Peter Grabner
Dr. med.
Expression von Resistenzfaktoren (P-170, GST-(, Katalase) und Onkoproteinen (c-
Fos, EGF-R) bei Nagetier-Zellinien nach kurzzeitiger Exposition zu Doxorubicin,
Ethanol und Coffein
Geboren am 03.08.1964 in Heidelberg
Reifeprüfung am 22.05.1984 in Neckargemünd
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1987 bis SS 1997
Physikum am 29.08.1989 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Pforzheim
Staatsexamen am 12.11.1997 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Doktorvater: Prof. Dr. rer. nat. M. Volm
An tierischen Zell- und Tumorlinien wurde der Einfluß einer kurzzeitigen
Doxorubicin-, Ethanol- und Coffein-Exposition auf die Expression von
verschiedenen Resistenzproteinen und Onkoproteinen untersucht. Als
Resistenzproteine wurden P-Glykoprotein (P-170), Glutathion S-Transferase-(
(GST-() und Katalase, und aus der Gruppe der Onkoproteine wurden c-Fos und der
EGF-Rezeptor (EGF-R) analysiert.
Es wurde gezeigt, daß die Expression von Resistenzproteinen sowohl auf mRNA-
Ebene (Northern-blotting) als auch auf Protein-Ebene (Streptavidin-Biotin-
Peroxidase-Komplex Methode) nachweisbar ist. Da mit der zuletzt genannten,
immuncytochemischen Methode zusätzlich die Heterogenität der einzelnen Zellen
bezüglich der Expression des jeweils untersuchten Proteins beurteilt werden
konnte, wurde diese Methode für die nachfolgenden Untersuchungen eingesetzt. Bei
neun Zellinien (NIH 3T3, Zajdela, Colon 26, CD 3575,
MH 3924, AH 130, Hep F1, RYH, L1210) wurde die Expression von P-170, GST-( und
c-Fos nach 24-stündiger Exposition zu Doxorubicin, Ethanol und Coffein bestimmt.
Bei einzelnen Zellinien wurde der zeitliche Verlauf der P-170, GST-(, Katalase,
c-Fos und
EGF-R Expression nach einmaliger Behandlung mit Doxorubicin (4 Linien), Ethanol
und Coffein (2 Linien) über einen Zeitraum von 96 Stunden analysiert.
Während bei einigen Zellinien keine Veränderungen nach Gabe der Agentien
festgestellt werden konnten, zeigten andere Linien deutliche Veränderungen. Nach
einer Behandlung mit Doxorubicin wurde bei den Zellinien NIH 3T3 und Zajdela
eine erhöhte Expression aller fünf untersuchten Parameter nachgewiesen. Bei der
Zellinie Colon 26 ließen sich P-170 und c-Fos induzieren, während bei L1210
Zellen keine Veränderungen beobachtet wurden. Nach einer Ethanol-Exposition
wurden bei der Zellinie NIH 3T3 wiederum alle untersuchten Parameter vermehrt
exprimiert und nach einer Behandlung mit Coffein wurde bei dieser Zellinie ein
Anstieg von P-170, GST-( und c-Fos gefunden. Die Katalase und der EGF-Rezeptor
ließen sich nicht durch Coffein induzieren. Bei der Zellinie Zajdela wurde die
Expression der untersuchten Proteine weder durch Ethanol noch durch Coffein
erhöht.
Die Untersuchungen zeigten, daß Doxorubicin der stärkste Induktor war, gefolgt
von Ethanol und Coffein. Die Induktion der Proteine trat jeweils innerhalb von
36 Stunden auf. In der Regel fiel die Expression innerhalb des untersuchten
Zeitraumes von 96 Stunden wieder auf Kontrollwerte zurück oder war rückläufig.
Die Resistenzproteine P-170 und GST-( wurden häufig gemeinsam überexprimiert,
ein Ergebnis, das auf eine gemeinsame Regulation der beiden Proteine hindeutet.
Da sowohl P-170 als auch GST-( eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor
AP-1 besitzen, wird eine gemeinsame Regulation durch diesen AP-1 Faktor, der von
den beiden Onkoproteinen c-Fos und c-Jun gebildet wird, angenommen. In
Übereinstimmung mit dieser Ansicht konnte in dieser Dissertation in allen
Fällen, in denen ein Anstieg der P-170 und/oder GST-( Expression gefunden wurde,
auch eine Erhöhung der c-Fos Expression nachgewiesen werden.
Bei den Zellinien NIH 3T3 und Zajdela wurde die Resistenz nach einer Behandlung
mit Doxorubicin (1 µg/ml, 24 Stunden) mit dem Nukleotid-Inkorporationstest
bestimmt. Die mit Doxorubicin vorbehandelten Zellen waren deutlich resistenter
gegen diese Substanz als die unbehandelten Kontrollzellen.
Nach einer 24-stündigen Vorbehandlung mit Doxorubicin, Ethanol bzw. Coffein
wurde bei NIH 3T3 Zellen eine im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen
verminderte Akkumulation von Rhodamin 123 nachgewiesen. Die verminderte R123
Akkumulation korrelierte mit der erhöhten Expression von P-Glykoprotein und
zeigte, daß dieses Transportprotein funktionsfähig war.
Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, Resistenz- und Onkoproteine mit
verschiedenen Agentien zu induzieren. Die Zeitspanne, die zwischen der
Applikation der Substanzen und dem Anstieg der Resistenzproteine liegt, ist zu
kurz, um das Ergebnis mit einer Selektion von resistenten Zellen zu erklären.
Die schnelle und in der Regel vorübergehende Erhöhung der
P-170, GST-( und Katalase Expression ist vielmehr eine direkte Reaktion der
einzelnen Zellen auf die durch Doxorubicin, Ethanol und Coffein verursachte
akute Zellschädigung. Die schnelle Induktion von Resistenzfaktoren, zum Beispiel
nach einer Doxorubicin-Behandlung, könnte auch das Versagen einer Chemotherapie
bei zuvor als sensitiv getesteten Tumoren erklären.
