Señalización Molecular en las Fases Tempranas de la Conidiación en el Hongo Modelo Aspergillus nidulans

(cc) 2021 Mikel I adi Se ano (cc by-nc-nd 4.0)
Biokimika II
Kimika Aplika ua
Kimika Fakul a ea
Donos ia
Señalización Molecula en las Fases Temp anas
de la Conidiacin en el Hongo Modelo
Aspe gillus nidulans
Memo ia p esen ada pa a op a al g ado de Doc o en Química Aplicada y Ma e iales
Polimé icos po ,
Mikel I adi Se ano
2021
Di ec o de Tesis Doc o al:
Unai Ona Ugalde
P o eso Ti ula
Facul ad de Ciencias Químicas
EHU/UPV
Es a Tesis Doc o al ha sido ealizada en la Facul ad de Ciencias Químicas de
Donos ia (EHU/UPV) bajo la di ección del D . Unai Ona Ugalde Ma ínez, P o eso
Ti ula de la UPV/EHU.
El abajo ecogido en es a memo ia ha sido inanciado po el Gobie no Vasco a
a és del p oyec o IT599-13, y po una beca del P og ama pa a Fo mación de Pe sonal
In es igado de la UPV/EHU al doc o ando Mikel I adi Se ano.

“A menudo la úl ima lla e que e queda po p oba ab e el candado”
Anónimo
Ai a, Ama, Amona, Imanol
e a Ma ia i
ESKERRAK / AGRADECIMIENTOS:
Gezu a di udien a en, hauek izan di a
esi hone an idaz ea gehien kos a u
zaizkidan hi zak, jakin badakidalako
asko izan za e ela u e haue an zeha ,
hainbes e joan e o i en ondo en, ni e
ondoan egon za e enak.
Lehenik e a behin, ez nuke zien zia en
munduan mu gil zeko auke a ik izango,
auke a eman ez bazeni . Unai, o ain dela
sei u e eskua luza u zenidane ik, zu i
eske hainba e onkei au e egi eko gai
izan naiz. Ezin izango dizu nahikoa
eske u une o o ni ekin izan duzun
pazien zia, denbo a e a hi z egi eko
eskaini didazun denbo a guz ia.
Momen u guz i haue a ik, za i xo asko
da ama za ni e bai an. Biho zez, mila
eske !
Labo a egian asko izan za e e u e
haue an zeha au e a egi en lagundu
didazuenak. Oie , libu u i eki ba naiz
zu e zako, be i egon za a p es izan
di udan zalan zak a gi u e a momen u
zaile an au e a ja ai zeko beha nuen
bul zada ema eko. Ma c, eske ak
ema en dizkizu ni e zako ezezaguna zen
mundu ba e aku si e a esi hone an
ezinbes eko ga an zia izan duen zu abe
izan za elako.
Aunque pa ezca men i a, és as han sido
las palab as que más me ha cos ado
esc ibi en la esis, po que sé que habéis
sido muchos los que habéis es ado a mi
lado du an e es os años, después de
an as idas y enidas.
En p ime luga , no end ía la
opo unidad de sume gi me en el mundo
de la ciencia, si no me hubie as dado la
opo unidad. Unai, desde que me
endis e la mano hace seis años, g acias
a i he sido capaz de a on a a ios
e os. No pod é ag adece e lo su icien e
oda la paciencia, ayuda y el iempo que
has dedicado a es a conmigo. De odos
es os momen os, me lle o muchos
oci os den o de mí. ¡Muchas g acias,
de odo co azón!
En el labo a o io habéis sido muchos los
que me habéis ayudado a a anza a lo
la go de es os años. Oie , soy un lib o
abie o pa a i, siemp e has es ado
dispues o a esol e las dudas que he
enido y a da me el impulso que
necesi aba pa a segui adelan e en los
momen os más di íciles. Ma c, e doy las
g acias po habe me mos ado un
mundo desconocido pa a mí y habe sido
un pila undamen al en es a esis.

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL ........................................ 5
1. Ca ac e ís icas gene ales de Aspe gillus nidulans ................................................... 7
2. Ciclo de ida ................................................................................................................ 7
2.1. C ecimien o ege a i o .................................................................................. 9
2.2. Desa ollo asexual ....................................................................................... 10
3. La ansición desde la hi a al conidió o o en Aspe gillus nidulans ...................... 11
4. El Fac o FluG y sus unciones en la o mación del conidió o o ......................... 15
OBJETIVOS .............................................................................................. 17
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ..................................... 21
1. Cepas de Aspe gillus nidulans .................................................................................. 23
2. Oligonucleó idos ....................................................................................................... 25
3. Plásmidos ................................................................................................................... 29
3.1. Plásmidos u ilizados en A. nidulans ............................................................ 29
3.2. Plásmidos u ilizados pa a exp esión en E. coli ............................................ 30
4. Medios y condiciones de cul i o de Aspe gillus nidulans ...................................... 31
5. Recuen o de conidias y cleis o ecios y pesaje de colonias ..................................... 33
5.1. Recuen o de conidias ................................................................................... 33
5.2. Recuen o de cleis o ecios ............................................................................. 33
5.3. Pesaje de colonias ........................................................................................ 34
6. Expe imen os de con ac o en e colonias ............................................................... 34
7. T ans o mación de Aspe gillus nidulans ................................................................ 34
7.1. Ob ención de p o oplas os ........................................................................... 35
7.2. T ans o mación de p o oplas os .................................................................. 36
8. Aislamien o y manipulación de ácidos nucleicos ................................................... 37
8.1. Gene ación de mu an es nulos y e ique ado de genes con o sin p omo o
inducible ............................................................................................................. 37
8.2. Ex acción de ADN genómico ..................................................................... 40
8.3. Sou he n Blo ............................................................................................... 41
8.4. Mu agénesis di igida .................................................................................... 44
8.5. Inducción de la exp esión ............................................................................ 45
8.6. Sus i ución de las egiones de luG po homólogos bac e ianos y de plan a 45
9. Técnicas de análisis de exp esión génica ................................................................ 47
9.1. Ex acción y cuan i icación del ARN o al .................................................. 47
9.2. Sín esis de cDNA ......................................................................................... 47
9.3. Real-Time PCR (PCR a iempo eal) ........................................................... 47
10. Técnicas de biología molecula pa a Esche ichia coli ......................................... 48
10.1. Medios de cul i o y condiciones pa a E. coli ............................................ 48
10.2. T ans o mación de E. coli .......................................................................... 48
10.3. Ex acción de ADN plasmídico ................................................................. 49
10.4. Diges ión y ligación de plásmidos y agmen os de ADN ........................ 50
11. Técnicas de biología molecula pa a Lac obacillus pa acasei y Pseudomonas
ae uginosa ...................................................................................................................... 51
11.1. Medios de cul i o y condiciones pa a L. pa acasei y P. ae uginosa ........ 51
11.2. Ex acción de ADN genómico en bac e ia ................................................ 52
12. Aislamien o y manipulación de p o eínas en Aspe gillus nidulans .................... 53
12.1. Ex acción de p o eínas .............................................................................. 53
12.2. Wes e n blo ............................................................................................... 54
13. He amien as de análisis bioin o má ico ............................................................. 55
13.1. Cons ucción y secuenciación .................................................................... 55
13.2. Análisis in silico de FluG .......................................................................... 55
13.3. Búsqueda de homólogos de FluG en bac e ias y plan as ........................... 55
13.4. Búsqueda de es uc u as de c is al median e SWISS-MODEL ................. 56
13.5. Modelado de FluG median e MAESTRO ................................................. 56
14. Mic oscopía de luo escencia ................................................................................. 57
CAPÍTULO III: PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE
FLUG .......................................................................................................... 59
1. In oducción .............................................................................................................. 61
2. Resul ados ................................................................................................................. 63
2.1. La p oducción de conidias no se e a ec ada en una cepa mu an e

ausA . 63
2.2. Una cepa

ausA e ie e el eno ipo aconidial de un mu an e c wA2 y

luG
............................................................................................................................ 63
2.3. La deleción del gen luG a ec a an o al desa ollo asexual, como al sexual
en Aspe gillus nidulans ....................................................................................... 65
2.4. FluG p esen a una dis ibución homogénea en el ci oplasma...................... 66
3. Discusión .................................................................................................................... 70
CAPÍTULO IV: ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN
FUNCIONAL DE FLUG .......................................................................... 73
1. In oducción .............................................................................................................. 75
2. Resul ados ................................................................................................................. 78
2.1. P ime a E apa. FluG con iene dos egiones a ines a sendos dominios
enzimá icos ......................................................................................................... 78
2.2. Es udio bioin o má ico de la egión N- e minal .......................................... 79
2.3. Es udio bioin o má ico de la egión C- e minal .......................................... 88
2.4. Es udio compa a i o de FluG con las -glu amil poliamina ligasas de
Pseudomonas ae uginosa ................................................................................... 95
2.5. Los genes homólogos a las dos egiones de FluG es án p esen es en
bac e ias, hongos y plan as ................................................................................. 97
2.6. Las dos egiones de FluG es án p esen es en ope ones de bac e ias ......... 100
3. Discusión .................................................................................................................. 101
CAPÍTULO V: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG ... 107
1. In oducción ............................................................................................................ 109
2. Resul ados .................................................................................................... 110
2.1. Las egiones N- y C- e minal de FluG cumplen dis in as unciones ......... 110
2.2. La exp esión po sepa ado de las egiones N- y C- e minal de FluG a ec a al
desa ollo sexual ............................................................................................... 112
2.3. La sus i ución de los esiduos conse ados a ec a a la unción de FluG ... 113
2.4. Ni eles de exp esión del gen luG en dis in os mu an es .......................... 114
2.5. La sus i ución he e óloga de ambas egiones de FluG po sus homólogos
bac e ianos complemen an su unción .............................................................. 115
2.6. La sus i ución he e óloga de FluG po su homólogo de plan a, NodGS, no
complemen a su unción ................................................................................... 117
2.7. P ecisiones sob e la ac i idad enzimá ica de la egión C- e minal ........... 118
3. Discusión .................................................................................................................. 126
CAPÍTULO VI: DISCUSIÓN GENERAL ........................................... 131
Una enzima bi uncional ............................................................................................. 133
La unción de FluG en el con ex o del micelio ......................................................... 137
El papel de FluG más allá de su elación como UDA .............................................. 141
CONCLUSIONES ................................................................................... 143
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 147
ANEXOS .................................................................................................. 169
Anexo 1 ........................................................................................................................ 171
Anexo 2 ........................................................................................................................ 172
Anexo 3 ........................................................................................................................ 173
Anexo 4 ........................................................................................................................ 175
Anexo 5 ........................................................................................................................ 176
Anexo 6 ........................................................................................................................ 177
Anexo 7 ........................................................................................................................ 180
Anexo 8 ........................................................................................................................ 181
Anexo 9 ........................................................................................................................ 183
Anexo 10 ...................................................................................................................... 184
Anexo 11 ...................................................................................................................... 185
Anexo 12 ...................................................................................................................... 186
Anexo 13 ...................................................................................................................... 187
Anexo 14 ...................................................................................................................... 188
Anexo 15 ...................................................................................................................... 191
Anexo 16 ...................................................................................................................... 192
Anexo 17 ...................................................................................................................... 193
Anexo 18 ...................................................................................................................... 194
Anexo 19 ...................................................................................................................... 195
Anexo 20 ...................................................................................................................... 196
Anexo 21: A ículo cien í ico ..................................................................................... 197
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL

INTRODUCCIÓN GENERAL
7
1. Ca ac e ís icas gene ales de Aspe gillus nidulans
El géne o Aspe gillus (Geise e al., 2007) comp ende unas 300 especies, en e las
que se incluyen algunas de in e és alimen a io (A. nige y A. o yzae) y clínico (A.
umiga us, A. la us o A. pa asi icus) (Taylo e al., 1993). Aspe gillus nidulans es un
o ganismo modelo empleado en es udios de biología undamen al (Pon eco o e al.,
1953; Ma inelli, 1994). Sus ca ac e ís icas pa a el cul i o (37 oC), ca ác e sap ó i o, la
acilidad pa a ealiza expe imen os en gené ica clásica, el ca ác e haplo-diplon e del
ciclo de ida y el ca ác e no pa ógeno de es a especie acili an su uso (Taylo e al.,
1993).
El genoma de A. nidulans, de 30,52 millones de pa es de bases, es á dis ibuido en
8 c omosomas. Con iene al ededo de 11.000 genes (Galagan, 2005), de los cuales, solo
el 20% han sido ca ac e izados (Ande sen, 2014). Los da os ac ualizados del genoma
pueden consul a se en Aspe gillus Genome Da abase (www.aspg.com) (Ce quei a e al.,
2014), sin emba go, la in o mación más comple a es  siendo in eg ada en la base de
da os FungiDB (www. ungidb.o g/ ungidb/) (Basenko e al., 2018).
2. Ciclo de ida
El ciclo de ida de Aspe gillus nidulans incluye ases haplon es y diplon es,
de allados en la Figu a 1 (Cassel on y Zolan, 2002). La p ime a e apa (haploide) comienza
con la ge minación de una espo a y con inúa con la o mación de un ubo ge mina i o.
El c ecimien o ege a i o, es á basado en hi as, que con o man una colonia
in e comunicada denominada micelio. Dependiendo de los es ímulos del en o no, el
hongo puede lle a a cabo el desa ollo asexual pa a o ma conidias (mi ospo as), o
sexual, dando luga a ascospo as (meiospo as). En cie os casos, un indi iduo puede
lle a a cabo la usión de hi as con o o, con usión de núcleos, dando luga a un diploide
(ciclo pa asexual). Teniendo en cuen a que es a esis se ha cen ado p incipalmen e en las
e apas comp endidas en e el c ecimien o ege a i o y el desa ollo asexual, a
con inuación, se explica án de alle es as dos ases del ciclo de ida.
INTRODUCCIÓN GENERAL
8
 Ciclo ege a i o
 Ciclo asexual
 Ciclo sexual
 Ciclo pa asexual
CICLO
PARASEXUAL
Fusión en e hi as
Diploide (2n)
He e oca ión
(n + n)
CICLO ASEXUAL
Célula pie y allo
Mé ulas
Fiálidas
Conidió o o
Vesícula
Desa ollo de
asca
Fo mación de
ascospo as
Cleis o ecio
Asca que con iene 8
ascospo as
CICLO SEXUAL
Ascospo a
Fo mación del
dica ion e
CICLO VEGETATIVO
Ge minación
Espo a
Rami icación
Figu a 1. Ciclo de ida de Aspe gillus nidulans. Modi icado a pa i de (Cassel on y Zolan, 2002)
INTRODUCCIÓN GENERAL
9
2.1. C ecimien o ege a i o
La o mación del micelio se inicia con la ge minación una espo a asexual o sexual.
Es ímulos ex e nos (p incipalmen e, p esencia de agua y azúca es) p opician una p ime a
ase de c ecimien o iso ópico (Momany, 2002). A con inuación, se es ablece un pun o
de c ecimien o pola izado dando luga al ubo ge mina i o. Es e ubo se ex iende de
mane a pola izada has a da luga a la o mación de una hi a. Las hi as son células
cilínd icas mul inucleadas que man ienen un c ecimien o pola (Riquelme e al., 2003) y
es án sepa adas po sep os, a a és de cuyos po os se egula el lujo de ma e ial celula
(Ha is, 2001).
La hi a p incipal da luga a ami icaciones, las cuales se an ex endiendo sin al e a
al c ecimien o de la hi a p incipal (T inci, 1970). A medida que anscu e es e pa ón de
c ecimien o, las ami icaciones dis ales acaban usionándose en e sí median e un p oceso
denominado anas omosis, el cual ha sido obse ado de alladamen e en el ascomice o
Neu ospo a c assa que o ece en ajas pa a la obse ación mic oscópica, po su amaño
(Rope e al., 2015; Fische y Glass, 2019) (Figu a 2). La ciné ica del c ecimien o de un
micelio ha sido es udiada en de alle en Aspe gillus nidulans (T inci, 1969; 1970).
Zona in e io de
la colonia
Zona pe i é ica
de la colonia
Figu a 2. Mo ología de una colonia de Neu ospo a c assa du an e el ciclo ege a i o: En la zona in e io de
la colonia, las hi as es án in e conec adas as enómenos de anas omosis (a iba a la de echa), mien as que,
en la zona pe i é ica, se epelen la una a la o a (abajo a la de echa). Modi icado a pa i de (Hickey e al.,
2002) y (Bulle , 1933)
INTRODUCCIÓN GENERAL
16
iden i icado pudo causa la espo ulación de un mu an e nulo (

luG) en la zona de
con ac o en e ambas colonias, incluso cuando es aban sepa adas po una memb ana de
amaño de po o de 6-8 kDa (Lee y Adams, 1994). O os es udios epo a on que un
mu an e nulo de FluG no p oducía un aduc o de dos me aboli os secunda ios llamados
dehid oaus inol y dio cinol, que, e a capaz de induci la espo ulación de un mu an e nulo
en luG (Rod iguez-U a e al., 2012). Se ha pues o en duda que el ci ado aduc o uese el
ac o de FluG, pues o que una cepa que no p oduce dehid oaus inol, es capaz de
espo ula (Nielsen e al., 2011). O os es udios han e i icado que mu an es de los genes
UDA que es án io debajo de FluG (FlbB y FlbE) pueden causa la espo ulación en la
zona de con ac o con el mu an e nulo de luG. Sin emba go, es os mu an es ambién
espo ulan en con ac o con una cepa sil es e. Ello indica que hay al menos dos
me aboli os elacionados con la espo ulación (E xebes e e al., 2008; Ga zia e al., 2009).
Si bien se puede in ui que exis e una elación en e los ac o es FlbB y FlbE con FluG,
se desconoce la iden idad de los me aboli os y su papel en el p oceso.
Algunos abajos han p opues o que la unción de FluG pod ía es a modulada po
la luz. Una mu ación en el gen (FluG701) a ec ó a la sensibilidad a la luz oja (Yage e
al., 1998). Es a e idencia p opició la conexión uncional en e FluG y el complejo el e .
En la misma línea, se obse ó que la exp esión de FluG aumen a en p esencia de la luz
(Ruge -He e os e al., 2011). O o es udio en Aspe gillus la us, epo ó median e
expe imen os Yeas -Two-Hyb id la in e acción molecula en e FluG y VeA (Chang e
al., 2013). Es o en a ía en con adicción con una dis ibución ci oplásmica desc i a
an e io men e (Lee y Adams, 1994).
An e la di e sidad de in o maciones e in e p e aciones sob e la unción de es e
impo an e ac o de desa ollo asexual, el obje i o de es a esis ha sido el de a oja luz
sob e su unción median e el uso de écnicas ac ualizadas de es udio en biología
molecula y bioin o má ica.

OBJETIVOS
OBJETIVOS
19
La línea p incipal de in es igación de es á esis doc o al es á dedicada a la
ca ac e ización y el análisis uncional del gen luG en Aspe gillus nidulans. Es e gen ha
sido analizado en es udios an e io es e ec uados en o os géne os de Aspe gillus, no
obs an e, su papel en la egulación del desa ollo de hongo sigue siendo desconocido.
Debido a ello, los obje i os gene ales que se plan ea on al inicio del abajo de
in es igación ue on:
1. De e minación de la ele ancia del gen ausA en la inducción del desa ollo
asexual, en elación con el gen luG. Localización de FluG in i o y p ime a
ca ac e ización bioin o má ica del gen luG.
2. Es udio bioin o má ico del gen luG y modelado es uc u al de la p o eína, con
el obje o de elucida su unción
3. Comp obación expe imen al de las hipó esis esul an es del análisis
bioin o má ico de la secuencia de luG.
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS
23
1. Cepas de Aspe gillus nidulans
Las cepas u ilizadas en el abajo ealizado a lo la go de es a esis, es án e lejadas
en la Tabla 1.
Tabla 1. Cepas u ilizadas en es e es udio
Cepa
Geno ipo
Fuen e
TTA127.4 (BD80)
yA2;

luG:: pC+; pabaA1; pC801;
eA1
(Lee y Adams,
1994)
TN02A3 (BD129)
py G89; a gB2; py oA4; ΔnkuA::a gB+;
eA1
(Nayak e al., 2006)
CRO1 (BD267)
c wA2; yA2; pabaA1; eA1
(Má quez-
Fe nández e al.,
2007)
BD688
py G89; a gB2; py oA4;
ΔausA::py G+; ΔnkuA::a gB+; eA1
Es e es udio
WIM 126
yA2; pabaA1; eA+
(Bu nick e al.,
1984)
FGSC A#1155
py G89;

nkuA::ba ; py oA4; eA1
Fungal Gene ics
S ock Cen e ;
(McCluskey e al.,
2010)
BD824
py G89;

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio (c uce
en e WIM126 x
FGSC A#1155)
BD969
py G89;

luG::py G+;

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD970
py G89; luG(1-406);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD971
py G89; luG(427-865);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD972
py G89; luG(H20A;H22A);

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
BD975
py G89; luG::GFP::py G+;

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
MATERIALES Y MÉTODOS
24
BD977
py G89; GFP:: luG;

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD982
py G89; alcA(p):: luG::GFP::py G+;

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
BD988
py G89; luG::HA3x::py G+;

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
BD1145
py G89;

luG::LSEI_0440:: luG(407-
865);

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
BD1194
py G89; luG(1-406);

nkuA::ba ;
py oA4; luG(427-865)::py oA+; eA+
Es e es udio
BD1195
py G89; luG(D354A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1196
py G89;
luG(H20A;H22A;D354A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1197
py G89; luG(E566A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1198
py G89; luG(E626A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1199
py G89; luG(H682A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1200
py G89; luG(R720A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1201
py G89; luG(R739A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1202
py G89; luG(R744A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1203
py G89; luG(E752A);

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1206
py G89; GFP:: luG;

nkuA::ba ;
py oA4; hhoA::mRFP::py G+; eA+
Es e es udio
BD1207
py G89; alcA(p)::GFP:: luG::py G+;

nkuA::ba ; py oA4;
hhoA::mChe y::py oA+; eA+
Es e es udio
MATERIALES Y MÉTODOS
25
BD1208
py G89; HA3x:: luG;

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1229
py G89;

luG::PA5508;

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
BD1231
py G89;

luG:: luG(1-426)::PA5508;

nkuA::ba ; py oA4; eA+
Es e es udio
BD1233
py G89;

luG::LSEI_0440:: luG(407-
426)::PA5508;

nkuA::ba ; py oA4;
eA+
Es e es udio
BD1235
py G89;

luG::NodGS;

nkuA::ba ;
py oA4; eA+
Es e es udio
2. Oligonucleó idos
Las secuencias de los oligonucleó idos u ilizados en es e abajo, suminis ados po
IDT y Me abion, es án e lejadas en la Tabla 2. Pa a el diseño de los oligonucleó idos se
u ilizó el paque e in o má ico Vec o NTI 10.1.1.
Tabla 2. Oligonucleó idos u ilizados en es e es udio
Oligonucleó ido
Secuencia (5´→3´)
Cons ucción
ausA-PP1
GGG GAG TGC ATA GGG ATA
CAG AGT ACT AAC C
Ampli icación de la egión
5´-UTR de ausA
ausA-PP2
CAT CTT TCG AAA TAA AGT
GAT CTT GAC TAA AAG G
Ampli icación de la egión
5´-UTR de ausA
ausA-SMP1
CCT TTT AGT CAA GAT CAC
TTT ATT TCG AAA GAT GAC
CGG TCG CCT CAA ACA ATG
CTC T
Gene ación del mu an e nulo

ausA
ausA-GFP2
CCA TTA CCA CAA CGA GGA
TAG GCA CTA AAT ACT AAT
TAG TCT GAG AGG AGG CAC
TGA TGC G
Gene ación del mu an e nulo

ausA
ausA-GSP3
TAA TTA GTA TTT AGT GCC
TAT CCT CGT TGT GGT AAT
GG
Ampli icación de la egión
3´-UTR de ausA
ausA-GSP4
GCC CGT CTT CCA AAT CTT
CGC
Ampli icación de la egión
3´-UTR de ausA
MATERIALES Y MÉTODOS
32
Es e iliza en au ocla e
Medio comple o Aspe gillus (MCA)
líquido
Solución de sales y
elemen os aza
20 mL
Ex ac o de le adu a
5 g
Ajus a el pH a 6,8 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
Medio de egene ación (MMR)
Solución de sales y
elemen os aza
20 mL
D(+)-Saca osa (1 M)
342 g
Aga (medio sólido)
15 g
Ajus a el pH a 6,8 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
Medio de egene ación-TOP (MMR-
TOP)
Solución de sales y
elemen os aza
20 mL
D(+)-Saca osa (1 M)
342 g
Aga (medio sólido)
6 g
Ajus a el pH a 6,8 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
Medio mnimo “Wa ch” (WMM)
Elemen os aza
1 mL
KCl (17 mM)
0,5 g
MgSO4·7H2O (5 mM)
0,5 g
Ajus a el pH a 6,8 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
Solución NaH2PO4 5 M
(25 mM)
5 mL
Solución de D(+)-glucosa
(0,1 % (p/ ))
5 mL
Solución de a a o
amónico (5 mM)
10 mL
Tabla 4. Soluciones u ilizadas pa a los medios
Soluciones
Can idades po li o
Elemenos aza (103x)
ZnSO4·7H2O
22 g
H3BO3
11 g
MnCl2·4H2O
5 g
FeSO4·2H2O
5 g
CoCl2·6H2O
1,6 g
CuSO4·5H2O
1,6 g
(NH4)6Mo7O24·4H2O
1,1 g
Na2EDTA
50 g
Ajus a el pH a 6,8 (con NaOH)
Cub i la bo ella con papel de aluminio
Es e iliza en au ocla e
Sales + Elemen os aza (50x)
KCl
26 g
MgSO4·7H2O
26 g
KH2PO4
72 g
50 mL de elemen os aza

MATERIALES Y MÉTODOS
33
Cub i la bo ella con papel de aluminio
Es e iliza en au ocla e
D(+)-glucosa (10x)
D(+)-glucosa
200 g
Es e iliza en au ocla e
Ta a o amónico (100x)
Ta a o amónico
92 g
Es e iliza en au ocla e
NaH2PO4 5 M
NaH2PO4
599,9 g
Es e iliza en au ocla e
Tabla 5. P epa ación de suplemen os
Suplemen os
Can idades po li o
Bio ina (104x)
Bio ina
0,1 g
Es e iliza po il ación (0,45m)
Ácido p-aminobenzoico (Paba) (103x)
Ácido p-aminobenzoico
2 g
Es e iliza po au ocla e
Pi idoxina (Py o) (103x)
Pi idoxina
0,5 g
Es e iliza po il ación (0,45m)
U idina
122 mg/100 mL de medio
U acilo
56 mg/100 mL de medio
5. Recuen o de conidias y cleis o ecios y pesaje de colonias
5.1. Recuen o de conidias
Se inocula on las cepas con en mé odo de inoculación-pun ual y se incuba on
du an e 72 ho as. Finalizado el pe iodo de incubación, se ecogie on las colonias co ando
el aga po el pe íme o de la colonia y se dispe sa on las espo as e iendo el ozo de
aga en un ubo de 50 mL con una solución de Tween® 20 al 0,02 % ( / ) y se agi a on
u ilizando un o ex a elocidad máxima du an e un minu o, dos eces. Se con a on las
espo as u ilizando un hema oci óme o (celda Thoma) en un mic oscopio (Op iho ,
Nikon). El á ea de la colonia se midió o og a iando las colonias, y a ando las imágenes
u ilizando el p og ama Digimize 4.6.1 (MedCalc So wa e b ba). Los con ajes se
hicie on en es andas con al menos cua o éplicas cada una y se u ilizó el es de G ubbs
pa a de ec a ‘ou lie s’ (G ubbs, 1969). El núme o de espo as po cm2 se calculó a a és
de la di isión de la concen ación de conidias po el diáme o de la colonia.
5.2. Recuen o de cleis o ecios
Se semb a on placas Pe i con 1x105 conidias en o ma de césped, se sella on las
placas con Pa a ilm® M (Bemis) en el pe íme o de las placas y se apa on con papel de
MATERIALES Y MÉTODOS
34
aluminio. Se incuba on a 37 C du an e 7 días. Finalizado el pe iodo de incubación, se
ecogie on 4 discos de 15 mm de diáme o pa as cada cepa, se pul e iza on con una
solución de e anol cosmé ico al 96 % pa a elimina de la supe icie las es uc u as de
espo ulación asexuales y se o og a ia on los cleis o ecios con una lupa binocula Nikon
SMZ8000 a 20x aumen os pa a pos e io men e se con ados u ilizando el p og ama de
a amien o de imágenes Fiji (Schindelin e al., 2012).
5.3. Pesaje de colonias
Pa a los expe imen os de pesaje, se co a on memb anas de diálisis (Spec a/Po ®
6) con un lími e de peso molecula de 3,5 kDa y se es e iliza on en las mismas
condiciones que los medios. Una ez es é iles, se coloca on las memb anas encima de los
cul i os de c ecimien o, se semb a on las cepas con en mé odo de inoculación-pun ual y
se incuba on du an e 72 ho as. Finalizado el pe iodo de incubación, se ecogie on las
colonias sepa andolas de la memb ana y se deja on seca a 80 C oda la noche. En los
casos en los que se co ó la colonia del aga , es e úl imo se eliminó de i iéndolo con agua
calien e (80 C) y secando la colonia a 80 C oda la noche. El á ea de la colonia se midió
o og a iando las placas sob e la memb ana, y a ando las imágenes u ilizando el
p og ama Digimize 4.6.1. Los pesajes se hicie on en es andas con al menos cua o
éplicas cada una y se u ilizó el es de G ubbs pa a de ec a ‘ou lie s’ (G ubbs, 1969). El
núme o de milig amos po cm2 se calculó a a és de la medida del diáme o de la colonia
y los pesajes ob enidos.
6. Expe imen os de con ac o en e colonias
Todos los expe imen os de con ac o se lle a on a cabo en placas de 90 mm de
diáme o con MCA. Las cepas se inocula on pun ualmen e con un cen íme o de
sepa ación y se incuba on has a que en aban en con ac o. A pa i de ese momen o, se
siguie on cul i ando du an e 96 ho as. Finalizado el pe iodo de incubación, se
o og a ia on las zonas de con ac o con una lupa binocula Nikon SMZ8000 a 20x
aumen os.
7. T ans o mación de Aspe gillus nidulans
La ob ención de los p o oplas os de Aspe gillus nidulans se ealizó median e el
p o ocolo desc i o po (Szewczyk e al., 2006), mien as que ans o mación de
MATERIALES Y MÉTODOS
35
p o oplas os se ealizó u ilizando el p o ocolo desc i os po (Tilbu n e al., 1983). Las
soluciones necesa ias pa a lle a a cabo ambos p ocesos es án de alladas en la Tabla 6.
Tabla 6. Soluciones u ilizadas en la ans o mación de A. nidulans
Soluciones
Can idades po 100 mL
KCl 0,6 M
KCl
4,47 g
Es e iliza en au ocla e
KCl 0,6 M + CaCl2 50 mM
KCl
4,47 g
CaCl2·2H2O
0,74 g
Es e iliza en au ocla e
KCl 1 M + Ácido cí ico 0,1 M
KCl
8,20 g
Ácido cí ico
monohid a ado
2,10 g
Es e iliza en au ocla e
Gua da a 4 C
D(+)-Saca osa 1,2 M
D(+)-Saca osa
41,08 g
Es e iliza en au ocla e
Solución 7
So bi ol
18,22 g
T is-HCl (1 M, pH=7,5)
1 mL
CaCl2 (1 M)
1 mL
Es e iliza en au ocla e
Solución 8
Polie ilenglicol (PEG6000)
60 g
T is-HCl (1 M, pH 7,5)
1 mL
CaCl2 (1 M)
1 mL
Añadi 10 mL de agua des ilada, undi
en el mic oondas y en asa a 100 mL
Es e iliza en au ocla e
Solución de ob ención de p o oplas os
(P epa a la 30 minu os an es de empeza
el p oceso de diges ión)
VinoTas e® P o
(No ozymes)
2,048 g
KCl 1 M + Ácido
cí ico 0,1 M
16 mL
Cen i uga has a que se disuel a el
VinoTas e® y eposa en hielo.
7.1. Ob ención de p o oplas os
Se ob u ie on espo as de la cepa a se ans o mada en un ubo de 50 mL que
con enía una solución de Tween® 20 al 0,02 % ( / ) y se agi ó u ilizando un o ex. La
suspensión esul an e de espo as se il ó a a és de Mi aclo h (Calbiochem®, dp = 22-
25 μm) es é il y pos e io men e se le eliminó la solución de Tween cen i ugándo a
4000 pm du an e 5 minu os. Se añadió solución de Tween nue amen e y se con a on las
espo as. Se inocula on 150 mL de MCA líquido y los suplemen os necesa ios con
2,5·106 conidias/mL en un ma az de 500 mL. El inóculo se incubó du an e 14 ho as a
28 °C con agi ación (180 pm). Una ez anscu ido el pe iodo de incubación, se il ó el
MATERIALES Y MÉTODOS
36
micelio a a és de Mi aclo h es é il sin p ensa el micelio y se la ó con MCA líquido
con el obje o de elimina el Tween esidual. Se pesa on en e 1 y 1,5 g de micelio y se
deposi a on en un ubo de 50 mL que con enía 16 mL de solución de ob ención de
p o oplas os (Tabla 6) y 16 mL de MCA líquido con los suplemen os eque idos. Se
incubó la mezcla a 30 °C en agi ación (100 pm) du an e 90-120 minu os. Du an e el
p oceso de diges ión, se agi ó la suspensión a baja elocidad du an e 5 segundos
u ilizando un o ex cada 15 minu os pa a a o ece la sepa ación de los p o oplas os y
el micelio. Se obse ó la apa ición de p o oplas os ap oximadamen e a los 60 minu os de
incubación. Una ez ob enidos los p o oplas os, se di idió la mezcla en dos ubos de
50 mL que con enían 16 mL de la solución de D(+)-saca osa 1,2 M; la mezcla se añadió
len amen e u ilizando una pis ola auxilia de pipe eado (Accu-Je ®, B and). Una ez
añadida la mezcla de p o oplas os a la saca osa, se p ocedió a cen i uga los ubos a
1800 g du an e 10 minu os a 4 °C (So allTM Bio uge P imo R, The mo Scien i ic). T as
habe inalizado la cen i ugación, se ecogió la banda de p o oplas os de la in e ase en e
la saca osa y la mezcla de p o oplas os (sin micelio) y se deposi ó en un ubo de 50 mL
p e iamen e en iado en hielo. Pos e io men e, se añadió a los p o oplas os ecogidos de
la in e ase el doble del olumen de KCl 0,6 M ío y se mezcló sua emen e po in e sión.
Se ol ió a cen i uga la mezcla esul an e a 1800 g du an e 10 minu os a 4 °C, se e i ó
el sob enadan e y se p ocedió a esuspende el p ecipi ado de p o oplas os en 2 mL de
KCl 0,6 M ío. La suspensión de p o oplas os esul an e se di idió en dos ubos de 2 mL
y se cen i ugó a 2400 g du an e 3 minu os a empe a u a ambien e (So allTM LegendTM
Mic o 21R, The mo Scien i ic). Se e i ó el sob enadan e y se esuspendie on ambos
p ecipi ados en un único ubo de 1 mL de KCl 0,6 M. P e ia la ans o mación de los
p o oplas os, se cen i ugó el ubo a 2400 g du an e 3 minu os a empe a u a ambien e, se
e i ó el sob enadan e y se esuspendió inalmen e el p ecipi ado en 1 mL de KCl 0,6 M
y CaCl2 50 mM.
7.2. T ans o mación de p o oplas os
Una ez ob enidos los p o oplas os y es ando e-suspendidos en la solución KCl
0,6 M y CaCl2 50 mM se añadie on 100 μL de la suspensión de p o oplas os y 10 μL de
ADN en un ubo de 50 mL; a modo de con ol, se añadie on o os 100 μL de la suspensión
de p o oplas os a o o ubo de 50 mL, pe o no se añadió ADN. Ac o seguido, se mezcló
el con enido median e agi ación po o ex en e 6 y 8 eces du an e 2 segundos a
elocidad máxima; es e paso es c í ico pa a asegu a una buena e iciencia en la
MATERIALES Y MÉTODOS
37
ans o mación. A con inuación, se 50 μL de solución 8 (a empe a u a ambien e)
añadie on a cada ubo y se mezcla on median e agi ación po o ex 4-6 eces du an e
2 segundos a la misma elocidad que el an e io paso. Inmedia amen e, se in oduje on
los ubos en hielo y se incuba on du an e 25 minu os. Una ez inalizada la incubación,
se añadió 1 mL de solución 8 a ambos ubos y se homogeniza on las mues as po
golpe eo con los dedos; se deja on incuba los ubos a empe a u a ambien e du an e
5 minu os. Finalmen e, se añadie on 5 mL de solución 7 a empe a u a ambien e y luego
MMR-TOP has a los 20 mL, es e úl imo, p e iamen e undido y man enido a 50 °C has a
el momen o de la ans o mación. Las mezclas esul an es se e ie on en cinco placas,
de las cuales, una con enía medio no selec i o, y cua o con enían medio selec i o. En el
caso del ubo que con enía el con ol sin ADN, se e ió la mezcla en dos placas, de las
cuales una con enía MMR con medio no selec i o (en el cual debe ían ge mina y c ece
los p o oplas os) pa a con i ma la iabilidad de los p o oplas os y una placa que con enía
MMR con medio selec i o a modo de con ol nega i o (en el que no debe ía de c ece
nada) pa a e i ica que no hubie a con aminan es. Po o o lado, el con enido del ubo
con ADN se e ió en es placas de MMR con medio selec i o pa a que solo c ecie an
aquellos p o oplas os que habían sido ans o mados. Las placas se incuba on du an e 3-
5 días. Finalmen e, las colonias ans o ma es ue on aisladas y e escadas en placas que
con enían medio selec i o pa a con i ma que no e a un con aminan e.
8. Aislamien o y manipulación de ácidos nucleicos
8.1. Gene ación de mu an es nulos y e ique ado de genes con o sin p omo o
inducible
Los case es genómicos que se han u ilizado en es a esis pa a la deleción y el
e ique ado de genes de A. nidulans ue on cons uidos u ilizando los p o ocolos de PCR
de usión (Yang e al., 2004) y Touchdown PCR y (Ko bie y Ma ick, 2008). Los case es
que se diseña on pa a la gene ación de mu an es nulos se cons uye on ampli icando
median e PCR po un lado los agmen os co espondien es a la egión 5´-UTR o
p omo o y la egión 3´-UTR o e minado del gen candida o a se delecionado.

MATERIALES Y MÉTODOS
38
Figu a 8. PCR de usión y e ique ado de genes. Delecin de genes: P ime o, se ampli ica on el p omo o (azul), el ma cado de
selección (
na anja) y el e minado ( e de) u ilizando los oligonucleó idos especí icos (PP, P omo e P ime y GSP, Gene S
peci ic
P ime ) PP1/PP2, SMP1/GFP2 y GSP3/GSP4, espec i amen e. Los oligonucleó idos SMP1 y GFP2, han sido diseñados con una
egión complemen a ia al inal del p omo o y p incipio del e minado , espec i amen e. Ac o seguido, los agmen os se usiona on
median e PCR u ilizando los oligonucleó idos PP1 y GSP4. El gen a deleciona (
mo ado
) es eemplazado en la ans o mación
median e ecombinación del p oduc o de PCR, el cual con iene el ma cado de selección. E ique ado de genes en el ex emo 3 :
P ime o, se ampli ica on 1,5 kb del gen a e ique a (sin codón s op;
mo ado), el ep opo (ama illo
) jun o al ma cado de selección
(na anja
) y el e minado ( e de
) u iliza on los pa es de oligonucleó idos GSP1/GSP2, GFP1/GFP2 y GSP3/GSP4, espec i amen e.
Los es agmen os se usiona on u ilizando los oligonucleó idos GSP1 y GSP4. El gen a e ique a , es eemplazado po el p oduc o de
usión con el epí opo deseado (TAG: GFP, mRFP o HA
3x).
Figu a 7. Cons ucción de los plásmidos bajo p omo o inducible: Pa a lle as a cabo la diges ión del agmen o de 1 kb del gen luG
(mo ado
) y el plásmido pNT5, el cual con iene el p omo o inducible alcA ( osa) el epí opo de in e és (ama illo
) y el ma cado gené ico
(na anja), se u iliza on las enzimas de es icción AscI y BamHI en los ex emos 5´ y 3´, espec i amen e. Una ez lle ada a cabo la
ligación, los plásmidos se secuencia on pa a desca a la p esencia de mu aciones no deseadas. T as lle a a cabo la ans o mación y
ecombinación del plásmido en la egión de 1 kb del gen luG, la co ec a in eg ación se con i mó median e Sou he n blo .
MATERIALES Y MÉTODOS
39
Po o o lado, se ampli icó el ma cado de selección que se deseaba inse a en luga
del gen diana, empleando oligonucleó idos con colas complemen a ias al ex emo 3´ del
p omo o y al ex emo 5´ del e minado que ue on ampli icados p e iamen e. Una ez
ob enidos los es agmen os, se usiona on median e PCR de usión o Touchdown PCR,
quedando el ma cado de selección en e los agmen os co espondien es al p omo o y
e minado (Figu a 8).
El e ique ado de p o eínas se e ec uó an o en el ex emo amino (5´ del gen) como
el ca boxilo e minal (3´ del gen) con los epí opos GFP, HA3x, mRFP o mChe y. El
e ique ado del ex emo amino e minal se e ec uó ampli icando median e PCR po un
lado los agmen os co espondien es a la egión 5´-UTR o p omo o y un agmen o que
con enía el gen candida o a se e ique ado y la egión 3´-UTR o e minado del mismo
gen. Po o o lado, se ampli icó el epí opo que se deseaba inse a en el ex emo amino
e minal del gen, empleando oligonucleó idos con colas complemen a ias al ex emo 3´
del p omo o y al ex emo 5´ del gen que ue on ampli icados p e iamen e. Una ez
ob enidos los es agmen os, se usiona on median e PCR de usión o Touchdown PCR,
quedando el epí opo en e los agmen os co espondien es al p omo o y el gen con el
e minado (Figu a 8). El e ique ado en el ex emo ca boxilo e minal se e ec uó
ampli icando una egión de 1,5 kb del ex emo ca boxilo e minal del gen candida o a se
e ique ado, y el e minado del mismo gen. De la misma o ma, se ampli icó un agmen o
que con enía el epí opo que se deseaba inse a en el ex emo ca boxilo e minal jun o
con un ma cado de selección adecuado, u ilizando oligonucleó idos con colas
complemen a ias al ex emo 3´ del gen que se que ía e ique a y al ex emo 5´ del
e minado que ue on ampli icados p e iamen e (Figu a 8).
El e ique ado en el ex emo amino e minal bajo el p omo o inducible alcA(p) se
lle o a cabo u ilizando el plásmido pNT5 3.1. Plásmidos u ilizados en A. nidulans). Pa a
ello, se ampli ica on ap oximadamen e 1 kb (sin el codón ATG) del gen luG y se
emplea on las écnicas de diges ión y ligación de alladas en el apa ado 10.4. Diges ión y
ligación de plásmidos y agmen os de ADN pa a lle a a cabo la cons ucción del
plásmido (Figu a 7).
MATERIALES Y MÉTODOS
40
8.2. Ex acción de ADN genómico
Es a écnica se u ilizó siguiendo el p o ocolo de (Samb ook e al., 1989).
Pa a ex ae ADN genómico se inocula on 1x106 conidias/mL de cada cepa en un
ma az de 100 mL con 25 mL de MMA líquido jun o con los suplemen os necesa ios y
se cul i ó a 37 °C oda la noche en agi ación (220 pm). El micelio se il ó a a és de
Mi aclo h, se in odujo en ubos cónicos de 2 mL y se lio ilizó (C yodos, Tels a ®) oda
la noche. Una ez ecogido el micelio lio ilizado, se añadió una bola de ace o inoxidable
de 3,2 mm de diáme o (Nex Ad ance) y se pul e izó el micelio lio ilizado con el
homogeneizado (Mini-Beadbea e , Biospec) en dos pulsos de 5 segundos con agi ación
mediana. Ac o seguido, se e i ó la bola y se añadió 1 mL de la solución TSE (Tabla 7),
100 μL de SDS al 10 % (p/ ) y se esuspendió la mues a po pipe eo has a que el micelio
pul e izado quedase comple amen e húmedo.
Tabla 7. Soluciones u ilizadas en la ex acción de ADN genómico de A. nidulans
Soluciones
P epa ación pa a 100 mL
T is-HCl 1 M (pH 8,0)
T izma®
12,114 g
Ajus a el pH a 8,0 (con HCl)
D(+)-saca osa 1 M
D(+)-saca osa
34,23 g
EDTA 0,5 M
EDTA
18,61 g
Solución TSE
(T is-HCl 25 mM / D(+)-Saca osa
250 mM / EDTA 20 mM)
T is-HCl 1 M (pH 8,0)
2,5 mL
D(+)-saca osa
25 mL
EDTA 0,5 M
4 mL
SDS 10 %
SDS
10 g
NaOAc 3 M (pH 6)
NaOAc
24,609 g
Ajus a el pH a 6,0 (con OAc)
Fenol/Se ag
(Se ag = Clo o o mo:Alcohol isoamílico;
24:1)
Fenol o gánico
25 mL
Clo o o mo
24 mL
Alcohol isoamílico
1 mL
Gua da a 4 C
Se incubó la mezcla du an e 15 minu os a 65 °C, mezclando el lisado po le e
golpe eo manual du an e la incubación. Ac o seguido, se añadió 1 mL de Fenol/Se ag
(Tabla 7), se agi ó la mezcla igo osamen e en o ex y se con inuó con una agi ación po
in e sión egula du an e 10 minu os. Se cen i uga on los ubos a empe a u a ambien e
du an e 5 minu os a máxima elocidad y se sepa ó la ase o gánica y la acuosa. Se ecogió
la ase supe io (acuosa) en o o ubo de 2 mL y se epi ió la enolización.
Una ez e minada la segunda enolización, se añadió a la ase acuosa 0,1 y 0,6
olúmenes de NaOAc 3 M (Tabla 7) e isop opanol, espec i amen e, espec o al olumen
MATERIALES Y MÉTODOS
41
ecogido p e iamen e. La mezcla se mezcló po in e sión y se incubó du an e 15 minu os
a empe a u a ambien e (en es e pun o un pelle blanco de ADN se hacía isible). Se
cen i ugó du an e 5 minu os, se e i ó el sob enadan e po aspi ación y se le añadió 1 mL
de E OH al 80 % ( / ) pa a la a el p ecipi ado. Se ol ió a cen i uga la mues a a
máxima elocidad y se e i ó el e anol median e aspi ación. El p ecipi ado se esuspendió
en 400 μL de agua Milli-Q® (Millipo eTM), se añadie on 4 μL de ARNasa (5 mg/mL)
(Sigma-Ald ich) y se incubó a 37 °C du an e 45 minu os pa a elimina el ARN p esen e
en la mues a. Se ol ie on a añadi 0,1 y 0,6 olúmenes de OAcNa (3 M) e isop opanol,
espec i amen e y se mezcló po in e sión. A con inuación, u ilizando una pun a de
pipe a, se ecogió la madeja de ADN y se ans i ió a un ubo de 2 mL con 500 μL de
E OH al 80 % ( / ). Seguidamen e, se cen i ugó la mues a a empe a u a ambien e
du an e 5 minu os a máxima elocidad y se eliminó el e anol en acío. Se dejó seca el
ADN con el ubo abie o pa a elimina los es os de e anol y se esuspendió en 200 μL de
agua Milli- Q®. Se ealizó una elec o o esis en gel de aga osa al 0.8 % (p/ ) pa a
comp oba el es ado y el amaño del ADN ex aído.
8.3. Sou he n Blo
Es a écnica diseñada po (Samb ook e al., 1989) se u ilizó pa a comp oba que la
ecombinación de los dis in os agmen os de ADN en los ans o man es de Aspe gillus
nidulans se había desa ollado co ec amen e. Las soluciones u ilizadas es án de alladas
en la Tabla 8. El e ique ado y de ección de las sondas se ealizó con el ki DIG-High
P ime DNA Labeling and De ec ion S a e Ki II (Roche).
Una ez se comp obó el es ado de las alícuo as de ADN ob enidas median e el
mé odo de ex acción de ADN desc i o an e io men e, se p ocedió a dige i las con una
endonucleasa de es icción que pe mi ie a dis ingui la co ec a ecombinación del
agmen o a inse a en el locus adecuado, espec o al ADN de la cepa pa en al. Se e ec uó
la diges ión en unción de las ins ucciones del ab ican e, y se dejó incubando a 37 °C
du an e oda la noche. Una ez inalizada la diges ión, se p ocedió a sepa a los
agmen os po su peso molecula median e una elec o o esis en gel de aga osa al 0,8 %
(p/ ), du an e 2-3 ho as. Una ez inalizada la elec o o esis, se expuso el gel a luz UV
(320 nm, Vilbe Lou ma ) du an e 5 minu os pa a que los agmen os de ADN sepa ados
su iesen una mayo deg adación, con el obje i o de acili a la ans e encia de
agmen os de g an amaño. Ac o seguido, se deposi ó el gel en una uen e y se sepa a on
MATERIALES Y MÉTODOS
48
10. Técnicas de biología molecula pa a Esche ichia coli
10.1. Medios de cul i o y condiciones pa a E. coli
El medio de cul i o u ilizado pa a Esche ichia coli ue LB (Be ani, 1951)
modi icado (Samb ook e al., 1989). La composición es á desc i a en la Tabla 9.
Tabla 9. Composición de medios de cul i o de E.coli
Medios de cul i o
Can idades po li o
LB líquido
Bac o ip ona (1 %)
10 g
Ex ac o de le adu a
(0,5 %)
5 g
NaCl (1 %)
10 g
Ajus a el pH a 7 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
LB sólido
Bac o ip ona (1 %)
10 g
Ex ac o de le adu a
(0,5 %)
5 g
NaCl (1 %)
10 g
Aga (1,5 %)
15 g
Ajus a el pH a 7 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
La selección de ans o man es se hizo en un medio que con enía el an ibió ico ampicilina
(50 mg/mL en agua) con una concen ación de 100 μg/mL.
10.2. T ans o mación de E. coli
La ans o mación de E. coli se lle ó a cabo median e la écnica de choque é mico
(Hanahan, 1983). Todo el p oceso se lle ó a cabo en un ubo de 1,5 mL, en el que se
añadie on 100 μL de células compe en es de las cepas DH1 o DH5α y 1-2 μL de ADN
plasmídico. Se dejó eposa la mezcla en hielo du an e 20 minu os, y ac o seguido se
indujo en choque é mico incubando la mezcla a 42 °C du an e 2 minu os y se dejó o a
ez en hielo du an e 1 minu o. A con inuación, se añadió 1 mL de medio LB líquido y se
incubó a 37 °C du an e 1 ho a con agi ación a 250 pm. Finalizado el pe iodo de
incubación, se inocula on en e 50 y 100 μL de la mezcla de ans o mación en placas de
Pe i de 90 mm que con enían medio LB sólido suplemen ado con ampicilina. En el caso
de las ligaciones, se cen i ugó la mezcla a 2500 pm du an e 3 minu os, se e i a on
900 μL de sob enadan e y se concen ó la mezcla de ans o mación en los 200 μL de

MATERIALES Y MÉTODOS
49
sob enadan e es an es pa a pos e io men e inocula lo en placas suplemen adas con
ampicilina.
10.3. Ex acción de ADN plasmídico
10.3.1. Ex acción de ADN plasmídico a pa i de colonias
Es e mé odo de ex acción se u ilizó pa a con i ma si las colonias ans o man es
con enían el plásmido de in e és. La composición de las soluciones u ilizadas pa a ex ae
ADN plasmídico de medio sólido es á de allada en la Tabla 10.
Tabla 10. Soluciones u ilizadas pa a la ex acción de ADN plasmídico en medio sólido
Soluciones
Can idades po 10 mL
Solución de lisis
T is-HCl 1 M (pH 8)
100 μl
EDTA 0,5 M (pH 8)
200 μl
NaOH 10 M
100 μl
SDS (10 %)
1000 μl
GLB
Glice ol
500 μl
Xileno-cianol
2,5 μl
Azul de b omo enol
2,5 μl
HCl 1 N + GLB
HCl 1 N
3,34 mL
GLB
6,66 mL
Pa a empeza , se añadie on 40 μl de solución de lisis en un ubo de 1,5 mL. Se omó
una mues a de la colonia ans o man e con un palillo es é il y se o ó epe idamen e
con a la pa ed del ubo has a que se deposi ó isiblemen e la biomasa. Ac o seguido, se
mojó el palillo en la solución de lisis emo iendo la mezcla y se dejó incuba a
empe a u a ambien e du an e 15 minu os. T as ello, se añadie on 8 μl de la solución HCl
(1 N) + GLB y se obse ó un colo e de oscu o en la disolución. Se añadió la can idad
necesa ia de solución de lisis has a que la mezcla adqui ió un colo azul y se congeló la
mezcla a -80 °C du an e 15 minu os. Finalizado es e iempo, se cen i ugó a 13000 pm a
4 °C du an e 10 minu os y se u iliza on 20 μl de sob enadan e pa a hace una
elec o o esis en gel de aga osa al 0,8 % (p/ ).
10.3.2. Ex acción de ADN plasmídico de cul i o líquido
Es e mé odo de ex acción se u ilizó pa a pu i ica el plásmido de in e és de las
colonias ans o man es que se habían con i mado con el mé odo de ex acción de ADN
plasmídico de medio sólido. La ex acción del ADN plasmídico se e ec uó inoculando
p ime o una alícuo a de la colonia bac e iana a analiza en 25 mL de medio LB líquido
MATERIALES Y MÉTODOS
50
suplemen ado con ampicilina. Se cul i ó la mezcla a 37 °C du an e oda la noche con una
agi ación de 200 pm. La ex acción se lle ó a cabo siguiendo las indicaciones del ki
GenElu eTM Plasmid MiniP ep Ki (Sigma-Ald ich). Finalizada la ex acción, se e i icó
la co ec a ex acción del ADN plasmídico, ealizando una elec o o esis en gel de
aga osa al 0,8 % (p/ ).
10.4. Diges ión y ligación de plásmidos y agmen os de ADN
Tan o el plásmido pNT5 como los dis in os agmen os se digi ie on po sepa ado
con las enzimas AscI (New England BioLabs®) y BamHI (Taka a Bio Inc.) u ilizando el
p o ocolo de diges ión acili ado po el ab ican e. La diges ión con ambas enzimas se
e ec uó a 37 °C du an e al menos 1 ho a y 30 minu os, y se comp obó que la diges ión se
comple ó ealizando una elec o o esis en gel de aga osa al 0,8 % (p/ ). T as con i ma
la co ec a diges ión, se inac i ó la enzima a a 80 °C du an e 20 minu os y se pu i icó
u ilizando el ki NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up (Mache ey-Nagel GmbH & Co),
pa a e i a cualquie eac i o que pudie a causa in e e encias en la segunda diges ión.
Una ez inalizadas ambas diges iones, se p ocedió a medi la concen ación en
μg/μl del plásmido y el agmen o u ilizando el espec o o óme o NanoD opTM 2000c
(The mo Fishe Scien i ic), y se calculó la concen ación de ambos en picomoles,
aliéndonos de la he amien a digi al DNA μg & pmol Con e e (Gene In ini y LLC).
La ecuación u ilizada po la he amien a, es la siguien e:
𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝐷𝑁𝐴 · 𝑝𝑚𝑜𝑙
660𝑝𝑔 · 106𝑝𝑔
1𝜇𝑔 · 1
𝑛º𝑑𝑒 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒ó𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠 =𝑝𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐷𝑁𝐴
T as ob ene las concen aciones, se p ocedió a p epa a la ligación añadiendo an o
el plásmido como el agmen o en una elación 1:3, espec i amen e. La ligación de lle ó
a cabo u ilizando la enzima T4 DNA Ligase (Taka a Bio Inc.) siguiendo el p o ocolo de
ligación acili ado po el ab ican e. La ligación se e ec uó a empe a u a ambien e
du an e al menos 4 ho as, y se ans o mó odo el p oduc o de ligación en E. coli
u ilizando el p o ocolo desc i o an e io men e (7.2. T ans o mación de p o oplas os).
MATERIALES Y MÉTODOS
51
11. Técnicas de biología molecula pa a Lac obacillus pa acasei y
Pseudomonas ae uginosa
11.1. Medios de cul i o y condiciones pa a L. pa acasei y P. ae uginosa
La composición de los medios de cul i o u ilizados an o pa a Lac obacillus
pa acasei (De Man e al., 1960) y Pseudomonas ae uginosa (Lapage e al., 1970) es án
desc i os en la Tabla 11 y Tabla 12, espec i amen e.
Tabla 11. Composición de los medios de cul i o u ilizados en Lac obacillus pa acasei
Medios de cul i o
Can idades po li o
MRS líquido
D(+)-glucosa
20 g
Pep ona
10 g
Ex ac o de ca ne
10 g
Ex ac o de le adu a
5 g
NaOAc
5 g
K2HPO4
2 g
Ta a o amónico
2 g
Tween 80 %
1 g
MgSO4·7H2O
0,1 g
MnSO4·H2O
0,05 g
Ajus a el pH a 6,2 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
MRS sólido
D(+)-glucosa
20 g
Pep ona
10 g
Ex ac o de ca ne
10 g
Ex ac o de le adu a
5 g
NaOAc
5 g
K2HPO4
2 g
Ta a o amónico
2 g
Tween 80 %
1 g
MgSO4·7H2O
0,1 g
MnSO4·H2O
0,05 g
Aga
15 g
Ajus a el pH a 6,2 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
Tabla 12. Composición de los medios de cul i o u ilizados en Pseudomonas ae uginosa
Medios de cul i o
Can idades po li o
Medio de nu ien es líquido
T is HCl
5 g
Ex ac o de le adu a
2 g
Ex ac o de ca ne
1 g
NaCl
5 g
Ajus a el pH a 7,2 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
MATERIALES Y MÉTODOS
52
Medio de nu ien es sólido
Pep ona
5 g
Ex ac o de le adu a
2 g
Ex ac o de ca ne
1 g
NaCl
5 g
Aga (1,5 %)
15 g
Ajus a el pH a 7,2 (con NaOH)
Es e iliza en au ocla e
11.2. Ex acción de ADN genómico en bac e ia
11.2.1. Ex acción de ADN genómico de Lac obacillus pa acasei
Es e mé odo de ex acción se u ilizó pa a pu i ica el ma e ial gené ico de L.
pa acasei (Klaenhamme , 1984), la p epa ación de las soluciones u ilizadas es á desc i a
en la Tabla 13.
Tabla 13. Soluciones u ilizadas pa a la ex acción de ADN de Lac obacillus pa acasei
P epa ación de soluciones
Can idades po li o
Solución de lisis
T is-HCl 1 M (pH 8)
20 mL
Tween 20 %
12 mL
EDTA 0,5 M (pH 8)
4 mL
20 g de Lisozima (Sigma-Ald ich)
Gua da a -20 °C
La ex acción se e ec uó inoculando p ime o una alícuo a de la colonia bac e iana
en 25 mL de medio MRS líquido. Se cul i ó la mezcla a 37 °C du an e oda la noche con
una agi ación de 200 pm. T as ello, se eliminó el sob enadan e y se esuspendie on las
células en 180 μL de solución de lisis y 20 μL de mu anolisina (1 mg/mL) (Sigma-
Ald ich), dejando incuba la mezcla du an e 1 ho a con agi ación a 200 pm. Ac o
seguido, se lle ó a cabo la ex acción de ADN genómico siguiendo las indicaciones del
ki NucleoSpin® Tissue (Mache ey-Nagel GmbH & Co). Finalizada la ex acción, se
e i icó el es ado del ADN genómico ealizando una elec o o esis en gel de aga osa al
0,8 % (p/ ).
11.2.2. Ex acción de ADN genómico de Pseudomonas ae uginosa
La ex acción de ADN genómico de P. ae uginosa se e ec uó u ilizando un ki de
ex acción de ADN genómico de bac e ias. P ime o se inoculó una alícuo a de la colonia
bac e iana en 25 mL de medio de nu ien es líquido. Se cul i ó la mezcla a 37 °C du an e
oda la noche con una agi ación de 200 pm. T as ello, se eliminó el sob enadan e y se
lle ó a cabo la ex acción de ADN genómico siguiendo las indicaciones del ki
MATERIALES Y MÉTODOS
53
NucleoSpin® Tissue (Mache ey-Nagel GmbH & Co). Finalizada la ex acción, se e i icó
el es ado del ADN genómico ealizando una elec o o esis en gel de aga osa al 0,8 %
(p/ ).
12. Aislamien o y manipulación de p o eínas en Aspe gillus nidulans
12.1. Ex acción de p o eínas
Tabla 14. Soluciones u ilizadas pa a la ex acción de p o eínas de Aspe gillus nidulans
Soluciones
Can idades po 100 mL
Solución de lisis
NaOH 10 M
1 mL
β-me cap oe anol
100 μL
Gua da a 0 °C
TCA 100 %
TCA
220,26 g
Cub i la bo ella con papel de aluminio
Gua da a 4 °C
T is Base 1 M
T izma®
12,114 g
Gua da a 4 °C
T is-HCl 0,5 M (pH 6,8)
T izma®
6,057 g
Ajus a el pH a 6,8 (con HCl)
SDS 10 %
SDS
10 g
Tampón de up u a
T is-HCl 0,5 M (pH 6,8)
1,66 mL
SDS 10 %
2 mL
β-me cap oe anol
500 μL
U ea
3,6 g
Gua da a -20 °C
La ex acción de p o eínas se lle ó a cabo median e el mé odo desc i o po (He ás-
Aguila y Peñal a, 2010). Se inocula on 2·106 conidias/mL de cada cepa en un ma az de
250 mL con 50 mL de medio líquido jun o con los suplemen os necesa ios y se cul i ó el
inóculo a 37 °C du an e 18 ho as en agi ación (220 pm). El micelio se il ó a a és de
Mi aclo h es é il, se in odujo en ubos cónicos de 2 mL y se lio ilizó (C yodos, Tels a ®)
oda la noche. Una ez ecogido el micelio lio ilizado, se añadió una bola de ace o
inoxidable y se pul e izó el micelio lio ilizado con el homogeneizado (Mini-Beadbea e ,
Biospec) en dos pulsos de 5 segundos con agi ación mediana. Ac o seguido se ecogie on
6-7 mg de micelio pul e izado en un nue o ubo de 2 mL y se esuspendió en 1 mL de
ampón de lisis Tabla 14. Se disol ió el micelio mezclando el ubo igo osamen e en el
o ex, se añadió 75 μL de TCA 100 % (p/ ) pa a p ecipi a las p o eínas y se incubó la
mezcla du an e 10 minu os en hielo. Finalizada la incubación, se cen i ugó a 14000 pm
du an e 5 minu os a 4 °C y se eliminó el TCA median e aspi ación. Se epi ió es e paso

MATERIALES Y MÉTODOS
54
pa a e i a el TCA esidual. Seguidamen e, se añadie on 100 μL de T is Base (1 M) y
200 μL de ampón de up u a, se mezcló median e agi ación po o ex y se gua dó la
mues a a -20 °C. P e iamen e a se ca gadas en un gel de SDS-poliac ilamida, se
descongela on las mues as en hielo y se agi a on en o ex du an e 30 segundos. Ac o
seguido, se hi ie on a 95 °C du an e 5 minu os y se cen i uga on du an e 1 minu o a
elocidad máxima.
12.2. Wes e n blo
Los ex ac os p o eicos ue on ca gados en un gel SDS-poliac ilamida pa a ealiza
la sepa ación de los mismos (Samb ook e al., 1989). Una ez se desna u aliza on las
mues as con las condiciones desc i as p e iamen e, se ca ga on en dos geles con una
concen ación de poliac ilamida del 10 % (Mini-PROTEAN® 3, Bio-Rad) (Laemmli,
1970). La in eg idad de los ex ac os p o eicos se analizó iñendo uno de los geles con
Bio-Sa eTM Coomassie. Una ez con i mado el co ec o es ado de los ex ac os p o eicos,
se p ocedió a la ans e encia del segundo gel a una memb ana de PVDF (T ans-blo ®
Tu boTM Midi PVDF T ans e Pack, Bio-Rad). Pa a comp oba que la can idad de
p o eína ue a la misma en odas las mues as, se empleó el mé odo Ponceau S aining
(Goldman e al., 2016). Una ez hecha la comp obación, los epí opos co espondien es
se de ec a on median e la hib idación con an icue pos p ima ios especí icos, y es os
an icue pos p ima ios se hib ida on con an icue pos secunda ios adecuados con ac i idad
pe oxidasa (Tabla 15).
Tabla 15. An icue pos u ilizados en el Wes e n blo
Es a ac i idad se indujo median e el ki de quimioluminiscencia ECL (Cla i yTM
Wes e n ECL Blo ing Subs a e, Bio-Rad) y la memb ana se e eló con el disposi i o
ChemiDocTM XRS+ Sys em (Bio-Rad). Las imágenes se analiza on median e el so wa e
ImageLab ( e sión 5.2, Bio-Rad).
An icue pos
Dilución
O igen
Fab ican e
P ima io
-GFP
1/5000
Ra ón
Roche
-HA
1/7500
Ra ón
San a C uz
Secunda io
- a ón IgG
1/4000
Cab a
Jackson InmunoResea ch
Labo a o ies INC
MATERIALES Y MÉTODOS
55
13. He amien as de análisis bioin o má ico
El análisis bioin o má ico de la secuencia genómica y p o eica de luG se lle ó a
cabo empleando las he amien as ci adas a con inuación.
13.1. Cons ucción y secuenciación
Las dis in as secuencias analizadas en es e abajo se ob u ie on a pa i de las bases
de da os Aspe gillus Genome Da abase (www.aspgd.o g/) (Ce quei a e al., 2014) y
Ensembl Genomes (www.ensemblgenomes.o g/) (Ke sey e al., 2018). Las
cons ucciones genómicas y plasmídicas se diseña on u ilizando el p og ama Vec o
NTI® e sión 10.1.1 (In i ogen). Los esul ados ob enidos de la secuenciación de
dis in os mu an es se compa a on con la secuencia o iginal del gen u ilizando la
he amien a Lalign (www.embne . i al-i .ch/so wa e/LALIGN_ o m.h ml), la cual
implemen a un algo i mo (Huang e al., 1990).
13.2. Análisis in silico de FluG
La secuencia p o eica de FluG se analizó u ilizando una se ie de p edic o es
especí icos pa a los dominios que se de allan a con inuación: El pép ido señal, el cual
señala el des ino, la u a de anspo e y la e iciencia de sec eción de una p o eína, se
p edijo median e la he amien a SignalIP 4.1 (Nielsen, 2017). Las señales de localización
y expo ación nuclea , que habili an el anspo e po el po o nuclea , se p edije on
median e las he amien as NLS adamus (Nguyen Ba e al., 2009) y Ne NES 1.1 (la Cou
e al., 2004), espec i amen e. La p esencia de hélices ansmemb ana, las cuales pueden
indica , según su con o mación que la p o eína in e ac úa con la memb ana celula , se
p edije on u ilizando la he amien a TMHMM se e 2 (Sonnhamme e al., 1998).
Finalmen e, los mo i os PEST, los cuales son candida os a se co ados median e
p o eólisis, se p edije on u ilizando la he amien a epes ind (Rechs eine y Roge s,
1996). La iden i icación de los mo i os uncionales se lle ó a cabo u ilizando la
he amien a HMMER (www.ebi.ac.uk/Tools/hmme /sea ch/phmme ).
13.3. Búsqueda de homólogos de FluG en bac e ias y plan as
U ilizando la secuencia p o eica de FluG como e e encia, se busca on o ólogos en
bac e ias, hongos y plan as ealizando un BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool),
(h ps://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=Blas Home) en el
MATERIALES Y MÉTODOS
56
apa ado P o ein Blas (Bo a yn e al., 2013). Se u ilizó el algo i mo BLOSUM26 como
ma iz de e e encia, ijando el lími e de e aluación del alineamien o (E- alo ) en 2e-100.
Una ez ob enidos los o ólogos, se p ocedió a hace un alineamien o múl iple de odas
las secuencias u ilizando la he amien a Clus al Omega
(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clus alo/) acili ado po EBI (Eu opean Bioin o ma ics
Ins i u e) (Li e al., 2015). Los alineamien os se isualiza on u ilizando el p og ama
Jal iew e sión 2.10.3b1 (Wa e house e al., 2009), y la conse ación de cada esiduo de
odos los homólogos ob enidos se ob u o u ilizando el algo i mo de di e gencia Jensen-
Shannon (Cap a y Singh, 2007). El alo de la iden idad de odos los o ólogos de FluG
se ob u o como una media de las iden idades de odas las iden idades de los o ólogos de
FluG en bac e ia, hongo y plan a, en compa ación con el FluG de Aspe gillus nidulans.
La cons ucción del á bol ilogené ico se lle ó a cabo u ilizando el so wa e MEGA7
(Kuma e al., 2016) y aplicando el mé odo basado en la mínima e olución (Neighbo -
Joining Me hod) (Sai ou y Nei, 1987). Los esul ados ue on pos e io men e edi ados
u ilizando la he amien a iTOL (In e ac i e T ee O Li e) (Le unic y Bo k, 2019). La
búsqueda de ope ones p edichos en bac e ia que codi ica an ambas egiones de FluG se
lle ó a cabo median e los p edic o es Ope onDB (Pe ea e al., 2009) y P oOpDB
(Taboada e al., 2012).
13.4. Búsqueda de es uc u as de c is al median e SWISS-MODEL
U ilizando la secuencia p o eica de FluG como e e encia, se u ilizó la he amien a
SWISS-MODEL (www.swissmodel.expasy.o g/) (Biasini e al., 2014) pa a iden i ica
es uc u as de c is al homólogas a ambas egiones de FluG. T as habe ob enido a ias
es uc u as candida as a se i como modelos de FluG, p e iamen e a se u ilizadas, se
e i icó si se había ca ac e izado la eacción enzimá ica que desempeñaban. Las
es uc u as de c is al de cada egión de FluG ue on ob enidas de P o ein Da a Bank
(PDB) (Be man e al., 2002).
13.5. Modelado de FluG median e MAESTRO
El modelado de FluG se lle ó a cabo u ilizando el p og ama MAESTRO,
p opo cionado po Sch ödinge Sui e, e sión 2017-1 (Sas y e al., 2013). P ime o, se
lle ó a cabo un p ep ocesado de la es uc u a de c is al candida a a se u ilizada como
molde. Pa a ello, den o del p og ama MAESTRO, se u ilizó la aplicación P o ein
MATERIALES Y MÉTODOS
57
P epa a ion Wiza d pa a elimina moléculas de agua, añadi los á omos de hid ógeno y
de ec a p oblemas es uc u ales del modelo. Las cadenas la e ales de aminoácidos que
al aban en el modelo, se gene a on u ilizando la aplicación P ime (Jacobson e al., 2004),
mien as que los es ados de p o onación de cada cadena la e al ue on gene ados
u ilizando la he amien a EPIK a pH = 7 (Shelley e al., 2007). Ac o seguido, se p ocedió
a la minimización del modelo u ilizando el campo de ue za OPLS3 (Shi akuma e al.,
2010; Ha de e al., 2016). Una ez inalizado el p ocesado de los c is ales, se p ocedió a
cons ui los modelos de FluG con las es uc u as de c is al a adas, u ilizando el
p og ama P ime. El alineamien o u ilizado pa a la gene ación de los modelos de cada
egión de FluG ue el ob enido po la he amien a SWISS-MODEL.
14. Mic oscopía de luo escencia
La localización subcelula de FluG en Aspe gillus nidulans se analizó u ilizando el
mic oscopio in e ido Zeiss Axio Obse e Z1 equipado con una len e de inme sión en
acei e (63x, Plan Apoch oma ), una cáma a Axiocam MRm Re .3, una uen e de luz
ex e na Zeiss HXP 120C pa a los expe imen os de epi luo escencia y los il os e de
( il o 38 HE, exci ación 470/40; emisión 525/50), ojo ( il o 43 HE, exci ación 545/25;
emisión 605/70) y DAPI ( il o 49; exci ación 365 nm; emisión 445 nm).
El análisis de las imágenes ob enidas en el mic oscopio se ealizó median e el
so wa e de lib e acceso Fiji e sión 2.0.0- c-54/1.51g (www. iji.sc/) (Schindelin e al.,
2012).
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
64

ausA, mien as que como cepas ecep o as de los me aboli os, se u ilizó un mu an e

luG el cual no sin e iza ningún me aboli o que es é aguas debajo de FluG, y la cepa
c wA2, la cual con iene una mu ación en el gen npgA que codi ica una 4- os opan e einil
ans e asa (PPTasa) (Má quez-Fe nández e al., 2007). Es a úl ima cepa es á a ec ada en
la biosín esis de la penicilina, la sín esis de pigmen os, la sín esis de lisina, la biosín esis
de side ó o os (Obe egge e al., 2003), así como en la sín esis de a ios policé idos en e
los que se encuen a el DHA. Cu iosamen e, an o el c ecimien o ege a i o y desa ollo
asexual y sexual es án a ec ados en el mu an e c wA2. Los de ec os que mani ies a es e
mu an e an o en la p oducción de me aboli os como en el desa ollo del hongo, lo
con i ie on en un candida o adecuado pa a el expe imen o de con ac o, pa a analiza que
cepas son capaces de complemen a los de ec os de dis in os mu an es.
Los esul ados de los p ime os expe imen os de con ac o lle ados a cabo
u ilizando como donan es una cepa sil es e y un mu an e ΔausA pa a ansmi i el
me aboli o a la cepa acep o a ∆ luG se mues an en la Figu a 12B. La o mación de un
en e de espo as ama illas pe enecien e a la cepa ∆ luG con i ma que un mu an e ΔausA
puede induci la espo ulación de la misma o ma que una cepa sil es e, lo cual indica
que la molécula señalizado a de FluG es á p esen e en es a cepa, que no p oduce DHA.
A
B
Figu a 12. A) Esquema del expe imen o de con ac o y ansmisión de la molécula induc o a de la espo ulación. La
zona de con ac o en e las dos cepas se mues a en ama illo, debido a que la cepa ecep o a es capaz de desa olla
espo as
B) Rep esen ación de los expe imen os de con ac o en e una cepa espo ulan e (WT y

ausA) y una cepa
lu y (

luG y c wA2). Las zonas de con ac o en las que se han desa ollado las espo as ama illas pe enecien es a
las cepas lu y, es án indicadas con lechas blancas. Ba a de escaña = 5 mm

PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
65
Po o o lado, los esul ados ob enidos de un segundo expe imen o de con ac o
mos ado en la igu a del Anexo 1 con i man que an o la cepa sil es e, como la cepa
∆ luG y la ΔausA ansmi en el me aboli o a la cepa c wA2, debido a que en la zona de
con ac o se han desa ollado conidió o os de colo ama illo pe enecien es a es a cepa.
Es a cues ión se a a más a ondo en el Anexo 1.
2.3. La deleción del gen luG a ec a an o al desa ollo asexual, como al sexual en
Aspe gillus nidulans
Es udios an e io es se cen a on en el e ec o de FluG sob e el desa ollo asexual
(Lee y Adams, 1994; Yage e al., 1998; D'Souza e al., 2001) sin apo a da os sob e la
o mación de cleis o ecios. Sin emba go, un es udio lle ado a cabo en Aspe gillus la us
sob e la ca ac e ización de un mu an e  luG, des eló que es e mu an e es á a ec ado
p incipalmen e en el desa ollo sexual (Chang e al., 2012). Resul ados pos e io es
apo a on e idencia que FluG ac úa con el complejo Vel e , o mado po los egulado es
del desa ollo y me abolismo secunda io VeA, VelB y LaeA (Chang e al., 2013).
Teniendo en cuen a es os da os, se decidió explo a el papel de FluG en el desa ollo
sexual de A. nidulans, lle ando a cabo un con aje de cleis o ecios en una cepa sil es e y
un nulo del gen luG (Figu a 13).
Figu a 13. Con aje de cleis o ecios (es uc u as cí cula es, melanizadas con un colo oscu o) en una cepa
WT y

luG (Izquie da
), jun o con los discos en los que e lejan los eno ipos ob enidos en MMA y MCA
(De echa
). Ba a de escala = 0,5 cm
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
66
Los esul ados (Figu a 13) mues an que en medio mínimo la p oducción de
cleis o ecios po unidad de á ea (cm2) en una cepa

luG se e educida en un 46%,
mien as que, en medio comple o, no se desa olla ninguna es uc u a sexual. Es os
esul ados demues an cla amen e que FluG es necesa io en el desa ollo asexual y sexual
de Aspe gillus nidulans, especialmen e en un medio ico en nu ien es.
2.4. FluG p esen a una dis ibución homogénea en el ci oplasma
An e la di e gencia de esul ados ci ados an e io men e, se decidió in es iga la
localización de FluG in i o median e mic oscopía de luo escencia.
El es udio de la localización de FluG se lle ó a cabo e ique ando la p o eína
luo escen e GFP (PM  27 kDa), la cual emi e luo escencia de colo e de. La p o eína
GFP se e ique ó en los ex emos N- y C- e minal y se comp obó si el e ique ado enía
algún e ec o en la unción de la p o eína. Se u ilizó la misma ap oximación pa a e ique a
a FluG con el epí opo no luo escen e 3xHA, el cual es menos oluminoso que GFP
(PM  3 kDa) y acili a el es udio de las p o eínas. Po o o lado, eniendo en cuen a que
es udios an e io es comp oba on que FluG iene una baja exp esión basal du an e las
e apas del c ecimien o y desa ollo asexual del hongo (Lee y Adams, 1994; E xebes e e
al., 2010a), se sus i uyó el p omo o na i o po el p omo o inducible alcA, el cual se
induce en p esencia de alcohol o eonina (Sealy-Lewis y Locking on, 1984). Una ez
ob enidas odas las cepas e ique adas de FluG (Figu a 14), se obse ó que las cepas
e ique adas en el ex emo C- e minal exhibían un eno ipo lu y, semejan e al obse ado
HA:: luG
luG::HA
Figu a 14. Feno ipos de los mu an es e ique ados con los epí opos GFP y HA3x en los ex emos N- y C- e minal de
FluG, as habe los incubado du an e 72 h. Ba a de escala = 1 cm
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
67
en una cepa

luG. Es e e ec o se obse ó ambién con el epí opo HA3x, lo cual indica
que, el e ique ado a ec aba d ás icamen e a la unción. Se desca ó es e úl imo e ique ado
en los expe imen os de mic oscopía.
Po o o lado, los e ique ados e ec uados con ambas p o eínas en el ex emo N-
e minal mos a on un eno ipo sil es e. La cepa con el e ique ado de GFP en el ex emo
N- e minal, e a cul i ada en un medio con glucosa (en el que el p omo o no es á ac i o),
se obse ó un descenso signi ica i o en la conidiación (Figu a 15). Es e esul ado es
cohe en e con la uncionalidad del p omo o .
En el caso de la cepa con p omo o alcA, se analizó la exp esión de la p o eína
después de cambia la uen e de ca bono a la eonina. La de e minación del iempo
eque ido pa a induci la exp esión de p o eína e ique ada bajo el con ol del p omo o
alcA, se lle ó a cabo moni o izando el pa ón de exp esión de la p o eína FluG en las
cepas e ique adas en el ex emo N- y C- e minal de con ambas p o eínas, median e
Wes e n blo (Figu a 15 y Anexo 2).
Los esul ados ob enidos en el expe imen o de de ección de la p o eína GFP
mues an una banda de ap oximadamen e 124 kDa co espondien e al e ique ado de FluG
con la p o eína GFP en las cepas alcA::GFP:: luG y luG::GFP (Figu a 15). Po un lado,
se obse ó que, después de habe inducido la exp esión de luG bajo el p omo o alcA
con eonina en la cepa alcA::GFP:: luG, el ni el de exp esión de GFP- FluG aumen aba
Figu a 15. De ección de los e ique ados FluG-GFP y GFP-FluG y aclA::GFP::FluG median e
Wes e n Blo .
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
68
con el iempo, como se puede obse a en los pe iodos de dos ho as e lejados en la Figu a
15. Sin emba go, no se pudo de ec a la banda co espondien e a la p o eína e ique ada en
la cepa GFP:: luG.
Po o o lado, los esul ados de de ección del epí opo HA3x (Anexo 2) mues an al
menos una banda de ap oximadamen e 100 kDa en los e ique ados de ambos ex emos
N- y C- e minal, jun o con o as bandas de meno amaño, lo cual sugie e que la p o eína
FluG es á siendo deg adada. Cabe des aca que las dos cepas e ique adas con ambas
p o eínas (GFP y HA3x) en el ex emo C- e minal, las cuales es án exp esadas bajo
p omo o na i o, mos a on una banda mucho más in ensa a la misma al u a en
compa ación con la obse ada en la cepa HA3x:: luG. Teniendo en cuen a que en odos
los expe imen os se ca gó la misma can idad de p o eína en el gel, es e úl imo esul ado
sugie e que la exp esión de FluG se e al e ada al e ique a la en el ex emo C- e minal
(en cuyo caso, pa ece que no se p oduce una o ma uncional de la p o eína, como se ha
apun ado an e io men e).
T as habe es udiado la de ección de la p o eína FluG en las cepas e ique adas con
HA3x y GFP, se p ocedió a analiza la localización de las que enían el e ique ado GFP
median e la écnica de mic oscopía de luo escencia. Teniendo en cuen a los an eceden es
que sugie en que FluG pueda ene una localización nuclea , la localización de los núcleos
se lle ó a cabo e ique ando la his ona H1 con mRPF y mChe y en las cepas GFP:: luG
y alcA::GFP:: luG, espec i amen e. Es as p o eínas emi en una luo escencia de colo
ojo cuando son obse adas median e mic oscopía de luo escencia. Dado que FluG es á
e ique ado con la una p o eína que emi e una luo escencia e de, en el caso de que ambas
p o eínas se colocalizasen en el mismo compa imen o celula , la luo escencia que se
obse a du an e la mic oscopía de luo escencia se ía de colo ama illo.
Figu a 16. A) Resul ados de luo escencia ob enidos con la cepa luG::GFP. B) Resul ados de
luo escencia ob enidos con la cepa GFP:: luG; H1::mRFP. Ba a de escala = 10 m
A
B
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
69
En acue do con los esul ados ob enidos en los expe imen os Wes e n blo , la cepa
luG::GFP, emi ía una señal de luo escencia po odo el ci oplasma (Figu a 16A). En la
cepa GFP:: luG exp esada bajo p omo o na i o, en cambio, no se de ec ó luo escencia.
(Figu a 16B). En la cepa alcA::GFP:: luG, se moni o izó la localización de FluG después
de habe inducido la exp esión del p omo o alcA con eonina du an e 2 ho as (Figu a
17C). En es a úl ima, a iempo 0 ho as no se de ec ó ninguna señal de luo escencia, al
igual que en la cepa GFP:: luG exp esada bajo p omo o na i o. Después de habe
inducido la exp esión de alcA con eonina du an e 2 ho as, se obse ó que GFP-FluG
p esen aba una dis ibución homogénea en el ci oplasma de la hi a. La señal oja que
emi ían los núcleos con i ma que GFP-FluG es á mayo men e ausen e del compa imen o
nuclea , elegado p incipalmen e al ci oplasma. Po o o lado, la p o eína pa ece es a
ausen e del lumen de las acuolas (pa e magni icada ma cada con lechas blancas).
Los esul ados ob enidos en el expe imen o de mic oscopía indica on que FluG es á
dis ibuido homogéneamen e po odo el ci oplasma de las células ege a i as.
Figu a 17. Resul ados de luo escencia ob enidos con la cepa alcA::GFP:: luG; H1::mChe y.. La
luo escencia e de co esponde a la localización de FluG y la luo escencia oja co esponde a la
localización de los núcleos. Ba a de escala = 10 m

PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
70
3. Discusión
En es e capí ulo se ha abo dado la elación de FluG con el DHA, el e ec o que iene
la ausencia de FluG en el ciclo sexual y se ha e i icado la localización que mues a in
i o.
En lo e e en e a la elación con el DHA, como ya pos uló el es udio de Rod iguez-
U a e al. (2012), se con i ma que el ac o DHA no es el ac o de FluG. Si bien es e
úl imo es udio esal ó el papel del DHA como un me aboli o secunda io que induce la
espo ulación, es udios pos e io es donde han analizado mu an es con un eno ipo
al amen e espo ulan e, han demos ado que es os mu an es ienen una al e ación en el
me abolismo secunda io en el que des acan un aumen o an o en la exp esión como la
sín esis del DHA (Gue ie o e al., 2017; Jain e al., 2018; Thieme e al., 2018).
Así como la ca ac e ización eno ípica del mu an e nulo del gen ausA, el cual no
p oduce DHA, des eló que es a cepa mos aba ni eles de espo ulación semejan es a los
obse ados en una cepa sil es e, los expe imen os de con ac o con i ma on que es e
mu an e e a capaz de e e i el eno ipo aconidial en la zona de con ac o de las colonias
adyacen es

luG y c wA2. Es e esul ado con i ma que el DHA no es á implicado
di ec amen e en la inducción de la espo ulación lle ada a cabo po FluG. Cabe esal a
que la complemen ación obse ada en una colonia c wA2 en con ac o con una cepa

luG
sugie e que exis en más me aboli os que inducen la espo ulación, ya que una cepa c wA2
no p oduce DHA (Má quez-Fe nández e al., 2007).
Po o o lado, el hecho de que una cepa

luG ue a capaz de induci la conidiación
en la zona de con ac o de una cepa c wA2 puede es a elacionado con el amplio papel
que desa olla es e úl imo gen. El es udio lle ado a cabo po Kim e al. (2015) con i maba
que el eno ipo le al causado po una cepa nula en el gen npgA podía se pa cialmen e
e e ido si al hongo se le añadía un concen ado il ado de un WT, el cual con enía
in e media ios del me abolismo, du an e el desa ollo asexual. Es e hecho con i ma que
la adición de los me aboli os exc e ados po el hongo no es su icien e pa a induci un
eno ipo sil es e.
Dejando a un lado el desa ollo asexual, la ca ac e ización eno ípica en o no al
desa ollo sexual de una cepa

luG con i mó que FluG iene un papel impo an e en la
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
71
egulación del ciclo sexual. Es e esul ado es á en conco dancia con las obse aciones
lle adas a cabo po Chang e al. (2012), en el que de alla que la deleción de luG en
Aspe gillus la us iene e ec o an o en el desa ollo asexual como el sexual del hongo.
El desa ollo asexual y sexual de A. nidulans, es á condicionado po las condiciones
lumínicas, las cuales son de ec adas po el complejo el e . En es e aspec o, a ios
es udios han elacionado a FluG con la espues a a la luz. Sin emba go, los expe imen os
de localización median e mic oscopía de luo escencia lle ados a cabo en es e es udio
con i ma on que FluG mues a una dis ibución homogénea mayo i a iamen e po odo
el ci oplasma de las hi as ege a i as, de acue do con las p ime as obse aciones (Lee y
Adams, 1994) y la ausencia de luo escencia ama illa en el núcleo, desca an que FluG
en e de mane a gene al al compa imen o nuclea en A. nidulans (Chang e al., 2013).
Cabe des aca que a ios es udios elacionan la ac i idad de FluG con el gen eA ( el e )
(Yage e al., 1998; Ruge -He e os e al., 2011), el cual iene un papel impo an e en la
espues a a la luz (Mooney y Yage , 1990). Yage e al. (1998) desc ibie on mu aciones
pun uales del gen luG en e los que se encon ó un mu an e insensible a la luz oja
( luG701) y es mu an es que sup imían la insensibilidad a la luz p o ocada po el alelo
eA1 ( luG10s eA1; eA1, luG20s eA1; eA1, luG30s eA1; eA1). Es e mismo es udio
con i mó po un lado que el me aboli o de FluG solo se sin e izaba en p esencia de la luz
en cepas con un ondo gené ico sensible ( eA) e insensible ( eA1) a la luz. Po o o lado,
es e es udio esal ó ambién que la complemen ación se obse aba solo en aquellas cepas
nulas en el gen luG con un ondo gené ico eA1 (Yage e al., 1998).
Po o o lado, los eno ipos obse ados de los di e en es mu an es e ique ados en
los ex emos N- y C- e minal de FluG con i man ambién que el ex emo C- e minal
cumple una unción impo an e en la ac i idad de FluG, ya que es os mu an es mues an
un eno ipo aconidial y una sob eexp esión del gen luG. Es a sob eexp esión coincide
con el esul ado ob enido po Yage e al. (1998), en el que el mu an e luG30s eA1; eA1,
el cual iene dos aminoácidos más en el ex emo C- e minal, mues a una sob eexp esión
de luG. Po o o lado, de acue do con los esul ados ob enidos po Chang e al. (2013),
el eno ipo aconidial obse ado en el mu an e e ique ado en el ex emo C- e minal pod ía
suge i que es e ex emo cumple una unción semejan e a la obse ada en A. la us, en el
que en ex emo C- e minal de FluG in e acciona con el ex emo N- e minal de LaeA y el
ex emo N- e minal de VelB del complejo imé ico VelB-VeA-LaeA. Sin emba go,
PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE luG
72
eniendo en cuen a que es os expe imen os de in e acción se ealiza on en le adu a, no se
puede con i ma que es a in e acción ocu a ambién den o del hongo.
Los esul ados ecogidos en es e p ime capí ulo e lejan un espec o de acción de
FluG más amplio que el que se conocía an es, ya que es e aba ca an o el desa ollo
asexual como el sexual. Po un lado, queda con i mado que el papel de FluG en el
desa ollo asexual no es á di ec amen e elacionado con el DHA, ya que un mu an e

ausA que no sin e iza es e me aboli o secunda io y mues a ni eles de espo ulación
semejan es a los obse ados en una cepa sil es e. Po o o lado, en es e es udio se ha
obse ado po p ime a ez la localización de FluG in i o, con i mando que FluG se
localiza mayo i a iamen e en el ci oplasma, excluido del núcleo. Finalmen e, el es udio
de las dis in as cepas e ique adas de FluG ha pe mi ido iden i ica que el ex emo C-
e minal de es a p o eína iene una unción impo an e asociada an o con el desa ollo
del hongo como la exp esión del mismo gen, aspec o que se discu i á en pos e io es
capí ulos.
Es os hechos, nos han conducido a lle a a cabo un es udio bioin o má ico en
p o undidad de la secuencia p o eica de FluG, u ilizando las úl imas he amien as y bases
de da os accesibles.
CAPÍTULO IV: ANÁLISIS DE SECUENCIA Y
PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
80
Median e un alineamien o de las secuencias seleccionadas de cada subg upo con la
egión N- e minal, se calculó el po cen aje de iden idad de la ma iz (PIM), en base a la
iden idad media conse ada en e dos candida os (Tabla del Anexo 5).
El mismo p oceso se lle ó a cabo u ilizando las es uc u as de c is al p opues as po
Seibe y Raushel (2005), pa a de e mina con más iabilidad an o los esiduos ca alí icos
p esen es en la egión N- e minal, jun o con la homología que p esen a es a egión con el
la es uc u a de c is al de la enzima candida a. En es e caso, el ac o que de e mina la
simili ud es uc u al de la egión N- e minal con el c is al u ilizado como modelo se
e lejó como QMEAN (Quali a i e Model Ene gy ANalysis) (Benke P. e al., 2011).
Es e ac o , ep esen a una unción que ecoge la calidad de la alineación global (la
es uc u a de c is al) y la esidual (cada esiduo) de la secuencia de in e és, en e al
modelo u ilizado como es uc u a de c is al (Tabla 19). Se conside a un QMEAN
acep able cuando los alo es son supe io es a -4.
Tabla 19. Resul ados ob enidos del alineamien o de la egión N- e minal de FluG con los c is ales
p opues os po (Seibe y Raushel, 2005) de cada subg upo. En cada subg upo se de alla, po un lado, la
cobe u a que iene el c is al con la egión N- e minal de FluG y la conse ación de los aminoácidos que
se unen a los me ales. Los aminoácidos conse ados es án esal ados en e de. Po o o lado, se de alla el
po cen aje de iden idad que conse a es a egión con la es uc u a de c is al de la enzima de cada subg upo,
jun o con la conse ación es uc u al e lejada como alo QMEAN. (*) No se pudo gene a un modelo
debido a la baja calidad de la homología.
Subg upo
Enzimas y
nomb e
del pdb
Cobe u a
con FluG
Residuos alineados
Iden idad de
secuencia
(%)
QMEAN
1
2
3
4
5
6
7
8
I
PTE
(1HZY)
239-406
HxH
-
-
K
H
H
-
D
12,16
-4,10
II
PHP
(1BF6)
240-406
HxH
-
-
E
H
H
-
D
10,67
-6,51
III
ADA
(1AM4)
15-382
HxH
H
H
D
27,48
-8,79
IV
AGD
(1O12)
HxH
E
H
H
D
*
*
V
DAA
(1M7J)
110-405
HxH
C
H
H
D
32,03
-8,25
VI
RDP
(1ITQ)
234-406
HxD
E
H
H
D
12,50
-7,32
VII
URI
-
HxH
H
D
-
-

ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
81
Los da os ob enidos en la Tabla 19 y la Tabla del Anexo 5 indican que la egión N-
e minal de FluG gua da una mayo simili ud con las amidohid olasas de ipo I
(AMDH_1), al con a io de lo que se había ob enido en la p ime a ap oximación (Tabla
16). No obs an e, el g upo de las AMDH_1 es á ep esen ado po una amplia a iedad de
enzimas que ca alizan eacciones muy dis in as, a pesa de ene en común g an pa e de
los esiduos ca alí icos que las unen a los cen os me álicos (Seibe y Raushel, 2005).
Es a azón, nos lle ó a p o undiza en la búsqueda de es uc u as de c is al que u ie an
simili ud con la egión N- e minal, con el obje i o de pode c ea un modelo c is alino de
la egión N- e minal de FluG.
2.2.2. Te ce a E apa. Búsqueda de homólogos c is alinos de la egión N- e minal
T as de e mina la simili ud de secuencia con amidohid olasas del ipo I, se
p ocedió a la búsqueda de es uc u as de c is al esuel as que conse asen homología con
la egión N- e minal. Las es uc u as de c is al ob enidas median e Swiss-Model, jun o
con in o mación ele an e en o no a la cobe u a e iden idad y con la homología
es uc u al de es os c is ales con la egión de in e és, se ecogen en la abla del Anexo 6.
Todos los c is ales candida os seleccionados, a excepción del c is al 2QPX, es aban
ca ac e izados p e iamen e (Tabla 20). En cuan o 2QPX, solo se con aba con la
es uc u a.
Los c is ales ienen a ias unciones enzimá icas asignadas. Po an o, se di idie on
en dos g upos: aquellos cuya unción enzimá ica había sido ca ac e izada y publicada, y
aquellos que solo enían una unción p edicha. Ambos g upos con ienen candida os que
cub en la egión N- e minal al comple o (aas 1-410) o pa cialmen e (aas 185-410), siendo
es os úl imos los mayo i a ios. Po o o lado, la simili ud con la egión N- e minal oscila
en e el 12% y el 19% en la mayo ía de los modelos. Sin emba go, se puede obse a que
los c is ales 2QPX y 4HJW mues an alo es supe io es al 20% (29,32 y 23,04,
espec i amen e). Sin emba go, los alo es del ac o QMEAN ob enidos de cada modelo
gene ado demues an que solo el modelo 3IRS supe a el alo acep able de -4. Sin
emba go, solo aba ca pa e de la egión N- e minal (aas 185-410) y su unción enzimá ica
no ha sido ca ac e izada.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
82
En is a de los esul ados, se op ó po selecciona aquellos c is ales que hubie an
sido ca ac e izados, cub ie an la o alidad de la egión N- e minal en la medida de lo
posible, y exhibie an un alo QMEAN lo más ce cano posible al -4. Se u ie on en
cuen a ambién o os candida os que, aunque no es u ie an ca ac e izados, cub ie an la
o alidad de la egión N- e minal de FluG y exhibie an un alo QMEAN acep able. Los
c is ales seleccionados es án ecogidos en la Tabla 20.
Tabla 20. C is ales homólogos a la egión N- e minal de FluG. En cada c is al se especi ica po un lado el
nomb e pdb, la unción asignada, los ligandos p esen es en el c is al, el o ganismo del que p o iene y la
e e encia de la publicación. Po o o lado, se de alla la cobe u a que iene el c is al con la egión N-
e minal de FluG, el po cen aje de iden idad que conse a es a egión con la es uc u a de c is al y la
conse ación es uc u al e lejada como alo QMEAN.
C is al
Función
Cobe u a
con FluG
Iden idad
de la
secuencia
QMEAN
Ligandos
O ganismo
Re e encia
1J5S
U ona o isome asa
5-408
14,68
-5,26
-
The mo oga
ma i ima
Schwa zenbache
R. e al 2003
3HK8
U ona o isome asa
5-408
14,25
-6,93
Zn +
HDL
Bacillus
halodu ans
Nguyen TT. E
al., 2009
4HJW
U acil-5-ca boxila o
deca boxilasa
185-410
23,04
-5,73
Zn
Me a hizium
anisopliae
Xu S. e al., 2013
6DXQ
4-oxalomesacona o
hid a asa
185-409
16,84
-4,58
Zn +
7QD
Sphingobium
sp. SYK-6
Hogancamp TN.
E al., 2018
6E6I
Hid olasa de enlace
me a del compues o
2,2',3- ihyd oxi-3'-
me oxi-5,5'-
dica boxibi enil
185-410
16,49
-5,49
Zn +
HVS
Sphingobium
sp. SYK-6
Kua sjah E. e
al., 2018
4IFK
2-amino-3-
ca boximucona o 6-
semialdehido
deca boxilasa
185-410
13,59
-5,60
Zn
Pseudomonas
luo escens
Huo L. e al.,
2013
3DC8
Dihid opi imidinasa
236-409
16,56
-4,84
Zn
Sino hizobium
melilo i
Ma inez-
Rod iguez S. e
al., 2010
2QPX
Amidohid olasa
me alodependien e
TIM-ba el old
4-406
29,32
-4,10
Zn
Lac obacillus
pa acasei
ATCC 334
Join Cen e o
S uc u al
Genomics
(JCSG)
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
83
Una ez seleccionados los candida os, se p ocedió a ca aloga al g upo de
amidohid olasas que pe enecía cada c is al, u ilizando pa a ello la he amien a HMMER.
Tan o los candida os seleccionados como la p edicción ob enida es án e lejados en la
Tabla 21. De la misma o ma, se analizó la conse ación de los esiduos ca alí icos de los
c is ales ca alogados en la Tabla 20 y la egión N- e minal de FluG, la cual se p esen a
en la abla del Anexo 7.
Tabla 21. Resul ados del análisis de los c is ales homólogos a la egión N- e minal de FluG con la
he amien a de p edicción uncional HMMER. C is ales homólogos a la egión N- e minal de FluG. En
cada caso se de alla la cobe u a que iene el c is al con la egión N- e minal de FluG y la p edicción
uncional, jun o con la cobe u a de aminoácidos p edicha con la he amien a HMMER. Po o o lado, se
adjun a una imagen con la disposición de las egiones uncionales delimi adas po la he amien a HMMER.
C is al
Función
Cobe u a
con FluG
P edicción
HMMER
Cobe u a
HMMER
Imagen HMMER
1J5S
U ona o isome asa
8-408
UxaC
2-449
3HK8
U ona o isome asa
5-408
-
-
4HJW
U acil-5-
ca boxila o
deca boxilasa
185-410
Amidohid o_2
9-373
6DXQ
4-oxalomesacona o
hid a asa
185-409
Amidohid o_2
5-330
6E6I
Hid olasa de enlace
me a del compues o
2,2',3- ihyd oxi-3'-
me oxi-5,5'-
dica boxibi enil
185-410
Amidohid o_2
3-330
4IFK
2-amino-3-
ca boximucona o 6-
semialdehido
deca boxilasa
185-410
Amidohid o_2
6-331
3DC8
Dihid opi imidinasa
236-409
Amidohid o_1
47-419
2QPX
Amidohid olasa
me alodependien e
TIM-ba el old
4-406
Amidohid o_2
201-368
FluG
-
-
Amidohid o_2
243-407
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
84
Una ez analizados los esul ados de la Tabla 21, se pudo ap ecia que las enzimas
homólogas a la egión N- e minal de FluG pe enecen a los subg upos amidohid olasa de
ipo I, II y u ona o isome asa (UxaC). Tan o el c is al 2QPX como la egión N- e minal
compa en pa e de la p o eína, la cual es homóloga a las amidohid olasas de ipo II.
Los esul ados de la conse ación de los esiduos ca alí icos en cada c is al,
des ela on que los únicos esiduos conse ados en odas las amidohid olasas son aquellos
que se unen al me al M, co espondien es a los esiduos H20; H22 y D354 en FluG. El
siguien e esiduo que pa ece es a más conse ado es H264 en FluG, cuyo papel es
ambién el de unión al me al M o M. O o esiduo que pa ece ene una al a
conse ación en la mayo ía de las enzimas, es el co espondien e a la H298 en FluG.
Pues o que la conse ación de los esiduos obse ada en la Tabla del Anexo 7
mues a un amplio espec o de ac i idades enzimá icas, pa a la siguien e ase se dio más
p io idad a aquellas enzimas que aba ca an la o alidad de la egión N- e minal (Tabla
21) y exhibie an un índice QMEAN acep able (Tabla 20). La combinación de ambos
da os indicó que es a egión conse aba odos los esiduos co espondien es a la
es uc u a de c is al 3DC8, la cual iene una ac i idad dihid opi imidinasa. Sin emba go,
los alo es la cobe u a de es e c is al solamen e aba caban el ango 236-409, con un alo
QMEAN de - 4,84. Po o o lado, se obse ó que los c is ales 1J5S y 3HK8, a pesa de
con a con un alo QMEAN pob e, aba caban g an pa e de la egión N- e minal y los
esiduos de unión al M es aban conse ados en FluG. Finalmen e, se comp obó que el
candida o 2QPX (el cual no había sido ca ac e izado) conse aba odos los esiduos
co espondien es a una dihid opi imidinasa, además de cub i casi al comple o la egión
N- e minal de FluG (4-406) con una homología es uc u al muy acep able, e lejado po
un alo QMEAN de - 4,30. Po lo an o, adop amos a 1JS5, 3HK8 y 2QPX como modelo
po que aba can la o alidad de la egión.
2.2.3. Te ce a E apa. Gene ación del modelo es uc u al de la egión N- e minal
La búsqueda de c is ales homólogos a la egión N- e minal de FluG pe mi ió
iden i ica una g an a iedad de homólogos que, pos e io men e ue on analizados en
de alle pa a desca a los menos adecuados pa a usa los como molde. Una ez inalizado
el p oceso de c iba, los c is ales que ue on seleccionados pa a modela ambas egiones
de FluG es án de allados en la Tabla 22.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
85
Una ez op imizados los modelos de las es uc u as de c is al candida as pa a es a
egión, se u iliza on como molde pa a modela la egión N- e minal. Los aminoácidos de
FluG se alinea on con el modelo en base del alineamien o ob enido con Swiss-Model, y
se calculo el po cen aje de iden idad y simili ud que compa e la secuencia de FluG con
la es uc u a usada pa a el modelado empleando la he amien a P ime del p og ama
Maes o (Sch ödingue Sui es) (Tabla 22).
Tabla 22. Los modelos u ilizados pa a modela la egión N- e minal de FluG, jun o con los ligandos
p esen es en cada c is al. Se de allan los alo es co espondien es a la cobe u a del c is al con es a egión
de FluG, el po cen aje de simili ud, iden idad y huecos p esen es en el p oceso de modelado. Zn: Zinc.
HDL: Ácido D-A abinohid oxámico.
La supe posición de los es modelos a pa i de los c is ales (Figu a 20, Figu a 21
y Figu a 22), pe mi e obse a dis in os g ados de conse ación en lo que espec a a los
esiduos ca alí icos de in e és (Tabla del Anexo 7).
En 1J5S, a pesa de no habe un me al p esen e en el c is al, los esiduos H30, H32
y D397 se coo dinan al M. Como se puede obse a en la Figu a 20, el modelo p edicho
de la egión N- e minal FluG que se ha gene ado a pa i de la es uc u a de 1J5S conse a
odos los esiduos mencionados an e io men e (H20, H22 y D354) con una disposición
espacial semejan e.
N- e minal de FluG
C is al
1J5S
3HK8
2QPX
Ligandos
-
Zn + HDL
Zn
Cobe u a
5-408
5-408
4-406
% Simili ud
22
26
43
% Iden idad
10
10
25
% Huecos
25
22
11

ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
86
En 3HK8, los esiduos H26, H28 y el D355 se coo dinan al ion de Zn2+ (M). Po
o o lado, el esiduo D355 se coo dina ambién al sus a o pa a asis i la eacción de
isome ización (Nguyen e al., 2009). Como se puede obse a en la Figu a 21, el modelo
p edicho de la egión N- e minal que se ha gene ado a pa i de la es uc u a de 3HK8
conse a odos los esiduos mencionados an e io men e (H20, H22 y D354) con una
disposición espacial adecuada pa a o ma las mismas in e acciones que se obse an en
c is al 3HK8 con el ion de Zn2+ y el sus a o.
Figu a 20.
Alineación es uc u al del modelo 1J5S ( e de
), con la es uc u a modelada de FluG
(g is), basada en la plan illa 1J5S. Los esiduos conse ados en FluG son H20, H22, H264 y D354.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
87
En el caso de 2QPX, los esiduos H17, H19 y D317 se coo dinan con el p ime ion
de Zn2+ (M), mien as que los esiduos H227 y H263 se coo dinan al segundo ion de
Zn2+ (M). Po o o lado, se p edice que una lisina (K166) su e una ca bamilación pos -
aduccional pa a o ma un puen e en e los dos iones de Zn2+, y que una i osina (Y171)
puede in e acciona con el sus a o en algunas amidohid olasas. Como se puede obse a
en la Figu a 22, el modelo p edicho de la egión N- e minal de FluG que se ha gene ado
a pa i de la es uc u a de 2QPX conse a odos los esiduos mencionados an e io men e
(H20, H22, K192, H264, H298 y D354) con una disposición espacial adecuada pa a
o ma las mismas in e acciones que se obse an en la es uc u a de 2QPX con los iones
de Zn2+ y el agua hid olí ica, jun o con la i osina (Y197) la cual puede in e acciona con
el sus a o (Figu a 22). Sin emba go, eniendo en cuen a que la ac i idad de la enzima
2QPX no ha sido ca ac e izada, no se puede a i ma del odo que odos los esiduos
cumplan el mismo papel que en la p o eína molde. No obs an e, eniendo en cuen a que
los esiduos conse ados en es a enzima se asemejan a aquellos p esen es en una
dihid opi imidinasa (Lohkamp e al., 2006; Hsieh e al., 2013), se pod ía asumi que los
esiduos de 2QPX y FluG cumpli ían la misma unción.
Figu a 21
. Alineación es uc u al del modelo 3HK8 ( e de
), con la es uc u a modelada
de FluG (
g is
), basada en la plan illa 3HK8. El Mα es  coo dinado a H20, H22 y D354. El
sus a o (HDL) es á coo dinado al me al.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
88
2.3. Es udio bioin o má ico de la egión C- e minal
2.3.1 Segunda E apa. Conse ación de los esiduos ca alí icos p edichos
Las p edicciones si uaban la egión C- e minal como una GSI. Los esiduos cla e
de es a ac i idad ienen que e con las dos e apas de mecanismo ca alí ico. En la p ime a
e apa, la eacción equie e la pa icipación de ATP pa a o ma un in e media io ac i ado,
el -glu amil os a o (Eisenbe g e al., 2000). Es e in e media io eacciona en una segunda
e apa con una molécula de amonio, pa a o ma glu amina. Es a eacción es cen al en el
me abolismo del ni ógeno y iene luga en odos los o ganismos (S ad man y Ginsbu g,
1974; Eisenbe g e al., 2000).
Los esiduos ca alí icos que pa icipan en la eacción ca alizada po la GS de
Salmonella yphimu ium (glnA; pdb: 1FPY), a menudo empleada como modelo (Gill y
Eisenbe g, 2001) se de allan en la Tabla 23. La es uc u a de c is al se empleó como base
pa a la nume ación los esiduos. Pa a pode de e mina la conse ación de los esiduos
ca alí icos de FluG con o as GSIs, se eligió como e e encia la es uc u a de c is al 1FPY
de S. yphimu ium. Los da os de la conse ación jun o con el papel que desempeña cada
uno de los esiduos ca alí icos (Eisenbe g e al., 2000) se e lejan en la Tabla 23.
Figu a 22.
Alineación es uc u al del modelo 2QPX ( e de
), con la es uc u a modelada
de FluG (
g is
), basada en la plan illa 2QPX. El Mα es  coo dinado a H20, H22, K192 y
D354; el Mβ se coo dina a K192, H264 y H298. Una molécula de agua se coo dina con
ambos me ales y D354 (
línea azul discon inua).
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
89
Tabla 23. Residuos ca alí icos de la es uc u a de c is al 1FPY, jun o con su unción, que pa icipan en la
sín esis de glu amina y que es án conse ados en la egión C- e minal de FluG (Eisenbe g e al., 2000;
Mu ay e al., 2013). Es án ma cados en g is los esiduos que no es án conse ados.
Residuos
Función
1FPY
FluG
D50
S481
Ex ae el p o ón del ion de amonio pa a o ma amoniaco
E130
E564
Se une al me al Mg2+ (M)
E132
E566
Se une al me al Mg2+ (M); suscep ible a in e acciona con
inhibido es
E213
E626
Se une al me al Mg2+ (M) y a la molécula de NH3
E221
E633
Se une al me al Mg2+ (M)
H270
H682
Se une al me al Mg2+ (M), median e el ni ógeno
H272
H684
In e acciona con el - os a o del ATP
R322
R720
In e acciona con el g upo amida del glu ama o
E328
W726
Ex ae el p o ón del es ado de ansición pa a o ma glu amina y
ADP
R340
R739
Pola iza el - os a o del ATP que o ma á el in e media io -glu amil
os a o
R345
R744
In e acciona con el ATP en el es ado de ansición
E358
E752
Se une al me al Mg2+ (M)
El análisis compa a i o de la homología en e la es uc u a de c is al de 1FPY y la
egión C- e minal de FluG des eló una simili ud del 20,05% y un alo QMEAN de
- 4,23. Teniendo en cuen a que el c is al cub e g an pa e de la egión C- e minal de FluG
(431-863) el alo QMEAN mues a que FluG p esen a una simili ud conside able. En
cuan o a la conse ación de esiduos ca alí icos, se obse ó que no se conse aban
aquellos que in e accionan con el amonio (Tabla 23, ondo g is). Es e da o indica que la
glu amina no es el p oduc o p obable de la eacción. En consecuencia, se p o undizó en
la búsqueda de es uc u as de c is al que u ie an mayo simili ud con las zonas
di e enciadas.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
96
luG) di e gen de es a unción. Sin emba go, los esul ados ob enidos en la Tabla B del
Anexo 12 mues an que odos los genes pauA1-6 compa en una iden idad de secuencia
y es uc u al simila es. Es e esul ado indica que, si bien odas es as enzimas compa en
una conside able homología es uc u al, es e mé odo no pe mi e de e mina las
di e encias en a inidad po dis in as poliaminas. Se ía plausible, po an o, que la mayo
a inidad po el sus a o pod ía es a elacionada con la conse ación de o os esiduos, así
como las dis ancias, pola idad u o os aspec os en o no a dichos esiduos. De es a o ma,
al igual que en apa ados an e io es, se lle ó a cabo un análisis en el que se e i icó la
conse ación de los esiduos ca alí icos p edichos pa a una GS en los genes pauA1-6,
ep esen ando los esul ados en la Tabla 27.
Tabla 27. La conse ación de los esiduos ca alí icos de cada gen pauA1-7, en e a la egión C- e minal
de FluG. La unción adsc i a de los esiduos es la co espondien e a las GS.
Residuos
Función
en las GS
FluG
PauA1
PauA2
PauA3
PauA4
PauA5
PauA6
PauA7
S481
P58
P50
P54
P58
P28
P54
V42
Ex ae el p o ón del NH4+
E564
E146
E140
E143
E146
E101
E143
E131
Unión M
E566
E148
E142
E145
E148
E103
E145
E133
Unión M
E626
E211
E205
E208
E211
E166
E208
E180
Unión M y NH3
E633
E218
E212
E215
E218
E173
E215
E187
Unión M
H682
H268
H261
H264
H268
H222
H265
H236
Unión M median e N
H684
H270
H263
H266
H270
H224
H267
H238
In e acción - os a o ATP
R720
R320
R314
R316
R320
R275
R317
R290
In e acción amida (Glu)
W726
Y326
S320
Y322
Y326
A281
Y323
W296
Ex ae p o ón pa a o ma
glu amina y ADP
R739
R338
R332
R334
R338
R293
R335
R308
Pola iza - os a o ATP
pa a o ma -glu amil
os a o
R744
R343
R337
R339
R343
R298
R340
R313
In e acción ATP
E752
E355
E349
E351
E355
E310
E352
E332
Unión M
438
458
452
454
458
413
455
443
Nº de aminoácidos

ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
97
El análisis de la conse ación de esiduos ca alí icos demos ó cla amen e que los
esiduos enca gados de la acepción y modi icación del amonio no es aban conse ados
en los genes pauA1-7 ni en luG. Es e esul ado, uel e a indica que una de las
di e encias más no ables en e una GS y una enzima que lle a a cabo la -glu amilación
de un sus a o dis in o al amonio eside en la conse ación de es os esiduos. Al compa a
los esiduos ca alí icos que sus i uían an o al aspa a o (D) como al glu ama o (E), se
pudo obse a que en odos los genes pauA1-6, el aspa a o es aba sus i uido po una
p olina (P), un aminoácido apola (a pH isiológico) ali á ico, mien as que el glu ama o
(E) es aba sus i uido po una i osina (Y; cadena la e al hid o óbica) (pauA1, pauA3,
pauA4, pauA6), una se ina (S; cadena la e al pola sin ca ga) (pauA2) o una alanina (A;
cadena la e al hid o óbica y muy pequeña) (pauA5).
Si bien el conjun o de esul ados ob enidos e o zó la hipó esis de que la egión C-
e minal de FluG es á más es echamen e elacionada a las enzimas -glu amil ligasas de
poliaminas, se p ocedió a in es iga en p o undidad las p opiedades ca alí icas de PauA7,
de alladas po Ladne e al. (2012), las cuales se án obje o de un a amien o expe imen al
en el quin o capí ulo.
2.5. Los genes homólogos a las dos egiones de FluG es án p esen es en bac e ias,
hongos y plan as
La p esencia de secuencias de o igen p oca io a iden i icadas en la secuencia de
FluG condujo a un análisis la dis ibución de esas secuencias en o os o ganismos. Pa a
ello, se u ilizó la he amien a pBLAST, empleando la secuencia p o eica de FluG como
plan illa. La búsqueda e eló la exis encia de homólogos de las dos egiones de FluG en
bac e ias, hongos y plan as. No obs an e, los dos dominios se encon a on den o del
mismo polipép ido en hongos y plan as (Figu a 24).
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
98
La búsqueda limi ada a los homólogos de FluG encon ados en Aspe gilli des eló
la exis encia de o ólogos en 14 especies. Es os o ólogos mos a on una media de
conse ación del 70  4 % con la secuencia de A. nidulans (Anexo 13). Po o o lado, se
p ocedió a comp oba si los esiduos ca alí icos p edichos pa a la egión N- y C- e minal
de FluG (Tabla del Anexo 7 y Tabla 25, espec i amen e) es aban o no conse ados en
los o ólogos de FluG. Los esul ados de allados en el Anexo 14 con i man que los
o ólogos de FluG en Aspe gilli conse an odos los esiduos ca alí icos en ambas
egiones. De la misma o ma, se lle ó a cabo es udio más de allado sob e especies de
hongos en los que se podían encon a o ólogos de FluG (Anexo 14). En es e caso, se
pudo con i ma que es á p esen e an o en hongos di e gen es emp anos (no o man
conidió o os), como en a ias especies de hongos ascomice os (con especies que ienen
conidió o os simples y complejos) y en hongos basidiomice os (no o man conidió o os).
Figu a 24. Dis ibución de secuencias p o eicas homólogas de FluG en bac e ias, hongos y plan as.
Los homólogos de FluG en bac e ias se encuen an sepa ados, mien as que, en hongos y plan a,
mues an la misma disposición que FluG. Los colo es ep esen an en
e de
la egión
amidohid olasa, en
g is en ‘linke ’ y en ojo la egión GSI.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
99
Po o o lado, se lle ó a cabo el mismo p ocedimien o con el conjun o de las
secuencias encon adas en los es einos, las cuales se alinea on pa a analiza la
conse ación de esiduos con unciones an es iden i icadas. Se elabo ó así un mapa de
conse ación de cada aminoácido pa a las egiones N- y C- e minal de FluG (Figu a 25).
Los esul ados e elan zonas de al a conse ación en bac e ias, hongos y plan as. Se
comp obó ambién si los esiduos ca alí icos p edichos pa a ambas egiones de FluG
es aban o no conse ados en las secuencias homólogas y se ma có su localización en la
Figu a 25.
Los esul ados ob enidos e lejan que los esiduos ca alí icos es án localizados en
zonas de al a conse ación ( ojas), lo cual demues a que los homólogos de FluG
p esen es en bac e ias, hongos y plan as ienen es os esiduos conse ados. De la misma
o ma, se pudo obse a que odos lo esiduos ci ados an e io men e pa a ambas egiones
(Tabla del Anexo 7 y Tabla 25) es án conse ados en odos los Aspe gilli (Anexo 15).
Figu a 25. Rep esen ación de la conse ación de los esiduos de los homólogos de FluG en bac e ias, hongos y plan as. Las
egiones N- y C- e minal es án ep esen adas po sepa ado. La conse ación de los esiduos se indica de meno a mayo en
colo
e de y ojo
, espec i amen e. Localización de los esiduos ca alí icos es á indicada median e líneas que conec an la
localización de dichos esiduos en cada eino.
H: His idina. K: Lisina. Y: Ti osina. D: Aspa a o. E: Glu ama o. R
: A ginina.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
100
2.6. Las dos egiones de FluG es án p esen es en ope ones de bac e ias
En is a de que las dos secuencias en FluG ienen homólogos que se exp esan po
sepa ado en p oca io as, se op ó po p o undiza en el es udio de la localización de es as
secuencias den o del genoma de bac e ias con el obje o de escla ece si pod ían pa icipa
en los mismos p ocesos me abólicos (Ma his e al., 2000). Como p ime a ap oximación,
se e ec uó una búsqueda de ope ones bac e ianos que al menos incluyesen una GSI y una
amidohid olasa. Una ez iden i icados, se e isa on ambién los genes adyacen es Figu a
26.
Figu a 26. Disposición de los ope ones que conse an genes homólogos a las egiones N- y C- e minal de FluG. En
e de se mues an los genes o ólogos a la egión N- e minal de FluG, los cuales codi ican p edichas amidohid olasas
me alodependien es. En
azul
se mues an los genes o ólogos a la egión C- e minal de FluG, los cuales codi ican
p edichas GSI. En
na anja
, se mues an genes que es án elacionados con el anspo e y la deg adación de uen es de
ni ógeno. En
mo ado
, se mues an genes que es án elacionados con la biosín esis de pep idoglucano y ácido p-
Aminobenzóico.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
101
Los esul ados de la Figu a 26 e leja on que las secuencias a ines a la
amidohid olasa y GSI obse adas en el gen luG se encon aban sepa adas. Si bien odos
los homólogos de FluG encon ados en hongos y plan as con enían p ime o el dominio
amidohid olasa y después el dominio GSI, en bac e ias, la g an mayo ía de los ope ones
codi icaban p ime o el gen GSI (GlnA) y pos e io men e la p edicha amidohid olasa
(Me al dependen amidohyd olase).
Va ios es udios lle ados a cabo en Mycobac e ium ube culosis (Haywa d e al.,
2009) y S ep omyces coelicolo (Rexe e al., 2006) des ela on que ambos o ganismos
con ienen cua o genes homólogos a las GSI (glnA1-4). En M. ube culosis, la unción de
la p edicha GSI de la Figu a 26 co esponde al gen glnA3 (S ong e al., 2003), cuya
unción no ha sido desc i a. Sin emba go, en S. coelicolo , el gen glnA3 de la Figu a 26
iene una unción -glu amil pu escina ligasa (K ysenko e al., 2017). En el es o de
ope ones, se obse ó que a ios genes adyacen es podían es a elacionados con p ocesos
de anspo e (Po E, Li M, AA_pe mease) (Kashiwagi e al., 1992) y deg adación (PuuD,
GabT, LdcC, Ya J) (Ku iha a e al., 2006) de dis in as uen es de ni ógeno, así como a
la biosín esis de pep idoglucano (F sI) (Wissel e al., 2005) y ácido p-Aminobenzoico
(AbgB) (Hussein e al., 1998).
3. Discusión
Los esul ados ob enidos en es e capí ulo con i man que FluG es á o mado po dos
egiones di e enciadas, unidas po una secuencia de ap oximadamen e ein e
aminoácidos. Si bien es udios an e io es lle ados a cabo po (Rexe e al., 2006) y (Lee y
Adams, 1994) ya menciona on que FluG con enía dos dominios con simili ud a una
amidohid olasa y una GSI, es e es udio ha delimi ado la ex ensión de aminoácidos
co espondien es a los dominios amidohid olasa en la egión N- e minal y el dominio GSI
en la egión C- e minal. Cabe esal a ambién que la p esencia de dos secuencias PEST
en FluG, pueden indica una ida media celula co a de la p o eína (Rechs eine y
Roge s, 1996).
Po un lado, la egión N- e minal iene simili ud con una amidohid olasa de ipo 2,
la cual o ma pa e de una amplia amilia de enzimas que compa en ca ac e ís icas
es uc u ales (Seibe y Raushel, 2005). Además, es as enzimas conse an ligandos
me álicos y esiduos ca alí icamen e impo an es. Es os esiduos comp enden cua o

ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
102
his idinas y un aspa a o, que ac úan como enlaces ca alí icos pa a uni se a uno o dos
iones me álicos en los si ios ca alí icos (Seibe y Raushel, 2005).
El análisis de es e g upo de amidohid olasas y la búsqueda de c is ales homólogos
a la egión N- e minal, ha pe mi ido iden i ica los esiduos ca alí icos conse ados en
o as secuencias. Es e análisis ha des elado que es a egión conse a es esiduos (H20,
H22 y D354) cuyo papel es la coo dinación del ligando me álico M (Nguyen e al.,
2009; Ma inez-Rod iguez e al., 2010). Teniendo en cuen a que los c is ales candida os
cumplen dis in as unciones enzimá icas, cabe des aca que la conse ación de es os es
esiduos en odas las es uc u as indica la impo ancia que ienen en es e g upo de
amidohid olasas. Po es e mo i o, es os es esiduos ue on seleccionados como
candida os pa a se mu ados pun ualmen e en FluG (siguien e capí ulo).
Se ha con i mado que FluG conse a odos los esiduos ca alí icos co espondien es
a amidohid olasas cíclicas (Nam e al., 2005), como las dihid opi imidinasas (Lohkamp
e al., 2006; Hsieh e al., 2013) y las hidan oinasas (Cheon e al., 2002) que pa icipan en
la u a de deg adación de las pi imidinas como el u acilo (U) y la imina (T). Es as
enzimas, además de ene los es esiduos que se coo dinan con el p ime ligando
me álico M (H20, H22 y D354), con ienen o os dos esiduos (H264 y H298) que se
coo dinan con un segundo ligando me álico M, jun o con la conse ación es uc u al de
una lisina (K192) y una i osina (Y197) que pod ían coo dina se a los dos ligandos (M
y M) y uni se al sus a o, espec i amen e (Hsieh e al., 2013). Sin emba go, eniendo
en cuen a que la es uc u a de c is al de la dihid opi imidinasa (3DC8), no aba ca la
o alidad de la egión N- e minal FluG, se seleccionó un c is al (2QPX) que, a pesa de
no ene in o mación sob e su ac i idad enzimá ica, conse a odos los esiduos
ca alí icos co espondien es a una dihid opi imidinasa y exhibe la mejo simili ud
es uc u al en e odos los candida os encon ados pa a la egión N- e minal de FluG. La
c eación del modelo de la egión N- e minal, u ilizando 2QPX como molde, ha
con i mado que odos los esiduos mencionados an e io men e exhiben una conse ación
es uc u al semejan e a la obse ada en 2QPX. Es e esul ado p opició la u ilización de
es e candida o pa a lle a a cabo una sus i ución he e óloga de la egión N- e minal de
FluG en el siguien e capí ulo.
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
103
La egión C- e minal de FluG p esen a una cla a simili ud con una GSI, sin
emba go, un análisis de allado e eló que FluG es á elacionado con enzimas que
ca alizan una ac i idad -glu amil ligasa (Ku iha a e al., 2008; Ladne e al., 2012; Takeo
e al., 2013). La búsqueda de c is ales homólogos a la egión C- e minal, pe mi ió
iden i ica en e a ios candida os que codi ican una GSI, un c is al (4HPP, gen PA5508)
que codi ica una -glu amil ligasa especí ica de aminas a omá icas (Ladne e al., 2012).
Los esiduos que ac úan sob e la unión del me al y la o ien ación del glu ama o
gene almen e se conse an en e las enzimas GSI y las -glu amil ligasas (Ladne e al.,
2012), como se ha podido con i ma en FluG en es e abajo. De la misma o ma, la
conse ación de los esiduos que se unen a los me ales, in i a a pos ula que los
inhibido es de las GS (PPQ, P3S) puedan ambién a ec a a la unción de FluG. Sin
emba go, la mayo di e encia en e las enzimas GSI y las -glu amil ligasas eside en la
in e acción en e dos esiduos (un glu ama o y un aspa a o) que p o egen el in e media io
γ-glu amil os a o y eliminan un p o ón de la molécula de amonio ( o mando amoníaco)
pa a p opicia la sus i ución po el os a o en el γ-glu amil os a o (Mu ay e al., 2013).
En es e es udio, se ha podido con i ma que es os esiduos no es án conse ados en las
secuencias de las -glu amil ligasas, la egión C- e minal y aquellos homólogos de las
GSI que no ca alizan la sín esis de glu amina (Ku iha a e al., 2008; Ladne e al., 2012;
K ysenko e al., 2017). Pa a le a a cabo una p ueba expe imen al que acla e es e pun o,
se han seleccionado una se ie de esiduos pa a lle a a cabo mu aciones pun uales en el
siguien e capí ulo, con el obje i o de de e mina su impo ancia en la ac i idad de a egión
C- e minal de FluG.
En la búsqueda lle ada a cabo pa a la selección de esiduos ca alí icos y genes
candida os pa a sus i ui ambas egiones de FluG, se pudo encon a más in o mación en
o no a la unción que lle an a cabo los homólogos que mos a on ene una buena
simili ud es uc u al con la egión C- e minal de FluG. Los in o mes del gen PA5508 han
asociado su ac i idad con la u a de u ilización de las poliaminas jun o con o os seis
genes pa álogos en Pseudomonas ae uginosa PAO1, siendo es e gen el único que no se
inducía en p esencia de sus a os de poliaminas (Yao e al., 2011). In es igaciones
pos e io es ealizadas po Ladne e al. (2012) mos a on que la p e e encia del sus a o
de PA5508 e a más ue e pa a las aminas a omá icas (ca ecolaminas) que pa a las aminas
lineales (poliaminas). La compa ación lle ada a cabo en e las sie e secuencias PauA1-7
y la egión C- e minal de FluG ha mos ado que an o la secuencia PauA7 como es a
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
104
egión, conse an una meno iden idad en compa ación con los PauA1-6. Es e esul ado
puede indica que el papel enzimá ico de FluG pueda es a más es echamen e elacionado
al de una -glu amil ligasa con p e e encia pa a las aminas a omá icas, que a una -
glu amil ligasa con p e e encia pa a aminas lineales como la pu escina.
Teniendo en cuen a que los in o mes sob e la unción de los homólogos de FluG se
ha desc i o en bac e ias, o o de los aspec os que susci ó in e és ue sabe en qué especies
se pueden encon a sus homólogos. De es a o ma, se con i mó que exis en secuencias
homólogas a las dos egiones de FluG en bac e ias (S ong e al., 2003; Rexe e al., 2006),
hongos (Schumache e al., 2015; Li e al., 2017; Chen e al., 2020) y plan as (Ma his e
al., 1999; T e askis e al., 2002; Doskočilo  e al., 2011; Sil a e al., 2015), sin emba go,
en bac e ias, es as egiones se encuen an po sepa ado. Cabe esal a ambién que, en los
es einos, odas las secuencias homólogas a FluG conse an odos los esiduos
ca alí icos que se han de allado en es e capí ulo. Es e hecho pod ía suge i que FluG pueda
cumpli el mismo papel en hongos y plan as. Sin emba go, basándonos en la
ca ac e ización de los homólogos de FluG en o os Aspe gilli (Mah y Yu, 2006; Ogawa
e al., 2010; Chang e al., 2012; Wang e al., 2015), no se puede a i ma que el papel de
-glu amil ligasa que se le ha adsc i o a FluG se haya conse ado en los di e en es einos,
más aún eniendo en cuen a que ambas egiones se encuen an po sepa ado en bac e ias.
Con espec o a las p edicciones que han adsc i o a FluG ac i idades de dos enzimas
de o igen p oca io a, se ha a ibuido a e en os de usión y isión impulsados po la
e olución pa áloga de bac e ias a hongos (Ma his e al., 2000), como ha podido ocu i
con los homólogos de FluG en bac e ia. Cabe des aca que es e hecho ambién puede
da se en e di e en es especies de hongos median e anslocación o in e sión
c omosómica (Leona d y Richa ds, 2012). En es e caso, se ha con i mado que los
homólogos bac e ianos de FluG se encuen an o ganizados en ope ones, cuyo papel es,
gene almen e, desconocido. En el caso de los ope ones encon ados en Mycobac e ium
ube culosis) y S ep omyces coelicolo , se ha obse ado que ambos o ganismos
con ienen cua o genes homólogos a las GSI (glnA1-4) (Rexe e al., 2006; Haywa d e
al., 2009), de los cuales glnA3 (S ong e al., 2003; Rexe e al., 2006) es el que es á
p esen e en ambos ope ones. La gene ación del nulo del gen glnA3 de S ep omyces
coelicolo no exhibió de ec os en la espo ulación, demos ando que el papel de es e gen
es dis in o al de la egión C- e minal FluG (Rexe e al., 2006). Un es udio pos e io
ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG
105
lle ado a cabo po K ysenko e al. (2017) des eló que el gen glnA3 iene ac i idad -
glu amil pu escina ligasa, la cual es á implicada en la u a de deg adación de las
poliaminas y su pos e io u ilización como uen e de ni ógeno (Ku iha a e al., 2008). Se
desconoce que papel puede ene el gen adyacen e que codi ica la amidohid olasa en es as
bac e ias, pe o la disposición ce cana en e las secuencias p edichas de GSI y
amidohid olasa, indica posiblemen e una conexión uncional (S ong e al., 2003; Iye e
al., 2009).
La in o mación ob enida en es e capí ulo ha pe mi ido, po un lado, selecciona los
esiduos ca alí icos candida os a se mu ados pun ualmen e pa a pode de e mina su
impo ancia en la unción de FluG. Po o o lado, se lle a á a cabo la sepa ación de las
egiones N- y C- e minal de FluG y se exp esa an indi idualmen e y po sepa ado den o
del hongo, con el obje i o de e i ica la unción que cumple cada uno. Finalmen e, se
sus i ui án las dos egiones de FluG po uno de los candida os bac e ianos que se han
u ilizado pa a el modelado de FluG, pa a comp oba si es os homólogos son capaces de
lle a a cabo in i o la unción na i a de FluG.
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
112
alo in e medio (Anexo 16). Es os esul ados indican que ambas egiones son
uncionales cuando se exp esan po sepa ado, ya que, po un lado, en MMA se midie on
ni eles de conidiación semejan es a los obse ados en las cepas WT y C- e minal. Po
o o lado, en MCA, el alo de C duplicó el ob enido en la cepa C- e minal, sin emba go,
es e alo ep esen aba la mi ad del alo de C ob enido en la cepa WT. En esumen, se
con i mó que la egión N- e minal iene un papel de apoyo a la egión C- e minal en la
p oducción de conidias en condiciones de al a disponibilidad de nu ien es,
especialmen e, cuando ambas egiones se exp esan en el mismo polipép ido.
2.2. La exp esión po sepa ado de las egiones N- y C- e minal de FluG a ec a al
desa ollo sexual
Los esul ados ob enidos en el apa ado an e io demos a on que al menos, en el
desa ollo asexual, las egiones N- y C- e minal cumplen unciones dis in as,
dependiendo de la condición del medio en el que es cul i ado el hongo. Teniendo en
cuen a los an eceden es y los esul ados ecogidos en la Figu a 28 del p ime obje i o, se
p ocedió al con aje de cleis o ecios de los mu an es que con enían las egiones N- y C-
e minal de FluG (Figu a 28). Los alo es del con aje de cleis o ecios es án de allados en
el (Anexo 17).
Figu a 28. Con aje de cleis o ecios po unidad de á ea (Cleis o ecios/Á ea) en una cepa WT,

luG, N- e minal (aa1–
aa406), C- e minal (aa427–aa865) en MMA (g is oscu o) y MCA (g is cla o).

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
113
Los esul ados mues an que en medio mínimo la p oducción de cleis o ecios po
unidad de á ea en los mu an es N- y C- e minal es semejan e al de una cepa

luG. En
medio comple o, la cepa que exp esa la egión N- e minal no desa olla ninguna
es uc u a sexual. Sin emba go, en las mismas condiciones, el mu an e que con iene la
egión C- e minal gene a la misma can idad de cleis o ecios que una cepa sil es e. Los
esul ados demues an que los el núme o más al o de cleis o ecios en ambos medios se
consigue cuando ambas egiones es án p esen es. La egión C- e minal es esencial pa a
que se lle e a cabo el desa ollo sexual en medio comple o.
2.3. La sus i ución de los esiduos conse ados a ec a a la unción de FluG
Las mu aciones sob e los esiduos equi alen es a H20, H22 y D354 en la egión N-
e minal de FluG (Figu a 22) habían sido desc i as como esenciales pa a la ac i idad de
amidohid olasas (Kim y Kim, 1998; Li e al., 2006; Lohkamp e al., 2006; Nguyen e al.,
2009). Con el obje o de p oba el e ec o de sus i uciones en esos mismos esiduos sob e
la unción de FluG, se cons uye on es mu an es en los que se sus i uye on los
aminoácidos po una alanina: simple (D354), doble (H20-H22) y iple (H20-H22-D354).
La misma es a egia se siguió pa a la egión C- e minal, donde los esiduos E566, E626,
H682, R720, R739, R744 y E752 se selecciona on en base a abajos an e io es (Ku iha a
e al., 2008; Ladne e al., 2012; Mu ay e al., 2013). Ninguna de es as sus i uciones dio
luga a la p edicción de cambios con o macionales impo an es cuando se es a on en e
a modelos de homología (Ma e iales y Mé odos, Maes o (Sch ödingue ®). Los eno ipos
obse ados pa a el conjun o de los mu an es se mues an en la Figu a 29 (Se incluye en
mayo amaño en el Anexo 18). Los alo es de p oducción de conidias y el peso seco po
unidad de á ea es án de alladas en el Anexo 16.
Todas las mu aciones en la egión N- e minal exhibie on alo es de C más bajos
con espec o a la cepa WT en ambos medios. En MMA, ue on lige amen e in e io es.
En MCA, sin emba go, se obse a on di e encias no ables. Po un lado, el mu an e H20A-
H22A p esen ó un ni el de conidiación supe io al mu an e D354A, y es e, a su ez,
supe ó al mu an e iple (H20A-H22A-D354A) (Figu a 29). Es o indica un e ec o adi i o
de las mu aciones.
En la egión C- e minal, las mu aciones en los esiduos E566, E626, H682, R720,
R739, R744 y E752 de i a on en cambios d ás icos. En MMA, odas las cepas mu an es
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
114
p esen a on alo es de C más bajos en compa ación con la cepa sil es e, pe o a su ez,
supe io es a los ob enidos en la cepa

luG. Es o indica que las mu aciones pun uales
esul a on en una inac i ación pa cial de la ac i idad. En MCA, los alo es de C ue on
muy bajos, ace cándose a los ob enidos en la cepa

luG. Sin emba go, el mu an e R739A
p esen ó un eno ipo di e gen e con alo es de C es adís icamen e supe io es en MCA en
compa ación a los o os mu an es de es a egión (Figu a 29).
En conjun o, los esul ados mues an que las mu aciones pun uales en ambas
egiones a ec an a la unción biológica a ibuible a cada una de las egiones, con i mando
la uncionalidad de los esiduos conse ados en cada una de ellas.
2.4. Ni eles de exp esión del gen luG en dis in os mu an es
Pa a de e mina que los eno ipos obse ados no e an p oduc o de una exp esión
génica al e ada, las cepas ue on examinadas po qPCR y compa adas con la de la cepa
WT, como se mues a en la Figu a 30 (Se incluye en mayo amaño en el Anexo 19). Con
la excepción del mu an e

luG, odos mu an es p esen a on ni eles de ansc ipción
iguales o supe io es a los obse ados en la cepa WT. La cuan i icación de la exp esión de
luG en odos los mu an es indicó que el ni el de exp esión e a supe io al obse ado en
Figu a 29. Feno ipos y a ios de C/Á ea (millones/cm2) de odos los mu an es FluG, as habe los incubado du an e 72 h. Cepa sil es e (WT)
jun o con el nulo de luG (

luG) y los mu an es pun uales de ambas egiones en MMA y MCA. Los alo es C/Á ea que son es adís icamen e
di e en es ( alo P <0,05) al WT (
∗) y el

luG (#) es án ma cados. Los alo es de C/Á ea en medio mínimo (MMA) es án ep esen ados en
g is oscu o, y los alo es de C/Á ea en medio comple o (MCA), es án ep esen ados en g is cla o. Ba a de escala = 1 cm
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
115
la cepa WT en la mayo ía de ellos. Teniendo en cuen a que las mu aciones causa on una
uncionalidad amino ada en é minos eno ípicos, es os ni eles de exp esión desca an
que los eno ipos obse ados se deban a ni eles de exp esión educidos. Es os esul ados
sugie en que la egulación de FluG pueda es a condicionada po el ni el de ac i idad que
es é lle ando a cabo, siendo su ausencia una señal pa a que aumen e la exp esión de luG.
2.5. La sus i ución he e óloga de ambas egiones de FluG po sus homólogos
bac e ianos complemen an su unción
Apoyados po las homologías es uc u ales obse adas en e las egiones N- y C-
e minal con las de Lac obacillus pa acasei (LSEI_0440) y Pseudomonas ae uginosa
(PA5508), espec i amen e, se cons uye on cepas en las que las secuencias bac e ianas
se exp esa on bajo el p omo o na i o de luG en combinaciones que incluían es
quime as p o eicas (LSEI_0440+C- e minal; N- e minal+PA5508; LSEI_0440+
PA5508) y un único polipép ido (PA5508).
Figu a 30. Los alo es de exp esión de luG pa a cada cepa en MMA se mues an en el g á ico. Todas las mues as ue on omadas
después de 18 h de c ecimien o ege a i o. Las siglas se e ie en a lo siguien e: WT, cepa sil es e;

luG, mu an e nulo del gen
luG; N- e minal, egión (1-406); C- e minal, egión (427-865); N + C sepa ados [N] y N + C sepa ados [C], mu an e de egión
sepa ada N- y C- e minal; H20A-H22A / D354A / H20A-H22A-D354A, mu an es pun uales de la egión N- e minal; E566A /
E626A / H682A / R720A / R739A / R744A / E752A, mu an es pun uales de la egión C- e minal.
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
116
Los eno ipos de las cepas mu an es se mues an en la Figu a 31. Los alo es de C
ob enidos en las cepas LSEI_0440+C- e minal y N- e minal+PA5508 ue on
signi ica i amen e más al os que la cepa WT en MMA. En las mismas condiciones, el
PA5508 y el LSEI_0440+PA5508 mos a on alo es de C es adís icamen e simila es en
compa ación con la cepa WT. Po o o lado, los alo es de C de las es quime as de
p o eínas (LSEI_0440+C- e minal; N- e minal+PA5508; LSEI_0440+PA5508) ue on
es adís icamen e simila es a la cepa WT en MCA. Sin emba go, la cepa que exp esaba el
polipép ido PA5508 solo exhibió un alo signi ica i amen e más bajo en compa ación
con el WT en el mismo medio.
Figu a 31. Feno ipos y a ios de C/Á ea (millones/cm2) de odos los mu an es de sus i ución de FluG, as habe los
incubado du an e 72 h. Cepa sil es e (WT) jun o con el nulo de luG (

luG) y los mu an es de sus i uciones
he e ólogas LSEI_0440+C- e minal (FluG), N- e minal (FluG)+PA5508, LSEI_0440+PA5508 y PA5508 solo en
MMA y MCA. Los alo es C/Á ea que son es adís icamen e di e en es ( alo P <0,05) al WT (
∗) y el

luG (#) es án
ma cados. Los alo es de C/Á ea en medio mínimo (MMA) es án ep esen ados en g is oscu o, y los alo es de C/Á ea
en medio comple o (MCA), es án ep esen ados en g is cla o. Ba a de escala = 1 cm
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
117
Los esul ados demues an que la p o eína codi icada po el gen LSEI_0440 puede
eemplaza uncionalmen e la egión N- e minal de FluG. Po o a pa e, la p o eína
codi icada po PA5508 cumple el papel de la egión C- e minal de FluG, ya sea como un
solo polipép ido (mu an e PA5508), o usionada a la egión N- e minal de FluG (quime a
N- e minal+PA5508). De acue do con los esul ados mencionados an e io men e, el
hecho de que la quime a que exp esa la p o eína usionada de LSEI_440 y PA5508 exhiba
un eno ipo es adís icamen e compa able a una cepa WT con i ma que ambas enzimas
bac e ianas pueden unciona conjun amen e pa a eemplaza a ambas egiones FluG.
2.6. La sus i ución he e óloga de FluG po su homólogo de plan a, NodGS, no
complemen a su unción
Siguiendo la misma es a egia que se lle ó a cabo con los homólogos bac e ianos,
se cons uyó una cepa que con enía la secuencia del gen NodGS de A abidopsis haliana
la cual se exp esó bajo el p omo o na i o de luG. Los eno ipos an o de la cepa mu an e,
como la cepa sil es e y se mues an en la Figu a 32.
Los esul ados obse ados demues an que NodGS no es capaz de complemen a la
unción de FluG, ya que los eno ipos ob enidos en el mu an e NodGS, es simila a los
ob enidos en un mu an e nulo del gen luG.
Figu a 32. Feno ipo de la cepa sil es e (WT) jun o con el nulo de luG (

luG) y el mu an e NodGS,
as habe lo incubado du an e 72 h. Cepa sil es e (WT) jun o con el nulo de luG (

luG) y el mu an e
NodGS. Ba a de escala = 1 cm

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
118
2.7. P ecisiones sob e la ac i idad enzimá ica de la egión C- e minal
T as la demos ación de la capacidad de la secuencia 4HPP pa a suplan a la unción
de la egión C- e minal, se conside ó opo uno ealiza un examen más de allado de la
secuencia y es uc u a de es a enzima. El abajo lle ado a cabo po Ladne e al. (2012)
enía como obje i o la iden i icación de las di e encias más no ables en e una GS y los
genes que son homólogos a las GS, pe o no compa en dicha unción como es el caso de
los genes pauA1-7. Teniendo en cuen a que a los genes pauA1-6 ya se les asignó un papel
en la deg adación de poliaminas en es udios an e io es (Lu e al., 2002; Chou e al., 2008;
Yao e al., 2011; Yao e al., 2012), su in es igación de cen ó en lle a a cabo una
e aluación es uc u al y bioquímica del gen pauA7 (PA5508). El es udio bioquímico
des eló que es a enzima no exhibía la ac i idad de una GS po que e a incapaz de o ma
glu amina. Sin emba go, mos aba una ac i idad -glu amil ligasa con p e e encia po
sus a os como las aminas he e ocíclicas o ca ecolaminas, ales como la yp amina,
se o onina y la dopamina (Ladne e al., 2012).
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
119
2.7.1. El ex emo C- e minal iene mayo simili ud con una -glu amil ligasa
La esolución del c is al de la p o eína PA5508, a lo ó una se ie de di e encias
es uc u ales en compa ación con la es uc u a de c is al de la GS de Salmonella
yphimu ium (1FPY). Po un lado, se esal aba que mien as la GS de S. yphimu ium
adop a un es ado oligomé ico de dos hexáme os coo dinados po el ex emo C- e minal
de la p o eína ( ambién conocido como co ea helicoidal) pa a o ma un dodecáme o, la
p o eína PauA7 o maba hexáme os, debido a que el ex emo C- e minal se pliega hacia
el in e io de la p o eína, quedando inaccesible pa a cualquie ipo de in e acción (Figu a
33). Ladne e al. (2012) elaciona on es e enómeno con la ausencia de una egión de
ap oximadamen e 55 aminoácidos p esen e en la GS de Salmonella yphimu ium, la cual
o ma dos láminas be a que impiden el plegamien o del ex emo C- e minal. En la
es uc u a de PauA7 se obse ó que es a egión es aba o mada po ap oximadamen e 12
aminoácidos sin es uc u a, siendo es a la azón po la que el ex emo C- e minal puede
ene acceso al plegamien o hacia el in e io de la p o eína (Figu a 33).
Figu a 33. Rep esen ación de la con o mación que adop a el ex emo C- e minal (ama illo) y la egión de las dos láminas be a
(azul
) en los c is ales 1FPY ( ojo) y 4HPP ( e de). A)
En el c is al 1FPY, el ex emo C- e minal es á o ien ado hacia el ex e io ,
quedando accesible pa a in e acciona con o a subunidad. Las dos láminas be a bloquean la mo ilidad del ex emo C- e minal.
B) En el c is al 4HPP, debido a la ausencia de las dos láminas be a, el ex emo C- e minal queda se pliega hacia el in e io de la
p o eína, quedando inaccesible pa a cualquie ipo de in e acción.
A
B
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
120
Teniendo en cuen a es os indicios, se p ocedió a analiza cual de los modelos del
ex emo C- e minal de las dos p o eínas modelo (1FPY o 4HPP) gua dan mayo simili ud
es uc u al con el ex emo C- e minal de FluG, aliéndonos pa a ello de los alo es
QMEAN que la he amien a Swiss-Model calcula po cada aminoácido. Así mismo, se
p ocedió ambién a analiza la egión en la que Ladne e al. (2012) obse a on la ausencia
de dos láminas be a (Figu a 33), pa a pode de e mina si es a egión que FluG con iene
los aminoácidos necesa ios pa a o ma es a es uc u a en el c is al 1FPY. Los esul ados
ob enidos se ep esen an en o ma de modelos de FluG ob enidos con el c is al 1FPY
(Figu a 34) y el c is al 4HPP (Figu a 35), jun o con un esumen en la Tabla A y la Tabla
B del Anexo 20.
T as analiza los esul ados ob enidos en la Tabla A del Anexo 20, el p omedio de
los alo es QMEAN indi iduales ob enido pa a los ece aminoácidos que pueden o ma
la co ea helicoidal sugie e que la es uc u a que adop a la p o eína PauA7 en el c is al
4HPP es la que mayo simili ud es uc u al p esen a pa a es a egión de FluG, ya que los
alo es QMEAN que p esen a FluG son supe io es pa a es a con o mación. Cuando se
compa ó la egión que es á o mada po dos láminas be a en el c is al 1FPY con la
p o eína PauA7 y con FluG, los esul ados ob enidos en la Tabla B del Anexo 20
Figu a 34. Con o mación que adop a el ex emo C- e minal (ama illo) y la egión de las dos
láminas be a (
azul) en los modelos 1FPY ( ojo
) y la egión C- e minal modelada con el c is al
1FPY (
mo ado). A)
En el c is al 1FPY, el ex emo C- e minal es á o ien ado hacia el ex e io ,
quedando accesible pa a in e acciona con o a subunidad. Las dos láminas be a bloquean la
mo ilidad del ex emo C- e minal.
B)
En el modelo de la egión C- e minal, debido a la ausencia
de las dos láminas be a, el ex emo C- e minal puede plega se hacia el in e io de la p o eína.
A
B
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
121
mos a on que ambas p o eínas ca ecen de los aminoácidos necesa ios pa a o ma la
es uc u a compues a po dos láminas be a. Si bien FluG con iene 11 aminoácidos más
que PauA7 en es a egión, el modelo de FluG cons uido con el c is al 1FPY demos ó
que FluG no o maba una es uc u a semejan e a las láminas be a (mos adas en azul)
p esen es en la GS de S. yphimu ium (Figu a 34).
Po o o lado, el modelo de FluG cons uido con el c is al 4HPP, demos ó que
FluG, si bien se ex endía 10 aminoácidos más que en modelo 4HPP, es a egión
conse aba una mayo simili ud con la -glu amil ligasa de P. ae uginosa (Figu a 35).
2.7.2. El dominio -G asp de FluG es simila al de ambas GS y -glu amil ligasas
O a ca ac e ís ica es uc u al impo an e de las GS eside en el ex emo N- e minal,
el cual adop a una es uc u a de seis laminas be a (de las cuales, cua o es án
in e lineadas), ambién conocido como -G asp, al y como se mues a en la Figu a 36.
Es a egión es especialmen e impo an e po que conse a el esiduo ca alí ico aspa a o
el cual ex ae el p o ón del amonio, y ambién po que una ez la p o eína se coo dina pa a
o ma un hexáme o, el -G asp in e acciona con la egión C- e minal (ca alí ica) de la
unidad adyacen e (Figu a 36).
Figu a 35. Con o mación que adop a el ex emo C- e minal (ama illo) y la egión de las dos láminas
be a (
azul) en los modelos 4HPP ( e de) y la egión C- e minal modelada con el c is al 4HPP (mo ado
).
A) En el c is al 4HPP, debido a la ausencia de las dos láminas be a, el ex emo C- e minal queda se pliega
hacia el in e io de la p o eína, quedando inaccesible pa a cualquie ipo de in e acción.
B)
En la egión
C- e minal, ampoco es án p esen es las dos láminas be a, y el ex emo C- e minal puede plega se hacia
el in e io de la p o eína.
A
B
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
128
uncionalmen e impo an es en las GS y las -glu amil ligasas, cumplen una unción
impo an e en FluG (Ladne e al., 2012).
Los análisis de exp esión de los mu an es, han des elado que, si bien la exp esión de
odos los mu an es es al menos an abundan e a la obse ada en una cepa sil es e, la
mayo ía de los mu an es, han exhibido una exp esión conside ablemen e supe io . Es e
hecho ambién ha sido p e iamen e epo ado po Lee y Adams (1994) y Yage e al. (1998),
quienes epo a on una exp esión abe an e de FluG po mu aciones que a ec aban a su
unción. Es e hecho sugie e que FluG pueda es a au o egulado median e algún ac o de
ansc ipción que pueda esponde (Thieme e al., 2018), a los ni eles de sus a o o p oduc o
de la enzima.
En lo que espec a a la posible unción enzimá ica de FluG se e ie e, un es udio
lle ado a cabo po Ma gelis e al. (2001), sus i uyó he e ologamen e el gen luG de A.
nidulans po la GS (glnA) del o ganismo p oca io a Anabaena sp., con i mando que es e
úl imo no e e ía los de ec os causados po la ausencia de FluG. Si bien, es a
ap oximación si ió pa a desca a que FluG u ie a la ac i idad enzimá ica de una GS,
eniendo en cuen a que en el Capí ulo IV las es uc u as homólogas a la egión N- y C-
e minal de FluG que se encon a on, e an o igina ias de Lac obacillus pa acasei y
Pseudomonas ae uginosa, se p ocedió a sus i ui he e ologamen e las dos egiones de
FluG po sus homólogos bac e ianos, pa a comp oba si son capaces de lle a a cabo in
i o la unción na i a de FluG. Los esul ados han demos ado que ambas p o eínas
codi icadas po los genes LSEI_0440 y PA5508 cumplen el papel de la egión N- y C-
e minal de FluG, espec i amen e. Cabe des aca que el hecho de habe obse ado un
eno ipo semejan e al de la cepa sil es e en la quime a con ambos genes bac e ianos
usionados, sugie e que la unción enzimá ica que cumplen es as enzimas, sea simila o
idén ica a la que lle a a cabo FluG.
Po o o lado, se pudo obse a que el gen NodGS, homólogo a FluG en A. haliana,
no complemen ó la unción na i a en A. nidulans. Si bien, se pudo con i ma que NodGS
conse a odos los esiduos ca alí icos p edichos, es posible que los codones que
codi ican los aminoácidos no sean los óp imos pa a lle a a cabo la aducción a la
elocidad óp ima, jun o con su pos e io plegamien o de la p o eína (Plo kin y Kudla,
2011). No obs an e, eniendo en cuen a los in o mes que se han epo ado en o no a la
unción de NodGS (Doskočilo  e al., 2011) y su homólogo en Medicago unca ula

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG
129
(T ujillo, 2019), es muy p obable que la unción que desempeñan es os homólogos sea
dis in a o se haya especializado lo su icien e como pa a no complemen a el papel de
FluG en A. nidulans.
Finalmen e, en análisis bioin o má ico lle ado a cabo en p o undidad compa ando la
egión C- e minal con la es uc u a de c is al de la -glu amil ligasa PauA7, indica que
ambas compa en dominios simila es, como una co ea helicoidal o ien ada hacia el in e io
de la p o eína y la ausencia de dos láminas be a. No obs an e, se han de ec ado ambién
di e encias an o en la conse ación de una y osina candida a a se adenilada, como la al a
de conse ación de los esiduos candida os a in e acciona con el sus a o, lo cual implica
que se necesi a ía lle a a cabo un abajo expe imen al más exhaus i o pa a alo a la
impo ancia de es os esiduos.
CAPÍTULO VI: DISCUSIÓN GENERAL
DISCUSIÓN GENERAL
FluG es á ac edi ado como uno de los p ime os ac o es de acción emp ana en la
inducción de la conidiación (Pa k y Yu, 2012). Sin emba go, su ca ac e ización ha
seguido una sinuosa ayec o ia, que ha man enido la incógni a en cuan o a su papel el
desa ollo asexual. El abajo pione o de Adams y colabo ado es (Lee y Adams, 1994;
Wiese e al., 1994), apun ó el ca ác e enzimá ico de es e ac o , como una hipo é ica
glu amina sin e asa de ipo I, mien as que es udios pos e io es no pe mi ie on elucida la
unción p ecisa (Ma gelis e al., 2001). Pos e io men e, o os abajos elaciona on al
ac o con la luz (Yage e al., 1998; Ruge -He e os e al., 2011) y el complejo Vel e
(Chang e al., 2013), des iando el en oque inicial, quedando así la unción en un es ado
de inde inición. T as el abajo p esen ado en es a esis, la unción enzimá ica
inicialmen e hipo e izada po Lee y Adams (1994) queda p ecisada y pa cialmen e
con i mada, si bien pe manecen aún sin demos a las eacciones p ecisas que desempeña.
En cualquie caso, la in o mación apo ada en es e es udio da cabida pa a hipo e iza
sob e la posible na u aleza de es as eacciones y el papel que pueden juga en el con ex o
gene al del desa ollo asexual y del uncionamien o del micelio como unidad
mul icelula .
Una enzima bi uncional
Los esul ados de es e es udio han demos ado que FluG cons a de dos egiones con
ac i idades enzimá icas p edichas (una amidohid olasa y una -glu amil ligasa) capaces
de desempeña sus unciones po sepa ado al igual que sus o ólogas bac e ianas. Las
enzimas bi uncionales, así como los complejos mul ienzimá icos, es án jus i icados po
el aumen o de e icacia que p opicia la p oximidad espacial en e las unidades ca alí icas,
minimizando así las ine icacias elacionadas con la di usión de los in e media ios.
En el caso de FluG, se a a de dos enzimas unidas po una secuencia que ca ece de
es uc u a. A al a de un conocimien o más especí ico sob e las eacciones de las dos
enzimas, el análisis uncional basado en el núme o de espo as ob enido pe mi e ex ae
conclusiones en el ámbi o de los p ocesos biológicos a ec ados. En medio mínimo, en el
que exis e una cie a limi ación nu i i a, los esul ados indica on que la egión C-
e minal (en adelan e -glu amil ligasa) es capaz de lle a a cabo la unción biológica
elacionada con el desa ollo asexual sin apo ación apa en e po pa e la egión N-
e minal (en adelan e amidohid olasa). Es udios an e io es ya indica on que la egión C-
e minal e a imp escindible pa a la ac i idad de FluG (D'Souza e al., 2001). En el medio

DISCUSIÓN GENERAL
comple o, en el que el apo e de ni ógeno o gánico es conside able, la ac i idad
amidohid olasa juega un papel de e minan e pa a man ene ni eles de conidiación
compa ables con los de la cepa sil es e. En su ausencia, se obse a un desequilib io
mo ogené ico en a o del c ecimien o ege a i o (Figu a 38).
Dado que la ac i idad undamen al de FluG se cen a en la -glu amil ligasa,
comenza emos po analiza es a ac i idad. Las enzimas bac e ianas que han sido capaces
de sus i ui la unción na i a en es e es udio pa icipan en la deg adación de uen es
complejas de ni ógeno, p incipalmen e aminas, pa a o ma compues os más simples que
Figu a 38. Rep esen ación de la hipo é ica u ilización que ienen la egión N- e minal (azul) y la egión C- e minal ( e de) de
FluG, empleando un in e media io me abólico abundan e en hi as cul i adas en MMA (
ojo) y MCA (MMA ( ojo
) + Ex ac o
de le adu a (
mo ado
). En MMA, la egión C- e minal de FluG es su icien e pa a lle a a cabo la espo ulación. En MCA, se
conside a que la egión N- e minal es necesa ia pa a p ocesa un in e media io me abólico sin e izado en p esencia del ex ac o
de le adu . Se especula que el p oduc o de la egión N- e minal pueda se i como sus a o de la egión C- e minal o que una
ez ans o mado po la egión N- e minal, deje de unciona como señalizado del c ecimien o. Las es uc u as
idimensionales de ambas egiones se han ob enido a pa i de las es uc u as de c is al ob enidas de los homólogos bac e ianos
de Lac obacillus pa acasei pa a la egión N- e minal (2QPX), y Pseudomonas ae uginosa pa a la egión C- e minal (4HPP).
La imagen del conidió o o ha sido modi icada a pa i de (Rod iguez-Rome o e al., 2010).
DISCUSIÓN GENERAL
puedan se p ocesados hacia o os p ocesos me abólicos como el c ecimien o, la sín esis
de p o eínas o la comunicación con o os o ganismos (Rei ze , 2003; an Heeswijk e al.,
2013; Luengo y Oli e a, 2020). Un ejemplo es el p oceso de deg adación de a ias aminas
lineales como la pu escina (Ku iha a e al., 2008; K ysenko e al., 2017), la cada e ina,
e anolamina (K ysenko e al., 2019) y aminas a omá icas (A o a, 2015) como la anilina
(Takeo e al., 2013) o sín esis de la me ilamina (Yamamo o e al., 2008) median e la -
glu amilación. Si bien es e p oceso ue a ibuido a cie as p o eínas homólogas a las
inicialmen e ca ego izadas como GS, es udios más de allados demos a on que es as
e ec úan una -glu amilación. La enzima -glu amil ligasa PauA7 (Ladne e al., 2012)
que sus i uye uncionalmen e la ac i idad de FluG in i o gua da cie a simili ud de
secuencia con una GS, pe o su unción es la -glu amilación de ca ecolaminas (Figu a
39). Es a p opiedad ambién se ha a ibuido más ecien emen e a o as enzimas no
homólogas a las GS que cumplen la misma unción sob e aminas a omá icas como la
i amina (Wang e al., 2014).
Figu a 39.
Esquema del ipo de aminas cuya u ilización po -glu amil ligasas ha sido con i mada. Es as aminas, una ez
-
glu amiladas (
p oduc o -glu amilado
), son p ocesadas po u as al e na i as que pueden de i a en la deg adación de es as mismas
pa a emplea las como uen e de ni ógeno, o, al e na i amen e, se pos ula que la glu amilación pudiese esul a da luga a la señal
que des ine el compues o a o os p ocesos como la señalización del inicio de p ocesos como la conidiación o el desa ollo sexual.
DISCUSIÓN GENERAL
A lo la go de la esc i u a de es a esis, la publicación de nue os es udios cen ados
en la esolución de es uc u as de c is al ha pe mi ido encon a una nue a enzima
candida a, denominada -glu amil me ilamida sin e asa (GmaS) (Wang e al., 2020). Se
ha podido e i ica que la enzima GmaS, al igual que la enzima PauA7, iene es echa
simili ud con una GS. No obs an e, no conse a los dos esiduos ca alí icos p esen es en
una GS, los cuales in e accionan con el amonio, y lle an a cabo el úl imo paso pa a o ma
el p oduc o. Cabe esal a ambién que o o es udio ha epo ado la capacidad que ienen
las enzimas GmaS de u iliza dis in os ipos de aminas ali á icas (lineales) y a omá icas
(cíclicas) como sus a o pa a pos e io men e -glu amila las (Pan e al., 2020). Las
e idencias ecogidas en o no a la ac i idad an e sá il que p esen an las enzimas -
glu amil ligasas, in i a a pensa que FluG pueda ambién conse a cie a p omiscuidad
po un abanico de sus a os des inados an o al c ecimien o como a la di e enciación del
micelio.
Los esul ados ob enidos en es a esis median e mu aciones pun uales en los
esiduos ca alí icos p edichos y la sus i ución de su homólogo bac e iano, apoyan la
in e p e ación de que FluG puede es a cumpliendo una unción enzimá ica semejan e a
la -glu amilación de uno o a ios sus a os. El obje i o úl imo, epo ado en bac e ias,
es la deg adación de poliaminas. Va ios es udios han esal ado la impo ancia de la
pu escina (Snea h, 1955; Guzmán-de-Peña e al., 1998) y la espe midina (Jin e al., 2002)
en las e apas del desa ollo asexual, desa ollo del ubo ge mina i o y el me abolismo
secunda io de A. nidulans y en el desa ollo asexual de o os hongos (Mead e al., 2013).
Sin emba go, no se ha epo ado un eque imien o di ec o de poliaminas exógenas pa a
la p oducción de conidió o os y su p esencia en el medio no con ibuyen a induci o
aumen a los ni eles de conidiación (U. Ugalde, comunicación pe sonal). Po an o,
pa ece poco p obable que el p oceso en el que pa icipa es a enzima sea equipa able al
obse ado en bac e ias que emplean las poliaminas como uen e de ca bono y ni ógeno.
Una posibilidad a conside a pod ía se que FluG in e enga sob e in e media ios
esul an es de p ocesos de au o agia, como la deg adación de pu inas y pi imidinas, o el
ciclo de la u ea, como se e á más a de.
Una ez o mulada una p opues a sob e la ac i idad -glu amil ligasa, pasamos
examina la ac i idad amidohid olasa, eco dando que es a ac i idad es especialmen e
ele an e en condiciones de al a disponibilidad de ni ógeno o gánico (aminoácidos y
DISCUSIÓN GENERAL
ácidos nucléicos). Los análisis de secuencia no han pe mi ido iden i ica posibles
o ólogos. Sin emba go, los esiduos conse ados co esponden a los de una
dihid opi imidinasa bac e iana, la cual pa icipa en la sín esis y deg adación de las
pi imidinas (Lohkamp e al., 2006). Es a unción es lle ada a cabo en A. nidulans po un
enzima ilogené icamen e dis an e (Aleksenko e al., 1999). En es e con ex o, no se puede
especula en de alle sob e los sus a os posibles de la amidohid olasa. Sin emba go, es
p obable que es én elacionados con p ocesos de au o agia, como la deg adación de
pu inas (Gou nas e al., 2011) y pi imidinas (Aleksenko e al., 1999). En el caso de las
pu inas, la deg adación de la adenina esul a en la o mación moléculas cíclicas como la
el ácido ú ico o la xan ina, las cuales siguen siendo deg adados has a o ma p oduc os
como la alan oina, u ea o el amonio. Cabe esal a que los esiduos ca alí icos an o en la
deaminasas de la amina (NadA) (Oes eiche e al., 2008) como la u easa (U eB)
(Kappaun e al., 2018), es án conse ados en la amidohid olasa. No obs an e, ambas
p o eínas no compa en simili ud es uc u al. En el caso de las pi imidinas, an o el u acilo
como la imina se pod ían deg ada dando luga a la -alanina o -aminoisobu i a o
(Schnacke z y Dob i zsch, 2008).
Los p oduc os de la amidohid olasa pod ían se -glu amilados, e i ando que la u a
de deg adación culminase en la acumulación de glu amina, un econocido es imulan e del
c ecimien o ege a i o en Neu ospo a c assa (Ca denas y Hansbe g, 1984). En es e
pun o, cabe eco da que el eno ipo esul an e de la ausencia de FluG es, p ecisamen e
un eno ipo de c ecimien o ege a i o desbocado en ase aé ea.
El sen ido global de es a con igu ación enzimá ica se á abo dado en la siguien e
sección.
La unción de FluG en el con ex o del micelio
Es udios sob e la génesis y desa ollo del micelio, y pa icula men e en A. nidulans,
mues an que, as la ge minación, iene luga una ase de c ecimien o ege a i o, a la
que sucede la eme gencia de los p ime os conidió o os (Cohen, 1973). En ese pe iodo
denominado pe iodo de compe encia (16 ho as), se ha es ablecido que la colonia adquie e
la compe encia pa a inicia el desa ollo asexual (Axel od e al., 1973). Toda ía no se ha
es ablecido con cla idad qué pa áme os son los que de inen la consecución de esa
compe encia (Noble y And ianopoulos, 2013), pe o puede que se a e de una