Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp

Universidade do Minho Escola de Ciências Stephanie Lopes Morais dezembro de 2019 Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp. Stephanie Lopes Morais Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp. UMinho|2019 Universidade do Minho Escola de Ciências Stephanie Lopes Morais dezembro de 2019 Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp. Trabalho efetuado sob a orientação da Doutora Andreia Ferreira de Castro Gomes e da Doutora Maria de Fátima de Sá Barroso Dissertação de Mestrado Mestrado em Biofísica e Bionanossistemas ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição: CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ iii Agradecimentos Antes de mais, queria agradecer ao Dr. João Miguel da Rocha e à Dr.ª Maria de Fátima Barroso pela a oportunidade de desenvolver este tema. Agradeço também à Dr.ª Andreia Gomes por ter aceite ser minha co-orientadora. À Dr.ª Fátima e à Dr.ª Andreia, agradeço profundamente ainda toda a orientação e o apoio incondicional que me forneceram ao longo deste projeto. Gostaria de agradecer igualmente à equipa do Grupo de Reações e Análises Químicas|Rede de Química e Tecnologia (GRAQ|REQUIMTE) do Instituto Superior de Engenharia do Porto por me receberem de braços abertos e por todo o apoio e cumplicidade oferecida. Um especial agradecimento à Dr.ª Piedade Barros e à Dr.ª Marlene Santos do Centro de Investigação em Saúde e Ambiente (CISA) da Escola Superior de Saúde (ESS) do Politécnico do Porto pela ajuda na escolha, cultivo, extração e amplificação dos organismos em estudo. E, sem deixar de ser, quero agradecer à minha família e amigos que, mesmo nos piores dias e entre as dúvidas e incertezas, ouviram-me e deram-me força para seguir em frente, especialmente a minha avó e a minha mãe a quem não me seria possível ter chegado a este momento, assim como, aos meus irmãos, Ricardo e Miguel que, da sua forma muito peculiar, me incentivam e inspiram a dar o melhor de mim mesma. Muito obrigada! iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp. Resumo A aquacultura é uma atividade agropecuária em crescimento, cuja finalidade é aumentar a quantidade de alimentos, de origem aquática, disponíveis no mercado. Porém, como outras práticas agrícolas, a aquacultura também está sujeita a ameaças externas. Uma das possíveis ameaças para estes sistemas são as contaminações pelas florações nocivas de algas (HAB) – evento resultante do aparecimento em grande escala de microalgas e/ou cianobactérias potencialmente tóxicas. Em Portugal, os bivalves são dos organismos mais cultivados em aquacultura, pelo que apresentam um risco acrescido quando em contato com uma HAB, pois existem espécies, como a Alexandrium minutum , com a capacidade de produzir toxinas suficientes para representar uma ameaça para a saúde pública. Tendo em conta o aumento das HAB nas últimas décadas, surgiu a necessidade de desenvolver meios de deteção capazes de os antecipar, de maneira a prevenir ou, pelo menos, limitar a perda económica e biológica, incluindo a humana. Nesta dissertação foi desenvolvido e otimizado um genossensor eletroquímico para a deteção da A. minutum – microalga produtora de toxinas prejudiciais para a aquacultura portuguesa. Este dispositivo baseia-se na deteção eletroquímica da reação de hibridação de duas cadeias de ADN complementares. Analisando bases de dados públicas, selecionou-se e desenhou-se sequências de ADN especificas (70 pb) capazes de detetar inequivocamente o material genético proveniente da A. minutum . A construção do genossensor foi efetuada em várias etapas (i) Fase sensorial: criação de uma monocamada auto-organizada (SAM) mista constituída pelo ADN tiolado e o mercapto-hexanol (MCH) na superfície do elétrodo descartável de ouro (SPGE); (ii) Promoção da reação de hibridação do ADN em formato “sandwich” (para aumentar a seletividade) e; (iii) Deteção eletroquímica da reação de hibridação através da avaliação da reação de redução do substrato tetrametilbenzidina/peróxido (TMB/H2O2). Após a otimização de todos os parâmetros analíticos, fizeram-se curvas de calibração. Obteve-se uma correlação linear entre a corrente eletroquímica e a concentração de ADN alvo no intervalo de 0,12 e 1 nM. Os genossensores desenvolvidos apresentaram uma repetibilidade e reprodutibilidade de 5,4 % e 4,1 % respetivamente, e ainda um limite de deteção (LD) e um limite de quantificação (LQ) de 0,03 e 0,08 nM, respetivamente. ADN extraído e amplificado de amostras biológicas distintas ( A. minutum , Lingulodinium polyedrum e células do epitélio oral) permitiram validar e confirmar a seletividade do genossensor. Este dispositivo também detetou o ADN complementar proveniente da A. minutum (a várias concentrações) e não registou nenhum sinal para as restantes amostras de ADN não complementares ( L. polyedrum e as células do epitélio oral) às sondas de ADN usado na construção do sensor. Confirma-se assim que os genossensores são uma ferramenta analítica promissora e de baixo custo para monitorizar a presença de A. minutum em culturas puras, no mar e em tanques de aquacultura. Palavras chave: Alexandrium minutum ; Cronoamperometria; Dinoflagelados; Hibridação em formato em sandwich; Genossensores eletroquímicos. vi Development of electrochemical genosensors for the detection of microalgae Alexandrium spp. Abstract Aquaculture is a fast-growing activity of agricultural character; whose purpose is to increase the amount of aquatic food available on the market. Like other farming practices, aquaculture is also subject to external threats. One possible threat to these systems is the contamination by harmful algae blooms (HAB) – a large-scale event resulting from the appearance of potentially toxic microalgae and/or cyanobacteria. In Portugal, shellfish are the most cultivated organisms in aquaculture, thus representing an increased risk when in contact with a HAB because there are species, like Alexandrium minutum , with the ability to produce enough toxins to pose a threat to public health. In view of the increase phenomena of HAB, the need to develop means of detection capable of anticipating these threats, in order to prevent economic and human loss, has emerged. In this thesis, an electrochemical genosensor for the detection of Alexandrium minutum – a microalgae that produces harmful toxins for portuguese aquaculture – was developed and optimized. This device is based on the electrochemical detection of the hybridization reaction between two complementary DNA sequences. Analyzing public databases, a specific DNA probe (70 bp) capable of unequivocally detecting the genomic material of A. minutum was selected and designed. The construction of the genosensor was obtained in various steps (i) Sensorial phase: creation of the thiolated DNA and mercapto-hexanol mixed self-assembled monolayer (SAM) on the screen-printed gold electrode (SPGE) surface; (ii) Promotion of the DNA hybridization reaction in a sandwich format (to increase the selectivity) and; (iii) Electrochemical detection of the hybridization reaction by evaluating the reduction reaction of tetramethylbenzidine/peroxide (TMB/H2O2) substrate. After the optimization of all the analytical parameters, the calibration curve was determined. A linear correlation between the analytical signal (electrochemical current) and the DNA target concentration was obtained in the 0,12 and 1 nM range. The developed genosensor presents a repeatability and reproducibility of 5,4 % and 4,1 % respectively and a detection and quantification limit of 0,03 and 0,08, respectively. The extracted and amplified DNA from the different biological samples ( A. minutum, Lingulodinium polyedrum and oral epithelium cells) validated and confirmed the selectivity of the genosensor. This device also detected the A. minutum complementary DNA (at various concentrations) and didn’t record any signal for the other non-complementary DNA samples ( L. polyedrum and the oral epithelium cells) to the artificial probes used during the genosensors design. It is therefore confirmed that genosensors are a promising and low-cost analytical tool to monitor the presence of A. minutum in pure cultures, in the sea and in aquaculture tanks. Keywords: Alexandrium minutum ; Chronoamperometry; Dinoflagellate; Electrochemical genosensors; Sandwich format hybridization. vii Índice Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros .................................................. ii Agradecimentos ............................................................................................................................................. iii Declaração de integridade ........................................................................................................................... iv Resumo ........................................................................................................................................................... v Abstract ........................................................................................................................................................... vi Lista de abreviaturas ......................................................................................................................................x Lista de figuras .............................................................................................................................................. xi Lista de tabelas ............................................................................................................................................. xv Capítulo 1 – Contextualização ......................................................................................................... 1 1. Enquadramento ........................................................................................................................................ 1 2. Motivação e objetivos ................................................................................................................................ 2 3. Organização da tese ................................................................................................................................. 3 Capítulo 2 – Estado de arte ............................................................................................................. 5 1. Introdução ................................................................................................................................................ 5 2. Aquacultura .............................................................................................................................................. 8 2.1. Aquacultura em Portugal................................................................................................................ 11 3. Cianobactérias ........................................................................................................................................ 17 4. Microalgas .............................................................................................................................................. 18 4.1. Diatomáceas ................................................................................................................................. 19 4.2. Dinoflagelados ............................................................................................................................... 21 4.3. Alexandrium spp. ........................................................................................................................... 21 4.3.1. Taxonomia e filogenia de Alexandrium ....................................................................... 22 4.4. Alexandrium minutum .................................................................................................................... 24 4.5. Alexandrium ostenfeldii .................................................................................................................. 25 4.6. Toxinas .......................................................................................................................................... 26 4.6.1. Iminas cíclicas de ação rápida ................................................................................. 28 4.6.1.1. Espirolidos ..................................................................................................... 28 4.6.2. Saxitoxinas .......................................................................................................... 29 4.6.2.1. Intoxicações paralítica causada por moluscos ........................................................ 30 5. Biossensores .......................................................................................................................................... 32 5.1. Constituintes de um biossensor ..................................................................................................... 32 5.2. História dos biossensores .............................................................................................................. 33 5.3. Tipos de biossensores.................................................................................................................... 33 5.4. Aplicações dos biossensores .......................................................................................................... 34 6. Genossensores ....................................................................................................................................... 35 7. Design do genossensor ........................................................................................................................... 36 viii 7.1. Seleção e desenho do elemento de bioreconhecimento .................................................................. 36 7.2. Seleção do elétrodo ....................................................................................................................... 37 7.3. Imobilização da cadeia simples de ADN captura ............................................................................. 37 7.3.1. Adsorção ............................................................................................................. 37 7.3.1.1. Monocamadas auto-organizadas ......................................................................... 38 7.3.2. Ligação por afinidade ............................................................................................. 39 7.3.3. Ligação covalente.................................................................................................. 39 7.4. Hibridização da cadeia complementar de ADN ............................................................................... 39 7.4.1. Estratégias de hibridização ...................................................................................... 40 7.4.1.1. Hibridização em formato “sandwich” ................................................................... 40 7.5. Deteção do sinal eletroquímico ...................................................................................................... 41 7.5.1. Voltametria .......................................................................................................... 42 7.5.1.1. Voltametria cíclica ........................................................................................... 43 7.5.1.2. Cronoamperometria ......................................................................................... 44 Capítulo 3 – Materiais e métodos .................................................................................................. 46 1. Materiais ................................................................................................................................................ 46 1.1. Design experimental ...................................................................................................................... 46 1.2. Crescimento de células .................................................................................................................. 47 1.3. Extração do material genético ........................................................................................................ 47 1.4. Amplificação do ADN ..................................................................................................................... 48 2. Reagentes............................................................................................................................................... 49 3. Sondas de ADN ...................................................................................................................................... 49 4. Procedimento experimental ..................................................................................................................... 52 4.1. Desenvolvimento do genossensor eletroquímico ............................................................................. 52 4.1.1. Pré-tratamento dos elétrodos ................................................................................... 52 4.1.2. Fase sensorial ...................................................................................................... 52 4.1.3. Hibridação em formato sandwich ............................................................................. 52 4.1.4. Deteção eletroquímica ........................................................................................... 53 4.2. Amostras reais............................................................................................................................... 54 4.2.1. Alexandrium minitum ............................................................................................. 54 4.2.2. Lingulodinium polyedrum ........................................................................................ 55 4.2.3. Células animais do epitélio oral ................................................................................ 55 4.3. Extração de ADN genómico ............................................................................................................ 55 4.3.1. Quantificação do ADN extraído ................................................................................. 56 4.4. Amplificação do ADN ..................................................................................................................... 57 4.5. Validação do genossensor eletroquímico ........................................................................................ 58 Capítulo 4 – Resultados e discussão .............................................................................................. 59 xv Lista de tabelas Tabela 1 – Técnicas de diagnostico molecular (Fonte: Biametrics, 2017). ........................................................ 7 Tabela 2 – Massa e valor dos organismos produzidos por aquacultura na EU-28, em 2015 (adaptado de European Commision, 2018). ......................................................................................................................................... 10 Tabela 3 – Principais espécies produzidas na UE, 2013 (adaptado de European Commision, 2016). ............. 10 Tabela 4 – Nome comum e científico das principais espécies cultivadas em aquacultura, por tipo de água e sistema, em Portugal....................................................................................................................................... 14 Tabela 5 – Produção derivada da aquacultura, em Portugal, entre 2000 e 2017. Valores expresso em toneladas. Informação obtida pela INE/DGRM, 2001 – 2018. .......................................................................................... 15 Tabela 6 – Número de empresas com práticas aquícolas nos diversos distritos e ilhas portuguesas. .............. 16 Tabela 7 – Cianobactérias potencialmente tóxicas (adaptado de WHO, 1999; Marques, 2006). ...................... 18 Tabela 8 – Exemplo dos impactos de alguns géneros de diatomáceas. Os nomes a negrito representam os organismos de maior risco ambiental (adaptado de Procopiak, 2006). ............................................................. 20 Tabela 9 – Classificação das toxinas mais comuns (adaptado de WHO, 1999; Hallegraeff, 2003; Codd et al., 2005; Naves, 2008; Demirel & Sukatar, 2012; Vilariño et al., 2013; Zanchett & Oliveira-Filho, 2013). .............. 27 Tabela 10 – Oligonucleotídeos utilizados no desenvolvimento do genossensor eletroquímico. ......................... 50 Tabela 11 – Primers utilizados para a amplificação da sequência de ADN de interesse. ................................. 57 Tabela 12 – Condições ótimas obtidas para a amplificação no PCR. .............................................................. 57 Tabela 13 – Variáveis analíticas otimizadas na construção do genossensor eletroquímico. ............................ 62 Tabela 13 – Variáveis analíticas otimizadas na construção do genossensor eletroquímico. Continuação. ....... 63 Tabela 14 – Valores selecionados para a construção do genossensor eletroquímico. ..................................... 68 Tabela 15 – Caracterização dos parâmetros antilíticos do genossensor desenvolvido. .................................... 70 Tabela 16 – Resultados obtidos da quantificação do ADN extraído pelo kit comercial MasterPureTM. A5 = réplica 5 das células cultivdas em meio Z8; A7 = réplica 7 das células cultivadas em meio Z8; Alg7 = amostra 7 do dinoflagelado da costa algarvia; H = amostra 1 das células do epitélio oral. Os valores apresentados resultam da média de 4 leituras no Nanodrop para a quantificação do ADN extraído. .......................................................... 71 Tabela 17 – Parâmetros analíticos testados e otimizados durante a etapa de amplificação da sequência de ADN por PCR. ......................................................................................................................................................... 72 Tabela 18 – Receita do meio de cultura f/2 (adaptado de Guillard & Ryther, 1962; Guillard, 1975). .............. 89 Tabela 19 – Receita do meio de cultura Z8. .................................................................................................. 90 Tabela 20 – Tabela completa da quantificação das amostras extraídas. Valores representam média obtida após 4 leituras. Valores a negrito indicam quais as amostras escolhidas para validar o genossensor desenvolvido. ... 92 1 Capítulo 1 – Contextualização Os resultados experimentais desta dissertação foram obtidos no laboratório de eletroquímica do Grupo de Reações e Análises Químicas|Rede de Química e Tecnologia (GRAQ|REQUIMTE), do Instituto Superior de Engenharia do Porto (ISEP) e no Centro de Investigação em Saúde e Ambiente (CISA), da Escola Superior de Saúde (ESS) do Politecnico do Porto. A dissertação está dividida em 5 capítulos, designados de 1) Contextualização, 2) Estado de arte, 3) Materiais e métodos, 4) Resultados e discussão e 5) Conclusões. 1. Enquadramento A súbita expansão demográfica no fim do século XIX levou a um aumento na procura de materiais e produtos (metalúrgicos, têxteis, alimentares, …). Dessa procura surgiram novas estratégias e tecnologias de maneira a satisfazer as necessidades populacionais (Santos, 2015). Uma das estratégias adotadas no campo da alimentação foi o desenvolvimento da aquacultura, também designada de agricultura aquática (Naylor et al., 2001). De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) das Nações Unidas, a aquacultura é a área do setor alimentar dedicada à criação e cultivo controlado de organismos aquáticos, em zonas costeiras ou continentais. Apesar dos registos históricos, que nos remete para o antigo Egito, esta atividade só se expandiu realmente nos últimos 30 anos, contribuindo atualmente por 50% do peixe disponível no mercado (Stanford University, 2009; FAO, 2018). Com uma biodiversidade atual de aproximadamente 585 espécies, a aquacultura surge então como uma das novas práticas de aumento da produção de vários organismos – peixes, crustáceos, moluscos, répteis (e.g. tartarugas e jacarés), anfíbios e até algumas plantas aquáticas, nomeadamente algas – com fins alimentares e de elevado rendimento económico (FAO, 2018). Em 2015, foram produzidas mundialmente mais de 76,6 toneladas de organismos – maioritariamente peixes – num valor aproximado de 137 mil milhões de euros (157 mil milhões de dólares), pelo que a aquacultura é considerada o setor alimentar com a maior taxa de crescimento mundial. A atração desta prática resume-se à sua acessibilidade, sendo explorada tanto por agricultores com poucos rendimentos como por empresas multinacionais – uma das razões pela qual mais de 88% da produção global deriva do Pacífico asiático (FAO, 2018). Com uma receita anual de aproximadamente 50 milhões de euros (e em crescimento) e uma produção de 10 a 11 toneladas de organismos, a aposta na aquacultura, em Portugal, é residual e relativamente recente, apesar do elevado potencial geográfico do país para a expansão desta prática. Segundo a empresa Terras D’Ouro, Portugal é o terceiro país com o maior consumo de pescado per capita a nível mundial e o primeiro a nível europeu. Este valor deve-se, sobretudo, ao consumo de bacalhau, ainda que, 70% da produção nos sistemas de aquacultura portugueses sejam de bivalves, isto é, de moluscos (Instituto Nacional de Estatística, 2014). Todavia, como qualquer outra atividade agrícola, os organismos cultivados em aquacultura também estão sujeitos a ameaças externas, tanto abióticas (tempestades marinhas, variações de temperatura, pH e salinidade das águas, entre outros) como bióticas, nomeadamente as microalgas e 2 cianobactérias responsáveis pelas florações nocivas de algas (HAB, do inglês, harmful algal bloom). Estes fatores tornam a monitorização e controlo destes sistemas imprescindíveis para uma produção mais rentável, de melhor qualidade e segura para o consumo humano, visto que a maior dificuldade na prevenção das proliferações de HAB é não saber onde, quando e a que escala ocorrerá o fenómeno nocivo. Nos últimos anos, com o aumento destes eventos nefastos e das alergias alimentares, geraramse preocupações quanto à segurança alimentar que apressaram o progresso (bio)tecnológico e a melhoria nos cuidados e higiene dos bens alimentares (El Goumi, 2017; Martín-Fernández et al., 2017; McPartlin et al., 2017). Assim sendo, os genossensores eletroquímicos – pequenos dispositivos com a capacidade de detetar, registar e converter a reação (bio)química da hibridação de duas cadeias de oligonucleotídeos complementares num sinal quantificável – surgem como uma alternativa bastante promissora (pelo seu baixo custo, capacidade de miniaturização, deteção em tempo real e fácil manuseamento) para monitorizar o aparecimento e/ou aumento da biomassa de microrganismos potencialmente perigosos nas redes hídricas naturais (rios, lagos, lagoas, etc…) ou artificiais (barragens, sistemas de aquacultura, etc…) de maneira a evitar ou, no mínimo, limitar as manifestações da HAB, pois caso um dos sistemas de aquacultura estejam contaminados, originará problemas agronómicos e ecológicos, podendo contaminar culturas inteiras ou mesmo levar à morte de toda a população produzida (Alves et al., 2016; El Goumi, 2017). 2. Motivação e objetivos O aumento dos incidentes nefastos provocados por microrganismos tem originado uma constante preocupação na população – sobretudo nas áreas da saúde e na segurança alimentar – quanto ao bem-estar e qualidade da vida humana, pelo que é necessário o desenvolvimento de dispositivos analíticos capazes de fornecer informações confiáveis e em tempo real sobre ambientes contaminados. Com o progresso tecnológico, vários campos científicos como a medicina, física, química, biologia, engenharia e (bio)tecnologia uniram-se para desenvolver técnicas e metodologias que permitem o desenvolvimento de dispositivos mais rápidos, versáteis, eficientes e de baixo custo para o diagnóstico e monitorização clínica e ambiental. Os biossensores são um dos dispositivos que surgiram dessa união, proporcionando sistemas portáteis simples, confiáveis, seletivos e de rápida deteção em comparação aos métodos analíticos convencionais (e.g. microscopia de fluorescência, reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase chain reaction), espectroscopia, hibridização in situ fluorescente (FISH, do inglês Fluorescence in situ hybridization), cromatografia, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA, do inglês Enzyme-linked immunosorbent assay), entre outros) que possuem limitações na análise dos analítos. Estas restrições podem incluir o custo e tempo do ensaio, o espaço de bancada do equipamento e a qualificação do profissional operacional, visto que cada metodologia molecular requer reagentes e equipamentos específicos que podem decorrer em mais de que um passo e necessitarem de técnicos especializados para os operar. Por exemplo, as técnicas de amplificação de ácido desoxirribonucleico (ADN) exigem locais específicos e esterilizados, assim como, um profissional qualificado para diminuir o risco de contaminação do material. O grande interesse nos biossensores advém do baixo custo de produção, à versatilidade da funcionalização das suas características – precisão, especificidade, sensibilidade, tempo de deteção e 3 manuseamento – e da sua capacidade para realizar análises in situ . Portanto, este trabalho experimental teve como finalidade o desenvolvimento e otimização de um genossensor eletroquímico – enquanto ferramenta expedita e versátil – capaz de detetar antecipadamente a contaminação de meios aquáticos, nomeadamente os sistemas de aquacultura industriais de bivalves ibéricos, por estirpes de microalgas e cianobactérias potencialmente perigosas. Para tal, serão exploradas diferentes estratégias para a construção de genossensores eletroquímicos, capazes de detetar e identificar o crescimento de populações nocivas de microalgas e cianobactérias. Assim, este trabalho teve como principal objetivo desenvolver um novo “design” capaz de detetar e quantificar o sinal elétrico resultante da hibridação das sondas complementares das microalgas dinoflageladas Alexandrium minutum para ser incorporado num genossensor eletroquímico. Para alcançar este resultado foi necessário: 1. Desenhar sequências específicas para a deteção da microalga Alexandrium minutum ; 2. Desenvolver um genossensor eletroquímico capaz de detetar as sequências de ADN escolhidas; 3. Otimizar, caracterizar e avaliar as variáveis experimentais envolvidas na construção do sensor; 4. Analisar ADN proveniente de amostras reais (amostras ambientais); 5. Validar o desempenho dos genossensores com os métodos de deteção de referência, tais como o PCR. 3. Organização da tese Capítulo 1 – Contextualização Neste capítulo descreve-se, sucintamente, a situação atual do tema da dissertação e ainda uma visão geral sobre a aquacultura, os efeitos das HAB – nomeadamente a existência de cianobactérias e microalgas nesta prática de cultivo de peixes e moluscos – e a mais valia da utilização dos genossensores eletroquímicos para a monitorização destas florações. No final, encontram-se os objetivos deste trabalho. Capítulo 2 – Estado de arte Este capítulo está dedicado aos conceitos dos elementos chave desta dissertação. O capítulo inicia-se com uma pequena introdução à HAB e a sua relevância. De seguida, descrevem-se as cianobactérias e as microalgas – especificamente as microalgas dinoflageladas Alexandrium minutum e Alexandrium ostenfeldii – e faz-se uma síntese sobre os biossensores – a sua evolução, as suas aplicações e os seus diferentes constituintes – os genossensores e as técnicas eletroquímicas de voltametria. Capítulo 3 – Materiais e métodos Nesta secção são descritos os materiais utilizados e os procedimentos experimentais efetuados ao longo de toda a atividade experimental. 4 Capítulo 4 – Resultados e discussão Este capítulo dedica-se à apresentação e discussão dos resultados obtidos em cada procedimento efetuado e nas diversas etapas do projeto, assim como as otimizações realizadas no desenvolvimento do sensor. Capítulo 5 – Conclusões O último capítulo apresenta as principais conclusões adquiridas nesta investigação e as perspetivas futuras neste tema. 5 Capítulo 2 – Estado de arte 1. Introdução A Terra tem sido o lar de milhões de microrganismos que evoluíram ao longo do tempo e, tal como os organimos macroscopicos, apresentam relações complexas e muito diversificadas, tanto para com os outros seres vivos como com o ambiente (Locey & Lennon, 2016; Walter et al., 2017). O fitoplâncton (microrganismos aquáticos fotossintéticos), por exemplo, compõe a base da teia alimentar dos seres aquáticos, contribui para a fixação de metade do carbono do planeta e, ainda, regula o ciclo dos nutrientes marinhos graças às suas interações com o zooplâncton (microrganismos aquáticos heterotróficos) (Behrenfeld & Falkowski, 1997; Falkowski et al., 1998; Bergkvist et al., 2012; Selander et al., 2015). No entanto, nem todas as relações estabelecidas são benéficas para os organismos (e.g. predação, parasitismo ou antibiose), podendo mesmo desencadear efeitos indesejados na dinâmica da teia alimentar. Um exemplo desta convivência contraprodutiva são as HAB e o seu efeito sob os organismos aquáticos e, consequentemente, no Homem. As HAB são o fenómeno (comum e de frequência crescente) resultante da rápida proliferação de microrganismos nocivos (e.g. algumas espécies de microalgas e cianobactérias) em ecossistemas aquáticos. O seu aparecimento pode prejudicar a (bio)sustentabilidade local devido às toxinas naturais que produzem, como as intoxicações por moluscos (do inglês, shellfish poisoning), ou pela acumulação de biomassa planctónica, que provoca a diminuição ou dissipação da quantidade de oxigénio (O2) da água quando se decompõe (Heisler et al., 2008; Ferris, 2016). Contudo, os impactos negativos não se limitam aos ecossistemas; os setores da saúde e da economia também são influenciados pelo aparecimento das HAB. As contaminações provocadas por estes organismos podem levar a perdas económicas significativas para as comunidades, ora pela morte dos peixes, aves e mamíferos litorais, o que leva à diminuição da atividade turística, das atividades portuárias e da pesca comercial, ora pelos prejuízos derivados da limpeza e descontaminação das águas e/ou costas e dos custos associados aos cuidados do serviço de saúde, resultado da exposição direta – quando pessoas ou animais nadam em águas contaminadas – ou indireta – pela ingestão de água, peixes ou bivalves contaminados – às toxinas produzidas (CDC, 2018). Estes eventos são facilmente reconhecidos pela coloração que conferem à água (doce, estuarina ou marinha), que varia entre verde, vermelho e castanho, dependendo da pigmentação e concentração da população de fitoplâncton – fenómeno cuja ocorrência tornou-se comum, ao longo dos anos, nas águas litorais e, como consequência, incentivou muitos investigadores a procurar e/ou identificar a razão do seu acréscimo, permitindo-nos hoje consultar uma extensa bibliografia de estudos comparativos, cuja finalidade é identificar as causas por detrás desta proliferação e desenvolver protocolos para o seu controlo (Anderson, 1989; Hallegraeff, 1993; GEOHAB, 2001; Vila et al., 2005). Portanto, para descobrir o(s) motivo(s) por detrás da expansão geográfica e aumento na frequência e intensidade das HAB e, assim, prevenir futuros riscos (como o consumo de alimentos contaminados) e prejuízos económicos e ambientais (resultante da perda massiva de seres vivos costeiros e de aquacultura, por exemplo) foram desenvolvidas ou adaptadas algumas técnicas de deteção (e.g. microscopia ótica, FISH, espectroscopia, PCR, entre outras...). 6 Na União Europeia (UE) a maioria dos métodos analíticos usam os princípios da biologia molecular – em particular, quanto à atividade e interações biológicas entre as macromoléculas – tornando os estudos genómicos e os bioensaios, testes promissores para o avanço biotecnológico, pois possibilitam a distinção entre espécies morfologicamente semelhantes e avalia os seus comportamentos e relações nos diversos ecossistemas (Pividori, et al., 2000; Subirós, 2009; Alberts et al., 2015). A tabela 1 identifica alguns dos métodos mais usuais da biologia molecular, bem como, as vantagens e desvantagens associadas a cada técnica molecular. Contudo, e apesar de abundantes, estas técnicas não são suficientes para acompanhar o crescimento da HAB, pelo que procuram-se metodologias analíticas alternativas que permitam uma deteção fiável e, ao mesmo tempo, rápida, seletiva, de custo reduzido e in situ . Deste modo, a deteção das sequências nucleicas específicas de cada organismo (de humanos, plantas, vírus e bactérias) e/ou da sua população torna-se cada vez mais imprescindível em diversas áreas científicas, cujas aplicações vão desde a deteção de doenças e organismos causadores de contaminações alimentares a investigações forenses e ambientais (Pividori, et al., 2000). Assim, os genossensores – dispositivos analíticos que detetam com elevada precisão e eficácia sequências nucleicas – são a nova aposta destes ramos científicos para a rápida deteção de HAB. 7 Tabela 1 – Técnicas de diagnostico molecular (Fonte: Biametrics, 2017). Técnicas Aplicações Sensibilidade Seletividade Vantagens Desvantagens Convencionais baseadas em células Microscopia Coloração de Gram Ensaios bioquímicos Bom a excelente Bom Baixo custo; Fornece dados quantitativos e qualitativos Amostras têm de ser colhidas em ambientes artificiais; Trabalho intensivo e demorado Imunológicas ELISA Ensaios sorológicos Microensaios Moderado a bom Moderado a bom Rápido; Barato; Fácil de operar; Fornece dados quantitativos e qualificativos; alto rendimento Apresenta limite mínimo de deteção; Dificuldades em gerar anticorpos seletivos Baseadas em ácidos nucleicos PCR Excelente Excelente Rápido; Fácil de operar; funciona com reduzido número de amostras ou a baixas concentrações; fornece dados quantitativos e qualificativos Não deteta espécies desconhecidas; Reduzida capacidade para a multiplexagem Sequenciação Bom a excelente Excelente Providencia informação detalhada e imparcial; indica novas espécies Apresenta limite mínimo de deteção; Dispendioso e demorado Microensaios de ADN/ARN Bom Excelente Fácil de utilizar; Alto rendimento Apresenta limite mínimo de deteção; Espécies desconhecidas não podem ser detetadas; Ligeiramente dispendioso e demorado Hibridação Moderada a bom Excelente Rápido; Fácil de utilizar Necessidade de pré-cultivar as amostras/organismos; Apresenta limite mínimo de deteção e um limite máximo de sondas Espécies desconhecidas não são detetadas Outros Espetroscopia Bom Bom Alto rendimento; Rápido; Gera espetros interpretáveis; Reduzido custo Apresenta limite mínimo de deteção; Pode ocorre sobreposição de amostras no espetro; Investimentos e manutenção iniciais dispendiosas; Não diferencia espécies semelhantes 8 50% 50% 2. Aquacultura A aquacultura (ou aquicultura) é o agro-negócio dedicado à produção de peixes e outros organismos aquáticos (e.g. algas, moluscos e crustáceos) em ambientes controlados. Segundo a direçãogeral de recursos naturais, segurança e serviços marítimos (DGRM) esta prática “consiste na criação ou cultura de organismos aquáticos, aplicando técnicas concebidas para aumentar, para além das capacidades naturais do meio, a produção dos referidos organismos”. Esta produção pode ocorrer tanto em água doce – lagoas, rios, lagos, tanques artificiais – como em águas marinhas – estuários, oceanos, mares, desde que, em pelo menos uma fase de vida destes organimsos, haja intervnção humana (Mestre, 2008; Fróis, 2016). Embora haja muitas críticas aos modos de cultivo destes organismos, o número de países e empresas com práticas de aquacultura tem aumentado nos últimos anos graças aos benefícios socioeconómicos que a atividade apresenta (e.g. criação de novos postos de trabalho, aumento dos nutrientes disponíveis no mercado, controlo do preço do pescado, etc…). Com este súbito crescimento a consciência ambiental das populações também aumentou e contribuiu para a implementação das técnicas de monitorização da segurança e controlo da qualidade na produção dos organismos, pelo que, desde 1976, a qualidade dos alimentos produzidos em aquacultura aumentou mais de 500% (FAO, 2018). Atendendo aos valores apresentados pela comissão europeia, em 2015, a China foi o país- -produtor que mais recorreu a esta atividade (figura 1), sendo responsável por 17,06% do volume total de organismos cultivados, enquanto, os 28 países da UE, em conjunto, contribuíram com apenas 1,23% para o volume total. Porém, esses 1,23% representaram uma produção de 1,3 milhões de toneladas em volume de organismos, correspondendo a uma receita de aproximadamente 4,4 mil milhões de euros (European Commision, 2018). Comparando os volumes de organismos obtidos mundialmente pelos dois métodos de captura (pesca e aquacultura) verifica-se que atualmente, perto de metade do pescado disponível no mercado tem origem em aquacultura (figura 1). Devido à reduzida adaptabilidade de Portugal à aquacultura, o seu contributo é desprezável em comparação às percentagens dos principais países-produtores. Figura 1 – Percentagem e origem dos produtos aquáticos colhidos pela pesca e aquacultura, em 2015 (adaptado de European Commision, 2018). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Aquacultura Pesca 9 Desde a implementação desta prática, a diversidade dos organismos produzidos tem aumentando, diferenciando-se hoje mais de cinco centenas de espécies produzidas nos diversos sistemas aquícolas. Dos organismos produzidos a grande predominância ainda são os peixes (de água doce e salgada), apesar de nos últimos anos haver um aumento na produção de algas, moluscos e crustáceos (figura 2). No entanto, graças à geografia da Europa, os principais organismos produzidos são os moluscos, nomeadamente os mexilhões, ostras e outros bivalves, que compõem cerca de um quarto do volume total cultivado na UE, enquanto o salmão atlântico e a truta arco-íris representam mais de um terço do valor total (figura 3). Os países europeus que mais apostam na aquacultura são o Reino Unido, a França, a Espanha, a Grécia e a Itália. A tabela 2 e 3 expressam a produção derivada de aquacultura dos 28 países da UE e os dez organismos mais cultivados em 2015, respetivamente (FAO, 2018). Figura 2 – Representação dos organismos mais cultivadas em 2016. Massa em mil toneladas de peso vivo (adaptado de Eurostat, 2018). Figura 3 – Principais organismos cultivados na União Europeia, em 2015 (adaptado de European Commision, 2018). 0 10 20 30 40 50 60 Peixe Algas Moluscos Crustáceos Outros Massa (mil toneladas) 16 Tabela 6 – Número de empresas com práticas aquícolas nos diversos distritos e ilhas portuguesas. Informação obtida no site da diretoria de empresas einforma, Portugal. Disponivel em: https://www.infoempresas.com.pt/A032_AQUICULTURA.html Figura 8 – Distribuição regional dos produtos de aquacultura em Portugal, em 2012 (adaptado do DGRM, 2014). Aveiro 71 Ilha de São Miguel (Ponta Delgada) 2 Beja 11 Ilha da Terceira (Angra do Heroísmo) 2 Braga 14 Leiria 28 Bragança 7 Lisboa 80 Castelo Branco 9 Portalegre 2 Coimbra 36 Porto 24 Évora 2 Santarém 13 Faro 632 Setúbal 104 Guarda 5 Viana do Castelo 20 Ilha da Madeira (Funchal) 10 Vila real 1 Ilha de São Jorge (Angra do Heroísmo) 1 Viseu 7 17 3. Cianobactérias As cianobactérias (também conhecidas por “microalgas azuis” ou cianófitas) compõem um conjunto de procariontes fotossintéticos que emergiram há cerca de 3,5 mil milhões de anos, evoluindo até à data para um dos filos mais diversificados e dispersos no mundo (Schirrmeister et al., 2011; Walter et al., 2017). Estes organismos habitam predominantemente em sistemas aquáticos de água doce (onde compõem o fitoplâncton), mas também podem habitar ecossistemas marinhos e salobros (ambientes estuarinos e/ou costeiros onde a água doce se mistura com a água salgada), pois são capazes de tolerar elevadas pressões osmóticas, assim como, condições hipertérmicas, alguns mesmo por extensos períodos de tempo. Recentemente, as cianobactérias têm surgido em sistemas terrestres, em particular em lagos e águas superficiais, representando uma potencial ameaça para a saúde pública (Berger et al., 2008). As cianobactérias podem ser fotossintéticas unicelulares ou multicelulares, simbióticas, tóxicas ou predadoras e ainda apresentam características metabólicas (são capazes de fixar nitrogénio) e uma pigmentação azul-esverdeado (ciano) semelhantes às algas eucarióticas. Para além de produzirem O2, tal como as plantas e algas eucarióticas, algumas cianófitas enriquecem os solos com compostos orgânicos, prevenindo a sua erosão – função extremamente importante no meio ambiente (Pelczar et al., 1986; Prescott et al., 1999; Tortora et al., 2001). Porém, nem todas apresentam benefícios para o ambiente. Algumas dessas espécies são capazes de produzir toxinas, designadas de cianotoxinas. Estas toxinas são um mecanismo de defesa das cianobactérias contra predadores. À semelhança das microalgas, em condições ideais – elevadas concentrações de nitratos e fosfatos, temperaturas elevadas e uma ampla disponibilidade de luz – as cianobactérias reproduzem-se descontroladamente, causando as florações, que estão frequentemente relacionadas com processos de eutrofização. A proliferação das cianobactérias e, consequentemente, das cianotoxinas na água representam um risco de grau incerto para a sustentabilidade ecológica, económica e para a própria saúde pública, pois proliferam durante todo o ano, com maior intensidade no verão, em vários regimes aquáticos – rios, albufeiras e lagos de norte a sul do país – e com uma tendência acrescida para o seu aparecimento (Berger et. al., 2008; Paerl & Paul, 2012). A tabela 7 indica as citotoxinas produzidas por alguns géneros encontrados nas diferentes ordens de cianobactérias, assim como a morfologia característica de cada ordem. Os sintomas da ingestão destas toxinas podem variar muito e vão desde simples irritações na pele e gastrointestinais até, eventualmente, doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica derivada das neurotoxinas β-metilamina-L-alanina, BMAA) ou mesmo resultar na morte do individuo (Berger et al., 2008; Paerl & Paul, 2012). 18 Tabela 7 – Cianobactérias potencialmente tóxicas (adaptado de WHO, 1999; Marques, 2006). Ordem Morfologia básica Géneros * característicos Toxinas características Chroococcales Unicelulares/Coloniais Aphanocaspa Eucapsis Gloeobacter Hydrococcus Merismopedia Microcystis Placoma Radaisia Microcistinas Saxitoxinas Lipopolisacaridos Oscillatoriales Filamentosas Anabaenopsis Aphanizomenon Lyngbya Oscillatoria Planktothrix; Pseudanabaena Schizothrix Yonedaella Microcistinas Lipopolisacaridos Lingbiatoxina Cilindrospermopsinas Nostocales Filamentosas Anabaena Anabaenopsis Cylindrospermopsis Dolichospermum Nodularia Nostoc Rhaphidiopsis Wollea Anatoxinas Cilindrospermopsinas Microcistinas Nodularinas Saxitoxinas Lipopolisacaridos Neosaxitoxinas GTX3 Stigonematales Filamentosas ramificadas Baradlaia Chlorogloeopsis Desmosiphon Fischerella Stigonema Symphyonemopsis Thalpophila Umezakia Lipopolisacaridos * Nem todas as cianobactérias mencionadas apresentam toxinas. 4. Microalgas As microalgas representam um conjunto de organismos aquáticos unicelulares ou multicelular simples cujas células compreendem tamanhos entre 2 e 200 μm, capazes de converter a luz solar em energia química através da fotossíntese. Este processo é essencial para a preservação da vida na Terra pois, para além de constituírem a base da teia alimentar, produzem O2, consumindo, ao mesmo tempo, dióxido de carbono (CO2) (Chapman, 2010; Alaswad et al., 2015). Muitas destas aparecem como células únicas (ou seja, são unicelulares), outras formam cadeias (filamentosas) ou talos (corpo vegetativo de uma alga multicelular) e ainda podem ser endofiticas, isto é, vivem no interior de outros organismos – 19 tais como protozoários, moluscos, esponjas e corais – como endossimbióticos ou associados a fungos para formar líquenes. No entanto, estas algas são todas eucariontes fotossintéticas que não possuem tecidos vegetais (e.g. raízes, caule e folhas) (Pelczar et al., 1986; Prescott et al., 1999; Tortora et al., 2001). Estes organismos podem ainda ser autotróficos ou heterotróficos e são capazes de se reproduzir rapidamente, originando grandes aglomerados de biomassa em diversos ecossistemas aquáticos e possibilitando a sua sobrevivência sob condições e regimes rigorosos. Esta resiliência deve-se à sua estrutura celular simples que, num meio aquoso, facilita o seu acesso à água, CO2 e a outros nutrientes para realizarem a fotossíntese (Mata et al., 2010; John et al., 2011; Alaswad et al., 2015; VelazquezLucio et al., 2018). Portanto, as microalgas são seres complexos, apesar da simplicidade da sua estrutura (Tomaselli, 1997). Em geral, as microalgas são taxonomicamente classificadas com base no tipo de pigmentos, reprodução, flagelos e material de armazenamento, bem como pela sua estrutura, morfologia celular (parede e arranjo celular) e habitat. A sua reprodução pode ser assexuada ou sexuada e ainda podem possuir flagelos, mas todas encontram meios de mobilidade e possuem pigmentos lipossolúveis – clorofila (existente em todas as algas) e carotenoides (carotenos e xantofilas) – e algumas possuem pigmentos hidrossolúveis, as ficobilinas (ficobiliproteínas). Tais pigmentos são responsáveis pela coloração encontrada nas algas (Pelczar et al., 1986; Prescott et al., 1999; Tortora et al., 2001). As microalgas podem ocupar diferentes níveis tróficos, principalmente com base na autotrofia e heterotrofia. As possíveis vias nutricionais destes seres são a fotoautotrofia (obrigatória ou facultativa), fotoheterotrofia, auxotrofia e mixotrofia. Sob o crescimento mixotrófico, uma mudança definitiva entre autotrofia e heterotrofia não ocorre, exceto na ausência de luz (Grobbelaar, 2004; Brennan & Owende, 2010). Os dois principais grupos de microalgas são as diatomáceas e os dinoflagelado (CDC, 2018). Neste caso, foi estudado uma espécie de dinoflagelados do género Alexandrium conhecida pelas suas toxinas marinhas e que frequentemente se agregam para formar os eventos de HAB ao longo das costas mediterrânicas e atlânticas. 4.1. Diatomáceas Diatomáceas são pequenas algas fotossintéticas unicelulares, revestidas por uma camada silicatada designada frústula (Gross, 2012; Uthappa et al., 2018). Muito biodiversas as diatomáceas, cujos tamanhos variam entre os 10 – 200 µm de diâmetro, constituem um dos, senão o, grupo de fitoplâncton mais relevantes, pois constituem a base da teia alimentar de muitos ecossistemas aquáticos – contribuem para 45% da produção primária marinha e 25% da produção global total – e, ainda, são um dos principais intervenientes na (bio)reciclagem de carbono, nitrogénio, fosfato e sílica (Werner, 1977; Mann, 1999; Sarthou et al., 2005; Bates & Trainer, 2006). As diatomáceas encontram-se frequentemente em regimes costeiras, onde a atividade humana é mais significativa, porque requerem locais luminosos e ricos em nutrientes (e.g. carbono, nitrogénio, fosfato e sílica) para crescerem/proliferarem, bem como águas turbulentas para se manter em suspensão. A maioria destes organismos são considerados benignos, porém existem espécies conhecidos por causar danos ora pela depleção de O2 local ora pela produção da neurotoxina ácido 20 domoíco (AD). A primeira espécie conhecida por produzir AD pertence ao género Pseudo-nitzschia (Bates & Trainer, 2006). Até à data foram registadas mais de dez mil espécies de diatomáceas (5,500 vivas e 4,500 fósseis, aproximadamente). A tabela 8 exemplifica os principais géneros (e a respetiva ordem) das famílias de diatomáceas que apresentam um risco ecológico. Tabela 8 – Exemplo dos impactos de alguns géneros de diatomáceas. Os nomes a negrito representam os organismos de maior risco ambiental (adaptado de Procopiak, 2006). Ordem Família Exemplo de géneros vivos Impacto Thalassiosirales Lauderiaceae Skeletonemataceae Thalassiosiraceae Trochosiraceae Schroedrella; Skeletonema; Skeletonemopsis Coloração das águas Intoxicação de organismos filtradores Coscinodiscales Aulacodiscaceae Coscinodiscaceae Heliopeltaceae Hemidiscaceae Hemipeltaceae Lobodisceae Rocellaceae Coscinodiscopsis; Cymatodiscus; Haynaladella; Kozloviella; Microsolenia; Palmeria; Phacodiscus; Stoschia; Symbolophora; Veniaminia Intoxicação de organismos filtradores Depleção do O2 da água Hemiaulales Hemiaulaceae Isthmiaceae Sheshukoviaceae Ailuretta; Arcus; Baxteriopsis; Bonea; Cerataulina; Climacodium; Dextradonator; Monile; Pseudorutilaria; Rymaiopsis; Sphynctolethus; Syringidium; Trinacria Intoxicação de organismos filtradores Depleção do O2 da água Chaetocerotales Chaetocerataceae Acanthoceras; Bacteriastrum; Chaetoceros; Chasea; Dossetia; Epithelion; Hercotheca; Monoceros; Periptera; Syndendrium Intoxicação de organismos filtradores Leptocylindraceae Leptocylindrus; Tenuicylindrus Fragilariales Fragilariaceae Staurosiraceae Asteroplanus; Brandinia; Ceratoneis; Desikaneis; Fossula; Fragilariforma; Frankophila; Gedaniella; Hyaloneis; Koernerrella; Martyana; Neofragilaria; Odontidium; Pseudoeunotia; Pteroncola; Rimoneis; Syrinx Thalassiophysales Catenulaceae Thalassiophysaceae Amphora; Catenula Potencialmente toxicas Bacillariales Bacillariaceae Bracillariales incetae sedis Allonitzschia; Alveus; Bacillaria; Cylindrotheca; Cymatonitzschia; Denticula; Fragilariopsis; Giffenia; Grunowia; Hantzschia; Mediaria; Nitzschia; Perrya; Pseudo-nitzschia; Sigmatella; Simonsenia; Trybilonella Produção de toxinas Fonte: http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/ 21 4.2. Dinoflagelados Um dinoflagelado é constituído por uma célula com dois flagelos diferentes e/ou possuem um dinocarion – núcleo único, em que os cromossomas se mantêm condensados e visíveis durante a mitose (Sousa et al., 1999). Atendendo a esta definição, estima-se que 75% a 80% das espécies planctónicas são dinoflagelados (Cembella, 2003). Estes organismos incluem-se no reino Protista, divisão Dinoflagellata e encontram-se, marioritariamente, em ambientes aquáticos (e.g. marinhos, estuarinos, continentais, bentónicos e em glaciares marinhos). Aproximadamente metade são fotossintéticos autotróficos, enquanto a outra metade são heterotróficos e alimentam-se via osmotrofia ou fagotrofia, atuando como predadores, endosimbiontes ou parasitas, pelo que são um dos constituintes mais importantes do fitoplâncton marinhos e de água doce (Gaines & Elbrächter 1987; Sousa et al., 1999; New World Encyclopedia, 2008). Estes seres geralmente vivem isolados, pois a maioria são células móveis devido aos seus flagelos capazes de locomoção, mas, por vezes, formam colónias. Morfologicamente, são organismos bastante diversos, complexos e com múltiplos organelos especializados. As suas células têm dimensões compreendidas entre os 5 e 100 μm, apesar de existirem espécies registadas com 2 mm de diâmetro (Sousa et al., 1999). Os seus géneros mais conhecidos são Alexandrium , Gonyaulax e Gymnodium e as suas toxinas são das biotoxinas mais potentes, pelo que estes organismos são os principais constituintes das HAB, cujas consequências já foram descritas. 4.3. Alexandrium spp. De entre todos os organismos responsáveis pelas HAB, os dinoflagelados do género Alexandrium são, indiscutivelmente, dos mais importantes e mais estudados graças à sua ampla diversidade e distribuição (que se tem expandido nos últimos anos), assim como, pela gravidade dos surtos de intoxicação causados pelas neurotoxinas excretadas por estes dinoflagelados (Anderson et al., 2012; Fabro et al., 2017). A capacidade destes procariontes colonizar diferentes e extensas regiões (águas polares, temperadas ou subtropicais) evidencia a sua adaptabilidade e resiliência e, com mais de 30 espécies morfologicamente definidas, algumas das quais produtoras de toxinas ou provocam efeitos nocivos sob a fauna e flora local, este género desempenha um enorme papel nas teias alimentares aquáticas e ecológicas, constituindo, portanto, uma ameaça para o ambiente – contaminação de águas e de organismos aquáticos – assim como para a saúde pública – intoxicações por exposição direta ou indireta às suas neurotoxinas (Sournia, 1995; Anderson et al., 2012; Fabro et al., 2017). As neurotoxinas produzidas pelas diferentes espécies de Alexandrium são particularmente interessantes, pois este é o único género de microalgas que produz toxinas do tipo saxitoxinas (STX) – toxinas com poder analgésico, responsáveis pelos surtos de intoxicação paralítica causada por moluscos (PSP, do inglês paralytic shellfish poisoning) (Fabro et al., 2017). Todavia, a diversidade toxigénica não se limita às STX. As Alexandrium spp . segregam toxinas de três famílias diferentes – saxitoxinas, espirolidos e goniodomios – característica peculiar deste género (Anderson et al., 2012). 22 Apesar da sua vasta distribuição global, a taxa de crescimento das Alexandrium spp. normalmente não é rápida, pelo que, quando distribuídas numa maior escala espacial (inferior a 100 km), coexistem numa percentagem moderada de biomassa em conjunto com outras espécies, tendo o fenómeno uma duração de dias ou, em certos casos, semanas (Anderson et al., 2012). 4.3.1. Taxonomia e filogenia de Alexandrium O género Alexandrium foi formalmente estabelecido com a descrição da espécie Alexandrium minutum por Halim em 1960 (Halim, 1960). No entanto, as tentativas para definir as diversas espécies dentro deste género nem sempre foram bem-sucedidas, tendo muitas delas sido incluídas originalmente noutros géneros como o Gonyaulax, Protogonyaulax, Gessnerium, Goniodoma e Pirodinium (Balech & Tangen, 1985; Anderson et al., 2012; John et al., 2014; Fabro et al., 2017). A dificuldade na classificação taxonómica e na identificação destas espécies deve-se à variabilidade de caracteres distintivos que cada uma apresenta (Balech & Tangen, 1985; Anderson et al., 2012). Do ponto de vista morfológico, as espécies do género Alexandrium são bastante homogéneas, pelo que para uma análise detalhada e correta identificação das espécies deste género são consideradas várias características tais como o tamanho e forma da célula, a formação de cadeias, a orientação das placas tecais, a forma do complexo de poros apicais, a posição da primeira placa apical (1’), a presença/ausência do poro ventral, entre outros (Balech 1995; Gu et al., 2013; John et al., 2014; Fabro et al., 2017). Geralmente, estes seres aparentam-se como pequenas a médias células (entre 17 a 54 μm) ovais ou elípticas sem espinhos. A placa apical do poro é grande, os seus sulcos rasos e as paredes tecais finas. Algumas ainda apresentam um reticulo muito fraco, irregular e incompleto na placa sulcal posterior e 1’ (Balech, 1989). A figura 9 ilustra as diferenças entre algumas das espécies do género Alexandrium . Com o avanço das técnicas moleculares, a classificação de espécies de Alexandrium foram revistos por vários autores (Anderson et al. 2012; Fabro et al., 2017). Estas análises estabeleceram (segundo as análises às sequências parciais do gene da grande subunidade ribossomal (LSUrADN do inglês large subunit ribossomal DNA)) três complexos de espécies: o complexo Alexandrium ostenfeldii , o complexo Alexandrium minutum e o complexo Alexandrium tamarense , esboçado na figura 10 (John et al., 2003a, Lilly et al., 2005; Lilly et al., 2007; Anderson et al., 2012; Fabro et al., 2017). Cada complexo estabelecido pode ainda ser dividido em grupos, compostos por espécies geneticamente semelhantes. Figura 9 – Comparação morfológica entre algumas espécies do género Alexandrium , incluindo as espécies Alexandrium minutum e Alexandrium ostenfeldii (extraído de Nézan et al., 2010). 23 Figura 10 – Árvore filogenética construída a partir das análises de proximidade do rAND da grande subunidade ribossomal (LSU) das espécies do género Alexandrium . Os estudos filogenéticos foram realizados por PhyML no programa Geneious 5.4.4 descrito em (Guindon & Gascuel, 2003). Os círculos verde, azul e laranja salientam os complexos Alexandrium ostenfeldii , Alexandrium minutum e Alexandrium tamarense , respetivamente (adaptado de Lilly et al., 2005; Anderson et al., 2012). 24 4.4. Alexandrium minutum Alexandrium minutum é uma das espécies tóxicas do género Alexandrium que podem originar eventos nocivos de PSP. Esta espécie (descrita, em 1960, após a contaminação das águas portuárias de Alexandria (Egito)) apresenta-se como um pequeno dinoflagelado blindado que possui uma distribuição alargada (figura 11) ao longo de vários regimes costeiros enriquecidos – portos, estuários ou lagoas – sobretudo, nas costas mediterrânias (Halim, 1960; Hallegraef et al., 1988; Belin, 1993; Giacobbe & Maimone, 1994; Tahri-Joutei et al., 2000; Maguer et al., 2000; Yoshida et al., 2000; Vila et al., 2001; Yahia et al., 2001; Usup et al., 2002; Vila et al., 2005). A. minutum é uma espécie fotossintética de vida livre e com um núcleo elíptico, cujas características morfológicas encontram-se bem descrita no trabalho de Balech (1995). Normalmente, reproduz-se assexuadamente por fissão binária, mas também possui um ciclo de reprodução sexuada, do qual resulta um cisto (Balech, 1989; Hallegraeff, 1991; Balech, 1995; Taylor et al., 1995; Steidinger & Tangen, 1996; Hwang et al., 1999). Como se observa na figura 12, A. minutum é uma célula esférica ou ligeiramente elipsoidal, com paredes tecais finas, algumas ornamentadas com pequenos poros espaçados entre si e um único poro ventral na 1’. Figura 11 – Distribuição das microalgas Alexandrium minutum (extraído de Lewis et al., 2018) 25 Figura 12 – Imagens de Alexandrium minutum ao microscópio eletrónico de varrimento. Setas evidenciam (A) o núcleo elíptico e (D) o poro ventral na primeira placa apical (extraído de Hansen et al., 2003). 4.5. Alexandrium ostenfeldii Alexandrium ostenfeldii é um dinoflagelado blindado tóxico com uma larga distribuição geográfica em litorais de águas temperadas ou frias por todo o mundo. Esta espécie foi primeiro descrita, em 1904, na costa da Islândia, mas habita preferencialmente na costa oeste da Europa, nomeadamente as costas espanholas (Braarud, 1945; Balech & Tangen, 1985; Fraga & Sánchez, 1985; Moestrup & Hansen, 1988; John et al., 2003b; Kremp et al., 2009; Smithsonian Institute, 2017). A. ostenfeldii é conhecida por ser a espécie menos toxica de todos as Alexandrium spp. e pela sua natureza mixotrofica (isto é, podem tanto ser autotróficas como heterotrófica), assim como, pelas interações aleloquímicas que estabelecem com outros procariontes (Jacobson & Anderson, 1996; Hansen et al., 1992; Gribble et al., 2005; Tillmann et al., 2007). Morfologicamente são indivíduos singulares (i.e., possuem uma única célula) de tamanho médio (entre 35 a 50 μm de diâmetro), mas podem aparecer em colónia de duas células. As suas paredes tecais são finas com alguns pequenos poros irregularmente distribuídos e um único poro ventral na 1’. Essas paredes ainda são revestidas por uma camada de muco (mucilagem) e o seu núcleo, em forma de U, dispõe-se na região equatorial da célula (Balech & Tangen, 1985; Larsen & Moestrup, 1989; Konovalova, 1993; Balech, 1995; Taylor et al., 1995; Mackenzie et al., 1996; Steidinger & Tangen, 1996; Jensen & Moestrup, 1997). A reprodução é assexuada, habitualmente por fissão binária, mas também possui um ciclo de reprodução isogâmica – reprodução sexuada que envolve a fusão de gametas morfologicamente semelhantes – da qual resulta um zigoto móvel devido ao flagelo (Jensen & Moestrup, 1997; Dusenbery, 2009). As figuras 13 e 14 representam algumas das caraterísticas morfológicas referidas anteriormente. 32 5. Biossensores Biossensores são dispositivos analíticos capazes de reconhecer e converter as reações (bio)químicas de moléculas biológicas – normalmente enzimas, anticorpos, peptídeos, ácidos nucleicos, entre outros – ou mesmo por microrganismos e células inteiras, designado elemento de bioreconhecimento ou biorrecetor, num sinal mensurável, obtendo-se informações semiou quantitativas do meio (Theâvenot et al., 1999; Nascimento et al., 2012; Hayat et al., 2014; Sin et al., 2014; Bhalla et al., 2016). O princípio fundamental de um biossensor baseia-se na conversão de uma resposta analítica, obtida através das ações biologicas de varias substâncias, num signal quantificável. Para tal, o analíto liga-se ao biorrecetor imobilizado, por metódos convencionais (lgações covalentes, não-covalentes ou adsorção física) ao elétrodo, o que produz uma resposta eletronica que é convertido num sinal elétrico, amplificado e depois quantificado. Os sinais obtidos são registados e transferidos para um dispositivo de armazenamento de dados e, posteriormente, processados (Grieshaber et al., 2008; Hayat & Marty, 2014a). O desempenho do biossensor depende maioritariamente da sua especificidade e sensibilidade à reação biológica, além da estabilidade da biomolécula. A vantagem destes dispositivos, em relação a todas as outras técnicas de deteção é que podem ser miniaturizados, permitindo análises em tempo real e in situ , para além de serem mais sensíveis, seletivos, fáceis de manusear e sem a necessidade de pessoal especializado (Luz et al., 2013; Alves et al., 2016; Malhotra et al., 2017). 5.1. Constituintes de um biossensor Os biossensores são constituídos essencialmente por uma componente biológica – o sistema de reconhecimento molecular – o transdutor e a unidade processadora de sinal, conforme o esquema da figura 19 (Lee et al., 2008; Bhalla et al., 2016). A finalidade destes sensores é identificar/quantificar um analíto com o mínimo de intervenção humana. A componente biológica corresponde ao analíto – substância de interesse a detetar (e.g. glucose, sangue, urina, etc.…) – e ao biorecetor – molécula que reconhece especificamente o analíto (e.g. enzimas, células, aptâmeros, ADN e anticorpos). O processo de aquisição de sinal (sob a forma de luz, calor ou variação de pH, carga, massa, etc.), é designado de bioreconhecimento e resulta da interação dos biorecetores com os analítos, visto que esses reagentes são imobilizados no sistema (Pathak et al., 2007; Chambers et al., 2008; Lee et al., 2008; Bhalla et al., 2016). O transdutor funciona como uma interface, pois é o segmento de um biosensor que converte (medindo as variações físicas ou químicas que ocorrem durante a interação entre o analíto com o biorreceptor) o evento do bioreconhecimento num sinal (de massa, carga, calor ou luz) mensurável – processo conhecido como sinalização. A maioria dos transdutores produzem sinais óticos ou elétricos que geralmente são proporcionais à concentração de analíto. Enquanto a unidade processadora atua como um detetor que filtra, amplia e analisa o sinal obtido (pelo transdutor). Esta unidade é composta por circuitos eletrónicos complexos que convertem o sinal análogo num digital e, posteriormente, o transfere para um monitor ou armazena-no no computador (Raiteri et al., 2002; Pathak et al., 2007; Bhalla et al., 2016). 33 Figura 19 – Esquema de um biossensor (adaptado de Bhalla et al., 2016). 5.2. História dos biossensores O conceito de biossensor não é recente. Há anos que os biossensores têm sido estudados como uma técnica alternativa aos métodos tradicionais (e.g. microscopia de fluorescência, FISH, espectroscopia, cromatografia, PCR, biologia molecular, etc…) para a análise de analítos (Nascimento et al., 2012; Hayat et al., 2014; Bhalla et al., 2016). O primeiro biossensor comercial foi desenvolvido em 1975, pela empresa Yellow Spring Instruments. Porém, antes da sua construção foram propostas e testadas os princípios por detrás destes dispositivos. Estes fundamentos remetem-nos para 1906 quando M. Cremer demonstrou que a concentração de um ácido num líquido é proporcional ao potencial elétrico que surge entre partes do fluido localizado em lados opostos numa membrana de vidro e 1922 quando Griffin e Nelson imobilizaram enzimas invertidas sob hidróxido de aluminio e carvão (Cremer, 1906; Griffin & Nelson, 1916; Nelson & Griffin, 1916; Bhalla et al., 2016). No entanto, o primeiro “verdadeiro” biossensor só foi desenvolvido em 1956 por L.C. Clark, Jr. com a finalidade de detetar O2 (Heineman & Jensen, 2006). A partir desta data e com o desenvolvimento das novas tecnologias foram construídos e otimizados inúmeros sensores com diversos fins, pois para além de proporcionaram melhores meios para o diagnóstico clínico, não só pela especificidade na deteção do evento, como também, pela sua rapidez na tradução do sinal, este dispositivos apresentam ainda uma maior versatilidade e sensibilidade na tradução dos eventos e sinais (Alves et al., 2016; Bhalla et al., 2016). 5.3. Tipos de biossensores Ao longo dos anos, foram desenvolvidos vários tipos de biossensores, todos eles com fins muito variáveis, podendo-se considerar três grandes grupos conforme o transdutor utilizado: os biossensores (i) óticos, (ii) eletroquímicos e (iii) piezoelétricos (ou de massa), como se verifica na figura 20. Analito Transdutor Amplificador Visor Biorecetor 2.67 mV Luz Calor ∆ pH ∆ de massa Conversão do sinal análogo a digital Conve rsão do sinal Sinal proc essa do Enzimas Células Aptâmero ADN NPs Proteínas Bio-reconhecimento Sinalização Quantificação 34 Dentro destes três grupos de transdutores, o eletroquímico é o mais atraente para a monitorização e diagnósticos clínicos, devido ao seu reduzido/moderado custo, à simplicidade, estabilidade, alta sensibilidade e portabilidade (Gaua et al., 2005; Song et al., 2006). Figura 20 – Classificação do biossensor segundo os transdutores (adaptado de Malhotra et al., 2017). 5.4. Aplicações dos biossensores Com o desenvolvimento de novas tecnologias e materiais surgiram novos métodos de funcionalização e miniaturização de componentes, o que permitiu a criação de dispositivos mais complexos e sensíveis com uma grande variedade de aplicações em diversas áreas – monitorização ambiental, deteção de doenças, segurança alimentar, análise e desenvolvimento de fármacos, entre outros – todas elas dedicadas a melhorar a qualidade da vida humana (Van Dorst et al., 2010; Monteiro, et al., 2011; Sharma et al., 2015; Bhalla et al., 2016). O exemplo mais comum é a utilização de biossensores de glucose para monitorizar os níveis glicémicos dos diabéticos, mas o mercado tem expandido e possibilitado a utilização de biossensores no processamento industrial. Por exemplo, na segurança alimentar os biossensores podem servir de plataformas para avaliar a qualidade, validade e valor nutricional de alimentos (Bhalla et al., 2016; Malhotra et al., 2017). Biossensores De massa Magnetoelétrico Piezoelétrico QCM SAW Eletroquímico Potenciométrico Amperométrico Condutimétrico Ótico RAMAN FRET SPR Outrod 35 Todavia, a área da saúde é o setor em que os biossensores são mais aplicados, sendo a deteção de biomoléculas como indicador de doenças ou alvos para fármacos. As técnicas eletroquímicas são um ótimo exemplo da utilização de biossensores para o diagnostico clínico (Formisano et al., 2015; Jolly et al., 2015a; Jolly et al., 2015b; Bhalla et al., 2016). 6. Genossensores Genossensores (também conhecidos por biossensores de ADN) são dispositivos analíticos que detetam, com uma elevada eficiência e especificidade, a sequência alvo durante a reação de hibridação entre duas cadeias polinucleotídicas complementares (Teles & Fonseca, 2008; Tosar et al., 2010; Palecek & Bartosík, 2012; Alves et al., 2016). Estes aparelhos são adequados para realizar diagnósticos clínicos e ambientais e ainda servem como plataformas multiplexas para a análise de ácidos nucleicos de uma forma rápida, simples e de baixo custo (Tosar et al., 2010). No início do século XXI, os genossensores prometem ser uma ferramenta eficaz para a obtenção de informações específicas da sequência analisada, em comparação aos métodos tradicionais de hibridização, contribuindo para a revolução tecnológica na área da saúde (Wang, 2000b; Tosar et al., 2010). Os métodos convencionais para a análise de genes específicos são realizados ora por sequenciação direta ou através de hibridização de ADN, porém, devido à sua simplicidade, a utilização das reações de hibridação são preferidas para o diagnóstico clínico. Neste caso, uma das sequências de ADN atua como uma “sonda de captura” capaz de reconhecer seletivamente uma cadeia de ácido ribonucleico (ARN) ou ADN complementar, pelo que a especificidade do genossensor é inteiramente dependente das propriedades do elemento de bioreconhecimento (Bora et al., 2013; Alves et al., 2016). Segundo o relatório de 2010 da União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), as moléculas de ADN, ARN e ácido nucleico peptídico (ANP) – todos eles aptâmeros de ácidos nucleicos – que podem atuar como o elemento de bioreconhecimento. Contudo, entre estas três moléculas, o aptâmero de ADN apresenta uma cadeia mais simples é altamente reprodutível, tem maior estabilidade quando exposta a uma larga variedade de condições/parâmetros pois possuem uma maior resistência à desnaturação e de fácil síntese. Para além da sua elevada estabilidade, os aptâmeros também apresentam uma maior afinidade e especificidade por ligandos – como os iões e pequenas moléculas – que não são reconhecidos por outros elementos de bioreconhecimento (Labuda et al., 2010; Palecek & Bartosík, 2012; Bora et al., 2013). A versatilidade das técnicas eletroquímicas facilita tanto a análise estrutural dos ácidos nucleicos bem como a sua deteção a baixas concentrações (Palecek & Bartosík, 2012). Nesse sentido, o registo analítico do sinal eletroquímico pode ocorrer de duas maneiras: (i) pela medição direta da resposta elétrica das cadeias de ADN ou (ii) pela monitorização dos compostos (indicadores ou intercaladores redox) unidos à dupla hélice do ADN (Pedrero et al., 2011). Assim, a construção e desenho de um genossensor eletroquímico envolve essencialmente cinco etapas: (i) a seleção e desenho de sequências específicas de ADN, (ii) a seleção do elétrodo, (iii) a imobilização da sonda de ADN de captura, (iv) a hibridação da cadeia complementar de ADN e a (v) a deteção do sinal eletroquímico (Pividori et al., 2000; Lucarelli et al., 2004). 36 A figura 21 exemplifica o esquema geral dos passos necessários para a montagem de um genossensor. Figura 21 – Esquema geral da montagem de um genossensor. (i) imobilização da sonda de ADN numa superfície metálica; (ii) hibridização da cadeia complementar de ADN; (iii) deteção do sinal (adaptado de Manzanares-Palenzuela et al., 2015). 7. Design do genossensor Para construir um genossensor eletroquímico capaz de detetar e identificar as microalgas e cianobactérias existentes nas águas de aquacultura são necessárias várias etapas laboratoriais. 7.1. Seleção e desenho do elemento de bioreconhecimento Qualquer biossensor tem como finalidade o reconhecimento molecular. Nos genossensores os ácidos nucleicos, especialmente o ADN, são o elemento de reconhecimento. A escolha da sequência depende do fim a que se destina o sensor (quantificação, monitorização, etc…) e da espécie em estudo. Portanto, a primeira etapa consiste na seleção das sequências de ADN ou ARN características do organismo de interesse, uma vez que cada ser possui um código genético único. Contudo, para cada população, existe uma sequência de nucleótidos que é característica da sua espécie ou estirpe (Bryce & Pacini, 1998; He et al., 2007; Dahm, 2008; Ozsoz, 2012; Paniel, et al., 2013). Uma vez que imobilizar todo o ADN genómico à superfície de um elétrodo torna-se quase impossível (devido ao seu grande tamanho e aos problemas associados ao bloqueio do sinal analítico) torna-se fundamental selecionar sequências de ADN (dentro do ADN genómico) com um número de pares de bases (pb) a variar entre 70 a 120 pb que, de forma inequívoca, identifiquem o organismo pretendido, por exemplo estirpes de microalgas ou cianobactérias (Farré & Barceló, 2003). Com base nas informações disponíveis em bases de dados públicas (e.g. The National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) é possível selecionar e desenhar sequências específicas de ADN (cerca de 70 a 150 nucleótidos) que permitam a deteção seletiva de determinada estirpe de microrganismos, nomeadamente microalgas e cianobactérias (Barata, 2017). Com recurso a este tipo de bases de dados torna-se, também, possível estudar a influência do tamanho da sequência de ADN e/ou ARN e das estruturas secundárias existentes no desenho e construção dos genossensores. (i) (ii) (iii) ADN 37 Os ácidos nucleicos em forma de aptâmeros é adequado para o reconhecimento de alvos específicos ou células inteiras, enquanto as sondas de ADN de cadeia simples (ssADN) hibridizam a sequências genómicas especificas (Paniel, et al., 2013; Manzanares-Palenzuela et al., 2015). Portanto, neste trabalho, recorreu-se a ssADN para detetar a hibridização das espécies de Alexandrium . 7.2. Seleção do elétrodo Entre os transdutores eletroquímicos, os elétrodos de ouro (Au) e de carbono têm sido frequentemente aplicados no desenho dos genossensores. Os elétrodos de carbono são usados por causa do seu vasto potencial e graças à sua resistência a altas temperaturas e a produtos químicos (adquiridos quando se combina das propriedades do carbono com as da grafite). No entanto, os elétrodos de Au são os mais utilizados nos estudos e construção de genossensores, pois fornecem uma superfície mais estável para a imobilização altamente organizada de compostos tiolados, podendo originar monocamadas auto-organizadas (SAM) (Jiang et al., 2011; Mix et al., 2012; Yang et al., 2012; Sun et al., 2013; Sun et al., 2014; Bonanni et al., 2009; Manzanares-Palenzuela et al., 2015). 7.3. Imobilização da cadeia simples de ADN captura A imobilização do ADN à superfície do elétrodo é o primeiro passo para a construção de um genossensor e a mais importante para o seu bom desempenho. Dependendo do tipo de transdutor, da biomolécula em estudo e da aplicação do biossensor, os métodos utilizados para a imobilização do ADN variam, alterando também as condições e as variáveis experimentais a utilizar (Cassidy et al., 1998; Labuda et al., 2010; Ozsoz, 2012). As superfícies das plataformas dos sensores (i.e. dos elétrodos) também podem variar na sua composição. Como se referiu, as mais usuais são as superfícies de carbono (nomeadamente as de grafite) e as de Au que, normalmente, são modificadas com nanomateriais (nanotubos de carbono) ou nanopartículas (NP) de Au para aumentar a seletividade e sensibilidade da metodologia (Labuda et al., 2010; Ozsoz, 2012). Alguns dos métodos desenvolvidos para a imobilização da sonda sobre a superfície do elétrodo são a: (i) adsorção (física ou química); (ii) a ligação por afinidade e (iii) ligação covalente (Labuda et al., 2010; Ozsoz, 2012). 7.3.1. Adsorção A adsorção é o método mais simples para a imobilização das sequências nucleicas sob as superfícies das plataformas. Esta técnica não requer reagentes nem modificações específicas ou complexas aos ácidos nucleicos para a sua fixação. As desvantagens associadas a este método são a probabilidade de os ácidos nucleicos desorganizarem-se durante a hibridização e a absorção a múltiplos locais no elétrodo, o que diminui a eficiência do processo (Rasmussen et al., 1991; Pividori et al., 2000; Ozsos, 2012). 38 7.3.1.1. Monocamadas auto-organizadas Quase todas as superfícies podem ser imobilizadas com monocamadas funcionalizadas que possuem as propriedades elétricas, óticas ou químicas específicas e necessárias para a deteção dos biorectores em estudo. Uma monocamada ideal foi descrita como cadeias alcalinas perfeitamente alinhadas e empacotadas, fixas sobre uma superfície sólida lisa (Wink et al., 1997). Ora a utilização de monocamadas auto-organizadas (SAM do inglês self-assembled monolayer) é uma técnica capaz de fixar monocamadas orientadas e ordendas sobre uma supreficie. SAM é a designação atribuída a estruturas orgânicas formadas e organizadas espontaneamente pela adsorção de constituintes moleculares sobre uma superfície sólida, em domínios ordenados. As moléculas ou ligantes que formam as SAM possuem “cabeças” com afinidade para o substrato por onde se ligam, por exemplo, a metais, óxidos metálicos ou semicondutores especificos e cujas propriedades, nomeadamente a composição dos seus componentes moleculares, é determinante para a orientação das cadeias à superfície (Love et al., 2005). A figura 22 esquematiza a adesão e organização de uma SAM sobre uma superfície de Au. As SAM são frequentemente usadas nos estudos de nanociências e de biossensores, pois (i) são fáceis de preparar (uma vez que não requerem técnicas nem equipamentos especializados); (ii) fixam-se em objetos de todas as dimensões e são componentes críticos na estabilização e na adição de funcionalidades a outras nanoestruturas; (iii) conseguem acoplar o ambiente externo às propriedades elétricas e óticas de estruturas metálicas e (iv) ligam estruturas a nível molecular a fenómenos interfaciais macroscópicos (Wink et al., 1997). Portanto, para uma maior seletividade do sensor recorre-se a SAM com estruturas/cadeias derivadas da adsorção química (quimioadsorção) de alcaloides em Au (Wink et al., 1997). Figura 22 – Esquema de SAM sob uma superfície de ouro (adaptado de Love et al., 2005). Interface orgânica: - Determina as propriedades superficiais; - Possui grupos químicos funcionais Interface sulfurometálica: - Estabiliza os átomos superficiais 39 7.3.2. Ligação por afinidade Este método utiliza outros intermediários (e.g. o sistema avidina/biotina) para ligar o ADN à superfície do elétrodo (e.g. Au). A interação não-covalente da avidina à biotina apresenta uma elevada estabilidade, assegurando, assim, uma vez formado o complexo, este não será perturbado pelas condições da reação de hibridização ou lavagem do sistema. Para tal, primeiro é necessário fixar a avidina sobre a plataforma. Isto pode ocorrer tanto por adsorção física como por ligação covalente. Depois os oligonucleotídeos biotinizados são depositados sobre a superfície para estabelecerem ligações com a avidina (Tombelli et al., 2002; Ozsos, 2012; Svitková & Labuda, 2017). A única desvantagem associada a este processo é o número de modificações necessárias aos ácidos nucleicos para imobilizar as sequências, o que aumenta exponencialmente o tempo de ensaio (Tombelli et al., 2002). 7.3.3. Ligação covalente As ligações covalentes são frequentemente utilizadas para imobilizar biomoléculas, visto que a maior parte dos estudos e sensores de deteção da hibridização operaram com elétrodos de Au. A ligação covalente estabelecida (graças às terminais tioladas das sondas) entre os grupos reativos (naturais ou artificiais) e o elemento de bioreconhecimento, sob a superfície dos elétrodos, promove a estabilidade e homogeneidade das biomoléculas, uma maior uniformidade na distribuição e número de ativação de sondas, para além de ser a técnica mais rápida e com o menor custo de produção (Palecek & Jelen, 2005; Monosík, et al., 2012; Hermanson, 2013; Kurbanoglu et al., 2016; Svitková & Labuda, 2017). 7.4. Hibridização da cadeia complementar de ADN A hibridização do ADN constitui o princípio fundamental na construção de qualquer genossensor (Rashid & Yusof, 2017). Esta reação é uma interação química natural e espontânea que resulta da capacidade de uma ssADN formar uma cadeia dupla (dsADN) com a sequência complementar, ou seja, o alvo é identificado através da sonda de ADN capaz de formar uma dsADN com a complementar à sequência de nucleótidos. Esta ainda ocorre com uma elevada especificidade e eficácia, mesmo quando numa solução com diferentes (i.e., não complementares) ácidos nucleicos (Pividori et al., 2000; Ozsoz, 2012; Rashid & Yusof, 2017). Nos genossensores, a reação de hibridização do ADN ocorre quando uma sonda de captura específica (i.e., ssADN com sequência conhecida) imobilizada no elétrodo interage com o elemento de reconhecimento do ADN alvo (tADN) (Ozsoz, 2012; Rashid & Yusof, 2017). Variando as condições experimentais como o pH, a temperatura e a força iónica do meio, a eficiência desta hibridização pode ser controlada, possibilitando, assim, a deteção de incompatibilidades nas bases nucleicas (Ozsoz, 2012). Acresce que a especificidade do genossensor dependerá das condições da seleção e estrutura secundária das sondas de ADN (principal aspeto na transdução eletroquímica da hibridização de ADN) (Ozsoz, 2012; Yan et al. 2013). 40 7.4.1. Estratégias de hibridização A hibridização dos ácidos nucleicos é o ponto central nesta deteção eletroquímica, pelo qual foram, ao longo dos anos, desenvolvidas várias estratégias para otimizar o sinal produzido. Estas estratégias baseiam-se nas propriedades eletroquímicas intrínsecas do ADN, ou melhor, das suas espécies eletroativas, quando próximas do elétrodo. Estas estratégias estão divididas em duas categorias: sem marcadores e com marcadores, representadas na figura 23 (Tosar et al., 2010). A estratégia sem marcador regista o sinal apenas da hibridização, ou seja, o sinal analítico detetado depende exclusivamente da ação do tADN. Por outro lado, a estratégia com marcadores recorre a sondas sintéticas de ADN marcadas com enzimas (e.g. peroxidase), NP (de Au ou de prata (Ag)) e espécies redox (e.g. ferro e peróxido de hidrogénio) para amplificar o sinal eletroquímico obtido nos processos de bioreconhecimento. Estas sondas marcadas, quando hibridizam com o ADN imobilizado no elétrodo, amplificam o sinal eletroquímico obtido, aumentando, consequentemente, a sensibilidade do genossensor (Tosar et al., 2010; Ozsoz, 2012). Figura 23 – Exemplificação das estratégias sem marcador (à esquerda) e com marcador (à direita). As sequências a vermelho representam as sondas de captura e as sequências a verde o tADN complementar (adaptado de Tosar et al., 2010). Esses marcadores normalmente encontram-se ligados covalentemente aos grupos terminais das sequências de ADN, pelo que a posição do marcador tem que ser cuidadosamente escolhida de maneira a não interferir com a construção do genossensor. É importante sublinhar que qualquer erro no posicionamento ou conjugação das suas estruturas levará à perda da bioatividade e da estabilidade do sistema e, naturalmente, à perda do sinal eletroquímico. Assim, os biossensores podem apresentar funções e aplicações muito diferentes, consoante o marcador utilizado (Ozsoz, 2012). 7.4.1.1. Hibridização em formato “sandwich” O ensaio em formato “sandwich” (SHA, do inglês sandwich hybridisation assay) consiste na promoção da reação de hibridização em, pelo menos, duas etapas. A primeira pode ocorrer, por exemplo, quando o ADN captura, imobilizado sob a superfície do sensor, hibridiza especificamente com uma região da sequência alvo, isto é, com o tADN; e a segunda etapa aquando a hibridização da sonda sinalizadora numa segunda região da sequência alvo, gerando um formato em “sandwich” (Ikebukuro et al., 2004; Immoos et al., 2004; Wan et al., 2009; Ozsoz, 2012; Wang et al., 2014). A figura 24 esquematiza as duas etapas descritas. Esta abordagem tem composto o desenho e construção de vários genossensores, pois a obtenção da reação de hibridização em várias etapas resulta num método eficaz para a deteção e/ou tADN tADN 41 quantificação de sequências oligonucleotidas específicas (Cao et al., 2002; Drummond et al., 2003; Ayers et al., 2005; Wang, et al., 2014). A elevada sensibilidade e seletividade alcançada por este formato torna-o oportuno para o estudo de microalgas (Ayers et al., 2005). As desvantagens associadas a este tipo de ensaio advêm do facto da utilização de várias etapas de incubação aumentarem a duração do ensaio (Ikebukuro et al., 2004; Ozsoz, 2012; Wang, et al., 2014). Para ultrapassar esta limitação têm-se utilizado várias técnicas para amplificar o sinal elétrico, incluindo o uso de NP de Au, nanotubos de carbono e enzimas (Patolsky et al., 1999; Alfonta et al., 2001; Campbell et al., 2002; Chen et al., 2003; Wang & Musameh, 2003; Daniel & Astruc, 2004; Chu et al., 2005; Boisselier & Astruc, 2009; Wang et al., 2014). Figura 24 – Esquema genérico da reação de hibridização em formato sandwich. 7.5. Deteção do sinal eletroquímico Com o avanço tecnológico, muitas técnicas e/ou estratégias foram empregues para analisar e detetar agentes patogénicos, elementos tóxicos, contaminantes ou mesmo os metabólicos sintetisados por microraganismos. Os métodos eletroanalíticos são um exemplo deste desenvolvimento e oferecem algumas vantagens em relação às outras estratégias – como a melhor seletividade e/ou especficidade na identificação das espécies de interesse após a reação de oxidação-redução ou a maior seletividade ao longo da reação redox do analíto no elétrodo – pelo que é o metodo mais utilizado, sobretudo por nãoeletroquimicos, da atualidade (Brett & Brett, 1993; Brett & Brett, 1998; Ricci et al., 2012; Pacheco et al., 2013; Mahato et al., 2018). Estes métodos de análise utilizam as propriedades elétricas quantificáveis (corrente elétrica, diferenças de potencial, variação da carga, entre outros) de um analíto quando este produz uma alteração no potencial do elétrodo, por exemplo, quando uma espécie redox interage física e/ou quimicamente com os demasiados componentes do meio, ou mesmo com as interfaces do sistema (Pacheco et al., 2013). Essas medidas (chamadas de sinais eletroanalíticos) podem, então, ser relacionadas com algum dos parâmetros intrínsecos da espécie (Wang, 2000a; Pacheco et al., 2013). A deteção eletroquímica da reação de hibridação do ADN normalmente advém das mudanças do comportamento eletroquímico do tADN na presença ou ausência do ADN complementar. A reação de hibridização pode ser monitorizada através do pico da corrente da atividade redox das bases eletroativas S S S S S S tADN ADN signaling Sondas de captura imobilizadas 1ª etapa 2ª etapa 48 Para quantificar o ADN extraído foi utilizado a micropipeta de 10 μL e o espectrofotómetro NanoDrop, da ThermoScientific, modelo NanoDrop Lit. 1.4. Amplificação do ADN A amplificação da sequência-alvo foi executada através do PCR convencional. O desenho dos primers – sequências especificas que permitem clivar e amplificar a região de ADN pretendida – foi desenvolvido através do Primer-BLAST (NCBI) (Ye et al., 2012) e adquiridos à Eurogentec (Bélgica). O protocolo de PCR utilizado foi o protocolo estabelecido pela Promega – Go Taq® G2 Flexi DNA Polymerase para a preparação das misturas de PCR. Este protocolo apresenta cinco passos simples, para os quais se recorreu ao uso de: micropipetas – 10, 20, 100, 200 e 1000 μL; microtubos de 100 μL e 1,5 mL e; o termociclador GTC96S, da Cleavere Scientific Ltd., UK. Para confirmar a presença do fragmento amplificado, foi efetuada uma corrida em gel de eletroforese (Fisher Bioreagents), usando uma tina e fonte (nanoPAC – 500) de eletroforese da Cleavere Scientific Lda e a visualização dos fragmentes, resultantes da eletroforese, foi documentada através de um transiluminador de fluorescência ultravioleta (UV) da VWR, modelo GenoSmart. No gel foi adicionado o marcador fluorescente Safe View (NBS Biologicals). A figura 31 mostra o NanoDrop e o termociclador utilizados nos ensios de biologia molecular. Figura 31 – Imagem do NanoDrop (à esquerda) e do termociclador (à direita). 49 2. Reagentes No decorrer deste projeto utilizaram-se os seguintes reagentes; para o desenvolvimento do sensor: sódio-fosfato de sódio-EDTA (SSPE 20x), 6-mercapto-1-hexanol (MCH), tampão fosfato-salino com caseína (PBS), o anticorpo Anti-Fluoresceína-Peroxidase e tetrametilbenzidina (TMB); para a extração das culturas celulares: Tissue and Cell Lysis Solution (TCL), MPC protein precipitation reagent (MPC), isopropanol e etanol 96%; PBS; OB protéase; BL buffer; HBC buffer; DNA Wash buffer; Elution buffer e etanol 96%; para a amplificação do ADN: 1x Green Go Taq® Flexi Buffer (GgTBuffer), MgCl2 Solution (MgCl2), Go Taq® G2 Flexi DNA Polymerase (Taq) e PCR Nucleotide Mix (dNTPs); e para a eletroforese: agarose, TBE buffer (TBE), SafeView Nucleic Acid Stain (SafeView) e 50 bp DNA Ladder (Ladder). O SSPE, MCH e TMB foram fornecidos pela Sigma-Aldrich, enquanto o anticorpo e o PBS adquiriram-se através da Roche e ThermoFisher, respetivamente. Enquanto o MPC, Proteinase K e TCL foram adquiridos pela Epicenter, o GgTBuffer, MgCl2 e Taq. pela Promega, o dNTP da Fermentas e a agarose, Ladder, Safe View e TBE por Fisher Bioreagents, Thermo Scientific™ GeneRuler™, NBS Biologicals e PanReac|AppliChem, respetivamente. O tampão SSPE 2x foi obtido por diluição em água ultrapura obtida do sistema de purificação Millipore Milli-Q (18.2 MΩ cm) na proporção 1:9 (20 mL de tampão SSPE 20x para 180 mL de água). Para além dos reagentes mencionados utilizou-se, também, albumina de soro bovino (BSA, do inglês bovine serum albumin), da Sigma-Aldrich. Todos os reagentes acima enumerados são de grau analítico, pelo que não tiveram que ser posteriormente purificados. 3. Sondas de ADN As sequências oligonucleotidas selecionadas: sonda de captura, sonda sinalizadora (ou signaling ) e a sonda alvo foram adquiridas na forma de um sal liofilizado, através da Eurogentec (França). Soluções padrão de ADN (captura, sinalizadora e alvo) de concentração 100 μM foram preparadas em água ultrapura e armazenadas a – 20ºC. As soluções de ADN de trabalho foram preparadas diariamente diluindo uma quantidade da solução padrão em SSPE 2x. A construção e desenvolvimento deste genossensor depende da seleção das sondas, pela qual foi escolhida uma sequência de ADN capaz de identificar os dinoflagelados Alexandrium minutum – espécie específica deste estudo. Para além da A. minutum , estas sequências também identificam três outras espécies do género Alexandrium ; a Alexandrium tamarense , a Alexandrium ostenfeldii e a Alexandrium insuetum . A tabela 10 descreve as sequências utilizadas nesta experiência e a figura 32 ilustra a estrutura de cada sequência. 50 Tabela 10 – Oligonucleotídeos utilizados no desenvolvimento do genossensor eletroquímico. Nome do oligonucleotídeo Sequência 5´→ 3´ pb Captura TCTATTGGCTCACGGAATTCTGCAA–HOC6SH 25 Signaling FC–GCACACCTTCAAGCATATCCCGAAGGTGCAAATTACGTTCAAACA 45 Alvo TTGCAGAATTCCGTGAGCCAATAGATGTTTGAACGTAATTTGCACCTTCGGGATA TGCTTGAAGGTGTGC 70 Complementar GCACACCTTCAAGCATATCCCGAAGGTGCAAATTACGTTCAAACATCTATTGGCT CACGGAATTCTGCAA 70 HOC6SH – grupo tiol; FC – fluoresceína. A sonda de captura e a sonda sinalizadora possuem terminações especificas (tabela 10) para ajudar no desenvolvimento do procedimento do ensaio; ADN de captura apresenta um grupo tiol (HOC6SH) na extremidade 3’ para facultar a sua fixação ao substrato de Au e o ADN da signaling , na extremidade 5’, uma fluoresceína para a facilitar a deteção do sinal. Quanto maior a variação da energia livre de Gibbs (∆G) maior a probabilidade de se formarem estruturas secundarias nas cadeias de ADN (os “loops” que se observa nas sequências da figura 32). Atendendo aos estudos termodinâmicos, menores ∆G facilitam a formação de SAM e diminui a probabilidade de se formar as estruturas secundarias, aumentando, assim, a probabilidade de ocorrer uma hibridização espontânea entre as cadeias de ADN complementares. Logo, as sequências selecionadas para este estudo apresentam, todas elas, uma vantagem para o modelo e formato do sensor adotado; a sonda de captura com uma ∆G de - 0,71 kcal/mol são ideias para a formação de SAM, uma vez que originam estruturas quase lineares e as sondas signaling e alvo com uma ∆G de - 7,51 kcal/mol e - 8,94 kcal/mol, respetivamente, possuem um valor aceitável para a hibridização do ADN. 51 Figura 32 – Possíveis dobramentos da estrutura dos oligonucleotídeos. Temperatura = 25,0ºC; [Na+] = 0,298 M; [Mg2+] = 0,0 M. (Fonte: unafold.rna.albany.edu) Captura Signaling Alvo Complementar 52 4. Procedimento experimental Este subcapítulo encontra-se dividido em três secções: “Desenvolvimento do genossensor eletroquímico”, “Análise de amostras reais” e “Avaliação do genossensor eletroquímico” atendendo ao local onde se realizou cada etapa experimental. 4.1. Desenvolvimento do genossensor eletroquímico Todo o procedimento para a elaboração e otimização do genossensor eletroquímico foi realizado com base na literatura (e.g. Lopéz, et al., 2014, Freitas, et al., 2016). Neste estudo distinguiu-se três momentos essenciais para a deteção do sinal: a fase sensorial; a hibridação em formato “sandwich” e; a deteção eletroquímica (que compreende a ligação do anticorpo e a reação peroxidase/TMB). Todo o procedimento está esquematizado sucintamente na figura 33. 4.1.1. Pré-tratamento dos elétrodos Os elétrodos foram lavados com etanol e água e secos com uma corrente de nitrogénio. 4.1.2. Fase sensorial Após a lavagem, imobilizou-se 3 μL de sonda de ADN de captura (1 μM) no elétrodo de trabalho. De seguida, esses elétrodos foram colocados numa caixa de Petri humificada dentro do frigorifico a 4ºC “over night” (aproximadamente 16 horas). Esta etapa tem como finalidade assegurar a fixação da sonda de captura à superfície do elétrodo pela extremidade tiolada. Depois do período de imobilização, sucedeu-se à lavagem da superfície dos elétrodos, desta vez, com o tampão SSPE 2x. Este passo ajuda a remover o ADN não imobilizado ao substrato, porém, também acaba por desordenar a monocamada imobilizada, o que promove a adsorção não especifica de alguns ácidos nucleicos das sondas ao substrato. Para contornar esse efeito, adicionou-se 3 μL de MCH, durante um curto período de tempo, de maneira a induzir a organização do ADN em SAM. O excesso de MCH foi depois removido após uma segunda lavagem dos elétrodos com o tampão SSPE 2x. 4.1.3. Hibridação em formato sandwich O formato de reação adotado para este estudo foi a hibridização em formato “sandwich”. Esta hibridação ocorre em duas etapas distintas designadas de hibridização homogénea e hibridização heterogénea (figura 34). Inicia-se a reação de hibridação pela hibridação homogénea. Na hibridação homogénea, as sondas de tADN são misturadas com sondas de ADN sinalizadoras e tampão SSPE 2x num eppendorf, durante 30 minutos. O volume adicionado variou conforme a concentração de tADN pretendida. 53 Na hibridização heterogénea 3 μL da solução homogénea é adicionada à superfície modificada (superfície do elétrodo previamente imobilizada com a sonda de ADN de captura e MCH), ocorrendo a hibridização entre as sondas tADN e signaling com a de captura. No final lavaram-se novamente os elétrodos com o SSPE 2x para remover qualquer ligação nãoespecifica que se tenha formado. 4.1.4. Deteção eletroquímica Para se detetar o sinal eletroquímico, 1,5 U/mL de peroxidases em PBS (designadas de anticorpo) foram adicionadas ao transdutor como um marcador da fluoresceína (proteína modificada numa das extremidades da sonda sinalizadora). Uma nova lavagem é realizada 30 minutos após a adição do anticorpo, para eliminar o excesso. No final o SPGE é conectado ao potencióstato e é adicionado 40 μL de TMB. O acréscimo do TMB, em conjunto com as enzimas peroxidase, promove a oxidação do peróxido de hidrogénio (H2O2), atribuindo uma coloração azulada à solução – indicador ótico da reação. A deteção da hibridização do ADN é então possível através da reação redoxdesencadeada pela peroxidase que usa o substrato TMB/H2O2, quando aplicado um potencial, para gerar um sinal eletroquímico (Heurich et al., 2011, Alves-Balvedi et al., 2016). Usando a cronoamperometria (tempo = 60s; potencia = - 0,1V) é possível monitorizar a resposta eletroquímica cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração de tADN. Figura 33 – Procedimento geral para o desenvolvimento do genossensor eletroquímico. S S S S S S S S S S S S S S S S S S S eTMB + H2O2 TMB red. S S S S S Cronoamperometria tADN + signaling MCH Anticorpo TMB 54 Figura 34 – Esquema geral da hibridação em formato sandwich. A sonda de captura está representada a azul claro, a sonda alvo a cinzento, a sonda sinalizadora a laranja, o MCH a preto e a fluoresceína a amarelo. 4.2. Amostras reais Dois géneros de dinoflagelados foram testados no genossensor desenvolvido: a Alexandrium minutum e a Lingulodinium polyedrum . A microalga tóxica Alexandrium minutum foi escolhida pela sua distribuição ao longo da costa ibérica e pelos impactos socio-economicos que a sua presença provoca nas culturas aquícolas de bivalves (figuras 11 e 17), enquanto a Lingulodinium polyedrum surge como um exemplo não tóxico de uma HAB real. L. polyedrum foi usada como controlo negativo do sensor. Para além dos dinoflagelados, células humanas do epitélio oral também foram aplicadas como um controlo negativo. 4.2.1. Alexandrium minitum O cultivo das microalgas efetuou-se em frascos de cultura de 40 mL, a 18ºC ± 1ºC, utilizando água autoclavada artificialmente salgada (salinidade de 35 psu) e enriquecida por um meio de cultura. Neste estudo, dois meios de cultura foram testados: o meio f/2 – meio recomendado pela empresa fornecedora – e; o meio Z8 – um dos meios indicado em literatura para o crescimento artificial das microalgas do género Alexandrium. Os dois meios de cultura foram preparados atendendo aos protocolos que se descreveu em anexo (anexo 1 e anexo 2). O stock inicial (i.e., a solução-mãe adquirida) apresentou uma densidade população baixa (valor não expresso). Assim, para aumentar a população dos dinoflagelados, foram transferidos, para quatro frascos de cultura, 10 mL do stock original e aproximadamente 30 mL do meio f/2. Durante os primeiros 20 dias cresceu-se os dinoflagelados dos frascos no meio recomendado – o meio f/2 – sob agitação mecânica, todavia, não houve um crescimento populacional notável. Portanto, fez-se crescer em meio Z8. tADN + signaling S S S S S S S S S 1ª Hibridização 2ª Hibridização 55 De cada um dos quatro frascos anteriores, um volume de 8 mL foi retirado e adicionado a quatro novos frascos de cultura/tecido (4x4), cujo volume final foi prefeito com o meio Z8 (assim sendo, cada um dos quatro frascos de cultura com o meio f/2 perdeu 32 mL de amostra). Aos restantes 8 mL foilhes adicionado mais nutrientes do meio f/2. A figura 35 esquematiza o procedimento adotado. Z8 8 mL f/2 Figura 35 – Esquema geral da distribuição das células de Alexandrium minutum . Os resultados da proliferação artificial das células, em ambos os meios, não foram os esperados. Todavia, notou-se um ligeiro aumento na quantidade de células. 4.2.2. Lingulodinium polyedrum Para testar a seletividade do genossensor desenvolvido recolheu-se uma amostra da HAB que deu à costa algarvia no dia 16 de junho de 2019. Foi recolhido um volume de 1,5 L de água marinha contaminada pela microalga Lingulodinium polyedrum (dinoflagelado identificado pelo IPMA). Não foram realizadas culturas, uma vez que a amostra inicial continha uma densidade populacional elevada de dinoflagelados. 4.2.3. Células animais do epitélio oral Células do epitélio oral (i.e., células do interior da bochecha humana), extraídas voluntariamente, serviram de um segundo controlo negativo para este projeto. Estas células foram recolhidas com a ajuda de uma zaragatoa e armazenadas em eppendorfs de 1,5 mL no frio, até à extração do ADN. 4.3. Extração de ADN genómico De modo a obter a máxima quantidade e qualidade de ADN, dois protocolos de extração celular foram testados: A – (Cultured cells protocol) de E.N.Z.A.® Tissue DNA Kit D3396-02 (200 preps) da Omega Bio-tek, Inc. (USA, 2018) e B – kit comercial “MasterPureTM DNA Purification kit” da Epicentre (2012). Quando o ADN das culturas A. minutum foi extraído de acordo com o protocolo A, obteve-se uma menor pureza e concentração de ADN (razões de pureza entre 1,0 – 1,5 e concentrações inferiores Stock 4 56 a 30 ng/μL). Assim, para obter maiores valores de pureza e concentração de ADN testou-se o protocolo B. Considerando que quando se experimentou o protocolo B, obteve-se uma maior pureza e concentração de ADN (pureza expressa pela razão 280/260 ≈ 1,8 e concentrações entre 40 – 50 ng/μL), todo o trabalho experimental que envolveu extração de ADN foi realizado segundo o protocolo B. A extração de ADN existente nas culturas envolveu várias etapas. A primeira etapa foi a separação do material biológico do meio aquoso. Para tal, verteu-se 10 mL do meio de culturas para tubos de falcon. Esses tubos foram centrifugados durante 15 minutos, a 4ºC, à velocidade de 2000 xg. Após a centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o pellet transferido para eppendorfs de 1,5 mL e adicionouse 300 μL da solução de lise “Tissue and Cell Lysis Solution” e 1 μL de proteinase K. Homogeneizou-se o meio com auxílio de um vórtex (10 s) e incubaram-se as células, num banho, a 65ºC, durante 15 minutos. A solução foi lentamente agitada a cada 5 minutos. Seguidamente, cada solução foi deixada a arrefecer, 5 minutos, no gelo. Depois deste repouso, adicionou-se 175 μL da solução “MCP Protein Precipitation Reagent” – uma solução que precipita as proteínas – e homogeneizou-se no vórtex, durante 10 s, antes de a centrifugar, a 10000 xg, durante 10 minutos. O pellet resultante foi rejeitado, aproveitando-se o sobrenadante – onde se encontra concentrado o ADN – ao qual se adicionou 500 μL de isopropanol. A mistura foi homogeneizada mecanicamente por inversão, antes de a centrifugar novamente sobre as mesmas condições. O pellet resultante, teoricamente, corresponderá ao ADN das culturas, assim, com cuidado, retira-se o sobrenadante às soluções e acrescenta-se-lhes 500 μL etanol 96%. Esta nova mistura é centrifugada e deixada a secar “over night”. Finalmente, 50 μL de água ultrapura é acrescentada ao ADN antes de proceder para a sua quantificação. Este método de extração foi aplicado às restantes misturas. 4.3.1. Quantificação do ADN extraído A quantificação do ADN extraído dos dois meios de cultura realizou-se por espetrofotometria no Nanodrop – espectrofotómetro capaz de ler a absorbância de uma solução com apenas 1 μL de amostra. O procedimento para esta medição é bastante simples. Primeiro, fez-se duas leituras da absorbância ao comprimento de onda de 260 nm da água ultrapura (i.e., do branco – solução desprovida de ADN); para este equipamento, a solução em branco corresponde à solução em que o material genético se encontra diluído, neste caso, a água ultrapura. De seguida, colocou-se 1 μL da solução contendo o ADN extraído, sobre o orifício da plataforma de leitura do Nanodrop e fizeram-se leituras da absorbância (ao comprimento de onda de 260 nm) de cada amostra. O valor da absorbância obtida nestes ensaios permitiu determinar a concentração do ADN através da equação de Beer-Lambert: c = (A*𝜺)/b (equação 3) em que, c = concentração dos ácidos nucleicos (ng/μL) A = absorbância (UA) 𝜺 = coeficiente de extinção dependedente do comprimento de onda (ng.cm/μL) b = largura (cm) 57 De acordo com a leitura, o 𝜺 é dependente do comprimento de onda e para soluções contendo dsADN tem um valor de 50 ng.cm/μl (Thermo Fisher Scientific, 2010). A cada dez leituras realizaram-se duas novas calibrações com os brancos. 4.4. Amplificação do ADN A amplificação da região do ADN pretendida efetuou-se através da técnica de PCR convencional. O procedimento experimental para este processo foi realizado no termociclador, de acordo com o protocolo prático Go Taq® G2 Flexi DNA Polymerase estabelecido pela Promega (2013) otimizado. A sequência transcrita foi amplificada usando-se os dois primers (primer 1 e primer 2) descritos na tabela 11. Cada uma das misturas de PCR (50 μL) conteve 10 μL GgTBuffer, 3 μL (correspondente a 1,5 mM) da solução de MgCl2, 1 μL (ou 0,25 mM) de dNTP, 0,25 μL de Taq., 2,5 μL de cada um dos primers, ADN das amostras biológicas e água ultrapura. O volume de ADN e água adicionados variou conforme a concentração da amostra. Tabela 11 – Primers utilizados para a amplificação da sequência de ADN de interesse. Primers Sequência 5´→ 3´ Direção Pb Primer 1 TTGCAGAATTCCGTGAGCCA Forword 20 Primer 2 GCACACCTTCAAGCATATCCC Reverse 21 A amplificação, no termociclador, iniciou-se com a desnaturação do ADN, durante 2 minutos a 95ºC, seguido de uma nova desnaturação, durante 2 minuto, a 94ºC por cada ciclo de amplificação. Após a desnaturação o ADN é reaquecido (processo designado de “annealing”) a –5ºC da sua temperatura de fusão (Tm, do inglês melting temperature), neste caso a 57,0ºC para a primer 2, durante 30 segundos, com o aumento de 1ºC a cada novo ciclo. De seguida, ocorreu a extensão das sondas à temperatura ótima da Taq., ou seja, a 72ºC, durante 1 minuto por ciclo, à exceção do último ciclo em que a extensão ocorre durante 5 minutos. Em cada amplificação fez-se 35 ciclos. No último passo, o termociclador efetua um ciclo onde o material é deixado a repousar a 4ºC, até se remover as amostras. A tabela 12 indica as etapas da amplificação do ADN. Tabela 12 – Condições ótimas obtidas para a amplificação no PCR. Processo Temperatura (ºC) Duração (min) Desnaturação inicial 94 2 Desnaturação 94 1 Annealing 60 0,5 Extensão 72 1 Extensão final 72 5 Número de ciclos = 35 64 A figura 43 ilustra a influência da concentração do MCH e do tempo de incubação no sinal eletroquímico produzido pelo genossensor. Para este estudo usaram-se várias concentrações de MCH (0; 0,25; 0,50 e 1,0 μM) a diferentes tempos de incubação de MCH (7,5; 15,0; 30,0 e 60,0 min). Figura 43 – Resposta cronoamperométrica obtida quando se estudou a influência da concentração e do tempo de incubação do MCH. Valores de Inc dos ensaios em branco, B, a azul escuro, com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM e concentração da sonda de ADN sinalizadora = 0,25 μM. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. Nesta otimização, as Inc obtidas para os ensaios em branco foram baixas e variaram entre os 6,03 nA (MCH = 0 μM a 7,5 min de incubação) e os 26,52 nA (MCH = 0 μM incubado durante 30 min). Analisando a figura 43, verifica-se que a razão S/B variou entre 30,9 e os 481 e as Inc médias variaram de 0,8 a 3,7 μA, sendo que a maior razão S/B (razão de valor 481) foi obtida no ensaio em que se usou uma concentração de MCH 0 μM incubado durante 15 min. Neste caso, acredita-se que o comprimento da sonda de captura tenha influenciado o ensaio (ver figura 32), uma vez que a sequência de captura possui apenas 25 pb, é provável que as sondas se tenham auto-organizado em SAM, mesmo sem a intervenção do espaçador. Todavia, considerando a fraca repetibilidade que se obteve nestes ensaios, selecionou-se para os futuros ensaios a concentração de MCH de 1 μM incubado durante 7,5 minutos (razão S/B de 464) – o segundo valor de razão S/B mais elevado – para assegurar a reprodutibilidade dos ensaios. Em anexo encontram-se os gráficos correspondentes aos ensaios individuais dos quatro períodos de incubação (7,5; 15,0; 30,0 e 60,0 min) nas respetivas concentrações de MCH (anexo 3). Seguidamente otimizou-se o tempo de incubação da reação da hibridação homogénea (reação da hibridação parcial que ocorreu entre a sonda de ADN alvo e a sonda de ADN de sinalização) ao estudar-se diferentes tempo de reação, que qualificou tempos entre os 15 e os 60 minutos (figura 44). Conforme se pode ver na figura 44, a maior razão S/B (valor de 396) foi atingida após 30 minutos de hibridação homogénea e a Inc média dos ensaios em branco foi de 7,92 nA. 0 100 200 300 400 500 600 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 0.1 0.5 1 0 0.1 0.5 1 0 0.1 0.5 1 0 0.1 0.5 1 7m30 15m 30m 60m S/B I (μA) Concentração (μM)/Tempo (min) B S S/B 65 Figura 44 – Respostas cronoamperométricas obtidas nos ensaios de otimização do tempo de reação da hibridação da solução homogénea. Valores de Inc dos ensaios em branco, B, a azul escuro, com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração da sonde de ADN de captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM e concentração da sonda de ADN sinalizadora = 0,25 μM. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. Posteriormente, avaliou-se a influência da concentração do ADN signaling na eficácia da reação da hibridação homogénea. A figura 45 mostra a variação dos sinais cronoamperométricos obtidos nestes ensaios a diferentes concentrações de ADN sinalizador (0,13; 0,25 e 0,50 μM). Verificou-se que as Inc médias dos brancos foi de 16,45 nA e a melhor razão entre S/B (razão máxima de 190) foi obtida quando se usou uma concentração de ADN signalling de 0,25 μM. Figura 45 – Respostas cronoamperométricas obtidas na otimização da concentração da sonda de ADN sinalizadora. Valores de Inc dos ensaios em branco, B, a azul escuro, com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração da captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. 0 100 200 300 400 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 15 30 60 S/B I (μA) Tempo (min) B S S/B 0 40 80 120 160 200 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.13 0.25 0.50 S/B I (μA) Concentração (μM) B S S/B 66 Para que a reação de hibridação homogénea ocorra, primeiro ambas as sondas (alvo e signaling ) têm que romper as estruturas secundárias (ver tabela 10 e figura 32) e de seguida, conforme a sua complementaridade, estas sondas têm que se ligar, de forma natural e espontânea, de forma antiparalelas (estrutura em hélix característica do ADN). De acordo com a literatura, o aumento da temperatura influência a eficácia desta reação uma vez que auxila a aberturas das sondas de ADN (Sousa et al., 2020). Neste sentido e de modo a estudar a influência da temperatura na reação da hibridação homogénea no desempenho do genossensor, esta reação foi realizada à temperatura ambiente (25°C) e a 98°C (temperatura de desnaturação do ADN que agiliza a abertura do ADN, sobretudo das suas estruturas secundarias, neste caso do tADN e da ADN signaling ). A figura 46 ilustra a influência da temperatura na reação da hibridação homogénea. A Inc médias dos ensaios em branco foi de 24,30 nA. Observou-se que a maior razão S/B (valor de 211) foi obtida à temperatura ambiente (25 °C). Figura 46 – Resposta cronoamperométrica obtida na otimização da temperatura da reação da hibridação homogénea. Valores da Inc dos ensaios em branco, B, a azul escuro, com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração da captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM; concentração e tempo de atuação da sonda de ADN sinalizadora = 0,25 μM, durante 30 min. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. A BSA é uma proteína bastante usada como agente bloqueador (evita as adsorções inespecíficas) de superfícies em ensaios biológicos, pois, por norma, melhora a razão S/B (Sousa et al., 2020). No entanto, neste trabalho, a adição de BSA, à temperatura ambiente, na etapa da hibridação homogénea apresentou um efeito negativo ao diminuir a Inc eletroquímica. Como indica a figura 47, a adição do BSA não contribuiu para o aumento do sinal; uma razão de S/B de 398 foi obtida na ausência de BSA, enquanto que uma razão S/B de 264 foi calculada na presença de BSA. Este facto também se relaciona com o comprimento das sondas escolhidas. Uma vez que a sonda alvo e sua complementar têm apenas 70 pb dificilmente se formam estruturas secundarias fortes que possam comprometer os processos de hibridização. Portanto, as próximas etapas foram realizadas na ausência deste agente bloqueador. 206 207 208 209 210 211 212 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 25 98 S/B I (μA) Temperatura (ºC) B S S/B 67 Figura 47 – Respostas cronoamperometricas obtidas na presença e ausência de BSA na reação da hibridação homogénea. Valores da Inc dos ensaios em branco, B, a azul escuro, e dos ensaios com sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho . Parâmetros analíticos: concentração da sonda de ADN de captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM; concentração e tempo de atuação da sonda de ADN sinalizadora = 0,25 μM, durante 30 min. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. A otimização do tempo da reação da hibridação heterogénea (reação entre a ssADN imobilizada no elétrodo e o ADN proveniente da reação da hibridação homogénea) foi realizada promovendo-se a reação entre o ADN de captura e o produto da hibridação homogénea por 30; 60 e 120 minutos. Conforme se observa na figura 48, à medida que o tempo da reação aumenta, aumenta também a razão S/B, obtendo-se o valor mais alto de S/B (320) aos 120 minutos. Porém, de modo a encurtar a duração de todo o ensaio da construção do genossensor, selecionou-se um tempo de 60 minutos para os futuros ensaios. Figura 48 – Respostas cronoamperométricas obtidas na otimização do tempo da reação da hibridação heterogénea. Valores da Inc dos ensaios em brancos, B, a azul escuro, com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração do ADN de captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM e concentração e tempo de atuação do ADN sinalizador = 0,25 μM, durante 30 min. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. 0 100 200 300 400 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 com BSA sem BSA S/B I (μA) B S S/B 302 306 310 314 318 322 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 30 60 120 S/B I (μA) Tempo (min) B S S/B 68 A figura 49 evidência a otimização da concentração (figura 49 A) e do tempo de incubação (figura 49 B) do anticorpo Anti-FITC-POD usado na etapa da deteção eletroquímica. Observando a figura, verifica-se que, tal como nas otimizações anteriores, se obtiveram Inc médias dos ensaios em branco baixas e na gama dos 30 nA. Os ensaios que proporcionaram maiores razões S/B foram aqueles em que se usou uma concentração de Anti-FITC-POD de 1,5 U/ml (S/B = 106) incubado durante 30 minutos (S/B = 193). Figura 49 – Respostas cronoamperométricas obtidas na otimização da (A) concentração do anticorpo anti-FITC-POD e (B) tempo de incubação do anti-FITC-POD. Valores de Inc dos ensaios em brancos, B, a azul escuro, e dos ensaios com a sonda sintética de tADN (1 nM) a azul claro e a razão S/B correspondente a vermelho. Parâmetros analíticos: concentração do ADN de captura = 1,0 μM; concentração e tempo de atuação do MCH = 1,0 μM, durante 7,5 min; concentração da sonda de ADN alvo = 1,0 nM e concentração e tempo de atuação da sonda de ADN sinalizadora = 0,25 μM, durante 30 min. Barras representam o erro padrão derivado das réplicas. A tabela 14 resume os parâmetros analíticos selecionados neste trabalho. Tabela 14 – Valores selecionados para a construção do genossensor eletroquímico. Variáveis Valores testados Valor selecionado Potencial aplicado (V) - 0,2 – + 0,1 - 0,1 Duração da reação eletroquímica (min) 0,0 – 2,0 1,0 Concentração da sonda de captura (μM) 0,25 – 10,0 1,0 Concentração do MCH (μM) 0,0 – 1,0 1,0 Tempo de incubação do MCH (min) 0 – 60 7,5 Tempo da hibridação homogénea (min) 15 – 60 30 Concentração da sonda de ADN sinalizadora (μM) 0,13 – 0,50 0,25 Concentração do anticorpo (U/mL) 0,25 – 10,0 1,5 Tempo de incubação do anticorpo (min) 15 – 60 30 Tempo da hibridação heterogénea (min) 30 – 120 60 Temperatura da reação da hibridação homogénea (°C) 25 ; 98 25 BSA (presença +; ausência -) + BSA ; - BSA - BSA A B 69 2.1.1. Caracterização eletroquímica do genossensor desenvolvido Nas condições experimentais otimizadas (ver tabela 14), avaliou-se o efeito do aumento da concentração do tADN (analito) sintético, de 0,06 a 6,25 nM, no sinal analítico obtido através da determinação da corrente cronoamperométrica (figura 50 A). Uma relação linear entre a concentração do ADN alvo e a Inc (subtraída do branco, Inet) foi obtida no intervalo de concentrações de [0,12;1,00] (figura 50 B), cuja equação de reta (figura 50 C) calculada foi de: Inet = 2,271 ± 0,028 [tADN] + 0,157 ± 0,014 (μA) (equação 4) R2 = 0,9995 Figura 50 – Curvas cronoamperométricas obtidas nas condições experimentais ótimas na (a) ausência e à concentração de (b) 0,06; (c) 0,12; (d) 0,25; (e) 0,50; (f) 1,00; (g) 2,00; (h) 3,00 e (i) 6,25 nM de tADN; B Relação linear entre a concentração do ADN alvo e a Ic; e C a curva de calibração correspondente ao intervalo de concentração de tADN 0,12 a 1,00 nM. As respostas obtidas são o resultado da média de três ensaios. O limite de deteção (LD) e o limite de quantificação (LQ) calculados como três vezes e dez vezes o desvio padrão do ensaio em branco dividido pelo declive da reta de calibração foram 0,03 nM e 0,08 nM, respetivamente. -20.0 -15.0 -10.0 -5.0 0.0 010 20 30 40 50 60 I (μA) tempo (s) I a A B C 70 A precisão do genossensor eletroquímico foi avaliado utilizando 1,0 nM de tADN. A repetibilidade foi determinada fazendo-se medições com vários elétrodos e a reprodutibilidade foi avaliada pela realização de três medições em cinco dias consecutivos. A repetibilidade e a reprodutibilidade expressas como o desvio padrão relativo foram de 5,39 % e 4,12 %, respetivamente. A tabela 15 resume a análise às características eletroquímicas do genossensor. Tabela 15 – Caracterização dos parâmetros antilíticos do genossensor desenvolvido. Parâmetros Resultados Linearidade (nM) 0,120 – 1,000 Declive 2,271 Interseção 0,157 Coeficiente de correlação (R) 0,999 Desvio padrão do declive 0,028 Desvio padrão da interseção 0,014 LD (nM) 2,478 x 10-2 LQ (nM) 8,260 x 10-2 Repetibilidade1 (%) 5,385 Reprodutibilidade1 (%) 4,116 Precisão total (%) 5,159 1 – n = 5. Após a construção, o desenvolvimento e a otimização do genossensor, fez-se a preparação das amostras reais. 2.2. Preparação das amostras reais 2.2.1. Extração e quantificação do ADN extraído Neste trabalho extraiu-se o ADN de 3 amostras reais: 2 dinoflagelados, Alexandrium minutum e Lingulodinium polyedrum, e das células animais do epitélio oral usando-se o kit comercial MasterPureTM. A qualidade e a quantidade de ADN genómica extraída destes organismos é fundamental para a eficácia da etapa de corte e amplificação da sequência de ADN pretendida (70 pb) pois, quanto mais concentrado estiver o ADN genómico extraído maior é a probabilidade de se amplificar a sequência de ADN pretendida, A quantificação do ADN por espetrofotometria foi realizada por medição da quantidade de radiação absorvida pelo ADN no comprimento de onda de 260 nm. Porém, é vulgar que amostras com ácidos nucleícos estejam contaminadas com outras moléculas como é o caso, das proteínas, compostos orgânicos, etc. Por isso, determinou-se a pureza (qualidade) do ADN através do cálculo da razão entre a absorbância a 260 nm obtida e a absorbância a 280 nm na mesma solução de ADN (pureza = Abs 260nm/Abs 280 nm). 71 Para soluções contendo dsADN, uma razão de 260 nm/280 nm de 1,8 indica que a amostra tem um elevado grau de pureza e contém uma elevada percentagem de ácidos nucleicos. Quando a razão da Abs 260/280 apresenta valores inferiores a 1,8 normalmente é indicação da contaminação da amostra com proteínas, fenóis, ARN, entre outros compostos que também absorvem ao comprimento de onda de 260 nm (Wilfinger et al., 1997; Thermo Fisher Scientific, 2010). A tabela 16 mostra os resultados obtidos na quantificação do material de ADN extraído a partir das células da Alexandrium minutum , Lingulodinium polyedrum e do epitélio oral. No anexo 4 encontra-se o cálculo detalhado efetuado na determinação da concentração do ADN. Tabela 16 – Resultados obtidos da quantificação do ADN extraído pelo kit comercial MasterPureTM. A5 = réplica 5 das células cultivdas em meio Z8; A7 = réplica 7 das células cultivadas em meio Z8; Alg7 = amostra 7 do dinoflagelado da costa algarvia; H = amostra 1 das células do epitélio oral. Os valores apresentados resultam da média de 4 leituras no Nanodrop para a quantificação do ADN extraído. A5 A7 Alg 7 H Abs (260 nm) 0,942 0,961 3,291 1,437 260/280 1,810 1,813 1,850 1,820 [ng/μL] 47,13 48,01 164,53 71,90 A elevada densidade populacional das amostras da HAB do Algarve é evidente, pois apresenta uma elevada concentração de ADN (164,53 ng/μL, depois de diluída 2 vezes). Porém, esta solução registou uma razão de absorbância de 1,850 (razão >1,8) o que, apesar de não ser o ideal, continua a ser um bom grau de pureza. Por outro lado, as amostras A5 e A7 extraídas do frasco de cultura 1 e 3 do meio Z8, respetivamente, registaram uma concentração total de ADN genómico extraído muito inferior (47,13 e 48,01 ng/μL) ao ADN extraído da amostra proveniente da maré vermelha do Algarve. Contudo, apresentam um maior grau de pureza – razões (Abs 260 nm/Abs 280 nm) ≈ 1,8. 2.2.2. Amplificação da sequência do ADN de interesse específico Após a extração do ADN genómico das amostras reais e determinada a quantidade e qualidade do mesmo, realizou-se a amplificação do ADN por PCR – técnica da biologia molecular usada para amplificar, i.e., fazer cópias de uma região especiifca do ADN de interesse. Neste caso, através de um termociclador, o ADN extraído foi clivado num fragmento da região pretendida (70 pb), ou seja, foi cortada a sequência de ADN especifica que identifica o género Alexandrium minutum . De modo a obter muitas cópias da sequência pretendida do ADN extraído, os parâmetros analíticos associados ao processo de amplificação foram otimizados. A tabela 17 resume as variáveis testadas e os respetivos valores otimizados. 72 Tabela 17 – Parâmetros analíticos testados e otimizados durante a etapa de amplificação da sequência de ADN por PCR. Variável Valores testados Valor ótimo Temperatura de annealing (ºC) 55 – 62 60 Concentração de Mg (μL) 2,5 – 4,5 3,0 Concentração de Taq, 0,25; 1,25 0,25 Duração do annealing (s) 30 – 45 30 Número de ciclos 30; 35 35 Após o processo de amplificação da sequência de interesse, recorreu-se à técnica de eletroforese em gel para confirmar a eficácia de cada amplificação efetuada. A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de ADN com base no tamanho e carga dos mesmos, pelo que este processo envolve a passagem de uma corrente através do gel onde estão retidas as cadeias de ADN amplificadas por PCR. Em função do seu tamanho e carga, os fragmentos de ADN migram através do gel (normalmente num gel de agarose) a diferentes velocidades, permitindo separar os fragmentos conforme o comprimento das suas bases; quanto maior o fragmento de ADN, menor a distância que percorrera no poço de gel e vice-versa. Nestes estudos, a eletroforese correu durante 45 – 55 minutos, a uma corrente constante de 100 V. A figura 51 mostra uma fotografia obtida no final da realização da eletroforese às amostras deste estudo que foram amplificadas por PCR. Figura 51 – Escala da marcação do ADN padrão (A) do padrão de 50 pb e (B) das bandas resultantes da eletroforese do ADN amplificado, a 0,08s de emissão. De modo a se observar as bandas resultantes da corrida das cadeias de ADN, recorreu-se a um marcador de ADN, designado Ladder (L), cuja marcação auxilia na visualização da migração dos fragmentos de ADN ao longo do gel de agarose. Este marcador é constituído por plasmídeos que limitam 13 fragmentos no gel a diferentes pesos moleculares – marcação entre os 50 e 1000 pb. A marcação dos 250 e 500 pb apresentam uma maior intensidade do que as restantes, pois servem de indicadores da progressão, ou seja, são os indicadores de referência da banda padrão (figura 51 A). _L_ _A5_ _A7_ _Al7_ _H_ _B_ pb 73 Comparando as bandas obtidas com a banda padrão, verifica-se que o ADN amplificado se encontra entre as bandas dos 50 e 100 pb (figura 51 B), resultado conforme o previsto (uma vez que a sequência de ADN utilizada neste trabalho possui 70 pb). Terminados todos os ensaios referentes às etapas da biologia molecular (extração e amplificação do ADN), as amostras reais foram aplicadas ao genossensor para confirmar e validar a eficiência do próprio na deteção de sequências do ADN proveniente de amostras reias. 2.3. Avaliação do genossensor eletroquímico na deteção de ADN de amostras reais O genossensor eletroquímico desenvolvido e otimizado neste trabalho foi usado para detetar as sequências de ADN extraídas e amplificadas das células dos dinoflagelados A. minutum e L. polyedrum e das células humanas do epitélio oral. Visto que o produto de PCR é essencialmente constituído por dsADN, foi necessário fazer um processamento de desnaturação ao ADN amplificado, através da realização de um aquecimento da amostra a 98ºC por 5 minutos, seguido de um arrefecimento imediato num banho de gelo, também por 5 minutos. Este procedimento é obrigatório devido à natureza da cadeia dupla dos amplicons. De seguida, 20 μL do gene amplificado, diluído 1:50, foi adicionado a uma solução contendo a sonda sinalizadora – hibridização homogénea. Depois da reação da hibridização heterogénea (à temperatura ambiente, durante 60 minutos), o sinal eletroquímico foi registado. A figura 52 apresenta os resultados eletroquímicos obtidos quando se usou o ADN amplificado das amostras reias como analito. Como se observa na figura 52, as Inc mais altas (na gama dos 3,0 – 5,0 μA) foram obtidas quando se usou o ADN amplificado das culturas A. minutum (amostras A5, A7 e Sn) como analito. Por outro lado, o ADN amplificado das células algarvias e humanas (Alg e H, respetivamente) registaram sinais eletroquímicos baixos; na mesma ordem de grandeza dos sinais dos ensaios em branco. Estes resultados prendem-se com o facto do ADN amplificado das culturas A. minutum , ser completamente complementar ao ADN que se encontra imobilizado na superfície do elétrodo de trabalho – o ADN de captura – e ao ADN que se encontra marcado, ocorre (na sua totalidade) a reação de hibridação entre as duas cadeias de ADN complementar, enquanto o ADN amplificado da L. polyedrum e do epitélio não conseguem hibridizar com as sondas sinalizadora e de captura, uma vez que não apresentam complementariedade de bases, logo não geram nenhuma corrente elétrica. Para além disso, também se verifica que a influência dos reagentes do PCR é desprezível na corrente analítica e que não há reatividade cruzada com outro ssADN curto presente na amostra. Confirma-se, assim, que o genossensor eletroquímico construído consegue discriminar com uma elevada precisão o ADN de amostras, pela complementariedade do ADN das amostras reais (amostras A5 e A7) e sintética (amostra Sn) de A. minutum e pela não complementariedade do ADN proveniente da L. polyedrum (amostra Alg) e do epitélio oral (amostra H). 80 Cembella, A.D. (2003) Chemical ecology of eukaryotic microalgae in marine ecosystems. Phycologia , 42, pp. 420–447. Chambers, J.P., Arulanandam, B.P., Matta, L.L., Weis, A. & Valdes J.J. (2008) Biosensor Recognition Elements. Current Issues in Molecular Biology , 10, pp. 1-12. Chandra, P., Singh, J., Singh, A., Srivastava, A., Goyal, R.N. & Shim, Y.B. (2013) Gold nanoparticles and nanocomposites in clinical diagnostics using electrochemical methods, Journal of Nanoparticle Research, Springer , pp. 1–12. Chapman, R.L. (2010) Algae: the world’s most important “plants” - an introduction. 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