Mediadores moleculares en enfermedades cardiovasculares: un estudio en saliva y placenta

Leioa, 2024ko ekainaren 19a /Leioa, 19 de junio de 2024 Gradu Amaierako Lana / Trabajo Fin de Grado Bioteknologiako Gradua / Grado en Biotecnología Mediadores moleculares en enfermedades cardiovasculares Un estudio en saliva y placenta Egilea/Autor/a: Uxue Abarrategi Gomez Zuzendaria/Director/a: Nora Fernandez-Jimenez, Iraia Garcia Santisteban © 2024, Uxue Abarrategi Gomez I ÍNDICE 1. RESUMEN ......................................................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 2 2.1 Enfermedades cardiovasculares .............................................................................. 2 2.2 GWAS ........................................................................................................................ 3 2.3 Placenta, saliva y metilación de ADN ..................................................................... 3 2.4 Aleatorización mendeliana ...................................................................................... 5 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................... 6 4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 6 4.1 Bases de datos ........................................................................................................... 6 4.2 GWAS seleccionados ................................................................................................ 6 4.3 SMR ........................................................................................................................... 7 4.4 Reactome y búsqueda bibliográfica ........................................................................ 8 5. RESULTADOS ................................................................................................................. 8 5.1 Resultados SMR ....................................................................................................... 8 5.2 Resultados Reactome ............................................................................................. 12 6. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 12 7. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 16 8. AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. 17 9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 17 10. ANEXOS .......................................................................................................................... 21 1 1. RESUMEN Las enfermedades cardiovasculares como la enfermedad de las arterias coronarias, la fibrilación auricular, el infarto de miocardio y el ictus continúan siendo la mayor causa de mortalidad a nivel mundial. Aunque la prevalencia de las enfermedades cardiovasculares en la población es alta, los mecanismos subyacentes a estas condiciones son poco conocidos. En estas enfermedades, consideradas enfermedades complejas, la genética representa un factor de riesgo significativo. En este trabajo, con el objetivo de conocer si existe una relación potencialmente causal entre la metilación del ADN y el desarrollo de las enfermedades descritas, realizamos un análisis de aleatorización mendeliana combinando datos de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) en las enfermedades mencionadas con datos de loci cuantitativos de metilación (mQTLs) de placenta y saliva. El análisis de la placenta sugiere que la metilación del ADN adyacente a los genes IL6R, CAMK2G, FES, PITX, FURIN, COLA41 y COLA42 induce cambios estructurales en el corazón y el sistema vascular durante el desarrollo prenatal, los cuales potencian el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares en la vida adulta. Estos resultados revelan el gran potencial del epigenoma de la placenta como mediador en la patogénesis de diversas enfermedades cardiovasculares. Por su parte, el análisis realizado con mQTLs de la saliva identifica el gen SLC25A44 como posible gen candidato relacionado con el ictus, pudiendo servir como biomarcador diagnóstico en este tipo de muestra que puede obtenerse de manera no invasiva. Estos resultados iniciales destacan la validez de este tipo de estudios en la comprensión de la etiopatogenia de estas enfermedades complejas y resaltan la necesidad de futuras investigaciones en el ámbito. 2 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Enfermedades cardiovasculares Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo, y se estima que 17,9 millones de personas mueren por su causa cada año. Estas enfermedades son un grupo de trastornos del corazón y los vasos sanguíneos e incluyen la enfermedad de las arterias coronarias (EAC), la fibrilación auricular (FA), el infarto agudo de miocardio (IM) y el ictus, entre otras. Más de cuatro de cada cinco muertes por ECV se deben a cardiopatías coronarias e ictus, y un tercio de estas muertes ocurren prematuramente en personas menores de 70 años (Organización Mundial de la Salud [OMS], 2021). En particular, la EAC es una de las enfermedades cardiovasculares más comunes y mortales. Las arterias coronarias son obstruidas por placas ateroscleróticas que impiden el paso de la sangre, el oxígeno y los nutrientes al corazón, lo que puede resultar en un IM, que puede llegar a provocar la muerte. La hipertensión, la diabetes y el tabaquismo son los principales factores de riesgo (Steffensen y Rasmussen, 2018). Gracias a los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) se han identificado una gran cantidad de loci genómicos, más de 200, asociados a la EAC y al IM. Algunos de estos genes y las rutas metabólicas en las que participan ya son dianas terapéuticas; por ejemplo, los relacionados con el metabolismo de los lípidos, la regulación de la presión arterial, la inflamación y la función plaquetaria (Hartiala et al., 2021). La FA es el tipo de arritmia más común y se caracteriza por la frecuencia y ritmo irregular del latido del corazón. Tiene una prevalencia global del 2-4% y sus factores de riesgo son la edad avanzada, el sexo masculino, la obesidad, el tabaquismo y otras enfermedades cardiovasculares. Además, la FA aumenta el riesgo de ictus, demencia y depresión. Aun así, los mecanismos moleculares de esta enfermedad son poco conocidos. Se estima que las variantes genéticas tienen un impacto de alrededor del 22% en el riesgo de padecer la enfermedad. Mediante GWAS se han identificado más de un centenar de loci relacionados con la FA, de los cuales muchos se encuentran en regiones no codificantes del genoma, lo que sugiere que podrían modular la regulación transcripcional (Liu et al., 2021). Por último, el ictus es la segunda causa de muerte en el mundo. Caracterizado por un déficit neurológico de aparición súbita, el ictus está causado principalmente por un infarto cerebral (ictus isquémico) y, con menor frecuencia, por una hemorragia intracerebral. Entre los factores de riesgo destacan los previamente mencionados en las demás enfermedades, así como la diabetes, la hipertensión arterial y diferentes enfermedades cardiacas (Malik et al., 2018). Hasta 3 el momento, estudios de GWAS en grupos de ascendencia predominantemente europea han identificado diez loci asociados con esta enfermedad. Malik et al. (2018) identificaron 22 nuevos loci de riesgo de ictus que eran comunes con múltiples rasgos vasculares como la presión sanguínea. 2.2 GWAS Las enfermedades cardiovasculares mencionadas son enfermedades complejas en las que interaccionan factores ambientales y genéticos. En estas enfermedades influyen variantes del ADN en numerosos loci distribuidos por todo el genoma. Dado que estas variantes suelen tener efectos pequeños y no siguen patrones de herencia mendeliana, su estudio requiere de aproximaciones a gran escala y basadas en la población, como los estudios de asociación de genoma completo o GWAS. Estos estudios analizan millones de variantes genéticas en muchos individuos para encontrar las significativamente asociadas a un rasgo o enfermedad compleja. Pueden tener en cuenta variantes en el número de copias o variaciones en la secuencia del genoma humano, aunque las variantes genéticas más estudiadas en los GWAS son los polimorfismos de nucleótido único (Single-Nucleotide Polymorphisms o SNPs) (Uffelmann et al., 2021). Un SNP es una variación común en la secuencia de ADN que ocurre cuando se altera un solo nucleótido en al menos el 1 % de la población. Para analizar los genomas se genotipa o secuencia un grupo de individuos con arrays de genotipado o métodos de secuenciación en busca de variantes genómicas que aparezcan con mayor frecuencia en quienes padecen una enfermedad o rasgo específico, en comparación con quienes no presentan dicha enfermedad o rasgo (Uffelmann et al., 2021). 2.3 Placenta, saliva y metilación de ADN La modificación epigenética más conocida hoy en día es la metilación del ADN, que consiste en la adición de un grupo metilo en la citosina de un dinucleótido CpG, esto es, en una citosina y una guanina unidas entre sí por un fosfato. Se cree que la metilación en una isla CpG del promotor de un gen hace que la expresión de ese gen se inhiba. Las diferencias interindividuales en los patrones de metilación del ADN se han implicado en el desarrollo de patologías humanas y se cree que reflejan condiciones ambientales que modulan el riesgo genético, sirviendo como una importante vía para la interacción entre genes y entorno (Nishitani et al., 2018). Dado que la metilación del ADN es específica de tejido, resulta fundamental estudiar los patrones de 4 metilación de cada tejido. La placenta es el órgano que une a la madre y al feto durante el desarrollo fetal. En las células de la placenta, como en cualquier otra célula, se dan modificaciones epigenéticas en el ADN. La metilación del ADN en la placenta ha sido relacionada con el peso al nacer, de manera que algunos genes del metabolismo de la glucosa están regulados epigenéticamente y sus niveles de metilación difieren en grupos de individuos de diferente peso al nacer (Mao et al., 2017). A su vez, el bajo peso al nacer ha sido relacionado con un mayor riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular, entre ellas el ictus, el IM y la EAC (Huang et al., 2022). Tekola‐ Ayele et al. (2020) identificaron 15 CpGs cuyos niveles de metilación estaban significativamente asociados con el peso al nacer. Algunos de los loci asociados al peso al nacer desempeñan funciones clave en los procesos de desarrollo y se han asociado a enfermedades cardiometabólicas. Por lo tanto, la identificación de los genes regulados epigenéticamente en la placenta puede ser importante para comprender los mecanismos moleculares que vinculan el peso al nacer con enfermedades cardiometabólicas posteriores. La saliva es un tejido que se puede obtener de manera no invasiva y puede servir como tejido espejo cuando no se dispone del tejido diana, como en el caso del corazón (Nishitani et al., 2018). Conocer la metilación de ADN vinculada a la variación genética asociada a enfermedades podría contribuir a la mejor comprensión de la etiología de las mismas, y quizá también a la búsqueda de marcadores predictivos no invasivos. En los últimos años, múltiples estudios han revelado que la metilación del ADN en loci específicos puede estar influida por variaciones en la secuencia, de forma que genotipos individuales en un locus concreto pueden dar lugar a diferentes patrones de metilación del ADN debido a la metilación específica de alelos. Estos sitios se denominan loci de rasgo cuantitativo de metilación (mQTLs) y pueden influir en el patrón de metilación a lo largo de una región genómica (Smith et al., 2014). De la misma forma, los SNPs asociados a la expresión génica se denominan loci de rasgo cuantitativo de expresión (eQTL), y pueden contribuir al nivel de expresión de genes adyacentes o incluso de cromosomas distintos. Cabe destacar que Oliva et al. (2022) concluyeron que los mQTLs contribuyen a un mayor número de asociaciones con enfermedades y rasgos que los eQTLs. Esto se debe a la diferencia en el extenso número de islas CpG (alrededor de 28 millones) en comparación con los genes expresados en el genoma (alrededor de 20.000). Por tanto, los mQTLs pueden revelar vínculos moleculares con rasgos que pasarían desapercibidos en estudios de eQTL-GWAS. 5 2.4 Aleatorización mendeliana La aleatorización mendeliana (MR, por sus siglas en inglés, Mendelian Randomization) es una aplicación ampliamente utilizada en el campo de la epidemiologia, que utiliza variantes genéticas, comúnmente SNPs, como variables instrumentales para inferir si un factor de riesgo afecta causalmente a un resultado de salud (Bowden y Holmes, 2019). Esto se debe a que los alelos de estos SNPs se distribuyen de manera aleatoria entre la población y no están influenciados por factores de confusión. Esto es, el principio de MR se basa en la ley de Mendel de la segregación independiente de alelos cuando los alelos de cada gen que van a ser transmitidos a la descendencia segregan de manera independiente a los gametos (Larsson et al., 2023). Por lo que la aleatorización se da de manera natural en los sujetos que participan en el estudio. Entre los métodos de MR, SMR (Summary-based Mendelian Randomization) destaca como una de las variantes más empleadas. SMR integra estadísticos de resumen de GWAS con datos de estudios de eQTLs o mQTLs con el fin de identificar asociaciones pleiotrópicas que podrían ser potencialmente causales entre mediadores moleculares como la expresión génica o la metilación del ADN y enfermedades. Cuando una asociación es pleiotrópica la expresión génica/metilación del ADN y la enfermedad se ven afectados por la misma variante, por su parte, cuando una asociación es causal, el efecto de la variante en la enfermedad esta medida por la expresión génica/metilación del ADN. En el caso concreto del presente estudio, este método puede interpretarse como un análisis para probar si el tamaño del efecto de un SNP sobre el fenotipo está mediado por la metilación del ADN de una CpG en uno o varios tejidos. Figura 1. Diseño de análisis SMR. SMR integra estadísticos de resumen de GWAS con datos de estudios de mQTLs para estudiar si el tamaño del efecto del SNP en la enfermedad está mediado por la metilación de una posición CpG, y probablemente, por su efecto sobre la transcripción de un gen. Creado con BioRender.com. 6 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS En este contexto, nuestra hipótesis es que parte de la susceptibilidad genética a las enfermedades EAC, FA, IM e ictus actúan mediante la metilación de ADN de la placenta en etapas prenatales, o bien por medio de la metilación de ADN en algún otro tejido adulto representado por la saliva. Por lo tanto, nuestro objetivo es identificar relaciones potencialmente causales entre la metilación de ADN en la placenta y la saliva y las cuatro enfermedades cardiovasculares mencionadas anteriormente mediante la aleatorización mendeliana. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Bases de datos Las bases de datos de mQTL de saliva y placenta, son propias del Grupo de Investigación. Los mQTLs de placenta se calcularon en 368 muestras de este órgano fetal, provenientes del proyecto Infancia y Medio Ambiente (INMA) del que forman parte los/as investigadores/as del Grupo IRLab. Se obtuvieron los datos de metilación del ADN de la placenta y de genotipado de genoma completo mediante los arrays EPIC y GSA de Illumina, respectivamente. Una vez realizado el control de calidad y la normalización de los datos, los mQTLs se calcularon con el software TensorQTL (Taylor-Weiner et al., 2019), utilizando como covariables el sexo del feto, los cinco primeros componentes principales (PCs) de los datos de genotipado, la estimación de la proporción de los diferentes tipos celulares que componen la placenta, y los 18 primeros componentes principales de los datos de metilación. La base de datos de placenta se ha publicado en un preprint y se encuentra en cuarta revisión en la prestigiosa revista Nature Communications (Cilleros-Portet et al., 2023). Los mQTLs de saliva se calcularon utilizando el mismo protocolo en 348 muestras salivares. En este caso, las covariables utilizadas fueron los cinco primeros PCs de los datos de genotipado, los 9 PCs de metilación, la edad y el sexo. 4.2 GWAS seleccionados Se seleccionó un GWAS para cada una de las cuatro enfermedades estudiadas. Para ello, se realizó la búsqueda de estos estudios en GWAS Catalog (https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Como criterios de selección se tuvieron en cuenta, por un lado, el tamaño muestral del estudio, con el fin de tener el mayor poder estadístico posible y, por tanto, una mayor probabilidad de obtener resultados significativos. Por otro lado, se priorizaron los estudios no provenientes de bases de 7 datos de biobancos, ya que estos utilizan a la población general y por lo general, registran un número escaso de casos incluso en enfermedades de relativa alta prevalencia. Además, se verificó que los GWAS seleccionados disponían de resúmenes estadísticos accesibles con todos los parámetros y datos imprescindibles para poder hacer un análisis de SMR incluyendo número de SNPs, alelo de referencia, valor de β o tamaño del efecto del alelo de referencia, valor de p, información sobre el genoma de referencia utilizado y número de casos y controles. Antes de analizar los GWAS y mQTLs con SMR, fue necesario formatear los GWAS mediante RStudio dado que SMR requiere un formato concreto. El formateo de estos datos se realizó mediante un script propio creado por el IRLab. A través de este script en primer lugar, se verificó que las columnas de los datos de GWAS eran reconocidas por el programa. En caso contrario, se les asignaros los nombres adecuados a las columnas no reconocidas. En ocasiones, fue necesario calcular nuevas variables que el propio GWAS no incorporaba. Además, se añadieron tanto el número de casos como el de controles, y el de participantes totales. Por último, se comprobó que los datos estuviesen anotados en la versión 37 del genoma humano (Genome Reference Consortium human 37 - GRCh37) y se cambió los que estaban en GRCh38, con el objetivo de que los GWAS y los mQTLs fuesen compatibles. 4.3 SMR SMR es un método para identificar asociaciones pleiotrópicas o potencialmente causales entre mediadores moleculares como la expresión génica o la metilación del ADN, y enfermedades o rasgos complejos. En nuestro caso utilizamos cuatro enfermedades cardiovasculares muy prevalentes y la metilación del ADN de placenta o saliva como mediador molecular, utilizando para ello resúmenes estadísticos de los GWAS más grandes y representativos de esas enfermedades y nuestras bases de datos de mQTLs de los tejidos arriba mencionados. El análisis se llevó a cabo con el software SMR (Zhu et al., 2016). Como resultado, se obtuvieron los posibles mediadores moleculares para las distintas enfermedades. El software SMR integra un test llamado HEIDI (HEterogeneity In Depedent Instruments) para distinguir la pleiotropía y el ligamiento. La probabilidad de ligamiento es inversamente proporcional al valor de HEIDI, ya que la detección de heterogeneidad significativa indica una menor probabilidad de ligamiento entre dos SNPs, uno relacionado con la metilación del ADN y el otro proveniente de un GWAS y asociado con la enfermedad. Esto refuerza la posibilidad de que ambos SNPs estén relacionados con el mismo rasgo. Además, el valor p obtenido del análisis de SMR se corrigió por Bonferroni. Este ajuste divide 14 enfermedades. El gen MIA3, también conocido como TANGO, codifica para una proteína cuya función es todavía desconocida. Este gen aumenta el riesgo de padecer ambas enfermedades mediante vías inflamatorias relacionadas con la aterosclerosis. En estudios experimentales, se ha demostrado que la proteína TANGO modula la actividad de la integrina β2 CD11c/CD18, reduciendo la adherencia y promoviendo la migración de monocitos a través del endotelio, lo que contribuye a la formación de la estría grasa en la aterosclerosis (Rayat et al., 2022). La metilación del ADN en este gen podría regular la síntesis de la proteína y por ende la aterosclerosis. Respecto al gen FES, es el más repetido en ambas enfermedades y como se muestra en la Tabla 2, el efecto de un SNP puede estar mediado por múltiples CpGs cercanas al gen. FES es un protooncogén que codifica para una tirosina quinasa implicada en la regulación de mecanismos celulares como la inflamación, la proliferación, el movimiento celular, la diferenciación y la supervivencia celular. Karamanavi et al. (2022) concluyeron que este gen protege frente a la aterosclerosis, identificando dos SNPs potencialmente causales con dicha protección. Concretamente, uno de los SNPs que describieron en este artículo fue rs17514846-A, que se asocia con la reducción de la expresión del gen FES y con la sobreexpresión del gen FURIN, adyacente a FES. FURIN ha sido relacionado con el desarrollo de aterosclerosis y, además, en los resultados de Reactome para la EAC, participa en las rutas metabólicas relacionadas con la síntesis de colágeno y la matriz extracelular. La aterosclerosis se caracteriza por la acumulación en las arterias de lípidos, células y matriz extracelular, de la cual el colágeno es el principal componente. En conclusión, podemos decir que esa región genómica potencia el riesgo de la EAC y del IM. Los SNPs con efecto en el gen FES han sido asociados con el peso al nacer y simultáneamente con la metilación del ADN en la placenta por Tekola‐Ayele et al. (2022). En este estudio, se sugiere que la asociación entre los SNPs del GWAS y el peso al nacer podrían estar mediados por la metilación del ADN de la placenta que afecta a la transcripción de este gen en particular. El peso al nacer está asociado con el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares en la vida adulta. Las condiciones adversas durante las primeras etapas del desarrollo fetal pueden provocar cambios metabólicos, fisiológicos y estructurales irreversibles, los cuales aumentan el riesgo de padecer enfermedades, entre ellas cardiovasculares, en etapas posteriores. Dentro de esas condiciones adversas se ha mencionado principalmente la malnutrición durante el embarazo, pero también diferentes factores genéticos y epigenéticos como podría ser la metilación del ADN (Mohseni et al., 2020). 15 Además de examinar los genes cercanos a las CpGs identificadas de manera individual, se llevó a cabo un análisis en Reactome para examinar las rutas metabólicas en las que participan estos genes y que podrían estar reguladas por la metilación del ADN. La lista de genes que han mostrado resultados significativos para la EAC muestra alta significación estadística en rutas biológicas de síntesis de colágeno y organización de la matriz extracelular, en las que participan los genes COL4A1, COL4A2 y FURIN entre otros. COL4A1 y COL4A2 codifican para dos subunidades del colágeno de tipo IV, proteína que forma parte de la membrana basal. Ésta es fundamental para la angiogénesis o síntesis de vasos sanguíneos que se da en la zona hipóxica de las placas ateroscleróticas. Una expresión alterada del colágeno de tipo IV puede desregular la angiogénesis, pudiendo provocar hemorragias y desestabilización de la placa aterosclerótica, siendo un riesgo para padecer EAC (Steffensen y Rasmussen, 2018). De acuerdo con los resultados obtenidos, la expresión de estos genes podría estar mediada por la metilación del ADN en la placenta. Estos genes, además, han sido relacionados con el desarrollo fetal. Como se ha mencionado, el colágeno de tipo IV forma parte de la membrana basal. Aun así, se ha visto que no es imprescindible durante el desarrollo temprano del corazón, pero si esencial para mantener la integridad estructural de estas membranas en etapas posteriores, donde la demanda mecánica es mayor. La deficiencia de colágeno de tipo IV se refleja en la baja estabilidad de las membranas basales para mantener sus funciones de barrera durante la proliferación progresiva de las células y la diferenciación y expansión de las capas celulares. Esto puede generar complicaciones como la hemorragia vascular en el corazón y las arterias, ya que los contactos célula-célula no son suficientes para estabilizar la arquitectura del tejido (Pöschl et al., 2004). Por otra parte, en la FA, la ruta metabólica más significativa fue la regulación transcripcional por los factores de transcripción de la familia AP-2 (TFAP2). Las dianas clásicas de esta familia son los genes ERBB2 y PITX2, los cuales contribuyen al enriquecimiento de esta ruta en nuestros datos. En este sentido, el gen ERBB2 es un protooncogén que está relacionado con el cáncer. La placenta y el cáncer son dos tejidos invasivos que muestran gran similitud entre sí. La placenta está organizada como una gran masa de clones tumorales, con divisiones celulares rápidas que seleccionan las células óptimas para formar el bebé (Costanzo et al., 2018; Coorens et al., 2021). La expresión reducida del gen PITX2 durante el desarrollo, por su parte, induce la FA al reducir la expresión de los genes de los canales de potasio y calcio, cruciales en la generación de los 16 impulsos eléctricos en el corazón, incrementando el riesgo de desórdenes del ritmo cardíaco (Van Ouwerkerk et al., 2020). Además, una isla CpG próxima al gen PITX2 se encuentra hipermetilada en pacientes con FA, y en consecuencia la expresión de este gen es menor. Dado que el gen PITX2 es importante en el desarrollo del corazón, la metilación del ADN en la placenta podría contribuir en la temprana predisposición a la enfermedad. Por último, en cuanto al IM, las rutas metabólicas más significativas fueron las relacionadas con la proteína semaforina 3A (Sema3A). Después de un IM se produce una lesión en el tejido cardiaco que desencadena la remodelación cardiaca para intentar reparar el tejido. Una remodelación adversa puede llevar a complicaciones como las arritmias ventriculares. La sobreexpresión de la proteína Sema3A en la zona del infarto parece tener un efecto protector al reducir la respuesta arritmogénica y el remodelado neural después de un IM (Yang et al., 2016). En el desarrollo fetal del corazón, esta proteína también se encuentra sobreexpresada y al igual que después de un IM, confiere protección contra las arritmias (Kimura et al., 2012). Las limitaciones de este estudio son por un lado que no podemos distinguir entre causalidad y pleiotropía. Para establecer relaciones causales entre los resultados obtenidos y la enfermedad se tendrían que llevar a cabo otro tipo de estudios, como por ejemplo modulación de la expresión o metilación del ADN mediante CRISPR/Cas9 in vitro. Además, la relación entre CpGs y genes se da por cercanía física, sin tener en cuenta la estructura tridimensional del ADN, por lo que dichas CpGs no tienen por qué participar en la regulación de los genes adyacentes, pudiendo dar lugar a falsos genes candidatos. Sería interesante combinar los resultados obtenidos con datos de conformación de la cromatina para ver qué parejas de SNP-CpG alejadas en la conformación lineal podrían encontrarse cerca en el espacio tridimensional. Por otro lado, el epigenoma de la saliva puede no reflejar directamente los cambios epigenéticos del tejido cardiovascular. Por último, el análisis del epigenoma proporciona información de un momento preciso, lo cual puede ser interesante en la placenta, ya que da información sobre el desarrollo fetal, pero en la saliva es difícil determinar cuáles podrían ser las células efectoras que participan realmente en la etiología de la enfermedad. Sin embargo, los mediadores moleculares en saliva podrían constituir biomarcadores no-invasivos de las enfermedades estudiadas. 7. CONCLUSIONES Este estudio sugiere que la metilación del ADN puede mediar la susceptibilidad genética de las enfermedades EAC, FA, IM e ictus. En concreto, la metilación de las CpGs identificadas en la placenta en etapas prenatales puede influir en el desarrollo de las enfermedades mencionadas, 17 ya que durante el desarrollo del feto pueden darse cambios estructurales en el sistema cardiovascular que aumenten el riesgo a padecer dichos desórdenes. A su vez, la metilación del ADN en la saliva puede proporcionar información sobre el ictus, y servir así como marcador. En conclusión, este trabajo resalta la importancia de futuras investigaciones en el campo de la epigenética para comprender mejor la etiopatogenia de las enfermedades cardiovasculares e identificar patrones de metilación específicos en tejidos accesibles para su uso como biomarcadores. 8. AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer a Nora Fernández e Iraia Garcia por su orientación, apoyo y dedicación durante todo el proceso de elaboración de este trabajo, así como por brindarme todos los conocimientos necesarios para el desarrollo del trabajo y mi formación académica. Además, agradezco al equipo del Grupo de Investigación por darme la oportunidad de participar en este proyecto y por ayudarme cuando lo he necesitado. 9. BIBLIOGRAFÍA Analysis tools - Reactome Pathway Database. (s. f.). [Visitado el 13 de marzo de 2024] https://reactome.org/userguide/analysis#analysis Bowden, J., y Holmes, M. V. (2019). Meta‐analysis and Mendelian randomization: A review. Research Synthesis Methods (Print), 10(4), 486-496. https://doi.org/10.1002/jrsm.1346 Chiesa, C., Pacifico, L., Natale, F., Hofer, N., Osborn, J. F., y Resch, B. (2015). Fetal and early neonatal interleukin-6 response. Cytokine, 76(1), 1-12. https://doi.org/10.1016/j.cyto.2015.03.015 Cilleros-Portet, A., Lesseur, C., Marí, S., Cosin-Tomas, M., Lozano, M., Irizar, A., Burt, A., García-Santisteban, I., Martín, D. G., Escaramís, G., Hernangomez-Laderas, A., Soler-Blasco, R., Breeze, C. E., Gonzalez-Garcia, B. P., Santa-Marina, L., Chen, J., Llop, S., Fernández, M. F., Vrijhed, M., … Fernández-Jiménez, N. (2023). Potentially causal associations between placental DNA methylation and schizophrenia and other neuropsychiatric disorders. medRxiv (Cold Spring Harbor Laboratory). https://doi.org/10.1101/2023.03.07.23286905 Coorens, T. H. H., Oliver, T. R. W., Sanghvi, R., Sovio, U., Cook, E., Vento-Tormo, R., Haniffa, M., Young, M. D., Rahbari, R., Sebire, N., Campbell, P. J., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. S., y Behjati, S. (2021). Inherent mosaicism and extensive mutation of human placentas. Nature, 592(7852), 80-85. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03345-1 Costanzo, V., Bardelli, A., Siena, S., y Abrignani, S. (2018). Exploring the links between cancer and placenta development. Open Biology, 8(6). https://doi.org/10.1098/rsob.180081 18 Cupido, A. J., Asselbergs, F. W., Natarajan, P., Ridker, P. M., Hovingh, G. K., y Schmidt, A. F. (2022). Dissecting the IL‐6 pathway in cardiometabolic disease: A Mendelian randomization study on both IL6 and IL6R. British Journal of Clinical Pharmacology, 88(6), 2875–2884. https://doi.org/10.1111/bcp.15191 Gu, X., Geng, D., Chen, C., Mu, J., Liu, F., Li, Q., Ren, Z., Chen, X., Li, J., Yu, Y., Xie, H., y Shen, C. (2023). mRNA expression of GWAS-identified genes in peripheral blood leukocytes as identification biomarkers for haemorrhagic stroke. Authorea. https://doi.org/10.22541/au.168000885.58046542/v1 Hartiala, J., Han, Y., Jia, Q., Hilser, J. R., Huang, P., Gukasyan, J., Schwartzman, W. S., Cai, Z., Biswas, S., Tregouet, D., Smith, N. L., Seldin, M., Pan, C., Mehrabian, M., Lusis, A. J., Bazeley, P., Sun, Y. V., Liu, C., Quyyumi, A. A., … Allayee, H. (2021). Genome-wide analysis identifies novel susceptibility loci for myocardial infarction. European Heart Journal, 42(9), 919-933. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehaa1040 Heberle, H., Meirelles, G. V., Da Silva, F. R., Telles, G. P., y Minghim, R. (2015). InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinformatics, 16(1). https://doi.org/10.1186/s12859-015-0611-3 Huang, X., Li, J., Qi, L., Adachi, J. D., Wu, J., Li, Z., Meng, Q., Li, G., y Lip, G. Y. H. (2022). Birth Weight and the Risk of Cardiovascular Outcomes: A Report From the Large PopulationBased UK Biobank Cohort Study. Frontiers In Cardiovascular Medicine, 9. https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.827491 Karamanavi, E., McVey, D. G., Van Der Laan, S. W., Stanczyk, P. J., Morris, G. E., Wang, Y., Yang, W., Chan, K., Poston, R. N., Luo, J., Zhou, X., Gong, P., Jones, P. D., Cao, J., Kostogrys, R. B., Webb, T. R., Pasterkamp, G., Yu, H., Xiao, Q., … Ye, S. (2022). The FES Gene at the 15q26 Coronary-Artery-Disease Locus Inhibits Atherosclerosis. Circulation Research, 131(12), 1004-1017. https://doi.org/10.1161/circresaha.122.321146 Kimura, K., Ieda, M., y Fukuda, K. (2012). Development, Maturation, and Transdifferentiation of Cardiac Sympathetic Nerves. Circulation Research, 110(2), 325-336. https://doi.org/10.1161/circresaha.111.257253 Koukoura, O., Sifakis, S., y Spandidos, D. A. (2012). DNA methylation in the human placenta and fetal growth (Review). Molecular Medicine Reports, 5(4), 883–889. https://doi.org/10.3892/mmr.2012.763 Larsson, S. C., Butterworth, A. S., y Burgess, S. (2023). Mendelian randomization for cardiovascular diseases: principles and applications. European Heart Journal, 44(47), 49134924. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehad736 Liu, Y., Li, B., Ma, Y., Huang, Y., Ouyang, F., y Liu, Q. (2021). Mendelian Randomization Integrating GWAS, eQTL, and mQTL Data Identified Genes Pleiotropically Associated With Atrial Fibrillation. Frontiers In Cardiovascular Medicine, 8. 19 https://doi.org/10.3389/fcvm.2021.745757 Malik, R., Chauhan, G., Traylor, M., Sargurupremraj, M., Okada, Y., Mishra, A., RuttenJacobs, L., Giese, A., Van Der Laan, S., Gretarsdottir, S., Anderson, C., Chong, M., Adams, H., Ago, T., Almgren, P., Amouyel, P., Ay, H., Bartz, T., Benavente, O., … Dichgans, M. (2018). Multiancestry genome-wide association study of 520,000 subjects identifies 32 loci associated with stroke and stroke subtypes. Nature Genetics, 50(4), 524–537. https://doi.org/10.1038/s41588-018-0058-3 Mao, L., Xiao, X. H., Zhang, Q., Zheng, J., Li, W. H., Yu, M., Zhang, H. B., Ping, F., Xu, J. P., y Wang, X. J. (2017). DNA Methylation and Birth Weight: a Genome-wide Analysis. PubMed, 30(9), 667-670. https://doi.org/10.3967/bes2017.088 Mohseni, R., Mohammed, S. H., Safabakhsh, M., Mohseni, F., Monfared, Z. S., Seyyedi, J., Mejareh, Z. N., y Alizadeh, S. (2020). Birth Weight and Risk of Cardiovascular Disease Incidence in Adulthood: a Dose-Response Meta-analysis. Current Atherosclerosis Reports, 22(3). https://doi.org/10.1007/s11883-020-0829-z Nishitani, S., Parets, S., Haas, B. W., y Smith, A. K. (2018). DNA methylation analysis from saliva samples for epidemiological studies. Epigenetics, 13(4), 352-362. https://doi.org/10.1080/15592294.2018.1461295 Oliva, M., Demanelis, K., Lu, Y., Chernoff, M., Jasmine, F., Ahsan, H., Kibriya, M. G., Chen, L. S., y Pierce, B. L. (2022). DNA methylation QTL mapping across diverse human tissues provides molecular links between genetic variation and complex traits. Nature Genetics (Print), 55(1), 112-122. https://doi.org/10.1038/s41588-022-01248-z Organización Mundial de la Salud (julio de 2021). Enfermedades cardiovasculares. [Visitado el 4 de abril de 2024] https://www.who.int/es/health-topics/cardiovascular-diseases#tab=tab_1 Pöschl, E., Schlötzer‐Schrehardt, U., Brachvogel, B., Saito, K., Ninomiya, Y., y Mayer, U. (2004). Collagen IV is essential for basement membrane stability but dispensable for initiation of its assembly during early development. Development, 131(7), 1619-1628. https://doi.org/10.1242/dev.01037 Rayat, S., Ramezanidoraki, N., Kazemi, N., Modarressi, M. H., Falah, M., Zardadi, S., y Morovvati, S. (2022). Association study between polymorphisms in MIA3, SELE, SMAD3 and CETP genes and coronary artery disease in an Iranian population. BMC Cardiovascular Disorders, 22(1). https://doi.org/10.1186/s12872-022-02695-6 Rothfels, K., Milacic, M., Matthews, L., Haw, R., Sevilla, C., Gillespie, M., Stephan, R., Gong, C., Ragueneau, E., May, B., Shamovsky, V., Wright, A., Weiser, J., Beavers, D., Conley, P., Tiwari, K., Jassal, B., Griss, J., Senff‐Ribeiro, A., … Stein, L. (2023). Using the reactome database. Current Protocols, 3 (4), e722. https://doi.org/10.1002/cpz1.722 Sixtus, R. P., Dyson, R. M., y Gray, C. L. (2024). Impact of prematurity on lifelong cardiovascular health: structural and functional considerations. Npj Cardiovascular Health, 1(1). https://doi.org/10.1038/s44325-024-00002-0 20 Smith, A. K., Kilaru, V., Kocak, M., Almli, L. M., Mercer, K. B., Ressler, K. J., Tylavsky, F. A., y Conneely, K. N. (2014). Methylation quantitative trait loci (meQTLs) are consistently detected across ancestry, developmental stage, and tissue type. BMC Genomics, 15(1), 145. https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-145 Steffensen, L. B., y Rasmussen, L. M. (2018). A role for collagen type IV in cardiovascular disease? American Journal Of Physiology. Heart And Circulatory Physiology, 315(3), H610H625. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00070.2018 Taylor-Weiner, A., Aguet, F., Haradhvala, N. J., Gosai, S., Anand, S., Kim, J., Ardlie, K., Van Allen, E. M., y Getz, G. (2019). Scaling computational genomics to millions of individuals with GPUs. Genome Biology, 20(1). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1836-7 Tekola‐Ayele, F., Zeng, X., Chatterjee, S., Ouidir, M., Lesseur, C., Hao, K., Chen, J., Tesfaye, M., Marsit, C. J., Workalemahu, T., y Wapner, R. J. (2022). Placental multi-omics integration identifies candidate functional genes for birthweight. Nature Communications, 13(1). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30007-1 Tekola‐Ayele, F., Zeng, X., Ouidir, M., Workalemahu, T., Zhang, C., Delahaye, F., y Wapner, R. J. (2020). DNA methylation loci in placenta associated with birthweight and expression of genes relevant for early development and adult diseases. Clinical Epigenetics (Print), 12(1). https://doi.org/10.1186/s13148-020-00873-x Uffelmann, E., Huang, Q. Q., Munung, N. S., De Vries, J., Okada, Y., Martin, A. R., Martin, H. C., Lappalainen, T., y Posthuma, D. (2021). Genome-wide association studies. Nature Reviews Methods Primers, 1(1). https://doi.org/10.1038/s43586-021-00056-9 Van Ouwerkerk, A. F., Hall, A. W., Kadow, Z. A., Lazarevic, S., Reyat, J. S., Tucker, N. R., Nadadur, R. D., Bosada, F. M., Bianchi, V., Ellinor, P. T., Fabritz, L., Martin, J. F., De Laat, W., Kirchhof, P., Moskowitz, I. P., y Christoffels, V. M. (2020). Epigenetic and Transcriptional Networks Underlying Atrial Fibrillation. Circulation Research, 127(1), 34-50. https://doi.org/10.1161/circresaha.120.316574 Yang, L. C., Zhang, P. P., Chen, X., Li, C., Sun, J., Hou, J., Chen, R., Wang, Y., y Li, Y. G. (2016). Semaphorin 3a transfection into the left stellate ganglion reduces susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction in rats. Europace: journal of the working groups on cardiac pacing, arrhythmias, and cardiac cellular electrophysiology of the European Society of Cardiology, 18(12), 1886–1896. https://doi.org/10.1093/europace/euv276 Yang, X., Sha, X., Cao, Y., Wang, W., y Shi, J. (2023). Cx43 overexpression reduce the incidence of obstructive sleep apnea associated atrial fibrillation via the CaMKⅡγ/HIF-1 axis. Biochemical And Biophysical Research Communications, 659, 62-71. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.03.084 Zhu, Z., Zhang, F., Hu, H., Bakshi, A., Robinson, M. R., Powell, J. E., Montgomery, G. W., Goddard, M. E., Wray, N. R., Visscher, P. M., y Yang, J. (2016). Integration of summary data from GWAS and eQTL studies predicts complex trait gene targets. Nature Genetics, 48(5), 481-487. https://doi.org/10.1038/ng.3538 21 10. ANEXOS Tabla Suplementaria 1. Resultados del análisis de SMR entre GWAS de ictus y mQTLs en saliva (los CpGs son los mismos que salen en placenta). Se detallan las CpGs, el SNP y su posición en el genoma (Posición), el gen más próximo a la CpG (Gen prox), el tamaño del efecto o beta resultante de SMR (b_SMR), el p valor de SMR (p_SMR), el p valor de HEIDI (p_HEIDI) y el p valor de Bonferroni (p_Bonf). CpG SNP Posición SNP Gen prox b_SMR p_SMR p_HEIDI p_Bonf cg24450063 rs1421426991 1:156163899 SLC25A44 -0,04 1,38E-13 0,07 9,66E-09 cg06970220 rs1421426991 1:156163899 SLC25A44 -0,05 5,30E-13 0,07 3,72E-08 Tabla Suplementaria 2. Resultados del análisis de Reactome para la EAC, FA e IM en placenta. Se detallan las rutas metabólicas, el p valor de Reactome y los genes que participan en la ruta metabólica. Enfermedad Ruta metabólica p valor Genes EAC Organización de la matriz extracelular 2,52E-06 SCUBE1, COL4A2, COL4A1, CTSK, FN1, PECAM1, FURIN, CTSS, LOXL1 Ensamblaje de fibrillas de colágeno y otras estructuras multiméricas 7,26E-06 COL4A2, COL4A1, CTSS, LOXL1 FA Regulación transcripcional por la familia de factores de transcripción AP-2 (TFAP2) 4,08E-05 ERBB2, PITX2 IM Señalización de repulsión SEMA3APlexina mediante la inhibición de la adhesión de integrinas 7,17E-03 FES