Determinação das propriedades viscoelásticas de biomateriais por espectroscopia de Brillouin
Abstract
O conhecimento das propriedades viscoelásticas dos biomateriais tem sido, nas últimas décadas, um dos grandes focos do estudo científico. Como se sabe, o desenvolvimento tecnológico tem vindo a fornecer ferramentas inovadoras para o estudo destas propriedades. Com a evolução do conhecimento de todas as questões relacionadas com a ótica, a tecnologia e a ciência, foram criadas as condições necessárias para o aparecimento da espectroscopia de Brillouin. Este tipo de espectroscopia consiste, de forma resumida, no estudo da difusão inelástica da luz numa amostra, utilizando normalmente luz emitida por um laser a 532 nm. É possível usar os dados recebidos pela tecnologia em questão para a obtenção das propriedades viscoelásticas da amostra pretendida. Durante a presente dissertação, a geometria utilizada será sempre a de backscattering, que permite a obtenção de resultados mais fidedignos e precisos. A espectroscopia de Brillouin é uma técnica não invasiva, label-free e não destrutiva, oferecendo um conjunto de características distintas do restante leque de opções da área da ótica. Os picos de Rayleigh, de Stokes e de Anti-Stokes obtidos aquando da realização de cada medição serão analisados através de software, e a partir daqui serão obtidos os valores de storage e loss modulus. O objetivo da presente dissertação consiste no estudo das propriedades viscoelásticas de biomateriais, mais especificamente do agar, através da espectroscopia de Brillouin, pretendendo-se criar um banco de dados conciso e viável com as propriedades estudadas e adquiridas. Para ser possível obter conclusões sobre o tópico em questão, é necessário conhecer os valores da densidade e do índice de refração das amostras estudadas. Desta forma, serão desenvolvidos métodos e modelos para obtermos estes valores. O trabalho desenvolvido na dissertação estabelece alicerces pertinentes no estudo das propriedades viscoelásticas das amostras de agar, mas também no desenvolvimento do estudo da espectroscopia de Brillouin no seu geral. Assim sendo, é possível comprovar que para o estudo de bactérias e de vírus, devem-se usar aditivos distintos, sendo eles a triptona para o primeiro e o extrato de levedura ou malte para o segundo. Se o objetivo fosse então o crescimento celular das culturas dever-se-ia usar o extrato de malte. Caso contrário os aditivos ideais seriam a triptona ou o extrato de levedura.
Full text
Julho 2023 António da Cruz Castelo Carneiro da Rocha Determinação das propriedades viscoelásticas de biomateriais por espectroscopia de Brillouin Determinação das propriedades viscoelásticas de biomateriais por espectroscopia de Brillouin Julho 2023 António da Cruz Castelo Carneiro da Rocha
i António da Cruz Castelo Carneiro da Rocha Determinação das propriedades viscoelásticas de biomateriais por espectroscopia de Brillouin Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Eletrónica Médica Trabalho efetuado sob a orientação de: Doutor José Artur Oliveira Rodrigues Julho 2023
ii Direitos de Autor e Condições de Utilização do Trabalho por Terceiros Nome: António da Cruz Castelo Carneiro da Rocha Título da Dissertação: Determinação das propriedades viscoelásticas de biomateriais por espectroscopia de Brillouin Mentor: José Artur Oliveira Rodrigues Ano de Conclusão: 2023 Designação do Mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Ramo do Mestrado: Eletrónica Médica Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Universidade do Minho, 26/07/2023
iii Agradecimentos Em reconhecimento às pessoas que tornaram possível a realização da presente dissertação deixo a seguinte menção. Primeiramente, quero agradecer ao meu orientador, Doutor José Artur Rodrigues, pela orientação prestada, por todo o apoio, pela paciência, por todos os bons conselhos e recomendações e pela total disponibilidade. Sob a tua orientação fui capaz de seguir em frente, com certeza no caminho escolhido. Agradeço também a todos os membros do laboratório CMEMS-UMinho, em especial ao professor José Higino Correia por todo o apoio, pela disponibilidade e por todos os conselhos e recomendações. Aproveito também para agradecer à Pastoral Universitária de Braga, a minha segunda casa, e em especial à Susana e ao Pe. Eduardo Duque pela amizade, competências desenvolvidas e pelo facto de me terem proporcionado vivências únicas onde aprendi muito. Agradecer as comunidades de Txada Loura em Cabo Verde e Cumura na Guiné-Bissau por me proporcionarem uma nova forma de viver e olhar para a vida. A todos os meus amigos, obrigado pelos momentos de boa disposição e camaradagem ao longo destes anos, que foram fundamentais no meu percurso. À minha namorada, Maria, pela compreensão, pelo incentivo, pela paciência nos momentos mais complicados e por todas as palavras amigas. O teu apoio incondicional foi determinante neste processo. A toda a minha família, obrigado pela presença e por todo o apoio. Aos meus avós por todas as palavras sábias e momentos de aprendizagem. À minha irmã Leonor agradeço toda a cumplicidade, amizade e por me motivar todos os dias a ser melhor. Em especial, aos meus queridos pais agradeço pelo amor incondicional, por todas as oportunidades proporcionadas e por serem verdadeiros pilares na minha vida. Esta menção não chega perto de fazer justiça à vossa influência neste percurso.
iv Declaração de Integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. Universidade do Minho, 26/07/2023 Assinatura:
v Resumo O conhecimento das propriedades viscoelásticas dos biomateriais tem sido, nas últimas décadas, um dos grandes focos do estudo científico. Como se sabe, o desenvolvimento tecnológico tem vindo a fornecer ferramentas inovadoras para o estudo destas propriedades. Com a evolução do conhecimento de todas as questões relacionadas com a ótica, a tecnologia e a ciência, foram criadas as condições necessárias para o aparecimento da espectroscopia de Brillouin. Este tipo de espectroscopia consiste, de forma resumida, no estudo da difusão inelástica da luz numa amostra, utilizando normalmente luz emitida por um laser a 532 nm. É possível usar os dados recebidos pela tecnologia em questão para a obtenção das propriedades viscoelásticas da amostra pretendida. Durante a presente dissertação, a geometria utilizada será sempre a de backscattering , que permite a obtenção de resultados mais fidedignos e precisos. A espectroscopia de Brillouin é uma técnica não invasiva, label-free e não destrutiva, oferecendo um conjunto de características distintas do restante leque de opções da área da ótica. Os picos de Rayleigh, de Stokes e de Anti-Stokes obtidos aquando da realização de cada medição serão analisados através de software , e a partir daqui serão obtidos os valores de storage e loss modulus . O objetivo da presente dissertação consiste no estudo das propriedades viscoelásticas de biomateriais, mais especificamente do agar, através da espectroscopia de Brillouin, pretendendo-se criar um banco de dados conciso e viável com as propriedades estudadas e adquiridas. Para ser possível obter conclusões sobre o tópico em questão, é necessário conhecer os valores da densidade e do índice de refração das amostras estudadas. Desta forma, serão desenvolvidos métodos e modelos para obtermos estes valores. O trabalho desenvolvido na dissertação estabelece alicerces pertinentes no estudo das propriedades viscoelásticas das amostras de agar, mas também no desenvolvimento do estudo da espectroscopia de Brillouin no seu geral. Assim sendo, é possível comprovar que para o estudo de bactérias e de vírus, devem-se usar aditivos distintos, sendo eles a triptona para o primeiro e o extrato de levedura ou malte para o segundo. Se o objetivo fosse então o crescimento celular das culturas dever-se-ia usar o extrato de malte. Caso contrário os aditivos ideais seriam a triptona ou o extrato de levedura. Palavras-chave: Espectroscopia de Brillouin, propriedades viscoelásticas, biomateriais, backscattering .
vi Abstract In recent decades, knowledge of biomaterials' viscoelastic properties has been one of the major focuses of scientific study. As known, technological development has been providing innovative tools for the study of these properties. With the evolution of knowledge of all issues related to optics, technology, and science, the necessary conditions were created for the emergence of Brillouin spectroscopy. This type of spectroscopy consists, in summary, in the study of the inelastic dispersion of light in a sample, normally using light emitted by a laser at 532 nm. It is possible to use the data received by the technology in question to obtain the viscoelastic properties of the intended sample. During the present dissertation, the geometry used will always be backscattering, which allows the obtaining of more reliable and precise results. Brillouin spectroscopy is a non-invasive, label-free, and non-destructive technique, offering a set of characteristics that are different from the rest of the range of options in the field of optics. The Rayleigh, Stokes, and Anti-Stokes peaks obtained during each measurement will be analyzed using software, and from here the storage and loss modulus values will be obtained. This dissertation aims to study the determination of the viscoelastic properties of biomaterials, more specifically agar, through Brillouin spectroscopy, intending to create a concise and viable database with the studied and acquired properties. To be able to reach conclusions about the topic in question, it is necessary to know the density and refractive index values of the studied samples. In this way, methods and models will be developed to obtain these values. The work developed in the dissertation establishes relevant foundations in the study of the viscoelastic properties of agar, but also in the development of the study of Brillouin spectroscopy in general. Therefore, it is possible to prove that for the study of bacteria and viruses, different additives must be used, namely tryptone for the first and yeast extract or malt for the second. If the objective was cell growth in cultures, malt extract should be used. Otherwise, the ideal additives would be tryptone or yeast extract. Keywords: Brillouin spectroscopy, viscoelastic properties, biomaterials, backscattering.
vii Índice 1. Introdução ................................................................................................................ 1 1.1 Biomateriais e a sua importância na área biomédica .......................................................... 1 1.2 Estudo das propriedades viscoelásticas .............................................................................. 3 1.3 Métodos de determinação da viscoelasticidade ................................................................... 8 1.4 Motivação e objetivos ......................................................................................................... 9 1.5 Organização da dissertação .............................................................................................. 10 2. Estado da arte ......................................................................................................... 11 2.1 Conceitos básicos da espectroscopia ................................................................................ 11 2.2 Espectroscopia de Brillouin .............................................................................................. 15 2.3 Difusão em diferentes materiais e modelo viscoelástico .................................................... 21 2.3.1 Difusão de Brillouin em materiais viscoelásticos ........................................................ 21 2.3.2 Difusão de Brillouin em materiais heterogéneos ........................................................ 27 2.4 Tipos de espectrómetros de Brillouin ................................................................................ 29 2.4.1 Espectroscopia de Brillouin usando interferómetros Fabry-Pérot................................. 29 2.4.2 Espectroscopia de Brillouin usando Virtually Imaged Phased Array ............................. 34 2.5 Evolução da espectroscopia: sistema multimodal Brillouin-Raman ..................................... 37 3. Materiais e Métodos ............................................................................................... 40 3.1 Preparação das amostras ................................................................................................. 40 3.2 Setup experimental .......................................................................................................... 42 3.2.1 Espectrómetro de Brillouin ........................................................................................ 43 3.1.2 Refratómetro ............................................................................................................ 46 3.1.3 Medições da densidade ............................................................................................ 49 4. Resultados obtidos .................................................................................................. 51 4.1 Composição das amostras ............................................................................................... 51 4.2 Difusão de Brillouin .......................................................................................................... 52
xiv Lista de equações Equação (1.1) – Tensão de cisalhamento ........................................................................................... 4 Equação (1.2) – Tensão de cisalhamento tendo em conta a viscosidade ............................................. 4 Equação (1.3) – Viscosidade dinámica ................................................................................................ 4 Equação (1.4) – Viscosidade cinemática ............................................................................................. 4 Equação (1.5) – Viscosidade longitudinal ............................................................................................ 5 Equação (1.6) – Módulo de Young ...................................................................................................... 6 Equação (1.7) – Relação entre o módulo longitudinal, o módulo de Young e o coeficiente de Poisson .. 6 Equação (1.8) – Módulo de cisalhamento ........................................................................................... 6 Equação (1.9) – Relação entre o módulo de Young, cisalhamento e volumétrico .................................. 6 Equação (1.10) -Módulo longitudinal usando módulo de Young e volumétrico ...................................... 6 Equação (2.1) – Energia do fotão ……………….…………….…….…………………………………………………...12 Equação (2.2) – Relação entre o comprimento de onda e a velocidade .............................................. 12 Equação (2.3) – Lei de Senll-Descartes ............................................................................................. 14 Equação (2.4) – Frequência final do fotão que sofre scattering .......................................................... 17 Equação (2.5) -Deslocamento de frequência dos picos de Brillouin usando a velocidade e o momento da onda ................................................................................................................................................ 19 Equação (2.6) – Momento trocado durante a difusão da luz .............................................................. 19 Equação (2.7) – Vetor de onda da luz incidente ................................................................................ 19 Equação (2.8) – Deslocamento de frequência para picos de Brillouin usando velocidade, comprimento de onda e índice de refração ............................................................................................................. 20 Equação (2.9) – Módulo elástico longitudinal .................................................................................... 20 Equação (2.10) – Complex longitudinal modulus ............................................................................... 21 Equação (2.11) – Função Damped Harmonic Oscilator ..................................................................... 22 Equação (2.12) – Storage modulus ................................................................................................... 22 Equação (2.13) – Loss modulus ....................................................................................................... 22 Equação (2.14) – Storage modulus em condições de relaxamento .................................................... 24 Equação (2.15) – Velocidade adiabática do som ............................................................................... 24 Equação (2.16) – Loss modulus dado em termos da viscosidade cinemática longitudinal .................. 24 Equação (2.17) – Viscosidade cinemática longitudinal ....................................................................... 24
xv Equação (2.18) – Longitudinal modulus até ao valor tipo sólido ......................................................... 24 Equação (2.19) – Tempo de relaxamento e período da onda acústica ............................................... 25 Equação (2.20) – Menor escala espacial da difusão num material heterogéneo ............................... 288 Equação (2.21) – Free Spectral Range ……………………………………………………………..……………………30 Equação (3.1) – Função Damped Harmonic Oscilator utilizada no Ghos ……………………………………….45 Equação (3.2) – Cálculo do índice de refração da amostra de interesse ............................................. 49 Equação (3.3) – Cálculo da constante necessária para obtenção do índice de refração ...................... 49 Equação (3.4) – Modelo de mistura ideal bifásico ............................................................................. 49 Equação (3.5) – Densidade individual de cada componente .............................................................. 50 Equação (4.1) – Cálculo do peso total de gel de agar produzido..…………………….………………………… 52 Equação (4.2) – Equação rearranjada do storage modulus ……………………………………………………..…..59 Equação (4.3) – Equação rearranjada do loss modulus . …………………………………………………………….59
1 Capítulo 1 1. Introdução No presente capítulo serão abordados conceitos básicos sobre os biomateriais, fundamentais para o desenvolvimento do trabalho, assim como os diferentes tipos existentes. É ainda realizada uma revisão sobre as propriedades viscoelásticas (viscosidade e elasticidade). De seguida, serão abordados alguns métodos de determinação da viscoelasticidade. Finalmente, serão apresentadas a motivação e os objetivos bem como a organização da dissertação. 1.1 Biomateriais e a sua importância na área biomédica Ao longo dos últimos anos os biomateriais têm conquistado muito interesse como uma categoria importante de materiais devido à sua alargada aplicação na medicina, e às suas inúmeras qualidades, como por exemplo, o aumento significativo da longevidade e a melhoria da qualidade de vida. O estudo dos biomateriais tem contribuído significativamente para o rápido crescimento das áreas cirúrgicas e da tecnologia médica. O termo biomaterial foi primeiramente definido em 1987 como “um material não viável usado num dispositivo médico, destinado a interagir com sistemas biológicos” [1]. Atualmente, biomaterial é sinónimo de material biomédico, e tem como definição ser “um material projetado para assumir uma função que pode direcionar, através de diversas interações com sistemas vivos, o curso de qualquer diagnóstico ou procedimento terapêutico” [2]. Idealmente, os biomateriais devem possuir algumas características (Figura 1.1). Por consequência, o grau de qualidade das características significará a capacidade que o biomaterial teria para a aplicação biomédica. É de mencionar que as características ideais influenciarão na mimetização do ambiente a que o biomaterial estará sujeito.
2 Figura 1.1: Diagrama das características ideais de um biomaterial (adaptado de [3]). Além destas características, existem ainda outras que podem ser tidas em conta, como por exemplo, a força, a rigidez e o custo. Os conhecimentos de todas estas propriedades são importantes para a determinação da possível utilização para as diferentes aplicações médicas. Para melhor perceber as aplicações dos biomateriais pelas suas características, estes são classificados em 4 grandes categorias: poliméricos, cerâmicos, metálicos e compósitos [1]. Os primeiros são constituídos por polímeros, que são macromoléculas resultantes da repetição de muitas unidades de moléculas pequenas, conhecidas como monómeros. As propriedades que tornam este biomaterial único são a sua flexibilidade, resistência a ataques bioquímicos, excelente biocompatibilidade, leves, amplamente disponíveis, variedade nas propriedades físicas e mecânicas e facilidade de serem fabricadas com uma forma desejada. Os cerâmicos têm como principais características a dureza, a força, a rigidez e a resistência à corrosão. O facto de serem isoladores térmicos constitui também uma grande vantagem. Os biomateriais metálicos, frequentemente usados como ligas metálicas têm como grande vantagem a sua força e resistência à corrosão (durabilidade), além das excelentes propriedades elétricas, condutividade térmica, biocompatibilidade e preço. Em contrapartida estes materiais podem em alguns casos causar reações alérgicas a alguns indivíduos e são suscetíveis à corrosão em certos ambientes. Por fim, os biomateriais compósitos são uma combinação de dois ou mais materiais, de forma a combinar as melhores propriedades dos mesmos. São amplamente usados em engenharia de tecidos, pois têm a capacidade de imitarem estruturas de tecidos vivos e possuírem uma excelente biocompatibilidade [4].
3 No que diz respeito às origens dos biomateriais estes podem ser naturais, obtidos através de plantas, animais ou mesmo de forma geológica, ou sintéticos quando são produzidos laboratorialmente [3,5]. Desta forma, os biomateriais são um grupo diversificado de materiais concebidos para interagir com sistemas biológicos. O facto de possuírem propriedades únicas possibilita a facilidade de adaptação a outros sistemas e ambientes. A interferência do biomaterial na saúde humana tornou-se necessária para uma melhor qualidade de vida. Como podemos observar na Figura 1.2, existem diversas aplicações dos biomateriais que são uma ajuda imprescindível na área da biomédica e da saúde. Figura 1.2: Exemplos de aplicações médicas dos biomateriais (adaptado de [6]). 1.2 Estudo das propriedades viscoelásticas A viscoelasticidade é a propriedade dos materiais que exibe tanto características viscosas como elásticas, aquando da sua deformação [7]. O comportamento viscoelástico de um material é caracterizado pela habilidade de se deformar, quando é aplicada uma pressão, e voltar à sua forma original [8]. Este comportamento surge da combinação de duas propriedades distintas, a viscosidade e a elasticidade. Os materiais viscoelásticos têm como característica o facto de serem frequência-dependentes, ou seja, as suas propriedades e comportamento podem alterar com a frequência das forças aplicadas [9]. Além disso, a viscoelasticidade é importante em muitas outras questões de engenharia, como por
4 exemplo, no comportamento do movimento dos fluidos em máquinas, podendo afetar a eficiência e o desempenho das mesmas. A viscosidade foi inicialmente definida por Isaac Newton como uma relação proporcional entre o escoamento do fluído e a força dirigida no próprio [10], ou seja, é uma medida de resistência deste ao fluxo. É uma propriedade importante dos fluídos porque determina como os mesmos interagem com superfícies sólidas. Por consequência, fluídos com uma maior viscosidade são mais espessos e movemse mais devagar, ao contrário daqueles com menor viscosidade. Existem diversos tipos de viscosidade, utilizadas para os mais diferentes aspetos desta propriedade, que serão abordados mais à frente. Inicialmente é necessário conhecer a fórmula da tensão de cisalhamento, dada por: , onde F é a força aplicada em Newton e A a área em metros quadrados. De notar que a tensão de cisalhamento tem como unidade o Pascal (Pa). Para se obter a viscosidade, e sabendo que a equação anterior é igual a: 𝜏=𝜂𝑑𝑢 𝑑𝑦 (1.2) , onde 𝑑𝑢 é a derivada da velocidade e 𝑑𝑦 a derivada da distância percorrida, e que o seu quociente fornece a taxa de deformação de cisalhamento, podemos então concluir que a viscosidade dinâmica, em Pa∙s é dada por: A viscosidade cinemática descreve o comportamento do fluxo da substância sobre a influência da gravidade da Terra, e é dada pelo quociente entre a viscosidade dinâmica e a densidade (ρ) [11]. 𝜈=𝜂𝜌 (1.4) 𝜏=𝐹𝐴 (1.1) 𝜂=𝐹𝑦 𝐴𝑢 (1.3)
5 Existe ainda outro tipo de viscosidade que será muito importante, a viscosidade longitudinal, que mais tarde será relacionada com o loss modulus (M’’) [9]. A viscosidade longitudinal é uma medida da resistência de um fluido para fluir na direção da força de cisalhamento aplicada, estando relacionada com a viscosidade em volume (ηb) e a viscosidade de cisalhamento (ηs). A viscosidade em volume é uma propriedade do fluído que descreve uma resistência à taxa de mudança de volume [12]. Por sua vez, a viscosidade de cisalhamento é a propriedade que descreve a resistência a uma tensão de cisalhamento. Em suma, a viscosidade longitudinal é dada pela equação 1.5 [13]. 𝜂𝐿= 𝜂𝑏+43𝜂𝑠 (1.5) A elasticidade, por sua vez, é uma propriedade do material que gera força de recuperação na aplicação de uma força externa para deformação do material [8], ou seja, refere-se à habilidade dos materiais voltarem à sua forma original após deformação ou, por outras palavras, resistirem a uma força externa [14]. Na teoria, quanto mais elásticos os materiais forem, maior e menos permanente será a sua deformação. Para melhor entender esta propriedade, definem-se três conceitos principais: módulo de Young (E), módulo de cisalhamento (G) e coeficiente de Poisson (ν). Este último é uma medida da contração de um material na direção perpendicular à tensão aplicada, ou seja, é o quociente entre a deformação lateral e a deformação longitudinal, sendo dependente da frequência [15]. O módulo de Young é uma medida de rigidez de um material, sendo definida como a razão entre a tensão aplicada (força de tração, σ) a um material e a sua deformação resultante (ε), sendo dada pela seguinte equação: 𝐸=𝜎𝜀 (1.6) O módulo de Young pode ser relacionado com o módulo longitudinal (M) através do coeficiente de Poisson, da seguinte forma [13]: 𝑀= 𝐸(1−υ) (1+υ)(1−2υ) (1.7)
6 A partir desta fórmula, pode-se ficar com a impressão, de forma errada, que M e E possuem a mesma ordem de grandeza. Sabendo que o valor do coeficiente de Poisson para os biomateriais se encontra próximo dos 0.5 [13,16], é possível perceber o porquê destes valores não possuírem a mesma ordem de grandeza. Finalmente, o módulo de cisalhamento (G) é uma medida da resistência de um material à deformação por cisalhamento [8]. É definida como a razão entre a tensão de cisalhamento aplicada (γ) e a deformação de cisalhamento resultante. 𝐺=γ𝜀 (1.8) Além disso, é possível relacionar ambos os módulos através da equação seguinte: 𝐸= 9𝐾𝐺 3𝐾+𝐺 (1.9) , onde K é o módulo volumétrico. Os valores do módulo de cisalhamento, e, por consequência do módulo de Young serão zero para baixas frequências, ou seja, na fase líquida. Este valor chega à ordem dos kPa-MPa quando se aproximam de uma transição sol-gel. Em contrapartida, o módulo longitudinal detetado pela espectroscopia de Brillouin (BS) está também relacionado com a elasticidade através da seguinte equação: 𝑀=𝐾+43𝐺 (1.10) O módulo volumétrico é uma medida de compressibilidade de um material e é definida como a razão da tensão aplicada radialmente pela mudança relativa do volume. Para materiais altamente incompressíveis, como líquidos e sólidos, o valor de K, e, por consequência, de M serão relativamente elevados e muito semelhantes. Por sua vez, o módulo de cisalhamento, já definido anteriormente, por norma, possui um valor muito menor, a não ser que a tensão seja aplicada rápido o suficiente para evitar que o sistema relaxe [13]. Nesse caso, ambos os valores de G e K estarão na ordem dos GPa. Pelo facto de incluir o valor do módulo volumétrico, o valor de M estará sempre na ordem dos GPa, mesmo para materiais líquidos [9].
7 Tanto as deformações volumétricas como deformações por módulo longitudinal são associadas a deformações que alteram o volume da amostra. Por outro lado, os outros dois tipos de deformação presentes na seguinte figura referem-se a deformações que conservam o volume da amostra. Na Figura 1.3 serão apresentados os principais tipos de deformações que podem ocorrer nos materiais. Figura 1.3: Principais deformações ocorridas nos materiais (adaptado de [13]). Além disso, é também possível concluir a partir da figura anterior que as deformações, que alteram o volume da amostra, assumem valores na ordem dos GPa para qualquer frequência. No que diz respeito às deformações a volume constante verifica-se que a baixas frequências estas possuem valores na ordem dos kPa, como visto anteriormente. Para frequências maiores do que aquelas que envolvem transições viscoelásticas, a matéria começa a ter um comportamento muito semelhante a um sólido, levando a que os valores destas deformações atinjam a ordem dos GPa. Como iremos ver mais à frente, a partir de um conceito chamado módulo longitudinal complexo, a parte real fornece informações sobre as propriedades elásticas dos materiais, enquanto a parte imaginária do número complexo fornece informações sobre a viscosidade longitudinal [13]. No que toca a toda a questão da BS, estes valores serão facilmente obtidos visto que o primeiro é observado através da posição do pico de Brillouin e o segundo será observado através da largura do mesmo.
8 1.3 Métodos de determinação da viscoelasticidade O estudo da viscoelasticidade é crucial nos mais diversos campos, incluindo as áreas da física, biologia, engenharia de materiais, medicina, entre outros. Determinar as propriedades viscoelásticas de um material é essencial para prever o seu comportamento sob diferentes condições de carga e conceber produtos que suportem o nível de tensão desejado. De seguida, serão apresentados alguns métodos para a determinação das propriedades viscoelásticas. A primeira técnica abordada é a citometria de torção magnética, que consiste na conexão de uma esfera magnética a uma superfície celular e na consequente torção utilizando um campo magnético rotativo. Isto permite medir o torque resultante e o ângulo de torção, fornecendo informações sobre as propriedades mecânicas da superfície com que está em contato, nomeadamente das propriedades viscoelásticas [17]. Esta técnica tem sido usada para estudar o DNA e RNA, entre outros, fornecendo também informações sobre os processos biológicos. A técnica de microscopia de deformação consiste na obtenção de imagens da superfície de uma amostra antes e depois da aplicação de uma carga e, em seguida, utilizar técnicas de processamento de imagens para determinar a deslocação e a deformação da amostra [18]. Isto permite o cálculo das propriedades mecânicas, como por exemplo, o módulo de Young ou o coeficiente de Poisson, necessários para a obtenção das propriedades viscoelásticas. A micro-reologia, técnica usada amplamente na obtenção das propriedades viscoelásticas, envolve o acompanhamento do movimento Browniano, ou seja, o movimento aleatório das partículas suspensas num fluido resultante da sua colisão com átomos da própria amostra, e a análise do seu movimento para extrair informações sobre as propriedades em questão [19]. Esta técnica permite a conceção e otimização de novos materiais e dispositivos para as mais diversas aplicações. Outra técnica que possui uma elevada importância no estudo destas propriedades é a microscopia de força atómica (AFM), sendo utilizada para obter imagens e manipular superfícies à nanoescala. A técnica envolve a passagem de uma ponta afiada sobre a superfície de uma amostra, enquanto se mede a força entre a ponta e a amostra [20]. Ao mover a ponta de forma controlada é possível gerar imagens de alta resolução da superfície e obter informações sobre as suas propriedades mecânicas. Por fim, temos a BS, sendo esta a técnica que será utilizada e estudada ao detalhe ao longo da presente dissertação. De uma forma muito sumarizada, a BS baseia-se na interação entre a luz e amostra, levando à difusão dos fotões com uma mudança de frequência proporcional à frequência da onda acústica. Com as mudanças de frequência da luz dispersa, é possível obter as propriedades viscoelásticas da amostra. Ao contrário de todas as técnicas abordadas anteriormente, a BS é a única
15 As lentes são essencialmente elementos de controlo de luz, feitas de um material dielétrico transparente possuindo faces com uma curvatura esférica e que podem ser utilizadas das mais diversas formas possíveis. Uma das vantagens das lentes em relação aos espelhos é que estas são transparentes, o que permite que a luz seja transmitida diretamente ao longo do eixo até ao detetor [35]. Como as superfícies são curvas, os raios de luz paralelos ao eixo ótico irão refratar-se de acordo com a lei de SnellDescartes. Lentes convexas ou positivas têm a capacidade de fazer os feixes de luz convergir para o designado ponto focal. Por sua vez, as lentes côncavas ou negativas irão divergir do ponto focal. Todas as questões até aqui abordadas serão de enorme relevo para a realização da dissertação. 2.2 Espectroscopia de Brillouin A primeira previsão teórica do efeito pelo qual um feixe de luz coerente difundia ondas acústicas termicamente induzidas, sofrendo um shift de frequência igual ao da frequência acústica da onda, ocorreu em 1922, e foi relatado por um físico francês de nome Léon Brillouin. Passados quatro anos, Mandelstam deparou-se com uma descoberta semelhante, e, foi só em 1930 que a primeira experiência foi realizada por Gross [9]. Na Figura 2.5 podemos observar um pouco do que foi a história da BS, no último século. Na última década a BS tem tido uma crescente importância, particularmente nas aplicações biomédicas, devido a dois fatores. Primeiramente, a tecnologia necessária para realizar a espectroscopia tem evoluído de forma exponencial, e, em segundo lugar, devido ao crescimento da área da mecanobiologia [7].
16 Figura 2.5: Linha temporal do desenvolvimento instrumental e aplicação do Brillouin (adaptado de [36]). As propriedades mecânicas dos tecidos vivos são relevantes para o estudo das funções e desenvolvimento celular, e para a saúde em geral. Ao ser uma tecnologia não invasiva, label-free e não destrutiva, a BS oferece muitas vantagens em relação a outros métodos existentes de caracterização das propriedades dos materiais [37]. A uma escala celular, a elasticidade e a viscosidade regulam a diferenciação celular e a migração, além de determinarem como as células irão responder a fatores físicos e ao ambiente. Ao nível dos tecidos, estas propriedades são importantes na morfogénese e na organização celular [13]. O conceito do Brillouin pode ser usado em diferentes técnicas para além da espectroscopia, como por exemplo, imagem Brillouin, microespectroscopia, microscopia, endoscopia, entre outras [7]. A BS proporciona a obtenção de propriedades mecânicas únicas tanto a nível celular como dos tecidos, que não seria possível de obter utilizando outras técnicas como a espectroscopia Raman ou a OCT. Além disso, estudos mais recentes apontam para uma conjugação desta tecnologia com as mencionadas anteriormente que permitirão obter um maior conjunto de propriedades numa só aquisição. Os dois principais fenómenos óticos que ocorrem quando um feixe de luz passa pela matéria são a absorção e a difusão. Os átomos e as moléculas absorvem a energia proveniente da luz, onde parte é dissipada na forma de calor, e a restante reemitida. À medida que aumenta a distância de propagação,
17 a intensidade da luz vai decaindo exponencialmente. Assim, pode-se concluir que o fenómeno da difusão depende principalmente do tamanho da partícula em relação ao comprimento de onda do feixe incidente [7]. A BS refere-se à deteção e análise de um ponto único da difusão da luz de Brillouin recolhido de uma amostra de interesse, permitindo o estudo das propriedades mecânicas de um material usando uma difusão inelástica da luz incidente [9]. Baseia-se na interação entre um fotão e um fonão acústico [38]. A difusão pode ser de dois tipos, elástico e inelástico. O elástico (Rayleigh) ocorre quando não há alteração da energia do fotão incidente, o que leva a que o comprimento de onda da luz dispersa se mantenha, como podemos observar na Figura 2.6. No espectro da frequência o pico de Rayleigh é o pico central (frequência igual à da luz incidente) e aquele que possui maior intensidade. Uma pequena fração da luz incidente, na ordem dos pico (10-12), pode interagir com as ondas acústicas e trocar energia e momento no processo. As ondas acústicas atuam de forma semelhante a uma grade que difrata a luz (grating diffraction) e viajam de forma paralela, igualmente espaçada e a velocidade constante, resultantes das flutuações de densidade tempo-dependentes [9]. Desta forma, é mais fácil decompor a luz em muitos comprimentos de onda de uma só vez. Porém, esta grating diffraction possui algumas desvantagens, como por exemplo, a eficiência da difração ser dependente do estado de polarização ou poder ocorrer uma difusão angular insuficiente [40]. Os fonões movem-se à velocidade do som, e tal interação resulta numa mudança de frequência da luz que sofreu difusão, devido ao efeito de Doppler, precisamente pela frequência do fotão (Ω) [41]. Consequentemente, se o fotão incidente possuir uma frequência de 𝜔𝑖, a frequência do fotão que sofre difusão é dada pela equação: 𝜔𝑠=𝜔𝑖±Ω (2.4) A energia pode ser transferida do fonão para o fotão (+), ou vice-versa (-) [7]. De toda esta sequência de acontecimentos irão surgir dois picos adicionais no espectro, denominados de picos de Stokes e Anti-Stokes de Brillouin [9]. Quando a difusão é do tipo inelástico, existe alteração de energia das partículas incidentes durante a interação, ou seja, o comprimento de onda irá alterar-se [13,42].
18 Figura 2.6: Diagrama de energia simplificado para os picos de Stokes , Anti-Stokes e Rayleigh (adaptado de [39]). No que diz respeito às interações inelásticas, existem dois tipos importantes, Brillouin e Raman. O primeiro ocorre a partir da interação da luz com os fonões acústicos, resultando em shifts de frequência, i.e. deslocamentos de frequência dos picos de Brillouin, na ordem dos 0.1 a 100 GHz, que estão relacionados com propriedades viscoelásticas dos materiais [43,44]. Por outro lado, a difusão de Raman acontece a partir da interação da luz com os movimentos vibracionais ou rotacionais das moléculas, resultando em deslocamentos de frequências muito elevadas, normalmente maiores que 1THz. Utilizando este último podemos obter as propriedades químicas do material. De notar, que os picos de Raman se encontram para além dos picos de Brillouin. Num caso ideal, iremos obter um espectro semelhante ao da Figura 2.7, com um pico central mais intenso, devido à difusão elástica, e dois picos igualmente espaçados e com aproximadamente a mesma intensidade, sem existência de ruído. Figura 2.7: Exemplo de uma difusão de Brillouin para uma amostra biológica (adaptado de [13]). Possuindo um deslocamento de frequência em relação ao pico elástico de:
19 𝜔𝐵=±𝑉.𝑞 (2.5) , onde V é a velocidade da onda acústica no material e q o momento trocado durante a difusão [45]. O valor de q é dado por: 𝑞=2.𝑛.𝑘𝑖.𝑠𝑖𝑛𝜃2 (2.6) , sendo n o índice de refração do material, ɵ o ângulo da difusão, e ki o vetor de onda da luz incidente. É ainda possível, definir matematicamente este valor pela equação: 𝑘𝑖=2𝜋 𝜆𝑖 (2.7) , onde λi é o comprimento de onda da luz incidente. Como podemos observar na Figura 2.8 a radiação recebida tem um vetor de onda k e frequência 𝜔. A onda gerada a partir das flutuações termodinâmicas, é mostrada pelas linhas paralelas e tem um vetor de onda q e uma frequência Ω. A radiação recebida é dispersa pela onda e passa a ter um novo vetor de onda k’ e uma nova frequência 𝜔′ [46,47]. Figura 2.8: Exemplo de alteração do vetor de onda q [46]. Tal como é recorrente durante a BS teremos uma geometria em backscattering , ou seja, um ɵ de 180º. As geometrias de backscattering são frequentemente usadas para evitar a ampliação dos espectros complexos, e permitem a utilização de uma elevada abertura numérica (NA) [48]. Para a utilização deste tipo de geometria deve-se ter sempre em atenção o facto do momento trocado (q) ser dependente do
20 ângulo [9]. Desta forma, para a geometria em questão o momento irá perder a última parcela da multiplicação uma vez que o seno de 90º é 1. Ao combinar o conjunto de equações estudadas até aqui, obtemos, a equação final que dará o deslocamento de frequência para os picos de Brillouin : 𝜔𝐵=±4.𝜋.𝑛 𝜆𝑖.𝑉 (2.8) O módulo elástico longitudinal (M), uma das propriedades elásticas dos materiais pode ser obtida através deste deslocamento 𝜔𝐵 [9]: 𝑀=𝜌.𝑉2=𝜌 𝑛2.𝜔𝐵2 4.𝑘𝑖2 (2.9) Posteriormente, serão abordados outros conceitos relacionados com o módulo elástico longitudinal, que terão uma enorme importância para a presente dissertação. O setup típico do sistema de BS é constituído por uma mesa ótica, um laser, um conjunto de componentes óticos (lentes e espelhos) que formam o caminho ótico até a amostra e um espectrómetro. Os parâmetros obtidos mais importantes são a frequência dos picos de Brillouin e o HWHM (Metade da Largura a Metade do Máximo), utilizando como modelo de ajuste o DHO (Oscilador Harmónico Amortecido). Mais à frente, todos estes conceitos e a forma como são obtidos e utilizados serão explicados com maior detalhe. No que respeita ao laser, há um especial cuidado para o facto da largura espectral de emissão dever ser inferior à largura do pico de Brillouin para evitar o alargamento espectral dos mesmos e maximizar a difusão inelástica. O ruído provocado pelo laser e a estabilidade da sua frequência são fatores importantes para obter dados mais precisos [46,49]. É também importante referir que variações ínfimas de temperatura podem reduzir o grau de fiabilidade do laser. Para a generalidade dos biomateriais o laser costuma ter um comprimento de onda de 532 nm. O facto deste comprimento de onda ser relativamente pequeno permite atingir melhores resoluções espaciais. As lentes têm a capacidade de transportar o feixe emitido pelo laser com a menor perda possível. As lentes em questão são convexas com o intuito de fazerem convergir todo o caminho ótico para um ponto focal. Toda a calibração e posicionamento das lentes é de enorme relevo pois, quanto maior a quantidade
21 de luz que chega ao ponto focal, maior o número de contagens que se irá obter, e por consequência melhores e mais rápidos os resultados serão obtidos. Por fim, o espectrómetro é a peça central do sistema, tendo no interferómetro a quase totalidade do seu funcionamento. O espectrómetro possui dois pinholes sendo que um é referente à calibração, e outro que dá acesso direto ao interferómetro. Existem dois tipos de interferómetros mais utilizados, que serão abordados mais à frente. 2.3 Difusão em diferentes materiais e modelo viscoelástico De seguida são apresentadas as diferentes formas de difusão da luz em diferentes materiais. A difusão da luz é o alicerce fundamental para a ocorrência da BS. Serão ainda apresentadas as equações para a formulação do modelo viscoelástico. 2.3.1 Difusão de Brillouin em materiais viscoelásticos A viscoelasticidade é a propriedade dos materiais que exibem características elásticas e viscosas aquando da sua deformação. Essa dupla natureza pode ser descrita pela definição dos módulos elásticos como complexos e dependentes da frequência [7,9]. A análise do espectro de Brillouin pode fornecer, para uma densidade e índice de refração conhecidos, uma caracterização única das propriedades mecânicas do material, porque as propriedades das ondas sonoras (como a sua velocidade ou atenuação) exibem uma dependência intrínseca das propriedades viscoelásticas do material [13]. A equação geral que rege a propagação de ondas acústicas longitudinais num meio viscoelástico, o módulo longitudinal complexo, M* , é dada por: 𝑀∗(𝜔)=𝑀′(𝜔)+𝑖𝑀′′(𝜔) (2.10) , onde M’ é o storage modulus , e M’’ o loss modulus . O primeiro descreve a resposta elástica do material à deformação, e o segundo refere-se à dissipação de energia devido aos efeitos viscosos [7]. A parte real do módulo longitudinal, M’, fornece informação sobre as propriedades elásticas do material (posição do pico), enquanto a parte imaginária, iM’’, está relacionada com a viscosidade longitudinal ηL do meio [13]. O módulo longitudinal complexo avaliado pela difusão de Brillouin mostra uma difusão em M’ associada a um máximo de M’’ (Figura 2.9), nas frequências em que os fonões acústicos longitudinais estão acoplados com graus de liberdade internos, como por exemplo, moléculas [9].
22 Para flutuações de densidade que ocorrem a frequências inferiores à taxa de relaxamento estrutural, o valor de M’ é inferior, porque as moléculas não respondem elasticamente, mas existe a possibilidade de se difundirem parcialmente sob compressão (regime viscoso). Em contrapartida, para as flutuações de densidade que ocorrem em frequências superiores à taxa de relaxamento, as moléculas não têm tempo para se difundirem e responderem elasticamente à perturbação, provocando um aumento do módulo elástico (regime elástico). Em materiais viscoelásticos, a análise dos espectros de Brillouin pode facilmente dar acesso a M* à frequência única dos picos de Brillouin [9]. De acordo com este modelo, os picos de Brillouin podem ser reproduzidos por uma função DHO, a expressão teoricamente derivada da lineshape de Brillouin de materiais viscoelásticos transparentes adquiridos a um único q [44,50], 𝐼(𝜔)=𝐼0 𝜋.Γ𝐵.𝜔𝐵2 (𝜔2−𝜔𝐵2)2+(Γ𝐵.𝜔)2 (2.11) convolvida com a função instrumental. O deslocamento da frequência 𝜔𝐵 e a largura do pico Γ𝐵 derivadas da análise de ajuste dos picos de Brillouin proporcionam a obtenção do storage modulus (M’) e do loss modulus (M’’) [9]: 𝑀′(𝜔𝐵)=𝜌 𝑞2.𝜔𝐵2 (2.12) 𝑀′′(𝜔𝐵)=𝜌 𝑞2.𝜔𝐵.Γ𝐵 (2.13) De notar que estas duas equações apenas são válidas para uma geometria de backscattering [38]. As medições da BS permitem descrever o módulo longitudinal complexo de um material para uma densidade (ρ) conhecida [46]. O deslocamento da frequência de Brillouin 𝜔𝐵 e a largura do pico Γ𝐵 proporcionam a obtenção do storage e do loss modulus no pico de frequência 𝜔=𝜔𝐵. Além disso, e igualmente importante, 𝜔𝐵 e Γ𝐵 não são parâmetros independentes, mas dependem do comprimento de onda do laser e da temperatura ambiente [7]. Em particular, ao realizar o ajuste do pico de Brillouin pela função DHO (equação 2.11), derivada da teoria hidrodinâmica de flutuações de densidade, obterse-á o valor correto de 𝜔𝐵 para estimar M’. Ter acesso a uma vasta gama de frequências é especialmente
23 útil em matéria biológica, onde há uma série de processos de relaxamento que podem afetar a dependência da frequência de M* [9]. De seguida, serão apresentados os três casos que são tipicamente encontrados em experiências de difusão de Brillouin, que são relevantes para amostras biomédicas, sendo eles, o comportamento do tipo líquido, do tipo sólido, e gel. Na Figura 2.9 é apresentado um gráfico da dependência da frequência em relação ao módulo longitudinal para os três casos. Figura 2.9: Curvas de difusão para amostras com diferentes taxas de relaxamento estrutural. A cinzento está a zona de difusão de Brillouin. O gráfico a) é uma amostra semelhante a um líquido, b) semelhante a um sólido e c) um gel (adaptado de [9,38]). O primeiro caso representa uma amostra altamente hidratada, onde o relaxamento estrutural responsável pela transição do comportamento do tipo líquido para o tipo sólido, está localizada a frequências maiores do que a frequência do pico de Brillouin. Neste caso, o espectro de Brillouin irá conter apenas um pico estreito (com os componentes Stokes e Anti-Stokes), indicando que a amostra é homogénea à escala do comprimento de onda do fotão [38]. No limite de diluição o módulo longitudinal nas frequências de Brillouin é o de um simples líquido, com um storage modulus em condições de relaxamento (ωτ << 1) de:
24 𝑀0′=𝜌.𝑉02 (2.14) onde, 𝑉02=𝜔𝐵 𝑞 (2.15) é a velocidade de som adiabática. O loss modulus é dado por: 𝑀′′=𝜔𝐵.𝑏 (2.16) onde b descreve a viscosidade cinemática longitudinal com o valor de 𝑏=𝜌 𝑞2.Γ𝐵 (2.17) Enquanto o sistema está num estado líquido, o relaxamento estrutural responsável pelo aumento do módulo longitudinal até ao valor do tipo sólido de 𝑀∞′=𝜌𝑉∞2 (2.18) ocorre numa escala de tempo na ordem dos picossegundos, ou seja, a uma frequência muito superior à do pico de Brillouin, originando uma relação linear entre o loss modulus e a frequência. No caso de um polímero altamente diluído, a água pode ser considerada como tendo duas fases, “livre” (ou bulk ) e “hidratada” (interagindo mais fortemente com as cadeias de polímeros). Neste estado, o aumento observado em Γ𝐵 ou M’’ com o aumento da concentração do polímero pode ser atribuído ao aumento da viscosidade cinemática longitudinal devido à dupla contribuição para o processo de relaxamento [38]. Ao reduzir a hidratação, o relaxamento estrutural desloca-se para frequências mais baixas [9]. A Figura 2.9 b) representa esta condição, onde a zona de difusão de Brillouin está localizado a frequências mais elevadas do que o relaxamento estrutural. Neste caso, uma nova alteração do estado de relaxamento (por exemplo, uma redução do nível de hidratação) iria induzir um aumento em M’(𝜔𝐵) correlacionado com uma diminuição de M’’(𝜔𝐵) ao contrário das amostras altamente hidratadas. Como deduzido a partir da equação 2.13, a condição de largura do pico máximo é alcançada quando o máximo de M’’(𝜔𝐵) corresponde à frequência do pico de Brillouin. Uma diminuição mais acentuada da hidratação
31 O principal elemento do TFPI é um par de dois espelhos paralelos separados por um espaço livre. Esse espaço tem um comprimento específico, e é denominado por etalon de Fabry-Pérot. Consoante a distância entre os espelhos, a luz atravessa ou é refletida pelo instrumento [7]. O TFPI é extremamente versátil pois possui uma variedade de parâmetros ajustáveis, o que possibilita melhorar e afinar a resolução do instrumento. Portanto, o mesmo instrumento pode ser utilizado para efetuar medições das mais diversas amostras como sólidos, géis e líquidos. A existência de transdutores piezoelétricos permite a realização do scan dos espelhos. Estes servem para estabilizar de forma dinâmica os espelhos, realinhando continuamente os mesmos, de forma a mantê-los paralelos e igualmente espaçados. O paralelismo dos espelhos é mantido ao fazer pequenas correções do alinhamento para que as características espectrais dominantes possuam uma máxima amplitude ou linewidth mínima [57]. Ao realizar o scan da distância entre os espelhos, a seletividade espectral é alcançada dentro da FSR do instrumento que é dada pela distância espectral entre os máximos vizinhos no espectro de transmissão, tal como visto anteriormente [7]. O feixe de luz, que entra pelo pinhole , irá encontrar o primeiro espelho Fabry-Pérot, no qual passará três vezes, como podemos observar na Figura 2.14, e fará o mesmo no segundo par de espelhos, permitindo obter um alto contraste. O facto do feixe de luz passar um maior número de vezes pelos espelhos leva à obtenção de um contraste superior e evita a sobreposição do feixe [46]. Em contrapartida, a desvantagem de um maior número de passagens pelo espelho seria a redução do diâmetro do feixe de luz o que levaria à consequente diminuição do rendimento, ou seja, um menor número de contagens obtidas [57]. Assim, conclui-se que o número ideal de passagens por cada par de espelhos seria de 3, o que permite que ambas as condições se encontrem o mais perto possível do valor ideal. O contraste do instrumento é limitado apenas pela dark current do fotodetetor. O instrumento é estabilizado eletronicamente para que o espelho permaneça totalmente paralelo independentemente de possíveis flutuações de temperatura [60]. Também o facto dos dois pares de espelhos partilharem o mesmo ambiente, torna o sistema Tandem muito menos sensível a variações de temperatura, do que se fosse construído com dois interferómetros separados. O caminho ótico parte do laser, passando por uma série de componentes óticos até chegar finalmente ao fotodetetor.
32 Figura 2.14: Esquemático de um Interferómetro Tandem Fabry-Pérot de três passagens (adaptado de [43]). O design do TFPI possibilita o alargamento da FSR, ou seja, uma maior resolução espectral do instrumento e um elevado contraste [61]. Em contrapartida, o seu baixo rendimento (elevada perda de sinal) e os longos tempos de varrimento espectral tornam desfavorável a utilização destes espectrómetros em sistemas vivos devido ao movimento destes, ou seja, de exigirem elevadas taxas de aquisição [9,13]. Vale a pena referir que, muitas vezes, uma medição rápida realizada à custa de uma elevada intensidade da radiação do laser, ou seja, uma alta densidade de luz a incidir na amostra, pode ser prejudicial para as células vivas, tecidos e organismos. Consequentemente, deve-se trabalhar com uma menor potência do laser e estender o tempo de aquisição ou usar uma menor NA [9]. É importante também referir que o tempo mínimo de aquisição está limitado pela velocidade de scanning dos espelhos, e não é possível ser significativamente melhorada. Uma das últimas adições nesta tecnologia foi a adição de isoladores óticos, que permitem a obtenção de um melhor contraste [43]. As vantagens e desvantagens de utilizar este interferómetro são apresentadas na Figura 2.15.
33 Figura 2.15: Esquema simples, vantagens e desvantagens de um Tandem Fabry-Pérot (adaptado de [13]). Em suma, o TFPI consiste num conjunto de dois espelhos planos semitransparentes e paralelos que, de acordo com o seu espaçamento relativo, apenas transmitem uma determinada frequência da luz. A realização do scan do espaçamento entre os espelhos permite a obtenção de todo o espectro contendo no centro o pico de Rayleigh com uma maior amplitude, e igualmente espaçados deste, os picos de Stokes e Anti-Stokes . Este será o tipo de espectrómetro utilizado durante a dissertação, presente no laboratório do CMEMS-UMinho (Figura 2.16). Figura 2.16: Interferómetro Tandem Fabry-Pérot utilizando no laboratório do CMEMS-UMinho.
34 2.4.2 Espectroscopia de Brillouin usando Virtually Imaged Phased Array O Virtually Imaged Phased Array (VIPA), inicialmente introduzido na área das telecomunicações [7], é usado para espalhar no espaço as frequências do feixe que sofre a difusão. O VIPA é um espectrómetro de alta resolução, que na sua essência é uma versão modificada de um Fabry-Pérot capaz de dispersar espacialmente o espectro sem necessidade de realizar o scan da cavidade ótica do interferómetro, permitindo a aquisição eficiente deste de uma só vez [13]. Estes podem ser single-stage ou multi-stage , ou seja, diferem no número de etalons que o instrumento possui. Como visto anteriormente, uma das desvantagens da grating diffraction é possuir uma pequena difusão angular. Uma alternativa para esse problema seria usar um dispositivo que realizasse uma waveguide grating , sendo capaz de fornecer maiores dispersões angulares, dependentes da frequência [62]. O VIPA segue esta linha de raciocínio, ao contrário do TFPI que utiliza a primeira. Desta forma, possui uma maior difusão angular. Além disso, possui uma baixa dependência do estado de polarização do feixe de luz, uma estrutura simples, é compacto e a magnitude do campo das imagens virtuais decaem exponencialmente com o aumento do número de reflexões [40,63]. Por não possuir estruturas móveis nem necessidade de sincronização, torna-se muito mais barato e significativamente mais fácil de instalar e operar [7]. O facto de ter um baixo custo permite a utilização em diagnósticos locais e monitorização de rotina. Até hoje, apenas são utilizados em diagnósticos de saúde ocular. O sistema possui uma fonte de luz, que vai incidir numa lente semicilíndrica focando a luz na placa de vidro (etalon) , com diferentes revestimentos refletivos, através de uma janela de entrada transparente. Após múltiplas reflexões na placa de vidro de espessura t, a luz colimada emerge do outro lado da placa, onde se propaga num ângulo que varia com a mudança do comprimento de onda da luz [40,63], oferecendo uma difusão angular suficientemente grande para separar os picos de Stokes e Anti-Stokes do pico de Rayleigh. Após passar por uma lente esférica, a luz incide na câmara CCD (charge-coupled device) , obtendo-se assim os dados desejados. O single-stage VIPA possui um menor contraste, o que o torna inapropriado para medições de amostras túrbidas. Na Figura 2.17 é apresentado um esquemático de um espectrómetro single-stage VIPA.
35 Figura 2.17: Esquemático de um espectrómetro single-stage VIPA (adaptado de [64]). Além do esquema single-stage , o multi-stage com duas placas VIPA é também utilizado em grande escala. Alinham-se dois VIPAs sequencialmente quando se pretende estudar a difusão espectral em direções ortogonais. Este género de difusão separa espacialmente os picos de Brillouin do “ruído” indesejado, tornando possível captar apenas o sinal de Brillouin [56]. O facto de serem utilizados dois etalons aumenta o contraste do espectrómetro. São também utilizadas máscaras de difração, quer na vertical quer na horizontal, que têm como função aumentar o contraste espectral intrínseco do instrumento sem comprometer a sua eficiência [13]. A Figura 2.18 retrata o caso do espectrómetro multistage VIPA. Figura 2.18: Esquemático de um espectrómetro multi-stage VIPA (adaptado de [9]). Como pode ser observado na Figura 2.19 o etalon possui três áreas com diferentes revestimentos. Na superfície frontal, uma janela estreita com um revestimento anti-reflexo que permite a passagem da luz para o etalon ; enquanto o resto dessa superfície possui um revestimento altamente refletor (100%). Na superfície posterior, um revestimento parcialmente refletor permite que apenas uma pequena porção da luz (5%) seja transmitida [56,62]. Para que este processo ocorra a placa de vidro deve-se encontrar ligeiramente inclinada. À medida que vai ocorrendo um número elevado de reflexões da luz entre as superfícies da placa vai existindo uma perda da potência através da superfície parcialmente transmissível
36 no lado da saída. Assim, se a transmissividade na superfície for uniforme, o VIPA é caracterizado pela interferência de muitos feixes de luz divergentes com a mesma forma separados por um comprimento d [63]. Estes feixes interferem uns com os outros para formar feixes de propagação colimados com ângulos de saída diferentes, dependentes do comprimento de onda [62]. Figura 2.19: Geometria do etalon do VIPA com respetivas distâncias transversais e longitudinais (adaptado de [40]). O feixe de luz é refletido em subcomponentes com diferença de fase fixa. A interferência entre os subcomponentes permite atingir a elevada difusão espectral aspirada. Caso o etalon esteja preenchido com ar chama-se air-spaced VIPA, caso contrário, se estiver preenchido com vidro com um índice de refração definido chama-se VIPA sólido. Os espectrómetros VIPA são a opção mais viável para medições de Brillouin que exigem velocidades de aquisição mais rápidas, e.g. sistemas vivos. Dado que os sistemas vivos se movem e reagem a estímulos são necessários tempos de aquisição mais curtos, refletindo-se num menor contraste da imagem. Normalmente existe um trade-off entre a taxa de aquisição e a potência do laser, que nas aplicações biomédicas necessita de ser cuidadosamente adaptada para que sejam reduzidos quaisquer efeitos prejudiciais à amostra [9]. É de referir que o tempo de aquisição é também dependente da transparência da amostra e da potência a que o laser está a ser utilizado [7]. A redução da NA pode ser utilizada para reduzir a densidade de potência da luz laser recebida. Embora reduza a resolução espacial, reduz também o alargamento espectral. Desta forma, se a intenção for melhorar a resolução, o aumento da NA é uma solução. No entanto, uma NA elevada envolverá um alargamento percetível da linha de Brillouin como resultado da dependência da mudança de frequência do ângulo de difusão [64]. As vantagens e desvantagens de utilizar este interferómetro são apresentadas na Figura 2.20.
37 Figura 2.20: Esquema simplificado, vantagens e desvantagens de VIPA (adaptado de [13]). O maior foco estará agora na melhoria do contraste destes espectrómetros, tendo sido recentemente incluído um filtro de limpeza sintonizável do laser, que permite o aumento significativo do contraste. Em suma, concluiu-se que o TFPI possui uma maior resolução espectral e contraste. Em contrapartida possui uma aquisição espectral lenta e um baixo rendimento (elevada perda de sinal). As características do VIPA são as inversas do TFPI [65]. Para a presente dissertação o TFPI será aquele que possui as características mais indicadas, por se pretender a obtenção dos resultados com a maior resolução espectral possível. 2.5 Evolução da espectroscopia: sistema multimodal Brillouin-Raman Apesar da presente dissertação se focar na BS, o estudo do estado da arte engloba a aprendizagem das mais diferentes técnicas, dos mais recentes modelos e futuras melhorias dos equipamentos. Desta forma, um dos tópicos a abordar é o equipamento multimodal Brillouin-Raman . Dado que já foram abordados alguns conhecimentos sobre a espectroscopia Raman, será feito apenas um breve resumo da mesma, para que este conceito seja melhor compreendido. Tanto a difusão de Raman como Brillouin baseiam-se no princípio da difusão inelástica da luz, sendo que o Brillouin ocorre por via de fonões acústicos e o Raman por fotões óticos. Quando a luz atinge a amostra os fotões dispersos alteram o seu comprimento de onda [66], ocorrendo sucessivamente um deslocamento da frequência dos picos que fornecem informações sobre a estrutura, simetria, ambiente eletrónico e ligações das moléculas, permitindo conhecer as propriedades químicas e as quantidades que cada substância possui numa dada amostra [67,68]. Desta forma, fornece uma “impressão digital”
38 que pode ser utilizada para identificação química, visto que cada molécula possui níveis de vibrações únicos [43]. Tal como a BS, a espectroscopia Raman é uma técnica não destrutiva, não invasiva e label-free , amplamente usada na área da química analítica e física, passando pela biofotónica até à biomédica. Além disso, os deslocamentos de frequência dos picos deste tipo de espectroscopia encontram-se numa gama bem mais alta do que a Brillouin, tipicamente superiores a 1 THz. Na Figura 2.21 pode ser observada a diferença nos deslocamentos dos picos de Brillouin e de Raman. Figura 2.21: Comparação entre os deslocamentos de frequência dos picos da espectroscopia Brillouin e Raman (adaptado de [47]). Os recentes avanços permitiram aliar o conhecimento das propriedades viscoelásticas com as propriedades químicas o que se tornou um grande avanço para a comunidade científica. Portanto, a criação de um novo aparelho que fornece medições simultâneas de ambos os espectros a partir de uma só aquisição torna-se extremamente útil para a caracterização e análise de amostras [69]. Depois de compreender o potencial da combinação de ambas as espectroscopias, o passo seguinte passa pela realização de um sistema único que combinasse o estudo dos dois sinais em simultâneo. O facto das duas espectroscopias se basearem na difusão inelástica, e apenas diferirem na gama dos deslocamento de frequência, facilitou a construção do sistema [9]. A disposição experimental para a combinação das espectroscopias está demonstrada na Figura 2.22. A fonte de laser é partilhada, o que facilita toda a preparação experimental e possibilita a maior precisão dos valores da intensidade do laser sobre a amostra e recolha de dados do mesmo ponto. Uma nota importante é que para além do esquema apresentado, no que toca à BS nesta disposição multimodal, pode também ser utilizado o VIPA, caso se pretenda medições mais rápidas [9,69]. No exemplo fornecido, uma micro-espectroscopia, a luz visível proveniente do laser, após seguir um caminho ótico, é focada na amostra e passa por uma objetiva duas vezes, a primeira quando atinge a amostra e a
39 segundo quando sofre backscattering . Uma placa de onda retardadora de λ/4 pode ser inserida a montante da objetiva para alterar a configuração da difusão [43]. Um beam splitter polarizado transmite a luz despolarizada, proveniente do backscattering para os espectrómetros, após passagem por um filtro de borda sintonizável de passagem curta (edge filter) , transmitindo a luz quer para o espectrómetro de Brillouin quer para o de Raman [9]. A partir daqui os dados recebidos serão analisados, e obter-se-ão os resultados sobre as propriedades desejadas. Figura 2.22: Exemplo de micro-espetroscopia multimodal Brillouin-Raman (adaptado de [9]). Em suma, através desta montagem é possível analisar simultaneamente e com bastante precisão as propriedades viscoelásticas e composição química de uma amostra. Este sistema possui um potencial significativo para o estudo de processos biológicos como a microbiologia, reabilitação e caracterização de tecidos, progressão de doenças ou na análise das reações celulares a mudanças físico-químicas [7,41]. Esta técnica apesar de se encontrar numa fase pós-embrionária tem uma elevada potencialidade.
40 Capítulo 3 3. Materiais e Métodos A metodologia refere-se aos passos necessários que promovem uma organização coerente do desenvolvimento do projeto, de forma a garantir rigor científico e a sua eficiência logística. Neste capítulo será demonstrado o processo da preparação das amostras e apresentado o setup experimental utilizado. 3.1 Preparação das amostras As culturas de agar, normalmente realizadas em placas de Petri preenchidas com um meio de crescimento que foi solidificado com agar, são amplamente utilizadas como um dos principais meios de cultura e estudo celular [70]. O agar pertence a uma família de polissacarídeos complexos encontrados nas paredes celulares de algumas algas vermelhas e é amplamente utilizado como agente gelificante, de espessamento e estabilizador [71,72]. As culturas de agar são baratas e rápidas de preparar, sendo também quimicamente e fisicamente estáveis, além de fornecerem um suporte nutritivo para o crescimento celular [73,74]. No presente estudo foram preparados quatro tipos diferentes de amostras de agar: apenas agar e combinação de agar com triptona, extrato de levedura e extrato de malte. Primeiramente, será demonstrado o processo da preparação das amostras e de seguida serão apresentadas as características do estudo em si, i.e. as concentrações utilizadas para cada conjunto de solutos. Numa placa de aquecimento a 120°C foram aquecidos 60 ml de água destilada (tendo em conta que aproximadamente 10 ml de água evaporava durante o processo) até atingir uma temperatura entre os 95°C e os 99°C. Durante este processo, o recipiente onde a água foi aquecida esteve sempre tapado, sendo aberto apenas para verificar a temperatura da água. Após atingir a temperatura desejada, foi adicionada à água a quantidade de agar previamente pesada e misturada com uma espátula até à completa dissolução. Após este passo, aqueceu-se a solução na mesma placa de aquecimento, sem variação de temperatura, durante 15 minutos. Por fim, a solução foi cuidadosamente transferida, com uma pipeta de Pasteur, para uma cuvete de vidro previamente aquecida e pesada, e o remanescente da solução foi transferido para uma placa de Petri também previamente pesada. A Figura 3.1 representa o processo relatado anteriormente.
47 Figura 3.5: Configuração usada para a medição da deslocação do feixe (adaptado de [81]). Este método utiliza uma cuvete transparente com paredes perfeitamente paralelas a uma distância conhecida entre elas, que é preenchida com o material transparente a ser estudado. Um feixe laser é então incidido obliquamente sobre uma das paredes transparentes da cuvete, atravessando-a. A Figura 3.6 representa o deslocamento do feixe de luz devido à refração que ocorre nas paredes da cuvete e do próprio material no seu interior. As variáveis n0, n1 e n2 representam o índice de refração do ar, das paredes da cuvete e da amostra, respetivamente. As outras variáveis δ e θ dizem respeito à deslocação e ao ângulo de incidência. Em suma, o deslocamento depende do ângulo de incidência, da espessura das paredes das cuvetes, da distância entre as paredes e do índice de refração da cuvete e da amostra. Figura 3.6: Deslocação do feixe de luz ao longo do eixo devido à refração na amostra e nas paredes da cuvete (adaptado de [81]). Este método baseia-se num ensaio de transmissão e utiliza um percurso ótico que não contém superfícies de amostra expostas à atmosfera. Ao evitar o endurecimento constante da superfície (devido ao contacto direto com o ar) e testando toda a espessura de 10 mm da amostra, reduz-se exponencialmente qualquer influência da evaporação da água que possa alterar os resultados.
48 Através das equações desenvolvidas por Nemoto, ao realizar medições do deslocamento de uma mesma cuvete vazia e preenchida pela amostra a estudar, a diferença entre os deslocamentos providencia o índice de refração da amostra, independentemente da espessura da parede da cuvete ou mesmo do índice de refração da mesma [81]. Foi desenvolvido um refratómetro personalizado com base no método acima descrito a fim de automatizar as experiências de determinar, com precisão, o índice de refração das amostras. A Figura 3.7 ilustra o refratómetro projetado. Figura 3.7: Design do refratómetro utilizado para a obtenção do índice de refração das amostras de agar. O refratómetro é composto por duas partes principais: a mesa rotativa e o carril de varrimento do eixo xx. A mesa rotativa inclui um motor de passo e um suporte onde a cuvete se encaixa perfeitamente. Esta mesa define o ângulo entre o feixe de luz laser e a cuvete, permitindo testar vários ângulos de incidência de forma rápida, sequencial e precisa. O carril de varrimento do eixo xx é constituído por uma plataforma que se desloca perpendicularmente ao feixe laser na direção deste mesmo eixo. Na plataforma, duas lâminas separadas por cerca de 3 mm bloqueiam toda a luz laser, exceto no espaço entre elas. No final do percurso ótico, centrado entre as duas lâminas, foi colocado um fotodetetor para detetar a luz transmitida. Para cada ângulo, o carril de varrimento do eixo xx desloca-se nos dois sentidos. Antes de obter os dados do refratómetro para as amostras de agar é necessário realizar a sua calibração. Para tal, são realizadas três medições com a cuvete cheia de água destilada visto que o índice
49 de refração da água é conhecido. De notar que, sempre que alguma amostra é estudada são realizadas três medições em pontos diferentes, e são estudados diferentes ângulos, desde os 20° até aos 60° em intervalos de 5°. São efetuadas as medições tanto das cuvetes cheias de água destilada, como das cuvetes vazias e com a amostra. Por fim, foi desenvolvido um software para processar automaticamente os dados obtidos das cuvetes vazias e com os géis. O valor do índice de refração da amostra em questão foi calculado pela seguinte equação: 𝑛2=𝑛0 { 1+[ cos𝜃 (sin𝜃−∆ 𝑑2) ]2 } 12sin𝜃 (3.2) , sendo que Δ é dado pela seguinte equação: ∆ =𝑑2[1− 𝑛0cos𝜃 (𝑛22−𝑛02sin2𝜃)12]sin𝜃 (3.3) 3.1.3 Medições da densidade A abordagem inicial para a medição da densidade das amostras consistiu em encher as cuvetes com agar e utilizar o volume interno e a massa conhecidas das cuvetes para calcular a densidade do gel. Algo semelhante ao princípio de Arquimedes calculando o quociente entre a massa e o volume das amostras. No entanto, este método não se revelou adequado para amostras de agar devido à superfície irregular causada pela adesão das paredes durante a fase líquida e pela contração durante o arrefecimento, resultando em imprecisões. Desta forma, foi utilizado uma aproximação baseada num modelo de mistura ideal bifásico [38]. Este modelo considera a composição do gel como uma mistura de fases sólidas e líquidas, assumindo uma distribuição uniforme de cada fase. O modelo de mistura considera as frações de volume das fases sólidas e líquida e as densidades correspondentes de cada fase, e pode ser descrito por: 𝜌=𝑚𝑤+𝑚𝑔 𝑉𝑤+𝑉𝑔=𝑚𝑤+𝑚𝑔 𝑚𝑤 𝜌𝑤+𝑚𝑔 𝜌𝑔 (3.4)
50 , onde 𝑚𝑤 e 𝑚𝑔 correspondem à massa da água e do componente (soluto) seco, respetivamente, e, 𝜌𝑤 e 𝜌𝑔 correspondem às densidades. No caso da presente dissertação como existe mais que um soluto seco, na equação anterior é realizada uma soma das massas e volumes de cada um individualmente. A densidade de cada componente em pó foi determinada utilizando a deslocação do líquido. Para garantir que os componentes não se dissolviam durante o ensaio, foram criadas soluções saturadas para cada um deles e utilizadas como líquido deslocado. Para cada solução, foi adicionada uma elevada quantidade do soluto à água destilada e misturada durante longos minutos. Deixou-se repousar a solução, e, de seguida, foi decantada e filtrada com um filtro de 30 µm de porosidade. A densidade de cada solução saturada foi medida. Finalmente, num recipiente de volume conhecido, adicionaram-se 3g do pó e a respetiva solução saturada até encher o volume do recipiente em questão (VT). A densidade de cada componente foi então calculada pela seguinte equação: 𝜌𝑔𝑥=𝑚𝑔𝑥 𝑉𝑇−𝑚𝑠 𝜌𝑠 (3.5)
51 Capítulo 4 4. Resultados obtidos Este capítulo apresenta os resultados experimentais obtidos. Inicialmente, serão apresentadas as composições das amostras de agar, os dados resultantes da BS, bem como o índice de refração e densidade das amostras realizadas. Por fim, será apresentado o modelo viscoelástico. 4.1 Composição das amostras O processo de obtenção dos géis de agar tende a ser bastante desafiante devido ao facto da água evaporar durante a preparação da amostra. Como foi dito anteriormente, foi considerada uma evaporação de aproximadamente 10 ml durante o processo. As concentrações obtidas para cada amostra são apresentadas na Tabela 4.1. Tabela 4.1: Concentrações de cada componente nas amostras realizadas. Meio de Cultura Número da Amostra % Agar % Aditivo % Total de solutos % Água Agar (sem aditivos) 1 0,527 - 0,527 99,473 2 1,263 - 1,263 98,737 3 1,606 - 1,606 98,394 4 2,227 - 2,227 97,773 5 3,006 - 3,006 96,994 6 3,011 - 3,011 94,989 7 3,665 - 3,665 96,335 Agar + Triptona 8 2,019 0,262 2,281 97,719 9 1,960 0,504 2,463 97,537 10 1,868 0,973 2,841 97,159 11 1,858 1,917 3,775 96,225 12 1,908 3,882 5,790 94,210 Agar + Extrato de Levedura 13 1,966 0,244 2,210 97,790 14 2,035 0,496 2,531 97,469 15 1,891 0,975 2,866 97,134 16 1,948 1,982 3,930 96,070 17 1,946 3,971 5,917 94,083 Agar + Extrato de Malte 18 1,968 0,259 2,227 97,773 19 1,950 0,500 2,450 97,550 20 2,000 1,001 3,001 96,999 21 1,915 1,913 3,828 96,172 22 1,861 3,730 5,591 94,409
52 Após obter os valores reais da massa dos componentes, desde que fossem de encontro com os valores propostos para as percentagens em questão, e após a pesagem da cuvete e placa de Petri, vazias e cheias, calculou-se o peso total de gel produzido pela seguinte equação: Para se obter a percentagem de agar utilizado e a percentagem do outro componente utilizado, realizou-se o quociente entre o valor da sua massa real, pelo valor do peso total. A percentagem de água é dada pela diferença entre o valor total (100 %) pela percentagem de solutos nessa mesma amostra. 4.2 Difusão de Brillouin A BS permite determinar as propriedades viscoelásticas das amostras, em concreto, os valores do deslocamento de frequência e da largura dos picos de Brillouin. Os valores obtidos pelo espectrómetro são analisados no software Ghost . Ao ser realizada uma espectroscopia, será obtido um espectro semelhante ao da Figura 4.1. Este apresenta um pico central, e dois picos simétricos. Será nestes picos que se obterão os valores em questão. Figura 4.1: Exemplo de um espectro de uma amostra realizada (amostra 13). Apesar da nitidez ótica diferir significativamente de amostra para amostra, o efeito de multiple scattering pode ser praticamente negligenciado em todas as amostras estudadas. Este normalmente aparece entre o pico de Rayleigh e picos de Brillouin e pode afetar significativamente os resultados (Figura 4.2). 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙=(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑃𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑃𝑒𝑡𝑟𝑖 𝐶ℎ𝑒𝑖𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑃𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑃𝑒𝑡𝑟𝑖 𝑉𝑎𝑧𝑖𝑎) +(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝐶𝑢𝑣𝑒𝑡𝑒 𝐶ℎ𝑒𝑖𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝐶𝑢𝑣𝑒𝑡𝑒 𝑉𝑎𝑧𝑖𝑎) (4.1)
53 Figura 4.2: Exemplo de um espectro que possui multiple scattering . Para obter dados com a maior qualidade possível é sempre realizado um ajuste de um dos picos de Brillouin usando o modelo DHO descrito na equação 3.1., obtendo-se os valores do deslocamento de frequência e da largura do pico de Brillouin. A Figura 4.3 exemplifica a qualidade do ajuste aos dados adquiridos. Como se pode observar o ajuste segue praticamente na perfeição o espectro obtido representado pelos pontos. Figura 4.3: Exemplo de um ajuste a um espectro de uma amostra realizada (amostra 13). A Figura 4.4 mostra os valores do deslocamento de frequência e da largura do pico do espectro de Brillouin de todas as amostras em função da concentração da massa do componente usado. No caso das amostras que são constituídas apenas por agar, é apenas considerada a concentração em massa deste, na globalidade da amostra. Nas restantes amostras, os gráficos não representam a quantidade de agar utilizado. Embora, para estas amostras a concentração alvo de agar ser de 2 %, estas concentrações
54 encontram-se num intervalo de valores de 2±0.142 %, devido à imprevisibilidade da evaporação no processo da preparação da amostra. Figura 4.4: Deslocamento de frequência e largura do pico dos espectros de Brillouin de todas as amostras em função da concentração em massa de cada componente estudado. Foi realizado também o estudo das duas características em questão utilizando desta vez o conjunto dos solutos, ou seja, a soma do agar com cada componente individualmente (Figura 4.5). Além disso, os gráficos apresentados dizem respeito à concentração de água, e não à concentração de solutos como anteriormente apresentado.
55 Figura 4.5: Deslocamento de frequência e largura do pico dos espectros de Brillouin de todas as amostras em função da concentração em massa da água. 4.3 Índice de refração Embora todas as amostras tenham sido preparadas com o mesmo protocolo, algumas delas resultaram em géis mais opacos e com defeitos visíveis (efeito particularmente prevalecente nas amostras que continham extrato de levedura). Como foi utilizado um método de transmissão para o cálculo do índice de refração, a difração no interior da amostra teve um forte impacto nos resultados das amostras irregulares. De seguida, é apresentado um exemplo de uma medição obtida através da realização de uma refratometria, na Figura 4.6. Figura 4.6: Exemplo de uma medição obtida através da refratometria (amostra 21). Como é possível observar existem 9 pares de curvas sendo que estas praticamente se sobrepõe entre si. Cada par de curvas representa uma medição obtida pelo fotodíodo, sendo que cada uma representa o movimento num sentido oposto (direção xx sentido positivo e sentido negativo). Para cada
56 ângulo como se pode verificar estão associados dois valores sendo este o valor da movimentação do carril de movimento no eixo xx. As cruzes azuis e laranjas representam os valores mínimos e máximos de cada curva para um valor de cerca de metade da unidade. A partir destes valores é possível obter os valores do índice de refração dados pelo software desenvolvido. Na Figura 4.7, são apresentados os diferentes sinais obtidos nas refratometrias realizadas, devido aos diferentes níveis de transparência, e pequenos defeitos que alteram qualidade dos dados da experiência. Figura 4.7: Representação do sinal adquirido com o refratómetro utilizado. O sinal a) refere-se a uma cuvete cheia de água; b) a uma cuvete com gel de agar; c) a uma cuvete com a maior concentração estudada de gel de agar com levedura. Podemos verificar que a primeira possui uma forma mais retangular, com declives bem definidos, a segunda começa a ter extremidades mais arredondadas e, finalmente, a última que não possui qualquer declive bem definido. Isto porque, a água possui as qualidades ideais para uma medição, qualidades praticamente semelhantes às do gel de agar. Por sua vez, a amostra de gel de agar com levedura, é opaca o que piora a qualidade dos dados obtidos pelo refratómetro. O índice de refração para todas as amostras em função da concentração de água em massa é apresentado na Figura 4.8.
63 frequência de Brillouin também aumenta, embora a taxas diferentes consoante o aditivo. Em termos de largura do pico de Brillouin, as baixas concentrações de aditivos não parecem ter um efeito significativo. No entanto, a concentrações mais elevadas, o aumento da largura do pico é mais lento em comparação com os géis que contêm apenas agar e água. Apesar de estudos recentes sugerirem que a quantidade de água é o principal fator a afetar as características da BS [82], foram observadas diferenças significativas nos géis de agar com concentrações semelhantes, mas com diferentes composições, indicando que as composições dos géis de agar também possuem um papel importante nas características obtidas pela BS. Apesar do refratómetro ter sido projetado para determinar o índice de refração com uma precisão elevada para amostras cujas superfícies expostas à água evaporam, o método de transmissão apresentou vários problemas. Embora um método que utilizasse a reflexão da superfície fosse o ideal para obter o índice de refração de uma amostra de agar sem perturbar o crescimento, é preferível utilizar o método da transmissão para criar uma correlação precisa com as concentrações dos constituintes do agar. Como observado na Figura 4.7, a transparência dos géis contendo apenas água e agar resulta em dois declives nítidos e distintos, idênticos aos obtidos na cuvete apenas com água destilada. No entanto, ao adicionar o extrato de levedura verifica-se, devido as declives assimétricos mal definidos, que houve um grande impacto na transparência da amostra. Este efeito afetou significativamente a precisão dos dados, como é possível observar na Figura 4.8. Relativamente às amostras apenas com agar verifica-se que a diminuição da concentração de água, ou seja, o aumento da concentração de agar, levou a um aumento no índice de refração das amostras. No entanto, verificaram-se comportamentos distintos no estudo de cada componente. Ao adicionar uma pequena quantidade do aditivo, verificou-se que havia uma redução ligeira do índice de refração, quando comparado com a amostra de controlo (agar a 2 %), excetuando a amostra que continha malte. O aumento da concentração do extrato de malte teve um efeito semelhante ao aumento da concentração de agar no índice de refração. Por outro lado, a adição de triptona teve pouco ou nenhum efeito sobre o índice de refração. As amostras do extrato de levedura foram as que apresentaram os defeitos mais visíveis nos géis, e os dados mostram isso, pois não apresentam nenhuma tendência evidente no índice de refração com o aumento da concentração do componente. No entanto, para todos os aditivos testados, as baixas concentrações parecem diminuir o índice de refração em comparação com o gel composto apenas por água e agar. O caso particular do extrato de malte não revela qualquer efeito adicional significativo no índice de refração, uma vez que a adição deste composto ou o aumento da concentração de agar proporcionam um aumento semelhante do índice de refração.
64 Para tentar solucionar os problemas levantados nas amostras com extrato de levedura surgiram duas possíveis soluções. Primeiramente, ajustar o protocolo realizado, mais precisamente a “receita” da preparação do agar, no entanto apresentaria riscos como a solidificação prematura do agar e uma maior evaporação da água na concentração da amostra. Também foi estudado o efeito da maximização da temperatura de aquecimento nas amostras de gel que possuíam extrato de levedura, e foi possível confirmar que o aumento da temperatura, apesar de proporcionar uma maior evaporação, tem a capacidade de atenuar os defeitos em questão. Um dos principais desafios é obter medições exatas da densidade em tempo real em amostras de agar sem perturbar o crescimento celular. As técnicas disponíveis de medição direta da densidade, apesar de terem um nível de precisão superior, não eram práticas devido a questões como a rápida evaporação da água, o encolhimento desigual durante o arrefecimento e a adesão do agar às paredes enquanto se encontra no seu estado líquido. Para além da evaporação, o maior consumo de componentes do agar pelas células que se encontram na superfície criaria um gradiente de densidade que dificultaria a obtenção de medidas exatas ao utilizar técnicas como a densitometria de ultrassons ou de raio-X. No futuro, métodos como a elipsometria ou outras técnicas de medição da espessura poderiam ser exploradas, pois teriam o potencial de fornecer medições mais exatas e em tempo real. No entanto, devido à rápida capacidade das amostras de agar formarem os gradientes de densidade, as abordagens baseadas em técnicas de aproximação continuam a ser necessárias. Desta forma, o modelo bifásico foi a melhor solução encontrada para as aproximações da densidade das amostras dos géis de agar, que apesar de não ter a precisão de algumas técnicas de medição direta, permite uma aproximação razoável do valor da densidade do agar. Analisando os valores das densidades saturadas e da densidade em pó concluiu-se que o agar é o que possui o menor valor em cada um dos tipos de densidade. Apesar da triptona possuir a menor densidade da solução saturada, de entre os três aditivos em estudo, é aquela que possui a maior densidade em pó. A maior densidade da solução saturada pertence ao extrato de levedura o que permite levantar a questão do porquê de ser esta a amostra mais turva. Relativamente às amostras obtidas, a densidade do agar não segue nenhuma tendência conclusiva (r2=0.3184), não se conseguindo concluir nenhuma relação entre o aumento da concentração e a sua densidade. Em relação aos aditivos em individual, verifica-se que o aumento da sua concentração leva a um aumento tendencial da densidade aproximada, possuindo valores muito próximos entre si para concentrações semelhantes. A análise anterior pode ser observada nos gráficos que estudam a relação entre a densidade e a concentração de
65 água (Figura 4.10), em que os dados não são analisados individualmente, mas como a amostra num todo. É possível verificar que a adição do agar não altera o comportamento do aditivo. Uma vez analisados os valores do deslocamento de frequência, largura do pico, índice de refração e densidade das amostras, é possível então calcular e analisar os valores do storage e loss modulus . Tal como referido anteriormente, o primeiro está relacionado com a resposta elástica e o segundo com a resposta viscosa da amostra. Os gráficos da Figura 4.11 permitem observar um aumento, a taxas diferentes, do M’ e do M’’ com o aumento da concentração de cada componente. Observando os componentes a nível individual, concluiu-se que o agar possui uma taxa de evolução de M’ mais constante. No que diz respeito aos aditivos, a triptona e o extrato de levedura possuem um aumento semelhante do M’ associado ao aumento da concentração do componente, o que não ocorre com o extrato de malte, que possui uma evolução cerca de três vezes menor. Assim, é possível verificar que tanto a triptona como o extrato de levedura possuem um maior storage modulus , concluindo-se que estas amostras têm uma resposta mais rígida à deformação, ou seja, após ocorrer uma deformação possuem uma menor capacidade de voltarem à forma inicial. Em contrapartida, dentro dos aditivos, o extrato de malte é o que possui menor M’, concluindo-se que este terá uma resposta mais elástica. Tal como visto anteriormente o agar é o que possui maior elasticidade, confirmando assim a análise feita anteriormente. Mudando o foco agora para o loss modulus , verifica-se que o agar, em contrapartida, é o componente que possui maior valor. Nos aditivos, por sua vez, a triptona é aquela que possui menor M’’, podendo-se afirmar que possui uma menor resposta viscosa, ou seja, existe uma menor dificuldade da amostra em fluir. Por outro lado, o maior valor de M’’ pertence ao extrato de levedura, ainda que seja equiparado ao valor do extrato de malte, possuindo assim a maior resposta viscosa. Apesar de, como referido anteriormente, as amostras do extrato de levedura terem sido aquelas nas quais se notaram maiores problemas óticos, os dados finais das suas regressões lineares são positivos, podendo ser explicado pela elevada influência que os valores obtidos na BS têm no cálculo do M’’ relativamente aos valores da densidade e índice de refração. Os resultados apresentados na Figura 4.12 mostram diferentes tendências do storage modulus , sendo que as amostras de agar não são tao propícias a alteração do M’ com a concentração de água. As amostras de agar com triptona e de agar com extrato de levedura possuem tendências semelhantes e definidas com maior declive que as amostras de agar com extrato de malte. É então possível constatar que o storage modulus é mais dependente do tipo de aditivo adicionado. Em contrapartida, verifica-se que o loss modulus parece mais dependente da concentração de água, visto que o agar tem uma
66 tendência semelhante à dos aditivos, que entre si apresentam um comportamento extremamente semelhante. Para além das culturas celulares serem quimicamente e fisicamente estáveis e de fornecerem um suporte nutritivo para o crescimento celular, por vezes os organismos que nelas são implementados têm uma seletividade em relação à cultura, i.e. a cultura de agar deve possuir certas características que permitam o crescimento ou a inibição da mesma. A adição de aditivos pode ser incorporada para atingir esse fim. Por exemplo, para microrganismos como bactérias, os meios de cultura celular devem ser menos viscosos, pois facilita a motilidade das bactérias pela cultura [83]. Desta forma, culturas de agar que utilizem o extrato de levedura ou extrato de malte não seriam tao benéficas como as que usariam a triptona. Por outo lado, se a intenção for estudar vírus este meio não seria tão vantajoso, pois a intenção passa por poder ter o mesmo o mais estanque possível [84]. A elasticidade por sua vez desempenha um papel fundamental na condução dos nutrientes até aos microrganismos [85]. Portanto, se a intenção da cultura celular for o crescimento do microrganismo, o extrato de malte seria o ideal pois gera uma amostra mais elástica. Por outro lado, a adição de triptona ao agar seria o ideal para a inibição do crescimento, uma vez que torna as amostras mais rígidas, dificultando o acesso de nutrientes ao microrganismo em questão.
67 Capítulo 6 6. Conclusão e Trabalho futuro O presente capítulo apresenta as principais conclusões obtidas com a realização da presente dissertação. São também sugeridas algumas perspetivas de trabalho futuro para a otimização dos processos e estruturas a desenvolver. 6.1 Conclusão Atualmente, os biomateriais possuem uma posição de extrema importância em todas as áreas relacionadas com a saúde e a biomédica, desde a investigação até a aplicação em si. O conhecimento das suas propriedades mecânicas e viscoelásticas traz o benefício de otimizar a sua aplicação. A BS é uma tecnologia ótica não invasiva, label-free e não destrutiva capaz de obter as propriedades viscoelásticas de um material com excelente precisão. Esta baseia-se na interação entre a luz e a amostra, levando à difusão dos fotões com uma mudança de frequência proporcional à frequência da onda acústica, utilizando dois pares de espelhos Tandem Fabry-Pérot para obter os valores do deslocamento de frequência e largura do pico de Brillouin. Com as mudanças de frequência da luz dispersa, é possível obter as propriedades viscoelásticas da amostra. O estudo realizado na dissertação explorou a aplicação da BS na avaliação das propriedades viscoelásticas de culturas celulares de agar contendo diferentes aditivos a diferentes concentrações. Foram testadas amostras de géis com diferentes concentrações de agar, triptona, extrato de levedura e extrato de malte. As amostras foram caracterizadas por diversas técnicas: BS, refratometria, e medição da densidade. Todos os dados obtidos dos testes foram necessários para obter os valores finais de M’ e M’’. O presente estudo mostra que as propriedades mecânicas dos géis de agar podem ser significativamente influenciadas pela inclusão de aditivos. Verificou-se que o índice de refração, a densidade, o espectro de Brillouin e as propriedades viscoelásticas dependem da composição dos géis de agar, o que permite compreender a criação de meios de cultura com propriedades mecânicas ideais para o crescimento celular. Além disso, os resultados da dissertação podem contribuir para o desenvolvimento de tecnologias de monitorização não invasivas e que obtenham dados em tempo real permitindo assim a avaliação da propagação e da multiplicação celular. Embora os resultados da
68 dissertação tenham sido promissores, seria necessária maior investigação para a compreensão da correlação entre a composição dos géis e o modelo viscoelástico proposto, em particular, no que se refere à obtenção de medições precisas do índice de refração e da densidade, e à sua correlação com as concentrações exatas de cada componente. Seriam, também, necessárias investigações para compreender de que forma a adição de múltiplos aditivos afeta o espectro de Brillouin e outras propriedades relevantes para o estabelecimento de um modelo viscoelástico. Assim sendo, é possível comprovar que para o estudo de bactérias e de vírus, devem-se usar aditivos distintos, sendo eles a triptona para o primeiro e o extrato de levedura ou malte para o segundo. Se o objetivo fosse então o crescimento celular das culturas deveria-se usar o extrato de malte. Caso contrário os aditivos ideais seriam a triptona ou o extrato de levedura. Em suma, os resultados obtidos fornecem informações importantes sobre o desenvolvimento de meios de culturas, além de fornecerem informações para o possível progresso tecnológico de ferramentas não invasivas e em tempo real para monitorizar a cultura celular durante o crescimento e propagação das células. 6.2 Trabalho futuro A presente dissertação conseguiu com sucesso obter os valores do storage e loss modulus das amostras do gel de agar. No entanto, a precisão do modelo viscoelástico está muito dependente do refratómetro e do modelo bifásico utilizado para obter o índice de refração e densidades das amostras, respetivamente. Como trabalho futuro, a otimização de ambos os processos seria vantajoso para a obtenção de resultados com ainda maior qualidade e precisão. O trabalho futuro poderá também focar-se na mistura de vários aditivos para constatar qual seria a resposta que a amostra daria. Pequenas alterações no protocolo, como por exemplo, na temperatura ou tempo de aquecimento poderiam suscitar novas questões e abordagens. A nível da saúde, transportar a BS para a deteção e evolução de tumores, pela comparação entre tecido saudável e cancerígeno, seria no futuro uma grande ajuda no diagnóstico precoce do cancro. A nível tecnológico, e visto que cada vez mais vivemos num mundo nanotecnológico, a BS poderia oferecer a capacidade de analisar as propriedades viscoelásticas de nanoestruturas ou matérias à nanoescala. A fusão da BS com outras técnicas de análise é também fascinante para trabalho futuro, por aliar a possibilidade da obtenção de diferentes características de um material simultaneamente. A nível mais global seria extremamente interessante miniaturizar o espectrómetro de Brillouin, tornando-o mais acessível e portátil.
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