Instauración del fundamento terapéutico de la inhibición de la vía de señalización Lefty-Smad en el Glioblastoma

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Alejand o Elúa Pinín
Tesis Doc o al
San Sebas ián, País Vasco
2022
INSTAURACIÓN DEL FUNDAMENTO
TERAPÉUTICO DE LA INHIBICIÓN DE
LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN
LEFTY-SMAD EN EL GLIOBLASTOMA
(cc) 2022 Alejand o Elúa Pinín (cc by 4.0)
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1 AGRADECIMIENTOS
En p ime luga , quie o ealiza una e lexión y mos a un e e no ag adecimien o a los
e dade os esponsables y mo o es de es e abajo, a oso os los En e mos. P obablemen e
nunca leáis es a Tesis, segu amen e nunca conozcáis los esul ados de es e es udio, pe o quie o
deja cons ancia de una i e u able ce eza: los que ealmen e nos mo i áis a los Clínicos y
Básicos cada día sois oso os. A eces se nos ol ida que odo lo que hacemos en el hospi al y
en el labo a o io es po y pa a oso os. Sien o que, con el paso del iempo, esa p ime a
mo i ación genuina que odos los p o esionales del ámbi o de la salud una ez sen imos, a la
que llamamos VOCACIÓN, que hace an bello y ag adecido nues o abajo, poco a poco se a
desgas ando, diluyendo, y se a ans o mando en acción u ina ia. Pasamos de abaja con
gus o pa a ayuda , a abaja lo jus o po que es lo que oca. Y po si algún día caigo en es e
engaño de la men e, aquí dejo esc i as es as líneas pa a in en a ol e a ás. En de ini i a,
g acias a odos los pacien es en e mos de Glioblas oma, en especial a IZM, po eco da nos cada
día a los Clínicos y Básicos que el abajo du o en p oyec os como el que a con inuación se
desc ibe me ecen cada go a de sudo y cada segundo que a es e dedicamos.
Es imp escindible que el lec o de es e documen o comp enda que la consecución de es e
abajo es u o del es ue zo di ec o e indi ec o de MUCHAS pe sonas a las cuales quie o da les
las g acias.
En p ime luga , a mi amilia. A mi mad e, a mi pad e y a mi he mano. A mis ías y íos, a mis
p imas y p imos, a mis abuelos. Cada uno de oso os me habéis enseñado algo que ha
de e minado mi pe sonalidad y ca ác e , y que ha o jado la pe sona que ha conseguido esc ibi
es e documen o.
A mis amigos, que habéis me habéis apoyado y sopo ado mi ausencia du an e es os úl imos
meses de esc i u a.
A odo el pe sonal de plan a de la 2ª 3ª. Al Se icio de Neu oci ugía del Hospi al Donos ia, desde
el Je e de Se icio, el D Ú culo, has a los esiden es (Pelayo, Pa i), pasando po odos los
Adjun os (Alicia, Ma iano, Nico, Mikel, Pa i, José, Le i); Al pe sonal de qui ó ano (limpieza,
en e me ía, celado es) Al equipo de anes esia. Al equipo de CMI. A odo el equipo del comi é de
umo es. Sin oso os y sin el apoyo que me habéis p es ado, cada uno a ues a mane a, cada
uno con su pequeña apo ación que hace que al inal odo uncione, es e p oyec o no hubiese
sido posible.
A mis Di ec o es, Ande y Nico que me habéis ido guiando a los la go de es os años en es e g an
T abajo cien í ico.
2
A Ma iano A ázola, mi u o . Desde que llegué a la esidencia me p egun as e si que ía hace la
esis doc o al en el a duo e eno de la in es igación básica. Me dijis e: - ¿Tienes algo que hace
po las a des? No, ¿ e dad? Pues, ala, al labo a o io has a e mina la esis (xd) -. Desde
en onces me has animado y mo i ado en los momen os cla e, y po eso e doy es e p o undo y
since o ag adecimien o.
A Joaquín Ande ma en, compañe o de labo a o io, de qui ó ano y de a en u as.
A Ande Saenz, po la in ini a pacencia que has enido, po u espí i u docen e, u ene gía y u
op imismo. Es a esis es an uya como mía.
A Ve ónica Moncho, po ayuda me en la ec a inal con los úl imos expe imen os.
A odos los in es igado es del Biodonos ia que pa icipas eis de un modo u o o en es e
p oyec o; Jaione, Mikel, Maddalen, Es e anía, Aizpea y muchos o os que se me quedan en el
in e o.
Cuando bebas agua, ecue da la uen e.
- P o e bio chino.
Ag adece a la llama su luz, pe o no ol ides
el pie del candil que pacien e la sos iene.
- Rabind ana h Tago e (1861-1941) Filóso o Indio
3
2 ABREVIATURAS
GBM: Glioblas oma Mul i o me
H.U.D: Hospi al Uni e si a io de Donos ia
LOE: Lesión Ocupan e de Espacio
WHO: Wo ld Heal h O ganiza ion
TC: Tomog a ía Compu e izada
RM: Resonancia Magné ica
TGFB: T ans o ming G ow h Fac o Be a
SNC: Sis ema Ne ioso Cen al
SMAD: Small Mo he s Agains Decapen aplegic
WHO: Wo ld Heal h O ganiza ion
WT: “Wild Type”
NOS: “No O he wise Speci ica ed”
IDH: Isoci a o deshid ogenasa
MGMT: O6 Me il Guanin Me il T ans e asa
EGFR: Recep o del Fac o de C ecimien o Epidé mico
EGF: Fac o de C ecimien o Epidé mico
TGFα: Fac o de c ecimien o ans o man e al a
ADN: Ácido Desoxi ibonucleico
TKI: Inhibido de Recep o Ti osin Quinasa
ARF: “Adenosine diphospha e-Ribosyla ion Fac o “
KDa: Kilodal on
ATRX: Al a - halassemia X-linked in ellec ual disabili y
ALT: “al e na i e leng hening o Telome s”
DAXX: “dea h-domain-associa ed p o ein”
RM: Resonancia Magné ica
FLAIR: “inc eased T2-weigh ed Fluid-A enua ed In e sion Reco e y”
LCR: líquido Ce alo aquídeo
DSC: Dynamic suscep ibili y con as
CBV: olumen de ujo sanguíneo ce eb al ela i o
4
GSC: Glial s em cells
GTR: G oss To al Resec ion
RT: adio e apia
TMZ: Temozolomida
RANO: Response Assessmen in Neu o-
Oncology
RC: Respues a Comple a
RP: Respues a Pa cial
BHE: Ba e a Hema oence álica
NICE: “Na ional Ins i u e o Heal h and
Ca e Excellence”
TAC: Tomog a ía Axial Compu e izada.
IHQ: Inmunohis oquímica
RT: Re o ansc ipción
TTF: “Tumo -T ea ing Fields”
EMT: T ansición Epi elial-Mesenquimal
PDGF: Fac o de c ecimien o epidé mico
de i ado de plaque as
FGFR2: Fac o de c ecimien o ib oblás ico
II
mTOR: “mammalian a ge o Rapamycin”
AMPK: “AMP-ac i a ed p o ein kinase”
GDFs: Fac o es de Di e enciación Y
C ecimien o.
BMP: “bone mo phogenic p o eins”
SARA: “Smad ancho o ecep o
ac i a ion”
SBE: “SMAD Binding Elemen ”
FDA: “Food and D ug Adminis a ion
NCCN: “Na ional Comp ehensi e Cance
Ne wo k”
VEGF-A: “Fac o de C ecimien o del
Endo elio Vascula A”
TTF: “Tumo -T ea ing Fields”
TMB: ”Tumo Mu a ional Bu den”
TAMs: “Tumo Associa ed Mac ophages”
SMAD: “small mo he s agains
decapen aplegic”
GSC: Glioma S em Cell
NSC: Neu al S em Cells
DAPK: dea h associa ed p o ein kinasa
DAXX: Dea h Associa ed p o ein six
TNF “Tumo Nec osis Fac o ”
NF-kappaB: “Nuclea Fac o kappa-ligh -
chain-enhance o ac i a ed B cells”
PDGFRA “pla ele -de i ed g ow h ac o
ecep o A”

5
3 RESUMEN
El Glioblas oma es el umo ce eb al p ima io más ecuen e y ag esi o del Sis ema Ne ioso
Cen al. P esen a un p onós ico muy pob e, con una mediana de supe i encia meno a los 15
meses, y los cos es en la sociedad ondan los 200.000 eu os po pacien e. Desde la publicación
del P o ocolo STUPP en el año 2005 ningún Fá maco ha mejo ado la escasa mediana de
supe i encia que log a el á maco alquilan e Temozolomida (meno del 5% a los 5 años) La
ausencia de nue as moléculas/es a egias e ec i as en el a amien o del GBM desde en onces
en la p ác ica clínica jus i ica la in es igación y búsqueda de nue os compues os.
La supe amilia de la ía TGFb (T ans o ming G ow h Fac o Be a), iene un papel c ucial en la
egulación de la ansc ipción de genes in oluc ados en la supe i encia, p oli e ación
di e enciación y apop osis celula en di e en es ejidos. Exis en una se ie de p o eínas llamadas
SMAD (Small Mo he s Agains Decapen aplegic) que ac úan como ansduc o es de los ligandos
de la supe amilia de la ía TGFb (T ans o ming G ow h Fac o Be a), egulando su ac i idad.
La supe amilia TGFb y las p o eínas SMAD es án des egulados en cánce . Di e en es es udios
eo izan que múl iples ejidos umo ales sec e an unas moléculas an i-SMAD esponsables en
pa e del aumen o de la p oli e ación celula . Una de es as moléculas inhibido as de SMAD es
conocida como LEFTY, la cual es á sob eexp esada en cánce y pa ece egula la población de
células mad e en di e en es umo es.
En es a Tesis hemos ca ac e izado la exp esión de LEFTY, que pa ece es a sob eexp esada en la
población de células mad e de glioma y en biopsias clínicas de Glioblas oma. De hecho, sus al os
ni eles co elacionan con peo supe i encia de los pacien es pos ulándose como una no edosa
y a ac i a diana e apéu ica. Median e un an icue po monoclonal an i-LEFTY hemos inhibido
es a p o eína y obse ado que se p oduce una disminución de la p oli e ación y de la capacidad
de au o- eno ación celula y un aumen o de la apop osis y senescencia an o en cul i os
celula es de líneas umo ales con encionales como en células mad e de glioma de i adas de
pacien es. Es os esul ados in i o ue on ampliados a modelos animales in i o donde hemos
iden i icado que el an icue po monoclonal an i-LEFTY p o oca una disminución en la capacidad
umo ogénica de las células de Glioblas oma y que eje ce una acción siné gica con el agen e
quimio e ápico Temozolomida.
En esumen, hemos demos ado que la ía LEFTY-SMAD es á al e ada en el Glioblas oma y que
su inhibición educe de mane a d ás ica la ac i idad maligna de las células de glioma. Es os
esul ados pos ulan la inhibición de LEFTY como una es a egia e apéu ica p ome edo a en el
a amien o de es a ag esi a neoplasia del Sis ema Ne ioso Cen al.
6
4 ÍNDICE
1 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................... 1
2 ABREVIATURAS ...................................................................................................................... 3
3 RESUMEN .............................................................................................................................. 5
4 ÍNDICE .................................................................................................................................... 6
5 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 8
5.1 Gene alidades del glioblas oma .................................................................................... 8
5.1.1 De inición y Epidemiología: ................................................................................... 8
5.1.2 Clasi icación: .......................................................................................................... 9
5.2 Diagnós ico: ................................................................................................................. 15
5.2.1 Mani es aciones clínicas: .................................................................................... 15
5.2.2 Ca ac e ís icas adiológicas: ................................................................................ 16
5.3 T a amien o ................................................................................................................. 18
5.3.1 Ci ugía: ................................................................................................................ 18
5.3.2 Quimio e apia y Radio e apia: ............................................................................ 20
5.3.3 Valo ación de la Respues a al a amien o: ........................................................ 21
5.3.4 Manejo e apéu ico del Glioblas oma Recu en e ............................................. 25
5.3.5 Nue as Te apias en el Glioblas oma ................................................................... 26
5.4 Biología molecula del glioblas oma ........................................................................... 30
5.4.1 Hallma ks del Glioblas oma ................................................................................ 30
5.4.2 Vía de señalización TGFB ..................................................................................... 44
5.4.3 LEFTY: .................................................................................................................. 48
5.4.4 Células Mad e de Glioma .................................................................................... 53
6 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 55
7 MATERIAL Y MÉTODOS: ...................................................................................................... 56
7.1 Cul i o celula .............................................................................................................. 56
7.1.1 Líneas celula es: .................................................................................................. 56
7.2 Ensayos uncionales .................................................................................................... 57
7.2.1 Ensayo de o mación de es e as y capacidad de au o eno ación de células
mad e de Glioma (GNS)....................................................................................................... 57
7.2.2 Ensayo de di e enciación de Células Mad e de Glioma (GNS) ............................ 58
7.2.3 Ensayo de iabilidad celula MTT ........................................................................ 58
7
7.2.4 Senescencia ......................................................................................................... 59
7.3 Ensayo de Ca cinogénesis IN VIVO .............................................................................. 59
7.3.1 Gene ación de umo es subcu áneos ................................................................. 59
7.4 Análisis de la exp esión de p o eínas .......................................................................... 60
7.4.1 Ex acción y cuan i icación de p o eína. ............................................................. 60
7.4.2 Wes e n Blo ....................................................................................................... 60
7.4.3 Inmuno luo escencia ........................................................................................... 62
7.4.4 EdU (5-e inilo-2´-deoxiu idina): .......................................................................... 62
7.4.5 Inmunohis oquímica ........................................................................................... 63
7.4.6 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.................................................................... 64
7.4.7 Análisis Es adís ico .............................................................................................. 65
8 RESULTADOS ....................................................................................................................... 66
8.1 La exp esión de las di e en es p o eínas de la ía señalización LEFTY-SMAD es
he e ogénea en biopsias de glioblas oma. ............................................................................. 66
8.2 La sob exp esión de LEFTY se asocia a una meno supe i encia en biopsias de
Glioblas oma. .......................................................................................................................... 67
8.3 Los ni eles de exp esión de LEFTY es án aumen ados en líneas celula es de
Glioblas oma y en líneas de células mad e de glioma ............................................................ 70
8.4 LA EXPRESIÓN DE LEFTY Y SMAD CAMBIA EN FUNCIÓN DEL ESTADO DE
DIFERENCIACIÓN CELULAR. ..................................................................................................... 71
8.5 La inhibición a macológica de LEFTY disminuye la iabilidad de las células mad e de
Glioma y de las células de Glioblas oma ................................................................................. 73
8.6 La inhibición Fa macológica de LEFTY educe las ca ac e ís icas umo ogénicas de las
células mad e de Glioma y de las células de Glioblas oma .................................................... 75
8.7 La modulación de la ía SMAD a ec a a la capacidad de au o eno ación umo al. .. 76
8.8 La inhibición Fa macológica de LEFTY educe el c ecimien o umo al en modelos de
expe imen ación animal ......................................................................................................... 77
8.9 El an icue po an i-LEFTY ac úa de o ma siné gica con la Temozolomida educiendo
el olumen umo al en modelos de expe imen ación animal ................................................ 82
9 DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 84
10 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 89
11 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 90
8
5 INTRODUCCIÓN
5.1 GENERALIDADES DEL GLIOBLASTOMA
5.1.1 De inición y Epidemiología:
Los Gliomas son umo es que de i an de las células de la Glía, las cuales ue on desc i as en
1850 po el pa ólogo Alemán Rudol Vi chow (Ch á al & Ve kh a sky, 2018) Glía en G iego
signi ica “cola“ , es deci , la neu oglia es el conjun o de células que ”unen“ a las Neu onas.
Cumplen di e sas unciones en e las que des acan sopo e es uc u al y me abólico. En es e
g upo se encuen an los as oci os , oligodend oci os , mic oglía , ependimoci os y células de
Schwann (Jessen, 2004) De cada uno de es as es i pes celula es se o igina un ipo de umo .
(As oci oma, oligodend oglioma, ependimoma, e c)
El Glioblas oma es un umo de i ado de la población as oci a ia de las células gliales. Es el
umo p ima io del SNC más ecuen e en la población adul a. (Adamson e al., 2009)
Rep esen a más del 60 % de odos los umo es ce eb ales en la población adul a(Rock e al.,
2012) y en e el 3-15% en la población pediá ica (K. K. Das & Kuma , 2017).Su incidencia es de
ap oximadamen e 3 po 100.000 habi an es en las di e en es se ies a ni el global en la población
adul a (B. Chen e al., 2021; Hani e al., 2017; S upp e al., 2010) y 0.85 po cada 100.000
habi an es en la población pediá ica(K. K. Das & Kuma , 2017). P esen a una meno incidencia
en países en ías de desa ollo aunque se c ee que es debido a que es á siendo
in adiagnós icado espec o a los países más desa ollados (Ohgaki, 2009) Es más ecuen e en
homb es que en muje es y su incidencia es mayo en la población caucásica. Se han epo ado
casos en odos los g upos de edad, sin emba go su pico de incidencia se si úa en e los 55 y los
60 años de edad (B. Chen e al., 2021; K. K. Das & Kuma , 2017; Ohgaki, 2009) El p onós ico de
es os pacien es es muy pob e siendo la mediana de supe i encia de ap oximadamen e 15
meses as ealiza el a amien o según el p o ocolo STUPP (Rock e al., 2012; S upp e al.,
2005; Thakka e al., 2014). Solamen e un 4,7 % de los pacien es p esen an una supe i encia
mayo a 5 años (Os om e al., 2013) y menos de un 1 % de los pacien es i en más de 10 años
as el diagnós ico (Tykocki & El ayeb, 2018)
15
5.2 DIAGNÓSTICO:
5.2.1 Mani es aciones clínicas:
Los pacien es con umo es ce eb ales pueden p esen a di e en es signos y sín omas
dependiendo de la localización de es e, del amaño, de la elocidad de c ecimien o del umo y
del edema que gene e. El sín oma más ecuen e es la ce alea, gene almen e holoc aneal que
se in ensi ica du an e el descanso noc u no del pacien e. Con ecuencia los pacien es y
amilia es consul an debido a embo amien o men al, deso ien ación, con usión, al e aciones de
memo ia, al e aciones del equilib io y cambios en la pe sonalidad. También se pueden da
dé ici s neu ológicos como al e aciones sensi i as y dé ici s de ue za en ex emidades.
Al e aciones del lenguaje son ecuen es cuando la localización del umo se encuen a ce cana
a las á eas mo o as y sensi i as del lenguaje. O a o ma de p esen ación pueden se las c isis
comiciales pa ciales o complejas. La p esen ación clínica de es os umo es suele se ápida y
gene almen e la e olución de la clínica desde su inicio has a que es diagnos icada no suele
supe a los 6 meses(S a k e al., 2012)
En cuan o a la localización, el 95 % de los umo es se o iginan a ni el sup a en o ial. El lóbulo
más a ec ado es el on al ( 43% ) seguido del empo al (28%) , pa ie al(25%) y occipi al (3%)(Ali
Kahn e al., 2003; La ja aa a e al., 2007) Aunque su p e alencia a ni el in a en o ial es muy
escasa , ambién pueden o igina se en oco ce eb al , ce ebelo y médula espinal. (Hu e al.,
2008; Malik e al., 2017; Timmons e al., 2018)
Figu a 4: Localización del Glioblas oma en el SNC. Más del 95 % de los Glioblas omas se dan a ni el
sup a en o ial y solamen e un 3-4 % se dan a ni el in a en o ial. Figu a c eada con Bio ende .com

16
5.2.2 Ca ac e ís icas adiológicas:
T as la sospecha clínica de lesión ocupan e de espacio en el pa énquima ce eb al se ealiza una
TC (Tomog a ía Compu a izada) pa a con i ma lo. El glioblas oma se compo a como una lesión
si uada a ni el subco ical, he e ogénea , hipodensa , de o ma o oide i egula , con edema
asogénico pe ilesional abundan e que suele causa desplazamien o de es uc u as ecinas y de
línea media. El cen o de dicha lesión se mues a más hipodenso que la pe i e ia y exis e una
cap ación de con as e yodado abiga ada (H. Singh e al., 2002)
Hoy la p ueba diagnós ica más usada y que más in o mación apo a al clínico en los p ime os
pasos del manejo de es e umo ce eb al es la RM (Resonancia Magné ica) Además de en el
diagnós ico, es una pieza cla e en el seguimien o del en e mo as el a amien o (lo e emos
en de alle más adelan e). El Glioblas oma se compo a como una lesión hipoin ensa en las
imágenes po enciadas en T1 e hipe in enso en las imágenes po enciadas en T2. En la secuencia
FLAIR (“inc eased T2-weigh ed Fluid-A enua ed In e sion Reco e y”), el Glioblas oma ambién
se ap ecia hipe in enso compa ado con el con el ejido sano ci cundan e . Dicha secuencia
elimina la señal que p o iene del LCR (líquido Ce alo aquídeo ) y mues a el edema causado po
la mic oin ila ación umo al en el ejido ci cundan e. El olumen FLAIR p e umo al pa ece no
asocia se con la Supe i encia pe o sí lo hace el olumen FLAIR pos adio e apia (Ga e e al.,
2017; G ossman e al., 2017) La dis upción de la BHE ( ba e a hema oence álica )p oducida po
la lesión se hace pa en e al isualiza la cap ación de Gadolinio en la RM. P esen a , al igual que
en el escáne una cap ación a iable que a desde la cap ación en anillo más o menos es é ico
a la cap ación abiga ada y deses uc u ada (Nelson & Cha, 2003) Como sabemos la pe usión
sanguínea de es as lesiones es á aumen ada en es as lesiones y es o lo podemos alo a
median e secuencias DSC ( Dynamic suscep ibili y con as ) en las cuales se alo a el spin eco
que gene a en paso de con as e ( Gadolinio) an es du an e y después en la zona dónde se
encuen a la lesión. Así se puede alo a el CBV ( olumen de ujo sanguíneo ce eb al ela i o)
que es á muy aumen ado en los umo es ce eb ales de al o g ado como el Glioblas oma
(Boxe man e al., 2016). La RM uncional y la secuncias DTI que pe mi en ealiza ac og a ías
y localiza á eas del ce eb o al amen e elocuen es han pe mi ido aumen a el g ado de
esección qui ú gica de dichas lesiones (Abdullah e al., 2013) (Shukla e al., 2017) La MRSI (
Magne ic esonance spec oscopic image) es una écnica que pe mi e de e mina la can idad de
un de e minado me aboli o en una de e minada egión al se some ido un ejido a una onda
elec omagné ica. El Glioblas oma p esen a gene almen e una disminución de N-ace il-
aspa a o (me aboli o que disminuye al habe pé dida o daño neu onal) , una aumen o de la
Colina, la cual aumen a an e la p oli e ación celula . El Lac a o es á aumen ado en egiones
donde p edomina la hipoxia y los Lípidos en egiones de nec osis. (Shimizu e al., 1996) Más
adelan e e emos como es as no edosas écnicas de imagen p esen an un papel undamen al
en el seguimien o de los pacien es con Glioblas oma después del a amien o.
17
Figu a 5: Imágenes de Tomog a ía Compu e izada u gen e de dos pacien e del H.U.D que
acudie on al Se icio de U genicas po Ce alea y ocalidad neu ológica A):TC sin con as e en el
que se pa ecía LOE on al de echa con impo an e edema asogénico y comp esión de as as
on ales de echas. B) y C) : TC sin y con con as e yodado en el que se ap ecia LOE localizada a
ni el de a io en icula con cap ación de con as e en anillo, cen o nec ó ico y edema
pe ilesional.
Figu a 6: Imágenes de Resonancia Magné ica de un pacien e del H.U.D. A) Secuecia T1 con
Gadolinio co es co onal y axial. Se ap ecia LOE on al de echa con cap ación de con as e en
anillo , cen o hipoin enso y edema asogénico pe ilesional. B) Secuencia Flai co e co onal.
Hipe in ensidad de la lesión y abundan e edema asogénico ci cundan e. C) Es udio de
Pe usión sob e una secuencia T1-GAD. Se ap ecian ele adas a ios de pe usión , compa ible
con Glioblas oma
18
5.3 TRATAMIENTO
T as la con i mación de la sospecha clínica median e las p uebas de imagen an e io men e
comen adas se da inicio al a amien o, el cual se asien a sob e es pila es undamen ales;
ci ugía, la cual debe log a la máxima esección umo al posible que sea segu a, adio e apia:
en o al 60 Gy y Quimio e apia: Temozolomida, usada inicialmen e simul ánea con la RT y
pos e io men e de o ma adyu an e (S upp e al., 2005).
5.3.1 Ci ugía:
Hemos de ene en cuen a una se ie de conside aciones p eope a o ias. Debido al g an edema
asogénico que es as lesiones p esen an,en la ac ualidad, se lle a a cabo un a amien o con
Gluco icoides (gene amen e Dexame asona 4 mg cada 8 ho as ) Dicha sus ancia ac úa sob e
los canales de K + al e ando la pe meabilidad de los capila es pe i umo ales y mejo ando el
acla amien o de agua ex acelula de la ba e a hema oence álica (Cencia ini e al., 2019). De
es e modo conseguimos una adecuada elajación del pa énquima ce eb al y po an o una
ci ugía más segu a. Es impo an e sabe que los Glucoco icoides p esen an una ele ada
mo bilidad ya que p esen an e ec os secunda ios como miopa ía, me abolismo ano mal de la
glucosa, complicaciones gas oin es inales, i i abilidad, ansiedad, insomnio y es á elacionado
con un al o iesgo de in ección po neumonía (Kos a as e al., 2014). Además se ha is o que la
Dexame asona induce un aumen o de la p oli e ación y angiogénesis in i o e in i o de la
población de GSC (Glioma S em Cells) (Aldaz e al., 2020; Luedi e al., 2018) po lo que cada ez
se cues iona más su uso en el a amien o del Glioblas oma. En cuan o a los á macos
an iepilép icos son ecomendables siemp e que se aya a ealiza es imulación co ical o
subco ical debido a al o iesgo de c isis comiciales in aope a o ias. T as la ci ugía, se debe
lle a a cabo una pau a descenden e has a su e i ada. Si el pacien e no ha p esen ado c isis no
es á indicado el a amien o p o ilác ico (Glan z e al., 2000).
Los obje i os de la ci ugía en el Glioblas oma son: máxima esección segu a, ob ención de ejido
pa a ealización de diagnós ico ana omopa ológico , mejo a de las condiciones pa a op a a
QMT y RT , e aso del empeo amien o clínico y mejo a de la calidad de ida del pacien e .En
cuan o a los p edic o es de buen p onós ico elacionados con el a amien o del Glioblas oma ,
el g ado de esección es el más impo an e de odos. Cuan o mayo es el g ado de esección
umo al mayo es la supe i encia de es os pacien es, siendo los que alcanzan una mayo
supe i encia los que p esen an GTR (G oss To al Ressec ion) seguidos de RT ( adio e apia) y
TMZ (Temozolomida). La esección umo al debe se mayo al 74 % de la masa pa a que la
esección enga un e ec o signi ica i o en la supe i encia (Y. M. Li e al., 2016; Wolbe s, 2014)
sin que el pacien e p esen e un de e io o de la unción neu ológica. Pa a consegui es e obje i o
con amos con écnicas qui ú gicas y he amien as in aope a o ias que nos ayudan a consegui
una ci ugía más segu a. Una de es as es la esección qui ú gica con mapeo uncional
in aope a o io ya sea con el pacien e do mido o despie o que nos pe mi e alo a dónde se
localizan cie as á eas elocuen es como la egiones del lenguaje, cálculo, lec u a, esc i u a,
mo o as, sensi i as, e c. (Lowens ein & Cas o, 2012). Exis en sus ancias luo escen es que nos
pe mi en isualiza es os umo ales en los má genes qui ú gicos. El 5 ALA (5-aminole ulinic
acid) es un aminoácido p ecu so del g upo hemo que se le da al pacien e que a a se
in e enido 6 ho as an es de la ci ugía a una dosis de 20 mg/Kg. Las células umo ales lo
me abolizan en la mi ocond ia p oduciéndose p o opo i ina IX , cuando es as células son
expues as a una luz azul con una longi ud de onda 400-410 nm , debido a la g an can idad de PP
IX que acumulan desp enden luo escencia oja y pueden dis ingui se del pa énquima ce eb al
19
sano inc emen ando la GTR y po an o la Supe i encia (Ce o e al., 2020; Waqas e al., 2017).
Exis e o a sus ancia luo escen e pe enecien e al g upo de los Xan enos conocida como
Flou esceína Sódica. Su uso en Neu oci ugía se emon a al año 1948. Se aplica po ía
in a enosa en el momen o en el que se incide la piel del pacien e. Es a sus ancia iaja en el
o en e sanguíneo y pasa a la ma iz ex acelula del pa énquima ce eb al en las á eas en dónde
la BHE es á dañada, siguiendo el mismo mecanismo de ac uación que el con as e de la RM, el
Gadolinio. Es a sus ancia abso be luz y emi e una luz de unos 560 nm de longi ud de onda que
puede se is a po el ojo humano empleando unos il os especí icos. De es e modo , e emos
que el á ea umo al se á luo escen e mien as que el ejido sano no lo se á , guiándonos de
es e modo en la esección (Böme s e al., 2020; Della Puppa e al., 2019). O a he amien a
undamen al en el qui ó ano es el Na egado . Dicho ins umen o consis e en un o denado en
el cual in oducimos un es udio de imagen de e minado del pacien e que amos a ope a y un
equipo de seguimien o, óp ico o magné ico, que nos pe mi e mos a le a la compu ado a dónde
es án en el espacio de e minados pun os del es udio de imagen. De es e modo du an e la ci ugía
pod emos sabe en odo momen o en qué egión del pa énquima ce eb al nos encon amos
espec o al es udio de imagen in oducido , pe mi iéndonos ealiza ci ugías más segu as , y con
unos má genes de esección mayo es (Ge a d e al., 2017).
Figu a 7: A: Lesión empo al de echa suges i a de Glioma de al o g ado de pacien e del Hospi al
Uni e si a io de Donos ia B: Colocación qui ú gica del pacien e: Decúbi o supino, cabeza ijada a la mesa
qui ú gica con cabezal de May ield y la e alizada hacia la izquie da. C: Una ez ealizada la c aneo omía y
du o omía se ap ecia co eza ce eb al sana y co eza ce eb al umo al ( lecha azul) D: Misma imagen que
la an e io pe o is a con modo que pe mi e e la luz ama illa de la Fluo esceína as se expues a a luz
azul de 494nm en las zonas dónde la BHE es á o a. E: Qui ó ano de Neu oci ugía del H.U.D F: Resección
qui ú gica mac oscópicamen e comple a. Lecho umo al ( lecha e de)
20
5.3.2 Quimio e apia y Radio e apia:
T as la ci ugía, el pos ope a o io y la comp obación de la co ec a cica ización de las he idas
qui ú gicas se lle a a cabo el a amien o complemen a io , cuyos pila es undamen ales son la
Quimo e apia (con Temozolomida) y la Radio e apia (Radiación X). La Temozolomida es un
agen e alquilan e, que de o ma espon ánea, al en a en con ac o con un PH mayo a 7 se
hid oliza en su o ma ac i a. Es liposoluble y a a iesa la BHE. Su mecanismo an ip oli e a i o
consis e en la adición de un g upo alquilo ( CnH2n+1 ) al ex emo O o N de una base Ni ogenada
del ADN. En conc e o la o ma ac i a de la TMZ añade g upos Me ilo (CH3) al O6 de la Guanina.
De es a o ma se in e umpe la ansc ipción y eplicación del ADN. (S obel e al., 2019; Tsang
e al., 1991) La adio e apia consis e en el empleo de adiaciones ionizan es, gene almen e
Rayos X , pa a daña las células umo ales. Pa a ello se emplea un acele ado médico lineal que
se enca ga de acele a o ones pa a que es os choquen con a un me al pesado y gene a ayos
X que se án con o mados y di igidos de o ma especí ica con a el umo a a a . Dicha adiación
p oduce la ionización de cie as moléculas de la célula, adicales lib e y al e aciones en el ADN y
mues o celula . Es os e ec os son mucho mayo es en las células que es án p oli e ando que en
las que es án quiescen es. (Dunne-Daly, 1999) La máxima dosis de adiación que el ce eb o
puede ole a son 20-25 Gy en una sola dosis o 60 Gy si se da de o ma accionada.(Sma , 2017)
El p o ocolo de a amien o que se u iliza en la ac ualidad después de log a la máxima esección
segu a consis e en da 60 Gy de Radio e apia de o ma accionada en 6 semanas, es deci ,30
días de a amien o en los que cada día se dan 2 Gy de adiación de o ma concomi an e con
TMZ 75mg/m2 al día, dia iamen e, du an e 6 semanas. T as un mes de descanso se inicia una
segunda e apa de a amien o con TMZ en mono e apia 150-200mg/m2 dia iamen e du an e 5
días cada 28 días du an e 6 ciclos. Es e p o ocolo ha mos ado una aumen o de la mediana de
supe i encia (de unos dos meses de media) espec o al a amien o con Radio e apia
exclusi amen e en di e en es es udios.(Feng e al., 2017; Szczepanek e al., 2013; S upp e al.,
2005) T as la inalización de es e p o ocolo de a amien o las guías NICE : “ Na ional Ins i u e
o Heal h and Ca e Excellence” ecomiendan la ealización de RM de con ol cada 3-6 meses
du an e los p ime os dos años, cada 6-12 meses has a los 5 años y anualmen e a pa i de los 5
años de la inalización del a amien o. El 50 % de los pacien es p esen a án p og esión o
ecu encia a los 6.5 meses desde la inalización del p o ocolo STUPP(S upp e al., 2005)
Figu a 8: Esquema del a amien o del P o ocolo S upp: TMZ+RT concomi an e du an e 6 semanas + 6
ciclos de 5 días de TMZ cada 28 días.

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Figu a 9: A: Sala de adio e apia. B: Es udio de plani icación de adio e apia en pacien e con Glioblas oma
on al. Imágenes cedidas po co esía del Se icio de Oncología Radio e ápica del Hospi al Uni e si a io
de Donos ia.
5.3.3 Valo ación de la Respues a al a amien o:
En 1990 Macdonald publicó una se ie de c i e ios que pe mi ían alo a la espues a al
a amien o de los Gliomas de al o g ado de una o ma obje i a. (Macdonald e al., 1990).Los
c i e ios basan en la alo ación de es pila es: mediciones de los diáme os pe pendicula es de
la egión cap an e de con as e en TAC (Tomog a ía Axial Compu e izada) o RM (Resonancia
Magné ica), el inc emen o o disminución de la dosis de Co icoides y los cambios en la
explo ación neu ológica. Es deci , un c i e io adiológico (CT O RM) c i e io clínico (es ado
neu ológico) y c i e io a macológico (dosis de co icoides). Debemos sabe que los es udios de
imagen se compa an con el es udio de imagen jus amen e pos e io a la máxima esección
qui ú gica. En unción de dichas a iables los pacien es se asignaban a 4 g upos de espues a al
a amien o: Respues a comple a, en la cual se ap ecia una desapa ición de la cap ación de
con as e jun o con una es abilidad o mejo ía del es ado neu ológico en ausencia de
co ico e apia; Respues a pa cial, en el cual se ap ecia educción igual o supe io al 50 % del
olumen de ejido cap an e de con as e, y es abilidad del es ado neu ológico y de la dosis de
co ico e apia; P og esión de en e medad o inc emen o en el 25 % del olumen cap an e,
empeo amien o del es ado neu ológico y es abilidad o aumen o de co ico e apia; En e medad
es able o cualquie o a escena io di e en e a los comen ados an e io men e. Los c i e ios de
Mcdonald ue on ampliamen e empleados, pe o p esen aban una se ie de limi aciones que
comen a emos a con inuación:
En ocasiones, as el a amien o con Quimio-Radio e apia en la RM se ap ecian cap aciones de
Gadolinio mayo es a las exis ían en la RM pos ope a o ia que desapa ecen con el paso de los
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meses y que no iene que e con p og esión umo al, si no con el daño de la adiación al ejido
ce eb al. Es e escena io se conoce como Pseudop og esión y no es enida en cuen a en los
c i e ios de Macdonald.
El Be acizumab, an icue po monoclonal an i VEGF-A, p oduce una disminución de la
pe meabilidad capila . Es o hace que la cap ación de con as e se man enga es able o disminuya
de una o ma muy e icaz. Sin emba go, has a en un 40 % de los pacien es es a es abilidad o
disminución en la cap ación de con as e es á acompañada de un inc emen o del olumen
umo al is o en secuencias T2/FLAIR. (Delgado-López e al., 2018). Es e escena io se conoce
como Pseudo espues a y ampoco es á conside ado en los c i e ios de Mcdonald.
Pa a da espues a a las limi aciones de los c i e ios an e io men e mencionados se es ableció
en el año 2010 un g upo de abajo mul idisciplina en el que es aban incluidos Radiólogos,
Oncólogos, neu ólogos , Neu oci ujanos y Neu opsicólogos conocido como g upo RANO
(Response Assessmen in Neu o-Oncology) (Wen e al., 2010). Los cambios más impo an es
in oducidos ue on:
• La de inición de lo que e a medible adiológicamen e y lo que no: se de ine como
en e medad medible cuando se pueden delimi a po RM los diáme os máximos
pe pendicula es en e sí de al menos una lesión que mida 10mm, isible en dos o más
co es axiales de 5mm.
• La alo ación de la secuencia T2/FLAIR además del T1-Gadolinio.
• La in oducción de los concep os Pseudo espues a y Pseudop og esión.
Se es ablecie on 4 g upos de espues a que pasamos a desc ibi a con inuación:
Respues a Comple a (RP): Se ienen que da odas las condiciones que siguen a con inuación
1. Desapa ición comple a de odas las lesiones con cap ación de con as e, medibles y no
medibles, du an e al menos 4 semanas
2. No apa ición de nue as lesiones.
3. Es abilidad o mejo ía de las lesiones sin cap ación de con as e(T2/FLAIR)
4. El pacien e debe es a sin co ico e apia y p esen a mejo ía o es abilidad neu ológica.
Respues a Pa cial (RP): Se ienen que da odas las condiciones que siguen a con inuación
1. Reducción del 50 % o más de la suma de los p oduc os de los diáme os mayo es
ans e sales de odas las lesiones cap an es du an e al menos 4 semanas.
2. No p og esión de lesiones no medibles
3. No apa ición de nue as lesiones
4. Es abilidad o mejo ía de lesiones sin cap ación de con as e (T2/FLAIR) mien as el
pacien e iene una dosis de co icoides igual o in e io a las que p esen aba cuando se
ealizó la RM basal.
5. El pacien e debe p esen a es abilidad o mejo ía clínica.
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En e medad Es able:
1. Es abilidad de las lesiones no cap an es (T2/FLAIR) mien as el pacien e se encuen a
con dosis de glucoco icoides iguales o meno es a las que p esen aba cuando se ealizó
la RM basal.
P og esión de En e medad: Se iene que da CUALQUIERA de las siguien es:
1. Inc emen o del amaño de las lesiones cap an es del 25 % en compa ación con la meno
lesión cap an e de la RM basal o con la mejo espues a ob enida.
2. Inc emen o en amaño de las lesiones no cap an es (T2/FLAIR) mien as el pacien e
p esen a dosis es ables o inc emen adas de glucoco icoides compa ado con la RM
basal
3. Cualquie nue a lesión
4. De e io o clínico que solamen e se pueda explica po la p og esión umo al.
5. Necesidad de inc emen a dosis de glucoco icoides.
Figu a 10: Ejemplo de Pseudo espues a: Imagen de RM de pacien e con Glioblas oma on al de echo del
H.U.D an es (A) y después (B) de a amien o con Be acizumab. Secuencias T1-Gad y Flai . En la imagen B
se obse a una disminución en la cap ación de gadolinio y un aumen o en el olumen de ejido
hipe in enso en el Flai en compa ación con la imagen A. Típica imagen de pseudo espues a as manejo
con Be acizumab.
24
Figu a 11: Ejemplo de P og esión Radiológica: Imagen de RM de pacien e con Glioblas oma pa ie al
izquie do del H.U.D. Secuencias T1-Gad y Flai . En la imagen B se obse a aumen o de la cap ación de
gadolinio y un aumen o en el olumen de ejido hipe in enso en el Flai en compa ación con la imagen A.
31
• Adquisición de al e aciones en los ecep o es de la supe icie celula : Es e mecanismo
implica que los ecep o es de la supe icie celula , no malmen e Ti osina Kinasa, que
ansducen las señales de c ecimien o hacia el ci cui o ci oplasmá ico, es án sob eexp esados
Es a sob exp esión consigue que la célula puede sob ep oli e a incluso con un ni el ambien al
no mal de FG. Los ecep o es ambién pueden su i al e aciones es uc u ales que conducen
a la señalización de c ecimien o independien e del ligando. Como ejemplo de ecep o es de
supe icie celula al e ados enemos al
• EFGR (Epide mal G ow h Fac o Recep o ). Es e es un ecep o ansmemb ana del
ipo i osin quinasa pe enecien e a la amilia de ecep o es E bB ( EGFR , HER2/neu
, He 3 y He 4 ) cuyo gen se encuen a localizado en el c omosoma 7p12 (H. Zhang
e al., 2007). Es e ecep o puede se ac i ado po a ios ligandos en e los que se
encuen an EGF y TGFα. T as dicha ac i ación se os o ilan los esiduos de Ti osina
p oduciéndose una ac i ación de la ía MAPK, lo que , as la ac i ación en cadena de
di e en es p o eínas in acelula es, conlle a a la ac i ación del complejo mTOR y la
inac i ación de P27 lo que p oduce el aumen o de la p oli e ación , supe i encia y
sín esis de ADN celula (Na i a e al., 2002; Tanaka e al., 2011). Exis en di e en es
ipos de al e aciones del EGFR: La sob eexp esión de es e ecep o se da en el 22- 89
% de los as oci omas de g ado IV, y consis e en un aumen o de la asc ipción del gen
sin que exis a al e aciones en el ADN. Las ampli icaciones se obse an en el 34-64% de
los as oci omas de g ado IV, siendo la polisomía del c omosoma 7 la más ecuen e
al e ación del núme o de copias de EGFR en Gliomas. Dichas ampli icaciones ocu en
en 57,4% de los GBM p ima ios , mien as que solamen e se dan en el 8 % de los
secunda ios (C. W. B ennan, Ve haak, McKenna, Campos, TCGA Resea ch Ne wo k,
e al., 2013; Mai e & Ligon, 2014) Las delecciones de de e minados dominios de
ex acelula es del EGFR dan luga a cinco a ian es de las cuales dos son Oncogénicas
: EGFR II (delección de exones 14 y 15) y EGFR III (delección de exones 15-15) Siendo
es a úl ima la más ecuen es(An e al., 2018). En di e en es es udios se ha alo ado
la exp esión de EGFR como ma cado p onós ico de la en e medad o de espues a a
a amien o en casos de adminis ación de EGFR ITKs (E lo inib, Ge i inib) o
an icue pos monoclonales con a EGFR (Ce uximab, Nimo uzumab) sin emba go
mues an esul ados con adic o ios y po lo an o el es a us de EGFR como ma cado
clínico es con o e ido (Saadeh e al., 2018).

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Figu a 12: La ac i ación del EGFR desencadena señales que p omue en p oli e ación y supe i encia
celula .
• Adquisición de al e aciones en los componen es del ci cui o ci oplasmá ico de las p incipales
ías de señalización del c ecimien o celula : T as la ac i ación de un ecep o celula se p oduce
una ac i ación de moléculas ci oplamá icas que son las enca gadas de la ansducción de la
señal. En ocasiones las células umo ales p esen an al e aciones a es e ni el lo que gene a que
se puedan ac i a señales p oli e a i as sin la es imulación con inua de los ecep o es. La
p incipal cascada mi ogénica es á cons i uida po SOS-Ras-Ra -MAPK en e o os. Una cua a
pa e de odos los umo es humanos p esen an al e aciones en las p o eínas RAS. El 2 % de los
Glioblas omas p esen an mu aciones en las di e en es p o eínas RAS. (C. W. B ennan, Ve haak,
McKenna, Campos, McLendon, e al., 2013; Holmen & Williams, 2005; The Cance Genome
A las Resea ch Ne wo k, 2008).
5.4.1.2 E asión de los sup eso es de C ecimien o:
El ciclo celula en un ejido no mal cons a de cua o ases:
Fase G1en la cual la célula c ece de amaño y duplica o gánulos pe o no cambia el con enido
gené ica. Fase S en la cual la célula duplica el ma e ial gené ico. Fase G2 la célula aumen a su
amaño y se p epa a pa a la ase M (mi osis y ci ocinesis). Después de la ase M, la célula puede
man ene la ase inicial G1 o pasa al es ado de eposo G0, saliendo del ciclo celula Fig 13
33
Las células no males eciben señales an ip oli e a i as pa a man ene la inac i idad celula y la
homeos asis isula . Todas es as señales son que impiden que la célula pase de la ase G1 a la
ase S son p ocesadas p incipalmen e po la p o eína del e inoblas oma (pRB) que o ma pa e
de la ía p16INK4a ⁄CDK4 ⁄ RB1.Es a ía unciona de la siguien e mane a: Cuando la pRB es á
hipo os o ilada , bloquea a los ac o es de ansc ipción E2F esponsables del paso de la célula
de la ase G1 a la ase S. p16INK4a se enca ga del bloqueo a las CDK que son las que os o ilan
a p RB, impidiendo su unción como sup eso de umo es (Fåh aeus e al., 1996). Las mu aciones
en es a ía se encuen an en el 50 % de los Glioblas omas p ima ies y en el 40 % de los
secunda ios (Bie na e al., 1997) En el es udio del TCGA (The Cance Genoma A las) el 78 % de
las mues as de Glioblas oma p esen aban mu aciones en la ía de señalización de p RB (The
Cance Genome A las Resea ch Ne wo k, 2008).
Figu a 13: Fases del Ciclo Celula . C eado con BioRende .com
5.4.1.3 Ac i ación de in asión y me ás asis:
Las me ás asis a dis ancia en el Glioblas oma son ex emadamen e a as , se dan en menos del
0,5 % de los pacien es y se c ee que es debido a una suma de ac o es : la ápida p og esión
umo al sumado al aislamien o del SNC del es o del o ganismo g acias a la BHE (Rossi e al.,
2020) Sin emba go la in asión de zonas ce eb ales adyacen es al umo es ecuen e y se
p oduce en poco iempo. Las células de Glioblas oma p esen an una exp esión disminuida de
Conexina 43, una de las p o eínas undamen ales en el co ec o uncionamien o de las uniones
celula es GAP o en hendidu a. Es a al e ación de las uniones en e células iene un papel
impo an e en la capacidad in asi a de es e umo (A ab e al., 2015) Un mecanismo
undamen al en el p oceso de in asión umo al del Glioblas oma es la T ansición Epi elial-
Mesenquimal (EMT) de las células umo ales. A con inuación, da emos unas pinceladas sob e
es e concep o. La EMT es un p oceso biológico median e el cual células pola izadas epi eliales,
adhe idas a la memb ana basal, se desp enden de dicha memb ana basal y adquie en
ca ac e ís icas de células mesenquimales. Como hemos dicho, es un p oceso biológico que
ocu e de o ma na u al en el o ganismo du an e la emb iogénesis , en la cual las células
epi eliales adquie en la mo ilidad necesa ia pa a la gas ulación y la o mación de la c es a
34
neu al (Knech & B onne -F ase , 2002) y du an e el p oceso de cica ización de las he idas. La
EMT se p oduce ambién en células de di e en es umo es y les pe mi e adqui i ca ac e ís icas
más a o ables pa a la in asión y me ás asis. Es e p oceso pa ece se e e sible y es a muy
in luenciado po el mic oambien e umo al (Dumon e al., 2008) La hipoxia isula y el p oceso
in lama o io del en o no umo al ac i an una se ie de cambios epigené icos que desencadenan
la EMT (Cha les e al., 2011) En conc e o pa ece que la la hipoxia isula y la llegada de células
in lama o ias desencadenan la libe ación de TGFb , ac o de c ecimien o epidé mico de i ado
de plaque as ( PDGF) y Fac o de c ecimien o ib oblás ico II (FGFR2) que desencadena la
ac i ación de una se ie de ac o es de ansc ipción como son Twis , Snail , Slug , Zeb e c.
eque idos pa a el inicio de la EMT (Nagaishi e al., 2012). T as es e p oceso las células
umo ales pie den la E-cade ina (glucop o eína que pa icipa en la o mación de las uniones
in e celula es) y se desanclan de la ma iz , adqui iendo g an capacidad de mo ilidad, de
in asión y p esen ando mayo Resis encia a los agen es geno óxicos y a la apop osis (Dong e &
Weinbe g, 2019; Iwada e, 2016; Kallu i & Weinbe g, 2009).
5.4.1.4 Inmo alidad Replica i a
Las células humanas p esen an una capacidad ini a de di isión. Si dejamos en una placa de
cul i o células di idiéndose e emos qué pasado cie o iempo p esen a án un s op de ese
p oceso eplica i o. Ese p ime pun o de con ol es el que conocemos como senescencia
eplica i a eje cido sob e odo a a és de las ías de p 53 y de p16/ Ink4a (Collado e al., 2007).
Si al e amos las ías an e io es de o ma que la célula pueda segui di idiéndose oda ía más
llega á un pun o en el que se p oduci á una mue e celula masi a en nues a placa de cul i o.
En ocasiones, una célula de ese cul i o (1 de 10 7 ) escapa a esa mue e celula masi a y con inua
di idiéndose de o ma inin e umpida. Decimos que esa célula se ha inmo alizado (I an
Maqsood e al., 2013) Lo que hace que las células humanas p esen en una capacidad ini a de
di isión son los Tolóme os.Es os son es uc u as de ecub imien o si uadas al inal de los
c omosomas ci cula es de los o ganismos euca io as. Consis en en secuencias de 6 nucleó idos
(TTAGGG y su complemen a io) que se epi en en ándem unas 2000 eces. Su unción es la de
da es abilidad a los c omosomas , e i a que es os se usionen , p o egiendo así los genes (Hug
& Lingne , 2006). La eplicación del ADN p oduce un aco amien o de los elóme os debido a la
imposibilidad de la ADN polime asa 3 de añadi pa es de bases al ex emo 5´. Cuando el
elóme o es demasiado co o se p oducen e o es en la eplicación que lle an a la célula a la
senescencia eplica i a. Uno de los mecanismos de escape de la senescencia eplica i a de las
céulas umo ales consis e en la ampliación de es as es uc u as. Es o ocu e debido a
mu aciones en
• TERT, ATRX, DAXX: La Telome asa es una ibonucleop o eína ansc ip asa in e sa. Se
enca ga de amplia los elóme os pa a e i a su deg adación y que así la célula pueda
segui di idiéndose al añadi desoxi ibonucleó idos a los ex emos de los elóme os.
P esen a un componen e ibonucleo ídico (TER) y un componen e p o eico (TERT) que
35
es el que iene la ac i idad T ansc ip asa In e sa. Es en el p omo o de es a subunidad
(TERTp) dónde se hallan las mu aciones que o iginan una elome sa hipe ac i ada que
pe mi e que las células umo ales escapen a la Senescencia eplica i a (O’Sulli an &
Ka lsede , 2010) Exis en dos ipos mu aciones en es e gen ( C228T y C250T), son
mu uamen e excluyen es y se encuen an has a en el 80 % de odos los gliomas y en
el 50 % de los Glioblas omas(Eckel-Passow e al., 2015; Olympios e al., 2021) En
cuan o a TERTp como ac o p onós ico independien e los es udios son con adic o ios
y hay e idencia an o a a o como en con a. En la ac ualidad las e apias di igidas
con a TERTp es án siendo in es igadas y aún no hay ningún á maco
come cializado(Hewe e al., 2017; Pekmezci e al., 2017). Además del ala gamien o
de los elóme os dependien es de la Telome asa exis e una ía al e na i a median e
la cual la célula umo al consigue ala ga los elóme os a a és de un mecanismo
independien e de la elome asa. Dicho mecanismo se denomina ALT(“ al e na i e
leng hening o Telome s”) y es á p esen e en el 75 % de los Glioblas omas secunda ios
que p esen an exp esión no mal de Telome asa y TERT WT(Fan e al., 2019) La ATRX ,
ambién conocida como Helicasa ATRX dependien e de ATP o Helicasa II ligada al
c omosoma X es una p o eína emodelado a de los complejos de c oma ina que jun o
a DAXX (“dea h-domain-associa ed p o ein”) añade la his ona H3.3 a la c oma ina
nuclea impidiendo el p oceso ALT.(De La Fuen e e al., 2011; Haase e al., 2018).
Figu a 14: Debido a la imposibilidad de la ADN Polime asa 3 de añadi pa es de bases en el segmen o 5´,
se p oduce un aco amien o p og esi o de los ex emos de los elóme os. La elome asa es la enzima que
se enca ga de añadi pa es de bases al ex emo 5´. Figu a C eada con BioRende .com
36
5.4.1.5 Inducción de la angiogénesis:
Todas las células del o ganismo equie en es a si uadas a una dis ancia de menos de 150 mic as
de un capila pa a pode lle a a cabo sus eque imien os homeos á icos (B yan , 1984) Du an e
la emb iogénesis se p oduce el desa ollo de nue as células endo eliales que se ag upan
o mando una es uc u a ascula ( asculogénesis) además del b o e de nue os asos
sanguíneos a pa i de los ya o mados (angiogénesis) Es e p oceso se man iene quiescen e
du an e nues a edad, sal o que se necesi e la o mación de nue os asos como puede se en
p ocesos de adap ación isiológica al depo e o en el caso de au o epa ación isula (Pape i &
He man, 2002). Es e balance se man iene median e la co ec a egulación de ac o es p o y
an iangiogénicos que se unen a ecep o es de las células endo eliales. Du an e la
umo ogénesis, en un es ado emp ano del desa ollo umo al, se p oduce un cambio
angiogénico que al e a el balance a a o de las sus ancias angiogénicas. El VEGF (Fac o de
C ecimien o del Endo elio Vascula ) y el FGF 1 y 2 son las p incipales p o eínas que as uni se a
ecep o es Ti osin-Kinasa de las células endo eliales es imulan la asculogénesis y angiogénesis.
Po la con a TSP-1 es un pép ido que se une al ecep o CD36 de las células endo eliales
impidiendo su p oli e ación y mig ación (Hanahan & Folkman, 1996). La hipoxia del
mic oambien e del Glioblas oma es imula la libe ación de VEGF po las células umo ales, la
asculogénesis y la angiogénesis. Es udios ecien es indican que las Glioma S em cells, además
de sus conocidas capacidades (Ahmed e al., 2013) (g an capacidad de au o eno ación,
capacidad de o mación de umo es as xeno ansplan e, esis encia a quimio e apia y
adio e apia) ienen un papel undamen al en la o mación de nue os asos in a umo ales ya
que su en un cambio eno ípico y de i an en células endo eliales y pe ici os (S. Das & Ma sden,
2013).
5.4.1.6 E asión de la mue e celula :
La capacidad de un umo pa a expandi se no solo iene de e minada po la capacidad de sus
células pa a p oli e a sino po la capacidad de sus células de e adi la mue e celula
p og amada. La esis encia a la apop osis es una ca ac e ís ica que se da en odos los ipos
umo ales (Hanahan & Weinbe g, 2000) La apop osis consis e en la inac i ación de una célula
o g upo de células de una o ma con olada de o ma que as la ac i ación de es e p oceso las
memb anas celula es se ompen, el ci oplasma y los esquele os nuclea es se descomponen, el
ci osol se ex uye, los c omosomas se deg adan y el núcleo se agmen a, odo en un lapso de
30 a 120 min.(Wong, 2011) La maquina ia apop ó ica es á cons i uida po una se ie de
senso es que moni o izan las señales in a y ex acelula es y una se ie de e ec o es que
desencadenan la espues a. En cuan o a los senso es que eciben señales de ex acelula es
enemos a ligandos que emi en señales de supe i encia como IGF1 , IGF2 e IL3 y sus
co espondien es ecep o es ansmemb ana, y ligandos que emi en señales de mue e
celula p og amado como son TNF al a y FAS. En el in e io celula enemos senso es que
moni o izan el es ado de la célula, el más conocido es
• P53, el gua dián del genoma: Es e senso es á localizado en el c omosoma 17p13.1. y
codi ica la p o eína p53 la cual es á compues a po 293 aminoácidos y iene un peso
molecula de 53KDa. Dicha p o eína unciona como ac o de ansc ipción y es á
o mada po di e en es dominios. El dominio de mayo amaño (98 esiduos) es el que
se une al ADN y el que acumula el mayo núme o de mu aciones de es e gen en el GBM.
Los o os dominios se comunican con ías que egulan su ac i idad ansc ipcional.

37
(Joe ge & Fe sh , 2008). La unción de P 53 consis e en man ene la in eg idad del
genoma espondiendo a es ímulos noci os (daño del ADN celula , geno oxiciadad,
ac i ación de señales de c ecimien o abe an es, ac i ación de oncogenes)
p omo iendo de ención del ciclo celula , senescencia y apop osis. Además, p53
p esen a un papel impo an e en la egulación del me abolismo celula , au o agia ,
in asión , me ás asis , mic oambien e e inmunidad (Kas enhube & Lowe, 2017). An es
de pasa a desc ibi las mu aciones que más ecuen emen e se dan en la ía P53
debemos explica b e emen e el uncionamien o de la ía p53-ARF-MDM2/4: Cuando
un es ímulo es esan e se p oduce se ac i an una se ie de p o eínas ( MYC, E2F1, E1A )
que ac i an la p o eína ARF (miemb o de la supe amilia RAS) la cual p oduce
deg adación de MDMD2 y MDM4, p o eínas que egulan nega i amen e a P53 po lo
que se p oduce un aumen o de la concen ación de p53 (She , 1998) Dicha ía es á
des egulada en el 84 % de los GBM (Cance Genome A las Resea ch Ne wo k e al.,
2013). La mu ación más ecuen e es la delección homozigo a del locus de ARF , la cual
ocu e en el 60% de los GBM. Dicha delección impide la deg adación de MDM2 y M2M4
po lo que es ás man end án concen aciones ano malmen e bajas de p53. Las
mu aciones que más ecuen emen e a ec an al gen que codi ica p53 son las mu aciones
pun uales sin sen ido en el dominio de unión al ADN. La p e alencia de las mu aciones
en TP53 a ían en e GBM p ima io y secunda io ( 30%-65%) (Xiong e al., 2020) y los
di e en es sub ipos de GBM (P oneu al 54%, mesenquimal 32% , neu al 21% y clásico
0%) O o de los mecanismos po los cuales se puede de e io a la ac i idad de p53 es
po la ampli icación de las egiones que codi ican MDM2 Y MDM4, es o se da en el 7-14
% de los GBM(C espo e al., 2015; Ve haak e al., 2010; Y. Zhang e al., 2018).
Figu a 15: El es és oncogénico a o ece la ac i ación del sup eso de umo es ARF quien inac i a
a MDM2 gene ando una mayo exp esión de P53. Figu a C eada con BioRende .com
38
Las señales en iadas po es os senso es con e gen en unas p o eínas de la amilia Bcl2 que
pueden se p oapop ó icas como Bax, Bid, Bak y Bim o an iapop ó icas como Bcl2, bclXL y Bcl
W que cuando se ac i an al e an la pe meabilidad mi ocond ial impidiendo o pe mi iendo la
libe ación de Ci oc omo C. Es e ci oc omo ac i a dos Caspasas, 8 y 9 que desencadenan la
ac i ación en cadena de múl iples caspasas que se enca ga án de des ui los o gánulos y el
ma e ial gené ico celula .Además de las mu aciones mencionadas en P53 exis en mu aciones
sob e odos los componen es de la ías implicadas en la apop osis, las más ecuen es se dan
sob e Bcl-2, Bcl xL, Bid, Bak, Bax, Bad, Bim, caspasas-8, -10, -9 y Fas en e o os (Blaho co a
e al., 2015; S einbach & Welle , 2004).
39
Además de lo comen ado has a aho a debemos menciona una ía que iene un papel
undamen al en la egulación de la supe i encia y apop osis celula , la ía PI3K- AKT. Es a ía
unciona de la siguien e mane a: La unión de ligandos como IGF 1 e IGF 2 a ecep o es TK
ac i an a la p o eína PIK3. Es a a su ez p o oca la ac i ación de AKT la cual mig a al núcleo e
inac i a ac o es de ansc ipción de genes p oapop ó icos como las p o eínas FOX. Po lo
an o, es a ía es una ía que p omue e la Supe i encia celula . El p incipal egulado de es a
ía es
• PTEN: El locus de es e gen se encuen a en el c omosoma 10q23.Codi ica una p o eína
de 403 aminoácidos y un peso molecula de 48 KDa. P esen a dos dominios p incipales,
el dominio C2 median e el cual se ancla a la memb ana celula y el dominio ca alí ico
que p esen a la unción os a asa (Wo by & Dixon, 2014) PTEN ac úa como sup eso de
umo es ya que inhibe la ía PI3K/AKT/mTOR la cual es á elacionada con aumen o de
la p oli e ación , c ecimien o y supe i encia en e o as unciones. (Knobbe e al.,
2002).El mecanismo median e el cual inhibe es a ía es el siguien e: cuando PI3K se
ac i a median e la acción de un ac o de c ecimien o unido a su ecep o , p oduce la
os o ilación de un lípido de memb ana, PIP2, que pasa a PIP3, el cual es el esponsable
de la ac i ación de AKT. PTEN e i a un g upo os a o de PIP 3 que pasa a PIP 2 lo que
ena la ía PI3K/AKT(Ál a ez-Ga cia e al., 2019)(Wo by & Dixon, 2014).Las
mu aciones que p oducen disminución de la unción de PTEN son ecuen es en GBM.
Has a en el 85 % de los GBM p esen an delecciones en es e gen según el A las del
genoma del Cánce (Cance Genome A las Resea ch Ne wo k e al., 2013). Sin emba go
no se obse an di e encias en la ecuencia de mu aciones de es e gen en los di e en es
sub ipos de GBM(Ve haak e al., 2010).
Figu a 16: PTEN ac úa como sup eso de umo es al inhibi la ía PIK3/AKT. Dicha ía culmina con la
inac i ación de genes p oapop ó icos p omo iendo la supe i encia celula .
40
5.4.1.7 E asión de la espues a inmune
Los di e en es e ec o es del sis ema inmune cons an emen e de ec an y eliminan células
cance osas de nues o o ganismo. Los umo es que consiguen c ece y se signi ica i os
consiguen de alguna mane a e i a es a igilancia inmunológica. Modelos expe imen ales
animales a los que se les ha sup imido la espues a inmune celula ( lin oci os T y Na u al Kille s)
p esen an una incidencia muy ele ada de umo es (Teng e al., 2008). Como imos en el
apa ado de Nue as Te apias, la e asión de la espues a inmune ha sido es udiada en los úl imos
años y ha o iginado la el campo de la Inmuno e apia.
5.4.1.8 Rep og amación del me abolismo ene gé ico:
Las células umo ales que han ido seleccionándose, empleando cada uno de los Hallma ks
explicados p e iamen e, p esen an una asa muy ele ada de eplicación en compa ación con las
células no males. Es a al a asa eplica i a conlle a un gas o ene gé ico muy ele ado. Las células
umo ales necesi an desa olla un me abolismo más e icien e que sus ecinas no umo ales
(Hanahan & Weinbe g, 2011) ¿Cómo log an las células umo ales ob ene es a g an can idad de
ene gía? Pa a explica lo debemos an es conoce las u as me abólicas celula es no males. Como
sabemos, la p incipal uen e de ene gía celula es la Glucosa. Dicho me aboli o su e un p oceso
oxida i o as el cual se ob iene Adenosín T i os a o (ATP). Exis en 2 u as de Glicólisis que se
dan en unción de la disponibilidad de OXÍGENO en el ambien e celula . La glucólisis ae obia
consis e en la oxidación de la molécula de glucosa en el ci osol has a ob ene pi u a o. El
pi u a o se ans o ma en Ac ilCoA y en a en la mi ocond ia. Comienza en onces el ciclo de
K ebs median e el cual, el Ace ilCoA se une al Oxalace a o o mando Ci a o. A consecuencia de
es as eacciones del Ciclo de K ebs se o man moléculas de NADH. El NADH de la ma iz
mi ocond ial en a á en las c es as mi ocond ales e in e end á en la cadena espi a o ia con la
consiguien e o mación de ATP. A modo esumen; as el me abolismo ae óbico de una molécula
de Glucosa se ob ienen 38 moléculas de ATP (Nai eh e al., 2021).
En cambio, cuando no se dispone de Oxígeno su icien e, se p oduce la Glucolisis anae óbica,
p oceso que se da en el ci osol en el cual la molécula de Glucosa se ans o ma en 2 moléculas
de Pi u a o y es as a su ez en 2 moléculas de Lac a o g acias a la enzima Pi u a o
Deshid ogenasa. Como consecuencia de la Glucolisis anae óbica se ob ienen 2 moléculas de ATP
po cada molécula de Glucosa (Melkonian & Schu y, 2021).
47
1: Aumen o de la exp esión de los inhibido es de CDK: Como hemos is o en apa ados
an e io es, cuando CDK4/6 se une a Cliclina, es e complejo os o ila a p RB, haciendo
que es e libe e al Complejo de T ansc ipción E2F que enía secues ado. EF2 mig a á al
núcleo y pa icipa á en la ansc ipción de genes enca gados de pasa de la ase G1 a la
ase S. En las células de Glioma, la ac i ación de TGFb esul a á en la ac i ación del
complejo SMAD que se uni á a complejos de ansc ipción como FoxO o C/EBPb dando
luga la ac i ación de p15/INK4b and p21/CIP1, dos de los p incipales inhibido es de CDK
(Seoane e al., 2004).
2: Disminución de la exp esión de c-Myc: T as la ac i ación del complejo SMAD y su
mig ación al núcleo es e se une a ac o es de T asc ipción E2F4/5 Y A C/EBPb lo que
disminui á la exp esión de c-Myc, po lo que no pod á ac i a a las CDK ni inhibi a p15
y p21.
Figu a 21: Esquema en el que se ap ecia cómo la ac i ación del complejo SMAD y su unión a di e en es
ac o es de ansc ipción egula nega i amen e la ac i idad p oli e a i a de la célula. Figu a C eada con
BioRende .com
Es imulación de la Di e enciación y Apop osis Celula : TFG b p omue e la di e enciación de las
Neu al S em Cells cul i adas in i o (Izsak e al., 2020) Además TFGb p omue e la apop osis
celula median e la ac i ación de la anc ipción de DAPK, que ac i a la apop osis mediada po
p53. (Jang e al., 2002), aumen o de la asnc ipción BAX y disminución de BCL2 y BCLxl , lo cual

48
p omue e la libe ación de Ci oc omo c de la mi ocond ia y po an o gene a ac i ación de la
cascada apop ó ica (Bakhshayesh e al., 2012)
Sup esión de la inmo alización y man enimien o de la es abilidad c omosómica:
Es udios en modelos in i o e in i o mues an que el silenciamien o del gen TGF b p oduce una
disminución en la apop osis y un aumen o de al e aciones c omosómicas cuando los ejidos son
expues os a á macos alquilan es y a adiaciones ionizan es. (Ewan e al., 2002; Glick e al.,
1996)
5.4.2.4 TGFB como oncogén:
Como hemos comen ado an e io men e, el acúmulo de mu aciones sob e las moléculas
enca gadas de lle a a cabo la espues a egulado a de la ía TGF b p oduce que es a se con ie a
en una ía de señalización que p omue e el desa ollo umo al a a és de los siguien es
mecanismos:
Aumen o de la p oli e ación celula : An e io men e comen amos la impo ancia de las ías que
dependen de c-Myc, p21 y p15 en el con ol de la p oli e ación celula . Pues en es ados celula es
p o umo ales de Glioma encon amos al e aciones en SMAD , PI3K, y FoxG1 que median la
esis encia al con ol de la p oli e ación celula inducida po TGFb (Seoane e al., 2004).
Aumen o de la mig ación e in asión celula : El Glioblas oma p esen a una g an capacidad pa a
in adi el pa énquima ce eb al sano. Es o es debido a la p oducción de p o easas que deg adan
la Ma iz Ex acelula pe mi iendo el a ance celula (Rao, 2003). TGBb1 exógeno aumen a
di ec amen e la mo ilidad celula median e el aumen o de la exp esión de in eg inas  y  y
cie as me alop o easas en células de Glioma in i o (Pla en e al., 2000; Wick e al., 2001).
Aumen o de la angiogénesis: La ele ada p oli e ación mic o ascula es una de las ca ac e ís icas
his ológicas undamen ales de Glioblas oma. El TFGb pa icipa en el aumen o de los asos
umo ales median e el aumen o de la ansc ipción de VEGF (“Vascula Endo elial G ow h
Fac o ”), FGF (“Fib oblas ic G ow h Fac o ”) y PAI-1 (“Plasminogen Ac i a o Inhibi o ”).
(Gue e o & McCa y, 2017) Cie os es udios sugie en que la hipoxia isula y el TGFb ealizan
una acción siné gica en la egulación de la ansc ipción del VEGF, ya que una de e minada
egión del p omo o del gen VEGF p esen a egiones de unión de ADN pa a SMADs y
HIF(Hipoxia-Inducible ac o (Sánchez-Elsne e al., 2001).
Man enimien o de las GSC: Como e emos en el apa ado siguien e las Glioma S em Cells
p esen an un papel impo an e en malignidad del Gliolas oma ya que son las esponsables de
su esis encia a la quimio adio e apia y ecu encia umo al. La señalización au oc ina de TGFb
p esen a un papel impo an e en la capacidad de au o eno ación de las GSC al induci la
ansc ipción de Sox4 y Sox2 (Ikushima e al., 2009)
5.4.3 LEFTY:
A con inuación, nos cen a emos en una molécula en conc e o pe enecien e a la supe amilia
TGFb, la cual es una de las p incipales dianas de nues o es udio.
Es uc u a: es una p o eína que o ma pa e de la supe amilia TGF b. El locus de LEFTY se
encuen a en el c omosoma (1q42.1) y con iene 3 genes, dos de los cuales son uncionales y un
e ce o (LEFTY 3) el cual es un pseudogén. LEFTY es sec e ada como un polipép ido de 42 KDa
49
que después es escindido en 2 dando luga a sus dos iso o mas LEFTY 1 (LEFTY A) y LEFTY 2
(LEFTY B) (Ulloa & Tabibzadeh, 2001). Ambas moléculas son p ác icamen e idén icas, el 96% de
su secuencia es igual y ambas p o eínas di ie en en solamen e 16 aminoácidos (Yashi o e al.,
2000).
Figu a 22: El loci de LEFTY se encuen a en el c omosoma 1. Se sec e a como un polipép ido que después
es escindido en dos iso o mas, LEFTY 1 y LEFTY 2. Figu a C eada con BioRende .com
Función:
LEFTY iene un papel undamen al en la egulación de la ía TGFb, en conc e o de la ía de
señalización ac i ada po NODAL, una molécula de la amilia TGFb(Ulloa & Tabibzadeh, 2001)
Pa a pode en ende mejo la unción de Le y explica emos b e emen e las p incipales
ca ac e ís icas de la ía NODAL:
Como hemos mencionado an e io men e, NODAL es una p o eína codi icada po el gen del
mismo nomb e si uado en el c omosoma 10 (10q22.1). Fo ma pa e de los ligandos de la amilia
del TGFb y es sec e ada como un p ecu so que se ac i a en el espacio ex acelula . Una ez en
su o ma ac i a, NODAL se une con un co ecp o EGF-CFR conocido como CRIPTO. Es e
complejo NODAL-CRIPTO se une a los ecep o es ansmemb ana se ina/ eonina kinasa ipo I
y ipo II (ALK4 y ACTRIIB)(Bianco e al., 2002) Una ez o mado es e complejo NODAL(ligando)-
CRIPTO(co ecep o )-ALK4-ACTRIIB( ecep o ) se p oduce la pos o ilación de SMAD2 / SMAD 5
lo que desencadena la cascada de señalización SMAD de la ía TGFb con la consecuen e
mig ación del complejo R-SAMAD/Co-SMAD al núcleo y egulación de la ansc ipción genómica.
El papel de LEFTY consis e en la egulación de es a ía. En conc e o LEFTY bloque la ac i ación
de la ía y de iene la cascada de señalización de di e en es o mas: LEFTY se une al complejo
NODAL-CRIPTO impidiendo que es e se una a los ecep o es ansmemb ana (Schie , 2003)
LEFTY ambién impide la os o ilación de las R-SMAD po el complejo Ligando-Recep o
50
e i ando la ac i ación de la cascada SMAD. Además de es o LEFTY e i a la anslocación del
complejo SMAD al núcleo celula impidiendo que o men complejos de ansc ipción genómica
(Ulloa & Tabibzadeh, 2001).
Debemos sabe que, en e o as acciones, la ac i ación de es a ía po NODAL a o ece la
ansc ipción de LEFTY, es ableciéndose así una egulación nega i a de la ía (Schie , 2003).
Figu a 23: LEFTY ac úa como inhibido de la ía NODAL al impedi la ac i ación de la cascada de
señalización dependien e de las p o eínas SMAD. Figu a C eada con BioRende .com
PAPEL FISIOLÓGICO DE LEFTY DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS:
Como hemos is o NODAL y LEFTY uncionan de o ma conjun a, o mando un ciclo egula o io.
La cascada de señalización que es ablecen a a és del complejo SMAD p esen a un papel
undamen al du an e el desa ollo emb iona io: A con inuación, ealiza emos una b e e
explicación de los e en os en los que pa icipa NOD AL-LEFTY de o ma isiológica:
Debemos sabe que as la ecundación del ó ulo po el espe ma ozoide comienza una e apa
conocida como desa ollo emb iona io que du a 8 semanas y que es á di idida a su ez en a ias
51
sube apas. De es as, las que a noso os nos in e esan po la implicación de NODAL son la
p egas ulación y la gas ulación. La gas ulación consis e en el p oceso median e el cual el
emb ioblas o, que consis e en una es uc u a o mada po solamen e una capa de células, pasa
a ene es capas: endodé mica , mesodé mica y ec odé mica. Du an e es as e apas se
es ablece el eje p oximal-dis al (PD), an e io -pos e io (AP) y de echa-izquie da (DI) del
emb ión. El p ime eje que se es ablece es el PD: Inicialmen e, la ac i ación de NODAL en el
Epiblas o p oximal induce la exp esión de LEFTY en el Epiblas o dis al, y es o gene a un g adien e
en la exp esión NODAL (J. B ennan e al., 2001). Sucesi amen e la exp esión de NODAL queda á
limi ado al epiblas o p oximal donde se o ma la Es ía P imi i a dónde da á comienzo la
Gas ulación. T as el p oceso de gas ulación, la exp esión de NODAL queda con inada a la
po ción más p oximal de la Es ía P imi i a, egión que oma á el nomb e de NODO VENTRAL y
en la que se inicia á el p oceso de LEFTY RIGHT ASIMTRY (P oceso que da nomb e a la p o eína
LEFTY). La ac i ación de nodal desde el Nodo median e in e acciones con Co ecep o es C ip o
en la Placa La e al Mesodé mica de inen el lado izquie do. En el lado de echo la exp esión de
LEFTY y un lujo cilia hacia la izquie da impiden que NODAL eje za su unción en el lado de echo,
es ableciéndose así una asime ía en izquie da -de echa.(Li le & No is, 2021) Mu aciones
homozigo as en SMAD 2, LEFTY, NODAL son mo ales pa a el emb ión en desa ollo. Mu aciones
He e ocigo as conlle an impo an es al e aciones c aneo aciales en el neona o (Nomu a & Li,
1998) condiciones como si us in e sus, ambiguous o he e o axia (Schweicke e al., 2017).
Debemos sabe que LEFTY y NODAL , es án al amen e exp esados en células S em humanas po
lo que son conside ados ma cado es de células S em (Wei e al., 2005).
Figu a 24: La exp esión de LEFTY y NODAL egula la de e minación de los ejes en la emb iogénesis. P:
p oximal, D: dis al, Po: pos e io , A: an e io , R: de echa, L: izquie da. Figu a C eada con BioRende .com
52
Como hemos is o LEFTY p esen a una impo an e unción egulado a du an e la emb iogénesis,
pe o ¿cómo se asocia es o con cánce ?, pues bien, en la úl ima década di e en es a ículos
elacionan la al e ación de di e en es ías egula o ias emb iona ias con el desa ollo umo al.
Un ejemplo es el es udio in i o que ealiza on Hend ix y colabo ado es en el que in oduje on
dos g upos de células de melanoma, uno al amen e ag esi o y o o pob emen e ag esi o, en el
emb ión de pez zeb a en el es ado de bás ula. Lo que se encon a on ue que las células
al amen e ag esi as p esen a on la capacidad de induci la o mación de un eje emb iona io
p ác icamen e comple o. Lo cual sugie e que las ías de desa ollo emb iona ias son
uncionan es en las células umo ales con ele ada capacidad umo al.(J. T. Lee & He lyn, 2006;
Topczewska e al., 2006) Nume osos es udios eo izan sob e la implicación de ías de la
supe amilia TGFb elacionadas con emb iogénesis isiológica ( ías NODAL y BMP, ambas
eguladas po LEFTY ) en el mecanismo umo ogénico de di e en es linajes celula es. (Buijs
e al., 2007; Fu & Peng, 2011; C.-C. Lee e al., 2010; Lomba do e al., 2011; T. Wang e al., 2017;
G. Xu e al., 2004; Zhao e al., 2008)
Le y en Cánce :
Escasas son las publicaciones en las que se es udie el papel de LEFTY en Cánce . A con inuación,
da emos una pincelada a los es udios que desc iben las p incipales ca ac e ís icas de es e
inhibido de SMAD, que pa ece ac ua como oncogén:
En 2018 Ma sumo o e al analiza on la exp esión de LEFTY en Ca cinoma de O a io de células
cla as iendo que es aba ele ada. Relaciona on un aumen o de la exp esión de LEFTY con un
aumen o en las p opiedades EMT/CSC de es as células (Ma sumo o e al., 2018). Zabala e al
publica on un es udio ecien e en el que LEFTY , median e la inhibición de SMAD 2 y SMAD 5 ,
es imula la eno ación celula y la p oli e ación en el epi elio basal de la mama y en células
cance osas de mama in i o (Zabala e al., 2020). En cuan o a LEFTY en Glioblas oma,
Ma sumo o e al publica on un es udio en 2020 en el que obse a on que es e inhibido de
SMAD, e a up egulado en las condiciones hipóxicas , y o iginaba un aumen o de la supe i encia
celula median e cambios en la apop osis , p oli e ación y ca ac e ís icas de la EMT y las GSC
(Ma sumo o e al., 2020).

53
5.4.4 Células Mad e de Glioma
El Glioblas oma es uno de los umo es que más he e ogeneidad in a umo al p esen a. Pa el e
al ealiza on un RNA-seq de 430 células de 5 umo es di e en es de Glioblas oma encon ando
una g an a iabilidad in e celula a ni el molecula (Pa el e al., 2014). Va iabilidad molecula
quie e deci que den o del mismo umo , exis en poblaciones celula es con al e aciones en
di e en es moléculas de di e en es ías celula es. Es o gene a poblaciones celula es di e en es
den o de un umo , cada una de ellas ca ac e izada po p esen a di e en es en ajas
adap a i as espec o a las células sanas. Así podemos encon a un clon cuyas al e aciones
molecula es le hayan con e ido una g an esis encia a la hipoxia, o o clon con capacidad pa a
e adi la espues a inmune, o o que p esen e una ele ada esis encia al daño a su ADN e c.
Den o de un umo encon amos un subg upo celula que p esen a las di e en es capacidades
comen adas an e io men e sumadas a una g an capacidad de au o eno ación, es e subg upo
celula se conoce como Células Mad e de Glioma o Glioma S em Cells (GSC) y amos a
de ene nos a comen a sus p incipales ca ac e ís icas y su peso en la pa ogénesis del
Glioblas oma.
La his o ia de las Glioma S em Cells comenzó en 1994 cuando Dick e al publica on una
p oli e ación man enida de células de Leucemia de humano en a ones inmunosup imidos
(Lapido e al., 1994). A pa i de ahí comenza on a busca se en o os umo es es as células que
podían di e encia se en modelos in i o y que p esen aban ele ada capacidad de
au o eno ación. En los años 2003 y 2004 Singh e al encon a on un subg upo celula den o de
los umo es ce eb ales que p esen aba la capacidad de au o eno ación y de gene ación de
umo es humanos al se inyec ada en modelos animales, las Glioma S em Cells (S. K. Singh e al.,
2003, 2004).
Es e subg upo celula pod ía de ini se en base a una se ie de c i e ios uncionales que deben
cumpli se en su o alidad : célula del ejido umo al que p esen a la capacidad de
au o eno a se , que al se inyec ada modelos de expe imen ación gene a umo es que
p esen an a su ez he e ogeneidad in a umo al (Gimple e al., 2019).Debemos des aca que
es e subg upo celula NO iene un ma cado pa ognomónicos si no que p esen an una se ie de
ma cado es lo ca ac e izan. Los ma cado es más ca ac e ís icos incluyen p o eínas
in acelula es como SOX2, OLIG2, MYC, and NESTIN y p o eínas de memb ana celula como
CD133, L1CAM, CD44, and A2B5 (Hassn Mes a i e al., 2020).
El aspec o más des acable de las Glioma S em Cells es que son las esponsables que cie os
umo es p esen en quimio esis encia y adio esis encia median e la ac i ación de pun os de
con ol de espues a al daño del ADN y al p esen a una ele ada capacidad epa ación del
ma e ial gené ico celula (Bao, Wu, McLendon, e al., 2006).También son las esponsables de la
ecu encia umo al as el a amien o (Au inge e al., 2015).Es as células además a o ecen
la angiogégenis mic o ascula median e di e en es mecanismos como son la di e enciación en
células endo eliales o pe ici os o la libe ación de moléculas p oangiogénicas (Bao, Wu,
Sa ho nsume ee, e al., 2006). O a de sus ca ac e ís icas es la capacidad que p esen an de
con ibui al silenciamien o de la inmunidad en el mic oambien e umo al (Ma e al., 2018).
54
Figu a 25: Las GSC se ca ac e izan po la capacidad de gene a umo es he e ogéneos en animales de
expe imen ación y se las esponsables de las ca ac e ís icas más ag esi as del Glioblas oma. Figu a
C eada con BioRende .com
55
6 OBJETIVOS
El obje i o p incipal de es e p oyec o es es udia la implicación de la ía de LEFTY en la
p og esión y a amien o del Glioblas oma.
Pa a el desa ollo del es udio hemos ealizado una di isión del obje i o p incipal en Obje i os
especí icos que son
1: Es udia la exp esión y ele ancia clínica de Le y en Glioblas oma:
1.1 Ca ac e ización de la exp esión de las p o eínas LEFTY y SMAD en líneas celula es de
Glioblas oma.
1.2 Ca ac e ización de la exp esión de las p o eínas LEFTY y SMAD en biopsias humanas de
Glioblas oma y co elación con la supe i encia.
2: Es udia el impac o de la inhibición a macológica LEFTY en la capacidad
umo ogénica del Glioblas oma:
2.1 E alua como la inhibición a macológica de LEFTY a ec a al c ecimien o del
Glioblas oma in i o.
2.2 E alua cómo la inhibición a macológica de LEFTY a ec a la población de células
mad e de glioma.
2.3 E alua como la inhibición a macológica de LEFTY a ec a al c ecimien o del
Glioblas oma in i o.
2.4 E alua cómo la inhibición a macológica de LEFTY a ec a al c ecimien o del
Glioblas oma de mane a combinada a quimio e apia.
56
7 MATERIAL Y MÉTODOS:
7.1 CULTIVO CELULAR
7.1.1 Líneas celula es:
Las líneas celula es de Glioma con las que abajamos en la ealización de es e p oyec o ue on
las siguien es: U87, U251, U373, A 172, T 98, GNS 166, GNS 179.
Las p ime as 5 líneas mencionadas son líneas celula es ob enidas de la Colección Ame icana de
Cul i os Tipo (ATCC) y ue on cul i adas de o ma adhe en e en medio DMEM (Medio de
cul i o Eagle modi icado po Dulbeco, Gibco, Wal ham, MA, USA) suplemen ado con 10%
( / ) de sue o bo ino e al (Gibco), glu amina (2 mM), penicilina (100 U/mL) y
es ep omicina (100 μg/mL).
Las dos siguien es, las células mad e de Glioma o GNS (Glioma Neu al S em Cell) 166 y 179 son
células mad e de Glioma de i adas de pacien e y ue on cedidas po el D S e e Polla d del
Cen e o Regene a i e Medicine and Edinbu gh Cance Resea ch Cen e de la Uni e sidad de
Edimbu go (Re Polla d SM 2009 Cell S em Cell). Fue on cul i adas en adhesión as a a la
supe icie de cul i o con 10 μg/mL de Laminina (L2020, Sigma Ald ich) du an e 3 h a 37 °C
en un medio selec i o pa a células mad e medio : DMEM/F12 (Medio de cul i o Eagle
modi icado po Dulbeco, Ham F12, Sigma) en p opo ción 1:1 y suplemen ado con B27 10x
(Gibco) N2 100x (Gibco), glucosa 45% y 20 ng/mL de ac o es de c ecimien o de ib oblas os
(bFGF,R&D Sys ems) y epidé mico (EGF, Sigma, S . Louis, MO, USA)
Los cul i os de células mad e de es e as en suspensión ue on ealizados en placas no
a adas pa a e i a la adhe encia, en medio de cul i o selec i o pa a células mad e
(desc i o an e io men e) y some idas a disg egación enzimá ica con acu asa (In i ogen
A1110501) pa a su subcul i o.T abajamos ambién con la línea celula NHA de As oci os
p ima ios ob enidos de có ex ce eb al humanos ( ScienCell Resea ch Labo a o ies #1800) de
que empleamos como con ol.Todas las líneas celula es se man u ie on en condiciones de
cul i o es ánda a 37°C de empe a u a, 95% de humedad, 21% de O2 y 5% de p esión de
CO2. Todos los p ocedimien os se ealiza on en campanas de lujo lamina de segu idad
Clase II (ni el de segu idad biológica 2; Class II Biohaza d Sa e y Cabine , ESCO).
LÍNEA CELULAR
TIPO CELULAR
ORIGEN
MEDIO DE CULTIVO
PROCEDENCIA
U87
Glioma
Glioblas oma
DEMEN+10%SBF
ATCC(HTB-14)
U251
Glioma
Glioblas oma
DEMEN+10%SBF
ATCC
U373
Glioma
Glioblas oma
DEMEN+10%SBF
ATCC(HTBJ-17)
A172
Glioma
Glioblas oma
DEMEN+10%SBF
ATCC(CRL-1620)
T98
Glioma
Glioblas oma
DEMEN+10%SBF
ATCC(CRL-1690)
GNS166
Célula mad e de
glioma.
Glioblas oma
DMEN/F12
S e e Polla d
GNS179
Célula mad e de
glioma.
Glioblas oma
DMEN/F12
S e e Polla d
NHA
As oci o
Ce eb o sano
DEMEN+10%SBF
Sceince Cell #1800
Tabla 1: Ca ac e ís icas de las líneas celula es empleadas.
63
7.4.5 Inmunohis oquímica
Realizamos inmunohis oquímicas (IHQ) con el obje i o de iden i ica y cuan i ica la exp esión
de di e en es p o eínas de in e és en los umo es gene ados en el ejido subcu áneo de modelos
animales.
7.4.5.1 TUMORES DE ENSAYOS IN VIVO
Los umo es gene ados en el ejido subcu áneo de los a ones inmunodep imidos
(Fox1Nu/Fox1/un) ue on ex aídos y ijados en 10% de o malina du an e 48 ho as a
empe a u a ambien e pa a pos e io men e se embebidos en pa a ina y co ados en secciones
de 4 μm de g oso con un mic o omo. Los co es ue on despa a inados, ehid a ados median e
baños sucesi os en alcoholes dec ecien es e incubados en ampón ci a o en ebullición du an e
10 minu os pa a la ecupe ación an igénica. A con inuación, se incuba on en solución de
bloqueo (PBS-0,3% T i ón X-100-5% FBS) y ue on incubados con los co espondien es
an icue pos p ima ios [Tabla 4 ] a 37°C du an e 2 ho as. T as la incubación con el an icue po
p ima io, los co es se la a on e incuba on con los an icue pos secunda ios [Tabla 10].
Pos e io men e las mues as ue on incubadas du an e 10 minu os a empe a u a ambien e con
el sus a o 3,3'Diaminobenzidina (DAB, Ca . No. SPR-DAB-060, Sp ing Bioscience),
p oduciéndose como p oduc o de la eacción DAB oxidada, un p ecipi ado ma ón de ec able
en el ejido. Las inciones se obse a on en un mic oscopio Eclipse 80i y ue on p ocesadas con
el so wa e NIS Elemen s Ad ances Resea ch (Nikon).
An icue po
ESPECIE DE ORIGEN
DILUCIÓN
REFERENCIA
P ima ios
Fos o-His ona 3
Ra ón
1:1000
Abcam Ab 14955
SOX2
Conejo
1:500
Milipo e AB5603
Caspasa 3
Conejo
1:1000
RDSys ems AF835
LEFTY 1
Conejo
1:1000
Ab 22569
p-SMAD2
Conejo
1:1000
In i ogen 10125104
p-SMAD5
Conejo
1:1000
In i ogen 163254884
Ki67
Conejo
1:250
Abcam16667
Secunda ios
Goa an i- abbi HRP
Cab a
1:2000
San a C uz
Bio echnology Sc-
2004
Goa an i-mouse HRP
Cab a
1:2000
San a C uz
Bio echnology Sc-
2004
Tabla 4: Ca ac e ís icas de los an icue pos p ima ios y secunda ios empleados en IHQ.

64
7.4.6 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Con el obje i o de es udia la exp esión de los ARN mensaje os (ARNm) de los genes de in e és
en líneas celula es de glioma median e PCR cuan i a i a, se pu i icó el ARN y se ob u o el ADN
complemen a io (ADNc) median e una eacción de e o ansc ipción (RT).
7.4.6.1 EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL
Pa a el aislamien o del ARN celula se lisa on las células con una solución mono ásica de
iociana o de guanidina y enol (T izol® Ca . No. AM-9738, Li e Technologies). La lisis en T izol se
ealizó du an e 10 minu os a empe a u a ambien e median e pipe eo igo oso. Pos e io men e
se añadie on 200 μL de clo o o mo (Ca . No. C2432, Sigma), se mezcló median e in e sión y se
dejó ac ua 10 minu os a empe a u a ambien e. Pos e io men e las mues as se cen i uga on
a 12.000 x g a 4°C du an e 10 minu os (mic ocen í uga 22R, Beckman Coul e ) ob eniendo así
3 ases bien de inidas: una ase supe io , acuosa, o mada po el ARN, una in e ase que con enía
el ADN y una ase in e io que con enía las p o eínas. La ase supe io con el ARN se as asó a
nue os ubos a ados con DEPC (Die il pi oca bona o, Ca . No. 159220, Sigma) y se desca a on
el es o de las ases. Se añadie on 500 μL de alcohol isop opílico (Ca . No. I9516, Sigma) y 1 μL
de glicógeno (5 μg/μL) (Ca . No. AM9510, Ambion) y se incubó du an e 10 minu os a
empe a u a ambien e pa a p ecipi a el ARN. Se ealizó o a cen i ugación a 12.000 x g a 4°C
du an e 10 minu os, se desca ó el sob enadan e, se añadió 1 mL de e anol al 75% y se
cen i ugó a 7.000 x g a 4°C du an e 5 minu os pa a la a el p ecipi ado. Finalmen e, se desca ó
el sob enadan e, se secó el pelle en una cáma a de acío du an e 10 minu os y se esuspendió
con agua lib e de ARNasas. La concen ación y pu eza del ARN aislado se de e minó median e
la medición de la abso bancia a 260 y 280 nm en un espec o o óme o Nanod op-1000 (The mo
Scien i ic).
7.4.6.2 TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT)
Pa a la ob ención del ADN complemen a io de cadena simple se ealizó la e o anscipción
median e el mé odo de cebado es alea o ios y el Ki Mul iSc ibeTM Re e se T ansc ip ase (Ca .
N° 4311235, Li e Technologies), pa iendo de 1 μg de ARN o al. Las mues as se some ie on a
los siguien es ciclos de empe a u a en un e mociclado BioRad C1000 The mal Cycle :
incubación de 10 minu os a 25°C, ase de calen amien o a 37°C du an e 120 minu os y ase de
calen amien o inal a 85°C du an e 5 minu os. El ADNc esul an e se diluyó en agua lib e de
ARNasas a una concen ación inal de 4 ng/μL.
7.4.6.3 PCR CUANTITATIVA (qRT-PCR)
Pa a de e mina los ni eles de exp esión de los genes de in e és se u ilizó la ecnología de
eacción en cadena de la polime asa cuan i a i a (qRT-PCR), que se basa en la eacción de PCR
pa a ampli ica el p oduc o especí ico, y pe mi e la moni o ización del p oceso ciclo a ciclo. Se
empleó ADN complemen a io como molde, dos cebado es especí icos y una mezcla de eacción
(Absolu e SYBR G een mix (Ca . N° 4368706G, Applied Biosys em) que con iene
65
desoxi ibonucleó idos (dNTPs), enzima ADN polime asa y el luo ó o o SYBR G een, el cual se
in e cala en los ácidos nucleicos de doble cadena y pe mi e la cuan i icación del p oduc o en
cada ciclo.
Las PCR se ealiza on en placas de 96 pocillos (cada mues a po iplicado) y en cada pocillo se
dispusie on 20 ng de ADNc en un olumen inal de 12 μL cons i uidos po 6μL de Absolu e SYBR
G een mix, 0,75 μL de agua lib e de ARNasas y 0,25 μL de mezcla de cebado es ( o wa d y
e e se) especí icos pa a cada gen de es udio [Tabla 5] a una concen ación de 0,4 μM. La
eacción se lle ó a cabo en un e mociclado Ligh Cycle 96 (Roche) con los siguien es ciclos de
empe a u a: ciclo de 120 segundos a 50°C; 1 ciclo de 600 segundos a 95°C, 41 ciclos de 15
segundos a 95°C y 60 segundos a 60°C y un úl imo paso de disociación consis en e en 10
segundos a 95°C, 60 segundos a 60°C y 1 segundo a 97°C.
Como gen de con ol in e no pa a co egi las a iaciones de los ni eles de ADNc se usó la
ampli icación de GAPDH (Glice aldehído 3 os a o deshid ogenasa). Pa a ealiza la
cuan i icación ela i a de los ni eles de exp esión génica se u ilizó la ó mula 2-ΔΔC , que consis e
en calcula la exp esión no malizada del gen de in e és en la mues a con espec o a las mues as
de e e encia. Los da os se p esen an como el “cambio de eces de exp esión” del gen diana
no malizado con el gen con ol y a su ez ela i izada espec o a la co espondien e mues a
con ol.
GEN
SECUENCIA FORWARD
SECUENCIA REVERSE
GAPDH
ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG
GACGGTGCCATGGAATTTGC
LEFTY-1
AGAGCTGGCGATGACTGAAC
AAACTGAGCAAGGGCTCTCC
LEFTY-2
ACGTGAGGGCCCAGTATGTA
TCCATGCCGAACACCAGC
SMAD-2
GCCGGGAGGTTCGATACAAG
AGTCTCTTCACAACTGGCGG
SMAD-5
GCGGCCGAGCTGCTAATAAA
CAGCTTCCTTTTCGCGAGC
Tabla 5: Secuencias de cebado es empleados.
7.4.7 Análisis Es adís ico
Los da os mos ados en el p esen e abajo ep esen an la media ± e o es ánda de la media
(SEM). Las medias ue on compa adas median e el es es adís ico de S uden y los da os se
ep esen a on usando G aphPad 8. Los as e iscos indican los di e en es g ados de signi icación
es adís ica: #p<0,1 * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; *** p<0.0001.
Los análisis de co elación se basa on en el coe icien e de Pea son cuando las mues as es aban
no malmen e dis ibuidas o el coe icien e de Spea man cuando no es aban no malmen e
dis ibuidas. El análisis de la no malidad se ealizó median e el es de Kolmogo o -Smi no ,
usando el so wa e G aphPad 8. Pa a los es udios de asociación en e supe i encia y o as
a iables se empleó el mé odo de Reg esión de COX.
66
8 RESULTADOS
8.1 LA EXPRESIÓN DE LAS DIFERENTES PROTEÍNAS DE LA VÍA SEÑALIZACIÓN
LEFTY-SMAD ES HETEROGÉNEA EN BIOPSIAS DE GLIOBLASTOMA.
Inicialmen e es udiamos la exp esión de LEFTY1, LEFTY2, SMAD2 y SMAD5 en biopsias umo ales
de glioblas oma. Pa a ello, empleamos el po al GlioVis (Bowman e al., 2017) donde es án
almacenados y accesibles da os de mues as de Glioblas omas del TCGA. Analizamos la
exp esión de es os 3 genes según es pla a o mas de secuenciación di e en es RNA-seq,
Agilen -4502A y HG-U133A.
La exp esión, a ni el ansc ipcional, de los genes ci ados en las mues as de glioblas oma ue on
compa ados con los ob enidos en ejido sano ce eb al, usado como con ol en cada es udio.
Los ni eles de LEFTY1 se encuen an disminuidos en las biopsias de glioblas oma
independien emen e de la pla a o ma u ilizada (Fig. 30A), mien as que los de LEFTY2 es án
aumen ados espec o al ejido sano ce eb al (Fig. 30B). En cuan o a las SMAD; los ni eles de
SMAD2 no pa ecen es a al e ados en 2 de las pla a o mas mien as que en RNA-seq es án
ele ados (Fig. 30C). Po úl imo, la exp esión de SMAD5 es á ele ada al se compa ada con el
ejido ce eb al con ol (Fig. 30D). Los esul ados ob enidos sugie en que la exp esión de los
genes de in e és es he e ogénea.
Figu a 30: Exp esión de los genes de in e és en biopsias de glioblas oma ob enidas en po al GlioVis. Boxplo del
log2 de la FPKM de exp esión de A) LEFTY1 B) LEFTY2 C) SMAD2 D) SMAD5 en biopsias de Glioblas oma de la base de
da os del TCGA.
67
8.2 LA SOBREXPRESIÓN DE LEFTY SE ASOCIA A UNA MENOR SUPERVIVENCIA
EN BIOPSIAS DE GLIOBLASTOMA.
Consul amos el Po al Glio is (Bowman e al., 2017) pa a de e mina cómo se elacionaba la
supe i encia con la exp esión de LEFTY y SMAD.
Analizamos, po un lado, una coho e de mues as del TCGA que incluye Glioblas omas
p ima ios, secunda ios y ecu en es; y; po o o lado, analizamos especí icamen e la coho e
de Glioblas omas ecu en es. Los esul ados mues an que, en ambas coho es, los pacien es
con mayo exp esión de LEFTY, an o de LEFTY 1 como de LEFTY 2, en las mues as analizadas,
p esen aban una meno supe i encia que aquellos con ni eles bajos de LEFTY. Pa ece que en
la coho e que analiza la exp esión de LEFTY especí icamen e en los Glioblas omas ecu en es
es as di e encias en la supe i encia son oda ía más signi ica i as.
Den o de la coho e que incluye Glioblas omas p ima ios, secunda ios y ecu en es, la
mediana de supe i encia es de 12,4 meses en los ni eles al os de LEFTY 1 y de 12,7 en los
ni eles bajos de LEFTY 1. En cuan o a LEFTY 2, la mediana de supe i encia es de 11,4 meses en
los ni eles al os y de 13,9 meses en los ni eles bajos. En la coho e que incluye exclusi amen e
Glioblas omas ecu en es, la mediana de supe i encia es de 8.2 meses en los ni eles al os de
LEFTY 1 y de 10.8 en los ni eles bajos de LEFTY 1. En cuan o a LEFTY 2, la mediana de
supe i encia es de 8.15 meses en los ni eles al os y de 10.5 meses en los ni eles bajos.
Figu a 31: Análisis de supe i encia Kaplan-Meie : A) y B) Análisis de supe i encia de pacien es con mues as de
GBM p ima ios, ecu en es y secunda ios en unción del ni el de exp esión de LEFTY 1 y LEFTY 2 C) y D) Análisis de
la supe i encia de pacien es con mues as de GBM ecu en es en unción del ni el de exp esión de LEFTY1 y LEFTY2.
68
Analizamos ambién la elación en e la supe i encia y la exp esión de SMAD 2 y SMAD 5 en
coho es de Glioblas oma que incluía mues as de Glioblas oma p ima io, secunda io y
ecu en e y de o ma indi idual po subg upos (p ima io, secunda io y ecu en e) y no
encon amos di e encias signi ica i as en cuan o a la supe i encia en unción de la exp esión
de SMAD 2 y SMAD 5.
Figu a 32: Análisis de supe i encia Kaplan-Meie : A) Análisis de supe i encia de pacien es con mues as de GBM
p ima ios, ecu en es y secunda ios en unción del ni el de exp esión de SMAD2 B) Análisis de supe i encia de
pacien es con mues as de GBM p ima ios , ecu en es y secunda ios en unción del ni el de exp esión de SMAD 5.
Una ez es udiados los da os disponibles en bases de da os públicas lle amos a cabo un es udio
simila en pacien es de nues o cen o. En es e caso nos cen amos en es udia la exp esión de
LEFTY a ni el p o eico. Pa a ello ealizamos un es udio inmunohis oquímico de mues as de
Glioblas oma de pacien es in e enidos en el año 2014 y 2015 po el Se icio de Neu oci ugía
en nues o cen o. Analizamos la exp esión de LEFTY en 65 mues as y a cada mues a se le
asignó un ni el que di idimos en nega i o/bajo (-), in e medio (+/-) y al o (+). Los casos en cada
g upo ue on 12, 40 y 10 espec i amen e. T es de las mues as p esen aban daños po lo que
no las incluimos en ninguno de los g upos. A con inuación, p e endimos asocia la exp esión de
LEFTY a la supe i encia de los pacien es, que es án inco po adas en la base de da os del Se icio
de neu oci ugía de mane a coo dinada con el comi é de neu o-oncología. Obse amos que, de
las 66 mues as, había algunas que p o enían del mismo pacien e o no sé enía in o mación
comple a po lo que nos quedamos con un o al de 40 indi iduos. Pa a e o za la es adís ica y

69
busca di e encias más cla as, las ag upamos en 2 coho es: LEFTY al o y LEFTY bajo. En es e
caso, la exp esión de LEFTY es á aumen ada en el 52,5 % de los pacien es de nues a mues a.
Figu a 33: Es udio inmunohis oquímico de las mues as de 40 pacien es in e enidos de Glioblas oma en el año 2014
y 2015 po el Se icio de Neu oci ugía del Hospi al Uni e si a io de Donos ia. Realizamos una di isión de las mues as
en dos g upos, LEFTY bajo (A) Le y in e medio (B) Y LEFTY al o (C).
T as analiza la supe i encia de cada uno de es os 40 pacien es lle amos a cabo un Modelo de
Reg esión de Cox. Pa ece exis i una asociación en e una mayo exp esión de LEFTY y una
meno supe i encia de los pacien es de nues a mues a, sin emba go, las di e encias no son
es adís icamen e signi ica i as.
Figu a 34: Análisis de supe i encia Kaplan-Meie . Analizamos la supe i encia en unción del g ado de exp esión de
LEFTY. Los esul ados mues an que pa ece exis i cie a asociación en e ni eles de exp esión más al os y una meno
supe i encia.
70
8.3 LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LEFTY ESTÁN AUMENTADOS EN LÍNEAS
CELULARES DE GLIOBLASTOMA Y EN LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE DE GLIOMA
Analizamos la exp esión de las p o eínas de in e és: LEFTY, SMAD2, SMAD 5, p-SMAD2 y p-
SMAD5 en di e en es líneas celula es de Glioblas oma, comp adas en la ATCC, y la compa amos
en e a una línea de as oci os p ima ios de i ada de indi iduos sanos (NHA). Los esul ados del
Wes e n Blo e leja on que LEFTY se exp esa en odas las líneas celula es es udiadas y que sus
ni eles son mayo es en compa ación con los as oci os sanos (Fig. 35). Las líneas de glioma que
más exp esión mos aban son la línea U87 y T98 en es e o den (Fig. 35). En cuan o a las SMAD,
obse amos una disminución de la exp esión de SMAD2 o al en células de glioma espec o a la
NHA, sob e odo en las líneas U87 y T98, consis en e con los ni eles de LEFTY) mien as que los
ni eles de SMAD5 o al pa ecen no es a disminuidos.
Realizamos ambién la medición de la exp esión de las p o eínas de in e és en dos líneas de
células mad e de Glioma (GSC) de i adas de pacien es denominadas GNS166 y GNS179 (Re
Polla d SM 2009 Cell S em Cell). En es e caso, los esul ados mos a on que la exp esión de LEFTY
e a muy al a en es as células. Ma cadamen e mayo que los as oci os sanos NHA y simila es a
las líneas de glioma U87 y T98, que p esen aban los ni eles más al os. En cuan o a los ni eles de
SMAD o al, la exp esión de SMAD 2 y SMAD 5 e a simila a los as oci os o es aba lige amen e
aumen ada (Fig. 35).
A con inuación, comple amos el análisis de exp esión de los genes de in e és en las líneas
celula es con encionales analizando sus ni eles de ARNm median e RT-PCR cuan i a i a. Todas
las líneas celula es ue on compa adas con la línea U87 la cual ue la que mos aba una exp esión
más ele ada de LEFTY a ni el p o eico. En es e caso, los esul ados mues an una exp esión
he e ogénea an o en LEFTY como SMAD, que no se ajus a de mane a p ecisa con lo obse ado
en los Wes e n Blo .
Figu a 35: Exp esión de los genes de in e és en líneas celula es de glioma. A) Análisis de exp esión de p o eína,
median e wes e n blo de LEFTY1, SMAD2 y SMAD5 en dis in as líneas umo ales con encionales de glioma y en GSCs
(dos líneas denominadas GNS166 y GNS179). NHA es línea humana p ima ia de as oci os usada como con ol. B)
Análisis de exp esión de mRNA de indicados genes en las líneas umo ales indicadas.
71
8.4 LA EXPRESIÓN DE LEFTY Y SMAD CAMBIA EN FUNCIÓN DEL
ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR.
Los esul ados del apa ado an e io sugie en que los ni eles de LEFTY es án en iquecidos en la
población de células mad e de glioma de i adas de pacien es. Pa a comple a el es udio de la
exp esión de LEFTY, y las SMAD, en las células mad e de glioma, analizamos su exp esión
median e Wes e n Blo y RT-PCR cuan i a i a en las di e en es líneas celula es de Glioblas oma
c ecidas en medio es ánda y as cul i a las en un medio selec i o pa a células mad e, de o ma
que es as c eciesen como oncos e as (2 y CSC) y adqui iesen ca ac e ís icas de célula mad e-
indi e enciadas (Re Ga os-Regulez 2016). En p ime luga , analizamos los ni eles de mRNA y
obse amos que an o LEFTY (1 y 2) como las SMAD p esen an una mayo exp esión a ni el
ansc ipcional en las oncos e as (Figu a 36) A ni el p o eico, los ni eles de LEFTY es án
en iquecidos en las oncoes e as, sob e odo en U251 y A172 y excep o U373, mien as que los
ni eles o ales de SMAD 2 y 5 pa ecen man ene se cons an es.
Figu a 36: Análisis de exp esión de LEFTY1, LEFTY2, SMAD2 y SMAD5 en dis in as líneas umo ales
con encionales de glioma an es y después de se cul i adas en condiciones de célula mad e como
oncos e as. A) Análisis de la exp esión de p o eína de los genes de in e és en las líneas celula es de
Glioblas oma. B) Análisis de la exp esión de los genes median e la cuan i icación de ARNm median e RT-
PCR cuan i a i a.
72
A con inuación, ealizamos un ensayo in e so al an e io men e comen ado. Lo que hicimos ue
cul i a las células mad e de Glioma de i adas de pacien es GNS166 y GNS179 en su medio
es ánda (selec i o pa a células mad e) y siguiendo un p o ocolo de di e enciación que consis e
en cul i a las en p esencia de sue o e al bo ino (FBS) y en ausencia de ac o es de c ecimien o
Fib oblás ico y Epidé mico (FGF y EGFR). De es a mane a compa amos la exp esión de LEFTY,
SMAD 2 y SMAD 5 en las líneas GNS166 y GNS179 en su o ma indi e enciada y di e enciada. Los
esul ados mos a on una cla a disminución en los ni eles p o eicos de LEFTY, y un aumen o de
SMAD 5 o al (Fig 37).
Figu a 37: Análisis de exp esión de p o eína de indicados genes en las líneas de GSCs GNS166 y GNS179 cul i adas
en condiciones de célula mad e y as 10 días en medio de di e enciación.
79
Figu a 42: La inhibición Fa macológica de LEFTY educe el c ecimien o umo al en modelos de
expe imen ación animal. Se es ablecie on dos b azos de a amien o compues os po 3 animales con 4
umo es cada uno en el g upo con ol, y 4 animales con 4 umo es cada uno en el g upo a ado. Se
inocula on 10 uL de an i-LEFTY de o ma in a umo al dos eces po semana du an e 3 semanas. A) y
B) Ralen ización del c ecimien o umo al en el g upo a ado espec o al g upo con ol. C) Ca ac e ización
inmunohis ológica de los umo es gene ados en modelos IN VIVO.

80
Figu a 43: La inhibición Fa macológica de LEFTY educe el c ecimien o umo al en modelos de
expe imen ación animal. Se es ablecie on dos g upos, uno con ol con 8 animales con un umo po
animal y o o de a amien o con 6 animales y un umo po animal. El á maco an i-LEFTY se inoculó
in a umo almen e, 5 días a la semana du an e 2 semanas, a una concen ación de 1 ug/uL:
Ralen ización del c ecimien o umo al en el g upo a ado espec o al g upo con ol. Du an e el pe íodo
de Wash Ou los e ec os del an icue po se man ienen y el c ecimien o umo al con inúa siendo lineal.
Figu a 44: La inhibición Fa macológica de LEFTY educe el c ecimien o umo al en modelos de
expe imen ación animal. Fo og a ía de compa ación en e el g upo a ado con an icue po An i-LEFTY y
el g upo con ol.
81
Figu a 45: La o mación de oncos e as p ima ias se e disminuida en las células ob enidas de umo es
a ados con an icue po An i-LEFTY.
82
8.9 EL ANTICUERPO ANTI-LEFTY ACTÚA DE FORMA SINÉRGICA CON LA
TEMOZOLOMIDA REDUCIENDO EL VOLUMEN TUMORAL EN MODELOS DE
EXPERIMENTACIÓN ANIMAL
A con inuación, decidimos lle a a cabo un nue o ensayo en el cual alo amos cual es el e ec o
sob e el c ecimien o umo al del inhibido de LEFTY cuando es e se usa de o ma combinada
con el á maco Gold s anda d en el a amien o del glioblas oma, el agen e quimio e ápico
Temozolomida.
Pa a ello inoculamos 500.000 células U87 en el ejido subcu áneo de a ones
inmunodep imidos, dejamos c ece los umo es, y cuando es os alcanza on un olumen en e
25-50 mm3 es ablecimos 3 g upos; Un g upo con ol en el que se inyec a ía placebo (DMSO), un
g upo de a amien o con Temozolomida que se inyec a ía du an e 5 días seguidos, y un e ce
g upo de a ones que se a a ían con 5 días de Temozolomida seguido de 3 semanas de
an icue po an i-LEFTY que se ía inyec ado cada 3 días. Ambos á macos ue on adminis ados
de o ma in a umo al. Realizamos mediciones del olumen umo al de o ma se iada mien as
du ó el ensayo.
En p ime luga , obse amos que los umo es alcanza on 25-50 mm3 en el día 29 pos inyección,
momen o en el que se pincha on los animales con placebo o con Temozolomida. El seguimien o
del a amien o mos ó una cla a alen ización del c ecimien o umo al en el g upo a ado con
Temozolomida (Fig 46 A). De hecho, a los 2-3 días de acaba el expe imen o (día 53 del
expe imen o) los con oles c ecie on de mane a con inua y signi ica i a has a alcanza un
olumen medio de 16003 a los 43 días de expe imen o, mien as que los a ados con TMZ no
supe a on los 250 mm3 y los seleccionados pa a se a ados ambién con an icue po es aban
en 50 mm3. Es a di e encia se man u o has a el inal del expe imen o ya que los con oles
siguie on c eciendo has a alcanza un olumen medio de 1500mm3 a los 54 días de expe imen o,
los a ados con TMZ no supe a on los 200mm3 (Fig .46 A).
A con inuación, se ealizó el a amien o con el an icue po an i-LEFTY con 9 inyecciones en e
los días 29 y 50 del expe imen o. En es e caso, se compa ó la p og esión del g upo a ado con
Temozolomida en e al a ado con Temozolomida y An icue po An i-LEFTY. De mane a no o ia,
es e úl imo g upo no solo mos ó un de enimien o del c ecimien o umo al si no la disminución
de amaño de algunos umo es. De hecho, el a amien o con LEFTY p o ocó que el olumen de
los umo es pasa a de 60 mm3 en el día 4 a 50 mm3al acaba le expe imen o el día 54 (Fig. 46 A-
B). Po el con a io, los a ados sólo con Temozolomida pasa on de 70 mm3 a 270 mm3.
El peso de los umo es as el sac i icio con i mó las di e encias en e los 3 g upos. Mien as que
los con oles enían un peso medio de 1,25 g amos, los a ados con Temozolomida alcanza on
un peso de 0,2 g amos y los de doble a amien o 0,09 g amos (Fig. 46C-D)
La inción inmunohis oquímica mos ó una signi ica i a educción de la exp esión de LEFTY 1 en
los umo es a ados en e a los con oles siendo es a mayo en el g upo de los a ados con
TMZ y an i-LEFTY (Fig 46 E)
83
Es os esul ados con i man el po encial an i- umo al an o de la Temozolomida como del
an icue po an i-LEFTY y sugie en que ambos á macos pod ían ac ua de o ma siné gica.
Figu a 46: E ec o la modulación de la ía SMAD jun o con el e ec o alquilan e de la TMZ p oducen una
disminución del olumen umo al in i o. Se es ablecie on 3 g upos, un g upo con ol con 5 animales,
o o a ado con TMZ con 15 animales y un e ce g upo a ado con TMZ y an i-LEFTY con 15 animales.
Se gene ó un umo po animal es a ez. Finalmen e ob u imos 4 umo es en el g upo con ol, 10 en
g upo TMZ y 11 en el g upo TMZ+ an i-LEFTYA. Se ealiza on 5 inyecciones dia ias de TMZ
in ape i oneal a una concen ación de 5mg /Kg y 3 inyecciones de an i-LEFTY in a umo al , 3 eces po
semana du an e 3 semanas: A) y B) Disminución del olumen umo al in i o. C) y D) Los umo es a ados
mues an un peso signi ica i amen e meno que los con oles E) Disminución de la exp esión de LEFTY en
los umo es a ados.
84
9 DISCUSIÓN
El Glioblas oma es el umo ce eb al p ima io más ecuen e y más ag esi o del SNC (Thakka
e al., 2014) Los cos es di ec os e indi ec os de es e umo suman unos 200.000 eu os po
pacien e a ado (Raize e al., 2015; Undabei ia e al., 2018). Cada año son diagnos icadas unas
1500 pe sonas en nues o país, lo que supone un g an cos e pa a nues a sociedad. A di e encia
de los que ha ocu ido con o os ipos de umo es (Ades e al., 2017; McQuade e al., 2017; S.
Yu e al., 2020), los a ances en a amien o del Glioblas oma son p ác icamen e inexis en es.
Desde la implan ación del p o ocolo STUPP en 2005 y a pesa de los nume osas líneas de
in es igación abie as en la búsqueda de nue os a amien os a macológicos, ninguno ha
mejo ado la escasa mediana de supe i encia que log a la Temozolomida ( 5 % a los 5 años )
cuando se combina con la máxima esección qui ú gica y la adio e apia (E. K. Liu e al., 2020;
S upp e al., 2005)
Como hemos comen ado p e iamen e, de las docenas de e apias in es igadas desde la
apa ición del p o ocolo STUPP solamen e dos de ellas han sido ap obadas po la FDA e
in oducidas en las guías e apéu icas pa a el manejo del Glioblas oma (Nabo s e al., 2020),
pe o ninguna de ellas ha conseguido g andes mejo as en la Supe i encia Global de los pacien es
con es a e ible en e medad. (Gilbe e al., 2014; S upp e al., 2017)
Po odo lo ela ado an e io men e c eemos que la in e sión de ecu sos en la in es igación y
es udio de nue as ías de señalización celula in oluc adas en el p oceso bilógico del
Glioblas oma que pe mi an desa olla nue as moléculas e ec i as en su a amien o es á
ampliamen e jus i icada. Siguiendo es a línea, hace años que nues o Cen o p esen a un
p oyec o de Medicina T aslacional en el que clínicos y básicos abajan en equipo cons uyendo
un lujo bidi eccional que a de la cabece a del pacien e al labo a o io y ice e sa. Den o de
es e p oyec o, comenzamos hace pocos años con la ca ac e ización de una ía de señalización
que pa ece es a des egulada en el Gliobla oma mul i o me y la búsqueda de su silenciamien o
a macológico. Dicha ía es la de LEFTY-SMAD. La cual o ma pa e de una de las más complejas,
cons an es y pleio ópicas de odas las ías de señalización celula , la ía de la supe amilia del
TGFb. (Ulloa & Tabibzadeh, 2001)
Le y (le - igh de e mina ion ac o ) es una p o eína sin e izada como p ecu so de 42kDa que
es escindida en dos de 34 y 28 kDa.(Ulloa e al., 2001) Es as p o eínas se conocen como Le y 1
( Le y A) y Le y 2 ( Le y B) y ienen un papel undamen al en la egulación de la ía de la
Supe amilia TGF b , en conc e o de la egulación de las ías Nodal y BMP . LEFTY es un inhibido
de la ía TGFb ya que impide la os o ilación de SMAD 2 y SMAD 5 (Ulloa & Tabibzadeh, 2001;
Zabala e al., 2020) , bloquea la unión de NODAL con su ecep o ansmemb ana e inac i a el
co ac o C ip o el cual es necesa io pa a el co ec o acoplamien o de NODAL al ecep o
ansmemb ana (Ulloa & Tabibzadeh, 2001) La unción p incipal y más es udiada de LEFTY y
SMAD consis e en su papel egulado de di e en es p ocesos emb iona ios (Shi a o i & Hamada,
2014) Sin emba go, ecien es publicaciones elacionan el papel de la señalización SMAD con la
ca cinogénesis, si bien , no es á de inido su papel, apa eciendo es a ía como p omo o a del
desa ollo umo al (W. Chen e al., 2019; Guo e al., 2015; X. Xu e al., 2019; Zhu e al., 2021) y
como sup eso a de umo es (Miu a e al., 2019; Zabala e al., 2020) En el caso conc e o de
LEFTY, el úl imo abajo de Zabala e al., es ablece de mane a obus a que su silenciamien o

85
educe de mane a muy se e a la ac i idad de las células mad e umo ales pos ulándolo como
una no edosa y a ac i a diana e apéu ica.
En conc e o, 2 es udios han dado alguna pincelada sob e la exp esión y unción de LEFTY en
glioblas oma. Ma sumo o e al analizó la exp esión de LEFTY en 95 mues as de egiones
pe inec ó icas de glioblas oma y obse ó que es aba ele ado (Ma sumo o e al., 2020).En
cambio Sun e al obse a on que la exp esión p o eica de LEFTY medido median e Wes e n Blo
en células de Glioma (GBM8401 y células de GBM del China Cen e o Type Cul u e Collec ion)
e a p ác icamen e inexis en e (Sun e al., 2014). En línea con es os esul ados obse amos que
la exp esión de LEFTY es he e ogenea pe o que se encuen a ele ada en la mayo ía de biopsias
humanas es ablecida en la coho e de pacien es del Hospi al Donos ia. Además, comple amos
el análisis ansc ipcional de LEFTY-1, LEFTY 2, SMAD 2 y SMAD 5 en di e en es mues as de
Glioblas oma del po al Glio is compa ándolas con mues as de ejido no umo al pa a e si se
con i maba un pa ón de exp esión obus o en e las p o eínas ci adas an e io men e. Los da os
esul an es ue on he e ogéneos pa a los 4 genes consul ados. Obse amos que los ni eles de
Exp esión de LEFTY 2 es aban ele ados, mien as que los de LEFTY 1 se encon aban
disminuidos. LEFTY 1 y LEFTY 2 ienen una homología de más del 95% y hay que es udia en
de alle las sondas usadas pa a pode da espues a a la exp esión di e encial en e ellas y con lo
obse ado a ni el de p o eína. Los ni eles de SMAD2 no pa ecen es a al e ados en 2 de las
coho es mien as que en la e ce a es án ele ados. Po úl imo, la exp esión de SMAD5 es á
ele ado en las mues as de glioblas oma de la TCGA al se compa ados con el ejido ce eb al
con ol. Es impo an e des aca que la ac i ación de SMAD se p oduce po os o ilación, da o no
ecogido en es os análisis po lo que debemos se p uden es con la in e p e ación de es os
esul ados. Es os da os he e ogéneos son cong uen es con los es udios a ce ca de la exp esión
de SMAD que se han ealizado en Glioblas oma. Zhang e al obse a on que la exp esión de
SMAD 2 es aba disminuida Glioblas oma (L. Zhang e al., 2006). Po el con a io Ho s e al
encon a on que la exp esión del ARNm de SMAD 2 aumen aba según se inc emen aba el g ado
de malignidad de los gliomas analizados (Ho s e al., 1992)
A con inuación, quisimos ob ene in o mación clínica. En conc e o, sabe si exis ía alguna
asociación en e ni eles de exp esión de LEFTY y SMAD y la supe i encia de los pacien es con
Glioblas oma.A pesa de la exis encia de los es udios mi ando exp esión de LEFTY o SMAD en
glioblas oma, no hemos encon ado ninguna publicación que a e sob e es e pun o.
Empleamos las mues as del Po al Glio is (Bowman e al., 2017) y analizamos dos coho es ,
una en la que se incluía una mezcla de mues as de Glioblas omas P ima ios, Secunda ios y
Recu en es , y o a en la que solamen e se incluían los ecu en es. Las cu as de Supe i encia
de Kaplan Meie mues an que exis e una asociación signi ica i a en e ni eles de exp esión
ele ados, an o de LEFTY 1 como de LEFTY 2, y una meno supe i encia de los pacien es, sob e
odo en aquellos que e an ecu en es, en los que la mediana de supe i encia e a de 2,4 meses
meno en aquellas mues as en los que la exp esión de LEFTY es aba aumen ado. En cuan o
SMAD no se ap ecia que haya ninguna asociación en e ni eles de exp esión y supe i encia. Sin
emba go, es os da os hacen pensa que p obablemen e LEFTY pueda ene un papel en la
pa ogénesis del Glioblas oma.
86
En el año 2005 Wei e al compa a on los genes más exp esados en líneas de células S em de
a ones y humanos y obse a on que LEFTY, en e o os ma cado es como SOX 2 , Oc 4 y
NODAL, es aba muy exp esado en células S em de ambas especies, es e esul ado les hizo
hipo e iza que LEFTY debe ene un papel impo an e en el p oceso de au o eno ación
celula en ambas especies (Wei e al., 2005).An e la ausencia de in o mación con unden e a
ce ca de la exp esión y unción de LEFTY y SMAD en el Glioblas oma, decidimos amplia nues o
análisis y lle a a cabo la ca ac e ización de la exp esión de ARN-m y p o eico en di e en es líneas
con encionales de Glioblas oma y en a ias líneas celula es de GSCs. Realizamos ambién
ensayos de di e enciación y desdi e enciación celula con las líneas an e io men e comen adas.
Empleamos como con ol de los ensayos una línea de as oci os sanos. Nues os esul ados
mues an que LEFTY es á exp esado en odas las líneas celula es siendo sus ni eles más al os en
al os en la población de células mad e de glioma de i adas de pacien es. Además, pa ece que la
exp esión de LEFTY se modi ica en unción del es ado de di e enciación celula , aumen ado
cuan o más indi e enciada es á la célula y disminuyendo cuando es a se di e encia. Es os da os
es án en línea con el abajo de Wei, lo publicado po Zabala e al, 2020 que iden i ica a LEFTY
como un gene ele an e pa a la egulación de las células mad e umo ales de mama (Ulloa e al.,
2001; Zabala e al., 2020), y po el abajo de Ma sumo o que mues a que ni eles ele ados de
LEFTY p omue en la ac i idad umo al y la adquisición de ca ac e ís icas de células mad e en
Glioblas oma (Ma sumo o e al., 2020). Ulloa e al y Zabala eo izan que LEFTY inhibe no solo al
complejo SMAD2/SMAD3/SMAD4 sino ambién a SMAD5 (Ulloa e al., 2001; Zabala e al., 2020)
lo que es compa ible con nues os esul ados que mues an que la exp esión de SMAD 2 pa ece
es a disminuida en las líneas umo ales en compa ación con las líneas sanas. La exp esión de
SMAD 5 pa ece es a aumen ada cuando las células se encuen an en una ase más di e enciada.
Según los da os an e io es queda cla o que las células de Glioblas oma p esen an una exp esión
ele ada de LEFTY y pa ece que es an o más ele ada cuando más indi e enciada sea la población
celula .
En el año 2014, Sun e al obse a on que la sob exp esión de LEFTY en células de glioblas oma
o iginaba una educción de la p oli e ación y de la in asión y un aumen o de la apop osis de
dichas células umo ales (Sun e al., 2014). Sin emba go, seis años más a de,Ma sumo o e al
es udia on LEFTY, ambién en Glioblas oma y obse a on que la hipoxia isula a o ecía la
sob eexp esión de dicha p o eína y que su sob e-exp esión eje cía un e ec o p omo iendo la
supe i encia celula al in lui sob e la apop osis, p oli e ación y ca ac e ís icas EMT/CSC,
(Ma sumo o e al., 2020)
En el año 2015 Dong e al ealiza on ensayos de silenciamien o de SMAD 2 y SMAD 3 median e
asn ección len i i al de ARN de ho quilla co a (Sh ARN) en células U251 de Glioblas oma.
Después ealiza on ensayos de p oli e ación y comp oba on que el silenciamien o del complejo
SMAD p oducía un aumen o de la p oli e ación celula en células de Glioblas oma.(Dong e al.,
2015) Ese mismo año, Yu e al publica on un a ículo en el que mos aba esul ados simila es
a los de Dong al. En p ime luga , analiza on la exp esión p o eica de SMAD 2 y 3 de mues as
de pacien es in e enidos de Glioblas oma y comp obó que la exp esión es aba ele ada. A
con inuación, silencia on SMAD 2 y SMAD 3 en células de Glioblas oma A172 y U87 median e
ans ección len i i al de ARN de ho quilla co a (Sh ARN) y ealiza on es udios de iabilidad
celula comp obando un aumen o de la p oli e ación de las células de Glioblas oma.Es a acción
pa ece es a mediada po p27 (Y. Yu & Ran, 2015). P 27 iene como unción de ene el ciclo
87
celula impidiendo que la célula en e en di isión. En condiciones no males , TGFb/SMAD
aumen a los ni eles de P27 , es a a su ez inhibe a CDK/CICLINA lo que impide que RB(p o eína
del e inobla oma ) ac i e a E2F ( ac o es de ansc ipción de genes necesa ios pa a el paso de
célula en Fase G0 a G1/S) (Dono an & Slinge land, 2000) Es e es un mecanismo median e el
cual la egulación de la ía SMAD puede a ec a a la p oli e ación de las células de Glioblas oma.
Basándonos en lo expues o an e io men e decidimos lle a a cabo una se ie de ensayos en los
cuales inhibimos la p o eína LEFTY, median e el empleo de un an icue po monoclonal an i-
LEFTY, con el cual a ábamos las células umo ales du an e 72h, pa a así egula la señalización
SMAD en es líneas con encionales de Glioblas oma (U87, U251, A172) y dos líneas de célula
mad e de Glioma (GNS166, GNS179). La iabilidad celula se io signi ica i amen e disminuida
(un 40 % menos) as la exposición celula du an e 72 ho as al an icue po monoclonal an i-
LEFTY. Pa a conoce qué p oceso biológico in luía en es a disminución de la iabilidad celula ,
decidimos cuan i ica median e es udio inmunohis oquímico ma cado es de P oli e ación (Edu
y Fos ohis ona 3), Apop osis (Caspasa 3) y Senescencia (B-Galac osidasa), en células a adas y
en células no a adas. Obse amos que el bloqueo de LEFTY gene a un aumen o mayo al 50 %
en la cuan i icación de células posi i as pa a ma cado es de Senescencia y Apop osis y una
disminución simila en los ma cado es de p oli e ación.
Como imos an e io men e, nues os esul ados y los de o os au o es indican que LEFTY debe
ene un papel impo an e en el p oceso de au o eno ación de cie as células umo ales.
Decidimos comp oba es e supues o es ando dicha capacidad de au o eno ación de células
de Glioblas oma U87 as inhibi LEFTY median e la acción de un an icue po an i-LEFTY. Pa a ello
ealizamos ensayos de o mación de oncoes e as, las cuales disg egábamos, pa a después medi
la capacidad que enían de ol e a o ma nue as es e as (2 y sphe es) Los esul ados
mos a on que las células a las que se les había inhibido LEFTY o maban un 60 % menos de
es e as que aquellas a las que no se lo había inhibido. Nues os esul ados pa ecen indica que
LEFTY iene un papel ele an e en la ca ac e ización S em de la célula de Glioblas oma y en su
capacidad de au o eno ación. En línea con nues os esul ados, Ma sumo o e al publica on un
es udio en 2018 en el que obse a on que la sob eexp esión de LEFTY en cánce de O a io
o iginaba que las células adqui iesen ma cado es mesenquimales (Vimen ina, N-Cadhe ina) y de
CSC (SOX 2, ALDH y CD 44) y su inhibición median e Sh ARN hacía que es os disminuyesen,
eo izando que LEFTY es á elacionado con las ca ac e ís icas EMT-CSC de es as células
umo ales. (Ma sumo o e al., 2018) El mecanismo median e el cual LEFTY gene a es e e ec o
no lo hemos es udiado a ni el molecula , sin emba go, a ios es udios en Glioblas oma indican
que la po enciación de la ía BMP inhibe las p incipales ca ac e ís icas de las GSC. (J. Lee e al.,
2008; Picci illo e al., 2006) Chi asani e al es udia on el papel de la ía BMP en Glioblas oma y
a i man que la exposición de Glioma S em Cell humanas y a la p o eína mo ogené ica ósea
7(BMP7) induce la di e enciación de las células mad e umo ales, a enúa la exp esión de
ma cado es de ipo mad e y educe la au o eno ación y la capacidad de iniciación umo al
median e la ac i ación del eje SMAD 1/5/8 y la consecuen e egulación nega i a del ac o de
ansc ipción Olig2.(Chi asani e al., 2010)
Hemos de des aca que los es udios que hemos analizado has a aho a lle a on a cabo
silenciamien o gené ico de LEFTY median e ans ección len i i al de Sh ARN. Nues o g upo ue
un paso más allá al emplea un an icue po monoclonal an i-LEFTY como es a egia
a macológica.
Finalmen e decidimos alo a cómo a ec a ía la inhibición de LEFTY al c ecimien o umo al de
Glioblas omas subcu áneos gene ados en modelos expe imen ales inmunosup imidos. Pa a ello
88
ealizamos dos expe imien os. En el p ime o compa amos el c ecimien o umo al en e un
g upo a ado con an icue po an i-LEFTY ( a amien o du an e diez días median e inyección
subcu ánea in a umo al de 10 μL) y un g upo con ol. En el segundo compa amos el
c ecimien o umo al en un g upo a ado exclusi amen e con TMZ du an e 5 días, un g upo
a ado con TMZ du an e 5 días + An i-LEFTY 3 semanas y un g upo con ol. Los esul ados del
p ime ensayo mos a on que los umo es en los que LEFTY había sido inhibido, mos a on un
c ecimien o alen izado espec o a los con oles, de o ma que a los 25 días de a amien o. Al
igual que en el es udio in i o, pa a escla ece qué p oceso biológico es aba as es a
ealen ización del c ecimien o umo al, analizamos los ma cado es de apop osis y p oli e ación
median e écnicas de inmunohis oquímica,en co es de umo es a ados y no a ados. La
exp esión del ma cado de apop osis (caspasa 3) ue signi ica i amen e más baja en el g upo
a ado y el ma cado de p oli e ación Ki 67 signi ica i amen e más ele ado en el g upo con ol.
El segundo ensayo mos ó que el a amien o conjun o en e TMZ y An i-LEFTY p oduce una
alen ización del c ecimien o umo al signi ica i amen e mayo que en el g upo a ado
exclusi amen e con TMZ y que, además, es e a amien o conjun o no solo alen iza si no que
disminuye el olumen en algunos umo es sugi iendo que pueda exis i un e ec o siné gico en e
ambos á macos.
Según nues os esul ados podemos deci que la inhibición de LEFY p oduce una disminución de
la capacidad umo ogénica de las células de Glioblas oma in i o e in i o debido a un aumen o
de la Apop osis y de la Senescencia y una disminución de la P oli e ación y de la capacidad de
au o eno ación. En nues o es udio no hemos analizado los mecanismos molecula es median e
los cuales es os p ocesos se lle an a cabo, sin emba go, es os pod ían debe se a la pé dida de
in lujo inhibi o io de LEFTY sob e ías de la supe amilia TGFb como son BMP y NODAL. En
células sanas y du an e las p ime as e apas del desa ollo neoplásico, la ía TGFb a o ece la
sup esión umo al(Ikushima & Miyazono, 2010; Yeh e al., 2019) median e di e en es
mecanismos como son: el con ol de la p oli e ación celula median e la ac i ación de p o eínas
como p15/INK4b , p27Kip1, p21Cip1, con la consecuen e de la de ención del ciclo celula (Chu
e al., 2008; C.-Y. Li e al., 1995) ; la ac i ación de la apop osis al in e ac ua con p o eínas como
DAPK (dea h associa ed p o ein kinase) , FAS y su e ec o BIM, SHIP que inhibe la ía de
supe i encia celula PI3K-Ak , DAXX (Dea h Associa ed p o ein six) e c (Schus e & K iegls ein,
2002) ; y median e la inac i ación de Cánce S em Cells a a és de la ac i ación de PTEN con la
consecuen e inac i ación de PI3K/AKT (Lomba do e al., 2011) o median e la down egulacioón
del ac o de ansc ipción Olig 2(Chi asani e al., 2010) . Sin emba go, e apas más a anzadas
del cánce , mu aciones en di e en es ni eles de es a ía le apo an un papel p o umo al. La
sob eexp esión de LEFTY, molécula inhibido a de la ía TGF b, puede se una de es as
al e aciones que p omue a ese e ec o p o umo al. La pleio opicidad de la ía hace di ícil
elucida qué al e aciones molecula es o iginan cada uno de los e ec os obse ados en nues a
in es igación po lo que u u os es udios más conc e os son necesa ios pa a desen ama los
complejos lujos de señales molecula es de es a ía, que pa icipan en la umo ogenicidad del
Glioblas oma.
En esumen y pa a conclui debemos sabe que la p o eína LEFTY inhibe las p o eínas SMAD, las
cuales canalizan la señalización de mul i ud de ligandos de la supe amilia TGFb y eje cen
múl iples acciones en la homeos asis celula que ienen un papel p o agonis a en el desa ollo
del cánce . Según nues os es udios la exp esión de LEFTY es á al e ada en el Glioblas oma y su
egulación median e la inhibición de LEFTY disminuye las ca ac e ís icas oncogénicas in i o e
in i o pos ulándose como una es a egia e apéu ica en el manejo del Glioblas oma.
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