Carola Rohrbeck
Dr. med.
G2-Arrest und G2-VerlŠngerung in Fanconi-AnŠmie-Zellen,
dargestellt mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung
Geboren am 07.11.1971 in Hamburg
ReifeprŸfung am 21.06.1991 in Hamburg
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1992 bis SS 1998
Physikum am 15.03.1994 an der UniversitŠt Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Ludwigsburg und in ZŸrich
Staatsexamen am 09.11.98 an der UniversitŠt Heidelberg
Promotionsfach: Humangenetik
Doktorvater: Herr Prof. Dr. med. C. R. Bartram
Die Fanconi-AnŠmie ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die unbehandelt meist schon
im Kindesalter zum Tode fŸhrt. Sie manifestiert sich in einer aplastischen AnŠmie. Neben
der Knochenmarkinsuffizienz besteht eine PrŠdisposition fŸr Neoplasien, insbesondere fŸr
die akute myeloische LeukŠmie. Die meisten Fanconi-AnŠmie-Patienten sind weiterhin
durch Fehlbildungen an Daumen, Unterarm oder der Haut betroffen. Auf zellulŠrer Ebene
findet man als typische VerŠnderung eine ChromosomeninstabilitŠt und eine
Zellzyklusabweichung in Form einer G2-Phase-VerlŠngerung. FŸr die Therapie der
Fanconi-AnŠmie ist eine frŸhzeitige und sichere Diagnostik ausschlaggebend.
In dieser Arbeit wurde die FISH-Analyse (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung) eingesetzt,
um Zellzyklusabweichungen bei Fanconi-AnŠmie-Patienten zu messen. Die FISH wurde
zwei diagnostischen Methoden, dem DEB-Test und der Durchflu§-Zytometrie
gegenŸbergestellt, die beide in der Fanconi-AnŠmie-Diagnostik zum Einsatz kommen.
Mittels der FISH lassen sich die Kerne einer Blutkultur, die sich in der G2-Phase des
Zellzyklus befinden, quantitativ bestimmen. Eine G2-VerlŠngerung von Fanconi-AnŠmie-
Zellen Šu§ert sich in einem erhšhten G2-Phase-Anteil.
FŸr die Fanconi-AnŠmie-Diagnostik mit der FISH empfiehlt es sich, eine Sonde
einzusetzen, die an eine DNA-Sequenz hybridisiert, welche in der spŠten S-Phase repliziert
wird. Um den Replikationszeitpunkt dieser sogenannten spŠt replizierenden Sonde zu
bestimmen, wurden DNA-Einbau-Studien mit chloriertem und jodiertem Uridin
durchgefŸhrt. Diese ergaben, da§ das fŸr die Diagnostik eingesetzte Cosmid
durchschnittlich nach 3 bis 4 Stunden S-Phase repliziert.
In dieser Arbeit wurden 35 Personen, davon 15 mit Verdacht auf Fanconi-AnŠmie der
FISH-Analyse unterzogen. Der Test ergab 15 positive und 20 negative Patienten. Alle 35
Personen wurden zusŠtzlich auch einem DEB-Test und zum Teil auch einer Durchflu§-
zytometrischen Untersuchung unterzogen. SŠmtliche Testergebnisse waren konkordant.
An einer EBV-transformierten Fanconi-Zellinie wurde mittels derselben DNA-
Einbautechnik festgestellt, da§ es innerhalb einer Kultur von Fanconi-AnŠmie-Zellen eine
Population gibt, die einen normalen Zellzyklus durchlŠuft und eine andere Population, die
eine deutliche G2-VerlŠngerung aufweist. Diese Population befindet sich unter den
ruhenden (inaktiven) Zellen, die keine markierten Nukleotide einbauen, weil sie die S-Phase
nicht durchlaufen. FŸr die Diagnostik brauchen auf markierten PrŠparaten nur noch die
inaktiven Kerne eines PrŠparates ausgewertet werden. Das Ergebnis bei Fanconi-AnŠmie-
Patienten weist einen durchschnittlich 3fach erhšhten Anteil an Kernen mit
Doppelpunktsignalen (35,5%) gegenŸber dem Anteil bei gesunden Personen (10,8%) auf.
Bei der FISH-Analyse auf nichtmarkierten Kernen erhŠlt man einen 1,4fach erhšhten Anteil
an Kernen mit Doppelpunkten bei Fanconi-AnŠmie-Patienten (41,9%) gegenŸber dem
gleichen Anteil bei Gesunden (35,9%).
Bei der Auswertung der FISH am Fluoreszenz-Mikroskop fielen neben Einzel- und
Doppelpunktsignalen auch fadenfšrmige Hybridisierungssignale auf. Es stellte sich die
Frage, wie diese zu deuten sind und ob sie in einer bestimmten Zellzyklus-Phase entstehen.
Mittels Einbau von chloriertem und jodiertem Uridin in die DNA konnte gezeigt werden,
da§ diese Hybridisierungssignale typischerweise in Kernen zu sehen sind, die gerade die
spŠte S-Phase durchlaufen. Dies ist ein Hinweis darauf, da§ es sich um Replikationsfiguren
handelt.
Obwohl die Zellzyklusbestimmungen in dieser Arbeit keine Fehldiagnosen lieferten, ist zu
erwarten, da§ bei einigen FŠllen falsch-negative Diagnosen gestellt werden, wenn man den
untersuchten Personenkreis erweitert. Mosaik-Patienten, die in der Literatur beschrieben
sind, prŠleukŠmische und leukŠmische Patienten, die auf Grund der erhšhten
Proliferationsrate keine G2-VerlŠngerung mehr aufweisen, kšnnen mit der FISH und auch
mit allen anderen Methoden, die eine G2-VerlŠngerung nachweisen, nicht erfa§t werden.
Seit der Klonierung von zwei der fŸnf Fanconi-AnŠmie-Genen (FAA und FAC) ist es
mšglich, FA-Patienten, die durch Mutationen in diesen beiden Genen charakterisiert sind,
auch mit molekulargenetischen Verfahren zu diagnostizieren. Diese Verfahren bieten eine
hohe Sicherheit. Auch eine kŸnftige Gentherapie setzt den Nachweis des molekularen
Defektes voraus. Trotz aller Vorteile der molekularen Verfahren werden die Funktionstests
zur FA-Diagnostik, zu denen auch die FISH-Analyse zŠhlt, weiterhin ihre Anwendung
finden. Man benštigt sie, wenn der Verdacht auf Fanconi-AnŠmie besteht, jedoch
Unklarheit Ÿber die Komplementationsgruppe herrscht. In diesen FŠllen werden indirekte
Funktionstest zuerst als Art Screenig-Test angewandt werden kšnnen, bevor weiterfŸhrende
diagnostische Ma§nahmen ergriffen werden. Die FISH-Analyse eignet sich insbesondere
wegen ihres geringen Zeit- und Kostenaufwands als Nachweismethode fŸr die Fanconi-
AnŠmie. Sie ist zudem in einem Labor, in dem die FISH-Analyse bereits als
Nachweismethode fŸr andere genetische Erkrankungen z.B. der Trisomie 21 eingesetzt
werden, ohne zusŠtzlichen Aufwand durchfŸhrbar.
