Identificación de biomarcadores pronósticos en pacientes con Linfoma Difuso de Células Grandes Bmediante Next Generation Sequencing en ADN extracelular circulante

Iden i icación de bioma cado es p onós icos en
pacien es con Lin oma Di uso de Células G andes B
median e Nex Gene a ion Sequencing en ADN
ex acelula ci culan e
Ja ie A zuaga Méndez
2025
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Facul ad de Medicina y En e me ía
Depa amen o de Gené ica, An opología Física y Fisiología
Animal
TESIS DOCTORAL
Iden i icación de bioma cado es p onós icos en pacien es con
Lin oma Di uso de Células G andes B median e Nex Gene a ion
Sequencing en ADN ex acelula ci culan e
Doc o ando:
Ja ie A zuaga Méndez
Di ec o as/es:
Juan Ca los Ga cía Ruiz
Idoia Ma ín Gue e o
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(cc) 2025 Ja ie A zuaga Méndez (cc by-nc-sa 4.0)
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Ag adecimien os
Quie o exp esa mi más since o ag adecimien o a odas las
pe sonas que han hecho posible que es e p oyec o se con ie a en
una ealidad. En especial, a mis di ec o es, Juan Ca los Ga cía e
Idoia Ma ín, cuya o ien ación y expe iencia han sido
undamen ales a lo la go de es e p oceso. G acias po su
dedicación y po guia me en cada paso de es e camino.
A mis compañe os del Se icio de Hema ología del Hospi al
Uni e si a io C uces, quienes me han b indado no solo su apoyo,
sino ambién sus conocimien os y compañe ismo.
Ag adezco ambién al pe sonal de en e me ía de la plan a y del
Hospi al de Día, y al pe sonal del Se icio de Ana omía Pa ológica
del Hospi al Uni e si a io C uces y del Biobanco Vasco, cuyo
comp omiso y ayuda en la ecogida de mues as han sido
undamen ales pa a lle a a cabo es a in es igación.
Al equipo in es igado de la UPV/EHU po su p o esionalidad y
apoyo cons an e.
Quie o hace una mención especial a los pacien es que
pa icipa on en es a in es igación. Su gene osidad y con ianza han
sido el pila sob e el cual se sos iene es e p oyec o.
Finalmen e, a mi amilia, cuyo apoyo incondicional y paciencia me
han acompañado en cada momen o.
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Ab e ia u as
ADN: Ácido desoxi ibonucleico
ADNc : ADN ci culan e umo al
ADNec: ADN ex acelula ci culan e
AID: Deaminasa de ci idina inducida po ac i ación
AP: Ana omía pa ológica
ARN: Ácido ibonucleico
ARNm: ARN mensaje o
Axi-cel: Axicab agene ciloleucel
BCR: Recep o del lin oci o B
BTK: Ti osina Kinasa de B u on
CAR: Recep o an igénico quimé ico
CBA: Célula B ac i ada
CG: Cen o ge minal
CMH: Células Mad e Hema opoyé icas
ECOG: Eas e n Coope a i e Oncology G oup
EMR: En e medad medible esidual
FFPE: Tejido ijado en o malina y embebido en pa a ina
FISH: Hib idación in si u luo escen e
HMS: Hipe mu ación somá ica
HUC: Hospi al Uni e si a io C uces
HR: Ha za d Ra io
ICC: Clasi icación In e nacional de Consenso
IPI: Índice p onós ico in e nacional
KEGG: Kyo o Encyclopedia o Genes and Genomes
LDCGB: Lin oma di uso de células g andes B
LF: Lin oma olicula
Liso-cel: Lisocab agene ma aleucel
LBAG: Lin oma B de al o g ado
LNH: Lin oma No Hodgkin
LZM: Lin oma de la zona ma ginal
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MHC: Complejo mayo de his ocompa ibilidad
MO: Médula ósea
NCG: No cen o ge minal
NGS: Nex Gene a ion Sequencing
NOS: No o he wise speci ied (no especi icado de o a
mane a)
OMS: O ganización Mundial de la Salud
PCR: Reacción en cadena de la polime asa
PET: Tomog a ía po emisión de posi ones
R/R: En ecaída o e ac a io
R-IPI: Índice p onós ico in e nacional e isado
RM: Respues a molecula
RMM: Respues a molecula mayo
RMP: Respues a molecula p ecoz
SG: Supe i encia global
SLP: Supe i encia lib e de p og esión
SNC: Sis ema ne ioso cen al
SNC-IPI: Índice p onós ico in e nacional pa a p edeci el
iesgo de ecaída en el sis ema ne ioso cen al
SP: Sang e pe i é ica
TAPH: T asplan e au ólogo de p ogeni o es hema opoyé icos
TC: Tomog a ía compu a izada
TCR: Recep o de la célula T
TdT: Te minal deoxynucleo idyl ans e ase
Tisa-cel: Tisagenlecleucel
TIT: Te apia in a ecal
UPV/EHU: Uni e sidad del País Vasco/Euskal He iko
Unibe si a ea
VAF: Va ian alelle ecuency (F acción alélica de la
a ian e)
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In oducción
Los lin omas di usos de células g andes B (LDCGB) son neoplasias
lin oides B madu as que se ca ac e izan po la p oli e ación no
egulada de lin oci os de amaño mediano o g ande, de o ma
di usa, des uyendo la a qui ec u a no mal de los ganglios
lin á icos. El LDCGB es la his ología de lin oma no Hodgkin (LNH)
más ecuen e y supone un 30-40% de odos los nue os
diagnós icos de LNH B y más del 60% de los LNH B de
compo amien o ag esi o (1,2). Como o as neoplasias
hema ológicas, es os lin omas p esen an una eno me
he e ogeneidad biológica, mani es ada en é minos mo ológicos,
gené icos y de compo amien o clínico.
Epidemiología
En Eu opa y Es ados Unidos la incidencia de LDCGB es de
ap oximadamen e 5-7 casos po cada 100 000 pe sonas al año (2–
4). Es a incidencia a ía po e nia, es más ecuen e en poblaciones
del no e de Eu opa y menos ecuen e en Á ica y Asia (5). La
incidencia de LDCGB en España se si úa en 6-7 casos po cada
100 000 pe sonas al año. En la comunidad au ónoma del País Vasco
la incidencia b u a de es e ipo de lin oma es de 6,28 casos po cada
100 000 pe sonas año (6). El Hospi al Uni e si a io C uces (HUC)
a endió en e 2020 y 2024 a 179 pacien es con LDCGB de nue o
diagnós ico.
Hay una lige a p edisposición po sexo, pues o que un 55% de los
casos ocu en en homb es, y la incidencia aumen a con la edad, con
una mediana de p esen ación a los 64 años. Hay cie a endencia a
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la ag egación amilia , con un inc emen o de has a 3,5 eces de la
incidencia de LDCGB en amilia es de p ime g ado (7,8).
Po úl imo, cabe des aca ambién, que se es á obse ando un
aumen o p og esi o en la incidencia de los LNH, incluido el LDCGB,
en los países desa ollados, con una endencia de un inc emen o
del 0,7% anual desde 2007 (9).
P esen ación clínica
El LDCGB se p esen a habi ualmen e como masas adenopá icas de
c ecimien o ápido localizadas ecuen emen e en ganglios
ce icales, axila es o abdominales. No obs an e, puede apa ece en
cualquie pa e del cue po.
La p esencia de en e medad ex agangliona es ecuen e y has a
un 26% de los pacien es p esen an un LDCGB p ima iamen e
ex agangliona (10). Un e cio de ellos p esen an en el momen o
del diagnós ico sudo ación noc u na p o usa, pé dida de peso o
ieb e. Es os sín omas, indica i os de ac i idad umo al, se conocen
como “sín omas B”, po la ele ancia que u ie on en el es adiaje
de Ann A bo (la p esencia de alguno de es os sín omas modi icaba
el es adio de A a B) (11). Ap oximadamen e el 60% de los pacien es
se diagnos ican en es adio a anzado (III o IV).
La médula ósea es á in il ada po lin oma has a en el 30% de los
pacien es con LDCGB (Fig. 1), pe o es a in il ación puede mos a
un ipo his ológico di e en e, como el lin oma olicula , has a en la
mi ad de ellos, sob e odo LDCGB ans o mados de un bajo g ado
his ológico (12).
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Fig. 1: Biopsia de médula ósea mos ando in il ación po LDCGB
(Hema oxilina Eosina, 400x). Se obse a una in il ación masi a po
células de amaño g ande con núcleos edondeados de c oma ina
laxa y escaso ci oplasma, que sus i uyen la celula idad no mal y la
g asa de la médula ósea. Fo og a ía co esía del Se icio de
Ana omía Pa ológica del Hospi al Uni e si a io C uces (HUC).
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Fisiopa ología, pa ogenia y gené ica del LDCGB
EL LDCGB es una neoplasia o iginada en los lin oci os B madu os p e
o pos cen o ge minal, que ob ienen un eno ipo neoplásico a
a és de la adquisición p og esi a de di e en es al e aciones
gené icas. El LDCGB puede ocu i de no o, sin an eceden es
p e ios de una neoplasia lin oide, pe o ambién como una
ans o mación de LNH de bajo g ado de malignidad o “indolen es”,
como la leucemia lin á ica c ónica (LLC), lin oma olicula (LF) o
lin oma de la zona ma ginal (LZM).
La pa ogenia molecula del LDCGB es compleja y muy he e ogénea,
ya que exis en muchas ías di e en es implicadas en la adquisición
del eno ipo neoplásico po la célula B madu a. Además, las
al e aciones molecula es que lle an a es a ans o mación son
di e en es en los di e en es sub ipos de LDCGB (13).
Es necesa io comp ende la complejidad biológica del LDCGB pa a
pode iden i ica a los pacien es que no ayan a esponde
adecuadamen e a la e apia con encional y se subsidia ios de
es a egias que mejo en los esul ados, ya sea median e
in ensi icación del a amien o o con e apias di igidas a las ías
me abólicas implicadas en su desa ollo. Es a iden i icación,
eó icamen e, ambién pod ía e i a la u ilización de a amien os
innecesa ios y po encialmen e óxicos en de e minados pe iles de
pacien es.
En es e sen ido, uno de los p ime os a ances en es a á ea se ob u o
con la iden i icación de dos sub ipos biológicamen e di e en es de
LDCGB basados en si su pe il de exp esión génica es simila a las
células B ac i adas (CBA) o a las células del cen o ge minal (CG)
(14). Pos e io men e, se iden i ica on algunas al e aciones
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ci ogené icas con alo p onós ico y p edic i o de espues a al
a amien o es ánda , especialmen e la coexis encia de
anslocaciones que a ec an al gen MYC con anslocaciones
a ec ando a los genes BCL2 o BCL6. Es os pacien es p esen an una
espues a de icien e al esquema de inmunoquimio e apia es ánda
( ipo R-CHOP y esquemas simila es), y ac ualmen e se a an con
esquemas más in ensi os o incluso esquemas ipo lin oma de
Bu ki (15,16). La implicación de la biología del LDCGB en el
a amien o del mismo se desc ibe en la sección “T a amien o”
(Pág. 37).
En los úl imos años, los es udios de secuenciación masi a median e
nex gene a ion sequencing (NGS) han pe mi ido iden i ica el
espec o de mu aciones y ías de señalización implicadas en la
pa ogenia del LDCGB, especialmen e en es g andes es udios que
es án buscando su alidación clínica (17–19).
Biología del lin oci o B no mal
Los lin oci os B se desa ollan desde las células mad e
hema opoyé icas (CMH) de la médula ósea (MO). P ime o, las CMH
se di e encian en p ogeni o es lin oides comunes que, as
di e en es es ados de madu ación, dan luga a los lin oci os B
í genes, células B que aún no han enido con ac o con su an ígeno.
Du an e es e p oceso de di e enciación en la MO, se da el p oceso
de ecombinación V(D)J pa a o ma el ecep o del lin oci o B
(BCR), que es á o mado po inmunoglobulinas de supe icie
asociadas a un complejo señalizado ansmemb ana y iene la
unción de econoce a los an ígenos pa a inicia la espues a
inmune adap a i a del lin oci o B.
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Los genes enca gados de la sín esis de las inmunoglobulinas son el
gen IGH (cadena pesada) e IGK o IGL (cadenas lige as kappa y
lambda). A di e encia de o os genes, la secuencia de es os genes
no puede ansc ibi se di ec amen e en un ARN mensaje o (ARNm)
y deben p ime o se p ocesados po los lin oci os B. Es os genes
ienen a ias egiones V y J (y en el caso de IGH ambién a ias
egiones D) que el lin oci o B debe eo dena , dejando
exclusi amen e una de cada pa a o ma un gen uncional. Es e
eo denamien o alea o io pe mi e gene a al ededo de 3x1011
combinaciones dis in as de inmunoglobulinas, capaces de
econoce un inmenso epe o io de an ígenos.
A ni el molecula , el p oceso consis e en co a el ADN eliminando
a ias egiones D y J pa a pos e io men e ensambla lo, uniendo una
D con una J. Pos e io men e el p oceso se epi e con las egiones V
y D. Las p incipales enzimas que pa icipan en es e p oceso son
RAG1/2 que o man un complejo enca gado de co a el ADN po
egiones especí icas en e las egiones V, D y J, TdT que añade
nucleó idos alea o ios en los pun os de co e pa a aumen a la
di e sidad y, po úl imo, el sis ema de epa ación del ADN po
ecombinación no homóloga ensambla los ex emos lib es.
Una ez han comple ado es e p oceso, los lin oci os B su en un
p oceso de selección posi i a y nega i a. Du an e la selección
posi i a, los lin oci os B que han eo denado un BCR uncional
eciben señales de supe i encia y di e enciación del es oma
medula . Los lin oci os cuyo eo denamien o ue no p oduc i o,
ealizan un segundo eo denamien o u ilizando el o o alelo de IGH
o en an en apop osis. En la selección nega i a, los lin oci os B que
han p oducido BCR que eaccionan ue emen e con a an ígenos
p opios, son eliminados, de o ma que se limi a el iesgo de
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au oinmunidad. La selección nega i a que su en los lin oci os B en
la MO no es an es ic a como la que su en los lin oci os T en el
imo, y pueden, po lo an o, exis i clones de lin oci os B
au o eac i os. Sin emba go, dado que la ac i ación de los lin oci os
B equie e la colabo ación con lin oci os T p e iamen e ac i ados,
el iesgo de au oinmunidad po la p esencia de es as clonas es bajo.
Una ez han comple ado el p oceso de di e enciación en la MO, los
lin oci os B í genes (sin con ac o p e io po el an ígeno) ci culan
po la sang e pe i é ica y se es ablecen en los ó ganos lin oides
secunda ios (p incipalmen e ganglios lin á icos) donde o man
olículos lin oides. En és os, se o iginan los cen os ge minales,
es uc u as empo ales que su gen en espues a al con ac o con un
an ígeno imo-dependien e y cuya unción es madu a la a inidad
de los lin oci os B que econocen a dicho an ígeno y di e encia los
hacia células plasmá icas o lin oci os B de memo ia.
La unción de las células plasmá icas es p oduci an icue pos con a
el an ígeno de o ma muy e icien e, mien as que los lin oci os B de
memo ia pe sis en du an e la gos pe iodos en el o ganismo pa a
pode inicia una espues a inmune de o ma más ápida an e
pos e io es con ac os con el an ígeno, sin necesidad de ealiza el
p oceso de madu ación de la a inidad an igénica de nue o (20).
Al e aciones gené icas en el LDCGB
Las al e aciones gené icas que pa icipan en la pa ogenia del LDCGB
son muy di e sas. Como en el caso de o os umo es, la
lin omagénesis se basa en la p og esi a ac i ación de
p o ooncogenes y desac i ación de genes sup eso es de umo es.
Es as mu aciones pueden o igina se an o po p ocesos comunes
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con o as neoplasias, po ejemplo, la deaminación espon ánea
asociada a la edad, como po mecanismos especí icos elacionados
con el p oceso de di e enciación y madu ación de los lin oci os B
(13).
Du an e su madu ación, los lin oci os B ealizan los p ocesos de
eo denamien o de las cadenas de inmunoglobulinas, cambio de
clase e hipe mu ación somá ica. Es os p ocesos, necesa ios pa a
c ea las inmunoglobulinas especí icas con las que los lin oci os B
ealizan su unción inmune, se basan en ac i a de o ma con olada
los genes RAG1 y RAG2, que pa icipan en el eo denamien o de
IGH. En es e p oceso se pueden causa o u as en IGH que lle en a
anslocaciones con o os genes (21).
Además, la deaminasa de ci idina inducida po ac i ación (AID)
media el cambio de clase y la hipe mu ación somá ica de las
inmunoglobulinas. Du an e el cambio de clase se pueden induci
o u as o - a ge en genes que es én ansc ipcionalmen e ac i os
como MYC o BCL6, dando luga a los eo denamien os MYC::IGH e
IGH::BCL6, espec i amen e (22). Respec o a la hipe mu ación
somá ica, la acción o - a ge de la AID du an e es e p oceso pa ece
se ambién una uen e impo an e de mu aciones oncogénicas en
el LDCGB ya que al ededo de la mi ad de los LDCGB p esen an un
pa ón de mu aciones simila a la hipe mu ación somá ica en genes
dis in os a los de las inmunoglobulinas. De hecho, las mu aciones
en algunos genes implicados en la pa ogenia del LDCGB como BCL2,
SGK1 y PIM1 pa ecen mediadas p incipalmen e po AID (17).
Las ías implicadas en la pa ogenia del LDCGB son muy di e sas, y
aunque se obse an cie os pa ones en las al e aciones gené icas
según la célula de o igen, los LDCGB CBA y CG no son en idades
biológicamen e homogéneas y hay g an a iabilidad de las ías
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implicadas en la pa ogenia den o de cada g upo. Las ías
me abólicas y de señalización más ecuen emen e al e adas en los
LDCGB se exponen a con inuación.
Di e enciación del lin oci o B
Se han desc i o a ias al e aciones gené icas que in e umpen la
di e enciación de los lin oci os B en pacien es con LDCGB. El gen
BCL6 es econocido como el egulado maes o de la ansición po
el cen o ge minal, y el gen PRDM1 es el egulado cla e
esponsable de la di e enciación de células plasmá icas.
BCL6: BCL6 egula la ansición po el cen o ge minal y
di e enciación a célula plasmá ica. En e el 25-50% de los LDCGB
CBA y el 10-30% de los CG ienen anslocaciones de es e gen que
p o ocan la sob eexp esión de la p o eína. También se han
obse ado mu aciones en el p omo o de BCL6 que impiden la
au o egulación nega i a y a o ecen su sob eexp esión. Además,
las mu aciones ac i ado as en MED2B o inac i ado as en EP300 y
CREBPP, ambién a o ecen la sob eexp esión de BCL6. La
sob eexp esión de BCL6 en LDCGB p omue e la p oli e ación
celula , impide la madu ación a célula plasmá ica y limi a la
espues a al daño en el ADN (23–26).
PDRM1: Es e gen sup ime la ía de señalización del BCR y la
p oli e ación celula en los lin oci os B ac i ados pa a p omo e su
di e enciación e minal a célula plasmá ica (27). Se obse an
mu aciones de PDRM1 en un 20-25% de LDCGB CBA. La pé dida de
unción de PMDR1 ac i a NF-κB y bloquea la di e enciación a célula
plasmá ica (28).
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se dan en un 20% de los LDCGB, sob e odo CBA, y p o egen en e
a la acción ci o óxica an i umo al de los lin oci os T CD8+ y NK (54).
PDL1 y PDL2: Se han obse ado ganancias de núme o de copias,
ampli icaciones y anslocaciones de PDL1 y PDL2 sob e odo en
LDCGB CBA, que p oducen sob eexp esión de es os genes, lo que
acili a la ane gia de los lin oci os T en el mic oambien e umo al
(56).
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Clasi icaciones de los LDCGB
Clasi icación his ológica
Los LDCGB son conside ados un g upo he e ogéneo de en idades
desde el pun o de is a his ológico. Aunque p esen an algunas
ca ac e ís icas mo ológicas e inmunohis oquímicas comunes,
ambién p esen an múl iples ca ac e ís icas especí icas que han
pe mi ido clasi ica los en di e sas en idades.
A pa i de la clasi icación de Neoplasias Lin oides de la
O ganización Mundial de la Salud 4ª edición, publicada en 2016
(OMS 2016) se han incluido a ias en idades diagnós icas den o
del LDCGB in en ando e leja es as di e encias clínicas y biológicas
(1). Es as en idades han sido e isadas en las ecien es clasi icación
de la OMS (5ª edición) (57) y la clasi icación in e nacional de
consenso de neoplasias lin oides madu as (ICC) (58).
Teniendo en cuen a las clasi icaciones an e io es, en los LDCGB se
incluyen las siguien es en idades:
• LDCGB ico en células T e his ioci os: En es e sub ipo de
LDCGB en el que las células umo ales suponen <10% de la
celula idad o al y p edomina un in il ado policlonal de
lin oci os T e his ioci os. Es e ipo in ecuen e de LDCGB
iene endencia a in il a la médula ósea y bazo (59).
• LDCGB p ima io medias ínico ( ímico): Supone el 7% de los
LDCGB y se diagnos ica ecuen emen e en edades más
emp anas que el es o de LDCGB (30-40 años), con un
p edominio en muje es con una elación 3 a 2 (60). Se
o igina en los lin oci os B de la médula del imo y iene
endencia a comp imi es uc u as locales, causando con
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ecuencia sínd ome de ena ca a supe io , ombosis de
g andes asos y aponamien o ca diaco.
• Lin oma in a ascula de células B g andes: De ine una
a ian e muy in ecuen e de LDCGB en la que se da una
p oli e ación neoplásica in a ascula de lin oci os B
g andes a ec ando sob e odo a los asos de pequeño
amaño en el sis ema ne ioso cen al (SNC), iñones,
pulmones y piel, sin que haya una ob ia exp esión
leucémica. Es una a ian e de compo amien o clínico muy
ag esi o (61,62).
• LDCGB p ima io de localizaciones inmunop i ilegiadas: La
5ª edición de la clasi icación de la OMS econoce una
en idad especí ica pa a los LDCGB de localización p ima ia
en el SNC, humo í eo, e ina o es ículos. Es os LDCGB
suelen p esen a un pe il de exp esión génica de célula B
ac i ada y mu aciones en MYD88 y CD79B (57).
• LDCGB cu áneo p ima io, ipo pie na “leg ype”: Se a a de
un LDCGB de localización cu ánea p ima ia que
ecuen emen e a ec a a la piel de las pie nas de o ma
bila e al. Es un sub ipo muy in ecuen e de LDCGB (1).
• LDCGB asociado a in lamación c ónica: LDCGB que se
desa olla sob e á eas de in lamación c ónica p e ia
(gene almen e pio ó ax c ónicos) y se asocia con in ección
po i us de Eps ein Ba . A ec a p incipalmen e a ancianos,
aunque es muy in ecuen e (57).
• LDCGB/Lin oma B de al o g ado con anslocación de BCL2
y MYC: Puede p esen a his ología del LDCGB o lin oma de
al o g ado más indi e enciado o anaplásico. Se ca ac e iza
po la anslocación de MYC y BCL2 con un gen cuyo
p omo o se encuen a ac i o en los lin oci os B
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(gene almen e IGH, IGK o IGL). Es os lin omas suelen
p esen a un pe il de exp esión génica de cen o ge minal
y compa en ca ac e ís icas clínicas y biológicas con el
lin oma de Bu ki . Es e sub ipo es clínicamen e muy
ag esi o y equie e un a amien o más in ensi o que el
es o de LDCGB (40,63).
• LDCGB, no especi icado de o a mane a (LDCGB, NOS): Es a
en idad ag upa odos los casos que no pueden clasi ica se
en ninguna de las en idades an e io es, y mues a una g an
he e ogeneidad clínica y biológica. Se a a, con di e encia,
de la en idad más ecuen e den o del global de LDCGB, ya
que más de la mi ad de los diagnós icos de és e se incluyen
en ella. His ológicamen e, es a a ian e se ca ac e iza po
una in il ación homogénea po lin oci os B g andes que
bo a po comple o la es uc u a gangliona (Fig. 2).
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Fig. 2: Imagen his ológica de un LDCGB, NOS. A: Hema oxilina
eosina 500x mos ando una in il ación di usa homogénea,
p incipalmen e po células g andes con núcleos de c oma ina laxa.
B: Tinción inmunohis oquímica pa a CD20, mos ando una ue e
posi i idad en la memb ana de las células, lo que las iden i ica como
clin oci os B. Fo og a ía Co esía del Se icio de Ana omía
Pa ológica del HUC.
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Clasi icación po célula de o igen
En el año 2000, Alizadeh e al. desa olla on una clasi icación del
LDCGB basada en el pa ón de exp esión génica medida median e
mic oa ays de exp esión génica (14). Con es a clasi icación
iden i ica on 2 subg upos de LDCGB, cen o ge minal (CG) y célula
B ac i ada (CBA), además de un pequeño po cen aje de LDCGB
inclasi icables.
Los LDCGB con pe il ipo CG p esen an una exp esión génica simila
a la de los lin oci os no males que p oli e an en el cen o ge minal,
mien as que los del ipo CBA mues an un pe il simila al que
p esen an los lin oci os B pos -cen o ge minal cuando se ac i an
po en a en con ac o con su an ígeno. En ambos casos, es os
pe iles de exp esión que en los lin oci os B no males ocu en
únicamen e du an e la p oli e ación y ac i ación, se man ienen
inde inidamen e en los lin oci os neoplásicos del LDCGB (Fig. 3)
(64–66).
Es a clasi icación iene ele ancia clínica, ya que el p onós ico de los
LDCGB CBA es peo que el de los CG, ya que mues an una
supe i encia global a los 5 años de un 25% a un 40% in e io . Sin
emba go, es a clasi icación p esen a a ias limi aciones
impo an es que han impedido su aplicación en el desa ollo de
es a egias pe sonalizadas de a amien o a ni el clínico.
P ime o, exis e mucha he e ogeneidad biológica y clínica den o de
cada g upo (CBA y CG). Es o es debido a que exis en múl iples
mecanismos po los cuales los lin oci os pueden adqui i el eno ipo
neoplásico y desemboca en cualquie a de los dos pe iles de
exp esión génica (di e en es al e aciones gené icas pueden
desemboca en la misma célula de o igen). Adicionalmen e, exis en
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pa ones mu acionales capaces de p oduci indis in amen e
lin omas an o con pe il de exp esión CBA como CG (al e aciones
gené icas simila es pueden desemboca en célula de o igen
di e en e), como se expone en el apa ado siguien e.
Segundo, la u ilización de los a ays de exp esión génica es
compleja, lo que ha supues o que no se puedan aplica de o ma
gene alizada en los labo a o ios clínicos-asis enciales. De hecho, la
o ma más habi ual en la ac ualidad de clasi ica po célula de
o igen es median e la aplicación de algo i mos basados en la
p esencia o ausencia de exp esión de cie os ma cado es
inmunohis oquímicos, como el algo i mo de Hans (Fig. 4) o el de
Choi. Es os algo i mos ienen una conco dancia con la exp esión
génica de en e el 85-90% (67,68).
Cuando los LDCGB se clasi ican median e algo i mos
inmunohis oquímicos se suelen clasi ica en los en los subg upos CG
y No CG (NCG), en luga de CG y CBA. El g upo NCG inclui ía odos
los LDCGB que no son CG, es deci , a los CBA p opiamen e dichos y
los LDCGB que hab ían sido inclasi icables po a ays de exp esión
génica.
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Fig. 3: Madu ación de los lin oci os B en el ganglio y célula de o igen
de los dos ipos LDCGB y o as neoplasias B madu as elacionadas.
LLC: Leucemia Lin á ica C ónica, HMS: Hipe mu ación somá ica.
LCM: lin oma de Células del Man o. Elabo ación p opia basada en
e e encias 64–66.
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Fig. 4: Algo i mo de Hans. A: Algo i mo inmunohis oquímico (CG:
Cen o ge minal). B-E: Aplicación del algo i mo de Hans pa a
clasi icación po célula de o igen de un caso de LDCGB. B:
Hema oxilina Eosina. C: CD10 de memb ana, nega i o. D: BCL6
nuclea , posi i o. E: MUM1 nuclea , posi i o. Según el algo i mo de
Hans, es e caso queda ía clasi icado como “No Cen o Ge minal”.
Co esía del Se icio de Ana omía Pa ológica del HUC.
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Clasi icación molecula
En 2018 Chapuy e al. lle a on a cabo un análisis median e
secuenciación del exoma y ansc ip oma comple os de 304 LDCGB
pa a iden i ica mu aciones pun uales, indels, al e aciones
somá icas del núme o de copias y a ian es es uc u ales.
In eg ando esos da os log a on iden i ica cinco sub ipos de LDCGB
con ca ac e ís icas gené icas y clínicas di e enciadas, que
denomina on “Clús e es” (17).
Poco después, Schmid e al. desa olla on o a clasi icación
basándose en los esul ados de NGS con un panel de 327 genes y
análisis de núme o de copias en 574 LDCGB (18). Con los esul ados
ob enidos encon a on cua o sub ipos di e en es de LDCGB que se
ca ac e izaban po p esen a al e aciones gené icas ca ac e ís icas
y ene un compo amien o clínico di e enciado. Además, ambién
c ea on un sis ema de clasi icación en base a un panel más
compac o de 50 genes y las anslocaciones de BCL2 y BCL6 pa a
acili a su aplicación clínica. Es e panel clasi icado enía una al a
conco dancia (>94%) con la clasi icación basada en el panel
comple o de 327 genes y análisis del núme o de copias. Un 54% de
los lin omas CBA y un 51% de los lin omas CG no pudie on se
clasi icados en ninguno de los cua o sub ipos p opues os po
Schmid e al. Po es a azón, ese mismo g upo p esen ó una
ac ualización de su clasi icación en 2020 añadiendo dos sub ipos
molecula es adicionales (19).
Ambas clasi icaciones son supe ponibles, aunque con cie as
di e encias, y pa ecen ene alo p onós ico, di e enciando
pacien es de al o y bajo iesgo de ecae o se e ac a ios. Sin
emba go, en ambos casos el es udio p onós ico se ha ealizado de
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Una posible explicación a es os pob es esul ados pod ía esidi en
la he e ogeneidad biológica del LDCGB. La mayo ía de es os
es udios u iliza on he amien as clínicas (sco es p onós icos ipo
Índice P onós ico In e nacional, IPI) o clasi icaciones a endiendo a
la célula de o igen pa a es a i ica a los pacien es, he amien as
que p esen an limi aciones. De es a o ma, los pacien es incluidos
en los es udios ue on he e ogéneos y aunque un subg upo de los
mismos espondie a mejo al a amien o in ensi icado, eso no
compensó la oxicidad a la que ue on expues os el es o de
pacien es po el sob e a amien o que ecibie on (75).
Un hecho que apoya es a hipó esis es que la in ensi icación del
a amien o ha enido un mayo impac o en el subg upo de LDCGB
y Lin omas B de al o g ado (LBAG) con eo denamien o de MYC y
BCL2, donde la adminis ación de un égimen in ensi icado y
ajus ado a la máxima ole ancia hema ológica de cada pacien e
(Ri uximab, e opósido, p ednisona, inc is ina, ciclo os amida,
doxo ubicina; R-daEPOCH) ha demos ado mejo a las asas de
espues a y la supe i encia lib e de e en os en compa ación con
R‑CHOP (15). Es a en idad, como ya se ha comen ado con
an e io idad, se dis ingue po su p onós ico ad e so y
bioma cado es diagnós icos dis in i os y ela i amen e sencillos de
analiza , lo que acili a su iden i icación p ecisa y el desa ollo de
e apias con in ensi icación de dosis.
En es e sen ido, as desc ibi se la clasi icación molecula del
LDCGB, los in es igado es del es udio PHOENIX (76) que compa aba
R‑CHOP s. R‑CHOP + ib u inib en LDCGB no CG, clasi ica on
molecula men e de o ma e ospec i a a los pacien es que
pa icipa on en el es udio pa a de e mina si la espues a ue
di e en e en e los di e en es g upos molecula es. A pesa de que
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en el es udio p incipal no obse a on di e encias signi ica i as en e
R‑CHOP e ib u inib + R‑CHOP en la población comple a, el análisis
de subg upos mos ó esul ados signi ica i amen e mejo es con
ib u inib + R-CHOP en compa ación con R‑CHOP en pacien es <60
años con g upos molecula es MCD y N1 (SLE 100% s. 47% y 50%
espec i amen e), mien as que no hubo di e encias en los g upos
BN2 e inclasi icables (77).
Ac ualmen e, es á en cu so el ensayo GIDANCE-01 (NCT04025593),
un es udio en ase II que compa a R‑CHOP con a R‑CHOP-plusX,
consis en e en R‑CHOP es ánda más un á maco adicional
(ib u inib, deci abina, ucidinos a o lenalidomida) escogido según
la clasi icación molecula del LDCGB y o os bioma cado es
gené icos. En un análisis in e medio de 107 pacien es se obse ó
que los esul ados e an signi ica i amen e mejo es en la ama R-
CHOP-plusX, an o en asa de RC (87% s. 66%) como en SLP a 1 año
(96% s. 79%) (78).
Todos es os hallazgos sugie en que es necesa io el diseño de
sis emas de es a i icación de iesgo más p ecisos pa a los
pacien es con LDCGB. Es os sis emas pod ían pe mi i di igi
es a egias de in ensi icación desde la p ime a línea en los
pacien es de al o iesgo, así como a enua el a amien o,
disminuyendo oxicidad innecesa ia, en los pacien es con mejo
p onós ico.
T a amien o de segunda línea y pos e io es
El a amien o es ánda del LDCGB en ecaída o e ac a io (R/R) es
la quimio e apia in ensi a basada en pla ino seguida de
in ensi icación con quimio e apia a al as dosis y asplan e au ólogo
de p ogeni o es hema opoyé icos (TAPH). Es e a amien o puede
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se cu a i o en al ededo de la mi ad casos, pe o p esen a
limi aciones no ables.
Po una pa e, es un a amien o muy in ensi o y no exen o de
e ec os ad e sos que equie e que el pacien e p esen e una buena
ese a uncional. O a de sus limi aciones es la edad, ya que los
TAPH no es án indicados habi ualmen e en pacien es mayo es de
75 años, edad en la que los LDCGB son más p e alen es. De es a
o ma, en o no a la mi ad los pacien es con LDCGB R/R no son
candida os a ecibi TAPH. También hay que ene en cuen a que la
e icacia de es e a amien o es mucho meno en los pacien es que
p esen an en e medad quimio- e ac a ia o ecaídas p ecoces (< 1
año). Además, las ecaídas as es a segunda línea de a amien o
ienen muy pocas p obabilidades de esponde a quimio e apia
adicional y su p onós ico es in aus o.
Po odo ello, se han in en ado desa olla nue as es a egias de
esca e basadas en inmuno y quimio e apia (Tabla 2), de las cuales
la más p ome edo a disponible es la e apia celula con lin oci os T
con ecep o an igénico quimé ico (CAR-T) an i CD19.
Los CAR-T son lin oci os T ci o óxicos au ólogos modi icados
gené icamen e median e la in oducción de un ec o e o i al
que con iene la secuencia de un ecep o quimé ico an i-CD19. Es e
ecep o combina la egión a iable de una inmunoglobulina an i-
CD19 con la egión in acelula del ecep o de la célula T (TCR), de
o ma que es os lin oci os CD8+ pueden ac i a se y des ui las
células neoplásicas que exp esan CD19 de o ma muy e icien e y sin
necesidad de ac i a se po los lin oci os T CD4+.
Ac ualmen e exis en 3 p oduc os CAR-T come ciales ap obados
pa a el a amien o del LDCGB: Axicab agene ciloleucel (Axi-cel),
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Tisagenlecleucel (Tisa-cel) y Lisocab agene ma aleucel (Liso-cel),
ca ac e izados po una e icacia simila , pe o con algunas di e encias
es uc u ales de i adas p incipalmen e de un dominio
coes imulado di e en e (CD28 pa a Axi-cel, 4-1BB pa a Tisa-cel y
Liso-cel) y una elación CD4+/CD8 + equilib ada única pa a Liso-cel.
Los es p oduc os demos a on una al a e icacia en el LDCGB R/R
as al menos 2 líneas p e ias, con asas de espues a globales del
52 al 83% con un 40% a 58% de RC y una mediana de du ación de la
espues a de 11 a 23 meses en e di e en es ensayos (79–81).
Es os buenos esul ados de los CAR-T como e ce a línea
impulsa on a p oba los como a amien o de segunda línea en
LDCGB R/R. Se han lle ado a cabo es g andes ensayos
alea o izados de ase III en los que se compa a on los es
p oduc os CAR-T y el a amien o es ánda (Quimio e apia de
esca e y TAPH), en pacien es con LDCGB e ac a io o en ecaída
p ecoz (82–84). En el ensayo BELINDA, el isa-cel no mos ó
supe io idad espec o al a amien o es ánda de esca e,
p obablemen e debido a un la go iempo desde la ecaída has a la
adminis ación del CAR-T (mediana de 59 días) (84). En cambio, los
ensayos ZUMA-7 (Axi-cel) y TRANSFORM (Liso-cel) demos a on la
supe io idad de los dos p oduc os CAR-T espec o al a amien o
es ánda , an o en é minos de espues as al a amien o (RC 65%
en e a 32%, y 66% en e a 39%, espec i amen e) como de
supe i encia (mediana de SLE 8,2 en e a 2 meses y 10,2 en e a
3,1 meses, espec i amen e).
A pesa de es os esul ados p ome edo es, los CAR-T ienen cie as
limi aciones que pueden di icul a su implan ación como
a amien o de segunda línea. Son p oduc os económicamen e
muy cos osos, su manu ac u a es compleja y puede demo a se
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a ias semanas, lo que puede di icul a su uso en pacien es con
en e medades ápidamen e p og esi as (de hecho, es e pudo se
una de las p incipales causas de los esul ados nega i os del es udio
BELINDA) y, además, al di igi se con a una única diana (el CD19)
pueden omen a la e olución clonal y apa ición de mecanismos de
escape en las células neoplásicas. La implan ación de nue os
bioma cado es que pe mi an una es a i icación del iesgo más
p ecisa y la iden i icación p ecoz de la ecaída en un momen o en
el que haya una baja ca ga umo al pod ían mi iga es os
p oblemas, al pe mi i la u ilización de los CAR-T de o ma más
e icien e, cen ándose en los pacien es que más se an a bene icia
de ellos.
E aluación de la espues a y moni o ización
La mayo ía de las ecaídas del LDCGB ocu en du an e los p ime os
dos años de seguimien o. Ac ualmen e la e aluación de la
espues a se ealiza median e PET-TC al inaliza el a amien o y,
pos e io men e, únicamen e median e he amien as clínicas
(anamnesis, explo ación), ese ando las p uebas de imagen pa a
los momen os en los que se sospeche una ecaída.
Se han es udiado a ias es a egias de moni o ización con p uebas
de imagen (PET o TC) se iadas pa a in en a de ec a de o ma
p ecoz la ecaída, pe o es as es a egias no han p ospe ado,
p incipalmen e po su baja sensibilidad y po iesgos asociados a la
i adiación epe ida (85,86).
De es a o ma, ac ualmen e no se cuen a con ninguna he amien a
que pe mi a de ec a p ecozmen e las ecaídas an es de que sean
sin omá icas.
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Tabla 1. Es a egias de mejo a de la p ime a línea de a amien o del LDCGB
Esquema
Fase
N
CdO
Ca ac . P es.
Resul ados
R-CHOP14 (87)
III
540
Todas
SLP a 2 años 75,4% s. 74,8% (NS)
SG a 2 años 82,7% s 80,8% (HR 0.9, NS)
R-ACVBP (88)
III
194
Todas
IPI 1 (bajo iesgo).
Edad <60 años.
SLE a 3 años 81% s 67% (HR 0,56, p=0,0035)
EAs g ado 3-4 42% s 15%
R-da-EPOCH (89)
III
266
Todas
SLP a 2 años 78.9 s 75,5, SG 86,5 s 85,7 (NS)
R-CHOP + TAPH
(90)
III
199
Todas
SG a 5 años 78% s 77% (NS)
G-CHOP (91)
III
706
Todas
SLP a 3 años 70% s 67% (NS). EAs más ecuen es
con G-CHOP
R2-CHOP (E1412)
(92)
II
145
Todas
ECOG <2
SLP a 3 años del 73% en e al 61%, (HR 0,66) SG a 3
años 83% s 75% (HR 0,67)
R2-CHOP
(ROBUST) (93)
III
285
No CG
SLP a 2 años 72%, SG a 2 años 79%. No di e encias
signi ica i as con R-CHOP, HR 0,85 (95% CI, 0,63 A
1,14).
VR-CHOP
(PYRAMID) (94)
II
103
No CG
No di e encias en SLP ni SG
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Esquema
Fase
N
CdO
Ca ac . P es.
Resul ados
VR-CHOP
(REMODLB) (95)
III
459
Todas
SLP a 30 meses 70,1% s 74,3% (NS)
Ib u inib +
RCHOP (76)
III
419
No CG
No di e encia en SLP en la coho e comple a. En
meno es de 60 años PFS supe io con Ib u inib + R-
CHOP (HR 0,57)
Pola-R-CHP
(POLARIX) (74)
III
440
Todas
Edad <80 años.
RC 78% s 74% (NS). SLP a 2 años 76,7% s. 70,2%.
No di e encias es SG. No di e encia en EAs g a es.
Vene oclax + R-
CHOP (96)
II
206
Todas
ECOG <2
RG 83%, RC 69%. SLP a 2 años 80% (HR s. Con oles
his ó icos R-CHOP 0,61%) EAs g ado 3-4: 86%
Ab e ia u as: Ca ac . P es.: Ca ac e ís icas de los pacien es N: Núme o de pacien es incluidos en la ama expe imen al.
CdO: Célula de o igen. IPI: índice p onós ico in e nacional. SLP: Supe i encia lib e de p og esión. RG: Respues as
globales. RC: Respues as comple as. SLE: Supe i encia lib e de e en os. SG: Supe i encia global. HR: Haza d Ra io. No
CG: No cen o ge minal. EAs: E en os Ad e sos. NS: No signi ica i o. ECOG: Eas e n Coope a i e Oncology G oup
(Pe eo mance Scale).
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Tabla 2. Nue os á macos pa a el a amien o del LDCGB en ecaída o e ac a io.
Esquema
Desc ipción
Fase
N
Población
Resul ados
Ta asi amab +
Lenalidomida (97)
An i-CD19 con
lenalidomida
II
81
LDCGB R/R no
elegibles pa a TAPH
RG 60%, RC 43%, SLP a 1 año 50%
Mosune uzumab
(98)
An icue po
biespecí ico An i-
CD20 x An i-CD3
I
129
LNH-B R/R (Incluye
LDCGB y o os)
RG 39%, RC 19%, Mediana SLP 1,4
meses
Glo i amab (99)
An icue po
biespecí ico An i-
CD20 x An i-CD3
I
127
LNH-B R/R (Incluye
LDCGB y o os)
RG 41%, RC 29%, Mediana SLP 2,4
meses
Epco i amab
(100)
An icue po
biespecí ico An i-
CD20 x An i-CD3
I/II
46
LNH-B R/R (Incluye
LDCGB y o os)
RG 68%, RC 45%
Od onex amab
(101)
An icue po
biespecí ico An i-
CD20 x An i-CD3
I
71
LNH-B R/R (Incluye
LDCGB y o os)
RG 60%, RC 60% en pacien es
p e iamen e no a ados con CAR-T.
RG 33%, RC 24% en pacien es
p e iamen e a ados con CAR-T
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Esquema
Desc ipción
Fase
N
Población
Resul ados
Plamo amab
(102)
An icue po
biespecí ico An i-
CD20 x An i-CD3
I
36
LNH-B R/R (Incluye
LDCGB y o os)
RG 33%
Pola uzumab-R-
Benda (103)
An i-CD79 con
i uximab y
bendamus ina
II
192
LDCGB R/R no
elegibles pa a TAPH
RG 41.5%, RC 38.7%. Mediana SLP 9.2
meses. Mediana SG 12.4 meses.
Loncas uximab
e esine (104)
An icue po
conjugado con a
CD19
II
145
LDCGB R/R
RG 42%, RC 24%. Mediana SLP 4.9
meses. Mediana SG 9.9 meses.
Ab e ia u as: N: Núme o de pacien es incluidos en la ama expe imen al (solo incluye los LDCGB en caso de que el es udio
incluyese o os LNH). CdO: Célula de o igen. IPI: índice p onós ico in e nacional. SLP: Supe i encia lib e de p og esión.
RG: Respues as globales. RC: Respues as comple as. SLE: Supe i encia lib e de e en os. SG: Supe i encia global. HR:
Haza d Ra io. No CG: No cen o ge minal. EAs: E en os Ad e sos. NS: No signi ica i o. LNH: Lin oma no Hodgkin. R/R: en
ecaída o e ac a io. TAPH: T asplan e au ólogo de p ogeni o es hema opoyé icos.
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Necesidades no cubie as en los LDCGB
Teniendo en cuen a lo p e iamen e expues o, se pod ía conside a
que exis en una se ie de necesidades no cubie as en el LDCGB:
• Di icul ad pa a diseña es a egias de mejo a de la p ime a
línea basadas en in ensi icación o e apias di igidas, debido
al iesgo de sob e o in a a amien o, po que los
bioma cado es ac ualmen e en uso, no pe mi en iden i ica
cla amen e a los pacien es de al o iesgo.
• La sensibilidad de las écnicas de e aluación de la espues a
es limi ada, lo que impide diseña es a egias de
consolidación en p ime a línea basadas en la p esencia o no
de en e medad esidual.
• No exis en écnicas de moni o ización de la en e medad que
pe mi an de ec a p ecozmen e la ecaída, de o ma que
és a suele p esen a se de o ma sin omá ica, con
en e medad ex ensa, lo que puede limi a la aplicabilidad de
a amien os que equie en iempo de manu ac u a o en los
que la can idad de masa umo al se ha elacionado con su
e icacia (como la e apia CAR-T).
Ac ualmen e se es án in es igando nue os bioma cado es en el
LDCGB que puedan ayuda a supli es as necesidades. En e ellos,
des aca el ADN ex acelula ci culan e (ADNec), cuyo es udio se
conoce como “biopsia líquida” y p esen a un papel cada ez más
ele an e como bioma cado en oncología.
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esidual (EMR), sino pa a de ec a la apa ición de nue as
mu aciones que puedan indica la o mación de clones esis en es
al a amien o.
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HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
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Hipó esis y Obje i os
Como se ha indicado an e io men e, el LDCGB mues a una
ma cada he e ogeneidad biológica y clínica que supone que el
p onós ico de los pacien es no pueda se p edicho con exac i ud
con las he amien as de es a i icación p onós ica ac ualmen e
disponibles en la p ác ica clínica. Es e hecho ha di icul ado mucho
el diseño de es a egias de a amien o di igidas con a es a
en e medad.
En la úl ima década, el es udio median e NGS del ADN ci culan e
umo al de o ma no in asi a (conocido como “biopsia líquida”) ha
omado ele ancia en múl iples cánce es. Aunque la in es igación
sob e es as écnicas en LDCGB aún es ela i amen e escasa, a ios
es udios han mos ado que pod ía apo a in o mación p onós ica
en es os pacien es.
Teniendo odo lo an e io en cuen a, p oponemos la siguien e
hipó esis y obje i os.
Hipó esis
El es udio molecula del ADN ex acelula ci culan e en plasma
median e Nex Gene a ion Sequencing en pacien es con Lin oma
Di uso de Células G andes B pe mi e mejo a la es a i icación
p onós ica p opo cionada po las he amien as clínicas
ac ualmen e en uso e iden i ica a pacien es de muy al o iesgo de
e ac a iedad o ecaída.
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Obje i os
El obje i o de es e es udio es iden i ica bioma cado es
molecula es de o ma mínimamen e in asi a que pe mi an
de ec a a los pacien es con LDCGB de al o iesgo de no esponde
a la quimio e apia de p ime a línea o de ecae , mejo ando así la
es a i icación p onós ica de es os lin omas.
Pa a ello, se han p opues o los siguien es obje i os especí icos:
1. E alua la sensibilidad de la ecnología NGS pa a iden i ica
mu aciones somá icas en ADN ex acelula ci culan e ob enido
a pa i de plasma (biopsia líquida), en una se ie de pacien es
con LDCGB, median e el es udio de:
1.1 La conco dancia en la de ección de a ian es somá icas,
iden i icadas median e un panel p eseleccionado de genes
elacionados con la biología de los LNH, en mues as
pa eadas de ADN ex aído ejido umo al ijado en
o malina y embebido en pa a ina y en ADN ex acelula
ci culan e ob enido de plasma.
1.2 La conco dancia en e la asignación de sub ipos
molecula es de LDCGB según las a ian es iden i icadas en
ADN ex aído de umo y plasma, con el panel
an e io men e mencionado.
2. Es ablece el pe il mu acional del LDCGB en biopsia líquida en
una se ie ampliada de pacien es, median e:
2.1 La iden i icación de los genes más ecuen emen e
mu ados en LDCGB a pa i de un panel p eseleccionado
de genes elacionados con la biología de los LNH.
2.2 La iden i icación de a ian es ecu en es y egiones
ecuen emen e mu adas en LDCGB (ho spo s).
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3. Iden i ica bioma cado es no in asi os en pacien es con LDCGB
que pe mi an:
3.1 Es a i ica el p onós ico de los pacien es de nue o
diagnós ico.
3.2 E alua p ecozmen e la espues a al a amien o de
p ime a línea con esquemas basados en R-CHOP.
4. E alua la u ilidad de los bioma cado es p e iamen e
iden i icados en una pequeña coho e de pacien es con LDCGB
ecaído o e ac a io a ados con esquemas de esca e con
in ención cu a i a.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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Mé odos
Población de es udio y mues as biológicas
C i e ios de inclusión y exclusión
Se incluye on pacien es con LDCGB, de no o o ans o mado de
lin omas de bajo g ado diagnos icados en los Se icios de
Hema ología y Hemo e apia del Hospi al Uni e si a io C uces y
Hospi al Uni e si a io A aba en e los años 2018-2022, que
cumplie on los siguien es c i e ios de inclusión y no p esen a on
ninguno de los siguien es c i e ios de exclusión.
C i e ios de inclusión:
1. Diagnós ico de LDCGB con i mado median e es udio
ana omopa ológico con alguna de las siguien es his ologías:
• LDCGB, no especi icado de o a mane a (LDCGB, NOS)
• LDCGB ico en células T e his ioci os
• LDCGB de localizaciones inmunop i ilegiadas
• LDCGB p ima io medias ínico ( ímico)
• Lin oma de al o g ado doble/ iple hi según la
clasi icación OMS 2016 de neoplasias lin oides (139), con
mo ología de LDCGB en la ana omía pa ológica, que
co esponde a LDCGB con anslocación de MYC y BCL2
en la más ecien e clasi icación OMS2022 (57).
2. T a amien o con in ención cu a i a:
• Pacien es incluidos en p ime a línea: T a amien os
basados en Ri uximab y an aciclinas “R-CHOP like”,
incluyendo R-CHOP, R-daEPOCH, R-miniCHOP y R-CHOP
con an aciclinas liposomales, seguidos o no de
consolidación con au o-TPH.
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Secuenciación del ADN
Panel NGS
Se u ilizó un panel basado en sondas de cap u a p e iamen e
publicado pa a su uso en mues as de ADNec en LDCGB (142). Es e
panel con iene 112 genes ecuen emen e mu ados en lin omas no
Hodgkin B:
• Región codi ican e comple a: ACTB, ARID1A, ARID1B,
ARID5B, ATM, B2M, BCL10, BCL2, BCL6, BCOR, BTG1, BTG2,
BTK, CARD11, CCND3, CD274, CD36, CD58, CD70, CD79A,
CD79B, CD83, CDKN2A, CDKN2B, CIITA, CREBBP, CXCR4,
DDX3X, DTX1, EP300, ETS1, ETV6, FBXW7, FOXO1, GNA13,
GNAI2, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, ID3,
IRF2BP2, IRF4, IRF8, ITPKB, KLHL14, KLHL6, KMT2D, KRAS,
MALT1, MAML1, MAP2K1, MAPK1, MCL1, MEF2B, MFHAS1,
MYC, MYD88, NFKBIA, NFKBIE, NFKBIZ, NOTCH2, OSBPL10,
PARP2, PAX5, PIK3CA, PIM1, POU2F2, PRDM1, PRKCB, REL,
RHOA, RRAGC, S1PR1, S1PR2, SETD1B, SETD2, SGK1,
SMARCA4, SOCS1, SPEN, SPIB, STAT3, STAT6, TBL1XR1,
TCF3, TMEM30A, TMSB4X, TNFAIP3, TNFRSF14, TNIP1, TOX,
TP53, XBP1 y ZEB2.
• Exones seleccionados: BRAF, DIS3, EBF1, EZH2, FAS, HVCN1,
NOTCH1, NRAS, P2RY8, PCBP1, PIK3CD, PIK3R1, PTEN,
PTPRD, SF3B1, TET2 y XPO1.
El ADN p o enien e de FFPE se agmen ó con COVARIS®, mien as
que el ADNec se p ocesó sin agmen a , ya que po su na u aleza
se encuen a ya agmen ado en cadenas de unas 150 pb.
Se ealiza on lib e ías con 10-200 ng de ADNec y 150 ng de ADN
p o enien e de mues as FFPE u ilizando adap ado es con ba code
molecula (Th uPLEX Taq-seq Ki , Taka a) y en iquecimien o po
cap u a (Su eSelec XT Ta ge En ichmen Sys em). La calidad de las
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lib e ías se de e minó u ilizando Bioanalyze (High Sensi i i y DNA
ki ) y, pos e io men e, las lib e ías se secuencia on en el
ins umen o No aSeq 6000 de Illumina (2x150 bp) en los Se icios
Gene ales de In es igación de la UPV/EHU (SGIke ).
Flujo de abajo y análisis bioin o má ico
Los da os c udos esul an es de la secuenciación se analiza on pa a
iden i ica las a ian es u ilizando el paque e bioin o má ico
“Sa ek”(143–145) (Fig. 7). Se a a de un p oceso bioin o má ico
alidado pa a la de ección de a ian es somá icas en mues a
umo ales, que se compone de los siguien es pasos:
1. Es udio de calidad de los a chi os asq median e Fas QC.
2. Eliminación de adap ado es median e Fas P.
3. Alineamien o con a la e sión GRCh38 (Hg38) del genoma
humano median e BWA con al algo i mo mem.
4. Iden i icación y ma cado de las lec u as duplicadas.
5. Recalib ación de la calidad de las bases siguiendo las buenas
p ác icas de GATK (GATK BaseRecalib a o y ApplyBQSR).
Es e paso u iliza un algo i mo que ajus a la calidad de las
bases epo ada po el secuenciado pa a aumen a la
especi icidad de la pos e io iden i icación de a ian es. En
gene al educe el iesgo de acep a a e ac os de
secuenciación como a ian es cuando se abaja con bajas
acciones alélicas (VAF).
6. Iden i icación de a ian es con mu ec 2 en modo “somá ico,
solo umo ”.
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7. Ano ación de las a ian es median e SnpE y Va ian E ec
P edic o (VEP) pa a pa a clasi ica las a ian es y p edeci
sus e ec os.
Adicionalmen e, se ealizó en pa alelo la iden i icación de a ian es
pa iendo de los a chi os BAM ecalib ados usando las
he amien as F eebayes (ajus ando la sensibilidad a VAF 1%) y
Pisces, con la con igu ación ecomendada pa a a ian es somá icas
de baja VAF.
Sólo las a ian es iden i icadas como “PASS” en al menos 2 de los 3
algo i mos u ilizados se conside a on pa a el análisis pos e io .
También se desca a on las a ian es con una cobe u a meno de
200 o menos de 10 lec u as de la a ian e.
Iden i icación de mu aciones somá icas y il ado de
polimo ismos
El il ado de polimo ismos se basó en un análisis uncional in silico
de las a ian es, ya que no se con aba con mues as con ADN
ge minal pa a hace un es udio compa a i o de de ección de
a ian es somá icas.
En un p ime paso, se conside a on p obables polimo ismos y se
elimina on del análisis aquellas a ian es que cumplie an alguno de
los siguien es c i e ios:
• F ecuencia en la población >1% en 1000 genomes o
GenomeAD.
• Repo adas como benignas en Clin a .
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Pos e io men e, se conside a on a ian es de in e és,
p obablemen e somá icas y elacionadas con el umo , aquellas
que cumplie an alguno de es os c i e ios:
• Cualquie a ian e epo ada como pa ogénica o
p obablemen e pa ogénica en ClinVa o asociada a cánce
en la base de da os COSMIC (146).
• La a ian e p oduce una p o eína uncada o cambio del
ma co de lec u a.
• La a ian e a ec a a un donan e o acep o de splicing,
e aluado median e las he amien as SpliceAI (147) y
Pangolin (148).
• Va ian es que p oducen un cambio de aminoácido
p obablemen e pa ogénico po algo i mos in silico
(CADDph ed sco e > 10, PolyPhen sco e > 0.9, SIFT < 0.1 o
Mu a ionAssesso sco e > 2).
Las a ian es de in e és se e isa on manualmen e u ilizando
las pla a o mas Va Some (149) y GeneBe (150) pa a con i ma
su pa ogenicidad. Es as pla a o mas ag egan in o mación sob e
la pa ogenicidad de a ian es de múl iples bases de da os y
algo i mos in silico.
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Fig. 7: Pipeline bioin o má ica de análisis de a ian es
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Cálculo de la concen ación de ADNc
Los ni eles de ADNc se calcula on eniendo en cuen a la
concen ación de ADNec o al (medida po Qubi as la ex acción)
y la mediana de la ecuencia alélica de las mu aciones pa ogénicas
obse adas en el es udio de secuenciación de dicho ADN, siguiendo
un mé odo p e iamen e publicado (121,122). Los ni eles de ADNc
se exp esa on en equi alen es de genoma haploide (hGE).
La ó mula empleada pa a el cálculo de los ni eles de ADNc ue la
siguien e:
[𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 (𝑛𝑔 𝑚𝑙
⁄)= 𝐴𝐷𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜 (𝑛𝑔)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 (𝑚𝑙)
[𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙
⁄)=[𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 (𝑛𝑔 𝑚𝑙
⁄)∗𝐹𝐴 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎
[𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (ℎ𝐺𝐸 𝑚𝑙
⁄)= [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙
⁄) ∗ 1000 𝑝𝑔
1 𝑛𝑔 ∗ 1 ℎ𝑔𝐸
3.3 𝑝𝑔
Donde:
𝐴𝐷𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜 (𝑛𝑔): es la can idad o al de ADN ex aído del
plasma, calculado como la concen ación de ADN en el eluido inal
mul iplicado po el olumen de dicho eluido.
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 (𝑚𝑙): es el olumen de plasma
p ocesado pa a la ex acción de ADNec.
[𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 : es la concen ación de ADNec o al en plasma
(libe ado po el umo y el es o de células del o ganismo).
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𝐹𝐴 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎: es la mediana de la ecuencia alélica de las a ian es
pa ogénicas iden i icadas en el es udio de NGS en ADNec en
plasma.
[𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙
⁄ ): es la concen ación de ADNc es imada,
exp esada en ng/uL.
[𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (ℎ𝐺𝐸 𝑚𝑙
⁄ ): es la concen ación de ADNc es imada,
exp esada en equi alen es de genoma haploide po ml de plasma.
Se calcula como la concen ación de ADNc en ng/ml po la masa de
un genoma humano haploide (3,3 pg).
Conco dancia de hallazgos gené icos de ec ados en mues as de
ADNec y ADN ex aído de FFPE
Pa a de e mina la p ecisión de la NGS en biopsia líquida pa a
hallazgo de mu aciones somá icas en LDCGB, se compa a on los
esul ados ob enidos en ADNec y ADN ex aído de FFPE, analizando
es pa áme os:
• P opo ción de pacien es con al menos una mu ación
somá ica de ec able en ADNec.
• Sensibilidad de la secuenciación de ADNec, calculada como
la p obabilidad de encon a en ADNec una mu ación
p esen e en la mues a umo al.
• Conco dancia en e la clasi icación en subg upos gené icos
según las mu aciones halladas en FFPE y ADNec ( e más
adelan e).
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Clasi icación de los LDCGB en sub ipos gené icos
Las mues as ue on clasi icadas en sub ipos molecula es u ilizando
el algo i mo LymphGen 2.0, Lymphplex 1.0 y wo-s ep
(19,151,152), u ilizando los a ian es halladas en la NGS de la
mues a umo al o ADNec, y la p esencia o ausencia de
anslocación de MYC, BCL2 y BCL6 en FISH ealizado en las
mues as de biopsia umo al en el es udio diagnós ico del pacien e.
Se selecciona on los sub ipos molecula es EZB, BN2, MCD, N1 y ST2.
Adicionalmen e, las mues as incluidas en el g upo gené ico EZB, se
clasi ica on como MYC+ si p esen a on mu aciones en DDX3X,
FOXO1, GNA13, MYC o TP53 (19).
Las disco dancias en e algo i mos se esol ie on po consenso
(asignando a la mues a el subg upo indicado po dos de es
algo i mos o asignando el g upo “O o” en caso de disco dancia
en e los es algo i mos).
No se pudo inclui el sub ipo A53 po que se de ine p incipalmen e
en base a a iaciones del núme o de copia (VNC) que no son
es udiadas en p o undidad po el panel u ilizado. Como
ap oximación a dicho g upo, se clasi ica on como “sospecha A53”
las mues as que hubie an sido clasi icadas en el sub ipo “O o” y
que p esen asen mu aciones con pé dida de unción en TP53 y
uncan es (pa ada o pé dida del ma co de lec u a) en B2M, ya que
es as dos son las únicas al e aciones ca ac e ís icas del sub ipo A53
que no se basan en VNC (19).
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Iden i icación de bioma cado es no in asi os
Iden i icación de nue os bioma cado es p onós icos
Además de las a iables clínicas con alo p onós ico ya conocidas
(edad, LDH, es adio, a ec ación ex agangliona , es ado gene al) se
es udió el e ec o en la supe i encia global (SG) y lib e de
p og esión (SLP) de las siguien es a iables:
• La concen ación de ADNec o al en plasma
• Va ian es somá icas iden i icadas en ADNec
• El sub ipo molecula de LDCGB calculado en base a las
a ian es iden i icadas en ADNec
• Los ni eles de ADNc (ADNec de i ado del lin oma)
E aluación p ecoz de la espues a al a amien o según los ni eles
de ADNc
De e minamos los ni eles de ADNc en los pacien es de los que se
disponía de mues a pa a de e mina la espues a molecula según
las de iniciones de Ku z e al (121), as habe ecibido 1 o 2 ciclos
de a amien o quimio e ápico:
• Respues a molecula p ecoz (RMP): educción de los ni eles
de ADNc de más de 2 loga i mos (o ADNc inde ec able)
as un ciclo de a amien o quimio e ápico.
• Respues a molecula mayo (RMM): educción de los
ni eles de ADNc de más de 2,5 loga i mos (o ADNc
inde ec able) as dos ciclos de a amien o quimio e ápico.
• Respues a molecula (RM): habe alcanzado RMP o RMM.
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Compa amos la SG y SLP de los pacien es según si alcanza on RM o
no pa a de e mina si és a se puede u iliza como bioma cado pa a
p edeci p ecozmen e la e ac a iedad o ecaída.
Los pacien es en p ime a línea y los pacien es en ecaída ue on
analizados po sepa ado.
Análisis es adís ico
El es udio es adís ico se ealizó u ilizando el so wa e R e sión
4.2.1.
Los es udios de supe i encia se ealiza on median e el es imado
de Kaplan-Meye y las supe i encias en e g upos se compa a on
median e la p ueba Log Rank. Las di e encias de supe i encia
en e g upos se exp esa on como haza d a io (HR).
Los pun os de co e de las a iables con inuas pa a la sepa ación
de g upos p onós icos (concen ación de ADNec, ni eles de ADNc )
se calcula on u ilizando la unción hie del paque e ol de R. Es a
unción u iliza la p ueba Log Rank mó il pa a iden i ica pun os de
co e óp imos en una a iable con inua pa a p oduci g upos con
mayo es di e encias de supe i encia.
La co elación en e a iables cuan i a i as con inuas se midió
median e el coe icien e de co elación de Pea son. U ilizamos la
p ueba de S uden pa a compa a medias y p ueba de chi
cuad ado (χ²) pa a analiza p opo ciones.
Se ealizó un modelo de iesgos p opo cionales mul i a ian e de
Cox pa a de e mina las a iables independien es con mayo
impac o p onós ico. Esas a iables se u iliza on pa a hace un sco e
p onós ico con obje i o de mejo a el pode disc imina i o del
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Sensibilidad de la NGS en ADNec
El es udio de la sensibilidad de la NGS pa a iden i ica mu aciones
somá icas en ADNec se lle ó a cabo en 46 pacien es de los que se
disponía de mues as pa eadas de ADN ex aído de mues a de
ejido FFPE y de plasma, en ambos casos an es de inicia el
a amien o.
Los pa áme os u ilizados pa a alo a la iabilidad de la NGS en
ADNec ue on los siguien es:
• P opo ción de pacien es con al menos una mu ación
somá ica de ec able en ADNec.
• La sensibilidad de la NGS sob e ADNec pa a de ec a
a ian es p esen es en ADN umo al ex aído de mues a
FFPE.
• La conco dancia en el sub ipo molecula calculado
u ilizando las a ian es halladas en ADNec en e a las
a ian es halladas en ADN umo al ex aído de mues a
FFPE
De ección de a ian es somá icas
T as el il ado de a ian es siguiendo el pipeline diseñado,
iden i icamos 513 a ian es pa ogénicas, p obablemen e
pa ogénicas o de signi icado incie o en las 46 mues as de ADN
ex aído de FFPE y 807 en las 78 mues as de ADNec.
La p o undidad de lec u a de las a ian es ue simila en FFPE y
ADNec, 2444,4 y 2256,7 lec u as, espec i amen e (Tabla 4). La
acción alélica (VAF) media de las a ian es halladas en ADN
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ex aído de FFPE ue del 39,3% ( ango 0,6% - 95,3%), y en ADNec,
del 23,1% ( ango 0,8% a 96,3%).
Tabla 4: P o undidad de lec u a de las a ian es en ejido umo al y
plasma.
P o undidad
media
Va ian es
>2000x (%)
Va ian es
>1000x (%)
Va ian es
>500x (%)
FFPE
2444,4x
54,5%
87,6%
95,8%
ADNec
2256,7x
48,1%
80,2%
96,0%
FFPE: ADN ex aído de ejido umo al ijado en o malina y embebido en
pa a ina, ADNec: ADN ex acelula ci culan e (en plasma).
Los esul ados de la secuenciación mos a on al menos una
mu ación en odas las mues as de ADN ex aído a pa i de la
mues a umo al, con una media de 11 mu aciones po pacien e
( ango 1-32). En ADNec, encon amos al menos una mu ación en 38
de los 46 pacien es (82,6%). Teniendo en cuen a es os da os, la
sensibilidad global de la NGS en ADNec pa a de ec a mu aciones
p esen es en el ejido umo al ue del 66,6%. Es a sensibilidad
depende de la VAF de la a ian e en el ejido umo al, siendo mayo
la sensibilidad pa a las a ian es con VAF más al a en umo (Tabla
5 y Fig. 9 A).
Si añadimos el da o de la concen ación de ADNec, obse amos que
en los pacien es con concen aciones de ADNec < 50 ng/ml, se
de ec a on el 46% de las a ian es, de 50 a 200 ng/ml el 76% y >200
ng/ml el 90%. La concen ación de ADNec ue signi ica i amen e
mayo en los pacien es con al menos una a ian e de ec ada en el
ADNec en compa ación con aquellos sin a ian es de ec ables (Fig.
9, C).
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Tabla 5: Sensibilidad de la NGS en ADNec (biopsia líquida) pa a
de ec a a ian es p esen es en ADN de ejido umo al (mues a de
biopsia de LDCGB)
FA en FFPE
<5%
5-15%
15-25%
25-40%
>40%
Global
Va ian es en
ADN de FFPE
42
41
131
148
150
513
Va ian es en
ADNec
5
21
78
108
130
342
Sensibilidad
11,9%
51,2%
59,5%
72,9%
86,6%
66,6%
FA: F acción alélica. Sensibilidad: % de a ian es de ec ables en ejido umo al
que se de ec a on en la mues a pa eada de ADNec.
Los ocho pacien es en los que no se obse a on mu aciones en el
ADNec p esen aban odos ellos es adio I, sin in il ación o gánica,
baja ca ga umo al y baja concen ación de ADNec. Incluyendo es a
in o mación en el cálculo de la sensibilidad, po un lado, una VAF
>5% en la mues a umo al (pa a elimina a ian es subclonales
poco ep esen a i as), y una al a ca ga umo al (pacien es con
es adio II o mayo ), la sensibilidad de la écnica aumen ó al 81,3%.
Po úl imo, iden i icamos 61 mu aciones únicamen e p esen es en
ADNec que no es aban p esen es en las co espondien es mues as
pa eadas de ejido umo al (Fig. 9, B).
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Fig. 9: Sensibilidad de la NGS en biopsia líquida (ADNec en plasma)
pa a de ec a a ian es somá icas en LDCGB, es udio sob e 46
pacien es con mues as pa eadas de umo y plasma. A:
Sensibilidad de la NGS en ADN ex acelula ci culan e pa a de ec a
a ian es p esen es en el ejido umo al según la ecuencia alélica
de la a ian e en umo al pa a inado (FFPE) y el es adio del
pacien e. B: Conco dancia global en e las a ian es halladas en
ADNec en plasma y ADN ex aído de ejido umo al FFPE C:
Concen ación de ADNec en pacien es sin y con a ian es en dicho
ADN.
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Clasi icación molecula según ADNec
Pa a de e mina la iabilidad del ADNec pa a clasi ica el LDCGB en
sub ipos molecula es (SM), compa amos la clasi icación ob enida
u ilizando las a ian es halladas en ADN ejido umo al y plasma en
las 46 mues as pa eadas.
La clasi icación en sub ipos molecula es se ealizó median e los
algo i mos LymphGen, LymphPlex y Two S ep, eniendo en cuen a
las a ian es iden i icadas en ADNec o ex aído de ejido umo al, y
la p esencia o ausencia de eo denamien os de MYC, BCL2 y BCL6
si se había ealizado es udio de FISH sob e la biopsia del
diagnós ico, según la p ác ica clínica habi ual ( e mé odos, pág.
77).
La conco dancia global en e el SM asignado según las a ian es
iden i icadas en ejido umo al y ADNec ue del 65%. Las
disc epancias se debie on p incipalmen e a las ocho mues as en
las que no se iden i ica on a ian es en ADNec en plasma. T es de
ellas habían sido clasi icadas median e el ejido umo al como EZB
y 5 como “O os”. Adicionalmen e, 2 pacien es clasi icados como
ST2 y uno clasi icado como “O os” median e ejido umo al ue on
clasi icados median e ADNec en plasma como “O os” y EZB,
espec i amen e (Fig. 10).
Teniendo en cuen a únicamen e las mues as con a ian es
iden i icadas en ADNec, la conco dancia de SM ue del 92%.
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Fig. 10 G á ico de Shankey que mues a la dis ibución de los
sub ipos molecula es en nues a se ie de 46 pacien es con
mues as pa eadas, desde la clasi icación po célula de o igen
(izquie da) a la clasi icación molecula según ADN de ejido umo al
(cen o) y según ADNec (de echa).
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Pe il mu acional del LDCGB en biopsia líquida
Genes ecuen emen e mu ados en LDCGB
En nues a coho e de 78 pacien es con mues a de plasma ex aída
en el momen o del diagnós ico, los 20 genes más ecuen emen e
mu ados ue on KMT2D (n=37 pacien es), TP53 (n=29), CREBBP
(n=28), TNFRSF14 (n=21), B2M (n=19), GNA13 (n=18), PIM1 (n=18),
TBL1XR1 (n=18), ARID1B (n=17), MYD88 (n=17), BTG2 (n=15), DTX1
(n=15), FOXO1 (n=15), TMSB4X (n=15), EZH2 (n=14), ITPKB (n=14),
CARD11 (n=13), CCND3 (n=13), EP300 (n=13) y TET2 (n=13).
La Fig. 11 mues a una ma iz indicando los genes mu ados en
biopsia líquida y ipo de a ian e po pacien e.
Muchos de los genes p esen a on a ias mu aciones en el mismo
pacien e (mul i-hi ), des acando BCL2 (con una media de 4,3
a ian es po pacien e), PIM1 (3,73), MYC (2,88), DTX1 (2,86),
MFHAS1 (2,78), PRDM1 (2,75), P2RY8 (2,71), BTG2 (2,68), SOCS1
(2,55), ACTB (2,37), RHOA (2,33) y KMT2D (2,26). En elación a los
genes con mayo núme o de mu aciones iden i icadas, es os ue on
KMT2D, PIM1, CREBBP, TP53, DTX1, TNFRSF14, BTG2, B2M, GNA13,
BCL2, SOCS1, TMSB4X, TBL1XR1 y TET2, en los que se encon a on
59, 41, 36, 35, 29, 26, 25, 24, 23, 22, 22, 22, 21 y 20 a ian es,
espec i amen e.
La Fig. 12 mues a el núme o de a ian es iden i icadas en cada gen
incluido en el panel, es a i icando po célula de o igen en la
coho e comple a de 90 pacien es.
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*Con inua en página siguien e
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115
012
098
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103
004
078
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072
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F017
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046
006
065
067
074
081
083
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105
T-002
T-004
T-010
CO
CG
CG
CG
CG
CG
NCG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
NCG
CG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
CG
CG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
CG
NCG
NCG
NCG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
SM
EZB
EZB
EZB
EZB
EZB
EZB
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
ST2
ST2
ST2
ST2
ST2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
A53
A53
A53
N1
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
BCL2 . 0100020121 1 1 1 1 02 2 2 2 0002 2 2 2 2 02 2 0 0 22202 2 2 2 2 2 02020 0 0 0 20 0 0 2222200020 0 2
BCL6 . 00000200002 2 2 2 02 2 020002 2 010 0 120 0 2020002 2 2 02 2 02020 0 20 0 0 0 0 0 2200020 0 2
MYC . 020000012220210212 2 0 0 202 2 1202 2 0002 2 02 2 02220101020120 0 2 2 2 120001 1 0 0 2
KMT2D 2255545 5 252144 42421525 5 5 137%
CREBBP 4247451 1 1 64575121227%
TNFRSF14
1654541 1 51 1 1 41
21%
EZH2 5 5 1 1 1 1 1 1 1 1 15%
TP53 1 1 1 1 1 51 1 1 5 5 5 1 1 1 1 261 1 1 1 21 1 539%
GNA13 2141545251 1 242722%
DDX3X 1 1 1 1 1 1 61513%
FOXO1 151 1 31 1 1 1 13%
CARD11 515 5 1 1 1 1 1 1 1 16%
TNFAIP3 21452 2 2 10%
NOTCH2 4 4 4 4 4 7%
TET2 1525241542516%
SGK1 41 1 6159%
MYD88 1 1 7111111151 1 1 1 1 1 25%
PIM1 151115 5 45115%
CD79B 1 1 1 61 1 2612%
BTG1 5 5 5 6175 5 12%
ETV6 156 6 6%
B2M 2326 6 35654515321%
NOTCH1 213%
TBL1XR1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 18%
DTX1 451 1 1 5 5 1 1 5116%
BTG2 16151 1 515615%
IRF8 41 1 1 841 1 1 815%
ARID1B 74 4 1717512%
ATM 51 1 21651 1 13%
CCND3 1 1 21 1 41 1 413%
TMSB4X 6163516 6 513%
BCL2 5151 1 1 1 10%
EP300 1 1 36 6 1 1 1 12%
ITPKB 41 1 1 751212%
SPEN 2 2 5121510%
TMEM30A
46451 1 4 4
12%
MEF2B 1 1 6141610%
MYC 51515 5 610%
ACTB 5 5 1 1 1 1 9%
BCL10 25454 4 9%
EBF1 6 6 1517%
GNAI2 7571 1 7%
H1-4 1 1 216%
IRF4 6514%
NFKBIE 12 2 2 57%
OSBPL10 1 1 1 617%
POU2F2 1 1 1 4219%
SOCS1 5 5 5 327%
TOX 1452149%
ARID1A 2 2 566%
CD58 5 5 246%
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CG
CG
CG
CG
CG
NCG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
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CG
CG
CG
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CG
CG
NCG
CG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
CG
CG
NCG
NCG
NCG
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NCG
NCG
NCG
CG
NCG
NCG
NCG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
CG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
NCG
SM
EZB
EZB
EZB
EZB
EZB
EZB
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
EZBM
ST2
ST2
ST2
ST2
ST2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
BN2
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
MCD
A53
A53
A53
N1
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
O he
BCL2 . 0100020121 1 1 1 1 02 2 2 2 0002 2 2 2 2 02 2 0 0 22202 2 2 2 2 2 02020 0 0 0 20 0 0 2222200020 0 2
BCL6 . 00000200002 2 2 2 02 2 020002 2 010 0 120 0 2020002 2 2 02 2 02020 0 20 0 0 0 0 0 2200020 0 2
MYC . 020000012220210212 2 0 0 202 2 1202 2 0002 2 02 2 02220101020120 0 2 2 2 120001 1 0 0 2
CDKN2A 641 1 6%
H1-5 121717%
KLHL6 414517%
PRKCB 1 1 1 1 6%
PTPRD 6 6 1 1 1 7%
CD70 645 5 6%
CD83 12316%
FAS 1644%
H1-2 1 1 516%
HVCN1 7254%
IRF2BP2 5214%
RHOA 1 1 1 46%
SETD1B 42516%
STAT6 1 1 1 4%
BCL6 1414%
BCOR 1214%
BRAF 1 1 1 4%
BTK 1 1 1 4%
CIITA 6714%
H1-3 1 1 74%
MAP2K1 1 1 1 4%
MCL1 1 1 34%
MFHAS1 5 5 14%
PRDM1 1514%
STAT3 5724%
ZEB2 2 2 64%
ETS1 21%
KLHL14 5 5 3%
MAML1 11%
NFKBIZ 613%
NRAS 1 1 3%
P2RY8 1 1 3%
PAX5 1 1 3%
RRAGC 1 1 3%
SPIB 213%
PCBP1 51%
ARID5B 61%
CD36 41%
CD79A 11%
MALT1 61%
NFKBIA 41%
PTEN 11%
S1PR2 11%
SMARCA4
5
1%
TCF3 11%
TNIP1 21%
XPO1 11%
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Leyenda:
Célula de o igen
Cen o ge minal
No cen o ge minal
T anslocaciones
P esen e
Ausen e
No es ada
Fig. 11: Va ian es halladas en ADN ex aído de plasma (biopsia
líquida) en las 67 mues as de plasma de los pacien es incluidos en
p ime a línea en las que se de ec ó al menos una a ian e. Las
mues as es án ag upadas po célula de o igen y sub ipo molecula .
“Mul i-hi ”: p esencia de dos a ian es pa ogénicas o
p obablemen e pa ogénicas di e en es en el mismo gen.
BCL2/BCL6/MYC .: T anslocación de BCL2/MYC/BCL6
Sub ipo molecula
EZB MYC-
MCD
EZB MYC+
A53 (sospecha)
ST2
N1
BN2
O o/Inclasi icable
Tipo de a ian e
1
Cambio de Aminoácido
7
Inse ción o deleción en ma co
2
Cambio ma co de lec u a
3
Pé dida de inicio
4
Codón de pa ada
8
Pé dida de pa ada
6
Luga de splicing
9
O as
5
"Mul i Hi "
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Fig. 15: Localización de las a ian es iden i icadas en CD79B. En ojo se indica la localización del ho spo
Ty 196, en el dominio ITAM de CD79B. EN ama illo a ian es de splicing en la unión en e el exón 4 y 5.
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Fig. 16: Localización de las a ian es iden i icadas en B2M. En ojo se indica la localización de la a ian e
ecu en e p.Me 1? (pé dida del codón de inicio). En ama illo a ian es en la egión de splicing en e los
exones 1 y 2.
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Fig. 17: Localización de las a ian es iden i icadas en BTG2. En ojo se indica la localización del ho spo
p.Gly28. Adicionalmen e en ama illo se mues a la egión de splicing al inicio del in ón 1-2 ambién al e ada.
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Fig. 18: Localización de las a ian es iden i icadas en FOXO1. En ojo se indica la localización del ho spo que
aba ca de p.A g21 a p.Th 24.
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Fig. 19: Localización de las a ian es iden i icadas en NFKBIE. En ojo se indica la localización de la a ian e
ecu en e NFKBIE: c.759_762delTTAC (p.Ty 254 s).
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Fig. 20: Localización de las a ian es iden i icadas en PIM1. En ojo se indica la localización del ho spo si uado
en el codón 135. A di e encia de o os genes con a ian es ecu en es, en PIM1 se iden i ica on múl iples
a ian es epa idas po oda la secuencia codi ican e.
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Iden i icación de bioma cado es p onós icos no in asi os
El es udio de bioma cado es con u ilidad p onós ica se ealizó
analizando el ADNec ob enido en el momen o del diagnós ico del
LDCGB en los 78 pacien es a ados en p ime a línea con R-CHOP o
esquemas simila es. Los bioma cado es es udiados ue on:
• La concen ación de ADNec o al en plasma
• Va ian es somá icas iden i icadas en ADNec
• El sub ipo molecula de LDCGB calculado en base a las
a ian es iden i icadas en ADNec
• Los ni eles de ADNc (ADNec de i ado del lin oma)
Concen ación de ADN ex acelula ci culan e o al
La concen ación de ADNec o al en las mues as ex aídas al
diagnós ico ue muy a iable, con una media de 150,28 ng/ml
( ango 4,86 – 1563,75 ng/ml). Cuando se compa a on los ni eles de
ADNec con el es o de a iables clínicas con alo p onós ico, se
obse ó una mayo concen ación de ADNec en los pacien es con
es adios a anzados (III-IV), sín omas B, a ec ación ex agangliona
y LDH ele ada (aunque mos ando ma cado solapamien o en e
g upos) (Fig. 21, A-D).
En elación con los análisis de supe i encia, obse amos que los
pacien es con mayo concen ación de ADNec al diagnós ico
mos aban una SLP y SG meno . Pa a es e es udio, di idimos a los
pacien es en 3 g upos, según los ni eles de ADNec: bajo (<10
ng/ml), in e medio (10-100 ng/ml) y al o (>100 ng/ml). Es os
pacien es p esen a on una SLP a 2 años de 91,7%, 69,7% y 54,0%, y
una SG a 2 años de 91,7%, 80,5% y 58,5%, espec i amen e, al y
como se mues a en la Fig. 21, E-F.
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Fig. 21: Concen ación de ADNec en plasma al diagnós ico según
di e en es ca ac e ís icas clínicas (A-D). Es udio de supe i encia según la
concen ación de ADNec en plasma en el momen o del diagnós ico (E-F):
Supe i encia lib e de p og esión (SLP) y global (SG). ** = p<0,01; ***
p<0,001; **** = p<0,0001.
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Va ian es somá icas iden i icadas en ADNec
Pa a de e mina el alo p onós ico de las mu aciones, analizamos
la SLP según la p esencia o ausencia de a ian es pa ogénicas (o
p obablemen e pa ogénicas) en cada uno de los genes incluidos en
el panel de o ma indi idual. Excluimos del análisis los genes
mu ados en menos de es pacien es di e en es, dado que no es un
amaño mues al su icien e pa a iden i ica di e encias
signi ica i as en supe i encia.
T as la co ección po compa aciones múl iples siguiendo el
mé odo de Benjamini-Hochbe g, iden i icamos dos genes
signi ica i os ARID1B e IRF8 (p ajus ada <0,05). Adicionalmen e,
iden i icamos cua o genes ce canos a la signi icación es adís ica:
IRF4, MYC, B2M y TP53 mul i-hi (p ajus ada <0,1 pe o >0,05 con p
b u a <0,01). El e ec o en la SLP de las mu aciones en es os genes
se mues a en la Tabla 6 y Fig. 22.
Tabla 6: Genes con alo p onós ico
Gen
N
HR
p
P ajus .
ARID1B
7 (8,9%)
5,27 (2,02-13,76)
<0,001
<0,001
IRF8
10 (12,8%)
3,96 (1,62-9,65)
0,0011
0,028
B2M
14 (17,9%)
2,99 (1,27-7,03)
0,0083
0,081 (NS)
IRF4
3 (3,8%)
5,43 (1,57-18,78)
0,0026
0,056 (NS)
MYC
7 (8,9%)
3,93 (1,46-10,58)
0,0035
0,064 (NS)
TP53 MH
7 (8,9%)
3,74 (1,39-10,4)
0,0049
0,070 (NS)
N: Núme o de pacien es con a ian es pa ogénicas en el gen (% del o al), HR:
Haza d a io (in e alo de con ianza del 95%), MH: Mul ihi , de inida según los
c i e ios de la ICC (>1 a ian e con acción alélica (FA) >10% o una a ian e con
FA >50%), NS: No signi ica i o.
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Fig. 22: Cu as de Kaplan-Meye mos ando la supe i encia lib e
de p og esión (SLP) según la p esencia de mu aciones pa ogénicas
o p obablemen e pa ogénicas en ADNec en plasma en los genes
ARID1B, IRF4, IRF8, MYC, B2M y TP53 mul ihi . No hubo di e encias
signi ica i as en la SLP según las mu aciones en el es o de genes
incluidos en el panel.
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Tabla 9: Dis ibución po célula de o igen en los di e en es sub ipos
molecula es
Sub ipo
To al
CG (N, %)
NCG (N, %)
p
EZB
17
16 (94,1%)
1 (5,9%)
<0,001
MCD
8
1 (12,5%)
7 (87,5%)
0,02
BN2
8
2 (25,0%)
6 (75,0%)
0,14 (NS)
ST2
6
4 (66,7%)
2 (33,3%)
0,37 (NS)
A53 (sospecha)
3
1 (33,3%)
2 (66,7%)
0,57 (NS)
N1
1
0 (0%)
1 (100%)
N/A
O o
24
12 (50%)
12 (50%)
0,93 (NS)
Sin a ian es
11
3 (27,3%)
8 (72,7%)
0,11 (NS)
CG: cen o ge minal, NCG: no cen o ge minal. La signi icación es adís ica
se ha calculado median e chi-cuad ado, compa ando la dis ibución po
célula de o igen de cada sub ipo espec o al es o. N/A: No aplica (no
calculable p pa a un único e en o). NS: No signi ica i o.
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Fig. 24: Supe i encia lib e de p og esión en los di e en es sub ipos
molecula es (cu as colo eadas). La cu a g is en cada g á ico
mues a la SLP del es o de pacien es como compa ación.
p <0.01
P = 0.024
P = 0.05
p=0.47
p=0.73
p=0.19
p=0.46
p=0.2
+
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Ni eles de ADN ci culan e umo al (ADNc )
Los ni eles de ADNc se calcula on en base a la concen ación de
ADNec en plasma o al y la mediana de la acción alélica de las
a ian es iden i icadas median e NGS ( e mé odos pág. 75). Los
ni eles de ADNc al diagnós ico mos a on una al a a iabilidad
( ango: inde ec able a 5,3 log10 hGE/ml)
La compa ación de los ni eles de ADNc con el es o de a iables
clínicas mos ó que es os ni eles ue on mayo es en los pacien es
con es adios a anzados, sín omas B, mayo LDH sé ica y a ec ación
ex anodal (Fig. 25).
Fig. 25: Ni eles de ADNc según di e en es a iables clínicas y
analí icas. Valo es de p: *< 0,05; **<0,01; ***<0,001; **** <0,0001.
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En los pacien es con ADNc de ec able (es deci , p esencia de
alguna a ian e en ADNec) hubo una ue e co elación en e los
ni eles de ADNc y la concen ación de ADNec (R2 = 0,89, p <0,01);
sin emba go, hubo 12 pacien es con concen aciones de ADNec
en e 0,4 log10 ng/ml y 2,1 log10 ng/ml en los que no se halla on
a ian es, con lo que la co elación global ue meno (R2 = 0,75, p
<0,01) (Fig. 26).
Fig. 26: Co elación en e los ni eles de ADNec y los ni eles de
ADNc . A: pacien es con ADNc de ec able. B: odos los pacien es.
Además, los ni eles de ADNc mos a on impac o p onós ico, dado
que median e es os ni eles se pudie on es a i ica a los pacien es
en 3 g upos p onós icos: ADNc bajo (<2 log10 hGE/ml), in e medio
(2-4,5 log10 hGE/ml) y al o (>4,5 log10 hGE/ml), con una SLP a 2
años del 93,3%, 67,7% y 37,5%, espec i amen e (p<0,01) (Fig. 27).
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Fig. 27: Cu as de Kaplan-Meye que mues an la supe i encia
lib e de p og esión (SLP) y global (SG) de los pacien es con LDCGB
según los ni eles de ADNc al diagnós ico (exp esados en log10
hGE/ml).
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Combinación de a iables clínicas y ni eles de ADNc
En nues a coho e, la aplicación del Índice P onós ico In e nacional
Re isado (R-IPI) (Tabla 10) pe mi ió di idi a los pacien es en es
g upos de iesgo con di e en e SLP: Muy Bueno (SLP a 2 años 100%),
Bueno (SLP a 2 años 86,5%) y Malo (SLP a 2 años 53,7%) (Fig. 28, A).
Tabla 10: Va iables incluidas en el Índice P onós ico In e nacional
Re isado (R-IPI).
Va iables del R-IPI
Va iable
Pun .
Edad >60 años
1
2 o más LE
1
LDH ele ada
1
Es adio III o IV
1
ECOG > 1
1
G upos de iesgo según R-IPI
Pun .
G. Riesgo
SLP 2a (IC 95%)
0
Muy Bueno
100% (100-100 %)
1-2
Bueno
86,5% (73,4-100 %)
3-5
Malo
53,7% (40,1-70,9 %)
Pun .: Pun uación. LE: Localizaciones ex agangliona es, LDH: Lac a o
deshid ogenasa, ECOG: Eas e n Oncology Coope a i e G oup
(Pe o mance Scale). G. Riesgo: G upo de iesgo. SLP 2a: Supe i encia
lib e de p og esión a 2 años. IC: in e alo de con ianza.
Pa a de e mina si los ni eles de ADNc podían mejo a la
disc iminación en e los g upos del R-IPI, con igu amos un nue o
sco e p onós ico consis en e en la pun uación IPI más uno o dos
pun os adiciones si los ni eles de ADNc e an supe io es a 2 o 4
log10 hGE/ml (Tabla 11). Es e sco e sepa ó a los pacien es en 4
g upos, 3 con una SLP simila a los g upos muy bueno, bueno y malo
del R-IPI (SLP a 2 años 100%), y un g upo adicional de muy al o
iesgo con SLP a 2 años in e io al 20% (Fig. 28, B).
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Tabla 11: Modi icación del R-IPI pa a inclui los ni eles de ADNc
Va iables R-IPI+ADNc
Va iables
Pun .
Edad >60 años
1
2 o más LE
1
LDH ele ada
1
Es adio III o IV
1
ECOG > 1
1
ADNc 2-4
1
ADNc >4
2
G upos de iesgo según R-IPI+ADNc
Pun .
G. Riesgo
SLP 2a (IC 95%)
0
Muy Bueno
100% (100-100 %)
1-3
Bueno
92,1% (82,2-100 %)
4-6
Malo
58,7% (44,6-77,2 %)
>6
Muy Malo
14,29% (2,3-39,6 %)
Pun .: Pun uación. LE: Localizaciones ex agangliona es, LDH: Lac a o
deshid ogenasa, ECOG: Eas e n Oncology Coope a i e G oup
(Pe o mance Scale). ADNc : ni eles de ADN ci culan e umo al en
log10 hGE/ml, G. Riesgo: G upo de iesgo, SLP 2a: Supe i encia lib e
de p og esión a 2 años. IC: in e alo de con ianza.
Fig. 28: Supe i encia lib e de p og esión de los pacien es con
LDCGB a ados con R-CHOP según R-IPI (A) y R-IPI+ADNc (B). MB:
Muy bueno, B: Bueno, M: Malo, MM: Muy Malo (únicamen e en
R-IPI+ADNc ).
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Iden i icación de bioma cado es de espues a a a amien o
Los ni eles de ADNc pa a e aluación p ecoz de la espues a
Pa a de e mina el alo del ADNc como bioma cado de espues a
al a amien o, analizamos mues as de plasma de 33 pacien es
a ados con R-CHOP, ex aídos as uno (N=16) o dos (N=17) ciclos
de dicho esquema.
En es as mues as, en p ime luga , de inimos la espues a
molecula p ecoz (RMP) y espues a molecula mayo (RMM) de
acue do con los c i e ios de inidos po Ku z e al. ( e Mé odos,
pág. 78), con la sal edad de que, en nues o caso, dada la meno
sensibilidad de nues a écnica, la disminución de 2 y 2,5 log
p opues a po Ku z e al. ue equi alen e a que los ni eles de
ADNc uesen inde ec ables (no halla a ian es somá icas en el
ADNec).
En base a es o, los análisis de supe i encia mos a on que aquellos
pacien es que no alcanza on la RMP o la RMM (es deci , pacien es
con ni eles de ADNc de ec ables as 1 o 2 ciclos de R-CHOP) enían
alo es de SLP y SG signi ica i amen e más bajos, con una SLP a 2
años de 28,6% s. 95,4% (HR 2,7; p<0,0001) y SG a 2 años de 28,6%
s. 100% (HR 3,32; p<0,0001) (Fig. 29).
Es as di e encias se debie on p incipalmen e a e ac a iedad y
ecaídas p ecoces en el g upo de pacien es que no alcanzó ningún
ipo de espues a molecula (n=7). De es os, cinco ecaye on an es
de los 6 meses del inicio del a amien o con R-CHOP. De es os 5
pacien es, 2 allecie on an es de pode inicia el a amien o de
esca e y 3 ue on e ac a ios a dicho a amien o.
En dos de los pacien es que no alcanza on espues a molecula y
ecaye on, la p og esión se iden i icó median e el TC in e im
ealizado de u ina as 2 ciclos de R-CHOP, muy ce cano en el
iempo a la ex acción de la biopsia líquida, mien as que en los
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o os es, el es udio median e biopsia líquida de ec ó la
pe sis encia de en e medad una media de 3,4 (1,6-6,2) meses an es
de que se e idenciase la p og esión clínica o po écnica de imagen.
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Fig. 29: Cu as de Kaplan-Meye que mues an la supe i encia
lib e de p og esión (SLP) y global (SG) según los ni eles de ADNc
as 1 o 2 ciclos de R-CHOP en pacien es a ados en p ime a línea.
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• La concen ación de ADNec (ADN ex acelula ci culan e en
plasma o al)
• La p esencia de mu aciones en a ios genes de o ma
indi idual o ag upados según las ías me abólicas en las que
pa icipan.
• El sub ipo molecula de LDCGB
• Los ni eles de ADNc (can idad del ADNec o al que
p o iene de las células umo ales)
Adicionalmen e, es udiamos el impac o p onós ico de la e olución
de los ni eles de ADNc en 33 pacien es con mues as de plasma
ex aídas as 1 o 2 ciclos de quimio e apia, pa a de e mina su
u ilidad pa a la e aluación p ecoz de la espues a o de ección
p ecoz del allo e apéu ico.
Po úl imo, de o ma explo a o ia, es udiamos los bioma cado es
p onós icos p e iamen e iden i icados en 12 pacien es con LDCGB
ecaído o e ac a io incluidos en segunda línea.
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Iden i icación de mu aciones somá icas en ADNc
Viabilidad de la NGS en ADNec
La NGS ealizada sob e mues a de ADNec pe mi e la de ección de
mu aciones somá icas del LDCGB de o ma no in asi a con una
sensibilidad a iable. En nues a se ie, con la me odología u ilizada,
iden i icamos en el plasma el 66,6% de odas las a ian es
iden i icadas en umo . Es a sensibilidad aumen ó al 81,3% pa a los
pacien es en es adio II de Lugano o supe io y pa a las a ian es con
acción alélica supe io al 5% en ejido umo al, de o ma simila a
la obse ada en es udios p e ios (123,128,129,131,142).
La capacidad de la NGS pa a de ec a las a ian es somá icas del
umo en ADNec depende an o de los ni eles de ADNc como la
ca ga alélica de la a ian e en el umo . Es e hecho implica que las
a ian es p incipales p esen es en oda la masa umo al se án más
ácilmen e de ec adas en biopsia líquida que las a ian es
subclonales.
En nues a coho e, además, iden i icamos algunas a ian es en
plasma que no se encon a on en la mues a pa eada de ejido
umo al. Es e hecho ha sido p e iamen e desc i o en o os es udios
simila es, y se pos ula que no se a a de alsos posi i os, sino de
a ian es clonales que se encuen an en una zona del umo
di e en e a la biopsiada. Es o signi ica que no se de ec an en los
es udios de NGS ealizados en ADN ex aído del ejido umo al,
pe o al pode libe a se al plasma, pueden se de ec adas en el
ADNec (129,130).
De es a o ma, la NGS sob e ADNec pod ía cap u a la
he e ogeneidad gené ica del LDCGB mejo que la NGS sob e una
mues a umo al ob enida po biopsia de una egión alea o ia del
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lin oma. Es e hallazgo es compa ible con la expe iencia clínica
p e ia con o as écnicas diagnós icas, po ejemplo, la PET, que en
algunos pacien es mues a di e en es ni eles de cap ación en
di e en es á eas que, al se biopsiadas, pueden mos a di e encias
his ológicas.
Po o o lado, la no iden i icación de a ian es en algunos pacien es
no ha signi icado un acaso de la écnica, ya que es e esul ado
ambién o o ga una in o mación clínica ele an e. De hecho, la
ausencia de a ian es en ADNec (o lo que es lo mismo, ene ni eles
de ADNc inde ec ables) asoció muy buen p onós ico en nues a
se ie.
Po úl imo, espec o a la capacidad de la NGS sob e ADNec pa a
ealiza la clasi icación molecula del LDCGB, en los 46 pacien es
con mues as pa eadas, la conco dancia de la clasi icación
molecula en e el ADN ex aído de FFPE y ADNec ue del 65%.
Es a baja conco dancia se explica p incipalmen e po las mues as
sin a ian es iden i icadas en ADNec, que no se pudie on clasi ica ,
y a amos como un subg upo apa e (“sin a ian es”). En el caso
de los 67 pacien es con al menos una a ian e de ec ada en plasma,
la conco dancia aumen ó al 92%. Además, pa a los pacien es con
sub ipos desc i os en la li e a u a como des a o ables (MCD en
NCG y EZB MYC+ en CG) la conco dancia ue del 100% ( odos ellos
enían a ian es de ec ables en ADNec).
Cabe des aca que odos los pacien es con anslocación de MYC
de ec ada po FISH p esen a on en ADNec alguna mu ación
ca ac e ís ica del sub ipo EZB MYC+, que pod ía habe los clasi icado
en es e sub ipo incluso en ausencia del esul ado del FISH de MYC.
Es e hecho iene g an ele ancia clínica, ya que en ocasiones la
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calidad y can idad de mues a ob enida en las biopsias diagnós icas
no pe mi e ealiza écnicas ci ogené icas.
Globalmen e, podemos conclui que la secuenciación con
ecnología NGS sob e ADNec iene una sensibilidad acep able pa a
de ec a mu aciones somá icas del LDCGB y pe mi e ealiza la
clasi icación molecula con iabilidad siemp e y cuando los ni eles
de ADNc sean su icien es pa a pode de ec a a ian es en plasma.
Pe il molecula del LDCGB en biopsia líquida
La ecuencia alélica de las a ian es y el núme o de a ian es
iden i icadas po mues a ue on simila es a o os es udios p e ios
(17–19).
En gene al, el pe il de mu aciones en e di e en es pacien es ue
muy he e ogéneo. Sin emba go, hubo a ios genes ecuen emen e
mu ados en los LDCGB CG, como KMT2D, CREBBP, TNSFR14 o EZH2;
en los LDCGB NCG, como B2M, PIM1 o MYD88; y en LDCGB con
ambas células de o igen, como TP53. Todos es os genes ienen
unciones conocidas en la pa ogenia del LDCGB ( e : Al e aciones
gené icas en el LDCGB, pág. 13).
Iden i icación de ho spo s con po encial ele ancia clínica
Aunque la mayo ía de las a ian es iden i icadas se localiza on po
oda la egión codi ican e de los genes analizados, iden i icamos
a ios ho spo en nues a se ie, egiones pequeñas de genes que se
encon a on ecuen emen e mu ados en a ias mues as.
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El más ecuen e ue la mu ación del codón Ty 646 del gen EZH2,
que se dio en un 16,6% de los pacien es al diagnós ico, odos ellos
de célula de o igen CG, la mayo ía (90%) pe enecien es al sub ipo
molecula EZB ( an o MYC+ como MYC-). El LDCGB ans o mado de
lin oma olicula (LF) suele pe enece al sub ipo EZB (19), y es e
ho spo ambién se encuen a ecuen emen e mu ado en LF,
aumen ando de ecuencia cuan o mayo sea su g ado his ológico,
lo que sugie e que pod ía ene elación con el enómeno de la
ans o mación a al o g ado (146). En nues a se ie no
iden i icamos que las a ian es en es e ho spo u ie an alo
p onós ico.
También ue on in e esan es el ho spo en CD79B p.Ty 196 y la
a ian e MYD88 p.Leu260P o (conocida ambién como L265P). Es e
conjun o de a ian es son muy especí icas del sub ipo MCD y muy
ecuen es en dicho g upo, es ando alguna de las dos p esen es en
al menos dos e cios de los LDCGB MCD (19). Es e sub ipo molecula
es especialmen e ele an e dado su compo amien o clínico
ca ac e ís ico, con mayo iesgo de in il ación ex agangliona y
neu omeníngea. De hecho, la úl ima edición de la guía de p o ilaxis
neu omeníngea en LDCGB publicada po GELTAMO (G upo Español
de Lin omas y T asplan e Au ólogo de Médula Ósea), sugie e que el
sub ipo MCD pod ía consolida se como una indicación de p o ilaxis
neu omeníngea en el u u o (154).
Cabe des aca que, como es e sub ipo se de ine p incipalmen e po
la p esencia de mu aciones en los ho spos s de MYD88 y CD79B, su
iden i icación en la p ác ica clínica pod ía se ela i amen e
sencilla, an o usando écnicas molecula es clásicas sob e mues a
de ADN umo al (PCR alelo especí ica, secuenciación Sange , e c.),
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como median e es udios di igidos en biopsia líquida (po ejemplo,
median e PCR digi al).
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Bioma cado es p onós icos en ADNec
Concen ación de ADNec
La concen ación de ADNec o al (de o igen umo al y no umo al)
mos ó impac o nega i o en la SLP y SG en nues a coho e.
Es e hecho p obablemen e se deba a que los ni eles de ADNec se
co elaciona on con los de ADNc , mos ando un impac o
p onós ico muy ue e en nues a se ie. Sin emba go, la co elación
no es comple a y hubo a ios pacien es con ADNec ele ado que no
p esen a on ni eles ele ados de ADNc .
La azón p obablemen e sea que el ADNec se puede ele a en
múl iples si uaciones clínicas, algunas de ellas ecuen emen e
concomi an es al debu de un LDCGB, como las in ecciones o la
in lamación sis émica (109,124). Po es o, la concen ación ele ada
de ADNec no siemp e indica ni eles ele ados de ADNc , po lo que
no pa ece se an ú il pa a iden i ica pacien es de al o iesgo. Po
el con a io, odos los pacien es con baja concen ación de ADNec
p esen a on ni eles de ADNc bajos o inde ec ables y un p onós ico
a o able, de o ma que pod ía se una he amien a ela i amen e
sencilla pa a iden i ica pacien es de buen p onós ico.
O a limi ación del ADNec pa a su aplicación como bioma cado
p onós ico es que es muy sensible a las a ian es p eanalí icas,
especialmen e al iempo desde la oma de la mues a de sang e
has a su p ocesamien o, así como a las condiciones de
almacenamien o de la misma. Es o es debido a que, en caso de
coagulación de la mues a de sang e an es de la sepa ación del
plasma, se p oduce una libe ación in i o de ADN de los neu ó ilos
que inc emen a alsamen e el ADN o al en el plasma (y educe el
po cen aje de ADNc ).
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En conclusión, el alo como bioma cado p onós ico del ADNec es
limi ado, pe o, dada la ela i a acilidad y el bajo cos e de su
medición, pod ía se un bioma cado ú il en la p ác ica clínica,
especialmen e pa a iden i ica pacien es de buen p onós ico si su
concen ación es baja.
Va ian es gené icas con alo p onós ico
Pa a iden i ica genes con alo p onós ico, ealizamos un es udio
de supe i encia alo ando la SLP de los 78 pacien es a ados con
esquemas simila es a R-CHOP, ag upados según si enían o no
a ian es pa ogénicas o p obablemen e pa ogénicas en cada uno
de los genes incluidos en el panel. Dado que el es udio es adís ico
incluyó múl iples análisis de supe i encia ealizados sob e la
misma población, co egimos el indicado p de cada análisis de
supe i encia median e la écnica de Benjamini-Hochbe g (BH),
pa a educi el iesgo de e o po compa aciones múl iples.
Con es e mé odo iden i icamos únicamen e 2 genes asociados a
p onós ico ad e so en nues a coho e: ARID1B e IRF8.
Adicionalmen e, iden i icamos o os 4 genes con endencia a un
p onós ico ad e so pe o que no alcanza on la signi icación
es adís ica as la co ección BH: BM2, IRF4, MYC y TP53 con
a ian es mul i-hi .
ARID1B es un gen que pa icipa en la emodelación de la c oma ina
e IRF8, IRF4 y B2M se han asociado a e asión inmune en neoplasias
lin oides. Es os genes pe enecen a las ías me abólicas con
impac o p onós ico que hemos iden i icado en es e es udio, y se án
discu idos en de alle más adelan e.
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Respec o al gen MYC, su al e ación más ecuen e y ca ac e ís ica
en LDCGB es su anslocación con IGH, pe o las mu aciones
pun uales en MYC ambién se han desc i o en un 5-15% de los
pacien es (39,155). Aunque el eo denamien o de MYC,
especialmen e cuando se encuen a asociado al eo denamien o de
BCL2, es un ac o de mal p onós ico econocido en el LDCGB, el
impac o p onós ico de las mu aciones pun uales de MYC no es á
cla o.
TP53 es un gen sup eso de umo es cuya pé dida de unción se
asocia a esis encia a la quimio e apia y p onós ico ad e so en
múl iples neoplasias. Las mu aciones con pé dida de unción de
TP53 ya han sido p e iamen e asociadas en la li e a u a a
p onós ico ad e so en LDCGB (44,156). En nues a coho e las
mu aciones pa ogénicas en TP53 po sí mismas no asocia on
p onós ico ad e so, sin emba go, en los casos con TP53 mul i-hi
(p esencia de 2 a ian es en TP53 o una a ian e con VAF >50%), sí
que iden i icamos una endencia hacia una meno SLP, aunque no
ue signi ica i a as la co ección es adís ica po compa aciones
múl iples.
No obs an e, hay que ene en cuen a que nues o análisis iene
a ias limi aciones. Po una pa e, como limi ación écnica po las
ca ac e ís icas del panel, en es e es udio únicamen e incluimos las
mu aciones pun uales e indels pequeñas, y pod ía habe o as
al e aciones, como a iaciones en el núme o de copias o
eo denamien os que no han sido de ec adas y pod ían se
impo an es, sob e odo en genes como TP53 o MYC. Po o a
pa e, muchos de los genes incluidos en el panel es aban mu ados
sólo en una pequeña p opo ción de las mues as. De es a o ma,
nues a coho e de 78 pacien es pod ía se demasiado pequeña
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pa a de ec a di e encias en supe i encia según las a ian es en
genes in ecuen emen e mu ados, especialmen e as la co ección
po compa aciones múl iples.
Po es e mo i o, pa a aumen a nues a po encia es adís ica,
decidimos ag upa los genes según las di e sas ías me abólicas en
las que pa icipan y es udia el p onós ico de la al e ación de dichas
ías de o ma in eg al.
Mu aciones en ías me abólicas con alo p onós ico
En nues a coho e iden i icamos es u as me abólicas que
cuando p esen a on mu aciones en alguno de los genes que
pa icipan en ellas, se asocia on a un p onós ico ad e so:
Remodelación de la c oma ina dependien e de ATP
Es a u a me abólica se enca ga de egula la compac ación de la
c oma ina y es uno de los mecanismos undamen ales de
egulación de la exp esión génica (157). Los genes de es a ía que
hemos es udiado han sido ARID1A, ARID1B, ARID5B, SMARCA4 y
ACTB. Los cua o p ime os son miemb os de la amilia de p o eínas
SWI/SNF que o man di e en es subunidades de los complejos de
emodelación de c oma ina dependien e de ATP. ACTB, en cambio,
es el gen que codi ica la be a-ac ina, una p o eína del ci oesquele o
que, en es e con ex o, egula la in e acción de los complejos de
emodelación de la c oma ina con el ADN (158,159).
La al e ación de la emodelación de la c oma ina se ha desc i o
como un mecanismo impo an e en la pa ogenia de los lin omas,
aunque su alo p onós ico aún no es á cla o (160). Las mu aciones
en es os genes es u ie on p esen es an o en LDCGB CG como NCG
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