Fluoreszenz in situ Hybridisierungsexperimente auf erweiterten DNA-Fasern
Jürgen Kraus
Dr.sc.hum. Fluoreszenz in situ Hybridisierungsexperimente auf erweiterten DNA-Fibern geboren am 21.02.1968 in Aschaffenburg Reifeprüfung am 26.06.1987 in Aschaffenburg Studiengang der Fachrichtung Biologie von WS 1987 bis WS 1993 Abschluss am 12.03.1990 an der Universität Würzburg Diplom am 18.11.1993 an der Universität Würzburg Promotionsfach: Humanogenetik Doktorvater: Prof.Dr.med. Thomas Cremer Die Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechnik ist in ihrem leistungsfähigen Spektrum seit Beginn der 90er Jahre um zwei wesentliche Methoden erweitert worden.
Molecular Combing
als hochauflösende Fiber-FISH-Technik eine reproduzierbare
Verlängerung und parallele Ausrichtung von geklonierten und linearisierten Cosmid-DNA-Molekülen auf
Die Orientierung der Moleküle und ihre Vollständigkeit konnten
durch zwei Farben
in situ
Hybridisierung von Vektor-DNA und Gesamtkosmid-DNA erfolgreich
Ein Modellsystem für eine hochauflösende komparative genomische Hybridisierung auf gekämmten DNA-Fasern konnte etabliert werden.
Es konnte eine eindeutige lineare Korrelation zwischen dem eingesetzten
Es wurde eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt.
In CGH-Fiber-Experimenten konnte die Verstärkung von MYCN in der Neuroblastomzelle Kelly auf dem MYCN-Cosmid dargestellt werden. Aufgrund der geringen Repräsentation von MYCN in der Referenz-DNA konnten quantitative Vergleichsbewertungen nicht durchgeführt werden.
Um die Repräsentation von Einzelkopie-Sequenzen zu erhöhen, wurden PCR-unterstützte
Affinitätschromatographie Wiederholungssequenzen aus genomischem DNA oder PAC-DNA
Fern. Fluoreszenz
in situ
Mit diesen Methoden konnten Hybridisierungen auf Metaphasechromosomen durchgeführt werden.
Das Ziel ist es, die Entwicklung von genetisch verflüssigerten DNA ohne Cot-1-Konkurrenten-DNA erfolgreich zu verwirklichen.
Die Durchführung von quantitativen FISH-Experimenten ohne Unterdrückungsbedingungen konnte
Die CGH-Analyse einer Neuroblastomzelle mit doppeltem
Wiederholungssequenz-depletierte Tumor- und Referenz-DNA, die ohne Einsatz von Cot-1-
DNA wurde hybridisiert und ermöglichte die Detektion von einem Drittel der Ungleichgewichte, die unter Unterdrückungsbedingungen mit nicht-depletiertem Neuroblastom-DNA gefunden wurden. Die Möglichkeit, depleterte PAC-DNA als ZielDNA in einem Matrix-CGH-Experiment zu verwenden, konnte durch den Nachweis einer bekannten etwa 20-fachen C-Myc-Verstärkung in der promyelotischen Zelllinie HL-60 demonstriert werden. Eine Erhöhung des Fluoreszenzquotients gegenüber dem Experiment mit nicht-depletiertem DNA als ZielDNA wurde jedoch bisher nicht erreicht.
Zur Bestimmung des Umfangs der MYCN-Amplifikation in der Kelly-Neuroblastom-Zelle
Es wurden zwei verschiedene Hapten-markierte Cosmide [pNb101(Testcosmid) /
cAW7(Referenzkosmid)] gleichzeitig auf herkömmlich vorbereitete gemachte Genomik
Neuroblastoma-DNA oder genomische Referenz-DNA werden hybridiert.
Durch die Messung der Längen der Hybridisierungssignalketten wurde die Verstärkung auf 101 Mal bestimmt. Dieses Ergebnis entspricht gut der autoradiographischen Verstärkung auf 100 Mal geschätzt. Diese Methode wäre somit als Alternative zur Verstärkung durch Southern Blot verfügbar.
High-Resolution-CGH-Methoden (Fiber-CGH/Matrix-CGH) bieten zwei Vorteile:
Die Vergleichsmethode der genomischen Hybridisierung wird in Zukunft möglich sein.
eine routinemäßige Anwendung in Tumorytogenetik und klinischer Diagnostik
die Möglichkeit einer Automatisierung des Verfahrens zu ermöglichen; und
Ein weiterer wichtiger Faktor ist, dass die Arbeitskräfte nicht mehr karyotypisiert werden.
DNA kann durch Hybridisierung
Gepflogen
Genomatik-Test-DNA zusätzlich zu
Das Ausmaß der Deletionen und Amplifikationen im kb-Bereich ist physisch kartografiert und die
Die Verstärkung wird im Rahmen der Verstärkung ermittelt, sodass ein geeignetes Hochlösungsgerät aufgestellt wird.
Das System zur Genomanalyse ist verfügbar, dessen Sensibilität bei der Verbesserung der
In Kombination mit Multicolor-FISH sollten die
Die meisten numerischen und strukturellen Abweichungen werden mit der FISH-Technik erfasst.
Sie wird in Kombination mit bereits etablierten Genome-
Sequenzanalyse-Systeme tragen wesentlich zur Untersuchung der Genombiologie bei.