Udo Kronberg
Dr. med.
Entwicklung und Evaluation eines direkten Nachweisverfahrens für Helicobacter pylori
aus Stuhlproben mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Geboren am 24.10.1970 in Stade
Reifeprüfung am 09.05.1990 in Ettlingen
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1991/92 bis zum SS 1998
Physikum am 30.08.1993
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Schwetzingen
Staatsexamen am 05.05.1998 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Labormedizin
Doktorvater: Prof. Dr. med. Heinrich Schmidt-Gayk
Ziel der Arbeit war es, einen diagnostischen Test für Helicobacter pylori - ein Bakterium,
welches für die Entstehung von Gastritiden, Ulcera und Magenneoplasien verantwortlich
gemacht wird - zu entwickeln, der einerseits in der Lage ist, einen direkten Keimnachweis zu
erbringen, und andererseits ohne die invasive Gastroskopie mit Biopsieentnahme auskommt.
Dies sollte mit einer Polymerase-Kettenreaktion aus Stuhlproben von infizierten Patienten
gelingen.
Nach der Auswahl entsprechend sensitiver Primerpaare (im endgültigen Protokoll werden
Primer verwendet, die gegen das 16S-rRNA-Gen von Helicobacter pylori gerichtet sind) war
die Schwierigkeit, ein geeignetes Verfahren zu finden, um die bakterielle DNA aus
Stuhlsuspension so zu präparieren und zu reinigen, daß die in Stuhlsuspension reichlich
vorhandenen Inhibitoren der PCR in ausreichendem Maße entfernt wurden. Mit den zunächst
getesteten Methoden, die in der Literatur beschrieben waren, war es nicht möglich, zuverlässig
zufriedenstellende Ergebnisse zu erhalten. Einzig erfolgversprechend waren die High-Speed/
Low-Speed-Zentrifugation nach Brian et al. (1992) und eine selbstentwickelte
Zweiphasenzentrifugation, die auf einer Methode von Iralu et al. (1993) basiert. Mit deren
Hilfe allein können jedoch nur 10 5 Bakterien in 250 mg Stuhl nachgewiesen werden, was für
einen diagnostischen Test nicht ausreicht.
Nach zahlreichen Versuchen zur Modifizierung der Methode mit verschiedenen anderen
Reinigungsverfahren stellte sich das endgültige Protokoll heraus. Dieses umfaßt eine
Vorreinigung der Stuhlsuspension mit einer Low-Speed-Zentrifugation zur Entfernung der
Schwebstoffe, die anschließende Anreicherung der Bakterien in der Interphase der
Zweiphasenzentrifugation, wodurch die Keime sich vom Rest der Stuhlsuspension gut trennen
lassen, sowie die DNA-Präparation mit einem kommerziellen Spin-Column-Set (QIAamp
"Blood Kit", Fa. QIAGEN, Hilden) mit anschließender Reinigung der DNA mit CTAB. Mit
dieser Methode lassen sich im günstigsten Falle 10 Bakterien in 100 mg Stuhl nachweisen,
was als zufriedenstellend angesehen wird.
Im weiteren Verlauf wurde die neue Methode im Vergleich zu anderen Diagnostikverfahren
wie der Untersuchung von Magenbiopsien mit Kultur und PCR sowie der serologischen
Untersuchung des Patienten auf Antikörper gegen Helicobacter pylori evaluiert. Es wurden
insgesamt Proben von 41 Patienten untersucht, von denen 17 Helicobacter pylori-positiv
waren. Die Stuhl-PCR erreichte eine Sensitivität von 64,7 % bei einer Spezifität von 100 %,
einem positiven Voraussagewert von 100% und einem negativen Voraussagewert von 80%,
woraus sich eine Voraussagegenauigkeit von 85,4% ergibt. Dies kann sicherlich als für einen
diagnostischen Test ausreichend bezeichnet werden. Der Stellenwert der neuen Methode als
fragliche Alternative zur Biopsieentnahme oder zur Verlaufskontrolle nach
Eradizierungstherapie muß in der Zukunft in Studien mit größeren Fallzahlen überprüft
werden.
