Tesis doc o al:
Sand a Luna Blanco
Ene o, 2022
Di ec o : D . Ra ael Pulido Mu illo
Tu o a: D a. Ana Zubiaga
Depa amen o de Gené ica, An opología Física y Fisiología Animal
Uni e sidad del País Vasco (UPV/EHU)
Análisis uncional y de econs i ución
aduccional de mu aciones
he edi a ias del gen PTEN en
pacien es con sínd omes umo ales y
de au ismo
(cc) 2022 SANDRA LUNA BLANCO (cc by-nc-sa 4.0)
Ag adecimien os
Me gus a ía que es as líneas si ie an pa a exp esa mi más since o ag adecimien o a
la Uni e sidad del País Vasco y al Ins i u o de In es igación Sani a ia Bioc uces Bizkaia que con
su ayuda han colabo ado en la ealización del p esen e abajo, pe o en especial a Ra ael
Pulido Mu illo, di ec o de es e abajo, po la o ien ación, el seguimien o y la supe isión
con inúa de la misma. También al g upo de Vic o J.Cid donde pa e de los esul ados han sido
ob enidos g acias a la colabo ación de su g upo (Depa amen o de Mic obiología y
Pa asi ología de la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad Complu ense de Mad id).
A odas mis compañe as del Depa amen o de Bioma cado es de Cánce po su
amis ad, colabo ación, po el apoyo ecibido y po hace an ag adable mi es ancia du an e la
ealización de es e p oyec o. A Jani e, Lo ena, Olaia y Lau a po acoge me en mi llegada y
enseña me el alo del compañe ismo, a Lei e, po esa aleg ia que ansmi es y po esos
momen os i idos du an e nues a es ancia en Mad id (sin i no hubie a sido lo mismo). Po
supues o, a odos los demás compañe os de Bioc uces. Gus a o y Ana, po la ayuda con odas
las mues as de secuenciación que os lle aba. Pa i, Edu ne, Ane, Piedad, Iñigo, Ma a, po
odos los momen os i idos ue a y den o del labo a o io. Echa é de menos los descansos de
los ie nes.
Quie o hace ex ensi a mi g a i ud, a oda mi amilia que siemp e me ha es ado
apoyando en los momen os más di iciles, en especial a Robe o, Ma y Ca men, Ca la, Jesús,
Jose Luis, Isabel, Josu, Joseba, C is ina y Leia, po es a siemp e ahí, po ansmi i me odo el
ca iño y amo pa a consegui que luche po lo que quie o y hace que odo el es ue zo dedicado
den sus u os. A mis abuelos, que sé que es a án o gullosos de mi. A mi abuela Manoli, un
ejemplo de admi ación y supe ación. A mis ios y p imos, Manoli, Pa xo, Iñigo, Ai o , Jose Luis,
Pili, Tania y Maikel. Muchos de mis log os se lo debo a oso os.
Po supues o, a la pe sona que desde el minu o uno ha es ado conmigo, Iñigo mi
ma ido, g acias a i empecé es e p oyec o y lo he conseguido inaliza . G acias po c ee en mi,
po escucha me, po sabe que es lo que necesi o en cada momen o y po odos los
momen os/ iajes que hemos i ido (que no son pocos) y los que nos quedan po hace . G acias
ambién po odos us consejos, po enseña me, sob e odo en los momen os no an buenos, a
e la ida desde o a pe spec i a, se que nos quedan muchos p oyec os jun os y que odo nos
i á bien po que ¡ engo a la mejo pe sona que pod ia ene a mi lado!
A odos ellos, muchas g acias.
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL ......................................................................................................................... I
Ab e ia u as .............................................................................................................................. V
RESUMEN ................................................................................................................................... VIII
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1
1. El gen sup eso umo al PTEN ............................................................................................... 1
1.1. Es uc u a de PTEN ........................................................................................................ 1
1.2. Iso o mas aduccionales de PTEN ................................................................................ 4
1.2.1. PTEN-L ................................................................................................................... 6
1.2.2. PTEN-M .................................................................................................................. 8
1.3. Con o mación de PTEN y elación con localización subcelula ..................................... 9
1.3.1. PTEN ex acelula ................................................................................................ 10
1.4. Función molecula de PTEN ........................................................................................ 11
1.4.1. Función de PTEN en la memb ana plasmá ica. Ac i idad os a asa de PTEN ..... 12
1.4.2. Función nuclea de PTEN ..................................................................................... 13
1.5. Regulación de PTEN ..................................................................................................... 15
1.5.1. Regulación ansc ipcional de PTEN .................................................................... 15
1.5.2. Regulación pos - ansc ipcional .......................................................................... 15
1.5.3. Modi icaciones pos - aduccionales ................................................................... 16
1.6. Implicación de PTEN en en e medades humanas. ...................................................... 19
1.6.1. Función de PTEN en en e medades he edi a ias: PHTS y ASD ........................... 19
Sínd ome hama oma umo al de PTEN (PHTS) ................................................................. 19
Desó denes del espec o au is a asociados a PTEN (PTEN-ASD) ........................................ 21
1.6.2. Función de PTEN como egulado homeos á ico: elación con cánce .............. 22
1.6.3. Función de PTEN en el Sis ema Ne ioso Cen al (SNC): elación con ASD ........ 25
1.7. Mu aciones en PTEN asociadas a en e medades........................................................ 29
1.7.1. Mu aciones somá icas ......................................................................................... 29
1.7.2. Mu aciones ge minales ....................................................................................... 33
1.7.3. Mu aciones PTC ................................................................................................... 35
2. Lec u a a a és ( ead h ough, RT) como ap oximación e apéu ica en en e medades
causadas po PTCs. ...................................................................................................................... 36
2.1. Mecanismo de acción .................................................................................................. 36
2.2. E iciencia del Read h ough .......................................................................................... 39
II
2.3. Tipos de induc o es de ead h ough ........................................................................... 40
OBJETIVOS ................................................................................................................................... 43
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................ 46
1. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................................. 48
1.1. Mu agénesis di igida ................................................................................................... 48
1.2. Plásmidos .................................................................................................................... 49
2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR ....................................................................................... 49
2.1. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE BACTERIAS ................................................... 49
2.1.1. Cepa de bac e ia y medios de c ecimien o ......................................................... 49
2.1.2. P epa ación de bac e ias compe en es con clo u o cálcico ............................... 50
2.1.3. T ans o mación de bac e ias ............................................................................... 50
2.1.4. Pu i icación del DNA plasmídico ......................................................................... 50
2.1.5. Secuenciación ...................................................................................................... 51
2.2. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE LEVADURAS ................................................. 52
2.2.1. Cepa de le adu a y medios de c ecimien o ........................................................ 52
2.2.2. T ans o mación de la le adu a ............................................................................ 52
2.2.3. Ensayo de c ecimien o en go a median e diluciones se iada ............................. 53
3. CULTIVOS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS .............................................................................. 53
3.1. Líneas celula es ....................................................................................................... 53
3.2. Mé odo de ans ección .......................................................................................... 53
3.3. Lisis de cul i os celula es......................................................................................... 54
4. INMUNODETECCIÓN PROTÉICA .......................................................................................... 55
4.1. Elec o o esis ............................................................................................................... 55
4.2. T ans e encia e hib idación ......................................................................................... 55
4.3. Re elado ...................................................................................................................... 56
4.4. An icue pos ................................................................................................................. 56
5. De e minación de la ac i idad os a asa de PTEN .............................................................. 56
RESULTADOS ............................................................................................................................... 59
1. Op imización del p o ocolo de mu agénesis pa a análisis de al o endimien o ................ 61
2. Respues a de ead h ough de los codones de e minación p ema u a (PTC) en el gen PTEN
............................................................................................................................................. 64
2.1. PTCome de PTEN asociado a en e medades ............................................................... 64
2.2. Inducción de ead h ough en mu aciones PTC de PTEN ............................................. 65
2.3. Análisis global del ead h ough del PTCome de la línea ge minal de PTEN asociado a
en e medades ......................................................................................................................... 69
III
2.4. Pun uación de e iciencia del ead h ough de PTEN .................................................... 73
2.5. Recons i ución uncional de PTEN median e el ead h ough de los PTC ................... 77
3. Análisis global de mu aciones he edi a ias de PTEN: implicaciones en sínd omes
umo ales y de au ismo............................................................................................................... 80
3.1. Pa ón de dis ibución de mu aciones missense de PTEN en pacien es con ASD y
PHTS. ..................................................................................................................................... 80
3.2. Pa ón uncional de mu aciones missense de PTEN encon adas en la línea ge minal
de pacien es con ASD y/o PHTS. ............................................................................................. 83
3.3. Análisis compa a i o de las mu aciones de la línea ge minal en PTEN y PTEN-L ....... 85
DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 95
1. P o ocolo de mu agénesis di igida es anda izado .......................................................... 97
2. Respues a al ead h ough de los PTCs de PTEN .............................................................. 98
3. Análisis global de mu aciones missense de la línea ge minal de PTEN asociadas a ASD y
PHTS ...................................................................................................................................... 101
CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 105
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ 109
BIBLIOGRAFÍA SUPLEMENTARIA ............................................................................................... 127
ANEXOS ..................................................................................................................................... 137
IV
V
Ab e ia u as
Ak P o eína quinasa B
ATP i os a o de adenosina
ASD Au ism Spec um Diso de -T ans o nos del espec o au is a
BLAST Basic Local Aligmen Sea ch Tool
Bp Pa es de bases
BRRS Sínd ome de Bannayan-Riley-Ru alcaba
cDNA DNA complemen a io
CHX Cicloheximida
CLS Cy oplasmic Localiza ion Signal
CRCs spo adic colo ec al cance s
CS Sínd ome Cowden
DD De elopmen al delay-Re aso en el desa ollo
DMEM Dulbecco´s Modi ied Eagle´s Medium
DMSO Dime il sul óxido
DNA Ácido desoxi ibonucleico
dNTP Deoxynucleo ide iphospha e
DO Densidad óp ica
dsDNA double s anded DNA
DTT Di io ei ol
EC endome ial ca cinoma
E.coli Esche ichia coli
EDTA Ácido e ilendiamino e aacé ico
EJC exón junc ion complex
FBS Sue o e al bo ino
G418 Gene icina
GAPDH Glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa
GF ac o de c ecimien o
GSK3 glucógeno quinasa sin asa 3
HGMD Human Gene Mu a ion Da abase
ICC In e na ional Cowden Conso ium
LB Medio de Lu ia-Be ani
mRNA ARN mensaje o
miRNAs mic oRNAs
MMAC1 Mu a ed in Mul iple Ad anced Cance s 1
M-PER Mammalian P o ein Ex ac ion Reagen
mTORC1 Mammalian a ge o apamycin complex 1
NLS Nuclea Localiza ion Signal -Señal de localización nuclea
NPC nuclea po e complexes
NMD nonsense media ed decay
NMDAR N-me il D- aspa a o ecep o
OBB Odyssey Blocking Bu e
OFC Occipi al- on al ci cum e ence
PBD PIP2 Binding Domain -Mo i o de unión a PIP2
In oducción
1
1. El gen sup eso umo al PTEN
El gen PTEN (Phospha ase and TENsin homolog dele ed on ch omosome 10) ue
descubie o en 1996, cuando dos g upos independien es lo halla on en una egión del
c omosoma 10q23, comúnmen e deleccionada en cánce es humanos [1, 2]. Inicialmen e,
PTEN, se iden i icó como una p o eína os a asa de i osina (P o ein Ty osine Phospha ase;
PTP) debido a su homología con la secuencia de aminoácidos del dominio ca alí ico de la
amilia de las PTPs, aunque ambién ue denominado MMAC1 (Mu a ed in Mul iple
Ad anced Cance s) o TEP-1 (T ans o ming g ow h ac o (TGF) egula ed and Epi helial cell-
en iched Phospha ase 1) [3-5].
PTEN es conside ado uno de los genes sup eso es umo ales más impo an es, jun o a
p53, ya que se encuen a mu ado con ela i a al a ecuencia en umo es humanos [6, 7].
Además, PTEN se encuen a mu ado en la línea ge minal de pacien es con sínd omes de
cánce he edi a io ca ac e izados po as o nos en el desa ollo, de iciencias
neu ológicas, desa ollo de hama omas y una mayo p edisposición a desa olla cie os
cánce es [8, 9].
1.1. Es uc u a de PTEN
El gen PTEN es á localizado en la egión q23 del c omosoma 10, y cons a de 9 exones.
La iso o ma más abundan e de la p o eína PTEN mues a un peso molecula apa en e de
47.2 kDa, y posee 403 aminoácidos dis ibuidos en 5 egiones con ele ancia uncional: la
egión N- e minal de unión a os a idilinosi ol-4,5-bis os a o = PIP2 (PIP2 Binding Domain;
PBD), seguido de un dominio os a asa de i osinas (PTP), un dominio C2 de unión a
memb anas, una cola C- e minal (C- ail) y un mo i o de in e acción con dominios PDZ
(PDZ-Binding Domain; PDZ-BD) [10] (Figu a 1).
In oducción
2
Figu a 1. Dominios uncionales de la p o eína PTEN. Regiones indicadas po colo es. N-
e minal de PTEN (aminoácidos 1-7, ec ángulo ama illo). Mo i os de localización N- e minal
(NLMs). Dominio os a asa (PTP) (aminoácidos 8-185, ec ángulo azul); dominio C2
(aminoácidos 185-353, ec ángulo na anja); cola C- e minal (aminoácidos 353-403, ec ángulo
mo ado) que incluye un mo i o de unión a dominios PDZ (PDZ-BD) (aminoácidos 401-403). En
la pa e de a iba se mues an las egiones codi icadas po los di e en es exones de PTEN.
La egión amino e minal (N- e minal) (aminoácidos 1-7) con iene a ios mo i os de
localización subcelula (NLMs): un mo i o de unión a PIP2 (PIP2 Binding Domain; PBD,
aminoácidos 6-14) enca gado de ac i a la enzima posicionando a PTEN en las memb anas
[11], una egión de localización ci oplasmá ica (Cy oplasmic Localiza ion Signal; CLS,
aminoácidos 19-25) [12, 13] y una egión de localización nuclea (Nuclea Localiza ion
Signal; NLS, aminoácidos 8-32) [14, 15].
El dominio os a asa (dominio PTP) de PTEN (aminoácidos 8-185) con iene el cen o
ac i o de la enzima, con el mo i o ca alí ico PTP 123HCKAGKGR130, que incluye la C124 y la
R130 ca alí icas. El dominio os a asa posee ac i idad en e a sus a os lipídicos y
p o eínicos [16], y pe enece al g upo de PTPs de doble especi icidad (DUSPs) [3, 16, 17]
(Figu a 2).
In oducción
3
Figu a 2. Compa ación de la es uc u a idimensional de PTEN con o as p o eínas
elacionadas. El dominio os a asa de PTEN (azul oscu o) es á elacionado con el dominio
os a asa de PTPs clásicas ( ep esen adas po PTP1B) y PTPs de especi icidad dual (DUSPs,
ep esen adas po VHR). La es uc u a del dominio C2 (na anja) es simila a los que p esen an
las os olipasas A2 y C1 (PLA2 y PLC1).
El dominio C2 de PTEN (aminoácidos 186-353) se une a esículas os olipídicas y es a
unión es impo an e pa a que PTEN ealice su unción, ya que asocia a PTEN con las
memb anas celula es y le ayuda a posiciona el dominio ca alí ico hacía su sus a o
os a idilinosi ol-3,4,5- is os a o, PIP3 [10]. La es uc u a idimensional del dominio C2, es
simila a la de los dominios C2 de la p o eína quinasa C (PKC), la os olipasa A2 (PLA2) o la
os olipasa C1 (PLC1; ambién conocida como PLCG1) (Figu a 2).
La egión ca boxi e minal (C- e minal) de PTEN (aminoácidos 353-403) con iene una
secuencia PEST y un mo i o de in e acción PDZ (Pos -synap ic densi y-95, Discs-la ge,
Zonula occludens-1) [10]. La secuencia PEST se denomina así po se una secuencia ica en
P olina (P), ácido glu ámico (E), Se ina (S) y T eonina (T). Las p o eínas que poseen es a
secuencia exhiben una ida in acelula co a, po lo que se ha p opues o que es a
secuencia ac úa como un pép ido señal pa a la deg adación de la p o eína [18]. El mo i o
PDZ cons a de 80-90 aminoácidos en donde se encuen a el mo i o de unión a los
dominios PDZ (PDZ-BD) (T401-K402-V403; TKV), muy conse ado en e eb ados. El mo i o
de unión a los dominios PDZ de PTEN se asocia con p o eínas egulado as con dominios
PDZ [19]. PDZ-BD es impo an e pa a la in e acción en e p o eínas y la egulación de la
ac i idad de PTEN [20]. Además, muchas de las p o eínas que in e accionan con PTEN a
In oducción
4
a és de los dominios PDZ son p o eínas de andamiaje con múl iples dominios PDZ que
es abilizan PTEN y lo di igen a compa imen os asociados con las memb anas. Es a egión
es diana de modi icaciones pos - aduccionales, como la os o ilación, la ace ilación y la
escisión po caspasa-3 [21, 22]. A di e encia del dominio ca alí ico y C2, la cola C- e minal y
el ex emo N- e minal no se han podido esol e median e c is alización [10].
1.2. Iso o mas aduccionales de PTEN
El RNA mensaje o (mRNA) de PTEN codi ica di e en es p o eínas debido a la p esencia
de inicios de aducción al e na i os no canónicos. Comúnmen e, los ibosomas inician la
aducción a pa i del codón de iniciación AUG más ce cano al ex emo 5´del mRNA. Sin
emba go, ecien es es udios han iden i icado codones de iniciación al e na i os al codón
AUG de PTEN, que gene an di e en es p o eínas [23]. Se han iden i icado 4 nue as
iso o mas que a ían en el núme o de aminoácidos de la egión N- e minal (Figu a 3, Tabla
1). La p ime a iso o ma que se descub ió ue PTEN-Long (PTEN-L), ambién llamada PTEN-
α. A las pos e io es iso o mas de PTEN se p opuso denomina las siguiendo el o den
al abé ico a pa i de la iso o ma PTEN-L: PTEN-M, PTEN-N y PTEN-O [24-26]. PTEN-M
( ambién llamada PTEN-β) es la iso o ma p edominan e, sin emba go, la iso o ma más
es udiada ha sido PTEN-L [27].
PTEN-L, PTEN-M, PTEN-N y PTEN-O poseen 173, 146, 131 y 72 aminoácidos adicionales
al PTEN canónico, espec i amen e (Figu a 3, Tabla 1). Las iso o mas PTEN-L, PTEN-N y
PTEN-O inician la aducción a pa i del codón CUG, mien as que la iso o ma PTEN-M lo
hace a a és del codón AUU [25].
In oducción
5
Tabla 1. Iso o mas de PTEN.
Se indica los aminoácidos que posee la ex ensión N- e minal de cada iso o ma de
PTEN (PTEN-L/α, PTEN-M/β, PTEN-N y PTEN-O), así como los aminoácidos o ales
de cada iso o ma y su peso molecula p e is o.
Figu a 3. Iso o mas aduccionales de PTEN. Se indican las di e en es iso o mas de PTEN (con el
núme o de aminoácidos). PTEN cons a de 403 aminoácidos. PTEN-L/α, PTEN-M/β, PTEN-N y
PTEN-O poseen 173, 146, 131 y 72 aminoácidos adicionales al PTEN canónico, espec i amen e
( ec ángulo e de). El dominio PTP ( ec ángulo azul), C2 ( ec ángulo na anja) y la cola C-
e minal ( ec ángulo mo ado) de las iso o mas no a ía espec o a la de PTEN. La Me 1 de PTEN
se co esponde con la Me 174 (M174-L) de PTEN-L (ma cada en ojo). En la pa e de a iba se
mues an las egiones codi icadas po los di e en es exones de PTEN.
Todas las iso o mas de PTEN se exp esan y son ac i as [25], es deci , ienen ac i idad
os a asa, ya que educen los ni eles de Ak os o ilado a ni eles simila es a los de PTEN y
PTEN-L.
In oducción
6
1.2.1. PTEN-L
La aducción de PTEN-L se inicia a pa i de una Leucina (Leu), ob eniendo una
p o eína con una ex ensión de 173 aminoácidos adicionales a la p o eína canónica
(Figu a 4). Con el in de e i a con usión a la ho a de iden i ica y nomb a los esiduos
de PTEN y PTEN-L, se ha es ablecido una nomencla u a común. Los aminoácidos de
PTEN-L se án calculados añadiendo 173 aminoácidos adicionales al esiduo de PTEN, y
se nomb a án seguidos de una L en mayúsculas (–L), de al mane a que la cis eína 124
(Cys124, C124) de PTEN es equi alen e a la cis eína 297-L (Cys297-L, C297-L) de PTEN-L
[26].
PTEN-L es 5 eces más e ec i a en uni se al subs a o PIP3 que PTEN w y no
equie e de PIP2 pa a man ene se en la con o mación ac i a. Se ha p opues o que es a
ex ensión de la egión N- e minal de PTEN-L le p opo ciona una mayo es abilidad
con o macional a PTEN [28].
Figu a 4. Dominios uncionales de PTEN-L. PTEN-L posee los mismos dominios es uc u ales que
PTEN además de una ex ensión de 173 aminoácidos en la egión N- e minal ( ec ángulo e de). En
la egión N- e minal de PTEN-L hay una señal de sec eción/localización mi ocond ial (aminoácidos
1-L-22-L, ec ángulo neg o), una secuencia de poli a gininas (aminoácidos 47-L-52-L, ec ángulo
ama illo) y una secuencia de localización nucleola (NLS). Dominio os a asa (PTP) (aminoácidos
174-L- 358-L, ec ángulo azul); dominio C2 (aminoácidos 358-L-526-L, ec ángulo na anja); cola C-
e minal (aminoácidos 526-L-576-L, ec ángulo mo ado). En la pa e de a iba se mues an las
egiones codi icadas po los di e en es exones de PTEN.
La ex ensión N- e minal de las iso o mas de PTEN juegan un papel impo an e
en la egulación uncional y localización subcelula . Se ha p opues o un posible modelo
de unión a la memb ana de PTEN-L g acias a una hélice de unión a memb ana
(Memb ane-Binding Helix, MBH) (aminoácidos 151-L-174-L) en la ex ensión N- e minal
de PTEN-L, la cual pod ía ope a como una hélice ansmemb anal o in e ac ua con la
In oducción
7
supe icie de la memb ana celula [29]. En un es udio lle ado a cabo en un modelo de
le adu a humanizada, p e iamen e usado pa a analiza a ian es pa ogénicas de PTEN
[30, 31], se obse ó que dicha hélice es esencial pa a la acumulación de PTEN-L en la
memb ana plasmá ica y que p e enía la impo ación de PTEN-L al núcleo [32].
Po o o lado, o iginalmen e se desc ibió que la ex ensión N- e minal de PTEN-L
con iene una señal sec e o a compues a po una egión de seis alaninas (A12-A17-L)
que le pe mi e sali de las células, un si io de escisión (S22-L) que acili a la sec eción
de PTEN-L ue a de la célula, y un mo i o de a gininas (R47-R52-L) que ac úa como una
secuencia de in e nalización en células ecep o as (Figu a 4) [23, 33]. Sin emba go, el
análisis en el modelo de le adu a humanizada demos ó que es e mo i o de a gininas
es impo an e pa a la localización nuclea [32], en conco dancia con o o es udio
independien e en el cual se mos ó que dicho mo i o de alaninas e a esponsable de la
localización nucleola de PTEN-M [34]. Además, median e análisis bioin o má icos, se
ha p opues o la exis encia de secuencias de localización nucleola (NoLS) y nuclea
(NLS) en es a egión N- e minal de PTEN-L y PTEN-M [27]. De hecho, se ha obse ado
que PTEN-L se ansloca al núcleo as un es és isquémico [35].
PTEN-L se ha localizado en la mi ocond ia [36], y el es udio en la le adu a
humanizada e eló la exis encia de una señal de localización mi ocond ial en los
p ime os 22 aminoácidos de PTEN-L [32]. Se ha demos ado que PTEN-L desempeña
unciones impo an es en el man enimien o de la es uc u a mi ocond ial y el
me abolismo ene gé ico, egula nega i amen e la mi o agia median e la
des os o ilación de la S65 de la ubiqui ina, y pa icipa en el man enimien o de la
ene gía mi ocond ial [36-38].
PTEN-L an agoniza la ía de señalización PI3K an o en células p oduc o as como
en células acep o as e induce la mue e celula en células cance ígenas, man eniendo
así la unción sup eso a umo al. Se ha demos ado que PTEN-L induce apop osis en
células de cánce colo ec al y, jun o con GAS1 (p o eína implicada en el a es o del
ciclo celula ), inhibe el c ecimien o en gliomas [23, 39, 40]. Se ha p opues o que
e siones sec e adas de PTEN-L mu ado pod ían eje ce un e ec o dominan e nega i o
sob e PTEN sil es e en células acep o as, en cuyo caso PTEN-L a o ece ía la c eación
de un ambien e umo ogénico [41, 42]. Además, se ha obse ado que PTEN-L y PTEN-
In oducción
8
M p omue en la umo ogénesis de células cance ígenas a a és de la in e acción con
la p o eína 5 con epe iciones WD (WDR5) y la ime ilación de la lisina 4 de la his ona
H3. Es os hallazgos sugie en la exis encia de unciones p o-oncogénicas,
independien es de ac i idad os a asa, pa a PTEN-L y PTEN-M [43].
Es udios ecien es a ibuyen a PTEN-L unciones no elacionadas di ec amen e
con la sup esión umo al. Se ha e elado que PTEN-L modula la po enciación a la go
plazo (LTP) del hipocampo y los p ocesos de memo ia y ap endizaje a a és de la
egulación de la señalización de la p o eína quinasa dependien e de Ca2+/calmodulina
(CaMKII) y la subunidad 2B del ecep o NMDA (NR2B) [44], y que PTEN-L se encuen a
in oluc ada en la egulación an o de la unción ol a i a como en la endoci osis de
células del bulbo ol a o io (OB) [45]. Po o o lado, Li y sus colabo ado es p oponen a
PTEN-L como un egulado posi i o del eclu amien o de neu ó ilos a luga es de
in ección, median e la des os o ilación de la T558 de Moesin (una p o eína que o ma
pa e de la amilia ERM, Ez in-Radixin-Moesin, cuya unción es el anclaje de
mic o ilamen os) [46]. PTEN-L ambién mejo a la espues a del in e e ón de ipo I
(IFN) y de ci oquinas p oin lama o ias, y p omue e la inmunidad inna a an i i al
du an e la in ección i al de mane a dependien e de su ac i idad os a asa [47].
1.2.2. PTEN-M
La iso o ma PTEN-M (Figu a 3), posee una ex ensión de 146 aminoácidos en la
egión N- e minal en compa ación con PTEN canónico, y ca ece de la secuencia de
sec eción N- e minal de PTEN. PTEN-M se encuen a p incipalmen e en el nucleolo
des os o ilando la nucleolina y egulando nega i amen e la ansc ipción del DNA
ibosomal y la p oli e ación celula [34].
In oducción
9
1.3. Con o mación de PTEN y elación con localización subcelula
La iso o ma canónica de PTEN eje ce unciones esenciales an o en asociación con
memb anas (p incipalmen e la memb ana plasmá ica) como en el núcleo. Di e en es
egiones de PTEN (la egión NLM, los mo i os de exclusión nuclea , y la cola C- e minal,
p incipalmen e) median cambios con o macionales en la p o eína y pa icipan en la
egulación de su unción y dis ibución subcelula [15, 48].
Cuando el mo i o de unión a PIP2 y la NLS de la egión N- e minal se encuen an
enmasca ados po los mo i os de exclusión nuclea de la cola C- e minal, PTEN es á en una
con o mación ce ada. Al e aciones en los mo i os de exclusión nuclea o en la cola C-
e minal de PTEN, como cambios en su es ado de os o ilación, unión a p o eínas
egulado as, o una p o eólisis pa cial, exponen el dominio NLS, p omo iendo la
con o mación abie a de PTEN (Figu a 5). La con o mación ce ada de PTEN
mayo i a iamen e se encuen a en el ci oplasma de o ma es able, aunque puede en a
en el núcleo po di usión o po mecanismos independien es de impo inas. La
con o mación abie a pod ía es a a o ecida po la asociación de PTEN a la memb ana a
a és de in e acciones con p o eínas con dominios PDZ, o median e in e acciones
elec os á icas en e la ca ga posi i a de los mo i os de unión a memb ana y la ca ga
nega i a de la memb ana plasmá ica. La in e acción de PTEN con la memb ana plasmá ica
es esencial pa a la des os o ilación de PIP3, con olando la p oli e ación y el c ecimien o
celula [49-51]. Las mu aciones en la egión N- e minal de PTEN asociadas a umo es
educen ecuen emen e su ac i idad ca alí ica y la capacidad de uni se a la memb ana
plasmá ica, a o eciendo la acumulación en el núcleo [12, 52]. La con o mación abie a de
PTEN ambién puede se anspo ada al núcleo po RAN GTPasas (RAS- ela ed nuclea
p o ein) dependien es de NLS y de mecanismos elacionados con impo inas u o as
p o eínas anspo ado as, y con la ubiqui inación o sumoilación de esiduos de Lys
especí icos [14, 53, 54].
In oducción
16
1.5.3. Modi icaciones pos - aduccionales
PTEN es á al amen e egulado po modi icaciones pos - aduccionales (Tabla 2)
[20, 92].
Tabla 2. P incipales modi icaciones pos - aduccionales que egulan la ac i idad de
PTEN.
En la abla se mues a las egiones de PTEN implicadas, así como los e ec os que p o ocan dichas
modi icaciones pos - aduccionales en la unción de PTEN.
Regulación po os o ilación
La os o ilación es una de las modi icaciones pos - aduccionales más
impo an es pa a egula la ac i idad de PTEN, y a ec a a esiduos Se , Th y Ty [93].
Exis en a ios si ios de os o ilación, p edominan emen e localizados en el dominio C2
y en la egión C- e minal de PTEN, que pueden a ec a a la es abilidad, a la ac i idad
os a asa y a la localización celula de la p o eína [21, 94-96]. La es abilización es el
esul ado de la asociación de esiduos os o ilados de la egión C- e minal con el
dominio C2, p omo iendo la disociación del dominio C2 de la memb ana y o mando la
con o mación ce ada, o ma más es able de PTEN. Sin emba go, a pesa de se la
o ma más es able, es la con o mación menos ac i a. La os o ilación de la Th 366
juega un papel impo an e en la deses abilización de PTEN [97]. La au o os o ilación de
Modi icaciones pos -
aduccionales
Regiones de PTEN implicadas
E ec os en la unción de PTEN
P omue e la con o mación ce ada y es able
Reduce la dime ización de PTEN
Oxidación Dominio os a asa (C124) Inhibe la ac i idad os a asa
Inhibe la ac i idad os a asa
Disminuye la es abilidad de la p o eína
Dominio os a asa (K125, K128) Inhibe la ac i idad os a asa
Dominio os a asa (K163) Aumen a la asociación con la memb ana plasmá ica
Dominio C- e minal (K402)
Aumen a las in e acciones con p o eínas que
con engan dominios PDZ
Dominio C2 (K266) Aumen a la asociación con la memb ana plasmá ica
Dominio C2 (K254) Induce la impo ación nuclea
SUMOilación
Modi icaciones pos - aduccionales que egulan la ac i idad de PTEN
Poliubiqui inación dando luga a la deg adación de
la p o eína
Monoubiqui inación pa a acili a la impo ación al
núcleo
Dominio N- e minal y C2 (K13,
K66, K289, K327, K330, K342 y
K344)
Ubiqui inación
Excluye a PTEN del núcleo y es á in oluc ada en la
epa ación del DNA
Fos o ilación
Fos o ilación C- e minal (T366,
S370, S380, T382, T383 y S385)
S-ni osilación
Dominio N- e minal (C83 y
C106)
Ace ilación
In oducción
17
la cola C- e minal libe a la asociación con el dominio C2, a o eciendo la ac i idad
uncional de PTEN [98]. La localización nuclea se e a ec ada po al e aciones en la
os o ilación de la cola C- e minal [14].
Regulación po ubiqui inación
PTEN puede se egulado po monoubiqui inaciones y po poliubiqui inaciones.
La monoubiqui inación de las Lys13 y Lys289, lle ada a cabo po la enzima E3 ligasa
(NEDD4-1), acili an la anslocación de PTEN al núcleo [99]. Po o a pa e, la
sob eexp esión de NEDD4-1 poliubiqui ina PTEN y a o ece su deg adación po el
p o eosoma [99, 100]. La poliubiqui inación de PTEN en Lys66 ambién egula su
exp esión y la es abilidad p omo iendo su deg adación a a és del p o eosoma [101].
Recien emen e, se ha is o que la poliubiqui inación de PTEN en la Lys342 y Lys344 po
la WWP1 (WW Domain-con aining ubiqui in E3 p o ein ligase 1) sup ime el
eclu amien o de PTEN a la memb ana plasmá ica y su dime ización, inhibiendo así la
sup esión umo al [102]. WWP2 (WW Domain-con aining ubiqui in E3 p o ein ligase
2), CHIP (Ca boxyl e minus o Hsc70 in e ac ing p o ein) y XIAP (X-linked inhibi o o
apop osis) son ubiqui in ligasas que ambién con ibuyen a la ubiqui inación y
deg adación de PTEN [103-105].
Regulación po oxidación
Las especies eac i as de oxigeno ( eac i e oxygen species, ROS) egulan la
ac i idad os a asa de PTEN al oxida esiduos de Cys (Cys124 y Cys71), lo que causa la
inac i ación e e sible de la enzima, uno de los p incipales mecanismos que con olan
la ac i idad isiológica de PTEN [106-108]. Se han desc i o a ias p o eínas egulado as
del es ado edox in acelula , como la pe oxi edoxina 1 (PRDX1), TXNIP ( hio edoxin-
in e ac ing p o ein), hid ope óxido de cumeno (CuHP) o la enzima glu a ión pe oxidasa
(GPX) [109-112], capaces de con a es a la oxidación de PTEN.
Regulación po S-ni osilación
El óxido ní ico (NO) desencadena la S-ni osilación de PTEN en esiduos de Cys.
La S-ni osilación del esiduo Cys83 de PTEN da luga a la sup esión de la ac i idad
os a asa de PTEN y p omue e la señalización a a és de Ak . Dependiendo de la
concen ación de NO se egula la señalización de Ak ; a concen aciones bajas de NO
se ac i a Ak y ice e sa [113]. Po o o lado, la oxidación de PTEN a a és de ROS da
luga a la o mación de un puen e disul u o, mien as que la oxidación de PTEN po NO
In oducción
18
pa ece o ma un puen e disul u o mix o con cis eínas o con glu a ión (GSH) [114].
Además, la egulación mediada po NO pod ía explica la pe dida de ac i idad de PTEN
obse ada en en e medades neu odegene a i as como la en e medad del Alzheime
(AD) [115]. DJ-1 es una p o eína p o ec o a en e a la neu odegene ación en la
en e medad de Pa kinson. Dicha p o eína pa ece egula la señalización de PI3K a
a és de la ni osilación de la Cys106 de PTEN, inhibiendo la ac i idad os a asa [116].
Regulación po ace ilación
La ace ilación de PTEN se p oduce en espues a a la es imulación de ac o es de
c ecimien o po la in e acción en e la his ona ace il ans e asa, PCAF, con lisinas
(Lys125 y Lys128) de PTEN, inhibiendo su ac i idad [117]. Po o a pa e, la inhibición
de his onas deace ilasas (HDACs) p oducen la anslocación de PTEN a la memb ana a
a és de la ace ilación de la Lys163, inhibiendo la p oli e ación, la mig ación y la
in asión celula [118]. La Lys402 del mo i o PDZ de PTEN ambién se ace ila po CBP
(p300-CREB-binding p o ein) aumen ando su capacidad de in e acciona con o as
p o eínas con dominios PDZ como el dominio PDZ 2 de MAGI2 y DLG1 (PDZ2/MAGI2 y
PDZ2/DLG1) [119, 120].
Regulación po SUMOilación.
La p o eína de pequeño peso molecula (11kDa) SUMO (Small Ubiqui in- ela ed
Modi ie ) egulan la ac i idad de PTEN. La p o eína SUMO1 modi ica co alen emen e a
PTEN en sus lisinas Lys254 y Lys266. La SUMOilación de PTEN en la Lys254 mejo a la
e ención de PTEN en el núcleo y con ibuye a epa a el DNA [121], mien as que la
sumoilación en la Lys266 de PTEN p omue e la unión de PTEN a la memb ana
plasmá ica, sup ime la ía de señalización PI3K/Ak e inhibe la p oli e ación y el
c ecimien o del umo [122].
La SUMOilación de PTEN, además, se e inc emen ada po PIASxα, uno de los
miemb os de la amilia de p o eínas PIAS (p o ein inhibi o o ac i a ed STAT) con
ac i idad ligasa SUMO E3, que egula posi i amen e el ni el de p o eína PTEN,
mejo ando la es abilidad de la misma al educi la ubiqui inación. Además, PIASxα
inhibe la ía PI3K/Ak y de iene el ciclo celula [123]. Po o o lado, se ha obse ado
que la in ección po el i us de la es oma i is esicula (VSV) induce la SUMOilación de
PTEN, pudiéndose conside a como un mecanismo pa a aumen a la espues a
an i i al celula [124].
In oducción
19
1.6. Implicación de PTEN en en e medades humanas.
1.6.1. Función de PTEN en en e medades he edi a ias: PHTS y ASD
El gen PTEN se encuen a mu ado en la línea ge minal de pacien es con
sínd omes de cánce he edi a io, ca ac e izados po as o nos en el desa ollo,
de iciencias neu ológicas, desa ollo de hama omas múl iples, y po mayo
p edisposición a desa olla cánce de mama, i oides y endome io, en e o os.
Desde el pun o de is a del diagnós ico gené ico, es os sínd omes se ag upan con la
denominación de sínd ome hama oma umo al de PTEN (PTEN hama oma umo
sínd ome, PHTS, OMIM *601728) [9, 125-129]. También se encuen an mu aciones en
la línea ge minal de PTEN en indi iduos con mac oce alia, e a do en el desa ollo y
deso denes del espec o au is a (PTEN Au ism Spec um Diso de , PTEN-ASD, OMIM
#605309) [130-133].
Sínd ome hama oma umo al de PTEN (PHTS)
Las mani es aciones clínicas de PHTS son he e ogéneas, e incluyen,
p incipalmen e, el sínd ome de Cowden (CS), sínd ome Bannayan-Riley-Ru alcaba
(BRRS), la en e medad de Lhe mi e-Duclos (LD) y sínd omes simila es a P o eus ( odos
ag upados en OMIM #158350). La mayo ía de es os sínd omes siguen un pa ón de
he encia au osómica dominan e.
• Sínd ome de Cowden (CS)
El sínd ome Cowden (CS) [134] es una en e medad a a ca ac e izada po la
p esencia de múl iples hama omas en di e sos ejidos, comúnmen e en la piel y en el
ac o gas oin es inal (GI), y con una mayo p edisposición al cánce [135]. Los pólipos
gas oin es inales en CS ocu en en el 60-90% de los pacien es, aunque es os,
no malmen e son asin omá icos. A pesa de que los hama omas en la piel y en el GI
son muy comunes en pacien es con CS, no hay e idencias de que es os pacien es
posean un mayo iesgo de desa olla umo es malignos en la piel o GI [126]. Po o o
lado, los lipomas, ib omas, anomalías ascula es y la mac oce alia ambién son
ca ac e ís icas de pacien es con CS [136]. El 85% de los casos de pacien es con CS
es án causados po mu aciones ge minales en el gen PTEN, y ap oximadamen e un 40-
60% de los casos se es ima que es de o igen amilia [137].
In oducción
20
• Sínd ome de Bannayan-Riley-Ru alcaba (BRRS)
El sínd ome Bannayan-Riley-Ru alcaba (BRRS) es un deso den congéni o
ca ac e izado po mac oce alia en combinación con pólipos in es inales
hama oma osos, mal o maciones ascula es, lipomas, hemangiomas y len iginosis
geni al [138]. A pesa de que no exis en unas eglas especí icas pa a iden i ica BRRS,
se pueden emplea a ios c i e ios basados en la p esencia o ausencia de mac oce alia,
en ca ac e ís icas de ma ológicas, mal o maciones ascula es y/o poliposis
gas oin es inal pa a diagnos ica es e sínd ome [139]. El sínd ome BRRS se es ima que
posee una mayo p edominancia en las muje es y con una pene ancia más emp ana,
en elación a la edad, en compa ación a pacien es con CS.
• En e medad Lhe mi e-Duclos (LD)
La en e medad Lhe mi e-Duclos (LD) es un as o no a o ca ac e izado po el
c ecimien o anómalo del ce ebelo y es á conside ada una a ian e eno ípica del CS
[140, 141]. Un es udio ealizado po Zhou y sus colabo ado es sugie e que LD asociado
con mu aciones en PTEN en la línea ge minal se mani ies a p incipalmen e en adul os,
ya que no encon a on mu aciones en PTEN en pacien es pediá icos con LD [142].
• Sínd ome simila es a P o eus (PS-like)
El sínd ome P o eus (PS) un as o no complejo de sob ec ecimien o
hama oma oso muy poco ecuen e (solo exis en 120 casos), que se ca ac e iza po
un sob ec ecimien o p og esi o a ni el de esquele o, piel, g asa y sis ema ne ioso
cen al [143, 144]. El sínd ome simila a P o eus (PS-like) desc ibe a aquellos pacien es
que no cumplen los c i e ios diagnós icos pa a el sínd ome de P o eus, pe o que
compa en una mul i ud de asgos clínicos ca ac e ís icos de la en e medad. Se han
iden i icado mu aciones en el gen PTEN en un 50% de casos del sínd ome simila a
P o eus [145].
In oducción
21
Desó denes del espec o au is a asociados a PTEN (PTEN-ASD)
Indi iduos con mu aciones en PTEN en la línea ge minal mani ies an eno ipos
elacionados con desó denes neu ológicos, ales como deso denes del espec o au is a
(ASDs), e aso en el desa ollo (DD)/ e aso men al y mac oce alias [130, 131]. Los
desó denes del espec o au is a son desó denes complejos que se ca ac e izan po
in e acciones sociales ano males, dé ici s en la comunicación, compo amien os
epe i i os y, p oblemas cogni i os con limi aciones a la ho a de imagina y en ende
las emociones y las in enciones de los demás [146]. Es udios amilia es y de gemelos
sugie en que los ac o es gené icos desempeñan un papel impo an e en la e iología
del ASD. El iesgo de apa ición de au ismo en he manos de niños con ASD es del 38%
en e al 13.5% en aquellas amilias que no iene a un hijo a ec ado. Además, es e
iesgo se inc emen a dependiendo del gene o del hijo a ec ado. Siendo la asa de
conco dancia gené ica pa a gemelos dicigó icos emeninos de un 5.3% en e a un 50%
en gemelos dicigó icos a ones [147].
La mac oce alia obse ada en pacien es de ASD con mu aciones en la línea
ge minal de PTEN es más se e a que en pacien es con ASD pe o sin mu aciones en el
gen PTEN, po lo que el pe íme o de la cabeza es un eno ipo muy impo an e a ene
en cuen a en pacien es con ASD [148].
La con ibución gené ica al au ismo es muy he e ogénea. Se han p opues o
a ias edes biológicas como posibles mecanismos en ASD. A ni el molecula , se
incluyen genes in oluc ados en la ansc ipción y aducción sináp ica (FMR1, TSC1/2,
PTEN, NF1 y CYF1P1); moléculas de adhesión a células neu onales (Familia de
neu exinas y neu oliginas); p o eínas de andamiaje en la sinapsis (Familia de genes
SHANK); ía de ubiqui inación (PARK2 y TRIM33); genes elacionadas con el calcio o
p o eínas del canal iónico (CACNA1A, CACNA1H, KCNMA1, SCN1A y SCN2A);
neu o ansmiso es (GRIN2, SLC6A3); y genes emodelado es de la c oma ina (MECP2,
CHD8 y BAF155); genes egulado es del c ecimien o y la mo ogénesis (HOX, PTEN y
EIF4E), en e o os [149, 150].
In oducción
22
1.6.2. Función de PTEN como egulado homeos á ico: elación con cánce
PTEN es un sup eso umo al haploinsu icien e, es deci , un indi iduo con una
sola copia del gen no es capaz de p oduci p o eína su icien e pa a asegu a la unción
no mal del gen, de al mane a que una educción del 50% de los ni eles de PTEN es án
asociados con una mayo acele ación de la p og esión del cánce [151].
El gen PTEN se encuen a mu ado con ela i a al a ecuencia en casi odos los
cánce es humanos p ima ios: cánce de endome io (59%), glioblas oma (22%),
melanoma (10%), colo ec al (5%) y mama (5%) (h p://cbiopo al.o g/). Los umo es
de endome io y glioma son los umo es que p esen an mayo po cen aje de
mu aciones en PTEN, mien as que los umo es de p ós a a p esen an una al a
ecuencia de deleción (Figu a 9). Además, los ni eles del mRNA de PTEN ambién se
encuen an al e ados en los dis in os ipos de cánce , siendo los cance es de p ós a a,
o a io y mama los que mues an una mayo disminución en el mRNA de PTEN [152].
Figu a 9. F ecuencia de mu aciones de PTEN en di e en es ipos de cance es. Da os ob enidos
de TCGA (The Cance Genome A las) ía cBioPo al (h p://cbiopo al.o g/). (Ab il 2020).
El ca cinoma de endome io (endome ial ca cinoma, EC) es el cánce geni al
emenino más ecuen e. Exis en dos ipos de cánce de endome io según las
mani es aciones clínico-pa ológicas; umo es de ipo I o endome ioides (EEC) y de ipo
II o no endome ioides (NEEC). A ni el molecula , las al e aciones asociadas a cada ipo
de umo son di e en es. En el caso del EEC, las mu aciones más ecuen es son
In oducción
23
mu aciones en el gen PTEN y en PI3K [153-155]. La inac i ación de PTEN es el de ec o
gené ico más común en el EEC, con más del 80% debido a mu aciones somá icas [156].
Indi iduos con mu aciones en la línea ge minal de PTEN ienen un 28% de p obabilidad
de desa olla cánce de endome io, compa ado con el 2.6% de la población gene al
(Tabla 3) [157, 158].
El glioblas oma (GBM) es uno de los umo es ce eb ales más ecuen es en el
sis ema ne ioso cen al (SNC) (50-75%), y el 30% de los es udios han e elado un
alo p onós ico posi i o pa a la exp esión del gen PTEN [152]. Se han de ec ado
mu aciones en PTEN en un 15-40% de casos de GBM p ima ios [159]. La adiación
ionizan e y la quimio e apia son a amien os es ánda es pa a pacien es con GBM, los
cuales p o ocan daño en el DNA celula . Se ha iden i icado un mecanismo de
esis encia a a és de la os o ilación de la i osina 240 de PTEN, lo que se p omue e
la epa ación del DNA en espues a a la adicación, p olongando la supe i encia de las
células y la p og esión del umo [160].
El cánce de mama es el cánce más ecuen e en muje es, con más de un millón
de casos nue os diagnos icados cada año. El cánce de mama es muy he e ogéneo,
con un impo an e papel en el desa ollo y p og esión umo al pa a la ía de
señalización de PI3K. A pesa de que es a o encon a mu aciones somá icas de PTEN
en pacien es con cánce de mama, la exp esión de la p o eína se encuen a ausen e
con mucha ecuencia en umo es de mama [152]. La de iciencia de PTEN ep esen a
un po encial ac o de p onós ico pa a la esis encia a T as uzumab (an i-HER2).
Además, una pé dida de PTEN puede a ec a a la egulación del pun o de con ol
inmuni a io, al induci la sob eexp esión de PD-L1 [161]. Po o a pa e, muje es con
CS poseen un iesgo de ida de desa olla cánce de mama del 25-50% [162], mien as
que en muje es con CS y con mu aciones en la línea ge minal de PTEN, es e po cen aje
se ele a has a un 85%, en e al 12% de la población gene al de desa olla cánce de
mama [157, 158] (Tabla 3). O os es udio e eló da os pa ecidos en los que muje es
con mu aciones en el gen PTEN ienen un 77% de iesgo de ene cánce de mama a
los 70 años [163]. No solo el cánce de mama es á asociado a muje es, ambién exis en
homb es con cánce de mama asociado a CS y con mu aciones en la línea ge minal de
PTEN [164].
In oducción
24
El cánce de i oides es el ipo de umo endoc ino con mayo p e alencia. El
cánce de i oides p esen a una g an a iabilidad eno ípica, an o en su mani es ación
como en el a amien o. El ca cinoma olicula de i oides (Folicula Thy oid Ca cinoma,
FTC) es el más ecuen e (90%) de los cance es de i oides diagnos icados. A ni el
molecula , la ía de señalización PI3K/Ak /mTOR juega un papel muy impo an e en
es e ipo de cánce . Además de se ac i ada po mu aciones en el oncogén Ras,
ambién se han desc i o mu aciones ac i ado as en PIK3CA que a ec an al 12-34% de
umo es di e enciados [165]. PTEN ambién es obje o de mu aciones y delecciones en
ca cinomas olicula es. El ca cinoma de i oides olicula es ecuen e en pacien es
PHTS (75% de p e alencia) [166]. Mu aciones ge minales de PTEN se han encon ado
en el 38% de pacien es con cánce de i oides compa ado con el 1% de pacien es sin
es e ipo de cánce (Tabla 3) [158, 167].
El cánce de p ós a a (PCa) es el umo maligno diagnos icado con mayo
ecuencia en la población masculina y es la segunda causa de mue e po cánce en
homb es, po de ás del cánce de pulmón. A ni el molecula , la mayo ía de los genes
implicados en es e ipo de cánce es án elacionados con el ciclo celula , espues a al
daño en el DNA y las ías de aducción de señales Ras/MAPK y PI3K/Ak . La
inac i ación de PTEN es una de las al e aciones más obse adas en es e ipo de cánce ,
con un 50-80% de umo es de p ós a a que mues an una pé dida de PTEN (Figu a 9) y
un 10% con mu aciones pun uales en el gen PTEN [168, 169]. La pé dida de PTEN
ambién se co elaciona con mayo es ni eles de ines abilidad c omosómica y un
aumen o de la aneuploidía en el cánce de p ós a a [170].
Po o o lado, los indi iduos con PHTS poseen mayo iesgo de ene o os ipos
de cance es a los a iba mencionados, compa ándolos con la población gene al, como
el cánce enal (34% s. 1.6%), cánce de colon (17% s. 5%) y melanomas (6% s. 2%)
(Tabla 3) [157, 158]. Va ios es udios han elacionado la pé dida de PTEN como un
ac o p onós ico pa a una peo supe i encia gene al en pacien es con cánce enal
debido a la ag esi idad del umo [170]. Mu aciones en genes sup eso es umo ales
co ien e abajo del ecep o del ac o de c ecimien o epidé mico (EGFR) como BRAF,
KRAS, PI3K y PTEN es án asociadas con cánce colo ec al. Más del 90% de pacien es
con mu aciones en PTEN ienen pólipos colo ec ales, en e los que se incluyen pólipos
hama oma osos, ganglioneu omas, pólipos ju eniles y pólipos adenoma osos [171].
In oducción
25
Además, exis en es udios en los que se ha is o la exis encia de melanomas en
pacien es de CS [157]. La al e ación del gen PTEN no se encuen a en e los e en os
mu acionales más ecuen es en melanoma (10%); sin emba go, la pé dida de PTEN
coexis e con mu aciones de BRAF en un 44% de pacien es [170].
Tabla 3. Incidencia de cánce de la población en gene al y de
pacien es con PHTS (en po cen aje)[158] .
1.6.3. Función de PTEN en el Sis ema Ne ioso Cen al (SNC): elación con
ASD
La ac i idad de los ci cui os neu onales es la base neu obiológica de la conduc a
y la ac i idad men al (emociones, memo ia y pensamien os). Los p ocesos de
di e enciación de las células neu ales y la o mación de ci cui os po con ac os
sináp icos en e neu onas (sinap ogénesis) ocu en en el sis ema ne ioso cen al
(SNC) du an e las úl imas ases del desa ollo p ena al y los p ime os meses después
del nacimien o. Los pacien es con ASD mani ies an anomalías en la o mación de
ci cui os y con ac os sináp icos en egiones ce eb ales implicadas en la conduc a
social, especialmen e en la co eza ce eb al p e on al. Es as anomalías pueden se
causadas po mu aciones en genes in oluc ados en la o mación de sinapsis y
plas icidad sináp ica, la egulación de la mo ología de las espinas dend í icas, la
o ganización del ci oesquele o y el con ol del equilib io exci ado e inhibido en la
sinapsis [172].
PTEN es á p esen e en la mayo ía de las neu i as du an e el c ecimien o
emp ano de las mismas, y en los axones y dend i as en las neu onas madu as, po lo
que ambién pa icipa en la plas icidad sináp ica en el ce eb o adul o [173]. Además,
PTEN se encuen a al amen e exp esado en las neu onas dopaminé gicas y
Tipo de cánce
PHTS (%)
Población
(%)
Mama
85
12
Ti oides
38
1
Renal
34
1,6
Endome io
28
2,6
Colon
17
5
Melanoma
6
2
In oducción
32
Figu a 15. Dis ibución del po cen aje de mu aciones de PTEN en di e en es ipos de cánce es. Se
mues a la dis ibución de las mu aciones en: A. cánce de endome io, B. Glioblas oma, C. cánce de
p ós a a, D. melanoma y, E. cánce de mama. Los pun os e des ep esen an mu aciones missense.
Los pun os ma ones ep esen an mu aciones con un cambio en el ma co de lec u a. Los pun os
neg os ep esen an mu aciones nonsense. Los pun os mo ados son esiduos con o as al e aciones.
Da os ob enidos de TCGA (The Cance Genome A las) ía cBioPo al (h p://cbiopo al.o g/).
(Ab il2020).
In oducción
33
1.7.2. Mu aciones ge minales
Las mu aciones ge minales que p edominan en el gen PTEN son mu aciones
missense y nonsense, ep esen ando un 44% de odas las mu aciones de PTEN (Figu a
16).
Figu a 16. Po cen aje de la dis ibución de las mu aciones ge minales del gen
PTEN. Da os p oceden es de la base de da os Human Gene Mu a ion Da abase
(HGMD) (Agos o 2020).
Den o de las mu aciones missense y nonsense se obse a que casi la mi ad de
odas ellas es án asociadas a CS, seguido de cánce de mama, o os ipos de cance es,
PHTS, mac oce alia y au ismo (Figu a 17).
In oducción
34
Figu a 17. Dis ibución de mu aciones missense y nonsense según su eno ipo. Sínd ome
de Cowden (CS), Sínd ome hama oma umo al de PTEN (PHTS), Sínd ome de Bannayan-
Riley-Ru alcaba (BRRS), Sínd ome del espec o au is a (ASD), Sínd omes simila es a P o eus
(PS), en e medad de Lhe mi e-Duclos (LD). Da os p oceden es de la base de da os Human
Gene Mu a ion Da abase (HGMD, Ab il 2020).
La p e alencia de mu aciones ge minales de PTEN en los sínd omes PHTS es
a iable; amilias con CS ienen un 85% de p e alencia [202, 203], indi iduos con BRRS
p esen an un 65% [137, 202], pacien es con diagnós ico clínico de PS p esen an en e
un 7-20% de p edominio, y en e un 50-67% de pacien es con el sínd ome simila a
P o eus ienen mu aciones en la línea ge minal de PTEN [8, 129, 145]. A pesa de que
odos es os sínd omes son he edados de o ma au osómica dominan e, las mu aciones
de no o en PTEN ocu en en e un 10-40% de pacien es PHTS [204]. Algunas de las
mu aciones de la línea ge minal de PTHS ambién se han iden i icado en pacien es con
ASD y mac oce alia, y en la mayo ía de los casos (>80 %) dichas mu aciones son de
no o [205].
In oducción
35
1.7.3. Mu aciones PTC
Al ededo de un e cio de las en e medades gené icas he edi a ias es án
causadas po mu aciones nonsense que gene an codones de e minación p ema u a
(PTCs, p ema u e e mina ion codons), los cuales p oducen en la mayo ía de los casos
p o eínas ines ables y no uncionales [206]. Po su pa e, los genes sup eso es
umo ales son una diana ecuen e de PTC. Po ejemplo, los genes p53, APC
(Adenoma ous polyposis coli) y PTEN, mues an un 10%, 30% y 17% de mu aciones
somá icas nonsense asociadas a umo es, espec i amen e [207, 208]. En el caso de
PTEN, las mu aciones que in oducen PTC son ecuen es, an o en umo es como en
pacien es PHTS, en los dominios PTP y C2 (Figu a 18), po lo que las es a egias
e apéu icas basadas en la econs i ución de la exp esión de PTEN en pacien es
a ec ados po es as mu aciones ienen especial ele ancia.
Figu a 18. Dis ibución del núme o de mu aciones nonsense y missense
en mues as de umo es humanos en el gen PTEN. El núme o en e
pa én esis encima de cada ba a indica la media del núme o de
mu aciones po aminoácido en cada dominio. Modi icado de [6]
(COSMIC, Julio 2020).
In oducción
36
2. Lec u a a a és ( ead h ough, RT) como ap oximación e apéu ica en
en e medades causadas po PTCs.
Las mu aciones nonsense que gene an PTCs son ecuen es en en e medades
gené icas ales como la dis o ia muscula de Duchenne (DMD, Duchenne muscula
dys ophy) (10-20% de los pacien es) [209] y la ib osis quís ica (CF, Cys ic ib osis) (2-5%
de los pacien es) [210]. Po ello, se han p opues o in e enciones clínicas en pacien es con
es e ipo de mu aciones pa a es au a la biosín esis de las p o eínas a ec adas, en e las
que des aca la “lec u a a a és” aduccional ( ead h ough, RT). El ead h ough
aduccional consis e en la inco po ación de un aminoácido en la posición co espondien e
a un PTC, acili ada po compues os que se unen al ibosoma y disminuyen la idelidad de
la e minación de la aducción [211-214]. El p ime es udio en el que se demos ó la
e icacia de compues os induc o es de ead h ough (an ibió icos aminoglucósidos) ue en
un modelo de ib osis quís ica [210, 215]. Pos e io men e, se han desc i o induc o es de
ead h ough no-aminoglucósidos con meno oxicidad y aplicación po encial en o as
en e medades [207, 216-220].
2.1. Mecanismo de acción
En las células euca io as, la biosín esis de p o eínas consis e en dos p ocesos
compa imen ados: ansc ipción génica y p ocesamien o del mRNA en el núcleo y
aducción del mRNA madu o en el ci oplasma. En el ci oplasma, el p oceso de aducción
del mRNA se desc ibe en es ases: iniciación, elongación y e minación (Figu a 19). La
ase de iniciación de la aducción comienza cuando la subunidad pequeña (40S) del
ibosoma, jun o con los ac o es de iniciación, se une al ex emo 5´ del mRNA y escanea el
mismo has a encon a el p ime codón de iniciación AUG (Me ionina) en un con ex o de
secuencia ap opiado [221, 222]. Du an e la elongación, los RNA inco po an aminoácidos
en la cadena polipep ídica po complemen a iedad de bases. En condiciones no males, la
e minación de la aducción ocu e cuando uno de los es codones de pa ada (UAA, UGA
o UAG) en a en el si io A del ibosoma y los ac o es de libe ación (euka yo ic elease
ac o s) acili an la libe ación de la cadena polipep ídica (Figu a 19B; Figu a 20A) [223,
224].
In oducción
37
Figu a 19. Rep esen ación esquemá ica del p oceso de la biosín esis de una p o eína. A. El gen es
ansc i o y p ocesado a un mRNA madu o en el núcleo, y en el ci oplasma es aducido a p o eína.
B. 1. El p oceso de la aducción iene luga as el econocimien o del codón de iniciación en el
ex emo 5´del mRNA. 2. Du an e la elongación, se an inco po ando aminoacidos a la cadena
polipep idica 3. La e minación de la aducción ocu e con el econocimien o de un codón de
e minación en el ex emo 3´ del mRNA.
En p esencia de mu aciones nonsense que gene en PTC en el mRNA, el ibosoma
econoce el PTC como si ue a un codón de pa ada canónico, libe ando una cadena
polipep ídica uncada (Figu a 20B). Es udios de c is alog a ía han demos ado que los
aminoglucósidos induc o es de ead h ough se unen al si io A del ibosoma educiendo
la idelidad del p oceso de e minación de la aducción y pe mi iendo el ead h ough
del PTC (Figu a 20C) [225].
In oducción
38
Figu a 20. Rep esen ación esquemá ica del e ec o del ead h ough en la aducción de
una p o eína. A. T aducción no mal de una p o eína. B. En p esencia de un PTC el ibosoma
no es capaz de sin e iza la p o eína en e a, gene ándose una p o eína uncada. C. En
p esencia de induc o es de ead h ough, el ibosoma es capaz de “lee a a és” del PTC,
gene ando una p o eína en e a. Nó ese que el aminoácido inco po ado en la posición del
PTC no coincide necesa iamen e con el aminoácido sil es e, lo que puede p oduci
p o eínas en e as no uncionales.
El mRNA es á suje o a a ios sis emas de igilancia o con oles de calidad, an o
en el núcleo como en el ci oplasma [226]. Uno de los sis emas de igilancia que iene
luga en el ci oplasma es el llamado nonsense-media ed mRNA decay (NMD), el cual es
capaz de dis ingui y deg ada aquellos mRNAs que con ienen PTCs pa a p e eni la
sín esis de p o eínas uncadas no uncionales [227]. Dependiendo de la posición en la
que se encuen e el PTC, el mRNA es suscep ible a la deg adación po la ía NMD. En
esumen, si un mRNA madu o p esen a algún PTC a más de 50-55 nucleó idos
co ien e a iba de la úl ima unión exón-exón, el ibosoma se de end á en el PTC en la
p ime a onda de aducción y eclu a á p o eínas pa a la deg adación del mRNA [228-
230]. Los agen es induc o es de ead h ough, al man ene la aducción de p o eínas a
pesa de la p esencia de un PTC, impiden el NMD y es abilizan el mRNA [231].
In oducción
39
La ecuencia con la que se inco po a un aminoácido en el p oceso de
ead h ough depende del PTC, ya que el ibosoma añade aminoácidos a pa i de
RNAs con an icodones “pa ecidos” po complemen a iedad al PTC [232-234]. En
sín esis, la ecuencia desc i a de aminoácidos inco po ados con el induc o de RT
G418, en células de mamí e o, es como sigue: UGA: 64% A ginina (R), 18% Cis eína (C)
y 18% ip ó ano (W); UAG: 86% Glu amina (Q), 10% Ti osina (Y) y 2% Lisina (K); UAA:
52% Glu amina (Q) y 48% Ti osina (Y) [234].
2.2. E iciencia del Read h ough
La e iciencia del ead h ough no es igual pa a los es codones de e minación.
Expe imen os en líneas celula es de mamí e o han demos ado que el codón de
pa ada UGA iene el po encial de ead h ough más al o y, po an o, la idelidad más
baja, seguido del codón UAG y UAA (UGA>UAG>UAA) [213, 217, 235].
Es udios expe imen ales en a ios o ganismos han demos ado que an o el
con ex o de la secuencia co ien e a iba como la secuencia co ien e abajo del codón
de pa ada ambién desempeña un papel esencial en la e iciencia de la e minación de
la aducción. El nucleó ido inmedia amen e después del codón de pa ada
(denominado +4 o la cua a base) eje ce la mayo in luencia en la idelidad de la
e minación [236], lo que sugie e que la señal de e minación de la aducción consis e
en un e anucleó ido y no solo en el codón de pa ada en sí [237]. La p esencia de
cis eína (C) en la cua a base se ha elacionado con mayo es ni eles de ead h ough,
an o en p esencia como en ausencia de aminoglucósidos induc o es [238, 239] y el
e ec o de la cua a base ambién se e al e ado en unción del codón de pa ada [235,
240, 241].
Además, la secuencia co ien e a iba del codón de pa ada (posiciones -1 a -3)
ambién juega un papel impo an e en la e iciencia de la e minación de la aducción.
Expe imen os en le adu as [240], así como en células de mamí e o [241, 242], han
demos ado que una adenina en la posición -1 o -2 espec o al codón de pa ada
es imula el ead h ough modi icando la es uc u a del mRNA en el si io-P del ibosoma
[242]. Po o a pa e, la combinación de UGA-C con un u acilo en la posición -1 (U-
In oducción
40
UGA-C) p esen a el mayo po encial de ead h ough es imulado po aminoglucósidos
[243].
Se es ima que el ead h ough basal de los codones de e minación na u ales se
p oduce en e un 0.001-0.1% de odas las ondas de aducción. En el caso de los PTCs,
se es ima que los ni eles de RT basal son más al os y pueden a ia en e 0.01% al
0.1%. Los induc o es de ead h ough son más e icaces con los PTCs que con los
codones de e minación na u ales, po lo que inc emen an la sín esis de la p o eína
en e a sin a ec a su co ec a e minación [243, 244].
2.3. Tipos de induc o es de ead h ough
Los an ibió icos aminoglucósidos son los compues os más es udiados como
induc o es de ead h ough de PTCs, con es udios que se emon an a la década de
1960, en donde se publicó el p ime es udio mos ando el po encial de es os
an ibió icos en bac e ias [245]. 25 años después, se demos ó la e icacia induc o a de
ead h ough de los aminoglucósidos en células de mamí e o, donde la pa omomicina y
G418 podían es au a casi el 20% de la ac i idad p o eica [246]. Los aminoglucósidos
son comúnmen e usados pa a a a in ecciones bac e ianas en la p ác ica clínica, y se
han desa ollado y es udiado un g an núme o de compues os sin é icos y na u ales,
que se pueden clasi ica como aminoglucósidos y no aminoglucósidos (Tabla 4).
El po encial e apéu ico de los aminoglucósidos como compues os es imulan es
de la lec u a de un PTC ha sido es ado en muchos modelos, desde sis emas de
ansc ipción y aducción in i o [235, 247], en líneas celula es [248-253], en células
de i adas de pacien es [254], en modelos animales [250, 255-257] y en ensayos
clínicos [258-260]. También exis en moléculas que no son aminoglucósidos con
capacidad de induci ead h ough en modelos animales y celula es. Es os compues os
son los an ibió icos mac ólidos (como la ilosina, espi amicina y josamicina) [261], la
negamicina [255, 262], PTC124 ( ambién conocido como A alu en o T ansla na) [220,
263-267], cli ocina [268] y Amlexanox [269], en e o os.
In oducción
41
Tabla 4: Tipos de induc o es de ead h ough
Se mues a los aminoglucósidos más impo an es, así como la e e encia en la
que se usa on pa a hace ead h ough en células de mamí e o.
Los aminoglucósidos p esen an a ios e ec os ad e sos, ales como oxicidad enal
y ó ica y, con meno ecuencia, bloqueo neu omuscula [270, 271]. A pesa de ello,
algunos es udios han demos ado que la adminis ación de gen amicina a pacien es con
DMD o con CF es ela i amen e segu a y puede se bene iciosa [258, 259]. En la
ac ualidad, solo es á ap obado el uso clínico de induc o es de RT en el caso del PTC124
(en Eu opa, pa a pacien es con DMD) [272]. El uso de induc o es de ead h ough como
agen es e apéu icos en el u u o equie e la iden i icación y ca ac e ización de
compues os de al a e icacia y baja oxicidad, lo que cons i uye el á ea de in es igación
muy ac i a en los úl imos años, que incluye es udios sob e la po encialidad de es os
compues os como nue as e apias an i-cánce .
AMINOGLUCOSIDOS
NO
AMINOGLUCOSIDOS
Nomb e Re e encia
Nomb e Re e encia
Pa omomicina
[246]
[248]
Mac ólidos
[261]
Gen amicina
[257]
[243]
[253]
PTC124
[234]
[264]
[263]
Gene icina
(G418)
[235] [235, 251]
[252]
Cli ocina
[268]
Tob amicina
[247]
Amikacina
[250]
[247]
E i omicina
Diop 2007
Kanamicina
[260]
MATERIALES Y METODOS
Ma e ial y mé odos
48
1. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
1.1. Mu agénesis di igida
La mu agénesis ealizada en es e abajo es á basada en la op imización de la
me odología del Ki come cial QuikChangeTM Si e-Di ec ed Mu agenesis (Agilen
Technologies) pa a hace mu agénesis di igida sob e secuencias de DNA. En el
p ocedimien o se u iliza un ec o de doble cadena de DNA (dsDNA) con el inse o de
in e és y dos oligonucleó idos sin é icos solapan es, diseñados indi idualmen e a pa i de
la secuencia de cDNA que se desea mu a . Las condiciones es ánda que hemos
op imizado pa a la mu agénesis de PTEN u ilizan oligonucleó idos con una longi ud de 29
bases, quedando el codón que con iene la mu ación deseada en medio del
oligonucleó ido y lanqueado po el mismo núme o de nucleó idos (13+3+13) [273, 274].
La eacciones de PCR se lle a on a cabo con la DNA polime asa e moes able Pwo
(Tabla 5) (5 U/μL; Roche, Swi ze land) con ac i idad co ec o a exonucleasa 3´→5´.
Tabla 5: Condiciones de la PCR pa a c ea mu aciones sob e la secuencia del
gen PTEN.
*Pa a la mu agénesis de PTEN-L, se aumen ó en 2 minu os la ase de elongación.
El p oduc o de PCR ob enido es a ado du an e 2 ho as a 37ºC con 0.1 μl DpnI (20
U/μl; New England Biolabs) (Figu a xx), una endonucleasa especí ica (5´-Gm6 ATC- 3´) que
digie e el DNA pa en al me ilado, quedando así las cadenas no me iladas de DNA de
nue a sín esis con la mu ación deseada (Figu a 21).
PCR
Fases
Ciclos
Tempe a u a (oC)
Tiempo
1
1
95 oC
1 min
2
18
95 oC
50 seg
60 oC
50 seg
68 oC
5 (7*) min
3
1
68 oC
7 min
Ma e ial y mé odos
49
1.2. Plásmidos
Los plásmidos u ilizados en es e abajo se desc iben en la Tabla 6.
Tabla 6: Plásmidos u ilizados en es a esis doc o al.
Plásmido
Ca ac e ís icas
Fuen e
pRK5
Vec o de exp esión en mamí e os.
Pha minge
pRK5 PTEN
Con iene el cDNA codi ican e de PTEN
(secuencia humana, NM_000314; aminoácidos
1-403) clonado en el ec o pRK5.
[21]
pRK5 PTEN-L
Con iene el cDNA codi ican e de PTEN-L
(secuencia humana, NM_001304717;
aminoácidos 1-576) clonado en el ec o
pRK5.
[275]
pYES2
Vec o de exp esión en le adu as. Con iene el
p omo o inducible po galac osa GAL1 y el
ma cado auxo ó ico URA3.
In i ogen
pYES2 PTEN
Con iene el cDNA codi ican e de PTEN
(aminoácidos 1-403) clonado en el ec o
pRK5.
[276]
pYES2 PTEN-L
Con iene el cDNA codi ican e de PTEN-L
(aminoácidos 22-576) clonado en el ec o
pRK5.
[31]
YCpLG
Vec o de exp esión cen omé ico en
le adu as. Con iene el p omo o inducible po
galac osa GAL1 y el ma cado auxo ó ico
LEU2.
L. Ba dwell y
J. Tho ne
(Uni . de
Cali o nia)[276]
YCpLG-p100α -
CAAX
Con iene el cDNA codi ican e de la subunidad
ca alí ica p110α (secuencia bo ina,
NM_006218) usionada en 3´ con la secuencia
de la señal de p enilación de RAS
[276]
2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR
2.1. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE BACTERIAS
2.1.1. Cepa de bac e ia y medios de c ecimien o
Se u iliza medio líquido LB (Lu ia-Be ani) (1% ip ona, 0.5% ex ac o de le adu a,
1% NaCl) y placas de aga (1.5% aga y 0.01% NaOH) con/sin ampicilina como medio
selec i o de c ecimien o pa a la cepa DH5α de Esche ichia coli. El eno ipo de dicha cepa
es F- Φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-a gF) U169 ecA1 endA1 hsdR17 ( k, mk+) phoAsupE44 hi-
1 gy A96 elA1 λ-.
Ma e ial y mé odos
50
2.1.2. P epa ación de bac e ias compe en es con clo u o cálcico
Las células compe en es de E. coli se han ob enido median e el mé odo de
ans o mación de clo u o de calcio (CaCl2). Se c ece una colonia DH5α en 5 ml de medio
LB sin penicilina du an e 24 ho as a 37ºC. Pos e io men e, se incubó 1 ml del inóculo en
50 ml de medio LB has a llega a una densidad óp ica (D.O 600nm) de 0.6. Después, se
ealiza on dos p ocesos de cen i ugación (10 min a 4000 pm a 4ºC) en los que se
esuspendió el pelle en CaCl2 0.1M. Po úl imo, se esuspendió en 2 ml de CaCl2 0.1M con
20% de glice ol, y se hicie on alícuo as que se congela on con hielo seco y se almacena on
a -80ºC.
2.1.3. T ans o mación de bac e ias
En ubos de polip opileno de 15 ml se añaden 2-10 μl del p oduc o de PCR
mu agénica ob enido as el a amien o con DpnI, 10μL de ampón TNE (50 mM T is-HCl
pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) y 10μl de TCM 10X (100 mM T is-HCl pH 7.5, 100 mM
CaCl2, 100 mM MgCl2), y se dejó hielo du an e 5 minu os. Al cabo de ese iempo, se
añadie on 25μl de células compe en es DH5α. T as 30 minu os en hielo, se aplicó un
choque é mico a 42ºC du an e 90 segundos. Pos e io men e se añadie on 500 μl de
medio LB y se deja on a 37ºC en agi ación du an e 90 minu os. Las células bac e ianas
ans o madas se ans i ie on a placas LB con ampicilina (50 g/ml) y se deja on
c eciendo du an e 24 ho as a 37ºC (Figu a 21). Al día siguien e, se pica on colonias en 5
ml de LB con ampicilina (50 g/ml), y se deja on c eciendo a 37ºC du an e oda la noche.
2.1.4. Pu i icación del DNA plasmídico
El DNA plasmídico se puede ex ae po dos mé odos:
- Pu i icación a pequeña escala: se ex ajo el DNA plasmídico median e el ki
come cial NucleoSpin Plasmid Easy Pu e (Mache ey-Nagel) de las colonias
ans o madas en 5 ml de LB con ampicilina a 37ºC en agi ación du an e 24
ho as.
- Pu i icación a g an escala: se u ilizó el ki NucleoBond X a Midi (Mache y-
Nagel) de las colonias bac e ianas ans o madas en 100 ml de LB con
ampicilina a 37ºC en agi ación du an e 24 ho as.
Ma e ial y mé odos
51
Los plásmidos ob enidos as la mu agénesis se digi ie on con enzimas de
es icción y se comp oba on median e una elec o o esis en geles de aga osa al 1% en
ampón TAE (40mM T is-ace a o, 1mM EDTA) con Gel-RedTM Nucleo Acid S ain (Bio ium) a
ol aje con inuo. El gel se isualiza en el sis ema G:BOX con su p og ama de análisis Gene
Snap (Syngene, Camb idge) (Figu a 21).
2.1.5. Secuenciación
Las mues as seleccionadas se secuencia on (ABI 3130xl Gene ic Analyze (Li e
Technologies)) pa a con i ma la mu ación deseada y pa a e i ica que no se hayan
in oducido mu aciones adicionales du an e el p oceso de PCR. La secuenciación se
ealizó en la Pla a o ma de Gené ica y Genómica del Ins i u o de In es igación Sani a ia
Bioc uces Bizkaia. Las secuencias de DNA se analizan u ilizando el p og ama BioEdi
(Figu a 21).
Figu a 21: Rep esen ación esquemá ica del mé odo de mu agénesis di igida Quikchange. Se lle a a
cabo la mu agénesis sob e el ec o de mamí e os pRK5-PTEN y el ec o de le adu as pYES2-PTEN. 1.
Reacción de PCR. Reacción de ampli icación del DNA median e PCR usando oligonucleó idos
complemen a ios con la mu ación deseada. 2. Diges ión. Diges ión del DNA molde pa en al con DpnI.
3. T ans o mación del p oduc o ob enido en células E. coli compe en es en placas de LB con
ampicilina. 4. Ob ención y aislamien o del DNA plasmídico. Diges ión con la enzima de es icción
(XbaI) y comp obación de la secuencia del DNA median e análisis de da os.
Ma e ial y mé odos
52
2.2. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE LEVADURAS
2.2.1. Cepa de le adu a y medios de c ecimien o
La cepa de Saccha omyces ce e isiae u ilizada ue YPH499, cuyo eno ipo es MATa
ade2-101 p1-63 leu2-1 u a3-52 his3∆200 lys2-801. Se u iliza como medio gene al de
c ecimien o no selec i o el medio líquido YPD (1% ex ac o de le adu a, 2% pep ona y 2%
glucosa), o sólido con aga (2%). El medio sin é ico comple o (SD) con iene 0.17% base
ni ogenada sin aminoácidos, 0.5% sul a o amónico y 2% de glucosa (Dex osa),
suplemen ándose con los aminoácidos ap opiados en unción de los plásmidos
co espondien es. Los medios SG y SR con ienen 2% de galac osa y a inosa,
espec i amen e.
2.2.2. T ans o mación de la le adu a
En aquellos casos en los que se ans o man dos plásmidos, las ans o maciones de
le adu a se lle a on a cabo di ec amen e desde placas YPD. Pa a ello, se p epa ó en un
ubo eppendo 100 µl de la mezcla de ans o mación (80 µl de polie ilenglicol (PEG) al
50 % y 20 µl de ace a o de li io (AcLi) 1M), se agi ó con el o ex. Después, con un palillo
es é il se cogió una pequeña can idad de la cepa de le adu a c ecida en la placa YPD y se
añadió a la mezcla jun o con 2 µl (1 µg/µl) de DNA plasmídico.
Pa a aquellas ans o maciones de más de 2 plásmidos, la cepa de S. ce e isiae se
c eció en 10 ml de medio liquido YPD a 30ºC du an e 24 ho as en agi ación. Se diluyó 1 ml
del inóculo en medio YPD y cuando el medio ob u o una D.O600 nm de 0.4, se dejó
incubando du an e 4 ho as más. Después se cen i ugó en io du an e 5 min a 2500 pm
y el pelle ob enido se esuspendió con la mezcla p e iamen e p epa ada de PEG al 50%
con AcLi 1M, DTT, con eniendo 3 µl de DNA plasmídico (1,5 µg/µl) y 5 µl de DNA de
espe ma de salmón (Sigma, 10 mg/ml) po mues a. El DNA de espe ma de salmón se
calien a du an e 5 minu os a 95ºC y es en iado en hielo an es de se añadido a la mezcla.
En ambos casos, los ubos de ans o mación se incuba on en agi ación du an e 45
min a 45ºC. Las le adu as ans o madas se semb a on en placas de aga con medio
sin é ico comple o (sin u acilo (SD-U), sin leucina (SD-L), sin u acilo ni leucina (SD-UL) o sin
u acilo ni leucina ni ip ó ano (SD –UTL)) y se dejó incubando a 30ºC du an e 3 días.
Ma e ial y mé odos
53
2.2.3. Ensayo de c ecimien o en go a median e diluciones
se iada
Las colonias ans o madas se incuba on en medio SD du an e 18 ho as, y dichos
cul i os se diluye on en agua es é il has a una densidad óp ica de 0.15, a pa i de los
cuales se p epa a on 3 diluciones se iadas (1/10, 1/100 y 1/1000). Con una pipe a
mul icanal se deposi a on 5 µl de cada dilución en pa alelo an o en placas SD, como
con ol del c ecimien o, como en placas SG pa a induci la exp esión de los genes
egulados po el p omo o GAL1. Se incuba on a 30ºC y el c ecimien o de las go as en las
placas se moni o izó as 72 ho as. Todos los expe imen os se ealiza on, al menos, es
eces.
3. CULTIVOS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
3.1. Líneas celula es
La línea celula COS-7 es una línea celula de iñón de mono que exp esa de o ma
endógena PTEN. Es a línea se cul i ó en DMEM (Dulbecco´s Modi ied Eagle´s Medium,
Lonza, USA) complemen ado con 5% FBS (sue o e al bo ino), 1mM L-Glu amina, 100
U/ml penicilina, y 0,1 mg/ml es ep omicina.
La línea celula U87-MG es una línea celula humana de glioblas oma, no exp esa
PTEN de o ma endógena. Es a línea celula se cul i ó en DMEM complemen ado con 10%
FBS, 1mM L-Glu amina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 100 U/ml penicilina, 0,1 mg/ml
de es ep omicina y 1mM pi u a o sódico.
3.2. Mé odo de ans ección
La línea celula COS-7 se ans ec ó u ilizando el p o ocolo de ans ección DEAE-
dex ano y el mé odo de ans ección GenJe TM. En ambos casos, días an es de la
ans ección se plaquea on al ededo de 1,5·104 células/cm2 en placas Pe i.
En el mé odo de ans ección DEAE-dex ano, as un la ado con PBS (Tampón
os a o salino (1,85 mM Na2HPO4, 8,4 mM Na2HPO4, 150mM NaCl)), las células se
incuba on du an e 4 ho as en una solución con DMEM al 2%, 10Mm de clo oquina, 10
mg/ml de dex ano y 1 µg de DNA plasmídico. T anscu ido ese iempo, las células
Ma e ial y mé odos
54
ans ec adas se incuba on 2 minu os con una solución de PBS con 10% de DMSO
(dime ilsul óxido) y se la a on con PBS. Finalmen e, las células se cul i a on du an e 48
ho as an es de se p ocesadas.
En el mé odo de ans ección GenJe TM In Vi o DNA T ans ec ion Reagen
(SignaGen Labo a o ies), las células se dejan en placas de seis pocillos con medio
comple o 1 ho a an es de se ans ec adas. Mien as an o, se p epa an dos soluciones;
la p ime a se añade 1 g de DNA en medio DMEM sin sue o y en la segunda, se p epa a
medio DMEM sin sue o jun o con GenJe Reagen pa a cada ans ección. Se añade la
solución del eac i o de GenJe sob e la solución de DNA, se o exea y se incuba du an e
15 minu os a empe a u a ambien e. T anscu idos los 15 minu os la mezcla se añade a
las células. Las células se cul i a on en un incubado sa u ado de humedad a 37ºC y 5% de
CO2 du an e 24 ho as. Pasadas 24 ho as se añade medio nue o y las células se p ocesa on
24-48 ho as pos - ans ección.
La línea celula U87-MG se ans ec ó con Lipo ec amine 3000 (The mo Fishe
Scien i ic, USA). En es a ans ección se ealizan dos incubaciones. P ime o, en un ubo se
mezcla la solución Op iMEM con 1 µg de DNA y la solución Plus Reagen ; en o o ubo se
incuba la solución Lipo ec amine con medio Op iMEM. T anscu idos 10 minu os, se
jun an las dos incubaciones y se dejan du an e 30 minu os a empe a u a ambien e. A
con inuación, se añadió la mezcla de la ans ección a las placas con medio nue o sin
an ibió icos. Ambas líneas se cul i a on de o ma u ina ia en placas de 6 pocillos en un
incubado sa u ado de humedad a 37ºC y 5% de CO2, y se p ocesa on 48-72 ho as pos -
ans ección.
En los expe imen os de es abilidad de p o eínas, las células se a a on con 800
µg/ml de cicloheximida (CHX, Sigma-Ald ich) du an e 6 ho as an es de lisa las. En los
expe imen os de ead h ough, las células se incuba on du an e 24 ho as en p esencia de
G418 (gene icina) a una concen ación de 200 μg/ml (o a la dosis indicada).
3.3. Lisis de cul i os celula es
Se ealiza on la ados con PBS io (4ºC). Después las células se incuba on a 4ºC con
150-200 µl ampón de lisis Mammalian P o ein Ex a ion Reagen (M-PER, The mo Fishe
Scien i ic) suplemen ado con un inhibido de os a asas PhosSTOP y con un cock ail de
inhibido de p o easas cOmple e EDTA- ee (Roche, Swi ze land) du an e 10 min.
Después, el lisado celula esul an e se cen i ugó a 14.000 pm du an e 10 minu os a 4ºC.
Ma e ial y mé odos
55
Dicha cen i ugación pe mi e ob ene un sob enadan e pos nuclea con el lisado celula .
La concen ación p o eica de cada mues a se cuan i icó empleando el ki Pie ceTM BCA
P o ein Assay (The mo Fishe ). Con concen aciones conocidas de la se oalbúmina bo ina
(BSA) se es ableció la ec a de calib ado que pe mi e calcula la abso bancia
co espondien e a la concen ación p o eica de nues a mues a. La abso bancia se midió
en un espec o o óme o BioPho ome e (Eppendo ).
4. INMUNODETECCIÓN PROTÉICA
4.1. Elec o o esis
Pa a la sepa ación elec o o é ica, se añadió ampón de ca ga Nu-PAGE 4X a los
ex ac os p o eicos p oceden es de células de mamí e o (125 mM de T is HCl pH=6,8, 5%
de SDS, 25% de glice ol y β-me cap oe anol (Me ck) po cada ml de ampón de ca ga) y se
hi ie on a 95ºC du an e 10 minu os. A con inuación, se lle ó a cabo una Las
elec o o esis se ealiza on en geles de poliac ilamida (10% SDS-PAGE), en condiciones
desna u alizan es y educ o as, a un ol aje con inuo de 20 V du an e oda la noche. Se
incluyó P ecision Plus P o ein (Bio-Rad) como ma cado de peso molecula .
4.2. T ans e encia e hib idación
T as la sepa ación de p o eínas en el gel de poliac ilamida, es ás se ans i ie on a
una memb ana de PVDF (Immobilon-FL, Millipo e), ac i adas p e iamen e con me anol, a
a és de una ans e encia semiseca (The mo Scien i ic Owl se ie HEP) du an e 1 ho a a
200 mA y 30 min a 100 mA. Una ez ealizada la ans e encia de p o eínas y pa a e i a la
posibilidad de uniones inespecí icas, la memb ana se bloqueó con OBB (Odissey Blocking
Bu e , LI-COR) (Dilución 1:1 en PBS) du an e 2 ho as a empe a u a ambien e y se incubó
con un an icue po p ima io monoclonal (diluido en ampón de bloqueo 1/1.000 con 2%
de azida sódica, la cual p e iene de con aminaciones bac e ianas y pe mi e eu iliza el
an icue po) (Tabla 7) du an e oda la noche a 4ºC. Después se ealiza on 6 la ados de 10
minu os con ampón NET-gela ina (50 mM T is-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5mM EDTA,
0.05% T i ón X-100, 0.25% gela ina). A con inuación, la memb ana se incubó con un
an icue po secunda io conjugado con un luo oc omo (Tabla 7) (diluido en ampón de
bloqueo 1/20.000) du an e una ho a a empe a u a ambien e.
Resul ados
62
Figu a 22. Moni o ización de la mu agénesis di igida usando una sus i ución de aminoácido de PTEN
como ejemplo. A. Ejemplo de pa de oligonucleó idos de 29 nucleó idos de longi ud (+, p ime o wa d;
-, p ime e e se) (13+3+13, sub ayado el codón que se sus i uye), pa a la mu ación D24G de PTEN, en
donde el aspa a o de la posición 24 (GAC) es sus i uido po una glicina (GGC). B. Gel de aga osa al 1%.
Se mues a el DNA ob enido de la PCR a ado con/sin Pwo y/o con/sin DpnI. El plásmido pRK5-PTEN
iene un amaño ap oximado de 6 kb, mien as que el plásmido pYES2-PTEN iene un amaño de 7.1 kb.
C. Con ol de diges ión con enzimas de es icción (XbaI + SalI, co an el inse o PTEN de 1,2 kb) de DNA
plasmídico ob enido de bac e ias ans o madas con el p oduc o de PCR mu agénico. D. E iciencia de la
ans o mación bac e iana del p oduc o de PCR (se mues a el núme o de colonias después del
a amien o con DpnI) y e iciencia de mu agénesis (núme o de mues as mu adas con espec o al
núme o de mues as secuenciadas).
La Tabla 8 mues a ejemplos de mu agénesis de PTEN con oligonucleó idos de la
misma longi ud (13+3+13) pe o dis in a Tm (mel ing empe a u e) y con enido de G/C.
Como se obse a, ni la Tm, ni la p esencia de una G o una C en los ex emos 3´de los
oligonucleó idos, ni el con enido de G/C a ec ó a la e iciencia de la mu agénesis. Po ello,
pa a el es o de expe imen os de es a esis, hemos u ilizado oligonucleó idos mu agénicos
de 29 nucleó idos de longi ud, independien emen e de su Tm y con enido en G/C.
Resul ados
63
Tabla 8. Mu agénesis di igida es anda izada pa a mu aciones de PTEN1
Mu ación2
Con enido de GC
(%)
Tm3
Núme o de
colonias
E iciencia de
mu agénesis
M1I (ATG→ATA)
48
75
22
1/1
K6E* (AAA→GAA)
52
76.5
12
1/1
K6I* (AAA→ATA)
52
76.5
8
1/1
N12T** (AAC→ACC)
41
72
12
1/1
R14G* (AGG→GGG)
41
72
20
1/2
D24G (GAC→GGC)
38
71
58
1/1
E43G (GAA→GGA)
48
75
11
1/1
I50T (ATT→ACT)
31
68
19
1/1
Y65C** (TAC→TGC)
34
69.5
8
1/1
Y68N** (TAC→AAC)
34
69.5
9
2/3
Y68H** (TAC→CAC)
38
71
15
1/1
Y68C** (TAC→TGC)
38
71
32
1/1
L70P** (CTT→CCT)
38
71
14
1/1
K80E*(AAA→GAA)
41
72
5
1/1
I101T* (ATC→ACC)
41
72
20
1/1
D107G* (GAT→GGT)
48
75
10
1/1
L112P (CTA→CCA)
45
74
10
1/1
H123R (CAC→CGC)
45
74
25
1/1
R130L (CGA→CTA)
45
74
38
1/1
G132D* (GGT→GAT)
38
71
32
1/2
R142P (CGG→CCG)
24
65
44
1/1
R159G* (AGG→GGG)
48
75
39
1/1
Q171E (CAG→GAG)
48
75
15
1/2
M205V (ATG→GTG)
45
74
19
1/1
D252V (GAT→GTT)
41
72
55
1/1
K254T** (AAA→ACA)
45
74
26
1/1
V255A (GTA→GCA)
41
72
100
1/1
1La mu agénesis se ha lle ado a cabo usando el plásmido pYES2-PTEN con oligonucleó idos de 29
nucleó idos de longi ud.
2Se indica la sus i ución del nucleó ido y el cambio de aminoácido.
3La Tm se calculó de acue do con el manual QuikChange.
* Uno de los oligonucleó idos mu agénicos iene una G o C en la posición 3´.
** Los dos oligonucleó idos mu agénicos iene una G o C en la posición 3´.
Resul ados
64
2. Respues a de ead h ough de los codones de e minación p ema u a
(PTC) en el gen PTEN
2.1. PTCome de PTEN asociado a en e medades
En la Figu a 23 se mues a el PTCome po encial de PTEN, es deci , odos los
di e en es PTC que se pueden gene a , cambiando un nucleó ido, a pa i de la secuencia
de DNA codi ican e del gen PTEN. El PTCome po encial de PTEN incluye 183 PTC,
gene ados a pa i de 146 codones, que incluyen 17 de los 18 codones que pueden
p oduci codones nonsense median e el cambio de un nucleó ido (el codón TCG no es á
p esen e en el gen PTEN). A día de hoy, se han iden i icado 141 PTC en PTEN asociados a
en e medades, de los cuales 15 se han encon ado solo en la línea ge minal de pacien es
PHTS, 71 son PTC esul ado de mu aciones somá icas en umo es y, 55 es án p esen es en
la línea ge minal de pacien es en umo es. Es os PTC se dis ibuyen a lo la go del dominio
PTP y el dominio C2 de PTEN, mien as que en la cola C- e minal no se ha encon ado
ningún PTC asociado a en e medad.
Figu a 23: PTCome de PTEN. Rep esen ación de los dominios de la p o eína PTEN y la dis ibución
de los PTC. En la pa e supe io se mues an los exones de PTEN y los dominios de la p o eína (los
núme os se co esponde con la nume ación de aminoácidos de PTEN: dominio PTP, aminoácidos 1-
185; dominio C2, aminoácidos 186-353; cola C- e minal, aminoácidos 354-403). En el diag ama de
ba as supe io se mues a el PTCome po encial de PTEN con los 141 PTC asociados a en e medades
(ma cados en neg o) y 42 PTC no elacionados con en e medades (ma cado en ama illo). En los
diag amas de ba as in e io es, se mues a la dis ibución de los PTC somá icos y los PTC de línea
ge minal (ma cados en ojo) del gen PTEN asociados a en e medades (en e medades asociadas al
PTCome de PTEN).
Tan o en pacien es con PHTS como en mues as de umo es, exis en es
mu aciones halladas ecuen emen e (R130X, R233X y R335X, si uadas en los exones 5, 7 y
8, espec i amen e). Es as mu aciones cons i uyen el 15%, 18%, y 4%, espec i amen e,
Resul ados
65
del o al de mu aciones PTC de PTEN encon adas en umo es humanos, y el 22%, 13%, y
17%, espec i amen e, de las mu aciones PTC de PTEN encon adas en pacien es con PHTS
(Figu a 24).
Figu a 24. Rep esen ación de los PTC somá icos y ge minales encon ados en el gen PTEN. En el
g á ico de la izquie da, se mues a el núme o de eces que un PTC ha sido encon ado en la línea
ge minal de pacien es (da os p oceden es de la li e a u a ( e Bibliog a ía suplemen a ia) y de la
base de da os HGMD). En el g á ico de la de echa se mues a el núme o de eces que un PTC ha
sido encon ado en mues as de umo es. Da os p oceden es de la base de da os COSMIC. Los
núme os en el eje de abscisas co esponden a la nume ación de los aminoácidos de PTEN.
2.2. Inducción de ead h ough en mu aciones PTC de PTEN
En la Figu a 25 se mues an a ios expe imen os sob e la lec u a aduccional
inducible po ead h ough de di e en es mu aciones PTC de PTEN. En p ime luga ,
analizamos la e icacia de G418 (gene icina), un an ibió ico aminoglucósido, pa a induci
ead h ough en el gen PTEN. Se usó líneas celula es humanas posi i as (COS-7) y nega i as
(U87MG) pa a PTEN, ans ec adas ansi o iamen e con plásmidos de cDNA que codi ican
las mu aciones PTC de PTEN más abundan es en umo es, R130X (TGA) y R233X (TGA). En
ambas líneas celula es obse amos la inducción de ead h ough en p esencia de G418
(Figu a 25A). Pa a e alua la especi icidad del PTC- ead h ough inducido po G418, se co-
ans ec ó el plásmido pRK5-PTEN (el ec o pRK5 ca ece del gen de esis encia a
neomicina, cuyo p oduc o p o eico inac i a G418) con el plásmido pRC/CMV (plásmido
que con iene el gen de esis encia a neomicina) o el plásmido acío pSG5 (plásmido que
ca ece de dicho gen de esis encia). La co- ans ección con el plásmido pRC/CMV bloqueó
la inducción con G418 del ead h ough del PTC R233X (Figu a 25B). A con inuación, se
e aluó el ead h ough inducido po G418 y gen amicina (o o an ibió ico aminoglucósido)
en algunas a ian es ep esen a i as de PTEN que con ienen PTC, usando dos an icue pos
an i-PTEN di e en es (an i-C- e minal o an i-N- e minal). Ambos an ibió icos ac i a on el
Resul ados
66
ead h ough de es os PTC de PTEN, gene ando p o eínas comple as de PTEN con una
e iciencia a iable dependiendo del PTC. Se puede obse a como la inducción del
ead h ough es mayo con G418 en odos los PTC, aunque ambién se puede ap ecia con
gen amicina. En algunas a ian es de PTC de PTEN, como R335X, se de ec ó la p o eína
PTEN uncada median e el an icue po an i-N- e minal (Figu a 25C). El análisis de allado de
la exp esión de di e en es PTC de PTEN mues a una disminución g adual en los ni eles de
exp esión de las p o eínas uncadas C- e minales de PTEN, siendo inde ec able las
uncaciones an e io es al aminoácido 219 (Figu a 25D). Es o concue da con la al a de
es abilidad en las células de las p o eínas uncadas C- e minales de PTEN. La can idad de
p o eína uncada C- e minal R335X disminuyó p opo cionalmen e a la can idad de
p o eína comple a de PTEN gene ada po el ead h ough (Figu a 25C).
Figu a 25. Inducción de ead h ough en di e en es mu aciones PTC de PTEN. Las células COS-7 se
ans ec a on con plásmidos pRK5 que codi ican di e en es PTC de PTEN (φ, ec o acío; w , ipo
sil es e). T as 24h de incubación las células se dejan sin a an o se incuban con G418 (200 µg/ml) o
gen amicina (800 µg/ml) du an e 24h más. La exp esión de p o eína se de ec ó median e Wes e n Blo
usando po sepa ado el an icue po an i-PTEN C- e minal (6H2.1), an icue po PTEN N- e minal y an i-
GAPDH como con ol de ca ga. A. Las células COS-7 y U87MG se ans ec a on con plásmidos pRK5 que
codi ican di e en es a ian es de PTEN (R130X y R233X). B. Las células COS-7 se co- ans ec a on con el
plásmido pRK5 y el ec o acío pRc/CMV y pSG5. C. Ac i ación del ead h ough en células COS-7 con
ambos an ibió icos. El as e isco (*) indica la mig ación de la p o eína uncada R335X C- e minal de
PTEN. D. Exp esión de las p o eínas uncadas C- e minales de PTEN en células COS-7 a pa i de las
co espondien es a ian es PTC.
Resul ados
67
Las a ian es de PTEN cuyo PTC se encuen a localizado en la egión N- e minal an es
de la me ionina 35 (Me 35), como R11X (TGA) y R15X (TGA), p oduje on una p o eína uncada
N- e minal de PTEN en condiciones no induc o as de ead h ough; dicha p o eína se de ec a
con el an icue po an i-C- e minal de PTEN, pe o no con el an icue po an i-N- e minal (Figu a
26A). A con inuación, analizamos compa a i amen e, en dis in as mu aciones PTC de PTEN, la
espues a de ead h ough en e a a ios induc o es, en e los que se incluyen compues os
aminoglucósidos (G418, gen amicina, Amicacina y Tob amicina) y no aminoglucósidos
(E i omicina). El compues o que más ead h ough induce es el G418, seguido de la
gen amicina. Se incluyó la mu ación Y176X como ejemplo de mu ación PTC que no su e
ead h ough (Figu a 26B). Pa a sabe la concen ación de induc o y el iempo necesa io pa a
induci ead h ough, se ealiza on los siguien es expe imen os. En p ime luga , se ealizó un
expe imen o con concen aciones c ecien es de G418 y de gen amicina (Figu a 26C) en las
a ian es R130X y R233X de PTEN. Obse amos que al añadi G418 a una concen ación de 200
µg/ml o gen amicina a una concen ación de 800 µg/ml, an o a la a ian e R130X como a
R233X, se conseguía mayo es ni eles de ead h ough (consiguiendo ni eles óp imos con
G418). En segundo luga , se ealizó un expe imen o pa a de e mina el iempo necesa io pa a
induci ead h ough en las células. Se obse a que 24 ho as es su icien e pa a ob ene
exp esión de p o eínas median e la inducción con G418 y dicho e ec o se man iene en las
células has a 48 ho as después (Figu a 26D).
Resul ados
68
Figu a 26. Inducción de ead h ough en di e en es mu aciones de PTEN. A. Las células COS-7 se
ans ec a on con di e en es a ian es con PTC de PTEN (R11X, R15X, y R130X). El as e isco (*) indica la
mig ación de la p o eína uncada N- e minal de PTEN.B. Cuan i icación de los ni eles de exp esión de
ead h ough de di e en es mu aciones PTC de PTEN en p esencia de di e en es induc o es. Se mide la
exp esión de los di e en es PTC en p esencia de G418 (200 µg/ml), Gen amicina (800 µg/ml), Amicacina
(2 mg/ml), Tob amicina (800 µg/ml) y E i omicina (175 µg/ml). Las ba as co esponden a la media ±
SD. C. Respues a a la dosis del induc o de ead h ough de di e en es mu aciones PTC de PTEN. Las
células COS-7 se incuban con G418 (200, 75, o 30 µg/ml) y gen amicina (800, 300, o 100 µg/ml) du an e
24h. D. Panel izquie do: las células COS-7 son a adas con o sin G418 (200 µg/ml) du an e el iempo
indicado. Panel de echo: las células COS-7 se incuba on du an e 24h en p esencia de G418 (200 µg/ml),
seguido de o a incubación en ausencia de G418, como se indica. En ambos casos, se mues a un
expe imen o ep esen a i o de al menos dos expe imen os independien es.
Resul ados
69
2.3. Análisis global del ead h ough del PTCome de la línea ge minal de
PTEN asociado a en e medades
La e iciencia del ead h ough es á in luenciada po la iden idad de cada PTC, así como
po la secuencia de nucleó idos p óxima en el mRNA. Pa a hace una es imación global del
po encial de ead h ough ealizamos un análisis global de la inducción de ead h ough con
G418, como induc o óp imo de ead h ough, de 70 PTC hallados en la línea ge minal de PTEN
en asociación con en e medades (15 PTC se han encon ado en la línea ge minal de pacien es
PHTS y 55 PTC se han encon ado en la línea ge minal de pacien es y en mues as de umo es
espo ádicos).
La Figu a 27 mues a un pa ón he e ogéneo de los ni eles de exp esión de p o eína
ob enidos (en e un 0-30% de inducción de ead h ough) de las a ian es de PTC ge minales de
PTEN. La abla 9 p esen a una clasi icación de PTC según su e icacia de ead h ough.
Ap oximadamen e el 6% de los PTC mos ó una e iciencia óp ima de ead h ough (>20% de
exp esión espec o a PTEN sil es e), el 11.5 % mos ó una e iciencia subóp ima de
ead h ough (10-20% de exp esión), el 18% mos ó una e iciencia baja de ead h ough (5-9%
de exp esión), y el 65% mos ó una e iciencia muy baja de ead h ough (0-4% de exp esión).
Figu a 27. Análisis global de la inducción de ead h ough de mu aciones PTC ge minales de
PTEN. Los ni eles de ead h ough se de e mina on median e Wes e n Blo en células COS-7 en
p esencia (ba as ojas) /ausencia (ba as azules) de G418 (200 µg/ml) du an e 24h. Los da os
es án no malizados en e a la exp esión de PTEN ipo sal aje. Se mues a la media de al menos
dos expe imen os independien es.
Resul ados
70
Tabla 9. E iciencia de ead h ough del PTCome asociado a en e medades según el ipo
de PTC
PTC
n1
E iciencia de ead h ough2
Óp ima
4 (5,7%)
Subóp ima
8 (11.4%)
Baja
13
(18.6%)
Muy baja
45
(64.28%)
TGA
16
(22.85%)
3 (75%)
4 (50%)
4
(30,8%)
5 (11.1%)
TAG
22
(31.45%)
1 (25%)
4 (50%)
3
(23.1%)
14
(31.1%)
TAA
32 (45.7%)
0 (0%)
0 (0%)
6
(46.1%)
26
(57.8%)
1 Núme o y po cen aje de cada ipo de PTC de la línea ge minal de PTEN asociadas
a en e medades.
2 La e iciencia de ead h ough se de ine como el po cen aje de exp esión espec o a
PTEN w (100%): óp ima (>20% de exp esión), subóp ima (10%-20% de exp esión),
baja (5%-9% de exp esión) y muy baja (0%-4% de exp esión). Se indica el núme o y
el po cen aje de cada ipo de PTC.
Nues o análisis global nos pe mi ió ealiza algunos análisis compa a i os en é minos
de secuencias de mRNA óp imas pa a el ead h ough de PTEN. La media de las e iciencias de
ead h ough pa a cada ipo de PTC ue on: TGA, e icacia de ead h ough del 11% ( ango 1-
25%); TAG, e icacia de ead h ough del 4.8% ( ango 0-29%); TAA, e icacia de ead h ough del
2.52% ( ango 0-9%). La mayo ía de los PTC que mos a on una e iciencia óp ima o subóp ima
de ead h ough ue on TGA PTC (77,5%), seguidos de TAG (37,5%) y TAA (0%). Po o o lado,
los PTC que mos a on una e iciencia de ead h ough muy baja ue on en su mayo ía TAA
(57.8%), seguido de TAG (31.1%) y TGA (11.1%) (Tabla 9). Es os esul ados, al igual que o os
es udios de ead h ough compa a i os u ilizando di e en es mRNA, e ue zan la idea de que
los codones de e minación TGA p esen an una mayo e iciencia de ead h ough seguido de
los codones TAG y TAA [251, 253].
Las mu aciones PTC p e alen es de PTEN R130X, R233X y R335X mos a on un
ead h ough óp imo o subóp imo (>17% de exp esión) (Tabla 10). Es o e ue za el po encial de
las e apias basadas en ead h ough de PTEN pa a g upos especí icos de pacien es.
Resul ados
71
Tabla 10. E iciencia de ead h ough de las mu aciones PTC ge minales de PTEN
Amino-
ácido1
Va ian e2
Sus i ución de
aminoácido2*
PTC3
E iciencia
de
ead h ough4
Pun uación
uncional
(FS)5
Pun uación
de e iciencia
uncional del
ead h ough6
K6
c.16A>T
p. (Lys6Te )/K16X
ATC TAA GAG
2.9+0.3
1/0
1.5
Y16
c.48T>A
p. (Ty 16Te )/Y16X
AGA TAA CAA
3.8+ 1.6
0.5/0
2.8
Q17
c.49C>T
p. (Glu17Te )/Q17X
TAT TAA GAG
6,2+3.6
0.5/1/1
6,2
L23
c.68T>A
p. (Leu23Te )/L23X
GAC TAA GAC
1.5+0.8
0/0
0
c.68T>G
GAC TGA GAC
4.7+3.9
0/0/0
0
Y27
c.84T>A
p. (Ty 27Te )/Y27X
ACC TAA ATT
1.7+1.8
0/1
0.8
Y29
c.87T>A
p. (Ty 29Te )/Y29X
ATT TAA CCA
8.7+6.0
1/1
8.7
c.87T>G
ATT TAG CCA
10.8+4.3
1/1/1
10.8
G36
c.106G>T
p.(Gly36Te )/G36X
ATG TGA TTT
19.9+1.4
0/0/1
3.5
Y46
c.138C>A
p. (Ty 46Te )/Y46X
GTA TAA AGG
3.4+2.1
0/1
1.6
c.138C>G
GTA TAG AGG
2.5+1.7
0/1/0
0.3
S59
c.176C>A
p. (Se 59Te )/S59X
GAT TAA AAG
6.5+3.7
1/1
6.5
c.176C>G
GAT TAG AAG
28.9+4.8
1/1/1
28.9
Y65
c.195C>A
p. (Ty 65Te )/Y65X
CAT TAA AAG
5.2+3.4
0.5/1
3.8
c.195C>G
CAT TAG AAG
1.9+0.4
0.5/1/0.5
1
Y68
c.204C>A
p. (Ty 68Te )/Y68X
ATA TAA AAT
0.1+0.1
0/1
0
E73
c.217G>T
p.(Glu73Te )/E73X
GCT TAA AGA
2.5+ 1.8
1/1
2.5
K80
c.238A>T
p.(Lys80Te )/K80X
GCC TAA TTT
1.5+0.2
1/1
1.5
R84
c.250A>T
p.(A g84Te )/R84X
TGC TGA GTT
3.9+0.2
1/1/1
3.9
Q87
c.259C>T
p.(Gln87Te )/Q87X
GCA TAA TAT
0.6+0.3
1/1
0.6
Y88
c.264T>A
p.(Ty 88Te )/Y88X
CAA TAA CCT
4.4+2.9
0.5/1
2.1
Q97
c.289C>T
p.(Gln97Te )/Q97X
CCA TAG CTA
6.1+0.1
1/1/1
6.1
E106
c.316G>T
p.(Glu106Te )/E106X
TGT TAA GAT
0.6+0.1
1/0
0.3
Q110
c.328C>T
p.(Gln110Te )/Q110X
GAC TAA TGG
6.9+5.8
1/1
6.9
W111
c.332G>A
p.(T p111Te )/W111X
CAA TAG CTA
3.1+1.2
0/1/0
0.3
G127
c.379G>T
p.(Gly127Te )/G127X
GCT TGA AAG
1.9+0.6
0/0/0
0
R130
c.388C>T
p. (A g130Te )/R130X
GGA TGA ACT
19,6+ 4,8
1/0/0
12,6
L139
c.416T>A
p.(Leu139Te )/L139X
TAT TAA TTA
1.2+0.1
1/0
0.6
c.416T>G
TAT TGA TTA
7.9+4.2
1/0/1
20.6
Resul ados
78
Figu a 30. Recons i ución de la ac i idad uncional PTEN en células. A. Las células COS-7 se co-
ans ec a on con plásmidos pRK5 que codi ican di e en es a ian es de PTEN (φ, ec o acío; w , ipo
sil es e, S59X, R130X, R233X, R335X y Y176X), solos o en combinación con el plásmido pSG5 HA-AKT. Se
incluye la mu ación Y176X como ejemplo de PTC que no induce ead h ough. T as 24h de incubación, las
células se incuban en p esencia o ausencia de G418 (200 µg/ml) du an e 24h más. Los ni eles de
p o eína HA-pAKT, HA-AKT y PTEN se midie on median e Wes e n Blo usando po sepa ado el
an icue po an i-pAKT (S473), an i-AKT y an i-PTEN (6H2.1). También se usa el an i-GAPDH como con ol
de ca ga. Las lechas indican la mig ación de PTEN. B. Cuan i icación del a io pAKT/AKT de cada
condición. La os o ilación de AKT se usa como medida indi ec a de la ac i idad ca alí ica de PTEN. Los
da os son la media de, al menos, dos expe imen os independien es. Las ba as co esponden a la media
±SD.
Además, in es igamos la acumulación nuclea de mu aciones PTC de PTEN as la
inducción del ead h ough. Pa a es os expe imen os, se u ilizó una a ian e Q17P PTEN-GFP
que se acumula en el núcleo [52]. Como se obse a, en el backg ound de Q17P, las mu aciones
R130X y R233X se de ec a on den o del núcleo as la inducción de ead h ough, pe o no la
mu ación Y176X (Figu a 31A). Es os da os concue dan con la de ección de dichas a ian es as
la inducción del ead h ough (Figu a 31B).
Resul ados
79
Figu a 31. Recons i ución de la acumulación nuclea de PTEN. Las células COS-7 son ans ec adas con
di e en es a ian es PTEN-GFP (e ique a de GFP en la egión C- e minal). T as 24h de incubación las
células se incuban en p esencia o ausencia de G418 (200 µg/ml) du an e 24h más. A. Las células se
isualizan di ec amen e con mic oscopia de luo escencia. Las imágenes de a iba mues an la
localización de PTEN-GFP w y Q17P en células sin a a . Las imágenes de abajo mues an la localización
de las di e en es mu aciones en células a adas y sin a a con G418. Pa a cada a ian e de PTEN-GFP,
las imágenes de la izquie da mues an la localización de PTEN-GFP ( e de), y las imágenes de la de echa
mues a la localización nuclea (azul, Hoechs ). B. Moni o ización de la econs i ución inducida po
ead h ough de las a ian es PTEN-GFP. Wes e n Blo de lisados de células COS-7 ans ec adas con los
plásmidos co espondien es. Los ni eles de p o eínas se analiza on usando el an icue po an i-PTEN
(6H2.1) y an i-GAPDH como con ol de ca ga. En odos los casos, se mues a la imagen de un
expe imen o ep esen a i o de, al menos, dos expe imen os independien es.
Es os esul ados indican que la inducción del ead h ough de algunos PTC iene
compe encia pa a econs i ui p o eínas uncionales de longi ud comple a de PTEN, an o en
é minos de ac i idad os a asa PIP3 en células como en el anspo e en e el ci oplasma y el
núcleo.
Resul ados
80
3. Análisis global de mu aciones he edi a ias de PTEN: implicaciones en
sínd omes umo ales y de au ismo.
3.1. Pa ón de dis ibución de mu aciones missense de PTEN en pacien es con
ASD y PHTS.
Se han iden i icado 208 mu aciones missense en la línea ge minal de PTEN inculadas a
en e medades, asociadas p incipalmen e con PHTS y a ian es elacionadas (ag upado como
PHTS) y, en meno medida, con ASD y sínd omes de e aso del desa ollo (ag upado como
ASD) (Figu a 32A; Tabla 12). Al ededo del 14% de mu aciones missense de la línea ge minal de
PTEN se han encon ado an o en pacien es con PHTS como con ASD (Figu a 32A; Tabla 12).
Es o indica una pene ancia a iable pa a las mu aciones de PTEN en muchos casos [8, 282,
283].
El núme o de mu aciones ge minales missense, compa ado con los o os ipos de
mu aciones de PTEN (mu aciones nonsense, delecciones, inse ciones), es mayo en pacien es
con ASD que en pacien es con PHTS [9, 284]. Las mu aciones missense de la línea ge minal de
PTEN iden i icadas se dis ibuyen a lo la go de los dominios PTP y C2, siendo la dis ibución de
mu aciones missense p edominan e en el dominio PTP an o en pacien es con PHTS como en
ASD (Figu a 32B). Es a obse ación concue da con la impo ancia de la ac i idad ca alí ica de
PTEN pa a de eje ce sus unciones biológicas. Al compa a los es loops ca alí icos del
dominio PTP de PTEN (loop WPD, aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI,
aminoácidos 160-171), el núme o de sus i uciones de aminoácidos en el loop P es 5 eces
mayo en mu aciones asociadas a PHTS que a ASD. Sin emba go, al compa a los mo i os de
localización subcelula (NLM, aminoácidos 6-32), se obse a un aumen o de sus i uciones de
aminoácidos en ASD espec o a PHTS (Figu a 32C).
Resul ados
81
Figu a 32: A. Rep esen ación de los dominios de la p o eína PTEN y la dis ibución de mu aciones
missense de línea ge minal de PTEN de ec ada en pacien es con ASD y PHTS. En la pa e supe io se
mues an los exones de PTEN, los dominios de la p o eína (los núme os se co esponde con la
nume ación de aminoácidos de PTEN: dominio PTP, aminoácidos 1-185; dominio C2, aminoácidos 186-
353; cola C- e minal, aminoácidos 354-403), NLM (aminoácidos 6-32) y los loops ca alí icos (loop WPD,
aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI, aminoácidos 160-171). En los diag amas de
ba as (colo ojo), se mues a la dis ibución de mu aciones missense de línea ge minal de PTEN
de ec ada en; pacien es con ASD (diag ama supe io ), pacien es con ASD y PHTS (diag ama de en medio)
y en pacien es con PHTS (diag ama in e io ). Las á eas azules indican los esiduos que no son obje o de
mu aciones. B. Dis ibución de mu aciones missense de la línea ge minal de PTEN asociadas a ASD,
ASD-PHTS y PHTS en los dominios PTP y C2. El po cen aje ha sido calculado espec o a los esiduos 1-
353. C. Dis ibución de mu aciones missense de la línea ge minal de PTEN en los loops ca alí icos del
dominio PTP (loop WPD, aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI, aminoácidos 160-
171) y en la egión NLM (aminoácidos 6-32).
Se ha denominado ecuencia ela i a ap oximada al núme o de eces que cada
sus i ución de aminoácidos ha sido encon ada en pacien es. En gene al, el pa ón de
ecuencia ela i a ap oximada de mu aciones indi iduales es dis in o en pacien es ASD, ASD-
PHTS y PHTS, aunque las ecuencias ag upadas de mu aciones en el dominio PTP y C2 son
simila es (Figu a 33). En la cola C- e minal solo se han encon ado es mu aciones en
pacien es con PHTS o ASD (PHTS: P354Q y N356D; ASD: P391S).
Resul ados
82
Figu a 33. A. F ecuencia de las mu aciones missense de línea ge minal de PTEN de ec ada en
pacien es. Se mues a la ecuencia ela i a ap oximada de mu aciones a lo la go de la secuencia de
aminoácidos de PTEN (núme o de eces que cada sus i ución de aminoácidos ha sido encon ada en
pacien es). En los g á icos de la izquie da, se mues a el núme o de eces que una mu ación missense de
PTEN ha sido encon ado en pacien es ASD, ASD-PHTS y PHTS. Los núme os en el eje de abscisas
co esponden a la nume ación de los aminoácidos de PTEN. B. F ecuencia ela i a ap oximada de
mu aciones missense de la línea ge minal de PTEN asociadas a ASD, ASD-PHTS y PHTS en los dominios
PTP y C2. El po cen aje ha sido calculado espec o a los esiduos 1-353. Da os p oceden es de la base de
da os HGMD, COSMIC y li e a u a ( e e e encias suplemen a ias).
Resul ados
83
3.2. Pa ón uncional de mu aciones missense de PTEN encon adas en la
línea ge minal de pacien es con ASD y/o PHTS.
U ilizando un sis ema he e ólogo de la le adu a como una pla a o ma de al o
endimien o pa a e alua in i o la ac i idad os a asa PIP3 de PTEN (apa ado de Ma e iales y
Mé odos), hemos ealizado un análisis uncional de las mu aciones missense de PTEN
asociadas a la línea ge minal, incluyendo mu aciones encon adas en ASD (49 mu aciones), en
ASD-PHTS (26 mu aciones) y en PHTS (133 mu aciones). En nues o modelo de la le adu a, la
exp esión de una o ma hipe ac i a de la subunidad ca alí ica de PI3K (p110α-CAAX) impide el
c ecimien o celula . La co-exp esión de PTEN sil es e con a es a es e e ec o, mien as que
mu an es de PTEN ca alí icamen e inac i os o con pé dida de unción no son capaces de
esca a el c ecimien o de la le adu a en p esencia de p110α-CAAX (Tabla 12). Se ha
moni o izado la ac i idad uncional de PTEN median e el c ecimien o de la le adu a (Tabla 12;
e ejemplos en Figu a 35) y median e la ubicación en la memb ana plasmá ica de un gen
epo e GPF-Ak (Figu a 34; Tabla 12) que se une a PIP3 [31, 278], y hemos compa ado el
impac o uncional de las mu aciones en PTEN y PTEN-L. Hemos es ablecido es ca ego ías
uncionales pa a las mu aciones de PTEN: ac i idad comple a = esca e de c ecimien o o al
(+++, ++), 0-20% GFP-Ak en la memb ana; ac i idad educida = esca e de c ecimien o pa cial
(+, +/-), 21-70% GFP-Ak en la memb ana; y sin ac i idad = sin esca e de c ecimien o (--), 71-
100% GFP-Ak en la memb ana.
Analizando los da os de o ma global, se obse a una mayo pé dida de ac i idad
uncional de PTEN en pacien es PHTS y ASD-PHTS que en ASD, an o con los da os ob enidos
po la localización de GFP-Ak en la memb ana plasmá ica (Figu a 34A) como con los da os
ob enidos median e la moni o ización del ensayo de c ecimien o de la le adu a (Figu a 34B).
Casi un 60% y un 50% de las mu aciones de la línea ge minal de PTEN de pacien es PHTS y ASD-
PHTS, espec i amen e, no p esen an ac i idad uncional, en e a un 31% de mu aciones de
pacien es ASD. Po o a pa e, el 57% de las mu aciones ASD p esen an ac i idad uncional,
en e a un 25% y un 23% de mu aciones de pacien es PHTS y ASD-PHTS, espec i amen e.
Resul ados
84
Figu a 34. Análisis compa a i o de las mu aciones de la línea ge minal de PTEN en pacien es ASD,
ASD-PHTS y PHTS. A. Diag ama de cajas de la ac i idad uncional de mu aciones de la línea ge minal
de PTEN en pacien es ASD, ASD-PHTS y PHTS, según la ubicación del gen epo e GFP-Ak en la
memb ana plasmá ica. Los bigo es ep esen an el mínimo y máximo de odos los da os; las cajas
ep esen an los alo es en e el cua il 1 y 3, y la línea den o de las cajas ep esen a la mediana. Los
da os se co esponden con los da os de la columna 4 de la Tabla 12. Ac i idad o al, 0-24% de células
PIP3 (+); ac i idad pa cial, 25-74% de células PIP3 (+); no ac i idad, 75-100% de células PIP3 (+). B.
Po cen aje de la ac i idad uncional de mu aciones de la línea ge minal de PTEN en pacien es ASD,
ASD-PHTS y PHTS, moni o izada median e el c ecimien o de la le adu a. Las ca ego ías uncionales se
han es ablecido de la siguien e mane a: ac i idad comple a= esca e de c ecimien o o al (+++, ++), 0-
20% GFP-Ak en la memb ana; ac i idad educida = esca e de c ecimien o pa cial (+, +/-), 21-70% GFP-
Ak en la memb ana; y sin ac i idad= sin esca e de c ecimien o (--),71-100% GFP-Ak en la memb ana.
Resul ados
85
3.3. Análisis compa a i o de las mu aciones de la línea ge minal en
PTEN y PTEN-L
La exp esión de la iso o ma la ga de PTEN (PTEN-L) e ie e la oxicidad causada po
PI3K de o ma simila a PTEN sil es e (Figu a 35; Tabla 12).
Figu a 35. Ejemplo de análisis uncional compa a i o en la le adu a de mu aciones de pacien es
asociadas a ASD en PTEN y PTEN-L. Se induce la oxicidad en la le adu a median e la exp esión
inducible de la subunidad ca alí ica de PI3K (p100) en galac osa, y dicha oxicidad es e e ida median e
la co-exp esión de PTEN ipo sil es e (w ). Las mu aciones en los ecuad os en ojo son ca alí icamen e
inac i as (M1I, K6E, K6I, P38H) o pa cialmen e inac i as en PTEN (N12T, D22E, T26I, Y27C), pe o son
o almen e ac i as en PTEN-L, excep o P38H. En condiciones de no exp esión (glucosa), las p o eínas no
se exp esan y si e pa a moni o iza que en odos los casos se plaquean la misma can idad de células.
Analizando los da os ob enidos sob e la ac i idad uncional en PTEN y PTEN-L, se
obse a una mayo ac i idad uncional de PTEN-L espec o a PTEN (Figu a 36 supe io ). Hemos
descubie o que mu aciones de pacien es ASD, ASD-PHTS y PHTS, que con ie en a PTEN
Resul ados
86
pé dida de ac i idad os a asa PIP3 en células, no a ec an a la ac i idad ca alí ica de PTEN-L
(ASD, 57% de mu aciones con ac i idad uncional en PTEN en e a un 85% de mu aciones con
ac i idad uncional en PTEN-L; ASD-PHTS, 28% de mu aciones con ac i idad uncional en PTEN
en e a un 65% de mu aciones con ac i idad uncional en PTEN-L; PHTS, 8% de mu aciones
con ac i idad uncional en PTEN en e a un 33% de mu aciones con ac i idad uncional en
PTEN-L) (Figu a 36; Tabla 12). Es o sugie e una mayo ole ancia a la mu ación en PTEN-L que
en PTEN.
Figu a 36. Compa a i a de la ac i idad uncional de mu aciones missense de la línea ge minal en PTEN
y PTEN-L, moni o izada median e el c ecimien o de la le adu a. El g á ico supe io , indica la ac i idad
uncional de odas las mu aciones analizadas en PTEN y PTEN-L; en el g a ico in e io , se indica la
ac i idad uncional de mu aciones missense en PTEN y PTEN-L en pacien es ASD, ASD-PHTS y PHTS. El
núme o en e pa en esis ep esen a el núme o o al de mu aciones analizadas.
Resul ados
87
Tabla 12: Lis ado de las mu aciones en PTEN y PTEN-L de ASD y PHTS analizadas in i o.
Mu ación1
En e medad2
Ac i idad
de PTEN3
Go as/
Ojime 4
Ac i idad de
PTEN-L 3
PTEN sil es e
+++
++++/6
+++
M1I (*)
ASD, CS
--
----/93
+++
M1V
ASD
--
-----/90
++
M1L (*)
ASD, Cánce de mama
y/o o a ios
--
---/98
K6E
ASD
--
+---/89
++
K6I
ASD
--
+---/93
++
N12T
ASD
++
++++/7
++
N12I
CS
-
----/96
--
K13E
CS
-
----/95
++
R14G
ASD
--
++--/90
++
R15S (*)
ASD,CS
--
----/90
+-
Y16H
PHTS
-
++--/17
++
Q17E(*)
ASD,CS
+/-
+---/45
--
D19Y
Cánce de mama
+/-
10
++
D22G
CS/BRRS
-
----/93
--
D22E
ASD
+-
++--/89
++
L23F
CS
+/-
++--/55
--
L23V
CS
-
----/97
--
D24G
PHTS
-
----/79
D24H
CS
-
----/90
--
D24V
CS
-
----/94
--
D24Y(*)
DD;BBRS
--
----/96
--
L25F(*)
ASD,CS
--
----/94
--
T26I
DD,mac oc
+-
++--/70
++
T26P
CS
-
95,92
Y27N
PHTS
-
----/95
--
Y27C
ASD
--
----/92
++
P30L
CS
+
++--/9
+
I32N
CS
-
----/90
--
A34D
BRRS
-
----/95
M35R
JPS
-
----/93
M35T
PLS
+/-
----/66
M35V
CS
-
----/93
DISCUSIÓN
Discusión
97
1. P o ocolo de mu agénesis di igida es anda izado
El es udio uncional de las p o eínas a ec adas po las al e aciones gené icas
p esen es en pacien es con cánce o en e medades he edi a ias es esencial pa a el
desa ollo de e apias e icaces [285, 286]. Sin emba go, oda ía exis e una g an b echa
en e la ecopilación de in o mación gené ica a pa i de mues as biológicas de pacien es
y las posibilidades expe imen ales pa a es udia y analiza las p opiedades de las
p o eínas mu adas. Pa a pode analiza dichas mu aciones, un paso impo an e es
gene a colecciones de mu aciones de cDNA en plásmidos de exp esión ap opiados [279],
y la mu agénesis di igida se ha con e ido en el mé odo ideal pa a ealiza es e abo daje.
El desa ollo de la eacción en cadena de la polime asa (PCR), ha supues o un g an a ance
en el desa ollo de p ocedimien os expe imen ales de mu agénesis di igida [287, 288]. La
mu agénesis de sa u ación es una me odología pode osa pa a c ea colecciones de inidas
de a ian es de p o eínas pa a la expe imen ación clínica, y exis en nume osos mé odos
de mu agénesis basados en la PCR [289, 290]. Sin emba go, la e ec i idad se e
comp ome ida cuando se equie e un g an núme o de mu aciones di e en es.
El mé odo de mu agénesis di igida basada en PCR más u ilizado en la ac ualidad es
el mé odo Quikchange. Según es e mé odo, los oligonucleó idos mu agénicos ienen que
ene de e minadas ca ac e ís icas: longi ud en e 25-45 bases, empe a u a de usión
igual o mayo a 78ºC (según la ó mula: Tm= 81.5 + 0.41 (%GC) – (675/N) - % Misma ch;
siendo N el núme o de bases del oligonucleó ido), con enido en GC mínimo de 40%, y
p esencia de una o más bases de C o G en sus ex emos. Los oligonucleó idos esul an es
suelen se la gos, lo que aumen a la posibilidad de c eación de es uc u as secunda ias
que di icul an la eacción de PCR y el cos e de cada mu agénesis.
Se han desa ollado mé odos al e na i os pa a aumen a la e icacia de la
mu agénesis median e PCR [291-293], pe o el diseño es bas an e complejo, los
oligonucleó idos siguen siendo la gos y p esen an unos ele ados cos es y una
me odología compleja. Es as limi aciones son impo an es cuando se necesi a gene a un
núme o ele ado de mu aciones. En es a esis, p opo cionamos una b e e isión de la
u ilidad de mu aciones especí icas en el análisis expe imen al de las unciones de PTEN,
una p o eína ele an e en en e medad. Desc ibimos un mé odo es anda izado, ápido y
simple de mu agénesis pa a ealiza sus i uciones de aminoácidos únicas y múl iples,
basado en el mé odo Quikchange (PCR in e sa de un solo paso y a amien o con la
Discusión
98
enzima de es icción DpnI) (Figu a 22; Tabla 8) [273, 274]. Nues os esul ados, alidados
con a ios ipos de plásmidos y con cDNAs que codi ican dos p o eínas di e en es, indican
que la u ilización de oligonucleó idos mu agénicos es ánda de 29 nucleó idos de
longi ud, independien emen e de su Tm y con enido en G/C, p opo cionan unas
condiciones de ampli icación y mu agénesis e icien es. C eemos que es e mé odo de
mu agénesis di igida es anda izada es en ajoso pa a ob ene un g an núme o de
mu aciones di e en es, y aplicable a cualquie p o eína de in e és, aunque la ampli icación
de cada cDNA puede ene dis in os eque imien os y necesi a op imización.
2. Respues a al ead h ough de los PTCs de PTEN
El gen PTEN es uno de los sup eso es umo ales más impo an es, con una
incidencia global de mu aciones asociadas a cánce sólo supe ada po TP53. Como ocu e
con o os sup eso es umo ales, exis e un g an núme o de mu aciones somá icas y de
línea ge minal en PTEN asociadas a en e medad que in oducen en la p o eína PTC,
p oduciendo p o eínas uncadas e ines ables que no son capaces de inhibi la
p oli e ación celula o p omo e la apop osis (Figu a 15 y 17). La e apia sup eso a de
mu aciones nonsense gene ado as de PTC es capaz de sup imi la e minación de la
aducción causada po dichas mu aciones median e el uso de agen es a macológicos,
como algunos an ibió icos aminoglucósidos, pe mi iendo el ead h ough del PTC. Se han
lle ado a cabo una g an a iedad de es udios donde se demues a la e icacia de los
compues os induc o es de ead h ough en modelos expe imen ales de di e sas
en e medades gené icas, como la dis o ia muscula de Duchenne (DMD) y la ib osis
quís ica (CF), en e o as [207, 210, 215, 217, 219]. En el caso del cánce , se ha e aluado el
po encial del ead h ough de a ios PTC que a ec an a los genes sup eso es umo ales
TP53 y APC, con esul ados p ome edo es en la es au ación uncional de ambos genes
[208, 218, 249, 261]. Sin emba go, has a la ealización de nues o abajo, no se habían
lle ado a cabo es udios de ead h ough en PTEN.
Discusión
99
En es e abajo hemos de inido la colección de mu aciones PTC (PTCome) de PTEN
asociadas a en e medad, y hemos ealizado un análisis del ead h ough aduccional y
uncional del conjun o de PTC hallados en la línea ge minal de pacien es PHTS (15 PTC se
han encon ado en la línea ge minal de pacien es PHTS, y 55 PTC se han encon ado en la
línea ge minal de pacien es y en mues as de umo es espo ádicos) (Figu a 23).
U ilizando la gene icina (G418) como un induc o óp imo de ead h ough, los
esul ados ob enidos indican un pa ón he e ogéneo de la espues a del ead h ough pa a
los di e en es PTC de PTEN, ob eniendo un ango de inducción de ead h ough en e 0% y
30% con espec o a la exp esión de PTEN ipo sal aje. De odos los PTC analizados, 12 PTC
(17%) mos a on una e iciencia óp ima-subóp ima de ead h ough (>10% de exp esión),
13 PTC (18,6%) mos a on una e iciencia de ead h ough baja (5%-9% de exp esión), y 45
PTC (64,3%) una e iciencia del ead h ough muy baja (0%-4% de exp esión) (Tabla 9). A
pesa de la g an a iabilidad a la espues a a G418, hemos obse ado que los es codones
de e minación no son igualmen e suscep ibles a ead h ough: en gene al, los PTC de TGA
p oducen ni eles de ead h ough más al os, seguidos de TAG y TAA (Figu a 27). La
mayo ía de los PTC con una e iciencia de ead h ough óp ima-subóp ima ue on PTC TGA
(62,5%), seguido de TAG (37,5%) y TAA (0%) (Tabla 9). Es o es á en línea con o os
es udios compa a i os de ead h ough en los cuales el o den de e icacia de lec u a de los
PTC e a: TGA>TAG>TAA [235, 251, 253]. La p esencia de Cis eína (C) en la posición +4
(nucleó ido +1 después del PCT) y una Adenina (A) en la posición -1 se ha p opues o como
o os ac o es a ene en cuen a a la ho a de mejo a la e iciencia del ead h ough [242,
294]. Nues os esul ados indican que el nucleó ido +4 C a o ece el ead h ough, pe o
sólo con una secuencia con ex o de nucleó idos ap opiada y con algunos aminoglucósidos
induc o es de ead h ough.
La inco po ación du an e la lec u a aduccional de aminoácidos codi icados po
codones a ines con espec o al codón con la mu ación PTC puede a ec a a la
uncionalidad de la p o eína esul an e [212, 214, 280]. Es o es c ucial en el caso de
p o eínas como PTEN, que mues an unciones de e io adas a causa de una g an a iedad
de sus i uciones de un solo aminoácido a lo la go de la secuencia. Pa a analiza
uncionalmen e las a ian es de PTEN p oducidas po ead h ough, hemos enido en
cuen a la ecuencia de inco po ación de aminoácidos pa a cada ipo de PTC [TGA: A g (R),
64.5%; Cys (C), 17.7%; T p (W), 17.9%. TAG: Gln (Q), 86.5%; Ty (Y), 10.8%; Lys (K), 2%.
Discusión
100
TAA: Gln (Q), 52%; Ty (Y), 47.9%] (Roy 2016), y hemos ealizado expe imen os
uncionales con las posibles a ian es de PTEN gene adas, asignando a cada una un
Func ional Sco e (FS) ela i o. De odas las mu aciones PTC de la línea ge minal de PTEN,
un 57% (40 PTC) mos a on ac i idad uncional simila a PTEN ipo sal aje pa a cualquie
aminoácido que se inco po e du an e la lec u a aduccional (FS=1); 39% (27 PTC) mos ó
ac i idad uncional educida (FS=0.5) o nula (FS=0) pa a alguno de los aminoácidos que se
inco po an, y 4% (3 PTC) muy poca o ausencia de ac i idad uncional (FS=0) (Tabla 10).
Todas las a ian es R233 y R335 mos a on una ac i idad uncional pa ecida a PTEN ipo
sal aje, a excepción de la mu ación R335W que mos ó una ac i idad uncional educida.
Las a ian es R130 y los PTC R130X, R233X y R335X no mos a on ac i idad uncional
(FS=0) (Figu a 28). Hemos de inido una pun uación de la e iciencia uncional del
ead h ough, que iene en conside ación an o la espues a aduccional del ead h ough,
como la ac i idad uncional de las p o eínas gene adas po ead h ough de dichas
mu aciones. Es a pun uación de la e iciencia uncional del ead h ough co ige el
po encial de econs i ución uncional de PTEN de algunos PTC, cuyos alo es de
ead h ough son óp imos o subóp imos (Figu a 29, Tabla 10). El 86% (60 PTC) mos a on
una pun uación de la e iciencia uncional del ead h ough meno de 10; un 10% (7 PTC)
mos a on una pun uación en e 10 y 20; y 4% (3 PTC) ob u ie on una pun uación
uncional en e 20 y 30. Los PTC más ecuen es, R130X, R233X y R335X, mues an una
pun uación la e iciencia uncional del ead h ough de 12.6, 25.2 y 15.5, espec i amen e,
lo que indica que pod ían se PTC a o ables pa a e apias basadas en ead h ough. La
econs i ución uncional de PTEN incluso se log ó en el caso de PTC di igida a esiduos
esenciales, como el esiduo ca alí ico R130 que es al amen e sensible a la pé dida de
unción po la sus i ución de aminoácidos. Es o puede explica se po la inco po ación
ela i a de al a ecuencia, du an e el ead h ough de algunos PTC, del aminoácido de ipo
sal aje (Tabla 11, [234]).
En gene al, es os hallazgos sugie en que el a amien o con induc o es de
ead h ough es una al e na i a p ome edo a a la e apia génica pa a pacien es
po ado es de mu aciones nonsense en genes ele an es. Nues o análisis puede
con ibui a la de e minación de qué pacien es poseen una mayo p obabilidad de
bene icia se de un posible a amien o de p ecisión. Sin emba go, la aplicabilidad del
ead h ough depende á del ipo de mu ación, la ubicación del PTC, el con ex o celula y la
na u aleza del gen. Además, hay que ene en cuen a que nues o análisis se ha lle ado a
cabo usando, p incipalmen e, G418, un compues o induc o de ead h ough óxico. El uso
Discusión
101
p olongado de o os induc o es, como la gen amicina, ambién p oduce impo an es
e ec os secunda ios [270, 271, 295], po lo que es necesa ia la iden i icación y alidación
de á macos induc o es de ead h ough con meno oxicidad. A es e espec o, han sido
descubie os o os compues os induc o es de la lec u a aduccional pa a as o nos
gené icos causados po mu aciones nonsense [219]. Amlexanox, un agen e
an iin lama o io que se adminis a po ía o al o ópica pa a a a el asma, ue
descubie o pa a inhibi la ía NMD e induci la lec u a de PTC [269]. Es e compues o es
menos óxico y ac i o a concen aciones más bajas que las eque idas pa a la gene icina.
También se ha descubie o que la cli ocina puede induci la lec u a aduccional dos o es
eces más que la gen amicina y gene icina [220, 268]. También se ha iden i icado la
enilpi azolanilida (Y-320), un compues o que cuando se combina con G418 aumen a la
e iciencia del ead h ough [296], y la 2,6-diaminopu ina (DAP), un compues o con una al a
e iciencia de co ección pa a mu aciones nonsense [297].
O o obs áculo en el desa ollo de e apias sup eso as de mu aciones nonsense es
el ni el mínimo de p o eína uncional necesa ia pa a alcanza ni eles e apéu icos.
Di e en es en e medades poseen un umb al e apéu ico dis in o. Se han desc i o
di e en es inhibido es de la ía NMD, como la ca eína, el inhibido SMG1 quinasa o NMD1,
que aumen an la can idad de mRNA po ado del PTC. Jun o con los induc o es de
ead h ough pueden aumen a la can idad de p o eína uncional [219, 269, 298, 299]. Sin
emba go, en muchos casos es a es a egia no es au a la uncionalidad de las p o eínas ya
que ca ecen de dominios c uciales.
3. Análisis global de mu aciones missense de la línea ge minal de PTEN
asociadas a ASD y PHTS
El gen PTEN se encuen a mu ado en la línea ge minal de pacien es con sínd omes
de cánce he edi a io, ca ac e izados po as o nos en el desa ollo, de iciencias
neu ológicas, desa ollo de hama omas múl iples, y con una mayo p edisposición a
desa olla cánce de mama y i oides, en e o os. Es os sínd omes se ag upan bajo el
e mino sínd ome hama oma umo al de PTEN (PHTS). También se han encon ado
mu aciones en la línea ge minal de PTEN en indi iduos con mac oce alia, e a do en el
desa ollo y deso denes del espec o au is a (ASD) [9, 130, 148].
Discusión
102
En es e abajo hemos c eado y analizado uncionalmen e 208 mu aciones missense
de la línea ge minal de PTEN. Se han analizado dichas mu aciones ag upándolas en dos
g upos: mu aciones de la línea ge minal de pacien es con PHTS (133 mu aciones) y
mu aciones de la línea ge minal de pacien es con ASD y pacien es con ASD-PHTS (75
mu aciones) (Figu a 32). Al ededo de un 14% de mu aciones missense se han encon ado
an o en la línea ge minal de pacien es con PHTS como de pacien es con ASD. Las
mu aciones missense se dis ibuyen a lo la go de los dominios PTP y C2, siendo
dominan es en el dominio PTP an o en pacien es PHTS como ASD (Figu a 32B). La
ecuencia ela i a ap oximada de mu aciones indi iduales a lo la go de la secuencia de
aminoácidos de PTEN es dis in a en pacien es PHTS y ASD; sin emba go, las ecuencias
ag upadas en el dominio PTP y C2 son simila es en pacien es PHTS y ASD (Figu a 33).
PTEN es á codi icado po un único gen, pe o la aducción al e na i a de su mRNA
p oduce a ias iso o mas p o eicas: PTEN (iso o ma p edominan e) y o as p o eínas con
ex ensiones N- e minales (PTEN-L, p incipalmen e), las cuales di ie en en la localización
subcelula y p opiedades uncionales [6]. Aunque oda ía se desconoce la pene ancia de
las mu aciones de PTEN en pacien es ASD y PHTS, en é minos de p edisposición umo al,
se pueden hace p edicciones basadas en las p opiedades uncionales de las a ian es de
PTEN. Sin emba go, no hay es udios globales de cómo mu aciones asociadas a PHTS y ASD
pueden a ec a a la unción de PTEN-L.
En es e abajo hemos analizado uncionalmen e las mu aciones missense de PTEN
asociadas a la línea ge minal, u ilizando el sis ema he e ólogo de la le adu a como una
pla a o ma de al o endimien o pa a e alua la ac i idad os a asa PIP3 de PTEN y PTEN-L
(Tabla 12). El análisis ealizado en PTEN, e leja una mayo pé dida de ac i idad uncional
en pacien es PHTS que en ASD-PHTS, an o con los da os ob enidos po la localización
GFP-Ak en la memb ana plasmá ica como con los da os ob enidos po la moni o ización
del ensayo de c ecimien o de le adu a. Casi un 60% de las mu aciones de la línea
ge minal de PTEN de pacien es PHTS y un 50% de las mu aciones de la línea ge minal de
PTEN de pacien es ASD-PHTS no p esen an ac i idad uncional, en e a un 31% de
mu aciones de pacien es ASD (Figu a 34). Es os da os co obo an nues so es udios
p e ios, y los da os de o os labo a o ios, con un núme o más educido de mu aciones , y
que sugie en que, en gene al, las mu aciones en PTEN que a ec an al neu odesa ollo
pod ían ene impac o pa ogénico menos g a e elacionado con el cánce .
Discusión
103
Po o a pa e, la compa ación del impac o uncional de un g upo de mu aciones en
PTEN y en PTEN-L indica una mayo ole ancia de PTEN-L a la pé dida de unción. En el
g upo de mu aciones de pacien es ASD, el 30% de mu aciones p esen aban ac i idad
uncional en PTEN en e a un 43% de ac i idad uncional en PTEN-L, y en el g upo de
mu aciones de pacien es ASD-PHTS, el 7% de mu aciones p esen aban ac i idad en PTEN
en e a un 16% de mu aciones con ac i idad uncional en PTEN-L (Figu a 36; Tabla 12).
Es os esul ados se pod ían explica , al menos en pa e, po la mayo es abilidad
in ínseca a ibuida a PTEN-L, en compa ación con PTEN [28], ya que muchas mu aciones
pa ogénicas a ec an a la es abilidad p o éica de PTEN [28] (nues os esul ados no
publicados). Además, ambién se ha a ibuido una mayo ac i idad ca alí ica cons i u i a a
PTEN-L, en compa ación con PTEN. En esumen, hemos obse ado que PTEN-L es menos
suscep ible a se al e ado po mu aciones po encialmen e pa ogénicas que PTEN, lo que
pod ía ene epe cusiones impo an es en es os g upos de pacien es [28] [300].
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