Die ex azellulä e Domäne de humanen Guanyla zyklase C und ih e Liganden:
Rekombinan e Exp ession, s uk u elle Cha ak e isie ung und
Ak i i ä sbes immung
Disse a ion
zu E langung des Dok o g ades
de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en
de Uni e si ä Bay eu h
o geleg on
Dipl.-Biochem.
Philipp Richa d Weiglmeie
aus Neuns e en
Bay eu h, 2013
Die o liegende A bei wu de on No embe 2008 bis Sep embe 2013 in Bay eu h am Leh s uhl
ü S uk u und Chemie de Biopolyme e un e Be euung on He n P o esso D . Paul Rösch
ange e ig .
Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de
Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines
Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na .).
Disse a ion einge eich am: 10.09.2013
Zulassung du ch die P omo ionskommission: 20.09.2013
Wissenscha liches Kolloquium: 05.02.2014
Am ie ende Dekan: P o . D . Rhe Kempe
P ü ungsausschuss:
P o . D . Paul Rösch (E s gu ach e )
P o . D . Clemens S eegbo n (Zwei gu ach e )
P o . D . Ma hias B euning (Vo si z)
P o . D . Ma hias Ullmann
„We shall no cease om explo a ion,
and he end o all ou explo ing
will be o a i e whe e we s a ed
and know he place o he i s ime.“
T. S. Elio , 1942

Inhal s e zeichnis I
Inhal s e zeichnis
1 Einlei ung........................................................................................................................................1
1.1 Ve b ei ung und Un e scheidung E. coli-induzie e sek e o ische Dia höen.......................1
1.2 E. coli hi zes abile En e o oxine..............................................................................................3
1.3 S uku on STa.......................................................................................................................4
1.4 Die Pep idho mone Guanylin und U oguanylin......................................................................7
1.5 Die Humane Rezep o -Guanyla zyklase C..............................................................................9
1.5.1 Regula ion de in es inalen Sek e ion du ch GC-C..........................................................9
1.5.2 Die Domänens uk u on GC-C...................................................................................12
1.5.3 MiniGC-C......................................................................................................................15
1.6 STa- und U oguanylin-Analoga als Wi ks o e zu Behandlung ch onische Ve s op ung
und des Reizda msynd oms...........................................................................................................16
1.7 Agonis en on GC-C als Diagnos ika und The apeu ika ü kolo ek ale Ka zinome..........17
2 Zielse zung....................................................................................................................................20
3 Ma e ial und Me hoden.................................................................................................................21
3.1 Bak e ien- und He es ämme, Säuge zelllinien......................................................................21
3.1.1 E. coli XL1 Blue und Top10..........................................................................................21
3.1.2 E. coli O igami B (DE3)................................................................................................21
3.1.3 P. pas o is GS115...........................................................................................................22
3.1.4 T84.................................................................................................................................22
3.1.5 COS-7.............................................................................................................................22
3.1.6 HEK 293T......................................................................................................................23
3.2 Plasmide.................................................................................................................................23
3.2.1 pET32a...........................................................................................................................25
3.2.2 pET43.1a-NusA-C489A und pET43.1a-NusA-Cys-.....................................................26
3.2.3 pPIC9K...........................................................................................................................27
3.2.4 pCMV_N xn..................................................................................................................28
3.3 Oligonukleo ide.....................................................................................................................29
3.4 Näh medien............................................................................................................................30
3.4.1 Näh medien ü E. coli...................................................................................................30
3.4.2 Näh medien ü P. pas o is............................................................................................31
3.4.3 Näh medien und Chemikalien ü die Kul u on Säuge zellen....................................33
3.5 Enzyme, P o eine, Ki s und S anda ds...................................................................................34
II Inhal s e zeichnis
3.6 Sons ige Chemikalien............................................................................................................35
3.7 Sons ige Ma e ialien..............................................................................................................35
3.8 Bes immung de Zelldich e on Bak e ien und He en..........................................................36
3.9 Konzen a ion on P o einen.................................................................................................37
3.10 Gelelek opho ese................................................................................................................37
3.10.1 Aga ose-Gelelek opho ese on DNA.........................................................................37
3.10.2 SDS-Polyac ylamid-Gelelek opho ese on P o einen................................................38
3.10.3 Wes e n Blo .................................................................................................................39
3.11 P äpa a ion on Plasmid-DNA............................................................................................41
3.12 Elek o ans o ma ion on Plasmid-DNA in Bak e ien und He en.....................................41
3.13 Fällung on DNA.................................................................................................................42
3.14 Ex ak ion on DNA aus Aga osegelen...............................................................................42
3.15 Enzyma ische Behandlung on DNA .................................................................................43
3.15.1 Res ik ion....................................................................................................................43
3.15.2 Dephospho ylie ung on 5'-Enden...............................................................................43
3.15.3 Liga ion........................................................................................................................44
3.15.4 Polyme ase-Ke en eak ion..........................................................................................44
3.15.5 O sge ich e e Mu agenese...........................................................................................45
3.16 Glyce in-Daue kul u en on E. coli-Klonen.......................................................................45
3.17 Exp ession on T x-P ou oguanylin, T x-P ou o-STh und ih e mu ie en Va ian en.....46
3.18 Lyse de Zellen und Reinigung de Fusionsp o eine...........................................................47
3.19 En e nen des Fusionsanhangs T x......................................................................................48
3.19.1 Behandlung mi P eScission-P o ease.........................................................................48
3.19.2 Isolie ung des P o eins ohne Fusionspa ne ...............................................................48
3.20 F eise zung de Pep ide........................................................................................................49
3.20.1 T ypsin-Ve dau.............................................................................................................49
3.20.2 Re e sed-phase high pe o mance liquid ch oma og aphy (RP-HPLC).....................49
3.21 Nachweis de biologischen Ak i i ä ...................................................................................50
3.21.1 Kul i ie ung on T84 Zellen........................................................................................50
3.21.2 DMSO-Daue kul u en on euka yo ischen Zellen......................................................51
3.21.3 In i o Ak i i ä s es ....................................................................................................52
3.22 Exp ession on NusA-C489A-MiniGC-C...........................................................................53
3.23 Reinigung on NusA-C489A-MiniGC-C............................................................................53
3.24 En e nen des Fusionsanhangs NusA-C489A......................................................................54
Inhal s e zeichnis III
3.24.1 P eScission-Ve dau......................................................................................................54
3.24.2 Reinigung on MiniGC-C............................................................................................54
3.25 Exp ession on NusA-Cys--ECD-GC-C und T x-ECD-GC-C............................................55
3.26 Reinigung on T x-ECD-GC-C...........................................................................................55
3.27 Reinigung on ECD-GC-C aus NusA-Cys--ECD-GC-C.....................................................56
3.28 Anzuch on P. pas o is.......................................................................................................57
3.29 Glyce in-Daue kul u en on P. pas o is Klonen.................................................................57
3.30 In i o Selek ion on P. pas o is Klonen mi mul iplen Plasmidinse ionen......................57
3.31 Selek ion on Klonen mi dem Me hanol-Abbau-Phäno yp Mu +......................................58
3.32 Exp essions es s on P. pas o is in Schü elkul u en...........................................................58
3.33 Fe men a ion on P. pas o is ..............................................................................................59
3.34 Exp ession on ekombinan en P o einen in COS-7 und HEK 293T.................................60
3.34.1 Zellanzuch ...................................................................................................................60
3.34.2 T ans ek ion und P o einexp ession.............................................................................60
3.34.3 Reinigung on sek e ie em P o ein aus dem Kul u übe s and....................................61
3.34.4 Th ombin-Spal ung......................................................................................................62
3.35 G ößenausschluss-Ch oma og aphie...................................................................................62
3.36 Massenspek ome ie...........................................................................................................63
3.37 CD-Spek oskopie................................................................................................................63
3.37.1 P oben o be ei ung......................................................................................................63
3.37.2 Messbedingungen.........................................................................................................64
3.38 NMR-Spek oskopie............................................................................................................64
3.38.1 P oben o be ei ung......................................................................................................64
3.38.2 Allgemeine Messbedingungen und Ve ah en.............................................................65
3.38.3 P ozessie ung und Analyse on NMR-Spek en..........................................................66
3.38.4 Homonuklea e Expe imen e.........................................................................................66
3.38.5 He e onuklea e Expe imen e........................................................................................67
3.38.6 Au nahmepa ame e de in diese A bei gemessenen NMR-Expe imen e.................68
3.38.7 Homonuklea e Zuo dnung...........................................................................................69
4 E gebnisse......................................................................................................................................71
4.1 Rekombinan e Exp ession und Cha ak e isie ung on humanem U oguanylin....................71
4.1.1 Reinigungss a egie ü ekombinan es U oguanylin.....................................................71
4.1.2 Exp ession in E. coli O igami B (DE3).........................................................................72
4.1.3 Reinigung on ekombinan em P ou oguanylin............................................................73
4 1 Einlei ung
s imulie . Dies üh zu eine on de cAMP-abhängigen P o einkinase A (PKA) e mi el en
Ak i ie ung on Ionenkanälen und schließlich zu Sek e ion on Anionen ins Da mlumen. LT und
das Chole a oxin aus V. chole ae sind sich in Sequenz (80% Iden i ä ), S uk u und
Wi kmechanismus seh ähnlich (Spangle , 1992). Die hi zes abilen En e o oxine sind kleine
cys ein eiche Pep ide de en namensgebendes Cha ak e is ikum die Ta sache is , dass sie im
Gegensa z zu LT selbs nach 60-minü ige Inkuba ion bei 95 °C noch ih e Ak i i ä behal en (Sack,
1975; G eenbe g & Gue an , 1981). Es we den zwei Klassen on ST un e schieden, die sich
sowohl in S uk u als auch Wi kmechanismus deu lich un e scheiden: STa binde an die in es inale
Rezep o -Guanyla zyklase C und induzie Dia hö du ch eine on 3',5'-zyklischem
Guanosinmonophospha (cGMP) abhängige Ak i ie ung des Anionenkanals CFTR (engl. cys ic
ib osis ansmemb ane conduc ance egula o ). Dagegen is die Wi kung on STb unabhängig on
zyklischen Nucleo iden und wi d on eine E höhung de in azellulä en Ca2+-Konzen a ion
e mi el (D ey us e al., 1993). STb wi d mi Dia höen bei Schweinen in Ve bindung geb ach
und wu de bishe noch nich als Auslöse menschliche E k ankungen iden i izie (Lo ie e al.,
1991). Die olgende A bei beschä ig sich ausschließlich mi hi zes abilen En e o oxinen des STa-
Typs (Weiglmeie e al., 2010).
Neben ETEC wu den eine Reihe wei e e Da mbak e ien iden i izie , welche hi zes abile
En e o oxine sek e ie en, die en wede mi STa iden isch ode seh homolog sind. Dazu zählen
S ämme on Ye sinia en e ocoli ica (Takao e al., 1984; Pai & Mo s, 1978), Klebsiella pneumoniae
(Klips ein e al., 1983; Albano e al., 2000), Ci obac e eundii (Gua ino e al., 1987), Vib io
chole ae (Takeda e al., 1991; Takao e al., 1985) und Vib io mimicus (A i a e al., 1991).
En e oagg ega i e E. coli exp imie en das hi zes abile En e o oxin EAST1 welches eben alls
s uk u elle Ähnlichkei en zu STa au weis und ü dessen Wi kung de gleiche Mechanismus
angenommen wi d (Sa a ino e al., 1993a; Mena d & Dub euil, 2002; Mena d e al., 2004).
1.3 S uku on STa
Zwei molekula e Spezies on STa wu den in ETEC-S ämmen iden i izie und mi STp (po cine)
und STh (human) bezeichne , da sie jeweils zue s in aus Schweinen bzw. Menschen isolie en
S ämmen en deck wu den. Beide Va ian en wi ken jedoch gleiche maßen pa hogen in Menschen.
Sie bes ehen aus 18 (STp) bzw. 19 (STh) Aminosäu en und en hal en jeweils sechs Cys eine,
welche in einem cha ak e is ischen 1-4/2-5/3-6 Mus e Disul idb ücken ausbilden (Shimonishi e
al., 1987) (Abb. 1.2). Dieses Ve b ückungsmus e e leih den Pep iden ih e auße o den liche

1 Einlei ung 5
Hi zes abili ä und schü z sie o p o eoly ischem Abbau. De 13 Aminosäu en lange
Sequenzbe eich de STa-Pep ide, de die d ei Cys inb ücken en häl , is in den e schiedenen
Pep iden s a k konse ie und wi d als oxische Domäne bezeichne , da e no wendig und
hin eichend ü die En e o oxizi ä de Pep ide is (Yoshimu a e al., 1985). Die oxische Domäne
weis g oße Ähnlichkei mi Sequenzbe eichen de Pep idho mone Guanylin (Cu ie e al., 1992)
und U oguanylin (Ham a e al., 1993) aus Säuge ie en au (Abb. 1.2). Diese eben alls
cys ein eichen Pep ide sind die endogenen Liganden de Guanyla zyklase C und dami wesen lich
an de Regula ion des Elek oly haushal s im Da m be eilig . Sie en hal en zwei Disul idb ücken die
in einem 1-3/2-4 Mus e angeo dne sind. Zule z wu de im Opossum das Pep id Lymphoguanylin
au mRNA-Ebene iden i izie und als wei e e Ve e e diese G uppe on pa ak inen Ho monen
o geschlagen (Fo e e al., 1999).
STa-Bindung an GC-C üh zu de en Übe ak i ie ung und dami zu eine e s ä k en Sek e ion on
Ionen und H2O ins Da mlumen. Die S uk u on STa is den S uk u en de ak i en Ho mone
Guanylin und U oguanylin seh ähnlich (Abb. 1.3). Das p o eoly isch s abile STa wi k als
langlebige Supe agonis on Guanylin und U oguanylin (Ca pick & Ga iepy, 1993). Die
s uk u elle Ähnlichkei zwischen den Pep idho monen Guanylin und U oguanylin au de einen
Sei e und den hi zes abilen En e o oxinen au de ande en Sei e deu e au eine kon e gen e
Abb. 1.2: P imä s uk u en bak e ielle hi zes abile En e o oxine sowie de endogenen
Pep idho mone Guanylin, U oguanylin und Lymphoguanylin. Disul idb ücken sind du ch
Klamme n angedeu e und die Ke n egionen bzw. oxischen Domänen sind un e leg .
6 1 Einlei ung
E olu ion beide Pep idg uppen hin und STh gil als Beispiel molekula en Mimik ys, das hie on
Bak e ien eingese z wi d um die eigene Ve b ei ung zu gewäh leis en (Lin e al., 2010b). Dies
spiegel sich auch im ela i en Bei ag wide , den die einzelnen Disul idb ücken on STa zu
Ak i i ä des Pep ids leis en. Expe imen e, bei denen Disul idb ücken du ch paa weisen Aus ausch
on Cys ein du ch Alanin aus STa eliminie wu den, haben gezeig , dass ein ak i es Pep id
mindes ens die 2-5-Disul idb ücke sowie eine wei e e Disul idb ücke en hal en muss. Dabei is ein
STa-Analogon, welches die beiden in Guanylin und U oguanylin ealisie en Disul idb ücken (2-
5/3-6) en häl , in kompe i i en Radioligandenbindungs es s e wa 130 mal schwäche ak i als STa,
wäh end ein Pep id welches die 1-4/2-5 Konnek i i ä en en häl , e wa 4200 mal schwäche ak i als
STa is (Ga iepy e al., 1987; Yamasaki e al., 1988; Tian e al., 2008).
S uk u ell bes eh STh aus eine ech shändigen Spi ale, die du ch die Cys ine s abilisie wi d. Das
Pep id ückg a bilde zwischen Cys-6 und Cys-10 eine 310-Helix, sowie eine ß-Keh e om Typ I
zwischen Asn-12 und Cys-15 und eine ß-Keh e om Typ II zwischen Cys-15 und Cys-18 (Ozaki e
al., 1991). Die Disul idb ücke zwischen Cys-5 und Cys-11 ha eine bei P o einen sel ene
ech shändige Kon o ma ion, wäh end sich die ande en beiden Disul idb ücken in eine
linkshändigen Spi ale ano dnen (Sa o e al., 1994), die bei P o einen wei häu ige anzu e en is
(Richa dson, 1981). Die S uk u wi d du ch Wasse s o b ückenbindungen s abilisie , die
meh hei lich on den Pep idg uppen des Rückg a s gebilde we den. Das Gesam pep id is ela i
hyd ophob, da alle Sei enke en nach außen o ien ie sind. Dadu ch e klä sich, dass STa im
Gegensa z zu STb in Me hanol löslich is (Nai & Takeda, 1998). Die ß-Keh e, die on Asn-12,
Abb. 1.3: Ve gleich de Lösungss uk u on STh(6-19) (Ma ecko e al., 2008), de
K is alls uk u on STp(5-17) (Ozaki e al., 1991) (PDB: 1ETN) und de Lösungss uk u on
humanem U oguanylin (Ma x e al., 1998) (PDB: 1UYA). Die Rezep o bindungs egionen sind
mi Sei enke en in o da ges ell .
1 Einlei ung 7
P o-13 und Ala-14 gebilde wi d (Ma ecko e al., 2008) gil als Rezep o bindungss elle.
Punk mu a ionen on Asn-12 ode Ala-14 üh en zu eine s a k e minde en Bindung on STh an
GC-C (Ca pick & Ga iepy, 1991). Auch ü den Sequenzabschni on Cys-6 bis Leu-9 wu de ein
Bei ag zu Bindung an den Rezep o o ausgesag (Wol e e al., 2002).
1.4 Die Pep idho mone Guanylin und U oguanylin
Sowohl Guanylin als auch U oguanylin wu den als endogene Liganden on GC-C iden i izie
(Kha e e al., 1994; Ki a e al., 1994). Die Gene beide Pep ide, GUCA2A und GUCA2B, sind bei
Menschen au dem Ch omosom 1 in enge Nachba scha zueinande kodie (Whi ake e al.,
1997). Was ih e Exp essionsmus e und ih e Ve eilung in e schiedenen Geweben angeh ,
un e scheiden sie sich jedoch deu lich oneinande . So konn e Guanylin bei Ra en sowohl im
Dünnda m als auch im Dickda m, nich jedoch im U in, nachgewiesen we den. U oguanylin wu de
dagegen im Zwöl inge da m und U in, jedoch nich im Kolon ge unden (Fan e al., 1997).
Daneben wu de U oguanylin in den Nie enkanälchen und im Magen iden i izie (Nakaza o e al.,
1998). Guanylin wi d on den sog. Beche zellen des Dünn- und Dickda ms, die auch ü die
Schleimbildung e an wo lich sind, sek e ie (Cohen e al., 1995; Li e al., 1995). Dagegen sind
en e och oma ine Zellen ü die P oduk ion on U oguanylin zus ändig. Diese is im Jejunum am
höchs en und nimm in Rich ung des dis alen Dünnda ms ab (Pe kins e al., 1997). Das
Exp essionsmus e beide Ho mone spiegel Un e schiede in de pH-Abhängigkei ih e Ak i i ä
wide . Wäh end Guanylin im leich basischen Milieu, bei e wa pH 8, mi de höchs en A ini ä an
den Rezep o GC-C binde , lieg das pH Op imum ü die U oguanylin-Bindung im Sau en, bei
e wa pH 5 (Ham a e al., 1997). Beim Opossum wu de au mRNA-Ebene ein wei e es zu
U oguanylin homologes Ho mon iden i izie , das eben alls GC-C ak i ie en kann (Fo e e al.,
1999; Fon eles e al., 2001), jedoch wu de das en sp echende Pep id bishe nich di ek
nachgewiesen.
Nach de Au nahme g öße e Mengen Salz we den Guanylin und U oguanylin in das Da mlumen
abgegeben, wo sie die Abso p ion on Na+ inhibie en und zu eine e s ä k en Sek e ion on Cl-
und Wasse üh en (Sindic & Schla e , 2005; Fon eles & do Nascimen o, 2011). Daneben we den
sie abe auch in den Blu s om abgegeben und eiche n sich in de Nie e an, wo sie zu Exk e ion
on Na+ und K+ üh en (S einb eche e al., 2001; Sindic & Schla e , 2005; Moss e al., 2008). Die
na iu e ischen und diu e ischen E ek e on Guanylin und U oguanylin we den in de Nie e du ch
einen cGMP-abhängigen Mechanismus he o ge u en, de jedoch nich on GC-C e mi el wi d
8 1 Einlei ung
(Ca i he s e al., 2004; Sindic e al., 2005). Daneben gib es Hinweise au einen zwei en cGMP-
unabhängigen Signalweg, de einen G-P o ein-gekoppel en Rezep o und die Ak i ie ung on
Phospholipase A2 einschließ (Sindice e al., 2002; Sindic e al., 2005).
Au g und des 1-3/2-4 Disul id e b ückungsmus e s on Guanylin und U oguanylin is bei beiden
Pep iden eine Fo m opologische S e eoisome ie ausgebilde . Die Pep ide kommen in je zwei
Kon o ma ionen o : eine ak i en A-Fo m und eine inak i en B-Fo m (Skel on e al., 1994 ; Ma x
e al., 1998). Die isome e Umlage ung zwischen beiden Fo men spiel sich bei Guanylin au eine
Zei skala on Minu en ab, wäh end sie bei U oguanylin inne halb einige Tage geschieh (Klod e
al., 1997). Die Kine ik dieses Übe gangs wi d dabei sowohl om pH als auch on s e ischen
Ein lüssen de Aminosäu en in de Pep idsequenz bes imm . So wu de bei U oguanylin beobach e ,
dass die Umlage ung bei pH 4,5 wesen lich schnelle e läu als bei pH 7,7 (Ma x e al., 1998).
Auße dem wu de gezeig , dass o allem die Sei enke en on Aminosäu en im C- e minalen Teil
on Guanylin und U oguanylin die jeweiligen In e kon e sionskine iken beein lussen (Schulz e al.,
2005). Die langsame e Umlage ung on U oguanylin gegenübe Guanylin kann au eine e s ä k e
s e ische Hinde ung du ch die zusä zliche C- e minale Aminosäu e Leucin zu ückge üh we den
(Schulz e al., 1998).
Sowohl Guanylin als auch U oguanylin sind als 116 bzw. 112 Aminosäu en lange P äp oho mone
kodie (de Sau age e al., 1992; Hill e al., 1995). Die Ho monsequenzen be inden sich am C-
Te minus de jeweiligen Vo läu e p o eine. Diese en hal en neben eines amino e minalen
Sek e ionssignal (P ä-Sequenz), das wäh end des Expo s abgespal en wi d, noch eine sog.
P osequenz, die als in amolekula es Chape on die Fal ung und ko ek e Disul id e b ückung de
e minalen Ho mone e möglich (Hidaka e al., 1998; Schulz e al., 1999). Nach de Sek e ion de
selbs inak i en P oho mone ins Da mlumen und den Blu s om we den die Ho mone e s do
p o eoly isch eigese z (Ma in e al., 1999). Es is bishe nich geklä , welche P o easen ü die
P ozessie ung de P oho mone e an wo lich sind. Neben dem 15 Aminosäu en langen Guanylin
und dem 16 Aminosäu en langen U oguanylin (Abb. 1.2) wu den auch länge ke ige F agmen e, die
die Ho monsequenzen en hal en, isolie (de Sau age e al., 1992; Hess e al., 1995).
Die Lösungss uk u on P oguanylin e klä die essen ielle Rolle, die den P osequenzen bei de
Fal ung on Guanylin und U oguanylin zukomm (Laube e al., 2003). In Fo m des P oho mons is
Guanylin du ch Wechselwi kungen inne halb eines zusammen mi dem Amino e minus gebilde en
β-Fal bla s in seine ak i en Topologie ixie . Da dabei ein Teil de Ho monobe läche on de
P o egion e deck is , sind die P oho mone selbs nich bioak i (Ga cia e al., 1993; Schulz e al.,
1999).
1 Einlei ung 9
1.5 Die Humane Rezep o -Guanyla zyklase C
Als bishe einzige Rezep o ü hi zes abile En e o oxine wu de die Guanyla zyklase C iden i izie
(Schulz e al., 1990; de Sau age e al., 1991; Vaand age e al., 1993). Guanyla zyklasen sind in
eine Vielzahl on Geweben exp imie und de on ihnen aus GTP gebilde e second messenge
cGMP spiel eine wich ige Rolle bei de Regula ion iele physiologische P ozesse (Lucas e al.,
2000). Man un e scheide zwischen löslichen Guanyla zyklasen und T ansmemb anp o einen, die
eine in azellulä e Guanyla zyklase-Domäne besi zen. GC-C gehö zu zwei en G uppe. Die
Familie de memb angebundenen Guanyla zyklasen wu de in e s e Linie bei Säuge ie en
besch ieben, jedoch gib es auch homologe Ve e e in ande en Wi bel ie klassen (Nakauchi &
Suzuki, 2005). Es sind sieben humane Guanyla zyklasen bekann , die diese G uppe zuge echne
we den können und mi GC-A bis GC-G bezeichne we den. GC-A und GC-B wa en die e s en
Guanyla zyklasen, die gleichzei ig auch als Rezep o en ü na iu e ische Pep idho mone
iden i izie wu den (Kuno e al., 1986; Paul e al., 1987; Schulz e al., 1989). Sie sind an de
Regula ion on Blu d uck, Na ium-Exk e ion und Vasodila a ion be eilig .
Im Gegensa z zu GC-A, GC-B und GC-C wu den ü die ande en Guanyla zyklasen keine
ex azellulä en Liganden ge unden. GC-D, GC-E und GC-F we den auch als senso ische
Guanyla zyklasen bezeichne , weil sie an de Regula ion de ol ak o ischen (GC-D) und isuellen
(GC-E und GC-F) Sinneswah nehmung be eilig sind (Meye e al., 2000; Duda & Sha ma, 2008).
GC-D wi d in Ge uchssinneszellen exp imie , wäh end GC-E und GC-F in den S äbchenzellen de
Re ina o kommen (Shyjan e al., 1992; Fulle e al., 1995; Lowe e al., 1995). GC-G wu de u. a. in
Ne enzellen nachgewiesen, jedoch is ih e physiologische Funk ion nich bekann (Schulz e al.,
1998; Fleische e al., 2009).
1.5.1 Regula ion de in es inalen Sek e ion du ch GC-C
GC-C wi d sowohl im Dünnda m als auch im Dickda m exp imie (de Jonge, 1975; K ause e al.,
1994a), jedoch nimm die Rezep o dich e en lang de longi udinalen Achse des Da ms, om
Jejunum bis zum dis alen Colon, ab (K ause e al., 1994b). Die gewebespezi ische Exp ession on
GC-C wi d u. a. on den T ansk ip ions ak o en HNF-4 und Cdx2 egulie (Swenson e al., 1999;
Pa k e al., 2000).
Zwa zeigen GC-C knockou Mäuse keine lei K ankhei ssymp ome, jedoch kann bei ihnen im
Gegensa z zu Wild yp-Mäusen keine lei STa-induzie e Sek e ionsan wo beobach e we den
(Mann e al., 1997; Cha ney e al., 2001).

10 1 Einlei ung
GC-C nimm eine wich ige physiologische Rolle bei de Regula ion des Elek oly - und
Wasse haushal s im Da m ein. Die Wechselwi kung on GC-C mi den pa ak inen Ho monen
Guanylin und U oguanylin se z eine Signalkaskade in Gang, an de en Ende Anionen wie Cl- und
HCO3- ins Da mlumen sek e ie we den (Abb. 1.4). De ak i e T anspo on Elek oly en ins
ex azellulä e Medium wi d on eine passi en Abgabe on Wasse beglei e . Dami egulie en
Guanylin und U oguanylin sowohl Fluidi ä als auch pH-We des Da minhal s. Übe ak i ie ung
on GC-C du ch die Supe agonis en STa bilde die molekula e G undlage on du ch ETEC
induzie en Dia hö-E k ankungen.
Nach Bindung on Pep idliganden an die ex azellulä e Domäne on GC-C komm es zu eine
Kon o ma ionsände ung und zu Ak i ie ung de in azellulä en ka aly ischen Domäne, wo au die
Konzen a ion on in azellulä em cGMP zunimm . Die cGMP-abhängige P o einkinase II (PKGII),
die einen N- e minalen My is oylanke äg und an de apikalen Plasmamemb an lokalisie is
(Vaand age e al., 1998), wi d ak i ie und phospho ylie den CFTR (Vaand age e al., 1997a;
Vaand age e al., 1997b), einen Anionen-Kanal de Cl- ins Da mlumen anspo ie (Os edgaa d e
Abb. 1.4: Ve ein ach e Da s ellung de du ch GC-C-Ak i ie ung s imulie en Elek oly -
Sek e ion (Weiglmeie e al., 2010). CFTR: cys ic ib osis ansmemb ane conduc ance
egula o ; NHE3: Na+/H+-Aus ausche 3; PKGII: cGMP-abhängige P o einkinase II; PKA:
cAMP-abhängige P o einkinase; PDE3: on cGMP inhibie e Phosphodies e ase 3.
1 Einlei ung 11
al., 2001). Daneben inhibie cGMP die cAMP-Hyd olyse du ch Phosphodies e ase PDE3
(Vaand age e al., 2000; O'G ady e al., 2002), so dass es zusammen mi cGMP auch zu einem
Ans ieg de in azellulä en cAMP-Konzen a ion komm . cAMP sowie hohe Konzen a ionen on
cGMP ak i ie en die P o einkinase A, welche ih e sei s CFTR du ch Phospho ylie ung ak i ie en
kann (Chao e al., 1994). Auße dem phospho ylie PKA den Na+/H+-Aus ausche NHE3, wodu ch
die Abso p ion on Na+ aus dem Da mlumen gehemm wi d (He & Yun, 2010). Zusä zlich so gen
sowohl cAMP als auch cGMP da ü , dass CFTR aus in azellulä en Vesikeln in die apikale
Zellmemb an ek u ie wi d (Tousson e al., 1996; Golin-Bisello e al., 2005).
De hie o ges ell e Mechanismus de STa-induzie en in es inalen Sek e ionsan wo wu de du ch
eine Vielzahl on Beobach ungen bes ä ig und gil als wei hin ane kann . Zusä zlich wu den einige
dazu komplemen ä e physiologische E ek e on STa iden i izie , die eben alls zu eine e s ä k en
Wasse sek e ion du ch das Da mepi hel üh en. Dabei is nich bekann , ob diese Wi kungen du ch
GC-C e mi el we den und auch on den Ho monen Guanylin und U oguanylin he o ge u en
we den. So üh STa du ch eine Um e eilung on F-Ac in zu eine egional beg enz en
Umo ganisa ion des Cy oskele s und dami zu eine Ak i ie ung on Ionen anspo e n wie dem
Na+-K+-2Cl--Aus ausche (Ma hews e al., 1993). Auße dem wu de gezeig , dass STa eine
e s ä k e Sek e ion on Neu o ansmi e n du ch en e oendok ine Zellen bewi k . Diese ak i ie en
a e en e Neu onen, welche wiede um zu eine S imulie ung sek e o ische Ne enzellen de
Da mschleimhau üh en (Nzegwu & Le in, 1996; Camille i e al., 2012). Schließlich wu de
sowohl ü E. coli STa als auch das s a k homologe hi zes abile En e o oxin aus Y. en e ocoli ica
eine Ak i ie ung on Phopholipase Cγ beobach e (Banik & Ganguly, 1989; Saha e al., 2005).
Phospholipase C hyd olysie Phospha idylinosi ol-4,5-diphospha und se z dabei die second
messenge Inosi ol-1,4,5- iphospha (IP3) und Diacylglyce ol (DAG) ei. IP3 üh zu eine
F eise zung on Ca2+ aus in azellulä en Speiche n und dami eine Ak i ie ung on Calmodulin
wäh end DAG die P o einkinase C (PKC) ak i ie (Goyal e al., 1987). PKC sowie Calmodulin-
abhängige P o einkinasen können, ebenso wie PKG II und PKA, du ch Phospho ylie ung on
CFTR und NHE3 die Ne o-Sek e ion on Ionen s imulie en (Piccio o e al., 1992). Es is jedoch
nich bekann , wie genau Phospholipase C on STa ak i ie wi d. Fü Phospholipase Cγ wu de eine
Ak i ie ung du ch Rezep o -Ty osinkinasen besch ieben (Ku osaki & Hikida, 2009). Zwa en häl
GC-C eine zu Ty osin-Kinasen homologe Domäne, jedoch is diese ka aly isch inak i (siehe Kap.
1.5.2).
Du ch Expe imen e mi GC-C knockou Mäusen wu de nachgewiesen, dass GC-C auch an de
Regula ion des pH-We s im Da m be eilig is . Demnach wi d die säu einduzie e Bica bona -
Sek e ion im Da m du ch einen GC-C-abhängigen Mechanismus e mi el (Rao e al., 2004). Zwa
12 1 Einlei ung
anspo ie CFTR neben Cl- auch HCO3- ins Da mlumen, jedoch wu de noch ein zusä zliche STa-
s imulie e abe GC-C- und CFTR-unabhängige Mechanismus de Bica bona -Sek e ion
iden i izie (Selle s e al., 2005; Selle s e al., 2008). Dies deu e au die schon in äl e en S udien
pos ulie e Exis enz eines al e na i en STa-Rezep o s, de nich mi GC-C iden isch is , hin
(Hi ayama e al., 1992; Hugues e al., 1992; Sindice e al., 2002; Ca i he s e al., 2004).
1.5.2 Die Domänens uk u on GC-C
GC-C ha mi den ande en Ve e e n de Familie de pa ikulä en Guanyla zyklasen eine
cha ak e is ische Domänens uk u gemein (Abb. 1.5). Das 1050 Aminosäu en g oße P o ein
un e gliede sich in eine ex azellulä e Domäne (406 AS), eine einzelne T ansmemb anhelix, eine
Kinase-Homologie-Domäne (260 AS), eine Dime isie ungsdomäne (43 AS), eine ka aly ische
Guanyla zyklase Domäne (130 AS) sowie eine C- e minale Domäne (63 AS).
Ex azellulä e Domäne
Die Ex azellulä e Domäne (ECD) is die Region, die inne halb de memb angebundenen
Guanyla zyklasen die ge ings e Homologie au weis . So be äg beispielsweise die Sequenziden i ä
Abb. 1.5: Dime isie ung und
Domänens uk u on GC-C
(schema isch). ECD: ex azellulä e
Domäne; TM: T ansmemb andomäne;
KHD: Kinase-Homologie-Domäne;
Linke : Linke egion mi
Dime isie ungsmo i ; GC: ka aly ische
Domäne; C- e minal: Ca boxy-
e minale Region.
1 Einlei ung 13
de Ex azellulä en Domänen on GC-C und GC-A lediglich 17 % (Hasegawa e al., 2005). Die
ECD on GC-C is 406 Aminosäu en g oß, en häl ie Disul idb ücken sowie 8-10 po en ielle N-
Glykosylie ungss ellen (Vaand age e al., 1993). Ih e wich igs e Funk ion bes eh in de Bindung
de ex azellulä en Liganden Guanylin, U oguanylin und STa. Es konn e kein di ek e Ein luss de
N-Glykane au die Ligandenbindung de ECD nachgewiesen we den (Ghaneka e al., 2004).
Jedoch wu de gezeig , dass Mu an en de ECD, bei denen Glykosylie ungss ellen eliminie
wu den, eine ge inge e S abili ä und eine deu lich ge inge e Ligandenbindungskapazi ä au weisen
(Hasegawa e al., 1999b). Zwa is die S uk u de ECD on GC-C bis zum je zigen Zei punk
unbekann , jedoch exis ie en K is alls uk u en de ECD on GC-A in Abwesenhei und Gegenwa
des Liganden ANP ( an den Akke e al., 2000b; an den Akke , 2001; Ogawa e al., 2004). In
beiden S uk u en lieg die ECD on GC-A als Dime o . Dies is im Einklang mi ühe en
Beobach ungen, wonach die ECD on GC-A zu Dime isie ung aus eich (Chinke s & Wilson,
1992) und diese Dime isie ung unabhängig on de Gegenwa on Liganden is (Lowe, 1992).
Auch ü GC-C wu de eine Liganden-unabhängige Dime bildung de ECD nachgewiesen
(Hi ayama e al., 1993).
Kinase Homologie Domäne
De in azellulä e Teil on GC-C, de p oximal zu Memb an lieg , weis g oße Sequenzhomologie
mi Ty osin-Kinasen au und wi d deswegen als Kinase Homologie Domäne (KHD) bezeichne .
Jedoch is die KHD ka aly isch inak i und ha in e s e Linie egula o ische Funk ionen, da ein in
ka aly isch ak i en P o einkinasen essen ielles HRD-Mo i in de KHD ehl (Hanks e al., 1995).
Phylogene ische S udien konn en zeigen, dass die KHD, die Dime sie ungsdomäne und die
ka aly ische GC Domäne e olu ionä gemeinsam en s anden sind (Biswas e al., 2009). Die KHD
üb einen inhibie enden Ein luss au die ka aly ische Domäne aus, de e s du ch die Bindung eines
Liganden an die ex azellulä e Domäne au gehoben wi d (Kolle e al., 1992; Rudne e al., 1995).
Die allos e ische Bindung on ATP an die KHD is wich ig ü die Ak i ie ung on
Guanyla zyklasen du ch ex azellulä e Liganden. Fü GC-A wu de besonde s aus üh lich
besch ieben, dass zusä zlich zu Bindung eines na iu e ischen Pep ids an die ex azellulä e Domäne
auch ATP als in azellulä e Ligand an ein ATP- egulie es Modul inne halb de KHD binden muss,
um das Signal bis zu ka aly ischen Domäne wei e zulei en (Chinke s e al., 1991; Duda e al.,
1993; Duda e al., 2001; Duda & Sha ma, 2005). Bei GC-C wu de in Abwesenhei on ATP eine
schnelle Inak i ie ung de ka aly ischen Domäne nach STa-Bindung beobach e (Vaand age e al.,
1993; Bak e e al., 2000) und Lys-516 als essen iell ü die ATP-Bindung iden i izie (Bhanda i e
al., 2001). Im Gegensa z zu GC-A wu de bei GC-C keine Phospho ylie ung de KHD beobach e
20 2 Zielse zung
2 Zielse zung
Die in es inale Guanyla zyklase C und ih e endogenen Pep idliganden sind die zen alen
Regula o en des Elek oly - und Wasse haushal s im Da m. Die Bedeu ung de Wechselwi kung
zwischen de ex azellulä en Domäne on GC-C und dem bak e iellen En e o oxin STh ü die
Pa hogenizi ä en e o oxigenische E. coli S ämme is de G und da ü , dass beide Bindungspa ne
Gegens and in ensi e Fo schung sind. Sei de e s maligen Cha ak e isie ung on GC-C und ih e
Liganden wu den iele E kenn nisse übe den physiologischen und egula o ischen Kon ex des
Sys ems gewonnen, jedoch ehl es bis heu e insbesonde e an einem genauen Ve s ändnis de
molekula en G undlagen diese In e ak ion sowie des Mechanismus, du ch den die ex azellulä e
Ligandenbindung in eine Ak i ie ung de in azellulä en ka aly ischen Domäne übe se z wi d.
Ein wesen liche G und ü diesen Mangel an s uk u ellen In o ma ionen bes eh in de
Schwie igkei , sowohl GC-C als auch seine Pep idliganden in ü s uk u biologische
Un e suchungen aus eichende Menge und Reinhei zu p äpa ie en. Ein Ziel de o liegenden
A bei is die E ablie ung eine geeigne en ekombinan en Exp essions- und Reinigungss a egie ü
Pep idliganden on GC-C. Insbesonde e soll en das endogene Ho mon U oguanylin und das
exogene En e o oxin STh sowie on diesen beiden Liganden abgelei e e Pep ide in E. coli
exp imie we den. Das en wickel e Exp essionssys em soll e sich zu He s ellung on ü NMR-
Spek oskopie aus eichenden Mengen de jeweiligen Pep ide eignen und die Möglichkei zu
An eiche ung de P oben mi NMR-ak i en Iso open bie en. Die biologische Ak i i ä de so
e hal enen Pep ide soll e mi einem geeigne en Tes übe p ü we den.
Ein zwei es Ziel diese A bei is die En wicklung eines Exp essionssys ems ü die ex azellulä e
Domäne on GC-C. Diese kann als Modellsys em zu s uk u ellen Un e suchung de
Ligandenbindung dienen. Dazu soll en meh e e S a egien zu Exp ession de gesam en ECD ode
ih e memb an-p oximalen Subdomäne (MiniGC-C) in E. coli, de He e Pichia pas o is und in
Säuge zellkul u en en wo en und da au hin übe p ü we den, ob sie sich zu He s ellung eine
ge al e en, löslichen Domäne eignen, die in de Lage is , die biologischen Liganden zu binden.

3 Ma e ial und Me hoden 21
3 Ma e ial und Me hoden
3.1 Bak e ien- und He es ämme, Säuge zelllinien
Es wu den ausschließlich Bak e iens ämme de Spezies Esche ichia coli und He es ämme de
Spezies Pichia pas o is e wende . Die Tabelle 3.1 gib einen Übe blick übe den Geno yp de
e wende en S ämme.
Tab. 3.1: Lis e de in diese A bei e wende en Bak e ien- und He es ämme.
S amm Geno yp Re e enz
E. coli XL1 Blue endA1 gy A96(nalR) hi-1
ecA1 lac glnV44 F'[::Tn10
p oAB+ lacIq Δ(lacZ)M15]
hsdR17( k- mk+)
(Bullock e al., 1987)
E. coli Top10 F- mc A Δ(m -hsdRMS-
mc BC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 nupG ecA1 a aD139
Δ(a a-leu)7697 galE15 galK16
psL(S R) endA1 λ-
(G an e al., 1990)
E. coli O igami B (DE3) F- ompT hsdSB( B- mB-) gal
dcm lacY1 ahpC (DE3)
go 522::Tn10 xB (KanR, Te R)
(De man e al., 1993; P inz e
al., 1997)
P. pas o is GS115 his4 (C egg e al., 1985)
3.1.1 E. coli XL1 Blue und Top10
Die E. coli S ämme XL1 Blue und Top10 wu den zu Ve meh ung und Gewinnung on Plasmiden
e wende . Beide S ämme besi zen hohe T ans o ma ionse izienzen und eignen sich, au g und des
Fehlens on Res ik ionsenzymen (hsdRMS- bzw. hsdR17 ( k- mk+)), zu s abilen Ve iel äl igung
de F emdplasmide. In beiden S ämmen is zudem die In eg a ion de Plasmide ins
Wi sch omosom un e d ück ( ecA1).
3.1.2 E. coli O igami B (DE3)
E. coli O igami B (DE3) is ein De i a des S amms BL21 (DE3) und wu de zu Exp ession
ekombinan e P o eine, die Disul idb ücken en hal en, e wende .
22 3 Ma e ial und Me hoden
De S amm en häl den Bak e iophagen DE3, de , on λ abgelei e und als P ophage ins
Bak e iench omosom in eg ie , die Gene ü den Lac-Rep esso (lacI) und die T7-RNA-
Polyme ase en häl . Das T7-RNA-Polyme ase-Gen s eh un e de Kon olle des lacUV5-P omo o s
sowie des lacO-Ope a o s und kann du ch Zugabe on Isop opyl-β-D- hiogalak opy anosid (IPTG)
induzie we den. Die induzie e T7-RNA-Polyme ase kann anschließend Gene, die un e de
Kon olle des T7-P omo o s s ehen, ansk ibie en.
Im Cy oplasma dieses S amms he sch ein oxida i es Milieu, wodu ch die Ausbildung on
Disul idb ücken in ekombinan en P o einen un e s ü z wi d. Dieses Milieu en s eh au g und on
inak i ie enden Mu a ionen in den Genen on Thio edoxin-Reduk ase ( xB) und Glu a hion-
Oxido eduk ase (go 522::Tn10). Da diese Mu a ionen du ch An ibio ika-Resis enzen gegen
Te acyclin und Kanamycin s abilisie we den, is de S amm kompa ibel mi
Exp essionsplasmiden, die Ampicillin- ode Chlo amphenicol-Resis enz e mi eln.
3.1.3 P. pas o is GS115
GS115 is abgelei e om P. pas o is Wild yp X-33 und en häl eine Mu a ion im Gen ü die
His idinol-Dehyd ogenase (his4), die den S amm da an hinde , His idin zu syn he isie en.
Exp essionsplasmide on P. pas o is, e wa pPIC9K-De i a e, en hal en das HIS4-Gen, so dass ih e
Selek ion du ch die Komplemen ie ung de His idin-Auxo ophie on GS115 e olgen kann.
Posi i e T ans o man en wachsen, im Gegensa z zu nich ans o mie en GS115, au
Minimalmedium.
3.1.4 T84
T84 (ATCC® Ca alog No. CCL-284TM) is eine humane Da mzelllinie, die on einem
me as a ischem Adenoka zinom aus dem Lungengewebe eines 77 Jah e al en Pa ien en abgelei e
wu de. Es handel sich um adhä en wachsende Zellen, die u. a. auch die Rezep o guanyla zyklase
GC-C exp imie en (Dha msa hapho n e al., 1984).
3.1.5 COS-7
Die COS-7 Zelllinie (ATCC® Ca alog No. CRL-1651TM) is abgelei e aus de Nie e de
3 Ma e ial und Me hoden 23
Ä hiopischen G ünmee ka ze (Ce copi hecus ae hiops). Die Zellen exp imie en das T An igen und
zeigen einen adhä en en Wachs umsphäno yp (Gluzman, 1981).
3.1.6 HEK 293T
HEK 293 (ATCC® Ca alog No. CRL-11268TM)is eine humane Zelllinie die du ch T ans o ma ion
eine menschlichen emb yonalen Nie enzelle mi Teilen des menschlichen Adeno i us 5 he ges ell
wu de (G aham e al. , 1977). HEK 293T lei e sich da on ab und exp imie zusä zlich noch das
SV40la ge T An igen. Dadu ch is in HEK 293T die Replika ion on Plasmiden, die den
Replika ionsu sp ung on SV40 en hal en, möglich. Die Zelllinie is e gleichsweise ein ach zu
kul i ie en und eigne sich zu ekombinan en Exp ession on P o einen. HEK 293T wachsen
adhä en am Boden des Kul u ge äßes.
3.2 Plasmide
Tabelle 3.2 zeig eine Lis e de in diese A bei e wende en, ode im Rahmen diese A bei neu
klonie en, DNA-Kons uk e.
Tab. 3.2: Übe sich übe die in diese A bei e wende en bzw. kons uie en Plasmide.
Plasmid Ve wendung Re e enz
pET32a E. coli Exp essions ek o mi T7-P omo o ; DNA-
Sequenzen ü einen N- e minalen Thio edoxin-
(T x) und Hexahis idin-(6xHis) Anhang
No agen
(Madison,
USA)
pET43.1a-NusA-C489A E. coli Exp essions ek o mi T7-P omo o ; DNA-
Sequenzen ü einen N- e minalen NusA-C489A-
und Hexahis idin-Anhang
(Tid en,
2003)
pET43.1a-NusA-Cys-E. coli Exp essions ek o mi T7-P omo o ; DNA-
Sequenzen ü einen N- e minalen NusA-C251A-
C454A-C489A- und Hexahis idin-Anhang
diese A bei
pPIC9K P. pas o is Exp essions ek o mi AOX1-P omo o ;
DNA-Sequenzen ü das Sek e ionssignal des α-
Fak o s aus S. ce e isiae
In i ogen
(Ca lsbad,
USA)
pET32a- Asp-p es-
p ou oguanylin
pET32a-De i a ; in eg ie in die MCS is das Gen
ü humanes P ou oguanylin mi eine N- e minalen
(Schus e ,
2004)
24 3 Ma e ial und Me hoden
Spal s elle ü P eScission P o ease, o de die
Sequenz ü 5 Aspa a -Res e klonie is ;
e wende e Res ik ionsenzyme: SacI und EcoRI
pET32a-Asp-p es-p ou o-STh pET32a-De i a ; in eg ie in die MCS is das Gen
ü humanes P ou o-STh mi eine N- e minalen
Spal s elle ü P eScission P o ease, o de die
Sequenz ü 5 Aspa a -Res e klonie is
diese A bei
pET32a-Asp-p es-p ou o-
STh-L78Y
pET32a-Asp-p es-p ou o-STh-De i a ; zu
Exp ession on STh L9Y
diese A bei
pET32a-Asp-p es-p ou o-
STh-Y74R-L78Y
pET32a-Asp-p es-p ou o-STh-De i a ; zu
Exp ession on STh Y5R L9Y
diese A bei
pET32a-Asp-p es-
p ou oguanylin-A72R-D75E
pET32a-Asp-p es-p ou oguanylin-De i a ; zu
Exp ession on U oguanylin A3R D6E
diese A bei
pET32a-Asp-p es-
p ou oguanylin-Δ(70-72)-
D75E
pET32a-Asp-p es-p ou oguanylin-De i a ; zu
Exp ession on U oguanylin ΔTIA D6E
diese A bei
pET43.1a-NusA-C489A-
miniGC-C
pET43.1a-C489A-De i a ; zu Exp ession on
MiniGC-C; kodie ü eine P eScission-Schni -
s elle zwischen NusA-C489A und MiniGC-C
diese A bei
pET32a-ECD-GC-C pET32a-De i a ; zu Exp ession de ECD on
humanem GC-C; kodie ü eine P eScission-
Schni s elle zwischen T x und ECD-GC-C
diese A bei
pET43.1a-NusA-Cys--
ECD-GC-C
pET43.1a-De i a ; zu Exp ession de ECD on
humanem GC-C; kodie ü eine P eScission-
Schni s elle zwischen NusA-Cys- und ECD-GC-C
diese A bei
pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis pPIC9K-De i a ; zu Exp ession de ECD on
humanem GC-C mi einem C- e minalen
Hexahis idin-Anhang; e wende es Res ik ions-
enzym: XhoI
diese A bei
pCMV_N xn De i a on pCMV5; Exp essions ek o ü die
ansien e T ans ek ion in Säuge zellen. Kodie ü
das Sek e ionssignal on Neu exin 1 a sowie in 3'-
Posi ion de MCS ü die Sequenz des Fc-
F agmen s on humanem IgG.
(Reissne e
al., 2008)
3 Ma e ial und Me hoden 25
pCMV_N xn_ECD-Th Kodie ü die ECD on humanem GC-C als
Fusionsp o ein mi einem C- e minalen IgG-
Anhang. Zwischen ECD-GC-C und IgG be inde
sich eine E kennungssequenz ü Th ombin.
diese A bei
3.2.1 pET32a
pET32a is ein Vek o ü die induzie e Übe exp ession on F emdgenen in E. coli (Abb. 3.1). Die
Gene we den als gene ische Fusion mi N- e minalem Thio edoxin (T x) exp imie . Zwischen T x
und dem F emdp o ein be inde sich auße dem noch eine Hexahis idin-Sequenz zu Reinigung
du ch immobilisie e Me allionen-A ini ä sch oma og aphie. T x wi k als Löslichkei sanhang und
soll die Fal ung bzw. spä e e Solubilisie ung des Fusionspa ne s aus unlöslichen P o einagg ega en
un e s ü zen. Das Gen ü das Fusionsp o ein s eh un e de Kon olle des T7-P omo o s und seine
Exp ession kann dami in Bak e iens ämmen, die den DE3-P ophagen en hal en, du ch IPTG-
Zugabe induzie we den.
Abb. 3.1: Plasmidka e on pET32a. De T7
P omo o s eh un e de Kon olle des lac
Ope a o s und egulie die Exp ession eines
Fusionsp o eins, dass aus einem N- e minalen
Thio edoxin ( xA), einem 6xHis-Anhang und
dem Zielp o ein bes eh . De Vek o kodie
zusä zlich noch den Rep esso lacI sowie eine
Ampicillin-Resis enz (AmpR) ü die Selek ion.
o i: pBR322 Replika ionsu sp ung; 1 o i:
Replika ionsu sp ung des Bak e iophagen 1 ( ü
die P oduk ion einzels ängige DNA). Das in
diese A bei e wende e Gen ü die ECD on
GC-C wu de mi Hil e de Res ik ionsenzyme
NcoI und BamHI in die Mul iple
Klonie ungss elle (MCS) einge üg .

26 3 Ma e ial und Me hoden
pET32a wu de zu Exp ession on on P ou oguanylin, P ou o-STh und de en mu ie en De i a en
e wende . Auße dem wu de in diese A bei die Ve wendung on pET32a zu Exp ession de ECD
on GC-C in E. coli un e such .
3.2.2 pET43.1a-NusA-C489A und pET43.1a-NusA-Cys-
Ein wei e e Exp essions ek o ü E. coli is pET43.1a, on dem die beiden in diese A bei
e wende en Vek o en pET43.1a-NusA-C489A und pET43.1a-NusA-Cys- abgelei e sind (Abb.
3.2). Sie kodie en ü einen N- e minalen NusA-Löslichkei sanhang sowie einen Hexahis idin-
Reinigungsanhang.
Abb. 3.2: Plasmidka e on pET43.1a. Wie ande e pET-Vek o en auch kodie pET43.1a ü
einen T7 P omo o , ein Ampicillin-Resis enzgen (AmpR), den lac Rep esso (lacI) und
Replika ionsu sp ünge ü E. coli (o i) und Bak e iophage 1 ( 1 o i). De Einbau des
F emdgens e olg hin e den Sequenzen ü einen NusA-Löslichkei sanhang sowie einen
Hexahis idinanhang. In de o liegenden A bei wu den zwei modi izie e Va ian en des Vek o s
e wende , bei denen das Cys ein 489 bzw. die d ei Cys eine 251, 454 und 489 in NusA du ch
Alanine e se z wu den. Das Gen ü MiniGC-C wu de du ch die Res ik ionsenzyme SmaI und
BamHI in die Mul iple Klonie ungss elle (MCS) einge üg , wäh end beim Gen ü die gesam e
ECD on GC-C die Enzyme SacI und EcoRI e wende wu den.
3 Ma e ial und Me hoden 27
Auch in diesen Vek o en s eh das Fusionsp o ein un e de T ansk ip ionskon olle des T7-
P omo o s. Da e zu Exp ession on P o einen mi Disul idb ücken e wende we de soll e, wu de
de u sp üngliche pET43.1a-Vek o so e ände , dass im NusA-Anhang en hal ene Cys eine du ch
Alanin e se z wu den. Dies be i Cys-489 im Falle on pET43.1a-NusA-C489A sowie Cys-251,
Cys-454 und Cys-489 im Falle on pET43.1a-NusA-Cys-. Die Maßnahme dien e dazu, zu
e hinde n, dass sich im oxida i en Cy oplasma on O igami B (DE3) Disul idb ücken zwischen
dem NusA-Anhang und seinen Fusionspa ne n bilden.pET43.1A-NusA-C489A wu de zu
Exp ession on MiniGC-C e wende wäh end pET43.1a-NusA-Cys- bei de Exp ession de ECD
on GC-C eingese z wu de.
3.2.3 pPIC9K
De Vek o pPIC9K eigne sich zu sek e ie en Exp ession ekombinan e P o eine in P. pas o is
(Abb. 3.3).
Abb. 3.3: Vek o ka e on pPIC9K. De Vek o
en häl Gene ü die His idinol-Dehyd ogenase
(HIS4), die zu Syn hese on His idin essen iell
is , sowie zu Ve mi lung on Resis enzen gegen
Ampicillin (AmpR; in E. coli) und Gene icin
(KmR; in P. pas o is). Das exp imie e F emdgen
s eh un e de Kon olle des P omo o s de He e-
eigenen Alkoholoxidase 1 (5' AOX1). Das
Sek e ionssignal des α-Fak o s on S. ce e isiae
(aF) wi d zu Sek e ion des Zielp o eins ins
Medium benö ig . De Vek o wi d in
linea isie e Fo m in P. pas o is einge üh und
in eg ie du ch homologe Rekombina ion ins
He egenom. o i: Replika ionsu sp ung ü E.
coli; TT: T ansk ip ions-Te mina o ; 5' AOX1: 5'-
Region des AOX1 P omo o s; 3' AOX1: 3'-Region
des AOX1-P omo o s. Das F emdgen wu de
du ch XhoI in den Vek o einge üh . Vo he
wu de eine zusä zliche XhoI-Schni s elle im
KmR-Gen des Vek o s du ch Mu agenese en e n .
28 3 Ma e ial und Me hoden
E en häl den Replika ionsu sp ung on pBR322 sowie ein Ampicillin-Resis enzgen zu
Manipula ion des Vek o s in E. coli. Das Gen HIS4 kodie ü die His idinol-Dehyd ogenase und
dien de Selek ion posi i e T ans o man en in HIS4-de izien en P. pas o is S ämmen. Zusä zlich
en häl de Vek o das Kanamycin-Resis enzgen, welches eben alls Resis enz gegen das bei
Euka yon en eingese z e An ibio ikum Gene icin e leih . Diese Resis enz dien dem in i o
sc eening on Klonen mi Mul i-Kopien-Inse ionen des Vek o s. Das Sek e ionssignal des α-
Fak o s aus S. ce e isiae dien de Sek e ion on Zielp o einen und wi d in P. pas o is wäh end dem
Expo abgespal en.
De Vek o wu de in diese A bei zu Exp ession on GC-C-6xHis e wende . Das F emdgen
wu de dabei mi dem Res ik ionsenzym XhoI in die MCS des Vek o s inse ie . Vo he wu de ein
zwei e XhoI-Schni s elle im Kanamycin-Resis enzgen des Vek o s du ch o sge ich e e Mu agenese
en e n .
3.2.4 pCMV_N xn
pCMV_N xn is ein Vek o zu Exp ession ekombinan e P o eine in Säuge zellen (Abb. 3.4).
pCMV_N xn is abgelei e om pCMV5 Exp essions ek o (Ande sson e al., 1989) und eigne sich
zu ansien en T ans ek ion on Säuge zellen. Die T ansk ip ion eines in den Vek o klonie en
Abb. 3.4: Vek o ka e on
pCMV_N xn. De Vek o en häl das
Ampicillin-Resis enzgen (AmpR) zu
S abilisie ung in E. coli. Auße dem
en häl e Replika ionsu sp ünge ü
E. coli (o i) und den Phagen 1 ( 1
o i). De Vek o kodie ü den CMV
P omo o und en häl zu Mul iplen
Klonie ungss elle (MCS) benachba e
Sequenzen, die ü ein N- e minales
Sek e ionssignal (NRXN) sowie ü
einen C- e minalen IgG-
Reinigungsanhang kodie en.
3 Ma e ial und Me hoden 29
Zielp o eins s eh un e de Kon olle des humanen Cy omegalo i us (CMV) P omo o s. In 5'-
Rich ung de Mul iplen Klonie ungss elle is das Sek e ionssignalpep id des synap ischen
Memb anp o eins Neu exin 1a aus Ra us no egicus wäh end sich am 3'-Ende de MCS die
Sequenz eines 26,8 kDa IgG-Anhangs be inde . Diese Anhang dien de spä e en Reinigung eines
Fusionsp o eins du ch A ini ä sch oma og aphie mi P o ein A Sepha ose. Die IgG kodie ende
Sequenz is 1296 bp lang und wi d nach de T ansk ip ion du ch Spleißen zum e igen T ansk ip
p ozessie .
Das Gen de ex azellulä en Domäne on GC-C mi eine C- e minalen Th ombin-
E kennungssequenz wu de un e Ve wendung de Res ik ionsendonukleasen SalI und BamHI in die
MCS des Vek o s einge üg .
3.3 Oligonukleo ide
In Tabelle 3.3 sind die in diese A bei e wende en Oligonukleo ide au ge üh . Sie wu den on
den Fi men biome s.ne (Ulm) und IBA GmbH (Gö ingen) bezogen.
Tab. 3.3: Übe sich de in diese A bei e wende en Oligonukleo ide.
# Sequenz Länge Ve wendung
1 5'-GCA ACT ATT GCT GCG AAT ATT GCT
GCA ACC CGG CGT GC-3'
38 bp Mu agenese P ou oSTh L78Y,
o wa d P ime
2 5'-GCA CGC CGG GTT GCA GCA ATA TTC
GCA GCA ATA GTT GC-3'
38 bp Mu agenese P ou oSTh L78Y,
e e se P ime
3 5'-CCA TCT TCA AAA CCC TGC GTA ACA
GCA GTA ACC GTT GCT GCG AAT ATT GC-
3'
50 bp Mu agenese P ou oSTh L78Y Y74R,
o wa d P ime
4 5'-GCA ATA TTC GCA GCA ACG GTT ACT
GCT GTT ACG CAG GGT TTT GAA GAT
GG-3'
50 bp Mu agenese P ou oSTh L78Y Y74R,
e e se P ime
5 5'-GTA CCA TCG CTA ACG ACG AAT GCG
AAC TGT GC-3'
32 bp Mu agenese P ou oguanylin D75E,
o wa d P ime
6 5'-GCA CAG TTC GCA TTC GTC GTT AGC
GAT GGT AC-3'
32 bp Mu agenese P ou oguanylin D75E,
e e se P ime
7 5'-CCC TGC GTA CCA TCC GTA ACG ACG
AAT GCG AAC TGT GCG-3'
39 bp Mu agenese P ou oguanylin D75E
A72R, o wa d P ime
8 5'-CGC ACA TTG CGC ATT CGT CGT TAC
GGA TGG TAC GCA GGG-3'
39 bp Mu agenese P ou oguanylin D75E
A72R, e e se P ime
9 5'-CCA TCT TCA AAA CCC TGC GTA ACG 42 bp Mu agenese P ou oguanylin D75E
36 3 Ma e ial und Me hoden
–HiT apTM Chela ing HP, 5 ml
–GST apTM HP, 5 ml
–HiT apTM QXL, 5 ml
–HiT apTM SPXL, 5 ml
–HiP epTM IMAC FF 16/10, 20 ml
–Supe dexTM 75
–Supe dexTM 200 10/300 GL
Säule ü die RP-HPLC (GE Heal hca e Eu ope GmbH, F eibu g, ehemals Ame sham Biosciences):
–Resou ceTM RPC, 3 ml
Ve schiedenes:
–Spec a/Po -Dialyseschläuche, 100 Da, 1000 Da, 3500 Da und 10000 Da
Molekula gewich s-Ausschlussg enze (Ro h, Ka ls uhe)
–Vi aspin® 20, Molekula gewich s-Ausschlussg enzen 5000 Da und 10000 Da (Sa o ius
AG, Gö ingen)
–Cells a ® Zellkul u laschen aus Polys y ol, 75 cm² (250 ml) und 25 cm² (50 ml), mi
Fil e deckel (G eine Bio-One, Solingen)
– mp P o ein A Sepha ose FF (GE Heal hca e Eu ope GmbH, F eibu g)
Ge ä e: eine Lis e de in diese A bei e wende en Ge ä e be inde sich im Anhang (siehe Kap.
10.4).
3.8 Bes immung de Zelldich e on Bak e ien und He en
Pho ome ische Messungen wu den an einem Ul ospecTM 2100P o Pho ome e (GE Heal hca e
Eu ope GmbH, F eibu g, ehemals Ame sham Biosciences) du chge üh . Die Lich s euung on
Bak e ien- ode He e-Suspensionen bei eine Wellenlänge on 600 nm (OD600) wu den in 1 cm
Polys y ol-Halbmik okü e en (Ro h, Ka ls uhe) gemessen, wobei als Re e enz die jeweiligen
einen Näh lösungen e wende wu den. Bei E. coli Kul u en en sp ich eine OD600 on 1 e wa eine
Zelldich e on 1 × 109 Zellen p o ml. Bei P. pas o is en sp ich 1 OD600 e wa eine Dich e on 5 ×
107 Zellen p o ml.

3 Ma e ial und Me hoden 37
Da He ekul u en gene ell wesen lich höhe e op ische Dich en bei 600 nm au weisen als
Bak e ienkul u en, wu de die Zelldich e on He ekul u en in de Regel in Fo m des
Nasszellgewich s in 1 ml de jeweiligen abzen i ugie en Zellsuspension angegeben.
3.9 Konzen a ion on P o einen
Die Konzen a ion on g öße en, T yp ophan-hal igen P o einen wu de du ch die pho ome ische
Bes immung ih e Abso p ion bei 280 nm bes imm . Die P o einlösungen wu den geeigne e dünn
und in eine 1 cm Qua zkü e e mi Hil e eines Ul ospecTM 2100P o Pho ome e s (GE Heal hca e
Eu ope GmbH, F eibu g, ehemals Ame sham Biosciences) e messen.
Zu Konzen a ionsbes immung on Pep iden, wie e wa U oguanylin, STh und de en mu ie en
Va ian en, wu de de PIERCE BCATM P o ein Assay Ki (The mo Fishe Scien i ic, Bonn)
e wende . Die Me hode basie au de Biu e -Reak ion, bei de , im alkalischen Milieu, Cu2+-Ionen
du ch die Pep idbindungen on P o einen zu Cu+ eduzie we den. Bicinchoninsäu e (BCA) bilde
mi diesen Ionen einen a bigen Komplex, de dem sensi i en kolo ime ischen Nachweis on
P o einen bei eine Wellenlänge on 562 nm dien . Da die Reduk ion de Kup e ionen ein
empe a u abhängige P ozess is , kann die Konzen a ion des gebilde en Fa bkomplexes und dami
die Sensi i i ä des Nachweises in gewissen G enzen a iie we den. Als Re e enz wu den
Rinde se umalbumin-Lösungen mi de inie en Konzen a ionen e wende .
3.10 Gelelek opho ese
3.10.1 Aga ose-Gelelek opho ese on DNA
Zu Kon olle on G öße und Reinhei on DNA, zumeis handel e es sich dabei um
Plasmidp äpa a ionen (Kap. 3.11) ode du ch PCR ampli izie e DNA-F agmen e (Kap. 3.15.4),
wu de Aga ose-Gelelek opho ese eingese z . Die Elek opho ese wu de in MINI-SUB® CELL GT
Gelkamme n (Bio-Rad Labo a o ies GmbH, München) mi e wa 10 cm × 6 cm g oßen Gelen
du chge üh . Zu He s ellung de Gele wu de 0,8 % (w/ ) ode 1,5 % (w/ ) Aga ose in TBE-Pu e
(90 mM T is/HCl, 90 mM H3BO3, 2 mM EDTA, pH 8,0) du ch E hi zen gelös . Nach dem
Abkühlen de Lösung au e wa 60 °C wu den 5 µl 1 % E hidiumb omid-Lösung p o 100 ml Gel
zugegeben.
Die zu analysie enden DNA-P oben wu den mi 2/5 Volumen eines Gelau agspu e s (50 mM
38 3 Ma e ial und Me hoden
EDTA, 50 % Glyce in ( / ), 0,15 % B omphenolblau (w/ ) und 0,15 % Xylencyanol (w/ ))
gemisch und au das Gel au ge agen. Die Elek opho ese wu de bei 99 V und 65 mA du chge üh
und bei einem Un e schied de Lau s ecken de beiden Fa bma ke on e wa 2 cm beende . Die
luo eszenzma kie en DNA-Banden wu den mi Hil e eines Geldokumen a ionssys ems (GEL
DOCTM 2000 bzw. GEL DOCTM XR+, Bio-Rad Labo a o ies GmbH, München) au gezeichne . Als
DNA-Längens anda d wu den λ/Hind III DNA (23,13 kb; 9,415 kb; 6,557 kb; 4,631 kb; 2,322 kb;
2,027 kb; 0,564 kb; 0,125 kb) ode peqGOLD DNA-Lei e Mix (10 kb; 8 kb; 6 kb; 4 kb; 3,5 kb; 3
kb; 2,5 kb; 2 kb; 1,5 kb; 1,2 kb; 1 kb; 0,9 kb; 0,8 kb; 0,7 kb; 0,6 kb; 0,5 kb; 0,4 kb; 0,3 kb; 0,2 kb;
0,1 kb; peqlab Bio echnologie GmbH, E langen) e wende .
3.10.2 SDS-Polyac ylamid-Gelelek opho ese on P o einen
SDS-Polyac ylamid-Gelelek opho ese (SDS-PAGE) wu de e wende um P o eingemische zu
cha ak e isie en und die Reinhei on P o einp oben zu kon ollie en. Dabei wu de das
diskon inuie liche Sys em nach Laemmli (Laemmli, 1970) e wende . Die Gelelek opho ese wu de
als e ikale Pla engelelek opho ese in Migh y Small SE 250 Elek opho esekamme n (Hoe e
Scien i ic Ins umen s, Hollis on, MA, USA) bei 32 mA und 200 V du chge üh . Die Gele wa en
zusammengese z aus e wa 7 cm langen T enngelen und e wa 1 cm langen Sammelgelen und wa en
10 cm b ei und e wa 0,75 cm mäch ig.
Tab. 3.4: Pipe ie schema zu He s ellung on je 6 10 %igen, 15 %igen und 19 %igen SDS-
Polyac ylamidgelen.
T enngel Sammelgel
10% 15% 19%
30 % Ac ylamid 11,7 ml 17,5 ml 22,2 ml 3 ml
2 % N,N'-Me hylenbisac ylamid 4,7 ml 7,0 ml 8,9 ml 1 ml
3 M T is/HCl, pH 8,8 4,4 ml 4,4 ml 4,4 ml -
0,5 M T is/HCl, pH 6,8 - - - 5 ml
10 % SDS 350 µl 350 µl 350 µl 120 µl
H2O 13,4 ml 5,5 ml - 10,7 ml
Na2SO35 mg 5 mg 5 mg -
10 % APS 300 µl 300 µl 300 µl 200 µl
TEMED 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl
3 Ma e ial und Me hoden 39
Je nach de G öße de zu e wa enden P o eine wu den 19 %ige, 15 %ige ode 10 %ige SDS-Gele
gegossen. Beim Gießen de Gele wu de das in Tab. 3.4 da ges ell e Pipe ie schema eingehal en.
Na iumdodecylsul a (SDS) wu de als dena u ie endes De e gens e wende . Als adikalische
Polyme isa ions-S a e dienen die Chemikalien Ammoniumpe oxodisul a (APS) und N,N,N',N'-
Te ame hyle hylendiamin (TEMED), nach de en Zugabe die Gellösung in die Kamme n gegossen
wu de.
Als Lau pu e wu de 50 mM T is/HCl, pH 8,3, 385 mM Glycin und 0,1 % (w/ ) SDS e wende .
Die P o einp oben wu den mi gleichem Volumen P obenpu e (2 × Ro i-Load® (Ro h Ka ls uhe))
gemisch und bei 98 °C ü 5 min dena u ie . Bak e ienzellpelle s wu den mi 100 µl 1 × Ro i-
Load® e se z und bei 98 °C 10 min lang dena u ie . He ezellpelle s wu den 100 µl B eaking
Bu e (50 mM Na iumphospha , pH 7,4, 1 mM Phenylme hylsul onyl luo id (PMSF), 1 mM
EDTA, 5 % Glyce ol) esuspendie , mi e wa einem Volumen saue behandel e Glaspe len
(Du chmesse 0,5 mm) e se z und anschließend 8 Mal je e wa 30 s am Vo ex gemisch . Die
P oben wu den dann du ch Zen i uga ion on den Glaspe len und Zell ümme n ge enn , 1 : 1 mi
2 × Ro i-Load® gemisch und 10 min bei 98 °C inkubie .
Die Gelelek opho ese wu de übliche weise beende sobald de im P obenpu e en hal ene
B omphenolblau-Fa bma ke , de im P obenpu e en hal en is , das un e e Gelende e eich ha e.
Die P obeinbanden wu den sich ba gemach , indem die Gele ü e wa 30 min in eine Fä belösung
(0,05 % (w/ ) Coomassie B illian Blau R-250, 10 % ( / ) Essigsäu e) inkubie wu den.
Anschließend wu den die Gele bis zum olls ändigen En ä ben des Gelhin e g undes, ü e wa 8 h,
in eine En ä belösung (10 % ( / ) Essigsäu e) geschü el .
3.10.3 Wes e n Blo
De Wes e n Blo dien e dem spezi ischen Nachweis de ECD on GC-C bei de Exp ession in P.
pas o is. Dabei wu den die P o eine du ch SDS-PAGE (Kap. 3.10.2) au ge enn und au eine
Ni ozellulose-Memb an (Sa o ius S edim Bio ech GmbH, Gö ingen) ans e ie . De Nachweis
e olg e schließlich übe einen spezi ischen An ikö pe . Im hie besch iebenen Fall wu de ein
polyklonale An i-Hexahis idin-An ikö pe (Gensc ip , Ca .-N . A00174) e wende , de in Hasen
he ges ell wu de und den Hexahis idin-Anhang des exp imie en GC-C-Kons uk s e kenn . Diese
gebundene p imä e An ikö pe wu de du ch einen sekundä en An ikö pe , de in Ziegen he ges ell
wu de und mi dem Enzym Alkalische Phospha ase (AP) gekoppel wa , de ek ie . Die Bande de
ECD on GC-C au de Memb an wu de du ch eine Fa b eak ion sich ba gemach .
40 3 Ma e ial und Me hoden
De T ans e de P o eine om 10 % SDS-Gel au die Ni ozellulose-Memb an wu de als sog. semi-
ockene Elek oblo du chge üh . Nach de SDS-PAGE wu de de Blo wie in Abb. 3.5 da ges ell
au gebau . Die Anode wu de mi eine Abdich olie bedeck , aus de ein de G öße des Gels
en sp echendes Fens e ausgeschni en wu de. Au die Anode wu den d ei Lagen, Wha man Papie
(Ch oma og aphy Pape , 3 MM CHR, Wha man In e na ional L d, Maids one, UK), die
Ni ozellulose-Memb an, das SDS-Gel und schließlich d ei wei e e Lagen Wha man Papie
passgenau geleg . Das Wha man Papie und die Memb an wu den mi T ans e -Pu e (25 mM
T is/HCl, pH 8,3, 192 mM Glycin, 20 % Me hanol ( / )) be euch e . De T ans e wu de bei eine
S oms ä ke on 40 mA ü eine Daue on 1 h in eine SEMI-PHORTM Blo ing-Kamme (Hoe e
Scien i ic Ins umen s, San F ancisco, CA, USA) du chge üh .
Dann wu de die Memb an ü 5 min in 20 ml Blocking-Pu e (1 × PBS, 10 % Milchpul e (w/ ),
0,05 % Tween 20 ( / )) geschwenk . Übe Nach wu de die Memb an in 20 ml Blocking-Pu e mi
1 µg/ml des an i-6xHis-An ikö pe s (Ca .-N . A00174, Gensc ip , Pisca away, NJ, USA) inkubie
und anschließend 3 mal je 5 min in jeweils 20 ml Wasch-Pu e (1 × PBS, 0,05 % Tween 20 ( / ))
geschwenk um den ungebundenen p imä en An ikö pe zu en e nen. Die Memb an wu de danach
in 20 ml Blocking-Pu e mi 0,7 µg/ml des an i-Hasen An ikö pe (An i-Rabbi IgG – Alkaline
Phospha ase, Sigma-Ald ich, S einheim) ü 2 h inkubie . Schließlich wu de sie 3 mal 5 min in je
20 ml 1 × PBS und 3 mal 5 min in je 20 ml AP-Pu e (100 mM T is/HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5
mM MgCl2) gewaschen. Um schließlich die Fa b eak ion, mi de die posi i en Banden sich ba
gemach we den, zu s a en wu den zu den le z en 20 ml AP-Pu e 33 µl 5-B om-4-chlo -3-
indoxylphospha (BCIP, 42 mg/ml in DMF) und 66 µl Ni oblau-Te azoliumchlo id (NBT, 83
mg/ml in 70 % DMF ( / )) zupipe ie . Du ch die Ak i i ä on AP wi d BCIP dephospho ylie
und anschließend on NBT oxidie . Dabei bilde sich aus BCIP ein blaue Indigo a bs o und aus
Abb. 3.5: Schema ische Au bau des
semi- ockenenen Elek oblo s, wie e
in diese A bei eingese z wu de.
3 Ma e ial und Me hoden 41
NBT ein o e Fa bs o . Zusammen e gib sich nach 5 – 10 min ein iole e Fa bumschlag, de die
du ch die An ikö pe de ek ie en Banden ma kie .
3.11 P äpa a ion on Plasmid-DNA
Um Plasmid-DNA zu ampli izie en wu de sie du ch Elek opo a ion (Kap. 3.12) in E. coli Top10
ode E. coli XL1 Blue eingeb ach . Die Bak e ien wu den in 10 ml LB-Medium übe Nach bei
37 °C geschü el . Anschließend wu de die Bak e iensuspension zen i ugie und aus dem
Zellpelle wu de die Plasmid-DNA p äpa ie . Zu Plasmidp äpa a ion wu de de Qiap ep Spin
Minip ep Ki (Qiagen, Hilden) e wende . Die Du ch üh ung e olg e nach Anweisungen des
He s elle s. Die Me hode basie au de alkalischen Lyse de Bak e ien und de Isolie ung de
Plasmid-DNA du ch Anionenaus ausch-Ch oma og aphie. Die DNA wu de im le z en Sch i in 100
µl H2O au genommen und bei -20 °C au bewah . Die Reinhei de P äpa a ion wu de du ch
Aga ose-Gelelek opho ese übe p ü und die au diesem Weg he ges ell e DNA wu de
anschließend ü Sequenzie ungen, Klonie ungen und T ans o ma ionen e wende .
Da ü die T ans o ma ion on pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis in P. pas o is g öße e Mengen an
Plasmid-DNA nö ig wa en wu den E. coli XL1 Blue mi dem Plasmid ans o mie und in 100 ml
LB-Medium angezogen. Aus de Bak e iensuspension wu de das Plasmid mi dem Nucleobond®
AX Midip ep-Ki (Mache ey-Nagel, Dü en) isolie . Diese Midip ep basie au demselben P inzip
wie die Minip ep und un e scheide sich lediglich im Maßs ab de P äpa a ion.
3.12 Elek o ans o ma ion on Plasmid-DNA in Bak e ien und He en
Zu Elek opo a ion on Plasmiden in Bak e ien wu de nu DNA e wende , die in einem Wasse
gelös wa . E wa 5 ng Plasmid in einem Volumen on e wa 2 µl wu de mi e wa 80 µl
elek okompe en en Bak e ien e misch und in eine 0,1 cm Elek opo a ionskü e e (peqlab
Bio echnologie GmbH, E langen) o geleg . Die Elek opo a ion e olg e mi einem Mic oPulse TM
(Bio-Rad Labo a o ies GmbH, München) und einem Spannungspuls de S ä ke 1,8 kV. Nach dem
Puls wu den die Bak e ien un e züglich mi 500 µl s e ilem LB-Medium e misch , in ein 1,5 ml
Eppendo -Ge äß übe üh und ü e wa 1 h bei 37 °C und 160 pm geschü el . Anschließend
wu den 50 µl und 100 µl de Bak e iensuspension au je eine Aga pla e mi LB-Selek i medium
auspla ie . Die Pla en wu den übe Nach bei 37 °C in einem B u sch ank (Modell 200, Memme
Schwabach) inkubie . Im E olgs all wa en am nächs en Mo gen Einzelkolonien zu sehen.

42 3 Ma e ial und Me hoden
Fü die Elek opo a ion on P. pas o is muss en elek okompe en e He ezellen he ges ell we den.
Dazu wu den 5 ml YPD-Medium mi GS115 Zellen aus eine Glyce in-Daue kul u angeimp und
übe Nach bei 30 °C und 220 pm geschü el . Anschließend wu den mi 0,1 – 0,15 ml diese
Kul u 500 ml isches YPD-Medium in einem 2 l Schü elkolben angeimp . Diese Kul u wu de
übe Nach bei 30 °C und 220 pm inkubie bis sie eine OD600 on e wa 1,5 e eich ha e. Die
Zellen wu den du ch Zen i uga ion (1500 × g, 5 min, 4 °C) gee n e und in 500 ml eiskal em
s e ilem Wasse esuspendie . Die Zen i uga ion wu de wiede hol und die Zellen dabei sukzessi e
in 250 ml eiskal em Wasse , 20 ml eiskal em 1 M So bi ol und 1 ml eiskal em 1 M So bi ol gelös .
Aus de esul ie enden Bak e iensusp ension (V = 1,5 ml) wu de ein 80 µl-Aliquo genommen und
mi e wa 20 – 30 µg Plasmid-DNA e se z . Da die Plasmide nach de T ans o ma ion in P. pas o is
ins Ch omosom in eg ie en sollen, müssen sie linea isie sein. Im Falle des in diese A bei
e wende en Kons uk s pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis geschah die Linea isie ung du ch Res ik ion
des Plasmids mi Sac I, das inne halb de 5' AOX1-P omo o egion (Kap. 3.2.3) schneide . Nach de
DNA-Zugabe wu de die Zellsuspension in eine 0,2 cm Elek opo a ionskü e e (Li e Technologies
GmbH, Da ms ad ) pipe ie , 5 min au Eis inkubie und in einem Mic oPulse TM Elek opo a o
(Bio-Rad Labo a o ies GmbH, München) mi einem 2 kV Spannungspuls behandel . Unmi elba
danach wu den die Zellen in 1 ml eiskal em 1 M So bi ol esuspendie und ü 1 h bei 30 °C
inkubie . Anschließend wu den je 200 µl de Suspension au MD-Aga pla en auspla ie und im
Inkuba o bei 30 °C ü 2 – 3 Tage inkubie , bis Kolonien sich ba wa en.
3.13 Fällung on DNA
Die Aus ällung on DNA aus wäss igen Lösungen, z. B. Liga ionsansä zen, e olg e du ch E hanol.
Dazu wu de die DNA-P obe mi 300 mM LiCl und 10 % Glykogen ( / ) e se z und anschließend
mi dem d ei achen Volumen kal em E hanol (-20 °C) e misch . De Ansa z wu de dann ü 1 h bei
-80 °C inkubie und zen i ugie . De Übe s and wu de abgenommen und das DNA-Pelle mi
80 % E hanol ( / ; -20 °C) gewaschen. Nach e neu e Zen i uga ion und dem En e nen des
Übe s ands wu de das Pelle im Vakuum ge ockne und schließlich in einem gewünsch en Volumen
s e ilen Wasse s au genommen.
3.14 Ex ak ion on DNA aus Aga osegelen
Zu Reinigung on PCR-F agmen en ode linea isie en Plasmiden wu den die en sp echenden
3 Ma e ial und Me hoden 43
P oben au eine Aga osegel au ge agen und de Elek opho ese un e zogen (Kap. 3.10.1). Die
gewünsch e Bande wu de ausgeschni en und die in dem Gel en hal ene DNA un e Ve wendung
des QIAquick® Gel Ex ac ion Ki (Qiagen, Hilden) isolie . Dabei wu den die Anweisungen des
He s elle s genau be olg und die Quali ä de esul ie ende DNA-P obe anschließend du ch
analy ische Aga ose-Gelelek opho ese übe p ü .
3.15 Enzyma ische Behandlung on DNA
3.15.1 Res ik ion
DNA on Plasmiden ode PCR-F agmen en wu de an spezi ischen E kennungssequenzen on Typ
II Res ik ionsendonukleasen (Kap. 3.5) geschni en. Dazu wu den die Konzen a ionen de DNA-
P oben au We e im Be eich on 0,3 – 0,5 µg/µl einges ell und mi dem om He s elle de
Res ik ionsenzyme (New England Biolabs, Schwalbach) o gesehenen Pu e e se z . Bei
Res ik ionen mi Sac I, Xho I und Bam HI wu de dem Ansa z zudem noch BSA zugegeben. Es
wu den zwischen 1 U und 5 U des jeweiligen Enzyms p o µg zu schneidende DNA eingese z .
Anschließend wu den die Ansä ze ü e wa 3 h bei 37 °C inkubie (B u sch ank, Modell 200,
Memme , Schwabach) und die geschni e DNA schließlich du ch Aga osegelek opho ese on
e en uell noch o handene ungeschni ene DNA ge enn .
3.15.2 Dephospho ylie ung on 5'-Enden
Um zu e hinde n, dass wäh end de Liga ion lee e Vek o en eligie en ohne ein PCR-F agmen
au zunehmen, wu den die 5'-Phospha e de linea isie en Vek o en du ch an a k ische Phospha ase
(AP, New England Biolabs, Schwalbach) en e n . Dazu wu de de DNA de om He s elle
gelie e e Pu e (10 × AP-Pu e , New England Biolabs, Schwalbach) sowie p o µg DNA e wa 1 U
Phospha ase zugese z . Die Dephospho ylie ung e lie bei 37 °C ü e wa 20 min und wu de du ch
Hi zeinak i ie ung de Phospha ase (65 °C, 5 min) abgeb ochen. Anschließend wu den die
dephospho ylie en Vek o en du ch den QIAQuick® Nucleo ide Remo al Ki (Qiagen, Hilden) aus
dem Ansa z isolie und in 50 µl einen Wasse s eluie .
44 3 Ma e ial und Me hoden
3.15.3 Liga ion
Fü die Liga ion on doppel e dau en Vek o en mi du ch PCR ampli izie en, doppel e dau en
DNA-F agmen en wu den Vek o und F agmen im mola en Ve häl nis 1 : 3 einges e z . P o e wa
80 – 150 ng Vek o wu den 400 U T4 DNA Ligase (New England Biolabs, Schwalbach) in T4-
DNA-Ligasepu e eingese z . Die Reak ion wu de übe Nach bei 16 °C du chge üh . Als
Kon ollen dien en de Liga ionsansa z ohne DNA-F agmen sowie de Liga ionsansa z ohne DNA-
F agmen und T4 DNA Ligase. Nach dem Ende de Reak ion wu den de Liga ionsansa z sowie die
beiden Kon ollen du ch E hanol ällung (Kap. 3.13) und Resuspension in je 10 µl H2O konzen ie
und in E. coli Top10 ode E. coli XL1 Blue ans o mie (Kap. 3.12). Aus den gewonnenen
Einzelkolonien wu de das Plasmid p äpa ie und die Liga ion du ch Sequenzie ung (LGC
Genomics, Be lin) übe p ü .
3.15.4 Polyme ase-Ke en eak ion
Die Polyme ase-Ke en eak ion (PCR) wi d zu in i o Ampli ika ion on DNA-F agmen en
eingese z (Saiki e al., 1985). Die Ve wendung on syn he ischen DNA-P ime n mi übe s ehenden
Enden, die sog. Linke -PCR, e laub es, eine de inie e DNA-Sequenz zu ampli izie en und
gleichzei ig die lankie enden Be eiche des F agmen s zu modi izie en, e wa um Schni s ellen ü
Res ik ionsenzyme ode Sequenzen, die ü Hexahis idin-Anhänge ode P o ease-Schni s ellen
kodie en, einzu ügen. Au diese Weise können DNA-F agmen e p äpa ie we den, die sich ü den
Einbau in neue Vek o en eignen.
Die e wende en P ime besaßen eine zu jeweiligen Ma ize komplemen ä e 3'-Region on e wa
20 bp. Im 5'-Be eich de P ime wu den die Res ik ionsschni s ellen und ande e benö ig e DNA-
Sequenzen einge üh .
Zu Du ch üh ung de Reak ion wu den in einem Gesam olumen on 50 µl e wa 50 ng Ma izen-
DNA, 2 µM de jeweiligen P ime , 200 µM dNTPs und 2 U Ven DNA-Polyme ase gemisch . Als
Pu e wu de de sog. The moPol Pu e (20 mM T is/HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl,
2 mM MgSO4, 0,1 % T i on X-100) on New England Biolabs (Schwalbach) e wende . Die
Reak ion wu de in einem P imas 25 ad anced The mozykle (peqlab Bio echnologie GmbH,
E langen) du chge üh . Tab. 3.5 zeig das ü alle in diese A bei du chge üh en Linke -PCRs
e wende e PCR-P og amm. Nach einem ini ialen Au schmelzen de Ma izen-DNA (95 °C, 5 min)
olg en 40 iden ische Tempe a u zyklen, die jeweils aus 30 s Dena u ie ung bei 95 °C, 30 s
Hyb idisie ung de P ime bei 55 °C und 2 min P ime -Ve länge ung du ch Ven DNA-Polyme ase
3 Ma e ial und Me hoden 45
bei 72 °C bes anden. Zum Schluss wu de die P obe ü 4 min bei 72 °C inkubie um un olls ändige
DNA-Doppels änge au zu üllen und dann bei 4 °C inkubie . Das P oduk de PCR wu de du ch
p äpa a i e Aga ose-Gelelek opho ese und anschließende Gelex ak ion ge einig (Kap. 3.14).
Tab. 3.5: In diese A bei bei Linke -PCRs e wende es PCR-P og amm.
Tempe a u [°C] Daue [min]
95 5
95 0,5
40 x55 0,5
72 2
72 4
4∞
3.15.5 O sge ich e e Mu agenese
Die o sge ich e e Mu agenese on Plasmiden wu de mi Hil e des QuickChange® Si e-di ec ed
Mu agenesis Ki s (Agilen Technologies, Böblingen) du chge üh . Sie e laub den Aus ausch, die
Dele ion ode Inse ion spezi ische Basen in einem Plasmid. Dabei we den geeigne e zu
Zielsequenz im Plasmid und zueinande komplemen ä e P ime e wende , welche die gewünsch e
Mu a ion en hal en. Mi diesen P ime n wi d die gesam e Plasmid-DNA du ch PCR ampli izie .
Dabei wi d die P uTu bo® DNA-Polyme ase e wende und es en s ehen mu ie e Plasmide mi
e se z en Einzels angb üchen. Da das Ma izenplasmid übliche weise du ch P äpa a ion aus E.
coli e hal en wu de, en häl es Me hylie ungen du ch DNA-Adenin-Me hyl ans e ase (Dam) und
kann du ch die Dam-spezi ische Res ik ionsendonuclease Dpn I abgebau we den. Die neu
syn he isie e, die Mu a ion en hal ene, DNA is nich me hylie und deshalb o Dpn I geschü z .
Das e bliebene mu ie e Plasmid kann di ek in E. coli Top10 ode E. coli XL1 Blue ans o mie
we den. Die da aus p äpa ie en mu ie en Plasmide wu den abschließend sequenzie .
3.16 Glyce in-Daue kul u en on E. coli-Klonen
Zu He s ellung on Glyce in-Daue kul u en on E. coli wu den 10 ml LB-Selek i medium mi
eine Einzelkolonie angeimp und übe Nach bei 37 °C und 160 pm bis zum e eichen eines
52 3 Ma e ial und Me hoden
Konzen a ion des gi igen DMSO zu e inge n. Nach eine Woche Inkuba ion, wobei das Medium
egelmäßig gewechsel wu de, wu den die Zellen in eine 250 ml Kul u lasche übe üh .
3.21.3 In i o Ak i i ä s es
Zu Übe p ü ung de biologischen Ak i i ä de ge einig en Liganden on GC-C wu den T84-
Zellen in 24-Well-Pla en angeimp . Dabei wu den jeweils die in eine oll bewachsenen 250 ml
Kul u lasche en hal enen Zellen in insgesam 10 ml Kul u medium esuspendie . Von diese
Zellsuspension wu den je 0,5 ml p o Well zum Animp en eingese z . Die Zellen wu den 7 Tage bei
37 °C und 5 % CO2 inkubie bis sich eine kon luen e Zellmonoschich in den Wells ausgebilde
ha e. Das Kul u medium wu de alle 2 Tage gewechsel .
Fü den in i o Ak i i ä s es wu de das Medium aus den Wells abgesaug und die Zellen mi 0,5 ml
PBS p o Well gewaschen. Danach wu den die Zellen mi 0,5 ml OPTI-MEM® I Medium (Li e
Technologies GmbH, Da ms ad ) p o Well übe schich e . In dem Medium wa auße dem 1 mM 3-
Isobu yl-1-me hylxan hin (IBMX), ein Inhibi o on Phosphodies e ase, en hal en. Die Zellen
wu den 5 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubie , anschließend wu den je 50 µl p o Well de in
200 mM HEPES, pH 7,4 gelös en Pep ide zugegeben. Typische Endkonzen a ionen on
e wende en Pep iden wa en 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM und 1 µM. Als Nega i kon olle
wu den Zellen e wende , die nu mi Pu e inkubie wu den. Danach wu den die Zellen ü 1 h
im Inkuba o bei 37 °C und 5 % CO2 au bewah . Das Medium mi den en hal enen Pep iden wu de
abgesaug und die Zellen du ch Zugabe on je 200 µl 0,1 M HCl und 20-minü ige Inkuba ion
lysie . Die Übe s ände de Lyse wu den in 1,5 ml Eppendo -Ge äße übe üh und ü 5 min bei
600 × g zen i ugie um Zell ümme zu en e nen. Die in jeweils 100 µl diese sau en Zellex ak e
en hal ene cGMP-Menge wu de schließlich mi dem cGMP Enzyme Immunoassay Ki , Di ec
(Sigma-Ald ich, S einheim) bes imm , wobei die Vo gaben des He s elle s genau be olg wu den.
An diese S elle soll ku z das dem Ki zug unde liegende Nachweisp inzip e klä we den:
Es handel sich um einen kompe i i en Immunoassay, bei dem zu De ek ion ein syn he isches
Konjuga aus cGMP und alkalische Phospha ase (AP) eingese z wi d, das mi den
nachzuweisenden cGMP-Molekülen um die Bindung an einen polyklonalen an i-cGMP An ikö pe
aus Hasen konku ie . Die Adso p ion dieses An igen-An ikö pe -Komplexes e olg in eine mi
an i-Hasen IgG beschich e en 96-Well-Pla e. Nach meh e en Waschsch i en wi d die Menge des
gebundenen cGMP-AP-Konjuga s du ch eine Fa b eak ion, die AP-abhängige Spal ung on p-
Ni ophenylphospha , bes imm und du ch Messung de Abso p ion bei 405 nm un e Ve wendung

3 Ma e ial und Me hoden 53
eines Mic opla e-Reade s (Model 550, Bio-Rad Labo a o ies GmbH, München) de ek ie . Zu
Eichung wu den cGMP-S anda dlösungen mi de inie en Konzen a ionen e wende . Da es sich
um einen kompe i i en Tes handel , is die Menge des in de P obe o handenen Analy en indi ek
p opo ional zu S ä ke des de ek ie en Fa bsignals. Je meh cGMP in de P obe en hal en wa
des o wenige cGMP-AP-Konjuga kann schließlich im en sp echenden Well nachgewiesen we den.
3.22 Exp ession on NusA-C489A-MiniGC-C
Zum Animp en eine Kul u mi O igami B (DE3) pET43.1a-NusA-C489A-MiniGC-C wu den
ausschließlich Einzelkolonien on Aga pla en mi isch ans o mie en Zellen e wende . Das
Animp en aus Glyce in-Daue kul u en üh zu seh nied igen Exp essions a en und ge ingen
Ausbeu en. Es wu de eine 10 ml LB-Kul u , die 100 µg/ml Ampicillin en hiel , mi eine
Einzelkolonie angeimp und ü e wa 10 h bei 37 °C und 160 pm geschü el . Die Kul u wu de
anschließend in 500 ml eine LB- ode M9-Vo kul u , die übe Nach inkubie wu de (37 °C,
160 pm, ca. 14 h), übe geimp . Mi de Vo kul u wu den schließlich 2 × 2 l LB- ode M9-
Haup kul u au eine OD600 on 0,2 angeimp und solange un e den gleichen Bedingungen
inkubie bis ein OD600-We on 0,7 e eich wa . Die Tempe a u des Inkuba o s wu de au 25 °C
he abgese z und 30 min spä e die Exp ession des ekombinan en P o eins du ch Zugabe on
0,1 mM IPTG ins Medium induzie . Nach wei e en ün S unden wu den die Zellen du ch
Zen i uga ion (10 min, 5500 × g, 4 °C) gee n e und übe Nach bei -20 °C einge o en.
3.23 Reinigung on NusA-C489A-MiniGC-C
Das Zellpelle wu de au ge au und in 5 ml Lysepu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9; 500 mM NaCl;
10 mM Imidazol; 100 mg/l Lysozym sowie eine P o easeinhibi o able e p o 500 ml) euspendie
und 1 h au Eis ge üh . De Zellau schluss wu de an einem Mic o luidics 110L Mic o luidize
(New on, MA, USA) du chge üh . Du ch Zen i uga ion ü 30 min bei 12000 × g und 4 °C
wu den Übe s and und unlösliches Pelle de Lyse oneinande ge enn . Das Pelle wu de
da au hin in 80 ml Lysepu e esuspendie und da in noch en hal enes Fusionsp o ein du ch
Ul aschallbehandlung (LABSONIC® P Soni ie , mi 14 mm Schwingsonde, B. B aun Bio ech In .
GmbH, Melsungen; Zyklus 1, 100 % Ampli ude, 5 × 1 min) solubilisie . Nach einem wei e en
Zen i uga ionssch i (30 min, 12000 × g, 4 °C) wu de de e hal ene Übe s and mi dem Übe s and
de Lyse am Mic o luidize e einig und au zwei hin e einande geschal e e mi 2 CV 50 mM
54 3 Ma e ial und Me hoden
NiSO4 beladene 5 ml HiT apTM Chela ing HP Säulen au ge agen (1 CV = 10 ml). Die Säule wu de
anschließend mi 5 CV Bindungspu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol)
gewaschen und mi einem S u eng adien eluie . Die Elu ionss u en wa en: 2,5 % (6 CV), 10 %
(6 CV), 20 % (4 CV), 50 % (4 CV), 100 % (4 CV). De e wende e Elu ionspu e en hiel 50 mM
T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 1 M Imidazol. Das Fusionsp o ein NusA-C489A-MiniGC-C
eluie e on de Säule bei Imidazolkonzen a ionen on 100 – 200 mM und wu de ak ionie
au ge angen. Die F ak ionen wu den du ch SDS-PAGE (Kap. 3.10.2) analysie und diejenigen
F ak ionen, die NusA-C489A-MiniGC-C en hiel en wu den e einig und gegen 20 mM T is/HCl,
pH 8,0, 100 mM NaCl dialysie .
3.24 En e nen des Fusionsanhangs NusA-C489A
3.24.1 P eScission-Ve dau
Um den NusA-C489A- sowie den 6xHis-Anhang zu en e nen wu de das Fusionsp o ein mi
P eScission-P o ease gespal en. Dazu wu den zu P obe im Dialyseschlauch e wa 0,8 mg
P eScission p o mg Fusionsp o ein zupipe ie und de Ansa z bei 20 mM T is/HCl, pH 8,0, 100
mM NaCl übe Nach wei e dialysie . Nach ca. 14 h wu de das NaCl aus dem Dialysepu e
en e n und die P obe ü wei e e 24 h gegen 20 mM T isH/Cl, pH 8,0 dialyise .
3.24.2 Reinigung on MiniGC-C
Die im Spal ansa z en hal ene P eScission-P o ease wu de, wie in Kap. 3.19.2 besch ieben, du ch
eine GST apTM-Säule (GE Heal hca e Eu ope GmbH, F eibu g) en e n . MiniGC-C und de
Fusionspa ne NusA-C489A wu den du ch Anionenaus ausch-Ch oma og aphie mi Hil e zweie
hin e einande geschal e en 5 ml HiT apTM QXL Säulen oneinande ge enn . Als Bindungspu e
wu de 20 mM T is/HCl, pH 8,0 e wende , wäh end de Elu ionspu e zusä zlich 1 M NaCl
en hiel . Die Fluss a e wu de au 1 ml/min einges ell und die Säule in 5 CV Bindungspu e
äquilib ie , mi dem Spal ansa z beladen, mi 4 CV Bindungspu e gewaschen und schließlich
eluie . Die Elu ionss u en wa en: 5 % (3 CV), 10 % (5 CV), 20 % (8 CV), 50 % (4 CV) und 100 %
(4 CV). F eies MiniGC-C eluie bei eine NaCl-Konzen a ion im Pu e on 200 mM wäh end de
NusA-Anhang nich o 500 mM NaCl on de Säule gewaschen wi d. Das Elua wu de ak ionie
au ge angen und diejenigen F ak ionen, in denen MiniGC-C gelek opho e isch nachgewiesen
3 Ma e ial und Me hoden 55
we den konn e (Kap. 3.10.2), wu den e einig und gegen 20 mM Kaliumphospha , pH 7,0, 100
mM NaCl dialysie und dann ü wei e e Expe imen e e wende .
3.25 Exp ession on NusA-Cys--ECD-GC-C und T x-ECD-GC-C
Sowohl T x-ECD-GC-C als auch NusA-Cys--ECD-GC-C wu den in E. coli O igami B (DE3)
exp imie . Die Bak e ien wu den in LB-Medium mi 100 µg/ml Ampicillin angezogen. Dazu
wu den jeweils 10 ml LB-Medium mi Einzelkolonien inokulie und bei 37 °C und 160 pm
geschü el . Diese Kul u en wu den nach e wa 10 h in 500 ml LB übe üh und übe Nach un e
den gleichen Bedingungen inkubie bis sie nach 14 h dazu e wende wu den um jeweils 2 × 2 l
LB-Medium au einen OD600-We on 0,3 anzuimp en. Die Bak e ienkul u en wu den solange bei
37 °C wei e inkubie bis eine OD600 on 0,9 e eich wa . Sobald dies de Fall wa , wu de die
Tempe a u au 20 °C gesenk und die Exp ession de Zielp o eine induzie . Dies geschah im Fall
on T x-ECD-GC-C mi 0,1 mM IPTG und im Fall on NusA-Cys--ECD-GC-C mi 1 mM IPTG.
Nach 18 h induzie e P o einexp ession wu den die Zellen du ch Zen i uga ion (10 min, 5500 × g,
4 °C) gee n e .
3.26 Reinigung on T x-ECD-GC-C
Die gee n e en Zellpelle s wu den in 20 ml Lysepu e p o G amm Nasszellgewich esuspendie
und 30 min au Eis ge üh . De Lysepu e en hiel 50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl,
10 mM Imidazol sowie jeweils e wa 100 mg/l DNase I und Lysozym und eine
P o easeinhibi o able e. Die esuspendie en Zellen wu den am Mic o luidize (110L,
Mic o luidics, New on, MA, USA) au geschlossen. Das Lysa wu de anschließend zen i ugie
(30 min, 12000 × g, 4 °C) und das unlösliche Pelle , welches das Fusionsp o ein en hiel , wu de in
50 ml Ha ns o pu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 8 M Ha ns o )
esuspendie . Nach 3 h Ex ak ion wu den die unlöslichen Bes and eile abzen i ugie (30 min,
12000 × g, 4 °C) und de lösliche Übe s and im Ve häl nis 1 : 1 mi Lysepu e e dünn . Dann
wu de de Ex ak ca. 2 h au Eis ge üh und schließlich e neu im Ve häl nis 1 : 1 mi Lysepu e
e se z , so dass die Endkonzen a ion an Ha ns o bei 2 M lag. Nach e wa 2 h Rüh en au Eis wa
in de P obe ein weiße Niede schlag p äzipi ie en P o eins sich ba , de du ch Zen i uga ion
en e n wu de (30 min, 12000 × g, 4 °C). De Übe s and de Zen i uga ion wu de au eine 5 ml
HiT apTM Chela ing HP Säulen, die mi Ni2+ beladen wa , au ge agen. Die Säule wu de mi 5 CV
56 3 Ma e ial und Me hoden
Bindungspu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol) gewaschen, und in
einem S u eng adien en mi Elu ionspu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 1 M Imidazol)
eluie . Die Elu ionss u en wa en 2,5 % (5 CV), 5 % (2 CV), 10 % (3 CV), 20 % (5 CV), 50 %
(4 CV) und 100 % (2 CV) und die Fluss a e be ug 1 ml/min. Diejenigen F ak ionen, in denen T x-
ECD-GC-C du ch SDS-PAGE (Kap. 3.10.2) nachgewiesen wu de, wu den e einig und gegen
20 mM T is/HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl dialysie . Wäh end diese Dialyse p äzipi ie e nahezu das
gesam e ge einig e T x-ECD-GC-C.
3.27 Reinigung on ECD-GC-C aus NusA-Cys--ECD-GC-C
Die Zellen wu den in 20 ml Lysepu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol,
0,05 % B ij-35, 100 mg/l DNase I, 100 mg/l Lysozym, eine P o easeinhibi o able e p o 500 ml
Pu e ) esuspendie , 30 min au Eis ge üh und anschließend am Mic o luidize (110L,
Mic o luidics, New on, MA, USA) au geschlossen. Das Lysa wu de ü 30 min bei 12000 × g und
4 °C zen i ugie und die unlöslichen Bes and eile in 80 ml Lysepu e esuspendie . Du ch
Ul aschallbehandlung wu de e such , einen Teil des noch nich olls ändig gelös en
Fusionsp o eins zu solubilisie en (LABSONIC® P Soni ie , mi 14 mm Schwingsonde, B. B aun
Bio ech In . GmbH, Melsungen; Zyklus 1, 100 % Ampli ude, 5 × 1 min). Nach eine wei e en
Zen i uga ion wu den die Übe s ände de Lyse und de Ul aschallbehandlung e einig und au
zwei hin e einande geschal e en, mi 2 CV 50 mM NiSO4 beladenen 5 ml HiT apTM Chela ing HP
Säulen au ge agen (1 CV = 10 ml). Nach dem Au agen de P obe wu den die Säulen mi 4 CV
Bindungspu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol) gewaschen, und mi
Elu ionspu e (50 mM T is/HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 1 M Imidazol) in einem S u eng adien en
eluie . Die Elu ionss u en wa en 2,5 % (3 CV), 5 % (2 CV), 10 % (2 CV), 15 % (2 CV), 20 %
(2 CV), 30 % (2 CV), 50 % (3 CV), 100 % (3 CV). Die Fluss a e bei de ch oma og aphischen
T ennung be ug 1 ml/min. Das Elua wu de ak ionie au ge angen und diejenigen F ak ionen, die
bei Imidazolkonzen a ionen o 50 mM und 100 mM eluie en und eine s a ke Abso p ion bei 280
nm zeig en, wu den e einig und mi P eScission-P o ease gespal en. Die Spal ung ollzog sich,
wie schon ü NusA-C489A-MiniGC-C besch ieben (Kap. 3.24.1), wäh end de Dialyse gegen 20
mM T is/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl. Anschließend wu de die NaCl Konzen a ion du ch eine
wei e e Dialyse au 50 mM gesenk und die P obe au zwei hin e einande geschal e en 5 ml
HiT apTM QXL Säulen au ge agen. Als Bindungspu e wu de 20 mM T is/HCl, pH 8,0, 50 mM
NaCl und als Elu ionspu e 20 mM T is/HCl, pH 8,0, 1 M NaCl e wende . Die Elu ion e olg e
3 Ma e ial und Me hoden 57
du ch einen S u eng adien en mi den S u en 10 % (5 CV), 20 % (5 CV), 30 % (5 CV), 50 %
(4 CV), 100 % (4 CV).
3.28 Anzuch on P. pas o is
P. pas o is Zellen wu den in YPD Medium bei 30 °C und 220 pm in einem Schü elinkuba o
angezogen. Da ans o mie e Vek o en in das Genom on P. pas o is inse ie we den und on do
s abil an alle Toch e zellen wei e gegeben we den, is es, nach eine ini ialen Selek ion posi i e
Klone, nich nö ig wäh end allen S u en de He eanzuch den Selek ionsd uck au ech zue hal en.
Die Selek ion on pPIC9K-Vek o en e olg e du ch die Kul i ie ung au Minimalmedium, da de in
diese A bei e wende e Exp essionss amm GS115 His idin-auxo oph is (Kap. 3.1). Diese
Auxo ophie wi d du ch das sich au den pPIC9K-Kons uk en be indliche HIS4-Gen kompensie .
3.29 Glyce in-Daue kul u en on P. pas o is Klonen
Zu An e igung on Glyce in-Daue kul u en wu den P. pas o is Einzelkolonien on Aga pla en
gepick und in 10 ml YPD Medium esuspendie . Die Kul u en wu den bei 30 °C und 220 pm ü
mind. 36 h geschü el . Sobald eine OD600 > 15 e eich wa , wu den in 2 ml K yoge äßen (Nunc
C yoTubeTM Vials, The mo Elec on LED GmbH, Langenselbold) jeweils 1,5 ml He ekul u mi 350
µl 87 % Glyce in e misch und in lüssigem S icks o einge o en. Nach einigen Minu en wu den
die Ge äße in eine -80 °C Ge ie uhe übe üh und do bis zu wei e en Ve wendung gelage .
3.30 In i o Selek ion on P. pas o is Klonen mi mul iplen Plasmidinse ionen
P. pas o is T ans o man en wu den wie in Kap. 3.12 besch ieben au MD-Aga pla en auspla ie .
Um Klone zu iden i izie en, die meh als ein Plasmid-Inse en hal en wu den die Kolonien on den
MD-Aga pla en au YPD-Aga pla en (Kap. 3.4.2) mi Gene icin übe geimp . Klone mi mul iplen
Inse ionen on pPIC9K-Kons uk en zeichnen sich du ch ih e Resis enz gegen selbs hohe
Konzen a ionen dieses An ibio ikums aus. Da nu bei e wa 1 % – 10 % de T ans o man en solche
Meh achinse ionen au e en müssen seh iele Klone ge es e we den.
Um dies zu e eichen, wu den ie MD-Pla en mi T ans o man en (> 500 Kolonien p o Pla e)
e wende . 2 ml s e iles Wasse wu de übe die Einzelkolonien de MD-Pla en pipe ie und mi

58 3 Ma e ial und Me hoden
einem Spa el so e eil , dass die He ezellen suspendie we den. Die Zellsuspension wu de
abgenommen und ih e Zelldich e du ch Abso p ionsmessung bei 600 nm bes imm (1 OD600 = 5 ×
107 Zellen/ml). Es wu den jeweils 106 Zellen au YPD-Aga pla en mi den Gene icin-
Konzen a ionen 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,75 mg/ml und 3 mg/ml auspla ie . Die Pla en wu den bei
30 °C inkubie bis nach 3 – 5 Tagen (je nach Gene icin-Konzen a ion) Kolonien sich ba wa en.
Von allen YPD-Pla en wu den Einzelkolonien ausgewähl und au neue YPD-Pla en mi den
gleichen Gene icin-Konzen a ionen ausges ichen um alsch-posi i e Klone zu iden i izie en.
Klone, die auch au den neuen Pla en inne halb on 3 – 5 Tagen Kolonien bilde en, wu den ü die
wei e Analyse ausgewähl .
3.31 Selek ion on Klonen mi dem Me hanol-Abbau-Phäno yp Mu +
Au g und de zelleigenen Alkohol-Oxidase AOX1 können GS115-He ezellen auch in Medium
wachsen, das Me hanol als einzige Kohlens o quelle en häl . Diese wild ypische
Wachs umsphäno yp wi d als Mu + bezeichne .
Da bei de Inse ion de pPIC9K-Kons uk e ins He egenom in sel enen Fällen de AOX1-P omo o
ze s ö wi d und die Klone die Fähigkei zum Wachs um au Me hanol als einzige
Kohlens o quelle e lie en (Mu S-Phäno yp), wu den die iden i izie en Mul i-Kopien-Klone (Kap.
3.30) au ih en Wachs umsphäno yp hin analysie . Die zu un e suchenden Klone wu den jeweils
gleichzei ig au Aga pla en mi Minimal-Dex ose-Medium (MD) und Minimal-Me hanol-Medium
(MM) auspla ie . Die Aga pla en wu den anschließend ü 2 Tage bei 30 °C inkubie . Diejenigen
Kolonien, die sowohl au den MD- als auch au den MM-Pla en no mal gewachsen sind, können
als Mu +-Klone iden i izie we den. Mu S-T ans o man en wachsen no mal au den MD-Pla en
abe kaum au den MM-Pla en.
Fü alle wei e en Exp essions es s und Zellanzuch en wu den lediglich Klone des Mu +-Phäno yps
e wende .
3.32 Exp essions es s on P. pas o is in Schü elkul u en
Mi den P. pas o is GS115 pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis Mu +-Klonen, die au Medium mi de
höchs en ge es e en Gene icin-Konzen a ion (3 mg/ml) wachsen können, wu den Exp essions es s
du chge üh . Als Nega i kon olle wu de P. pas o is GS115 pPIC9K e wende . Die Klone wu den
als Einzelkolonien au Näh aga pla en gepick , in 10 ml YPD Flüssigmedium esuspendie und ü
3 Ma e ial und Me hoden 59
24 h bei 30 °C und 230 pm geschü el . Von diesen Kul u en wu den jeweils 100 µl e wende um
25 ml BMGY-Kul u en zu inokulie en. Diese wu den bei 30 °C und 220 pm geschü el , bis eine
OD600 on 6 e eich wa . Dann wu den die Zellen abzen i ugie (5 min, 1500 × g, 4 °C) und in
jeweils 100 ml BMMY-Medium esuspendie . Die Kul u en wu den ü insgesam 4 Tage bei 30 °C
und 220 pm geschü el . Nach 24 h, 48 h und 72 h wu den den Kul u en jeweils 0,4 ml 100 %
Me hanol zugese z sowie je 1 ml P oben gezogen. Die P oben wu den abzen i ugie und die
Übe s ände und Zellpelle s du ch SDS-PAGE (Kap. 3.10.2) und Wes e n Blo (Kap. 3.10.3) au die
Exp ession des Zielp o eins hin analysie .
3.33 Fe men a ion on P. pas o is
Die Fe men a ion on P. pas o is e olg e in einem Bios a ® B Fe men a ionssys em mi einem 10 l
Kul u ge äß. Die Fe men a ion wu de mi einem Ausgangs olumen on 5 l Fe men a ionsmedium
du chge üh , wobei wäh end de Fe men a ion die Kohlens o - (Glyce in bzw. Me hanol) sowie
S icks o quellen (Ammoniak) zuge ü e wu den, so dass am Ende de Fe men a ion ein Volumen
on e wa 8 l e eich wa .
Eine Einzelkolonie on P. pas o is GS115 pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis wu de in 10 ml YPD-
Medium ü 24 h bei 30 °C und 220 pm im Schü elkolben angezogen. Danach wu den mi 100 µl
diese Kul u 250 ml BMGY inokulie und ü e wa 16 h bei 30 °C und 220 pm Schü eln in einem
1 l Schü elkolben inkubie bis eine OD600 on 5,5 e eich wa . Mi diese S a e kul u wu de de
Fe men e angeimp . Das Fe men a ionsmedium en hiel 100 mM Kaliumphospha , pH 6,0, 2 %
Pep on (w/ ), 1 % Caseinhyd olysa (w/ ), 1 % He eex ak (w/ ) und 4 % Glyce ol (w/ ). 100
µg/ml Ampicillin wu den zu Ve meidung bak e ielle Kon amina ionen zugese z . De pH-We des
Mediums wu de au 6 einges ell und wäh end de Fe men a ion alle 12 h kon ollie und e l.
du ch Zugabe on 25 % NH3 (w/ ) nachges ell . Die Schaumen wicklung im Fe men e wu de
du ch egelmäßige op enweise Zugabe eine 10 % Schaum e hü e -Lösung (An i oam Y-30,
Sigma-Ald ich, S einheim) gehemm . De im Medium gelös e Saue s o wu de du ch eine pO2-
Elek ode (Me le Toledo GmbH, Gießen) kon inuie lich gemessen. Die Kul u wu de mi 800 pm
ge üh und mi 10 l/min Lu begas , bis das im Medium en hal ene Glyce ol on den Zellen
e b auch wu de. Dies wa nach 20,5 h de Fall und äuße e sich in einem apiden Ans ieg des im
Medium gelös en Saue s o s bis au 100 %. An diesem Punk wu de de Kul u ü eine Daue on
9 h mi eine Ra e on 1,5 ml/min eine Glyce ol-Lösung (50 % Glyce ol (w/ ), 1,2 % PTM1-
Spu enelemen e ( / )) zuge ü e . 2 h o dem Ende de Glyce ol-Fü e ung wu den dem
60 3 Ma e ial und Me hoden
Fe men a ionsmedium auße dem noch 10 ml Me hanol zugese z um die Exp ession on Enzymen
zu dessen Me abolisie ung zu induzie en. Nach dem Ende de Glyce ol-Fü e ung wu de 1 h
gewa e , bis das im Medium en hal ene Glyce ol e b auch wa , was wiede um am Ans ieg des
O2-Signals e kennba wa . Dann wu de de Kul u mi eine Ra e on 0,2 ml/min Me hanol (98,8 %
Me hanol ( / ), 1,2 % PTM1-Spu enelemen e ( / )) zuge ü e , was die Exp ession des
Zielp o eins induzie . Die Zelldich e de Kul u ha e zu diesem Zei punk einen We on
185 mg/ml Nasszellgewich . Die Fe men a ion wu de 4 Tage und 8 S unden nach dem Beginn de
Me hanol-Fü e ung beende . Die Zellen wu den abzen i ugie (10 min, 5500 × g, 4 °C) und bei
-20 °C au bewah . De Übe s and de Zen i uga ion wu de bei 4 °C ge üh . Du ch op enweise
Zugabe on 1 M NaOH un e Rüh en wu de de pH des Zellübe s ands au einen We on 7,5
geb ach .
3.34 Exp ession on ekombinan en P o einen in COS-7 und HEK 293T
3.34.1 Zellanzuch
COS-7 Zellen wu den on de A bei sg uppe on P o . D . Ma kus Missle (Uni e si ä Müns e )
und HEK 293T Zellen wu den on de A bei sg uppe on P o . D . Clemens S eegbo n (Uni e si ä
Bay eu h) e hal en. Beide Zelllinien wu den in 250 ml Kul u laschen mi DMEM Medium, das
10 % Fe ales Rinde se um (FBS) und 1 % Pencillin-S ep omycin-Lösung (PS) en hiel , bei 37 °C
und 5 % CO2-Sä igung angezogen. Jeweils zwei Tage nach dem Animp en wa en die
Kul u laschen mi kon luen en Zellmonolaye n bewachsen. Bei de Subkul u de Zellen wu de
zue s das Medium abgesaug , die Zellen dann mi 10 ml o gewä m en PBS (37 °C) p o
Kul u lasche gewaschen und mi 1 ml eine Lösung on 0,26 % T ypsin und 0,02 % EDTA
behandel . Die Zellen wu den 5 min bei Raum empe a u inkubie , bis sie on de Ge äßwand
abgelös wa en. Dann wu den sie in 40 ml DMEM, 10 % FBS, 1 % PS esuspendie und in ie
neue 250 ml Kul u laschen übe üh .
3.34.2 T ans ek ion und P o einexp ession
Zu Vo be ei ung de P o einexp ession wu den die Zellen gespli e , mi Hil e eine Neubaue -
Zählkamme gezähl und anschließend in 10 cm Pe ischalen mi je 10 ml Medium esuspendie .
Eine Pe ischale wu de dabei mi 5 × 105 COS-7 Zellen ode mi 1,4 × 106 HEK 293T Zellen
3 Ma e ial und Me hoden 61
angeimp . Die angimp en Zellen wu den ü 18 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubie und dann
ans izie .
DEAE-Dex an Me hode
COS-7 Zellen wu den mi de Die hylaminoe hyl (DEAE)-Dex an Me hode ans izie . Dabei
wu de das Medium de Pe ischalen abgesaug und die Zellen in 6 ml 1 × TBS (50 mM T is/HCl,
pH 8,4; 150 mM NaCl) p o Schale gewaschen. Dann wu den zu jede Pe ischale 3,3 ml
T ans ek ionsmix (6,6 µg DNA, 100 mg DEAE-Dex an, 1 × TBS) pipe ie und die Zellen 30 min
bei 37 °C und 5 % CO2 inkubie . Anschließend wu de de Übe s and abgesaug und die Zellen mi
10 ml DMEM, 10 % FBS, 1 % PS und 100 µM Chlo oquine übe schich e . Die Zellen wu den ü
3 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubie , dann wu de das Medium abgesaug und 10 ml DMEM, 10 %
FBS, 1 % PS zugegeben. Nach 14 h wu de das Medium gegen DMEM, 1 % PS ausge ausch , da
das e ale Rinde se um IgGs en häl , welche die P o ein einigung s ö en.
Calciumphospha me hode
HEK 293T Zellen wu den mi Hil e de Calciumphospha me hode ans izie . Dazu wu den 8,4 µg
DNA in einem Gesam olumen on 15 µl mi 685 µl 250 mM CaCl2 und 700 µl 2 ×
T ans ek ionspu e (274 mM NaCl, 40 mM HEPES, 12 mM Glukose, 10 mM KCl, 1,4 mM
Na2HPO4) gemisch und ü 20 min bei Raum empe a u inkubie . Diese Ansa z wu de
anschließend au eine Pe ischale mi e wa 50 % kon luen en HEK 293T Zellen ge äu el . Die
Zellen wu den übe Nach bei 37 °C und 5 % CO2 inkubie bis am nächs en Mo gen das Medium
gewechsel wu de und, wie bei den COS-7 Zellen besch ieben, FBS aus dem Wachs umsmedium
en e n wu de. Bei de P o einexp ession ohne N-Glykosylie ungen en hiel das Medium
zusä zliche noch 2,5 µg/ml Tunicamycin.
Nach T ans ek ion de Säuge zellen wu den diese ü d ei Tage ohne Medienwechsel bei 37 °C und
5 % CO2 inkubie . Anschließend wu de de Kul u übe s and abgenommen, in lüssigem S icks o
schock-ge o en und bis zu wei e en Ve wendung bei -80 °C au bewah .
3.34.3 Reinigung on sek e ie em P o ein aus dem Kul u übe s and
Zu Reinigung on ECD-GC-C-Th -IgG aus dem Übe s and de Zellkul u en wu den
P o ein A Sepha ose Beads e wende . Zue s wu den e wa 600 µl de Beads-Lösung
68 3 Ma e ial und Me hoden
insensi i e nuclei enhanced by pola iza ion ans e ) (Mo is & F eeman, 1979; Bu um & E ns ,
1980) eingese z .
Ein gemessenes [1H, 15N]-HSQC-Spek um is zweidimensional mi eine Achse ü die chemischen
Ve schiebungen on 1H und eine Achse ü die chemischen Ve schiebungen on 15N. Im Spek um
ko elie en die de ek ie en Signale die Ve schiebungen on 15N-Ke nen und ih en ko alen
gebundenen P o onen. Bei P o einen gil das [1H, 15N]-HSQC-Spek um als „Finge abd uck“, da die
Signale de Rückg a amidg uppen jedes P o eins in einem spezi ischen Mus e angeo dne sind. Im
HSQC wi d ü jede Aminosäu e ein Rückg a -Signal, sowie e l. noch Sei enke ensignale,
e wa e . Die Ausnahme bilde P olin, das au g und de Rings uk u seine Sei enke e keine
Amidg uppe besi z und im Spek um nich au auch .
Die in einem [1H, 15N]-HSQC-Spek um en hal ene In o ma ion is äuße s nü zlich, da sie u. a.
Aussagen da übe zuläss , ob ein P o ein ge al e is . Auße dem wi d das HSQC-Expe imen bei
NMR-Bindungss udien eingese z und dien als G undlage ü iele meh dimensionale (3D und 4D)
NMR-Expe imen e.
In diese A bei wu de ou inemäßig das sog. FHSQC-Schema eingese z (Mo i e al., 1995).
[1H, 1H, 15N]-TOCSY-HSQC und [1H, 1H, 15N]-NOESY-HSQC
Bei g öße en P o einen kann die Auswe ung on TOCSY- und NOESY-Expe imen en du ch
Signalübe lage ungen deu lich e schwe we den. In diesen Fällen is es wünschenswe , die in
beiden Spek en en hal enen Resonanzsignale en lang eine zusä zlichen Dimension au zu ennen.
Bei den [1H, 1H, 15N]-TOCSY-HSQC- und [1H, 1H, 15N]-NOESY-HSQC-Expe imen en wi d die
In o ma ion aus den beiden homonuklea en Spek en du ch die [1H, 15N]-Ko ela ion edi ie
(G onenbo n e al., 1989; Tallu i & Wagne , 1996).
Neben de Ve ein achung on NOESY- und TOCSY-Spek en e lauben die d eidimensionalen
Expe imen e die eindeu ige sequen ielle Zuo dnung de Signale des [1H, 15N]-HSQC-Spek ums.
3.38.6 Au nahmepa ame e de in diese A bei gemessenen NMR-Expe imen e
Nach olgend sind die in de o liegenden A bei e wende en NMR-Expe imen e sowie die
Au nahmepa ame e au ge üh (Tab. 3.6). Alle im Rahmen diese A bei e wende en
Pulsp og amme wu den on D . K is ian Schweime (Leh s uhl Biopolyme e, Uni e si ä Bay eu h)
gesch ieben.

3 Ma e ial und Me hoden 69
Tab. 3.6: Übe sich de im Rahmen diese A bei au genommenen NMR-Spek en und ih e
Au nahmepa ame e .
Expe imen Puls-
p og amm NS SF0
(MHz) Dim Ke n SW
(Hz) TD P o ein/Pep id siehe
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 16 700,2 F1 15N 1667,5 256 P ou oguanylin
P ou o-STh
Abb. 4.6
Abb. 4.16
F2 1H 9765,6 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 16 700,2
F1 15N 1774,0 256 U oguanylin
STh
Abb. 4.10
Abb. 4.19 B
Abb. 4.35 B
F2 1H 9124,1 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 16 700,2 F1 15N 1206,3 256 STh L9Y
STh Y5R L9Y
Abb. 4.25 A
Abb. 4.25 B
F2 1H 9124,1 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 32 700,2 F1 15N 1667,5 256 MiniGC-C Abb. 4.33
F2 1H 9765,6 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 64 800,1 F1 15N 2270,4 256 MiniGC-C Abb. 4.34 A
F2 1H 9615,4 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 16 600,2 F1 15N 1581,5 256 U oguanylin
MiniGC-C
Abb. 4.34 B
Abb. 4.35 A
F2 1H 8417,5 1024
[1H, 15N]-HSQC hsqcN15.ks 16 800,1 F1 15N 1621,7 256 U oguanylin Abb. 4.41
F2 1H 11160,7 1024
[1H, 1H]-NOESY
Mischzei : 300 ms noesyw5.ks 16 800,1 F1 1H 9601,5 512 U oguanylin Abb. 4.9
F2 1H 10416,7 4096
[1H, 1H]-TOCSY dipsidp gse.
ks 16 600,2 F1 1H 7812,5 768 U oguanylin -
F2 1H 7812,5 4096
[1H, 1H, 15N]-
NOESY-HSQC
Mischzei : 300 ms
n15noesy.ks 16 700,2
F1 15N 1774,0 64
STh Abb. 4.19 AF2 1H 9103,3 256
F3 1H 9765,6 1024
[1H, 1H, 15N]-
TOCSY-HSQC n15 ocsy.ks 16 800,1
F1 15N 2108,3 32
STh -F2 1H 9601,5 196
F3 1H 11160,7 1024
NS: Anzahl de akkumulie en FIDs (engl.: numbe o scans); SF0: T äge equenz des P o onenkanals; Dim:
Dimension; SW: B ei e des spek alen Fens e s in de jeweiligen Dimension (engl: sweep wid h); TD: Anzahl de
gemessenen komplexen Da enpunk e (engl: ime domain).
3.38.7 Homonuklea e Zuo dnung
Fü die Zuo dnung on Resonanzsignalen in NMR-Spek en zu den en sp echenden Nuklei im
un e such en Pep id ode P o ein können d ei e schiedene A en on du ch NMR-Spek oskopie
e häl lichen In o ma ionen be ücksich ig we den (Ca anagh e al., 2006):
70 3 Ma e ial und Me hoden
–In e ak ionen übe ko alen e Bindungen hinweg, e mi el du ch skala e Kopplungen
–Wechselwi kungen übe den eien Raum hinweg, e mi el übe dipola e Kopplungen
–die chemisch-magne ische Umgebung de jeweiligen Nuklei, die sich in de chemischen
Ve schiebung niede schläg .
Diese In o ma ionen können du ch eine Reihe on Zuo dnungss a egien e hal en we den. Bei den
in diese A bei un e such en Pep iden wu den homonuklea e Expe imen e (TOCSY und NOESY)
zu sequen iellen Zuo dnung de P o onen e wende . Die Zuo dnung e olg e un e Ve wendung
unma kie e P oben. Zu Übe agung au die Signale des [1H, 15N]-HSQC-Spek ums und dami
zu Iden i izie ung de chemischen Ve schiebungen de Rückg a -S icks o a ome wu den [1H, 1H,
15N]-TOCSY-HSQC- und [1H, 1H, 15N]-NOESY-HSQC-Expe imen e mi 15N-ma kie en
Pep idp oben du chge üh .
Die homonuklea e Zuo dnung wu de nach de on Wü h ich e al. en wickel en S a egie
du chge üh (Wü h ich, 1986). Skala e Ko ela ionen, die du ch COSY und TOCSY e hal en
we den können, sind imme au P o onen besch änk , die inne halb eines Spinsys em, d. h. eines
Aminosäu e es s, o liegen. Dies lieg da in beg ünde , dass die 4JHH-Kopplungen, die ü eine
Ko ela ion übe die Pep idbindung hinweg e o de lich wä en, zu klein sind. Skala e
Ko ela ionsexpe imen we den benu z , um die P o onen esonanzen inne halb jedes Spinsys ems
zuzuo dnen.
Die du ch das NOESY-Expe imen e hal enen abs andsabhängigen Ko ela ionen können dazu
e wende we den, die einzelnen Spinsys eme sequen iell zu e binden. Zwa en hal en NOESY-
Spek en auch K euzsignale zwischen P o onen, die in de Pep idsequenz wei oneinande en e n
sind, jedoch is eine Meh hei de Signale zwischen e schiedenen Aminosäu en au de en
sequen ielle Nachba scha zu ückzu üh en. So sind insbesonde e zwischen dem 1HN eine
Aminosäu e i+1 und den 1HN, 1Hα und 1Hβ de jeweiligen Vo gänge aminosäu e i o mals in ensi e
NOESY-K euzsignale zu beobach en. Diese In o ma ion dien dazu, die jeweiligen Spinsys eme in
die ich ige sequen ielle Reihen olge zu b ingen. Aminosäu e-spezi ische chemische
Ve schiebungen einzelne P o onen e lauben es schließlich, eine Ab olge on au diese Weise
e knüp en Spinsys emen dem jeweils passenden Abschni de Pep id- bzw. P o einsequenz
zuzuo dnen.
4 E gebnisse 71
4 E gebnisse
4.1 Rekombinan e Exp ession und Cha ak e isie ung on humanem U oguanylin
4.1.1 Reinigungss a egie ü ekombinan es U oguanylin
Thomas Laube ha im Rahmen seine Disse a ion gezeig , dass sich humanes P oguanylin in E.
coli in gu e Ausbeu e exp imie en läss und dass aus dem ekombinan en P oguanylin das ak i e
Ho mon Guanylin du ch sau e Hyd olyse eigese z we den kann (Laube , 2003). Die
ekombinan e He s ellung on U oguanylin ha sich abe als schwie ig e wiesen. Zwa gelang die
Exp ession und Reinigung on P ou oguanylin. Jedoch konn e U oguanylin nich in ü
s uk u biologische S udien aus eichende Menge und Reinhei aus dem P oho mon eigese z
we den (Schus e , 2004). Eine al e na i e Reinigungss a egie, bei de die enzyma ische Spal ung
on P ou oguanylin zum ak i en Ho mon du ch das Ein ügen de E kennungssequenz on TEV-
P o ease zwischen P o egion und Ho mon begüns ig we den soll e, üh e eben alls nich zu
Isolie ung ak i en U oguanylins (Leo, 2009). Zu Beginn diese A bei wa kein Ve ah en
e ügba , um U oguanylin in ü NMR-S udien aus eichende Ausbeu e und Reinhei ekombinan
da zus ellen.
Das in diese A bei zu He s ellung on U oguanylin e wende e Plasmid wi d mi pET32a-Asp-
p es-p ou oguanylin bezeichne (siehe Anhang, Kap. 10.1.1). Es kodie ü ein Fusionsp o ein,
welches neben dem C- e minalen P ou oguanylin aus einem N- e minalem Thio edoxin-
Löslichkei sanhang (T x) und eine 46 Aminosäu en langen Ve bindungs egion, die einen
Hexahis idin-Reinigungsanhang en häl , bes eh . De Hexahis idinanhang e laub die ein ache
Reinigung des Fusionsp o eins du ch immobilisie e Me allionen-A ini ä sch oma og aphie
(IMAC). Schni s ellen ü Th ombin und P eScission-P o ease e lauben die Abspal ung de
Fusionspa ne on P ou oguanylin. Fü die Ausbildung de na i en S uk u on P ou oguanylin is
es essen iell, dass sich Disul idb ückenbindung sowohl in de Ho mon egion als auch inne halb de
P o egion ausbilden können. Um dies zu e möglichen wu de pET32a-Asp-p es-p ou oguanylin in
E. coli O igami B (DE3) exp imie . Diese S amm exp imie wede Thio edoxin-Reduk ase ( xB-)
noch Glu a hion-Oxido eduk ase (go -) und zeichne sich deswegen du ch ein oxida i es
Cy oplasma aus, in dem die Bildung on Disul idb ücken begüns ig wi d. Gegenübe ande en
Bak e iens ämmen mi oxida i em Cy oplasma, wie AD494 (DE3) ode O igami (DE3), zeig
O igami B (DE3) ein e besse es Wachs um . a. in Minimalmedium, so dass höhe e Zelldich en
e eich we den können.
72 4 E gebnisse
4.1.2 Exp ession in E. coli O igami B (DE3)
Das Plasmid pET32a-Asp-p es-p ou oguanylin wu de du ch Elek opo a ion in E. coli O igami B
(DE3) einge üh und posi i e T ans o man en wu de au LB-Aga mi Ampicillin als
Selek ionsmi el iden i izie . Zu Selek ion de ch omosomalen Mu a ionen in den Genen xB und
go en hiel das Medium noch die An ibio ika Kanamycin und Te acyclin. In den Flüssigkul u en
wu de au Kanamycin und Te acyclin, nich abe au Ampicillin e zich e , da ch omosomale Gene
wesen lich s abile als plasmidkodie e Gene sind und sich gezeig ha , dass insbesonde e in
Gegenwa on Te acyclin deu lich ge inge e Zelldich en e eich we den.
Nach de T ans o ma ion wu den Einzelkolonien e wende um LB-Vo kul u en anzuimp en. Mi
diesen wu de die Haup kul u au eine OD600 on 0,15 – 0,25 angeimp . Die Zellen wu den bei 37
°C au eine OD600 on 0,7 he angezogen und die Induk ion e olg e mi IPTG. Nach 5 S unden wa
die Exp ession abgeschlossen und die Zellen wu den gee n e (siehe Kap. 3.17). Die Exp ession
wu de mi SDS-PAGE übe p ü , indem Zellp oben o und nach de Induk ion au ein 19%iges Gel
au ge agen wu den (Abb. 4.1).
Au dem Gel is deu lich die In ensi ä szunahme eine Bande bei e wa 29 kDa zu beobach en. Diese
en sp ich dem Fusionsp o ein T x-P ou oguanylin, welches eine heo e ische Masse on 27,3 kDa
ha . Die In ensi ä de Bande zum Zei punk de le z en P obenen nahme (Abb. 4.1, Bahn 4) zeig ,
dass das e wende e Plasmid eine hohe Exp essions a e in O igami B (DE3) Zellen ha .
Abb. 4.1: Exp ession on T x-P ou oguanylin in E. coli O igami B (DE3). Die Anzuch e olg e
unma kie in LB-Medium. Zellp oben wu den au ein 19 % SDS-Polyac ylamidgel au ge agen.
S: low ange P o eins anda d; 1: Zellpelle o Induk ion; 2: 1 h nach Induk ion; 3: 3 h nach
Induk ion; 4: 5 h nach Induk ion.
4 E gebnisse 73
4.1.3 Reinigung on ekombinan em P ou oguanylin
4.1.3.1 Zellau schluss und Reinigung des Fusionsp o eins T x-P ou oguanylin
Die nach de Exp ession gee n e en Zellen wu den in Lysepu e esuspendie und mi Hil e eines
Mic o luidize s au geschlossen (siehe Kap. 3.18). Wäh end de Zelllyse wu de das Au e en g oße
Mengen p äzipi ie en P o eins beobach e . Nu ein ela i kleine An eil des Fusionsp o eins kann
im Rohex ak de Lyse ge unden we den, wäh end de g öß e Teil als unlösliche Bes and eil des
Lysepelle s o lieg . Um den An eil an löslichem T x-P ou oguanylin zu e höhen wu de das
Lysepelle in einem Ex ak ionspu e mi 4 M Ha ns o esuspendie . Du ch Zen i uga ion
wu den Zellbes and eile, die noch imme unlöslich wa en, en e n . Die gelelek opho e ische
Analyse zeig , dass du ch den Ha ns o de Haup an eil des Fusionsp o eins solubilisie we den
konn e. In de unlöslichen F ak ion is das Fusionsp o ein nu noch als dünne Bande zu beobach en
(Abb. 4.2, Bahnen 2 und 3).
De Übe s and de Ha ns o ex ak ion wu de im Ve häl nis 1:1 mi Bindungspu e de
Cobal ionen-Ch oma og aphie e dünn um die Konzen a ion an Ha ns o zu e inge n und das
Fusionsp o ein zu ückzu al en. Aus diesem Ex ak wu de T x-P ou oguanylin du ch Cobal ionen-
A ini ä sch oma og aphie isolie (Abb. 4.3). Die P o einlösung wu de au eine mi CoCl2 beladene
und in Bindungspu e äquilib ie e HiP epTM IMAC FF 16/10 Säule mi einem Be olumen on 20
ml au ge agen. Dabei wu de Co2+ als immobilisie es Me allion gewähl , da es im Ve gleich zu Ni2+
wenige unspezi ische P o eine binde . Die Elu ion e olg e in einem S u eng adien en mi einem
Abb. 4.2: Lyse de Zellen und Ha ns o ex ak ion on T x-P ou oguanylin. P oben wu den au
ein 19 % SDS-Gel au ge agen. S: low ange P o eins anda d; 1: Übe s and nach Lyse; 2: Pelle
nach Ha ns o ex ak ion; 3: Übe s and nach Ha ns o ex ak ion.

74 4 E gebnisse
Elu ionspu e , de 1 M Imidazol en hiel . Die A ini ä sch oma og aphie wu de du ch SDS-PAGE
analysie .
Bei eine Imidazolkonzen a ion on 200 mM wi d T x-P ou oguanylin on de Säule gewaschen.
Die eluie e F ak ion, die das Fusionsp o ein in eine Reinhei on übe 90 % en hiel , wu de
anschließend dialysie .
4.1.3.2 Spal ung des Fusionsp o eins mi P eScission-P o ease
Das ge einig e T x-P ou oguanylin wu de zu Abspal ung des Thio edoxin- und
Hexahis idinanhangs mi P eScission-P o ease behandel (siehe Kap. 3.19.1). Die p o eoly ische
Spal ung geschah wäh end de Dialyse du ch Zugabe de P o ease in den Dialyseschlauch.
Insgesam wu den Fusionsp o ein und P o ease e wa 24 h bei 4 °C inkubie . Vo und nach de
Spal ung en nommene P oben wu den gelelek opho e isch analysie (Abb. 4.4). Dabei zeig e sich,
dass die enzyma ische Spal ung du ch P eScission-P o ease nich olls ändig e olg . Nach 24 h
Spal ung kann imme noch T x-P ou oguanylin als schmale Bande au dem Gel beobach e we den.
Auch du ch länge e Inkuba ionszei en und Zugabe on meh P eScission-P o ease konn e keine
olls ändige Spal ung e eich we den. Die beiden Spal p oduk e lassen sich im Gel ein ach anhand
ih e Massen iden i izie en. De Thio edoxin-Hexahis idin-Anhang (T x) ha eine echne ische
Abb. 4.3: Cobal ionen-A ini ä sch oma og aphie on T x-P ou oguanylin. Au ge agen wu de
de Ha ns o ex ak . De e wende e Elu ionspu e en hiel 1 M Imidazol. A) Ch oma og amm.
B) 19 % SDS-Gel. S: low ange P o eins anda d; 1: au die Säule au ge agene
Ha ns o ex ak ; 2: Säulendu ch luss; 3: Elu ions ak ion bei 25 mM Imidazol; 4:
Elu ions ak ion bei 200 mM Imidazol.
4 E gebnisse 75
Masse on 17,6 kDa und läu somi au dem Gel deu lich obe halb des eien P ou oguanylin,
welches eine heo e ische Masse on 9,6 kDa besi z .
Um eines P ou oguanylin zu e hal en muss en aus dem Spal ansa z sowohl die zugese z e
P eScission-P o ease als auch das ungespal ene Fusionsp o ein und de eie Fusionsanhang en e n
we den. P eScission-P o ease besi z einen GST-Anhang und kann somi leich du ch eine
GST apTM-Säule abge enn we den. T x-P ou oguanylin und T x können du ch ih e
Hexahis idinanhänge mi Hil e on Nickelionen-A ini ä sch oma og aphie aus dem Gemisch
en e n we den. Ein mi Nickel beladenes Säulenma e ial wu de in diesem Fall gewähl , da Nickel
eine g öße e Bindungsa ini ä und -kapazi ä als Cobal ha .
Einzig P ou oguanylin binde wede an die GST apTM-Säule noch an die Nickelsäule und be inde
sich beide Male im Säulendu ch luss (Abb. 4.5). Das SDS-Gel bes ä ig , dass eies P ou oguanylin
im Säulendu ch luss de Nickelionen-Ch oma og aphie ge unden we den kann (Abb. 4.5 B Bahn
2). P ou oguanylin konn e in gu e Reinhei e hal en we den, es sind nu mi Mühe schwache
Banden on T x bzw. T x-P ou oguanylin zu e kennen. P ou oguanylin wu de gegen H2O bides .
dialysie und anschließend lyophilisie . Die Ausbeu e p o Li e Bak e ienkul u be ug 3,5 mg
eines P ou oguanylin.
Abb. 4.4: P escission-Spal ung on T x-P ou oguanylin. P oben wu den au ein 19 %iges SDS-
Gel au ge agen. S: low ange P o eins anda d; 1: o Spal ung; 2: nach Spal ung; 3:
P escission-P o ease.
76 4 E gebnisse
4.1.4 NMR-Spek oskopie mi 15N-ma kie em P ou oguanylin
Die Ma kie ung on P ou oguanylin mi dem NMR-ak i en S icks o iso op 15N e laub die
Cha ak e isie ung des ekombinan en P o eins mi els he e onuklea e NMR-Expe imen e. Dazu
wu den die Zellen E. coli O igami B (DE3)/pET32a-Asp-p es-p ou oguanylin in mi 15N
ange eiche em M9-Minimalmedium angezogen (siehe Kap. 3.4.1). Im Un e schied zu Anzuch in
LB-Medium wu den die Zellen nach de Induk ion jedoch bei 20 °C übe Nach inkubie , um dem
in Minimalmedium langsame en Zellwachs um Rechnung zu agen. Die Reinigung des 15N-
ma kie en P ou oguanylins ollzog sich dann analog zum nich ma kie en P o ein.
Die Iso openma kie ung on P o einen is Vo ausse zung ü de en Cha ak e isie ung du ch
he e onuklea e NMR-Expe imen e. Diese e lauben die Au ennung de Signale des NMR-
Spek ums en lang zusä zliche , du ch die NMR-ak i en He e oke ne bes imm en Dimensionen und
e inge n dami die Übe lage ung on Signalen, die o allem bei g öße en un e such en
Molekülen o p oblema isch is . Daneben e möglichen NMR-ak i e He e onuklei einen
e besse en Kohä enz ans e im Molekül, was sich in eine g öße en Sensi i i ä
meh dimensionale NMR-Expe imen e niede schläg .
Von 15N-ma kie em P ou oguanylin wu de eine [1H, 15N]-HSQC-Spek um au genommen (Abb.
4.6). Die Amidsignale im Spek um zeigen eine s a ke Dispe sion in de P o onendimension, was
da au hindeu e , dass das P o ein eine ausgep äg e Te iä s uk u besi z . Ein wei e es
augen älliges Me kmal des Spek ums is die Anzahl de de ek ie en Signale. Fü ekombinan es
Abb. 4.5: Nickelionen-A ini ä sch oma og aphie zu Reinigung on P ou oguanylin on T x und
T x-P ou oguanylin. De Elu ionspu e en hiel 1 M Imidazol. A) Ch oma og amm. B) 19 %iges
SDS-Gel. S: Molekula gewich ss anda d; 1: P obe o GSTTM-T ap und Nickelsäule; 2:
Säulendu ch luss Nickelsäule; 3: Elu ionspeak bei 25 mM Imidazol; 4: Elu ionspeak bei 500 mM
Imidazol.
4 E gebnisse 77
P ou oguanylin, einem P o ein mi 88 Aminosäu en und 7 P olinen, wä en 80 Resonanzsignale des
Pep id ückg a es zu e wa en. Im o liegenden Spek um kann man jedoch 155 Rückg a signale
un e scheiden. Auße dem äll au , dass einige Signale paa weise dich beieinande liegen. Dies
weis au das Vo liegen des P o eins in zwei, ode meh e en, Kon o ma ionen hin, die mi einande
im Aus ausch s ehen.
4.1.5 F eise zung on U oguanylin
Um zu zeigen, dass aus dem ekombinan en P ou oguanylin auch biologisch ak i es U oguanylin
δ(15N) [ppm]
δ(1H) [ppm]
Abb. 4.6: [1H, 15N]-HSQC Spek um on 15N-ange eiche em ekombinan em P ou oguanylin.
Signale de Sei enke en Glu amin und Aspa agin sind mi Linien ma kie . Nega i e Signale, die
du ch spek ale Fal ung en s ehen, sind o da ges ell . Das Spek um wu de au genommen bei
25 °C, in 50 mM Kaliumphospha , pH 7,8, 10 % D2O und 0,04 % NaN3. Die
P obenkonzen a ion be ug 400 µM.
84 4 E gebnisse
4.2.2 Exp ession on pET32a-Asp-p es-P ou o-STh in E. coli O igami B (DE3)
Das Plasmid pET32a-Asp-p es-P ou o-STh wu de du ch Elek opo a ion in E. coli O igami B
(DE3) einge üh . Die Selek ion au posi i e Klone e olg e du ch Auspla ie en de T ans o man en
au LB-Aga mi Ampicillin, Te acyclin und Kanamycin (siehe Kap. 3.17). Te acyclin und
Kanamycin dien en dabei de Selek ion on Klonen mi oxida i em Cy oplasma. Die au eine OD600
on e wa 0,2 angimp en LB-Haup kul u en e eich en inne halb on ca. 2 S unden eine OD600 on
0,8 und wu den mi 1 mM IPTG induzie . Da sich gezeig ha , dass das exp imie e T x-P ou o-
STh deu lich schlech e löslich is als T x-P ou oguanylin, wu de die Exp essions empe a u au
25 °C he abgese z , womi eine ge inge e Exp essions a e des ekombinan en P o eins e eich
we den soll. Da die Menge an F emdp o ein im Cy osol de Bak e ien bei 25 °C langsame ans eig ,
komm es in ge inge em Ausmaß zu Bildung on nu schwe löslichen Einschlusskö pe n. Um
dennoch hohe Zelldich en und dami eine hohe Ausbeu e an ekombinan en P o ein zu e eichen,
wu de die Exp ession übe Nach du chge üh . Zum Zei punk de E n e de Zellkul u lag de en
OD600 bei 3,2 – 4. Die Exp ession on T x-P ou o-STh wu de du ch SDS-PAGE übe p ü (Abb.
4.12). Au dem SDS-Gel is deu lich die induzie e Exp ession in Fo m eine Bande bei e wa
29 kDa zu e kennen. Dabei handel es sich um das ekombinan e T x-P ou o-STh, dessen
heo e isches Molekula gewich bei 27,4 kDa lieg . Die hohe In ensi ä de Bande ela i zum
Hin e g und de Wi sp o eine zeig , dass, bei den gewähl en Bedingungen, das he e ologe P o ein
in hohen Mengen exp imie wi d.
Abb. 4.11: Schema ische Ve gleich de P o eine P ou oguanylin (oben) und P ou oSTh (un en).
Die Ho mon- bzw. Toxin egion is blau ma kie . Disul idb ücken sind du ch Linien angedeu e .

4 E gebnisse 85
4.2.3 Reinigung on P ou o-STh
4.2.3.1 Zellau schluss und Reinigung on T x-P ou o-STh
Die Lyse de Bak e ien e olg e du ch den Mic o luidize . Wäh end de Lyse wu de die Bildung
eines lockigen Niede schlags unlöslichen P o eins beobach e , ähnlich wie bei de Reinigung on
P ou oguanylin jedoch in ge inge em Um ang. Wie e wa e is nahezu kein T x-P ou o-STh in de
löslichen F ak ion des Zellau schlusses zu inden (Abb. 4.13, Bahn 1). Das P o ein bilde unlösliche
Agg ega e und muss du ch Ha ns o in Lösung geb ach we den.
Es zeig sich auch, dass T x-P ou o-STh wesen lich schwe e löslich is als T x-P ou oguanylin, das
mi 4 M Ha ns o nahezu olls ändig solubilisie we den kann. Nach Ex ak ion mi 8 M Ha ns o
konn e zwa ein g oße Teil des Fusionsp o eins in Lösung geb ach we den, jedoch wa noch
imme ein deu liche An eil im unlöslichen Pelle de ek ie ba (Abb. 4.13).
Die unlösliche F ak ion wu de du ch Zen i uga ion om solubilisie en Fusionsp o ein ge enn .
Um das P o ein nach de Ha ns o ex ak ion wiede zu ückzu al en wu de die Ha ns o -
konzen a ion du ch Ve dünnung au 2 M gesenk , wobei ein kleine Teil des Fusionsp o eins
aus iel. Jedoch konn e diese An eil minimie we den, indem die Ve dünnung s u enweise, zue s
Abb. 4.12: Exp ession on T x-P ou o-STh in E. coli O igami B (DE3). Die Bak e ien wu den in
LB-Medium kul i ie . Zellp oben wu den au ein 19 % SDS-Polyac ylamidgel au ge agen. S:
low ange P o eins anda d; 1: Zellpelle o Induk ion; 2 – 5: Zellpelle s 1 h, 2 h, 3 h und 20 h
nach Induk ion.
86 4 E gebnisse
au 4 M Ha ns o und nach wenigen S unden Inkuba ion au 2 M Ha ns o , du chge üh wu de.
Abb. 4.13: Zellau schlusse on E. coli O igami B (DE3) pET32a-Asp-p es-P ou o-STh und
Ha ns o ex ak ion on T x-P ou o-STh. P oben wu den au ein 19 % SDS-Polyac ylamidgel
au ge agen. S: low ange P o eins anda d; 1: lösliche F ak ion de Lyse; 2: Pelle nach
Ha ns o ex ak ion; 3: Übe s and nach Ha ns o ex ak ion.
Abb. 4.14: Cobal ionen-A ini ä sch oma og aphie zu Reinigung on T x-P ou o-STh. A)
Ch oma og amm; B) 19 % SDS-Polyac ylamidgel. S: low ange P o eins anda d; 1:
au ge agene Ha ns o ex ak ; 2: Säulendu ch luss; 3: Elu ions ak ion bei 25 mM Imidazol; 4:
Elu ions ak ion bei 200 mM Imidazol.
4 E gebnisse 87
Aus dem e dünn en Ha ns o ex ak wu de das Fusionsp o ein du ch Cobal ionen-
A ini ä sch oma og aphie ge einig (Abb. 4.14). Es eluie on de Säule bei eine
Imidazolkonzen a ion on 200 mM. Die gelelek opho e ische Analyse de eluie en F ak ion
(Abb. 4.14 B) läss zwa e kennen, dass sie in ge ingem Um ang Ve un einigungen en häl , jedoch
kann angesich s de In ensi ä de Bande on T x-P ou o-STh on eine Reinhei on wei übe
95 % ausgegangen we den.
4.2.3.2 Spal ung on T x-P ou o-STh mi P eScission-P o ease
Zu Abspal ung des P ou o-STh on seinen Fusionspa ne n wu de das Fusionsp o ein mi
P eScission-P o ease behandel . Die enzyma ische Spal ung wu de wäh end de Dialyse des
Fusionsp o eins du ch Zugabe de P o ease in den Dialyseschlauch du chge üh . Die Spal ung des
Fusionsp o eins wu de gelelek opho e isch kon ollie (Abb. 4.15). P ou o-STh e schein nach de
Spal ung als dünne Bande bei e wa 10 kDa, was in gu em Einklang mi dem heo e ischen
Molekula gewich on 9,7 kDa s eh .
Die Iden i ä de Bande wu de du ch Pep idmassen inge abd uck bes ä ig . Selbs nach eine
Inkuba ionszei on 36 h wa die Spal ung des Fusionsp o eins nich olls ändig. Ein kleine Teil
des Fusionsp o eins blieb im Spal ansa z e kennba . Dies lieg mögliche weise da an, dass die
Pu e bedingungen ü die Spal ung du ch P eScission P o ease nich op imal wa en. De in de
Abb. 4.15: Enzyma ische
Spal ung des Fusionsp o eins
T x-P ou o-STh du ch
P eScission P o ease zu
F eise zung on P ou o-STh.
19 % SDS-Polyac ylamidgel.
S: low ange P o eins anda d;
1: P obe o de P eScission-
Zugabe; 2: P obe 36 h nach
Zugabe on P eScission
(Weiglmeie e al., 2013).
88 4 E gebnisse
Li e a u o geschlagene P eScission-Pu e en häl 1 mM DTT, das die Ak i i ä de Cys ein-
P o ease P eScission übe einen länge en Zei aum s abilisie . Alle dings kann au g und de in
P ou oSTh en hal enen Disul idb ücken kein Reduk ionsmi el wie DTT zum Spal pu e
zugegeben we den. Selbs du ch die nochmalige Zugabe eines Aliquo s de P o ease zum
Spal ansa z ließ sich keine olls ändige Spal ung e eichen.
T o z de nich ganz olls ändigen Spal ung wu de P ou o-STh aus dem Spal ansa z isolie . Analog
zu Reinigung on P ou oguanylin wu de die P eScission-P o ease du ch GST-
A ini ä sch oma og aphie aus de Lösung abge enn , wäh end T x und das ungespal ene
Fusionsp o ein T x-P ou o-STh du ch Nickelionen-A ini ä sch oma og aphie en e n wu den
(siehe Kap. 3.19.2). De Du ch luss, de nu noch P ou o-STh en hiel , wu de gegen 1 mM T isHCl,
pH 8.0 dialysie und anschließend lyophilisie .
4.2.4 [1H, 15N]-HSQC-Spek um on 15N-ma kie em P ou o-STh
Die Exp ession on 15N-ma kie em P ou o-STh e olg e du ch Kul i ie ung de Bak e ien in M9-
Minimalmedium, dem [15N]-(NH4)2SO4 als einzig e ügba e S icks o quelle zugese z wu de.
Ansons en un e schied sich die P o einexp ession und - einigung nich om ü unma kie es
P ou o-STh besch iebenen Vo gehen. Das lyophilisie e P ou o-STh wu de in 50 mM
Kaliumphospha pu e , pH 7.8 gelös . Dabei ha sich gezeig , dass die Löslichkei on P ou o-STh
im Ve gleich zu P ou oguanylin deu lich ge inge is . Es konn en lediglich e wa 50 µM P ou o-STh
in Lösung geb ach we den. Bei höhe en Konzen a ionen komm es bei Raum empe a u inne halb
wenige Minu en zu Niede schlagsbildung. Dennoch eich die Konzen a ion de P obe aus, um
ein [1H, 15N]-HSQC-Spek um au zunehmen (Abb. 4.16). Dieses zeig anhand de gu en Dispe sion
en lang de P o onendimension (6,6 ppm – 9,3 ppm), dass eine deu lich ausgep äg e Te iä s uk u
des P o eins o lieg , es also ge al e is . Das Au e en on paa weise nahe beieinande liegenden
Signalen, wie im HSQC-Spek um on P ou oguanylin (Abb. 4.6), is nich zu beobach en.
4 E gebnisse 89
4.2.5 T ypsin-Ve dau on P ou o-STh
Aus dem ge einig en P ou o-STh wu de das En e o oxin STh p o eoly isch du ch T ypsin
eigese z . T ypsin spal e nach A gininen und se z aus P ou o-STh, neben ande en F agmen en,
das C- e minale Pep id NSSNYCCELCCNPACTGCY ei, das genau de Sequenz on na i em
STh en sp ich . Die Spal ung e olg e bei 37 °C ü eine Daue on 18 S unden und wu de dann
du ch Senken des pH on 7,8 au 3,0, wodu ch T ypsin inak i ie wi d, un e b ochen (siehe Kap.
3.20.1). Aus dem Spal ansa z wu de STh du ch Umkeh phasen-HPLC ge einig (Abb. 4.17).
δ(15N) [ppm]
δ(1H) [ppm]
Abb. 4.16: [1H, 15N]-HSQC-Spek um on 15N-ma kie em P ou o-STh. Signale de
Sei enke en on Aspa agin und Glu amin sind du ch Linien gekennzeichne . Das Spek um
wu de bei 25 °C au genommen. De e wende e Messpu e enhiel 50 mM Kaliumphospha , pH
7,8, 10 % D2O ( / ) und 0,04 % NaN3 (w/ ). Die P obenkonzen a ion be ug 45 µM.

90 4 E gebnisse
Dabei e gib sich ein Ch oma og amm das e wa ungsgemäß g oße Ähnlichkei en mi dem on
gespal enem P ou oguanylin au weiß (Abb. 4.7). Bei e wa 26 % Ace oni il i ein deu liche
Elu ionsgip el au , de massenspek ome isch als STh iden i izie wu de. Die Lage dieses STh-
Elu ionsgip els is e gleichba mi dem Elu ions e hal en on U oguanylin. Dies is nich
e wunde lich angesich s de gleichen Länge und des ähnlichen isoelek ischen Punk s beide
Pep ide. Im Gegensa z zu U oguanylin is jedoch nich zu e kennen, dass de STh en sp echende
Elu ionsgip el eine Schul e hä e bzw. mi einem ande en Elu ionsgip el übe lage n wü de.
Die massenspek ome ische Analyse des isolie en Elu ionsgip els aus eine 15N-ma kie en P obe
zeig Signale bei 663,7 Da und bei 2065,5 Da (Abb. 4.18 A). Wäh end le z e e We as genau dem
heo e ischen Molekula gewich s on [15N]-STh (2065,3 Da) en sp ich , is die Iden i ä de
kleine en Masse ungeklä . O enba handel es sich um eine Ve un einigung, jedoch en sp ich die
Masse wede den o he gesag en Spal p oduk en on P ou o-STh noch den du ch Au op o eolyse
on T ypsin en s andenen Pep iden.
Ähnlich wie schon ü U oguanylin wu de auch ü STh das Vo liegen on Disul idb ücken
übe p ü , indem das Pep id mi DTT eduzie wu de und sein Massenspek um mi dem de
u sp ünglichen P obe e glichen wu de (Abb. 4.18 B). Dabei e gib sich eine Massenzunahme
du ch die Reduk ion on insgesam 6 Da, so dass da on ausgegangen we den kann, dass in dem
ge einig en Pep id 3 Cys ine o liegen.
Abb. 4.17: Isolie ung on STh du ch RP-HPLC. De Elu ionsgip el, de STh en häl , is du ch
einen P eil ma kie . De e wende e Elu ionspu e en hiel 80 % Ace oni il ( / ) und 0,1 %
TFA. De G adien is g ün da ges ell . Menge an gespal enem P ou o-STh: 10 mg.
4 E gebnisse 91
4.2.6 NMR-Spek oskopie mi ekombinan em STh
Zu nähe en Cha ak e isie ung des ge einig en STh wu den NMR-Spek en au genommen. Als
Hinweis au die Iden i ä des Pep ids wu den P o onen esonanzen mi We en aus de Li e a u
e glichen. Chemisch syn he isie es STh wu de be ei s in einigen ande en S udien NMR-
spek oskopisch un e such (Ga iepy e al., 1986; Ma ecko e al., 2008). Jedoch handel e es sich
dabei s e s um das e kü z e Pep id STh(6-19), das zwa die oxische Domäne, nich abe den N-
Te minus en häl . Dies sch änk die Ve gleichba kei de Li e a u we e mi den hie gemessenen
Abb. 4.18: Maldi-TOF-Massenspek en
on ekombinan exp imie em 15N-
ma kie em STh. A) Massenspek um
des STh-Elu ionsgip els aus Abb. 17.
Theo e ische Masse: 2065,3 [M+H]+. B)
Ve gleich de Massen on oxidie em
(g au) und eduzie em (schwa z) 15N-
STh. Die Massenzunahme on 6 Da bei
de Reduk ion deu e au das Vo liegen
on 3 Disul idb ücken im oxidie en
Pep id hin. Die sich ba e
Iso open e eilung is ein Resul a de
nich zu 100 % e olg en 15N-Ma kie ung
(Weiglmeie e al., 2013).
.
92 4 E gebnisse
Signalen ein S ück wei ein, da da on auszugehen is , dass die Gegenwa on 5 zusä zlichen
Res en, inklusi e eine a oma ischen Aminosäu e, die chemischen Ve schiebungen inne halb de
oxischen Domäne beein luss . Da die S uk u de Ke n egion on STh abe du ch die d ei ache
Disul id e b ückung besonde s s abilisie wi d, is nich zu e wa en, dass das Vo liegen ode
Fehlen des N-Te minus einen deu lichen Ein luss au die Kon o ma ion de es lichen Pep idke e
ha . Vo ausgese z , dass das ekombinan he ges ell e Pep id die ko ek e S uk u und
Disul id e b ückung ha , soll en dessen Resonanzsignale den Li e a u we en ähneln.
Abb. 4.19: NMR-Spek en on
ekombinan he ges ell em 15N-
ma kie em STh. Die P obe
en hiel 120 µM En e o oxin in
H2O, pH 3,0 und wu de bei 25 °C
gemessen. A) [1H, 15N]-NOESY-
HSQC, gezeig is die P ojek ion
des Spek ums au seine [1H, 1H]-
Ebene. K euz- und
Diagonalsignale de Amid-
p o onen sind, sowei sie
zugeo dne we den konn en, mi
ih e Sequenzposi ion und ih e
Posi ion in de jeweiligen
Aminosäu e besch i e .
B) [1H, 15N]-HSQC de P obe.
Die Resonanzen des Pep id-
ückg a s sind besch i e mi de
zugehö igen Aminosäu e im Ein-
Buchs aben-Code und de
Sequenzposi ion. Signale de
Sei enke en on Aspa agin und
Glu amin sind mi Linien
gekennzeichne .
.
δ(15N) [ppm] δ(1H) [ppm]
δ(1H) [ppm]
δ(1H) [ppm]
4 E gebnisse 93
Ausschni e de on ekombinan em STh gemessenen Spek en sind in Abb. 4.19 da ges ell .
Insgesam zeigen die Spek en on ekombinan em STh eine g oße Dispe sion de chemischen
Ve schiebungen, on 7,1 bis 9,0 ppm, die g öße is als e wa bei U oguanylin (Abb. 4.10). Dies geh
au den als Rings om-E ek bezeichne en magne ischen Ein luss de im Pep id en hal enen
a oma ischen Aminosäu en Y5 und Y19 in Ve bindung mi de , im Gegensa z zu unge al e en
Pep iden, ausgep äg en S uk u ie ung de disul id e b ück en Domäne zu ück.
Au allend an den Spek en is die ü ein 19-Aminosäu e-Pep id ge inge Zahl an de ek ie en
Resonanzsignalen, . a. im 15N-NOESY-Spek um (Abb. 4.19 A). Das [1H, 15N]-HSQC zeig , dass es
g oße In ensi ä sun e schiede zwischen den Signalen gib (Abb. 4.19 B). NMR-S udien an STh(6-
19) haben be ei s gezeig , dass insbesonde e de N- e minale Teil des Pep ids au g und ungüns ige
dynamische Eigenscha en nu s a k e b ei e e, und deshalb wenig in ensi e Resonanzsignale
lie e , de en Zuo dnung nich ode nu schwe möglich is (Ga iepy e al., 1986; Ma ecko e al.,
2008).
Die Zuo dnung de Resonanzen des ekombinan en STh e olg e un e Ve wendung on TOCSY
und NOESY-Expe imen en, wie be ei s ü U oguanylin besch ieben (Kapi el 4.1.6). Au diese
Weise gelang die Zuo dnung on P o onen de Aminosäu en C11 bis Y19, also des C- e minalen
Teils des Pep ids. Den es lichen Aminosäu en konn en mangels auswe ba e NOESY-K euzsignale
keine Resonanzen zugeo dne we den. Basie end au den cha ak e is ischen chemischen
Ve schiebungen ih e be a-P o onen konn en die beiden Se in-Res e des N-Te minus, S-2 und S-3,
iden i izie we den, jedoch e lauben die NOESY-Spek en nich die Bes immung de genauen
Sequenzposi ion. Ve gleich man die zugeo dne en chemischen Ve schiebungen mi We en aus de
Li e a u (Ma ecko e al., 2008), so zeig sich, eine wei gehende Übe eins immung (siehe Anhang,
Kap. 10.1.13). Kleine e Abweichungen können du ch die Gegenwa de N- e minalen
Aminosäu en und du ch ge ing ügige Abweichungen de Messbedingungen e klä we den.
4.2.7 Biologische Ak i i ä on ekombinan em U oguanylin und STh
Zu Un e suchung de biologischen Ak i i ä de ge einig en ekombinan en Pep ide U oguanylin
und STh muss ih e Wi kung au die on GC-C e mi el e Signal ansduk ion quan i izie we den.
T84-Zellen sind eine Adenoca cinoma-Zelllinie die on me as a ischem Da mk ebs-Gewebe
abgelei e is (Dha msa hapho n e al., 1984). Sie exp imie en in hohem Maße GC-C, jedoch keine
ande en Guanyla zyklasen (Singh e al., 1991). We den T84-Zellen de ex azellulä en S imulie ung
du ch die Pep ide U oguanylin und STh ausgese z , so komm es in azellulä zu Akkumula ion
100 4 E gebnisse
A3R D6E zusä zlich einge üh en A ginine nich zu En s ehung neue T ypsin-Schni s ellen
üh en und sich die Pep ide au diese Weise nich e kü zen lassen. Auße dem üh die Δ(70-72)-
Dele ion in P ou oguanylin Δ(70-72) D6E dazu, dass T ypsin die Pep idke e nich meh C- e minal
on R-69, sonde n C- e minal on K-66 hyd olysie . O ensich lich is die P o ease bei on STh
und U oguanylin abgelei e en Pep iden nich in de Lage, in de Nähe de disul id e b ück en
Ke n egion zu spal en.
In allen ie in Abb. 4.24 gezeig en Massenspek en können eine Reihe on Ve un einigungen
nachgewiesen we den. Diese de ek ie en Massen s immen wede mi F agmen en aus de zu
e wa enden Au op o eolyse on T ypsin übe ein noch en sp echen sie den ande en du ch
Abb. 4.24: ESI-Massenspek en on ekombinan ge einig em STh L9Y, STh Y5R L9Y (15N-
ma kie ), U oguanylin ΔTIA D6E und U oguanylin A3R D6E. Die heo e ischen Massen de
Pep ide ([M+2H]2+) sind: 1047,15 (STh L9Y), 1055,15 (15N-STh Y5R L9Y), 1027,15
(U oguanylin ΔTIA D6E und U oguanylin A3R D6E). Expe imen ell ge unden Massen die mi
diesen We en gu übe eins immen sind o gekennzeichne .

4 E gebnisse 101
yp ischen Ve dau de jeweiligen Vo läu e p o eine en s ehenden Pep iden.
4.3.4 Cha ak e isie ung on STh L9Y und STh Y5R L9Y
Sowohl STh L9Y als auch STh Y5R L9Y wu den 15N-ma kie , so dass [1H, 15N]-HSQC-Spek en
on beiden Pep iden au genommen we den konn en. Die Zuo dnung on Rückg a amidsignalen
on STh L9Y e olg e un e Ve wendung on NOESY-Spek en (Abb. 4.25 A). Dies wa ü STh
Y5R L9Y nich möglich, da das Pep id nu in ge ingen Mengen he ges ell we den konn e (Kap.
3.2). Die Zuo dnung on Signalen im HSQC-Spek um on STh Y5R L9Y (Abb. 4.25 B) e olg e
du ch Ve gleich mi den Spek en on STh L9Y und STh (Abb. 4.20 B).
Abb. 4.25: [1H, 15N]-HSQC-
Spek en on 15N-ma kie em A)
STh L9Y und B) STh Y5R L9Y.
Die P oben en hiel en 109 µM
STh L9Y bzw. 35 µM STh Y5R
L9Y und wu den in H2O, pH 3,0
bei 10 °C gemessen. Die
Resonanzen des Pep id ückg a s
sind besch i e mi de
zugehö igen Aminosäu e im Ein-
Buchs aben-Code und de
Sequenzposi ion. Das ge al e e
Signal de Sei enke e on R-5 is
o da ges ell . Sei enke en-
signale de Aspa agine sind
du ch Linien e bunden.
.
δ(1H) [ppm]
δ(1H) [ppm]
δ(15N) [ppm] δ(15N) [ppm]
102 4 E gebnisse
Zwa deu en die Massenspek en beide Pep ide au Ve un einigungen de P oben hin, jedoch sind
in den gemessenen HSQC-Spek en kaum in ensi e Signale zu e kennen, die nich auch in den STh-
Spek en gemessen wu den (Abb. 4.20), so dass o zdem eine ela i e hohe Reinhei angenommen
we den kann. Dies gil au g und des ge ingen Signal-zu-Rausch-Ve häl nisses nu beding ü STh
Y5R L9Y.
Die Lage de Rückg a amidsignale in den Spek en on STh L9Y, STh Y5R L9Y und STh (Abb.
4.20 B) is seh ähnlich, so dass angenommen we den kann, dass alle d ei Pep ide die gleiche
Kon o ma ion und Disul id e b ückung au weisen. Ge ing ügige Abweichungen de bekann en
Signale können au den Ein luss de Sei enke en de mu ie en Aminosäu en zu ückge üh we den.
Die Ak i i ä de mu ie en STh-Analoga wu de in einem in i o Tes bes imm (Abb. 4.26). Dabei
wu de, wie schon ü U oguanylin und Wild yp-STh (Abb. 4.21), de bei T84-Zellen du ch die
Pep ide s imulie e Ans ieg de in azellulä en cGMP-Konzen a ion quan i izie .
In Abb. 4.26 äll au , dass . a. bei nied igen Konzen a ionen (10 – 100 nM) die mu ie en STh-
Analoga nu eine gegenübe dem Wild yp deu lich eduzie e cGMP-P oduk ion an egen.
Auße dem is de gemessene cGMP-Ans ieg bei STh L9Y s ä ke und se z ühe ein als bei STh
Abb. 4.26: In i o Ak i i ä s es mi T84-Zellen. STh L9Y, STh Y5R L9Y sowie STh als
Kon olle wu den jeweils in den Konzen a ionen 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM und 900
nM dem ex azellulä en Medium de Zellen zugese z . Nach 1 S unde Inkuba ion wu de die
on den Pep iden s imulie e in azellulä e cGMP-P oduk ion bes imm . Au ge agen is das
a i hme ische Mi el aus je zwei du chge üh en Messungen. Die Fehle balken kennzeichnen
die Abweichungen de Messwe e oneinande .
4 E gebnisse 103
Y5R L9Y. O enba e inge n beide Punk mu a ionen, L9Y und Y5R, die Ak i i ä des
En e o oxins. Dieses E gebnis bes ä ig , dass de P opep id- e mi el e Fal ungsmechanismus on
STh auch Mu a ionen inne halb de En e o oxinsequenz und selbs die Ein üh ung eine posi i en
Ladung ole ie . Wei e hin zeig Abb. 4.26, dass die Ak i i ä on STh du ch bes imm e
Punk mu a ionen beein luss we den kann.
4.3.5 Ak i i ä on U oguanylin A3R D6E und U oguanylin ΔTIA D6E
Fü STh ha sich gezeig , dass die Ein üh ung on Punk mu a ionen nich zu einem gänzlichen
Ve lus de Ak i i ä des Pep ids üh . Um dies auch ü U oguanylin zu übe p ü en wu den die
Ak i i ä en on U oguanylin A3R D6E und U oguanylin ΔTIA D6E bes imm (Abb. 4.27). Ein
Ve gleich de E gebnisse on U oguanylin A3R D6E und U oguanylin ΔTIA D6E e laub auße dem
eine Aussage übe den Ein luss on Sequenzen, die die im Vo läu e p o ein N- e minal on de
Ho monsequenz liegen, au den Mechanismus de Fal ung. Wie in Abb. 4.22 schema isch
da ges ell , wu de im Kons uk P ou oguanylin Δ(70-72) D6E die TIA-Sequenz, d. h. die
Sequenzposi ion 70-72 on P ou oguanylin, dele ie .
Abb. 4.27: In i o Ak i i ä s es mi T84-Zellen. U oguanylin A3R D6E, U oguanylin ΔTIA
D6E und U oguanylin wu den jeweils in e schiedenen Konzen a ionen im Näh medium
de Zellen gelös . Nach 60-minü ige Inkuba ion wu de die in azellulä e cGMP-
Konzen a ion bes imm . Die da ges ell en We e en sp echen jeweils dem a i hme ische
Mi el aus zwei du chge üh en Messungen. Abweichungen de Messwe e oneinande sind
du ch die Fehle balken angedeu e .
104 4 E gebnisse
Die E gebnisse des in i o Ak i i ä s es zeigen, dass U oguanylin A3R D6E eine mi U oguanylin
e gleichba e Ak i i ä besi z . Wede die Mu a ion D6E noch die du ch das A ginin an Posi ion 3
zusä zlich einge üh e posi i e Ladung üh en zu eine signi ikan en Ve inge ung ode S eige ung
de Ak i i ä . Gleichzei ig wu de ü das Pep id U oguanylin ΔTIA D6E übe haup keine biologische
Ak i i ä nachgewiesen. Die Dele ion de d ei Aminosäu en T70, I71 und A72 in P ou oguanylin
üh also dazu, dass das C- e minal da on gelegenen Ho mon nich meh ge al e we den kann.
Auch die Lösungss uk u on P oguanylin (Laube e al., 2003) leg nahe, dass die Aminosäu en,
die N- e minal de Ho mon egion liegen, une lässlich ü die ko ek e O ien ie ung de selben im
Gesam p o ein sind.
4.4 Ex azellulä e F agmen e on GC-C
Die Ve ügba kei de e schiedenen Pep idliganden is eine wich ige G und o ausse zung ü die
Au klä ung des molekula en Mechanismus de Ligandene kennung und de kon o ma ionellen
Signal ansduk ion inne halb on GC-C. Fü die Du ch üh ung on Bindungss udien is es ebenso
wich ig, die ex azellulä e Ligandenbindungsdomäne unk ional exp imie en zu können. Pa allel
zu E ablie ung des Exp essionssys ems ü die disul id e b ück en Agonis en wu de e such ,
F agmen e on GC-C zu exp imie en, welche das ü de en Bindung no wendige ex azellulä e
E kennungsmo i en hal en.
Zwa gib es ela i ein ach zu kul i ie ende humane Zelllinien, welche GC-C exp imie en, e wa
T84 Zellen ode Caco2 Zellen (Singh e al., 1991; Waldman e al., 1998). Jedoch s ell die
Reinigung des 1050 Aminosäu en um assenden P o eins aus diesen Quellen keine be iedigende
S a egie zu Gewinnung on P oben ü Bindungss udien da . In den genann en Zell ypen wi d
GC-C nu mi äuße s ge ingen Exp essions a en exp imie , so dass nu kleine Mengen nich
homogenen P o eins isolie we den könn en. Biophysikalische Analyseme hoden, wie NMR-
Spek oskopie ode Rön genk is allog aphie, e o de n jedoch ela i g oße Mengen einen und
homogenen P o eins, was nu du ch ekombinan e Exp essionsme hoden e eichba is . Auße dem
is GC-C ein T ansmemb anp o ein und kann nich ohne wei e es in wäss ige Lösung solubilisie
we den. Jedoch bes eh die Chance, dass die isolie e ex azellulä e Domäne, ode geeigne e
F agmen e de selben, eine ü die Un e suchung ih e Bindungseigenscha en aus eichende
Löslichkei haben.
4 E gebnisse 105
4.4.1 Exp ession und Cha ak e isie ung on MiniGC-C
Da die gesam e ex azellulä e Domäne (ECD) on GC-C mi 407 Aminosäu en ela i g oß ü
NMR-spek oskopische Un e suchungen is , wä e es on Vo eil, ein kleine es F agmen de ECD
zu iden i izie en, welches das Ligandenbindungsmo i en häl und isolie exp imie we den kann.
Alle dings muss dieses F agmen nich nu löslich sein, sonde n auch in seine isolie en Fo m
annähe nd die S uk u einnehmen, welche es im Kon ex des Gesam p o eins ha , so dass die
s uk u ellen Vo ausse zungen ü die Ligandenbindung wei e hin gegeben sind.
Das Kons uk MiniGC-C, das de isolie en memb an-p oximalen Subdomäne de ECD on GC-C
en sp ich (Kapi el 1.5.3), is mi eine Länge on nu 197 Aminosäu en ein iel e sp echende
Kandida ü die Du ch üh ung on Bindungss udien mi STh ode U oguanylin. Fü das on GC-C
aus Schweinen (Sus sc o a) abgelei e e MiniGC-C wu de gezeig , dass es sich unabhängig al en
kann und in ü NMR-S udien aus eichenden Mengen ekombinan he ges ell we den kann (Laube
e al., 2009; Tid en, 2003). Da übe hinaus wu de eine Wechselwi kung zwischen po zinem
MiniGC-C und dem hi zes abilen En e o oxin STp nachgewiesen.
Im Rahmen diese Dok o a bei wu de zunächs e such , die humane Va ian e on MiniGC-C zu
exp imie en und zu einigen und anschließend die Bindung zwischen MiniGC-C und hi zes abilem
En e o oxin STh bzw. U ouganylin zu ep oduzie en.
4.4.1.1 Exp ession in O igami B (DE3)
Da MiniGC-C lau dem S uk u model (siehe Kap. 1.5.3) übe eine Disul idb ücke e üg , wu de
es in E. coli O igami B (DE3) exp imie (siehe Kap. 3.22). Um die Löslichkei des P o eins zu
e höhen wu de ein N- e minale NusA-Löslichkei sanhang e wende , de du ch P eScission-
P o ease abspal ba is . Fü die Exp ession wu de das Plasmid pET43.1a-NusA-C489A-miniGC-C
e wende . Da NusA übe un e b ück e Cys eine e üg , is in diesem Kons uk de ü den
Löslichkei sanhang kodie ende Exp essions ek o pET43.1a du ch o sge ich e e Mu agenese so
e ände wo den, dass das C- e minal, und dami dem Fusionspa ne MiniGC-C am nähes en
liegende, Cys ein 489 on NusA du ch Alanin e se z is . Dadu ch wi d die Ge ah eine
Fehl e b ückung inne halb des Fusionsp o eins minimie .

106 4 E gebnisse
Das Plamsid pET43.1a-NusA-C489A-miniGC-C wu de du ch Elek opo a ion in E. coli O igami B
(DE3) ans o mie und pos i ie Klone wu den au Ampicillin-hal igem LB-Aga selek ie .
Posi i e Kolonien wu den e wende um LB-Flüssigkul u en anzuimp en. Bei eine Zelldich e on
OD600 = 0,7 wu de die Exp ession des Fusionsp o eins du ch die Zugabe on 0,1 mM IPTG
induzie . Die Exp ession e olg e bei 25 °C ü 5 h. Anschließend wu den die Zellen gee n e .
Abb. 4.28 zeig das SDS-Gel zu Analyse de Exp ession on NusA-C489A-MiniGC-C. Das
Fusionsp o ein ha ein Molekula gewich on 82,6 kDa. 6 S unden nach dem Beginn de Induk ion
zeig sich ein s a ke Bande bei e wa 80 kDa, die dem exp imie en Fusionsp o ein NusA-C489A-
MiniGC-C en sp ich .
Bei de He s ellung 15N-ma kie e P oben wu den die Bak e ien in 15N-ange eiche em M9-
Medium kul i ie . In M9-Medium e olg e die P o einexp ession übe Nach und daue e e wa 15
h, die Kul i ie ung e lie ansons en abe un e den gleichen Bedingungen wie in LB.
4.4.1.2 Reinigung on MiniGC-C
Nach de E n e wu den die Zellen am Mic o luidize au geschlossen und de Zellex ak
gelelek opho e isch analysie . Es zeig e sich, dass NusA-C489A-MiniGC-C . a. in de löslichen
F ak ion des Lysa s nachgewiesen we den konn e (Abb. 4.29 B, Bahn 2). Da das Fusionsp o ein
übe einen Hexahis idin-Anhang e üg , e olg e seine wei e e Reinigung du ch Nickelionen-
A ini ä sch oma og aphie. In Abb. 4.29 A is das Ch oma og amm de Reinigung abgebilde . Bei
25 mM Imidazol eluie en im Wesen lichen Ve un einigungen, u. a. ein P o ein das mi einem
beobach ba en Molekula gewich on e wa 70 kDa eine ähnlich G öße ha wie das Fusionsp o ein.
Abb. 4.28: Exp ession on NusA-
C489A-MiniGC-C in E. coli
O igami B (DE3). Die Bak e ien
wu den in LB-Medium kul i ie .
Zellp oben wu den au ein 10 %
SDS-Ac ylamid-Induk ionsgel
au ge agen. S: low ange
P o eins anda d; 1: Zellpelle o
Induk ion; 2: Zellpelle s 5 h nach
Induk ion.
4 E gebnisse 107
Wei e e Analysen diese F ak ionen haben jedoch gezeig , dass sie nu seh ge inge Mengen NusA-
C489A-MiniGC-C en hal en. In F ak ionen, die eine Imidazolkonzen a ion on 100 mM und 200
mM Imidazol en sp echen, kann im SDS-Gel eine Bande bei e wa 80 kDa nachgewiesen we den,
die dem Fusionsp o ein en sp ich (Abb. 4.29 B).
Zwischen dem NusA-Anhang und MiniGC-C lieg eine P eScission-Schni s elle, so dass de
Löslichkei sanhang du ch P eScission p o eoly isch en e n we den kann. Nach e wa 15-s ündige
Spal ung e schein au dem SDS-Gel eine Bande bei e wa 25 kDa, was gu mi dem echne ischen
Molekula gewich on 22,7 kDa übe eins imm (Abb. 4.30 B Bahn 2). Um die P o ease
anschließend aus dem Gemisch zu en e nen wu de dieses au eine GST-T ap Säule au ge agen.
De Säulendu chb uch, de nu noch wenig P eScission en häl (Abb. 4.30 B Bahn 3) wu de au
eine QXL-Anionenaus ausche säule au ge agen um MiniGC-C on NusA und noch o handenem
ungespal e em Fusionsp o ein zu ennen. Da de NusA-Anhang mi einem pI on 4,7 ela i saue
is , binde e wesen lich s ä ke an die Q-Sepha ose als das nu schwach sau e MiniGC-C (pI = 5,7)
Abb. 4.29: Reinigung on
NusA-C489A-MiniGC-C
du ch Nickelionen-A ini ä s-
ch oma og aphie. De
Elu ionspu e en hiel 20 mM
T is/HCl, pH 7,9, 500 mM
NaCl, 1 M Imidazol.
A) Ch oma og amm. B) 15 %
SDS-Polyac ylamidgel de
Reinigung.
S: Molekula gewich s-
s anda d; 1: Pelle de Lyse;
2: Übe s and de Lyse; 3:
Säulendu chb uch; 4: Elu ion
bei 25 mM Imidazol; 5 u. 6:
Elu ion bei 100 mM Imidazol;
7: Elu ion bei 200 mM
Imidazol.
108 4 E gebnisse
und eluie demen sp echend bei deu lich höhe en Salzkonzen a ionen. Abb. 4.30 zeig
Ch oma og amm und SDS-Gel zu Analyse de T ennung. MiniGC-C eluie ab e wa 75 mM NaCl
on de Säule, wäh end de NusA-Anhang e s bei Salzkonzen a ionen on 500 mM und meh
eluie . Die gelelek opho e ische Analyse zeig , dass das ge einig e MiniGC-C hoch ein is (Abb.
4.30 B Bahn 5).
4.4.1.3 G ößenausschlussch oma og aphie
Zu Kon olle de Reinhei und zu Abschä ung des Molekula gewich s on MiniGC-C wu de eine
G ößenausschlussch oma og aphie du chge üh (siehe Kap. 3.35). Zu Kalib ie ung de
e wende en Supe dex 75 Säule wu den dabei die P o eine Ribonuclease A (MW = 13700 Da),
Chymo ypsinogen (MW = 25000 Da) und O albumin (MW = 44000 Da) gewähl und als Ma ke
ü das To olumen de Säule dien e das polyme e Saccha id Blue Dex an. Die Abschä zung be uh
Abb. 4.30: Isolie ung on
MiniGC-C du ch Anionen-
aus auschch oma og aphie.
De Elu ionspu e en hiel 20
mM T isHCl, pH 8,0, 500 mM
NaCl.
A) Ch oma og amm. B) 19 %
SDS-PAGE de P eScission-
Spal ung und de
ch oma g aphischen T ennung.
S: Molekula gewich s-
s anda d; 1: P obe o
P eScission-Zugabe; 2: P obe
nach P eScission-Zugabe; 3:
Säulendu ch-b uch; 4: Elu ion
bei 75 mM NaCl; 5: Elu ion
bei 100 mM NaCl; 6: Elu ion
bei 500 mM NaCl.
4 E gebnisse 109
au de Annahme, dass alle e wende en Re e enzp o eine und MiniGC-C eine annähe nd gleiche,
globulä e, äuße e Fo m haben. Abb. 4.31 zeig das Ch oma og amm sowie die e s ell e Eichge ade
zu G ößenabschä zung. Dass im Ch oma og amm nu ein Elu ionspeak e kennba is deu e da au
hin, dass das P o ein ela i saube ge einig wu de und zumindes keine Ve un einigungen
o handen sind, de en Molekula gewich sich on MiniGC-C deu lich un e scheide . Die aus dem
Elu ions olumen on MiniGC-C abgelei e e Masse be äg 21,8 kDa und lieg dami ela i nahe
am echne ischen We on 22,8 kDa (Abweichung 4,4 %).
4.4.1.4 CD-Spek oskopie mi MiniGC-C
Zu e s en s uk u ellen Cha ak e isie ung des ge einig en MiniGC-C wu de CD-Spek oskopie
e wende (siehe Kap. 3.37). Das Fe n-UV-CD-Spek um on MiniGC-C deu e da au hin, dass
Abb. 4.31: G ößenausschluss-
ch oma og aphie on MiniGC-C.
Ve wende wu de eine Supe dex 75
Säule und als Pu e 20 mM
Kaliumphospha , pH 7,0, 100 mM
NaCl. A) Ch oma og amm. Die
Elu ions olumina on Blue Dex an
und de Re e enzp o eine
Ribonuclease A, Chymo ypsinogen
und O albumin sind gekennzeichne .
B) Eichge ade zu Bes immung des
Molekula -gewich s. Die Posi ion on
MiniGC-C au de Ge aden is o
ma kie . Du ch linea e Reg ession
wu de die Ge adengleichung
bes imm :
Ka = -0,262 * log(MW) + 1,396
Ko ela ionskoe izien :
R2 = 0,985
116 4 E gebnisse
4.4.2.2 Reinigung on T x-ECD-GC-C und NusA-Cys--ECD-GC-C
Die gee n e en Zellen wu den zunächs au geschlossen und es wu de gep ü , ob sich das P o ein im
löslichen Übe s and ode im unlöslichen Pelle be and. T x-ECD-GC-C wa olls ändig unlöslich
und nu im Pelle nachweisba (Abb. 4.37 B, Bahn 1). Das Fusionsp o ein wu de deswegen mi 8 M
Ha ns o aus dem Pelle ex ahie . Selbs die hohe Ha ns o konzen a ion konn e nu einen Teil
des o handen P o eins solubilisie en, was aus dem Ve gleich on P oben aus Pelle und Übe s and
de Ha ns o ex ak ion he o geh (Abb. 4.37 B, Bahnen 3 und 4). Es wu de e such , T x-ECD-
GC-C du ch Ve dünnung des Ha ns o s au eine Endkonzen a ion on 2 M zu ückzu al en, was
dazu üh e, dass ein g oße Teil des solubilisie en P o eins wiede p äzipi ie e (Abb. 4.37 B,
Bahnen 5 und 6). Le z endlich konn e nu ein ela i kleine Teil des exp imie en Fusionsp o eins
in Lösung gehal en we den. Diese Teil wu de du ch Nickelionen-A ini ä sch oma og aphie
ge einig (Abb. 4.37 A), was zu eine insgesam g oßen Reinhei des P o eins üh e (Abb. 4.37 B,
Bahn 10). Jedoch ging dieses P o ein binnen wenige S unden nach dem Ch oma og aphie-Sch i
du ch P äzipi a ion as olls ändig e lo en. Insgesam wu de aus dem Reinigungs e such
geschlossen, dass pET32a-ECD-GC-C au g und de ehlenden Löslichkei kein geeigne es Sys em
zu Exp ession de ECD is .
NusA-Cys--ECD-GC-C wu de zwa wenige s a k exp imie , wa jedoch wesen lich besse löslich
Abb. 4.36: Induk ion de Exp ession on TRX-ECD-GC-C (Bahnen 1 und 2) und NusA-Cys--
ECD-GC-C (Bahnen 3 und 4). Zellp oben wu den o de Induk ion und jeweils 18 h nach
Beginn de Induk ion au 10 % SDS-Polyac ylamidgele au ge agen. S: low ange
Molekula gewich ss anda d; Exp ession on TRX-ECD-GC-C: 1: o Induk ion; 2: 18 h nach
Induk ion; Exp ession on NusA-Cys--ECD-GC-C: 1: o Induk ion; 2: 18 h nach Induk ion.

4 E gebnisse 117
als T x-ECD-GC-C. Vo e suche e gaben, dass die Zugabe on 0,05 % des nich ionischen
De e genz B ij-35 die Löslichkei on NusA-ECD-GC-C deu lich e besse (Wei ich, 2009).
Auße dem konn e die Menge an gelös em Fusionsp o ein e höh we den, wenn das unlösliche Pelle
des Zellau schlusses am Mic o luidize e neu in Lysepu e esuspendie und du ch
Ul aschallbehandlung wei e solubilisie wu de (Abb. 4.37 D, Bahnen 13 und 14).
Die e einig en Übe s ände wu den au eine Hi ap Nickelionen-A ini ä sch oma og aphiesäule
au ge agen. Das Fusionsp o ein eluie e ab Imidazolkonzen a ionen on 50 mM und wu de
Abb. 4.37: Reinigung on TRX-ECD-GC-C und NusA-Cys--ECD-GC-C du ch Nickela ini ä s-
Ch oma og aphie. A) Ch oma og amm und B) 10 % SDS-Ac ylamidgel de Reinigung on
TRX-ECD-GC-C; C) Ch oma og amm und D) 10 % SDS-Ac ylamid-Reinigungsgel on NusA-
Cys--ECD-GC-C. SDS-Gel on TRX-ECD-GC-C: 1: Pelle Zellau schluss; 2: Übe s and
Zellau schluss; 3: Pelle 8 M Ha ns o ex ak ion; 4: Übe s and 8 M Ha ns o ex ak ion; 5:
Pelle Rück al ung; 6: Übe s and Rück al ung; 7: Du chb uch de Nickel-Säule; 8: Elu ion bei
25 mM Imidazol; 9: Elu ion bei 100 mM Imidazol; 10: Elu ion bei 200 mM Imidazol. SDS-Gel
on NusA-Cys--ECD-GC-C: 11: Pelle Lyse am Mic o luidize ; 12: Übe s and Lyse am
Mic o luidize ; 13: Pelle Lyse pe Ul aschall; 14: Übe s and Lyse pe Ul aschall; 15:
Du chb uch de Nickelsäule; 16: Elu ion bei 25 mM Imidazol; 17: Elu ion bei 100 mM
Imidazol; 18: Elu ion bei 50 mM Imidazol. S: low ange P o eins anda d.
118 4 E gebnisse
gesammel (Abb. 4.37 C). Die gelelek opho e ische Analyse zeig jedoch, dass die F ak ionen noch
e un einig wa en, insbesonde e sind zwei s a ke Banden bei e wa 66 kDa und 75 kDa zu e kennen
(Abb. 4.37 D, Bahn 18).
Im nächs en Sch i wu de e such , das Fusionsp o ein du ch Behandlung mi P eScission-P o ease
zu spal en um den Löslichkei s- und Reinigungsanhang zu en e nen. Abb. 4.38 A zeig , dass die
P o easebehandlung nich , ode nu in seh ge ingem Ausmaß, zu eine Spal ung des
Fusionsp o eins üh . Die Bande bei 100 kDa ep äsen ie NusA-Cys--ECD-GC-C, was du ch
einen Pep idmassen inge abd uck bes ä ig wu de. Sie e lie du ch die Anwesenhei de P o ease
nich e kennba an In ensi ä (Abb. 4.38 A, Bahn 3).
Abb. 4.38: P eScission-Spal ung und Anionenaus auschch oma og aphie on NusA-Cys--ECD-
GC-C. A) 10 % SDS-Ac ylamidgel de e such en P eScission-Spal ung. B)
Ch oma og aphische Au ennung des P eScission-Spal ansa zes du ch eine HiT apTM QXL
Säule und C) 10 % SDS-Ac ylamid-Reinigungsgel. S: low ange P o eins anda d. 1:
P eScission-P o ease; 2: P o ein-P obe o de Spal ung; 3: P o ein-P obe 20 h nach Zugabe
on P eScission; 4: Säulendu chb uch; 5: Elu ion bei 100 mM NaCl; 6: Elu ion bei 200 mM
NaCl; 7: Elu ion bei 300 mM NaCl; 8: Elu ion bei 500 mM NaCl; 9: Elu ion bei 1 M NaCl.
4 E gebnisse 119
Eine Bande ü die ECD, die echne isch bei e wa 46 kDa liegen soll e, kann nich beobach e
we den, wi d abe mögliche weise on de P eScission-P o ease übe deck . De Spal ansa z wu de
du ch Anionenaus ausch-Ch oma og aphie an eine HiT apTM QXL-Säule au ge enn . Dabei zeig
sich, dass nu ein P o ein s a k an die Säule binde , welches bei hohen Salzkonzen a ionen ab e wa
500 mM eluie und au dem SDS-Polyac ylamidgel bei e wa 66 kDa läu . Bei dem P o ein handel
es sich seh wah scheinlich um den NusA-Anhang. Ob diese du ch die P eScission-Behandlung
abgespal en wu de ode be ei s o he du ch p o eoly ischen Abbau on GC-C aus dem
Fusionsp o ein en s eh , konn e nich e mi el we den.
Insgesam konn e die ECD on GC-C nich an die QXL-Säule gebunden we den. In e essan is ,
dass das Fusionsp o ein NusA-Cys--ECD-GC-C eben alls nich an die Säule binde und im
Du chb uch zu inden is , obwohl de ela i nied ige echne ische pI on 4,79 dies e wa en ließe
(Abb. 4.38 C, Bahn 4).
Da eine wei e e Au einigung des Fusionsp o eins nich gelang, wu de de Du chb uch de
Anionenaus auschch oma og aphie konzen ie und zu wei e en Cha ak e isie ung e wende .
4.4.2.3 G ößenausschluss-Ch oma og aphie
Das sonde ba e Lau e hal en on NusA-Cys--ECD-GC-C an Ionenaus ausche -Säulen (Abb. 4.38)
gab Anlass zu eine genaue en Un e suchung seines Oligome isie ungsg ads. Dies wu de du ch
G ößenausschlussch oma og aphie an zwei nacheinande geschal e en Supe dexTM 200 10/300 GL
Säulen e eich (Abb. 4.39). Als Ma ke ü das To olumen de Säule wu de dabei das
hochmolekula e Polysaccha id Blue Dex an e wende . Es zeig e sich, dass de G oß eil des
P o eins aus de P obe mi dem To olumen de Säule, annähe nd gleichzei ig wie Blue Dex an,
eluie . Auch die gelek opho e ische Analyse zeig , dass es sich bei dem im To olumen de Säule
eluie enden P o ein um NusA-Cys--ECD-GC-C handel (Abb. 4.39 B, Bahnen 1 und 2). Diese
E gebnisse sp echen da ü , dass das Fusionsp o ein g öße e Oligome e bilde , de en
Assozia ionsg ad deu lich übe das ü die ECD disku ie e Dime isie ungs e hal en hinausgeh
(Hi ayama e al., 1993).
120 4 E gebnisse
Angesich s de schon angesp ochenen Schwie igkei en, das humane P o ein GC-C in E. coli zu
exp imie en, bes eh die Möglichkei , dass die beobach e e Oligome isie ung ein ach du ch eine
ehle ha e Fal ung des P o eins im bak e iellen Wi und eine in e molekula e Disul id e b ückung
e klä we den kann. Diese Annahme konn e du ch ein ein aches gelelek opho e isches Expe imen
bes ä ig we den (Abb. 4.40).
Abb. 4.39: G ößenausschluss-Ch oma o-
g aphie on NusA-Cys--ECD-GC-C an
zwei Supe dexTM 200 10/300 GL Säulen.
A) Ch oma og amm on NusA-Cys--ECD-
GC-C. Die Elu ions- olumina on Blue
Dex an (Säulen-To olumen), Fe i in
(MW = 440 kDa), T ans hy e in (MW =
63,5 kDa) und O albumin (MW = 44 kDa)
sind du ch senk ech e Linien
gekennzeichne . B) 10 % SDS-Poly-
ac ylamidgel mi P oben, die bei den
Elu ions olumina 1: 16 ml; 2: 19,5 ml; 3:
26,5 ml und 4: 33 ml en nommen wu den.
S: low ange P o eins anda d.
Abb. 4.40: Nachweis in e molekula e
Disul id e b ückung du ch SDS-PAGE. 1: P obe
mi 20 % Glyce in, 1 % SDS als Beladungspu e
(en häl kein β-Me cap o-e hanol; nich
eduzie end); 2: P obe mi Ro i®-Load 1 als
Beladungspu e ( eduzie end); S: low ange
P o eins anda d.
4 E gebnisse 121
De ü die SDS-PAGE in diese A bei s anda dmäßig e wende e P obenpu e Ro i®-Load 1
en häl u. a. auch ein hiolhal iges Reduk ionsmi el, welches die in e molekula en
Disul idbindungen o de Gelelek opho ese eduzie (Abb. 4.40, Bahn 2). E sä z man Ro i®-
Load 1 du ch eine Lösung on 20 % Glyce in und 1 % SDS, also einen nich - eduzie enden
Beladungspu e , so üh dies dazu, dass NusA-Cys--ECD-GC-C nich in das Polyac ylamidgel
eind ingen kann und als Bande an de G enze zwischen T enn- und Sammelgel bleib (Abb. 4.40,
Bahn 1). Die Bande bei e wa 100 kDa is als Konsequenz deu lich schwäche . Aus diesem E gebnis
olg , dass die Oligome isie ung on NusA-Cys--ECD-GC-C a sächlich au die Ausbildung
in e molekula e Disul idb ücken zu ückzu üh en is .
4.4.2.4 NMR-Ti a ion on U oguanylin mi NusA-Cys--ECD-GC-C
Zule z wu de eine mögliche Bindung des exp imie en NusA-Cys--ECD-GC-C an die Liganden
on GC-C un e such . Abb. 4.41 zeig die Ti a ion on 15N-ma kie em U oguanylin mi dem
ge einig en Fusionsp o ein. Ähnlich wie bei MiniGC-C kann auch bei de hie exp imie en
ex azellulä en Domäne on GC-C keine Bindung an U oguanylin es ges ell we den. Es sind
keine Ve ände ungen des NMR-Spek ums on U oguanylin du ch die Zugabe des Fusionsp o eins
zu beobach en. Dami zeig sich, dass die Exp ession de ECD on GC-C in E. coli nich zu
Gewinnung on ak i en P o einen üh . Säm liche Reinigungs e suche üh en en wede zu
unlöslichem P o ein, wie im Fall on T x-ECD-GC-C, ode , wie bei NusA-Cys--ECD-GC-C, zu
oligome isie en Spezies, die e mu lich au eine Fehl al ung des P o eins zu ückgehen.
Zusä zlich zu den hie gezeig en E gebnissen wu den im Rahmen on Bachelo - und Mas e a bei en
eine Reihe wei e e Kons uk e ü die Exp ession de ECD in E. coli un e such , jedoch konn e in
keinem Fall eine e olg eiche Reinigung de unk ionalen Rezep o domäne e eich we den (Kap.
5.6).

122 4 E gebnisse
4.4.3 Exp ession de ex azellulä en Domäne on GC-C in Pichia pas o is
Die bei de Exp ession in E. coli beobach e e Fehl al ung de ex azellulä en Domäne on GC-C
kann mögliche weise au das Fehlen eine geeigne en Fal ungsmaschine ie zu ückge üh we den,
die sowohl Chape one als Fal ungshel e , als auch die un e s ü zende Wi kung des euka yo ischen
Sek e ionssys ems, e l. in Ve bindung mi pos - ansla ionalen Modi ika ionen, einschließ .
GC-C is ein Glykop o ein mi insgesam neun E kennungssequenzen ü N-Glykosylie ungen und
es is anzunehmen, dass die Glykosylie ung de ECD einen Ein luss au de en Fal ung ausüb , was
auch in de Li e a u disku ie wi d (Hasegawa e al., 1999b; Ghaneka e al., 2004). Au g und
diese Übe legungen wu de e such die ECD on GC-C in einem euka yo ischen Wi ssys em zu
exp imie en. Die Wahl iel au die me hylo ophe He e Pichia pas o is, da diese sich du ch eine
Reihe on Vo eilen gegenübe al e na i en euka yo ischen Exp essionssys emen auszeichne :
Abb. 4.41: NMR-Ti a ionen on U oguanylin mi NusA-Cys--ECD-GC-C. [1H, 15N]-HSQC-
Spek en on 15N-ma kie em U oguanylin wu den bei 25 °C au genommen, als Pu e wu de 20
mM Kaliumphospha , pH 7,0, 100 mM NaCl, 10 % D2O ( / ) und 0,04 % (w/ ) NaN3
e wende . B) 20 µM 15N-ma kie es U oguanylin i ie mi de unma kie en NusA-Cys--
ECD-GC-C-P obe. Die Gesam p o einkonzen a ion de P obe be ug 55 mg/ml, sie wa jedoch
e un einig (Abb. 33, Bahn 2). Basisspek um on 15N-ma kie em U oguanylin (schwa z) und
Zugabe on 80 µl ( o ) und 150 µl (blau) de NusA-Cys--ECD-GC-C-P obe.
δ(15N) [ppm]
δ(1H) [ppm]
4 E gebnisse 123
–au g und de phylogene ischen Nähe zum gene isch gu e s andenen Modellsys em
Saccha omyces ce e isiae ges al e sich die gene ische Manipula ion on P. pas o is
ela i ein ach. Das Einb ingen on F emdgenen e olg du ch spezi ische
Exp essions ek o en, die dann du ch homologe Rekombina ion ins Wi sgenom s abil
in eg ie we den.
–P. pas o is kann au ela i kos engüns igen Wachs umsmedien zu hohen Zelldich en (>
200 mg/ml Nasszellgewich ) angezogen we den. Auße dem exis ie en P omo o en, die
eine enge Regula ion de Genexp ession und die P oduk ion g oße Mengen an
ekombinan em F emdp o ein e lauben.
–P. pas o is wi d in Minimalmedien kul i ie , was eine ein ache Ma kie ung de
ekombinan en P o eine mi NMR-ak i en Iso open e möglich . Als S icks o quelle
können z. B. Ammoniumsul a ode Ammoniak e wende we den, als
Kohlens o quelle dienen u. a. Glyce ol ode Me hanol. Auße dem kann P. pas o is, im
Gegensa z zu ielen ande en euka yo ischen Exp essionssys emen wie Insek en- ode
Säuge zellen, gu in D2O wachsen (Mo gan e al., 2000). Insbesonde e bei de
Un e suchung g öße e P o eine mi NMR-Me hoden is die Deu e ie ung des
un e such en P o eins ein wich iges Hil smi el zu Ve besse ung de
Relaxa ionseigenscha en.
–Wie alle euka yo ischen Exp essionssys eme kann P. pas o is exp imie e P o eine pos -
ansla ional modi izie en. Auße dem e üg es übe Sek e ionssys eme, die denen on
humanen Zellen ähnlich sind, so dass die he e ologe Exp ession de ECD on GC-C
un e Bedingungen e olg , die de na ü lichen Genexp ession wesen lich ähnliche sind
als dies in bak e iellen Wi so ganismen de Fall is .
4.4.3.1 Klonie ung on pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis und Iden i izie ung on geeigne en
Exp essionsklonen
Als Exp essions ek o wu de pPIC9K gewähl (Abb. 4.42 A). In diesem Vek o is die Exp ession
eines F emdgens un e die Kon olle des P omo o s ü die Alkohol-Oxidase 1 (AOX1) ges ell . Bei
AOX1 handel es sich um ein P o ein, dessen Exp ession äuße s p äzise egulie is , und das nu in
Gegenwa on Me hanol induzie wi d, wobei dann abe eine s a ke Exp ession e olg , so dass in
Zellen, die au Me hanol wachsen, ypische weise bis zu 30 % des löslichen Gesam p o eins au
124 4 E gebnisse
AOX1 en allen (In i ogen, 2009).
pPIC9K eigne sich ü die sek e ie e Exp ession eines F emdgens, da de Vek o eben alls das
Sek e ionssignal des α-Fak o s aus S. ce e isiae kodie . Das Gen on ECD-GC-C wu de, inklusi e
eines C- e minalen Hexahis idin-Anhangs (6xHis), un e Ve wendung de P ime #13 und #14
Abb. 4.42: Mul i-Kopien-In eg a ion und sek e ie e Exp ession on ECD-GC-C du ch das
Kons uk pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis. A) Das Gen ü ECD-GC-C wu de, inklusi e eines
kodie en Hexahis idin-Anhangs am 3'-Ende, du ch das Res ik ionsenzym XhoI in die Mul iple
Klonie ungss elle on pPIC9K inse ie . B) Schema ische Da s ellung de Mul i-Kopien-
Inse ion on pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis in das Ch omosom on P. pas o is. Dadu ch en s ehen
meh e e sog. Exp essionskasse en, die alle jeweils die Gene ü ECD-GC-C-6xHis sowie die
Gene icin-Resis enz en hal en. Be o das Kons uk du ch Rekombina ion in das He e-Genom
einge üh we den kann muss es du ch einen Res ik ionsschni , z. B. SacI, linea isie we den.
MCS: Mul iple Klonie ungss elle; TT: T ansk ip ions-Te mina o ; HIS4: Gen ü His idinol
Dehyd ogenase; KmR: Gene icin-Resis enz; AmpR: bak e ielle Ampicillin-Resis enz; o i:
bak e ielle Replika ionsu sp ung; 5' AOX1: P omo o ü Alkohol Oxidase 1; 3' AOX1: 3'
F agmen on Alkohol Oxidase 1; a-Fac o : Sek e ionssignal des α-ma ing ac o s aus S.
ce e isiae.
4 E gebnisse 125
sowie on XhoI als Res ik ionsenzym in die Mul iple Klonie ungss elle (MCS) on pPIC9K
eingeb ach . Vo he wu de du ch eine s ille o sge ich e e Mu agenese eine wei e e XhoI
Schni s elle inne halb des HIS4 Gens on pPIC9K en e n (siehe Kap. 3.15.5). Die XhoI
Schni s elle lieg am 3'-Ende des α-Fak o Sek e ionssignals, und es ha sich gezeig , dass die Wahl
de In eg a ionss elle eines F emdgens im Vek o e heblichen Ein luss au dessen Exp essions a e
ha . Bei Equis a in üh die In eg a ion an de XhoI Schni s elle zu eine gegenübe den
nach olgenden Res ik ionss ellen de MCS e höh en P o einexp ession was au ein mögliches
nega i es T ansla ions egula ionselemen inne halb de MCS zu ückge üh wu de (Ou chkou o e
al., 2002).
Das Kons uk pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis (siehe Kap. 10.1.10) wi d, nach eine o angehenden
Linea isie ung mi SacI und de Einb ingung in die He ezellen, du ch homologe Rekombina ion
s abil ins Wi sgenom in eg ie . In e wa 1 – 10 % de Klone komm es dabei zu eine sog.
Meh achin eg a ion, also de In eg a ion meh e e Kopien des Kons uk s, in das Wi sgenom
(Abb. 4.42 B). Die Plasmidkopien liegen dann als sog. Exp essionskasse en im Genom o , was
au g und des Gen-Dosis-E ek s die Exp essions a e des F emdgens e höhen kann.
Das Plasmid pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis wu de du ch Elek opo a ion in den S amm P. pas o is
GS115 eingeb ach (siehe Kap. 3.12). Da diese His idin-auxo oph is und pPIC9K du ch das
kodie e HIS4-Gen diese Auxo ophie kompensie , können posi i e Klone du ch Selek ion au
Glukose-Minimalmediumaga -Pla en iden i izie we den. Anschließend wu de e such , Klone, in
denen die oben besch iebene Meh achin eg a ion des Kons uk s s a ge unden ha , zu
iden i izie en. Da pPIC9K ein Resis enzgen ü das euka yo ische An ibio ikum Gene icin (KmR;
das Gen is iden isch mi dem bak e iellen Kanamycin-Resis enzgen) besi z , können du ch die
Selek ion au Näh aga -Pla en mi s eigenden Gene icin-Konzen a ionen Klone isolie we den,
die meh e e Kopien des Kons uk s en hal en. Deswegen wu den die au dem Minimalmedium
selek ie en posi i en Klone e neu esuspendie und au Aga pla en auspla ie , die YPD-
Vollmedium und Gene icin in den Konzen a ionen 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,75 mg/ml und 3 mg/ml
en hiel en (siehe Kap. 3.30). Wäh end au den Pla en mi 0,5 mg/ml Gene icin ein dich e Zell asen
zu beobach en wa , konn en au den Pla en mi 1 mg/ml, 1,75 mg/ml und 3 mg/ml Gene icin
jeweils e wa 450, 67 und 4 Kolonien gezähl we den. Die 4 Klone, die au de höchs en Gene icin-
Konzen a ion wuchsen, wu den gepick und nochmals au eine Aga pla e mi 3 mg/ml Gene icin
ausges ichen um alsch-posi i e Klone zu e kennen. Von den 4 ausges ichenen Klonen wuchsen
d ei auch au de neuen Pla e.
Da in sel enen Fällen die In eg a ion de Exp essions ek o en die Fähigkei de Zellen zu
132 4 E gebnisse
no wendig, den Exp essions ek o in den Zellen du ch die Ve wendung eines Selek ionsmi els,
e wa eines An ibio ikums, zu s abilisie en. E wa 14 S unden nach de T ans ek ion wu de das
Medium de Kul u en zu DMEM mi 1 % Penicillin-S ep omycin-Lösung gewechsel , da im
Fe alen Rinde se um IgG-P o eine en hal en sind, die bei de Reinigung des Zielp o eins aus dem
Medium s ö en wü den. Die Exp ession des Fusionsp o eins e olg e ü d ei Tage bei 37 °C und 5
% CO2-Sä igung. Anschließend wu den die Übe s ande gee n e . Aus diesen wu de das
Fusionsp o ein du ch die hocha ine Wechselwi kung des IgG-Anhangs mi P o ein A Sepha ose
Beads isolie (siehe Kap. 3.34.3). Zu Kon olle de Exp ession wu de anschließend ein Teil Beads
mi gebundenem ECD-GC-C-Th -IgG in SDS-Pu e gelös und du ch SDS-PAGE analysie (Abb.
4.46).
Aus Abb. 4.46 geh he o , dass in den Übe s änden de HEK 293T Zellen deu lich meh P o ein
en hal en is als in den Übe s änden de COS-7 Zellen. In allen Übe s änden is eine in ensi e
Bande bei e wa 230 – 250 kDa zu e kennen, bei de es sich um das sek e ie e Zielp o ein in
dime e Fo m handel . Die s a ke Dime isie ung is au den IgG-Fusionsanhang zu ückzu üh en,
wie aus Kon ollexpe imen en, bei denen nu IgG exp imie wu de, he o geh (siehe Kap.
4.4.4.3).
Wegen de g öße en Exp essions a e de HEK 293T Zellen, wu den diese ü die wei e en Ve suche
e wende .
Abb. 4.46: Exp ession de ECD-GC-C-Th -IgG in COS-7 und HEK 293T Zellen. 12 % SDS-
Polyac ylamidgel beladen mi den du ch P o ein A Beads isolie en P o eine aus dem
Kul u übe s and. Au ge agen is jeweils die Menge an P o ein, die in 10 ml Kul u medium
en hal en is . S: Molekula gewich ss anda d

4 E gebnisse 133
Nach den besch iebenen Exp essions es s wu de eine g öße e Kul u on HEK 293T Zellen, 27
Pe ischalen mi insgesam 270 ml Kul u medium , mi pCMV_N xn_ECD-GC-C-Th ans izie .
Als Nega i kon olle wu de eine 10 ml Pe ischale mi H2O ans izie . Auße dem wu den die
Zellen in eine wei e en Schale mi dem lee en pCMV_N xn Vek o , de nu ü IgG kodie ,
ans izie . Die Anzuch wu de wie bei den Exp essions es s besch ieben du chge üh und nach
d ei Tagen wu den die Zellübe s ande gee n e und das sek e ie e Fusionsp o ein mi P o ein A
Beads isolie . Auße dem wu de ein Teil de Zellen lysie . Abb. 4.47 A zeig ein SDS-Ac ylamidgel
au dem die Kul u übe s ände und Zelllysa e de angezogenen Zellen, inklusi e beide Kon ollen,
analysie wu den.
Sowohl im Kul u übe s and als auch im Zelllysa is jeweils eine in ensi e Bande bei e wa 250 kDa
zu e kennen, die dem dime isie en Fusionsp o ein en sp ich (Abb. 4.47 A, Bahnen 4 und 5). Dies
konn e auch du ch einen Pep idmassen-Finge p in nachgewiesen we den (siehe Kap. 3.36). Die
IgG-Kon olle zeig seh dicke Banden, die eine g oßen Menge an sek e ie em IgG im
Zellübe s and en sp echen. Die Bande, die IgG en sp ich , wande au eine Höhe on e wa 54 kDa
und ep äsen ie ein IgG-Dime . Das monome e IgG, mi einem Molekula gewich on 26,8 kDa,
wi d e s nachdem die Gelp obe ü 10 min bei 95 °C gekoch wu de, de ek ie ba (Abb. 4.47 A,
Bahnen 1 und 2 bzw. 7 und 8). Wei e hin äll au , dass in den P oben de mi pCMV_N xn_ECD-
GC-C-Th ans izie en Zellen deu lich meh F emdbanden de ek ie ba sind als in de
Nega i kon olle, die mi Wasse ans izie wu de (Abb. 4.47 A, Bahnen 3 und 6). Auch in de
IgG-Kon olle sind wenige in ensi e emde Banden zu e kennen. Aus diesem Be und wi d
geschlossen, dass es sich bei den F emdbanden nich um Wi sp o eine handel , sonde n e mu lich
um F agmen e des exp imie en Fusionsp o eins, welche du ch p o eoly ischen Abbau en s ehen.
Das exp imie e ECD-GC-C-Th -IgG weiß wohl nu eine s a k beg enz e S abili ä im
Kul u übe s and de Zellanzuch au .
4.4.4.3 Ein luss de Glykosylie ung au die Exp ession on ECD-GC-C-Th -IgG in
HEK 293T
In einem wei e en Expe imen wu de die P o einexp ession in Gegenwa on 2,5 µg/ml
Tunicamycin du chge üh und die E gebnisse du ch SDS-PAGE analysie (Abb. 4.47 B).
134 4 E gebnisse
Abb. 4.47: Exp ession on pCMV_N xn_ECD-GC-C-Th in HEK 293T. 12 % SDS-
Polyac ylamdigele die mi P oben on aus Kul u übe s änden isolie em P o ein und
Zelllysa en beladen wu den. Die Exp ession e olg e in A) Abwesenhei bzw. B) Gegenwa on
2,5 µg/ml Tunicamycin. Als Kon ollen wu den Zellen e wende , die mi Wasse ode
pCMV_N xn ans ezie wu den. S: Molekula gewich ss anda d; 1 und 9: Kul u übe s and de
mi pCMV_N xn ans ezie en Zellen, P obe gekoch ; 2 und 10: Kul u übe s and de mi
pCMV_N xn ans ezie en Zellen, P obe nich gekoch ; 3 und 11: Kul u übe s and de mi
Wasse ans ezie en Zellen; 4 und 12: Kul u übe s and de mi pCMV_N xn_ECD-GC-C-Th
ans ezie en Zellen; 5 und 13: Zelllysa de mi pCMV_N xn_ECD-GC-C-Th ans ezie en
Zellen; 6 und 14: Zelllysa de mi Wasse ans ezie en Zellen; 7 und 15: Zelllysa de mi
pCMV_N xn ans ezie en Zellen, P obe nich gekoch ; 8 und 16: Zelllysa de mi
pCMV_N xn ans ezie en Zellen, P obe gekoch .
Die au ge agenen P oben de Kul u übe s ände en sp echen jeweils dem in 10 ml (Kon ollen,
Banden 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16) bzw. 30 ml (Zielp o ein, Banden 4, 5, 12, 13)
Medium en hal enen P o ein.
4 E gebnisse 135
Tunicamycin inhibie die Syn hese on N-Glykanen und esul ie somi in de Exp ession on
nich glykosylie em ECD-GC-C-Th -IgG (Tkacz & Lampen, 1975). Abb. 4.47 B zeig , dass nach
Ve wendung on Tunicamycin im Näh medium, kaum ECD-GC-C-Th -IgG in Kul u übe s and und
Zelllysa de ek ie ba wa , ganz im Gegensa z zu IgG-Kon olle, bei de kein g oße Ein luss on
Tunicamycin au die Menge an exp imie em P o ein e kennba wa . O ensich lich wi d du ch die
ehlende Glykosylie ung en wede die Exp ession des Fusionsp o eins s a k gehemm ode seine
S abili ä so s a k eduzie , dass das exp imie e P o ein schnell abgebau wi d.
4.4.4.4 S abili ä on isolie em ECD-GC-C-Th -IgG
Das aus dem Kul u übe s and de HEK 293T Zellen isolie e ECD-GC-C-Th -IgG Fusiosp o ein
wa du ch die on seinem IgG-Anhang e mi el e hocha ine Wechselwi kung an die P o ein A
Sepha ose gebunden. Da in diesem Zus and eine wei e Cha ak e isie ung des P o eins unmöglich
is , muss e es on den Beads eluie we den. Dazu s anden zwei S a egien zu Ve ügung. Die
Elu ion des Gesam p o eins du ch einen seh sau en Pu e (50 mM Glycin; pH 1,8; 100 mM NaCl),
bei dem die In e ak ion on IgG und P o ein A au gehoben wi d, ode die Spal ung des
Fusionsp o eins du ch Th ombin, bei de ECD-GC-C eigese z wi d. Die e s e e wähn e S a egie
eigne sich nich zu Reinigung des P o eins, da es bei dem nied igen pH-We zu i e e siblen
En al ung de ECD on GC-C komm . Dies wu de on D . Hanna Be kne und D . Ma in Klose in
einem Expe imen übe p ü , in dem du ch Obe lächenplasmon esonanz-Spek oskopie keine
Wechselwi kung zwischen dem saue eluie en Fusionsp o ein und U oguanylin bzw. STh
nachgewiesen we den konn e. Um das an die P o ein A Beads gebundene Fusionsp o ein zu spal en
wu den diese in Th ombin-Pu e (20 mM T is/HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2)
gewaschen und esuspendie . Nach Zugabe on Th ombin wu de die P obe ü 16 h bei 4 °C
inkubie und anschließend du ch SDS-PAGE analysie (Abb. 4.48).
Nach de Th ombin-Spal ung kann an den P o ein A Sepha ose Beads de gespal ene IgG-
Fusionspa ne deu lich nachgewiesen we den. Im Übe s and de Th ombin-Spal ung kann jedoch
kein lösliches ECD-GC-C nachgewiesen we den (Abb. 4.48, Bahnen 3 und 4). Zudem sind an den
Beads e schiedene schwache Banden de ek ie ba , die au einen Abbau des P o eins hinweisen
könn en. Mögliche weise komm es zu unspezi ische Spal ung des ekombinan en P o eins du ch
die Th ombin-P o ease (Di Ce a & Can well, 2001) ode abe ande sa ige Wi sp o easen, die in
de P obe mi geschlepp we den. De Übe s and de Th ombin-Spal ung zeig e noch eine schwache
Abso p ion bei 280 nm (A280 = 0,1), die eine Konzen a ion on ECD-GC-C on 1,7 µM
136 4 E gebnisse
en sp echen wü de (V = 800 µl). Jedoch konn e, au g und de ge ingen P obenmenge, du ch SDS-
PAGE nich geklä we den, ob es sich dabei um ein P o ein mi de passenden G öße handel e.
Abb. 4.48: S abili ä on ECD-GC-C-Th -IgG nach de Isolie ung aus dem Kul u übe s and
on HEK 293T Zellen. S: Molekula gewich ss anda d; 1: P o ein A Beads beladen mi ECD-
GC-C-Th -IgG, P obe nich gekoch ; 2: P o ein A Beads beladen mi ECD-GC-C-Th -IgG,
P obe gekoch ; 3: P o ein A Beads nach Th ombin-Spal ung, P obe nich gekoch ; 4:
Übe s and de Th ombin-Spal ung, du ch Vi aspins MWCO 10000 ca. 5 ach au konzen ie .
Die in Bahnen 1 und 2 au ge agene P obe en sp ich dem aus 40 ml Kul u übe s and isolie en
P o ein.
5 Diskussion 137
5 Diskussion
Zu biophysikalischen Cha ak e isie ung de Wechselwi kungen zwischen de Rezep o domäne on
GC-C und den Pep idliganden U oguanylin und STh is es nö ig, die Bindungspa ne in
genügende Menge und ü in i o Expe imen e aus eichende Reinhei zu Ve ügung zu haben.
Pep ide we den übliche weise du ch au oma isie e chemische Syn hese he ges ell . Dies is
p inzipiell auch ü die Liganden de GC-C möglich, jedoch e o de die oxida i e Fal ung de
Pep ide, au g und ih es komplexen Disul id e b ückungsmus e s, den ex ensi en Einsa z
o hogonale Schu zg uppen. Dies e g öße den Syn heseau wand, e höh die Anzahl mögliche
Nebenp oduk e und e inge die Ausbeu e an biologisch ak i en P oduk en (Ikemu a e al., 1984;
Gali e al., 2002). In diese A bei wu de ein Ve ah en zu ekombinan en He s ellung
e schiedene Agonis en on GC-C in E. coli en wickel . Rekombinan e Exp essionss a egien sind
ela i kos engüns ig und e lauben meis ein ein aches Scale-up de P oduk ion. Hinzu komm , dass
die Exp ession in E. coli die Möglichkei bie e , das p oduzie e Pep id au ein achem Weg mi
NMR-ak i en Iso open zu ma kie en, was eine wich ige Vo ausse zung ü NMR-Bindungss udien
da s ell .
5.1 Rekombinan e Exp ession on U oguanylin
Die P imä s uk u en on P oguanylin und P ou oguanylin zeichnen sich du ch 35 % Iden i ä aus.
P oguanylin en häl jedoch in seinem mi le en Sequenzabschni sieben Aminosäu en, die eine
nich s uk u ie e, lexible Schlei e bilden und bei P ou oguanylin keine En sp echung haben
(Laube e al., 2003). Es konn e jedoch gezeig we den, dass die Dele ion diese Sequenz nu
ge ing ügige Ände ungen de Lösungss uk u zu Folge ha , so dass angenommen we den kann,
dass die Te iä s uk u en on P oguanylin und P ou oguanylin im Wesen lichen übe eins immen
(Laube , 2003). Diese Annahme wi d auch du ch die ähnlichen unk ionellen Eigenscha en beide
P o eine un e s ü z . So gil ü beide P o eine, dass die P opep ide essen iell ü die ko ek e
Fal ung de jeweiligen Ho mon egionen sind (Hidaka e al., 1998). Auße dem konn e ü
P ou oguanylin, wie auch ü P oguanylin, du ch Dele ionsexpe imen e eine wich ige Rolle de N-
Te mini ü die Fal ung de C- e minalen Sequenzbe eiche gezeig we den (Schulz e al., 1999;
Hidaka e al., 2000). Die oxida i e Fal ung zum biologisch ak i en Ho mon geling wede mi
eiem Guanylin noch mi eiem U oguanylin (Hidaka e al., 1998; Schulz e al., 1999). Dies s eh
im Gegensa z zu ande en kleinen disul id e b ück en Pep iden wie Endo helin (Yanagisawa e al.,

138 5 Diskussion
1988) und ω-Cono oxinen (P ice-Ca e e al., 1996a), die mi ela i gu en Ausbeu en zu ih e
na i en Fo m oxidie we den können.
Eine P osequenz- e mi el e Fal ung wu de bei eine Reihe on ande en P o einen beobach e ,
da un e de T ypsin-Inhibi o BPTI aus de Bauchspeicheld üse on Rinde n (Weissman & Kim,
1992), das Zy okin MIC-1 (Fai lie e al., 2001) ode de humane Ne enwachs ums ak o NGF
(Ra enholl e al., 2001). Bei einigen Cono oxinen un e s ü z das P opep id die Fal ung indi ek ,
indem es die Disul idisome ase-abhängige Ausbildung de Disul idb ücken e leich e (Buczek e
al., 2004).
In de o liegenden A bei wu de U oguanylin ekombinan he ges ell . Dazu wu de das P oho mon
P ou oguanylin in E. coli exp imie und ge einig . Anschließend wu de U oguanylin du ch
p o eoly ischen Ve dau mi T ypsin eigese z und aus dem Spal ansa z au ge einig . In eine
ühe en A bei wu de be ei s gezeig , dass P ou oguanylin in E. coli exp imie und in ü NMR-
Spek oskopie aus eichende Menge ge einig we den kann (Schus e , 2004). Jedoch konn e damals
das Ho mon U oguanylin nich in eine Fo m aus dem P oho mon eigese z we den.
Zu ekombinan en Exp ession on P ou oguanylin wu de in diese A bei das Plasmid pET32a-
Asp-p es-p ou oguanylin im E. coli S amm O igami B (DE3) als Fusionsp o ein T x-
P ou oguanylin exp imie . Da die oxida i e Fal ung on P ou oguanylin in i o zu Ausbildung
de ko ek en Disul idb ücken üh (Hidaka e al., 1998) wu de da on ausgegangen, dass die
Fal ung des P o eins auch im oxida i en Milieu des Cy oplasmas on O igami B (DE3) glück .
Nach de Induk ion kam es zu eine s a ken Exp ession des Fusionsp o eins (Abb. 4.1). De
e wende e S amm O igami B (DE3) ha gegenübe ühe e wende en, Leucin-auxo ophen
E. coli S ämmen, e wa O igami (DE3) ode AD494 (DE3), den Vo eil wesen lich schnelle en
Zellwachs ums und dami eine höhe en Ausbeu e des Zielp o eins. Wäh end de Lyse de Zellen
konn e das Au e en eines weißlichen P äzipi a s beobach e we den. Dabei handel es sich um
schwe lösliche sog. Einschlusskö pe chen, die im Wesen lichen aus ekombinan em P o ein
bes ehen. Bei T x-P oguanylin zeig e sich, dass nach dem Zellau schluss de wei aus g öß e Teil des
Fusionsp o eins im löslichen Übe s and en hal en is (Laube , 2003). Dies s eh im Gegensa z zu
T x-P ou oguanylin, das g öß en eils im unlöslichen Pelle zu inden is . Das Lysepelle wu de mi
4 M Ha ns o pu e ex ahie , was zu Solubilisie ung g oße Mengen des Fusionp o eins üh e
(Abb. 4.2). Die Rück al ung e olg e o de ch oma og aphischen Reinigung du ch Ve dünnung
des Ha ns o s. Bei de Spal ung des ge einig en Fusionsp o eins mi P eScission-P o ease wi d
P ou oguanylin eigese z , wobei alle dings au äll , dass de Ve dau nich olls ändig e läu
(Abb. 4.4). Dies läss sich wohl da au zu ück üh en, dass e wa 20-25 % des ückge al e en
Fusionsp o eins in eine ehlge al e en S uk u o lieg , in de die Schni s elle nich zugänglich ü
5 Diskussion 139
P eScission-P o ease is . Nach de Spal ung konn e das eigese z e P ou oguanylin du ch
Me allionen-A ini ä sch oma og aphie on noch o handenem T x-P ou oguanylin und eiem T x
ge enn we den.
15N-ma kie es P ou oguanylin konn e im Wesen lichen au gleichem Weg wie unma kie es
P ou oguanylin exp imie und ge einig we den. Das [1H, 15N]-HSQC-Spek um on
P ou oguanylin (Abb. 4.6) zeig eindeu ige Cha ak e is ika eines ge al e en P o eins, wobei
insbesonde e die s a ke Dispe sion de Signale en lang de P o onendimension he o zuheben is .
Augen ällig am o liegenden Spek um is die Ta sache, dass mi 155 de ek ie en
Rückg a amidsignalen e wa doppel so iele Resonanzen zu beobach en sind, als die Sequenz des
P o eins e wa en ließe. Auße dem gib es bei den Signalen im Spek um s a ke
In ensi ä sun e schiede, . a. auch bei einigen Signalen, die paa weise dich beieinande liegen. Das
Spek um sieh aus, als liege das P o ein in zwei e schieden populie en Kon o ma ionszus änden
o . Mögliche weise is dies ein Resul a eine un olls ändigen Rück al ung, so dass ein Teil des
P o eins nich die na i e S uk u einnimm . Es kann sich auch um ein Gleichgewich zweie
Kon o me e des P o eins handeln, die im langsamen Aus ausch zueinande s ehen. E en uell is
auch cis/ ans-Isome ie de 7 in de Sequenz o kommenden P oline ein G und ü das Au e en
on paa weise beieinande liegenden Peaks. Im [1H, 15N]-HSQC-Spek um on P oguanylin is ein
de a iges Au e en on e schieden populie en Kon o ma ionszus änden jedoch nich e kennba
{(Laube , 2003).
Die F eise zung on U oguanylin e olg e du ch die Spal ung des P oho mons mi T ypsin. Da
T ypsin am C-Te minus de basischen Aminosäu en Lysin und A ginin spal e , wi d P ou oguanylin
in eine Reihe kleine e Pep id agmen e e dau , da un e auch das 19 Aminosäu en lange
C- e minale F agmen TIANDDCELCVNVACTGCL. Dieses un e scheide sich on de in U in
nachgewiesenen Fo m (Abb. 1.2) (Ki a e al., 1994) du ch die d ei zusä zlichen N- e minalen
Aminosäu en Th eonin, Isoleucin und Alanin. Da unbekann is , du ch welche Enzyme das
na ü liche P ou oguanylin p ozessie wi d und aus na ü lichen Quellen nu das be ei s e wähn e 16
Aminosäu en lange U oguanylin sowie ein wei e es 24 Aminosäu en langes, eben alls biologisch
ak i es F agmen isolie we den konn en (Hess e al., 1995) wu de mi dem du ch die T ypsin-
Spal ung e hal enen Pep id wei e gea bei e , zumal dieses die gesam e ü die Bioak i i ä
no wendige Ke n egion en häl .
Bei de Reinigung on U oguanylin aus dem Spal ansa z du ch Umkeh phasen-HPLC e häl man
bei eine Ace oni il-Konzen a ion on e wa 24 % ( / ) einen Elu ionsgip el, de das U oguanylin-
Pep id en häl (Abb. 4.7). De Nachweis de Iden i ä e olg e du ch MALDI-TOF-
Massenspek ome ie. De Elu ionsgip el im HPLC-Ch oma og amm besi z alle dings eine
140 5 Diskussion
Schul e was da au hindeu e , dass zwei molekula e Spezies mi ähnlichem Elu ions e hal en da in
en hal en sind. Die massenspek ome ische Analyse zusammen mi NMR-Spek en de
Teilbe eiche des Elu ionsgip els zeig e, dass es sich bei den beiden molekula en Spezies um ein und
dasselbe Pep id agmen handel , dass jedoch zwei un e schiedliche S uk u en annimm , die du ch
die e wende e Polys y ol/Di inylbenzol-Säule nu unzu eichend oneinande ge enn we den
können. Du ch NMR-Spek oskopie und Ve gleich de chemischen Ve schiebungen mi den
Li e a u we en ü die A-Fo m on U oguanylin (Ma x e al., 1998) konn e jedoch gezeig we den,
dass de g öße e und e was spä e eluie ende Teil des Elu ionsgip els dem ak i en U oguanylin-
Pep id en sp ich (Abb. 4.9 und Anhang 10.2). Da die chemischen Ve schiebungen de ande en
Spezies jedoch nich mi den Li e a u we en de B-Fo m on U oguanylin (Ma x e al., 1998)
übe eins immen, spiegel das Au e en zweie Isome e des U oguanylin-Pep ids nich die bekann e
Topoisome ie on U oguanylin wide . S a dessen handel es sich bei de Ve un einigung
e mu lich um ein ehlge al e es bzw. alsch disul id e b ück es Pep id. Das Vo liegen zweie
Kon o ma ionen des P oho mons, das schon im [1H, 15N]-HSQC-Spek um on P ou oguanylin
sich ba wa , üh mögliche weise dazu, dass ein Teil des exp imie en U oguanylins nich zum
na i en Ho mon oxidie wi d. Um dennoch eine möglichs eine P obe on ak i em U oguanylin
zu e hal en wu de nu de hin e e Teil des HPLC-Elu ionsgip els gesammel und e einig , was
jedoch dazu üh , dass auch ein Teil des P oduk s e lo en geh . Du ch das wiede hol e Au agen
au die HPLC-Säule kann die T ennung de beiden Pep idspezies e besse und die Ausbeu e des
na i en Pep ids ges eige we den. Die Resonanzen im NOESY-Spek um des na i en Pep ids (Abb.
4.9) konn en bis au die Aminosäu en Asn-4 und Asp-5 zugeo dne we den (siehe Anhang 10.2).
Diese konn en wegen ih e ähnlichen chemischen Ve schiebungen und dem Fehlen on
in a esidualen NOESY-K euzsignalen im Be eich des lexiblen N-Te minus des Pep ids nich
eindeu ig zugeo dne we den. Es e gab sich eine gu e Übe eins immung de chemischen
Ve schiebungen mi den Li e a u we en (Ma x e al., 1998). Die Abweichungen de hie
gemessenene We e on den chemischen Ve schiebungen de Li e a u liegen in de G ößeno dnung
0 – 0,07 ppm. Lediglich ü die Amidp o onen de Aminosäu en Asp-3 und Leu-19 be ugen die
Di e enzen zu den bei Ma x e al. gemessenen Resonanzen 0,14 und 0,15 ppm . Dies kann ü
Asp-3 mi einem möglichen Ein luss de zusä zlich o handenen Th -Ile-Ala-Sequenz am N-
Te minus und ü das C- e minale Leu-19 mi ge ing ügigen Va ia ionen des pH-We s e klä
we den. Von den 18 im [1H, 15N]-HSQC-Spek um on U oguanylin en hal enen
Rückg a amidsignalen konn en 16 eindeu ig zugeo dne we den (Abb. 4.10 A). Zudem ha sich
gezeig , dass nach meh ägige Inkuba ion de NMR-P obe bei Raum empe a u zusä zliche Signale
im HSQC-Spek um de P obe au auch en (Abb. 4.10 B,). Die chemischen Ve schiebungen diese
5 Diskussion 141
zusä zlichen Signale in de P o onendimension s ehen im Einklang mi den Li e a u we en ü die
B-Fo m on U oguanylin (Ma x e al., 1998), so dass e wa e we den kann, dass es sich bei dem
Ve hal en de P obe um die besch iebene Topoisome ie on U oguanylin handel .
Die massenspek ome ische Analyse de U oguanylin-P obe (Abb. 4.8) e gab eine Masse on
1975,4 Da, was seh gu mi de ü das 15N-ma kie e Pep id e wa e en echne ischen Masse on
1975,2 Da übe eins imm und das Vo handensein zweie Disul idb ücken im Pep id bes ä ig . Die
Disul id e b ückung wu de auch du ch den beobach e en Massenzuwachs des Pep ids um 4 Da
nach Reduk ion mi DTT nachgewiesen (Abb. 4.8 B).
Au g und diese E gebnisse s eh nun eine Me hode zu Ve ügung um das Ho mon U oguanylin
au ela i ein achem Weg übe ekombinan e Exp ession des Vo läu e p o eins he zus ellen. Zwa
üh die in einem Teil des P o eins beobach e e Fehl al ung dazu, dass die Ausbeu e kleine is als
dies bei olls ändige Rück al ung möglich wä e. Jedoch lassen sich o zdem mi de hie
o ges ell en S a egie Ausbeu en im Be eich 0,2 – 0,3 mg eines Ho mon p o Li e Bak e ienkul u
e zielen, was den E o de nissen diese A bei genüg .
5.2 Rekombinan e Exp ession on E. coli STh du ch P osequenz-Aus ausch
Die hi zes abilen En e o oxine aus E. coli sind deu lich s ä ke e Agonis en de GC-C als die
endogenen Ho mone Guanylin und U oguanylin. Sie binden mi eine gegenübe den endogenen
Liganden Guanylin und U oguanylin e wa zehn ach höhe en A ini ä an die ex azellulä e Domäne
on GC-C (Ham a e al., 1997). Diese Ums and und die Rolle de En e o oxin/GC-C-
Wechselwi kung ü die Pa hogeni ä on ETEC machen STh zu einem in e essan en Ziel ü die
ekombinan e Exp ession.
In i o we den STh und STp jeweils als 72 Aminosäu en en hal ende Vo läu e p o eine exp imie
(Okamo o & Takaha a, 1990; Rasheed e al., 1990). Das Vo läu e p o ein on STh en häl ein 19
Aminosäu en langes P e-Signalpep id, das essen iell ü die SecA-abhängige T ansloka ion des
P o eins übe die inne e Zellmemb an ins Pe iplasma is und wäh enddessen abgespal en wi d
(Yang e al., 1992; Pugsley, 1993). Daneben en häl das Vo läu e p o ein ein 34 Aminosäu en langes
P opep id, dessen genaue Funk ion bishe nich geklä we den konn e. Es is nich essen iell ü die
Fal ung des C- e minalen STh, da S ämme, in denen das P opep id, nich abe das P e-Signalpep id,
dele ie wu de imme noch 40 % de en e o oxischen Ak i i ä des Wild yps behal en (Okamo o &
Takaha a, 1990; Yamanaka e al., 1993). Mögliche weise e langsam es die Passage om
Pe iplasma ins ex azellulä e Medium und so g somi da ü , dass genügend Zei ü die im