei e e wi d au G und des Lokalisa ions e hal ens de F agmen e im N- e minalen Be eich e mu e . HEAT-Repea -Domänen wu den du ch SMART im N- e minalen Be eich on CapG zwischen den Aminosäu en 90 und 553 o he gesag (Abbildung 6, osa Balken). Diese Sequenzen e mi eln P o ein-P o ein-In e ak ionen (Neuwald und Hi ano, 2000) und könn en dahe auch wich ige Be eiche zu Regula ion on CapG da s ellen. P o ein-P o ein-In e ak ionen könn en beispielsweise den T anspo on CapG wäh end des Zellzyklus e mi eln. Da CapGC-EGFP keine HEAT-Repea -Regionen en häl , o zdem abe seh e izien im Ke n ange eiche we den kann, soll en en sp echende P o ein-P o ein-In e ak ionen ehe beim Ke nexpo als beim Ke nimpo zum T agen kommen. Ta sächlich e scheinen die F agmen e, denen ein g oße Be eich de HEAT-Repea -Domänen ehl (CapGNM4-EGFP und CapGNM5-EGFP), wäh end de In e phase wei gehend gleichmäßig in de Zelle e eil . CapGM-EGFP s ell hie bei eine Ausnahme da , da dieses F agmen anscheinend ohne HEAT-Repea - e mi el e In e ak ionen aus dem Ke n expo ie we den kann. E en uell is de Expo dieses F agmen s du ch dessen ge inge e G öße auch ohne en sp echende P o ein-P o ein-In e ak ionen möglich. Allgemein schein die E gebnisse 35 subzellulä e Lokalisa ion on CapG wäh end de In e phase du ch ein Gleichgewich on P o einexpo und –impo egulie zu sein, welches du ch die An- bzw. Abwesenhei de einzelnen P o eindomänen e schoben wi d. Die N-Te minalen zwei-D i el (CapGNM-EGFP) on CapG e scheinen hingegen wich ig, um die Ch oma inlokalisa ion wäh end de Mi ose zu e möglichen. Nach Zusammenb uch de Ke nhülle, e häl CapGNM-EGFP Zugang zu DNA und lokalisie im wei e en Ve lau de Mi ose wie auch das olle-Länge P o ein am Ch oma in (He zog, 2007 und Abbildung 9A bis E). Nach wei e e Ve kü zung dieses P o einbe eichs (CapGNM1-EGFP, CapGNM2-EGFP CapGNM3-EGFP, CapGNM4-EGFP, CapGNM5-EGFP, CapGN-EGFP und CapGM-EGFP) kann keine lei Lokalisa ion am Ch oma in beobach e we den. Fü die Ch oma inassozia ion wäh end de Me aphase e schein somi de gesam e Be eich de N- e minalen zwei-D i el essen iell. Auch CapGMC-EGFP und CapGC-EGFP können am Ch oma in assoziie en, alle dings e s wäh end de Anaphase. Zu diesem Zei punk delokalisie en das endogene CapG und die beiden ande en nich -SMC Condensin I-Un e einhei en be ei s om Ch oma in (Fische , 2010; Naga ka , 2010; Oli ei a e al., 2007). Das wü de ü eine al e na i e DNA-Bindung diese CapG-F agmen e auße halb des Condensin-Komplexes sp echen, die be o zug e möglich is , wenn das endogene CapG be ei s nich meh am Ch oma in lokalisie . 2.1.1. CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in CapG is wäh end de In e phase nich homogen im Zellke n e eil . In eigene o ausgegangene A bei konn e du ch in i o Mik oskopie on Emb yonen, welche UAST- CapGFL-EGFP wäh end Mi ose 14 exp imie en, gezeig we den, dass lokale An eiche ungen des P o eins inne halb de Zellke ne o handen sind (He zog, 2007). Diese lokalen An eiche ungen inne halb de In e phase-Zellke ne sind ü CapGC-EGFP noch deu liche (Abbildung 7B). Um zu un e suchen, ob es sich hie bei um eine Lokalisa ion de Fusionsp o eine speziell an He e och oma inbe eichen de Ch omosomen wäh end de In e phase handel , wu de die Lokalisa ion de CapG-EGFP-F agmen e zusammen mi dem mRFP1-ma kie en HP1 un e such . HP1 wu de in D. melanogas e als ein mi He e och oma in-spezi ischen DNA-Sequenzen assoziie es P o ein besch ieben (James und Elgin, 1986). Auch die Ch oma inassozia ion dieses P o eins wu de be ei s un e such . HP1 e schein wäh end de In e phase egional am Ch oma in konzen ie , dissoziie alle dings mi beginnende Ch omosomenkondensa ion und is wäh end in de Me aphase schließlich gleichmäßig in de Zelle e eil (Kellum e al., 1995). E gebnisse 36 Um eine Exp ession de UAST-CapG-EGFP-Kons uk e zusammen mi mRFP1-HP1 zu e mi eln, wu den die T ansgeninse ionen UAST-CapGFL-EGFP II.2 und UAST-CapGC-EGFP II.3 jeweils mi eine T ansgeninse ion eines mRFP1-ma kie en HP1-Kons uk es ekombinie . Die Exp ession on mRFP1-HP1 wi d hie bei un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e des HP1-Genlokus e mi el . Du ch in i o Mik oskopie on Emb yonen, in denen die Exp ession de UAST-CapG-EGFP-T ansgeninse ionen du ch α4 ub-Gal4-VP16 e mi el wu de, konn e die Lokalisa ion on CapGFL-EGFP und CapGC-EGFP in Bezug zu de on mRFP1-HP1 wäh end des Zellzyklus beobach e we den. Die du ch Kellum e al. 1995 besch iebene Lokalisa ion on HP1 konn e ü das mRFP1-ma kie e HP1 in lebenden Emb yonen bes ä ig we den (Abbildung 7 und Abbildung 8). Wäh end de In e phase we den lokal konzen ie e Be eiche on CapGFL-EGFP deu lich, welche mi mRFP1-HP1 übe lappen (Abbildung 7A, gelbe P eil). Es können ebenso Be eiche beobach e we den, in denen nu CapGFL-EGFP (Abbildung 7A, g üne P eil) ode abe nu mRFP1-HP1 lokal ange eiche o liegen (Abbildung 7A, o e P eil). Abbildung 7: CapG lokalisie wäh end de In e phase am He e och oma in. A) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGFL-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) wäh end de Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4- VP16/UAST-CapGFL-EGFP II.2, mRFP1-HP1 II.1). Wäh end de In e phase e en lokal konzen ie e Be eiche on CapGFL-EGFP au , die mi mRFP1-HP1 übe lappen (gelbe P eil). In de Übe lage ung we den auch lokale An eiche ungen on CapGFL-EGFP deu lich, welche nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (g üne P eil); ebenso lokale An eiche ungen on mRFP1-HP1, die nich mi CapGFL-EGFP übe lappen ( o e P eil). B) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGC-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en (α4 ub- Gal4-VP16/UAST-CapGC-EGFP II.3, mRFP1-HP1 II.1). Wäh end de In e phase zeig sich hie eine seh ausgep äg e Lokalisa ion on CapGC-EGFP im Ke n. Alle lokal konzen ie en Be eiche on mRFP1-HP1 übe lappen auch mi CapGC-EGFP (gelbe P eil). In de Übe lage ung we den abe auch lokale An eiche ungen on CapGC-EGFP deu lich, die nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (g üne P eil). Die Maßs absbalken en sp echen 5 μm. E gebnisse 37 Die Kolokalisa ion on CapGFL-EGFP und mRFP1-HP1 wu de wei e hin auch im Ve lau de Mi ose e olg (Abbildung 8A bis G). Beginnend mi de Ch omosomenkondensa ion in de P ophase inde eine Beladung on CapGFL-EGFP an das Ch oma in s a (Abbildung 8B), wäh end mRFP1- HP1 beginn , sich gleichmäßig in de gesam en Zelle zu e eilen (Abbildung 8C). CapGFL-EGFP e bleib bis hin zu Anaphase am Ch oma in lokalisie , mRFP1-HP1 hingegen bleib di us in de Zelle e eil (Abbildung 8D bis E). E s wäh end de In e phase de Mi ose 15 kann wiede um eine lokale Konzen a ion on mRFP1-HP1 beobach e we den (Abbildung 8G). Es inde be ei s hie eine Kolokalisa ion mi dem CapGFL-EGFP s a . CapGC-EGFP zeig wäh end de In e phase eine seh deu liche Ke nlokalisa ion (Abbildung 7B). Alle lokal konzen ie en Be eiche on mRFP1-HP1 übe lappen hie auch mi CapGC-EGFP (Abbildung 7B, gelbe P eil). In de Übe lage ung we den abe auch lokale An eiche ungen on CapGC-EGFP deu lich, welche nich mi mRFP1-HP1 übe lappen (Abbildung 7B, g üne P eil). Im Ve lau de Mi ose (Abbildung 8H bis O) können wäh end de spä en P ophase noch lokal konzen ie e Be eiche on CapGC-EGFP beobach e we den, wäh end mRFP1-HP1 beginn in die gesam e Zelle zu di undie en (Abbildung 8K). Nach dem NEBD sind beide P o eine di us in de ganzen Zelle e eil (Abbildung 8L). Wäh end de Anaphase is CapGC-EGFP in de Lage, am Ch oma in zu lokalisie en (Abbildung 8M). Ku z danach we den hie CapGC-EGFP- An eiche ungen deu lich, in denen auch eine beginnende Kolokalisa ion des mRFP1-HP1 beobach e we den kann (Abbildung 8N). Die Kolokalisa ion on CapGFL-EGFP bzw. CapGC-EGFP mi mRFP1-HP1 leg eine Ch oma inlokalisa ion on CapG wäh end de In e phase p ä e en iell am He e och oma in de Ch omosomen nahe. Diese Beobach ung könn e au eine Funk ion on CapG beispielsweise zu S uk u ie ung des He e och oma ins wäh end de In e phase hinweisen. Auße dem is de G oß eil des He e och oma ins pe izen isch und äg zu Ausbildung de Zen ome e de Ch omosomen bei. Wäh end de Mi ose e scheinen CapG, Ba en und CapD2 o e s an den Zen ome en ange eiche und e s spä e en lang de gesam en Ch omosomena me e eil (Fische , 2010; Naga ka , 2010; Oli ei a, 2007). So könn e ein Teil on CapG wäh end des gesam en Zellzyklus am He e och oma in assoziie e bleiben, um bei de Beladung de wei e en Condensin-Un e einhei en als Zen ome -spezi ische Docking-si e zu ungie en. Konsis en hie zu konn e ü CapGFL-EGFP keine Delokalisa ion de konzen ie en Be eiche on de In e phase hin zu P ophase beobach e we den. E gebnisse 38 Abbildung 8: He e och oma inlokalisa ion on CapG im Ve lau de Mi ose. A bis G) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGFL-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) wäh end de Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4- VP16/UAST-CapGFL-EGFP II.2, mRFP1-HP1 II.1). H bis O) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGC-EGFP (g ün) zusammen mi mRFP1-HP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4-VP16/UAST-CapGC-EGFP II.3, mRFP1- HP1 II.1). Die besch iebenen Ke ne sind jeweils du ch P eilspi zen ma kie . Die Zei punk e de jeweiligen Au nahmen sind in jedem Bild angegeben. De Zei punk =0 en sp ich dem le z en au genommenen Bild o Ein e en de Anaphase. Die Maßs absbalken en sp echen 10 μm. 2.1.2. Die Ch oma inassozia ion on CapGNM-EGFP is nich am Zen ome ini iie Eine zei lich dem endogenen CapG en sp echende Ch oma inbeladung konn e ü keines de e kü z en CapG-EGFP F agmen e beobach e we den ( gl. Abbildung 6). CapGNM-EGFP is wäh end de In e phase wei gehend zy oplasma isch lokalisie (Abbildung 9A), kann abe nach dem Zusammenb uch de Ke nhülle am Ch oma in anlage n (He zog, 2007). Um zu un e suchen, E gebnisse 39 ob auch diese e spä e e Assozia ion on CapGNM-EGFP, gemäß de des endogenen P o eins, en lang de zen ome en Region de Ch omosomen ini iie wi d, wu de eine in i o Mik oskopie du chge üh . Hie bei wu den Emb yonen mik oskopie , welche UAST-CapGNM-EGFP e mi el du ch α4 ub-Gal4-VP16 zusammen mi einem mRFP1-ma kie en His on exp imie en (α4 ub- Gal4-VP16, His-2A D-mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFP III.2/+). Die Exp ession on His-2A D- mRFP1 wi d hie bei un e Kon olle de genomischen egula o ischen Elemen e des His-2A D- Genlokus e mi el . Zum Zei punk des NEBD kann eine gleichmäßige Ve eilung on CapGNM- EGFP in de Zelle beobach e we den (Abbildung 9B). Eine Ch oma inlokalisa ion inde im Folgenden gleichmäßig en lang de gesam en Ch omosomen s a (Abbildung 9C). Es können keine lokal ange eiche en Be eiche on CapGNM-EGFP zu Beginn de Ch omosomenassozia ion e gleichba zu denen on CapGFL-EGFP beobach e we den ( e gleiche Abbildung 9C und Abbildung 8C). Die Anlage ung on CapGNM-EGFP wäh end de Me aphase soll e somi en lang de gesam en Ch omosomena me ini iie we den können. E s wäh end de Me aphase we den lokale An eiche ungen on CapGNM-EGFP am Ch oma in deu lich (Abbildung 9D). Um zu un e suchen, ob es sich hie bei um An eiche ungen des P o ein agmen s an den Zen ome en de Ch omosomen handel , wu de eine an i-CID Fä bung de UAST-CapGNM-EGFP exp imie enden Emb yonen o genommen. CID is die Zen ome - spezi ische His on H3 Va ian e in D. melanogas e , die homolog zum CENP-A P o ein on Ve eb a en is (Heniko e al., 2000). Die lokal konzen ie en Be eiche on CapGNM-EGFP übe lappen jedoch nu eilweise mi den CID-spezi ischen Signalen (Abbildung 9F bis I), was au eine nich ausschließlich Zen ome -spezi ische Konzen a ion dieses P o ein agmen s hinweis . CapGNM-EGFP könn e wei e hin auch an den He e och oma inbe eichen de Ch omosomena me lokal ange eiche o liegen. Um diese F age nachzugehen, wu den Fä bungen on Emb yonen e schiedenen Al e s o genommen. Die lokalen An eiche ungen on CapGNM-EGFP am Ch oma in konn en hie bei sowohl wäh end de Mi ose 11 als auch wäh end de Mi ose 14 beobach e we den ( e gleiche Abbildung 9G und I). Die ühe Emb yonalen wicklung in D. melanogas e is du ch eine Phase seh schnelle Zellzyklen in einem syncy ialen Blas ode m gekennzeichne , in denen das Ch oma in seh homogen e schein und kaum T ansk ip ion s a inde (Edga e al., 1986). Mi dem Einse zen de T ansk ip ion emb yonale Gene se z auch eine T ansi ion im E scheinungsbild des Ch oma ins ein, es e schein zunehmend he e ogen. Diese T ansi ion inde wäh end de Mi osen 10 – 14 s a (Edga und Schubige , 1986). Die Mi ose 11 inde somi zu einem Zei punk s a , an dem die E gebnisse 40 He e och oma inbe eiche de Ch omosomen noch wei gehend unde inie sind, was eine o angigen Konzen a ion on CapGNM-EGFP am He e och oma in wiede um en gegen sp ich . Abbildung 9: Die ini iale Beladung on CapGNM-EGFP e olg nich übe das Zen ome . A bis E) Lebende Emb yonen, die UAST-CapGNM-EGFP (g ün) zusammen mi His-2A D-mRFP1 ( o ) in Mi ose 14 exp imie en (α4 ub-Gal4-VP16, His-2A D-mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFPIII.2/+). Die Zei punk e de jeweiligen Au nahmen sind in jedem Bild angegeben. De Zei punk =0 en sp ich dem le z en au genommenen Bild o Ein e en de Anaphase. F) bis I) UAST-CapGNM-EGFP exp imie enden Emb yonen (α4 ub-Gal4-VP16, His-2A D- mRFP1 II.2/+; UAST-CapGNM-EGFP III.2/+) wu den sowohl wäh end Mi ose 11 (F und G) als auch wäh end Mi ose 14 (H und I) ixie und mi Kaninchen-an i-CID An ikö pe n sondie . In den Übe lage ungen is die Au o luo eszenz on CapGNM-EGFP in g ün und die an i-CID-Fä bung in o da ges ell . In G) und I) sind jeweils einzelne mi o ische Figu en de in F) und H) da ges ell en epide malen Regionen gezeig . Die Maßs absbalken en sp echen 5 μm. Zusammen assend konn e gezeig we den, dass die Beladung on CapGNM-EGFP e s nach dem Zusammenb echen de Ke nhülle e olg und nich wie ü das endogene CapG am Zen ome ini iie is . Es inde eine gleichmäßige Assozia ion des P o ein agmen es en lang de Ch omosomena me s a . Bis hin zu spä en Me aphase e schein CapGNM-EGFP alle dings inhomogen am Ch oma in e eil . E gebnisse 41 2.1.3. Die N- e minalen zwei-D i el on CapG e mi eln biologische Funk ionali ä Mu a ionen in CapG sind in D. melanogas e be ei s im Emb yonals adium le al. Um die physiologische Rele anz de einzelnen P o eindomänen on CapG zu un e suchen, wu de gep ü , ob de CapG-mu an e Phäno yp du ch die Exp ession de e schiedenen UAST-CapG- EGFP-T ansgeninse ionen komplemen ie we den kann. Hie bei wu den d ei un e schiedliche CapG-mu an e Allele eingese z (CapG1, CapG6 und CapGEP2346). CapG1 und CapG6 en hal en Punk mu a ionen, welche jeweils ein o zei iges S opkodon an S elle de T iple s de Aminosäu en 343 (CapG1) und 77 (CapG6) ein üh en (Jäge e al., 2005). Bei CapGEP2346 handel es sich um eine P-Elemen -Inse ion in de 5`UTR, 17 bp s omau wä s des S a kodons on CapG (Dej e al., 2004). Alle diese Mu a ionen sind homozygo emb yonal le al und die mu an en Emb yonen weisen wäh end de Mi ose 15 massi e Anaphasenb ücken au (Dej e al., 2004; Jäge e al., 2005). Die un e schiedlichen UAST-CapG-EGFP-T ansgene soll en du ch die ubiqui ä exp imie enden T eibe da-Gal4 (Woda z e al., 1995) bzw. ubP-Gal4 (O'Donnell e al., 1994) in e schiedenen anshe e ozygo CapG-mu an en Fliegen exp imie we den. Hie zu wu den Jung auen de Geno ypen CapG1/CyO; da-Gal4/da-Gal4 ode TM3,Se bzw. CapG1/CyO; ubP-Gal4/TM3,Se mi Männchen de Geno ypen CapG6/CyO; UAST-CapGX-EGFP/UAST-CapGX-EGFP ode TM3,Se bzw. CapGEP2346/CyO; UAST-CapGX-EGFP/UAST-CapGX-EGFP ode TM3,Se gek euz und de en Nachkommen analysie . Nachkommen, welche den anshe e ozygo CapG-mu an en Geno yp komplemen ie en, konn en anhand de Abwesenhei des dominan en Ma ke s Cy selek ie we den. Tabelle 1 zeig den p ozen ualen An eil de a sächlich au ge e enen Fliegen, die den anshe e ozygo CapG-mu an en Geno yp komplemen ie en können, on den nach den Mendelschen Regeln heo e isch e wa e en Fliegen des jeweiligen Geschlech s. Das olle-Länge Kons uk is in de Lage, die physiologische Funk ion on CapG in CapG1/CapG6 anshe e ozygo CapG-mu an en Indi iduen zu e mi eln. Übe aschende weise konn en auch adul e Fliegen e hal en we den, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleiniges unk ionelles CapG- Allel exp imie en. Keines de wei e en un e such en Kons uk e wa in de Lage, die Funk ion on CapG in den CapG1/CapG6 anshe e ozygo CapG-mu an en Fliegen zu komplemen ie en. Im Ve suchsansa z e laub in homozygo CapG-mu an en Indi iduen zunächs (bis einschließlich Mi ose 14) die ma e nale Kon ibu ion eine unges ö e P oli e a ion. Wei e hin kann die Exp ession de UAST-CapG-EGFP-T ansgene, beding du ch den da-Gal4 T eibe , e s im spä en Zellzyklus 14 e mi el we den. So konn e eine Funk ionali ä de T ansgeninse ionen, beding du ch den Ve suchsau bau, wäh end de e s en 14 Zellzyklen nich un e such we den. Da UAST- E gebnisse 48 (Rei hinge , 2009). Hie zu wu de ein N- e minales F agmen on CapG in Bak e ien exp imie , ge einig und zu Immunisie ung on Mee schweinchen und Kaninchen eingese z . Die e hal enen An ikö pe wu den a ini ä sge einig und cha ak e isie (Rei hinge , 2009). In Immunblo s on P o einex ak en aus w1-Emb yonen bzw. O a ien können nach Ve wendung on diesen polyklonalen An ikö pe n aus Kaninchen (Abbildung 12A) und auch aus Mee schweinchen (Rei hinge , 2009) zwei Banden im e wa e en G ößenbe eich on CapG de ek ie we den. Beide P o einbanden sind spezi isch ü das endogene CapG, da sie in P o einex ak en on Fliegeno a ien, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleinig unk ionelles CapG- Allel exp imie en, nich nachgewiesen we den können (Abbildung 12A, CapGNM-Rescue-O a ien). Alle dings we den in diesen P o einex ak en auch ü das CapGNM-EGFP zwei Banden de ek ie . Abbildung 12: In de Fliege können e schiedene Iso o men on CapG nachgewiesen we den. A) P o einex ak e on 3-6 S unden al en w1-Emb yonen und O a ien, sowie aus O a ien on Fliegen, welche UAST-CapGNM-EGFP als allein unk ionelles CapG-Allel exp imie en (CapGNM-Rescue = CapG6/CapG1; UAST- CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4), wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . De Immunblo wu de mi Kaninchen-an i–CapG(N) An ikö pe n sondie . B) P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1- Emb yonen und aus einem in i o ansk ibie en und ansla ie en cDNA-Plasmid (pCS2-CapG) on CapG (CapG-IVT) wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn , geblo e und mi Kaninchen-an i-CapG(N)- An ikö pe n sondie . C) Ein P o einex ak aus ansgenen Fliegen, welche ein C- e minal EGFP-ma kie es CapG exp imie en, das basie end au de ü CapG-kodie enden genomischen DNA he ges ell wu de (gCapG- EGFP) sowie ein P o einex ak aus ansgenen Fliegen, welche ein C- e minal EGFP-ma kie es CapG exp imie en, das basie end au de cDNA on CapG gene ie wu de (CapGFL-EGFP= α4 ub-Gal4-VP16/+; UAST- CapGFL-EGFP III.2/+), wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn , geblo e und mi Kaninchen-an i- EGFP-An ikö pe n sondie . D) P o einex ak e on 3-6 S unden al en w1-Emb yonen, O a ien und Hoden sowie aus O a ien und Hoden de CapGNM-Rescue-Fliegen, wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . De Blo wu de nacheinande mi Kaninchen-an i-CapG(N), an i-Ba en, an i-CapD2 und an i- Tubulin als Ladekon olle sondie . E gebnisse 49 In P o einex ak en aus ansgenen Fliegenemb yonen, in welchen ein C- e minal EGFP- ma kie es CapG exp imie wi d, das au Basis de genomischen DNA on CapG gene ie wu de, we den du ch Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe ebenso zwei Banden en sp echende G öße e ass (Abbildung 12C, gCapG-EGFP). Im P o einex ak aus Emb yonen ansgene Fliegen, in denen UAST-CapGFL-EGFP un e Kon olle eines Gal4-P omo o s exp imie wi d (UAST-CapGFL-EGFP), kann du ch Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe im Immunblo jedoch nu eine Bande de ek ie we den (Abbildung 12C, CapGFL-EGFP). Die Mig a ion diese Bande im SDS-Gel en sp ich de jenigen de höhe -molekula en Bande im Ex ak aus gCapG-EGFP Emb yonen. Die UAST-CapG-EGFP Kons uk e wu den au de Basis on cDNA (SD10043) on CapG gene ie . Mi diese cDNA wu de ebenso ein Plasmid he ges ell (pCS2-CapG), mi welchem CapG in i o ansk ibie und ansla ie we den konn e. Nach T ansk ip ion und T ansla ion des pCS2-CapG im Re ikulozy enlysa konn e ü das e hal ene P o ein im Immunblo , nach Sondie ung mi Kaninchen-an i-CapG-An iköpe n ebenso nu eine Bande de ek ie we den (Abbildung 12B, CapG-IVT). Die Mig a ion diese Bande en sp ich wiede um de jenigen de höhe -molekula en Bande aus dem Ex ak de w1-Emb yonen, e schein alle dings leich nach un en e schoben. Übe aschende weise konn e in P o einex ak en aus Hoden on w1-Fliegen du ch den Kaninchen-an i-CapG An ikö pe nu eine einzelne Bande de ek ie we den (Abbildung 12D, w1- Hoden). Diese Männchen-spezi ische Iso o m on CapG weis wiede um ein modi izie es Lau e hal en im SDS-Gel e glichen zu den beiden Iso o men on CapG on Emb yonen und O a ien au . De he ges ell e Blo wu de wei e hin auch mi An ikö pe n sondie , welche gegen die beiden wei e en nich -SMC Condensin I-Un e einhei en Ba en und CapD2 ge ich e sind (Abbildung 12D). Ba en konn e im P o einex ak aus Hoden on w1-Fliegen nich nachgewiesen we den. Auch das Signal on CapD2 is in den P o einex ak en de Hoden schwäche als in denen de O a ien. Au allend is wei e hin, dass sowohl Ba en als auch CapD2 in den O a ienex ak en de Fliegen, welche UAST-CapGNM-EGFP als alleiniges unk ionelles CapG-Allel exp imie en (CapGNM-Rescue-O a ien), wenige abundan sind als in den O a ienex ak en de w1-Fliegen (Abbildung 12D). Auch nach Ab eiche ung on Ba en bzw. CapD2 du ch RNAi in S2 D osophila- Zellen ode auch in Ba en bzw. SMC4 homozygo -mu an en Emb yonen konn e eine Reduk ion de P o einle el de wei e en Condensin I-Un e einhei en beobach e we den (Oli ei a e al., 2005; Sa idou e al., 2005). Diese E ek kann ü die P o einp oben aus den Fliegenhoden nich bes ä ig we den. Alle dings is anhand de α-Tubulin-Sondie ung zu e kennen, dass sich die Lademengen de P oben hie nich en sp echen. E gebnisse 50 Bei de niede molekula en P o einbande on CapG könn e es sich um eine Iso o m des P o eins handeln, welche du ch T ansla ion eine al e na i gespleiß en mRNA en s eh . Nich ganz konsis en hie bei is das Au e en de Doppelbande in P o einex ak en UAST-CapGNM-EGFP exp imie ende Fliegen, da auch dieses Kons uk basie end au de cDNA on CapG he ges ell wu de. Sowohl bei De ek ion des endogenen P o eins du ch an i-CapG(N)-An ikö pe , als auch bei De ek ion des au genomische DNA basie enden, C- e minal ma kie en CapG-EGFP du ch an i-EGFP-An ikö pe , kann eine Doppelbande de ek ie we den. Die p ä-mRNA on CapG soll e demzu olge in e n p ozessie we den. Das Übe sp ingen on Exons (Exon-skipping) ode das Benu zen al e na i e 5' bzw. 3' Spleißs ellen könn en hie bei in eine e kü z en mRNA esul ie en. Abbildung 13: Die p ä-mRNA on CapG wi d in Emb yonen nich al e na i gespleiß . A) Da s ellung de CapG kodie enden Gen egion. Die osa Balken en sp echen den 6 Exons on CapG. Angegeben sind die Oligonukleo id-Paa e, welche zu PCR-Analyse eingese z wu den, um ein mögliches al e na i es Spleißen de CapG-mRNA nachzuweisen. B) Gelelek opho e ische-Analyse de PCR zum Nachweis eines al e na i en Spleißens de p ä-mRNA on CapG. Als Ma ize ü die PCR wu de das cDNA-Plasmid SD10043 und eine cDNA eingese z , welche du ch e e se T anskip ion eine aus Fliegenemb yonen he ges ell en mRNA gewonnen wu de (cDNA Emb yonen). Die e wa e en P oduk e nach Ampli ika ion de cDNA sind angegeben. Um eine e en uell e kü z e mRNA on CapG nachzuweisen, wu de eine PCR-Analyse du chge üh . Die genomische DNA on CapG en häl 6 Exons und 5 In ons (Abbildung 13A). Es E gebnisse 51 wu den die in Abbildung 13A angegebenen P ime paa e e wende , um e schiedene Be eiche on CapG zu ampili izie en. Als Ma ize wu de zum einen das cDNA-Plasmid SD10043 eingese z , welches auch ü die Klonie ung de UAST-CapG-EGFP Kons uk e und des pCS2-CapG genu z wu de. Zum ande en wu de du ch e e se T ansk ip ion eine mRNA aus w1-Fliegenemb yonen, eine cDNA he ges ell und als Ma ize eingese z . Bei einem Fehlen on in e nen Exonsequenzen soll en nach Ampli ika ion de en sp echenden he ges ell en cDNA aus Fliegenemb yonen auch kleine e F agmen e im Aga osegel nachweisba sein. Die jeweils e hal enen Ampli ika e de cDNA, die aus de mRNA de Emb yonen gewonnen wu den, en sp echen abe ohne Ausnahme denen des cDNA-Plasmides SD10043 (Abbildung 13B). Die E gebnisse de PCR-Analyse legen nahe, dass die im Immunblo au e ende Doppelbande nich au ein al e na i es Spleiße gebnis de p ä-mRNA on CapG zu ückzu üh en is . So soll en in de Fliege un e schiedliche Iso o men on CapG o handen sein, die au eine Modi ika ion des P o eins zu ückzu üh en sind. 2.1.7. CapG wi d wäh end des Zellzyklus phospho ylie In un e schiedlichen Geweben de Fliege e en auch un e schiedliche Iso o men on CapG au . Das könn e da au hinweisen, dass CapG du ch en sp echende Modi ika ionen gewebsspezi isch egulie we den kann. Wei e hin wu de un e such , ob eine en sp echende Regula ion auße dem auch zellzyklusspezi isch s a inden kann. Hie zu wu den Emb yonen on Fliegen des Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/TM3,Se wäh end de Mi ose 14 du ch Hi zeschock synch onisie (siehe Ma e ialien und Me hoden 4.5.3). Anschließend wu den Emb yonen so ie , in welchen sich alle Zellen in de G2-Phase ( o Mi ose 14), P ophase, Me aphase, Anaphase ode Telophase be anden. Es wu den P o einex ak e de so ie en Emb yonen he ges ell und du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn . Im Immunblo konn en zwei Banden ü CapG wäh end de e schiedenen Phasen de Mi ose gleiche maßen in ensi nachgewiesen we den (Abbildung 14A), was au eine Funk ionali ä beide Iso o men des P o eins wäh end de Mi ose schließen läss . Das Lau e hal en beide Banden im SDS-Gel schein jedoch wäh end de Me aphase e zöge zu sein. Die Zuo dnung de Emb yonen zu Ana-und Telophase konn e hie bei im Immunblo du ch eine an i-Cyclin B-Sondie ung bes ä ig we den (Abbildung 14A). Es is be ei s bekann , dass die Condensin-Un e einhei en e schiedene O ganismen wäh end de Mi ose du ch Phospho ylie ung egulie we den (zusammenge ass in Bazile e al. (2010). So könn en auch in D. melanogas e beide Iso o men on CapG wäh end de Me aphase E gebnisse 52 phospho ylie o liegen, was die Ve zöge ung de gelelek opho e ischen Au ennung de P o ein o men im SDS-Gel e klä en wü de. Im Folgenden wu den dahe die Phospho ylie ung on CapG und die de wei e en nich -SMC Condensin I-Un e einhei en wäh end de Mi ose un e such . 1-2 S unden al e syncy iale w1-Emb yonen wu den in eine Mischung aus Hep an und Schneide s-Medium inkubie , dem Demecolzin zugese z wu de. Demecolzin hemm die Ausbildung de Mi k o ubuli de mi o ischen Spindel, wodu ch die Zellen in de P ome aphase a e ie en. So konn e ein P o einex ak aus Me aphase-a e ie en und somi Zellzyklus- synch onen Emb yonen e hal en we den (+Deme). Es wu de auße dem ein na i e P o einex ak on 2-4 S unden al en, nich Zellzyklus-synch onen w1-Emb yonen he ges ell . Ein Teil dieses Ex ak s wu de du ch λ-Phospha ase in i o dephospho ylie (+λ). Ein wei e e Teil des Ex ak s wu de nich mi λ-Phospha ase behandel (-λ), einem le z en Teil wu de λ- Phospha ase zugegeben und unmi elba danach dena u ie (+λ†). Nach SDS-Gelelek opho ese wu de ein Immunblo ange e ig und mi an i-CapG(N), an i-CapD2, an i-Ba en und an i-α- Tubulin-An ikö pe n sondie (Abbildung 14B). Im P o einex ak aus nich synch onisie en Emb yonen (-λ) können beide Iso o men on CapG im SDS-Gel schnelle wande n als die Iso o men aus Me aphase-a e ie en, synch onen Emb yonen (+Deme) (Abbildung 14B). Nach zusä zliche Dephospho ylie ung des Ex ak s aus nich synch onisie en Emb yonen (+λ) kann eine wei e e Beschleunigung des Lau e hal ens beide Banden beobach e we den (Abbildung 14B). Das deu e da au hin, dass CapG wäh end des gesam en Zellzyklus phospho ylie o lieg , wäh end de Me aphase alle dings zusä zliche Phospho ylie ungen s a inden können. Das Phospho ylie ungsmus e on CapG un e scheide sich auße dem on dem de wei e en Condensin I-Un e einhei en CapD2 und Ba en. Auch ü CapD2 kann nach Phospha asebehandlung des P o einex ak s aus nich -synch onen Emb yonen (+λ) ein beschleunig es Lau e hal en im SDS-Gel beobach e we den (Abbildung 14B). Es kann jedoch kein Un e schied im Lau e hal en on Me aphase-a e ie en, synch onen Emb yonen (+Deme) zu nich synch onisie en Emb yonen (-λ) es ges ell we den (Abbildung 14B). Eine Mi ose- spezi ische Phospho ylie ung on CapD2 is dahe unwah scheinlich. Im Gegensa z dazu is ü Ba en in Me aphase-a e ie en Emb yonen (+Deme) im Ve gleich zu nich synch onisie en Emb yonen (-λ) ein e zöge es Lau e hal en im SDS-Gel es zus ellen (Abbildung 14 B). E gebnisse 53 Abbildung 14: CapG wi d wäh end de Me aphase phospho ylie , die haup sächlichen Phospho ylie ungs- s ellen be inden sich inne halb des C-Te minus. A) Phospho ylie ung on CapG im Ve lau de Mi ose. Emb yonen on Fliegen des Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/TM3,Se wu den wäh end de Mi ose 14 synch onisie . Es wu den Emb yonen so ie , in welchen sich alle Zellen in de G2-Phase ( o Mi ose 14), P ophase (P o), Me aphase (Me a), Anaphase (Ana) ode Telophase (Telo) de 14. Mi ose be anden. Nach SDS- Gelelek opho ese de P o einex ak e wu de ein Immunblo ange e ig und diese nacheinande mi Kaninchen-an i-CapG(N), Maus-an i-Cyclin B und Maus-an i-α-Tubulin-An ikö pe n sondie . Cyclin B wu de hie bei als Kon olle ü die Zuo dnung de Emb yonen zu den angegebenen Phasen de Mi ose und α-Tubulin als Ladekon olle eingese z . B) 1-2 S unden al e, syncy iale w1-Emb yonen wu den du ch Demecolzin- Behandlung wäh end de Me aphase a e ie (+Deme). Es wu de auße dem ein na i e P o einex ak on 2-4 S unden al en, nich Zellzyklus-synch onen w1-Emb yonen he ges ell (-λ). Ein Teil dieses Ex ak s wu de mi λ- Phospha ase behandel (+λ), ein wei e e mi λ-Phospha ase behandel und unmi elba in SDS-P obenpu e au gekoch (+λ†). Nach SDS-Gelelek opho ese wu de ein Immunblo ange e ig , de nacheinande mi Kaninchen-an i-CapG(N), Kaninchen-an i-Ba en, Kaninchen-an i-CapD2, und Maus-an i-α-Tubulin-An ikö pe n zu Ladekon olle sondie wu de. C) Es wu den na i e P o einex ak e on 3-6 S unden al en Emb yonen, die UAST-CapGNM-EGFP (α4 ub-Gal4-VP16/+; UAST-CapNM-EGFP III.1/+) ode UAST-CapGC-EGFP (α4 ub-Gal4- VP16/+; UAST-CapC-EGFP III.1/ +) exp imie en, he ges ell (-λ). Ein Teil diese Ex ak e wu de mi λ-Phospha ase behandel (+λ), ein wei e e mi λ-Phospha ase behandel und di ek in SDS-P obenpu e au gekoch (+λ ). Nach SDS-Gelelek opho ese de P o einex ak e wu de ein Immunblo ange e ig und diese nacheinande mi Kaninchen-an i-EGFP und Kaninchen-an i-CapG(N)-An ikö pe n sondie . D und E) Vo he sagen de Phospho ylie ungss ellen on CapG du ch die Web-basie en P og amme SCANSITE (D) und NETPHOS(E). Beide P og amme sagen Phospho ylie ungss ellen o angig im C- e minalen Be eich on CapG o aus. E gebnisse 54 Du ch Phospha asebehandlung (+λ) kann hie alle dings keine Beschleunigung des Lau e hal ens on Ba en im SDS-Gel beobach e we den (Abbildung 14B), was au eine Me aphase-spezi ische Phospho ylie ung on Ba en hinweis . Die nich -SMC Un e einhei en des Condensin I-Komplexes scheinen dahe wäh end des Zellzyklus un e schiedlich phospho ylie und somi indi iduell kon ollie we den zu können. Die Phospho ylie ungss ellen inne halb on CapG wu den im Wei e en nähe ka ie . Du ch die Web-basie en P og amme SCANSITE und NETPHOS wu den Phospho ylie ungss ellen on CapG ü den C- e minalen Be eich des P o eins o he gesag (Abbildung 14D und E). Na i e P o einex ak e aus UAST-CapGNM-EGFP und UAST-CapGC-EGFP exp imie enden Emb yonen wu den mi λ-Phospha ase behandel und das Lau e hal en de e schiedenen CapG-F agmen e wäh end SDS-Gelelek opho ese mi dem de F agmen e aus unbehandel en P o einex ak en e glichen (Abbildung 14C). Im Immunblo wu den Kaninchen-an i-EGFP An ikö pe zu De ek ion de EGFP-ma kie en F agmen e und Kaninchen-an i-CapG(N) An ikö pe zu Kon olle de Phospha aseak i i ä eingese z . Fü CapGC-EGFP konn e nach Phospha asebehandlung ein schnelle e Gellau beobach e we den, nich abe ü CapGNM-EGFP. Es konn e somi die Vo he sage eine haup sächlichen Lokalisa ion de Phospho ylie ungss ellen im C- e minalen Be eich on CapG bes ä ig we den. Es is zusammenzu assen, dass beide Iso o men on CapG wäh end de Mi ose gleiche maßen abundan au e en und auße dem auch beide wäh end de Me aphase phospho ylie we den können. Dies sp ich eine Zellzyklus-spezi ischen Funk ion eine de beiden Iso o men und eine un e schiedlichen Phospho-Regula ion en gegen. Die Phospho ylie ungss ellen ih e sei s liegen o angig im C- e minalen Be eich on CapG. 2.1.8. Lokalisa ion und Funk ionali ä on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen Es konn e sowohl eine Funk ionen de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und CapD3 bei de Ch oma ins uk u ie ung (Ha l e al., 2008a) als auch eine Rolle on CapG wäh end de Meiose in de weiblichen Keimbahn besch ieben we den (Resnick e al., 2009). Um die de aillie e Lokalisa ion on CapG in den Fo p lanzungso ganen adul e Weibchen nähe zu un e suchen, wu den O a ien aus Fliegen des Geno yps gCapG-EGFP III.1, His-2A D-mRFP1 III.1/TM3,Se p äpa ie , in denen ein C- e minal EGFP-ma kie es CapG zusammen mi dem mRFP1-ma kie en His on 2A D exp imie wi d (Naga ka , 2010). Das C- e minal EGFP- ma kie e CapG wi d in diesen Fliegen un e Kon olle de genomischen, egula o ischen E gebnisse 55 Elemen e des CapG-Genlokus exp imie und konn e be ei s als unk ionell besch ieben we den (Naga ka , 2010). Die O a ien de Fliege bes ehen aus einzelnen O a iolen, welche wiede um aus Eikamme n e schiedene En wicklungss adien au gebau sind. Die Eikamme n sind ih e sei s on Epi helzellen soma ischen U sp ungs (Follikelzellen) umgeben. Im an e io en Teil jede O a iole be inde sich das Ge ma ium. Hie sind die Keimbahns ammzellen angesiedel . Nach de en mi o ische Teilung we den wiede um eine Keimbahns ammzelle und eine Zys oblas enzelle gebilde . Die Zys oblas enzelle du chläu 4 mi o ische Teilungen, wo aus 15 Näh zellen und eine Oozy e he o gehen (de Cue as e al., 1997). Abbildung 15: Lokalisa ion on CapG in de weiblichen Keimbahn. Au o luo eszenz de O a ien on Weibchen, welche gCapG-EGFP (g ün) zusammen mi His-2A D-mRFP1 ( o ) exp imie en (gCapG-EGFP III.1, His-2A D-mRFP1 III.1/TM3,Se ). A) Übe sich on Eikamme n e schiedene En wicklungss adien. B) Eikamme im S adium 10 und e g öße e Au nahme de G enzzellen diese Eikamme . Die Maßs absbalken be agen 10 µm. Es konn e eine Lokalisa ion on gCapG-EGFP sowohl in den Ke nen de Zellen des Ge ma iums, de Follikelzellen als auch de Näh zellen beobach e we den (Abbildung 15). Die In ensi ä de EGFP-Fluo eszenz nimm hie bei nach dem En wicklungss adium 6 de Eikamme n ab. Eine wei e e in e essan e Beobach ung is die Lokalisa ion on CapG-EGFP in den Ke nen de G enzzellen (bo de cells). Die G enzzellen gehen aus den epi helialen Follikelzellen he o , ollziehen dann alle dings eine Mo phologieände ung und we den zu Mesenchymzellen E gebnisse 56 (Mon ell, 2001). Somi we den sie beweglich und können du ch die Näh zellen hindu ch zum an e io en Ende de Oozy e gelangen. Die G enzzellen agen wäh end de Oogenese zu Ausbildung de Mik opyle bei, welche spä e zum Eind ingen de Spe mien geb auch wi d (Mon ell e al., 1992). Sie spielen ebenso eine Rolle bei de Spezi izie ung on Zellen des an e io en und pos e io en Be eiches on Ei und Emb yo (S e ens e al., 1990). Eine Lokalisa ion on CapG im Ke n diese G enzzellen könn e au eine pos mi o ische Funk ion des P o eins bei de G enzzellen wicklung ode auch -mig a ion hinweisen. Ebenso könn e CapG an de Ausbildung de Mik opyle ode an de Zellspezi izie ung be eilig sein. In diese A bei konn e be ei s gezeig we den, dass Fliegenweibchen, welche UAST-CapGFL-EGFP ode auch UAST-CapGNM-EGFP als alleinig unk ionelle CapG-Allele e mi el du ch da-Gal4 exp imie en, lebens ähig, abe s e il sind und nu seh wenige Eie legen (Tabelle 1). Da UAST- Vek o en in Keimbahn-spezi ischen Zellen nich exp imie we den (B and und Pe imon, 1993), könn e die S e ili ä de Weibchen da au zu ückzu üh en sein, dass in diesen Zellen nich aus eichend P o ein zu Ve ügung s eh . Du ch diese Weibchen konn en olglich mögliche Phäno ypen on Zellen de weiblichen Geschlech so gane bei unzu eichende P o einmenge on CapG un e such we den. In Abbildung 16 sind die O a ien on Weibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 gezeig . Diese we den im Folgenden als CapGNM- Rescue-Weibchen bezeichne . Anhand de Au o luo eszenz on CapGNM-EGFP konn e eine Exp ession des P o ein agmen s in den O a ien diese Weibchen o allem in Zellen soma ischen U sp ungs (Follikel- und G enzzellen) bes ä ig we den (Abbildung 16B). Die In ensi ä des EGFP-Signals a iie hie s a k on Zelle zu Zelle, was au eine nich gleichmäßige Exp ession de UAST-CapGNM-EGFP-Kons uk s hinweis . Du ch die Hoechs 33258-Fä bung konn e auch das E scheinungsbild de G enzzellen de En wicklungss adien 9 und 10 beobach e we den. Auch in den G enzzellen zeig sich eine ungleichmäßige Exp ession des UAST-CapGNM- EGFP (Abbildung 16B). Das P o ein agmen is in den G enzzellen sowie auch in den Follikelzellen haup sächlich im Zy oplasma lokalisie (Abbildung 16B), was konsis en zu subzellulä en Lokalisa ion on CapGNM-EGFP in Emb yonen is (Abbildung 9A). Mi els de DNA- Fä bung konn en alle dings keine une wa e en Phäno ypen in Bezug au die Anzahl de G enzzellen, de en G uppie ung ode auch Mig a ion es ges ell we den ( gl. Abbildung 16A mi 15B). Da die G enzzellen auch an de Ausbildung de Mik opyle be eilig sind, welche eine Funk ion beim Eind ingen de Spe mien ha , könn en die on CapGNM-Rescue-Weibchen abgeleg en Eie schlich weg nich be uch ungs ähig sein. Um dies zu übe p ü en, wu den en sp echende E gebnisse 57 Weibchen mi w1-Männchen gek euz . Die abgeleg en Eie wu den mi einem an i-Spe m ail- An ikö pe sondie und mi Hoechs 33258 ge ä b (Abbildung 16D und E). De hie bei ange ä b e Schwanz de Spe mien is inne halb de Emb yonen zu beobach en, was eine Be uch ungs ähigkei de abgeleg en Eie beleg . Das E scheinungsbild de G enzzellen und auch die Be uch ungs ähigkei de Emb yonen on Weibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGFL-EGFP III.3/da-GAL4 (CapGFL-Rescue) wu den wäh end diese A bei in analoge Weise un e such . Auch hie konn en in Bezug au die Anzahl, G uppie ung ode Mig a ion de G enzzellen keine Phäno ypen es ges ell we den. Von diesen Weibchen abgeleg e Eie können ebenso du ch w1-Männchen be uch e we den (Da en nich gezeig ). Abbildung 16: Mo phologie de G enzzellen und des Synap onemalen Komplexes in de weiblichen Keimbahn nach Ab eiche ung on CapG. A bis C) Eikamme n des S adiums 10 aus einem O a on Fliegenweibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4. A) DNA-Fä bung mi Hoechs 33258. B) CapGNM-EGFP konn e anhand de Au o luo eszenz isualisie we den. C) In de Übe lage ung is CapGNM-EGFP in g ün und die Hoechs 33258-Fä bung in o da ges ell . Da ges ell sind Eikamme n des En wicklungss adiums 10 und e g öße e Au nahmen de en G enzzellen. D und E) Fliegenweibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 wu den mi w1-Männchen gek euz . Die abgeleg en Eie wu den mi einem Maus-an i-Spe m ail-An ikö pe sondie , um die Be uch ungs ähigkei de Eie nachzuweisen (E), und mi Hoechs 33258 ge ä b (D). F bis H) O a ien on Fliegenweibchen des Geno yps CapG1/CapG6; UAST-CapGNM-EGFP III.2/da-Gal4 wu den p äpa ie , mi einem an i-C(3)G-An ikö pe (g ün) sondie , um den SC da zus ellen und mi Hoechs 33258 ( o ) ge ä b . Es is jeweils auch eine Ve g öße ung de C(3)G-Fä bung da ges ell . Es zeig sich eine Assemblie ung des SC en lang de Ch omosomen im Ge ma ium (F) und dessen g aduelle Dissozia ion on den Ch omosomen in das Zy oplasma om S adium 5 (G) bis hin zum S adium 7 (H). Die Maßs absbalken be agen 10 µm. E gebnisse 64 zusä zliche CapG1–Allel en hal en, bleib de An eil an Eikamme n mi schwach poly änem Näh zellch oma in as gleich, alle dings is de An eil de Eikamme n mi poly änem Näh zellch oma in hie hin zu denen mi e s ä k poly änem Näh zellch oma in e schoben (Abbildung 18B, Balken 2). In Weibchen, welche das zusä zliche CapG6–Allel en hal en, e schein de An eil an Eikamme n mi e s ä k poly änem Näh zellch oma in gegenübe den anshe e ozygo CapD3-Mu an en nich e ände , alle dings is hie de An eil de Eikamme n mi schwach poly änem Ch oma in hin zu denen mi poly änem Ch oma in e schoben (Abbildung 18, B Balken 3). Du ch das Einb ingen eines zusä zlich CapG-mu an en Allels kann de poly äne Phäno yp des Näh zellch oma ins in anshe e ozygo CapD3-mu an en Fliegen also insgesam wei e e s ä k we den. Fü beide CapG-Allele konn en un e schiedliche E ek e beobach e we den, was du ch zusä zliche Mu a ionen au den Ch omosomen mi den CapG-Allelen e klä we den könn e. Es wu de gleiche maßen un e such , ob die Poly änie des Ch oma ins de Näh zellke ne in O a ien on anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen ebenso du ch Einb ingen eines zusä zlich mu an en CapG-Allels wei e e s ä k we den kann. Hie bei wu den eine ch omosomale Dele ion (CapH2D (3R)Exel6159) und zwei un e schiedliche CapH2-Allele eingese z . Bei CapH2PL00617 lieg eine pBac-Inse ion im e s en In on on CapH2 o , bei CapH2TH2 hingegen handel es sich um eine Dele ion inne halb de 5´-Region on CapH2 (Ha l e al., 2008a). Da be ei s ü die e schiedenen CapH2-Allelkombina ionen un e schiedliche Phäno ypen bezüglich de Mo phologie des Näh zellch oma ins beobach e we den konn en, wu den die Phäno ypen de e schiedenen anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen ge enn ge ach e . So wu den o e s O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159 und CapG1/+; CapH2PL00617/ CapH2D (3R)Exel6159 p äpa ie , mi Hoechs 33258 ge ä b und die Mo phologie des Näh zellch oma ins in Eikamme n des S adiums 10 bes imm . Auch hie wu de die Poly änie des Näh zellch oma ins in meh e en Eikamme n ausgewe e und e schiedenen Klassen zugeo dne (Abbildung 19A). E wa die Häl e de Eikamme n de anshe e ozygo CapH2- mu an en Weibchen weisen einen schwach poly änen Phäno yp des Näh zellch oma ins au , in 44,8% e schein das Ch oma in poly än und in nu 3,4% s a k poly än (Abbildung 19B, Balken 1). Weibchen, welche ein zusä zliches CapG-mu an es Allel (CapG1) en hal en, zeigen eine Ve inge ung an Eikamme n mi schwach poly änem Näh zellch oma in und eine Zunahme an Eikamme n mi poly än bzw. e s ä k poly änem Ch oma in (Abbildung 19B, Balken 2). E gebnisse 65 Abbildung 19: Du ch ein zusä zlich CapG-mu an es Allel kann die Poly änie de o a ialen Näh zellen on he e ozygo CapH2-mu an en Weibchen wei e ges eige we den. A) Hoechs 33258 ge ä b e O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159 (Zeile 1) und CapG1/+; CapH2PL00617/CapH2D (3R)Exel6159 (Zeile 2). C) Hoechs 33258 ge ä b e O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2TH2 (Zeile 1) und CapG6/+; CapH2PL00617/CapH2TH2 (Zeile 2). Du ch Mik oskopie konn e die Poly änie des Ch oma ins de Näh zellen in Eikamme n des S adiums 10 un e such und in die angegebenen Phäno ypenklassen einge eil we den. In de Tabelle sind die Gesam zahl de ausgezähl en Eikamme n (n) und de p ozen uale An eil de Eikamme n, die den en sp echenden Phäno ypenklassen (schwach poly än, poly än und e s ä k poly än) zugeo dne wu den, da ges ell . Un e den jeweiligen Spal en sind Beispiele on Eikamme n de einzelnen Phäno ypenklassen da ges ell . B) G a ische Da s ellung de E gebnisse aus A). D) G a ische Da s ellung de E gebnisse aus C). Die einzelnen Balken en sp echen jeweils den da übe angegebenen Geno ypen. Die Phäno ypenklassen de Eikamme n sind in un e schiedlichen Fa ben da ges ell (blau: schwach poly än, o : poly än, g ün: e s ä k poly än) und en sp echen denen de Da s ellungen in A) und C). Eine analoge Analyse wu de mi O a ien on Weibchen de Geno ypen CapH2PL00617/CapH2TH2 und CapG6/+; CapH2PL00617/CapH2TH2 o genommen (Abbildung 19C). 72% de Eikamme n de anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen diese Allelkombina ion weisen einen schwach poly änen Phäno yp des Näh zellch oma ins au , in 28% e schein das Ch oma in poly än (Abbildung 19D, Balken 1). Weibchen, welche ein zusä zliches CapG-mu an es Allel (CapG6) E gebnisse 66 en hal en, zeigen ebenso eine Ve inge ung an Eikamme n mi schwach poly änem Näh zellch oma in und eine Zunahme an Eikamme n mi poly änem Ch oma in (Abbildung 19D, Balken 2). Eikamme n mi e s ä k poly änem Ch oma in konn en hie nich beobach e we den. Auch de poly äne Phäno yp de Näh zellke ne on anshe e ozygo CapH2-mu an en Fliegen kann du ch das Einb ingen eines mu an en-CapG Allels wei e ges eige we den. Du ch diese gene ischen In e ak ionss udien wi d eine Funk ion on CapG bei de Disassemblie ung des poly änen Ch oma ins de Näh zellke ne on Fliegeno a ien im Zusammenspiel mi CapH2 und CapD3 nahegeleg . 2.2.1.2. Disassemblie ung on poly änem Speicheld üsench oma in in La en Auch in den Ke nen on Speicheld üsen aus La en können poly äne Ch oma ins uk u en beobach e we den (Abbildung 20A). Im Gegensa z zu den Näh zellke nen de O a ien, bleiben diese gebände en S uk u en hie alle dings wäh end de En wicklung e hal en. Wäh end in CapH2-mu an en O a ien de poly äne S a us de Näh zellke ne länge als no mal pe sis ie , üh in einem komplemen ä em Ansa z die Übe exp ession on CapH2 in den no male weise poly änen Speicheld üsenzellen zu eine Dispe sion des poly änen Ch oma ins (Ha l e al., 2008a). Um die mögliche gene ische In e ak ion on CapG mi den Condensin II-Un e einhei en zu e i izie en, wu de wei e hin un e such , ob auch CapG zu Disassemblie ung des Speicheld üsench oma ins bei agen kann. Hie ü wu den 2 e schiedene UASP-CapG- T ansgene e mi el du ch F4-Gal4 in den Speicheld üsen on Fliegenla en übe exp imie . Nach Übe exp ession on CapG (Abbildung 20C und D), konn e hie eine Disassemblie ung des poly änen Ch oma ins de Speicheld üsen beobach e we den. Nach analoge Übe exp ession de Condensin I-Un e einhei Ba en wu de hingegen keine e gleichba e Ch oma indispe sion beobach e (Abbildung 20E). Im Fall eine gene ischen In e ak ion de Condensin-Un e einhei en, soll e die CapH2- Übe exp ession in CapD3 ode auch he e ozygo CapG-mu an en La en supp imie we den (Ha l e al., 2008a). Dahe wu den die E ek e de Übe exp ession on CapH2 auch in he e ozygo CapD3-mu an en La en, he e ozygo CapG-mu an en La en sowie anshe e ozygo CapD3/CapG-mu an en La en un e such . Nach F4-Gal4 e mi el e Übe exp ession des unk ionellen T ansgens UASP-mche y-CapH2 III.2 (2.2.2.3.) kann eben alls eine Disassemblie ung des Ch oma ins de Speicheld üsenke ne beobach e we den (Abbildung E gebnisse 67 20B). In he e ozygo CapD3-mu an en La en wi d diese Disassemblie ung supp imie (Abbildung 20F). Auch das Ch oma in on he e ozygo CapG-mu an en La en kann nach Übe exp ession on mche y-CapH2 nich olls ändig disassemblie we den und e schein wie auch nach mche y-CapH2 Übe exp ession in he e ozygo CapD3-mu an en La en noch eilweise poly än (Abbildung 20G und H). Nach CapH2-Übe exp ession in anshe e ozygo CapD3/CapG-mu an en La en kann jedoch keine wei e e Supp ession de Ch oma in- disassemblie ung beobach e we den ( e gleiche Abbildung 20I und K mi F, G und H). Du ch diese Expe imen e konn e gezeig we den, dass CapG e gleichba zu CapH2 be ähig is , eine Disassemblie ung des poly änen Speicheld üsench oma ins zu induzie en. Es wu de auch hie ein Zusammenspiel on CapG und CapH2 nachgewiesen, da die E ek e de CapH2- Übe exp ession du ch ein CapG ode auch CapD3-mu an es Allel supp imie we den konn en. Ob CapG, CapH2 und CapD3 die Dispe sion des Speicheld üsench oma ins als Un e einhei en inne halb eines Condensin II-Komplexes e mi eln ode ob CapG unabhängig on einem Condensin II-Komplex eine Ch oma in eo ganisa ion ausüben kann, konn e du ch die gene ischen In e ak ionss udien alle dings nich di e enzie we den. Abbildung 20: Funk ionali ä on CapG bei de Disassemblie ung de poly änen Speicheld üsen- ch omosomen. Hoechs 33258 ge ä b e Ke ne de Speicheld üsen on La en im S adium 3. A) Wild yp (w1). B) CapH2-Übe exp ession (F4-Gal4/+; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). C) CapG-Übe exp ession (F4-Gal4/+; UASP- CapG III.2/+) und D) (F4-Gal4/+; UASP-CapG-mRFP1 III.1/+). E) Ba en-Übe exp ession (F4-Gal4/ UASP-Ba en- EGFP III.2). F) CapH2-Übe exp ession in he e ozygo CapD3-mu an en La en (F4-Gal4/CapD3EY00456; UASP- mche y- CapH2 III.2/+). G) CapH2-Übe exp ession in he e ozygo CapG-mu an en La en (F4-Gal4/CapG1; UASP-mche y-CapH2 III.2/+) und H) (F4-Gal4/CapG6; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). I) CapH2-Übe exp ession in anshe e ozygo CapD3/CapG-mu an en La en (F4Gal4/CapD3EY00456, CapG1; UASP-mche y-CapH2 III.2/+) und K) (F4-Gal4/CapD3EY00456, CapG6; UASP-mche y-CapH2 III.2/+). De Maßs absbalken en sp ich 5 µm. E gebnisse 68 2.2.2. In i o Iden i ika ion de Condensin II-Komponen en on D. melanogas e 2.2.2.1. Condensin II-spezi ische Un e einhei en we den du ch CapG nich p äzipi ie Die Fähigkei on CapG, eine Disassemblie ung on poly änen Ch omosomens uk u en im Zusammenspiel mi CapH2 und CapD3 zu induzie en, zeig eine gene ische In e ak ion on CapG mi den Condensin II-spezi ischen Un e einhei en au . Die F age, ob diese gene ische In e ak ion au die P äsenz on CapG und CapH2 bzw. CapD3 in einem gemeinsamen Komplex zu ückzu üh en is , könn e du ch den Nachweis physikalische In e ak ionen diese Condensin- Un e einhei en bean wo e we den. Um diese F age nachzugehen, wu den P o einex ak e on Emb yonen und O a ien, in denen ein C- e minal du ch mRFP1-ma kie es CapG-T ansgen un e Kon olle de genomischen, egula o ischen Elemen e des CapG-Genlokus exp imie wi d (gCapG-mRFP1), du ch Immunp äzipi a ion mi Kaninchen-an i-mRFP1-Sepha ose analysie . Die Funk ionali ä des CapG-mRFP1 Fusionsp o eins in de Fliege wa be ei s gezeig wo den (Naga ka , pe s. Mi eilung). Zu Kon olle wu den Ex ak e aus w1-Emb yonen und O a ien on w1-Fliegen he ges ell und in analoge Weise analysie . Um unspezi ische Kop äzipi a ionen du ch Bindung an die mRFP1-Ma kie ung zu kon ollie en, wu de einem Teil diese na i en P o einex ak e bak e iell exp imie es mRFP1 P o ein zugese z . Du ch Immunblo en konn e eine Kop äzipi a ion de Condensin I-spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 du ch CapG- mRFP1 nachgewiesen we den (Abbildung 21B). Die P äzipi a e wu den ebenso du ch SDS- Gelelek opho ese au ge enn und anschließend eine Silbe ä bung un e zogen. Es konn en hie dis ink e Banden in den P äzipi a en de CapG-mRFP1 en hal enden P o einex ak e, nich abe in denen de w1-O a ien nachgewiesen we den (Abbildung 21A, P eilspi zen), was da au hinweis , dass spezi ische In e ak o en on CapG-mRFP1 kop äzipi ie we den konn en. Um die Iden i ika ion de kop äzipi ie en P o eine übe Massenspek ome ie zu e möglichen, wu de ein wei e es SDS-P o eingel de Massenspek ome ie-kompa iblen Fä bung mi els kolloidalem Coomassie un e zogen. Da du ch diese Fä beme hode nu wenige dis ink e Banden ange ä b we den konn en, wu den die gesam en Spu en de P äzipi a e in Be eiche au ge eil (Abbildung 21C und D, o e Käs chen), und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie . E gebnisse 69 Abbildung 21: Die Un e einhei en des Condensin I-Komplexes können du ch gCapG-mRFP1 p äzipi ie we den. Na i e P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen und O a ien on w1-Weibchen, sowie aus 3-6 S unden al en Emb yonen und Fliegenweibchen des Geno yps gCapG-mRFP1]/TM3,Se wu den du ch Immunp äzipi a ion un e Ve wendung on Kaninchen-an i-mRFP1-Sepha ose analysie . Zum Teil wu de den w1-Ex ak en bak e iell exp imie es mRFP1 (1 ng/µl) zugese z . A) P oben de Elua e (IP) de Immunp äzipi a ionen wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und anschließend eine Silbe ä bung un e zogen. B) P oben de P o einex ak e o Immunp äzipi a ion (INPUT), de Übe s ände nach P äzipi a ion (ÜB) und de Elua e nach P äzipi a ion (IP) de Immunp äzipi a ionen aus Emb yonenex ak en wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und du ch Immunblo en un e Ve wendung on Kaninchen-an i-mRFP1, Kaninchen-an i-CapD2 und Kaninchen-an i-Ba en An ikö pe n analysie . C) P oben de Elua e (IP) de Immunp äzipi a ionen aus w1-bzw. gCapG-mRFP1 Emb yonenex ak en wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und kolloidal-Coomassie ge ä b . Die gesam en Gelspu en de P äzipi a e wu den in jeweils 10 Be eiche au ge eil ( o e Käs chen) und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie . D) P oben de Elua e (IP) de Immunp äzipi a ionen aus w1- bzw. gCapG- mRFP1 O a ienex ak en wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und kolloidal-Coomassie ge ä b . Die gesam en Gelspu en de P äzipi a e wu den in jeweils 6 Be eiche au ge eil ( o e Käs chen) und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie . Du ch die P eilspi ze is die Bande des bak e iell exp imie en mRFP1 gekennzeichne , welches dem Ex ak de w1-O a ien o de P äzipi a ion zugese z wu de. Die Massenspek ome ie und p imä e Analyse de Da en wu den in de Biochemie co e acili y des Max Planck Ins i u s in Ma ins ied du chge üh . In den P äzipi a en de gCapG-mRFP1 Emb yonenex ak e konn en insgesam 168 D. melanogas e -P o eine iden i izie we den, in denen aus gCapG-mRFP1 exp imie enden O a ien 545 P o eine. In den P äzipi a en de w1- Emb yonen wu den 234 P o eine und in denen de w1-O a ien 899 P o eine iden i izie . Eine wei e e Analyse de Da en wu de on mi o genommen. Die iden i izie en P o eine wu den E gebnisse 70 o e s nach ih em unique and azo co e age so ie , de ein Maß ü die Spezi i ä de Pep idmassenzuo dnung da s ell . Es wu den alle P o eine e wo en, de en unique and azo co e age kleine als 5 wa . Es wu den ebenso ibosomale P o eine und P o eine dele ie , denen nu 1 spezi isches Pep id zugeo dne we den konn e. Alphabe isch geo dne e Tabellen de e bliebenen P o eine inden sich im Anhang (A1) CapG-mRFP1-Emb yonen O bi_0112 und A2) CapG-mRFP1-O a ien O bi_1060). Um die P o eine zu iden i izie en, die eben alls aus w1- O a ienex ak en p äzipi ie wu den, wu den die in de Nega i kon olle iden i izie e P o eine analog so ie und zusammenges ell (Anhang: A3) w1-O a ien O bi_1060). Tabelle 2: Zusammens ellung de mi höchs e In ensi ä du ch CapG-mRFP1 p äzipi ie en P o eine. Da ges ell sind die 30 mi höchs e In ensi ä iden i izie en P o eine (sowie CapG) aus P äzipi a en on CapG- mRFP1 exp imie enden Emb yonen (A) und O a ien (B), bzw. aus w1-Emb yonen (A) und w1-O a ien (B) nach Immunp äzipi a ion mi Kaninchen-an i-mRFP1 Sepha ose. Den Ex ak en de w1-O a ien wa bak e iell exp imie es mRFP1-P o ein zugese z wo den. Angegeben sind die iden i izie en P o eine, die Spezi i ä ih e Pep idmassenzuo dnung (Co e age), ih Molekula gewich (MW), de gemi el e We des Gelbe eiches, in dem die meis en Pep ide iden i izie wu den (SA), die Anzahl de Pep ide, die dem en sp echendem P o ein zugeo dne we den konn en (PEP), sowie die In ensi ä mi de die Pep ide iden i izie wu den (INT). In g ün sind die iden i izie en Condensin I-Un e einhei en da ges ell . In blau sind die We e de P oben de CapG- mRFP1 P äzipi a ionen he o gehoben. A P o ein Co e age [%] MW [kDa] SA PEP CapG PEP w1 INT CapG INT w1 1 SMC4 48,8 160 2,2 198 1 126540000 0 2 SMC2 48,5 134 4,2 121 4 101560000 93326 3 CAPD2 37,5 158 3,5 158 1 84385000 25022 4 Hsc70-4 54,2 71 5,1 52 56 36548000 37354000 5 Ba en 34,6 83 5,2 34 0 29572000 0 6 S ess-sensi i e B 32,1 33 7,8 17 13 11578000 7376300 7 CG11700;CG32744;Ubi-p63E 22,6 34 5,4 22 20 4574000 3875400 8 be aTubulin 56D 45,4 50 5,7 33 60 4094900 31003000 9 Hsc70-3 25,8 72 5,0 18 17 4011800 3941500 10 polyA-binding p o ein 33,1 70 5,3 25 26 3823800 5736900 11 Yolk p o ein 3 26 46 6,7 15 14 3387200 4325100 12 Recep o o ac i a ed p o ein kinase C 1 25,5 36 7,0 10 9 3236700 3220900 13 P o ein-L-isoaspa a O-me hyl ans e ase 27 25 8,0 8 11 2749500 7217600 14 S uba is a 33,3 30 7,0 10 12 2597500 4642000 15 Ribosomal p o ein S2 15 29 7,3 6 8 2591400 4090400 16 Dacapo 6,1 27 5,5 10 10 2295500 1982100 17 alphaTubulin 84B 31,1 50 5,5 14 24 2258500 10668000 18 Yolk p o ein 2 30,3 52 6,5 17 15 2094400 2932200 19 CG8010 23 44 5,0 9 10 1798000 2724800 20 Ac in 5C 41,2 42 6,6 17 57 1660500 27681000 21 E 1alpha 48D 23,3 50 6,6 9 19 1653600 7225300 22 CLIP-190 20,9 189 2,3 2 47 1644500 4116600 23 Quemao 14,7 26 7,9 5 5 1541000 2027200 24 Jagua 32,2 144 3,7 14 89 1440200 22498000 25 Yolk p o ein 1 22,6 49 6,5 12 10 1386200 1991500 26 Rudimen a y 6,1 247 1,6 13 13 1331600 1576100 27 E 2b 10 94 5,0 9 4 1188700 478270 28 Cla h in hea y chain 17 191 3,0 15 26 1092100 3492100 29 T opomyosin 1 8,7 29 5,6 10 10 1037200 994390 30 CapG 5,8 154 3,6 11 0 971730 0 E gebnisse 71 B P o ein Co e age [%] [kDa] SA PEP CapG PEP w1 INT CapG INT w1 1 Hsc70-4 63,3 71 3,88 86 101 133400000 269390000 2 SMC2 52,2 134 5 105 0 101770000 0 3 SMC4 47,3 160 5,9 104 0 100370000 0 4 Zippe 65,1 237 5,5 160 537 76121000 118880000 0 5 E 1alpha 48D 39,1 50 3,27 39 47 63100000 73740000 6 be aTubulin 56D 57,9 50 3,46 83 51 58024000 35158000 7 CAPD2 34,4 158 5,76 85 0 56621000 0 8 Cul-2 56,8 87 4,04 49 64 34056000 60057000 9 Jagua 60,7 145 4,88 71 225 34039000 428380000 10 Ba en 41,5 83 4,52 58 0 33304000 0 11 P o ein in e ac ing wi h APP ail-1 39,8 79 4,01 40 48 31463000 45880000 12 Yolk p o ein 3 68,3 46 3,52 46 55 28376000 90561000 13 Alpha Tubulin 84D 53,1 50 3,27 37 26 26099000 24056000 14 PolyA-binding p o ein 60,3 70 3,75 49 67 25549000 78034000 15 La a lamp 60,3 316 5,8 103 230 21780000 154450000 16 Hsc70-3 45,1 72 3,99 27 40 18853000 43022000 17 Ribosomal p o ein S2 50,6 29 2,07 18 26 16997000 46994000 18 S uba is a 60,7 35 2,87 20 25 16498000 44612000 19 S ess-sensi i e B 59,6 34 2,02 19 28 16205000 45981000 20 Didum 59,7 208 5,58 67 275 15956000 375100000 21 Quemao 38,8 28 2,1 22 19 15263000 33973000 22 Rack1 63,5 36 2,16 25 31 14793000 58550000 23 Yolk p o ein 2 50,9 50 3,48 34 61 14614000 72422000 24 Ma e nal exp ession a 31B 66,4 52 3,12 35 42 13635000 32885000 25 Yolk p o ein 1 43,7 49 3,88 45 67 13410000 53108000 26 Myosin 61F 53,1 121 4,61 34 131 12823000 134940000 27 T aile hi ch 38,8 69 4,04 23 28 11865000 21185000 28 DnaJ-like-2 44,7 45 3 19 15 10761000 8311900 29 Pon in 47,1 50 3,56 18 16 10504000 6327800 30 Hsp26 53,8 23 2 14 15 9501100 24070000 108 CapG 4,5 154 6 6 0 922630 0 Nach Dele ion de T e e mi nied ige Signi ikanz konn en 65 mögliche In e ak o en on gCapG- mRFP in Emb yonalex ak en und 260 mögliche In e ak o en in den Ex ak en de O a ien e hal en we den. Diese wu den schließlich nach de In ensi ä de in den P äzipi a en de ek ie en Pep ide geo dne . Die Da en de jeweils 30 mi höchs e In ensi ä kop äzipi ie en P o eine und die de Condensin-Un e einhei en sind in Tabelle 2 da ges ell . Pep ide de Condensin-Ke nun e einhei en SMC4 und SMC2 sowie die de Condensin I-spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 konn en konsis en zu du chge üh en Immunblo -Analyse (Abbildung 21B) mi hohe Spezi i ä (co e age) und In ensi ä in den P äzipi a en de CapG- mRFP1 en hal enden Ex ak e, nich abe in denen de Nega i kon olle iden i izie we den (Tabelle 2, g ün ma kie ), was gene ell ü eine e ek i e P äzipi a ion du ch CapG-mRFP1 sp ich . Dem CapG selbs konn en une wa e e weise nu wenige Pep ide mi ge inge Spezi i ä und In ensi ä zugeo dne we den. Fü die Massenspek ome ie wu den die P o eine in den en sp echenden Gels ücken mi T ypsin in Pep ide geschni en und anschließend analysie . Wie iele Pep ide so gene ie we den, und wie gu diese dann in de Massenspek ome ie E gebnisse 72 iden i izie we den können, häng on de Aminosäu esequenz de en sp echenden P o eine ab. Somi können nich alle P o eine gleich gu du ch diese Me hode p ozessie und iden i izie we den. Wei e e P o eine, de en Pep ide mi hohe In ensi ä im P äzipi a de CapG-mRFP1 exp imie enden Emb yonen bzw. de CapG-mRFP1 O a ienex ak e iden i izie wu den, wu den alle dings mi ähnlich hohe In ensi ä auch im P äzipi a de Nega i kon olle ge unden und sind somi nich spezi isch. Pep ide de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapD3 und CapH2 konn en in de Gesam hei de in den P äzipi a en iden i izie en P o eine nich de ek ie we den, was eine In e ak ion diese P o eine mi CapG in den un e such en löslichen Lysa en unwah scheinlich mach . Obwohl die Funk ionali ä des mRFP1-ma kie en CapG in de Fliege nachgewiesen we den konn e, könn en spezi ische P o ein-P o ein-In e ak ionen du ch die C- e minale Fusion mi mRFP1-Ma kie ung behinde sein. Dahe wu de auße dem eine Immunp äzipi a ion on CapG aus w1-Emb yonen un e Ve wendung on Kaninchen-an i-CapG(N)-Sepha ose du chge üh . Hie bei konn e eine Kop äzipi a ion de Condensin I-spezi ischen Un e einhei en CapD2 und Ba en du ch das endogene CapG kla nachgewiesen we den, nich abe eine Kop äzipi a ion des Condensin II-spezi ischen CapH2 (Abbildung 22). Abbildung 22: CapH2 kann du ch das unma kie e, endogene CapG nich p äzipi ie we den. Na i e P o einex ak e aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen wu den du ch Immunp äzipi a ion mi Kaninchen- an i-CapG(N)-Sepha ose bzw. An ikö pe - eie - Sepha ose (Sepha ose) analysie . P oben de P o einex ak e o Immunp äzipi a ion (INPUT), de Übe s ände nach P äzipi a ion (ÜB) und de Elua e nach P äzipi a ion (IP) wu den übe SDS- Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . De ange e ig e Blo wu de nacheinande mi Kaninchen- an i-CapG(N), Kaninchen-an i-Ba en, Kaninchen-an i- CapD2 und Ra e-an i-CapH2 An ikö pe n sondie . CapG konn e sowohl im P o einex ak aus Emb yonen als auch aus O a ien in einem löslichen Condensin I-Komplex e e en nachgewiesen we den, nich abe in einem löslichen Condensin II-Komplex. Es konn en auße dem keine wei e en, bishe nich bekann en In e ak o en on CapG iden i izie we den. E gebnisse 73 2.2.2.2. Die P äzipi a ion Condensin II-spezi ische Un e einhei en kann auch du ch SMC4 nich e eich we den Die bishe du chge üh en Koimmunp äzipi a ionsexpe imen e weisen nich da au hin, dass CapG in einem Condensin II-Komplex assemblie en kann. Al e na i könn e auch in D. melanogas e ein bishe nich cha ak e isie es CapG2-P o ein exis ie en. Mögliche Kandida en ü CapG2 könn en hie bei du ch Immunp äzipi a ion de Condensin-Ke nun e einhei SMC4 und anschließende massenspek ome ische Analyse de P äzipi a e iden i izie we den. Da in D. melanogas e eine Lokalisa ion und Funk ion de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en in de weiblichen Keimbahn gezeig we den konn e (Ha l e al., 2008a), soll e eine P äzipi a ion eines Condensin II-Komplexes aus O a ienex ak en möglich sein. Dahe wu de ein na i e P o einex ak aus O a ien he ges ell , in denen UASP-SMC4-EGFP II.1 bzw. UASP-SMC4-EGFP III.1 un e Kon olle on α4 ub-Gal4-VP16 ek opisch exp imie wu den. Diese Ex ak wu de du ch Immunp äzipi a ion un e Ve wendung on Kaninchen-an i-EGFP- Sepha ose analysie . Obwohl die olls ändige biologische Funk ionali ä on SMC4 in anshe e ozygo SMC4-mu an en Fliegen du ch Exp ession de UASP-SMC4-EGFP-T ansgene nich e mi el we den konn e, wu de eine Lokalisa ion des EGFP-ma kie en SMC4 en lang de zen alen Achse de Me aphase-Ch omosomen konsis en zu de des endogenen SMC4 bes ä ig (Oli ei a, 2007). Im Immunblo konn e wei e hin eine Kop äzipi a ion de Condensin I- spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 du ch SMC4-EGFP gezeig we den (Abbildung 23A), was insgesam da ü sp ich , dass das Fusionsp o ein dennoch e ek i in einem Condensin-Komplex assemblie we den kann. Die Immunp äzipi a e wu den auße dem du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und anschließend kolloidal-Coomassie ge ä b . Da hie auch in de Spu de Heißelu ion dis ink e Banden kenn lich wa en (Abbildung 23B, IP Heiß), wu den die Spu en de P äzipi a e beide Elu ionssch i e in Be eiche au ge eil , und die Gesam hei de Pep ide diese Be eiche mi els Massenspek ome ie iden i izie (Abbildung 23B, o e Käs chen). Da be ei s im o he igen Expe imen eine Analyse des P äzipi a s de Nega i kon olle o genommen wu de, wu de diese hie nich analysie . Die Massenspek ome ie und P imä analyse de Da en wu den analog zum o ausgegangenen Expe imen o genommen. Die Lis e de insgesam 731 iden i izie en P o eine de P äzipi a e wu de wie be ei s besch ieben on mi p ozessie . Eine alphabe isch geo dne e Tabelle de e bliebenen 278 po en iellen SMC4-In e ak o en is im Anhang da ges ell (EGFP-SMC4-O a ien O bi_0231). Diese P o eine wu den schließlich nach de In ensi ä de in den P äzipi a en E gebnisse 80 Die Condensin-Ke nun e einhei en SMC2 und SMC4 konn en du ch beide CapH2- Fusionsp o eine p äzipi ie we den, alle dings nich mi höchs e P io i ä (Tabelle 4, g ün ma kie ). E en uell konn e eine P äzipi a ion on SMC2 und SMC4 du ch das Übe angebo an CapH2 hie s imulie ode soga e zwungen we den. Un e de Gesam hei de p äzipi ie en P o eine inden sich keine ü CapG spezi ischen Pep ide, was ein e neu e Hinweis da au is , dass CapG nich in beiden Condensin-Komplexen assoziie en kann. Beme kenswe e weise wa auch CapD3 un e den insgesam 1280 iden i izie en P o einen nich e e en, was eine In e ak ion on CapD3 und CapH2 an sich und im Rahmen eines Condensin II-Komplexes, zumindes in löslichen Ex ak en aus O a ien, wiede um in F age s ell . Wei e hin wu de un e such , ob ein bishe nich iden i izie es CapG2 du ch CapH2 p äzipi ie we den konn e. Die be ei s iden i izie en CapG2 P o eine höhe e Ve eb a en haben ein Molekula gewich on ca. 100 kDa und en hal en cha ak e is ische HEAT-Repea -Domänen. Die in den P äzipi a en on CapH2 iden i izie en P o eine wu den dahe nach ih em Molekula gewich so ie und en sp echende Kandida en du ch NETPHOS und SCANSITE analysie . So konn e die Exis enz on HEAT-Domänen und wei e en S uk u elemen en, bzw. Sequenzhomologien zu bekann en P o einen un e such we den. Es konn e hie nu ein HEAT- Domänen en hal endes P o ein he ausgea bei e we den (CG32164), welches alle dings eine signi ikan e Homologie zu Impo inen abe keine Ve wand scha zu CapG2-Ve e e n au weis . Auße dem s ell sich die F age, ob un e den gewähl en expe imen ellen Bedingungen eine P äzipi a ion on CapG2 du ch CapH2 e wa e we den kann, wenn auch keine P äzipi a ion on CapD3 du ch CapH2 e eich wu de. Du ch die Immunp äzipi a ionen einzelne Condensin-Un e einhei en konn e die Exis enz eines löslichen Condensin I-Komplexes in de Fliege nachgewiesen we den. Es konn en hingegen keine Hinweise au eine Assozia ion on CapG in einem Condensin II-homologen Komplex e hal en we den. Da auch nich alle e wa e en In e ak ionen de Komponen en des Condensin II- Komplexes nach ollzogen we den konn en, muss die Exis enz und Rele anz eines löslichen Condensin II-Komplexes in D. melanogas e in F age ges ell we den. E gebnisse 81 2.2.2.4. Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-silencing Signalweges kann nich bes ä ig we den E s kü zlich konn e in D. melanogas e eine Funk ion de RNA-Helikase Vasa wäh end de Mi ose gezeig und ein Modell ü die Regula ion des Condensin I-Komplexes du ch Komponen en des piRNA-Signalwegs in de weiblichen Keimbahn au ges ell we den (Pek und Kai, 2011). Die Au o en konn en eine di ek e In e ak ion on Vasa mi den Condensin I- spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2, nich abe mi CapD3 zeigen. Auch du ch die hie du chge üh en massenspek ome ischen Analysen konn en in den P äzipi a en de Condensin- Un e einhei en Komponen en des RNA-silencing Signalweges iden i izie we den, alle dings nich mi hohe P io i ä (siehe Tabellen im Anhang, en sp echende Da en sind g au he o gehoben). Die In e ka ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-silencing Signalweges wu de du ch eine Immunblo -Analyse de P äzipi a e einzelne Condensin-Un e einhei en un e Ve wendung on An ikö pe n, welche gegen die RNA-silencing-Komponen en Vasa und A gonau e 2 (Ago2) ge ich e sind, wei e üh end übe p ü . Hie zu wu den na i e P o einex ak e aus gCapG-EGFP und gCapG-mRFP1 exp imie enden Emb yonen mi els Immunp äzipi a ion, un e Ve wendung eine en sp echend An ikö pe -gekoppel en Sepha ose, analysie . Auße dem wu den UASP-SMC4-EGFP III.1 und UASP-EGFP-CapH2 II.4 e mi el du ch ubP-Gal4 in O a ien übe exp imie und P o eine de na i en Ex ak e aus diesem Gewebe du ch an i-EGFP-Sepha ose immunp äzipi ie . Zu Kon olle wu de eine sei s ein Ex ak aus EGFP-Pch2 exp imie enden Emb yonen he ges ell und mi els Immunp äzipi a ion un e Ve wendung on an i-EGFP-Sepha ose analysie . Ande e sei s wu de ein na i e P o einex ak aus wild ypischen (w1) Emb yonen he ges ell und diesem o de Immunp äzipi a ion du ch an i-mRFP1-Sepa ose, bak e iell exp imie es mRFP1-P o ein zugese z . Die P äzipi a e wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und im Immunblo mi an i-SMC2, an i-Vasa und an i- Ago2-An ikö pe n sondie (Abbildung 26). Fü CapG-EGFP, CapG-mRFP1 und SMC4-EGFP konn e de E olg de Kop äzipi a ion du ch den Nachweis de P äzipi a ion on SMC2 bes ä ig we den. Eine e gleichba e ek i e P äzipi a ion on SMC2 du ch EGFP-CapH2 konn e hingegen nich gezeig we den. Diese Ta sache bes ä ig , dass die In e ak ionen zwischen den einzelnen Un e einhei en inne halb eines Condensin I- Komplexes wesen lich s ingen e sind, als die inne halb de Condensin II-Komplexe. Fü Vasa konn e eine gewisse P äzipi a ion be ei s du ch EGFP-Pch2 beobach e we den, was au eine unspezi ische In e ak ion des P o eins mi de EGFP-Ma kie ung ode abe de eingese z en E gebnisse 82 A ini ä sma ix hinweis . Eine me klich spezi ische Kop äzipi a ion on Vasa konn e alle dings du ch keine de Condensin-Un e einhei en e eich we den. Auch eine In e ak ion on Ago2 mi den hie eingese z en Condensin-P o einen wu de du ch dieses Expe imen nich bes ä ig . Eine physikalische In e ak ion on SMC4, CapG ode CapH2 mi den RNA-silencing Komponen en Vasa und Ago2 konn e somi nich e i izie we den, wodu ch in diese A bei keine Hinweise au eine mögliche Regula ion de Condensin-Komplexe du ch den RNA-silencing Signalweg e hal en we den konn en. Abbildung 26: Eine In e ak ion de Condensin-Un e einhei en mi Komponen en des RNA-silencing Signalweges konn e nich bes ä ig we den. A) Na i e P o einex ak e aus EGFP-CapH2 (UASP-EGFP-CapH2 II.4/+; ubP-Gal4/+) und SMC4-EGFP (UASP-EGFP-SMC4 III.1/ ubP-Gal4) en hal enden O a ien, sowie aus 3-6 S unden al en Emb yonen des Geno yps (gCapG-EGFP III.1/TM3,Se ) wu den du ch Kaninchen-an i-EGFP- Sepha ose immunp äzipi ie . Als Nega i kon olle wu den P o eine aus Ex ak en on 3-6 S unden al en Emb yonen des Geno yps s yα-Gal4, UAS-EGFP-Pch2 analog p äzipi ie . B) Ein na i e P o einex ak on 3-6 S unden al en Emb yonen des Geno yps (gCapG-mRFP1/TM3,Se ) wu de du ch Kaninchen-an i-mRFP1- Sepha ose p äzipi ie . Als Nega i kon olle wu de einem Ex ak aus 3-6 S unden al en w1-Emb yonen bak e iell exp imie es mRFP1 zugese z und dieses analog p äzipi ie . Na i e P o einex ak e o P äzipi a ion (INPUT), Übe s ände nach P äzipi a ion (ÜB) und P äzipi a e nach Heißelu ion mi SDS-P obenpu e (IP) wu den du ch Immunblo en un e Ve wendung on Kaninchen-an i-EGFP-An ikö pe n, Kaninchen-an i- mRFP1-An ikö pe n, Kaninchen-an i-SMC2-An ikö pe n, Ra e-an i-Vasa-An ikö pe n und Maus-an i-Ago2- An ikö pe n analysie . 2.2.3. In i o Assay zu Analyse de In e ak ionen einzelne Condensin-Un e einhei en Une wa e e weise konn e du ch die bishe igen E gebnisse keine s ingen e In e ak ion de Condensin II-Komponen en gezeig we den, was die Exis enz eines löslichen Condensin II- Komplexes in D. melanogas e insgesam in F age s ell . Um di ek e In e ak ionen de Un e einhei en in einem möglichen Condensin II-Komplex in einem wei e en unabhängigen expe imen ellen Ansa z nachzu ollziehen, wu de basie end au den Expe imen en de A bei sg uppe on Hi ano (Onn e al., 2007), ein in i o In e ak ionsassay e ablie . Hie bei E gebnisse 83 wu den einzelne Condensin-Un e einhei en in i o ansk ibie und ansla ie und de en di ek e In e ak ion du ch anschließende Koimmunp äzipi a ionsexpe imen e un e such . 2.2.3.1. In e ak ionen de Condensin I-Komponen en we den im in i o Assay bes ä ig Vo e s wu de die Funk ionali ä des in i o Assays anhand de be ei s besch iebenen In e ak ionen de Condensin I-Un e einhei en in D. melanogas e gep ü . In den olgenden Expe imen en wu de mi dem SP6-gekoppel en-Re ikulozy enlysa -Sys em on P omega gea bei e , um die kodie enden Be eiche ü die en sp echenden Condensin-Un e einhei en ansk ibie en und ansla ie en zu können. Es wu de eine C- e minale His-Flag-Ma kie ung an Ba en (Ba en-HFHF) ange üg , um eine P äzipi a ion du ch Maus-an i-Flag-Aga ose zu e möglichen. Eine an en sp echende Posi ion ange üg e EGFP-Ma kie ung des P o eins konn e in de Fliege als unk ionell besch ieben we den (Oli ei a e al., 2007). Als Nega i kon olle wu de eine His-Flag-ma kie e Va ian e des humanen Secu ins e wende , welches nich mi den Condensin-Un e einhei en in e agie en soll e. Un e schiedliche Kombina ionen de einzelnen Kons uk e wu den im Lysa ko ansk ibie , in Gegenwa on [35S]Me hionin ko ansla ie und eine Koimmunp äzipi a ion un e zogen. Es wu den Aliquo s de Reak ionen o de P äzipi a ion, om Übe s and nach P äzipi a ion und om Elua de P äzipi a ion du ch SDS- Gelelek opho ese und übe anschließende Au o adiog a ie analysie . Hie bei konn e eine P äzipi a ion on CapG und CapD2 du ch Ba en-HFHF gezeig we den (Abbildung 27). Des Wei e en wu de die In e ak ion de Kleisin-Un e einhei en Ba en und CapH2 mi de Condensin-Ke nun e einhei SMC4 un e such . Hie bei wu de eine C- e minale His-Flag- Ma kie ung analog zu de on Ba en an CapH2 usionie . Nach Du ch üh en des be ei s besch iebenen In e ak ions-Assays konn e eine P äzipi a ion on SMC4 du ch Ba en-HFHF gezeig we den (Abbildung 27). Auch CapH2-HFHF is in de Lage, SMC4 zu p äzipi ie en, nich abe mi e gleichba e E ek i i ä . Ba en schein also s ingen e mi SMC4 in e agie en zu können als CapH2 mi SMC4. Mi dem e wende en Assay wa es somi möglich, In e ak ionen de Condensin-Un e einhei en on D. melanogas e in i o zu ekons uie en. Diese In e ak ionen en sp echen den be ei s e ablie en Modell o s ellungen de Condensin-Komplexe (Onn e al., 2007). De Assay kann somi zu wei e üh enden In e ak ionss udien de Condensin-Un e einhei en eingese z we den. E gebnisse 84 Abbildung 27: E ablie ung eines in i o Assays zu In e ak ionsanalyse de Condensin Un e einhei en. Die angegebenen P o einkombina ionen wu den in i o ko ansk ibie und in Gegenwa on [35S]Me hionin ko ansla ie . Die Reak ionen wu den un e Ve wendung on Maus-an i-Flag-Aga ose (Sigma) immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and nach P äzipi a ion (ÜB) und Elua e nach P äzipi a ion (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und du ch Au o adiog a ie analysie . 2.2.3.2. CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3 Du ch den e ablie en In e ak ions-Assay konn e wei e hin un e such we den, ob CapG di ek mi CapH2 beziehungsweise CapD3 in e agie en kann. Es wu den die His-Flag-ma kie en Kons uk e ü Ba en und CapH2 e wende , ü die be ei s eine Kop äzipi a ion on SMC4 gezeig we den konn e. Auße dem wu de auch in diesem Expe imen das His-Flag-ma kie e humane Secu in als Nega i kon olle he angezogen. Da CapH2 und CapG bei SDS- Gelelek opho ese eine ähnliche Mig a ion au weisen, wu den die Un e einhei en zunächs einzeln ansk ibie und ansla ie . [35S]Me hionin wu de hie bei nu zu Ma kie ung on CapG eingese z . Die einzelnen Reak ionen wu den gemisch und di ek du ch Maus-an i-Flag-Aga ose p äzipi ie . Aliquo s de Reak ionsgemische o P äzipi a ion, de Übe s ände nach P äzipi a ion und de Elua e nach P äzipi a ion wu den du ch SDS-Gelelek opho ese au ge enn und zunächs geblo e . Die E izienz de P äzipi a ionen konn e du ch die Ve wendung on Kaninchen-an i-Flag An ikö pe n zu Iden i ika ion de Flag-ma kie en P o eine im Immunblo gezeig we den (Abbildung 28A). Im P äzipi a de Reak ion on Ba en-HFHF und CapG i neben de e wa e en Bande on Ba en-HFHF noch eine wei e e Bande en sp echend des Molekula gewich s on Secu in-HFHF au (Abbildung 28A). Da diese Reak ion kein Secu in-HFHF zugegeben wu de (INPUT), soll e es sich hie bei um ein Abbaup oduk on Ba en-HFHF handeln. Die Au o adiog a ie des Blo s zeig wei e hin, dass CapG du ch Ba en-HFHF kop äzipi ie we den konn e, nich abe du ch CapH2-HFHF (Abbildung 28A). E gebnisse 85 Um eine mögliche In e ak ion on CapG und CapD3 zu un e suchen, wu de ein N- e minal 6xmyc-ma kie es CapD3 eingese z . Ebenso wu de die In e ak ion on CapG und CapD2 un e such . CapD2 wu de analog du ch eine N- e minale 6xmyc-Ma kie ung gekennzeichne . Fü ein an en sp echende Posi ion EGFP-ma kie es Fusionsp o ein wa be ei s eine biologische Funk ionali ä in de Fliege gezeig wo den (Fische , 2010). Als Nega i kon olle wu de hie die N- e minal 6xmyc-ma kie e ka aly ische Un e einhei de humanen Phospha ase PP2A (PP2A(C)) e wende . Die einzelnen Un e einhei en wu den auch in diesem Expe imen zunächs indi iduell ansk ibie und ansla ie , gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-myc- Sepha ose p äzipi ie . Die In e ak ionsanalyse e olg e auch hie du ch SDS-Gelelek opho ese und Wes e nblo , ge olg du ch einem Nachweis mi Maus-an i-myc-An ikö pe n. Hie bei konn e eine wenig s ingen e Kop äzipi a ion on CapG du ch myc-CapD2 nich abe du ch myc-CapD3 bzw. myc-PP2A(C) nachgewiesen we den (Abbildung 28B). Abbildung 28: CapG in e agie nich mi CapH2 und CapD3. CapG wu de in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ansla ie . Die angegebenen Epi op-ma kie en P o eine wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in Abwesenhei on [35S]Me hionin. Die Reak ionen wu den gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-Flag- Aga ose (A) bzw. Kaninchen-an i-myc-Aga ose (B) immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and (ÜB) und Elua e de P äzipi a e (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ionen zu bes immen, wu den die Wes e nblo s zunächs mi Kaninchen-an i-Flag (A) bzw. Maus-an i-myc (B) An ikö pe n sondie . Du ch die anschließende Au o adiog a ie (AR) de Blo s konn e die Kop äzipi a ion on CapG un e such we den. Un e den gewähl en expe imen ellen Bedingungen konn e eine di ek e In e ak ion on CapG mi den Condensin I-spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2, nich abe mi denen des Condensin II-Komplexes gezeig we den. Eine di ek e Assemblie ung on CapG inne halb eines Condensin II-Komplexes schein somi wei e unwah scheinlich. E gebnisse 86 2.2.3.3. Die di ek e In e ak ion on CapH2 und CapD3 is im in i o Assay nachweisba Eine zen ale F age, die du ch den in i o In e ak ions-Assay bean wo e we den soll e, is die de In e ak ions ähigkei de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und CapD3. Um diese F age nachzugehen, wu den die zu un e suchenden P o eine myc-CapD3 und CapH2 zunächs ge enn ansk ibie und ansla ie . [35S]Me hionin wu de wiede um nu zum Ma kie en de möglichen In e ak o en eingese z . Die myc-ma kie e ka aly ische Un e einhei de humanen PP2(A) wu de e neu als Nega i kon olle he angezogen. Als wei e e Nega i kon olle soll e die P äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD3 dienen. Die P äzipi a ion e olg e un e Ve wendung on Kaninchen-an i-myc-Aga ose. En nommene P oben wu den du ch SDS-Gelelek opho ese und anschließendem Wes e nblo un e Ve wendung on Maus- an i-myc-An ikö pe n analysie . Danach wu de eine Au o adiog a ie des Blo s du chge üh . Es konn e eine Kop äzipi a ion on CapH2 du ch myc-CapD3 gezeig we den. Ebenso wu de eine Kop äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD3 nachgewiesen. Ba en konn e alle dings auch du ch myc-PP2(A) p äzipi ie we den (Abbildung 29A). Eine spezi ische In e ak ion on Ba en mi de hie eingese z en ka aly ischen Un e einhei de humanen PP2A(C) konn e du ch Ve wendung eine wei e en Kon olle ausgeschlossen we den. So wu de eine e gleichba e Kop äzipi a ion on Ba en auch du ch ein N- e minal myc-ma kie es Kons uk de humanen Kohäsin-Un e einhei Scc1 un e Ve wendung eine Maus-an i-myc-Sepha ose beobach e (Da en nich gezeig ), was insgesam au eine unspezi ische In e ak ion on Ba en mi den eingese z en A ini ä sma izes ode mi dem myc-Epi op de P o eine hinweis . Die Spezi i ä de In e ak ion on Ba en und CapD3 muss somi in F age ges ell we den. In einem wei e en Expe imen wu de die Kop äzipi a ion on CapD3 du ch die be ei s e wende en C- e minal His-Flag-ma kie en P o eine CapH2 und Ba en un e such . Es wu de auch ein N- e minal-Flag ma kie es CapH2 e wende , um mögliche Beein äch igungen de P o einin e ak ionen du ch die C- e minale Ma kie ung auszuschließen. Ein an en sp echende Posi ion EGFP-ma kie es P o ein konn e un e Punk 2.2.2.3. als unk ionell besch ieben we den. Als Nega i kon ollen wu den das His-Flag-ma kie e humane Secu in und das His-Flag- ma kie e Ba en eingese z . Die einzelnen Un e einhei en wu den auch in diesem Expe imen zunächs indi iduell ansk ibie und ansla ie , gemisch und un e Ve wendung on Maus- an i-Flag-Sepha ose kop äzipi ie . Die In e ak ionsanalyse e olg e du ch SDS-Gelelek opho ese und anschließendem Wes e nblo du ch Ve wendung on Kaninchen-an i-Flag-An ikö pe n. In de Au o adiog a ie des Blo s kann eine Kop äzipi a ion on CapD3 be ei s du ch Secu in E gebnisse 87 beobach e we den (Abbildung 29B), was au eine gewisse unspezi ische In e ak ion on CapD3 mi de eingese z en A ini ä sma ix ode de His-Flag-Ma kie ung hinweis . Eine s ingen e e Kop äzipi a ion on CapD3 kann du ch das C- e minal His-Flag-ma kie e CapH2-Kons uk , abe auch du ch Ba en-HFHF nachgewiesen we den (Abbildung 29B). Abbildung 29: In e ak ionen de Condensin II spezi ischen Un e einhei en. A) Myc-PP2A(C), CapH2 und Ba en wu den in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ansla ie . Myc-CapD3 wu de ebenso in i o ansla ie , alle dings in Abwesenhei on [35S]Me hionin. B) CapD3 wu de in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ko ansla ie . Die angegebenen Flag-ma kie en P o eine wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in Abwesenhei on [35S]Me hionin. Die Reak ionen wu den en sp echend gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-myc-Sepha ose (A) bzw. Maus-an i-Flag-Aga ose (B) immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and (ÜB) und Elu ion (IP) wu den übe SDS-Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ion zu bes immen, wu den die Wes e nblo s zunächs mi Maus-an i-myc (A) bzw. Kaninchen-an i-Flag-An ikö pe n (B) sondie . Du ch die Au o adiog a ie (AR) de Blo s konn e eine mögliche Kop äzipi a ion de adioak i ma kie en Un e einhei en un e such we den. Zusammen assend konn e im e wende en in i o Assay eine di ek e In e ak ion on CapH2 und CapD3 gezeig we den. Wei e hin wu de auch eine une wa e e In e ak ion de Condensin I- Un e einhei Ba en mi de Condensin II-Un e einhei CapD3 beobach e , de en Spezi i ä alle dings nich kla he ausgea bei e we den konn e. 2.2.3.4. Die Bildung eines e nä en Komplexes is nu du ch Condensin I-spezi ische Un e einhei en e möglich Im Gegensa z zu P äzipi a ion on CapH2 aus Geweben de Fliege, konn e im in i o Assay eine In e ak ion on CapH2 und CapD3 nachgewiesen we den. Ebenso konn en du ch den Assay une wa e e In e ak ionen zwischen Condensin I und Condensin II-spezi ischen Un e einhei en E gebnisse 88 gezeig we den. Es s ell sich nun abe die F age, ob diese in i o In e ak ionen nu du ch das geziel e Zusammenb ingen einzelne Un e einhei en e möglich sind ode auch eine physiologische Rele anz haben. Diese F age könn e du ch die in i o Rekons i u ion e nä e Komplexe bean wo e we den. Nach de bishe igen Modell o s ellung wi d eine In e ak ion on CapD2/CapD3 mi de Ke nun e einhei SMC4 du ch die Kleisine Ba en/CapH2 e b ück . Im olgenden Ve suchsansa z wu de demzu olge un e such , ob du ch die Gegenwa de Kleisine eine Kop äzipi a ion on SMC4 du ch die myc-ma kie en P o eine CapD2 beziehungsweise CapD3 e b ück we den kann. Abbildung 30: Die In e ak ion on CapD2 und SMC4 wi d du ch Ba en s imulie . SMC4, CapH2 und Ba en wu den in Gegenwa on [35S]Me hionin in i o ko ansla ie . Die myc-ma kie en P o eine myc-CapD2 (A) und myc-CapD3 (B) wu den ebenso in i o ansla ie , alle dings in Abwesenhei on [35S]. Die Reak ionen wu den en sp echend gemisch und un e Ve wendung on Maus-an i-myc-Sepha ose immunp äzipi ie . P oben de Reak ionen o P äzipi a ion (INPUT), Übe s and (ÜB) und Elu ion (IP) wu den übe SDS- Gelelek opho ese au ge enn und geblo e . Um die E izienz de Immunp äzipi a ion zu bes immen, wu den die Wes e nblo s wu den zunächs mi Maus-an i-myc An ikö pe n sondie . Du ch die Au o adiog a ie de Blo s (AR) konn e eine mögliche Kop äzipi a ion de adioak i ma kie en Un e einhei en un e such we den. Die eingese z en P o eine wu den wiede um ge enn ansla ie , anschließend gemisch und eine P äzipi a ion an Maus-an i-myc-Sepha ose un e zogen. Die E izienz de P äzipi a ionen wu de du ch Wes e nblo s un e Ve wendung on Maus-an i-myc-An ikö pe n gezeig . In Abbildung 30A sind in allen P äzipi a en (IP) Banden im Molekula gewich sbe eich on myc- PP2A(C) e kennba . Da diesen Reak ionen kein myc-PP2A(C) zugese z wu de (INPUT), soll e es sich hie bei um Abbaup oduk e on myc-CapD2 handeln. Die Au o adiog a ie beide Blo s mach wiede um eine gewisse Kop äzipi a ion on Ba en du ch die Nega i kon olle myc- E gebnisse 89 PP2A(C) deu lich. Ve glichen zu diese unspezi ischen P äzipi a ion kann alle dings eine s a ke Kop äzipi a ion on Ba en du ch myc-CapD2 (Abbildung 30A), nich abe du ch myc-CapD3 (Abbildung 30B) beobach e we den. Ebenso wu de die Bildung eines e nä en Komplexes zwischen myc-CapD2, Ba en und SMC4 e möglich (Abbildung 30A), was de bishe igen Modell o s ellung eines Condensin I-Komplexes en sp echen wü de. Eine nachweisba e P äzipi a ion on SMC4 du ch myc-CapD3 konn e du ch Ba en nich e b ück we den (Abbildung 30B). Auch CapH2 wu de du ch myc-CapD2 p äzipi ie , konn e abe keine nachweisba e In e ak ion mi SMC4 e mi eln (Abbildung 30A). Ebenso konn e du ch die wenig s ingen e In e ak ion on CapH2 mi CapD3 keine, dem Modell des Condensin II-Komplexes en sp echende, P äzipi a ion mi SMC4 e b ück we den. In den du chge üh en Expe imen en konn e die bishe ige Modell o s ellung des Condensin I- Komplexes auch in de Fliege bes ä ig we den. Es wu de ebenso eine schwache di ek e In e ak ion de Condensin II-spezi ischen Un e einhei en CapH2 und CapD3 gezeig . Übe aschend wu de eine e gleichsweise schwache In e ak ion auch zwischen Condensin I und Condensin II-spezi ischen Komponen en beobach e . Da die Bildung eines e nä en Komplexes on SMC4, CapH2 und CapD3 jedoch nich s imulie we den konn e, muss die Exis enz eines löslichen Condensin II-Komplexes in D. melanogas e e neu in F age ges ell we den. Diskussion 96 emb yonalen zygo ischen Exp ession bis hin zum adul en S adium gewäh leis e we den. Diese Ta sache läss da au schließen, dass die Ch oma inassozia ion on CapG o dem NEBD wäh end diese En wicklungss adien nich essen iell ü dessen P o ein unk ion is und auch nich am Zen ome ini iie we den muss. Vielmeh konn e eine seh schnelle und o allem gleichmäßige Anlage ung on CapGNM-EGFP en lang de gesam en Ch omosomen gezeig we den. Es wu de be ei s nachgewiesen, dass CapD2 und Ba en zum Zei punk des NEBD e wa halbmaximal am Ch oma in angelage sind (Fische , 2010; Oli ei a e al., 2007). So könn e die Assemblie ung eines P ä-Condensin-Komplexes wäh end de P ophase in Abwesenhei on CapG s a inden und CapGNM-EGFP dann nach dem NEBD di ek en lang de gesam en Ch omosomen an diesem P ä-Komplex assemblie en. Al e na i wä e eine Beladung des gesam en Condensin- Komplexes, de schon im Zy oplasma assemblie sein könn e, e s nach dem NEBD e möglich . Diese wä e dann nich meh am Zen ome ini iie . Die Lokalisa ion on CapGNM-EGFP wu de in den hie du chge üh en Expe imen en du ch eine α4 ub-Gal4-VP16 e mi el e Exp ession des UAST-CapGNM-EGFPIII.2 T ansgens in CapG-wild ypischen Fliegen analysie . Die e spä e e Lokalisa ion on CapGNM-EGFP könn e dahe auch en lang de Ch omosomena me an assemblie e Condensin-Komplexe du ch einen Aus ausch on be ei s Condensin-gebundenem endogenen CapG mi ungebundenem CapGNM-EGFP e olgen. Du ch FRAP-Analysen wu de alle dings gezeig , dass CapG ech s abil am Ch oma in assoziie bleib und nu e wa 17,5% des P o eins wäh end de Me aphase gegen mobiles CapG ausge ausch we den (Naga ka , 2010). Um abschließend es zus ellen, ob eine Beladung on CapG übe das Zen ome s a inden muss, soll e die Assozia ion on CapGNM-EGFP am Ch oma in in CapG-mu an en Fliegenemb yonen wäh end de Mi ose 16 un e such we den, wenn die ma e nale Kon ibu ion des endogenen CapG au geb auch is . In diesen Emb yonen könn e du ch die Analyse de Ch oma inassozia ion ande e Epi op-ma kie e Condensin-Un e einhei en auch geklä we den, ob de en ini iale Ch oma inbeladung auch ohne CapG am Zen ome ini iie we den kann. 3.6. Die Exp ession e kü z e CapGNM-EGFP T ansgene üh zu SAC- e mi el e Ve zöge ung de Mi ose Obwohl dem Condensin eine wesen liche Rolle bei de S uk u ie ung des Zen ome be eichs de Ch omosomen zugesp ochen wi d (siehe 1.3.5), is die Ak i ie ung des SAC nach Mu a ion de Condensin-Un e einhei en aglich. Wäh end in S. ce e isiae eine Ak i ie ung und Diskussion 97 Au ech e hal ung des SAC in Condensin-Mu an en s a inde (Yong-Gonzalez e al., 2007), is die E hal ung de SAC-Ak i i ä in SMC2-deple ie en Humanzellen nich gewäh leis e (Samoshkin e al., 2009). Im hie du chge üh en Expe imen konn e eine Ak i ie ung des SAC nich nach Ab eiche ung de Condensin-Un e einhei en, sonde n du ch ek opische Exp ession e kü z e F agmen e on CapG zusä zlich zu dem endogenen CapG beobach e we den. Wäh end CapGNM-EGFP im Condensin-Komplex angelage we den kann, könn e eine Assemblie ung de e kü z en F agmen e im Condensin-Komplex nich e möglich sein. Konsis en hie zu konn en SMC2, SMC4, Ba en und CapD2 du ch CapGNM-EGFP, nich abe du ch CapGNM4-EGFP p äzipi ie we den. So könn en die e kü z en CapGNM-EGFP-F agmen e nach ek opische Exp ession in de Zelle ange eiche o liegen und dominan -nega i e E ek e he o u en. Es wu de be ei s eine di ek e In e ak ion de Zen ome -spezi ischen His onkomponen e CID mi CapG gezeig , die haup sächlich du ch den N- e minalen Be eich on CapG e mi el wi d (Jäge e al., 2005). De Einbau on CID in das zen ome e Ch oma in, de be ei s wäh end de Me aphase s a inden kann (Mellone e al., 2011), könn e hie bei du ch eine In e ak ion mi den e kü z en CapGNM-EGFP F agmen e behinde sein. Demzu olge könn e das zen ome e Ch oma in ehle ha de inie we den und le z lich eine Si ua ion en s ehen, die eine Ak i ie ung des SAC he o u . Al e na i könn en du ch wei e e dominan -nega i e E ek e, Komponen en, die zu Regula ion de SAC-P o eine nö ig sind, behinde we den. De e zöge en Me aphase schloss sich alle dings eine appa en no male Anaphase an. Es konn en somi keine wei e en zy ologischen E ek e nach Übe exp ession de e kü z en CapG- F agmen e beobach e we den. Alle dings wu den nach gewebsspezi ische ek opische Exp ession diese F agmen e im sich en wickelnden Auge du chaus o ensich liche Phäno ypen e zeichne (F ank, 2008). 3.7. CapG lieg in de Fliege in e schiedenen Iso o men o , welche gleiche maßen du ch Phospho ylie ung egulie we den In P o einex ak en aus wild ypischen Emb yonen und O a ien konn en im Immunblo jeweils zwei Banden im e wa e en G ößenbe eich on CapG de ek ie we den, die nich au al e na i e Spleiße eignisse de CapG-p ä-mRNA zu ückzu üh en sind. Es konn e alle dings wede eine Zellzyklus-spezi ische Funk ion noch eine un e schiedliche Phospho-Regula ion de beiden Iso o men in Emb yonen nachgewiesen we den. In P o einex ak en aus Hoden konn e im Immunblo hingegen nu eine Bande ü CapG nachgewiesen we den, welche wiede um einen modi izie en Gellau e glichen zu den Iso o men de Emb yonen und O a ien au weis . Diskussion 98 In de Fliege soll en also e schiedene Iso o men on CapG o liegen, welche au eine Modi ika ion des P o eins be uhen. Beach lich is hie bei, dass die en sp echende Modi ika ion in Emb yonen und O a ien eine e höh e Mobili ä on CapG wäh end de SDS- Gelelek opho ese he o u . So könn e CapG beispielsweise p o eoly isch p ozessie we den. Eine en sp echende P ozessie ung soll e alle dings in e n s a inden, da die Doppelbande zum einen du ch polyklonale An ikö pe de ek ie we den kann, welche gegen den N-Te minus on CapG gene ie wu den (Kaninchen-an i-CapG(N)). Zum ande en we den auch C- e minale CapG- Fusionsp o eine du ch An ikö pe , welche gegen die C- e minale Ma kie ung ge ich e sind, als Doppelbande de ek ie . Auch ü das cDNA-basie e CapGNM-EGFP, nich abe CapGFL-EGFP, konn e sowohl du ch Sondie ung mi an i-EGFP als auch mi an i-CapG(N) An ikö pe n, eine Doppelbande im Immunblo nachgewiesen we den. Wü de bei dem kleine en CapGNM-EGFP eine analoge hypo he ische p o eoly ische P ozessie ung o liegen wie bei dem genomischen Kons uk olle -Länge, wü de man e wa en, dass de Abs and de beiden P o einbanden im Gel e g öße wi d. De Abs and beide CapGNM-EGFP Banden is alle dings ge inge als de , de beiden Banden des endogenen CapG, was wiede um gegen eine p o eoly ische Modi ika ion on CapG sp ich . Da die gene ie en UAST-CapGNM-EGFP-T ansgeninse ionen die P o ein unk ion on CapG om Beginn de emb yonalen zygo ischen Exp ession bis hin zum adul en S adium besse komplemen ie en können als die UAST-CapGFL-EGFP-T ansgeninse ionen, könn e die besag e Modi ika ion dennoch einen Ein luss au die Funk ionali ä on CapG haben. Die molekula e G undlage diese Modi ika ion soll e dahe in wei e üh enden Expe imen en nähe un e such we den. 3.8. Lokalisa ion und Funk ion on CapG in weiblichen Fo p lanzungso ganen Es konn e eine spezi ische Lokalisa ion on CapG in den Ke nen de Zellen des Ge ma iums, de Näh zellen, de Follikelzellen und auch de G enzzellen gezeig we den, was au eine Funk ion des P o eins in diesen Zellke nen hinweis . Auße dem sind Weibchen, welche UAST-CapGNM- EGFP (CapGNM-Rescue) ode auch UAST-CapGFL-EGFP (CapGFL-Rescue) als alleinig unk ionelle CapG-Allele e mi el du ch da-Gal4 exp imie en s e il, was da au zu ückzu üh en is , dass UAST-Kons uk e in de weiblichen Keimbahn nich exp imie we den (B and und Pe imon, 1993; Ro h, 1998). Da in diesen Weibchen jedoch die Exp ession on CapGNM-EGFP bzw. CapGFL- EGFP du ch den ubiqui ä en Gal4-T eibe (da-Gal4) in den soma ischen Geweben gewäh leis e is , kann hie die Konsequenz de komple en Abwesenhei on CapG wäh end de Oogenese Diskussion 99 s udie we den. In Weibchen, welche spezielle hypomo phe CapG-Allele agen, die eben alls zu weibliche S e ili ä üh en, wu de eine e zöge e Disassemblie ung des SC besch ieben (Resnick e al., 2009). In den hie un e such en CapGNM-Rescue und CapGFL-Rescue-Weibchen konn e jedoch sowohl ein akku a e Assemblie ung als auch Disassemblie ung des SC beobach e we den, was eine ges ö e S uk u des SC als G und ü die S e ili ä unwah scheinlich mach . Wei e hin in e essan schien die Lokalisa ion on CapG im Ke n de pos mi o ischen G enzzellen. T o z de o angig zy oplasma ischen Lokalisa ion on CapGNM-EGFP in den G enzzellen de CapGNM-Rescue-Weibchen, konn en alle dings keine Au älligkei en bezüglich de Anzahl, G uppie ung ode Mig a ion diese Zellen beobach e we den. Auße dem wa en die Eie de CapGNM-Rescue-Weibchen be uch ungs ähig, was insgesam gegen eine beein äch ig e Funk ion de G enzzellen in den CapGNM-Rescue-Weibchen sp ich . Somi konn en bishe keine spezi ischen Phäno ypen inne halb de weiblichen Keimbahn nach Ab eiche ung on CapG he ausgea bei e we den. Es is möglich, dass CapG in spä en S adien de Oogenese, z.B. bei den meio ischen Teilungen nach de Be uch ung eine Rolle spiel . Die ge inge Anzahl on ei en Oozy en und abgeleg en Eie n in den CapGNM-Rescue- und CapGFL-Rescue-Weibchen haben eine genaue Analyse diese P ozesse nich e möglich . Wei e hin konn e, beding du ch die Ve wendung on UAST-Kons uk en, nich un e such we den, ob die N- e minalen zwei-D i el on CapG auch die Funk ionali ä on CapG wäh end de Oogenese gewäh leis en können. Um diese F age zu bean wo en, soll e das en sp echende CapGNM-EGFP-F agmen un e Kon olle de CapG- egula o ischen genomischen Sequenzen exp imie , ode in einen UASP-Vek o klonie we den. De UASP-Vek o en häl eine modi izie e UAS-Exp essionskase e, die auch in de weiblichen Keimbahn ak i ie we den kann (Ro h, 1998). Du ch P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion könn en en sp echende Kons uk e in das Fliegengenom eingeb ach und schließlich die Funk ionali ä on CapGNM-EGFP in CapG-mu an en Fliegenweibchen un e such we den. Die du ch diese Weibchen e en uell abgeleg en Eie wü den es schließlich auch e lauben, eine Funk ionali ä on CapGNM-EGFP in den ühen syncyi ialen Teilungen zu un e suchen. Die subzellulä e Lokalisa ion ode auch Phospho-Regula ion on CapG könn e nämlich du chaus wich ig sein, um die schnellen Zyklen im Syncy ium zu e lauben. Du ch analoge Analysen en sp echend nich -EGFP-ma kie e CapGNM- Kons uk e könn e auch hie de Ein luss de EGFP-Ma kie ung un e such we den. Diskussion 100 3.9. Lokalisa ion on CapG und CapD2 in männlichen Fo p lanzungso ganen Da anshe e ozygo CapD3-mu an e Fliegenmännchen s e il sind (Sa idou e al., 2005) und auße dem eine Funk ion on CapH2 und CapD3 bei de Ausbildung de Ch omosomen e i o ien in den p imä en Spe ma ozy en gezeig we den konn e (Ha l e al., 2008b), wu de bishe e mu e , dass dem Condensin II-Komplex speziell eine Rolle wäh end de Spe ma ogenese on D. melanogas e zukommen soll e. Hingegen wu de die Lokalisa ion de Condensin I- Un e einhei en in den Hoden on Fliegenmännchen in de hie du chge üh en A bei e s mals besch ieben. Wäh end eine Lokalisa ion on CapG in den Zellke nen de apikalen Hodenspi ze gezeig we den konn e, wa diese in den p imä en Spe ma ozy en nich nachweisba . Das deu e ehe au eine Rolle on CapG wäh end de mi o ischen gonialen Teilungen, als eine Be eiligung des P o eins an de Ausbildung de Ch omosomen e i o ien in den Ke nen de p imä en Spe ma ozy en im Zusammenspiel mi CapH2 und CapD3 hin. Übe aschend konn e abe eine An eiche ung on CapG am Ch oma in de ei enden Spe ma idenke ne gezeig we den. Eine seh ausgep äg e Lokalisa ion zeig sich hie auch ü CapD2, das dem Ch oma in s ab ö mig au zuliegen schein . Die un e schiedlichen Lokalisa ionsmus e beide P o eine könn en dadu ch e klä we den, dass im e s en Fall die Au o luo eszenz on CapG-EGFP zusammen mi de on His-2A D-mRFP1 und im zwei en Fall an i-CapD2 übe indi ek e Immun luo eszenz zusammen mi de DNA-Fä bung du ch Hoechs 33258 analysie wu de. So muss in wei e üh enden Expe imen en die Spezi i ä des an i- CapD2-An ikö pe s in männlichen Hoden gezeig we den, die wäh end diese A bei nich übe p ü wu de. Wei e hin könn e die Kolokalisa ion zweie un e schiedlich Epi op-ma kie e Condensin-Un e einhei en in diesem Gewebe un e such we den. Dami das Ch oma in in den ei en Spe mien hoch kompak ie und ansk ip ionsinak i o liegen kann, muss es wäh end de Spe ma iden ei ung eo ganisie we den. Da en sp echende Funk ionen ü den Condensin-Komplex in ande en Geweben be ei s gezeig we den konn en, könn en CapG und CapD2 en wede unabhängig ode inne halb eines Condensin-Komplexes zu Reo ganisa ion des Spe ma idench oma ins und somi zu Ausbildung des ei en Spe miench oma ins bei agen. Du ch spezi ische Ab eiche ung de P o eine in den Hoden de Fliegen und Analyse au e ende Phäno ypen könn en en sp echende Funk ionen de Condensin-Un e einhei en wei e üh end un e such we den. Diskussion 101 3.10. Gene ische In e ak ion on CapG, CapH2 und CapD3 Wäh end je d ei nich SMC-Un e einhei en beide Condensin-Komplexe in Ve eb a en (Ono e al., 2003; Yeong e al., 2003), P lanzen (Fujimo o e al., 2005) und auch C. elegans (Csanko szki e al., 2009) besch ieben we den konn en, wu de in D. melanogas e bishe kein CapG2-Homolog iden i izie . So wu de be ei s spekulie , dass CapG analog zu den SMC-Un e einhei en, in beiden Condensin-Komplexen de Fliege assemblie we den kann (Longwo h e al., 2008; Resnick e al., 2009). Fü die Condensin II-spezi ischen Un e einhei en on D. melanogas e wu de gezeig , dass diese eine Disassemblie ung on poly änen Ch oma ins uk u en e mi eln können. So pe sis ie das poly äne Ch oma in de o a ialen Näh zellke ne in CapH2- und auch CapD3-mu an en Fliegenweibchen bis hin zum En wicklungss adium 10 (Ha l e al., 2008a). Wäh end diese A bei konn e nach Ab eiche ung on CapG inne halb de Näh zellke ne hingegen keine e zöge e Disassemblie ung des Ch oma ins beobach e we den. In den hie bei analysie en CapGNM-Rescue-Weibchen wi d die Funk ion on CapG allein du ch die CapGNM-EGFP- T ansgeninse ion e mi el , die alle dings bei den e wende en Exp essionssys emen in den Keimbahngeweben, zu denen auch die Näh zellen gehö en, nich exp imie wi d. Somi sp echen diese Resul a e zunächs gegen eine Rolle on CapG bei de Disassemblie ung des Näh zellch oma ins. Du ch gene ische In e ak ionsanalysen konn e hingegen gezeig we den, dass CapH2, CapD3 und CapG eine gemeinsame Funk ionali ä zu Disassemblie ung des Näh zellch oma ins auszuüben scheinen. So wu de de poly äne Phäno yp des Näh zellch oma ins sowohl in anshe e ozygo CapD3-mu an en Weibchen, als auch in anshe e ozygo CapH2-mu an en Weibchen du ch das Einb ingen eines zusä zlich CapG- mu an en Allels wei e e s ä k . F aglich bleib , ob CapG, CapH2 und CapD3 eine Funk ion als Un e einhei en inne halb eines Condensin II-Komplexes e mi eln ode ob CapG unabhängig on einem Condensin II-Komplex eine Funk ion zu Ch oma in eo ganisa ion ausüb . CapG e mi el kla eine P o ein unk ion auch inne halb des Condensin I-Komplexes. Da Mu an en in den Genen ü die Condensin I-spezi ischen Komponen en üh in de En wicklung s e ben, konn en bishe keine Phäno ypen bezüglich de Mo phologie des Näh zellch oma ins in Condensin I-Mu an en un e such we den. Wei e üh end könn e abe in einem analogen Expe imen die Poly änie des Näh zellch oma ins in anshe e ozygo CapH2- ode CapD3- mu anen Fliegen nach Einb ingen eines zusä zlichen Ba en- ode CapD2-mu an en Allels un e such we den. Diskussion 102 Wäh end in CapH2-mu an en O a ien de poly äne S a us des Näh zellch oma ins länge als no mal pe sis ie , kann in einem komplemen ä en Ansa z du ch die Übe exp ession on CapH2 in den no male weise poly änen la alen Speicheld üsenzellen eine Disassemblie ung des Ch oma ins induzie we den (Ha l e al., 2008a). Wä e CapH2 in einem Condensin II-Komplex ak i , soll en die wei e en Condensin II-Un e einhei en im Übe schuss o handen sein. Konsis en mi diese Annahme, kann de du ch die CapH2-Übe exp ession e zeug e Phäno yp in CapD3-Mu an en supp imie we den. Auch in CapG-mu an en La en konn e de du ch die Übe exp ession on CapH2 e zeug e Phäno yp supp imie we den, was wiede um ein Hinweis au eine Assemblie ung on CapG im Condensin II-Komplex wä e. Alle dings wu de auch nach Übe exp ession on CapG eine Disassemblie ung des poly änen Ch oma ins beobach e . Wä e CapG inne halb eines Condensin II-komplexes ak i , soll e wiede um o ausgese z sein, dass die wei e en Condensin II-Un e einhei en im Übe schuss o handen sind. Diese Folge ung is nich schlüssig, da ja CapH2 ebenso übe exp imie we den muss, um eine Disassemblie ung des Ch oma ins he o zu u en. Al e na i könn e CapG auße halb eines Condensin II-Komplexes nach Übe exp ession die Ch oma ins uk u de Speicheld üsench omosomen beein lussen. Nach Übe exp ession de Condensin I-spezi ischen Un e einhei Ba en konn e keine Dispe sion des poly änen Speicheld üsench oma ins on Fliegenla en beobach e we den. Un e de Annahme, dass die Menge an CapG in den Speicheld üsen limi ie end is , wä e diese Beobach ung konsis en zu Condensin I- e mi el en E ek en nach Übe exp ession on CapG. Die zu Übe exp ession de P o eine genu z en ansgenen Fliegen wu den du ch P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion e zeug . Da hie eine zu ällige T ansgeninse ion in das Fliegengenom s a inde , häng die Exp essionss ä ke de T ansgeninse ionen auch on de en Inse ionso inne halb des Fliegengenoms ab. Die Exp essionsle el de un e schiedlichen T ansgeninse ionen wu den wäh end diese A bei nich e glichen. Es könn e dahe auch möglich sein, dass die genu z en UASP-CapH2 und UASP-CapG-T ansgeninse ionen s ä ke exp imie we den als die UASP-Ba en-T ansgeninse ion. Um die E ek e de Übe exp ession einzelne Condensin-Un e einhei en zu e i izie en, soll en in olgenden Analysen die Exp essionsle el de eingese z en T ansgeninse ionen gegeneinande abgeglichen we den. Beispielsweise könn e die In eg a ion un e schiedliche T ansgeninse ionen basie end au dem phiC31-In e g ase-In eg a ionssys em an de inie en Posi ionen des Fliegengenoms ges eue we den (Bischo e al., 2007), was Inse ions-abhängige Exp essionsun e schiede ausschließen wü de. Wei e hin könn e auch die Fähigkei wei e e Condensin I-Komponen en un e such we den, eine Disassemblie ung on poly änen Ch oma ins uk u en zu e mi eln. So könn en in Diskussion 103 gene ischen In e ak ionss udien die E ek e de Übe exp ession on CapH2 in Ba en- he e ozygo mu an en Fliegenla en un e such we den. Fü eine Analyse de Übe exp ession on CapH2 in CapD2-he e ozygo mu an en Fliegenla en müss en o e s CapD2-mu an e Allele e zeug we den. 3.11. Die Komposi ion lösliche Condensin-Komplexe Du ch die gene ischen In e ak ionss udien konn e gezeig we den, dass neben CapH2 und CapD3 auch CapG an de S uk u ie ung on poly änem Ch oma in be eilig is . Eine mögliche Assemblie ung on CapG inne halb eines Condensin II-Komplexes wu de du ch Immunp äzipi a ion einzelne Condensin-Un e einhei en und massenspek ome ische Analyse de jeweiligen P äzipi a e nähe un e such . Insgesam konn e in den P äzipi a en de Condensin-P o eine, abe auch in denen de jeweiligen Kon ollen, eine Vielzahl on Pep iden de ek ie und möglichen P o einen zugeo dne we den. Diese Ta sache is au die Sensi i i ä de gewähl en Analyseme hode mi els eines O bi ap-Massenspek ome e s zu ückzu üh en. Die Spezi i ä de In e ak o en is du ch die Anzahl de ihnen zugeo dne en Pep ide im Ve häl nis zu Spezi i ä diese Pep idmassenzuo dnung (unique and azo co e age) bes imm . Die Rele anz de einzelnen In e ak o en konn e du ch die Anzahl de insgesam iden i izie en Pep ide und de en In ensi ä no mie zu den en sp echenden We en de Nega i kon olle e mi el we den. So konn en nach Immunp äzipi a ion on CapG aus P o einex ak en on Emb yonen und auch O a ien alle ande en Komponen en des Condensin I-Komplexes als spezi ische In e ak o en iden i izie we den. Neben diesen P o einen konn en alle dings keine wei e en signi ikan en In e ak o en on CapG, insbesonde e nich CapH2 und CapD3, iden i izie we den. Da eine Assemblie ung on CapG im Condensin II-Komplex somi nich wah scheinlich e schien, soll e ein mögliche CapG2-Kandida in D. melanogas e du ch P äzipi a ion on SMC4 iden i izie we den. In den P äzipi a en on SMC4 konn en insgesam meh Pep ide als in denen des CapG de ek ie und en sp echenden P o einen zugeo dne we den. Umso übe aschende wa die Ta sache, dass in den 731 analysie en In e ak o en wiede um wede CapH2 noch CapD3 en hal en wa en. Die P äzipi a ionen on CapG und SMC4 wu den in O a ienex ak en on Fliegen o genommen. In diesem Geweben wu de sowohl eine Exp ession on CapH2 als auch Funk ionali ä on CapH2 und CapD3 nachgewiesen (Ha l e al., 2008a). Falls diese Funk ionen du ch einen Condensin II- Komplex e mi el we den, soll e so auch dessen P äzipi a ion aus Ex ak en dieses Gewebes möglich sein. Diskussion 104 Nach Übe exp ession und P äzipi a ion zweie un e schiedlich Epi op-ma kie e Va ian en de Condensin II-Un e einhei CapH2 aus O a ienex ak en konn e ande e sei s eine Kop äzipi a ion de Condensin-Ke nun e einhei en e eich we den. SMC2- und SMC4-spezi ische Pep ide wu den hie alle dings nich mi höchs e In ensi ä nachgewiesen. Obwohl die einzelnen P äzipi a ionsexpe imen e nich di ek mi einande e glichen we den können, wa en die jeweils ande en Condensin I-Un e einhei en nach P äzipi a ion du ch CapG und SMC4 un e den 30 mi höchs e In ensi ä iden i izie en P o eine en hal en. Eine Ausnahme bilde hie nu CapG, das wah scheinlich du ch die Me hode de Massenspek ome ie nich e ek i p ozessie bzw. analysie we den kann. So konn en soga nach P äzipi a ion on CapG selbs nu seh wenige Pep ide des P o eins in den P äzipi a en ge unden we den. Du ch P äzipi a ion on CapH2 konn en SMC2 und SMC4 hingegen nich einmal un e den 100 mi höchs e In ensi ä kop äzipi ie en P o eine ge unden we den. Eine In e ak ion on SMC4 und CapH2 konn e somi nu nach Übe exp ession und P äzipi a ion on CapH2, nich abe im komplemen ä en Expe imen nachgewiesen we den. Du ch das Übe angebo an CapH2 könn en zusä zliche Condensin II-Komplexe gebilde und olglich eine In e ak ion des CapH2 mi SMC2 und SMC4 s imulie we den. Vo ausgese z wi d hie bei, dass SMC2 und SMC4 be ei s im Übe angebo o handen sind ode abe dass CapH2 Ba en aus be ei s assemblie en Condensin I-Komplexen e d ängen könn e. Wenn CapH2 nach Übe exp ession im Condensin II-Komplex unk ionie , soll en SMC2, SMC4, CapD3 und ein mögliches CapG2 im Übe schuss o liegen, da be ei s du ch die Übe exp ession on CapH2 allein Phäno ypen gene ie we den können. So konn e zumindes nach Übe exp ession on CapH2 in Speicheld üsen on Fliegenla en eine Disassemblie ung des poly änen Ch oma ins in wild yischen La en, nich abe in CapD3-mu an en La en beobach e we den (Ha l e al., 2008a). Obwohl die Pep ide de P äzipi a e on CapH2 insgesam 1280 P o einen zugeo dne we den konn en, was imme hin as einem Zehn el des gesam en Fliegenp o eoms en sp ich , wu de CapD3 hie nich iden i izie . Die N- e minal an CapH2 ange üg en EGFP- bzw. mche y-Ma kie ungen soll en eine In e ak ion mi CapD3 hie bei nich behinde n. So konn e eine sei s die biologische Funk ionali ä de ü die P äzipi a ionsexpe imen e eingese z en N- e minal mche y- bzw. EGFP-ma kie en T ansgene du ch Komplemen a ionsanalysen nachgewiesen we den (Punk 2.2.2.3). Zum ande en wu de eine di ek e In e ak ion eines an analoge Posi ion N- e minal His-Flag-ma kie en CapH2 mi CapD3 im in i o Assay gezeig (Punk 2.2.3.3). Auch CapG konn e in den P äzipi a en on CapH2 nich nachgewiesen we den, was sowohl gegen eine physikalische In e ak ion on CapG und CapH2 als auch gegen eine Anlage ung dieses Diskussion 105 P o eins im Condensin II-Komplex sp ich . Un e de Vielzahl de kop äzipi ie en P o eine konn e wei e hin auch kein o ensich liche Kandida ü ein mögliches CapG2 on D. melanogas e he ausgea bei e we den. Hie bei is alle dings aglich, ob un e den gewähl en expe imen ellen Bedingungen eine In e ak ion on CapH2 mi CapG2 e wa e we den kann, wenn auch die In e ak ion on CapH2 und CapD3 nich s a inde . 3.12. Iden i ika ion on In e ak ionspa ne n de Condensin-Un e einhei en Du ch die Immunp äzipi a ion de einzelnen Condensin-Un e einhei en und de massenspek o- me ischen Analyse de jeweiligen P äzipi a e konn en neben den Condensin-Un e einhei en selbs keine wei e en o ensich lichen In e ak o en de Condensin-Komponen en iden i izie we den. Alle dings konn en die in den P äzipi a en iden i izie en P o eine mi den be ei s in de Li e a u disku ie en In e ak o en de Condensin-Un e einhei en e glichen we den. So wu de in D. melanogas e eine di ek e In e ak ion on Ba en mi Topo II gezeig (Bha e al., 1996). Topo II-spezi ische Pep ide konn en in diese A bei nu in den P äzipi a en on CapH2, nich abe in denen on CapG und SMC4 nachgewiesen we den (siehe Tabelle im Anhang, g au ma kie ). Dies könn e eine spezi ische In e ak ion on Topo II mi den Kleisin-Un e einhei en implizie en. Fü die humanen Condensin II-spezi ischen Un e einhei en (Yeong e al., 2003) wie auch die des X. lae is (Takemo o e al., 2009) konn e wei e hin eine di ek e In e ak ion mi de P o einphospha ase PP2(A) nachgewiesen we den. Da Pep ide de PP2(A) auch wäh end diese Analysen speziell in P äzipi a en on CapH2 iden i izie wu den (siehe Tabelle im Anhang, g au ma kie ), könn e PP2(A) auch in de Fliege eine egula o ische Funk ion bezüglich de Condensin II-Un e einhei en übe nehmen. E s kü zlich konn e in D. melanogas e eine Funk ion de RNA-Helikase Vasa wäh end de Mi ose demons ie , sowie eine Regula ion des Condensin I-Komplexes du ch den piRNA- Signalweg naheleg we den. Es wu de eine di ek e In e ak ion on Vasa mi den Condensin I- spezi ischen Un e einhei en Ba en und CapD2 gezeig , nich abe mi de Condensin II- spezi ischen Un e einhei CapD3 (Pek und Kai, 2011). Bei den hie du chge üh en P äzipi a ions- expe imen en konn e Vasa alle dings auch speziell in den P äzipi a en on CapH2 nachgewiesen we den. Neben Vasa wu den auch wei e e Komponen en des RNA-silencing Signalweges in den P äzipi a en de Condensin-Un e einhei en iden i izie (siehe Tabellen im Anhang, g au ma kie ). In D. melanogas e wu den 5 A gonau -E ek o P o eine besch ieben, welche Ma e ialien und Me hoden 112 In Tabelle 11 sind die Fliegens ämme au gelis e , welche wäh end diese A bei he ges ell wu den. Tabelle 11: Wäh end diese A bei he ges ell Fliegens ämme Geno yp He s ellungsa pUAST-CapGNM5-EGFP II.1 P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion pUAST-CapGNM5-EGFP III.1 pUAST-CapGNM5-EGFP III.2 pUAST-CapGFL-EGFP II.2, g-mRFP1-HP1 II.1/ CyO, P[ y+, z lacZ] Rekombina ion einzelne Allele pUAST-CapGC-EGFP II.3, g-mRFP1-HP1 II.1/ CyO, P[ y+, z lacZ] pUAST-CapGN-EGFP III.1, pUAST-CapGMC-EGFP III.2 w*; CapG1, P{EPgy2}Cap-D3EY00456/ CyO, P[ y+, z lacZ] w*; CapG6, P{EPgy2}Cap-D3EY00456/ CyO, P[ y+, z lacZ] 4.1.5. An ikö pe Tabelle 12: Ve wende e An ikö pe . P imä e An ikö pe Blo Immun- luo eszenz Re e enz/ Quelle Kaninchen-an i-EGFP(IS28) 1:3000 1:3000 Dü , 2004 Kaninchen-an i-mRFP1 1:3000 1:3000 Schi enhelm e al., 2007 Kaninchen-an i-CapG(N) 1:3000 Rei hinge , 2009 Kaninchen-an i-SMC2(IS04), unge einig es Se um 1:3000 S. Heidmann, pe sönliche Mi eilung Kaninchen-an i-Ba en 1:4000 Bha e al., 1996 Kaninchen-an i-CapD2 1:10000 1:1000 Sa idou e al., 2005 Kaninchen-an i-CID(IS1) 1:500 Jäge e al., 2005 Kaninchen-an i-C(3)G 1:3000 Geschenk on M. Lily Kaninchen-an i-Flag 1:2000 Sigma Maus-an i α- ub 1:80000 Sigma Ald ich Maus-an i-spe m ail 1:20 Ka , 1991 Maus-an i-Cyclin B (F2) 1:40 Knoblich und Lehne , 1993 Maus-an i-GFP (Clone #71 hyb idoma supe na an ) 1:200 Geschenk on P. Heun (MPI, F eibe g) un e ö en lich , ge einig on M. He mann Maus-an i myc (9E10 hyb idoma supe na an ) 1:100 – 1:1000 E an e al., 1985 Maus-an i-Ago-2 un e dünn Miyoshi e al., 2005 Mee schweinchen-an i-CapG(N) 1:3000 Rei hinge , 2009 Ra e-an i-CapH2 1:500 Oli ei a, 2007 Ra e-an i-Vasa 1:1000 De elpomen al S udies Hyb idoma Bank Sekundä e An ikö pe POD-Ziege-an i-Kaninchen 1:3000 Jackson Immunochemicals POD-Ziege-an i-Mee schweinchen 1:3000 Jackson Immunochemicals POD-Ziege-an i-Maus 1:3000 Jackson Immunochemicals POD-Ziege-an i-Ra e 1:3000 Jackson Immunochemicals Cy3- Ziege-an i-Kaninchen 1:600 Jackson Immunochemicals Cy5- Ziege-an i-Kaninchen 1:600 Jackson Immunochemicals Ma e ialien und Me hoden 113 4.2. Umgang mi D osophila melanogas e 4.2.1. S anda dme hoden Hal ung on D. melanogas e und K euzungsexpe imen e e olg en wie bei (G eenspan, 1997), (Robe s, 1998) und (Sulli an, 2000) besch ieben. In o ma ionen zu den Mu a ionen, die als phäno ypische Ma ke dien en, zu Balancie ch omosomen sowie zu gene ischen Nomenkla u inden sich bei (Lindsley, 1992) ode bei FlyBase (FlyBase Conso ium, 2003). 4.2.2. Keimbahn ans o ma ion on D. melanogas e -Emb yonen du ch Mik oinjek ion und Ka ie ung on T ansgeninse ionen T ansgene Fliegen wu den du ch P-Elemen e mi el e Keimbahn ans o ma ion on D. melanogas e w1-Emb yonen e zeug (Sp adling und Rubin, 1982). Eine de aillie e Besch eibung de Vo gehensweise de Injek ion inde sich bei He zig (1999). Als Injek ionsappa a u wu de ein Fem oje (Eppendo ) genu z . Eine de aillie e Besch eibung de Ka ie ung und E ablie ung ansgene Fliegens ämme inden sich bei K ame (1999). 4.2.3. Emb yonenkollek ionen Fü Emb yonenkollek ionen wu den adul e Fliegen in Flugkä igen bei eine Inkuba ions empe a u on 25°C gehal en. Die Flugkä ige wu den mi He e bes ichenen Ap elsa aga pla en e schlossen. Zum Ablegen zu ückgehal ene Emb yonen, wu de s e s eine 1-s ündige Vo kollek ion du chge üh . Fü die eigen liche Kollek ion wu den Ap elsa aga pla en en sp echend de Kollek ionsdaue gewechsel , die Emb yonen en sp echend de Kollek ionsdaue bei 25°C zu Al e ung inkubie und anschließend mi NaCl-Tx on de Ap elsa aga pla e gewaschen. Nach eine 3-minü igen Decho ionisie ung mi 50% Klo ix ( / ; Colga e Palmoli e GmbH) wu den die Emb yonen mi NaCl-Tx gewaschen und en sp echend wei e behandel . 4.2.4. Immun luo eszenz ä bung on Emb yonen Nach Kollek ion und Decho ionisie ung (siehe 4.2.3) wu den die Emb yonen in eine 1:1 Mischung aus Me hanol und Hep an (je 700 µl) ü 5 min un e Ro a ion ixie . Nach de Fixie ung wu den die Emb yonen zue s d eimal mi 1 ml Me hanol und dann d eimal mi 1 ml PBTx gespül und d eimal ü 10 min mi 500 µl PBTx un e Ro a ion bei RT gewaschen. Die Emb yonen wu den dann ü 1h in 1 ml PBTx (10% NGS, no mal goa se um ode 10% FBS, e al bo ine se um) un e Ro a ion bei RT inkubie , um unspezi ische An ikö pe bindes ellen zu blockie en und anschließend übe Nach mi dem p imä en An ikö pe in 1 ml PBTx (10% NGS ode 10% FBS) bei 4°C un e Ro a ion inkubie . Danach wu den übe schüssige An ikö pe du ch 3-maliges Spülen und 2-maliges Waschen in je 1 ml PBTx en e n und die Emb yonen mi dem sekundä en An ikö pe in 500 µl PBTx (5% NGS ode 5% FBS) ü 2h bei RT un e Ro a ion inkubie . Nach de An ikö pe inkuba ion wu de d eimal mi 1 ml PBTx gespül und einmal mi 1 ml PBTx ü 5 min un e Ro a ion gewaschen. Anschließend e olg e die Fä bung de DNA du ch den in e kalie enden Fa bs o Hoechs 33258. Hie zu wu den die Emb yonen 5 min lang un e Ro a ion mi 1 ml PBS/Hoechs 33258 (1 μg/ml Hoechs 33258 in PBS) inkubie . Nach Abziehen de Fä belösung wu den die Emb yonen mi 1 ml PBS gespül und 5 min in 1 ml PBS un e Ro a ion gewaschen. Die Emb yonen wu den anschließend au einen Objek äge übe üh , übe schüssiges PBS abpipe ie , in Mon ie medium au genommen und mi einem Deckglas ixie . Ma e ialien und Me hoden 114 4.2.5. Immun luo eszenz ä bung on Speicheld üsen, Fliegeno a ien und Hoden Fü die P äpa a ion on Speicheld üsen wu den D osophila-La en des d i en La ens adiums in PBS übe üh und de en Ve dauungs ak mi eine Pinze e he aus p äpa ie . Fü die P äpa a ion on O a ien und Hoden wu den die Fliegen mi CO2 be äub und in PBS übe üh . Mi els eine Pinze e wu de das Abdomen geö ne und die O a ien bzw. die männlichen Rep oduk ionso gane he aus p äpa ie . Soll e eine di ek e Mik oskopie olgen, konn en die e hal enen Gewebe di ek au einen Objek äge gegeben, in Mon ie medium sezie und du ch ein Deckglas ixie we den. Al e na i wu den die e hal enen Gewebe in ein Gemisch aus 150 µl Fixie ungslösung und 300 µl Hep an ans e ie und 20 min un e Ro a ion ixie . Nach meh achem Waschen mi PBST wu de eine Immun luo eszenz ä bung de Gewebe analog zu de on ixie en Emb yonen o genommen (siehe 4.2.4), mi dem Un e schied, dass sowohl die Waschsch i e als auch die An ikö pe e dünnungen in PBST s a PBTx o genommen wu den. Al e na i wu de di ek nach dem Waschen eine Hoechs 33258-Fä bung (analog zu de ixie e Emb yonen) de Gewebe o genommen. Die ge ä b en Gewebe wu den abschließend au einen Objek äge übe üh , mi Mon ie medium übe schich e , un e dem Mik oskop (Zeiss, S emi 2000) sezie und mi einem Deckglas ixie . 4.3. Mik oskopie und Bildbea bei ung Zu mik oskopischen Analyse wu de ein Fluo eszenzmik oskop des Typs Axioplan 2 on Zeiss genu z . Es wu de eine 16- ache bzw. 20- ache Objek i -Ve g öße ung e wende . Mik oskopische Au nahmen wu den mi de AxioCam MRm-Kame a ange e ig und mi de So wa e AxioVision 3.1 (Zeiss) e s ell . Kon okale Lase mik oskopie e olg e am Lase -Scanning-Mik oskop on Leica (Leica Con ocal TCS SP5) mi de LCS-So wa e. Soll en hie bei lebende Emb yonen mik oskopie we den (in i o Mik oskopie), wu den diese nach Decho ionisie ung au einem Ap elsa aga block au ge eih und mi ig au ein mi Klebs o (Hep anex ak on Packe klebeband) e sehenes Deckglas übe üh . Zum Schu z o Aus ocknung wu den die Emb yonen mi einem saue s o du chlässigem, hoch iskosen Öl (Vol ale 10 S, el a ochem) übe schich e . Zu An egung de Fluo eszenz a bs o e Hoechs 33258, EGFP, mRFP1, Cy3 sowie Cy5 wu den einen Dioden UV-Lase 405 (An egungswellenlänge 405 nm), ein A gonlase (An egungswellenlänge 458-514 nm), ein DPSS561- Lase (An egungswellenlänge 561 nm) und ein Helium/Neon-Lase (An egungswellenlänge 633 nm) eingese z . Fü die Fluo eszenzau nahmen wu den ein 40- aches und ein 60- aches Öl-Objek i e wende . Fü Zei eihen wu de alle 15s bzw. 20s ein Bild au genommen. Die Eins ellungen de Blenden und des Pho omul iplie s wu den den en sp echenden P äpa a en bzw. de expe imen ellen Zielse zung angepass . Bei hohem Hin e g undsignal, wu den die luo eszenzmik oskopischen Au nahmen mi eine 2- bis 4- achen Ab as e ung au genommen. Die Bildbea bei ung e olg e mi Hil e de So wa e ImageJ 1.41 (Na ional Ins i u e o Heal h, USA) und mi dem P og amm Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.). Ma e ialien und Me hoden 115 4.4. Molekula biologische Me hoden 4.4.1. Polyme ase-Ke en eak ion (PCR) Fü PCR-Reak ionen wu den das „Expand Long Range dNTPack“ (Roche), ode P u-DNA-Polyme ase (Fe men as) ode eine selbs he ges ell e Taq-DNA-Polyme ase e wende . Als Templa e wu den 50- 500 ng Plasmid-DNA eingese z . Genomische DNA ode cDNA aus Fliegen wu de zu je 1 µl en wede un e dünn ode in eine Ve dünnung on 1:3 bis 1:10 eingese z . Den 25–50 µl PCR-Ansä zen wu de wei e hin de jeweilige PCR-Pu e in eine 1- achen Endkonzen a ion, Desoxy ibonukleo idmix und PCR-P ime nach Angaben de jeweiligen He s elle zugegeben. Bei Ve wendung de Taq-DNA- Polyme ase wu den 1,5 mM MgCl2; 0,1 mM Desoxy ibonukleo idmix, 0,4 µM PCR-P ime , sowie PCR-Pu e in eine 1- achen Endkonzen a ion eingese z . Die PCR-Reak ionen wu den in den PCR- Maschinen RoboCycle G adien 96 Ho Top Combo (S a agene) und Pe kin Elme Ce us Gene Amp PCR Sys em 9600 du chge üh . Eine En salzung de PCR-Reak ionen wu de mi els des „Qiagen PCR pu i ica ion Ki “ (Qiagen) nach den Angaben des He s elle s o genommen. 4.4.2. DNA-F agmen ie ung du ch Res ik ionsendonukleasen Die enzyma ische Res ik ion on DNA wu de mi Res ik ionsendonukleasen de He s elle NEB, Fe men as und Roche en sp echend de Angaben des jeweiligen He s elle s du chge üh . Es wu den 0,5 bis 3 μg Plasmid-DNA mi 2 bis 10 U des/de jeweiligen Res ik ionsenzyms/-enzyme in einem Gesam olumen on 10 bis 50 μl gemisch . Gleichzei ig wu de eine 1- ache Konzen a ion des en sp echenden Reak ionspu e s (10x) sowie gegebenen alls on Rinde se um-Albumin (BSA) einges ell . De Res ik ionsansa z wu de bei de enzymspezi ischen Tempe a u ü mindes ens 1h inkubie . 4.4.3. Enzyma ische Dephospho ylie ung on DNA-F agmen en Um eine Religa ion on Vek o -DNA wäh end de enzyma ischen Liga ion zu e meiden, wu den Vek o en nach de enzyma ischen Res ik ion an ih en 5’-Enden dephospho ylie . Dazu wu den die Res ik ionsansä ze nach Hi ze-Inak i ie ung de Res ik ionsenzyme (15 min bei 65°C) en salz , eine 1- ache Konzen a ion an SAP-Pu e einges ell und 1 bis 5 U Alkalische Ga nelen-Phospha ase (SAP; Fe men as) zugese z . Die Reak ionsansä ze wu den ü 30 min bei 37°C inkubie und anschließend Hi ze-inak i ie (15 min bei 65°C). 4.4.4. Enzyma ische Liga ion on DNA-F agmen en Zu Gene ie ung on Plasmiden wu de ein klonie es und mi Res ik ionsenzymen geschni enes DNA-F agmen un e Ve wendung on T4-DNA-Ligase (Fe men as/ NEB) in einen Vek o klonie . Die en sp echende Reak ion wu de in einem Volumen on 10 μl mi 1 μl des om jeweiligen He s elle angegebenen Reak ionspu e s (10x) sowie 1 µl T4-DNA-Ligase angese z und ü mindes ens 3h bei Raum empe a u inkubie . Nach de Liga ion wu den die Ansä ze ü 15 min bei 65°C inkubie um die Ligase zu inak i ie en. 4.4.5. T ans o ma ion on Plasmid-DNA in E. coli-Bak e ien Zu T ans o ma ion on Plasmid-DNA in Esche ichia coli wu den 50 μl chemisch kompe en e E. coli- Bak e ien mi 10 μl eines Liga ionsansa zes gemisch und ü mindes ens 10 min au Eis inkubie . Danach wu de ein Hi zeschock (45s bei 42°C) o genommen, ge olg on eine e neu en Inkuba ion ü 2 min au Eis. Nach Zugabe on 500 µl LB-Medium wu den die Bak e ien ü e wa 30 min bei 37°C Ma e ialien und Me hoden 116 un e schü eln inkubie . Die Bak e ien wu den anschließend au LB-Aga pla en ausgeb ach , die Ampicillin in eine Konzen a ion on 100 μg/ml en hiel en, und übe Nach bei 37°C inkubie . 4.4.6. Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli-Bak e ien Zu P äpa a ion on Plasmid-DNA wu den de „QIAp ep Spin Minip ep Ki “ und de „QIA il e Plasmid Midi Ki “ de Fi ma Qiagen nach Anweisung des He s elle s e wende . 4.4.7. Aga osegelelek opho ese und Ex ak ion on DNA-F agmen en Zu analy ischen und zu p äpa a i en Au ennung on DNA-F agmen en wu den 1%-ige Aga osegele au T is-Bo a -Basis e wende (Samb ook, 1989). P o 100 ml lüssige Aga ose wu den 3 μl E hidiumb omid (10 mg/ml) zugegeben, um die DNA spä e im UV-Lich sich ba zu machen. Soll e eine P äpa a ion de DNA-F agmen e aus de Aga ose e olgen, wu den diese mi einem Skalpell un e UV-Lich ausgeschni en und anschließend mi dem „Gel-Ex ac ion Ki “ (Qiagen) nach den Angaben des He s elle s ex ahie . 4.4.8. P äpa a ion genomische DNA aus Fliegenemb yonen Zu P äpa a ion de genomischen DNA aus D. melanogas e wu den 4 bzw. 30 adul e Fliegen mi CO2-be äub und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Die Fliegen wu den in 100 μl bzw. 400 μl Pu e A homogenisie und das Homogena anschließend 30 min bei 65°C inkubie . Dann wu den 120 μl bzw. 900 μl eine Li hiumchlo id/Kaliumace a -Lösung zugegeben und de Ansa z 30 min au Eis inkubie . Nach 15-minü ige Zen i uga ion (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 16000g, RT) wu de de Übe s and in ein neues Reak ionsge äß ans e ie , die DNA du ch Zugabe on 100 μl bzw. 540 μl Isop opanol ge äll und du ch Zen i uga ion (15 min, 60000g, RT) sedimen ie . Anschließend wu de das DNA-Pelle mi 70%igem E hanol gewaschen, ge ockne und in 20 µl bzw. 50 µl TE-Pu e au genommen. 4.4.9. P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben und Re e se T ansk i ion Zu P äpa a ion on RNA aus Fliegengeweben wu de de „RNeasy Mini Ki “ (Qiagen) nach dem P o okoll „Pu i ica ion o To al RNA om Animal Tissues“ genu z . Um RNA aus w1-Emb yonen zu e hal en, wu den diese nach en sp echende Kollek ion on de Ap elsa aga pla e gesammel , decho ionisie , mi NaCl-Tx gewaschen und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Übe schüssige Waschpu e wu de quan i a i abgezogen und das Volumen de Emb yonen du ch eine skalie e Kapilla e bes imm . Es wu den 20–100 µl Emb yonen eingese z . Diese wu den zu Lage ung in lüssigen S icks o einge o en und dann di ek in RTL-Pu e (Qiagen) au gea bei e . Zu P äpa a ion on RNA aus adul en w1-Fliegen wu den jeweils 20 Männchen ode Weibchen be äub und di ek in RTL-Pu e (Qiagen) au gea bei e . Zu e e sen T ansk ip ion wu den de „Omnisc ip RT Ki “ (Qiagen) ode eine Re e se T ansk ip ase (Fe men as) nach den Angaben des jeweiligen He s elle s eingese z . Es wu de je 1 µl (300-400 ng) de p äpa ie en RNA-P oben p o T ansk ip ions eak ion eingese z . Hie bei wu den sowohl Oligo-dT als auch Hexame p ime zu je 10 µM p o T ansk ip ions eak ion eingese z . 4.4.10. Sequenzie ung und Sequenz e gleiche Alle Sequenzie ungen wu den on de Fi ma Sequencing Labo a o ies Gö ingen du chge üh . DNA- P oben wu den nach den Angaben de Fi ma o be ei e . Sequenzanalysen wu den mi den P og ammen SeqBuilde (DNA S a So wa e) und Mul align (Mul iple sequence alingmen by Flo ence Co pe ; h p://bioin o.genopole- oulouse.p d. /mul alin/mul alin.h ml) du chge üh . Ma e ialien und Me hoden 117 4.5. P o einbiochemische Me hoden 4.5.1. He s ellung on A ini ä sma izes au Basis on P o ein A-Sepha ose 4.5.1.1. Kopplung polyklonale An ikö pe Fü die Immunp äzipi a ion aus na i en D. melanogas e -P o einex ak en wu den ausschließlich selbs he ges ell e A ini ä sma izes e wende . Hie ü wu den die polyklonalen An ikö pe , Kaninchen-an i-EGFP(IS28), Kaninchen-an i-mRFP1, Kaninchen-an i-mche y ode Kaninchen-an i- CapG(N) ko alen an P o ein A-Sepha ose (A i-P ep P o ein A, BIORAD) gekoppel . Die P o ein A- Sepha ose wu de o e s d eimal mi dem 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH 9,0) gewaschen. Schließlich wu den p o 100 µl gese z e P o ein A-Sepha ose 50 µl a ini ä sge einig e, polyklonale An ikö pe lösung e dünn in 1 ml 50 mM Bo ax (pH 9,0) zugegeben. Nach eins ündige Inkuba ion un e Ro a ion (RT) wu de de Übe s and nach Zen i uga ion (Tischzen i uge, VWR Galax Mini, 20 sek) on de Sepha ose abge enn , diese zweimal mi dem 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH 9,0) gewaschen und im 10- achen Volumen an 50 mM Bo ax (pH 9,0) au genommen. Zu ko alen en Kopplung de An ikö pe an die Sepha ose wu de es es Dime hylpimelida in eine Endkonzen a ion on 20 mM zugeben. Nach 30-minü ige Inkuba ion un e Ro a ion (RT) wu de de Übe s and abgenommen. Zu Blockie ung on nich eagie em Dime hylpimelimida wu de die Sepha ose mi dem 10- achen Volumen an 200 mM E hanolamin (pH 8) gewaschen und wei e e 2h im 10- achen Volumen an 200 mM E hanolamin (pH 8) un e Ro a ion bei RT inkubie . Die Sepha ose wu de anschließend mi dem 10- achen Volumen an 100 mM Glycin (pH 3) gewaschen und zweimal ü 10 min im 10- achen Volumen an 100 mM Glycin (pH 3) un e Ro a ion (RT) inkubie . Nach d eimaligem Waschen mi dem 10- achen Volumen an PBS konn e die e hal ene A ini ä sma ix im 10- achen Volumen an PBS (0,01% Thime osal) bei 4°C gelage we den. 4.5.1.2. Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden Die Kopplung on monoklonalen Maus-Hyb idomaübe s änden an P o ein A-Sepha ose e olg e im Wesen lichen wie un e 4.5.1.1 besch ieben, alle dings un e Hochsalzbedingungen. Hie zu wu de dem 50 mM Bo ax NaCl in eine Endkonzen a ion on 3 M zugese z wu de. Dem Hyb idomaübe s and wu de o de Kopplung NaCl in eine Endkonzen a ion on 3 M zugese z sowie de pH-We mi els 1 M NaOH au 9,0 einges ell . Zu Kopplung wu den 2 ml Hyb idomaübe s and p o 100 µl P o ein A-Sepha ose eingese z . Wäh end diese A bei wu de ein an i-myc Hyb idomaübe s and (mAB 9E10 an i-myc) zu He s ellung eine en sp echenden A ini ä sma ix eingese z . 4.5.2. He s ellung na i e P o einex ak e aus D. melanogas e -Geweben und anschließende Immunp äzipi a ion Emb yonen wu den wie un e Punk 4.2.3 besch ieben e hal en und in ein 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Nach Bes immen de Emb yonenmenge (in µl) wu de de übe schüssige Pu e en e n . Fü eine länge e Lage ung konn en die Emb yonen in lüssigem S icks o einge o en und bei -80°C gelage we den. Um na i e P o einex ak e aus O a ien he zus ellen, wu den diese aus Fliegenweibchen p äpa ie (siehe Punk 4.2.5) und in Po ionen on ja 20-30 O a ienpaa en in 1,5 ml-Reak ionsge äße übe üh . Nach En e nen des übe schüssigen Pu e s wu den auch die O a ien in lüssigem S icks o einge o en. In ge o ene Fo m konn en schließlich meh e e Aliquo s e ein we den. Die Ex ak he s ellung wu de bei 4°C du chge üh . Hie bei wu den die Fliegengewebe du ch Zugabe on gekühl em Lysepu e (mi P o easeinhibi o en) in einen Glashomogenisa o (Kon es) übe üh . De Au schluss e olg e du ch ein Te lon-Pis ill (Kon es), das du ch eine Ma e ialien und Me hoden 118 Boh maschine (Bosch) ange iebenen wu de (ca. 10mal au und ab, bei mi le e D ehzahl). Es wu den je 400 µl Lysepu e p o 100 µl Emb yonen bzw. 100 O a ienpaa en eingese z . Die Homogena e wu den schließlich zen i ugie (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 15 min, 16000g, 4°C). Die mi le e Phase mi löslichen P o einen wu de mi els eine Pas eu pipe e abgenommen und in ein isches 1,5 ml-Reak ionsge äß übe üh . Nach Zen i uga ion (15 min, 16000g, 4°C) konn e du ch e neu es Abnehmen de mi le en Phase de na i e P o einex ak e hal en we den. Diesem wu den 20 µl en nommen und in 10 µl SDS-P obenpu e au gekoch (INPUT). De es liche Ex ak wu de dann mi eine An ikö pe -gekoppel en A ini ä sma ix (4.5.1.1) ü 3-4h bei 4°C un e Ro a ion inkubie . P o 200-400 µl na i em P o einex ak wu den 30 µl A ini ä sma ix eingese z , welche o he d eimal mi je 1 ml Lysepu e gewaschen wu de. Nach de Inkuba ion wu de de Übe s and du ch Zen i uga ion abge enn (1 min, 16000g, 4°C), diesem 20 µl en nommen und in 10 µl SDS-P obenpu e au gekoch (ÜB). Die A ini ä sma ix wu de d eimal mi 1 ml Lysepu e gewaschen und wei e e 10 min in 1 ml Lysepu e un e Ro a ion bei 4°C inkubie . Um unspezi ische In e ak o en on de Ma ix abzu ennen, konn e diese je nach Expe imen du ch wei e e Pu e (WPS und olgend WPD) je einmal gespül und ü 10 min un e Ro a ion bei 4°C inkubie we den. Nach Abnehmen des Waschpu e s olg e die Elu ion. Diese konn e o e s mi els Elu ionspu e e olgen. Hie bei wu de die Ma ix in 40 µl Elu ionspu e ü 5 min bei 37°C inkubie , diese schließlich nach Zen i uga ion (1 min, 16000g, 4°C) abgenommen, mi wei e en 20 µl SDS- P obenpu e e se z und gekoch (IP). Anschließend konn e die A ini ä sma ix in 40 µl SDS- P obenpu e ü 5 min bei 95°C inkubie und nach Zen i uga ion (1 min, 16000g, 4°C) und Abnahme des Übe s andes ein wei e es Elua e hal en we den (IP, Heißelu ion). Al e na i konn e die Ma ix nach dem le zen Waschsch i auch in eine Mobicol-Säule (Mobi ec) übe üh und du ch Zen i uga ion (Tischzen i uge, VWR, Galax mini, 20 sek) om Pu e abge enn we den. In diesem Fall wu de die Elu ion di ek du ch Zugabe on 40 µl SDS-P obenpu e (ohne β-Me cap oe hanol) und 5-minü ige Inkuba ion bei 95°C o genommen. Du ch Zen i uga ion (Tischzen i uge, 20 sek) wu de das Elua schließlich on de A ini ä sma ix abge enn und nach Zugabe on 4 µl β- Me cap oe hanol (14,4M) e neu ü 10 min gekoch (IP). Fü die Immunp äzipi a ionen on CapG-mRFP1 und SMC4-EGFP (siehe E gebnisse, Abschni e 2.2.2.1 und 2.2.2.2) wu de eine zweis u ige P äzipi a ion o genommen. Fü die P äzipi a ionen on mche y-CapH2 und EGFP-CapH2 (siehe E gebnisse, Abschni 2.2.2.3) wu den die A ini ä sma izes di ek in SDS-P obenpu e gekoch . Die P oben on INPUT und ÜB wu den schließlich so e dünn , dass 20 Emb yonen bzw. 2,5 O a ien p o 10 µl SDS-P obenpu e en hal en wa en. Fü die SDS- Gelelek opho ese wu den jeweils 10 µl ü INPUT und ÜB und 5–15 µl de Elua e eingese z . 4.5.3. P o einp äpa a ion on D. melanogas e -Emb yonen in e schiedenen Phasen de Mi ose 14 Fliegen des Geno yps s ing7B, P[w+,Hs-s ing]/ TM3,Se wu den in Flugkä igen (siehe Punk 4.2.3) gehal en. Emb yonen wu den jeweils ü 30 min gesammel und wei e e 160 min bei 25°C geal e . In eine solchen Kollek ion (160-190 min) be inden sich die Zellen eine Meh zahl de Emb yonen in de G2-Phase des Zellzyklus 14 und können du ch eine ek opische Exp ession de Phospha ase Cdc25/s ing synch on in die Mi ose ge ieben we den (Saue e al., 1995). Um eine Exp ession des Hs-s ing zu e mi eln, wu den die Ap elsa aga pla en ü 20 min bei 37°C im Wasse bad inkubie und anschließend ü 5 min, 8 min, 12 min ode 15 min bei 25°C geal e . Die Emb yonen wu den decho ionisie und in eine 1:1 Mischung aus Me hanol (1mM Vanada ) und Hep an (je 700 µl) ü 5 min un e Ro a ion ixie . Anschließend wu den die Emb yonen d eimal mi Me hanol (1mM Vanada ) und zweimal mi EB-Pu e (0,5% Tween 20 (w/ )) gewaschen und 5 min un e Ro a ion mi Ma e ialien und Me hoden 119 Hoechs 33258 (1 μg/ ml in EB) ge ä b . Nach zweimaligem Waschen in EB-Pu e konn en die Emb yonen in EB (60% Glyce in) bei -20°C gelage we den. Die Emb yonen wu den schließlich mi Hil e eines in e sen Mik oskops (Axio e 25; Ca l Zeiss) au einem Objek äge anhand de Mo phologie ih e DNA den un e schiedlichen Zellzyklusphasen de Mi ose 14 zugeo dne . En sp echende Emb yonen wu den e einig , in kEB homogenisie und 5 min bei 95°C gekoch . 4.5.4. Demecolzinbehandlung on D. melanogas e -Emb yonen Um einen Zellzyklusa es inne halb de Mi ose zu bewi ken, wu den Emb yonen nach en sp echende Kollek ion und Decho ionisie ung (Punk 4.2.3) in eine 1:1 Mischung aus Schneide s- Medium (Gibco) (10 µM Demecolzin) und Hep an (je 300-700 µl, en sp echend de Emb yonenmenge) übe üh und 20 min bei RT un e Ro a ion inkubie . In einem pa allelen Ansa z wu den Emb yonen in eine Mischung aus Schneide s-Medium und Hep an ohne Demecolzin inhibie . Nach de Inkuba ion wu den die Emb yonen zweimal mi Lysepu e (mi P o easeinhibi o en) gewaschen, in eine en sp echenden Menge an Lysepu e (mi P o easeinhibi o en) homogenisie und nach Zugabe on SDS-P obenpu e 5 min bei 95°C gekoch . Um den E olg des Me aphasena es es zu übe p ü en, wu de ein Teil de Emb yonen nach de Inkuba ion du ch Me hanol/Hep an ixie (Punk 4.2.4) und de en DNA du ch 5-minü ige Inkuba ion in Hoechs 33258 (1 μg/ml in PBS) ge ä b . 4.5.5. Phospha asebehandlung on Emb yonalex ak en Zu Phospha asebehandlung wu den Emb yonen nach dem Absammeln on de Ap elaga pla e (Punk 4.2.3) decho ionisie und mi NaCl-Tx gewaschen. Die Anzahl de Emb yonen wu de du ch eine skalie e Kapilla e bes imm . Es wu den jeweils 300 Emb yonen in 150 µl λ-Lysepu e (mi P o easeinhibi o en) homogenisie . 50 µl des Homogena es wu den mi 1 µl λ-Phospha ase (NEB) ü 15 min bei 30°C inkubie (+λ). Wei e e 50 µl des Homogena es wu den ohne Zugabe on λ- Phospha ase analog inkubie (-λ). Anschließend wu den je 25 µl SDS-P obenpu e zugegeben und die Ex ak e ü 5 min bei 95°C gekoch . Dem le z en Teil des Homogena es wu den λ-Phospha ase und SDS-P obenpu e gleichzei ig zugegeben und unmi elba au gekoch (+λ†). 4.5.6. He s ellung dena u ie ende Ex ak e aus D. melanogas e -Geweben Zu He s ellung dena u ie ende P o einex ak e on Emb yonen wu den diese nach de Kollek ion (Punk 4.2.3) gesammel , decho ionisie , mi NaCl-Tx gewaschen und die Anzahl de Emb yonen du ch eine skalie e Kapilla e ges imm . Nach Zugabe on 50 µl SDS-P obenpu e p o 100 Emb yonen wu den diese homogenisie und 5 min bei 95°C gekoch . Zu He s ellung dena u ie ende P o einex ak e aus O a ien und Hoden wu den diese o e s in PBS p äpa ie (siehe Punk 4.2.5), anschließend in Lysepu e (mi P o easeinhibi o en; 50 µl Lysepu e je 10 O a ien bzw. 25 Hodenpaa e) homogenisie und nach Zugabe on SDS-P obenpu e ü 5 min bei 95°C gekoch . Nach 1-minü ige Zen i uga ion (Eppendo -Zen i uge, Typ 5415 D, 16000g, RT) wu den die Ex ak e bis zu wei e en Ve wendung bei -20°C gelage . 4.5.7. SDS-Polyac ylamidgelelek opho ese (SDS-PAGE) P o einex ak e wu den en wede du ch selbs he ges ell e 10%ige SDS-Polyac ylamidgele ode du ch G adien engele (SERVAGel™ Neu al pH 7.4 G adien ) de Fi ma Se a au ge enn . Die Elek opho ese and in en sp echenden Gelkamme n bei 100 bis 140 V in SDS-Lau pu e s a . Als Molekula gewich ss anda d wu den PageRule P es ained P o ein Ladde (10-170°kDa Fe men as) und PageRule Uns ained P o ein Ladde (Fe men as) eingese z . Ma e ialien und Me hoden 120 4.5.8. Wes e nblo und immunologische Nachweis (Immunblo ) De T ans e de gelelek opho e isch au ge enn en P o eine au eine Hybond-ECL-Ni ozellulose Memb an (GE Heal hca e) e olg e du ch Elek oblo en. Das Blo en wu de 1h bei 100 V in T ans e pu e du chge üh . Die Memb an wu de nach dem T ans e mi Ponceau S ge ä b und die Ma ke banden gg . mi einem Kugelsch eibe gekennzeichne . Du ch Spülen de Memb an in H2Odd wu de die Fä belösung wiede en e n . Unspezi ische P o einbindungss ellen wu den du ch eins ündiges Schwenken de Memb an bei RT in Milchpu e blockie . Anschließend e olg e die Inkuba ion mi dem p imä en An ikö pe in Milchpu e (0,02% (w/ ) Na iumazid) übe Nach bei 4°C. Die Memb an wu de dann d eimal ku z und zweimal 30 min un e Schü eln mi Milchpu e gewaschen. Nach 2-s ündige Inkuba ion de Memb an mi dem en sp echenden sekundä en An ikö pe in Milchpu e , wu de diese e neu d eimal mi Milchpu e gespül und d eimal 15 min gewaschen. Zule z wu de die Memb an d eimal ku z mi PBST gespül und zweimal 15 min in PBST gewaschen. De Nachweis de Mee e ich-Pe oxidase gekoppel en sekundä en An ikö pe e olg e du ch die ECL-De ek ionssys eme „ECL Plus Wes e n Blo ing De ec ion Reagen s“, ECL Ad ance Wes e n Blo ing De ec ion Reagen s“ (GE Heal hca e) und „Two Bo le Subs a e“ (p.j.k.) nach den Angaben des jeweiligen He s elle s. Die Signalde ek ion e olg e mi dem Luminescen Image Analyze LAS-4000 (Fuji Co p.) mi de dazugehö igen So wa e Image Reade LAS-4000 2.0. Zu wei e en Bea bei ung wu de Mul i Gauge (Fuji ilm) und Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) e wende . Die Blo s konn en nach „Ve gi en“ de Pe oxidaseak i i ä des sekundä en An ikö pe s mi els 1-s ündige Inkuba ion de Blo s in Michpu e (0,02% (w/ ) Na iumazid) mi wei e en p imä en An ikö pe n sondie we den. 4.5.9. De ek ion on P o einen im SDS-Gel du ch Au o adiog a ie Zu De ek ion on adioak i ma kie en P o einen wu den diese wie besch ieben mi els SDS-PAGE au ge enn . Nach Inkuba ion des Gels ü 1h in En ä belösung wu de dieses au Wha manTM Papie (Schleiche & Schuell) ge ockne und du ch Au legen eines Phosphoimage -Schi ms (Fuji Co p.) ü mindes ens 4h exponie . Die au o adiog aphische En wicklung e olg e un e Ve wendung eines FLA 7.000 Phosphoimage s (Fuji Co p.). Die wei e e Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) o genommen. 4.5.10. Silbe ä bung on SDS-Gelen Zu Silbe ä bung on SDS-Gelen wu den diese nach de Elek opho ese meh mals mi H2Odd gespül und anschließend mi dem „PageSil e Sil e S aining Ki “ (Fe men as) nach Angaben des He s elle s ge ä b . Die Digi alisie ung de Gele e olg e du ch di ek es scannen (HP, Scanne ), die Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) o genommen. 4.5.11. Kolloidale Coomassie-Blau-Fä bung on SDS-Gelen Die Fä bung on SDS-Polyac ylamidgelen mi kolloidalem Coomassie e olg e nach (Candiano e al., 2004). Dabei wu den SDS-Gele nach de Elek opho ese meh mals mi H2Odd gespül und dann übe Nach in kolloidalem Coomassie, dem ku z o Geb auch Me hanol in eine Konzen a ion on 20% ( / ) zugese z wo den wa , bei RT inkubie . Die En ä bung e olg e du ch meh ägige Inkuba ion in H2Odd. Die Digi alisie ung de Gele e olg e du ch di ek es scannen (HP, Scanne ), die Bildbea bei ung wu de mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) o genommen. Ma e ialien und Me hoden 121 4.5.12. Massenspek ome ische Analyse Zu massenspek ome ischen Analyse wu den die P o einp oben zunächs du ch SDS- Gelelek opho ese au ge enn und kolloidal Coomassie ge ä b (Punk 4.5.11). Die Gele wu den du ch Scannen (HP, Scanne ) digi alisie und mi dem P og amm Adobe Adobe Pho oshop CS3 (Adobe Sys ems Inc.) bea bei e . So konn en Be eiche ma kie we den, welche spä e analysie we den soll en. Die Gele wu den schließlich in H2Odd ge üll e En so gungsbeu el (Roche) eingeschweiß und zu Mass Spec ome y Co e Facili y des Max Planck Ins i u s nach Ma ins ied e schick , wo eine NanoLC-MS/MS-Analyse du chge üh wu de. Hie bei wu den die P o eine aus dem SDS-Gel ex ahie , yp isch e dau , du ch on-line nanoLC sepa ie und du ch elec osp ay andem Massenspek ome ie mi els eines LTQ O bi ap Massenspek ome e s analysie . 4.6. In i o In e ak ions-Assay 4.6.1. Übe p ü ung des P o einmodells on CapD3 Fü den in i o Assay wu de die einzelnen Condensin-Un e einhei en in i o ansk ibie und ansla ie . Hie zu muss en en sp echende, in i o ansk ibie ba e Plasmide he ges ell we den. Da im in i o-Sys em kein mRNA-Spleißen s a inde , muss en die Klonie ungen ausgehend on cDNA- Klonen de einzelnen Condensin-Un e einhei en du chge üh we den. Zu Ampli ika ion on SMC4 wu de hie bei selbs he ges ell e cDNA aus 4-8 S unden al en Emb yonen (T unze , pe sönliche Mi eilung) e wende . Fü die Ampli ika ion de wei e en Condensin-Komponen en wu den die in Tabelle 5 au ge üh en cDNA-Plasmide eingese z . Fü CapH2 und CapD3 sind bei lybase (www. lybase.o g) e schiedene P o einmodelle o geschlagen, die au un e schiedlichen T ansk ip ionsmodellen be uhen. Die Klonie ung on CapH2 wu de basie end au dem P o einmodell PA du chge üh . En sp echend diesem Modell wu den auch die UASP-mche y-CapH2 und UASP- EGFP-CapH2 ansgenen Fliegen gene ie (P ei e , 2009; Hä ne , 2009), de en Funk ionali ä in diese A bei bes ä ig we den konn e (siehe E gebnisse, Abschni 2.2.2.3). Fü CapD3 sind d ei e schiedene T ansk ipi ionsmodelle sowie de en ko espondie ende P o eine o geschlagen (Abbildung 32). Modell A und B un e scheiden sich hie bei nu im Be eich de 5’UTR (un ansla ed egion), die ko espondie enden P o eine CapD3-PA und CapD3-PB sind iden isch. Dem Modell RC zu Folge soll e on einem e kü z en T ansk ip die T ansla ionsini ia ion e s im Exon 2 e olgen, wobei ein N- e minal e kü z es P o ein gebilde wü de (CapD3-PC). Um die P äsenz de CapD3-T ansk ip e in D. melanogas e zu p ü en, wu den mRNA´s aus e schiedenen wild ypischen Fliegengeweben (w1-Emb yonen un e schiedlichen Al e s, w1- Fliegenweibchen, w1-Fliegenmännchen) p äpa ie und mi els e e se T ansk ip ion in cDNA umgesch ieben (Punk 4.4.9). Diese cDNA´s wu den schließlich als Ma izen ü PCR-Reak ionen eingese z . Anhand de Ampli ika ion de cDNA ü RpL32 (Ribosomal p o ein L32), welches in allen Geweben gleich abundan ansk ibie we den soll e, konn en die e hal enen cDNA´s de un e schiedlichen Fliegengewebe no mie we den. Es wu den ebenso de CapD3 cDNA-Klon RE74832 und aus adul en w1-Fliegen p äpa ie e, genomische DNA (Punk 4.4.8) als Ma izes ü die PCR eingese z . Zu PCR-Ampli ika ion wu den die in Abbildung 32 angegebenen P ime eingese z , welche an e schiedenen Be eichen des CapD3 anlage n. Du ch Ampli ika ion mi dem Oligonukleo id-Paa SaHe18/SaHe19 konn e ein P oduk in den cDNA-P oben de ühen Emb yonen und ein seh schwaches P oduk in den cDNA-P oben de Fliegenmännchen e hal en we den, dessen G öße eine Ampli ika ion on cDNA gemäß de T ansk ipi ionsmodelle RA bzw. RB en sp ich . Die Klonie ung de CapD3-Kons uk e wu de dahe basie end au dem T ansk ip ionsmodell RA bzw. RB o genommen, de en P o einmodelle übe eins immen. Re e enzen 128 6. Re e enzen Ande son, D.E., A. Losada, H.P. E ickson und T. Hi ano. 2002. Condensin and cohesin display di e en a m con o ma ions wi h cha ac e is ic hinge angles. J Cell Biol. 156:419-424. Aono, N., T. Su ani, T. Tomonaga, S. Mochida und M. Yanagida. 2002. Cnd2 has dual oles in mi o ic condensa ion and in e phase. Na u e. 417:197-202. Au ich, F. 2009. E ablie ung und Cha ak e isie ung on ansgenen D osophila melanogas e -Linien und Un e suchung de Funk ion des Condensin-Komplexes. Bachelo a bei am Leh s uhl ü Gene ik. 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Den Ex ak en de w1-O a ien wa bak e iell exp imie es mRFP1-P o ein zugese z wo den. Iden i izie e P o eine nach Immunp äzipi a ion aus EGFP-SMC4 en hal enden O a ienex ak en du ch Kaninchen-an i-EGFP Sepha ose (A4), sowie nach Immunp äzipi a ion aus mche y- CapH2 und EGFP-CapH2 en hal enden O a ienex ak en du ch Kaninchen-an i-mche y Sepha ose bzw. Kaninchen-an i-EGFP Sepha ose (A5). Die du ch die Massenspek ome ie e ass en Da en de in den P äzipi a en iden i izie en P o eine wu den wie in Abschni (siehe E gebnisse 2.2.2.1) p ozessie . Angegeben sind alle e bliebenen P o eine in alphabe ische Reihen olge, die Spezi i ä ih e Pep idmassenzuo dnung (Co e age), ih Molekula gewich (MW), de gemi el e We des Gelbe eiches, in dem die meis en Pep ide iden i izie wu den (SA), die Anzahl de Pep ide, die dem en sp echendem P o ein zugeo dne we den konn en (PEP), sowie die In ensi ä mi de die Pep ide iden i izie wu den (INT). In g au sind die im Tex e wähn en P o eine he o gehoben. A1) CapG-mRFP1-Emb yonen O bi_0112 P o ein Co e age [%] MW[kDa] SA PEP CapG PEP w1 INT CapG INT w1 Ac 5C-PA 41,2 42 6,6 17 57 1660500 27681000 alphaTub67C-PA 19,7 51 5,0 3 7 539520 1183600 alphaTub84B-PA 31,1 50 5,5 14 24 2258500 10668000 ATPsyn-be a-PA 40 54 6,0 8 16 619220 2259300 ba -PA;ba -PB 34,6 83 5,2 34 29572000 0 be aTub56D-PB 45,4 50 5,7 33 60 4094900 31003000 blw-PA 20,5 59 6,2 8 11 590120 2405000 CAP-D2-PA;bnl-PA 37,5 158 3,5 158 1 84385000 25022 Cap-G-PA 5,8 132 3,6 11 971730 0 Cc gamma-PA 17,5 59 5,0 4 10 326840 790040 CG11700-PA;CG32744-PA;Ubi-p63E-PA 22,6 34 5,4 22 20 4574000 3875400 CG15092-PA 11,6 36 6,6 3 9 347000 892580 CG6439-PA 7,8 40 7,0 2 3 121650 384930 CG6459-PA 7,2 29 8,0 2 1 625080 66440 CG6842-PA 5,4 50 3,3 7 9 828710 810100 CG6904-PA 9,9 82 5,0 6 4 482910 344180 CG8010-PA 23 44 5,0 9 10 1798000 2724800 CG8258-PA 7,7 59 5,0 2 2 97323 93201 CG8863-PA; 9,4 45 6,3 2 5 135860 535960 CG9461-PA 6,9 125 4,3 11 7 891880 525910 Chc-PA 17 191 3,0 15 26 1092100 3492100 CLIP-190-PA 20,9 189 2,3 2 47 1644500 4116600 cul-2-PA;cul-2-PB 13,8 87 5,0 8 11 833400 1411900 dap-PA 6,1 27 5,5 10 10 2295500 1982100 didum-PA 27,2 207 2,3 6 64 841530 12049000 E 1alpha48D-PA 23,3 50 6,6 9 19 1653600 7225300 E 2b-PA 10 94 5,0 9 4 1188700 478270 gammaTub37C-PA 19,9 51 6,0 5 11 322620 2260900 glu-PA 48,8 160 2,2 198 1 126540000 0 His2A:CG31618-PA 7,3 13 6,0 3 4 777640 605240 His2B:CG17949-PA 20,3 14 8,8 2 3 115230 63971 His4:CG31611-PA 17,5 11 7,4 2 5 165190 349330 Hsc70-3-PA; 25,8 72 5,0 18 17 4011800 3941500 Hsc70-4-PA 54,2 71 5,1 52 56 36548000 37354000 Hsc70-5-PA 7,1 74 6,1 8 8 772400 618480 Hsp26-PA 17,3 23 8,0 2 3 102560 219150 Hsp83-PA 10,2 82 5,0 6 6 896170 636140 Imp-PA 10,1 62 5,0 4 1 300780 27498 Ja ac1-PA;Ja ac1-PB 5,7 22 5,2 9 6 556250 381910 ja -PA 32,2 144 3,7 14 89 1440200 22498000 l(1)G0022-PA 12,2 58 5,0 5 5 410100 871480 l(1)G0156-PA;CG32026-PA 25,4 39 7,0 8 12 706560 2112500 mod(mdg4)-PF;mod(mdg4)-PA 13,6 59 5,0 7 6 421560 753840 Nap1-PA 13 43 5,6 3 6 200650 1003400 oho23B-PA 62,7 9 9,4 3 4 338160 492760 pAbp-PA 33,1 70 5,3 25 26 3823800 5736900 Pa 1-PA 7,3 79 5,0 3 8 419550 1209100 Pcm -PA 27 25 8,0 8 11 2749500 7217600 piwi-PA 5,9 97 5,0 5 2 569770 188080 pon -PA 16 50 5,0 3 7 324970 683170 Qm-PA;Qm-PB 14,7 26 7,9 5 5 1541000 2027200 Rack1-PA 25,5 36 7,0 10 9 3236700 3220900 -PA; -PB 6,1 247 1,6 13 13 1331600 1576100 sesB-PA 32,1 33 7,8 17 13 11578000 7376300 SMC2-PA 48,5 134 4,2 121 4 101560000 93326 Anhang 144 eEF1del a;CG4912 12,1 29 2 2 386290 E 1alpha48D;EF1B;F1;CG8280;E 1alpha100E;EF1a;F 2;CG1873 39,1 50 3,27 47 73740000 E 1be a;CG6341 23,4 29 2 6 2750700 E 1gamma;E 1g;CG11901 24,8 49 3 10 4941000 E 2b;CG2238 44,5 94 4,12 42 20037000 EG:118B3.2;CG13366 18,6 122 4,79 24 3809000 EG:25E8.1;CG2918;Dmel_CG2918 11,3 103 5 9 1638500 EG:34F3.8;CG12467;CG7359 9,5 25 2 2 238560 eIF-3p40 16,6 38 3 3 546390 eIF-3p66;CG10161 9,5 64 4 4 1365600 eIF3-S10;CG9805 20,3 134 5 24 4109100 eIF3-S8;Dmel_CG4954 11,1 106 4,71 16 1689600 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ien O bi_0321 P o ein Desc ip ions Co e age [%] [kDa] SA PEP E1 PEP ho E INT E1 INT ho E >14-3-3epsilon-PA 24 30 5 12 5 1543800 2265900 >14-3-3ze a-PA 11 28 5 1 2 77975 384060 >26-29-p-PA 14 62 5 8 7 1854500 1592600 >Aa s-ile-PA 5 141 3 5 2 1568200 445480 >Aa s-lys-PA 7 65 4 3 0 572960 0 >Ac 57B-PA 23 42 5 30 11 115920000 22962000 >Ac 5C-PA 71 42 5 102 67 667910000 244950000 >Ac 87E-PA 6 42 5 2 2 2868800 430640 >alphaCop-PA 19 139 3 24 6 9693600 2360000 >alpha-Spec-PA 25 278 1 63 16 31864000 9590300 >alphaTub67C-PA 22 51 5 8 4 6800200 1717700 >alphaTub84B-PA 45 50 5 30 17 58959000 25286000 >A c-p34-PA 8 35 5 0 2 0 325150 >a e -PA 14 64 4 7 0 1511600 0 >ATPsyn-be a-PA 35 54 5 13 10 8624000 3612600 >ATPsyn-gamma-PA 23 33 6 4 3 808480 362990 >aub-PA 16 99 4 15 4 5418400 910620 >awd-PA 25 19 7 3 2 276760 305960 >ba -PA 30 83 3 47 28 66636000 28864000 >bel-PA 29 85 4 25 7 14586000 2349400 >ben-PA 10 17 7 2 0 194000 0 >be aCop-PA 14 107 4 13 4 4421500 878890 >be a'Cop-PA 10 103 3 11 3 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9356700 2013200 > al-PA 22 69 4 13 5 19278000 2652000 >T ip1-PA 15 36 5 4 4 1085800 402030 >Up 1-PA 7 130 3 6 0 1422100 0 >up-PA 10 47 5 6 1 13537000 940160 >up-PF 25 47 5 27 13 44868000 18928000 > as-PA PA 7 72 4 4 1 1683700 102300 > kg-PA 5 194 1 5 9 3110800 19000000 >wal-PA 8 34 5 1 2 56545 196340 >wupA-PA 16 24 6 9 10 19639000 6776700 >yellow-g2-PA 15 43 5 5 7 1925600 2846300 >yellow-g-PA 20 43 5 5 6 5121100 4481500 >yl-PA 6 215 2 16 4 17627000 3040200 >Yp1-PA 32 49 4 20 14 29402000 12356000 >Yp2-PA 31 52 4 27 15 36722000 13558000 >Yp3-PA 32 46 4 25 10 23696000 4974500 >yps-PA 21 38 5 8 5 3620400 1680500 >zip-PB 53 231 2 395 196 1586800000 601680000 A5) che y-CapH2 und EGFP-CapH2-O a ien O bi_0498 P o ein Desc ip ions Co e age [%] [kDa] SA PEP c y PEP EGFP INT c y INT EGFP >128up-PA 18,2 41 6,4 8 5 875350 1278300 >14-3-3epsilon-PA 59,5 30 6,4 45 37 10331000 28334000 >14-3-3ze a-PD 45,6 28 7,5 12 18 3572400 6733400 >26-29-p-PA 31,5 62 6,1 34 33 8559100 8939400 >Aa s-a g-PA 8,4 76 5,0 5 1 462270 110590 >Aa s-asp-PA 13 59 4,9 5 5 568670 465530 >Aa s-ile-PA 14,6 141 3,4 18 15 1424300 2527900 >Aa s-lys-PB 14 69 4,9 9 6 1667700 1099100 >Acp65Aa-PA 18,1 11 9,0 2 2 217300 540510 >Ac 42A-PA 9,6 42 6,7 17 15 26290000 29487000 >Ac 57B-PA 39,1 42 6,4 266 148 970700000 469680000 >Ac 5C-PA 89,9 42 6,1 726 591 3083300000 2377900000 >Ac 79B-PA 27,1 42 6,3 44 28 189320000 157480000 >Ac 88F-PA 13,3 42 6,4 17 13 9795200 16742000 >Ac n-PA 55,1 104 4,6 87 46 33784000 25067000 >Adam-PA 9,7 27 7,0 2 1 213710 185740 >Adh-PC 26,2 28 7,6 9 5 466000 459600 >AGO2-PC 19,7 137 4,0 50 42 7792600 8794200 >Aldh-PA 5,8 57 5,2 6 3 1017600 865150 >alpha-Adap in-PA 11,2 106 3,9 14 2 1875800 238470 >alpha-Ca -PA 38,3 102 4,5 30 20 9335800 6764600 >alphaCop-PA 7,2 139 5,2 19 6 2323100 614570 >alpha-Spec-PA 77,4 278 2,5 1098 821 1394500000 728950000 >alphaTub67C-PA 29,7 51 5,9 23 23 4387300 5860400 >alphaTub84B-PA 43,6 50 6,1 86 58 40872000 46215000 >Aly-PA 34,6 28 7,6 25 20 4733200 7671500 >Ance-PA 35,3 71 5,2 27 13 22701000 9503000 >Ank-PA 8,2 170 3,4 13 10 1228400 1590600 >AnnIX-PB 63,6 36 7,4 41 33 46954000 70429000 >AnnX-PA 69,4 36 7,2 46 43 14407000 57804000 >Anxb11-PA 41,6 36 6,8 36 25 9133600 6607700 >Aph-4-PA 27,5 65 5,0 11 13 1030100 2291400 >a ala 1-PC 15,3 77 4,8 9 4 1277900 313590 >A c-p20-PA 48,8 20 8,5 18 14 8909500 6350500 >A c-p34-PA 56,8 35 7,0 35 21 8342200 5984700 >A d1-PA 11,7 22 8,0 2 2 261170 249290 >A 102F-PA 23,3 21 5,7 2 4 98665 1017300 >A gk-PA 15,5 61 6,2 17 9 2216400 1840300 >a m-PA 24 91 4,2 29 16 5552600 4231800 >A p11-PA 23,3 42 6,0 10 10 2490600 3617300 >A p14D-PA 17 45 4,9 10 8 3618300 2229700 >A p66B-PA 42,3 47 6,0 21 13 20014000 6976000 >A p87C-PA 52,7 43 6,5 41 31 33212000 44562000 >A pc3A-PB 48,4 22 8,5 22 17 6975100 2205700 >ATPsyn-be a-PA 56 54 5,5 70 54 24496000 32156000 >ATPsyn-b-PA 21,4 27 7,9 6 6 910850 484720 Anhang 151 >ATPsyn-d-PA 20,8 20 8,0 3 3 322680 445550 >ATPsyn-gamma-PA 32,7 33 7,6 15 12 2594100 2108800 >aub-PA 26,4 99 4,2 26 13 4947100 4050300 >awd-PA 30,2 19 8,1 13 7 829640 609170 >bai-PA 18 24 8,8 9 7 2338100 2046900 >ball-PA 7,3 66 5,0 4 4 386990 833270 >Bap-PA 25 101 4,2 27 13 5716700 3183100 >bel-PA 48,9 85 5,1 118 98 91818000 68574000 >ben-PA 29,8 17 9,0 3 3 648390 296530 >be aCop-PA 36,4 107 4,4 73 44 25004000 18401000 >be a-Spec-PA 66,1 266 2,6 805 599 890100000 448730000 >be aTub56D-PB 62,2 50 6,1 133 97 69037000 84408000 >be aTub97EF-PA 15,7 59 5,5 30 22 7394200 9034400 >BicC-PA 23,3 98 4,8 26 20 4073000 3965000 >bic-PA 78,7 18 8,2 22 19 8101100 7132200 >Bin1-PA 7,3 17 9,0 3 3 318490 309850 >blw-PA 34,8 59 6,0 41 38 17101000 21979000 >bocksbeu el-PB 6,5 44 7,8 2 4 89888 231360 >bonsai-PA 8,2 33 7,0 2 2 48103 109520 >bo -PA 50,5 68 5,2 51 40 19957000 18049000 >bs -PA 26 157 3,3 23 28 6066900 4258400 >Bsg-PG 15,8 32 6,4 3 6 334780 843190 >bu -PA 5,5 76 5,0 3 1 261790 110940 >CaBP1-PA 8,1 47 6,1 4 5 748820 1479500 >Ca 1-PA 5,8 49 5,8 2 2 266500 120710 >Cam-PA 98,7 17 8,7 55 42 112490000 67294000 >CapH2 29,9 110 4,6 109 65 42097000 14688000 >ca hD-PA 26,8 42 6,6 14 15 1837700 3930400 >Cc gamma-PA 13,1 59 5,0 8 6 971050 2222200 >cdc2-PA 11,8 34 7,0 3 3 200110 307580 >CG10031-PA 16,3 14 9,0 2 2 354620 528710 >CG10077-PA 26,8 88 5,1 36 23 6923600 7174100 >CG10116-PA 30,4 31 7,0 6 5 2579200 1677800 >CG10237-PB 31,8 38 7,1 10 8 2420100 1929800 >CG10289-PA 5,2 111 3,4 6 2 1126800 227430 >CG10306-PA 45 26 8,1 15 12 5800400 3284600 >CG10407-PA 6,2 30 8,0 2 2 140580 169530 >CG10469-PA 16,1 30 7,0 4 1 990390 0 >CG10470-PA 22,4 21 8,4 6 4 1017400 493520 >CG10472-PA 17,6 31 7,7 5 7 1537600 1520500 >CG10527-PA 35,5 32 7,1 12 13 1225100 4640900 >CG10540-PA 78 33 6,6 51 39 73322000 53643000 >CG10565-PA 13 74 4,9 9 4 1299500 421860 >CG10576-PA 19,2 43 5,9 9 7 1542500 1603500 >CG10627-PA 31,5 61 5,0 15 11 3199900 2418900 >CG10641-PA 51,2 25 8,0 7 8 1371400 1049000 >CG10664-PA 19,8 21 8,9 5 5 2366700 1725100 >CG10672-PA 25,6 34 8,0 8 9 1326900 1832600 >CG10680-PA 16,3 28 7,0 1 3 23343 291650 >CG10724-PA 32,9 67 5,0 20 13 5488600 2267400 >CG10911-PA 23,1 38 3,4 18 16 22713000 11868000 >CG10912-PA 16,2 30 4,8 6 3 2688600 2208200 >CG1091-PB 7,1 64 5,0 5 4 771310 622840 >CG10990-PA 5,1 56 4,7 4 3 378770 286810 >CG10992-PA 7,6 37 8,1 5 2 343370 194120 >CG11015-PA 20 14 9,0 2 2 228440 261850 >CG11092-PA 7,2 94 4,2 4 2 685810 448710 >CG11107-PA 12,8 83 5,0 8 7 910520 1056100 >CG11137-PA 36,1 18 8,8 5 4 373850 331180 >CG11241-PA 6,7 56 6,0 2 3 451900 658910 >CG1146-PA 7 36 9,0 2 1 162090 41862 >CG11669-PA 29,9 67 4,8 18 5 11176000 1540900 >CG11837-PA 7,5 35 7,0 2 2 265300 338220 >CG11844-PB 21,2 49 6,0 6 7 1493200 2340500 >CG11875-PA 29,1 35 7,0 6 11 967200 1947400 >CG11876-PA 26,8 39 6,9 9 9 5688600 9695300 >CG11909-PA 25,6 75 5,0 16 8 5969000 1061100 >CG11999-PA 16,7 24 8,0 3 3 659540 837270 >CG12042-PA 45,5 58 5,6 23 19 4875400 5713800 >CG12079-PA 14,7 30 8,0 3 3 305950 205510 >CG12114-PA 11,5 41 7,1 8 6 380240 750130 >CG12128-PA 12,4 54 5,1 5 4 508360 545750 >CG12139-PB 6,4 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6 5 590120 835010 >CG13887-PB 10,1 26 8,0 2 3 585230 298120 >CG13997-PA 22,1 19 8,7 2 1 133320 47008 >CG14120-PA 9,4 151 2,0 13 13 1832900 1615600 >CG14207-PA 47,5 21 8,1 9 7 3012400 3017400 >CG14213-PA 11,8 34 7,0 2 3 195170 673180 >CG14224-PA 8,2 59 5,0 3 3 235780 356560 >CG14309-PA 21,7 107 6,3 31 26 7308400 10157000 >CG1444-PA 13,4 35 7,0 3 3 127730 242930 >CG14516-PB 6,3 115 3,6 7 9 910860 1673700 >CG14544-PA 18,3 35 7,0 4 2 434570 198670 >CG14648-PA 50,6 60 5,3 52 33 34224000 34711000 >CG14816-PA 38,1 33 7,2 18 11 2668200 2220000 >CG14820-PA 14,9 48 7,0 3 3 383650 409950 >CG14872-PB 7,1 35 7,0 1 2 31259 150780 >CG15019-PA 19,9 17 8,8 3 2 156310 112330 >CG15092-PA 16,2 36 6,9 18 14 3201800 2260800 >CG15100-PA 10,3 112 4,0 9 4 1386300 610600 >CG15255-PA 29,1 29 8,1 12 9 4241700 3649600 >CG15293-PA 12,3 37 6,7 2 4 235940 786780 >CG15347-PA 16,4 23 6,6 5 5 1404400 1605900 >CG15721-PA 6,3 93 1,0 4 5 772940 503320 >CG15818-PA 11,7 32 7,0 3 3 218960 294430 >CG15820-PA 6,5 35 8,3 3 1 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