Mikrobiyoloji Laboratuvar Tanı Yöntemleri Klinik Rehber

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Editörler Yasemin ZER Mustafa SAĞLAM Lyon 2025 MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Editörler Yasemin ZER Mustafa SAĞLAM Lyon 2025 Mikrobiyoloji Laboratuvar Tanı Yöntemleri Klinik Rehber Editors • Prof. Dr. Yasemin ZER • Orcid: 0000-0002-9078-9900 • Dr. Mustafa SAĞLAM • Orcid: 0000-0002-0479-3250 Cover Design • Motion Graphics Book Layout • Motion Graphics First Published • October 2025, Lyon e-ISBN: 978-2-38236-899-2 DOI: 10.5281/zenodo.17275992 copyright © 2025 by Livre de Lyon All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without prior written permission from the Publisher. The author or authors of the relevant section are responsible for any copyright infringement that may occur due to the images and graphics used in the book. The editor or publisher does not assume responsibility in this regard. Publisher • Livre de Lyon Address • 37 rue marietton, 69009, Lyon France website • http://www.livredelyon.com e-mail • [email protected] I ÖNSÖZ Klinik tanı ve tedavi süreçlerinin merkezinde yer alan, Tıbbi Mikrobiyoloji, enfeksiyon hastalıklarına neden olan etkenlerin teşhisinde doğru, hızlı ve güvenilir sonuçlara ulaşabilmeyi sağlamayı hedeflemektedir. Bu açıdan, laboratuvar yöntemlerinin bilimsel veriler ışığında modernize edilmesi laboratuvarın birincil sorumluluklarındandır. Patojen spektrumunun giderek çeşitlenmesi tanı ve tedavi protokollerinin güncellenmesini gerektirmektedir. Günümüzde teknolojideki gelişmeler klasik mikrobiyolojik yöntemlere ek olarak moleküler teknikler, immünolojik teknikler ve analitik sistemlerin kullanımı ile önemli bir değişim sağlayarak tanı sürecini çok boyutlu hale getirmiştir. Bu kitap, “Mikrobiyoloji Laboratuvar Tanı Yöntemleri: Klinik Rehber” hem öğrencilere hem de klinisyenlere sistematik olarak uygulanabilir pratik bir kaynak olarak hazırlanmıştır. Bu bağlamda tanı algoritmalarını sistematik, kapsamlı ve kanıta dayalı sunan bu eserde, temel mikrobiyolojinin etik ilkelerinden ileri moleküler yöntemlere, örnek alımından raporlanmasına, besiyeri hazırlama yöntemlerinden bakteri tanımlanmasına kadar çeşitli yöntem ve teknikler bilimsel ilkeler çerçevesinde ele alınmıştır. Rehber niteliği taşıyan bu kaynak, klinisyenlerin karar verme süreçlerinde laboratuvar sonuçlarının etkinliğini ve güvenilirliğini desteklemek, doğru tedavi ve hasta güvenliğine katkıda bulunması hedeflenmiştir. Bu eserle, sadece mevcut bilgi birikimini bir araya getirmek ve aktarmakla kalmayıp geleceğe ışık tutmak amaçlanmıştır. Antimikrobiyal direnç, hızlı tanı testleri, yeni nesil dizileme teknolojileri ve yapay zeka destekli tanı uygulamaları gibi çağdaş konulara değinilmesi kitabın güncel ve ileriye dönük bir bakış açısını ortaya koymaktadır. Çok kıymetli yazarlar tarafından kaleme alınan bu eserin, sağlık profesyonelleri, öğrenciler, araştırmacılar, klinisyenler için başvuru ve yol gösterici bir kaynak olacağına inanmaktayız. Emeği geçen tüm yazarlara ve kendilerine yol gösterici olarak seçen okurlarımıza sonsuz teşekkürlerimizi sunarız. Prof. Dr. Yasemin ZER Dr. Mustafa SAĞLAM III CONTENTS ÖNSÖZ I BÖLÜM I. LABORATUVAR ETİĞİ 1   BüşraAĞCA BÖLÜM II. ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ 7   KaanÇEYLAN BÖLÜM III. STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ 31   YektaMOGUL BÖLÜM IV. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN EKİPMANLAR VE ÖZELLİKLERİ 47   EsraNurSİZER BÖLÜM V. MİKROORGANİZMALARIN BOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ 61   ElifKESKİN BÖLÜM VI. BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI 77   HaticeBİRGİN BÖLÜM VII. BAKTERİ METABOLİZMASI 105   EsraÖZ BÖLÜM VIII. BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER VE KULLANILAN YÖNTEMLER 113   YaseminZER BÖLÜM IX. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ 133   MerveÖZEROL IV   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER BÖLÜM X. MİKOBAKTERİLERDE TANI YÖNTEMLERİ 147   DenizGAZEL BÖLÜM XI. PARAZİT ENFEKSİYONLARININ TANI YÖNTEMLERİ 159   GönençÇALIŞKANTÜRK BÖLÜM XII. MANTAR ENFEKSIYONLARININ TANI YÖNTEMLERI 183   SalihaGökçeALAGÖZ BÖLÜM XIII. MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİ TANI YÖNTEMLERİ 203   MustafaSAĞLAM BÖLÜM XIV. İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER 247   MehmetERİNMEZ BÖLÜM XV. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ 259   FeyzaNurARIMAN 7 BÖLÜM II ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ SampleCollectionMethodsandTransfertoLaboratories Kaan ÇEYLAN1 1(Uzm. Dr.), T.C. Sağlık Bakanlığı Ergani Devlet Hastanesi E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-8493-2715 1. Giriş Mikrobiyoloji laboratuvarlarında yapılan testlerin sonuçlarının doğruluğunun en önemli etkenlerinden birisi, numunelerin doğru şekilde alınıp, toplanarak, uygun koşullar altında laboratuvara ulaştırılmasıdır. Bu husus sadece test sonuçlarının doğru olup olmamasını değil, aynı zamanda sunulan sağlık hizmetinin kalitesini de etkilemektedir. Numunelerin doğru bir şekilde alınarak, laboratuvara ulaştırılmasını kapsayan analiz öncesi süreçler, T.C. Sağlık Bakanlığı Sağlıkta Kalite, Akreditasyon Ve Çalışan Hakları Daire Başkanlığı tarafından 2020 yılında yayınlanan SKSHastane rehberinin 6.1 numaralı sürümünde de belirtilmiş ve ilgili rehberin Mikrobiyoloji Laboratuvarı başlığında numune alımı ve transferini kapsayan preanalitik süreçlere ait SML02 ve SML03 alt başlıkları “Çekirdek Gösterge”ler olarak tanımlanmıştır. Bu bölümde, mikrobiyoloji laboratuvarında çalışılan testlerin doğru olması ve sağlıkta kalite standartlarını karşılayabilmesi için doğru örnek alımı yöntemleri ve uygun koşullarda laboratuvara transferinin sağlanması açıklanacaktır. 8   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 2.SolunumSistemiÖrneklerininAlınmaYöntemleriveLaboratuvara Transferi 2.1.BalgamÖrnekleri Uygun şekilde alınmış balgam örnekleri özellikle, alt solunum yolu enfeksiyonlarının tanısı için oldukça önemlidir. Uygun şekilde alınmış balgam örneği makroskobik olarak, mikroskobik olarak, kültür ile ve moleküler yöntemlerle incelenerek çeşitli enfeksiyon hastalıklarının tanımlanması için son derece değerlidir. Kendiliğinden balgam çıkarabilen hastalar, işlem öncesi ağızlarını steril su ya da izotonik serum fizyolojik ile çalkaladıktan sonra, derin bir öksürükle bir defada vida kapaklı steril bir kabın içerisine çıkarmalıdırlar. Hasta kendiliğinden balgam çıkaramıyor ise, indüklenmiş balgam örneği alınabilir. İndüklenmiş balgam örneği sulu görünümünden dolayı tükürük ile karıştırılmamalıdır. İndüklenmiş balgam almak için, hastaya ılık hipertonik tuzlu su, nebulizatör ile 10 dakika kadar solutulur. Ardından derin bir öksürük ile en az 10 mL kadar balgam elde edilmeye çalışılır. Balgam veya indüklenmiş balgam örneği alınırken sabah ilk çıkarılan balgamın alınması uygundur. Ayrıca hasta diş protezi kullanıyorsa işlem öncesi çıkarması gerekmektedir. Balgamın antibiyotik tedavisi öncesi alınması kültür için alınan balgam örneklerinde etkenin izolasyon şansını arttıracaktır. Alınan balgam örneği 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Balgam örneğini evde verip laboratuvara teslim etmek isteyen hastalara bu husus dikkatlice açıklanmalıdır. 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılamayacak balgam örnekleri +2-8°C arasındaki sıcaklıklarda 24 saat kadar bekletilerek laboratuvara ulaştırılabilir. Balgam oda ısısında 2 saatten fazla bekletilirse aşırı üreyen flora bakterileri nedeniyle enfeksiyon etkeni olabilecek bakterilerin izolasyon oranları düşmektedir. Mycoplasma pneumonia ve Chlamydia pneumonia tanısında moleküler test yapılması için alınan balgam örnekleri +2-8°C arasında 48 saate kadar bekletilebilmektedir. Balgam örneklerinden virolojik inceleme amaçlı moleküler test çalışılacaksa, alınan balgam örneği 1 saate kadar oda ısısında saklanabilir. 1 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılamayacaksa 2 güne kadar +4°C’de; 2 günden uzun süre saklanacaksa -80°C’de saklanabilmektedir. Hastanın balgam veremeyeceği durumlarda, trakealaspirat, bronkoalveolar lavaj sıvısı, bronkoalveolar lavaj yıkama sıvısı, akciğer biopsi örneği de mikrobiyolojik inceleme için kullanılabilir. ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   9 2.2.BoğazSürüntüÖrnekleri Uygun şekilde alınan boğaz sürüntü örnekleri, hızlı antijen testleri, kültür ve moleküler testlerin yapılmasına olanak sağlamaktadır. Hızlı tanı testlerinin kültür ile bir arada yapılacağı ya da hızlı tanı testinin sonucuna göre kültür yapılması gereken durumlarda boğaz sürüntüsü almak için çift uçlu eküvyonlar kullanılabilmektedir. Boğaz sürüntüsü alırken, ışık kaynağının yeterli olması gerekmektedir. Gerek görülürse bir dil basacağı kullanılarak dile hafifçe bastırılabilir. Bu sırada tonsiller ve farenks membran varlığı açısından da makroskobik olarak muayene edilmelidir ve bu membranlar kültür materyali olarak alınarak steril taşıyıcı içerisinde, en geç 2 saatte oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Eküvyon, örnek alınan bölge dışında ağzı içinde hiçbir yere dokundurulmamalıdır. Örnek farinks arka duvarı ile tonsillerden alınır. Lezyon görülen alanlarda da örnek alınarak eküvyon, varsa taşıyıcı besiyeri içerisinde, yoksa nemli bir şekilde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Örnek hemen laboratuvara ulaştırılamayacaksa, 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Örnek alırken epiglottis kızarık ya da inflamasyonlu görünüyorsa eküvyon epiglottise değdirilmemelidir, yoksa solunum yolunda tıkanıklığa yol açabilir. Ayrıca, oral-genital temasta bulunan erişkinlerde de arka farenks, tonsiller ya da lezyon bulunan bölgeden örnek alınabilir. Alınan örnek kömür içeren taşıyıcı besiyerinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Numune 24 saate kadar oda sıcaklığında bekletilebilir. Etken olarak Neisseria gonorrhoeae düşünüldüğünde örnek kömür tozlu taşıma besiyerinde taşınmalı ve en geç 12 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Anaeropların etken olduğu düşünüldüğü durumlarda ise anaerop taşıma sistemleri kullanılarak 24 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Viral etkenler düşünüldüğünde ya da moleküler çalışmalar yapılacak ise nazofarenks örneklerinin tercih edilmesi daha uygundur. Ancak dakron uçlu bir eküvyon yardımıyla eküvyon ucu örnek alınacak bölgeye bastırılarak 360° çevrilmesiyle alınan örnekler de kullanılabilir. Örnek alınır alınmaz, örnek alınan eküvyon viral trasnport media (VTM) içerisine konulmalıdır. Alınan sürüntü örnekleri 1 saate kadar oda ısısında saklanabilir. Bir saat içerisinde laboratuvara ulaştırılamayacaksa 2 güne kadar +4°C’de; 2 günden uzun süre saklanacaksa -80°C’de saklanabilmektedir. 2.3.BurunÖrnekleri Burun örnekleri hem enfeksiyon etkenlerinin araştırılması, hem de taşıyıcılık araştırılması açısından önemlidir. Burun örneği alırken, steril eküvyon 10   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER ile burun deliklerine girilerek, nazal mukozadan örnek alınır. Alınan örnek nemli bir taşıyıcıda ya da transport besiyeri içerisinde en geç 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılamayacak örnekler 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Burun sürüntüsü, ilk tercih olmasa da, virolojik amaçlı moleküler tanıda kullanılabilir. Bu amaçla, dakron uçlu bir eküvyon yardımıyla eküvyon ucu örnek alınacak bölgeye bastırılarak 360° çevrilmesiyle alınan örnekler de kullanılabilir. Örnek alınır alınmaz, örnek alınan eküvyon viral trasnport media (VTM) içerisine konulmalıdır. Alınan sürüntü örneği 2 saate kadar oda sıcaklığında, 2 saatten 48 saate kadarda +4°C’de bekletilebilir. Eğer moleküler çalışma yapılacaksa -70°C’de ya da kuru buzda muhafaza edilmesi gerekmektedir. 2.4.NazofarenksÖrnekleri Nazofarenks sürüntü örneği alırken, gövdesi esneyebilen dakron uçlu eküvyon kullanılarak, burundan nazofarenkse girilir. Eküvyon birkaç saniye bekletildikten sonra yavaş bir şekilde çevrilir. Streptococcus penumonia için alınan nazofarengeal sürüntü örneği, 6 saate kadar +4°C’de yağsız süt-tripton glikoz-gliserin içeren taşıyıcı içerisinde bekletilebilir. 6 saatte laboratuvara ulaştırılamayacaksa 48 saate kadar +4°C’de kömür içeren transport besiyerinde bekletilebilir. Haemophilus influenzae için alınan nazofarengeal sürüntü örneklerinin en geç 15 dakika içerisinde (mümkünse hastabaşı ekim) ekilmesi gerekmektedir. Branhamella catarrhalis ve Neisseria meningitidis için alınan sürüntü örneklerinin de hasta başı ekimi en uygun yöntemdir. Mümkün değilse 6 saat içerisinde oda ısısında kömürlü taşıma besiyeri ile laboratuvara ulaştırılmalıdır. Bu da mümkün değilse 72 saate kadar +4°C’de kömürlü transport besiyerinde bekletilebilir. Nazofarensk sürüntüsü virolojik amaçlı moleküler tanıda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla, dakron uçlu bir eküvyon yardımıyla eküvyon ucu örnek alınacak bölgeye bastırılarak 360° çevrilmesiyle alınan örnekler de kullanılabilir. Örnek alınır alınmaz, örnek alınan eküvyon viral trasnport media (VTM) içerisine konulmalıdır. Alınan sürüntü örneği 2 saate kadar oda sıcaklığında, 2 saatten 48 saate kadarda +4°C’de bekletilebilir. Eğer moleküler çalışma yapılacaksa -70°C’de ya da kuru buzda muhafaza edilmesi gerekmektedir. Nazofarenksten alınabilecek bir başka örnek de nazofarengeal aspirattır. Nazofarengeal aspirat, hasta sırt üstü yatar iken, burnundan nazofarenkse uzatılan bir kateter yardımıyla, SF verilip 2 mL kadarının aspire edilmesiyle ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   11 alınmaktadır. Alınan aspirat örneği 2 saate kadar oda sıcaklığında, 2 saatten 48 saate kadarda +4°C’de bekletilebilir. Eğer moleküler çalışma yapılacaksa -70°C’de ya da kuru buzda muhafaza edilmesi gerekmektedir. 2.5.KulakÖrnekleri Kulaktan dış kulak yolu ve orta kulak sıvısı örnekleri alınabilmektedir. Alınacak örneklerin mutlaka bir kulak-burun boğaz hastalıkları uzmanı tarafından alınması gerekmektedir. Dış kulak yolu sürüntü örneği alırken, dış kulak yolunda krut ya da kurumuş sekresyonlar ıslatılmış bir eküvyonla temizlenir. Başka bir eküvyonla dış kulak yolundan örnek alınır. Gram boyama yapılacaksa ayrı bir eküvyonla da onun için örnek alınır. Alınan örnekler oda ısında 2 saat içerisinde Amies transport besiyerinde laboratuvara ulaştırılır. 2 saat içerisinde ulaştırılamayacak örnekler 24 saate kadar +4°C’de bekletilebilir. Orta kulak sıvısı örneği alınırken, kulak zarı temizlendikten sonra en az 1 mL örnek aspire edilmelidir. Kulak zarı sağlam değilse ya da hastada tüp mevcutsa esnek, ince bir eküvyonla örnek alınır. Alınan örnekler oda ısında 2 saat içerisinde steril bir tüp içerisinde laboratuvara ulaştırılır. 2 saat içerisinde ulaştırılamayacak örnekler 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Otitis media tanısı için, farenks, nazofarenks ve burun örneklerinin tanısal değeri yoktur. 2.6.DiğerÖrnekleri Sinüzit tanısında sinüs aspirasyon ya da biyopsi örnekleri uygundur. Sinüzit tanısı amacıyla burun ya da nazofarenks sürüntüsü ile balgam ve tükürük örneklerinin tanısal değeri yoktur. Maksiller sinüsten aspirasyon örneği alırken, maksiller sinüse bir iğne ile girilerek aspire edilir. Eğer yeterli aspirat elde edilemezse önce 2 mL SF enjekte edilerek daha sonra bu sıvı aspire edilebilir. Sinüste biriken irin drene olmuşsa, sinüs girişindeki meatustan eküvyonla da örnek alınabilir. Ancak bu yöntem sadece yetişkinler için geçerli olup, çocuklarda kolonizasyon olabileceği için önerilmez. Alınan aspirasyon örneği en kısa sürede oda sıcaklığında laboratuvara iletilir. Eküvyonla alınan örnek oda sıcaklığında transport besiyerinde 2 saatte laboratuvara iletilir. Örnekler hemen laboratuvara ulaştırılamayacaksa 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Sinüs biyopsi örneği, mutlaka bir kulak, burun ve boğaz hastalıkları uzmanınca cerrahi girişimle alınır. Alınan örnek oda ısısında 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılır. 12   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Vincent anjini ve Lemierre hastalığı şüphesi olduğunda, lezyondan biyopsi, aspirasyon materyali ya da yıkama materyali alınabilir. Alınan örnekler oda sıcaklığında 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılır. 2 saatte laboratuvara ulaştırılamayacak örnekler, 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Lemierra hastalığı tanısı için en az 2 set olmak şartıyla kan kültürü de alınabileceği unutulmamalıdır. Parotit tanısında parotis bezinden alınan aspirasyon sıvısı değerlidir. Alınan aspirasyon sıvısı en geç 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Farengeal ya da tonsiller bölgelerde yer alan abselerin tanısında apse aspirasyon materyali tanı için değerlidir. Alınan materyal oda ısısında 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saatte ulaştırılamayacak örnekler 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir. Nazofaringeal yıkama ve/veya aspirasyon sıvısı, boğaz çalkantı suyu, nazal yıkama ve/veya aspirasyon sıvısı, trakeal aspirat, bronkoalveolar lavaj sıvısı ve doku biyopsi örnekleri de virolojik amaçlı moleküler tanıda kullanılabilmektedir. Alınan örnekler steril bir tüpte boş olarak ya da VTM içerisinde soğuk zincir ile laboratuvara teslim edilebilir. Alınan örnekler 2 saate kadar oda sıcaklığında, 2 saatten 48 saate kadarda +4°C’de bekletilebilir. Eğer moleküler çalışma yapılacaksa -70°C’de ya da kuru buzda muhafaza edilmesi gerekmektedir. 2.7.TüberkülozTanısındaÖrnekYönetimi Tüberküloz, akciğer tüberkülozu ve akciğer dışı tüberküloz olarak sınıflandırılabilir. Akciğer tüberkülozunda en sık kullanılan örnek türü balgamdır. Balgam örneği verecek olan hastaya örneğin nasıl verilmesi gerektiği ayrıntılı bir şekilde anlatılmalıdır. Akciğer tüberkülozu şüphesinde balgam örneği alırken en uygun yaklaşım 3 gün üst üste sabah ilk balgam örneğinin alınmasıdır. Eğer 3 gün üst süte sabah balgamı alınamayacaksa, ilk balgam hastanın kliniğe başvurduğu esnada, ikinci balgam ertesi gün sabah evde, üçüncü balgam ise hasta ikinci balgam örneğini teslim ederken ya da üçüncü gün sabahı evde olmak üzere, en az bir balgam örneğinin sabah ilk balgamı olması gerekmektedir. Balgam verecek hastaya steril vida kapaklı bir kap verilir. Hastanın balgam vereceği sabah hiçbir gıda maddesi tüketmeden, dişlerini fırçalayıp ağzını iyice çalkalaması gerekmektedir. İşlem önce ılık su içmek de balgam verme işlemini kolaylaştırmaktadır. Yine hastanın yapacağı hafif egzersiz de hastanın balgam çıkarmasını kolaylaştırmaktadır. Eğer balgam verilecek ortamda uygun bir izolasyon odası yoksa, hastanın kalabalık olmayan bir ortamda, mümkünde ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   13 güneş alan bir yerde, balgam örneğini vermesi en uygunudur. Daha sonra hasta derin bir nefes alıp bir süre nefesini tutup kuvvetli bir öksürük ile balgamı direk kabın içine çıkarmalıdır. Kabın ağzını dikkatlice kapatarak iki saat içerisinde laboratuvara ulaştırmalıdır. Ayaktan balgam çıkaramayan hastalara nebülizatör yardımı ile yavaşça SF solutularak derin ve kuvvetli bir öksürük ile indüklenmiş balgam da elde edilebilir. İndüklenmiş balgam alındığında bu durum mutlaka istem formunda belirtilmelidir. Ne balgam ne de indüklenmiş balgam veremeyen bir hasta olduğu takdirde 5-10 mL bronkoalveolar lavaj sıvısı, 5 mL SF içerisine alınan bronşial fırçalama örneği ya da en az 3 mL olmak şartıyla trakeal aspirat da alınabilir. Nörolojik bir hastalığı bulunan veya koma halinde bulunan hastalar ile 10 yaşından küçük çocuklarda balgam yerine açlık mide suyu da alınabilir. Açlık mide suyu, yaklaşık 8 saatlik açlığı takip eden sabah, hasta henüz hiç yatağından kalkmadan, 25-50 mL SF nazogastrik tüp ile verilip, ardından aspire edilerek alınabilir. Alınan açlık mide suyu örneği, örneğin 5-10 mL’si başıma 100 mg nötralize edilip, bu şekilde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Yukarıdaki yöntemlerle uygun örnek alınamazsa larinks sürüntüsü ya da akciğer biopsi örneği de akciğer tüberkülozu incelemesi amacıyla kullanılabilir. Akciğer dışı tüberküloz için, tutulum olduğu şüphelenilen bölgelerden çeşitli örnekler alınabilmektedir. Üriner sistem tüberkülozu için, dış ürogenital bölge temizlendikten sonra alınan en az 40 mL sabah idrarı uygundur. İdrar alınamayan hastalardan kateter yardımıyla veya suprapubik aspirasyon ile örnek alınabilir. İntestinal tüberküloz şüphesinde 3-5 gr dışkı örneği alınabilir. Santral sinir sistemi tutulduğundan şüphelenilirse, en az 2 mL beyin omurilik sıvısı örneği alınabilir. Plevra, perikard, periton veya eklem sıvısı da en az 10 mL alınmak şartıyla uygun örneklerdir. Deri tutulumu durumunda da lezyonlu bölgeden apse içeriği ya da aspire edilmiş olan sıvı uygun örneklerdir. İnvaziv teknikler ile tanı konulamadığı durumlarda biyopsi örneği de alınabilir. Yaygın tüberküloz şüphesi durumunda ya da nedeni bilinemeyen ateş olgularında kan ve kemik iliği örnekleri de uygun örneklerdir. Aseptik şartlarda heparin ya da SPS içeren tüplere alınan kan ve kemik iliği örnekleri ya da mikobakteri kan kültürü besiyerine alınan örnekler de uygun örneklerdir. Örneklerin kurum içinde ya da kurum dışında taşınması durumunda Enfeksiyöz Madde ile Enfeksiyöz Tanı ve Klinik Örneği Taşıma Yönetmeliği’ne uygun şartlarda taşınması önemlidir. Örnekler laboratuvara 1 saat içinde ulaşacaksa oda ısında, 1 saati aşacaksa 24 saate kadar +4°C’de muhafaza edilmelidir. Ancak beyin omurilik sıvısı, kemik iliği ve kan örnekleri asla 14   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER buzdolabına konmaz, +4°C’de saklanmazlar. Moleküler test çalışılmayacaksa beyin omurilik sıvısı, kemik iliği, kan ve diğer steril vücut sıvısı örnekleri asla EDTA içeren tüplere alınmazlar. Latent tüberküloz tanısı için hastadan kan alınarak ELISA ya da ELISPOT testleri çalışılabilmektedir. ELISA temelli testlerde kan örneği özel tüplere alınır. ELISPOT testlerinde ise kan örneği EDTA içeren tüplere alınır. Alınan örnekler en kısa sürede laboratuvara ulaştırılır. Test o an çalışılmayacaksa üretici firma önerileri doğrultusunda, üretici firma aksi bir öneride bulunmamışsa çalışılana kadar +4°C’de bekletilebilir. 2.8.Mantarenfeksiyonlarındaörnekyönetimi Solunum yollarını tutan mantar enfeksiyonu şüphesinde tanı için enfeksiyon odağının lokasyonu dikkate alınmalıdır. Dış kulak yolu gibi invaziv olmayan girişimlerle ulaşılabilen lezyonlarda eküvyonla sürüntü alınıp, transport besiyeri içerisinde en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır. Hemen laboratuvara ulaştırılamayacak örnekler 2 güne kadar +4°C’de bekletilebilmektedir. Eküvyon yardımıyla alınamayacak örnekler için aspirasyon materyali ya da SF enjeksiyonu sonrası elde edilen yıkama sıvısı da kullanılabilir. Steril bir kaba alınan aspirasyon sıvısı ya da yıkama materyali de sürüntü örnekleri için belirtilen sürelerde laboratuvara ulaştırılmaldır. Balgam, trakeal aspirat, bronkoalveolar lavaj sıvısı da mantar enfeksiyonlarının tanısı için değerli örneklerdir. Ağzı vida kapaklı steril kaplara alınan örnekler de diğer yukarıda belirtilen süreler içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Ancak alınan alt solunum yolu örneklerinde Pneumocystis jirovecii şüphesiyle immunfloresans boyama yapılacaksa örnek +4°C’de 7 gün kadar saklanabilir. Aspergillus şüphesi bulunan hastaların bronkoalveolar lavaj sıvısı örneklerinden galaktomannan antijeni de saptanabilmektedir. İnvaziv enfeksiyon şüphesinde hasta serumunda galaktomannan, β-1-3-D-glukan, ya da Cryptococcus kapsül antijeni de çalışılabilmektedir. 3. Genitoüriner Sistem Örneklerinin Alınma Yöntemleri ve Laboratuvara Taşınması 3.1.İdrarörnekleri Orta akım idrarı, idrar yolu enfeksiyonlarında en sık tercih edilen örnek türüdür. İdrarın ilk kısmı dışarı atılır. Ardından gelen 10-50 mL’lik kısım vida kapaklı steril idrar kabına alınır. Ardından gelen idrar dışarı atılır. Kabın kapağı ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   15 derhal kapatılır. İdrar verme işlemi öncesi ilk olarak hastanın ellerini sabunlu suyla yıkaması gerekmektedir. Sünnetli erkek hastalarda herhangi bir temizlik işlemine gerek yok iken, sünnetsiz erkek hastalarda bir gazlı bez sabunlu su ile ıslatılarak penis başı silinir, ardından sadece su kullanılarak ıslatılmış bir gazlı bez ile durulanır. Kadınlarda, hasta temizlik ve idrar örneğini verme süresince bir eliyle labiumları açık tutmalıdır. Diğer eliyle önce sabunlu su ile sonra sadece su ile ıslatılmış gazlı bez yardımıyla üretral ve vajinal bölgeyi arkadan öne doğru silmelidir. Temiz idrar, özellikle bebekler olmak üzere orta akım idrar verebilecek durumda olmayan hastalar için kullanılır. Temiz idrar alırken de orta akım idrar gibi perine temizliği yapılıp idrarın ilk kısmı atılmadan idrar kabına alınmalıdır. Bebeklerde ise bu amaç için cinsiyete uygun idrar torbaları kullanılır. Torba takıldıktan sonra 30 dakika içinde torbaya idrar yapılmamış ise torba yenisi ile değiştirilmelidir. İdrar veremeyen hastalarda kateter ile de idrar örneği alınabilmektedir. Hastanın üriner kateteri yoksa, hastaya kateter takılarak gelen ilk 15mL’lik idrar dışarı atıldıktan sonraki idrar steril kaba alınabilir. Kateteri bulunan hastalarda ise kateterin üretraya yakın bölümü temizlenir. Temizlenen bölgenin distalinden klemplenerek idrar akışının durması sağlanır. Biriken idrar enjektör ile aspire edilerek örnek alınır. Kateterli hastadan örnek alırken, kateter takıldıktan sonraki ilk 72 saat içerisinde örnek alınması gereklidir. Ayrıca kateterli hastanın idrar torbasından örnek alınması uygun değildir. İdrar veremeyen hastalardan numune almanın bir diğer yöntemi de suprapubik aspirasyondur. Ayrıca anaerop enfeksiyon şüphesinde de suprapubik aspirasyonla idrar alınması uygundur. Suprapubik bölge temizlendikten sonra enjektör ile mesaneye girilerek idrar örneği alınır. İdrar, parazitolojik enfeksiyonların tanısı için de kullanılabilmektedir. Trichomonas vaginalis şüphesi olan hastalarda steril bir kaba ilk gelen 10-15 mL’lik idrar; başka bir steril kaba ise 10 mL’lik orta akım idrar alınır. Schistosoma haematobium şüphesinde ise 24 saat toplanmış idrar ya da yoğun aktivite sonrası elde edilen gündüz idrarı kullanılabilir. Gündüz idrarı alınacaksa en az 3 gün üst üste alınmalıdır. Prostatit şüphesi olan hastalarda prostat sıvısı da mikrobiyolojik tanı için kullanılabilmektedir. Bu amaçla iki veya dört örnekli yöntemler kullanılabilmektedir. İki örnekli yöntemde orta akım idrarı ve prostat masajı sonrası gelen sekresyon değerlendirilir. Dört örnekli yöntemde ise ilk idrar, orta akım idrar, prostat masajı ile elde edilen sekresyon ve prostat masajı idrar örneği alınabilir. 16   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER İdrarda etkenin kendisinin araştırılabileceği gibi antijenik yapıların tanıda yardımcı olduğu durumlarda vardır. L. pneumophila ve S. pneumoniae’ya ait antijenik yapılar idrardan araştırılarak tanıya yardımcı olunabilir. Alınan idrar ve protat sıvısı sekresyon örnekleri moleküler çalışma yapılmayacaksa 1 saate kadar oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Transfer süresinin 1 saati aşacağı durumlarda +4°C’de bekletilmelidirler. Yalnızca S. haematobium için alınan öğlen idrarı 24 saate kadar, günlük biriktirilen idrar ise 48 saate kadar oda ısısında bekletilebilmektedir. Moleküler test çalışılacağı durumlarda alını örnek 24 saate kadar +4°C’de bekletilebilmektedir. Süre daha da uzayacaksa ya da örnek başka merkeze gönderilecekse idrar örneği santrifüj edilerek elde edilen süpernatant fosfatlı tampon solüsyonu içerisinde -70°C’de saklanabilir. 3.2.Kadıngenitalsistemörnekleri Kadın genital sistem enfeksiyonlarında en sık tercih edilen örnek, steril eküvyonla alınan vajinal sürüntü örneğidir. Alınan örnek transport besiyeri içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Alınan örnek oda sıcaklığında 24 saate kadar bekletilebilir. Endoservikal sürüntü örneği de kadınlarda genital sistem enfeksiyonlarında oldukça değerli örnekler arasındadır. Endoservikal sürüntü örneği alırken hasta litotomi pozisyonunda olmalı ve serviks bir spekulum yardımıyla görünebilmelidir. Örnek eküvyon ya da endoservikal fırça yardımıyla alınmalıdır. Endoservikal kanala 1 cm kadar girilerek, eküvyon ya da endoservikal fırça döndürülmeli ve skuamokolumnar bileşkeden de örnek alındığından emin olunmalıdır. Örnek taşıma besiyerinde oda sıcaklığında laboratuvara gönderilmelidir. 24 saate kadar oda sıcaklığında bekletilebilir. Dış genital bölgede yer alan lezyonlarda sürüntü ya da kazıntı örnekleri de alınabilir. Lezyon eritem şeklindeyse, üzeri SF ile temizlendikten sonra eküvyon ile örnek alınabilir. Lezyon ülser ya da vezikül şeklindeyse üzeri gazlı bez ile temizlendikten sonra, varsa kabuk kaldırılarak kabuğun altındaki eküvyon ya da enjektörle alınmalıdır. Lezyonda sifiliz şüphesi varsa ve karanlık alan mikroskobisi yapılacaksa, lezyondaki sıvı direk lama alınıp üzerine lamel kapatılmalıdır. Karanlık alan mikroskobisi yapılacak örnek, alındıktan sonra 15 dakika içerisinde incelenmelidir. Alınan diğer örnekler transport besiyeri içerisinde oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Hemen laboratuvar ulaştırılamayacak örnekler 24 saate kadar oda sıcaklığında bekletilebilir. Haemophilus ducreyi şüphesiyle alınan örnekler +4°C’de laboratuvara ulaştırılmalı, mümkün değilse 24 saate kadar yine +4°C bekletilmelidir. ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   23 örnekler ilk yarım saat oda sıcaklığında, sonrasında 1 güne kadar +4°C’de bekletilebilir. Virolojik inceleme yapılacak örnekler ilk gün +4°C’de, daha uzun süre saklanacaksa -70°C’de saklanabilmektedir. Parazitolojik inceleme yapılacak örnekler en kısa sürede oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Mikolojik inceleme yapılacak örnekler ise 1 güne kadar oda sıcaklığında bekletilebilmektedir. 5.5.Duodenunörnekleri Şüpheli organizmalar bakteriyel ya da paraziter etkenler olduğunda duodenum içeriği de incelenebilmektedir. Geniş ağızlı, vida kapaklı bir kap içerisine alınan en az 1 mL hacmindeki duodenum örneği uygundur. Alınan örnek en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalı, transfer süresi 30 dakikaya aşacaksa 24 saate kadar +4°C’de saklanabilmektedir. Örnek parazitolojik inceleme için alındıysa uygun bir fiksatif içerisinde bekletilmesi uygun olacaktır. 5.6.Safratubajıörnekleri Şüpheli organizmalar bakteriyel ya da paraziter etkenler olduğunda safra tubajı da duodenum içeriği gibi incelenebilmektedir. Geniş ağızlı, vida kapaklı bir kap içerisine ya da anaerop taşıma sistemi içerisine alınan safra tubajı örneği uygundur. Alınan örnek en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalı, transfer süresi 30 dakikaya aşacaksa 24 saate kadar +4°C’de saklanabilmektedir. Örnek parazitolojik inceleme için alındıysa uygun bir fiksatif içerisinde bekletilmesi uygun olacaktır. 5.7.Analörnekler Anal bölgeden paraziter inceleme için sürüntü ya da selofan bant yöntemiyle örnek alınabilir. Sürüntü örneği, hafifçe ıslatılmış bir eküvyon yardımıyla yumurtaların toplaması yoluyla elde edilir. Selofan bant yöntemindeyse bir lama yapışık olan bant hafifçe kaldırılarak anal bölgeye 4-5 defa sürerek, tekrar lama yapıştırılır. Örnekler sabah uyanır uyanmaz, hasta tuvalete gitmeden önce alınmalıdır. Alınan örnek 48 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 6. Cilt, Yumuşak Doku ve Göz Örneklerinin Alınma Yöntemleri ve Laboratuvara Taşınması 6.1.Yaraörnekleri Yara örneği almadan önce, varsa yaranın üzerindeki kurumuş kabuklar kaldırılmalıdır. Yara yeri SF ile temizlenmelidir. Yara üzerinde bulunan eksuda 24   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER da temizlendikten sonra temiz bir eküvyon ile yaranın enfekte olduğu düşünülen kısmından örnek alınır. Yara derin ise, mikobakteri aranacaksa ya da ısırık yarası ise eküvyon ile örnek alımı önerilmez. Eküvyon ile örnek alındığında örnek bir transport besiyerinde taşınmalıdır. Boyama ve farklı kültürler yapılacaksa, her işlem için ayrı örnek alınmalıdır. Alınan örnek 24 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Isırık yaralarından yara tabanından alınan biyopsi veya aspirasyonla alınan örnekler uygundur. Örnek almadan önce cilt dezenfekte edilmeli, yara SF ile yıkanmalıdır. Biyopsi ve ya aspirasyon materyali alınamaz ise eküvyon ile alınan sürüntü örneği de uygundur. Alınan örnekler anaerop taşıma sisteminde 2 saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Yanık yaralarında bakteriyel kolonizasyon gelişip gelişmediğinin değerlendirilmesi için haftada iki kez yara sürüntü kültürünün yapılması değerlidir. 6.2.Abseveaspiratörnekleri Mikrobiyolojik açıdan inceleme için, aspirat örnekleri ve cerrahi olarak alınan biyopsi örnekleri değerli örneklerdir. Yüzeyel abselerde örnek almadan önce cilt temizliği yapılması uygundur. Kapalı abselerden örnek alınırken temiz bir enjektör ile abse içeriği aspire edilmelidir. Yeterli içerik elde edilemezse, SF enjekte ederek aspire edilmesi uygundur. 1 mL ve üzerinde örnek alınması yeterlidir. Abse kapalı değil de pürülan ise absenin derin bölgelerine SF enjekte ederek aspire edilerek örnek alınmalıdır. Bu da mümkün değilse sürüntü örneği alınmalıdır. Enjektör ile alının örnek, içeriğindeki hava tamamen boşaltıldıktan sonra ağzı iyice kapatıldıktan sonra laboratuvara gönderilebilir. Enjektör ile alınmayan örnekler uygun transport besiyeri içerisinde laboratuvara gönderilmelidir. İdeal olanı alınan örneklerin 30 dakika içerisine laboratuvara ulaştırılmasıdır. Ancak bu mümkün değilse, örnek oda sıcaklığında bekletilmelidir. 6.3.Biyopsiörnekleri Deriden biyopsi örneği, deri yüzeyi flora ve çevresel kontaminantlar açısında steril SF ve gazlı bez yardımıyla temizlendikten sonra alınmalıdır. Örnek yaranın derininden kazıntı ya da doku parçası şeklinde alınmalıdır. Alınan örnek anaerop taşıma sistemi içerisinde ya da tabanına nemlendirilmiş gazlı bez konulmuş, ağzı kapaklı steril kap içerisinde alınmalıdır. Uygun olan, örneğin yarım saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmasıdır. ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   25 6.4.Gözörnekleri Göz örneği alırken, tek gözle lazyon olsa dahi iki gözden de örnek alınması etken-kontaminasyon ayrımı için değerlidir. Göz enfeksiyonlarında kornea kazıntısı, konjonktiva sürüntüsü, gözyaşı kanalı sürüntüsü, kontakt lens solüyonu, ön kamara sıvısı, biyopsi ya da aspirasyon örnekleri uygundur. Ayrıca uygun endikasyonlarda beyin-omurilik sıvısında VDRL çalışılması da mümkündür. Alınan örneklerden moleküler test çalışılacak ise, örneği alanın pudrasız eldiven giymesi gerekmektedir. Göze lokal olarak uygulanmış ilaçların uzaklaştırılması için, göz SF ile yıkanmalıdır. Çalışılacak her test ve şüphelenilen her özel etken için ayrı örnek alınması gerekmektedir. Gözden sürüntü örneği alırken, pamuklu tahta eküvyonlar kullanılmamalıdır. Eküvyonlar plastik ya da esneyebilen telden yapılmış olmalıdır. Sürüntü örneğinden klamidya kültürü yapılacaksa kalsiyum aljinatlı, viral kültür yapılacaksa dakron uçlu eküvyon kullanılmalıdır. Trahom şüphesi olan hastalarda, göz kapağı dışa çevrilerek, lezyonlu bölgeden epitelden yoğun örnek alınmaya çalışılmalıdır. Acanthamoeba şüphesinde ise alınan örnek mevcutsa Page çözeltisi, mevcut değilse PBS ile alınmalıdır. 6.5.Deriörnekleri Deri örnekleri mikolojik inceleme için değerlidir. Örnek almadan önce kontaminasyonu engellemek için dezenfeksiyon yapılmalıdır. Lezyonun sınırından bistüri yardımıyla kazıntı örneği alınır. Lezyon vezikül şeklindeyse vezikülün üstü, temiz bir makasla kesilerek örnek alınmalıdır. Alınan örnek temiz, kuru bir kağıda alınmalı ve mümkünse hasta başında ekim yapılmalıdır. Hasta başı ekim yapılamayacak ise, temiz bir zarfın içinde ya da iki lame lamın arasına konularak bantlanıp 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 6.6.Saçlıderi,saçvekılörnekleri Örnek, mümkünse Wood ışığı altında alınmalıdır. Herhangi bir cilt antisepsisi yapılmadan, lezyonlu olduğu tespit edilen 10 kadar saç ya da kıl kökü örneği alınmalıdır. Ayrıca, varsa, kabuklar da penset yardımıyla toplanmalıdır. Steril bir diş fırçası ya da tarak ile de özellikle saçlı deriden kazıntı örneği alınabilir. Nodüllü olduğu tespit edilen saç tellerinden birkaçı kesilerek alınabilir. Alınan örnek temiz, kuru bir kağıda alınmalı ve mümkünse hasta başında ekim 26   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER yapılmalıdır. Hasta başı ekim yapılamayacak ise, temiz bir zarfın içinde ya da iki lame lamın arasına konularak bantlanıp 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 6.7.Tırnakörnekleri Örnek alınmadan önce tırnak dezenfekte edilmelidir. Yüzeyel onikomikozlarda, tırnak plağının yüzeyindeki beyaz alanlar kazınarak alınmalıdır. Yüzeysel olmayan onikomikozlarda ise lezyon tırnağın proksimalindeyse, tırnağın sağlıklı olan üst katmanları soyulur ve lezyon içinden örnek alınırken, lezyon tırnağın distalindeyse, tırnağın sağlıklı kısmı kesilerek örnek alınır. Alınan örnek temiz, kuru bir kağıda alınmalı ve mümkünse hasta başında ekim yapılmalıdır. Hasta başı ekim yapılamayacak ise, temiz bir zarfın içinde ya da iki lame lamın arasına konularak bantlanıp 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 6.8.Şarbonşüphesindeörnekyönetimi Deri şarbonu şüphesinde, vezikül sıvısı ya da sürüntü örnekleri tercih edilebilmektedir. Vezikül sıvısı örneği, tercihen dakron uçlu bir eküvyonla alınır. Sürüntü örneği ise eskar evresinde, eskar dokusundan kabuk kaldırılmadan, kabuğun altına bir pastör pipeti ya da eküvyon yardımıyla girilerek alınır. Alınan örnekler transport besiyeri içerisine konularak laboratuvara ulaştırılır. Örnekler 1 saate kadar oda sıcaklığında 1 saatten 1 güne kadar ise +4°C’de muhafaza edilebilir. 6.9.Lepraşüphesindeörnekyönetimi Lepra tanısı için lezyonlardan alınan biyopsi ya da kazıntı örnekleri veya nazal yayma örnekleri tercih edilmektedir. Mevcut olan nodül ve plaklar örnek alımı için uygun lezyonlardır. Deri kazıntı örneği ve lezyon sıvıları da boyama için uygun örnek tipleridir. 7. Steril Vücut Sıvısı Örneklerinin Alınma Yöntemleri ve Laboratuvara Taşınması 7.1.Beyin-Omuriliksıvısıörnekleri Beyin-omurilik sıvısı örnekleri lomper ponksiyon ile alınabilmektedir. Örnek, omuriliğin L3-L4, L4-L5 veya L5-S1 aralığından alınmalıdır. Örneğin alınmasından önce cilt %70 alkol veya iyot çözeltisi ile temizlenmeli, iyot ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   27 çözeltisi kullanıldıysa işlemden sonra cilt tekrar %70 alkol ile silinmelidir. Her birinde yaklaşık 1-2 mL örnek olacak şekilde en az 3 ayrı kaba örnek alınması önerilmektedir. Mümkün değilse tek tüpe alınan örnek de uygundur. Ancak örnek tek tüpe alındıysa ilk olarak mikrobiyolojik inceleme yapılmalıdır. Beyin-omurilik sıvısı, ağzı kapaklı steril bir tüpe alınmalıdır. Uygun örnek miktarı bakteriyolojik, virolojik ve parazitolojik inceleme için 1 mL; mikolojik inceleme için 2 mL; mikobakteriyolojik inceleme için ise 5 mL olmalıdır. Örnekten parazit aranacaksa, alınan örnek 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Virüs tespiti için alınan örnekler, 24 saate kadar +4°C’de, 24 saati aşan durumlarda ise -70°C’de muhafaza edilebilir. Diğer örnekler ise 24 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. N. meningitidis şüphesiyle alınan örnek laboratuvara hemen ulaştırılamayacaksa, % 5 CO2 içeren ortamda muhafaza edilmesi daha uygundur. Trans-Isolate (T-I) besiyeri isimli özel bir besiyeri beyin-omurilik sıvısı örneklerinin taşınması için önerilen özel bir transport besiyeridir. Özellikle trasnfer süresi 1 günü aşan örneklerin T-I besiyerine, eğer mevcut değilse pediatrik kan kültür şişelerine inoküle edilmesi önerilmektedir. Haemophilus influenzae tip b şüphesi bulunan örnekler için besiyeri içerisine Isovitalex veya Vitox eklenmesi gerekmektedir. 7.2.Peritonörnekleri Periton sıvısı, iğne aspirasyonu yoluyla ya da periton diyalizi esnasında alınmaktadır. İğne aspirasyonu ile örnek alırken işlem öncesi cilt dezenfekte edilmelidir. Alınan örnek ağzı kapaklı steril tüpe, anaerop taşıma sistemine ya da kan kültür şişesine alınabilir. Hücre sayımı yapılacak örnekler EDTA içeren tüplere alınabilmektedir. Alınan örnek en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalı, hemen ulaştırılamayacak örnekler bakteriyolojik kültür için bir gün kadar oda sıcaklığında, mantar kültürü için 1 güne kadar +4ºC’de bekletilebilir. Periton diyaliz sıvısı örneği, diyaliz torbasından yaklaşık 50 mL kadar alınır. Diyaliz sıvısı enjektöre alınıp, hasta başında Steril bir tüp ya da kan kültür şişesine ekilebileceği gibi, diyaliz torbası içi içe geçmiş iki adet plastik torbaya da konulabilir. Örnek 1 saat içerisinde oda saçıklığında laboratuvara ulaştırılabilir, 1 saati geçen durumlarda 1 güne kadar +4ºC’de bekletilebilir. 7.3.Perikardörnekleri Perikard sıvısı iğne aspirasyonu ya da cerrahi işlem sırasında alınabilir. Örnek alımından önce cilt dekontamine edilmelidir. Örnekler steril, ağzı kapaklı bir tüpe alınmalıdır, örnek miktarı yeterli ise kan kültür şişesine de 28   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER ekim yapılabilir. Bakteriyolojik inceleme için 1-5 mL, mikolojik inceleme için 5 mL, virolojik inceleme için 1 mL, anaerop kültürler için 1 mL’den fazla, mikobakteri aranacaksa 5 mL’den fazla örnek alınmalıdır. Virolojik inceleme için alınan örnekler 15 dakika içerisinde buz üzerinde laboratuvara ulaştırılmalı, 15 dakikayı geçen durumlarda -70°C’de bir güne kadar bekletilebilir. Diğer örnekler en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır, ancak bekletilecekse bir güne kadar oda sıcaklığında bekletilebilir. 7.4.Plevraörnekleri Plevra sıvısı, torasentez yoluyla alınmaktadır. Örnek alınmadan önce dezenfekte edilmelidir. Örnek, ağzı kapaklı, steril bir kap içerisinde en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır. Antikoagülen olarak heparin içeren kaplara alınan örnekler uygundur. Örnek miktarı yeterli ise kan kültür şişesine de örnek ekimi yapılabilir. Mikobakteri aranacaksa 5-10 mL örnek, virüs aranacaksa 1 mL örnek, anaeroplar için 1mL’den fazla örnek ve diğer etkenler için de 5-10 mL örnek alınması uygundur. Ancak alınan örnek miktarı ne kadar artarsa etkeni üretme ihtimali de o kadar artmaktadır. Mikobakteriler için alınan örnek 2 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Virolojik çalışma yapılacak örnekler +4ºC’de 24 saate kadar, daha uzun süre bekletilecek ise-80ºC’de saklanmalıdır. 7.5.Eklemörnekleri Eklem sıvısı alınacak bölgenin derisi, işlem öncesi ilk olarak %70’lik alkol, ardından iyot çözeltisi ile silinmelidir. Steril bir tüp ya da uygun transport besiyeri içerisine, hücre sayımı için en az 1 mL, diğer incelemeler için ise en az 2-3 mL örnek alınmalıdır. Ayrıca, yeterli miktarda örnek alınabiliyorsa, kan kültür şişesine ekim yapmak da uygun bir yaklaşımdır. Ancak kan kültür şişesine alınan örnekte Gram boyama yapılamayacağı bildirilmelidir. Steril tüp içerisine alınan örneğin pıhtılaşmasını engellemek için EDTA ya da sitrat eklenmesi mikroorganizmalar için inhibitör etki yaratabildiği için önerilmemektedir. Örnek miktarı önerilenden az alındıysa anaerop taşıma sistemlerine alınması daha uygundur. Alınan örnekler en geç 1 saat içerisinde oda sıcaklığında laboratuvara ulaştırılmalıdır. Kültür yapılacak örnek kesinlikle buzdolabına konulmaz, sadece mikroskobi için ayırılan örnek kısa bir süreliğine buzdolabında bekletilebilmektedir. 7.6.Amniyonsıvısıörnekleri Amniyon sıvısı, amniyosentez ile ya da sezaryen esnasında alınabilir. En az 3 mL ağzı kapaklı steril bir tüp ya da anaerop taşıma sistemi içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Örnek en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır. ÖRNEK ALINMA YÖNTEMLERİ VE LABORATUVARLARA TRANSFERİ   29 Hemen gönderilemeyeceği durumlarda, 1 güne kadar oda sıcaklığında bekletilebilir. Virolojik inceleme yapılacaksa 1 güne kadar +4ºC’de, 1 günden uzun sürelerde -70ºC’de saklanabilmektedir. 8. Sonuç Mikrobiyoloji laboratuvarında tanının doğru konulabilmesi için örnek yönetimi son derece önemlidir. Kitabın bu bölümünde, numunelerin doğru bir şekilde alınıp, uygun koşullar altında muhafaza edilmesi ve laboratuvara ulaştırılması için gerekli temel bilgiler sunulmuştur Kaynakça 1. SKS Hastane (Sürüm 6.1). 1st ed. Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı; June 2020. Sağlık Bakanlığı Yayın No:1156. Accessed August 26, 2025. [https:// kalite.saglik.gov.tr/TR-12679/saglikta-kalite-standartlari-sks.html](https:// kalite.saglik.gov.tr/TR-12679/saglikta-kalite-standartlari-sks.html) 2. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlık Derneği. Solunum Sistemi Örneklerinin Laboratuvar İncelemesi Rehberi. Ankara: KLİMUD; 2022. KLİMUD-SOL. REH.10/22.Ver02.1. Accessed August 26, 2025. [https://www.klimud.org/ icerik/rehberler-38/klimud-rehberleri-8265](https://www.klimud.org/icerik/ rehberler-38/klimud-rehberleri-8265) 3. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları: Bulaşıcı Hastalıklar Laboratuvar Tanı Rehberi. Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı; 2014. Sağlık Bakanlığı Yayın No:934. 4. Miller JM, Binnicker MJ, Campbell S, et al. A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2018 update by the Infectious Diseases Society of America and the American Society for Microbiology. Clin Infect Dis. 2018;67(6):e1-e94. Accessed March 10, 2022. 5. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu. Ulusal Tüberküloz Tanı Rehberi. Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı; 2014. Sağlık Bakanlığı Yayın No:935. 6. T.C. Sağlık Bakanlığı. Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taşıma yönetmeliği. Resmî Gazete. 2010 Sep 25:27710. 7. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlık Derneği. Üriner Sistem Örneklerinin Laboratuvar İncelemesi Rehberi. Ankara: KLİMUD; 2020. KLİMUD-ÜRİ. REH.09/20.Ver02.1. 8. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlığı Derneği (KLİMUD). Genital Sistem Örnekleri. Ankara: KLİMUD; November 2015. KLİMUD Kaynak No:6. ISBN:978-605-84108-1-7. 30   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 9. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlık Derneği. Kan Dolaşımı Örneklerinin Laboratuvar İncelemesi Rehberi. Ankara: KLİMUD; 2022. KLİMUD.KAN. REH.04/22.Ver02. 10. T.C. Sağlık Bakanlığı, Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı ve Biyolojik Ürünler Dairesi Başkanlığı. Numune Alma El Kitabı (NAEK). Rev. 2023. Accessed August 26, 2025. [https://hsgm.saglik. gov.tr/depo/birimler/mikrobiyoloji-referans-laboratuvarlari-ve-biyolojikurunler-db/Dokumanlar/Rehberler/naek-rv5.pdf](https://hsgm.saglik.gov.tr/ depo/birimler/mikrobiyoloji-referans-laboratuvarlari-ve-biyolojik-urunler-db/ Dokumanlar/Rehberler/naek-rv5.pdf) 11. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlığı Derneği (KLİMUD). Gastrointestinal Sistem Örnekleri. Ankara: KLİMUD; November 2017. KLİMUD Kaynak No:12. ISBN:978-605-84108-6-2. 12. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlık Derneği. Deri, Deri Ekleri, Yumuşak Doku ve Göz Örneklerinin Laboratuvar İncelemesi Rehberi. Ankara: KLİMUD; 2024. KLİMUD-DYD.REH.06/24.Ver02. KLİMUD Kaynak No:8. 13. Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlık Derneği. Steril Vücut Sıvıları Laboratuvar İncelemesi Rehberi. Ankara: KLİMUD; 2020. KLİMUD-SVS. REH.10/20.Ver02. KLİMUD Kaynak No:5. 14. Boriskin YS, Rice PS, Stabler RA, Hinds J, Al-Ghusein H, Vass K, Butcher PD. DNA microarrays for virus detection in cases of central nervous system infection. J Clin Microbiol. 2004;42:5811-5818. 15. Brouwer MC, Tunkel AR, van de Beek D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin Microbiol Rev. 2010;23:467-492. 16. T.C. Sağlık Bakanlığı, Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü. Aşı ile Önlenebilir İnvaziv Bakteriyel Hastalıkların Sürveyansı Rehberi. Accessed April 16, 2025. [https://hsgm.saglik.gov.tr/depo/birimler/mikrobiyoloji-referanslaboratuvarlari-ve-biyolojik-urunler-db/Dokumanlar/Rehberler/10.8.2._0_ ASI_ILE_ONLENEBILIR_INVAZIV_BAKTERIYEL_HASTALIKLARIN_ SURVEYANSI_REHBERI.pdf](https://hsgm.saglik.gov.tr/depo/birimler/ mikrobiyoloji-referans-laboratuvarlari-ve-biyolojik-urunler-db/Dokumanlar/ Rehberler/10.8.2._0_ASI_ILE_ONLENEBILIR_INVAZIV_BAKTERIYEL_ HASTALIKLARIN_SURVEYANSI_REHBERI.pdf) 31 BÖLÜM III STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ SterilizationandDisinfectionMethods Yekta MOGUL1 1(Arş. Gör. Dr.), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0007-5380-5477 1. Giriş Dezenfeksiyon antisepsi, ve sterilizasyon (DAS) uygulamaları, mikroorganizmaların çoğalmasını ve yayılmasını önleyerek, mikrobiyoloji laboratuvarlarında ve sağlık hizmetlerinde güvenli çalışma koşullarının sağlanmasında önemli bir rol üstlenmektedir. Hastanelerde farklı düzeylerde dezenfeksiyon-sterilizasyon işlemleri uygulanmaktadır. Dezenfeksiyon-sterilizasyon uygulamalarında TC. Sağlık Bakanlığı SKS Versiyon 6.1’de kalite standartları kitabında asgari koşullar belirtilmiştir. SDA uygulamaları hastanelerde merkezi sterilizasyon üniteleri (MSÜ), hastane kontrol komitesi ve mikrobiyoloji laboratuvarınca yürütülmektedir. Mikrobiyoloji uzmanlarının son yıllarda artan oranda MSÜ sorumluluğu alıyor olmasından dolayı bu konularda farkındalığın artması, uygulama alanında daha fazla mikrobiyoloji asistan ve uzmanlarının bulunması önem taşımaktadır. Tanımlar; · Germisid: Mikroorganizmaları elimine eden veya çoğalmalarını inhibe eden ajanlardır. Etkileri kalıcıdır ve mikroorganizmaların yeniden üremesine olanak tanımazlar. Bakterisid: Bakterileri öldüren maddelerdir. 32   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Fungusid: Mantarları yok eden maddelerdir. Virusid: Virüsleri etkisiz hale getiren maddelerdir. Sporosid: Bakteri sporlarını yok eden maddelerdir. · Mikrobiyostatik Etki: Mikroorganizmaların üremesini ve çoğalmasını geçici olarak durduran bir etkidir. Etkinin ortadan kalkmasıyla mikroorganizmalar yeniden üreyip çoğalabilir. Bu etkiye maruz kalan mikroorganizmalar ölmez, uzun süre canlı kalabilirler. Bakteriyostatik: Bakterilerin üremesini durduran ajanlar. Fungustatik: Mantarların üremesini önleyen ajanlar. · Dekontaminasyon: Bir yüzey, nesne veya ortam üzerindeki zararlı maddelerin sterilizasyon, dezenfeksiyon veya temizleme ile güvenli bir seviyeye indirgenmesi veya tamamen ortadan kaldırılması işlemidir. Laboratuvar ortamında enfeksiyon zincirinin kesilmesi için; klinik örnekler ve kültür materyalleri imha edilmeden önce, yüzeyler ile cansız araç-gereçler işlem sonrasında ve belirli aralıklarla, ayrıca dökülme veya sıçrama meydana geldiğinde mutlaka dekontaminasyon uygulanmalıdır. · 2. Mikroorganizmaların Kontrol Edilme Nedenleri · Steril Ürünlerin Korunması · Enfeksiyonların Önlenmesi · Gıda Güvenliğinin Sağlanması · Bilimsel Araştırmalarda Saf Kültürlerin Korunması · Aseptik Alanların Güvenliği 3. Antisepsi Antisepsi, canlı dokular üzerinde veya içerisinde bulunan mikroorganizmaların elimine edilmesi ya da üremelerinin inhibe edilmesi amacıyla uygulanan bir işlemdir. Bu yöntem, özellikle deri, mukoz membranlar ve travmaya uğramış doku bölgelerinde yerleşen patojen mikroorganizmaların kimyasal ajanlar aracılığıyla ortadan kaldırılmasını hedefler. Başka bir ifadeyle antisepsi, canlı dokulara yönelik bir dezenfeksiyon yaklaşımı olup, enfeksiyon gelişme riskinin azaltılmasında önemli bir rol üstlenir. 3.1.AntiseptikAjanlar Antiseptikler, mikroorganizmaların proliferasyonunu inhibe ederek veya onları elimine ederek etki gösterir. Bu yolla enfeksiyon gelişimi engellenir ve doku bütünlüğü korunur. Antiseptikler, yara dezenfeksiyonu, cerrahi alanın hazırlanması ve günlük hijyen uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ   39 yöntemde mikroorganizmaların nükleik asitleri ve proteinlerinin alkilasyonu yoluyla germisidal etki sağlanır. · Etilen oksit (EO), yanıcı, patlayıcı, toksik, karsinojenik ve alerjen özelliklere sahip bir gazdır. Kullanımı sırasında çalışanların gaz ile temasını ve çevreye yayılımını önlemek için özel güvenlik önlemleri alınmalıdır. · EO sterilizatörleri, bağımsız havalandırma sistemine sahip ayrı bir odada bulundurulmalıdır. · Oda girişinde uyarı levhaları yer almalı ve yalnızca EO’nun zararlı etkileri konusunda eğitim almış personelin girişine izin verilmelidir. Gaz kaçağı durumunda koruyucu tedbirlerin uygulanması zorunludur. · EO sterilizasyon odasında basıncın, çevre alanlara kıyasla daha düşük tutulması gerekir. Basınç farkı, sesli ve görsel uyarı sistemleri ile sürekli olarak izlenmelidir. · Sterilizasyonda saf EO gaz kartuşları kullanılmakta olup, kartuş sterilizatörün özel bölmesine yerleştirilir. Cihazın kapatılması ve işlem başlatılmasının ardından kartuş açılarak EO gazı kabin içerisine salınır. Negatif basınç altında çalışan bu sistemlerde EO sızıntısı en aza indirilir. · Sterilizasyon tamamlandığında kabin içindeki EO ya özel yöntemlerle nötralize edilerek zararsız hale getirilir ya da paslanmaz çelik borular aracılığıyla çatının veya çevredeki en yüksek yapının en üst noktasından en az 7.5 metre yükseklikten atmosfere tahliye edilir. · İşlem sırasında EO konsantrasyonunun 300–1200 mg/L, bağıl nemin %40–60 ve sıcaklığın 37–55°C aralığında olması gereklidir. · EO yüksek penetrasyon özelliğine sahip olduğundan, sterilizasyon sonunda malzemelerde kalabilecek gaz artıklarının uzaklaştırılması için havalandırma zorunludur. · İmplantlar, solunum sisteminde kullanılacak cihazlar ve yüksek emiciliğe sahip tekstil ürünleri (örn. pamuklumateryaller) için uygun değildir. Ancak gerekli validasyonu yapılmış ve sterilizasyon döngüsü boyunca EO konsantrasyonu anlıkolarakizlenebilen endüstriyel sterilizatörlerde tekstillerin sterilizasyonu mümkün olabilir. 2. Formaldehit: Saf formaldehit, suda yüksek oranda çözünebilen, renksiz, yanıcı ve toksik bir gazdır. Ticari kullanımlarda ise %35–40’lık çözeltileri formol veya formalin olarak adlandırılır. Bu çözeltiler yanıcı veya patlayıcı olarak değerlendirilmez, 40   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER fakat deri ile teması tahrişe, solunması ise astım benzeri solunum problemlerine yol açabilir. Çalışma ortamlarında kısa süreli (≤15 dk) maruziyet için sınır 2 ppm, 8 saatlik zaman ağırlıklı ortalama maruziyet sınırı ise 0,75 ppm olarak belirlenmiştir. Etilen oksit sterilizatörlerinde olduğu gibi, formaldehit sterilizatörleri ile çalışan personelin de düzenli sağlık kontrollerinden geçirilmesi gerekir. Sterilizasyon sırasında formalin, negatif basınç altında buharlaştırılarak formaldehit gazı oluşturulur. İşlemin etkinliği, ortamın %60–80 nem içermesi, litrede 8–16 mg formaldehit konsantrasyonunun sağlanması ve sıcaklığın 50–80°C arasında tutulmasına bağlıdır. Formaldehit sterilizasyonunda, basınçlı buhar yöntemine benzer şekilde, ön hazırlık aşamasında vakum uygulanarak kabin içindeki hava boşaltılır. Daha sonra buhar enjekte edilerek kabin ve içindeki yük istenilen sıcaklığa kadar ısıtılır. Ardından birkaç kez ardışık formaldehit gazı enjeksiyonu gerçekleştirilir. İşlemin sonunda kabin ve paketlerde biriken formaldehit kalıntıları, önce buhar sonra hava ile tekrarlayan yıkamalarla giderilir. Bu sayede ek bir havalandırma sürecine ihtiyaç duyulmadan malzemeler kullanıma hazır hâle gelir. b) Sıvı Kimyasallar ile Sterilizasyon: 1. Hidrojen Peroksit: Renksiz bir sıvıdır ve dezenfektan olarak özellikle yumuşak kontakt lenslerin, cerrahi implantların ve plastik tıbbi aletlerin dezenfeksiyonunda yaygın şekilde kullanılmaktadır. Hidrojen peroksit virüs, bakteri, maya, bakteri sporlarına karşı geniş spektrumlu bir etkinlik gösterir ve hasta bakım alanlarında yüksek düzey dezenfektan olarak kabul edilmektedir. Materyallerin ön temizlik işlemlerinin ardından, %6’lık hidrojen peroksit çözeltisi ile oda sıcaklığında ve en az 20 dakikalık temas süresi sağlanarak etkin dezenfeksiyon gerçekleştirilebilir. Ayrıca, %7.5 oranında hidrojen peroksit ile %0.85 fosforik asit içeren kombinasyonlar, hidrojen peroksite dayanıklı endoskopların yüksek düzey dezenfeksiyonu amacıyla başarıyla kullanılabilmektedir. Yapılan çalışmalar, %6-7.5 H₂O₂’nin Cryptosporidium parvum’u inaktive edebilen tek sterilizan olduğunu göstermiştir. Ayrıca, hidrojen peroksitin buhar fazı, plazma sterilizasyonu adı altında çeşitli modern sterilizasyon sistemlerinde etkin bir ajan olarak yer almaktadır. 2. Perasetik Asit: Perasetik asit düşük konsantrasyonlarda bile bakterisidal, virüsidal ve fungusidal etkiye sahiptir ve hidrojen peroksite göre daha güçlüdür. Hücre STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ   41 duvarını geçirgen hâle getirir ve proteinleri denatüre eder. Isıya duyarlı aletlerin sterilizasyonu küçük perasetik asit cihazları ile 56°C’de 12 dakikada yapılabilir. Oda sıcaklığında %1 perasetik asit ve 20 dakika temas ile kritik ve yarı kritik alanlar dezenfekte edilir. Metallerdeki korozif etkisini önlemek için immersibl endoskoplar %35’lik asit çözeltisi %0,2’ye seyreltilerek tampon ve nötralize edici ajanlarla otomatik sistemlerde sterilize edilir. 5. Dezenfeksiyon Dezenfeksiyon, bir yüzey veya materyaldeki patojen mikroorganizmaların (bakteri sporları hariç) fiziksel veya kimyasal yöntemlerle temizlenmesi işlemidir. Bu süreç, mikroorganizmaların inaktivasyonu veya çoğalmalarının inhibisyonu yoluyla gerçekleştirilir. Sterilizasyonun aksine, dezenfeksiyon tam ve mutlak bir arındırma sağlamaz; bunun yerine, mikroorganizma yükünü azaltmaktan sterilizasyona yaklaşan sonuçlara kadar geniş bir etkinlik spektrumuna sahiptir. 5.1.DezenfeksiyonunTemelÖzellikleri Dezenfeksiyon işleminin etkinliği, bakteri sporları ve mikobakteriler gibi daha dirençli yapılara karşı değişkenlik gösterir. Mikroorganizmaların dezenfeksiyona duyarlılıkları Şekil 1’de gösterilmiştir. Dezenfeksiyon, etkisine göre üç farklı kategoriye ayrılır: · Yüksek Düzey Dezenfeksiyon: Bakteri sporları ve mikobakteriler dahil olmak üzere neredeyse tüm mikroorganizmaları yok eder; sterilizasyona en yakın sonuçları verir. · Orta Düzey Dezenfeksiyon: Mikobakteriler ve birçok patojeni ortadan kaldırır, ancak bakteri sporlarına karşı tam bir etki sağlamaz. · Düşük Düzey Dezenfeksiyon: Yalnızca belirli patojen mikroorganizmaları hedefler ve bakteri sporları ile mikobakterilere karşı etkisizdir. 42   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Şekil 1. Mikroorganizmaların dezenfeksiyona duyarlılıkları (1). 5.2.DezenfeksiyonYöntemleri Dezenfeksiyon, hem fiziksel hem de kimyasal yöntemlerle uygulanabilir: · Fiziksel Yöntemler: Isı, radyasyon veya filtrasyon gibi teknikler içerir. · Kimyasal Yöntemler: Daha yaygın olarak tercih edilir ve bu amaçla kullanılan maddelere dezenfektan adı verilir. Dezenfeksiyon Yöntemleri; a. Alkoller Etil ve izopropil alkol, güçlü antimikrobiyal özellik gösteren alkol türevleridir. Su ile %60-80 oranında hazırlanan çözeltileri en etkili formudur. Bu alkol çözeltileri, yüzeylerin yanı sıra termometre ve stetoskop gibi tıbbi cihazların dezenfeksiyonunda orta ve düşük düzeyde etkinlik sağlayan bileşikler olarak kullanılır. Etil alkol, zarflı virüslere etkili olmasının yanı sıra, hepatit A, poliovirüs ve HPV dışındaki bazı zarfsız virüslere karşı da etki gösterir. Adenoviruslara karşı yüksek etkinliği nedeniyle tonometre gibi cihazların dezenfeksiyonunda tercih edilir. İzopropil alkol ise zarflı virüslere karşı etkilidir, ancak zarfsız virüslere karşı etkili değildir. En zayıf etkili alkol metil alkol olarak bilinmektedir. Alkollerin sporları öldürme yeteneğinin bulunmaması ve protein açısından zengin maddelere düşük nüfuz etme kapasitesi, etkinliğini azaltan noktalardır. Bununla birlikte, alkolün içine iyot, povidon iyot ya da klorheksidin gibi bileşenler eklenerek daha etkili ve kalıcı bir dezenfeksiyon sağlanabilir STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ   43 Alkoller antiseptik olarak da yaygın şekilde kullanılmaktadır. Büyük miktarlarda solunmaları baş ağrısı ve uyuşukluk yapabilir. Kapalı alanlarda geniş yüzeylerde kullanıldığında göz ve ciltte tahrişe neden olabilir; bu nedenle geniş alanlarda kullanımı önerilmez. Yüksek yanıcılık özelliğine sahip olduklarından, serin ve iyi havalandırılan yerlerde saklanmalı ve açık alev yakınında kullanılmamalıdır. Uzun süreli kullanım alkolün lastik ve plastik malzemeleri sertleştirmesine ve mercekli tıbbi cihazların montaj elemanlarını bozmasına yol açabilir. b. Etilen Oksit Oldukça kuvvetli bir dezenfektandır. Saf hali toksik, irritan ve patlayıcı özelliği olan bir maddedir. Penetrasyonu çok hızlıdır ve etki ettiği hücrede enzim inaktivasyonunun sonucu DNA ve RNA yapısını bozarak etki gösterir. Diğer yöntemlerle sterilize edilemeyen plastik aletler ve diğer birçok cerrahi aracın dezenfeksiyonunda kullanılabilmektedir. c. Glutaraldehit Glutaraldehitalkilleme yoluyla etki ederler ve metallerde aşındırma yapmaması ve plastik malzemelere zarar vermemesi sayesinde, sterilizasyona uygun olmayan tıbbi cihazların yüksek düzey dezenfeksiyonunda tercih edilmektedirler. Ancak, glutaraldehit ile temas; cilt tahrişi, mukoza zarlarında irritasyon veya solunum sistemi semptomlarına neden olabilir. Bu yüzden, kullanım sırasında personelin koruyucu önlemler alması gerekmektedir. d. Hipokloritler Klor ve klor bileşikleri güçlü oksitleyici özellik gösterir. Hızlı etkili, düşük maliyetli ve geniş spektrumlu antimikrobiyal etkiye sahip dezenfektanlardır; bakteriyel sporlar dahil birçok mikroorganizmayı etkili bir şekilde yok edebilirler ve toksik kalıntı bırakmazlar. Ancak cilt ve yüzeylerde tahriş edici ve aşındırıcı etkileri olabilir. En yaygın klor kaynağı, içeriğinde %5.25 (50.000 ppm) sodyum hipoklorit (NaOCl) bulunan çamaşır suyudur. Bunun dışında kloraminler, sodyumdikloro-izosiyanüratlar (klor tabletleri) ve klordioksit gibi diğer klor bileşikleri de dezenfeksiyon amacıyla kullanılmaktadır. Mikroorganizmalar, hücre içi enzimatik reaksiyonların inhibisyonu, proteinlerin denatürasyonu ve nükleik asitlerin inaktivasyonu yoluyla öldürülür. Etkinlikleri, kullanılan yoğunluk ve temas süresine bağlı olarak değişir ve yüksek, orta veya düşük düzeyde dezenfeksiyon sağlayabilir. Ayrıca etkinlik pH ile ters orantılıdır; yani pH düştükçe antimikrobiyal etki artar. 44   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER e. İyot ve İyodoforlar İyot ile yüzey aktif bir maddenin karışımına “iyodofor” adı verilir ve en çok bilineni povidon iyottur. Dokuda toksik etki yaratmadığı için derinin dezenfeksiyonu için ameliyat öncesi ilgili bölgeye sıklıkla uygulanır. f. Kireç Kalsiyum hidroksit (Ca(OH)₂), yani sönmüş kireç, yüksek pH değeri sayesinde oluşturduğu alkali ortamla mikroorganizmaların hücre zarlarını ve protein yapılarını bozarak çoğalmalarını engeller, ayrıca kötü kokuları nötralize eder ve organik maddelerin ayrışmasını hızlandırarak hijyenik bir ortam sağlar. g. Ozon Ozon (O₃), suların dezenfeksiyonunda kullanılan etkili bir gazdır. Çok düşük konsantrasyonlarda bile başarılı bir dezenfeksiyon sağlayabilir. Mikroorganizmalara karşı etkisi, organizma türüne göre değişiklik gösterse de genellikle yüksek bir dezenfeksiyon gücü sunar. Organik maddeler üzerinde de oldukça etkilidir. Kokusu rahatsız edici olmasa da toksik ve tahriş edici özelliklere sahiptir. Ancak ozonun uçucu yapısı nedeniyle uygulama sırasında konsantrasyonunun sabit tutulması önemlidir. h. Beta-propiolakton: Serum ve aşıların sterilizasyonunda yaygın olarak kullanılan, renksiz ve kokusu rahatsız etmeyen bir sıvıdır; yüksek nemli ortamlarda etkili olur, proteinler üzerinde minimal etki göstererek son nötralizasyon ihtiyacını ortadan kaldırır ve nispeten toksik olmayan son ürünler üretir. Hızlı doku penetrasyonu sayesinde arter, kemik ve kıkırdak gibi doku greftlerinin daha güvenli ve homojen hazırlanmasını sağlar, iz bırakmaz ve kırılabilir malzemelerin dezenfeksiyonunda tercih edilir; ancak karsinojen olması nedeniyle kullanım alanı sınırlıdır. ı. Ağır Metaller: Ağır metaller (civa, gümüş, bakır, arsenik ve tuzları), dezenfeksiyon amacıyla sıklıkla kullanılır ve mikroorganizmaların proteinlerine bağlanarak enzim aktivitelerini bozar. Bunlardan bakır sülfat, algler ve klorofilli organizmalara karşı oldukça etkilidir. Bunun yanında gümüş nitrat içeren göz damlaları ve antibiyotikler, özellikle yenidoğanlarda klamidya enfeksiyonlarını önlemek için sıkça kullanılır. STERİLİZASYON VE DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ   45 6. Sonuç ve Öneriler: Sterilizasyon, dezenfeksiyon ve antisepsi yöntemlerinin; tıbbi bakım, araştırma laboratuvarları ve genel halk sağlığının korunmasında çok önemli bir rolü vardır. Mikroorganizmaların çeşitliliği ve direnç seviyeleri nedeniyle, her tekniğin etkinliği farklılık gösterir; bu yüzden doğru yöntem seçimi hayati bir unsurdur. Materyallerin kategorilere ayrılması, uygun sterilizasyon ve dezenfeksiyon stratejilerinin belirlenmesinde temel bir prensip oluşturmaktadır. Bu sınıflandırma sayesinde, hem enfeksiyon riskleri azaltılmakta hem de uygulamaların standart hale getirilmesi sağlanmaktadır. Günümüzde bu yöntemler yalnızca enfeksiyonların önlenmesinde değil; tıbbi ekipmanların güvenli ve uzun süreli kullanımının temininde, gıda endüstrisinde hijyen standartlarının korunmasında ve bilimsel araştırmalarda elde edilen verilerin doğruluğunun güvence altına alınmasında da vazgeçilmez bir unsur haline gelmiştir. Sağlık çalışanlarının ve mikrobiyoloji uzmanlarının bu alandaki bilinç düzeyinin yükseltilmesi ve uluslararası standartlara uyumun artırılması hem hastaların hem de çalışanların güvenliğini önemli ölçüde güçlendirecektir. Kaynakça 1. Dolapçı İ. Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon. Ankara Üniversitesi; 2015. Accessed September 24, 2025. https://dspace.ankara.edu.tr/server/api/core/ bitstreams/6f3bdfb7-50f8-42cf-a95b-27485e8ba74b/content 2. Vural T, Çelen E. Sıvı dezenfektan olarak hidrojen peroksit, perasetik asit ve türevi alet dezenfektanlarının kullanım ilkeleri: Kombinasyonlarının kıyaslanması. Dezenfeksiyon Antisepsi Sterilizasyon Derneği; 2005. Accessed September 24, 2025. https://www.das.org.tr/kitaplar/kitap2005/19-05.pdf 3. Denyer SP, Stewart GSAB. Mechanisms of action of disinfectants. Int Biodeterior Biodegradation. 1998;41(3-4):261-268. doi:10.1016/S09648305(98)00023-7 4. Altın ME. Diş hekimliğinde sterilizasyon ve dezenfeksiyon. İstanbul Üniversitesi; 2021. Accessed September 24, 2025. https://nek.istanbul.edu.tr/ ekos/TEZ/DHFK352ET.pdf 5. Mubarak MT, Ozsahın I, Ozsahin DU. Evaluation of sterilization methods for medical devices. In: 2019 Advances in Science and Engineering Technology International Conferences (ASET); March 26-10, 2019; Dubai, United Arab Emirates. IEEE; 2019:1-4. doi:10.1109/ ICASET.2019.8714223 46   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 6. Dezenfeksiyon ve Antisepsi. DAS Yayınları; 2005. Accessed September 24, 2025. https://das.org.tr/kitaplar/kitap2005/9-05.pdf 7. Öğütlü A, Metin DY, Perçin Renders D, Ersöz G, eds. Dezenfeksiyon Antisepsi Sterilizasyon Rehberi 2025. DAS Derneği; 2025. 47 BÖLÜM IV MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN EKİPMANLAR VE ÖZELLİKLERİ EquipmentUsedinMicrobiologyLaboratoryand TheirFeatures Esra Nur SİZER1 1(Uzm. Dr.), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0001-1228-7980 1. Giriş Bulaşıcı hastalıkların kontrolü ve yönetiminde, laboratuvarlarda güvenilir mikrobiyolojik tanı yöntemlerinin uygulanması temel unsurlardan biridir. Güvenilir ve doğru sonuçlara ulaşılabilmesi; yeterli altyapı, uygun teknik donanım ve yetkin personel varlığını gerektirmektedir. Bu bağlamda, uygun teknolojik ekipmanlarla donatılmış bir laboratuvar, etkin mikrobiyolojik tanı sürecinin vazgeçilmez bileşenlerinden biridir. Bu bölümde, tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılan temel ekipmanlara ve bunların kullanım amaçlarına değinilecektir. 2. Mikroskoplar Mikroorganizmalar, çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük yapılar olup genellikle 0.1-10 mikrometre (µm) boyutlarındadır. İnsan gözü 200-250 (µm) küçük nesneleri algılayamaz; bu nedenle mikroorganizmaların incelenmesinde mercek sistemlerine ihtiyaç duyulmuştur. İlk mikroskoplar 10x–20x büyütme kapasitesine sahipken, Zaccharias Janssen 1590’da ikinci bir mercek kullanarak büyütmeyi 50x–100x’e 48   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER çıkarmıştır. Galileo (1610), Kepler (1611) ve Robert Hooke (1635–1703) daha gelişmiş mikroskop modellerinin oluşmasına katkı sağlamıştır. Antonjvan Leeuwenhoek, geliştirdiği 300x ve üzerinde büyütme gücüne sahip mikroskop ile çeşitli mikroorganizmaları gözlemleyip tasvir etmiştir. Sonraki dönemlerde mikroskop teknolojisinde önemli gelişmeler sağlanmış; mikroskopların büyütme kapasiteleri artırılarak daha ayrıntılı gözlemler mümkün hâle gelmiştir. Günümüzde kullanım amacına bağlı olarak çeşitli mikroskop türleri geliştirilmiştir. Her biri kendine özgü prensiplerle çalışır. 2.1.BileşikIşıkMikroskobu Bileşik ışık mikroskobu, tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında en sık kullanılan mikroskop türüdür. Aydınlatma kaynağı olarak görünür ışık kaynağını kullanır ve numunenin büyütülmesini çoklu mercek sistemiyle sağlar. Genellikle objektif mercek ve oküler mercek olmak üzere iki ana mercek içerir. Görüntüleri yaklaşık 1000-3000 kata kadar büyütebilir. Fakat görünür ışığın dalga boyundan (0.4 μm) daha küçük nesnelerin görüntüsünü üretemez. Toplam büyütme gücü, objektif merceğin büyütme katsayısı ile oküler merceğin büyütme katsayısının çarpımıyla belirlenir. Bileşik ışık mikroskobunun çalışma prensibi şu şekildedir; ışık, bir yoğunlaştırıcı (kondansör) yardımıyla tablaya yerleştirilen numune üzerine odaklanır ve numuneden geçen ışık objektif mercek tarafından toplanır. Bu mercek, gövde tüpü içerisinde büyütülmüş bir görüntü oluşturur ve bu görüntüye birincil (primer) görüntü adı verilir. Ardından ışık, gövde tüpü boyunca ilerleyerek oküler merceğe ulaşır ve burada ikinci kez büyütülür. Bu yeni oluşan görüntüye ise ikincil (sekonder) görüntü denir. Sonuç olarak, net görüş mesafesi içerisinde, iki aşamalı büyütme ile elde edilen belirgin ve detaylı bir görüntü gözlenir (Şekil 1). MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN EKİPMANLAR . . .   55 parçacıkların filitrasyonunu sağlar. Biyogüvenlik kabinleri hem numuneyi hem laboratuvar çalışanını hem de çevreyi potansiyel biyolojik risklere karşı koruyacak şekilde tasarlanmışken, benzer bir sistem olan laminar akış kabinleri ise yalnızca çalışma materyalini dış ortam kontaminasyonundan korur. Biyogüvenlik kabinleri; yapı özellikleri, sağladıkları koruma düzeyleri ve kullanım amaçlarına göre üç sınıfa ayrılır. Sınıf I ve sınıf II biyogüvenlik kabinleri, genellikle biyogüvenlik seviyesi 1 ve 2 düzeyindeki laboratuvar çalışmalarında tercih edilirken; sınıf III kabinler, biyogüvenlik seviyesi 3 ve 4 gibi yüksek riskli patojenlerle çalışılan laboratuvarlarda kullanılmak üzere tasarlanmıştır (Şekil 3). Şekil 3. Biyogüvenlik Kabini Çeşitleri (5). 6.1.SınıfIBiyogüvenlikKabini Çevreye ve laboratuvar personeline koruma sağlayan en temel biyogüvenlik kabinidir. Ancak, sterilize edilmemiş oda havası kabin içindeki çalışma alanına geçtiği için ürüne koruma sağlamaz. Sınıf I biyogüvenlik kabininde, oda havası kabinin ön açıklığından içeri çekilir. İçerde sirküle olan hava, kabin içinden çıkmadan dış ortama geçerken önce HEPA/ULPA (Ultra-Low Penetration Air) filtreler aracılığıyla sterilize edilir ve daha sonra hava dış ortama atılır. Bu nedenle kabinler, çalışanı ve çevreyi aerosolden korurken numuneyi korumaz. 6.2.SınıfIIBiyogüvenlikKabini Bu kabinlerde, kabin içine giren ortam havası da HEPA filtrelerden geçirildiği için hem numunenin hem laboratuvar personelinin hem de çevrenin korunması sağlanır. Kabinin üst bölümüne yerleştirilmiş bir fan, çalışma alanı yüzeyinin üzerine HEPA filtreden geçirilmiş steril hava akımını yönlendirerek 56   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER bir hava perdesi oluşturur. Hava akımı, biyolojik materyallerin işlendiği alanı sürekli olarak temiz hava ile besleyerek kontaminasyon riskini azaltır. Hava daha sonra çalışma alanının altından geçerek HEPA filtrelerinden geçmeden önce kabinin üst kısmına geri döner. Toplam hava hacminin yaklaşık %70’i kabin içerisinde HEPA filtreden geçirilerek yeniden sirküle edilir, kalan %30’u ise egzoz HEPA filtresinden geçtikten sonra laboratuvar ortamına verilir. Sınıf II biyogüvenlik kabinleri, mekanizmalarındaki farklılıklara göre beş alt tipe ayrılır: Tip A1, Tip A2, Tip B1, Tip B2 ve Tip C1. 6.3.SınıfIIIBiyogüvenlikKabini Bu kabinler sızdırmaz, tamamen kapalı ancak havalandırmalı kabinlerdir. Kabin içine giren veya çıkan tüm hava HEPA filtresinden geçer. Kabin içerisinde yapılan işlemler sırasında kullanılmak üzere ön bölümde sisteme bağlı kauçuk eldivenler bulunmaktadır. Kabinde, malzemelerin eldiven bölmesinden çıkmadan önce sterilize edilmesini kolaylaştıran bir transfer bölmesi bulunur. Eldivenler, kabin içinde çalışanın el hareketlerini kısıtlasa da çalışan ile numuneler arasında doğrudan teması önler. Daha çok biyogüvenlik seviyesi 4 biyolojik materyallerin güvenli şekilde işlenmesinde kullanılır. 7. Laminar Flow Çeker ocak olarak da adlandırılır. Bu kabinler, çalışma alanını çevresel kontaminasyondan korumak amacıyla tasarlanmış olup, besiyeri dökme işlemi gibi steril ortam gerektiren işlemler için uygun çalışma alanı oluşturur. Odadaki hava kabin içine çekilir ve bir filtreden(HEPA) geçirilir. Filtrelenen hava, çalışma alanının üzerinden geçerek çalışana doğru yönlendirilir ve ardından odaya geri verilir. Bundan dolayı laminar akışlı dolaplarda yalnızca numune korunur, çalışan korunmaz. Bazılarında çalışma öncesinde kabin içini ve içerisindeki materyalleri sterilize etmek amacıyla UV lamba yer alabilir. 8. Hassas Terazi Genellikle miligram (mg) altı aralıktaki kütlelerin ölçümünde kullanılan bir terazi türüdür. 0.001 grama kadar hassasiyette ölçüm yapabilirler. Elektronik hassas teraziler, doğrudan kütleyi ölçmek yerine, kütleye karşı denge sağlamak amacıyla gereken kuvveti temel alarak ölçüm yapar ve yapılan ölçüm dijital olarak görüntülenir. Hava akımlarından kolayca etkilenebildiğinden, ölçümlerin şeffaf bir koruyucu fanus içerisinde gerçekleştirilmesi, daha doğru ve güvenilir sonuçlar elde edilmesini sağlar. Titreşime neden olabilecek laboratuvar ekipmanları ile aynı alanda bulunmamalıdır. Hassas terazilerin doğruluğunun MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN EKİPMANLAR . . .   57 sağlanması için, haftalık olarak standart ağırlıklarla kontrol edilmesi ve yılda bir kez kalibrasyonunun yapılması gerekmektedir. 9. Sıcak Plaka Sıcak plaka, mikrobiyoloji laboratuvarlarında masaüstü ısıtma sistemi olarak kullanılan bağımsız bir cihazdır. Geleneksel ateşle ısıtma yöntemlerinden farklı olarak, sıcak plaka elektrik akımı aracılığıyla ısı üretir. Elektrik akımı, yüksek dirençli bobinlerden geçerken, bu direnç elektrik enerjisinin ısı enerjisine dönüşmesini sağlar ve bobinlerin ısı yaymasına neden olur. Laboratuvarda, cam eşyaları ve bileşenlerini ısıtmak için sıcak plakalar kullanılır. Ayrıca su banyoları, herhangi bir dökülme veya aşırı ısınma durumunda tehlikeli olabileceğinden, sıcak plakalar su banyoları yerine de kullanılabilir. 10. pH Metre pH metre, laboratuvar ortamlarında su bazlı çözeltilerdeki hidrojen iyonu (H⁺) konsantrasyonunu ölçerek çözeltinin asidik veya bazik özelliklerini belirlemeye yarayan bir cihazdır. Bu cihaz, referans elektrot ile pH elektrodu arasındaki elektrik potansiyeli farkını ölçtüğü için potansiyometrik pH metre olarak da adlandırılır. Mikrobiyoloji laboratuvarında çeşitli solüsyonların ve besiyerlerinin hazırlanmasında pH değerinin ölçülmesi amacıyla kullanılır. 11. Santrifüj Santrifüj, bir cismin tek eksen etrafında dönmesini sağlayan ve bu dönüş sırasında eksene dik yönde dış kuvvet uygulayan bir cihazdır. Santrifüj cihazı, sedimantasyon prensibine dayanarak çalışır; yüksek dönüş hızı sayesinde daha yoğun parçacıklar merkezden uzaklaşırken, daha hafif ve küçük parçacıklar merkeze doğru itilir. Bu sayede, daha yoğun bileşenler tüpün dibinde birikirken, daha hafif bileşenler üst kısımda toplanır ve numunenin bileşenleri ayrılmış olur. Santrifüjün temel uygulama alanı, süspansiyon halindeki partiküllerin ayrılmasıdır. Mikrobiyoloji laboratuvarında çeşitli hücrelerin, kan bileşenlerinin, nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrıştırılması gibi yaygın kullanım şekilleri vardır. Santrifüj cihazının masaüstü, soğutmalı, ultra ve vakumlu gibi çeşitli türleri bulunmaktadır (Şekil 4A). 12. Vorteks Karıştırıcı Vorteks karıştırıcılar, laboratuvarlarda cam tüp ya da flakon içindeki sıvı örneklerin hızlı ve homojen biçimde karıştırılmasını sağlayan temel 58   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER cihazlardandır. Motorla çalışan mekanizma, tüp tabanına dairesel titreşim hareketi aktararak sıvının girdap şeklinde dönmesine neden olur. Bu türbülanslı hareket, içerikte etkin karışım ve homojenizasyon sağlar.Mikrobiyoloji laboratuvarında genellikle numune tüplerindeki sıvıların karıştırılmasında kullanılır. Ayrıca, hücre ve hücre organellerinin homojen hale getirilmesine de olanak tanır (Şekil 4B). 13. Su Banyosu Benmari olarak da adlandırılan su banyosu, sabit sıcaklıkta kontrollü bir ortam gerektiren kimyasal reaksiyonlar için kullanılan geleneksel bir laboratuvar cihazıdır. Sıvı ya da katı maddelerin kontrollü biçimde ısıtılması veya soğutulmasında kullanılır (Şekil 4C). Şekil 4.A: Santrifüj, B: Vorteks Karıştırıcı, C: Su Banyosu (6-8). 14. Bunsen Beki Bunsenbeki hem öze gibi ekipmanların sterilizasyonunda hem de alev çevresinde steril bir çalışma alanı oluşturmak amacıyla kullanılan bir laboratuvar ekipmanıdır. Tek bir açık gaz alevi üreterek sterilizasyon, yakma ve ısıtma işlemlerinde görev alır. Tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında bu işlemler için yaygın olarak tercih edilmektedir. 15. Pipet Pipet, mililitre (mL) ya da mikrolitre (µL) düzeyindeki düşük miktardaki sıvı hacimlerini ölçmek ve transfer etmek amacıyla kullanılan temel laboratuvar ekipmanıdır. Pipetler temel olarak cam, plastik ve elektronik olmak üzere üç grupta sınıflandırılır. Cam pipetler genellikle borosilikat camdan, plastik pipetler ise polietilen tereftalat (PET) malzemeden üretilir. Elektronik pipetler, MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN EKİPMANLAR . . .   59 mikroişlemci kontrollü mekanizmalarla çalışır. Elektronik pipetle ölçülen en küçük hacim 0.1 μL’dir. Pipetler genellikle 1 mL ve üzerindeki hacimlerin ölçülmesinde kullanılırken, mikropipetler 1 ila 1000 µL arasındaki küçük hacimlerin hassas ölçümü için tasarlanmıştır (Şekil 5). Şekil 5.A: Otomatik Pipet, B: Çok Kanallı Otomatik Pipet, C: Pasteur Pipeti (9). 16. Öze Özeler, bakteri veya maya gibi mikroorganizmaları, inkübasyon öncesinde katı ya da sıvı besiyerlerineinoküle edilmesinde kullanılan temel laboratuvar araçlarıdır. Genellikle 1 µL ve 10 µL hacimlerinde üretilen özelerin uç kısmında, çapı yaklaşık 2-5 mm arasında değişen küçük bir halka bulunur. Ucunda halka olmayan düz bir telden oluşan iğne özeler de mevcuttur. Kullanılan malzemeye göre; tekrar kullanılabilen, metal saplı ve uç kısmı nikel veya platin telden üretilen tel özeler ile plastik reçineden yapılmış tek kullanımlık plastik özeler olmak üzere iki türü bulunmaktadır. 17. Sonuç ve Öneriler Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan her bir ekipmanın teknik özellikleri ve doğru kullanım koşulları, yalnızca güvenilir sonuçların elde edilmesine ve laboratuvar güvenliğinin sürdürülebilirliğine katkı sağlamakla kalmaz, aynı zamanda laboratuvar işleyişinin bütüncül bir parçasını oluşturur. Bu nedenle, laboratuvar pratiğinde kullanılan ekipmanların düzenli bakımının yapılması, kullanım protokollerine titizlikle uyulması ve teknolojik gelişmelerin yakından takip edilmesi hem tanısal doğruluğu artırmak hem de sürdürülebilir bir laboratuvar standardı oluşturmak açısından büyük önem taşımaktadır. Ayrıca bu ekipmanların etkin şekilde kullanılabilmesi personelin yeterli teknik bilgiye sahip olmasıyla mümkündür. Dolayısıyla, laboratuvar altyapısının güncel 60   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER teknolojilerle donatılması ve bu ekipmanların standartlara uygun biçimde kullanılması, enfeksiyon hastalıklarının tanı ve kontrolünde güvenilir sonuçlara ulaşmada temel bir gerekliliktir. Kaynakça 1. Altındiş M. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı. Ankara: Nobel Tıp Kitabevleri; 2024. 2. Ceyhan İ. Biyogüvenlik laboratuvar seviyeleri ve biyogüvenlik kabinlerinin seçimi, kullanımı ve bakımı. In: 4. Ulusal Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi Bildirileri. Ankara: Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Tüberküloz Referans Laboratuvarı; 2005:608-633. 3. Ertürk Ö, Aydın S, Karaman Ü, Alver DO. Genel Mikrobiyoloji. Ankara: Nobel Akademik Yayıncılık; 2022. 4. Microbe Notes. Instruments used in microbiology lab with principle, uses. 2024. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/instrumentsused-in-microbiology-lab/#13-microscope](https://microbenotes.com/ instruments-used-in-microbiology-lab/#13-microscope) 5. Microbe Notes. Biosafety cabinets—definition, classes (I, II, III) and types. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/biosafetycabinets/](https://microbenotes.com/biosafety-cabinets/) 6. Microbe Notes. Centrifuge: principle, parts, types, and applications. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/?s=centrifugal](https:// microbenotes.com/?s=centrifugal) 7. Microbe Notes. Vortex mixer—definition, principle, parts, types, examples, uses. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/?s=vortex] (https://microbenotes.com/?s=vortex) 8. Microbe Notes. Water bath—definition, principle, parts, types, procedure, uses. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/?s=water+bath] (https://microbenotes.com/?s=water+bath) 9. Microbe Notes. Guide to pipettes: principle, types and key uses. Accessed August 10, 2025. [https://microbenotes.com/pipette-principle-partstypes-procedure-uses-examples/](https://microbenotes.com/pipette-principleparts-types-procedure-uses-examples/) 10. Sanderson J. Fundamentals of microscopy. Curr Protoc Mouse Biol. 2020;10(2):e76. 11. Şanlıdağ T, Tuğlu İ, Özbakkaloğlu B. Biyogüvenlik kabinleri. Türk Mikrobiyol Cem Derg, 2003;33:168-175 61 BÖLÜM V MİKROORGANİZMALARIN BOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ StainingandMicroscopicDiagnostic MethodsofMicroorganisms Elif KESKİN1 1(Arş. Gör. Dr.), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0003-3635-8573 1. Giriş Mikroorganizmaların detaylı bir biçimde incelenebilmesi amacıyla çeşitli boyama yöntemlerine başvurulmaktadır. Bu gerekliliğin temelinde, mikroorganizmaların içinde bulundukları ortamla aralarındaki kırılma indisi farkının oldukça düşük olması yatmaktadır. Bu durum, mikroskobik gözlem sırasında morfolojik yapıların ve hücresel özelliklerin ayırt edilmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, uygun boyalar kullanılarak hem mikroorganizmaların morfolojileri hem de yapısal karakteristikleri daha belirgin hâle getirilebilmektedir. Boyalar, moleküler yapıların iyonlaşma sonucunda kazandıkları elektriksel yüke bağlı olarak; asidik, bazik ve nötr olmak üzere üç temel gruba ayrılmaktadır. 1.1.AsidikBoyalar İyonize olduklarında negatif elektriksel yük taşıyan bu boyalar, çoğunlukla sodyum tuzları şeklinde bulunan renkli asitlerin tuzlarıdır; bununla birlikte bazı durumlarda potasyum, kalsiyum ya da amonyum tuzları da kullanılabilmektedir. Asidik boyalar, özellikle hücre dışı yapıların veya arka planın (zemin) 62   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER boyanmasında tercih edilmektedir. Yaygın olarak kullanılan asidik boyalar arasında asit fuksin, pikrik asit, eozin, nigrosin ve kongo kırmızısı yer almaktadır. 1.2.BazikBoyalar İyonize olduklarında pozitif elektriksel yük kazanan bu boyalar, genellikle klorür, benzen sülfonat, oksalat veya asetat gibi anyonlarla birleşen renkli bazların tuzlarıdır. Bazik boyalar, negatif yüke sahip hücresel bileşenler-özellikle nükleik asitler ve hücre duvarı-ile güçlü bağlanma eğiliminde olduklarından, mikroorganizmaların temel boyanmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu gruba dâhil olan başlıca boyalar arasında metilen mavisi, kristal viyole, bazik fuksin, safranin ve malaşit yeşili bulunmaktadır. 1.3.NötrBoyalar Nötr boyalar, asidik ve bazik boyaların belirli oranlarda karıştırılmasıyla elde edilir. Bu karışım sayesinde, preparat üzerinde hem asidik hem de bazik yapıların farklı renklerde ayırt edilebilmesi mümkün hâle gelir. Özellikle hematolojik ve histolojik incelemelerde sıklıkla tercih edilen nötr boyalara Giemsa ve Wright boyaları örnek olarak verilebilir. Mikrobiyolojik uygulamalarda farklı amaçlara hizmet eden çok sayıda boya ve boyama yöntemi bulunmaktadır. Boya teknikler yalnızca tek bir boya ve birkaç basit adımdan oluşurken, bazıları birden fazla boyanın kullanıldığı daha karmaşık prosedürleri içermektedir. Mikrobiyoloji alanında kullanılan boyama yöntemleri temel olarak iki ana grupta incelenmektedir. Basit boyama yöntemleri Bu boyama yöntemi, preparat üzerinde bulunan mikroorganizmalar hakkında hızlı ve temel düzeyde bilgi edinilmesini sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Uygulamada yalnızca tek bir boya solüsyonu kullanılmakta ve busolüsyon preparata tek aşamada uygulanmaktadır. Mikroorganizmalar, kullanılan boyanın kimyasal özelliklerine bağlı olarak çeşitli şekillerde boyanarak mikroskobik olarak görünür hâle gelir. Bu amaçla genellikle karbolfuksin, kristal viyole ve metilen mavisi gibi bazik özellik taşıyan boya solüsyonları tercih edilmektedir. Birleşik boyama yöntemleri Bu yöntemler, birden fazla boya kullanılarak gerçekleştirilen boyama tekniklerini ifade etmektedir. MİKROORGANİZMALARINBOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ   63 I. Diferansiyel boyama yöntemleri: Mikroorganizmaların birbirinden ayırt edilebilmesi amacıyla kullanılan boyama yöntemleridir. Örneğin, Gram boyama ve Ziehl-Neelsen boyama gibi teknikler bu amaçla sıklıkla tercih edilmektedir. II. Strüktürel boyama yöntemleri: Mikroorganizmaların iç ve dış morfolojik yapılarına dair bilgi elde etmek amacıyla kullanılan boyama yöntemleridir. Bu teknikler sayesinde kapsül, spor, flagella, çekirdek, lipit gibi yapılar ayrıntılı şekilde gözlemlenebilmektedir. 2. Basit Boyama Yöntemleri 2.1.MetilenMavisiileBoyama Metilen mavisi boyama, rutin klinik mikrobiyoloji pratiğinde çeşitli amaçlarla kullanılabilen, basit ancak tanı açısından oldukça faydalı bir boyama yöntemidir. Klinik laboratuvarlarda; bakteri veya parazitlerin morfolojik özelliklerinin tanımlanması, kapsül şişme testinin değerlendirilmesi gibi çok çeşitli amaçlarla kullanılabilen, basit fakat işlevsel bir boyadır. Corynebacterium diphtheriae tanısında özel bir yere sahiptir. Bu boyayla boyandığında, C. diphtheriae açık mavi renkte sitoplazma üzerinde belirgin kontrast oluşturan koyu renkli metakromatik granüller sayesinde boncuklu veya bantlı bir hücre morfolojisi sergiler. Bu karakteristik görünüm, tanı açısından ayırt edici bir özellik taşır. Metilen mavisi, Mycobacterium spp.’nin boyanmasında veya benzeri asidorezistan boyama yöntemlerinde zıt boya (kontrast boya) olarak da kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra, dışkının direkt mikroskopik incelemesinde lökositlerin gösterilmesinde de önemli bir rol oynar; zira lökosit varlığı, genellikle invaziv bir enfeksiyonun göstergesi olarak değerlendirilir. Ayrıca, Gram boyama ile tespiti güç olan fuziform bakteriler ve spiroketlerin (özellikle Vincent anjini gibi ağız enfeksiyonlarında) morfolojilerinin ortaya konulmasında da etkili bir boyama ajanı olarak kullanılabilir Hazırlanışı şu şekildedir: 0.3 gram metilen mavisi, 30 mL %95’lik etanol içerisinde tamamen çözülene kadar eritilir. Ardından 100 mL distile veya deiyonize su eklenerek karışım tamamlanır. Elde edilen solüsyon, bir gece bekletildikten sonra Whatman No. 2 filtre kâğıdı kullanılarak süzülür ve kullanılacak şişeye aktarılır. Şişe uygun şekilde etiketlenir ve oda sıcaklığında saklanır. Hazırlanan boyanın raf ömrü yaklaşık 1 yıldır. 64   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Not: Corynebacterium ve Cryptosporidium türlerinin boyanmasında önerilen formül, alkali LMMB (alkali Loeffler’in metilen mavisi boyası) olarak da bilinmektedir. Bu özel formülasyonda, yukarıda belirtilen standart hazırlama yönteminden farklı olarak 100 mL distile su yerine, 100 mL %0.01’lik potasyum hidroksit (KOH) çözeltisi kullanılır. Bu alkali ortam, hedef mikroorganizmaların belirgin şekilde boyanmasını ve ayırt edilmesini kolaylaştırır. Metilen Mavisi ile Boyama Basamakları · Boyamaya hazır ve sabitlenmiş lamlar, bir boyama standına yerleştirilir. · LMMB (Loeffler’in Metilen Mavisi Boyası) çözeltisinden, yayma alanını tamamen örtecek miktarda lam üzerine damlatılır. · Boya, preparat üzerinde 1–3 dakika bekletildikten sonra lam, akan çeşme suyu altında nazikçe yıkanır. · Yüzeydeki su fazlası dikkatlice süzdürülür ve lam, dik konumda bırakılarak havada kurutulur. Kuruyan preparat, mikroskopta immersiyon objektifi kullanılarak incelenir. 2.2.KarbolFuksinileBoyama · Uygun şekilde hazırlanmış, kurutulmuş ve fikse edilmiş preparatların üzerine, filtre kâğıdından süzülmüş karbol fuksin çözeltisi damlatılır. · Boya, preparat üzerinde 5–10 saniye bekletildikten sonra dökülür ve preparat hafif akan su ile nazikçe yıkanır. · Lam, kurutma kâğıdı ile ya da havada tamamen kurutulur. Ardından immersiyon objektifi ile mikroskopik inceleme yapılır. Boyama sonucunda mikroorganizmalar kırmızı renkte gözlemlenir. 2.3.KristalViyoleileBoyama · Hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole çözeltisinden yeterli miktarda damlatılır ve 20–30 saniye bekletilir. · Sürenin sonunda boya dökülür ve preparat hafif akan su ile dikkatlice yıkanır. · Lam, havada kurutulduktan sonra immersiyon objektifi ile mikroskop altında incelenir. Bu boyama yöntemiyle mikroorganizmalar mor renkte görünür. MİKROORGANİZMALARINBOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ   71 Boyama sonucunda spor yapıları yeşil renkte, geri kalan hücre yapıları ise kırmızı-pembe renkte gözlemlenir. 3.4.SpiroketlerinBoyanması Spirochaetes sınıfı içinde yer alan insan patojenleri, dünya genelinde önemli enfeksiyon hastalıklarına neden olmaktadır. Ancak bu bakterilerin bazı türlerinin yalnızca in vivo koşullarda kültürlenebilir olması, bazılarının ise hiç kültürlenememesi, klinik laboratuvarlarda enfeksiyonların kesin olarak doğrulanmasını zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, spiroket enfeksiyonlarının tanısında klasik kültür yöntemlerinden ziyade, doğrudan mikroskobik inceleme, serolojik testler ve moleküler tanı yöntemleri gibi alternatif yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Tüm bu yöntemler daha etkin olmasına rağmen mevcutta bulunan boyama yöntemleri de vardır. Bunlar; Fontana spiroket boyama yöntemi ve Modifiye Becker yöntemidir. Fontana Boyama Basamakları · İnce bir preparat, temiz bir lam üzerine hazırlanır ve havada kurutulur. · Daha sonra fikzatif solüsyon uygulanır; her biri 30 saniye sürecek şekilde, toplam üç kez fikzatif uygulaması yapılır. · Ardından fikzatif, etil alkol ile değiştirilerek preparat üç dakika bu solüsyonda bekletilir. Fazla alkol dökülerek süzülür ve preparat ya oda sıcaklığında kurutulur ya da ısıtılarak kuruma sağlanır. · Sonraki aşamada mordant solüsyonu eklenir; bu solüsyon hafifçe ısıtılarak buhar çıkması sağlanır ve yaklaşık 30 saniye bekletilir. Preparat önce çeşme suyu, ardından distile su ile yıkanarak süzülür ve kurutulur. · Daha sonra amonyak-gümüş nitrat solüsyonu ilave edilir ve yine buhar çıkıncaya kadar ısıtılır; buhar oluşmaya başladıktan sonra preparat 30 saniye boyunca bu solüsyonda bekletilir. · Distile su ile dikkatlice yıkanır, havada kurutulur ve lam ile lamel arasına balsam damlatılarak mikroskobik incelemeye hazır hale getirilir. Boyama sonucunda Spiroketler siyah renkte, arka plan ise parlak kahverengi ile sarımsı tonlar arasında değişen bir görünümde izlenir. 4. Mantar Boyama Yöntemleri Mantar kolonilerinin makroskobik ve mikroskobik morfolojilerinin ayrıntılı ve doğru biçimde incelenebilmesi için, öncelikle örneklerden preparatlar 72   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER hazırlanmalıdır. Ardından bu preparatlar ya natif halde ya da uygun boyama yöntemleri kullanılarak mikroskobik olarak değerlendirilmelidir. Mantarların tanımlanmasında genellikle koloni morfolojisi ve mikroskobik özelliklerin analizi esas alınmaktadır; ancak birbirine yakın cins ve türlerin ayırt edilebilmesi için, ayırt edici nitelikteki bazı biyokimyasal testlerin uygulanması gerekebilir. Candida türlerinin tanısında gerçekleştirilen boyalı mikroskobik incelemelerde; Gram ve Wright boyama yöntemlerinin yanı sıra, metilen mavisi ve Giemsa gibi boyalar da kullanılmaktadır. Candida türleri, Gram boyama yöntemiyle incelendiğinde Gram pozitif karakterde boyanma özelliği gösterir. Pratik mikoloji uygulamalarında, besiyerinde üreyen küf mantarlarının mikroskobik değerlendirilmesinde en sık başvurulan yöntemlerden biri, örneklerin laktofenol pamuk mavisi ile boyanarak direkt mikroskobik incelemeye tabi tutulmasıdır. Laktofenol pamuk mavisi çözeltisinde yer alan fenol, preparattaki mikroorganizmaların inaktivasyonunu sağlar. Yüksek fenol konsantrasyonu, hücresel litik enzimleri denatüre ederek hücre lizisini engeller. Pamuk mavisi ise, mantar hücre duvarında bulunan kitin yapısına bağlanarak bu yapıyı boyayan asidik karakterde bir boyadır. Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama Basamakları · Temiz ve kuru bir lamın ortasına bir ya da iki damla laktofenol pamuk mavisi solüsyonu damlatılır. · Steril bir öze yardımıyla, mantar kolonisinin birkaç farklı bölgesinden alınan materyal, laktofenol pamuk mavisi solüsyonunun üzerine yerleştirilir. · Preparat, temiz bir lamel ile dikkatlice kapatılır ve mikroskop altında incelenir. 5. Parazit Boyama Yöntemleri 5.1.TrikromBoyama Bağırsak protozoonlarının tanımlanmasında önemli yöntemlerden biri olarak kabul edilen trikrom boyama tekniği, kist ve trofozoitlerin tespiti ile tanımlanmasını kolaylaştırmakta ve karşılaşılan protozoonların kalıcı preparatlarının elde edilmesine imkân tanımaktadır. Özellikle Entamoeba histolytica’nın tanımlanmasında laboratuvar tanı süreçlerinde kritik bir yöntem olarak değerlendirilir. Ayrıca, bu teknik parazitlerin artefaktlar, konak hücreleri MİKROORGANİZMALARINBOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ   73 ve maya hücrelerinden ayrımında kullanılan kalıcı bir boyama yöntemi olup, hem konsantrasyon işlemi uygulanmış dışkı örneklerine hem de taze dışkı örneklerine uygulanabilmektedir. Önemli noktalardan birisi dışkının santrifüj edilmemesidir. Trikrom boyama yönteminin başlıca avantajları arasında, iyi boyanmış organizmaların yapılarını ayrıntılı şekilde ortaya koyması, doğrudan incelemede gözden kaçabilecek protozoonların daha kolay tespit edilmesi, preparatların bozulmadan uzun süre saklanabilmesi ve pozitif örneklerin eğitim amacıyla kullanılabilmesi yer almaktadır. Trikrom boyama yönteminin dezavantajı, tanının morfolojik kriterlere dayanması nedeniyle, patojenliği kanıtlanmış tür olan Entamoeba histolytica ile Entamoeba dispar arasındaki ayrımı yapmada yetersiz kalmasıdır. Ayrıca, fiksasyonun yeterince iyi yapılmadığı yaymalarda, boyama sonucu protozoonların morfolojik farklılıkları yeterli düzeyde ortaya konulamamaktadır. TrikromBoyama Basamakları Trikrom boyama yönteminin uygulama aşamaları aşağıdaki şekilde özetlenebilir: · Preparat, %70’lik alkol solüsyonunda 5 dakika bekletilir. · D’Antoni’nin iyot solüsyonunda 3-5 dakika tutulur. · %70’lik alkol solüsyonunda 2-5 dakika bekletilir. · Bir kez daha %70’lik alkolde 2-5 dakika bekletilir. · Schaudinn fiksatifi ile sabitlenmiş lamlar 5-8 dakika, PVA (polivinil alkol) fiksatifiyle sabitlenmiş lamlar ise 8-10 dakika trikrom boyasında tutulur. · Lamların fazla boyası, dik olarak kâğıt havlular üzerine yerleştirilerek süzülür. · Lamlar %90’lık asit alkole 2-3 saniye batırılır. · Kâğıt havluya değdirilen lamlar, %100 alkolde çalkalanır. · %100 alkolde 2-5 dakika bekletilir. · Tekrar %100 alkolde 2-5 dakika bekletilir. · Toluen veya ksilende 2-5 dakika tutulur. · Bir kez daha toluen veya ksilende 2-5 dakika bekletilir. Not: Bu adımlar laboratuvar protokollerine göre değişiklik gösterebilir. Adımlar arasında lamlar bir reaktiften diğerine aktarılırken, önceki reaktifin damlaları kurutma kâğıdı ile emdirilerek sonraki reaktifin kirlenmesi önlenir; bu uygulama, boyama kalitesinin artırılmasına katkı sağlar. 74   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Trikrom Boyanın Değerlendirilmesi İyi sabitlenmiş ve uygun şekilde boyanmış dışkı örneklerinde, trofozoit ve kistlerin sitoplazmaları mavi-yeşil tonlarda veya açık mor renkte; nükleer kromatin, kromatoid cisimcikler ve sindirilmiş eritrositler ise çoğunlukla kırmızı veya kırmızı-mor renkte görülür. Zemin genellikle yeşil renkte olup, sindirilmeyen besin artıkları ile maya ve mantar hücreleri de çoğunlukla yeşil tonlarda boyanır. Boyanmamış ya da kırmızıya boyanmış kistlerin varlığı, sabitleme işleminin yetersiz veya gecikmiş olduğunu düşündürür. Entamoeba coli kistleri ise genellikle diğer amip türlerine kıyasla daha koyu mor renkte izlenir. 5.2.GiemzaBoyama Vücut sıvıları veya dokulardan hazırlanan yaymalarda en başarılı boyalardan biri olarak kabul edilen bu yöntem, özellikle lökosit, eritrosit, trombosit ve parazitlerin nükleus ile sitoplazma morfolojilerinin ayırt edilmesinde kullanılmaktadır. Başlıca kullanım alanlarından biri ise sıtma şüphesiyle yapılan kan yaymalarında Plasmodium türlerinin araştırılmasıdır. Ayrıca, parazitoloji alanında diğer kan protozoonlarının ve mikroflaryaların tanısında, Chlamydia spp. şüpheli örneklerde inklüzyon cisimciklerinin tespitinde de Giemsa boyasından yararlanılmaktadır. Bunun yanı sıra, bazı bakteriyel, viral ve fungal ajanların doku invazyonları sonucu gelişen patolojilerin incelenmesi gibi klinik mikrobiyolojide pek çok durumda Giemsa boyası önemli bir tanı aracı olarak kullanılmaktadır. Giemsa boyasının bileşiminde hem asidik hem de bazik boyalar yer almaktadır; bu karışım özellikle azur-eozin ve metilen mavisi içerir. Giemza Boyama Basamakları Giemza boyama yönteminin uygulama aşamaları aşağıdaki şekilde özetlenebilir: · Bir boyama şalesine konmak üzere %2.5 konsantrasyonda 40 mL Giemsa çalışma solüsyonu hazırlanır. · İkinci bir şaleye 40 mL tamponlu su konur ve içine 20 µL Triton X-100 eklenir (mikroflarya incelemesi için bu miktar 200 µL’ye çıkarılır). Yaymalar, Giemsa çalışma solüsyonu bulunan şaleye yerleştirilir ve 45-60 dakika süreyle bekletilir. · İnce yayma lamı, şaleden çıkarıldıktan sonra tamponlu suya daldırılır ve 3-4 kez batırılıp çıkarılarak yıkanır. Kalın damla preparatı ise tamponlu su içinde yaklaşık 5 dakika süreyle bekletilmelidir. MİKROORGANİZMALARINBOYANMA VE MİKROSKOPİK TANI YÖNTEMLERİ   75 · Lamlar dik pozisyonda dizilerek havada kurutulur ve ardından mikroskopta incelenir. Giemza Boyanın Değerlendirilmesi Plasmodium varlığında, parazitlerin sitoplazması mavi; nükleer materyali ise kırmızı veya mor-kırmızı renkte boyanır. Enfekte eritrositlerde ise Schüffner granülleri ve diğer inklüzyonlar kırmızı renkle belirginleşir. Mikrofilaryalar genellikle mavi-mor renkte görünürken, kılıfları boyanmayabilir. Göz veya ürogenital örneklerden hazırlanan yaymaların Giemsa boyamasında, enfekte hücrelerde Chlamydia spp. inklüzyon cisimcikleri bazofilik özellik göstererek koyu mavi-mor renkte boyanır. 6. Sonuç ve Öneriler Sonuç olarak, mikroorganizmaların tanımlanmasında kullanılan boyama yöntemleri, mikrobiyolojik tanının temel taşlarından biri olmaya devam etmektedir. Basit, diferansiyel ve özel boyama teknikleri, mikroorganizmaların morfolojik ve yapısal özelliklerinin ortaya konulmasında önemli katkılar sağlamakta; Gram boyama başta olmak üzere çeşitli yöntemler hâlen tanıda altın standart olarak kabul edilmektedir. Günümüzde moleküler ve immünolojik yöntemlerin gelişmesine rağmen, klasik boyama teknikleri hem hızlı ve ekonomik olmaları hem de diğer tanı yöntemlerini destekleyici nitelikleriyle mikrobiyolojik tanıda vazgeçilmez bir rol üstlenmektedir. Kaynakça 1. Ahern H. Microbiology: A Laboratory Experience. Open SUNY Textbooks; 2018. 2. Arda M. Boyalar ve boyama metotları. mikrobiyoloji.org. Published 2009. Accessed August 5, 2025. http://www.mikrobiyoloji.org/TR/Genel/BelgeGoster. aspx?F6E10F8892433CFFAAF6AA849816B2EF390D47D60FBD4D6B 3. Microbe Notes. Gram staining: principle, procedure & result interpretation. Accessed August 5, 2025. https://microbenotes.com/?s=gram+staining+steps 4. Arda M. Mantar preparat ve kültür hazırlama yöntemleri. mikrobiyoloji. org. Published 2009. Accessed August 7, 2025. http://www.mikrobiyoloji. org/TR/Genel/BelgeGoster.aspx?F6E10F8892433CFFA79D6F5E6C1B43FF76748A22998D156C 76   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 5. Aryal S. Negative stainingprinciple, reagents, procedure and result. microbiologyinfo.com. Published 2022. Accessed August 10, 2025. https:// microbiologyinfo.com/negative-staining-principle-reagents-procedure-andresult/ 6. Lermi A. ARB boyama nasıl yapılır. enfeksiyonhastaliklari.com. Published 2017. Accessed August 11, 2025. https://enfeksiyonhastaliklari.com/ arb-boyama-nasil-yapilir/ 7. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu. UMS Bulaşıcı Hastalıklar Laboratuvar Tanı Rehberi-Cilt 2. Sağlık Bakanlığı; 2014. Accessed August 1, 2025. https:// gida.erciyes.edu.tr/EditorUpload/Files/bakterilerde-basit-boyama-yontemi.pdf 8. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu. UMS Bulaşıcı Hastalıklar Laboratuvar Tanı Rehberi-Cilt 3. Sağlık Bakanlığı; 2014. Accessed August 3, 2025. https:// hsgm.saglik.gov.tr/depo/birimler/mikrobiyoloji-referans-laboratuvarlari-vebiyolojik-urunler-db/Dokumanlar/Rehberler/UMS_LabTaniRehberi_Cilt_3.pdf 9. Beşe M. Mikrobiyoloji’de Kullanılan Boyalar ve Boyama Yöntemleri. İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları; 1993:1-226. 10. Temiz A. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Hatiboğlu Yayıncılık; 2021:1-250. 11. Koneman EW, Procop GW, Church DL, Hall GS, Janda WM, Schreckenberger PC, Woods GL. Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 7th ed. Wolters Kluwer; 2017:23-1229. 12. Ertürk Ö, Aydın S, Karaman Ü, Odabaş Alver D. Genel Mikrobiyoloji. Nobel Akademik Yayıncılık; 2022:47-51. 77 BÖLÜM VI BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI BacterialCultureMethodsandUsedMedia Hatice BİRGİN1 1(Arş. Gör. Dr.), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail:htcbir[email protected] ORCID: 0009-0003-8293-5175 1. Besiyeri Besiyeri, mikroorganizmaların üretilmesi ve sahip oldukları aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla gerekli besin maddelerini ve koşullarını sağlayan, genellikle laboratuvarlarda kullanılan yapay veya doğal ortamlardır. Besiyerleri mikroorganizmaların uygun koşullarda çoğaltılması için optimum bir ortam sağlarlar. Bu sayede saf kültürler elde edilir, mikroorganizma tanımlanır ve sayımları yapılabilir. Ayrıca mikroorganizmaların yapısal ve kimyasal özelliklerinin değerlendirilmesinde, antimikrobiyal ajanlara karşı direnç profillerinin belirlenmesinde ve sterilizasyon testlerinde besiyerlerinden faydalanılır. Ek olarak, mikroorganizmaların ürettikleri metabolik maddelerin elde edilmesi ve test edilmesi sırasında da besiyerleri kullanılır. Pek çok kullanım alanlarının bulunması, besiyerlerini mikrobiyolojik çalışmaların ayrılmaz bir bileşeni yapmaktadır. 1.1.BesiyeriBileşimineGirenMaddeler Besiyerleri hazırlanırken amaç, hedef organizmanın gelişmesini optimize edecek konsantrasyonlarda gerekli besin maddelerinin dengelenmiş karışımını sağlamaktır. Besin öğelerinin fazla veya eksik olması optimal besiyeri elde edilmesini engeller. Örneğin, üreme için gerekli faktörlerin eksik veya fazla olması bakterinin üremesini olumsuz etkileyebilir. Temel besin kaynağı olan 78   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER glikoz dahil olmak üzere tüm besin öğeleri, konsantrasyonları arttıkça baskılayıcı etki yaparlar. Besiyeri bileşiminde bulunan maddeler ya mikroorganizmanın gelişimi için ya mikroorganizmaların üremesini baskılamak için veya üreyen mikroorganizmanın hangi mikroorganizma olduğunu anlamaya yardımcı bileşenlerdir. Mikroorganizma gelişimi için eklenen maddeler mikroorganizmanın canlılık faaliyetlerini sürdürebilmek için zorunlu olan maddelerdir. İnhibitör maddeler besiyerinde gelişmesi istenmeyen mikroorganizmaların üremesini baskılayan bileşiklerdir. Ayrıca üreyen mikroorganizmanın hangi metabolik aktiviteler yaptığını ortaya koymak için çeşitli indikatörler ve ayıraçlar besiyerine eklenebilir. Besiyerinde bulunan maddeler: a. Su Besiyeri hazırlanmasında kullanılan suyun kalitesi, mikrobiyolojik ve kimyasal açıdan büyük önem taşımaktadır. Kullanılan suyun taze hazırlanmış, damıtılmış (tercihen cam sistemlerde) veya iyon değiştirici reçinelerden geçirilerek elde edilmiş deiyonize (demineralize) su olması gerekmektedir. Özellikle deiyonize sularda mikrobiyal kontaminasyon riski bulunduğundan, mikrobiyolojik kalite kontrolü dikkate alınmalıdır. Saf su sistemleri ile bu suyun depolandığı kapların düzenli olarak temizlenmesi önemlidir; zira zamanla alg gelişimi meydana gelebilir ve bu alglerin ürettiği metabolitler, duyarlı mikroorganizmaların gelişimini olumsuz etkileyebilir. Saf suyun pH aralığı 6.5–7.5 olmalıdır. Depolama sürecinde atmosferik CO₂’yi absorbe eden saf su, asidik pH değerleri gösterebilir bu nedenle pH değeri 5.5’in altına düştüğünde su ısıtılarak CO₂ uzaklaştırılmalı, pH kontrolü yeniden yapılmalı; gerekirse NaOH ile nötralizasyon uygulanmalıdır. Asidik su, besiyeri bileşimindeki maddeleri etkileyerek istenmeyen değişimlere yol açabilir. Aylık olarak yapılan kontrollerde toplam bakteri sayısı 1.000 kob/mL’yi, depolanmış sularda ise 10.000 kob/mL’yi geçmemelidir. Klor kalıntısı negatif olmalı ya da kullanılan testin tespit sınırının altında bulunmalıdır. Yıllık analizlerde ise kurşun (Pb), kadmiyum (Cd), krom (Cr), bakır (Cu), nikel (Ni) ve çinko (Zn) gibi ağır metallerin her biri 0,05 mg/L’yi, toplamda ise 0,1 mg/L’yi geçmemelidir. Belirlenen sınırların aşılması durumunda düzeltici ve önleyici faaliyetler planlanmalı ve kayıt altına alınmalıdır. BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   79 b. Pepton Peptonlar, et, kazein ve soya gibi protein kaynaklarının enzimatik hidrolizi (örneğin pepsin, tripsin, papain) ile elde edilen, polipeptit, dipeptit ve aminoasitleri içeren kompleks karışımlardır. Bu ürünler suda kolay çözünür ve ısıya dayanıklıdır; koagülasyon göstermezler. Peptonlar, mikroorganizmalar için başta azot olmak üzere aynı zamanda karbon kaynağı olarak da önemli bileşenlerdir. Ayrıca içeriklerindeki bazı aminoasitler ve vitaminler, birçok mikroorganizma için büyüme faktörü olarak işlev görür. Mikrobiyolojik uygulamalarda, formüle dayalı besiyeri hazırlanıyorsa, formülde belirtilen peptonun kullanılması zorunludur. Ayrıca peptonlar, belirli durumlarda tek başlarına (%1 oranında) besiyeri olarak kullanılabilecek nadir bileşenlerdendir. Genel bir ifade olarak, mikrobiyolojide “pepton” denildiğinde, pankreatik enzimlerle hidrolize edilmiş et peptonu (Peptone from meat, pancreatic) kastedilmektedir. Bu tür peptonlar, ticari firmalar tarafından farklı amaçlara yönelik üretilip çeşitli adlarla pazarlanmaktadır. c. Maya Ekstraktı Maya ekstraktı (maya özütü, yeast extract) Saccharomyces cerevisiae türü bira veya ekmek mayasının proteolitik enzimlerce hidrolize edilmesi sonucu oluşturulan bir maddedir. Bu işlem sonucunda Saccharomyces cerevisiae’lerin içeriğindeki aminoasitler, peptitler, vitaminler, karbonhidratlar ve mineraller serbestleşir ve mikroorganizmaların gelişebilmesi için iyi bir kaynak oluşturmuş olurlar. d. Malt Ekstraktı Malt ekstraktı (malt özütü, malt extract), biralık arpanın kontrollü şartlarda çimlendirilmesi ve kavrulmasıyla elde edilen malttan üretilen, zengin karbonhidrat içeriğine sahip bir biyolojik üründür. Özellikle yüksek oranda içerdiği maltoz ve diğer çözünür karbonhidratlar sayesinde, maya ve küf gibi mantar grubu mikroorganizmaların geliştirilmesi amacıyla mikrobiyolojik besiyerlerinde sıklıkla kullanılmaktadır. e. Et ekstraktı Et ekstraktı (et özütü, meat extract), yağsız etten hazırlanan ham et suyunun su içeriğinin uçurulmasıyla elde edilen, koyu renkli ve macun kıvamında bir üründür. Bu işlem sonucunda, etin suda çözünür fraksiyonları konsantre hale getirilmiş olur. Et ekstraktı; aminoasitler, jelatin, vitaminler 80   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER ve çeşitli mineraller gibi mikroorganizmaların büyümesi için gerekli olan temel besin öğelerini içerir. Karbonhidrat içermemesi, et ekstraktını özellikle karbonhidratlardan asit üretimini değerlendirmeye yönelik biyokimyasal testlerde uygun hale getirmektedir. Bu nedenle, asit oluşum testlerinin yapıldığı besiyeri formülasyonlarında sıklıkla tercih edilmektedir. f. Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract), özellikle üremesi güç (fastidious) patojen bakterilerin kültürlerinde kullanılan zengin besin içerikli biyolojik ürünlerdir. Beyin ve kalp ekstraktı streptokoklar, meningokoklar ve gonokoklar gibi zor üreyen mikroorganizmaların üremesini desteklemek için kullanılmaktadır Çeşitli mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve toksin üretiminin test edilmesi için besiyerlerine katılan özel bileşenler arasında yer almaktadır. g. Agar Agar, mikrobiyolojik besiyerlerinin katılaştırılmasında en yaygın olarak kullanılan doğal jelleştirici maddedir. Bu polisakkarit, Gelidium, Gracilaria ve benzeri kırmızı deniz yosunlarından elde edilir. Mikrobiyolojik analizlerde en uygun kalite, özellikle Gelidium türlerinden elde edilen agar ile sağlanır. Agarın jelleştirici özelliği, yapısında bulunan D-galaktoz türevlerinden kaynaklanmaktadır. Bileşiminde ayrıca eser miktarda inorganik tuzlar, protein benzeri maddeler ve lipitler bulunur. Mikrobiyolojik kullanıma uygun agar, özel saflaştırma süreçlerinden geçirilerek antimikrobiyal bileşiklerden ve pigmentlerden arındırılır. Agarın yapısındaki iki temel polisakkarit olan agaroz ve agaropektin, sırasıyla jelleştirme ve viskozite özelliklerinden sorumludur. Kompleks bir yapıya sahip olduğu ve mikroorganizmalar tarafından sindirilemediği için; besiyerlerine eklenmesinin tek amacı daha katı bir ortam oluşturmaktır. Agarın erime sıcaklığı 40-45°C, katılaşma sıcaklığı ise 85–90°C’dir. İçerisinde agar bulunduran besiyerleri petri kaplarına dökülürken sıcaklığın 40-45°C arasında tutulmasına dikkat edilmelidir. Petri kaplarına döküm esnasında ısı kaybına bağlı katılaşma olmaması ve düzgün bir yüzey oluşabilmesi için döküm sıcaklığı önemlidir. h. Karbonhidratlar Besiyerlerine karbonhidratlar genellikle enerji ve karbon kaynağı olarak eklenirler. Ayrıca mikroorganizmaların karbonhidratları metabolize etme yeteneklerine göre sınıflandırılması ve tanımlanmaları için besiyerlerine BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   87 ayırt edilmelerini sağlar. Örnek olarak Eozin Metilen Mavisi (EMB) agar verilebilir. EMB agar içerisinde bulunan eozin ve metilen mavisi ile gram pozitif bakterilerin üremesini inhibe ederken, içerdiği laktoz şekeri sayesinde laktozu kullanan mikroorganizmaların tanınmasını kolaylaştırır. Şekil 1. Soldaki besiyeri koyun kanlı agar sağdaki besiyeri eozin metilen blue (EMB) agardır. EMB agarda laktozu kullanan bakteri kolonilerinin mor renk değişimi izlenmektedir. E. Zenginleştirici Besiyerleri: Çeşitli mikroorganizmaların bulunduğu floralı ortamlarda hedeflenen bakterilerin izolasyonunu kolaylaştırmak amacıyla kullanılan besiyerleridir. Üremesi istenen mikroorganizmaların spesifik büyümesini sağlamak amacıyla özel besin maddelerini içeren besiyerleridir. Selenit Broth ve Tetrathionate Broth Salmonella izolasyonu için kullanılan zenginleştirici besiyerlerine örnek verilebilir. F. İdentifikasyon (tanımlama) besiyerleri: Mikroorganizmaların cins veya tür düzeyinde ayrımını yapabilmek için dizayn edilmiş özel besiyerleridir. Seçici ve ayırt edici özellikte besiyerleridir. Üreyen mikroorganizmaların kullandığı substrat molekülleri veya oluşturduğu ürünlere göre içerisindeki çeşitli ayıraçlarla mikoorganizmaların tespit edilebildiği besiyerleridir. İdentifikasyon besiyerleri mikroorganizmaların izolasyon aşamasından başlanarak daha hızlı tanımlanmasına yardımcı olurlar. Triple Sugar Iron (TSI) Agar birkaç biyokimyasal tepkimenin test edildiği ve bakteri tanımlanmasında kullanılan bir besiyeridir. 88   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Şekil 2. Bakteri tanımlanmasında kullanılan bazı besiyerleri. Soldaki Triple Sugar Iron (TSI) Agar, ortadaki Indol agar, sağdaki Sitrat agar G. Transport (Taşıma) Besiyerleri: Çalışılacak numunelerde bulunması muhtemel mikroorganizmaların kültürünün yapılıncaya kadar çevresel şartlardan korunabilmesi ve canlılıklarının muhafaza edilebilmesi için özel olarak oluşturulmuş besiyerleridir. Transport besiyerleri taşıma esnasında mikroorganizmanın metabolik aktivitesini devam ettirebilmesi için uygun miktarda besin maddeleri içerirler. Cary Blair ve Stuart besiyeri, yaygın olarak kullanılan taşıma besiyerleridir. H. Saklama Besiyerleri Laboratuvarda izole edilen mikroorganizmaların canlılıklarının kaybolmadan uzun zamanlar saklaması için kullanılan besiyerleridir. Mikroorganizmalar saklama besiyerlerinde genotipik ve fenotipik özelliklerini değiştirmeden metabolik aktivitelerini minumum seviyede uzun süreler sürdürebilirler. Gliserollü buyyon besiyeri saklama amacıyla sık kullanılan bir besiyeridir. I. Özel amaçlı besiyerleri Çeşitli çalışmalarda veya sektörlerde mikroorganizmaların ürettiği toksin, enzim, antimikrobiyal maddeler ve metabolik ürünlerin elde edilmesini kolaylaştırmak için düzenlenmiş besiyerleridir. Özel amaçlı besiyerleri genellikle endüstriyel ve biyoteknoloji alanlarındaki mikrobiyoloji laboratuvarlarında tercih edilir. Clostridium tetani bakterisinden tetanoz toksininin üretilebilmesi için kullanılan özel toksin üretim besiyerleri veya Penicillium türlerinden penisilin elde edilmesi için kullanılan antibiyotik üretim mediumları bu gruba örnek besiyerleridir. Bu besiyerleri ile hedef kimyasalların üretilmesi amaçlanır BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   89 ve bu maddelerin üretimini kolaylaştıracak spesifik besin kaynakları, indikatörler ve substratlar ihtiva ederler. İ. Özgül Besiyerleri: Spesifik bir mikroorganizmanın veya mikroorganizma grubunun üremesini desteklemek amacıyla oluşturulmuş besiyerleridir. Bordetella pertussis izolasyonu için kullanılan Bordet-Gengou agar özgül bir besiyeridir. Aynı şekilde, Vibrio türlerinin izolasyonu için kullanılan TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Sucrose) Agar da özgül besiyerlerine örnek verilebilir. Bu tür besiyerleri sadece hedeflenen mikroorganizmanın ihtiyacı olan besinleri bulunduran ve diğer mikroorganizmaların üremesini engelleyen inhibitör içeren besiyerleridir. 1.4.BesiyeriHazırlanması Besiyeri hazırlamadan önce laboratuvarda kullanılacak besiyeri miktarı ve çeşidi belirlenmelidir. Laboratuvarın normal koşullardaki çalışma kapasitesine göre günlük veya haftalık olacak şekilde hazırlanacak besiyerleri ve kullanılacak petri ve tüp sayısı hesaplanır. Bu hesaplamalar extra bir durum yoksa her petri kabına 15-25 mL, deney tüpüne ise 5-10 mL hacimde besiyeri eklenir. Ayrıca petri kabının ve deney tüpünün çapına ve kullanım amacına göre miktarlar değişkenlik gösterebilir. Besiyerleri genellikle tek tek bileşenlerinin tartılarak eklenmesi veya hazır karışım toz formlar şeklinde temin edilerek hazırlanabilir. Genellikle laboratuvarlarda uzun raf ömrü, hazırlama kolaylığı ve kalite kontrollerinin yapılmış olması gibi avantajları nedenlerden dolayı sıklıkla hazır dehidre besiyerleri kullanılmaktadır. Besiyeri çeşidine göre dehidre besiyeri; içeriğinde bulunan çeşitli maddelerin belirli oranlarda bir araya getirilip kurutularak toz veya granül haline getirilmesi ile oluşturulmuş hazır ticari besiyerleridir. Bazı durumlarda besiyeri hazırlamada kullanılan diğer bir yöntem ise tüm bileşenlerin ayrı ayrı alınarak besiyeri çeşidine uygun formülasyonda tartılarak bir araya getirilmesidir. Bazı araştırma ve deneysel çalışmalar için esneklik kazandıran bir yöntemdir. Besiyeri içerisine giren bileşenlerin çeşitlerinde ve miktarlarında ayarlama yapma imkânı sağlar. Bu bölümde laboratuvarlar tarafında daha sık kullanılan yöntem olan dehidre besiyerinden besiyeri hazırlama aşamaları sırasıyla anlatılacaktır. A. Tartım İşlemi Hazır dehidre besiyeri paketleri üzerinde gerekli toz besiyeri miktarı; hacim(litre) başına ne kadar ekleneceği belirtilmektedir. Hazırlanmak istenen 90   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER besiyeri hacmi belirlendikten sonra hacme uygun bir kap (erlen veya balon) seçilir ve dehidre besiyerinden uygun miktarda alınarak eklenir. Kabın hacmi hazırlanacak besiyeri hacminde fazla olmalıdır ısıtma ve çalkalama işlemlerinin rahat yapılabilmesi için kabın üst kısmında yeterince boş alan bırakılmalıdır. Tartım esnasında erlen veya balon joje içerisine dehidre besiyeri doğrudan konmamalıdır öncelikle özel bir tartım kabı veya küçük beherlerde tartımı yapılmalıdır. Daha sonra besiyerinin hazırlanacağı kaba alınarak uygun hacimde distile su eklenir, çalkalama veya ısıtma işlemi ile besiyerinin su içerisinde çözünmesi sağlanır. Bu şekilde besiyeri homojen hale getirilmiş olur. B. Sterilizasyon Besiyeri hazırlamak için oluşturulan karışımın steril hale getirilmesi gerekmektedir. Besiyeri hazırlama esnasında kullanılan kaplar, malzemeler ve kimyasal maddelerin içerisinde bulunabilecek mikroorganizmaların elimine edilmesi için sterilizasyon işlemine tabi tutulmalıdır. Yapılan çalışmalarda besiyerinde sadece çalışılmak istenen numuneden alınan mikroorganizmaların üretilebilmesi için önemli bir adımdır. Besiyeri hazırlarken sterilizasyon yöntemi olarak en sık otoklavda basınçlı buhar yöntemi kullanılmaktadır. Otoklavda sterilizasyon işlemi yapılamadığı durumlarda kaynatma, tindelizasyon ve membran filtrasyon yöntemi kullanılabilir. Kuru sıcak sterilizasyon yönteminin kullanılmasında besiyeri ve çözeltilerde kaçınılmalıdır. C. pH ayarlaması Sterilizasyon işlemi tamamlandıktan sonra besiyerinin oda sıcaklığında (25°C) pH değeri belirlenmelidir. Besiyerinin pH değerinin sterilizasyon öncesi ayarlanması önerilmez, işlem sonrası pH’da değişimler yaşanabilir ve istenen pH değerini yakalamak zorlaşır. Sterilizasyon sonra pH ayarlaması yapılırken aseptik şartların sağlanmasına önem gösterilmelidir. Bu nedenle sıklıkla filtrasyon yöntemi ile sterilize edilmiş HCI veya NaOH kullanılır. Besiyerinde belirli bir hacim alınarak titrasyonlar sonucu pH ayarı yapılır. Titrasyon sonuçlarına göre toplam besiyerine hacmine eklenecek asit veya baz tampon çözeltilerin hacmi hesaplanır. Katı besiyerlerinde pH ölçümleri besiyeri sıcakken ve henüz katılaşmamışken yapılmalıdır ve pH ölçümleri yapılırken elde edilen değerler sıcaklık düzletmesine göre hesaplanmalıdır. Besiyeri pH ayarlanmasında pH metre kullanılmaktadır ancak pH metre olmadığı durumlarda pH kâğıdı kullanılabilir. Kullanılacak pH kağıdının ölçüm aralıkları belli olmalıdır ancak yinede hassas ölçümler için yeterli değildir, pH hakkında yaklaşık bir bilgi sunar. BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   91 D. Katkı Maddelerinin Besiyerine İlavesi Besiyerine eklenecek katkı maddelerinin bir kısmı otoklav ile sterilizasyon işlemi sırasında bozulabilir (antibiyotikler, vitaminler, kan, yumurta) veya diğer kimyasallarla reaksiyona girebilir. Bu sebeple bu tarz katkı maddeleri besiyerine otoklavlama işlemi sonrası aseptik şartlarda ilave edilirler. Katkı maddeleri sıvı besiyerine oda sıcaklığında kolaylıkla eklenirken katı besiyerlerinde ise agar katılaşmadan yaklaşık 45–50°C sıcaklık aralığında iken ilave edilmelidir. Katı maddelerinin soğuk olması durumunda ani sıcaklık kaybından dolayı besiyerinde katılaşmalar yaşanabilir buda homojen dağılımı bozabilir. Bu nedenle katkı maddelerinin yaklaşık 30–35°C’ye ısıtılarak yavaş bir şekilde besiyerine eklenmesi önerilir. Genellikle katkı maddeleri steril (antibiyotikler) veya pastörize edilmiş (yumurta) bir şekilde ticari olarak elde edilir. Kullanılacak kan aseptik koşullarda alındığında steril kabul edilir. Diğer asitler, vitaminler ve bazı şekerler filtrasyon yöntemi ile steril hale getirilir. Liyofilize formda bulunan katkı maddelerinin su ilavesi ile eritilmesi ve tam çözünmesi sağlanmalı ve işlemler esnasında aseptik koşullara dikkate edilmelidir. Sıvı katkı maddeleri besiyerine direk eklenebilir. Genellikle katkı maddeleri tek seferde ve tümüyle besiyerine eklenir ancak hepsinin kullanılamadığı durumlarda ağzı kapalı ve kontaminasyon olmamasına dikkat edilerek saklanmalıdır. E. Petri kutularına döküm Sterilizasyon işlemi ve katkı maddelerinin ilavesinin ardından sıvı besiyerleri deney tüplerine katı besiyerleri deney tüpü veya petri kaplarına aseptik koşullar altında dökülerek besiyerleri kullanıma hazır hale getirilmiş olur. Döküm esnasında besiyerleri iyice çalkalanarak homojenliğinden emin olunmalıdır. Petri kaplarının çapına bağlı olarak kap başına dökülecek besiyeri hacmi belirlenir. Genellikle besiyerinin 2-5 mm yükseklikte olması istenir. Standart 9 cm bir petri kabı için her kaba 15-20 mL (ortalama 20 mL) besiyeri hacmi eklenmelidir. Agar içeren katı besiyerlerinde besiyerinin sıcaklığının yaklaşık 50°C’ye kadar soğuması beklenir. Bu sıcaklık besiyerinin katılaşmasını kolaylaştırmak ve petri kabının kapağında yoğuşmanın oluşmasını engellemek için ideal sıcaklıktır. Yüksek sıcaklıklarda besiyeri dökülmesi durumunda petri kabında 92   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER birikecek yoğun su buharı daha sonra yapılacak kurutma işlemini zorlaştıracaktır. Besiyeri dökülen petri kutuları düz ve sabit zeminde soğumaya bırakılır. Deney tüplerinde agarlı besiyeri hazırlanması isteniyorsa standart deney tüplerine yaklaşık 5-10 mL besiyeri eklenir. Daha sonra dik pozisyonda oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Bazı çalışmalar için daha geniş yüzey alanı oluşturmak için eğik (yatık) besiyeri hazırlanabilir. Bu tarz besiyerleri için tüpler dikey pozisyonda değil de bir destek gerecinin üzerine ağızları zeminden 1 cm yukarıda olacak şekilde eğimli bir pozisyonda soğumaya bırakılırlar. Yatık besiyerinin dipteki dik kısmı yaklaşık 2.5 cm yükseklikte olmalıdır. Şekil 3. Besiyeri hazırlama aşamaları F. Kurutma İşlemi Besiyeri yüzeyinin kuruluk derecesi çalışmalar için önemlidir ne çok kuru neden çok ıslak olması istenir. Yüzeyin ıslak olması inkübasyon esnasında petri kabı kapağında su damlası oluşturarak besiyerinin kontaminasyonuna sebep olabilir. Bunun yanı sıra hareketli bakterilerin anormal yayılmasına ve hareketsiz BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   93 bakterilerin normalden büyük boyutlarda koloniler oluşturmasına neden olarak çalışmaların sonuçlarını etkileyebilir. Besiyerinin aşırı kuru olması numune ekiminin sağlıklı olmamasına ve mikroorganizmaların normalden küçük boyutta koloni yapmasına sebep olarak çalışma sonuçlarını yanıltabilir. Besiyeri yüzeyinin kurutulması esnasında çevreden kontaminasyon olmamasına özen gösterilmelidir. Laminer akış kabinleri, kuru hava sterilizatörleri, UV ile sterilize edilmiş alanlar veya hava akımının çok az olduğu ortamlar kurutma işlemi sırasında tercih edilmelidir. Genel olarak kurutma süreci oda sıcaklığında veya 37°C’ye ayarlı kuru hava sterilizatörlerinde 10-15 dakika süreyle petri kutu kapakları altta olacak şekilde ve çok az açık bırakılarak yapılır. Bu işlem için inkübasyon amacıyla kullanılan inkübatörlerin kullanılması kontaminasyon riskini arttıracağından inkübatör kullanımı önerilmemektedir. Şekil 4. Petri kaplarının kapakları hafif aralanarak besiyerleri kuruma işlemine bırakılır. Şekil 5. Kuruma işlemine bırakılan eğik (yatık) besiyerleri 94   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER G. Besiyerlerinin Depolanması Laboratuvarlarda hazırlanana besiyerlerinin depolama süresi ve şartları; besiyeri çeşidine, içerisinde bulunan maddelere, içerisinde bulunduğu kabın ambalajlama türüne (tüp, vida kapaklı şişe, plastik veya cam petri kutusu) ve ortam koşullarına (ışık, nem, sıcaklık) bağlıdır. Bu sebeple her laboratuvar kendi besiyeri hazırlama ve muhafaza etme şartlarını göz önünde bulundurarak kendi depolama sürelerini oluşturmaları gerekmektedir. Uluslararası standartlara göre örneğin; ISO 11133 standartları kapsamında katkı maddesi içermeyen besiyerleri buz dolabında en fazla 3 ay, oda sıcaklığında en fazla 1 ay süreyle saklanabilir. Ancak yine de bazı besiyerlerinin hazırlanır hazırlanmaz kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. H. Besiyeri Kalite kontrolleri Dehidre veya hazır besiyerlerinin ve katkı maddelerinin üretimi esnasında tüm besiyeri üreticileri ISO 11133 standartlarına uymak ve yine aynı standartlar nedeniyle kalite kontrol süreçlerini tamamlamak zorundadır. ISO 11133 standartları üretici sorumluluklarını ve ürün kalitesini sağlamak için gerekli olan şartları sağlar. Kalite standartlarına uygun hazırlanmış besiyeri ve içerikleri kullanıcıların ek kontrole ihtiyaç duymamasını sağlar ancak bazı şüpheli durumlarda kullanıcıların kendi kontrollerini yapması gerekmektedir. Örneğin besiyeri ambalajının bütünlüğü, ürünün rengi ve yapısında bir bozulma olup olmadığının çalışmalar öncesi kontrol edilmesi önerilir. Yeni kullanılacak bir besiyeri daha önce rutinde kullanılan besiyeri ile karşılaştırılarak test edilmesi ve aynı mikroorganizmalarla üretimde yakın sonuçlar alınması diğer bir kontrol yöntemidir. Tüm bu kontrol yöntemleri katkı maddeleri içinde gerçekleştirilmelidir. Kalite kontrol amacıyla test edilecek standart mikroorganizmaların besiyeri üreticileri tarafından açıkça belirtilmesi gerekmektedir. Bu mikroorganizmaların ticari olarak temini bazen pahalı olmaktadır bu nedenle laboratuvarlar kendi mikroorganizma izolat arşivi ile iç kalite kontrollerini yapabilir. Besiyerinin hatalı olduğu veya kalitesinde bir sorun olduğu düşünüldüğü durumlarda üretici veya tedarik eden firma ile iletişime geçilmelidir. 2. Kültür Mikrobiyoloji alanında kültür; mikroorganizmaların üremeleri ve gelişmeleri için uygun fiziksel ve kimyasal şartlar sağlanarak besiyeri denilen BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   95 ortamlarda çoğaltılması işlemidir. Mikroorganizmaların numunelerden izole edilmesi, çoğaltılması ve ileri testlerle ayrıntılı bir şekilde incelenmesi için mikrobiyoloji alanında sık kullanılan bir yöntemdir. Özellikle klinik mikrobiyoloji alanında kan, idrar, beyin omurilik sıvısı vb. hastaya ait numunelerden enfeksiyon etkeni olabilecek mikroorganizmaların tespit edilmesi, tanımlanması ve daha farklı tetkiklerin yapılması için kullanılan kültür işlemi, çoğu zaman enfeksiyon hastalıkları tanısında altın standarttır. Bununla birlikte izole edilen mikroorganizmaların antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde de kültür işlemi önemli bir rol oynar. Bu sayede izole edilen mikroorganizmaların hangi ilaçlara duyarlı hangi ilaçlara dirençli olduğu tespit edilerek tedaviye yön verilmiş olur. Çevresel alanlardan bir tür mikroorganizmanın izolasyonu ve saf bir şekilde elde edilebilmesi içinde kültür yöntemi kullanılır. Ayrıca çeşitli araştırmalarda kültür yapılarak mikroorganizmaların metabolizma, genetik ve patogenezdeki rollerinin aydınlatılması sağlanır. Kültür çeşitli biyolojik ürünlerin (enzim, antibiyotik, probiyotik vb.) elde edilmesi, aşı geliştirilmesi ve çeşitli ilaçların test edilmesi için sıklıkla başvurulan önemli yöntemdir. Tüm bu işlevleri nedeniyle kültür yöntemi tanı ve tedavi, endüstriyel ve akademik çalışmalar için vaz geçilmez bir metottur. 2.1.KültürYöntemleri 2.1.1.KatıKültürYöntemi Mikrobiyoloji alanında en sık tercih edilen bir kültür yöntemidir. Üretilen mikroorganizmaların koloni oluşturabilmesi için agar içeren katı besiyerleri kullanılır. Bu yöntemde amaç üreme esnasında oluşan kolonilerin birbirinden ayırt edilebilmesi ve izole edilmek istenen mikroorganizmanın saf bir şekilde elde edilmesidir. Saf kültür üreme esnasında sadece hedeflenen bir mikroorganizma türünün çoğaltıldığı tanı, araştırma ve biyolojik ürün üretimi esnasında oldukça sık kullanılan bir kültür yöntemidir. Katı kültür yöntemi mikroorganizmaların koloni morfolojilerinin incelenmesi, pigment üretimi ve hemoliz yapma yeteneği gibi çeşitli özelliklerinin belirlenmesine de katkı sağlar. Genellikle dört çeşit teknikle katı besiyerine ekim işlemi yapılır. Sonuç olarak, katı kültür yöntemi, mikroorganizmaların çoğaltılması, saflaştırılması ve özelliklerinin incelenmesi için mikrobiyolojide vazgeçilmez bir tekniktir. Koloni morfolojilerinin gözlemleri, tür tayini ve antibiyotik duyarlılık testleri gibi birçok uygulama bu yönteme dayanır. 96   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER A. Çizim yöntemi: Çizim yönteminde ekilecek olan örnekten steril bir öze yardımı ile alınan numune petri kabındaki katı besiyerine belirli bir düzen içinde yayılarak ekilir. Bu yöntemde amaç daha yoğun mikroorganizma bulunan ekim alanlarından daha az mikroorganizma bulunan alanlara doğru ilerleyerek üreme esnasında kolonilerin tek tek oluşmasını sağlamaktır. Böylece oluşan kolonilerden saf kültür elde edilmesi kolaylaşır. Şekil 6. Çizim yöntemi ile inokülasyon (ekim) işlemi. B. Dökme Plak Yöntemi Bu yöntemde mikroorganizma içerdiği düşünülen örneklerin seri sulandırımı hazırlanır ve her sulandırım içerisinde henüz katılaşmamış yaklaşık 45–50°C’ta sıcaklığındaki besiyeri içerisine petri kaplarına içerisine eklenerek karıştırılır ve katılaşmaya bırakılır. Dökme plak yöntemi ile mikroorganizmaların hem besiyerinin yüzeyinde hem de içerisinde üremesi sağlanmış olur. Bu yöntem belirli hacimdeki canlı mikroorganizma sayısının belirlenmesi için tercih edilmektedir. C. Batırma Yöntemi: Bu yöntem deney tüpünde bulunan katı besiyerine ekim yapmak için kullanılır. Ekilmesi istenen numuneye batırılıp çıkarılan uzun bir iğne daha sonra tüp içerisindeki besiyerinin en dip kısmına kadar batırılır ve çekilir. Bu yöntemle mikroorganizmanın besiyerinde gaz oluşturması, ürediği bölgeye göre bakterinin aerob, anaerob, fakültatif anaerob veya mikrooerob özellikte olması, BAKTERIYEL KÜLTÜR YÖNTEMLERI VE KULLANILAN BESIYERLERI   103 bir rol oynamaktadır. Moleküler tanı yöntemlerindeki hızlı gelişmelere rağmen, kültür ile canlı mikroorganizmaların elde edilmesi, fenotipik özelliklerin gözlemlenmesine olanak tanıması ve yeni tedavi stratejilerine zemin hazırlaması, onu tıbbi mikrobiyolojide vazgeçilmez bir yöntem kılmaktadır. Kaynakça 1. T.C. Millî Eğitim Bakanlığı. Laboratuvar Hizmetleri, Besiyeri. [https:// megep.meb.gov.tr/mte_program_modul/moduller/Besiyeri.pdf](https://megep. meb.gov.tr/mte_program_modul/moduller/Besiyeri.pdf). Accessed August 26, 2025. 2. Besiyerleri. [http://www.mikrobiyoloji.org/TR/Genel/BelgeGoster. aspx?F6E10F8892433CFFAAF6AA849816B2EF50AE810C424EC20D] (http://www.mikrobiyoloji.org/TR/Genel/BelgeGoster.aspx?F6E10F8892433CFFAAF6AA849816B2EF50AE810C424EC20D). Accessed August 26, 2025. 3. T.C. Millî Eğitim Bakanlığı. Laboratuvar Hizmetleri, Mikrobiyolojik Kültür. [https://megep.meb.gov.tr/mte_program_modul/moduller/Mikrobiyolojik%20K%C3%BClt%C3%BCr.pdf](https://megep.meb.gov.tr/mte_program_ modul/moduller/Mikrobiyolojik%20K%C3%BClt%C3%BCr.pdf). Accessed August 26, 2025. 4. Petti CA, Carroll KC. Procedures for the storage of microorganisms. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, eds. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington, DC: ASM Press; 2011:124-131. 5. Prescott LM, Harley JP, Klein DA, eds. Industrial microbiology and biotechnology. In: Microbiology. 5th ed. New York: McGraw-Hill; 2002:1000. 6. Sewell DL. Quality control. In: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington, DC: ASM Press; 1992:13.2.22-23. 7. Pell PA, Sneath PHA. A note on the survival of bacteria in cryoprotectant medium at temperatures above 0°C. J Appl Bacteriol. 1984;57(1):165-167. 8. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. Ayıraçlar, boyalar ve besiyerleri: Bakteriyoloji. In: Başustaoğlu A, ed. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Ankara, Türkiye: Çeviri; 2009:334-364. 9. Genç Ö. Bakterilerin üremesi, metabolizması ve besiyerleri. In: Altındiş M, ed. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı. 1st ed. Ankara, Türkiye: Nobel; 2022:115-132. 104   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 10. Altındiş M, Kutlu HH. Mikroorganizmaların kültür yöntemleri ve sayımı. In: Altındiş M, ed. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı. 1st ed. Ankara, Türkiye: Nobel; 2022:133-148. 11. Riedel S, Hobden JA, Miller S, Morse SA, Mietzner TA. Mikroorganizma kültürleri. In: Yenen OŞ, ed. Jawetz, Melnick & Adelberg Tıbbi Mikrobiyoloji. Ankara, Türkiye: Nobel Tıp Kitapevleri; 2014:67-76. 105 BÖLÜM VII BAKTERİ METABOLİZMASI BacterialMetabolism Esra ÖZ1 1(Arş. Gör. Dr.), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail: [email protected] ORCID:0000-0003-4830-1075 1. Giriş Metabolizma, bir organizmada gerçekleşen tüm biyokimyasal reaksiyonları ifade eder. Bu süreçler; anabolizma ve katabolizma olmak üzere iki genel kategoriye ayrılır. a. Anabolizma, glikoz ve amino asitler de dahil olmak üzere daha basit monomerlerden, karbonhidratlar ve proteinler gibi daha büyük organik bileşikler oluşturur. Bağ oluşumu için enerji gereklidir. b. Katabolizma, ise bu polimerleri karbondioksit, amonyak ve su gibi daha basit moleküllere hidrolize eder. Katabolik reaksiyonlar hücrenin başlıca enerji kaynağıdır. Bakterilerdeki katabolik reaksiyonlar oldukça çeşitlidir, çünkü enerji kaynakları inorganik bileşiklerden (örneğin sülfür, demir iyonu, hidrojen) organik bileşiklere (örneğin karbonhidratlar, lipitler, aminoasitler) kadar uzanır. Bakteriler, O2 ile ilgili davranışlarına göre aşağıdaki gibi sınıflandırılır: a. Fakültatif aerop (anaerob) bakteriler: Bu bakteriler, oksijenli ortamda enerji elde etmek için aerobik metabolizmayı kullanırken, oksijensiz ortamda fermentasyon veya anaerobik mekanizmayı kullanırlar. Bu bakterilere örnek olarak Proteus, Klebsiella, Salmonella türleri ve Stafilokoklar verilebilir. 106   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER b. Zorunlu aerob bakteriler: Bu bakteriler yalnızca O2 varlığında çoğalabilir (Örnek; Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis). c. Zorunlu anaerob bakteriler: Bu bakteriler O2 varlığında ölürler. Metabolizmaları ve hayati enzimleri O2 tarafından inhibe edilir (Örnek; Clostiridium perfiringens). d. Aerotolerant anaerob bakteriler: Bu bakteriler, zorunlu anaerobların aksine, elementel oksijeni tolere edebilmelerine rağmen, besin substratlarını elementel oksijen kullanmadan okside ederler. Beslenme veya metabolik açıdan bakıldığında, bakteriler; heterotroflar (organotroflar) ve ototroflar (litotroflar) olmak üzere ikiye ayrılırlar. Heterotrof (organotrof) bakteriler, enerjilerini sağlamak için karbon kaynağı olarak, en az bir tane organik maddeye ihtiyaç duyarlar. Enerjilerini kimyasal reaksiyonlar ile elde edenler kemoheterotof olarak adlandırılırken, gün ışığından alanlar fotoheterotrof olarak isimlendirilir. İnsan vücudunda yaşayan tüm bakteriler heterotrofik gruba girer. Ancak, bu gruptaki beslenme ihtiyaçları büyük ölçüde değişir. E. coli ve Pseudomonas aeruginosa gibi bakteriler, karbon kaynağı olarak çok çeşitli organik bileşikler kullanabilir ve çoğu basit laboratuvar ortamında çoğalabilir. Haemophilus influenzae ve anaeroblar gibi diğer patojenik bakteriler ise hassastır ve büyüme ortamında vitaminler, pürinler, pirimidinler ve hemoglobin gibi ek metabolitlere ihtiyaç duyarlar. Ototrof (litotrof) bakteriler, enerjilerini sağlamak için tamamen inorganik kimyasalların varlığına ihtiyaç duyarlar. Besin maddesi olarak basit inorganik maddeler (NaCl, FeCl3, MgSO4 vb.), atmosferdeki CO2 veya karbonatları kullanırlar. Kemoototrof ve fotoototrof olmak üzere ikiye ayrılırlar. Kemoototroflar, gerekli enerjiyi inorganik maddelerin oksidasyonu ile sağlarlar. Fotootrof bakteriler, enerjilerini güneş ışığından sağlarlar. 2. Metabolik Gereksinimler Mikroorganizmaların kuru ağırlığının büyük bir kısmı, karbon, hidrojen, azot, oksijen, fosfor ve kükürt elementlerini içeren organik maddedir. Ayrıca, enzimatik katalizi kolaylaştırmak ve hücre zarı boyunca kimyasal gradyanları korumak için potasyum, sodyum, demir, magnezyum, kalsiyum ve klorür gibi BAKTERİ METABOLİZMASI   107 inorganik iyonlara ihtiyaç vardır. Bakteriler ayrıca büyüme ve enerji dönüşümü için gerekli olan birçok oksidasyon-redüksiyon reaksiyonunda fonksiyonel koenzim olarak B-kompleks vitaminlerine ihtiyaç duyarlar. Bütün hücreler yaşamlarını sürdürebilmek için devamlı bir enerji kaynağına ihtiyaç duyarlar. Hücresel “enerji birimi” adenozin trifosfat (ATP) adı verilen bir bileşiktir. Memeli ve bitki hücreleri gibi bakteriler de birincil kimyasal enerji kaynağı olarak ATP’yi veya yüksek enerjili fosfat bağını (-P) kullanır. Mikrobiyal dünyada substrat parçalanması için çeşitli biyokimyasal yollar mevcuttur ve kullanılan belirli yol, son ürünü ve ortamın son pH’ını belirler. Mikrobiyologlar, bu metabolik farklılıkları, bakterilerin tanımlanmasında fenotipik belirteçler olarak kullanırlar. 3. Katabolizma Katabolik reaksiyonlar bir hücrenin major enerji kaynağıdır. Kimyasal bağların kırılmasıyla enerji açığa çıkar. Ancak enerjinin bir kısmı ısı olarak kaybedilir. Katabolik reaksiyonlar sıklıkla degradatif reaksiyonlar olarak adlandırılırlar. Büyük makromoleküllerin, hücre dışında özgül enzimler aracılığıyla yıkılmasıyla başlayan metabolik süreçler gelişir. Monosakkaritler, kısa peptitler ve yağ asitleri gibi oluşan daha küçük moleküller, gerekli transport mekanizmaları ile hücre membranından sitoplazmaya taşınır. Metabolitler bir veya birkaç yolak üzerinden ortak bir ara ürün olan pirüvik aside dönüştürülür. Pirüvik asitten karbonlar ya enerji üretimine yönlendirilir ya da karbonhidratlar, aminoasitler, lipitler ve nükleik asitlerin yapımında kullanılır (Şekil 1). 108   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Katabolizma Şekil 1. Karbonhidrat, Protein ve Yağ Metabolizması. Glikozun yanı sıra, diğer karbonhidratlar, proteinler ve yağlar da hücresel solunum için elektron ve proton sağlayarak enerji kaynağı olabilir. Ara ürünler, yola çeşitli noktalardan girer (3). 4. Enerji Üretimi: Bakteri metabolizması, kullanılan biyokimyasal mekanizmaya bağlı olarak üç gruba ayrılır. A. Aerobik solunum: Elektron transport zincirinde son elektron alıcısı olarak, moleküler oksijenin görev yaptığı metabolik bir süreçtir. Aerobik solunumda, glikozu CO2’ye dönüştüren ve hücrenin önemli miktarda enerji geri kazanmasını sağlayan bir dizi reaksiyon (glikoliz, Krebs siklusu ve solunum zinciri) gerçekleşir. BAKTERİ METABOLİZMASI   109 Glikoliz (Embden-Meyerhof-Parnas Yolu): Bu yolağın reaksiyonları hem aerobik hem de anaerobik şartlarda gerçekleşir. Glikoliz, her biri belirli bir enzim gerektiren, dokuz ayrı biyokimyasal reaksiyonu içeren dokuz adımlı bir biyokimyasal yoldur. Bakterilerin glukoz katabolizmasında en sık kullandığı ve glukozun pirüvata dönüşümünde major yolaktır. Glikoliz’de, altı karbonlu bir glukoz molekülü, nihayetinde iki adet üç karbonlu pirüvik asit (pirüvat olarak da adlandırılır) molekülüne parçalanır. NADH2 formunda indirgeyici güç ve ATP formunda enerji üretilir. Glikoliz çok az enerji üretir; net verimi yalnızca iki molekül ATP’dir. Glikoliz, hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerin sitoplazmasında gerçekleşir. Oksijen yokluğunda enerji üretimini sağlayan esas yol substrat düzeyinde fosforilasyondur. Glikoliz ile oluşturulan pirüvik asit daha sonra, fermentasyon ile bakteri türüne göre değişen çeşitli son ürünlere dönüştürülür. Enterobacteriaceae’nin tüm üyeleri de dahil olmak üzere birçok bakteri tarafından kullanılır. Krebs Siklusu: Glikoliz sırasında üretilen pirüvik asit molekülleri, asetil-koenzim A (asetil-CoA) moleküllerine dönüştürülür ve ardından Krebs döngüsüne girer. Krebs döngüsünün ilk adımında asetil-CoA, oksaloasetat ile birleşerek sitrik asit (bir trikarboksilik asit [TCA]) üretir; dolayısıyla Krebs döngüsünün diğer isimleri de sitrik asit döngüsü, trikarboksilik asit döngüsü ve TCA döngüsüdür. Bu döngüde, sekiz reaksiyonun sonunda biyokimyasal yol, başlangıç noktası olan oksaloasetata geri döner. Krebs döngüsü sırasında yalnızca iki ATP molekülü üretilir, ancak Krebs döngüsü sırasında oluşan birkaç ürün (örneğin NADH, FADH2 ve hidrojen iyonları) elektron transport zincirine girer. Bu döngü sayesinde, lipitlerden köken alan karbonlar (asetil-CoA formunda) enerji üretimine veya biyosentetik prekürsörlerin oluşturulmasına yönlendirilebilir. Ayrıca döngünün birkaç noktasından deamine olmuş aminoasitler giriş yapabilir. Prokaryotik hücrelerde hem Krebs döngüsü hem de elektron transport zinciri hücre zarının iç yüzeyinde gerçekleşir. Elektron Transport Zinciri: Krebs döngüsü sırasında üretilen bazı ürünler elektron transport zincirine (ETZ) girer. ETZ, elektronlar olarak açığa çıkan enerjinin bir bileşikten diğerine aktarıldığı bir dizi oksidasyon-redüksiyon reaksiyonundan oluşur. Bu bileşikler arasında flavoproteinler, kinonlar, hem olmayan demir proteinleri ve sitokromlar bulunur. Oksijen, zincirin sonunda bulunur; son veya terminal elektron alıcısı 110   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER olarak adlandırılır. ETZ’de birçok farklı enzim yer alır; bunlar arasında, elektronları son elektron alıcısı olan oksijene aktarmaktan sorumlu enzim olan sitokrom oksidaz (sitokrom c veya sadece oksidaz olarak da bilinir) da bulunur. Elektron transport zinciri sırasında, oksidatif fosforilasyon olarak bilinen bir süreçle çok sayıda ATP molekülü üretilir. Oksidasyon, elektron kaybını ifade eder ve fosforilasyon ise ADP moleküllerinin ATP moleküllerine dönüşümünü ifade eder. Bir glukoz molekülünün aerobik solunumla katabolizmasından elde edilen net ATP molekül verimi, prokaryotik hücrelerde 38’dir. B. Anaerobik solunum: Bu sistem, aerobik solunumla aynı üç yolu içerir, ancak son elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni kullanmaz; bunun yerine NO3⁻, SO4²⁻, CO3²⁻ve diğer oksitlenmiş inorganik bileşikler kullanılır. Bazı bakteriler, aerobik sitokrom sistemi gibi işlev gören, anaerobik bir solunum sistemi geliştirmiştir; ancak bu sistem, elektron taşınmasında son elektron alıcısı olarak serbest oksijen yerine oksijen içeren iyonları kullanır. Bunlardan nitrat (NO3⁻) ve nitrit (NO2⁻) indirgeme sistemleri en iyi bilinenleridir. Örneğin, fakültatif bir tür olan Escherichia coli, elektronların birleşerek nitrit(NO2⁻) veya başka bir azot ürünü oluşturduğu nitratı (NO3⁻) kullanır. Çeşitli bakteriler tarafından anaerobik olarak indirgenen, oksijen içeren diğer moleküller, karbonatlar ve sülfatlardır. Sülfat, sitokrom zincirindeki elektronlarla birleşerek hidrojen sülfüre (H2S) dönüşür. Anaerobik solunumda üretilen ATP miktarı, aerobik solunuma göre daha azdır. C. Fermentasyon: Fermantasyon, hem zorunlu hem de fakültatif anaeroblar tarafından gerçekleştirilen anaerobik bir süreçtir. Bakteriyel fermentasyon veya oksidasyon için başlangıç karbonhidratı glukozdur. Bakteriler, karbon kaynağı olarak diğer şekerleri kullandığı zaman, öncelikle şekeri glukoza dönüştürürler. Glukoz fermantasyonunun ilk adımı glikolizdir. Fermantasyon reaksiyonlarının bir sonraki adımı, pirüvik asidin bir son ürüne dönüştürülmesidir. Fermantasyonda elektron alıcısı organik bir bileşiktir. Fermantasyonun, enerji üretiminde verimi solunuma (oksidasyon) göre daha azdır, çünkü başlangıç substratı tamamen indirgenmediği için substrattaki tüm enerji açığa çıkmaz. Fermantasyon gerçekleştiğinde, ortamda bir son ürün karışımı (örneğin laktat, bütirat, etanol ve asetoin) birikir. Bu son ürünlerin analizi, özellikle anaerobik bakterilerin tanımlanması için faydalıdır. Son ürün tayini, Enterobacteriaceae’nın tanımlanmasında kullanılan iki önemli tanı testi olan Voges-Proskauer BAKTERİ METABOLİZMASI   111 (VP) ve metil kırmızısı testlerinde de kullanılır. İnsan vücudunda yaşayan mikroorganizmalar tarafından kullanılan bazı fermantasyon yolları şunlardır: Alkollü fermantasyon, başlıca son ürün etanoldür. Saccharomyces gibi mayaların glikozu fermente ederek etanol ürettikleri yoldur. Homolaktik fermantasyon, son ürün neredeyse tamamen laktik asittir. Streptococcus cinsinin tüm üyeleri ve Lactobacillus cinsinin birçok üyesi, pirüvatı bu yolu kullanarak fermente eder. Heterolaktik fermantasyon, bazı laktobasiller bu karışık fermantasyon yolunu kullanırlar ve bu yolun son ürünleri arasında laktik aside ek olarak karbondioksit, alkoller, formik asit ve asetik asit bulunur. Propiyonik asit fermantasyonu, propiyonik asit, Propionibacterium acnes ve bazı anaerobik, spor oluşturmayan, gram pozitif basiller tarafından gerçekleştirilen fermantasyonların başlıca son ürünüdür. Karışık asit fermantasyonu, Enterobacteriaceae familyasındaki Escherichia, Salmonella ve Shigella cinslerinin üyeleri, şeker fermantasyonu için bu yolu kullanır ve son ürün olarak da laktik, asetik , süksinik ve formik asitler gibi bir dizi asitler üretilir. Üretilen güçlü asit, bu organizmaların metil kırmızısı testinde gösterdiği pozitif reaksiyonun temelini oluşturur. Bütandiol fermantasyonu, Enterobacteriaceae familyasındaki Klebsiella, Enterobacter ve Serratia cinslerinin üyeleri, şeker fermantasyonu için bu yolu kullanır. Son ürünler asetoin (asetil metil karbinol) ve 2,3-bütandioldür. Asetoinin tespiti, bu mikroorganizmaların pozitif Voges Proskauer (VP) reaksiyonunun temelini oluşturur. Bu yolakta az miktarda asit üretilir. Bu nedenle, pozitif VP reaksiyonu gösteren organizmalar genellikle metil kırmızısı testinde negatif reaksiyon gösterir ve bunun tersi de geçerlidir. Bütirik asit fermantasyonu, birçok Clostridium türü, Fusobacterium ve Eubacterium dahil olmak üzere bazı zorunlu anaeroblar, asetik asit, karbondioksit ve hidrojenle birlikte, birincil son ürün olarak bütirik asit üretirler. Bakteriler glukozu pirüvik asite yıkmak için major olarak üç biyokimyasal yolak kullanırlar. Bunlar; Glikoliz (Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)Yolağı), Pentoz Fosfat Yolağı, Entner-Doudoroff Yolağı Pentoz Fosfat Yolağı Karbonhidrat metabolizması için glikoliz (EMP) yoluna alternatif bir yoldur. Glikozun ribuloz-5-fosfata dönüştürülmesi ve ribuloz-5-fosfatın diğer 3, 4, 5, 6 ve 7 karbonlu şekerlere dönüştürülmesi gerçekleşir. Nükleotid 112   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER sentezi için pentoz sağlar. Pirüvata dönüştürülebilen gliseraldehit-3-fosfat ve biyosentetik reaksiyonlar için indirgeyici güç sağlayan NADPH üretilir. ATP üretmek için kullanılabilir ancak verim EMP yolundan daha azdır. Laktobasiller gibi heterolaktik fermentasyon yapan bakteriler ve EMP yolunda gerekli olan bazı enzimlerden yoksun olan Brucella abortus tarafından kullanılır. Entner-Doudoroff Yolağı Glukoz-6-fosfatı (glukoz yerine) pirüvata ve gliseraldehit fosfata dönüştürür ve bu da diğer yollara yönlendirilebilir. Glukoz molekülü başına bir NADPH üretir ancak bir ATP kullanır. Pseudomonas alcaligenes, Enterococcus faecalis ve belirli glikolitik enzimlerden yoksun diğer bakteriler tarafından kullanılan aerobik bir süreçtir. 4. Sonuç ve Öneriler Bakteriler, çeşitli bileşikleri substrat olarak kullanma ve üretilen son ürünlerde büyük farklılık gösterir. Bu nedenle bakteri metabolizmasını anlamak, bakterileri tanımlamaya yönelik süreçte yardımcı olacaktır. Kaynakça 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6. baskı. Ankara, Turkey: Dr. Ahmet C. Başustaoğlu; 2010. 2. Cowan MK, Smith H. Microbiology: A Systems Approach. 5th ed. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2018. 3. Pommerville JC. Alcamo’s Fundamentals of Microbiology. 9th ed. Burlington, MA: Jones and Bartlett; 2011. 4. Engelkirk PG, Engelkirk JD. Burton’s Microbiology for the Health Sciences. 10th ed. Philadelphia, PA: Wolters Kluwer Health; 2015. 5. Kayser FH, Bienz KA, Eckert J, Zinkernagel RM. Medical Microbiology. 10th German ed. Stuttgart, Germany: Georg Thieme Verlag; 2001. 6. Rohilla A. Handbook of Bacteriology. Jaipur, India: Oxford Book Company; 2010. 7. Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA, Mietzner TA. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. 26th ed. New York, NY: McGrawHill; 2013. 8. Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G. Textbook of Diagnostic Microbiology. 5th ed. St. Louis, MO: Elsevier Saunders; 2015. 9. Genç Ö. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı. 1. baskı. Ankara, Turkey: Nobel; 2022. BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER . . .   119 de katalaz enzimi içerebileceğinden). Anaerop bakterilerde katalaz enziminin araştırılmasında %15’lik H2O2 solüsyonu kullanılmalıdır. Neisseria türlerinde %30’luk H2O2 kullanılır. Gram pozitif kokların ayrımında (streptokok katalaz negatif, stafilokok katalaz pozitif) yaygın olarak kullanılır. Ayrıca Streptococcus agactia ile Listeria monocytogenes (katalaz pozitif) ayrımında da kullanılabilir. Tüm Enterobacterales üyeleri katalaz pozitiftir. Laboratuvarda yapımı kolay, özel inkübasyon ve deney koşulları gerektirmeyen, hızlı testlerdendir. Test iki farklı şekilde uygulanabilir; a. Lam yöntemi: İncelenecek kültürden öze ile örnek alınarak temiz bir lam üzerinde distile su ile karıştırılarak 1-2 damla %3 konsatrasyonda ‘luk H2O2 eklenir ve homojenize edilir. Hava kabarcığının oluşması pozitif olarak değerlendirilir. b. Tüp yöntemi: Temiz bir tüpe 2 damla (0.1 mL) %3 konsatrasyonda H2O2 konur. Test edilecek bakteri tüpün iç yüzeyindeki solüsyona değdirilir. Tüpün kapağı kapatılarak tüp yatık pozisyona getirilip gaz çıkışı olup olmadığı incelenir. II. Koagülaz Testi Koagülaz plazmanın pıhtılaştırılmasını sağlayarak bakterilerin immüniteden, antibiyotik etkisinden kaçmalarını sağlayabilen bir virülans faktörüdür. Termostabil trombine benzer yapıda bir madde olup, fibrinojen aktivasyonu ile pıhtı oluşumunu sağlar. Bakterilerde ortama salınmış şekilde (serbest) ve hücre duvarına bağlı (clumping faktör) şeklinde bulunabilir. Özellikle Staphylococcus aureus gibi koagülaz üreten stafilokokları diğer stafilokoklardan ayırt etmek için kullanılır. Test denellikle ticari olarak temin edilen EDTA’lı tavşan plazması ile yapılır. İki farklı şekilde uygulanabilir; a. Lam yöntemi: Stafilokoklaraın hücre duvarına bağlı olarak bulunan koagülaz enzimini (clumping faktör) saptamak için uygulanır. Bağlı koagülaz doğrudan plazmadaki fibrinojen ile etkileşerek küme oluşturabildiğinden lamda koagülaz testi ile gösterilebilir. Lam üzerine bir damla (10-15 µL) serum fizyolojik damlatarak, homojen bir bakteri süspansiyonu hazırlanır. Üzerine bir damla tavşan plazması 120   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER konarak dairesel hareketlerle karıştırılır. Önerilen reaksiyon süresi sonunda kümeleşme gözlenmesi durumunda test “pozitif” olarak değerlendirilir. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında sıklıkla tercih edilen koagülaz testi uygulama kolaylığından dolayı lamda koagülazdır. Bununla beraber çeşitli durumlarda (kapsüllü izolatlarda clumping faktörün maskelenmesi, sadece serbest koagülazı olan stafilokokların ayrımı gibi) tüp yöntemine ihtiyaç olabilir. Ayrıca ilk etapta bakteri süspansiyonu yaparken kümelenmeler meydana gelmişse bakterinin kendinden kümelenme eğiliminde olduğunda (otoaglütinasyon) da tüp testi yapılmalıdır. b. Tüp yöntemi: Bu yöntemle bağlı ve serbest koagülaz enzimi saptanabilir. Steril bir tüpe 0.5 mL tavşan plazması ve üzerine test edilecek bakteri bir öze dolusu konur. 35-37⁰C’de 4 saat inkübe edilir. Sarsmadan test tüpü kontrol edilir. Plazmanın pıhtılaşmasının gözlenmesi durumunda test “pozitif” olarak değerlendirilir. Tüpte koagülaz testi pozitif ise izolat S. aureus olarak raporlanabilir. S. lugdunensis ve S. schleiferi lam koagülaz testi pozitiftir. Belirtilen türlerin kuvvetli PYR testlerinin pozitif olması ve S. intermedius’un da tüp koagülaz testi negatif olması S. aureus’dan ayrımını sağlar. S. intermedius ve S. hyicus’un tüpte yapılan koagülaz testleri pozitif olabilir, ancak bu türler daha çok hayvan kökenli olup insan enfeksiyonları daha nadirdir (Tablo 1). Tablo 1. Yaygın görülen katalaz pozitif, basitrasin (0.04 U) dirençli Gram pozitif kokların önemli özellikleri. Tür Tipik özellikler Lam* Tüp* Polimiksin B (300 U) PYR S.aureus 1VP + V + RS.intermedius VP – V + S+ S.hyicus VP – - V RS.lugdunensis Ornithin + V - R+ S.schieferi Ornithin – + V S+ S.saprophyticus Novobiyosin R, nonhemolitik - - SS.epidermidis Nonhemolitik - - RS.haemolyticus Üreaz -, VP +, DNase – - - S+ S.caprae Üreaz +, DNase + - - S+ Diğer KNS Nonhemolitik (genellikle), üreaz2V- - SV 1VP: Voges-proskauer,2V: Değişken, *: Koagülaz BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER . . .   121 III. Oksidaz testi Sitokrom oksidaz varlığını araştırmak amacı ile kullanılır. Bakterilerde demirli bir hemoprotein olan sitokrom oksidaz veya indofenol oksidaza enzimleri bulunabilir. Sitokrom oksidaz ve indofenol oksidaz enzimlerinin başlıca görevi NADH molekülünden elektron alıcısına (genellikle oksijene) elektron transferini yönetir. Bu sistemler yalnızca son hidrojen alıcısı olarak oksijeni kullanabilen aerop bakterilerde vardır. Atmosferik oksijen varlığında genellikle tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür substratı emdirilmiş kağıt yada diskler kullanılır. Bu substrat renksiz bir boyadır ve enzim için yapay bir elektron alıcısı görevi yapar. Enzimi içeren bakteri ile temas sonrası boyar maddenin okside olması ile birlikte oluşan ürün (indofenol mavisi) renk değişikliği (koyu mor) ile saptanmış olur. Bu test Gram negatif bakterilerin identifikasyonundaki başlangıç testlerindendir. Genel olarak Enterobacterales üyeleri oksidaz negatif, Pseudomonas spp., Neisseria spp., Moraxella spp., Campylobacter spp. , Pasteurella spp.ve Vibrio türlerinde oksidaz pozitiftir. Test iki şekilde yapılabilir: 1. Absorban bir kağıda substrat olarak kullanılacak olan, %1’lik tetrametilp-fenilendiamin dihidroklorür veya oksalat emdirilir. Platin öze (nikel yada krom öze kullanılmaz, alevde yakma sırasında oksidasyon ürünleri oluşabilir) ile test bakterisine değdirilir. Kağıtta mavi-mor renk değişimi olması pozitif reaksiyon olarak yorumlanır. Besiyerinde 48 saatten fazla beklemiş olan bakterilerde saptanmış olan reaksiyon doğru sonuç vermeyebilir. Genellikle laboratuarlar ticari olarak temin edilen substratın emdirilmiş olduğu hazır test kitlerini kullanır. Testin yapılışı ve sonuç oluşması birkaç dakika olduğundan pratik bir rutin testtir. 2. Bakterilerin yatık hazırlanmış nutrient yatık agar besiyerindeki taze pasajı üzerine %1’lik p-aminodimetil anilin okzalatla α-naftol çözeltisi (%1 etanolde çözdürülen) damlatılır. Gözlemlenen renk reaksiyonu (mavi&mor) olumlu reaksiyon olarak kabul edilir. Bu yöntem uzun sürmesi nedeniyle daha az tercih edilir. Testlerin karbonhidrat içeren veya boya maddeleri içeren (tellürit, eosinmetilen mavisi agar vb.) kültürlerden yapılmaması önerilir. 122   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER IV. Üreaz testi Bakterilerin bazıları üreaz enzimi ile üreyi kullanabilir. Bu enzim üre substratının amonyak (NH3) ve karbondioksite (CO2) ayrışmasını katalize eder. NH3’ın devam eden reaksiyonunda alkali ürün (amonyum karbonat) oluşur. Bu durumda besiyerinde bulunan fenol kırmızısı indikatörü besiyeri renginin pembe-kırmızıya dönüşmesini sağlar. Bu test Enterobacterales’lerin ayrımında sık kullanılır; Proteus spp., bazı Enterobacter türleri, Citrobacter ve Klebsiella spp. üreaz pozitif bu grupta yer alan bakterilerdir. Ayrıca Brucella spp., Helicobacter pylori üreaz pozitif diğer bakterilerdendir. Üre besiyeri agar&broth olarak hazırlanabilir. İçerisindeki fenol kırmızısı ayıracı pH>8.4 olduğunda pembeye dönüştürür. Test yapılan besiyerindeki protein ihmal edilebilir düzeyde olduğundan, bakterinin peptonları hidrolizine bağlı pH değişikliği olması beklenmez. Çeşitli formda üre besiyerleri olabilir; a. Christensen’in üre besiyeri; Üre, pepton, dekstroz, tampon madde, fenol kırmızısı içerir. Katı veya sıvı formları vardır. Katı formda tüplere yatık olarak hazırlanır. Besiyeri hazırlarken üre otoklavlanmaz, filitrasyonla steril edilerek besiyerine ilave edilir. b. Hızlı üre testi; Agar yada buyyon formunda olabilir. Laboratuvar dışında gastrik biyopsi örneklerinde H. pylori araştırmasında da kullanılır. Üre diskler; üre emdirilmiş disklerdir. Kullanımları kolaydır. Yapılışı: Burgu kapaklı tüplerde hazırlanmış olan besiyerine öze ile inokülasyon yapılarak, tüpün kapağı sıkıca kapatılmadan normal atmosferik koşullarda kültüre edilir. Renk değişimi 2., 4., 6. ve 24. saatlerde kontrol edilir. 4. Sülfür, Nitrat ve Amino Asit Metabolizması a. Sülfür Redüksiyon Testi: Bazı bakteriler, sülfatları sülfürlere indirger. Bu test, bakterilerin sülfür kullanıp kullanmadığını anlamaya yardımcı olur. Özellikle gram negatif bakterilerin tanısında faydalıdır. Bu amaçla sülfür-indol hareket besiyeri, KIA veya TSI agar kullanılabilir. Bakteri sülfür bileşiğinin (örneğin sodyum BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER . . .   123 tiyosülfat) tiyosülfat redüktaz veya sistin desülfataz enzimleri ile indirgemesi durumunda oluşan ürünler (H2S gazı) besiyerinde saptanabilir. Salmonella spp, Proteus spp., Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda sülfür redüksiyonu yaparak H2S gazı oluşturan bakterilerdir. b. Nitrat Redüksiyon Testi: Nitratı nitritlere ve diğer türevlerine indirgeme kapasitesi de bakteriyel sınıflandırmada önemli bir özelliktir. Bakterilerin anaerobik solunum yeteneklerini ve azotu metabolizma etme yeteneklerini test etmek için kullanılır. Bakterilerin nitratları (NO₃⁻), nitritlere (NO₂⁻) veya daha ileri düzeyde gaz halindeki azota (N₂) gibi maddelere dönüştürebilmesini gösteren bir testtir. Bu test ile bakterinin nitrat redüktaz enzimi üretip üretmediği değerlendirilir. Bakterilerin oksijen ihtiyacını nitratlardan sağladığının (anaerobik solunum) göstergesidir. Nitrat redüksiyonu testi nitrat buyyon kullanarak yapılır. Ortamdaki nitriti saptayarak veya nitrat veya nitritin ortamda bulunmadığının gösterilmesi prensibi ile test değerlendirilir. Test yapıldığında ortamda nitrit olup-olmadığı eklenen reaktifler (sülfanilik asit+α-naftilamin) eklenmesi ile renk değişikliğin olmasıyla (kırmızı renkli diazonyumun meydana gelmesi) belirlenmiş olur. Eğer testte Durham tüpü kullanılmış ise bakterinin gaz yapıp-yapmadığı da belirlenir. Test Enterobacteralaes türlerinde pozitif olup, üriner enfeksiyonların tanısında kullanılan test striplerinin üzerinde bulunur. Ayrıca nonfermenter bakterilerin, Moraxella, Neisseria, Haemophilus türlerinin ayrımında, Corynebacterium türlerinin tanımlanmasında ve Corynebacterium diphtheriae’nın biyotiplendirilmesinde kullanılır. c. Amino Asit Dekarboksilasyon Testleri: Dekarboksilaz enzimleri, aminoasitlerin karboksil (COOH) grubunu ayrıştırarak çeşitli alkali metabollitler (aminler) meydana gelmesini sağlayan enzimlerdir. Bu reaksiyonlar dekarboksilasyon olarak tanımlanır ve her dekarboksilaz bir amino asite (lisin, ornitin, arginin dekarboksilaz gibi) özgüdür. Lisin, ornitin ve arjinin rutinde en sık test edilen aminoasitler olup, dekarboksilasyonları sonucu sırasıyla kadaverin, putressin ve sitrulin ürünleri oluşur. Aminoasit dekarboksilasyon testleri yaygın olarak Enterobacterales türleri, Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio spp. ve nonfermenter gram negatif bakterilerin identifikasyonunda kullanılır. 124   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Test için baz besiyerleri “Moeller dekarboksilaz” besiyeridir. Temel besiyerinde pepton, maya-özütü, %0.05 glikoz yanı sıra, enzim için ko-faktör olan piridoksal ve indikatör (brom krezol moru+krezol kırmızısı) bulunmaktadır. Test besiyeri belirtilen baz besiyerine lisin, ornitin ve arjinin ilavesi ile oluşturulur. Dekarboksilasyon anaeob şartlarda oluşan bir reaksiyon olduğundan, test bakterisi tüplere eklendikten sonra besiyerinin üzerine mineral yağ ilave edilmelidir. İnkübasyonun başlangıcında glikoz fermentasyonu ile besiyeri sarı, ilerleyen süreçte karbonhidratların tükenip, aminoasitlerin kullanımı sonucu oluşan alkali ürünler ile reaksiyon olan tüplerde renk mora döner. 5. Diğer biyokimyasal testler a. ONPG (O-Nitrofenil-β-D-Galaktopiranosid Testi ) Testi ONPG testi genel olarak Enterobanterales ailesinden bakterilerin laktoz şekerini fermente edip etmediğinin saptanması amacı ile yapılır. Laktozun fermentasyonu için bakterilerde permeaz+beta-galaktosidaz enzimlerinin her ikisi de var olmalıdır. Şekerin hücreye girişi permeaz, stoplazmada parçalanması (galaktoz+glikoz) beta-galaktosidaz enzimlerince yapılır. Laktoz negatif bakterilerde enzimlerin her ikisi de bulunmaz. Bu enzimlerden sadece beta-galaktosidazı olan bakterilerin uygun besiyerinde inkübasyonun erken döneminde laktozu fermente etmediği, bir-kaç gün sonra ise laktoz kullanmış koloniler oluşturduğu (geç laktoz pozitif) görülebilir (eskiyen kültürlerde hücre duvarının geçirgenliğinin artışı ile laktozun hücre içine pasif girmesi nedeniyle) (bazı Escherichia coli türleri gibi). Beta-galaktosidaz enzimi laktozu parçalayan enzim olduğundan ONPG testinde bakteride bu enzimin varlığını araştırarak laktoz fermentatif olup olmadığını saptanır. Testte kullanılan o-Nitrofenil-β-D-galaktopiranosid maddesi enzimin substratına benzeyen renksiz bir maddedir ve hücreye gerçek substrattan daha kolay girer. Permeazın olmadığı bakterilerde hücre içine girerek var ise β-galaktosidaz tarafından hidroliz edilir ve galaktoza ve sarı renkli bir madde olan nitrofenole ayrışır. Laktozlu bir besiyerinde üremiş olan kültürden (KIA/TSI agarda üreyen bakteriler ile en iyi sonuç alınır) bakterinin 0.25 mL steril SF içinde ~2 McFarland bulanıklığında süspansiyonu hazırlanır. 0.25 mL ONPG ve broth eklenerek normal atmosferik koşullarda 35-37°C’de, 3-4 saat üretilir. Eğer tüplerde sarı renk oluşumu gözlenirse bakteride beta-galaktosidaz enziminin var olduğu, gözlenmez ise olmadığı sonucuna varılır. BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER . . .   125 b. L-Pirolidonil β-naftilamid (PYR hidrolizi) Testi Bakterilerin pirolidonil peptidaz enziminin varlığını araştıran bir testtir. Enzimin substratı PYR olup, metabolize edilirse β-naftilamid ürünü oluşur. Bu ürün oluşmuş ise üzerine %0.01’lik sinnamaldehit eklenmesi sonucu oluşan renk değişimi ile tespit edilir. PYR kanserojen bir madde olup, laboratuvar ortamında hazırlanması önerilmez ve genellikle ticari olarak temin edilen PYR içeren kağıt&diskler kullanılır. PYR içeren sıvı şeklinde ticari test formları da vardır. Sıvı formdaki test kitleri özellikle Staphylococcus türlerinin ayrımında tercih edilir. PYR hidrolizi Streptococcus pyogenes, Enterococcus tanımlanmasında yaygın olarak kullanılır. S. pyogenes, Enterococcus izolatlarının %99’u PYR pozitiftir. Koagülaz negatif stafilokokların ayrımında, E. coli’nin biyokimyasal özellikleri ile ayırt edilemediği bazı gram negatif bakterilerden ayırt edilmesinde de kullanımı önerilmektedir. PYR diski ile test yapılırken steril su veya serum fizyolojik ile ıslatılan disk üstüne bakteri sürülür. 2 dakika kadar sonra üzerine 1 damla sinnamaldehit damlatılır. Kırmızısı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilir. c. Safrada Erime Testi Bu test, Streptococcus pneumoniae identifikasyonunda kullanılır. Öyle ki başkaca yöntemlerle S. pneumoniae tanısı alınsa dahi tanının doğrulanmasında da yapılması önerilir. Pratik olarak S. pneumoniae’nın diğer α-hemolitik streptokoklardan ayırt edilmesinde de faydalanılan bir testtir. Üremiş kolonilerin safra tuzları (sodyum deoksikolat) ile muamele edilmesi ile kolonilerde erime meydana gelip-gelmediğinin saptandığı bir testtir. Bu testte pnömokok kolonileri erirken, diğer streptokok kolonileri erimez. S. pneumoniae’da bulunan bazı otolitik enzimlerin (örneğin amidaz) testte kullanılan safra tuzları ile aktive olduğu, böylece hücrenin parçalanmasına yol açtığı düşünülmektedir. Test, tüp veya lam üzerindeki bakteri süspansiyonuna yada direkt olarak plaktaki kolonilerin üzerine safra tuzu damlatılması şeklinde yapılabilir. α-hemolitik streptokoklarda, özellikle de optokinle ayrım yapılamıyorsa, S. pneumoniae olup olmadıklarının teyit edilmesinde faydalıdır. Tüp testi; 0.5 mL SF içerisinde test bakterisinin 1 McFarland bulanıklığında süspansiyonu yapılır. “Test” ve “kontrol” tüpü olarak iki temiz tüp alınarak her iki tüpe de 0.25 mL bakteri süspansiyonu konur. 126   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER -Test tüpüne 4-5 damla %2’lik safra çözeltisi, kontrol tüpüne 4-5 damla SF eklenir ve karıştırılır. - 35°C’de 2 saat kadar inkübe edilir. 15-20 dakikada test tüpündeki bulanıklık kontrol edilir. Berraklaşma yada bulanıklığın kaybolması bakterinin erimesi olarak yorumlanır (pozitif reaksiyon), Direkt plak (spot) testi; Test edilecek bakterinin koyun kanlı agardaki 24 saati geçmemiş olan pasajı ile yapılır. Koloninin üzerine doğrudan bir-kaç damla %10’luk safra solüsyonu eklenir. Agar yüzü yukarı bakacak şekilde plak, etüvde üzerindeki sıvı kuruyana dek tutulur (yaklaşık 15-30 dakika). Plak erime bulgusu açısından değerlendirilir. d. Eskülin ve Safra-Eskülin Testleri Eskülin bir glikoziddir ve bazı bakterilerin ürettiği eskülinaz (β-glikozidaz) enzimi tarafından glikoz+eskületine parçalanır. Oluşan ürünlerden eskületin, demir ile birleşerek (fenolik demir bileşiği) üreme ortamında kahverengi&siyaha renk değişimine yol açabilir. Eskülinin floresan özelliği de olduğundan eğer bakteri tarafından metabolize edilirse floresanın azalması&kaybolması da test değerlendirmesinde kullanılır. Eskülin ihtiva eden kültür ortamına eğer safra tuzları da ilave edilirse, hem safra tuzuna dayanıklılık hem de eskülin hidrolizi test edilebilmiş olur. Bu amaçla kullanılan safra-eskülin agar bakteri üremesi için gereken temel maddelere ek olarak, eskülin, ferrik sitrat ve %40 safra içerir. Bu besiyeri seçici ve ayırt edici bir besiyeridir. Besiyerindeki ferrik sitrat, eskülinin hidroliz ürünü ile reaksiyona girerek testin değerlendirilebilmesini sağlar. Çoğu bakteri asidik şartlarda eskülini hidrolize eder ve safraya tolerans gösterebilir. Buna karşın enterokoklar, Streptococcus bovis grup üyeleri ve L. monocytogenes yüksek safta varlığında ürer ve eskülini hidrolize eder. Özellikle enterokokların sürveyansı amacı ile kullanılan besiyerleri bu şekildedir. e. Tuz Tolerans Testi (%6.5’luk sodyum klorürde üreme) Bakterilerin sodyum klorürün (NaCl) farklı konsantrasyonlarında üreyebilme özelliği birçok bakterinin (enterokok, halofilik vibriolar vb.) identifikasyonunda kullanılır. Özellikle enterokoklarda %6.5 konsantrasyonunda tuzlu suda üremenin gösterilmesi tanıda yaygın kullanılır. Enterokokları diğer streptokoklardan ayıran önemli özelliklerden biri %6.5 NaCl’lü besiyerinde üreyebilmesidir ve PYR testi ile birlikte yapılır. Testin yapılmasında Brain-heart infüzyon broth’a glikoz, %6.5 NaCl ve bir indikatör (bromkrezol moru) ilave edilerek hazırlanan besiyeri kullanılır. Yüksek tuz konsantrasyonu besiyerinde seçiciliği sağlayarak çoğu bakterinin üremesini BAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA TEMEL PRENSİPLER . . .   127 engeller. Üreyebilen bakteriler ise bakterilerin besiyerindeki glikozu kullanması ile açığa çıkmış olan asitik ürünler besiyeri renginin sarıya dönüşmesi ile tespit edilir. Bunun yanısıra herhangi bir indikatör kullanmadan, besiyerinde üreme bulgusu olarak bulanıklığın oluşup oluşmadığı prensibine dayalı olarak da test yapılabilir. Brain-heart infüzyon broth ve %6.5 NaCl ilavesi ile hazırlanan besiyerine test edilecek bakteri ekilir. 24. Saatte tüpte bulanıklık varsa test sonlandırılır, yoksa 72 saate dek beklenir, bulanıklık olmaması test edilen bakterinin tuzlu ortamda üreyemediği olarak değerlendirilir. Enterococcus türleri, S. aureus ve S. agalactiae tuzlu ortamda üreyebilen başlıca koklardır. S. aureus için bu özellik seçicilik sağlamak için hazırlanan mannitol salt agarda da kullanılır. Ayrıca halofilik Vibrio türlerinin tanısında da test faydalıdır. f. Hippurat hidrolizi testi Hippurikinazın enzimatik etkinliği ile bakterilerin hippuratı benzoik asit ve glisine hidroliz etmesinin gösteren biyokimyasal bir testtir. Temel olarak oluşan glisinin indikatör ninhidrin ile reaksiyonu temelli bir testtir. Glisin, ninhidrinin oksitleyici etkisiyle deamine olur, bu da ninhidrinin indirgenmesine neden olur ve mor renkli bir kompleks oluşturur. Kullanılan test besiyerinde protein kaynağı olarak yalnızca hippurat bulunmalıdır, çünkü ninhidrin mevcut tüm serbest aminoasitlerle reaksiyona girer ve yalancı pozitif sonuçlar alınabilir. Testte %1 sodyum hippurat kullanılır. Test edilecek bakterinin taze kültüründen yoğun bir süspansiyon (≥3 McFarland) hazırlanır, 2 saat 35-37°C’de inkübe edilir, inkübasyon sonrası 4 damla ninhidrin solüsyonu eklenir. Tüp 35-37°C’de 30 dakika (10.-15. dakikalarda da renk değişimi açısından değerlendirilir) inkübe edilerek renk değişimi açısından değerlendirilir. L. monocytogenes, C. jejuni, G. vaginalis, S. agactiae hippurat hidrolizi yapan başlıca bakterilerdir. 6. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Bakterilerin antimikrobiyal ajanlara duyarlılıkları belirlenerek tür seviyesinde tanımlama yapılabilir. Bazı bakteriler için duyarlılık paternleri tanımlamada kullanılır: Örneğin S. pneumoniae optokin direnci, S. pyogenes basitrasin duyarlılığı gibi. Bu testler genellikle referans disk difüzyon veya mikrodilüsyon gibi yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Ayrıca antibiyotik duyarlılık testleri ile özellikle kısıtlı imkanları olan kurumlarda hastane enfeksiyonu salgını yapan bakterileri kategorize etmek de mümkündür (antibiotipleme). 128   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Tablo 2. Bakteri tanımlanmasında kullanılan önemli indikatör antibiyotikler. Tür Antibiyotik profil özelliği Streptococcus.pneumoniae Optokin duyarlı Staphylococcussaprophyticus Novobiocin dirençli Staphylococcusepidermidis Novobiocin duyarlı Enterococcusfaecalis, Enterococcusfaecium Farklı vankomisin direnç profilleri Neisseriagonorrhoeae Penisilin direnci varyasyonları Özellikle intrinsik direnç mekanizmaları bilinen izolatlarda tanının doğrulanmasında (örneğin; Klebsiella pneumoniae’da ampisiln direnci, Proteus spp.’de kolistin direnci gibi) standart yöntemlerle saptanan antibiyogram sonuçları da göz önüne alınır. 7. Serolojik Testler Bakterilerin yüzeyinde bulunan antijenlerin veya bakterilere karşı oluşan antikorların varlığını belirlemek için serolojik testler kullanılabilir. Kültürde üremiş olan ve ön tanısı düşünülen bakteriye göre seçilmiş monovalan veya polivalan antiserumlar kullanılarak doğrulama veya serotip tayini yapılabilir (örneğin kültürde Salmonella üremesi durumunda serotip belirleme ve serolojik doğrulama yapılması gibi). Ayrıca direkt klinik tanıya uygun örnek (örneğin boğaz sürüntü örneğinde S. pyogenes, idrarda Legionella pneumophila Serogrup I antijeni araştırılması) alınarak uygulanabilir. Direk örnekten yapılan testler hasta başı testler (POCT) hızlı tanıda önemli olup, rasyonel antibiyotik tedavilerinin uygulanması açısından da önemlidir. Bununla birlikte bu testler ile saptanan sonuçların klinik bulgularla birlikte değerlendirilmesi, gerekli durumlarda mutlaka kültürle doğrulanması önemlidir. Hasta serumunda etkene karşı antikor saptanması prensibine dayalı serolojik testler bakteriyel etkenler için; sistemik yayılım gösteren (Brucella spp. gibi), kültürde üretilmesi zor (Treponema pallidum gibi), etkenler için kullanılabilir. Bu testlerde tanı ve tedaviye cevabın izlenmesi de mümkündür. 8. Moleküler Yöntemler DNA analizleri, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA dizi analizi ve genetik işaretlemeler gibi moleküler tekniklerle bakterilerin tanımlanması ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ   135 İnkübasyon: Petri plakları 35±2°C sıcaklıkta aerobik koşullarda 16–18 saat süreyle bekletilir. Bu süreçte antibiyotik, diskten çevreye doğru yayılır ve agar üzerinde bir konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bakterinin ilgili antibiyotiğe duyarlı olduğu bölgede üreme inhibe olurken, dirençli olduğu bölgede ise üreme devam eder. Değerlendirme ve Yorumlama: İnkübasyon süresi tamamlandığında, antibiyotik disklerinin çevresinde oluşan inhibisyon zonlarının çapı cetvel veya kumpas kullanılarak milimetre cinsinden ölçülür. Elde edilen zon çapları, CLSI veya EUCAST tarafından belirlenmiş sınır değerlerle karşılaştırılır. Bu değerlendirme sonucunda izolat, ilgili antibiyotiğe karşı duyarlı (S), orta duyarlı (I; yüksek dozda duyarlı) veya dirençli (R) olarak sınıflandırılır. 2.1.3.KliniktekiYeriveSınırlılıklar Hızlı sonuç vermesi ve çok sayıda antimikrobiyal ajan için uygulanabilir olması nedeniyle disk difüzyon testi, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık kullanılan yöntemlerden biridir. Ancak yöntemin MİK gibi kantitatif veriler sunmaması, ayrıca yavaş üreyen ya da özel besiyeri gerektiren mikroorganizmalar için uygun olmaması önemli kısıtlılıklar arasında yer alır. Bu tür organizmalarda, alternatif olarak dilüsyon yöntemleri veya gradyan temelli duyarlılık testlerinin tercih edilmesi önerilir. Şekil 1.Kirby-Bauer Test Aşamaları (12). 136   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 2.2.GradiyentDifüzyonYöntemi(G-test) Gradiyent difüzyon yöntemi, antibiyotik duyarlılığının değerlendirilmesinde hem kalitatif hem de kantitatif veri sağlayabilen bir yaklaşımdır. Bu yöntem yaygın olarak “G-test” olarak bilinir. Belirli bakteri türlerinin test edilmesinin gerektiği durumlarda G-test yöntemi öncelikli olarak tercih edilir. 2.2.1.TestPrensibi G-test, antibiyotiğinartan konsantrasyonlarda (logaritmik gradyan şeklinde) emdirildiği ince plastik test şeritlerin, inoküle edilmiş agar yüzeyine yerleştirilmesi prensibine dayanan bir yöntemdir. Şeritteki antibiyotik, agar ortamına difüze olarak bakteri üremesini inhibe eder. 2.2.2.UygulamaAşamaları İnokülüm Hazırlığı: Testlerde, 18–24 saatlik taze ve saf bakteri kültürleri tercih edilir. Steril öze ile alınan birkaç koloni, serum fizyolojik veya MHA içine eklenerek süspansiyon hazırlanır. Bu süspansiyonun bulanıklığı, 0,5 McFarland standardına (yaklaşık 1–2 × 10⁸ CFU/mL) uygun ayarlanır. Bulanıklık ayarı, tercihen densitometre kullanılarak; bu mümkün değilse görsel karşılaştırma yöntemiyle yapılır. Hazırlanan süspansiyon bekletilmeden kullanılmalı ve en fazla 15 dakika içinde işleme alınmalıdır. İnokülasyon: Uygulama aşamasında, 4 mm kalınlığında ve pH değeri 7.2–7.4 aralığında hazırlanmış MHA plakları kullanılır. Belirli bakteri türlerinin üremesi için gerektiğinde agara %5 koyun kanı veya NAD gibi ek büyüme faktörleri ilave edilebilir. Steril pamuklu eküvyon, bakteri süspansiyonuna batırıldıktan sonra tüp kenarına bastırılarak fazla sıvı uzaklaştırılır. Ardından agar yüzeyi, eküvyon yatay, dikey ve çapraz yönlerde sürülerek tamamen kaplanır. Plakların kenarlarının da inokülasyonu, bakterilerin homojen dağılımı açısından önemlidir. İşlem tamamlandıktan sonra plaklar, yüzeyin kuruması için 3–5 dakika bekletilir; bu sürenin 15 dakikayı aşmamasına dikkat edilir. Şeridin Yerleştirilmesi: Steril pens veya özel aplikatör kullanılarak tutulan G-test şeridi, antibiyotik konsantrasyon skalası yukarı bakacak şekilde agar yüzeyine yerleştirilir. Şeridin agar yüzeyi ile tam temas etmesi, hava kabarcıklarının oluşmaması ve ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ   137 pozisyonunun sabit kalması sağlanmalıdır. Birden fazla şerit yerleştirilecekse, inhibisyon zonlarının çakışmasını önlemek amacıyla şeritler arasında 2–3 cm mesafe bırakılmasına dikkat edilmelidir. İnkübasyon: G-test şeritleri yerleştirildikten sonra plaklar ters çevrilmeden doğrudan inkübatöre alınır. Genellikle 35±2°C’de, aerob koşullarda 18–24 saat inkübasyon uygulanır. Bazı bakteri türlerinin CO₂ ile zenginleştirilmiş ortamda veya anaerob koşullarda inkübasyonu gerekebilir. Yavaş üreyen mikroorganizmalar söz konusu olduğunda ise inkübasyon süresi, optimal üreme sağlanana kadar uzatılabilir. Sonuçların Okunması: İnkübasyon süresi tamamlandığında oluşan inhibisyonzonu eliptik biçimde gözlenir ve bu zonun şerit üzerindeki konsantrasyon skalası ile kesiştiği nokta, MİK değeri olarak kabul edilir. Elde edilen MİK değeri, CLSI veya EUCAST standartlarına göre yorumlanır. Test prensibinde belirtildiği üzere, kesişme noktası iki değer arasında ise daha yüksek olan değer rapor edilir. Elde edilen sonuçlar, CLSI veya EUCAST kriterleri doğrultusunda “duyarlı; S”, “orta duyarlı; I (yüksek dozda duyarlı)” veya “dirençli; R” olarak yorumlanır. Ayrıca zonun düzensiz görünümü, zon içerisinde koloni gelişimi gibi bulgular, sonuçların değerlendirilmesinde dikkate alınmalı, standartlarda bu alanda belirtilen kurallara göre değerlendirilmelidir (Şekil 2). 2.2.3.KliniktekiYeriveSınırlılıklar G-test yöntemi, klinik mikrobiyoloji uygulamalarında özellikle vankomisin ve karbapenemler gibi kritik öneme sahip antibiyotiklerin MİK değerini belirlemede yaygın olarak kullanılmaktadır. Disk difüzyon testinde sonuçların belirsiz olduğu durumlarda, G-test daha net ve güvenilir veriler sunarak tedaviye yönelik klinik kararların doğruluğunu artırır. Ayrıca, yavaş üreyen, fastidiyöz özellik gösteren veya özel besiyeri gerektiren bakterilerde de pratik ve güvenilir bir alternatif olarak öne çıkar. Direnç paternlerinin takibinde, epidemiyolojik araştırmalarda ve nadir patojenlerin değerlendirilmesinde sağladığı kantitatif veriler, yöntemin klinik değerini önemli ölçüde güçlendirmektedir. Bununla birlikte, G-test yönteminin bazı sınırlılıkları bulunmaktadır. Öncelikle, disk difüzyon testine kıyasla daha yüksek maliyetli olması ve tüm antibiyotikler için ticari şeritlerin bulunmaması, yöntemin kullanımını kısıtlayabilir. Ayrıca şeritlerin doğru şekilde yerleştirilmesi ve sonuçların hatasız 138   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER yorumlanabilmesi için işlemin deneyimli personel tarafından yürütülmesi gereklidir. Bazı bakteri–antibiyotik kombinasyonlarında inhibisyon zonlarının net olarak gözlenememesi, minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) ölçümünü zorlaştırmaktadır. Şekil 2. E-test (13). 3. Dilüsyon Testleri Dilüsyon yöntemleri, antimikrobiyal ajanların bakteriyel üreme üzerindeki etkisini kantitatif olarak değerlendirmeye olanak tanıyan ve altın standart olarak kabul edilen tekniklerdir. Bu yöntemde, antibiyotikler sıvı besiyerindeiki kat seri dilüsyon ile hazırlanır ve test edilecek mikroorganizma inoküle edilir. Böylece, bakteriyel üremeyi inhibe eden en düşük antibiyotik konsantrasyonu olan minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri belirlenir. Elde edilen MİK değerleri hem klinik uygulamalarda hem de araştırma alanlarında altın standart olarak kabul edilmektedir. 3.1.Sıvı(Broth)DilüsyonYöntemleri Sıvı dilüsyon yöntemleri, antibiyotiklerin sıvı besiyerinde (genellikle Müller-Hinton broth) iki kat artan konsantrasyonlarda hazırlanması prensibine dayanır. Bu yöntem, minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerinin kantitatif olarak belirlenmesine olanak tanır ve makrodilüsyon ile mikrodilüsyon olmak üzere iki farklı şekilde uygulanabilir. 3.1.1.Makrodilüsyon(TüpDilüsyonYöntemi) Makrodilüsyon tekniğinde, en az 1 mL hacmindeki steril tüplerde antibiyotikler iki kat artan konsantrasyonlarda hazırlanır. Bakteri süspansiyonu, 0,5 McFarland standardına uygun olarak hazırlanıp tüplere eşit miktarda eklenir. Tüpler, 35 ± 2 °C’de 18–24 saat süreyle inkübe edilir. İnkübasyon sonunda, ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ   139 bakteri üremesinin tamamen durduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu MİK olarak belirlenir. Yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlaması nedeniyle makrodilüsyon yöntemi, duyarlılık testlerinde altın standart kabul edilir. Ancak yüksek besiyeri tüketimi, fazla iş gücü gereksinimi ve aynı anda sınırlı sayıda örneğin işlenebilmesi gibi dezavantajları mevcuttur (Şekil 3). Şekil 3. Makrodilüsyon Testi (14). 3.1.2.Mikrodilüsyon Mikrodilüsyon, makrodilüsyon prensibinin daha küçük hacimlerde uygulanması olup genellikle 96 kuyucuklu mikrotitre plaklarda gerçekleştirilir. Her bir kuyucuk, test edilecek antibiyotiğin iki kat artan konsantrasyonlarını içerir. Standart bakteri süspansiyonu, belirlenen hacimlerde kuyucuklara eşit dağıtıldıktan sonra plaklar 35±2°C’de 18–24 saat inkübe edilir. Sonuçlar çıplak gözle değerlendirilebileceği gibi, spektrofotometre veya otomatik okuyucular aracılığıyla da analiz edilebilir. Otomasyona uyumlu olması, kısa sürede sonuç vermesi ve az hacimde besiyeri gerektirmesi, mikrodilüsyon yönteminin başlıca avantajlarıdır. Bununla birlikte, standart protokollere uyulmadığında kontaminasyon riski artmakta olup yöntemin dikkatli bir şekilde uygulanması gerekmektedir. 3.2.AgarDilüsyonYöntemi Agar dilüsyon yöntemi, mikroorganizmaların antimikrobiyal ajanlara duyarlılığını değerlendirmede kullanılan, yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlayan tekniklerden biridir. Bu yöntemde, farklı konsantrasyonlarda antibiyotik içeren katı besiyerleri hazırlanır ve test edilecek mikroorganizmalar bu ortamlara inoküle edilir. Elde edilen MİK değeri, hem klinik tedavi planlamasında hem de antibiyotik direnç eğilimlerinin izlenmesinde kritik bir 140   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER parametre olarak kabul edilir. CLSI ve EUCAST standartlarına uygun şekilde yürütülen bu yöntem, nadir görülen veya zor üreyen patojenlerde güvenilir sonuçlar sağlayabilse de, yüksek zaman ve iş gücü gereksinimi nedeniyle rutin laboratuvar uygulamalarında sınırlı olarak kullanılmaktadır. 3.2.1.TestPrensibi Bu teknik, çeşitli konsantrasyonlarda antibiyotik içeren katı besiyerlerine test edilecek mikroorganizmanın inoküle edilmesi esasına dayanır. Çoğu uygulamada MHA kullanılır. Antibiyotikler iki kat artan konsantrasyonlarda hazırlanır ve eritilmiş agara eklenerek ayrı plaklar dökülür. Bakteri süspansiyonu 0,5 McFarland bulanıklığında hazırlanır agar yüzeyine inoküle edilir. 18-24 saat inkübasyon sonunda, üremenin olmadığı en düşük antibiyotik konsantrasyonu MİK olarak belirlenir. 3.2.2.UygulamaAşamaları Antibiyotik Çözeltilerinin Hazırlanması: İşleme başlamadan önce, kullanılacak antibiyotiğin stok çözeltisi üretici talimatlarına veya uluslararası standartlara uygun şekilde hazırlanır. Antibiyotik, uygun çözücü ve seyreltici kullanılarak çözülür, ardından eritilmiş MHA’a eklenir ve hedef konsantrasyona ulaşacak biçimde homojenize edilir. Her konsantrasyon için ayrı agar karışımı hazırlanarak steril petri kaplarına dökülür ve düzgün yüzeye sahip plaklar elde edilir. Plakların Hazırlanması: Plakların kalınlığı, standart olarak 4 mm olacak şekilde ayarlanır. Agar döküm işlemi tamamlandıktan sonra plakalar, oda sıcaklığında katılaşmaya bırakılır. Katılaşan plaklar, kullanılıncaya kadar uygun koşullarda, genellikle buzdolabında ve nem kaybını önleyecek şekilde muhafaza edilir. Bakteri Süspansiyonunun Hazırlanması: Saf kültürden seçilen mikroorganizma, steril serum fizyolojik veya uygun sıvı besiyerinde hazırlanarak 0.5 McFarland standardına ayarlanır. Bu bulanıklık, yaklaşık 1–2 × 10⁸ CFU/mL bakteri yoğunluğunu ifade eder. Elde edilen süspansiyon, agar plak yüzeyine inoküle edilir. İnkübasyon: İnokülasyonun ardından plaklar, yüzeyin kuruması için kısa bir süre bekletilir ve ters çevrilmeden inkübatöre yerleştirilir. Genellikle 35±2°C’de, ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ   141 aerob koşullarda 18–24 saat süreyle inkübasyon uygulanır. Bazı bakteri türleri için anaerob veya CO₂ zenginleştirilmiş ortam gerekebilirken, yavaş üreyen mikroorganizmalarda inkübasyon süresi optimal üreme sağlanana kadar uzatılabilir. Sonuçların Değerlendirilmesi: İnkübasyon süresi tamamlandığında bakteri üremesinin tamamen durduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu, MİK değeri olarak kaydedilir. Kısmi üreme, bulanık alanlar veya tek tük koloni varlığı gözlendiğinde sonuçlar titizlikle değerlendirilir ve gerektiğinde test tekrarlanır. 3.2.3.KliniktekiYeriveSınırlılıklar Yüksek doğruluk ve tutarlılık sağlaması, agardilüsyon yöntemini antimikrobiyal duyarlılık testlerinde referans standart haline getirmektedir. Klinik mikrobiyolojide nadir veya zor üreyen patojenlerin incelenmesi, direnç mekanizmalarının araştırılması ve yeni antibiyotiklerin etkinlik çalışmalarında önemli bir role sahiptir. Ayrıca, epidemiyolojik araştırmalarda antibiyotik direnç eğilimlerinin takibi için güvenilir veri sunar. Bununla birlikte, yöntemin bazı sınırlılıkları da bulunmaktadır. Her antibiyotik konsantrasyonu için ayrı plak hazırlanması gerekliliği, uygulamayı hem zaman açısından uzun hem de iş gücü açısından yoğun hale getirir. Plakların kısa raf ömrü, önceden hazırlanıp uzun süre saklanmalarını güçleştirir. Aynı anda çok sayıda antibiyotiğin test edilmesi yöntemin pratikliğini azaltır. Doğru ve güvenilir sonuç elde edilebilmesi için teknik bilgiye sahip, deneyimli personel tarafından uygulanması gereklidir. 4. Otomatize Antibiyotik Duyarlılık Sistemleri Otomatize antibiyotik duyarlılık test sistemleri, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında izole edilen mikroorganizmaların antimikrobiyal ajanlara karşı duyarlılık profillerini hızlı, objektif ve standart bir biçimde belirlemek için geliştirilmiş entegre teknolojilerdir. Bu sistemler, disk difüzyon veya G-test gibi geleneksel manuel yöntemlerin getirdiği uzun inkübasyon süreleri, yüksek iş yükü ve subjektif değerlendirme gibi sınırlılıklarını ortadan kaldırarak tanısal süreçlere önemli bir hız ve güvenilirlik kazandırmıştır. Çalışma prensipleri, mikroorganizmanın sıvı besiyeri ortamında MİK değerinin belirlenmesine dayanır. MİK, bakteri üremesini görünür şekilde durduran en düşük antimikrobiyal konsantrasyon olarak tanımlanır. Otomatize sistemler bu değeri, turbidimetrik, spektrofotometrik veya floresan tabanlı optik 142   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER algılama teknikleri ile mikroorganizmanın büyüme eğrisini gerçek zamanlı izleyerek hesaplar. Klinik açıdan, bu cihazlar özellikle çoklu ilaç direnci ve benzeri direnç fenotiplerinin arttığı günümüzde kritik bir rol üstlenir. Erken ve doğru sonuçlar sağlayarak hedefe yönelik tedavinin hızla başlanmasına imkân tanır, ampirik tedavi süresini kısaltır, morbidite ve mortalite oranlarını düşürür. Ayrıca, antimikrobiyal direnç yönetimine katkı sağlayarak antibiyotiklerin rasyonel kullanımını teşvik eder ve epidemiyolojik sürveyans için değerli veri üretir. 4.1.YaygınOlarakKullanılanOtomatizeSistemler BD Phoenix™ M50 Sistemi: Becton Dickinson (BD) tarafından geliştirilen BD Phoenix™ M50, antibiyotik duyarlılık testi ve mikroorganizma tanımlaması için entegre çözümler sunan bir platformdur. Sistem, bakteri üremesini ve metabolik aktiviteye bağlı renk değişimlerini eş zamanlı olarak değerlendirebilmek amacıyla kolorimetrik ve turbidimetrik ölçüm tekniklerini bir arada kullanır. Tipik olarak 6–12 saat içerisinde sonuç verebilmesi, özellikle acil klinik kararların gerektiği durumlarda önemli avantaj sağlar. Modüler yapısı sayesinde hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakteriler için geniş kapsamlı antibiyotik panelleri kullanılabilir. VITEK® 2 Sistemi: BioMérieux tarafından geliştirilen VITEK®2 sistemi, günümüzde dünya genelinde en yaygın kullanılan otomatize antibiyotik duyarlılık test (AST) sistemlerinden biridir. Çalışma prensibi, mikro-kuyucuk yapısına sahip özel test kartlarının kullanımına dayanır. Turbidimetrik ölçümler, bakteri çoğalmasını izlerken; kolorimetrik analizler biyokimyasal reaksiyonları değerlendirerek hem mikroorganizma tanımlamasını hem de antibiyotik duyarlılık testini mümkün kılar. Sistem, genellikle 4–15 saat içerisinde sonuç üretir ve test kartlarının yüklenmesinden raporun alınmasına kadar geçen süreç tam otomasyon ile yürütülür. Ayrıca, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) gibi belirli direnç mekanizmalarının tespitinde gelişmiş algoritmalar kullanarak klinik karar sürecine katkı sağlar. Micro Scan Walk Away Sistemi: Beckman Coulter tarafından geliştirilen Micro Scan Walk Away sistemi, esnek kullanım özellikleri ve yüksek test kapasitesi ile öne çıkan bir otomatize antibiyotik duyarlılık test (AST) sistemidir. Çalışma prensibi, her biri farklı bir ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ   143 antibiyotik veya besiyeri içeren mikro-kuyucuklu panellerin kullanımı üzerine kuruludur. Standart besiyeri içeren panellere ek olarak hızlı test (rapid test) seçenekleri de sunarak sonuçların daha kısa sürede elde edilmesine imkân tanır. Kullanıcı ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilen panel yapısı, belirli patojen gruplarına ve antibiyotik kombinasyonlarına odaklanmayı mümkün kılar. Bu yönüyle Micro Scan Walk Away, hem rutin klinik uygulamalarda hem de araştırma amaçlı çalışmalarda tercih edilen çok yönlü bir sistem olarak dikkat çekmektedir. Tablo 1. Otomatize Sistemlerin Avantaj ve Dezavantajları Avantajlar Dezavantajlar Hızlı sonuç verme: Bazı sistemlerde 4–8 saat içinde duyarlılık ve tanımlama sonuçları alınabilir. Yüksek maliyet: Cihaz, sarf malzemesi ve bakım giderleri manuel yöntemlere göre daha fazladır. Standardizasyon: Test prosedürleri otomatik yürütüldüğü için laboratuvarlar arası sonuç farklılıkları azalır. Esneklik sınırlılığı: Kullanılabilecek antibiyotik ve test seçenekleri üretici firmanın panel içeriğiyle sınırlıdır. Düşük insan hatası: Tam otomasyon, manuel işlem kaynaklı hataları minimize eder. Teknik arıza riski: Cihaz arızaları test süreçlerini geciktirebilir. Yüksek verimlilik: Aynı anda çok sayıda örnek ve antibiyotik kombinasyonu test edilebilir. Bazı mikroorganizmalar için uygun olmama: Nadir veya özel besiyeri gerektiren türlerde performans sınırlı olabilir. Direnç mekanizması tespiti: ESBL, karbapenemaz gibi direnç mekanizmalarını belirleyebilen gelişmiş algoritmalar sunar. Teknoloji bağımlılığı: Cihaz ve yazılım güncellemeleri ile üreticiye bağımlılık söz konusudur. 5. Sonuç ve Öneriler Antibiyotik duyarlılık testleri, enfeksiyon hastalıklarının etkin tedavisinde doğru antibiyotik seçimini yönlendiren ve direnç gelişiminin önlenmesinde kritik rol oynayan yöntemlerdir. Disk difüzyon, gradiyent difüzyon ve dilüsyon yöntemleri, farklı avantaj ve sınırlılıklarıyla klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmakta; otomatize sistemler ise hızlı ve standart sonuçlarıyla modern laboratuvar pratiğine önemli katkı sağlamaktadır. Bu yöntemlerin doğru 144   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER seçimi ve standartlara uygun biçimde uygulanması, yalnızca hasta yönetimini iyileştirmekle kalmayıp, aynı zamanda antibiyotik direncine karşı küresel mücadelede de stratejik bir önem taşımaktadır. Kaynakça 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. CLSI standard M100. Wayne, PA: CLSI; 2025. 2. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Breakpoint Tables for Interpretation of MICs and Zone Diameters. EUCAST; 2025. 3. Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clin Infect Dis. 2009;49(11):1749-1755. doi:10.1086/647952 4. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 2007. 5. Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Washington, DC: ASM Press; 1991. 6. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. J Pharm Anal. 2015;6(2):71-79. doi:10.1016/j. jpha.2015.03.005 7. Schumacher A. In vitro antimicrobial susceptibility testing methods: Agar dilution and broth dilution. Int J Pept Res Ther. 2017;23(1):45-52. doi:10.1007/s10989-017-9621-5 8. Kowalska-Krochmal B, Dudek-Godek K. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: Broth microdilution and agar dilution recommendations. Int J Mol Sci. 2021;22(8):4215. doi:10.3390/ijms22084215 9. Patel JB. Agar dilution MIC test. In: Major Reference Works. Hoboken, NJ: Wiley; 2023. doi:10.1002/9781683670438.cmph0064 10. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically (CLSI Standard M07). Wayne, PA: CLSI; 2023. 11. Hu X, Sun L, Nie T, et al. Evaluation of agar dilution method in susceptibility testing of polymyxins for Enterobacteriaceae and non-fermentative rods: Advantages compared to broth microdilution and broth macrodilution. Antibiotics. 2022;11(10):1392. doi:10.3390/antibiotics11101392 247 BÖLÜM XIV İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER ImmunoserologicalTests Mehmet ERİNMEZ1 1(Dr. Öğr. Üyesi), Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-3570-3510 1. Giriş İmmün, kelime anlamı itibariyle kökleri Antik Roma’ya dayanan ‘‘immünis’’ sözcüğünden türemiş ve askerlik, vergi gibi zorunluluklardan muaf tutulan kişileri tanımlamaktaydı. Günümüzde immünoloji, konağın patojenlerin enfeksiyöz kabiliyetlerine karşı gösterdiği direnci yani bağışıklığı inceleyen bir bilim dalıdır. İnsan vücudunda hastalığa yol açabilecek virüsler, bakteriler, mantarlar, protozoonlar ve helmintler gibi oldukça fazla çeşitte mikroorganizma ile bu gruplara dahil sayılması güç miktarda patojen göz önüne alındığında immün sistemin de farklı mekanizmalarla karşı koyması gerekmektedir. Doğal (innate) immünitenin etkisiz veya yetersiz kaldığı durumlarda insan vücudu ‘antijen’ adı veriler mikrobiyal moleküllerle tanışır. Antijen, temel olarak kazanılmış (adaptif) immün sistem elemanları tarafından spesifik olarak tanınan ve ‘antikor’ üretimine neden olan moleküüler olarak tanımlanabilir. Antikorlar ise B lenfositler tarafından her bir antijenik determinanta (epitop) özgün olacak şekilde üretilen, aynı zamanda ‘immünglobulinler’ olarak da adlandırılan serum molekülleridir. Seroloji, özellikle dolaşım sisteminde olmak üzere çeşitli vücut sıvılarında antijenlerin, antikorların ve immün sistemin diğer elemanlarının araştırıldığı bir dalıdır. İmmünoserolojik testlerin günümüz tıbbi pratiğinde, mikroorganizmaların yol açtıkları hastalıkların tanısında, bu hastalıkların 248   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER evrelerinin tespitinde, tedaviye yanıtın izlenmesinde, bağışıklık durumunun belirlenmesinde vb. pek çok durumda oldukça önemli bir kullanım alanı vardır. Günümüzde kullanımda olan yüzlerce immünoserolojik test yöntemi olasa da bu testlerin neredeyse tamamı antijen-antikor birleşmesinin özgünlüğüne dayalıdır. O nedenle bu bölümde Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında en yaygın olarak kullanılan yöntemler ele alınacaktır. 2. İmmünoserolojik tanı yöntemleri 2.1.Presipitasyontestleri Antikorlar ve çözünür formdaki antijenlerin, eşdeğer konsantrasyonlarda veya çeşitli oranlarda kombinasyonlar halinde karşılaştırıldığında çökeltiler (presipitat) oluşturması prensibine dayanmaktadır. Agar jel presipitasyon testi Agar (%1-2) jel uygun çözücüyle (distile su veya tampon solüsyonu) ile hazırlanarak, otoklavda sterilizasyon sonrası katılaşmaya başlamadan önce lam yüzeylerine dökülerek katılaşması beklenir. Daha sonra agar jel yüzeyinde birbirine 3-5 mm (reaksiyonun kuvvetine göre ayarlanabilir) uzaklıkta olacak şekilde 2-4 mm çapında kuyucuklar açılır. Daha sonra karşılıklı kuyucuklara eklenen suda çözünebilen antijen ve antikorların agar jel yüzeyinde diffüze olarak birleşmesiyle meydana gelen immünolojik reaksiyon presipitasyon halkaları olarak gözlemlenir. Ayrıca oluşan bu presipitasyon halkaları Coomassie Blue adı verilen bir protein boyasıyla boyanarak daha net olarak olarak görülebilir. 2.1.1.JelElektroforez Bazı antijen karışımları farklı bir çok antijen içerebilmesi ve içerdiği antijenlerin kompleks yapısı gereği basit diffüzyon yöntemleri ve presipitasyon halkaları ile ayrılamayabilir. Bu nedenle jel elektroforez veya immünoelektroforez olarak adlandırılan bir teknik geliştirilmiştir. Bu yöntem, antijenlerin presipitasyonlarının incelenmesinden önce jel yüzeyine voltaj uygulanmasıyla elektriksel yüklerine göre ayrılması esasına dayanır. Pozitif ve negatif elektrotlar arasında, antijenler jel yüzeyinde elektriksel yüklerine göre elektrik akımı uygulanarak hareket ettirilir. Pozitif yüklüantijenler negatif elektroda doğru hareket ederken, negatif yüklü antijenler pozitif İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER   249 elektroda doğru ilerler. Daha sonra jel yüzeyi boyunca ince bir kanal şeklinde bir kuyu açılır ve diffüze olması için antikorla doldurulur. Antijen ve antikorlar arasında presipitasyon halkaları gözlenir. İmmünoelektroforez yönteminin çeşitli varyasyonları da bulunmaktadır. Karşıt akım elektroforezinde, pozitif yüklü bir antikor ve negatif yüklü bir antijenin elektrik akımı yardımı ile birbirlerine doğru hareketi ve presipitasyon oluşumu sağlanır. Roket elektroforez adı verilen yöntemde ise antikor içeren jel üzerinde antijenlerin negatif elektrot tarafında sıralanan antijenlerin pozitif elektroda doğru hareketi gözlemlenir. Bu teknikte antikorlar hareketsiz olduğu için antijenlerin roket benzeri presipitasyon görüntüleri antijen konsantrasyonu hakkında bilgi verebilir. 2.1.2.Tüppresipitasyontesti Antikor ve antijen birleşmesinin sıvı ortamda presipitasyon oluşturarak gözlemlenmesi esasına dayanır. Deney için altı tüpten oluşan bir set hazırlanır; 1. tüp: Antikor (bağışık serum) ve test sıvısı (antijen aranan) 2. tüp: Antikor ve ½ sulandırılmış test sıvısı 3. tüp: Antikor ve pozitif kontrol 4. tüp: Antikor ve serum fizyolojik 5. tüp: Normal serum (bağışık olmayan) ve test sıvısı 6. tüp: Serum fizyolojik ve test sıvısı Ortalama olarak onbeş dakika beklendikten sonra tüp yüzeyinde presipitasyon halkası izlenmeye başlar. Presipitasyonun belirginleşmesi için tüpler 2 saat boyunca 37 °C’ de inkübe edildikten sonra ertesi güne kadar buzdolabında bekletilerek incelenebilir. Test sonuçları yorumlanırken 3 no’lu tüp pozitif, 4-6 no’lu tüplerin negatif olması gerektiğine dikkat edilmelidir. 2.2.Aglütinasyontestleri Antikorlar ve partiküler (parçacıklı) formdaki antijenlerin eşdeğer konsantrasyonlarda veya çeşitli oranlarda kombinasyonlar halinde karşılaştırıldığında gözle görülür parçacıklar, çökelti (aglütinat) oluşturması prensibine dayanmaktadır. Bu yöntemde antikor-antijen birleşmesinin gözle görülebilir parçacıklar oluşturması için lateks, bentonit ve polistiren gibi sentetik parçacıklar veya yüzeyine antijen kaplanmış eritrositler kullanılabilir. 250   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 2.2.1.RoseBengalTesti Rose Bengal testi, Brucella enfeksiyonları tanısında genellikle tarama amacıyla kullanılan bir immünoserolojik testtir. Rose Bengal boyası kullanılarak, Brucella abortus standart bakteri süspansiyonlarından hazırlanmış antijenler kullanılır. Lam veya pürüzsüz bir zemin üzerinde önce hasta serumu daha sonra eşit miktarda antijen eklenerek homojenize olana kadar karıştırılır. Rotator kullanılarak, lam 4-5 dakika boyunca çevrilir. Lam yüzeyi üzerinde iri tanecikli çökeltiler oluştuğunun gözlenmesi pozitif test sonucuna yani hasta serumunun antikor içerdiğine işaret eder. 2.2.2.Wright(BrucellaTüpaglütinasyon)testi Wright testi ile Rose Bengal test sonucu pozitif gelen hastaların doğrulanması amacıyla titrelendirme yapılarak test gerçekleştirilir. Bu amaçla 1/20-1/640 arasında titrelendirme yapmak için 7 adet tüp alınır; - Tüpler bir spor üzerinde dilüsyon değerleri yazılarak sıralanır. - Birinci tüpe 0.9 mL serum fizyolojik eklenir. - Diğer tüplere 0.5 mL serum fizyolojik eklenir. - Birinci tüpe 0.1 mL hasta serumu eklenerek iyice karıştırılır. - Birinci tüpten 0.5 mL alınarak bir sonraki tüpe aktarılarak iyice karıştırılır ve bu işlem son tüpe kadar tekrarlanır, son tüpten alınan 0.5 mL dışarı atılır. - Sulandırımın yapıldığı ilk tüp de atılarak ikinci tüpten itibaren her bir tüpe 0.5 mL antijen eklenir. - Tüpler çalkalanarak karıştırılır ve ardından 37°C’de 24-48 saat inkübe edilir. - Test sonucu değerlendirilirken tüplerin dip kısmında oluşan aglütinasyon ve üst kısmındaki bulanıklık değerlendirilir. - Testin 1/100 ve üzeri titrelerde aglütinasyon vermesi hastalığın varlığına işaret eder. Wright tüp testinde hem IgG hem de IgM tipi antikorlar aglütinasyon oluşturur. IgG tipi antikorların araştırılması için Merkaptoetanol veya Rivanol kullanılarak test gerçekleştirilir. Merkaptoetanol ve Rivanol, IgM’deki bisülfit bağlarını parçalayarak aglütinasyon etkinliğini yok eder. Klinik olarak bruselloz olduğu düşünülen ancak test sonucu negatif olan bazı hastalarda blokan antikorların varlığının araştırılması için Coombs deneyi kullanılır. İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER   251 2.2.3.Hemaglütinasyon Hayvanlardan elde edilen eritoristlerin çeşitli antijenlerle kaplanmasıyla elde edilen eritrosit süspansiyonları, antikorlarla karşılaştırıldıkları zaman aglütinasyon meydana gelir. Aynı eritrosit yüzeyi birden fazla antijen ile de kaplanabilir. Dolaylı hemaglütinasyon ya da parçacık aglütinasyonu adı verilen bu testlerde çok az antikor varlığı bile olumlu reaksiyonun gözlenmesi için yeterli olmaktadır. Ancak, antijenle kaplanan eritrositlerin kendi antijenlerini kaybetmediği unutulmamalıdır. Bu nedenle, ortamda eritrosit antijenlerine karşı; kan grubu antikorları, heterofil antikorlar, soğuk agglütininler vb. olması durumunda istenmeyen aglütinasyonlar meydana gelebilir. Eritositler özel yöntemler kullanılarak formalinize edilip uzun süre saklanılabilmektedir. Eritrosit ve parçacıklar basitçe antijenlerle muamele edilip kaplanabilirler veya tannik asit vb. maddelerle işleme tabii tutularak antijenle kaplanırlar. Çeşitli mikroorganizmaların antijenleriyle eritrositlerin kaplanmasıyla, antikor aranması amacıyla geliştirilen ticari kitler kullanıma girmiştir. Testler U tabanlı kuyucuklarda gerçekleştirilir ve kuyucuk dibinde yoğun düzgün kenarlı çökeltiler negatif olarak değerlendirilirken, kenarları düzensiz kalınca bir daire şeklinde çökeltiler pozitif olarak değerlendirilir. 2.4.Hemadsorpsiyontesti Bazı virüsler hücre içinde çoğalmalarına ve hücre dışına saçılmalarına rağmen enfekte ettikleri hücrelerde sitopatik yani hücreyi parçalayıcı etkide bulunmazlar. Hemadsorpsiyon testi, sitopatik etki oluşturmayan ancak hemaglutinin oluşturan virüslerin tanısında kullanılan serolojik bir yöntemdir. Virüsle enfekte olan hücreler üzerine viral antiserum eklendikten bir süre sora eritrositlerin eklendiğinde virüsler nötralize olacağı için hücreler eritrositlere bağlanamazlar yani hemadsorbsiyon olayı gerçekleşmez. Eğer hasta serumunda virüse karşı antikor yoksa veya serum kullanılmaz ise hemadsorbsiyon inhibisyonu gerçekleşmez ve eritrositler hücreler üzerinde kümeler oluşturmaya başlar. Reaksiyon mikroskop yardımı ile gözlemlenir. Aslında, hemadsorbsiyon tek başına serolojik bir olay değilken, hemadsorbsiyonun inhibisyonunun değerlendirilmesi serolojik bir yöntemdir. 2.5.Nötralizasyontesti Mikroorganizmaların enfeksiyona yol açma kabiliyetlerinin yani enfektivitelerinin onlara özgü olarak oluşturulan antikorlar tarafından ortadan kaldırılmasına nötralizasyon adı verilir. Nötralizasyon testi virüslere 252   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER ek olarak toksin ve enzimler için de uygulanılabilmektedir. Nötralizan antikorların varlığının gösterilmesinde sıklıkla hücre kültürleri kullanılır. Hücre kültürlerinde sitopatik etki ile hücre ölümlerine yol açtığı gözlemlenen virüsler, antiviral antikorlarla oda ısısında 30-40 dk kadar bekletildikten sonra yeniden hücre kültürlerine ekildiklerinde sitopatik etkinin ortadan kalktığı gözlenir ve bu durumda nötralizasyon tespit edilmiş olur. Nötralizasyonun miktarı yani engellenen sitopatik etkinin oranı, antikor ve virüs miktarına göre değişiklik gösterebilir. Bundan yola çıkılarak nötralizasyon testleri hem antijenin hem de antikorun tespit edilmesi için kullanılabilir. Ayrıca, nötralizasyon testleri deney hayvanlarında enfeksiyon modelleri oluşturulması vasıtasıyla da kullanılabilir. Plak nötralizasyon ve reduksiyon testi ismi verilen yöntemde hücrelerde üremesi sitopatik bir etki yaratan virüslerin bulunduğu hücrelerin yüzeyi besleyici bir agarla kapatılır ve bu besleyici agar yüzeyinde plaklar yani sitopatik odaklar oluşumu izlenir. Eğer virüsler özgün antikorlarla muamele edildikten sonra hücrelere ekilir ve üzeri besleyici agarla kapatılır ise ya hiç plak oluşaz ki bu duruma plak nötralizasyonu denir ya da oluşan plak sayısında azalma olur ve bu durum da plak redüksiyonu olarak adlandırılır. Plak sayısımda %50 ve üzeri azalmalar anlamlı kabul edilir. 2.6.Türbidimetrikyöntemler Türbidimetrik yöntemler bir çözeltinin bulanıklık derecesinin, ortama 90° dik açıyla gelen ışığın çözeltiden geçen miktarının yani adsorbsiyona maruz kalmayan kısmının fotometri ile ölçülmesi esasına dayanır. Bu sayede bulanıklığa neden olan maddenin konsantrasyonunun tespit edilmesi amaçlanır. Bu yöntemler günümüzde ticari olarak geliştirilen otomatize sistemlerde kullanılmaktadır ve immunoglobülinler, RF, ASO, CRP gibi akut faz reaktanlarının tespitinde yaygın olarak kullanılaktadır. 2.7.Nefelometrikyöntemler Nefelometrik yöntemler bir çözeltinin bulanıklık derecesinin, ortama 90° dik açıyla gelen ışığın çözeltiden geçerken ışıkta meyda gelen kırılımın yani difraksiyonun fotometri ile ölçülmesi esasına dayanır. Nefelometrik yöntemler, türbidimetrik yöntemlere göre özellikle spesifik proteinlerin ölçülmesi için daha geniş bir deteksiyon sınırına sahiptir ve daha iyi bir duyarlılığa sahiptir. Nefelometrik yöntemlerle, transferrin, hsptoglobulin, RF, CRP, ASO vb. akut faz reaktanları, kompleman testleri ve immünoglobulinler çalışılabilmektedir. Bu testler, çeşitli ticari olarak geliştirilen cihazlarla tam otomatize bir şekilde çalışılabilmektedir. İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER   253 2.8.ELISAtestleri ELISA (Enzyme-linked immunoassay) veya kısaca EIA (Enzyme immunoassay) günümüzde en yaygın kullanılan immünoserolojik yöntemler arasında yer almaktadır. ELISA testlerinde, antikor bir enzim ile işaretlendirmiştir. Enzim olarak yaygın olarak horse redish peroksidase kullanılır. Ortama katılan kromojen substrat, antijen antikor reaksiyonu durumunda enzim tarafından parçalanarak renk değişikliği meydana getirir. Ardından kolorimetrik değerlendirme ile yani renk değişikliğinin miktarı tespit edilerek sonuçlar yorumlanır. ELISA testlerinde kullanılan enzimler değişiklik gösterebilir ve beklendiği gibi enzimlere göre kullanılan substratlar da değişiklik gösterir. Bu yöntemle hem antikor hem de antjen varlığı araştırılabilir. ELISA ile antikor aranmasında, bilinen bir antijen plastik bir yüzey üzerine adsorbsiyon yöntemi ile kaplanır. Antijenle kaplı plastik yüzey üzerine antikor varlığı araştırılan şüpheli hasta serumu eklenir. Ardından yıkama işlemi ile antijenle kompleks oluşturmayan antikorlar uzaklaştırılır. Daha sonra enzim ile işaretli antikor eklenir ki bu antikor yıkama sonrası uzaklaşmayan yani antijene spesifik olarak bağlanan antikorlara karşı reaksiyon verecek anti-human globulindir. Ardından yeniden yıkama işlemi yapılarak yine reaksiyon vermeyen antikorlar uzaklaştırılır ve ortama kromojen substrat eklenir. Eğer şüpheli serum antijene karşı antikor içeriyorsa yıkama işlemleri ile uzaklaşmaz ve enzim ile yıkılan substrat renk değişimine yol açar. Negatif serum örneklerinde ise herhangi bir renk değişikliği meydana gelmez. ELISA ile antijen aranmasında, bilinen bir antikor plastik bir yüzey üzerine adsorbsiyon yöntemi ile kaplanır. Antikorla kaplı plastik yüzey üzerine şüpheli antijen eklenir. Ardından yıkama işlemi ile antikorla kompleks oluşturmayan antijenler uzaklaştırılır. Daha sonra enzim ile işaretli antikor eklenir ki bu antikorlar antijene spesifik olarak elde edilmiş antikorlardır. Ardından yeniden yıkama işlemi yapılarak reaksiyon vermeyen antikorlar uzaklaştırılır ve ortama kromojen substrat eklenir. Eğer şüpheli antijene karşı antikor bağlanması gerçekleşirse yıkama işlemleri ile uzaklaşmaz ve enzim ile yıkılan substrat renk değişimine yol açar. Negatif örneklerde ise herhangi bir renk değişikliği meydana gelmez. 2.9.Radyoimmünoassay Radyoimmünoassay (RİA), radyoaktif maddelerle konjuge edilmiş antikorların kullanılmasıyla antijen veya antikorların arandığı bir serolojik yöntemdir. Radyoaktif madde olarak 14C, 125I, vb. radyoizotoplar kullanılır. Antijen ve antikor birleşmesi meydana geldiğinde oluşan immün kompleks 254   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER radyoaktif hale gelir. Oluşan radyoaktivite, gama ölçer detektörler yardımı ile tespit edilir. Radyoaktivitenin derecesi ile kantitasyon yapılabilir. İmmün kompleks oluşmadığı negatif olgularda, radyoaktivite saptanmaz. RİA ile yarışmalı (kompetetif) ölçümler de yapılabilmektedir. Özellikle allerjene özgü IgE varlığını test etmek için RİA yöntemleri kullanılabilmektedir. RAST (RadioAllergoSorbent Test), spesifik IgE antikorlarını (alerjene özgü) saptamak için yapılır. Belirli bir alerjene karşı duyarlılığın değerlendirilmesinde kullanılır. Test tüpüne alerjen (örneğin polen, ev tozu, hayvan epiteli) bağlanır. Test tüpüne şüpheli serumu eklenir. Eğer bu alerjene özgü IgE varsa, allerjenle bağlanır. Yıkama ile bağlanmayanlar uzaklaştırılır. Daha sonra test tüpüne, radyoaktif olarak işaretlenmiş anti-IgE antikoru eklenir ve tüpteki radyoaktivite ölçülür. Radyoaktivite düzeyi, hastanın o alerjene karşı ne kadar IgE oluşturduğunu gösterir. RIST (RadioImmunoSorbent Test) yöntemi, genel alerjik yatkınlığı değerlendirmek maksadıyla toplam IgE düzeyini saptamak için yapılır. Ancak spesifik alerjen tanımlamaz. Test tüpüne anti-IgE antikorları bağlanır. Şüpheli serum eklenir ve serumda yer alan tüm serbest IgE’ler bu antikorlara bağlanır. Daha sonra radyoaktif işaretli IgE eklenir ve eğer hasta serumunda IgE varsa, tüpteki antikorlar tarafından bağlanmıştır bu nedenle radyoaktif IgE bağlanamaz. Sonuç olarak; radyoaktivite ne kadar azsa, hastanın serumunda o kadar çok IgE vardır. 2.10.İmmünofloresansyöntemi İmmünofloresans yöntemi (İFA), flourokrom maddelerle konjuge edilmiş antikorların kullanılmasıyla antijen veya antikorların arandığı bir serolojik yöntemdir. Flourokrom madde olarak Auramine, Rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate) vb. boyalar kullanılır. Antijen ve antikor birleşmesi meydana geldiğinde oluşan immün kompleksin taşıdığı boyalar UV-ışınları ile donatılmış mikroskop altında parlak sarı-yeşil floresans vererek kolaylıka tespit edilirler. İmmün kompleks oluşmadığı negatif olgularda, floresan saptanmaz. İFA testleri, direkt ve indirekt olmak üzere iki farklı modelle uygulanabilir. Direkt İFA testinde, şüpheli antijeni taşıyan materyal sıvı (hücre kültürü, nazofarinks sürüntüsü, vb.) temiz bir lam üzerine yayılır ve asetonla fikse edilir. Bunun üzerine FITC ile boyalı bilinen antikorlar konulur. Bir süre bekletildikten sonra yıkanır, kurutulur ve UV-ışınları altında mikroskopta incelenir. Pozitif olgularda; eğer preparat üzerinde homolog antijen varsa, flourokrom boyalı antikorla bağlanarak mikroskop altında parlak ışıltı, renkli İMMÜNOSEROLOJİK TESTLER   255 ışıma şeklinde görünecektir. Negatif olgularda; antijen yoksa veya başka bir etken varsa antijen-antikor birleşmesi gerçekleşmeyeceği için flourokrom boyalı antikorlar yıkama işlemi ile giderilir ve mikroskop altında parlak renkli bir ışıma izlenmez. İndirekt İFA testinde, temiz bir lam üzerine bilinen bir antijen fikse edilerek üzerine şüpheli serum ilave edilir. Bir süre bekletilir ve yıkanıp, kurutulur. Daha sonra lam üzerine, FITC ile boyanmış antiglobulin (antihuman, antibovine, vs) ilave edildikten sonra tekrar yıkanır ve kurutulur. Eğer şüpheli serumda, lamdaki antijene karşı antikor bulunuyorsa antijen-antikor birleşmesi meydana gelir. Yıkanmakla giderilmeyen bu kompleks ikinci yani flourokrom boyalı antikorla birleşerek mikroskop altında parlak ışıltı, renkli ışıma meydana getirir. Eğer şüpheli serum lam yüzeyindeki antijene özgül antikorlar içermiyorsa mikroskop altında parlak renkli bir ışıma izlenmez. 2.11.İmmünoblotyöntemi Buraya kadar olan kısımda bahsedilen yöntemler genellikle bilinen antijenleri veya antikorları tespit etmek için yeterlidir. Ancak, bazı durumlarda kompleks bir yapı içerisinde bulunan ve daha önce bilinmeyen antijenlerin veya antikorların tanımlanması ve karakterize edilmesi gerekmektedir. Bu tür durumlarda immünoblot yöntemi oldukça faydalıdır. Test edilmek istenen antijenler ilk önce molekül ağırlıklarına göre jel elektroforez yöntemi ile ayrıştırılırlar. Molekül ağırlığı yüksek proteinler jelin üst kısmında yer alırken molekül ağırlığı daha düşük olan proteinler jelin alt kısımlarına doğru göç eder. Daha sonra jel yüzeyindeki bu ayrıştırılmış antijenler, bir immünoblot tankı içinde elektrik akımı vasıtasıyla nitrosellüloz bir membran üzerine transfer edilir. Bu işlem sırasında nitroselüloz membran üzerinde ayrıştırılmış antijenlerin sıralamasında değişiklik olmaz. Blot, önce spesifik antijene karşı antikorla ardışık olarak işlenir, ardından yıkanır ve son olarak antikorları tespit etmek için radyoaktif olarak işaretlenmiş bir konjugat blota bağlanır. Tekrar yıkandıktan sonra, blot bir kaset içinde X-ışını filmiyle temas edecek şekilde yerleştirilir; otoradyografi sonrası film banyo edilir. Otoradyografi, radyoaktif bir maddenin dağılımından gelen bozunma emisyonlarının (örneğin, beta parçacıkları veya gama ışınları) örüntüsüyle üretilen bir X-ışını filmi veya nükleer emülsiyon üzerindeki bir görüntüdür. Otoradyografi sonrası antikorun bağlandığı antijen bantları görünür hâle gelir. Bu teknik ayrıca enzimle konjuge edilmiş antikorlar veya kromojen materyaller kullanılarak da modifiye edilebilir. 256   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER İmmünoblot yöntemine benzer şekilde ayrıştırılan antijenlerin radyoizotopla konjuge antikorlarla test edilmesiyle oluşan farklı presipitasyon çizgilerinin değerlendirildiği immünopresipitasyon adı verilen bir yöntem de bulunmaktadır. 3. Sonuç ve Öneriler Serolojik testler; antijen–antikor reaksiyonlarının özgüllüğüne dayalı olarak patojenlerin saptanması, hastalık evresinin belirlenmesi, bağışıklık durumunun izlenmesi ve tedavi yanıtının değerlendirilmesinde vazgeçilmez araçlardır. Bu yöntemlerin doğru uygulanması, uygun numune seçimi ve sonuçların klinik verilerle birlikte değerlendirilmesi, doğru tanı ve etkili hasta yönetimi için kritik önem taşır. Laboratuvarlarda kullanılan serolojik testlerin uluslararası kalite standartlarına göre düzenli olarak kalibrasyon ve validasyonlarının yapılması yanlış pozitif veya negatif sonuç riskini azaltır. Tek bir yönteme bağlı kalınmaksızın, klinik bulgularla uyumlu olarak farklı serolojik testlerin birlikte kullanılması tanı güvenirliğini artırır. Testlerin uygulanması ve sonuçların yorumlanması aşamalarında sürekli mesleki eğitim programlarıyla personelin bilgi güncelliğinin sağlanması gereklidir. Ayrıca serolojik sonuçların, hastanın öyküsü ve fizik muayene bulgularıyla birlikte değerlendirilmesi tanı ve tedavi sürecinde multidisipliner yaklaşım açısından oldukça önemlidir. İmmünoserolojik yöntemler hakkında bilgi birikim seviyesinin yükselmesi hem akademik hem de pratik tıpta daha güvenilir, hızlı ve klinik açıdan değerli sonuçlar üretilmesine katkı sağlayacaktır Kaynakça 1. Tille PM. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 13th edn. USA: Mosby; 2013. 2. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology. 3rd edn. USA: Mosby; 1993. 3. Kılıçturgay K. İmmünoloji. 4. Baskı. Türkiye: Güneş & Nobel tıp kitapevleri; 2007. 4. Altındiş M. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı. Türkiye: Nobel tıp kitapevleri; 2013. 5. Topçu, AW, Söyletir G, Doğanay M. Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi Etkenlere Göre Enfeksiyonlar. Türkiye: Nobel Tıp Kitabevleri; 2008. 6. Mims C, Dockrell HM, Goering RV, Roitt I, Wakelin D, Zuckerman M. Medical Microbiology. 3rd edn. USA: Mosby; 2004. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   263 · Zaman çizelgesi: Her görev ne zaman üzerinde çalışılacak ve ne zaman tamamlanacak, · Bütçe ve kaynak ihtiyaçları: Ek personel, eğitim ihtiyaçları, tesisler, ekipman, · Reaktifler ve malzemeler, kalite kontrol malzemeleri, · Kıyaslamalar: Uygulamadaki ilerlemenin izlenmesi için gereklidir. Yazılı plan, herkesin planı ve uygulama sürecini anlaması gerektiği için tüm laboratuvar personelinin erişimine açık olmalıdır. Organizasyonun uygulama aşamasında, aşamalar halinde uygulamalar hazırlanmalı, kaynak ihtiyacı sürecin başında belirlenmeli ve etkili bir iletişimle tüm personel görevlendirilmelidir. Kalite yönetimini izlemek için bir sistem kurmak, bir kalite sisteminin uygulanmasında esastır. İyi bir kalite sisteminin genel hedefi olan sürekli iyileştirmeyi sağlayacak olan, sistemin düzenli olarak takip ve izlemidir. İzleme, sistemin düzgün çalıştığından emin olmak için sistemin her bir parçasını kontrol edebilmeyi içerir. Genellikle kalite yöneticisi, izleme programından birincil olarak sorumlu kişi olacaktır. İzleme süreci için bir sistem geliştirilerek kontrollerin zamanını veya sıklığını belirlenmeli, izlemenin nasıl yönetileceğine karar verilmelidir. Ayrıca düzenli aralıklarla iç denetimler yapılmalıdır. 2.2.Personel Laboratuvarların en önemli kaynağı personelidir. Kalite yönetim sisteminin uygulanmasında kritik olan, dürüst, işlerinin önemini kavrayan ve sürekli iyileştirmeye katılan özelliklerdeki personele sahip olmaktır. Bir tıbbi laboratuvar yöneticisi; · Her bir personel için ayrıntılı iş tanımı geliştirmeli, · Personeli belirlenen görev doğrultusunda eğitmeli ve bu eğitimler kayıt altına alınmalı, · Personelin gerekli oryantasyon ve eğitimi aldığından emin olmalı, · Personel için yeterlilik değerlendirmesi yapıp sonuçlarını kaydetmeli, · Personel için sürekli öğrenim fırsatları oluşturmalıdır. Bir laboratuvar personeli ise düzenlenen eğitimlere katılmalı, iş sorumlulukları arttıkça yeni eğitimler talep etmeli ve kişisel mesleki gelişiminin kaydını tutmalıdır. Laboratuvar yönetimi, laboratuvardaki tüm pozisyonlar için uygun personel niteliklerini belirlemelidir. Bunlar, eğitim, beceri, bilgi ve deneyim 264   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER gereksinimlerini içermelidir. Nitelikleri tanımlarken, dil, bilgi teknolojileri ve biyogüvenlik gibi ihtiyaç duyulan özel beceri ve bilgileri göz önünde bulundurulmalıdır. İş tanımları, her personel pozisyonu için sorumluluk ve yetkilerin net ve doğru bir tanımını yapar. İş tanımları şunları içermelidir: · Gerçekleştirilmesi gereken tüm faaliyetleri ve görevleri ortaya koymalı, · Testleri yürütme ve kalite sistemini uygulama sorumluluklarını (politikalar ve faaliyetler) belirlemeli, · Çalışanın geçmişini ve eğitimini yansıtmalı, · Güncel tutulmalı ve laboratuvarda çalışan herkes için erişilebilir olmalıdır. İş tanımları yetkinlik temelli olmalı ve ihtiyaç duyulan becerileri yansıtmalıdır. Her personel pozisyonu için gereksinimler, laboratuvarın büyüklüğüne ve sunulan test hizmetlerinin karmaşıklığına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, sınırlı personele sahip küçük laboratuvarlarda personelin birçok sorumluluğu olabilir ve birçok görevi yerine getirebilirken, daha fazla personele sahip daha büyük laboratuvarlarda personel özelleşmiş olabilir. Oryantasyon, yeni bir çalışanın yeni çalışma ortamını ve belirli görev veya sorumluluklarını tanıma sürecidir. Oryantasyon, eğitimden farklıdır. Çalışanların genel performansları hakkında periyodik olarak resmi bir değerlendirme yapılmalıdır. Bu değerlendirme; teknik yeterlilik, verimlilik, laboratuvar politikalarına uyum, güvenlik kurallarına uyma, iletişim becerileri, dakiklik ve profesyonel davranışı içermelidir. Değerlendirme, bir çalışanın moralini, motivasyonunu ve öz saygısını etkileyebilir ve tüm çalışanlar için eşit bir şekilde yapılmalıdır. İnsanlar, eleştiriye, nazik bir şekilde dile getirilse bile, farklı tepkiler verirler; bu nedenle, çalışanlara danışmanlık yaparken kişiliğe uygun yaklaşımlarda bulunulmalıdır. Olumlu geri bildirimlerin yanı sıra iyileştirme önerileri de sunulmalıdır. 2.3.Ekipman Laboratuvardaki ekipmanların doğru yönetimi, doğru, güvenilir ve zamanında test sonuçlarının sağlanması için gereklidir. İyi bir ekipman yönetim programının birçok faydası vardır. Bunlar: · Yüksek düzeyde laboratuvar performansının korunmasına yardımcı olur. · Test sonuçlarındaki değişkenliği azaltır ve teknisyenin test sonuçlarının doğruluğuna olan güvenini artırır. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   265 · İyi bakımlı bir cihaz için daha az onarım gerekeceğinden onarım maliyetlerini düşürür. · Cihazın ömrünü uzatır. · Arıza ve arızalardan kaynaklanan hizmet kesintilerini azaltır. · Çalışanların güvenliğini artırır. · Daha fazla müşteri memnuniyeti sağlar. Laboratuvar için ekipman seçimi yaparken; kurulumu, kalibrasyon ve performans değerlendirilmesi, bakımı, problem ve sorun giderilmesi, servis ve tamir hizmetleri ve son olarak işi biten ekipmanın elde çıkarılması gibi konular göz önünde bulundurulmalıdır. Ekipman yönetim sorumluluğu, laboratuvardaki bir teknisyene özel olarak atanabilir. Birçok laboratuvarda, ekipman bakımı ve sorun giderme konusunda iyi becerilere sahip bir kişi bulunur. Bu kişiye tüm ekipmanların denetimi rolünün verilmesi önerilir. Ekipman yönetimi ile ilgili aktiviteler; cihazlara ait tüm kayıtların rutin olarak gözden geçirilmesini, gerektiğinde bakım prosedürlerinin yenilenmesini ve tüm prosedürlerin doğru olarak takip edildiğinden emin olunmasını içermelidir. Laboratuvara cihaz temin ederken atın almadan önce şu sorular sorulmalıdır: · Bağlantı şemaları, bilgisayar yazılımı bilgileri, gerekli parçaların listesi ve bir kullanım kılavuzu sağlanıp sağlanmadığı, · Üreticinin, satın alma fiyatının bir parçası olarak ekipmanı kurup kurmayacağı ve personeli eğitip eğitmeyeceği (gerektiğinde seyahat masraflarını karşılayarak), · Garantinin, cihazın beklendiği gibi performans gösterdiğini doğrulamak için bir deneme süresi içerip içermediği, · Üreticinin cihaz bakımını sözleşmeye dahil edip etmeyeceği ve eğer öyleyse, bakımın düzenli olarak yapılıp yapılmayacağı. Laboratuvarın elektrik, su ve mevcut alan gibi tüm gerekli fiziksel gereksinimleri karşılayıp karşılayamayacağını belirlenmelidir. Ekipmanları laboratuvara taşımak için yeterli imkan olmalıdır, kapı açıklıkları ve asansör erişimi göz önünde bulundurulmalıdır. Mümkün olduğunda, laboratuvar ekipmanlarını üreticinin kurması en iyisidir; bu durum, garanti koşullarını iyileştirmenin yanı sıra kurulumun düzgün ve hızlı bir şekilde yapılmasını da sağlayabilir. Ekipman kurulduktan sonra bakım ve işletim programlarından sorumlu bir kişi belirlenmelidir. Parça ve malzemelerin kullanımı kayıt altına alınmalıdır. 266   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Günlük, haftalık ve aylık bakım takibi çizelgesi oluşturulmalıdır. Tüm kullanıcılar için eğitim planlanarak sadece eğitimini tamamlayan personelin cihazı kullanımı sağlanmalıdır. Hasta örneklerini test etmeden önce, doğruluk ve kesinlik açısından doğru çalıştığından emin olmak için yeni ekipmanın performansını değerlendirmek önemlidir. Önleyici bakım, sistematik ve rutin temizlik, ekipman parçalarının planlı aralıklarla ayarlanması ve değiştirilmesi gibi önlemleri içerir. Üreticiler genellikle düzenli aralıklarla (günlük, haftalık, aylık veya yıllık) gerçekleştirilmesi gereken bir dizi ekipman bakım görevi önerir. Bu önerilere uyulması, ekipmanın maksimum verimlilikte çalışmasını sağlayacak ve ekipmanın kullanım ömrünü uzatacaktır. Bir kullanıcının, cihaz sonuçlarında kayma gözlemlediğinde, sorunu çözmek için ilk adım olarak önleyici bakım prosedürlerini tekrarlaması önemlidir. Bu işe yaramazsa, sorun giderme işlemlerine geçilmelidir. Cihazdaki problem nedeniyle testin tamamlanma suresinde gecikme olacağı, sonuç bekleyenlere bildirilmelidir. Arızalı cihaz kesinlikle kullanılmamalıdır. Rutin servis bakımı iş akışını aksatmayacak şekilde planlanmalıdır. Her büyük cihazın kendi cihaz bakım dosyası olmalıdır. Santrifüjler ve pipetler gibi daha küçük, yaygın olarak kullanılan ekipmanlar, laboratuvardaki tüm bu ekipmanları ele alan bir ekipman bakım dosyası ile değerlendirilebilir. Bir cihaz bakım dosyası şunları içermelidir: · Rutin bakım için adım adım talimatlar, · Cihazın kalibrasyon talimatları, · Sorun giderme kılavuzu, · Üreticinin gerekli servis ve onarım bilgileri, · Yedek parçalar gibi kullanım ve bakım için gereken belirli öğelerin listesi. Cihazda herhangi bir problemle karşılaşıldığında, sorun giderme sonrası şu bilgiler kaydedilmelidir; sorunun meydana geldiği tarih ve ekipmanın hizmetten çıkarıldığı tarih, arıza veya hatanın nedeni, üretici tarafından sağlanan herhangi bir hizmet hakkında bir not da dahil olmak üzere alınan düzeltici eylem, kullanıma geri dönüş tarihi ve sorun nedeniyle bakım veya işlev kontrolleri prosedüründe yapılan herhangi bir değişiklik varsa bu değişiklik. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   267 2.4.SatınAlmaveEnvanter Verimli ve uygun maliyetli laboratuvar işlemleri; reaktiflerin, malzemelerin ve hizmetlerin kesintisiz olarak erişilebilir olmasını gerektirir. Kısa bir süre için bile olsa test yapılamaması, klinik bakım, önleyici faaliyetler ve halk sağlığı programları için büyük bir aksaklığa neden olur. Satın alma ve envanter yönetim programının aşağıdaki gibi faydaları mevcuttur: · İhtiyaç duyulduğunda sarf malzemeleri ve reaktiflerin elde bulundurulur. · Yüksek kaliteli reaktifler uygun maliyete elde edilebilir. · Reaktifler ve sarf malzemeleri uygunsuz depolama nedeniyle kaybolmaz veya miad aşımı sonucu mağduriyet yaşanmaz. Envanter yönetiminin zorluğu, stoktaki malzeme ve reaktiflerin kullanımıyla ile son kullanma tarihleri arasında denge kurmaktır. Reaktiflerin kullanım ömrü birkaç haftadan birkaç yıla kadar değişebilir. İhtiyaç duyulan reaktiflerin her zaman elinizin altında olduğundan ve son kullanma tarihlerinin geçmediğinden emin olmak için son kullanma tarihlerini sürekli olarak takip etmek önemlidir. Ancak, aşırı stok yapmak hem maliyetli hem de gereksiz maliyete sebep olabilir. Beklentileri belirleyerek malzeme ve hizmet sağlayıcılarıyla ilişki kurup sürdürmek çok önemlidir. Doğrudan satın alma yapan laboratuvarlar, tedarikçilerin ve üreticilerin niteliklerini, teknik özelliklerini ve nakliye yöntemleri gibi unsurları dikkatlice incelemelidir. Başlangıçta laboratuvar; satın alınacak malzeme ve bu malzemenin kriterlerini tanımlamalı ve tedarikçinin niteliklerini ve güvenilirliğini dikkate alarak en iyi fiyatı aramalıdır. Maliyet, kalite ve güvenilirliği dikkate alarak diğer laboratuvarlarla fikir alışverişi yapılabilir. Satın alma işleminden sonra tedarikçileri değerlendirmek de aynı derecede önemlidir. Tedarikçinin belirtilen ürünleri teslim edip etmediği veya merkezi tedarik biriminin kullanıcı şartnamelerinin karşılandığını garanti edip etmediği gibi faktörleri göz önünde bulundurulmalıdır. Bir envanter kontrol programı diğer bir adıyla stok yönetim programı oluştururken dikkate alınması gereken bir dizi faktör vardır. Laboratuvarın tüm malzeme ve reaktiflerin durumunu yakından izleyebileceği, mevcut miktarları bilebileceği ve yeniden sipariş gerektiğinde uyarı alabileceği bir sistem tasarlanmalıdır. Bunun için laboratuvar ihtiyaçları analiz edilmeli, sorumlu bir personel atanmalı ve düzenli takip yapılmalıdır. Laboratuvar, gerçekleştirdiği 268   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER tüm testlerin bir listesini oluşturmalı ve her test için ihtiyaç duyulan tüm sarf malzemelerini ve reaktifleri belirlemelidir. Yeni malzeme siparişleri arasındaki süre için sarf malzemelerinin ve reaktiflerin kullanımını tahmin etmeye yardımcı olmak için mevcut tüm bilgileri kullanmak akıllıca olacaktır. İhtiyaçları analiz etmek için gerekli bilgiler şunları içerir: · Kullanılan her bir ürünün tam açıklaması, · Ürünün tedarik edildiği paket sayısı veya birim sayısı, · Aylık yaklaşık kullanım, · Ürünün laboratuvarın işlerinde sahip olduğu öncelik veya önem düzeyi, · Bir teslimatı almak için gereken süre, · Depolama alanı ve koşulları. Stok kayıtlarında şu bilgiler kaydedilmelidir: Reaktifin veya malzeme setinin teslim alındığı tarih, tüm malzemeler, reaktifler ve kitler için lot numaraları, kabul kriterlerini karşılayıp karşılamadığı, lot numarasının veya malzeme kutusunun hizmete girdiği tarih veya kullanılamıyorsa, imha tarihi ve yöntemi. Stok kayıt defteri, herhangi bir anda elde bulunan tüm malzemelerin ve reaktiflerin takibini sağlar. Yukarıda belirtilen bilgilere ek olarak, şunları kaydetmek iyi bir fikirdir: Malzemeleri teslim alan kişinin adı ve imzası, teslim tarihi, son kullanma tarihi, teslim alınan malzemenin miktarı, elde bulunması gereken minimum stok miktarı ve mevcut stok bakiyesi. Envanterin doğru şekilde yönetilmesi; laboratuvarın verimliliğini ve etkinliğini artıracaktır, ihtiyaç duyulan malzemelerin kesintisiz akışını sağlayacaktır, gerekli ürünlerin ihtiyaç duyulduğunda mevcut olduğundan emin olunacaktır, hasta ve kliniğin ihtiyaçlarının karşılandığından emin olunacaktır. 2.5.SüreçYönetimi Örnek yönetimi, kalite yönetim sisteminin bileşenlerinden biri olan süreç yönetiminin bir parçasıdır. Laboratuvarda elde edilen sonucun kalitesi, laboratuvara gelen örneklerin kalitelisiyle doğru orantılıdır. 2.5.1.PreanalitikSüreç Laboratuvar inceleme sürecinin preanalitik aşaması, numunenin mikrobiyoloji laboratuvarına ulaşmasından ve laboratuvarda numune kabulü ve işlenmesinden önce gerçekleşen tüm adımları kapsar. Preanalitik faaliyetlerin MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   269 çoğu mikrobiyoloji laboratuvarının dışında gerçekleşse ve en büyük hata kaynağı olsa dahi, laboratuvar tüm test sürecinden sorumludur. Preanalitik süreçte; test istemi, doğru hastadan doğru örnek alınması, örneğin uygun kaba doğru bir şekilde alınması, örneğin doğru zaman ve şekilde laboratuvara transportu ve kabulü aşamalarının hatasız olarak tamamlanması gerekir. Bu aşamaların tamamı laboratuvar dışında gerçekleşmesine rağmen, bu aşamalarda meydana gelecek hata sonucun doğruluğunu tehlikeye atar. Bu sebeplerle laboratuvar numune alımını doğru şekilde tanımlamalı ve bunu ilgili birimlere iletmelidir. Doğru numune alımı, etiketlenmesi, taşınması, depolanması ve atık bertarafı için ayrıntılı talimatlar; laboratuvar personeli, hemşireler ve hastalara bildirilmelidir. Doğru numune alma prosedürleri, talep edilen numunelerin toplanması için gerekliliklerin belirlenmesi ve bunlara uyulması, hastanın kimliğinin doğrulanması ve ardından numune toplama için malzemelerin ve hastanın hazırlanmasıyla başlar. Yanlış toplanmış veya yanlış etiketlenmiş numuneler, yanlış yorumlamaya veya daha da kötüsü, yanlış hasta için sonuçların raporlanmasına yol açabilecek önemli hatalardır. Numuneler, toplandıkları hastayla kesin olarak bağlantı kurmalarını sağlayacak özel bilgilerle etiketlenmelidir. Etikette en az iki hasta tanımlayıcı (örneğin ad, doğum tarihi veya hasta kimlik numarası), tarih ve varsa numune toplama saati bulunmalıdır. Numune etiketi, numunenin kaynağını ve ilgili durumlarda numune alınan anatomik bölgeyi içermelidir. Numune istem formunda, hastanın demografik bilgileri, talep edilen test ve numune açıklaması yer almalıdır. Hastanın demografik bilgileri, en az iki hasta tanımlayıcıyı (örneğin, adı ve doğum tarihi veya hasta kimlik numarası) ve ayrıca hastanın cinsiyetini, yaşını veya doğum tarihini içerir. Testi talep eden yetkili kişinin adı varsa testi toplayanın kimliği ve yapılacak testler açıkça belirtilmelidir. Hasta ile ilgili örneğin immün sistemi baskılanma durumu gibi ilgili klinik bilgiler de sağlanmalıdır. İstem formu, numunenin türünü, ilgili durumlarda numune alınan anatomik bölgeyi ve ilgili durumlarda numune alma tarihini ve saatini içermelidir. Ek test istemi için sözlü test talepleri genellikle hoş karşılanmasa da, bu talepler kaçınılmazdır. Laboratuvar, eğer çalışılacaksa bu tür taleplerin belirli bir süre içinde belgelendirilmiş bir şekilde onaylanmasını zorunlu kılan bir prosedür geliştirmeli ve bu prosedüre uymalıdır. Test sürecindeki hataların çoğu analiz öncesi aşamada meydana geldiğinden, mikrobiyoloji yönetimi iş birlikçi olmalı ve mümkün olan durumlarda, hasta bakımı ve sonuçları üzerindeki olumsuz etkiyi azaltmak için mümkün olduğunca çok sayıda preanalitik hatayı 270   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER çözmelidir. Örnek alan personel eğer mümkünse kayıt altına alınmalıdır. Bu bilgi, laboratuvar tarafından erişilebilir olmalıdır. Bu, özellikle örneğin riskli örnek olması ya da örnek alımı ile ilgili gerektiğinde eğitimin gerekli olması durumunda önemlidir. Örnek alan kişinin kimliği, talep formu, örnek kabı veya tıbbi kayıt dahil olmak üzere çeşitli yerlere kaydedilebilir. Numunenin bütünlüğü zamana, sıcaklığa ve bazı durumlarda koruyuculara bağlıdır. Her numune türü için taşıma gerekliliklerini belirlemek ve bunları izlemek mikrobiyoloji laboratuvarının sorumluluğundadır. Bir laboratuvarın kalite güvence programına örnek olarak, örnek taşıma çantalarındaki sıcaklık, taşıyıcılar veya pnömotik tüp sistemleri tarafından taşıma süresi ve koruyucuların ve son kullanma tarihlerinin tutarlı kullanımı gibi çevresel koşulların izlenmesi verilebilir. Taşıyıcının ve genel halkın maruziyetini en aza indirmek için biyolojik örneklerin veya kontrol suşlarının paketlenmesine ilişkin güvenlik gerekliliklerini belirlemek ve bunlara uymak da aynı derecede önemlidir. Güvenli taşıma uygulamalarını sağlamak için paketleme ve nakliyeyi gerçekleştiren yetkili laboratuvar personelinin yıllık sertifika alması zorunludur. Her laboratuvar, numuneler için kabul ve ret kriterlerini belirlemeli ve bunlara uymalıdır. Numune reddi durumunda, sebebiyle bu durum kayıt altına alınmalıdır. Numunenin laboratuvar içerisindeki takibi, bilgi sistemine veya bir kayıt defterine kaydedilmesi ve her numuneye, test şişesine ve kültür besiyerlerine laboratuvar kimlik numaralarının uygulanmasıyla sağlanabilir. Numune üzerinde gerçekleştirilen her işlemin ve bu görevi kimin gerçekleştirdiğinin kaydedilmesi de numunenin takibine yardımcı olabilir. Her numune, türüne göre biyogüvenlik kurallarına uyularak belirli bir süre saklanmalı ve gerektiğinde ulaşılabilir olmalıdır. 2.5.2.AnalitikSüreç Analitik süreç kapsamında belli başlı ana faaliyetler bulunur. Bunlar test verifikasyonu, test validasyonu ve kantitatif sonuçlara sahip testler için belirsizlik ölçümünün oluşturulması şeklindedir. Verifikasyon (doğrulama), ISO kılavuzunda tanımlandığı gibi, bir laboratuvarın testin üretici tarafından iddia edilen performansı gösterdiğini ve laboratuvarında kullanım için kabul edilebilir olduğunu belirlediği süreçtir. Laboratuvar, test yöntemini üreticinin talimatlarına göre, seçilen numuneleri veya izolatları kullanarak uygulamalı, süreci belgelemeli ve sonuçları kaydetmelidir. Normal değerlerin referans aralığı ve raporlanabilir aralık, test MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   271 prosedürünün uygulanması için laboratuvar tarafından belirlenmelidir. Referans aralıkları, testin gerçekleştirildiği normal sağlıklı nüfusun %95’i için beklenen değerlerdir. Nüfus, cinsiyete (erkek veya kadın) veya yaşa (pediatrik veya yetişkin) göre değişiklik gösterebilir ve referans aralığı, testin gerçekleştirildiği hasta tipini yansıtmalıdır. Referans aralıkları, laboratuvar raporlarından elde edilen verilerin yorumlanmasına yardımcı olan bir karar destek aracıdır. Çoğu normal referans aralığı, kan şekeri konsantrasyonları veya kırmızı kan hücresi sayımları gibi kantitatif testler için geçerlidir. Kalitatif mikrobiyoloji testlerinin raporlanabilir bir referans aralığı olabilir; örneğin, idrar kültürü için “üreme yok” veya A grubu streptokok testi için “A grubu streptokok negatif” gibi. Tüm verifikasyon sonuçları sorumlu kişi tarafından incelenmeli ve kaydedilmelidir. Validasyon, CLSI ve ISO’ya göre, bir işlem, süreç, sistem, donanım ya da metodun beklendiği şekilde çalıştığını ve kullanım amacını karşıladığını kanıtlama eylemi veya sürecidir. Eğer cihazlar ve ilgili yöntemler yeni ise validasyon gereklidir. Validasyon çalışması için aynı örnekler eski ve yeni cihazdaki yöntemler ile belli bir sure paralel çalışılır, beklenen sonuçların elde edilip edilmediğine bakılır. Validasyon çalışmasının sonuçlarının tümünün kayıt altına alınması gereklidir. Laboratuvarda geliştirilen her yeni yöntem için validasyon gereklidir. Laboratuvar, testin amacını, numune gereksinimlerini, gerekli ekipman ve malzemeleri ve testin nasıl gerçekleştirileceğine dair adım adım talimatları ayrıntılı olarak açıklayan tüm testler için yazılı prosedürlere sahip olmalıdır. Prosedür basılı veya elektronik olarak hazırlanabilir ve testi gerçekleştiren personele sunulmalıdır. Ölçüm belirsizliği, ölçüm sonuçlarında varyasyon olduğunda, gerçek değere ilişkin belirsizlik olacaktır. Belirsizlik, gerçek değerin makul bir şekilde bulunabileceği aralığı temsil eder. Ölçüm belirsizliği genellikle “%95 kapsam” olarak tahmin edilir. Çoğu durumda, rastgele varyasyonda açıklanan ±2SD aralığı, ölçüm belirsizliği olarak kabul edilir. Ancak varyasyonun derecesi, kullanılan yönteme de bağlıdır. Daha kesin olan yöntemler daha az belirsizliğe sahiptir. Çünkü %95 aralığında yer alan varyasyon miktarı daha küçüktür. Klinisyenler ve tıbbi laboratuvar uzmanları, bir günde 5.000 kopya/ml’lik bir PCR sonucunun, bir sonraki hafta bildirilen 10.000 kopya/ml’lik bir sonuçla nasıl karşılaştırıldığını anlamalıdır. Belirsizlik ölçümü, bu sonuçların klinik olarak anlamlı derecede farklı olup olmadığını veya test parametrelerinin varyasyonu dahilinde olup olmadığını yorumlamak için bilgi sağlayacaktır. Benzer şekilde, bir laboratuvar, yöntem için belirsizlik ölçümünü belirlemek 272   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER amacıyla aynı idrar numunesi üzerinde birden fazla kültür gerçekleştirebilir. Örneğin, 60.000 CFU/ml’lik bir idrar kültürü sonucunun gerçek değeri 45.000 ile 75.000 CFU/ml arasında olabilir. 2.5.3.KaliteKontrolü Kalite kontrolünün (KK) tüm süreçleri, süreç yönetiminin bir parçasıdır ve testlerin analitik aşamasıyla ilgili işlemleri izler. Kalite kontrolünün amacı, hasta sonuçları raporlanmadan önce test sistemi arızası, çevresel koşullar veya kullanıcı performansından kaynaklanan hataları tespit etmek, değerlendirmek ve düzeltmektir. Dünya Sağlık Örgütü, 1981 yılında “iç kalite kontrolü” (İKK) terimini kullanmış ve bunu “laboratuvar çalışmalarını ve ortaya çıkan sonuçları sürekli olarak değerlendirmek için bir dizi prosedür” olarak tanımlamıştır. KK ve İKK terimleri bazen birbirinin yerine kullanılabilir. Ülkelere göre bu kullanım değişebilir. Kalite kontrol süreçleri, laboratuvar incelemelerinin kantitatif, kalitatif veya yarı kantitatif sonuçlar üreten yöntemler kullanmasına bağlı olarak değişiklik gösterir. Bu incelemeler aşağıdaki şekillerde farklılık gösterir. Kantitatif incelemeler, numunede bulunan bir analitin miktarını ölçer ve ölçümlerin doğru ve hassas olması gerekir. Ölçüm, belirli bir ölçüm birimiyle ifade edilen sayısal bir değer üretir. Örneğin, bir kan şekeri testinin sonucu 5 mg/ dL olarak raporlanabilir. Kalite kontrol programının amaçlarından biri normal varyasyon ile hatalar arasında ayrımı yapmaktır. Kalitatif incelemeler, bir maddenin varlığını veya yokluğunu ölçen veya morfoloji gibi hücresel özellikleri değerlendiren incelemelerdir. Sonuçlar sayısal olarak değil, “pozitif” veya “negatif”; “reaktif” veya “nonreaktif”; “normal” veya “anormal”; ve “üreme var” veya “üreme yok” gibi kantitatif terimlerle ifade edilir. Kantitatif incelemelere örnek olarak mikroskobik incelemeler, antijen ve antikorların varlığı veya yokluğu için serolojik prosedürler ve birçok mikrobiyolojik prosedür verilebilir. Yarı kantitatif incelemeler, sonuçların kantitatif olarak ifade edilmemesi bakımından kalitatif incelemelere benzer. Aradaki fark, bu testlerin sonuçlarının ölçülen maddenin ne kadarının mevcut olduğunun tahmini olarak ifade edilmesidir. Sonuçlar “eser miktar”, “orta miktarda” veya “1+, 2+ veya 3+” gibi terimlerle ifade edilebilir. Örnek olarak idrar çubukları, ketonlar için tablet testleri ve bazı serolojik aglütinasyon prosedürleri verilebilir. Diğer serolojik testlerde ise sonuç genellikle bir titre olarak ifade edilir. Bu da yine bir sayı içerir, ancak mevcut miktarın kesin bir miktarını değil, bir tahmin sağlar. Yapılan MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   279 sahip olmalı ya da bu yetkiye sahip kişilere raporlama için açıkça belirlenmiş bir sürece sahip olmalıdır. Uygunsuzluk hasta testlerini içeriyorsa, süreç ayrıca, hastaya zarar verme potansiyeli olduğunda, kurumsal olay yönetiminin bir parçası olarak olayın raporlanmasını da içermelidir. Olay, testin durdurulmasının gerekli olup olmadığını belirlemek için analiz edilmeli ve sorunu çözme ve düzeltici eylemi belirleme yetkisine sahip bir kişiye bildirilmelidir. Bu analiz, eğilimleri değerlendirmek için daha önce bildirilen testlerin incelenmesini içermelidir. Uygunsuz olayın tıbbi önemi varsa, sağlık hizmeti sağlayıcılarına bildirimde bulunmak gerekebilir. Hasta testi durdurulmuşsa, teste ne zaman yeniden başlanmasının kabul edilebilir olduğunu belirlemek için bir süreç geliştirilmelidir. Uygunsuz olay yönetim programında ilk adım, olaya yol açan süreçte nelerin meydana geldiğinin, ilgili tüm tarafların ve eylemlerin tanımlanması ve olay laboratuvar dışında gerçekleşiyorsa tarih, saat ve yerin belirtilmesi de dahil olmak üzere belgelendirilmesidir. Olay laboratuvar içinde gerçekleşiyorsa, ilgili laboratuvar bölümü belirlenecektir. Araştırma, ilgili prosedürlerin ve prosedüre uyumun, kullanılan cihaz ve yazılımların ve ilgili tarafların eğitim ve yeterliliğinin incelenmesini içermelidir. İlgili taraflarla görüşmeler yapılmalı ve sorunun nasıl tespit edildiği belirlenmelidir. İkinci adım, olayın sınıflandırılmasıdır. Olaylar, iş akışı yoluna göre preanalitik, analitik veya postanalitik olarak sınıflandırılabilir. Olaylar ayrıca hastaya zarar verme potansiyeline göre de sınıflandırılabilir. Örneğin, bir Staphylococcus aureus izolatının oksasiline dirençli olduğu halde duyarlı olarak bildirilmesi durumunda, bir hata ciddi zarar verme potansiyeline sahip olarak sınıflandırılabilir. Zarara neden olabilecek herhangi bir eylemde bulunma olasılığı düşükse veya hata, sonucunda işlem yapılsa bile zarar verme olasılığı düşükse, bu hata küçük olarak sınıflandırılabilir. Örnek olarak Staphylococcus capitis’in Staphylococcus hominis olarak yanlış tanımlandığı bir durum olabilir. Olaylar ayrıca sorun türüne göre de sınıflandırılabilir: Sistemik (süreç veya prosedürde başarısızlık), bilgi temelli (eğitim veya yetkinlik eksikliği) veya davranış temelli (politikalara ve prosedürlere kasıtlı olarak uymama). Uygunsuz olay analizinden sonra, kök neden analizine ihtiyaç olup olmadığı belirlenmelidir. Kök neden analizi, tekrarlayan, yüksek riskli, yüksek maliyetli veya yüksek hacimli olayların yanı sıra ciddi olumsuz hasta sonuçlarına (sentinel olay) sahip herhangi bir olay için yapılmalıdır. Kök neden analizi gerçekleştirmek için süreç haritalama, balık kılçığı diyagramları, Pareto 280   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER grafikleri ve hata modu ve etki analizi dahil olmak üzere çeşitli kalite iyileştirme metodolojisi araçları kullanılabilir. Kök neden analizi yapıldıktan sonra düzeltici eylem uygulanır. Düzeltici eylem, bir uygunsuzluğun nedenini ortadan kaldırmak için yapılan eylemdir. Nedenin belirlenmesi, kök neden analizinin bir parçası olarak açıklanan araçların uygulanmasını gerektirebilir veya gerektirmeyebilir. Önleyici eylem, olası uygunsuzluğun nedenini ortadan kaldırmak için gerçekleştirilen proaktif bir eylemdir. Yüksek riskli olaylar için bir önleyici eylem planı geliştirilmelidir. Düzeltici eylemde olduğu gibi, önleyici eylemin etkinliği izlenmelidir. Laboratuvar, önleyici eylem gerektiren olası uygunsuz olay belirlemek için bir sürece sahip olmalıdır. Son adım, laboratuvar yönetimine özet bir rapor halinde veri ve analiz sağlamaktır. Laboratuvar yönetimi, sorun çözümü için önceliği belirlemeli ve önceliklendirme için risk yönetimiyle koordineli çalışmalıdır. Öncelik belirlenirken, olayın sıklığı, hastaya zarar verme riski, laboratuvar akreditasyonu riski, müşteri memnuniyeti ve olayın meydana gelme maliyeti dikkate alınmalıdır. Laboratuvar yönetimi, kök neden analizi ihtiyacını belirlemeli ve uygun kaynakları tahsis etmelidir. Yüksek riskli olaylar olan tekrarlayan uygunsuz olay, sürekli iyileştirme sürecinin bir parçası olarak iyileştirme fırsatları olarak belirlenmelidir. 2.9.Değerlendirme İç ve dış denetimler ve performansın bir dış kalite değerlendirme programı (DKD) ile değerlendirilerek kalite yönetim sistemi etkinliğinin tespit edilmesine yönelik bir araçtır. Değerlendirme, tüm ilgililere laboratuvarın mevzuata, akreditasyon ve müşteri gerekliliklerine uyduğunu göstermek amacıyla kalite yönetim sisteminin bir kısmının (veya bazen tamamının)sistematik incelemesi olarak tanımlanabilir. Harici sertifikasyon veya akreditasyon kuruluşları tarafından yürütülen denetimler, laboratuvar uygulamalarını ilgili kuruluşun gerektirdiği spesifikasyonlara göre değerlendirir. DKD burada, bir dış tedarikçi veya ticari bir kurum üzerinden laboratuvar performansının objektif değerlendirildiği bir sistem olarak tanımlanır. DKD, laboratuvar performansının bir göstergesi olduğu için, laboratuvar kalite yönetim sisteminin iyileştirilmesinde önemlidir. İç denetim sırasında laboratuvar, kalite yönetim sistemini, ISO 15189 gibi, belirlenen kalite sistemine uygulanan tanınmış bir standartlar kümesine göre değerlendirmelidir. Alternatif olarak, kalite sistemi kurum tarafından MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   281 oluşturulmuşsa, kalite el kitabı ve kalite politikasında açıklanan temel kalite faaliyetlerine odaklanan bir kontrol listesi, kalite sistemini denetlemek için kullanılabilir. KYS’nin etkinliğini belirlemek için yapılan iç denetimler, CLIA sertifikasyonu veya akreditasyonu için yapılan teknik ve bilimsel öz değerlendirmeyle birleştirilebilir. Denetimler, laboratuvarın KYS ile ilgili performansını değerlendirmek üzere eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmelidir. Denetçiler, laboratuvar operasyonları, standartların yorumlanması ve denetim süreci hakkında bilgi sahibi olmalıdır. Kaynakların izin verdiği her durumda, denetçiler denetlenecek faaliyetten bağımsız olmalıdır. Belge ve kayıtların tarafsız bir şekilde incelenmesi, standartlara uygunluğun objektif bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Denetimler, nesnellik ve tarafsızlığı sağlayacak şekilde yürütülmelidir. Denetimin kriterleri, kapsamı ve zamanlaması denetimden önce bildirilmeli ve standartların kontrol listesi önceden paylaşılmalıdır. Denetimin sonunda, uygunsuzlukları gözden geçirmek ve soru sorma fırsatı sağlamak için bir özet toplantı düzenlenmelidir. Belirtilen uygunsuzlukların yazılı bir raporu laboratuvara zamanında iletilmelidir. Bir denetimin hemen ardından laboratuvar, gerekliliklere uyumu sağlayacak düzeltici eylem planına uygun olmayan durumları ele almalıdır. Denetim sırasında ortaya çıkan uygunsuzluklar, faaliyetlerin iş süreci, hasta sonuçları ve güvenlik hususları üzerindeki etkisi açısından değerlendirilmelidir. Hasta veya personel güvenliğini etkileyen uygunsuzluklar, daha fazla zaman ve analiz gerektiren düzeltici veya önleyici eylem planlarının ardından derhal düzeltici eylemlerle ele alınmalıdır. Laboratuvarlar, tüm bulguları, izlenip çözülmek üzere uygunsuz olay olarak kaydedilmelidir. Dış denetim bulgularının ve sorunları gidermeye yönelik tüm faaliyetlerin dokümantasyonu kaydedilmelidir. Dış denetimlerin sonuçları ve “öğrenilen dersler”, kalite sisteminin gözden geçirilmesinin bir parçası olarak yönetim ve personel ile paylaşılmalıdır. Laboratuvar hizmetlerinizin kullanıcıların ihtiyaç ve gereksinimlerini nasıl karşıladığı konusunda geri bildirim istemek, kalite yönetim sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır. Laboratuvarınızın “müşterilerinin” kim olduğunu anlamak hayati bir ilk adımdır. Laboratuvarın müşterileri, mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından sağlanan hizmet ve bilgileri kullanan herkestir. Bu müşteriler arasında acil servislerdeki, yoğun bakım ünitelerindeki, polikliniklerdeki, bağlı sağlık tesislerindeki sağlık hizmeti sağlayıcıları, test hizmeti verdiğiniz laboratuvarlar, enfeksiyon önleme uzmanları, antibiyotik yönetimi için verileri kullanan eczacılar, halk sağlığı laboratuvarı, epidemiyologlar vb. yer alır. 282   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Geri bildirim verileri incelenmeli ve iyileştirme faaliyetlerini yönlendirmek için kullanılmalıdır. ‘Müşteriler’ için neyin değerli olduğunu anlamak, sınırlı kaynakların uygun şekilde kullanılmasını ve müşteriler için en büyük etkiyi sağlayan süreçlerin iyileştirilmesine odaklanılmasını sağlayacaktır. Laboratuvar, müşterilerin şikayetlerini dile getirmesini, ihtiyaçlarını anlamak için tek fırsat olarak beklememelidir. Neyin işe yaradığı ve neyin iyileştirilebileceği konusunda proaktif olarak resmi ve gayri resmi geri bildirim istemek, laboratuvar sistemini iyileştirmek için paha biçilmez bilgiler sağlayacaktır. Anket sonuçlarına göre yapılan değişiklikler izlenmeli ve yapıcı yorumlarda bulunanlara iletilmelidir. Değerlendirmelere ve istenen geri bildirimlere ek olarak, performansı izlemek için resmi kalite göstergeleri kullanılmalıdır. Kalite göstergeleri, tüm test süreci için kritik faaliyetleri kapsamalıdır. Uygunsuz olay kaydından tespit edilen sorunlar ve kişiselleştirilmiş bir kalite kontrol planında risk olarak tanımlanan süreçler, kalite göstergeleri için fikir sağlayabilir. Laboratuvar ayrıca, çalışmalarının hem teknik hem de teknik olmayan yönlerinin performansını izlemek için kalite göstergeleri de içermelidir. Kalite göstergeleri, mikrobiyoloji laboratuvarında tek bir uzmanlık alanı (örneğin viroloji, parazitoloji veya mikoloji), tüm mikrobiyoloji alanları veya tüm tanı laboratuvarı alanları (örneğin biyokimya, hematoloji, kan bankası ve mikrobiyoloji) için yıllık olarak oluşturulabilir ve izlenebilir. Birden fazla laboratuvar bölümünün ve üst düzey yönetimin ortak çabasını gerektiren kesişen sorunlar ortaya çıkarılabilir. Örneğin kan kültür kontaminasyon oranlarını %3’ün altında tutmaya çalışmak bir kalite göstergesidir. Laboratuvar, neyin izleneceğine ve verileri ölçmek için beklenen kıstaslara veya eyleme geçilmesi gereken eşik değerine karar vermelidir. 2.10.Sürekliİyileşme Sürekli iyileştirme süreci, kalite yönetim sisteminin temel bir bileşenidir. Bu süreç aracılığıyla, iyileştirme fırsatları belirlenir ve sonuçları ve müşteri memnuniyetini iyileştirmek için harekete geçilir. Faaliyetler, risk değerlendirmesine göre önceliklendirilmelidir. İyileştirme planları oluşturmak için kalite iyileştirme modelleri ve araçları kullanılmalıdır. Planlar belgelendirilmeli ve uygulanmalıdır. Planın etkinliği, sürekli incelemelerle belirlenmelidir. İyileştirme fırsatları, yalnızca bir soruna tepki olarak değil, proaktif olarak da tespit edilebilir. Tüm iyileştirme fırsatlarının büyük değişiklikler olması gerekmez; küçük iyileştirmelerin uygulanması yalnızca kolay olmakla kalmaz, MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   283 aynı zamanda son derece değerlidir. İyileştirme fırsatları, dört kalite sistemi esası olan organizasyon, müşteri, değerlendirmeler ve uygunsuz olaylardan veya laboratuvar personeli tarafından tespit edilebilir. İyileştirme fırsatları, kalite yönetim sisteminin bir parçası olarak planlanmış faaliyetler olabilir. Anketler aracılığıyla toplanan müşteri ve/veya personel geri bildirimleri; güçlü yönler, zayıf yönler, fırsatlar, literatür taraması, kurumsal misyon veya değerler ve risk değerlendirmeleri yoluyla tespit edilebilirler. İyileştirme fırsatları ayrıca başarısızlıklardan veya müşteri şikayetlerinden tespit edilebilir veya iç ve dış değerlendirmeler, kalite göstergeleri veya uygunsuz olayların analizleri yoluyla keşfedilebilir. Klinik ortamlarda iyileştirme için en yaygın kullanılan model, planlauygula-kontrol et-harekete geç modelidir. Bu model, sürekli iyileşmeye olanak tanıyan dört adımlı bir yaklaşımdır. “Planla” aşaması bir iyileştirme fırsatını belirler, temel nedeni belirler ve potansiyel bir çözüm belirler. “Uygula” aşaması uygulama adımıdır. En sık kullanılan çözüm, küçük ölçekli uygulamadır (örneğin, hastanenin bir alanında yeni bir örnek toplama yöntemi denemek). “Kontrol et” aşaması, çözümün gereksiz veya beklenmedik sonuçlar olmadan sorunu ortadan kaldırıp kaldırmadığını belirlemek için verileri analiz eder. “Harekete geç” aşaması, planın tam ölçekli uygulanmasına veya yeniden değerlendirilmesine olanak tanır. Kullanılan model ne olursa olsun, bir iyileştirme fırsatı belirleyip seçmenin ve bir çözüm üretip uygulamanın bir yolunu içermelidir. Çözümün etkinliği değerlendirilmeli ve istenmeyen sonuçlar açısından izlenmelidir. İyileştirmenin rutin süreçlere entegre edilmesi zorunludur. Bireyler eski alışkanlıklarına geri dönebilir, bu nedenle iyileştirmeyi sürdürmenin bir yolu bireylerin dahil edilmesidir. Sonuçların yönetime ve personele raporlanması bunu kolaylaştırır ve geri bildirimi teşvik eder. Sürekli iyileşme, sürekli bir değişim sürecidir. Değişim risk içerir ve laboratuvarın riskleri ve potansiyel etkilerini belirlemek için bir süreci olmalıdır. Yönetim, ekibe risk analizini gerçekleştirmek için eğitim ve/veya nitelikli kişiler de dahil olmak üzere yeterli kaynaklar sağlamalı ve yönetim çözümler için ek destek ve onay sağlayabilir. Yönetim hem somut değişimi hem de psikolojik geçişi içeren bir değişim yönetimi stratejisi geliştirmelidir. Çözümlerin sonuçlarını gözden geçirmelidir. İletişim, sürekli iyileşme sürecinin kritik bir bileşenidir. Sürekli iyileşme, projelerinin hedefleri ve durumu hakkında bilgi paylaşmak, personel geri bildirimi için fırsatlar sağlamak ve sürekli iyileşme sürecinin başarılarını kutlamak önemlidir. 284   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 2.11.MüşteriOdaklılıkveDanışmanlıkHizmetleri Mikrobiyoloji laboratuvarı, bulaşıcı hastalık tanısı, patojen tespiti, antibiyogram ve biyogüvenlik alanlarında içerik uzmanlığı ve liderlik sağlar. Bu nedenle, mikrobiyoloji laboratuvarı, mevcut ve değişen ihtiyaçları karşılamak için uzmanlığına ihtiyaç duyan sağlık sistemindeki tüm disiplinler veya kişilerle iş birliği yapar. Mikrobiyoloji laboratuvarı, preanalitik süreç (örneğin, doğru tanı için uygun test konusunda tavsiyelerde bulunmak ve optimum numuneyi belirleme ve toplama konusunda talimat vermek), analitik süreç (örneğin, kullanılan optimum yöntem ve teknolojileri seçmek) ve postanalitik süreç (örneğin, nihai sonuçları raporlamak ve yorumlama ve veri analizleri sağlamak) dahil olmak üzere tüm test süreci hakkında danışmanlık yapmaktan sorumludur. Bu bilgilerin açık ve zamanında iletilmesi, mikrobiyolojide başarılı bir konsültasyon için çok önemlidir. Yanlış veya yetersiz iletişim genellikle hataların temelini oluşturur. Bu nedenle, mikrobiyoloji laboratuvarının hasta bakımını tehlikeye atabilecek yanlış yorumlamaları önlemek için etkili iletişim stratejileri geliştirmesi büyük önem taşır. Mikrobiyoloji laboratuvarı, tavsiyelerini kullanıcılara nasıl ileteceğini belirlemeli ve iletilen mesaj için paydaşlarının (örneğin bulaşıcı hastalıkları önleme birimi, eczane ve enfeksiyon hastalıkları) görüşlerini almalıdır. İletişim yazılı veya elektronik formatta olabilir. Zamanında iletişim, kritik bir test sonucu için hekime telefonla ulaşmak gibi sözlü de olabilir. Yeni patojenler veya yeni bir kan kültürü cihazı kullanıldığında personel içi görüşmeler hakkında yüz yüze telefon görüşmeleri de iyi bir iletişim biçimidir. Uygun durumlarda, iletişimler kaydedilmeli, arşivlenmeli ve gelecekte referans olarak kullanılmak üzere kolayca erişilebilir olmalı ve denetim amacıyla danışmanlık hizmetlerinin kanıtı olarak kullanılabilir. Laboratuvarla tavsiye almak için iletişime geçmek için, mikrobiyoloji laboratuvarının çalışma saatleri ve normal çalışma saatleri içinde ve dışında iletişim bilgileri gibi temel bilgiler sağlanmalıdır. 2.12.TesislerveGüvenlik Tesislerin yönetimi, laboratuvarın numune toplama ve test alanları ile hasta başı test alanları, kaliteli çalışma yapmak ve hasta, personel ve ziyaretçi güvenliğini sağlamak için yeterli alana sahip olmalıdır. Laboratuvar hem ekipman hem de personel için alanın yeterliliğini değerlendirip belirlemelidir. Güvenli bir ortamın sağlanmasına özellikle dikkat edilmelidir. ISO 15189’da belirli güvenlik standartları yer almasa da ISO 15190 belgesinde belirtilmiştir. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   285 Güvenlik, iyi bir kalite yönetim sisteminin ayrılmaz bir parçası olmalıdır. Biyogüvenlik seviyeleri, kişisel koruyucu ekipman ve tesis ve mühendislik kontrollerinin ayrıntılı bir şekilde ele alınması bu belgenin kapsamı dışındadır. Laboratuvar, biyolojik, kimyasal ve radyasyon tehlikelerine; biyogüvenliğe ve gizliliğe dayalı kontrollü erişime sahip olmalıdır. Erişim seviyeleri laboratuvar içinde mekandan mekana değişebilir ve testlerin biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) veya daha yüksek seviyede yapıldığı alanlara erişim kısıtlanmalıdır. Ayrıca, laboratuvarın giriş ve çıkışlarına içerideki tehlikeleri belirten işaretler asılmalıdır. Mikrobiyoloji laboratuvarları için giriş işaretleri biyolojik tehlikeyi belirtmeli ve acil durumlarda iletişim bilgileri gösterilmelidir. Tuş takımları veya çift kapılı, kilitli antreler gibi erişim kontrolleri, mikobakteriyoloji laboratuvarları gibi BSL-3 seviyesinde faaliyet gösteren laboratuvarlara sınırlı erişim sağlar. Laboratuvar ortamı, yönetmeliklerine uygun olmalıdır. Çalışma tezgahları, zeminler, tavanlar ve duvarlar dahil olmak üzere laboratuvardaki tüm alanlar ve yüzeyler temiz ve bakımlı olmalıdır. İdeal olarak, bu yüzeyler kolayca dekontamine edilebilmeleri için gözeneksiz olmalıdır. Laboratuvarlarda testlerin yapıldığı alanlar asla halıyla kaplanmamalıdır. Hem laboratuvar hem de ofis alanı olmak üzere çalışma ortamı, işle ilgili kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarının oluşmasını önlemek için ergonomik olarak tasarlanmalıdır. Ayrıca, uyumsuz çalışma ortamları arasında yeterli alan ayrımı olmalıdır. Örneğin, biyogüvenlik kabinleri (BGK’ler), düzgün çalışmasını sağlamak için havalandırma sistemlerinden uzakta konumlandırılmalı ve potansiyel amplikon kontaminasyonu olan alanlar moleküler reaktif ve ana karışım hazırlama alanlarından ayrı olmalıdır. Reaktif hazırlama ve ekipman temizliği için özel lavabolar bulunmalı ve ayrı el yıkama lavaboları eller serbest olmalı ve başka amaçlarla kullanılmamalıdır. Sonuçların kalitesini etkileyebilecek ve buna göre izlenmesi, kaydedilmesi ve ayarlanması gereken ek çevresel koşullar arasında aydınlatma, gürültü, titreşim, toz seviyeleri, duman, radyasyon, elektrik beslemesi, sıcaklık ve nem yer alır. Laboratuvar havalandırması, tüm alanların hava değişimi, nem ve sıcaklık gereksinimlerini karşılayacak şekilde izlenmeli ve ayarlanmalıdır. Havalandırma, odanın konfigürasyonundan, ısı üreten ekipmanların (örneğin kan kültürü cihazları) ve havalandırma ekipmanlarının (örneğin biyogüvenlik dolapları ve kimyasal duman davlumbazları) konumundan ve çalışma düzenlerinden etkilenebilir. Mümkün olduğunca hava akışı, koridorlardan laboratuvar alanına doğru içe doğru olmalıdır. Mikobakteriyoloji, mikoloji ve viroloji laboratuvarları için yeterli sıklıkta hava değişimi sağlayan negatif hava basıncı kullanılmalıdır. 286   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER Genel olarak, BSL-2 için kabul edilebilir hava değişimi sıklığı saatte 3 ila 15 hava değişimi arasındadır ve bu, genellikle mikobakteriyoloji laboratuvarları gibi daha yüksek kimyasal veya tehlike konsantrasyonlarının olduğu alanlarda daha sıktır. Gaz ve vakum hatları uygun şekilde mevcut olmalı ve açıkça işaretlenmelidir. Gaz tüpleri her zaman dik bir şekilde sabitlenmeli, tercihen duvar gibi sağlam bir yüzeye monte edilmeli ve yanıcı maddelerden uzakta tutulmalıdır. Vanalar kullanılmadığında vana emniyet kapakları takılı olmalıdır. Reaktiflerin, numunelerin, ekipmanların, malzemelerin, belgelerin ve kayıtların bütünlüğünü korumak için uygun boyut, sıcaklık ve nem oranına sahip yeterli bir depolama tesisi mevcut olmalıdır. Ekipman ve reaktifler, üretici tarafından belirlenen ve karşılanması gereken sıcaklık ve nem gereksinimlerine sahip olabilir. Sıcaklık, gerekli koşullar altında günde 24 saat korunmalı ve düşük yoğunluklu saatlerde enerji tasarrufu için değiştirilmemelidir. Numune depolama alanı, çapraz bulaşma olasılığını ortadan kaldıracak şekilde seçilmelidir. Laboratuvar kapsamlı bir güvenlik programı geliştirmeli ve uygulamalıdır. Program genellikle biyogüvenlik, tehlikeli maddelerin taşınması ve personel koruyucu ekipman kullanımını içerir. Bir laboratuvar güvenlik programı ayrıca yangın güvenliğini, kimyasal hijyeni, elektrik tehlikeleri, radyasyon ve tehlikeli atıklarla ilgili güvenli uygulamaları, ilk yardıma erişilebilirliği ve ergonomiyi de ele almalıdır. Güvenlik programı, işyeri düzenleyici gerekliliklerine ve kapsamlı bir risk değerlendirmesine dayanmalıdır. Güvenlik uygulamalarının doğrudan gözlemlenmesini içeren güvenlik eğitimi, personel yeterliliğinin bir parçası olarak sağlanmalı ve belgelenmelidir. Laboratuvar personeli, biyogüvenlik laboratuvarı uyumluluğu yönergelerini izlemeli ve yönetim, personeli mesleki olarak edinilen enfeksiyonlardan korumak için kaynakları sağlamalıdır. Güvenlik malzemeleri ve depolama alanı yeterli olmalı ve kullanıma yakın olmalıdır. Gerekli güvenlik malzemeleri, laboratuvarın biyogüvenlik seviyesine ve mevcut kimyasal tehlikelere bağlıdır. Güvenlik malzemeleri, kişisel koruyucu ekipmanlarla sınırlı olmayıp, biyogüvenlik dolapları, emniyet kapları ve kapaklı rotorları olan santrifüjler ve güvenli delici-kesici alet kapları gibi ürünlerin mühendislik kontrollerini de içerir. Biyolojik ve kimyasal dökülme kitleri, ilgili alanlarda kolayca erişilebilir olmalı ve uygun şekilde işaretlenmelidir. Dökülme tatbikatları, sorumlu görevli tarafından yapılmalı ve personel bu uygulamalar hakkında bilgi sahibi olmalıdır. Güvenlik ekipmanlarının (örneğin, biyogüvenlik dolapları, duşlar ve göz yıkama üniteleri) performansı düzenli olarak izlenmeli ve kaydedilmelidir. İş sağlığı hizmetleri, personele işyerindeki herhangi bir tehlikeli maruziyet için sağlanmalıdır. Özellikle, mesleki sağlık hizmetleri MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI KALİTE YÖNETİM SİSTEMLERİ   287 laboratuvar kaynaklı enfeksiyonları izlemeli ve bunlara müdahale etmeli ve kan örnekleriyle ilgilenen kişilere hepatit B aşısı gibi koruyucu aşılar sağlamalıdır. 3. Sonuç ve Öneriler Son olarak iyi bir kalite yönetim sistemi uygulamayan laboratuvarlarda, tespit edilemeyen birçok hata ve sorunun ortaya çıkacağı garantidir. Bir kalite yönetim sistemi uygulamak, hatasız bir laboratuvarı garanti etmeyebilir, ancak hataları tespit eden ve tekrarlanmasını önleyen yüksek kaliteli bir laboratuvar sağlar. Kaynakça 1. Carey RB, Bhattacharyya S, Kehl SC, et al. Practical guidance for clinical microbiology laboratories: implementing a quality management system in the medical microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev. 2018;31(3):e00062-17. doi:10.1128/CMR.00062-17. 2. World Health Organization. Laboratory quality management system: handbook, Version 1.1. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 2011. Accessed August 15, 2025. https://iris.who.int/handle/10665/44665 3. International Organization for Standardization. Medical laboratories— requirements for safety. ISO 15190. Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization; 2003. 4. US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th ed. Washington, DC: Government Printing Office; 2007. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Establishing molecular testing in clinical laboratory environments; approved guideline. CLSI MM19-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011. 6. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for biosafety laboratory competency. MMWR Suppl. 2011;60:1-23. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; approved guideline, 4th ed. CLSI M29-A4. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014. 8. Clark RB, Lewinski MA, Loeffelholtz MJ, Tibbetts RJ. Cumitech 31A: verification and validation of procedures in the clinical microbiology laboratory. Coordinating ed, Sharp SE. Washington, DC: ASM Press; 2009. 288   MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ: KLİNİK REHBER 9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Laboratory quality control based on risk management; approved guideline, 1st ed. CLSI EP23-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011. 10. Animal and Plant Health Inspection Services, Centers for Disease Control and Prevention. Select agents regulations. Federal Select Agent Program. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention; 2017. Accessed August 15, 2025. http://www.selectagents.gov/Regulations.html 11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Quality management system: continual improvement; approved guideline, 3rd ed. CLSI QMS06-A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011. 12. Zarbo RJ, Copeland JR, Varney RC. Deviation management: key management subsystem driver of knowledge-based continuous improvement in the Henry Ford production system. Am J Clin Pathol. 2017;148(4):354-367. doi:10.1093/ajcp/aqx084