Entwicklung und Bewertung eines direkten Erkennungsverfahren für Helicobacter pylori aus Stuhlproben durch die Polymerase-Kette-Reaktion (PCR)

Udo Kronberg

Dr. med Entwicklung und Evaluation eines direkten Erkennungsverfahren für Helicobacter pylori aus Stuhlproben mit Hilfe der Polymerase-Kette-Reaktion (PCR) geboren am 24.10.1970 im Reifegrad am 09.05.1990 in Ettlingen Studiengang des Fachbereichs Medizin von WS 1991/92 bis SS 1998 Physik am 30.08.1993 Klinische Studie in Heidelberg

Dies sollte mit einer Polymerase-Kette-Reaktion aus Stuhlproben von infizierten Patienten durchgeführt werden.

Nach der Auswahl entsprechend empfindlicher Primerpaare (im Endprotokoll werden Primare verwendet, die gegen das 16S-rRNA-Gen von Helicobacter pylori ausgerichtet sind) war es schwierig, eine geeignete Methode zu finden, um die bakterielle DNA aus der Stuhlsuspension so vorzubereiten und zu reinigen, dass die PCR-Inhibitoren, die in der Stuhlsuspension reichlich vorhanden sind, ausreichend entfernt wurden. Mit den zuvor getesteten Methoden, die in der Literatur beschrieben wurden, war es nicht möglich, zuverlässig zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen.

Nach zahlreichen Versuchen, die Methode mit verschiedenen anderen

Das endgültige Protokoll über die Reinigungsverfahren ergab sich.

Vorreinigung der Stuhlspension mit einer Low-Speed-Zentrifugation zur Entfernung von

Schweifstoffe, die sich anschließend an die Bakterien in der Interphase der

Zwei-Phase-Zentrifugation, wodurch sich die Keime gut vom Rest der Stuhlsuspension trennen

die DNA-Präparation mit einem kommerziellen Spin-Column-Set (QIAamp)

"Blood Kit", Fa. QIAGEN, Hilden) mit der anschließenden DNA-Reinigung mit CTAB. Mit dieser Methode können in den günstigsten Fällen 10 Bakterien in 100 mg Stuhl nachgewiesen werden, was als zufriedenstellend angesehen wird. Im weiteren Verlauf wurde die neue Methode im Vergleich zu anderen Diagnosemethoden wie der Untersuchung von Magenbiopsien mit Kultur und PCR sowie der serologischen Untersuchung des Patienten gegen Helicobacter pylori antibodies bewertet. Insgesamt wurden Proben von 41 Patienten untersucht, von denen 17 Helicobacter pylori-positiv waren.