Biorremediação de efluentes gerados por processos de cozedura da cortiça pela flora microbiana associada a macrófitas indígenas

Bruno Miguel Silva Pimenta Biorremediação de efluentes gerados por processos de cozedura da cortiça pela flora microbiana associada a macrófitas indígenas março de 2024 Biorremediação de efluentes gerados por processos de cozedura da cortiça pela flora microbiana associada a macrófitas indígenas Bruno Miguel Silva Pimenta UMinho|2024 Universidade do Minho Escola de Ciências Bruno Miguel Silva Pimenta Biorremediação de efluentes gerados por processos de cozedura da cortiça pela flora microbiana associada a macrófitas indígenas março de 2024 Dissertação de Mestrado Mestrado em Biodiversidade, Ecologia e Alterações Globais Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Fernanda Maria Fraga Mimoso Gouveia Cássio Universidade do Minho Escola de Ciências ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii AGRADECIMENTOS À Professora Doutora Fernanda Cássio, agradeço a disponibilidade, a orientação prestada, a confiança e o incentivo contínuo em todo o processo. Às técnicas de investigação Doutora Márcia e Doutora Lídia, agradeço a boa disposição, o profissionalismo e a constante disponibilidade. À Doutora Diana Barros e à Doutora Daniela Batista, agradeço a disponibilidade e a orientação prestada no trabalho de laboratório. À empresa areipor/AREIAS PORTUGUESAS, S.A., agradeço o fornecimento dos materiais requisitados e as suas fichas técnicas. À empresa ADRIANO SUREDA TIQUE, HERDEIROS, LDA, agradeço o fornecimento de resíduos provenientes da cozedura da cortiça, bem como a partilha de todo o saber dentro da Indústria. Este trabalho tem o apoio do “Contrato Programa” UIDB/04050/2020 financiado por fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Biorremediação de efluentes gerados por processos de cozedura da cortiça pela flora microbiana associada a macrófitas indígenas RESUMO A natureza tóxica e biorrecalcitrante dos poluentes das águas residuais da cozedura da cortiça torna o seu tratamento biológico um desafio significativo. O presente trabalho insere-se no esforço de viabilizar a tecnologia de sistemas de zonas húmidas construídas para o tratamento de águas residuais da indústria corticeira. Para investigar o efeito de depuração de espécies indígenas de macrófitas com capacidade fitorremediadora, três ensaios em mesocosmos foram desenvolvidos com monocultura de Phragmites australis e co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia . A sequenciação de alto rendimento foi aplicada para investigar a riqueza e diversidade bacteriana e fúngica na rizosfera e filosfera das plantas durante um período de 30 dias expostas ao efluente. Os resultados mostraram que os mesocosmos com monocultura de Phragmites australis apresentaram maior eficiência na remoção de compostos de carbono total (quantificada pela diminuição de carbono total - TC) com taxas de remoção de 46,3%. A taxa de remoção de TC nos mesocosmos com monocultura de Phragmites australis apresentou uma correlação positiva e significativa com o índice de diversidade Shannon da comunidade fúngica presente na rizosfera, enquanto que nos mesocosmos com co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia, a sua taxa de remoção de TC tem uma correlação positiva, mas menos significativa com o índice de riqueza chao1 da comunidade fúngica presente na rizosfera. Os índices de diversidade bacteriana presente na rizosfera apresentaram ser, em média, superiores nos mesocosmos com co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia. Porém, nos mesocosmos com monocultura de Phragmites australis, a sua flutuação apresentou ser mais acentuada durante o tempo de exposição ao efluente. Relativamente ao nicho da filosfera, as alterações das comunidades microbianas da rizosfera afetam o microbioma da filosfera como resultado da interconexão entre os diferentes nichos da planta. Este efeito foi observado na comunidade bacteriana nos mesocosmos com monocultura de Phragmites australis , onde se registou uma similaridade genética entre a comunidade bacteriana da filosfera no tempo 4 e a comunidade bacteriana da rizosfera no tempo 1. Relativamente às comunidades fúngicas presentes na filosfera, os seus índices de diversidade e riqueza diminuíram com o tempo de exposição ao efluente em todos os mesocosmos. Palavras-Chave: água residual da cozedura de cortiça, biorremediação, metagenómica, zonas húmidas construídas. vi Bioremediation of cork cooking wastewater by microbial flora associated with indigenous macrophytes ABSTRACT The toxic and biorecalcitrant nature of the pollutants in cork boiling wastewater make their biological treatment a significant challenge. The present work is part of the effort to make viable the technology of constructed wetland system for the treatment of wastewater from the cork industry. To investigate the purification effect of indigenous macrophyte species with phytoremediation capacity three assays in mesocosms were developed with a monoculture of Phragmites australis and co-association of Phragmites australis and Typha latifolia . Highthroughput sequencing was employed to investigate bacterial and fungal richness and diversity in the rhizosphere and phyllosphere over a period of 30 days. The results showed that the mesocosms with Phragmites australis monoculture had greater efficiency in the removal of total carbon compounds (TC) with removal rates of 46.3%. TC removal rate by Phragmites australis mesocosms had a significant positive correlation with the Shannon diversity index of the fungal community in the rhizosphere. Key words: Biorremediation, constructed wetland, cork boiling wastewater, metagenomic vii ÍNDICE AGRADECIMENTOS .......................................................................................................... iv RESUMO ...................................................................................................................... v LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... ix LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... xv LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS .................................................................... xvi 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1 1.1Recursos hídricos ......................................................................................................................... 2 1.1.1 Disponibilidade de recursos hídricos ...................................................................................... 2 1.1.2.Recursos hídricos no contexto internacional ........................................................................... 4 1.2. Pressões e impactos que comprometem os recursos hídricos ..................................................... 6 1.2.1. Alterações climáticas ............................................................................................................ 7 1.2.2. Poluição ............................................................................................................................... 9 1.3. Necessidade de abastecimento de água ...................................................................................15 1.3.1. Necessidade de abastecimento de água na indústria...........................................................15 1.4. Indústria corticeira ....................................................................................................................16 1.4.1. Tratamento do efluente produzido na cozedura da cortiça ...................................................17 1.5. Biorremediação ........................................................................................................................18 1.5.1. Fitorremediação .................................................................................................................18 1.5.2. Rizodegradação ..................................................................................................................21 1.6. Objetivos ..................................................................................................................................22 2. Materiais e Métodos ........................................................................................... 23 2.1 Germinação e propagação vegetativa de macrófitas indígenas ....................................................24 2.1.1Material Biológico .................................................................................................................24 2.2 Construção dos mesocosmos ....................................................................................................26 2.2.1 Luz .....................................................................................................................................28 2.2.2 Solução nutritiva de Hoagland modificada ............................................................................29 2.2.3 Transplantação e aclimatização do material biológico nos mesocosmos ...............................30 2.3 Amostragem e métodos analíticos .............................................................................................30 xiv Figura 47 - Correlações entre a flutuação dos valores de TP, TC e TN e os índices de diversidade fúngica na filosfera registados no ensaio 1 e do ensaio 2, através da análise de Pearson. * = p < .05; ** = p <.001; *** = p < .0001. ........................................................................................ 53 xv LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Descrição detalhada sobre as diferentes fontes de distribuição da água a nível global e o respetivo volume de água em km3, a percentagem de água doce e a percentagem do total de água ..................... 3 Tabela 2 – Área percentual de montado de sobro, produção média anual em toneladas e percentagem de produção dos países que exploram o setor corticeiro (Adaptado APCOR., 2020). ................................. 16 Tabela 3 - Características químicas do caulino. A sua composição química inclui sílica, alumina, óxido de ferro, óxido de cálcio, óxido de magnésio, óxido de sódio e óxido de potássio e dióxido de titânio com, respetivamente 59.4%, 28.59%, 0.7%, 0.04%, 0.24% e 0.05%, 1.98% e 0.29%, com L.O.I. (Loss on ignition) de 8.59%. ...................................................................................................................................... 26 Tabela 4 – Cálculo das concentrações de macronutrientes, micronutrientes e solução Fe-EDTA para um volume final de 7 litros, respetivos reagentes, massa (g), massa Molar (g/M), Mole (M) e Molaridade (M/L). ..................................................................................................................................................... 29 Tabela 5 – Características do efluente bruto e diluído sobre os parâmetros TN (mg/L), TP (mg/L), CQO (mg/L), ph (19ºC) e TPF (mg/L). ..................................................................................................... 31 Tabela 6 – Índices de riqueza e diversidade bacteriana na rizosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2. .................................................................................................................................................. 42 Tabela 7 – Índices de riqueza e diversidade bacteriana na filosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2. ..................................................................................................................................................... 45 Tabela 8 - Índices de riqueza e diversidade fúngica na rizosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2. ..................................................................................................................................................... 49 xvi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS ADN - ácido desoxirribonucleico Ag - Prata Al - Aluminio CBO - carência bioquímica de oxigénio Cd - Cádmio CQO - carência química de oxigénio Cr - Crómio CS - Combined Systems Cu - Cobre DAC - Disponibilidade de água per capita DCH - Disponibilidade de captação hídrica ddH2O - água esterilizada ultrapura DQA - Diretiva-Quadro da Água ETARs - Estações de Tratamento de Água Residual Fe - Ferro Fe-EDTA - ácido férrico etilenodiaminotetracético FWS - Free Water Surface GBIF - Global Biodivercity Information Facility Hg - Mercúrio HSSF - Horizontal Subsurface Flow IS - Intensified System lm - Lumens L.O.I. - Loss on ignition Mn - Manganês N - Azoto nano-Fe2O3 - nano-óxido de ferro nano-TiO2 - nano-dióxido de titânio Ni - Niquel xvii ODM – Objetivos de Desenvolvimento do Milénio ODS - Objetivos de Desenvolvimento Sustentável P - Fósforo PF - Produtos farmacêuticos POPs - Poluente Orgânicos Persistentes Sn - Estanho TC - Total de carbono TN - Total de azoto TP - Total de fósforo TPF - Total de polifenóis TSS - total de sólidos suspensos UE – União Europeia VF - Vertical Flow Zn - Zinco 1. INTRODUÇÃO 2 1.1 Recursos hídricos Tratando-se de um recurso natural de carácter insubstituível, o debate sobre a água compreende uma peculiar transparência de questões técnicas, sociais, económicas, culturais e naturais (Schmidt &Ferreira, 2014). Na medida em que a água é um recurso significativo para o desenvolvimento socioeconómico e para a proteção de ambientes saudáveis (Xiang et al., 2021), as suas questões apresentam-se atualmente incluídas numa série de desafios à escala mundial (Mukherjee et al., 2020). Num contexto em que a escassez de água afeta cerca de 40% da população mundial, o que está em causa é garantir a gestão sustentável e a disponibilidade do recurso para as necessidades societais e ambientais (Ferreira et al ., 2018). 1.1.1 Disponibilidade de recursos hídricos Ocupando 71% da superfície do planeta Terra, 96.5% deste recurso encontra-se retido nos oceanos, 0.9% na forma de outras águas salinas e apenas 2.5% na forma de água doce (https://www.usgs.gov). Como podemos observar na Fig.1, o diminuto volume de água doce que, como se encontra distribuída de forma díspar por todo o planeta, restringe o total de água disponível a ser aproveitada para as atividades antropogénicas e naturais, a uma porção relativamente pequena (Shaw, 2021). Figura 1 - Os histogramas representam a distribuição percentual relativa ao total de água, a distribuição percentual referente ao total de água doce e a distribuição percentual alusiva ao total de água de superfície e outras formas de águas doces ( https://www.usgs.gov). 3 O total de recursos renováveis de água doce de um país, pode ser calculado pelo volume total do escoamento dos seus rios, em adição à recarga natural das águas subterrâneas, mais o volume total de fluxo real dos rios provenientes de países fronteiriços, suplementado pela água armazenada em lagos, reservatórios, calotes polares e águas subterrâneas fósseis (DG ENV – EC, 2007). Todavia, após centenas de anos daquilo que parecia ilimitado e barato, os recursos hídricos estão finalmente a ser reconhecidos como finitos (Tabela 1) e insustentáveis no seu modo de utilização (Laud et al., 2020). 2,120 0.006 0.0002 1,120 0.003 0.0001 12,900 0.04 0.001 11,470 0.03 0.0008 91,000 0.26 0.007 85,400 0.006 300,000 0.86 0.022 176,400 0.013 30.1 0.76 12,870,000 0.93 16,500 0.05 0.001 Atmosfera Zonas húmidas Rios Água biológica 1,338,000,000 24,064,000 68.7 23,400,000 Salgada Humidade do solo Permafrost e gelo subterrâneo Lagos Doce Salgada % do total de água Oceanos, mares e baías Calotas de gelo, glaciares e neve permanente Águas pluviais Doce 96.54 1.74 1.69 10,530,000 Fonte de água Volume de água em km³ % de água doce Tabela 1 - Descrição detalhada sobre as diferentes fontes de distribuição da água a nível global e o respetivo volume de água em km3, a percentagem de água doce e a percentagem do total de água 4 Os desafios inerentes aos recursos hídricos emergem com a intensificação de determinadas atividades antropogénicas, que marcam o desenvolvimento humano desde a Revolução Industrial (Klages et al ., 2020). A diminuição do volume de água subterrânea, o desaparecimento de zonas húmidas, a indisponibilidade de água de boa qualidade e a sobreexploração de água doce, que se destina a satisfazer as necessidades societais (Mukherjee et al ., 2020) repercutem uma inequívoca insustentabilidade do recurso (Ferreira et al ., 2018). Neste contexto, para assegurar o bom estado dos recursos hídricos e garantir a proteção e segurança dos ecossistemas de água doce, torna-se fundamental congregar o envolvimento cívico a uma governança participativa, assente numa lógica holística e sistémica, que se revela crucial para a implementação de um desenvolvimento sustentável em todas as fases do processo de gestão de água (Ferreira et al ., 2018; Guerra & Lourenço, 2018). 1.1.2.Recursos hídricos no contexto internacional A aplicação de políticas nacionais e supranacionais incitadas pela realização de múltiplos eventos dedicados à proteção dos recursos hídricos, impeliu uma visão amplificada e simultaneamente preocupada com a sustentabilidade do recurso e as necessidades básicas dos cidadãos (Schmidt & Ferreira, 2014). Deste modo, a Assembleia Geral das Nações Unidas aprova a designada “Declaração do Milénio da Nações Unidas” (Vieira, 2015). Esta declaração representa oito Objetivos de Desenvolvimento do Milénio (ODM) que, neste contexto, destaca-se o objetivo sete, com a meta de reduzir para metade a população mundial desfavorecida pelo acesso a água potável e saneamento básico até 2015 (Machete & Marque., 2021). Dada a inquietação social e política à escala europeia, os Estados-Membros aprovam a Diretiva 2000/60/EC ou Diretiva-Quadro da Água (DQA), tornando-se o principal instrumento da política da água da União Europeia (UE) (Ferreira et al ., 2018). Contudo, os seus objetivos continuam a representar um desafio perante a legislação da UE em matéria de água, uma vez que 47% das águas superficiais não apresentaram as condições de um bom estado ecológico em 2015 conforme previsto (Almeida et al., 2021). Apesar dos esforços realizados para o cumprimento dos ODM, cujos resultados refletem décadas de negociações internacionais e de iniciativas que visam estruturar o desenvolvimento mundial (Ahmed, 2021), o seu progresso está longe de colmatar os impactos negativos de uma sociedade consumidora cada vez mais globalizada (Guerra & Lourenço, 2018). Deste modo, os ODM declarados em 2000, são agora os precursores dos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) (Song, 2021). 5 A Agenda 2030 integra 17 ODS que representam um marco no cenário internacional de políticas sustentáveis (Fig. 2) (Bornemann & Weiland, 2021). Esta agenda ambiciosa exige uma reconsideração sobre os princípios e as práticas governamentais previamente estabelecidas (Bornemann & Weiland, 2021) e estabelece 169 metas que servem como modelo para uma transição sustentável à escala mundial (Weiland et al ., 2021). Neste contexto, sublinha-se o tema “ Leaving no one behind ”, que reflete uma ideia de envolvimento transversal no sentido em que o acesso universal à água potável e saneamento, contribui significativamente para a realização de um conjunto de metas presentes na Agenda 2030 (WWDR, 2019). Figura 2 - 17 Objetivos do Desenvolvimento Sustentável (ODS) da Agenda 2030. (https://unric.org). Figura 3 - ODS número 6 como fator de conexão essencial para cumprir os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (WWDR, 2019). 12 Por outro lado, a dispersão global de pesticidas no meio ambiente ameaça a funcionalidade ecológica dos ambientes aquáticos devido à toxicidade sinergética que pode provocar em organismos não-alvo sob exposições agudas e crónicas (Tang et al ., 2021; Pimentão et al ., 2020). Estes agroquímicos incluem centenas de ingredientes ativos que se distinguem pela sua propriedade química, comportamento ambiental, reação às medidas de mitigação específicas e ecotoxicidade (Chow et al., 2020). O seu uso intensivo e descontrolado constitui um risco para os recursos hídricos (Pirsaheb et al., 2017; Srivastav, 2020). A sua ocorrência nos corpos de água superficiais deriva essencialmente de eventos associados ao escoamento de água, drenagem e pulverização (Rico et al ., 2021). Esta categoria de poluentes contamina adicionalmente os recursos de água subterrânea de vários Estados-Membros Europeus (Fig. 10) (EEA., 2018) e afeta os recursos de água potável na Europa (Wuijts et al., 2021). Embora os agroquímicos sintéticos sejam considerados uma ferramenta critica para a segurança alimentar (Baweja et al., 2020), as suas repercussões são visíveis em proporções globais, registando-se que 74.8% (28.8 milhões Km2) de solo agrícola encontra-se sob o risco de contaminação por pesticidas, dos quais 0.62 milhões Km2, representam regiões onde ocorrem Figura 10 - Visão geral dos contaminantes presentes nas massas de água pluviais na Europa. A cor amarela ilustra o Número de Estados Membros afetados pelos respetivos poluentes e a cor azul representa em proporção percentual a área de corpos de água subterrânea comprometida pelos mesmos. Adaptado de EEA., 2018. 13 episódios desde escassez total de água a uma variabilidade relativamente elevada quanto à sua disponibilidade (Fig. 11) (Tang et al ., 2021). Em consequência da elevada afinidade destes agroquímicos com o solo e da estreita interconexão do solo com os corpos de água, os recursos hídricos superficiais e pluviais encontram-se suscetíveis à contaminação por pesticidas (Syafrudin et al., 2021). Estatisticamente, a relação entre o crescimento populacional e o uso de pesticidas mostra ser significativa para a categoria de herbicidas, não se registando qualquer relação entre a rápida urbanização e o consumo de pesticidas (Hedlund et al., 2020). No entanto, a rápida urbanização e o crescimento populacional revelam ser os principais fatores que contribuem para a presença de derivados farmacêuticos nos sistemas de água doce (Yuan et al ., 2020). Produtos farmacêuticos (PF) encontram-se geralmente presentes nas águas superficiais, pluviais, águas destinadas ao consumo doméstico e em sistemas de esgotos, com concentrações que variam desde ppt (ng/L) a ppb (µg/L) (Ahamad et al., 2020). Uma vez que os produtos farmacêuticos consistem numa complexa mistura de constituintes individuais, a sua toxicidade no meio ambiente expressa-se ou por sinergismo ou por antagonismo (Kar et al .,2020). A sua persistência após tratamento é devido à baixa eficiência das tecnologias de tratamento convencionais, tornando as Estações de Tratamento de Água Residual (ETARs) as principais fontes Figura 11 - Mapa global das regiões que apresentam elevado risco de poluição por pesticidas, elevado risco de escassez no abastecimento de água e de biodiversidade. A escala representa o nível de preocupação relativamente aos três fatores referidos, registando-se pelos círculos vermelhos o nome do país, a bacia hidrográfica e a área de impacto das regiões que apresentam um elevado nível de preocupação. Adaptado de Tang et al ., 2021. 14 de poluição pontual de PF dos recursos hídricos (Felis et al., 2020; Rodrigues-Mozaz et al 2020; Hena et al., 2021). Esta categoria de poluente está classificada como contaminante de preocupação emergente, que inclui da mesma forma os pesticidas, nanomateriais e microplásticos (Arrigo & Baroni., 2020). Por sua vez, os microplásticos, caraterizados pela sua grande área de superfície, elevada porosidade e hidrofobicidade, proporcionam um substrato artificial para a adesão de biofilmes que, consequentemente, contribuem para a acumulação de produtos farmacêuticos, metais pesados e poluentes orgânicos persistentes (POPs) nos corpos de água (Zhou et al ., 2020; He et al ., 2021). POPs consistem em compostos químicos orgânicos com carateristicas persistentes, elevada toxicidade e estabilidade ambiental, caracterizando-se também por serem bioacumuláveis com capacidade de se difundirem a longas distancias (Sun et al., 2020); Devido ao seu carácter recalcitrante e persistência ambiental, a poluição dos recursos hídricos por poluentes orgânicos constitui um problema ambiental crítico presente em todo mundo (Lu & Astruc, 2020; Vasseghian et al., 2021). As principais fontes de poluição de POPs revela ser a imprópria descarga de efluentes industriais, seguindo-se pelo efluente de águas residuais, devido à ineficiência das tecnologias de tratamento físico e químico existentes (Khasawneh & Palaniandy, 2021). Esta categoria de poluentes para além de contaminar os recursos hídricos, produz efeitos negativos na estrutura e função dos ecossistemas aquáticos (Yuan et al ., 2020); (Vasseghian et al., 2021). Embora a sua eliminação tenha sido aprovada por vários países na Convenção de Estocolmo, ratificado pela UE em 2004 (https://www.asae.gov.pt/), outros compostos químicos têm sido propostos como cadidatos a POPs com o intuito de serem acrescentados à lista definida pelas Nações Unidas (Nguyes et al., 2020). Apesar do conhecimento atual sobre as diversificadas fontes de poluição dos recursos hidricos e os seus efeitos adversos ao meio ambiente, torna-se cada vez mais urgente reformular estratégias para mitigar a contaminação da água, uma vez que a necessidade em água limpa e segura é constante (Tzanakakis et al., 2020; Kumar et al., 2020). 15 1.3. Necessidade de abastecimento de água À escala mundial, impulsionado por uma combinação entre crescimento populacional, alteração dos padrões de consumo e o desenvolvimento socioeconómico, o consumo de água doce apresenta aumentos anuais de aproximadamente 1% (Krutov et al., 2020). Devido essencialmente à crescente necessidade de abastecimento no setor industrial e doméstico, prevêse que a procura global de água continue a aumentar a uma taxa semelhante até 2050, o que representa um aumento entre 20 e 30% acima do nível atual de uso da água (Fig. 12) (WWDR, 2019). Embora 70% das extrações mundiais de água sejam discriminadas para o uso agrícola, a necessidade de água para fins domésticos e industriais irá aumentar a um ritmo superior ao do setor agrícola (Weerasooriya et al., 2021). 1.3.1. Necessidade de abastecimento de água na indústria As captações realizadas pelo setor industrial (incluindo o setor energético), representam 19% dos recursos mundiais de água doce, valor que, em 2050, se estima atingir os 24% com aumentos absolutos na Ásia e na Europa (WWDR., 2020). Em Portugal, as necessidades de abastecimento de água doce correspondem a 7500 ×106 m3/ano, dos quais 350 ×106 m3/ ano são devidos ao setor Industrial (PNUEA), sendo o setor de transformação, com 84% do consumo industrial total, o maior consumidor de água (Almeida, 2019). Figura 12 - Necessidade de captação e consumo de água por setor à escala global, respetivamente ao ano 2014, 2025 e 2040, que confirma uma tendência de aumento na captação e consumo de recursos hídricos. O setor agrícola em comparação com os outros setores, embora apresente uma diminuição na sua participação no uso total de água, continua e continuará a ser o maior utilizador em termos de captação e consumo (WWDR, 2020). Fonte: (WWDR., 2019). 16 1.4. Indústria corticeira No que concerne à indústria de transformação, o setor corticeiro destaca Portugal como líder mundial na produção de cortiça, com 46% e 85 mil toneladas (tabela 2) (APCOR, 2020). Tabela 2 – Área percentual de montado de sobro, produção média anual em toneladas e percentagem de produção dos países que exploram o setor corticeiro (Adaptado APCOR., 2020). País Área Montado de Sobro (%) Produção anual média (toneladas) Percentagem da Produção Portugal 34% 85 145 46% Espanha 27% 61 504 33% Marrocos 18% 11 686 6% Argélia 11% 9 915 5% Tunísia 4% 6 962 4% Itália 3% 6 161 3% França 3% 5 200 3% Embora a produção e extração da cortiça serem frequentemente apresentadas como exemplo de produção sustentável (Monteiro, 2014), a sua transformação requer consumos significativos de água (Duarte, 2015). Após a extração, seleção, estabilização e maturação da matéria-prima, a cortiça passa por um processo de cozedura (Fig.13), designado cozimento, que altera as suas propriedades físicas, extrai compostos hidrossolúveis, desinfeta e facilita o subsequente processo de corte (Couceiro, 2015; Barrigón Morillas et al ., 2021). Neste processo a cortiça é cozida em água a temperatura de 100ºC por um período de 1 a 2 horas (Garcia-Costa et al ., 2020). Uma segunda cozedura, denominada de “escalda”, ocorre posteriormente com o objetivo de amaciar a cortiça, tem uma duração de 30 minutos (Couceiro, 2015). De modo a garantir a qualidade organolética do vinho e a economia de energia e água, o potencial de reutilização de água na cozedura de cortiça é limitado para 20 ciclos (Panizio, 2020). Figura 13 - Exemplos de caldeiras utilizadas no processo de cozedura de cortiça. A figura à esquerda representa uma caldeira tradicional e à direita uma caldeira convencional. 17 Este processo requer entre 400-1200 L de água por cada tonelada de cortiça processada (Panizio., 2020; Gomes et al., 2020). Como resultado, por cada tonelada de cortiça processada obtém-se entre 200-400 L de água residual com carácter recalcitrante, elevada carga orgânica, baixa biodegradação e de natureza tóxica, devido à presença de compostos fenólicos e polifenólicos (Fernandes et al., 2019; Alexandre et al., 2020). Tendo em consideração as características do efluente, a sua descarga sem tratamento prévio constitui um risco para os ecossistemas aquáticos (Madureira et al., 2017). 1.4.1. Tratamento do efluente produzido na cozedura da cortiça Para reduzir a carga orgânica e promover a biodegradação do efluente, o método de tratamento inicial/primário consiste numa aplicação prévia de coagulação/floculação (Pintor et al., 2010). A utilização de sais permite a eliminação da carga electroestática negativa da superfície das partículas suspensas e coloidais (Pavanelli, 2001; Jorge et al., 2021). As partículas neutralizadas formam flocos com a introdução de um polímero floculante (Sun et al ., 2021), ocorrendo o processo de sedimentação gravítica quando o floco atinge a densidade e o tamanho ótimo (Lim et al., 2022). Numa aplicação a larga escala, a eficiência do método de coagulação/floculação depende do efeito de vários fatores que condicionam as condições do processo, nomeadamente o tipo e a dose aplicada de coagulante/floculante, pH, concentração inicial dos compostos presentes no efluente e temperatura do mesmo (Gomes, 2002; Zhao et al ., 2021). Embora seja um método que atinja determinada eficiência no processo de redução da carência química de oxigénio (CQO), os restantes contaminantes inibem o subsequente método convencional de tratamento biológico (Wu et al ., 2018). A comunidade e atividade dos microrganismos presente nos sistemas anaeróbios é influenciada por uma série de fatores que incluem a temperatura, condutividade, presença de sulfatos, fósforo, metais pesados e elevadas concentrações de outros poluentes (Ritigala et al ., 2021). Além do fato de produzir uma quantidade significativa de lamas, este tratamento requer a adição de fósforo e outros nutrientes, para acelerar os processos metabólicos, e necessita de regular operação/manutenção, uma vez que a sua performance é influenciada não só pelas características do influente (e.g., total de sólidos suspensos (TSS), carência química de oxigénio (CQO), carência bioquímica de oxigénio (CBO), alcalinidade) que condiciona a comunidade microbiana presente no reator, mas também por fatores ambientais e por parâmetros operacionais (Gomes, 2015); (Ali et al., 2020). 18 A toxicidade exercida pelos compostos fenólicos e polifenólicos ainda persistentes no efluente, tornam o tratamento biológico deste tipo de água residual um desafio significativo (Ge et al ., 2018). Deste modo, os métodos de tratamento biológico convencional são caraterizados por elevados consumos energéticos e limitada sustentabilidade ambiental, ao que se acrescenta a dificuldade em atender aos requisitos rigorosos de qualidade de efluente, sendo, portanto, necessário implementar novas tecnologias que cumpram com os princípios de sustentabilidade e que promovam a eficiência no tratamento de águas residuais (Gomes et al ., 2020; Vymasal et al., 2021). 1.5. Biorremediação A biorremediação é um sistema focado nos processos biológicos desempenhados por organismos, que envolvem a degradação, remoção, alteração, imobilização e desintoxicação de vários resíduos físicos e químicos (Sharma et al., 2021; Ghosh et al ., 2021). A conversão de poluentes orgânicos e inorgânicos, entre outros contaminantes, em dióxido de carbono, água, sais inorgânicos, biomassa e outros produtos menos tóxicos, é realizada por bactérias, fungos, algas e plantas (Gotalpeh et al ., 2013; Sutherland & Ralph, 2019; Braragava et al., 2020; Ojha et al ., 2021). Os diferentes tipos de biorremediação incluem a remediação microbiana, micorremediação, ficorremediação e fitorremediação (Khalib et al ., 2021; Mirshad et al ., 2022). 1.5.1. Fitorremediação A fitorremediação é uma técnica sustentável de tratamento de água e solos contaminados, que utiliza uma variedade de plantas que, por processos biológicos, removem, acumulam ou decompõem substâncias tóxicas em sistemas poluídos (Rai, 2009). A construção de zonas húmidas é uma tecnologia ecológica, capaz de realizar o tratamento de desperdícios orgânicos e inorgânicos em estado líquido (águas residuais) e sólido (lamas e solos contaminados) (Fu et al ., 2018; Xiang et al., 2020; Vymasal et al., 2021). A vegetação é essencialmente constituída por plantas com capacidade fitorremediadora, que apresenta um aumento significativo de biomassa na presença de contaminantes, em níveis que são tóxicos para a maioria das plantas (Miretzky et al ., 2004). A resiliência destas plantas está dependente de certas propriedades que incluem: tolerância aos tóxicos presentes no efluente, capacidade de extração e acumulação, transformação, volatilização ou degradação de múltiplos contaminantes (Evangelou et al., 2007; Rahman & Hasegawa, 2011; Oliveira, 2013). 19 No estado atual de desenvolvimento tecnológico, existem cinco tipos de sistemas de zonas húmidas que apresentam um uso difundido (Fig. 14) (Kadlec & Wallace, 2008; Wu et al., 2015): • Free Water Surface (FWS): a água que corre nestes sistemas encontra-se numa área aberta, com uma aparência semelhante aos pântanos naturais. • Horizontal Subsurface Flow (HSSF): nestes sistemas é utilizado um leito com substrato e fragmentos rochosos, plantado com vegetação típica das zonas húmidas. O escoamento da água ocorre sob a superfície do leito, fluindo horizontalmente. • Vertical Flow (VF): a água flui sobre uma superfície de areia ou fragmentos rochosos, plantada com vegetação de zonas húmidas. A água é tratada à medida que se infiltra e flui pelas raízes das plantas. • Combined Systems (CS): consiste na combinação sequenciada de sistemas, de modo a maximizar a performance do tratamento pretendido. • Intensified System (IS): utilizado para o tratamento de águas residuais que contêm uma elevada carga de poluentes. O custo operacional destes sistemas é normalmente mais elevado, no entanto minimiza a área necessária para a sua implementação. Figura 14 - Relação entre os custos energéticos necessários para a operação/manutenção e a área necessária para a implementação dos sistemas. A: FWS; B: HSSF; C: VF; D: CS e IS (Adaptado Wu et al ., 2015). 20 Do ponto de vista técnico-económico, a tecnologia de sistemas de zonas húmidas construidas tira vantagem nos custos inerentes à construção/operação do sistema, e que, tendo em consideração a particular e complexa interdependência entre água e energia (PNUEA), proporciona uma estratégia relativamente eficaz em termos de necessidade energética (Maucieri et al ., 2017; Fahid et al .,2020). Dado que estes sistemas possuem a capacidade de suportar múltiplos contaminantes, ao que se acrescenta a crescente evidência de que a seleção de macrófitas é uma passo importante para a eficiência do sistema (Vymasal et al., 2021), a escolha criteriosa das espécies vegetais a utilizar requer conhecimento tanto das características físico-químicas do efluente a tratar, como das propriedades,capacidades e mecanismos desempenhados por cada espécie de planta. Os mecanismos que afetam a concentração, mobilidade e toxicidade dos contaminantes incluem: • Fitoextração: requer o conhecimento sobre os processos básicos de absorção elementar, translocação, (hiper)-acumulação e tolerância da planta (Freitas et al ., 2009); • Fitovolatilização: geralmente resulta numa diluição substancial e posterior decaimento foto-químico na atmosfera (Limmer & Burken, 2016); • Fitoestabilização: pode ocorrer através de absorção, precipitação, complexação ou redução do nº de valência dos metais. Reduz a mobilidade de contaminantes e a disponibilidade biológica de metais na cadeia alimentar (Etim, 2012); • Fitodegradação: também reconhecido como fitotransformação, evolve a degradação de contaminantes através de processos metabólicos ocorridos dentro da planta (Abdullah et al., 2020); • Fitodessalinização: utilização de plantas halófitas para reduzir a salinidade de águas residuais (Parveen et al ., 2022); • Rizofiltração: inclui filtração, absorção, sedimentação e precipitação por processos geoquímicos (Mthembu, 2016). A sobrevivência de macrófitas emergentes em solos inundados é geralmente limitada pelo nível de oxigénio e potencial presença de substâncias fitotóxicas. Todavia, para além de se adaptarem a um amplo espectro de condições abióticas (Pietrangelo et al ., 2018), as macrófitas possuem a capacidade de criar condições aeróbicas na rizosfera através de arejamento interno, 21 que resulta na libertação de oxigénio dos espaços intercelulares da raiz para o substrato inundado (Soukup et al ., 2002; Faußer et al., 2012). A rizosfera representa um complexo nicho ecológico constituído por comunidades microbianas presentes no volume de solo influenciado pelo sistema radicular das plantas (Manriquez et al., 2021). A utilização de oxigénio como recetor de eletrões em condições de redução-oxidação, permite que os microrganismos degradem os compostos orgânicos em moléculas mais simples como água e dióxido de carbono, através do processo de respiração aeróbica (Tomer et al., 2021). Embora o desempenho de purificação seja atribuído a um conjunto de mecanismos de remoção, nomeadamente sedimentação, filtração, precipitação, volatilização e absorção por parte das plantas, é reconhecido que a degradação das substâncias poluentes se deve principalmente à atividade microbiana presente na rizosfera das plantas (Meng et al ., 2014; Xiang et al .,2020). 1.5.2. Rizodegradação Quando as plantas apresentam desenvolvimento de biomassa na presença de contaminantes, os microrganismos que desencadeiam mecanismos de desintoxicação proliferam entre as comunidades indígenas presentes na rizosfera (Urana et al., 2020). A rizodegradação é o mecanismo de degradação desempenhado pela flora microbiana associada às raízes da planta, numa interação microrganismo-planta (Rane et al ., 2022). As plantas possuem a capacidade de estimular a atividade microbiana através da secreção de exsudatos radiculares ricos em aminoácidos, hidratos de carbono e flavonoides (Kumar et al., 2020; Ahmad et al ., 2021). A libertação de exsudatos ricos em nutrientes, aumentam as fontes de carbono e azoto no solo, tornando-o propício para o crescimento e atividade microbiana. (Allamin et al., 2020; Tondera et al., 2021). Em troca, seres endófitos (bactérias e fungos) expressam um conjunto de mecanismos benéficos para o crescimento do hospedeiro e, conjuntamente com determinadas enzimas libertadas pela planta, desempenham um papel importante na degradação de substâncias orgânicas e inorgânicas (Sharma & Kumar, 2021; Gupta et al ., 2021; Rane et al ., 2022). Esta conexão simbiótica entre planta-microrganismos, constitui uma estratégia prática e um bio-recurso valioso na aplicação de técnicas de biorremediação de substâncias tóxicas (Lopez et al., 2012; He et al., 2019; Allamin et al ., 2020). Na tabela em anexo I, podemos observar a perfornance de diversos sistemas de zonas húmidas na depuração de diferentes poluentes. 28 Todos os mesocosmos foram revestidos com folha de alumínio para prevenir a possível foto-degradação dos compostos orgânicos ao nível do substrato (Dias et al ., 2020) e inseridos numa sala termostatizada com temperatura constante a 18ºC. 2.2.1 Luz A luz é um recurso fundamental para as plantas que encontra envolvida essencialmente em três processos: fotossíntese, processo através do qual as plantas convertem a energia da luz em energia química; fotomorfogénese, processo que determina o desenvolvimento da estrutura ou forma da planta; e o fototropismo, onde é desenvolvida uma resposta de crescimento por parte das plantas induzida por luz lateral (Duysens, 1959; Nemhauser & Chory, 2002; Whippo & Hangarter, 2006). As espécies provenientes de ambientes com elevada variabilidade de luz, possuem uma estratégia de elevada plasticidade, que maximiza a captação de carbono (Ojanguren & Goulden, 2013). As caraterísticas fotossintéticas de espécies provenientes de zonas húmidas, afeta diretamente a capacidade de libertação oxigénio para o microbiota presente na rizosfera, o que influência consequentemente a eficiência de descarga em zonas húmidas construídas (Mburu, 2013). Deste modo, para o sistema de iluminação foram utilizados LED’s “Twinstar Light 60 B”, que apresentam um fluxo luminoso de 1741 lm (Lumens) e que compreende o espectro luminoso necessário para o processo de fotossíntese (Fig. 24). Figura 23 - Tubo de distribuição da solução nutritiva utilizado na fase de aclimatização. Em toda a sua modificação foram utilizados materiais que não comprometem ou alteram a composição química da solução nutritiva administrada, simulando em simultâneo o fluxo horizontal pretendido. Figura 22– Disposição das bombas hidráulicas nos mesocosmos. A linha a tracejado vermelho encontra-se a 18 cm de altura a partir da camada de caulino. Assinalada com a seta, a linha de cor amarela representa o nível de água pretendido para o ensaio. A estabilização do substrato foi realizada com a adição da solução nutritiva, que permaneceu a uma altura de 18 cm para proceder com a transplantação das macrófitas. 29 Uma vez que as espécies de plantas utilizadas no presente ensaio apresentam um elevado crescimento de biomassa na presença de ótimas condições luminosas (Gucker, 2008; Priscilla et al ., 2010), o fotoperíodo foi estabelecido para as 16/8 horas de luz/noite. A instalação do sistema luminoso foi acompanhada com a transplantação das macrófitas para os mesocosmos, seguido da adição de nutrição com a solução de Hoagland modificada, com o intuito de minimizar o stress induzido às plantas e iniciar a fase de aclimatização. 2.2.2 Solução nutritiva de Hoagland modificada Para promover o crescimento vegetativo de macrófitas em laboratório, foi elaborada uma solução nutritiva com composição química em conformidade com os requisitos nutricionais das plantas. Deste modo, e tendo em conta os valores do indicador de Ellenberg (Packer et al ., 2017), para o fornecimento de ferro foi realizada uma solução Fe-EDTA (Steiner & van Winden, 1970), posteriormente introduzida na solução modificada com concentrações que promovem o crescimento de biomassa (Tylová et al ., 2013) (Tabela 4). Figura 24– A figura à direita corresponde ao espectro de energia radiante visível, que abrange comprimentos de onda desde 390 nm (violeta) até cerca de 700 nm (vermelho) e a respetiva absorção da clorofila a e b dentro desse espectro. Adaptado de Mestre, 2014. À esquerda encontram-se os LED’s utilizados nos ensaios que incorporam luz azul, verde, vermelha e branca. Tabela 4 – Cálculo das concentrações de macronutrientes, micronutrientes e solução Fe-EDTA para um volume final de 7 litros, respetivos reagentes, massa (g), massa Molar (g/M), Mole (M) e Molaridade (M/L). 30 Para estabilizar as macrófitas no sistema, os mesocosmos foram inicialmente aclimatizados com solução nutritiva de Hoagland modificada durante 6 semanas, de maneira a permitir a criação de biofilmes na rizosfera e no sistema (Dias et al ., 2020). Para colmatar os níveis de evapotranspiração durante a aclimatização, a solução era novamente introduzida até ao nível de água pretendido (19 cm). 2.2.3 Transplantação e aclimatização do material biológico nos mesocosmos Na transplantação foi utilizada água desionizada para retirar qualquer sedimento presente no sistema radicular das plantas, seguido de imediata colocação da planta no mesocosmos. Para proporcionar a estabilidade necessária foi adicionado substrato constituído por areia de grão fino (2-3.2 mm). Uma vez transplantadas, todas as plantas no mesocosmos foram preenchidas com substrato na sua totalidade, para posterior adição de solução nutritiva de Hoagland modificada e início de aclimatização (Fig. 25). A recolha de efluentes gerados por processos de cozedura de cortiça foi realizada durante a fase de aclimatização, na freguesia de Azaruja, Distrito de Évora, onde foram recolhidos 60 litros de efluente diretamente da caldeira de cozedura da empresa “ADRIANO SUREDA TIQUE, HERDEIROS, LDA.”. A água residual foi armazenada numa câmara fria com temperaturas entre os 4-6ºC de modo a evitar a degradação dos compostos orgânicos antes de alimentar os mesocosmos (Gomes et al ., 2018). 2.3 Amostragem e métodos analíticos 2.3.1 Composição química do efluente bruto gerado por cozedura de cortiça As análises químicas ao efluente para o parâmetro total de polifenóis (TPF), total de azoto (TN), total de fósforo (TP) e total de carbono (TC), foram realizadas no Centro de Apoio Científico e Tecnolóxico á Investigacíon (C.A.C.T.I.), na Universidade de Vigo, sendo também determinado os diferentes perfis de compostos polifenólicos específicos presentes no efluente bruto recolhido, nomeadamente ácido gálico, aldeído protocatecuito, ácido protocatecuito, ácido vanílico, ácido ferúlico, ácido caféico e ácido elágico (Fig. 26). Figura 25 – Sistema radicular de Phragmites australis durante a transplantação do material biológico. Trocas de água desionizada regulares para retirar qualquer sedimento presente no sistema radicular. 31 Tendo em conta que a elevada concentração de compostos fenólicos provoca um efeito de inibição na degradação dos mesmos (Gomes et al ., 2020), o efluente bruto foi sujeito a uma diluição de 1:10 com água desionizada e posteriormente ajustado para uma concentração de total de polifenóis de 65 mg/L (Tabela 5). Embora a diluição do efluente não seja praticada para o tratamento preliminar anaeróbico e aeróbico, torna-se um requisito eficaz que reduz a fitotoxicidade de efluentes característicos pela presença de compostos polifenólicos (Fig. 27) (Arienzo et al ., 2009; Rusan et al ., 2016). Tabela 5 – Características do efluente bruto e diluído sobre os parâmetros TN (mg/L), TP (mg/L), CQO (mg/L), ph (19ºC) e TPF (mg/L). Índice TN (mg/L) TP (mg/L) CQO (mg/L) pH (19º C) TPF (mg/L) Efluente bruto 46,8 13,3 2880 5,25 690 Efluente diluído 4,41 1,25 271,4 5,46 65 Figura 27 – No gobelé à esquerda encontra-se o efluente bruto, de cor castanho escuro, com pH: 5,25 (19ºC), TPF (mg/L): 690, TN (mg/L): 46,8, TP (mg/L): 13,3 e CQO (mg O2/L): 2880. À direita encontra-se o efluente diluído, de cor castanho claro, com pH: 5,46 (19ºC), TPF (mg/L): 65, TN (mg/L): 4,41, TP (mg/L): 1,25 e CQO (mg O2/L): 271,4. 1 2 3 4 5 6 7 Figura 26 – Formula estrutural dos compostos fenólicos específicos. 1 – ácido gálico, 2 – ácido protocatecuito, 3 – aldeído protocatecuito, 4 – ácido vanílico, 5 – ácido ferúlico, 6 – ácido caféico, 7 – ácido elágico. Adaptado de Zhao et al .,2011; Zhang et al ., 2021; Mattos, 2009; Castor, 2013; Freitas, 2016; Degáspari et al., 2005. 32 2.3.2 Desenho experimental Para analisar o efeito depurador realizado por plantas indígenas, a experiência consistiu na realização de três ensaios em mesocosmos diferenciados pela co-associação das espécies macrófitas Phragmites australis e Typha latifólia. Na figura 28 podemos observar a disposição do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2 e o desenho experimental esquematizado. Controlo (AA) (A) (A) R1 (A) (A) R2 (A) (A) R3 Réplicas Solução Hoagland modificada Ensaio 1 (AA) (A) (A) R1 (A) (A) R2 (A) (A) R3 Efluente (Diluição 1:10) Ensaio 2 (AB) (A) (B) R1 (A) (B) R2 (A) (B) R3 Efluente (Diluição 1:10) Figura 28 – Disposição do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2 na fase final de aclimatização. À esquerda vemos o ensaio controlo, no meio o ensaio 1 e à direita o ensaio 2. Cada ensaio possui 3 réplicas na qual as letras “AA” representam a macrófita Phragmites australis e as letras “AB” representam a macrófita Phragmites australis em consociação com a macrófita Typha latifólia . O ensaio controlo continuou a ser alimentado com a solução de Hoagland modificada e, após a aclimatização, o ensaio 1 e 2 passou a ser alimentado com o efluente produzido na cozedura da cortiça numa diluição de 1:10. 33 Na fase de aclimatização (semana 2), observa-se o crescimento de novos recrutas emergentes em todos os ensaios, registando-se ainda um crescimento gradual de biomassa em ambas as espécies de macrófitas e o desenvolvimento de raiz em zonas mais profundas dos mesocosmos (Fig.29). Com o intuito de controlar o crescimento vegetativo, foram realizadas podas às zonas de dominância apical das macrófitas. O respetivo corte às plantas mãe (plantas transplantadas para o mesocosmos), para além de ser realizado com o intuito de controlar o crescimento vegetativo, favorece o crescimento de recrutas já emergentes (Fig.30), bem como o desenvolvimento de novos recrutas no sistema (Amrstrong et al., 1992; Asaeda et al., 2003). De modo a avaliar a diversidade e riqueza da comunidade microbiana numa abordagem de sequenciação metagenómica, foram retiradas amostras de sedimento, raiz e tecido vegetal (folha) de todas as réplicas dos respetivos ensaios uma vez por semana. Cada semana é representada por diferentes tempos de amostragem (T0, T1, T2, T3 e T4), sendo o intervalo entre T0 e T1 que marca a fase final de aclimatização, lavagem e alimentação do ensaio 1 e 2 com o efluente previamente diluído de acordo com os parâmetros referidos na tabela 5. Em cada tempo, foram também retiradas amostras de água para posterior análise de TN, TP, CQO, TPF e pH, tendo sido excluído a análise do perfil de compostos polifenóis devido às concentrações residuais presentes no efluente. Figura 29 – Podemos observar no círculo preto o crescimento do sistema radicular das macrófitas durante a fase de aclimatização. Figura 30 - Crescimento de um recruta emergente de Phragmites australis , registado durante a segunda, a terceira e a quarta semana de aclimatização à solução de Hoagland, com 6.5 cm, 13.5cm e 20.5 cm, respetivamente. 34 2.3.4 Metagenómica Metagenômica é definida como a avaliação do material genético diretamente isolado das amostras ambientais (Rheims et al., 1996; Hess et al., 2011). Tendo em conta que a cultura de mais de 99% de microrganismos não é viável (Huson et al., 2007), o desenvolvimento e a implementação de tecnologias de sequenciação de ácido desoxirribonucleico (ADN) e as suas correspondentes ferramentas de bioinformática, revolucionaram os métodos de estudo sobre a ecologia e diversidade microbianas e a sua aplicabilidade em diferentes campos, nomeadamente o microbioma intestinal de peixes (Ghanbari et al., 2015), monitorização e manipulação de alimentos e produtos alimentares fermentados (Mayo et al ., 2014), biorremediação de metais pesados e poluentes orgânicos persistentes (Sharma et al ., 2021; Bharagava et al., 2019) e comunidades microbianas associadas a plantas (Beckers et al., 2016; Fadiji et al., 2020). 2.3.5 Extração ADN A extração do ADN dos microrganismos presentes nas amostras de rizosfera e filosfera, foi realizada com recurso ao kit DNeasy® PowerMax® Soil Kit (Qiagen, Hilden, Germany) . Foi seguido o protocolo do fabricante com a exceção do passo 3 e 4, sendo utilizado o FastPrep programado para 65000 rotações por minuto durante 20 segundos de modo a homogeneizar as amostras. Após a extração de ADN genómico foi realizado o pool das múltiplas réplicas nos diferentes tempos de amostragem, dissolvido em água esterilizada ultrapura (ddH2O), para posterior sequenciação dirigida do ADN 16S (V4; fragmentos com 300 pares de bases) para identificação das comunidades bacterianas e sequenciação dirigida da região ITS2 (fragmentos com 380 pares de bases) para a identificação das comunidades fúngicas. 2.3.6 Análise estatística Os resultados obtidos em todos os procedimentos foram analisados no programa Rstudio (R for Windows, versão 4.2.1), tendo-se realizado os cálculos de médias, desvio-padrão e a elaboração dos gráficos de barras para cada procedimento. Na análise estatística, o teste de normalidade foi realizado com o teste de Shapiro-Wilk ( Shapiro-test ). Two-way ANOVAS foram aplicadas para avaliar o efeito que o tempo (T0, T1, T2, T3, T4) e a presença de Typha latifolia teve na depuração dos parâmetros químicos do efluente. A ANOVAS foram posteriormente analisadas pelo teste de Tukey's multiple comparisons . Os testes de correlação foram analisados com o método não-paramétrico de Pearson ( Pearson test ). 35 3. Resultados Discussão 36 3.1 Efeito depurador das plantas indígenas Phragmites australis e Typha latifolia do efluente proveniente da cozedura da cortiça 3.1.1 Depuração dos compostos Totais de Fósforo (TP) Nos sistemas de zonas húmidas construídas, a capacidade de absorção de fósforo (P) apresenta uma tendência variável, que depende de determinados fatores como a capacidade de absorção do substrato, a temperatura da região, a precipitação de compostos insolúveis, e a absorção realizada por microrganismos e plantas presentes no sistema (Lu et al., 2009; Ballantine & Tanner, 2010; Maucieri et al., 2020). Tendo em conta as condições a que os mesocosmos foram submetidos em termos de substrato (areia) e temperatura (18 º C), não se observou a absorção de compostos TP no ensaio 1, que representa uma monocultura de Phragmites australis , e no ensaio 2, que representa uma co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia , após ter sido inserido o efluente (Fig. 31). A ausência de depuração dos compostos TP pode ter estado relacionada com a mobilidade deste macronutriente, que se encontra relacionada com a interação de vários macronutrientes e micronutrientes como o cálcio, magnésio, alumínio e ferro (Wiater, 2022). Parte do aumento da sua concentração de TP pode estar ligada com os níveis de evapotranspiração Figura 31 - Concentração de compostos totais de fósforo no ensaio 1 (vermelho) e no ensaio 2 (azul) nos distintos tempos. O tempo 0 representa a concentração de fósforo proveniente da alimentação dos mesocosmos com solução hidropónica e o tempo 1 representa a concentração dos compostos totais de fósforo (1.25 mg/L) após a aplicação de efluente no ensaio 1 e 2. As diferentes letras sugerem diferenças significativas (P < 0.05). Média ± SEM, n = 3. 37 registados no último tempo de amostragem (T4), sendo 1240 ml no ensaio 1 e 1083,3 ml no ensaio 2. Existem, porém, outros fatores que poderiam ter condicionado a absorção de compostos TP, nomeadamente a aplicação de azoto (N) em combinação com um rácio de N:P < 10, que proporciona uma resposta de crescimento positiva em ambas as macrófitas (Tylová et al., 2013), a realização de uma segunda poda na fase final de aclimatização, tendo em consideração que, em ambiente natural, novos tecidos de Phragmites australis apresentam elevadas concentrações de N e P, que diminuem com a sua maturidade (Susuki et al ., 2020) e a realização dos ensaios na fase de frutificação das macrófitas, que armazenam N e P em órgãos de reserva para o posterior desenvolvimento de novos recrutas (Maddison et al., 2009). Podemos observar que o ensaio 1 apresentou ao longo do tempo um aumento acentuado de compostos TP no efluente. A concentração de compostos TP no tempo 0 foi de 23,42 (mg/L) e aumentou para 24,67 (mg/L), 37,53 (mg/L), 39,78 (mg/L) e 41,83 (mg/L) respetivamente nos tempos 1, 2, 3 e 4. Por outro lado, o ensaio 2 apresentou ao longo do tempo um aumento menos acentuado de compostos TP. No tempo 0 registam-se 23,91 (mg/L) e um aumento para respetivamente 25,16 (mg/L), 28,33 (mg/L), 31,7 (mg/L) e 32,62 (mg/L) nos tempos 1,2,3 e 4. Em relação ao tempo 1, que representa o tempo de amostragem após a introdução de efluente nos mesocosmos, regista-se no ensaio 1 um aumento de respetivamente 52%, 61% e 70% nos tempos 2, 3 e 4. No ensaio 2 registou-se um aumento de 12.5%, 23.9% e 30% respetivamente nos tempos 2, 3 e 4. 3.1.2 Depuração de compostos Totais de Carbono (TC) Podemos observar na figura 32, que o ensaio 1 e ensaio 2 apresentaram uma diminuição progressiva na concentração de compostos TC, tendo-se registado uma diminuição mais acentuada no ensaio 1. Para o ensaio 1, a concentração de TC no tempo 0 foi de 30,1 (mg/L) e aumentou para 95,1 (mg/L) no tempo 1, devido ao efluente inserido com 65 (mg/L) de concentração de total de fenóis, e uma diminuição respetivamente para 61 , 2 (mg/L), 54 , 2 (mg/L) e 51 , 1 (mg/L) nos tempos 2, 3 e 4. O ensaio 2 apresentou, também, ao longo do tempo uma diminuição progressiva na concentração de compostos TC no efluente. No tempo 0 a concentração foi de 13,6 (mg/L), e registou-se um aumento para 78,6 (mg/L) no tempo 1, devido ao efluente inserido, seguido de 44 de TC apresentaram uma associação positiva apenas com os índices de diversidade Shannon e Simpson . Contudo, não se registou nenhuma diferença significativa entre as associações. 3.2.2 Análise da diversidade e riqueza bacterianas presente na filosfera da monocultura de Phragmites australis e na co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia Relativamente à filosfera, as curvas de rarefação apresentaram-se estáveis e a cobertura para a amostra controlo, ensaio 1 e ensaio 2 foi de, respetivamente, 99,80%, 99,68% e 99,60%. Na figura 38 podemos observar que, em média, a riqueza de espécies presente na filosfera do ensaio 2, que representa uma co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia , foi maior do que o ensaio 1 e no controlo, que representam uma monocultura de Phragmites australis . Embora o habitat da filosfera apresente uma duração mais curta e mais frágil quando exposto a baixos níveis de matéria orgânica (Zhou et al ., 2019), as suas comunidades microbianas regulam os processos entre o sistema planta-atmosfera (Genitsaris et al ., 2020) e desempenham um papel importante em múltiplas funções, tais como: a produtividade do hospedeiro, função e longevidade das folhas, crescimento apical, massa da semente e remoção de contaminantes (Zhu et al ., 2022). Podemos observar nas curvas de rarefação que, em comparação com a rizosfera, o número de espécies observadas em cada ensaio foi menor. Além disso, o ensaio 1 apresenta Figura 38 - Curvas de rarefação da filosfera nas amostras controlo (verde), ensaio1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) relativas à riqueza de espécies de bactérias. 45 igualmente um desvio de padrão acentuado. Este desvio padrão encontra-se relacionado com uma alteração na diversidade e riqueza bacterianas da filosfera registada no ensaio 1, podendo esta ser observada através dos índices de diversidade expressos na tabela 7 e nos histogramas da figura 39. Tabela 7 – Índices de riqueza e diversidade bacteriana na filosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2. Filosfera/Bactérias Índices de Alfa diversidade Amostra Tempo Espécies observadas Shannon Simpson chao1 ACE Controlo 0 259 1.280 0.391 364.356 427.505 1 198 1.081 0.327 296.447 330.926 2 211 1.067 0.291 261.714 281.803 3 399 1.281 0.350 615.724 688.460 4 511 1.388 0.350 770.517 779.348 Ensaio 1 0 297 0.769 0.178 458.053 522.620 1 166 0.898 0.261 277.000 293.177 2 306 1.176 0.324 499.717 522.755 3 272 0.824 0.215 447.560 473.461 4 2063 4.240 0.649 2644.964 2629.393 Ensaio 2 0 631 2.343 0.584 910.028 954.798 1 573 2.086 0.559 827.250 858.899 2 880 3.332 0.762 1230.828 1287.787 3 1019 3.801 0.800 1362.642 1430.757 4 824 3.425 0.787 1034.400 1084.938 Figura 39 – Índice de diversidade shannon (histograma da esquerda) e índice de riqueza chao1 (histograma da direita) da filosfera nas amostras controlo (verde), ensaio 1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) nos distintos tempos. A linha a tracejado representa a aplicação de solução nutritiva no controlo e de efluente proveniente da cozedura de cortiça no ensaio 1 e 2. 46 Embora não se tenha observado nenhuma alteração significativa na diversidade e riqueza bacterianas após ser inserido o efluente, registou-se uma alteração significativa no último tempo de amostragem (tempo 4) do ensaio 1. Esta alteração pode ser resultado da interconexão entre os diferentes nichos da planta, entre eles a rizosfera, a filosfera e a espermosfera (Lemanceau et al., 2017). As alterações das comunidades da rizosfera afetam o microbioma da filosfera, onde parte do microbioma da rizosfera pode ser transferido para a zona aérea da planta através dos sistemas xilema e floema (Zhu et al., 2022). Na figura 40 podemos observar a dissimilaridade genética entre as comunidades bacterianas presentes na rizosfera e na filosfera do ensaio 1 e do ensaio 2. A distância métrica qualitativa observada na figura 40, tem em conta a árvore filogenética das populações presentes em cada amostra retirada (Katiraei et al ., 2022). Podemos observar que existiu uma dissimilaridade genética entre as comunidades bacterianas presentes na filosfera e na rizosfera. Relativamente às comunidades bacterianas presentes na rizosfera, registou-se uma distância filogenética entre a raiz do ensaio 2, que representa a co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia, e a raiz do ensaio 1 e do ensaio controlo, que representam as monoculturas de Phragmites australis. No ensaio controlo e ensaio 1, podemos constatar a similaridade genética das comunidades bacterianas no T0, que se desassociam no T1, após ter sido inserido o efluente no ensaio 1 e a solução de Hoagland no ensaio controlo. Figura 40 – Dissimilaridade filogenética das amostras controlo (amarelo), ensaio 1 (púrpura) e ensaio 2 (verde) relativa às comunidades bacterianas presentes na rizosfera e na filosfera nos tempos 0, 1, 2, 3 e 4. A abundância relativa ao nível filo pode ser observada à direita de cada amostra e no respetivo tempo de amostragem. 47 No que concerne às comunidades bacterianas presentes na filosfera, a distância filogenética separa claramente as populações de bactérias presentes entre a filosfera do ensaio 2, da comunidade bacteriana presente no ensaio controlo e no ensaio 1. Na monocultura de Phragmites australis (ensaio 1), a alteração significativa na diversidade e riqueza bacterianas registada na filosfera no T4, mostrou uma similaridade genética muito próxima à comunidade bacteriana da rizosfera do ensaio 1 registada no T1. Isto pode estar relacionado com a interconexão entre os vários compartimentos das plantas, a capacidade de migração das comunidades da rizosfera para a filosfera, através dos sistemas xilema e floema, ao que se acresce a função de remoção de contaminantes referida anteriormente. As correlações entre os compostos TP, TC e TN e os índices de diversidade bacteriana na filosfera registados no ensaio 1 e no ensaio 2, podem ser observados na figura 41. No ensaio 1 não se registou qualquer associação entre os valores TP, TN e TC e os índices de diversidade e riqueza bacteriana. Por outro lado, no ensaio 2 registou-se uma associação positiva e significativa com os valores de TP e os índices de diversidade bacteriana Shannon e Simpson (P=0.0421). 3.2.3 Análise da diversidade e riqueza fúngicas presente na rizosfera da monocultura de Phragmites australis e co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia A análise de rarefação por amostra, baseada nas Unidades Taxonómicas Operacionais (OTU) com 3% de dissimilaridade é mostrada na figura 42. As curvas de rarefação apresentaramse estáveis com uma cobertura para a amostra controlo, ensaio 1 e ensaio 2 de 100%. Podemos observar que, em média, a riqueza de espécies de fungos presente na rizosfera do ensaio 2, que Ensaio 1 Ensaio 2 Figura 41 - Correlações entre a flutuação dos valores de TP, TC e TN e os índices de diversidade bacteriana na filosfera registados no ensaio 1 e do ensaio 2, através da análise de Pearson. * = p < .05; ** = p <.001; *** = p < .0001. 48 representa uma co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia , foi maior do que o ensaio 1 e no controlo, que representam uma monocultura de Phragmites australis (figura 42). Embora a comunidade fúngica presente na rizosfera apresentasse uma diversidade e riqueza inferior às comunidades bacterianas, o seu papel na degradação de compostos orgânicos recalcitrantes, devido ao seu complexo e bem desenvolvido aparelho enzimático, torna esta comunidade extremamente importante na biorremediação e na biodegradação de compostos orgânicos complexos (Kharitonov et al ., 2022). Fungos como as micorrizas arbusculares formam uma associação mutualista com raízes de plantas terrestres e aquáticas (da Silva et al ., 2022), que podem interagir com outros fungos e bactérias por via de redistribuição de nutrientes e competição por espaço (Li et al ., 2022). Outros fungos endófitos associados ao microbioma de plantas aquáticas revela ter um efeito herbicida promissor, capaz de desempenhar um papel de bio-controlo contra ervas daninhas aquáticas presentes em cursos de água (Pramanic et al ., 2023). Tal efeito pode estar relacionado com os valores de diversidade fúngica que se verificou na rizosfera do ensaio 2 antes da introdução do efluente proveniente da cozedura da cortiça (T0), o que pode confirmar a possível competição entre as espécies de macrófitas Phragmites australis e Typha latifolia referida anteriormente. Figura 42 - Curvas de rarefação da rizosfera nas amostras controlo (verde), ensaio1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) relativas à riqueza de espécies de fungos. 49 A flutuação da diversidade e riqueza fúngica na rizosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2 pode ser observada através dos índices de diversidade expressos na tabela 8 e na figura 43. Tabela 8 - Índices de riqueza e diversidade fúngica na rizosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2. Rizosfera/ Fungos Índices de Alfa diversidade Amostra Tempo Espécies observadas shannon simpson chao1 ACE Controlo 0 237 2.754 0.630 249.400 255.092 1 261 3.431 0.788 268.452 271.482 2 232 2.641 0.680 247.000 252.339 3 238 2.366 0.618 256.000 262.417 4 230 2.686 0.664 237.906 241.655 Ensaio 1 0 201 2.349 0.677 244.938 228.426 1 273 3.746 0.818 290.526 295.751 2 243 2.864 0.717 273.938 277.775 3 230 3.004 0.758 245.000 250.149 4 259 2.849 0.707 284.800 294.343 Ensaio 2 0 231 3.946 0.878 256.500 253.823 1 495 4.866 0.929 535.679 532.234 2 408 4.981 0.925 426.000 432.788 3 477 4.204 0.851 516.590 520.857 4 361 4.111 0.877 379.092 392.241 Figura 43 - Índice de diversidade shannon (histograma da esquerda) e índice de riqueza chao1 (histograma da direita) da rizosfera nas amostras controlo (verde), ensaio 1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) nos distintos tempos. A linha a tracejado representa a aplicação de solução nutritiva no controlo e de efluente proveniente da cozedura de cortiça no ensaio 1 e 2. 50 O ensaio 2, que representa uma co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia , apresentou uma maior diversidade e riqueza fúngica ao longo do tempo e uma alteração acentuada nos índices de diversidade após a introdução de efluente nos mesocosmos. Contudo, embora menos acentuado, registou-se que as monoculturas de Phragmites australis que representam o ensaio 1 e o ensaio controlo, manifestaram alterações muito semelhantes na diversidade e riqueza da comunidade fúngica presente na rizosfera, após a introdução do efluente proveniente da cozedura de cortiça e da solução nutritiva de Hoagland , respetivamente. Com a exceção no tempo 3, que distingue a flutuação dos índices de diversidade e riqueza fúngica presente na rizosfera do ensaio controlo e do ensaio 1, podemos afirmar que a introdução de efluente proveniente da cozedura de cortiça e a ausência da possível competição entre as macrófitas Phragmites australis e Typha latifolia, reflete uma flutuação de diversidade e riqueza fúngica distinta entre o ensaio 1 e o ensaio 2. As correlações entre os compostos TP, TC e TN e os índices de diversidade fúngica na rizosfera registados no ensaio 1 e no ensaio 2, podem ser observados na figura 44. Podemos observar que no ensaio 1, os valores de TC mostraram uma associação positiva e significativa com os índices de diversidade Shannon e Simpson . Para os valores de TP e TN não se registou qualquer associação significativa com os índices de diversidade e riqueza. Relativamente ao ensaio 2, os valores de TC e os valores de TN apresentaram uma associação positiva e significativa, respetivamente, com os índices de riqueza e o índice Shannon . Para os Ensaio 1 Ensaio 2 Figura 44 - Correlações entre a flutuação dos valores de TP, TC e TN e os índices de diversidade fúngica na rizosfera registados no ensaio 1 e do ensaio 2, através da análise de Pearson. * = p < .05; ** = p <.001; *** = p < .0001. 51 valores de TP não se registou qualquer associação significativa com os índices de diversidade observados no ensaio 2. 3.2.4 Análise da diversidade e riqueza fúngicas presente na filosfera da monocultura de Phragmites australis e co-associação de Phragmites australis e Typha latifolia A análise de rarefação por amostra, baseada nas Unidades Taxonómicas Operacionais (OTU) com 3% de dissimilaridade é mostrada na figura 45. As curvas de rarefação apresentaramse estáveis com uma cobertura para a amostra controlo, ensaio 1 e ensaio 2 de 100%. Podemos observar que, em média, a riqueza de espécies de fungos presente na filosfera do controlo foi maior do que o ensaio 1 e no ensaio 2 (figura 45). A comunidade fúngica presente na filosfera foi menos abundante em comparação com a comunidade bacteriana devido provavelmente à sua maior sensibilidade a determinados fatores abióticos como a variação de temperatura, posição geográfica do hospedeiro, radiação solar, nutrientes e poluição (Xu et al ., 2022). Contudo, os fungos que constituem o nicho da filosfera, para além de desempenharem um papel crítico no crescimento da planta hospedeira, apresentam a função de bio-controlo e a capacidade de remediar poluentes (Abdel-Wareth., 2022). Figura 45 - Curvas de rarefação da filosfera nas amostras controlo (verde), ensaio1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) relativas à riqueza de espécies de fungos. 52 A flutuação da diversidade e riqueza fúngicas na filosfera do ensaio controlo, ensaio 1 e ensaio 2 pode ser observada através dos índices de diversidade expressos na tabela 9 e na figura 46. Filosfera/ Fungos Índices de Alfa diversidade Amostra Tempo Espécies observadas shannon simpson chao1 ACE Controlo 0 141 3.189 0.837 149.053 152.133 1 101 3.300 0.835 108.857 109.024 2 233 2.988 0.821 257.750 262.821 3 169 2.987 0.814 187.474 186.087 4 210 3.068 0.827 225.658 234.149 Ensaio 1 0 161 3.318 0.849 170.240 177.280 1 128 2.825 0.677 134.562 137.395 2 115 0.614 0.115 135.312 139.661 3 122 1.529 0.343 127.833 129.794 4 136 1.888 0.426 150.000 150.534 Ensaio 2 0 179 2.490 0.676 197.207 201.024 1 194 2.936 0.747 216.545 216.221 2 181 3.220 0.806 195.130 195.616 3 157 1.852 0.464 169.500 176.082 4 103 2.141 0.654 110.650 115.344 Figura 46 - Índice de diversidade shannon (histograma da esquerda) e índice de riqueza chao1 (histograma da direita) da filosfera nas amostras controlo (verde), ensaio 1 (laranja) e ensaio 2 (púrpura) nos distintos tempos. A linha a tracejado representa a aplicação de solução nutritiva no controlo e de efluente proveniente da cozedura de cortiça no ensaio 1 e 2. 53 O ensaio controlo apresentou uma maior diversidade e riqueza fúngica ao longo do tempo e uma alteração acentuada nos índices de riqueza após a introdução da solução nutritiva de Hoagland nos mesocosmos. O ensaio 1 e o ensaio 2 apresentaram alterações acentuadas nos índices de diversidade fúngica. No ensaio 1, após a introdução do efluente proveniente da cozedura de cortiça, a diversidade fúngica que constitui a filosfera apresentou uma diminuição acentuada no tempo 1 e no tempo 2, seguido de um aumento no tempo 3 e no tempo 4. O ensaio 2, que apresentava uma menor diversidade fúngica em relação ao ensaio 1 no tempo 0, observou-se um aumento gradual de diversidade após a introdução de efluente, registados no tempo 1 e 2, seguido de uma diminuição no tempo 3 e um aumento no tempo 4. Relativamente à riqueza fúngica, o ensaio controlo, o ensaio 1 e o ensaio 2 apresentaram flutuações distintas ao longo do tempo. No ensaio controlo, após a introdução de solução de Hoagland , observou-se uma diminuição de riqueza fúngica registada no tempo 1, seguido de um aumento acentuado no tempo 2 e uma diminuição no tempo 3, que estabilizou até ao tempo 4. No ensaio 1, após a introdução do efluente proveniente da cozedura de cortiça, registouse uma diminuição na riqueza fúngica no tempo 1, seguido de uma flutuação pouco acentuada nos restantes tempos. Ao contrário do ensaio 1, após a introdução de efluente proveniente da cozedura de cortiça, no ensaio 2 registou-se um aumento de riqueza fúngica no tempo 1 seguido de uma diminuição gradual nos restantes tempos. As correlações entre os compostos TP, TC e TN e os índices de diversidade fúngica na filosfera registados no ensaio 1 e no ensaio 2, podem ser observados na figura 47. Ensaio 1 Ensaio 2 Figura 47 - Correlações entre a flutuação dos valores de TP, TC e TN e os índices de diversidade fúngica na filosfera registados no ensaio 1 e do ensaio 2, através da análise de Pearson. * = p < .05; ** = p <.001; *** = p < .0001. 60 Beckers, B., Op De Beeck, M., Thijs, S., Truyens, S., Weyens, N., Boerjan, W., & Vangronsveld, J. (2016). Performance of 16s rDNA primer pairs in the study of rhizosphere and endosphere bacterial microbiomes in metabarcoding studies. Frontiers in Microbiology, 7, 650. Bharagava, R. N., Purchase, D., Saxena, G., & Mulla, S. I. (2019). Applications of metagenomics in microbial bioremediation of pollutants: from genomics to environmental cleanup. In Microbial diversity in the genomic era (pp. 459-477). Academic Press. Bharagava, R. N., Saxena, G., & Mulla, S. I. (2020). Introduction to industrial wastes containing organic and inorganic pollutants and bioremediation approaches for environmental management. In Bioremediation of industrial waste for environmental safety (pp. 1-18). Springer, Singapore. Bialowiec, A., Davies, L., Albuquerque, A., & Randerson, P. F. (2012). The influence of plants on nitrogen removal from landfill leachate in discontinuous batch shallow constructed wetland with recirculating subsurface horizontal flow. Ecological Engineering, 40, 44-52. Caponera, D. A., & Nanni, M. (2019). Principles of water law and administration: national and international. Routledge, 2019. Castor, L. R. G. (2013). Propriedades químicas e farmacológica da apocinina, vanilina e ácido vanílico. Chow, R., Scheidegger, R., Doppler, T., Dietzel, A., Fenicia, F., & Stamm, C. (2020). A review of long-term pesticide monitoring studies to assess surface water quality trends. Water research X, 100064. Clapham, A. R., Tutin, T. G., & Moore, D. M. (1990). Flora of the British isles . CUP Archive.. Couceiro, R. A. A. (2015). Gestão/Tratamento de águas residuais numa indústria de produção de rolhas de cortiça (Doctoral dissertation, Universidade de Lisboa (Portugal)). CRESPO, S., & Pérez-Moreau, R. L. (1967). Revisión del género Typha en la Argentina. Darwiniana, 413-429. da Silva, K. J., Fernandes, J. A., Magurno, F., Leandro, L. B., Goto, B. T., & Theodoro, R. C. (2022). Phylogenetic Review of Acaulospora ( Diversisporales, Glomeromycota ) and the Homoplasic Nature of Its Ornamentations. Journal of Fungi, 8, 892. 61 Degáspari, C. H., Waszczynskyj, N., & Prado, M. R. M. (2005). Atividade antimicrobiana de Schinus terebenthifolius Raddi. Ciência e Agrotecnologia, 29, 617-622. Dias, S., Mucha, A. P., Duarte Crespo, R., Rodrigues, P., & Almeida, C. M. R. (2020). Livestock wastewater treatment in constructed wetlands for agriculture reuse. International Journal of Environmental Research and Public Health, 17, 8592. Dias-Machado, M., Madeira, L. M., Nogales, B., Nunes, O. C., & Manaia, C. M. (2006). Treatment of cork boiling wastewater using chemical oxidation and biodegradation. Chemosphere, 64, 455461. Duarte, J. T. (2015). Avaliação de Impacto Ambiental, Valorização do Efluente e dos Resíduos Sólidos da Indústria Corticeira (Doctoral dissertation, Instituto Politecnico do Porto (Portugal)). Duysens, L. N. M. (1959). The path of light energy in photosynthesis. In Brookhaven Symp. Biol (Vol. 11, pp. 10-25). Etim, E. E. (2012). Phytoremediation and its mechanisms: a review. international Journal of Environment and Bioenergy, 2, 120-136. Evangelou, M. W., Ebel, M., & Schaeffer, A. (2007). Chelate assisted phytoextraction of heavy metals from soil. Effect, mechanism, toxicity, and fate of chelating agents. Chemosphere, 68, 9891003 Fadiji, A. E., & Babalola, O. O. (2020). Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: a review. Journal of Microbiological Methods, 170, 105860. Fahid, M., Ali, S., Shabir, G., Rashid Ahmad, S., Yasmeen, T., Afzal, M., ... & Ahmad, P. (2020). Cyperus laevigatus L. enhances diesel oil remediation in synergism with bacterial inoculation in floating treatment wetlands. Sustainability, 12(6), 2353. Faulwetter, J. L., Gagnon, V., Sundberg, C., Chazarenc, F., Burr, M. D., Brisson, J., ... & Stein, O. R. (2009). Microbial processes influencing performance of treatment wetlands: a review. Ecological engineering, 35, 987-1004 Faußer, A. C., Hoppert, M., Walther, P., & Kazda, M. (2012). Roots of the wetland plants Typha latifolia and Phragmites australis are inhabited by methanotrophic bacteria in biofilms. FloraMorphology, Distribution, Functional Ecology of Plants, 207(11), 775-782. 62 Feckler, A., Rosenfeldt, R. R., Seitz, F., Schulz, R., & Bundschuh, M. (2015). Photocatalytic properties of titanium dioxide nanoparticles affect habitat selection of and food quality for a key species in the leaf litter decomposition process. Environmental Pollution, 196, 276-283. Felis, E., Kalka, J., Sochacki, A., Kowalska, K., Bajkacz, S., Harnisz, M., & Korzeniewska, E. (2020). Antimicrobial pharmaceuticals in the aquatic environment-occurrence and environmental implications. European Journal of Pharmacology, 866, 172813. Feng, L., He, S., Yu, H., Zhang, J., Guo, Z., Wei, L., & Wu, H. (2022). A novel plant-girdling study in constructed wetland microcosms: Insight into the role of plants in oxygen and greenhouse gas transport. Chemical Engineering Journal, 431, 133911. Fernandes, A., Gomes, A. C., Pereira, C., Magdziak, A., Pacheco, M. J., Ciríaco, L., ... & Lopes, A. (2019). Influence of Molecular Size on the Electrochemical Oxidation of Fractioned Cork Boiling Wastewater. ChemElectroChem, 6, 1722-1731. Foster, S., & MacDonald, A. (2021). Groundwater management. Handbook of Catchment Management 2e, 125-152. Freitas, M., Pacheco, A., Anawar, H., Dionísio, I., Dung, H., Canha, N., ... & Capelo, S. (2009). Determination of phytoextraction potential of plant species for toxic elements in soils of abandoned sulphide-mining areas. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 282, 21-27. Freitas, P. D. I. (2016). Resíduos da indústria agro-alimentar como possíveis fontes de ácido ferúlico (Doctoral dissertation, Universidade da Madeira). Fu, X., Wu, X., Zhou, S., Chen, Y., Chen, M., & Chen, R. (2018). A constructed wetland system for rural household sewage treatment in subtropical regions. Water, 10, 716. Fytianos, G., Rahdar, A., & Kyzas, G. Z. (2020). Nanomaterials in cosmetics: Recent updates. Nanomaterials, 10, 979. Garcia-Costa, A. L., Carbajo, J., Masip, R., Quintanilla, A., Yuste-Córdoba, F. J., & Casas, J. A. (2020). Enhanced cork-boiling wastewater treatment by electro-assisted processes. Separation and Purification Technology, 241, 116748. Ge, X., Wu, Z., Cravotto, G., Manzoli, M., Cintas, P., & Wu, Z. (2018). Cork wastewater purification in a cooperative flocculation/adsorption process with microwave-regenerated activated carbon. Journal of Hazardous Materials, 360, 412-419. 63 Geeraert, N., Archana, A., Xu, M. N., Kao, S. J., Baker, D. M., & Thibodeau, B. (2021). Investigating the link between Pearl River-induced eutrophication and hypoxia in Hong Kong shallow coastal waters. Science of The Total Environment, 772, 145007. Genitsaris, S., Stefanidou, N., Leontidou, K., Matsi, T., Karamanoli, K., & Mellidou, I. (2020). Bacterial communities in the rhizosphere and phyllosphere of halophytes and drought-tolerant plants in mediterranean ecosystems. Microorganisms, 8, 1708. Ghanbari, M., Kneifel, W., & Domig, K. J. (2015). A new view of the fish gut microbiome: advances from next-generation sequencing. Aquaculture, 448, 464-475. Ghosh, S., Sharma, I., Nath, S., & Webster, T. J. (2021). Bioremediation-the natural solution. In Microbial Ecology of Wastewater Treatment Plants (pp. 11-40). Elsevier. Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R., & Varma, A. (Eds.). (2013). Fungi as bioremediators (Vol. 32). Springer Science & Business Media. Gomes, A. C., Silva, L., Albuquerque, A., Simões, R., & Stefanakis, A. I. (2018). Investigation of lab-scale horizontal subsurface flow constructed wetlands treating industrial cork boiling wastewater. Chemosphere, 207, 430-439. Gomes, A. C., Silva, L., Albuquerque, A., Simões, R., & Stefanakis, A. I. (2020). Treatment of cork boiling wastewater using a horizontal subsurface flow constructed wetland combined with ozonation. Chemosphere, 260, 127598. Gomes, A. P. D. (2015). Avaliação e gestão de riscos em sistemas de saneamento (Doctoral dissertation, Universidade do Minho). Gomes, J. F. P. D. S. (2002). Análise e optimização do processo de coagulação/floculação química na ETAR de Barcelos (Universidade do Porto, Faculdade de Engenharia). Gucker, C. L. (2008). Phragmites australis . USDA Forest Service, Rocky Mountain Research Station, Fire Sciences Laboratory. Gupta, S., Kaur, G., & Nirwan, J. (2021). Role of Endophytes in Plant-Associated Remediation and Plant Growth Promotion: A Deep Insight. In Mycoremediation and Environmental Sustainability (pp. 143-170). Springer, Cham. 64 He, M., Chen, W. J., Tian, L., Shao, B., & Lin, Y. (2019). Plant-microbial synergism: An effective approach for the remediation of shale-gas fracturing flowback and produced water. Journal of Hazardous Materials, 363, 170-178. He, S., Jia, M., Xiang, Y., Song, B., Xiong, W., Cao, J., ... & Zeng, G. (2021). Biofilm on microplastics in aqueous environment: Physicochemical properties and environmental implications. Journal of Hazardous Materials, 127286. Hedlund, J., Longo, S. B., & York, R. (2020). Agriculture, pesticide use, and economic development: a global examination (1990-2014). Rural Sociology, 85, 519-544. Hena, S., Gutierrez, L., & Croue, J. P. (2021). Removal of pharmaceutical and personal care products (PPCPs) from wastewater using microalgae: A review. Journal of Hazardous Materials, 403, 124041. Hess, M., Sczyrba, A., Egan, R., Kim, T. W., Chokhawala, H., Schroth, G., ... & Rubin, E. M. (2011). Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen. Science, 331, 463-467. Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., & Schuster, S. C. (2007). MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Research, 17, 377-386. Jadoun, S., Verma, A., & Arif, R. (2020). Modification of Textiles via Nanomaterials and Their Applications. Frontiers of Textile Materials: Polymers, Nanomaterials, Enzymes, and Advanced Modification Techniques, 135-152. Jorge, N., Teixeira, A. R., Matos, C. C., Lucas, M. S., & Peres, J. A. (2021). Combination of Coagulation-Flocculation-Decantation and Ozonation Processes for Winery Wastewater Treatment. International Journal of Environmental Research and Public Health, 18(16), 8882. Kadlec, R. H., & Wallace, S. (2008). Treatment wetlands. CRC press, 3-6 Kapoor, D., & Singh, M. P. (2021). Heavy metal contamination in water and its possible sources. In Heavy Metals in the Environment (pp. 179-189). Elsevier. Kar, S., Sanderson, H., Roy, K., Benfenati, E., & Leszczynski, J. (2020). Ecotoxicological assessment of pharmaceuticals and personal care products using predictive toxicology approaches. Green Chemistry, 22, 1458-1516. 65 Katiraei, S., Anvar, Y., Hoving, L., Berbée, J. F., van Harmelen, V., & Willems van Dijk, K. (2022). Evaluation of full-length versus V4-region 16S rRNA sequencing for phylogenetic analysis of mouse intestinal microbiota after a dietary intervention. Current Microbiology, 79, 276. Khalid, F. E., Lim, Z. S., Sabri, S., Gomez-Fuentes, C., Zulkharnain, A., & Ahmad, S. A. (2021). Bioremediation of diesel contaminated marine water by bacteria: A review and bibliometric analysis. Journal of Marine Science and Engineering, 9, 155. Kharitonov, S., Shchegolkova, N., Alexandrova, A., Saynchuk, A., Michel, P., Maciejewski, K., ... & Krasnov, G. (2022). Taxonomic Diversity of Fungi and Bacteria in Azoé-NP® Vertical Flow Constructed Wetlands. Water, 14(5), 698. Khasawneh, O. F. S., & Palaniandy, P. (2021). Removal of organic pollutants from water by Fe2O3/TiO2 based photocatalytic degradation: A review. Environmental Technology & Innovation, 21, 101230. Köbbing, J. F., Thevs, N., & Zerbe, S. (2013). The utilisation of reed ( Phragmites australis ): a review. Mires & Peat, 13. Köck-Schulmeyer, M., Ginebreda, A., Petrovic, M., Giulivo, M., Aznar-Alemany, Ò., Eljarrat, E., ... & Barceló, D. (2021). Priority and emerging organic microcontaminants in three Mediterranean river basins: Occurrence, spatial distribution, and identification of river basin specific pollutants. Science of The Total Environment, 754, 142344. Krutov, A., Norkulov, B., Artikbekova, F., & Nurmatov, P. (2020, June). Optimal location of an intake at a reservoir prone to salt diffusion. In IOP Conference Series: Materials Science and Engineering (Vol. 869, No. 7, p. 072020). IOP Publishing. Kumar, A., Devi, S., Agrawal, H., Singh, S., & Singh, J. (2020). Rhizoremediation: a unique plant microbiome association of biodegradation. Plant microbe Symbiosis. Springer International Publishing, Berlin, 203-220. Kumar, N. M., Sudha, M. C., Damodharam, T., & Varjani, S. (2020). Micro-pollutants in surface water: Impacts on the aquatic environment and treatment technologies. In Current Developments in Biotechnology and Bioengineering (pp. 41-62). Elsevier. Launert. E. Edible and Medicinal Plants. Hamlyn 1981 ISBN 0-600-37216-2 66 Lemanceau, P., Barret, M., Mazurier, S., Mondy, S., Pivato, B., Fort, T., & Vacher, C. (2017). Plant communication with associated microbiota in the spermosphere, rhizosphere and phyllosphere. In Advances in botanical research (Vol. 82, pp. 101-133). Academic Press. Li, H., Liu, F., Luo, P., Chen, X., Chen, J., Huang, Z., ... & Wu, J. (2019). Stimulation of optimized influent C: N ratios on nitrogen removal in surface flow constructed wetlands: Performance and microbial mechanisms. Science of the Total Environment, 694, 133575. Li, J., Liu, Y. X., Lü, P. P., Wang, Y. L., Li, Z. F., Zhang, Y., ... & Guo, L. D. (2022). Community Assembly of Fungi and Bacteria along Soil-Plant Continuum Differs in a Zoige Wetland. Microbiology Spectrum, 10, e02260-22. Li, P., Karunanidhi, D., Subramani, T., & Srinivasamoorthy, K. (2021). Sources and consequences of groundwater contamination. Archives of environmental contamination and toxicology , 80 , 1-10. Lim, K. S., Sethu, V., & Selvarajoo, A. (2022). Natural plant materials as coagulant and flocculants for the treatment of palm oil mill effluent. Materials Today: Proceedings , 48 , 871-887. Limmer, M., & Burken, J. (2016). Phytovolatilization of organic contaminants. Environmental Science & Technology, 50(13), 6632-6643. Lombardi, T., Fochetti, T., Bertacchi, A., & Onnis, A. (1997). Germination requirements in a population of Typha latifolia . Aquatic Botany, 56, 1-10. Lopez, B. R., Tinoco-Ojanguren, C., Bacilio, M., Mendoza, A., & Bashan, Y. (2012). Endophytic bacteria of the rock-dwelling cactus Mammillaria fraileana affect plant growth and mobilization of elements from rocks. Environmental and Experimental Botany, 81, 26-36. Lu, F., & Astruc, D. (2020). Nanocatalysts and other nanomaterials for water remediation from organic pollutants. Coordination Chemistry Reviews, 408, 213180. Lu, S. Y., Wu, F. C., Lu, Y. F., Xiang, C. S., Zhang, P. Y., & Jin, C. X. (2009). Phosphorus removal from agricultural runoff by constructed wetland. Ecological Engineering, 35, 402-409. Maddison, M., Mauring, T., Remm, K., Lesta, M., & Mander, Ü. (2009). Dynamics of Typha latifolia L. populations in treatment wetlands in Estonia. Ecological Engineering, 35, 258-264. 67 Madureira, J., Pimenta, A. I., Popescu, L., Besleaga, A., Dias, M. I., Santos, P. M., ... & Margaça, F. M. (2017). Effects of gamma radiation on cork wastewater: antioxidant activity and toxicity. Chemosphere, 169, 139-145. Manriquez, B., Muller, D., & Prigent-Combaret, C. (2021). Experimental evolution in plant-microbe systems: a tool for deciphering the functioning and evolution of plant-associated microbial communities. Frontiers in Microbiology, 12, 896. Mattos, T. C. G. D. (2009). Mecanismos da ação antioxidante dos ácidos caféico e tânico em sistemas contendo íons ferro. Dissertação de Mestrado, Universidade de Brasília. Maucieri, C., Barbera, A. C., Vymazal, J., & Borin, M. (2017). A review on the main affecting factors of greenhouse gases emission in constructed wetlands. Agricultural and Forest Meteorology, 236, 175-193. Maucieri, C., Salvato, M., & Borin, M. (2020). Vegetation contribution on phosphorus removal in constructed wetlands. Ecological Engineering, 152, 105853. Mayo, B., TCC Rachid, C., Alegría, Á., MO Leite, A., S Peixoto, R., & Delgado, S. (2014). Impact of next generation sequencing techniques in food microbiology. Current Genomics, 15, 293-309. Mburu, N. (2013). Experimental and modeling studies of horizontal subsurface flow constructed wetlands treating domestic wastewater. Wageningen University and Research. McCormick, M. K., Brooks, H. E., & Whigham, D. F. (2016). Microsatellite analysis to estimate realized dispersal distance in Phragmites australis . Biological Invasions, 18, 2497-2504. Meng, P., Pei, H., Hu, W., Shao, Y., & Li, Z. (2014). How to increase microbial degradation in constructed wetlands: influencing factors and improvement measures. Bioresource Technology, 157, 316-326. Mestre, A. B. (2014). Contribuição para o estudo de propagação e produção de plantas aquáticas (Doctoral dissertation, ISA/UL). Miretzky, P., Saralegui, A., & Cirelli, A. F. (2004). Aquatic macrophytes potential for the simultaneous removal of heavy metals (Buenos Aires, Argentina). Chemosphere, 57, 997-1005. 68 Mirshad, P. P., Sarath, N. G., Shackira, A. M., & Puthur, J. T. (2022). Bioremediation: Tools and Techniques for Wastewater Reclamation. In Innovative Bio-Based Technologies for Environmental Remediation (pp. 51-70). CRC Press. Monteiro, F. R. S. C. (2014). Integração da ozonização e de leitos de macrófitas para obter a depuração do efluente da indústria corticeira (Doctoral dissertation, UBI). Mthembu, M. S. (2016). Removal of organic and inorganic nutrients in a constructed rhizofiltration system using macrophytes and microbial biofilms (Doctoral dissertation, DUT). Muller, K. A., Johnson, C. D., Bagwell, C. E., & Truex, M. J. (2021). Methods for Delivery and Distribution of Amendments for Subsurface Remediation: A Critical Review. Groundwater Monitoring & Remediation, 41, 46-75. Nemhauser, J., & Chory, J. (2002). Photomorphogenesis. The Arabidopsis Book/American Society of Plant Biologists, 1, 3-4. Nguyen, V. H., Smith, S. M., Wantala, K., & Kajitvichyanukul, P. (2020). Photocatalytic remediation of persistent organic pollutants (POPs): a review. Arabian Journal of Chemistry, 13, 8309-8337. Nogueira, V., Lopes, I., Rocha-Santos, T. A. P., Gonçalves, F., & Pereira, R. (2018). Treatment of real industrial wastewaters through nano-TiO2 and nano-Fe2O3 photocatalysis: case study of mining and kraft pulp mill effluents. Environmental Technology, 39, 1586-1596. Ohlsson, L. O., Karlsson, S., Rupar-Gadd, K., Albers, E., & Welander, U. (2020). Evaluation of Laminaria digitata and Phragmites australis for biogas production and nutrient recycling. Biomass and Bioenergy, 140, 105670. Ojanguren, C. T., & Goulden, M. L. (2013). Photosynthetic acclimation within individual Typha latifolia leaf segments. Aquatic Botany, 111, 54-61. Ojha, N., Karn, R., Abbas, S., & Bhugra, S. (2021, June). Bioremediation of Industrial Wastewater: A Review. In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol. 796, No. 1, p. 012012). IOP Publishing. Oki, T., & Quiocho, R. E. (2020). Economically challenged and water scarce: identification of global populations most vulnerable to water crises. International Journal of Water Resources Development , 36 , 416-428. 69 Oliveira, L. I. P. (2013). Tratamento de águas ruças por fitorremediação com Lemna minor ou por biossorção com cortiça. Dissertação de Mestrado, Universidade do Porto, Faculdade de Ciências. Packer, J. G., Meyerson, L. A., Skalova, H., Pyšek, P., & Kueffer, C. (2017). Biological flora of the British Isles: Phragmites australis . Journal of Ecology, 105, 1123-1162. Panizio, R. (2020). Tratamento e valorização energética de efluentes da indústria corticeira (Doctoral dissertation, IPP). Pardue, M. J., Castle, J. W., Rodgers Jr, J. H., & Huddleston III, G. M. (2014). Treatment of oil and grease in produced water by a pilot-scale constructed wetland system using biogeochemical processes. Chemosphere, 103, 67-73. Parveen, S., Bhat, I. U., Khanam, Z., Rak, A. E., Yusoff, H. M., & Akhter, M. S. (2022). Phytoremediation: In situ alternative for pollutant removal from contaminated natural media: A brief review. Biointerface Research in Applied Chemistry . Pavanelli, G. (2001). Eficiência de diferentes tipos de coagulantes na coagulação, floculação e sedimentação de água com cor ou turbidez elevada (Doctoral dissertation, Universidade de São Paulo). Peng, Y., Gu, X., Yan, P., Sun, S., Zhang, M., Tang, L., & He, S. (2023). Mixotrophic denitrification improvement in ecological floating bed: Interaction between iron scraps and plant biomass. Science of The Total Environment, 861, 160718. Pietrangelo, L., Bucci, A., Maiuro, L., Bulgarelli, D., & Naclerio, G. (2018). Unraveling the composition of the root-associated bacterial microbiota of Phragmites australis and Typha latifolia . Frontiers in Microbiology, 9, 1650. Pimentão, A. R., Pascoal, C., Castro, B. B., & Cássio, F. (2020). Fungistatic effect of agrochemical and pharmaceutical fungicides on non-target aquatic decomposers does not translate into decreased fungi-or invertebrate-mediated decomposition. Science of the Total Environment, 712, 135676. Pintor, A., Vilar, V., Martins, R., & Boaventura, R. (2010). Utilização da água de lavagem das rolhas, com elevado teor de H2O2, no tratamento do efluente da cozedura da cortiça por oxidação fotofenton solar. In XVIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química COBEQ 2010 (pp. 179-187). 76 Zhu, Y. G., Xiong, C., Wei, Z., Chen, Q. L., Ma, B., Zhou, S. Y. D., ... & Duan, G. L. (2022). Impacts of global change on the phyllosphere microbiome. New Phytologist, 234, 1977-1986. Autoridade de Segurança Alimentar e Económica. Disponível em: https://www.asae.gov.pt/ [Consultado em 12 de Agosto de 2020]. European Environment Agency 2018 Water Assessment. Disponível em: https://www.eea.europa.eu/publications/state-of-water [Consultado em 03 de Julho de 2020]. European Environment Agency 2016 Air Pollutant Emission Inventory Guidebook. Disponível em: https://www.eea.europa.eu/data-and-maps/indicators/eea32-persistent-organic-pollutant-popemissions-1/emep-eea-2013 [Consultado em 06 de Julho de 2020]. Flora-On Portugal Continental | Flora de Portugal interactiva. Disponível em: https://flora-on.pt/#1Typha+latifolia [Consultado 20 de Março de 2023]. Programa Nacional para o Uso Eficiente da Água (PNUEA). Disponível em: https://apambiente.pt/agua/programa-nacional-para-o-uso-eficiente-da-agua [Consultado em 10 de Setembro de 2020]. United States Geological Survey. Disponível em: https://www.usgs.gov/ [Consultado em 03 de Julho de 2020]. United Nations Regional Information Centre. Disponível em: https://www.unric.org/en [Consultado em 15 de Julho de 2020]. UN World Water Development Report 2019 – Leaving No One Behind. Disponível em: https://www.unesco.org/en/wwap/wwdr/2019 [Consultado em 25 de Agosto de 2020]. UN World Water Development Report 2020 – Water and Climate Change. Disponível em: https://www.unesco.org/en/wwap/wwdr/2020 [Consultado em 25 de Agosto de 2020 GBIF.org (04 April 2023) GBIF Occurrence Download https://doi.org/10.15468/dl.zq8rn3 GBIF.org (04 April 2023) GBIF Occurrence Download https://doi.org/10.15468/dl.k242ea 77 78 Anexo 1 - Perfornance de sistemas de zonas húmidas na depuração de diferentes poluentes #1 Tipo de Poluente Água subterrânea contaminada com Benzeno, amoníaco e Éter metil-terc-butílico (MTBE) Espécies de macrófitas Phragmites australis Parâmetros Sistema de zonas húmicas: Horizontal Subsurfice Flow Sistema A, B, C, D e E, diferenciados em termos de adição de filtro, presença de plantas e solo. Dimensão: 5 m x 1.1 m x 0.6 m Solo: Gravilha fina: 2-3.2 mm; altura 0.5 m A - Sem adição de filtro com Phragmites australis B - Adição de filtro com carvão ativo (0.1 %-wt) com Phragmites australis C - Adição de filtro com óxidos de ferro (Lepidocronite e Goethite 0.5 % - wt) D - Sem adição de filtro e planta E - Sem solo com um manto de raízes Nível da água: A, B, C, D - 40 cm; E - 15 cm Caudal (Q): A, B, C, D - 6.0 L/h; E - 6.9 L/h Concentração de Benzeno, MTDE e amoníaco: . Benzeno - nº amostras (n) =72, amplitude entre 13-32 mg/L, média: 20 mg/L . MTDE - n=73, amplitude entre 1.2-5.9 mg/L, média: 3.7 mg/L . Amoníaco - n=73, amplitude entre 37-63 mg/L, média: 45 mg/L 79 Observações e comentários A taxa de remoção dos poluentes altera-se de acordo com a estação do ano. Regista-se taxas de remoção com maior eficiência no verão a temperaturas superiores a 15º C. Taxas de remoção para Benzeno, amoníaco e MTBE de 81%, 54%, 17% respetivamente. A baixa eficiência na remoção de MTBE resulta numa inibição causada pela presença de benzeno. No verão, o sistema E em comparação com os restantes sistemas, atinge uma taxa superior de remoção para Benzeno MTDE e amoníaco com 99%, 82% e 41% respetivamente. Oxigénio considerado fator limitante, registando-se baixas concentrações de oxigénio (< 0.5 mg/L). Os filtros adicionados não apresentam efeitos significativos na remoção de contaminantes. Regista-se que a degradação microbiana foi a principal causa para a remoção de contaminantes. Potencial de degradação de Benzeno por microrganismos poderá ser provados em microcosmos (Seeger et al., 2011). #2 Tipo de Poluente Água contaminada com Óleo e Gorduras (O&G), Fe, Mn, Ni e Zn. Espécies de macrófitas Phragmites australis Parâmetros Sistema de zonas húmidas : Subsurface Flow com fluxo vertical e Free Water Surface Série A, B e C diferenciadas pelo tipo de sistema, solo, plantas e separador de óleo-água. Em cada série foram contruídas 4 células. Dimensão: cada célula = 1.23 m x 0.64 m x 0.61 m 80 Solo: A e B: 0.2 m gravilha (pea gravel): 5-10 mm seguido de 0.4m de gravilha de granito média: 20-30 mm; C: 0.36 m de grão grosso de quartzo sub-anguloso. A - 4 células com separador de óleo-água e Phragmites australis ; sistema Subsurface Flow fluxo vertical B - 4 células sem separador de óleo-água e Phragmites australis ; sistema Subsurface Flow fluxo vertical C - 1 célula com Schoenoplectus californicus e 3 células com Typha latifolia ; sistema Free Water Surface Concentração: Série B e C - alteração da concentração e taxa de retenção hidráulica (TRH) para atingir determinados valores de massa de O&G e avaliar o efeito de O&G na performance do sistema. Valor nominal de massa de O&G: 5 mg/minconcentração de 50 mg/L com 4 dias (d) de TRH; 10 mg/min - concentração de 100 mg/L com 4 d de TRH; 20 mg/min - concentração de 100 mg/L com 2 d de TRH. Série A - Efeito do separador de óleo-água no tratamento de O&G: 10mg/min - concentração de 100 mg/L com 4 d de TRH. Metais Fe, Mn, Ni e Zn com concentração média de 0.38 mg/L, 1.25 mg/L, 1.29 mg/L e 5.64 mg/L respetivamente. Observações e comentários As taxas de remoção de O&G alteram-se de acordo com os valores de massa de O&G: Nas séries B e C os sistemas atingem uma eficiência superior para valores de massa de O&G de 5 mg/min com 97.3% para as duas séries. 81 Regista-se que para 10 mg/min a eficiência de remoção na série B e C é de 91.2% e 90.4% respetivamente. Adicionalmente, a série A para 10 mg/min regista 98.4%. O aumento da massa de O&G provoca nos sistemas uma redução no potencial de oxidaçãoredução uma redução no potencial redox que altera a eficiência de remoção de O&G. O aumento da massa de O&G de 5 mg/min para 10 mg/min provoca nos sistemas um aumento na concentração de Fe e Mn e uma redução na concentração de Ni e Zn no efluente. No sistema Subsurface Flow as séries apresentam um aumento na eficiência de remoção de Fe, Ni e Zn e uma redução de Mn. Regista-se adicionalmente que o aumento da massa de O&G de 5 mg/min para 10 mg/min provoca no sistema Free Water Surface uma remoção eficiente de Fe e Mn e um decréscimo na eficiência de remoção de Ni e Zn. Sistemas de zonas húmidas significativamente influenciado pelas condições biogeoquímicas (Pardue et al. , 2014) #3 Tipo de Poluente Água de cozedura da Indústria corticeira Espécies de macrófitas Phragmites australis Parâmetros Sistema de zonas húmidas: Horizontal SubSurface Flow Sistema A e B diferenciados pela presença de plantas e de ozonação. A - Presença de Phragmites australis B - Ausência de Phragmites australis Dimensão: 34.8 cm x 15 cm x 14.3 cm Solo: LECA "Filtralite NR": 4-8 mm; altura 14 e 13 para o sistema A e B respetivamente 82 Nível de água 9.8 cm para ambos os sistemas Caudal (Q): 0.3922 L/d para o sistema A e 0.2232 L/d para o sistema B; TRH= 5 d. Temperatura ambiente variou entre os 8-32º C. Leito de macrófitas alimentado inicialmente com efluente sintético. Concentrações de CQO e Fenóis Totais (ácido Tânico) de 2419 mg/L e 182.6 mg/L respetivamente Experiência dividida em 8 Fases, sendo a fase 6, 7 e 8 as que caraterizam a introdução do efluente. Fase 6: CQO= 900.47 mg/L; Fenóis Totais= 62.26 mg/L; sem ozonação; Fase 7: CQO= 1373 mg/L; Fenóis Totais= 86.71 mg/L; com ozonação após passar no sistema; Fase 8: CQO= 1142.95 mg/L; Fenóis Totais= 45.89 mg/L; com ozonação antes de passar no sistema. Observações e comentários Taxas de remoção de CQO e Fenóis Totais superiores no sistema A na fase 6. Taxa de remoção de CQO com 75.9% e 59.41% para o sistema A e B respetivamente. Taxa de remoção de Fenóis Totais com 56.65% e 42.38% para o sistema A e B respetivamente. Os valores de remoção para o sistema B são resultado da formação de biofilme e, portanto, devido à presença de microrganismos. Verificou-se que a submissão dos efluentes na fase 7 traduziram melhores eficiências de remoção de CQO do que a fase 8. Na remoção de outros compostos como Azoto Total, Amoniacal e Fósforo foi verificada uma maior eficiência no sistema A Verifica-se no geral um melhor rendimento depurativo com a presença de Phragmites australis . A remoção de Azoto e Fósforo é limitada pelo período de senescência, outono e inverno, Relativamente à coloração do efluente o sistema B apresenta valores superiores (Monteiro, 2014). 83 #4 Tipo de Poluente Água de cozedura da Indústria corticeira Espécies de macrófitas Phragmites australis Parâmetros Sistema de zonas húmidas: Horizontal Subsurface Flow Sistema A e B diferenciados pela presença de Phragmites australis . A - Presença de Phragmites australis B - Ausência de Phragmites australis Dimensão: 0.35m x 0.15 m x 0.25 m Solo: LECA "Filtralite NR": 4-8 mm; altura 0.143 m. Nível de água: 0.098 m. Caudal (Q): 0.26-0.51 L/d; TRH= 5 d. Temperatura ambiente variou entre os 18-26º C. Experiência dividida em 7 fases distinguidas pela diluição do efluente com água destilada e estação do ano. Concentração do efluente bruto: . CQO: 1382 mg/L . CBO5: 263 mg/L . CBO20: 417 mg/L . Azoto Total (TN): 10.7 mg/L . Fósforo Total (TP): 7.5 mg/L . Total de Fenóis (TF): 116.3 mg/L Observações e comentários 84 Taxas de remoção de Fenóis superiores no sistema A devido à disponibilidade de oxigénio fornecido pelas plantas: Regista-se na fase 6 taxas de remoção de Ácido Gálico e Elático com 41.8% e 76% respetivamente. Na fase 3 regista-se uma taxa de remoção para os mesmo compostos fenólicos com 71.7 e 90.4% respetivamente Outros compostos fenólicos e as respetivas taxas de remoção encontram-se igualmente presentes no estudo. O aumento da carga de fluxo é proporcional às taxas de remoção orgânica. Para CQO, BOD5 e BOD20 as taxas de remoção para o sistema A são de 57.7%, 88.3% e 79.2% respetivamente. Embora o efluente apresente cor intensa, elevada carga orgânica e compostos fenólicos o sistema Horizontal Subsurface Flow plantado com Phragmites australis recebeu cargas superiores a 11.5g CQO/m2/d e 0.91g TF/m2/d durante um período operacional de 2.5 anos e atinge taxas de remoção superiores aos métodos de tratamento biológico convencionais (Gomes et al., 2018). #5 Tipo de Poluente Água de cozedura da Indústria corticeira Espécies de macrófitas Phragmites australis Parâmetros Sistema de zonas húmidas: Horizontal Subsurface Flow Sistema A: sistemas de zonas húmidas construídas + ozonação Sistema B: Ozonação + sistemas de zonas húmidas construídas Ensaios divididos na fase A1-A2-B1-B2, diferenciadas pela concentração do efluente Dimensão: 0.35m x 0.15 m x 0.25 m Período funcional: 500 d Solo: LECA "Filtralite NR": 4-8 mm; altura 0.143 m. 85 Caudal: A1: 0.38 L/d; A2: 0.34 L/d; B1 e B2: 0.32 L/d; TRH: 5.1-6.2 d Temperatura ambiente variou entre os 10-28º C. Concentração do efluente bruto: . A2: CQO: 1493 mg/L . B2: CQO: 1558 mg/L . A2:TF: 93 mg/L .B2:TF: 103 mg/L . A2: CBO5: 279 mg/L .B2: CBO5: 262mg/L . A2: CBO20: 448 mg/L .B2: CBO20: 481 mg/L Concentração efluente diluído: . A1: CQO: 661 mg/L .B1: CQO: 737 mg/L . A1:TF: 45 mg/L .B1:TF: 65 mg/L . A1: CBO5: 130 mg/L .B1: CBO5: 136 mg/L . A1: CBO20: 251 mg/L .B1: CBO20: 231 mg/L Observações e comentários A performance do sistema de zonas húmidas foi avaliada com unidades de taxa de remoção de massa (TRM) (g/m2/d) Regista-se uma melhor performance do sistema de zonas húmidas com o efluente diluído. Regista-se que o sistema A apresenta melhor performance que o sistema B; verifica-se taxas de remoção superiores com efluente diluído. Verifica-se uma taxa de remoção expressa em TRM de CQO, CBO5 e TF: . A1: 82.7%, 94.4% e 81.2%, respetivamente; . B1: 69.1%, 87.6% e 30.3%, respetivamente; . A2: 71.4%, 93.1% e 59.0%, respetivamente; . B2: 73.2%, 93.4% e 49.0%, respetivamente. Os resultados mostram uma redução na performance do sistema de zonas húmidas quando aplicado o tratamento prévio de ozonação. A diluição do efluente bruto (A1) leva a um aumento da taxa de remoção de TF de 59% para 81.2%, o que sugere que a elevada concentração de compostos fenólicos provoca um efeito de inibição na degradação dos mesmos.