Desenvolvimento e validação de cosmecêuticos com Diospyros kaki

Universidade do Minho Escola de Ciências Jocelio Evaristo Francelino Desenvolvimento de validação de cosmecêuticos derivados de Diospyros kaki Janeiro de 2020 Desenvolvimento e validação de cosmecêuticos derivados de Diospyros kaki UMinho | 2020 Jocelio Evaristo Francelino 2 Universidade do Minho Escola de Ciências Jocelio Evaristo Francelino Desenvolvimento e validação de cosmecêuticos com Diospyros kaki Dissertação de Mestrado Mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Alberto Carlos Pires Dias e da Doutora Vanessa Alexandra Fernandes Magalhães Janeiro de 2020 ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-Não Comercial-Sem Derivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii AGRADECIMENTOS Esta dissertação de mestrado não poderia ser realizada sem o apoio, incentivo e compreensão de inúmeras pessoas que de alguma forma me ajudaram a vencer os obstáculos que surgiram no decorrer de sua execução. Pessoas às quais não posso deixar de agradecer. Em primeiro lugar agradeço a Deus, pois com ele tudo é possível. Aos meus pais, que sempre me apoiaram em todas as decisões e me deram suporte de todas as forma possíveis. À minha irmã, pela amizade e por sempre estar disposta a ajudar no que for preciso. Apesar da distância, vocês sempre se fizeram presentes e me ajudaram a vencer mais uma etapa. Aos meus orientadores Doutor Alberto Dias e Doutora Vanessa Magalhães, que durante este ano estiveram compartilhando seus conhecimentos e ensinando o caminho certo a se seguir. Foram várias as barreiras, mas juntos conseguimos ultrapassá-las. Estiveram sempre dispostos a ouvir, corrigir, criticar, alertar e ajudar. Sem a orientação de vocês esta dissertação não seria possível, muito obrigado! Aos meus colegas de laboratório, agradeço por todos os ensinamentos, pelo tempo dispensado para tirar as dúvidas, ajudar nos ensaios ou mesmo conversar e dar boas risadas. Quero agradecer imensamente ao Luis Giraldo e à Marta Cunha, que me ensinaram muito nos ensaios bioquímicos e de forma especial à Barbara Ferreira, que é uma “ expert ” em formulações cosméticas e ensaios biometrológicos na pele e foi uma verdadeira professora nesta parte do trabalho. Aprendi muito com vocês, obrigado! Agradeço a todos os professores do mestrado de Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas, pela competência e dedicação ao ensino e à ciência. Aos colegas do “Mestrado das Plantas”, agradeço pelos vários momentos divertidos e inesquecíveis que vivemos durante estes dois anos, foi muito bom conhecê-los, desejo a cada um muita sorte e sucesso. Aos meus colegas de trabalho do Hemocentro de Goiás, que desde o início desta jornada foram grandes apoiadores e mesmo distantes sempre me enviavam boas energias e mensagens de incentivo. Por fim, a todos que não citei os nomes ou mencionei, mas que fizeram parte desta etapa que está a acabar. Muito obrigado a todos! iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Desenvolvimento e validação de cosmecêuticos com Diospyros kaki RESUMO O mercado de cosméticos é sem dúvida um mercado em ascensão e muito lucrativo. Os consumidores estão cada vez mais exigentes e as indústrias de cosméticos investem cada vez mais no desenvolvimento de novos produtos. Os cosméticos produzidos com extratos de plantas estão se destacando por representarem produtos naturais, sustentáveis, puros, saudáveis, seguros e eficientes. O Diospyros kaki , uma planta rica em compostos fitoquímicos, tem sido descrito por ter um efeito benéfico sobre a pele, nomeadamente por apresentar atividades antioxidante, anti-inflamatória, antialérgica, foto-protetora e antirrugas, além de clareamento, redução de eritema, prevenção de dermatites e redução de sebo. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a produção de cremes utilizando subprodutos do Diospyros kaki , como extratos de folhas verdes, de folhas vermelhas e de resíduo alcoólico (biomassa da fermentação alcoólica da produção de vinagre de dióspiro). Diferentes extratos foram produzidos e analisados qualitativamente através da técnica de HPLCDAD, onde foram identificados vários polifenóis como a quercetina, o kaempferol, catequinas, a procianidina, derivados do ácido clorogénico e derivados glicosilados da luteína, em consonância com o já referido na literatura. Realizaram-se ensaios bioquímicos conhecidos, como DPPH, ICA, radical superóxido e óxido nítrico para avaliação da atividade antioxidante in vitro dos extratos. Os extratos de folhas vermelhas e folhas verdes apresentaram atividade antioxidante significante nestes ensaios. Realizaram-se ainda ensaios de citotoxicidade e citoproteção contra insultos oxidativos recorrendo à avaliação da viabilidade celular (ensaio MTT), com as linhas celulares de fibroblastos L929 e queratinócitos HaCaT. Os ensaios de citoproteção indicaram que o três extratos possuem capacidade de proteger as células dos efeitos do insulto oxidativo, com efeitos citoprotetores mais potentes para os dois extratos de folhas. Adicionalmente foi efetuado o ensaio em fibroblastos L929 para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigénio (ERO) recorrendo ao marcador diclorofluoresceína diacetato (DCFDA). Verificou-se que os extratos de folhas verdes e de resíduo alcoólico reduziram significativamente o nível de ERO intracelular. Por fim, foram preparados cremes com extratos de folhas verdes (fvd) e de folhas vermelhas (fvm). Estes cremes foram avaliados em voluntários para observar os efeitos imediatos da sua aplicação tendo sido avaliados os seguintes parâmetros na pele: formação de eritema através do Mexameter, perda transepidérmica de água (TEWL) através do Tewameter e variação do conteúdo aquoso do estrato córneo através do Corneometer. Os cremes apresentaram bons resultados na pele, pois não indicaram a formação de eritema, melhoraram a hidratação da pele de seca para suficientemente hidratada e não apresentaram aumento na TEWL. Palavras chave: antioxidante, citoproteção, cosméticos, Diospyros kaki , pele. vi Development and validation of cosmeceuticals with Diospyros kaki ABSTRACT Cosmetics is undoubtedly a growing and very profitable market. Consumers are increasingly demanding, and the cosmetics industries are investing more in new products development. Cosmetics with plant extracts are standing out for representing natural, sustainable, pure, healthy, safe and efficient products. Diospyros kaki , a rich in phytochemicals plant, has been described for with beneficial effects on the skin, namely with antioxidant, anti-inflammatory, anti-allergic, photo-protective and anti-wrinkle activities, in addition to whitening skin, erythema reduction, dermatitis prevention, and sebum reduction. In this context, this work aimed to produce creams using by-products of Diospyros kaki , such as extracts of green leaves, red leaves and alcoholic residue (from the fruit alcoholic fermentation in the persimmon vinegar production). Different extracts were produced. They analysed qualitatively using the HPLC-DAD. Several polyphenols, such as quercetin, kaempferol, catechins, procyanidin, chlorogenic acid derivatives, and lutein glycosylated derivatives, were identified in line with has been already mentioned in the literature. Recognized biochemical assays were carried out, such as DPPH, ICA, superoxide radical and nitric oxide, in order to evaluate the in vitro antioxidant activity of the extracts. Both extracts (of red leaves and green leaves) showed significant antioxidant activity in these assays. Cytotoxicity and cytoprotection assays against oxidative insults were also carried out using cell viability assessment (MTT assay), using L929 fibroblast and HaCaT keratinocyte cell lines. Cytoprotection tests indicated that the three extracts have the capacity to protect cells from the effects of the oxidative insult, with pronounced potent cytoprotective effects for the leaf extracts. In addition, the L929 fibroblasts assay was performed for the quantitative evaluation of reactive oxygen species (ROS) using the dichlorofluorescein diacetate marker. It was observed that either the green leaves or alcoholic residue extracts significantly reduced the intracellular ROS level. Finally, creams were prepared with both green and red leaves extracts. These creams were evaluated in volunteers to examine the immediate effects of their application. The following parameters on the skin having been evaluated: erythema formation (through Mexameter), transepidermal water loss - TEWL (through Tewameter) and the water content of the stratum corneum (through the Corneometer). The creams showed good results on the skin, as they did not lead to erythema formation; instead, they improved the hydration of dry skin to sufficiently hydrated and did not show an increase in TEWL. Keywords: antioxidant, cytoprotection, cosmetics, Diospyros kaki , skin. vii ÍNDICE Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros ..................................................... ii Agradecimentos .................................................................................................................................. iii Declaração de Integridade .................................................................................................................. iv Resumo............................................................................................................................................... v Abstract.............................................................................................................................................. vi Índice de Figuras ................................................................................................................................. x Índice de Tabelas ............................................................................................................................. xiv Lista de Abreviaturas, Siglas e Unidades ........................................................................................... xvi Introdução Geral ......................................................................................................................... 1 Origem, importância e principais usos do Diospyros kaki L. (Dióspiro) .................................. 1 Os compostos fitoquímicos e sua importância...................................................................... 3 Fitoquímicos de interesse dermatológico e cosmético obtidos de Diospyros kaki ................... 6 A pele: principais funções e estrutura ................................................................................ 10 Os Radicais Livres e o envelhecimento da pele .................................................................. 13 Cosméticos ....................................................................................................................... 18 Produção de cosméticos com plantas ................................................................................ 20 Avaliação da segurança e eficácia de produtos cosméticos ................................................ 23 Objetivos................................................................................................................................... 26 Objetivo Geral:................................................................................................................... 26 Objetivos específicos: ........................................................................................................ 26 Materiais e Equipamentos ......................................................................................................... 27 Métodos ................................................................................................................................... 29 Recolha do material vegetal ............................................................................................... 29 Preparação dos extratos .................................................................................................... 29 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ................................................................ 30 Ensaios bioquímicos para avaliação da atividade antioxidante in vitro ................................. 31 Atividade de sequestro do Superóxido ........................................................................ 32 Atividade quelante de Ferro (ICA) ............................................................................... 33 Ensaio de redução do DPPH ...................................................................................... 34 Inibição da produção de Óxido Nítrico ........................................................................ 36 xiv ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Produção mundial de dióspiro no ano de 2017 de acordo com dados do “Food and Agriculture Organization of the United Nations” (FAOSTAT, 2019). ........................................................................ 2 Tabela 2 - Principais técnicas utilizadas no isolamento e identificação de compostos fitoquímicos das plantas. Adaptado de (Mendoza & Silva, 2018). *Neste trabalho foi utilizado a técnica de Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para identificação qualitativa dos principais compostos fitoquímicos dos extratos de Diospyros kaki . ................................................................................................................. 6 Tabela 3 - Fitoquímicos isolados em partes da planta do Diospyros kaki que tem aplicação na área dermatológica ou cosmética. Adaptado de (Kashif et al ., 2017). .......................................................... 9 Tabela 4 - Principais causas de stress oxidativo na pele. Adaptado de Kohen (1999) ......................... 15 Tabela 5 - Principais causas, mecanismos moleculares e manifestações clínicas dos processos intrínsecos e extrínsecos de envelhecimento da pele. Adaptado de (Cavinato, 2018). ......................... 16 Tabela 6 - Exemplos de produtos botânicos com suas funções antienvelhecimento e os tipos de estudos e resultados observados. Adaptado de (Campa & Baron, 2018) ........................................................ 22 Tabela 7 – Materiais e reagentes utilizados nos ensaios. ................................................................... 27 Tabela 8 - Equipamentos utilizados durante os ensaios. .................................................................... 28 Tabela 9 – Descrição do gradiente de eluição da análise por HPLC-DAD. ........................................... 31 Tabela 10 - Concentrações de extratos usadas no ensaio de citoproteção e citotoxicidade. ................ 40 Tabela 11 - Fases da preparação das formulações, com os ingredientes e as quantidades. Na fase D, foram adicionados os respetivos extratos do dióspiro e no creme controlo foi adicionado água em substituição ao extrato. ..................................................................................................................... 43 Tabela 12 - Limites microbiológicos em produtos cosméticos, divido por categoria de produtos. Adaptado de (“Revis. SCCS Notes Guid. Test. Cosmet. Ingredients their Saf. Eval. 9th Revis.,” 2016). .............. 44 Tabela 13 – Compostos obtidos através da análise de HPLC dos extratos de dióspiro. ....................... 52 Tabela 14 - Atividade de eliminação do superóxido dos extratos de folhas de dióspiro e do antioxidante ácido ascórbico e comparação da significância dos resultados. ......................................................... 54 Tabela 15 – Atividade quelante de ferro dos extratos de dióspiro e do agente quelante EDTA e comparação da significância dos resultados.......................................................................................................... 56 Tabela 16 - Redução do radical DPPH dos extratos de folhas de dióspiro e do antioxidante Trolox e comparação da significância dos resultados. ..................................................................................... 57 xv Tabela 17 – Inibição da produção de óxido nítrico apresentada pelos extratos de folhas do dióspiro e o ácido ascórbico e comparação da significância dos resultados. ......................................................... 59 Tabela 18 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas. .............................................................................................................................................. 62 Tabela 19 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas. .............................................................................................................................................. 63 Tabela 20 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas. .............................................................................................................................................. 64 Tabela 21 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas. .............................................................................................................................................. 65 Tabela 22 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas (pré-incubação por 2 horas e co-incubação por 3 horas com t-BHP). ................................................. 67 Tabela 23 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas (pré-incubação por 21 horas e co-incubação por 3 horas com t-BHP). ............................................... 68 Tabela 24 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas (pré-incubação por 2 horas e co-incubação por 3 horas com t-BHP). ........................................ 70 Tabela 25 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas (pré-incubação por 21 horas e co-incubação por 3 horas com t-BHP). ...................................... 71 Tabela 26 - Deteção de espécies reativas de oxigénio (ERO) com o DCFDA para os extratos de folhas vermelhas, folhas verdes e resíduo alcoólico de dióspiro expresso em percentagem de intensidade de fluorescência e comparação da significância dos resultados. ............................................................. 73 Tabela 27 – Dados provenientes da avaliação microbiológica das formulações cosméticas com extratos de dióspiro, formulação controlo e parâmetros de referência da norma europeia (“Revis. SCCS Notes Guid. Test. Cosmet. Ingredients their Saf. Eval. 9th Revis.,” 2016). ................................................... 75 xvi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES ADN - Ácido desoxirribonucleico AOX - Antioxidante ATP - Adenosina trifosfato BHT - Hidroxitolueno butilado cn - Controle negativo °C - Graus Celsius CE - Eletroforese capilar CEN - Comitê Europeu de Normalização c-LC - Cromatografia líquida capilar COX-2 - Ciclooxigenase-2 D. kaki - Diospyros kaki DCF - Diclorofluoresceína DCF-DA - 2 ', 7'-diclorofluorescina-diacetato DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO - Dimetilsulfóxido DPPH - 2,2-difenil-1-picril-hidrazil EC - Concentração Efetiva EDTA - Ácido etileno diamino tetra acético EGCG - Epigalocatequina-3-galato ERA - Extrato de resíduo alcoólico ERN - Espécies reativas de nitrogênio ERO - Espécies reativas de oxigênio F. - Folhas FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations FBS - Soro fetal bovino fc - Formulação controlo fvd - Formulação com folhas verdes fvm - Formulação com folhas vermelhas FZ - Ferrozina g - Gramas GC - Cromatografia gasosa h - Horas H2O2 – Peróxido de hidrogénio HIF-1α - Fator indutor de hipóxia-1alfa HO-1 - Hemeoxigenase-1 HPLC - Cromatografia líquida de alta resolução ICA – Atividade quelante de ferro IFN-γ - Interferon gama IL-2 - Interleucina 2 IL-6 - Interleucina 6 IL-1β - Interleucina 1 beta IR - Espectroscopia de infravermelho ITP - Isotacoforese Kcal - Quilocaloria KCl - Cloreto de potássio LB - Luria Bertani LDH - Enzima lactato desidrogenase LED - Diodo emissor de luz LPS - Lipopolissacarídeo xvii m² - Metros quadrados MEC - Matriz extracelular mg - Miligramas µg - Microgramas min - Minutos mL - Mililitros μL - Microlitros mm - Milímetros mM - Milimolar µM - Micrómetro MMP-1 - Metaloproteinase-1 da matriz MS - Espectroscopia de massa MTT - Brometo [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazólio] N/A - Não avaliado NaCl - Cloreto de sódio NADH - Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NADPH - Fosfato dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NBT - Azul de nitrotetrazólio NED - N-(1-naftil) etilenodiamida NF-kB - Fator nuclear kappa B NIR - Espectroscopia no infravermelho próximo nm - Nanometros NO - Óxido nítrico -OH - Grupo hidroxilo O2•- - Superóxido p - Probabilidade PBS - Solução tampão fosfato salina PGE2 - Prostaglandina E2 PMS - Metossulfato de fenazina PRDX2 - Peroxirredoxina 2 Res.- Resíduo RMN - Espectroscopia de ressonância magnética nuclear RPM - Rotação por minuto RPMI - Roswell Park Memorial Institute SC - Estrato córneo SNP - Nitroprussiato de sódio t1 – Medição inicial antes da aplicação dos cremes t6 – Medição após 6 horas da aplicação dos cremes t-BHP - Hidroperóxido de terc-butilo TEWL - Perda transepidérmica de água TLC - Cromatografia em camada fina TLE - Eletroforese em camada fina TNFα - Fator de necrose tumoral alfa UA - Unidades arbitrárias UFC - Unidade formadora de colônias UV - Ultravioleta UVB - Ultravioleta B VEGF - Fator de crescimento endotelial vs. - Versus 1 INTRODUÇÃO GERAL Origem, importância e principais usos do Diospyros kaki L. (Dióspiro) O diospireiro ( Diospyros kaki L.) é uma planta frutífera, pertencente à família Ebenaceae (Figura 1) e originária da Ásia, mais precisamente das montanhas da região central da China (de Campos et al ., 2015), onde é cultivada desde séculos antes de Cristo. Foi levada para o Japão no século VII e Coreia no século XIV (Martínez-calvo et al ., 2012), onde foram desenvolvidas novas variedades e com o passar dos anos foi disseminada para outros países. A sua introdução nos países ocidentais, ocorreu inicialmente no século XIX, começando nos Estados Unidos, seguindo para França, Espanha, Itália (de Campos et al ., 2015; Park et al ., 2004) e Brasil (Neuwald et al ., 2009). Com o passar dos anos, espalhouse pelos cinco continentes (Tim, 2012). Embora existam mais de 400 espécies cultivadas globalmente, apenas quatro têm importância comercial, Diospyros virginiana, Diospyros oleífera, Diospyros lotus e Diospyros kaki , esta última destacase como a mais importante. (Akbulut et al ., 2008; Bibi et al ., 2007; Butt et al ., 2015) Figura 1 - Classificação biológica do dióspiro. Adaptado de Butt et al ., (2015). A produção global de dióspiro alcançou 3.702.232 toneladas em 2007 e 5.190.324 toneladas em 2014. A área colhida aumentou 578.020 hectares em 10 anos, confirmando a importância econômica desta espécie em todo o mundo (Kluge & Tessmer, 2018). De acordo com a FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), os maiores produtores mundiais em 2017 foram China, Espanha, Coreia, Japão e Brasil, conforme pode ser observado na Tabela 1. 2 Tabela 1 - Produção mundial de dióspiro no ano de 2017 de acordo com dados do “Food and Agriculture Organization of the United Nations” (FAOSTAT, 2019). País Produtor Quantidade produzida (em toneladas) China 4.216.376 Espanha 404.131 República da Coreia 378.991 Japão 225.300 Brasil 180.800 Azerbaijão 147.219 Uzbequistão 85.824 Itália 49.675 Israel 29.000 Irão 24.326 Nepal 2.823 Nova Zelândia 2.333 Eslovénia 2.055 Chile 744 Austrália 717 México 53 TOTAL 5.750.367 O dióspiro, conforme seu amadurecimento, pode ter uma cor que varia entre o amarelo, laranja e o vermelho. Quando totalmente amadurecido tem um sabor doce e suave, entretanto, quando não está totalmente maduro é rico em taninos solúveis que lhe conferem uma certa adstringência (Celik & Ercisli, 2008). É um fruto rico em proteínas, fibras, carboidratos, carotenóides, compostos fenólicos, vitaminas e minerais (Kluge & Tessmer, 2018). De acordo com Baltacioǧlu & Artik (2013), a polpa de diferentes variedades apresenta de 0,40% a 1,16% de fibra bruta, 80% de água, de 0,40% a 0,60% de proteína e 0,05% de gordura total, além de apresentar baixas taxas calóricas (70 kcal/100g). Segundo Butt et al . (2015), a rica composição fitoquímica do dióspiro tem incentivado pesquisas para seu uso na cura de doenças e promoção da saúde, já que ele é potencialmente eficaz no combate a produção de radicais livres, hipercolesterolemia, diabetes mellitus, cancro, distúrbios dérmicos e hipertensão. Na Coreia, Japão e principalmente na China, devido ao desempenho de seus ingredientes funcionais, é tradicionalmente usado para fins medicinais (Yaqub et al ., 2016), incluindo o tratamento de paralisia, úlcera de frio, queimaduras e para conter o sangramento (Jo et al ., 2003; Sun et al ., 2011; Xie et al ., 2015). Carotenóides como β-criptoxantina, β-caroteno, zeaxantina, licopeno e luteína são pigmentos encontrados em frutas do dióspiro (Giordani et al ., 2011), sendo responsáveis pela sua coloração e desempenhando um papel importante na saúde humana devido a provitamina A e às atividades 3 antioxidantes (Giordani et al ., 2011; Kluge & Tessmer, 2018). O fruto do dióspiro também é considerado fonte de vitamina C e de compostos fenólicos e polifenólicos, como flavonóides (catequinas e taninos condensados) que fazem o “ Scavenging ” dos radicais livres (El-Hawary et al ., 2019; Suzuki et al ., 2005). Em alguns países asiáticos, as folhas do diospireiro são consumidas como chá promotor da saúde por possuírem inúmeros efeitos biológicos, nomeadamente antioxidante, anticancerígeno, antihipertensivo, anti-inflamatório, anti-hiperglicémico (Kawakami et al ., 2013) anti-histamínico, antialérgico e neuro-protetor (Xie et al ., 2015), ainda apresentando efeitos benéficos na hemostase sanguínea, na constipação, na apoplexia e na aterosclerose (JS Lee et al ., 2006; Sun et al ., 2011). De acordo com as pesquisas de Jo et al . (2003) e Matsuo & Ito (1978) foram encontradas nas folhas do diospireiro, oligómeros flavonóides, taninos, fenóis, ácidos orgânicos, clorofila, vitamina C e cafeína. Suas folhas estão cada vez mais populares também na indústria cosmética devido as propriedades de clareamento da pele. Na China o chá é usado para evitar a produção de melanina; no Japão, é usado também como anti-envelhecimento e fonte de nutrientes. Em Taiwan, onde é conhecido como “folha da beleza”, além de ser usado como bebida, é usado para lavar rosto e corpo (Xie et al ., 2015). A madeira das plantas do gênero Diospyros possuem um grande número de derivados de naftaleno. Vários naftaldeídos e algumas naftoquinonas foram isolados e suas atividades antifúngicas investigadas, sendo que eles exibiram efeitos inibitórios contra parasitas protozoários (Matsushita et al ., 2011). Nas últimas décadas, há grande quantidade de informação disponível sobre as atividades fitoquímicas e farmacológicas de constituintes isolados de folhas de diospireiro. No entanto, visto que a maioria das publicações são em Chinês e baseadas na Medicina Tradicional Chinesa e não estão acessíveis à todos (Xie et al ., 2015), há muita informação a ser elucidada. Praticamente todas as partes da planta são utilizadas e seu uso muito difundido na área da medicina, farmacologia, bem-estar, alimentar e cosmética, esta última em menor proporção e que carece de mais investigação. Os compostos fitoquímicos e sua importância O "fito-" da palavra fitoquímicos é derivado do grego “ phyto ”, que significa planta. Portanto, a palavra fitoquímicos significa literalmente, químicos das plantas. Entretanto, numa definição mais ampla podemos considerar os fitoquímicos como compostos bioativos encontrados em frutas, vegetais, grãos e outras partes das plantas. Conforme demonstrado na Figura 2, eles podem ser classificados em cinco 4 principais grupos: alcalóides, carotenóides, compostos fenólicos, compostos azotados e compostos organossulfurados. Os fitoquímicos mais estudados são os compostos fenólicos e os carotenóides (Liu, 2004). Figura 2 - Fitoquímicos encontrados em plantas. Adaptado de (Liu, 2004). Há cerca de 400.000 espécies de plantas superiores no mundo, sendo uma fonte valiosa de numerosos compostos fitoquímicos. Mais de 80% dos aproximadamente 30.000 produtos naturais conhecidos são de origem vegetal, quase quatro vezes maior do que o estimado no reino microbiano. Estes produtos naturais das plantas compõe uma grande parte dos produtos farmacêuticos, aditivos alimentares, cosméticos e agroquímicos utilizados em nossa vida quotidiana (Zhong, 2011). De fato, os seres humanos têm desenvolvido um amplo catálogo de plantas úteis ao longo do tempo através do contato contínuo com a natureza, e o uso de plantas e extratos de plantas na medicina tradicional é conhecido desde os tempos antigos (Barbulova et al ., 2014). Frutas e vegetais são partes vitais da dieta humana e uma rica fonte de compostos bioativos, incluindo fibras alimentares, antioxidantes naturais e vários fitoquímicos. A maioria dos compostos bioativos (fitoquímicos, compostos fenólicos e carotenóides) não são nutritivos, mas são eficazes contra inúmeras doenças, pois desempenham papéis importantes como agentes quimiopreventivos ou quimioterápicos (Yaqub et al ., 2016). 5 As plantas sintetizam uma vasta gama de compostos orgânicos que são tradicionalmente classificados como metabolitos primários e secundários, embora os limites precisos entre os dois grupos possa ser, em alguns casos, um pouco confuso (Crozier et al ., 2007). Os metabolitos primários incluem principalmente aminoácidos, glicosídeos e ácidos gordos, envolvidos no crescimento, desenvolvimento, reprodução e em outras funções primárias das plantas. Já os metabolitos secundários foram definidos pela primeira vez em 1891, por Kossel, como compostos que aparentemente não têm papel importante na manutenção de processos vitais fundamentais das plantas. Os metabolitos secundários são os principais contribuintes de odor, cor e sabor específicos das partes da planta. No passado, pensava-se que esses compostos orgânicos eram biologicamente insignificantes, mais tarde, verificou-se que eles desempenham um papel importante e fundamental na interação das plantas com o meio ambiente e nos mecanismos de defesa da planta contra danos bióticos e abióticos (Ahmed et al ., 2017). Enquanto os metabolitos primários apresentam sua principal importância para a nutrição humana, os metabolitos secundários, devido às suas extensas atividades biológicas, são utilizados há séculos na medicina popular e nos dias atuais têm recebido grande atenção devido à sua utilização potencial em cosméticos, medicamentos e mais recentemente como nutracêuticos. Essa mudança drástica no interesse dos metabolitos secundários não é puramente académica, mas também de natureza comercial (Ahmed et al ., 2017; Fumagali et al ., 2008) Os metabolitos secundários podem ser classificados de diferentes maneiras com base em características químicas, origem vegetal ou origem biossintética. Na maioria da literatura publicada até a data que considera a classificação de origem biossintética, eles são subdivididos em três grupos principais: terpenóides, sintetizados a partir de ácido mevalônico no citoplasma ou piruvato e 3fosfoglicérido no cloroplasto; alcalóides, comumente derivados de aminoácidos aromáticos ou alifáticos (Crozier et al ., 2006); e compostos fenólicos, derivados da via do chiquimato ou da via do ácido mevalônico (Crozier et al ., 2007). Os compostos fenólicos, envolvidos na síntese de lignina, apresentam atividade farmacológica importante e são comuns a todas as plantas superiores, enquanto outros compostos, como os alcalóides, são escassamente distribuídos entre plantas superiores e sua presença é usada como traço taxonómico e constitui a base da quimiotaxonomia e ecologia química (Fumagali et al ., 2008). Os extratos vegetais são uma combinação de vários tipos de fitoquímicos com polaridades diferentes, devido a este fato, a sua separação ainda permanece como um grande desafio para o processo de identificação e caracterização dos mesmos (Boligon & Athayde, 2014). A Tabela 2 apresenta um resumo das principais técnicas de separação e identificação de compostos fitoquímicos, como por 6 exemplo, os diversos tipos de cromatografia, que permitem isolar mais destas moléculas, constituindo se como a base para o estabelecimento da disciplina de fitoquímica (Fumagali et al ., 2008; Harborne, 1984). Apesar das modernas técnicas de triagem, separação e elucidação estrutural terem renovado o interesse das indústrias farmacêuticas por produtos naturais, ainda há muitas plantas a serem estudadas (Saklani & Kutty, 2008). Tabela 2 - Principais técnicas utilizadas no isolamento e identificação de compostos fitoquímicos das plantas. Adaptado de (Mendoza & Silva, 2018). *Neste trabalho foi utilizado a técnica de Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para identificação qualitativa dos principais compostos fitoquímicos dos extratos de Diospyros kaki . Cromatografia Cromatografia em camada fina (TLC) Cromatografia gasosa (GC) Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) * Cromatografia líquida capilar (c-LC) Eletroforese Eletroforese em camada fina (TLE) Isotacoforese (ITP) (eletroforese em velocidade uniforme) Eletroforese capilar (CE) Técnicas espectroscópicas Espectroscopia UV Espectroscopia de infravermelho (IR) Espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) Espectroscopia de massa (MS) A busca por novos ingredientes naturais pelas indústrias cosméticas levou à coleta de flores, sementes, raízes, folhas, galhos e frutos de plantas por todo o mundo. Os metabolitos de plantas com potenciais aplicações cosméticas incluem os compostos fenólicos, polifenóis, flavonóides, terpenóides, esteróides, saponinas esteróides, esteróis, açúcares, polissacarídeos, lignanas, carotenóides, ácidos orgânicos, antocianinas e cumarinas. Várias fontes vegetais foram exploradas pela indústria farmacêutica e cosmética para criar formulações com uma combinação inovadora de ingredientes e com ações específicas, como antialérgica, anti-inflamatória, hidratante, pró-colagénica, anti carcinogénica, antienvelhecimento, anti-hiperpigmentação e com fator de proteção UV (Charles Dorni et al ., 2017). Fitoquímicos de interesse dermatológico e cosmético obtidos de Diospyros kaki Dados científicos revelaram uma excelente posição do Diospyros kaki na dermatologia e na estética, tornando-o uma opção valiosa nestas áreas. Os princípios ativos de diferentes partes da planta demonstraram possuir efeitos anti-inflamatórios, antialérgicos, foto-protetores e antirrugas, com atividades apreciáveis contra as enzimas tirosinase, elastase e colagenase. A promissora atividade antioxidante, o potencial de clareamento da pele, a redução do conteúdo de sebo e no tamanho e número 13 direção às da superfície, formando as outras quatro camadas da epiderme, conhecidas como: camada espinhosa, camada granulosa, camada lúcida e camada córnea (Seeley et al ., 2004). A derme é um sistema integrado de matrizes celulares e acelulares fibrosas que acomoda estruturas nervosas e vasculares, bem como apêndices derivados da epiderme. Muitos tipos de células residem na derme, incluindo fibroblastos, macrófagos, mastócitos e células imunes circulantes. A derme é responsável pela elasticidade da pele, flexibilidade e resistência à tração. Oferece proteção contra ferimentos mecânicos, retém água e auxilia na regulação térmica. Ela também contém e suporta recetores de estímulos sensoriais e é um elemento-chave na cicatrização de feridas (Kolarsick et al ., 2011). A força mecânica da pele é dada pela derme, que é composta principalmente pela matriz extracelular (MEC) onde os fibroblastos sintetizam alguns de seus componentes, como o colagénio e a elastina, que a sustentam e lhe dão elasticidade. O colagénio é um dos principais materiais resistentes ao stress da pele. As fibras elásticas, por outro lado, desempenham um papel na manutenção da elasticidade, mas fazem muito pouco para resistir à deformação e à rutura da pele (Sadaf Hashim Hussain et al ., 2013). A derme tem duas camadas, a superficial (camada papilar) e a mais profunda (camada reticular). A camada papilar é uma fina camada de derme localizada imediatamente abaixo da epiderme e cobre as papilas dérmicas. A matriz do tecido conjuntivo hospeda células do tecido conjuntivo distribuídas aleatoriamente, colagénio principalmente do tipo III, misturado a uma rede de fibras elásticas soltas e muitos capilares que nutrem as camadas avasculares da epiderme e regulam a temperatura corporal. A camada reticular é uma mistura de tecido conjuntivo denso contendo principalmente feixes de fibras de colagénio tipo I com fibras elásticas grossas. A derme hospeda também folículos capilares, glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas, vasos sanguíneos, nervos e recetores sensoriais (Arda et al ., 2014). A hipoderme, é uma camada de tecido conjuntivo laxo que liga a pele aos órgãos internos. Ela contém gordura subcutânea e tecido laxo, proporcionando amortecimento, termorregulação e estabilidade da pele, conectando a derme aos órgãos internos (Farage et al ., 2007). Os Radicais Livres e o envelhecimento da pele Espécies reativas de oxigênio (ERO), espécies reativas de nitrogênio (ERN), hidrogênio atômico, alguns metais pesados de transição, cloro, determinados medicamentos, radiação ionizante e resíduos ambientais são tipos diferentes de radicais livres (Valko et al ., 2007). Os radicais livres ou espécies reativas são inevitavelmente gerados pelo organismo, já que são necessários no processo de respiração 14 celular que ocorre nas mitocôndrias, a fim de gerar a energia na forma de adenosina trifosfato (ATP)(Poyton et al ., 2009). O efeito nocivo dos radicais livres que causam potencial dano biológico é denominado stress oxidativo e stress nitrosativo. Isso ocorre em sistemas biológicos quando há uma superprodução de ERO/ERN por um lado e uma deficiência de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos por outro. Em outras palavras, o stress oxidativo resulta das reações metabólicas que usam oxigênio e representam um distúrbio no status de equilíbrio das reações pró-oxidantes e antioxidantes nos organismos vivos. Por esse motivo, o stress oxidativo tem sido implicado em várias doenças humanas, bem como no processo de envelhecimento. O equilíbrio entre os efeitos benéficos e prejudiciais dos radicais livres é um aspeto muito importante dos organismos vivos (Dröge, 2002; Valko et al ., 2007). As ERO podem ter efeitos benéficos, pois podem agir como esterilizadores químicos em nosso mecanismo de defesa ou operar como moléculas reguladoras em várias vias de sinalização intracelular (Martin & Feng, 2009), outro exemplo benéfico de ERO em concentrações baixas/moderadas é a indução de uma resposta mitogénica (Valko et al ., 2007). Entretanto, no geral, as ERO são considerados compostos tóxicos. Em 1956, Denham Harman propôs que as ERO são determinantes do processo de envelhecimento, pois em excesso podem danificar lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, levando à disfunção celular e à morte (Harman, 1956). A geração de ERO, incluindo oxigênio singleto, radical hidroxilo, anião superóxido e peróxido de hidrogênio, bem como a libertação de ferro 'livre', leva a níveis significativos de stress oxidativo (Cefali et al ., 2016). Em pesquisas recentes, níveis alterados de ERO foram implicados em doenças como Alzheimer, Parkinson, aterosclerose, artrite reumatoide, diabetes, psoríase, fibrose cística, hipertensão, isquemia e cancro (Benz & Yau, 2008). A pele está exposta ao stress oxidativo, tanto de origem endógena como exógena, estando poucos tecidos no corpo sujeitos a semelhantes níveis de exposição. As fontes exógenas incluem poluentes do ar, o ozono e altas concentrações de oxigénio, radiações ionizantes e não-ionizantes, presença de bactérias patogénicas, vírus, e diferentes químicos e toxinas exógenas. As fontes endógenas incluem enzimas associadas à produção indireta de ERO, como por exemplo, a xantina oxidase que converte a xantina em ácido úrico, algumas células como os neutrófilos envolvidas no processo imune do organismo, algumas doenças (Kohen, 1999) e produção de energia pelas células (Inoue, 2017). A Tabela 4 resume as principais fontes de espécies reativas a que a pele está exposta. 15 Tabela 4 - Principais causas de stress oxidativo na pele. Adaptado de Kohen (1999) Causas Fontes Exógenas Poluentes (fumaça de cigarro) Gases atmosféricos (ozónio) Químicos (ácidos, herbicidas, toxinas) Agentes patogénicos (vírus, bactérias) Radiação (UV, radiação ionizante) Fontes Endógenas Enzimas (xantina oxidase, NO sintase) Células (Neutrófilos) Processos patológicos (eventos isquémicos e pós isquémicos) Doenças (psoríases, cancro) Produção de energia celular Os sinais do envelhecimento tornam-se evidentes ao longo do tempo e as alterações cutâneas constituem a sua primeira evidência óbvia (Makrantonaki & Zouboulis, 2007). O envelhecimento cutâneo é o resultado cumulativo de dois componentes comumente denominados “intrínseco” e “extrínseco” que serão minuciados na Tabela 5. O processo de envelhecimento intrínseco ou cronológico é uma consequência inevitável de alterações fisiológicas e genéticas e não ocorre apenas na pele, mas também em todos os outros tecidos e órgãos do corpo e é resultante do declínio “geneticamente programado” das funções que garantem o bom funcionamento do organismo. Já o componente extrínseco depende de fatores externos, como exposição à luz solar, poluição, tabagismo, hábitos alimentares, entre outros e é estimado em 80% dos sinais visíveis do envelhecimento da pele (Rodan et al ., 2016). A luz solar é o componente externo mais prejudicial à pele e por esse motivo, o envelhecimento extrínseco é muitas vezes referido como fotoenvelhecimento. O fotoenvelhecimento é caracterizado por rugas, hiperpigmentação, telangiectasia, queratose actínica e maior risco de cancro de pele em áreas expostas ao sol, como rosto e pescoço (Inoue, 2017). 16 Tabela 5 - Principais causas, mecanismos moleculares e manifestações clínicas dos processos intrínsecos e extrínsecos de envelhecimento da pele. Adaptado de (Cavinato, 2018). Causas Mecanismos moleculares Manifestações histológicas Manifestações clínicas Envelhecimento Intrínseco Passagem do tempo Encurtamento de telómeros Diminui a espessura da epiderme Rugas finas Genética Stress oxidativo Achatamento da junção dermoepidermal Deficiência da função da barreira da pele Diminuição da função do sistema de reparo de danos a ADN Aumenta a perda de água transepidermal Aumenta a vulnerabilidade Diminuição do tempo de renovação da epiderme Atrofia do colagénio reticular da derme Pele seca Aparecimento de células senescentes Atrofia do sistema de fibras elásticas Pele embotada Redução do número de melanócitos e células de Langerhans Atrofia dérmica Pele enrugada Envelhecimento extrínseco Exposição a raios UV Inflamação Perda progressiva dos glicosaminoglicanos Redução do colagénio fibrilar Rugas profundas Fumaça de cigarro Danos ao ADN Perda do colagénio VII da junção dermoepidermal Distúrbios de pigmentação Hábitos alimentares Stress oxidativo Elastose solar (acumulação das fibras elásticas parcialmente degradadas) Palidez Poluição ambiental Aparecimento de células senescentes Remodelação da Matriz extracelular Elasticidade reduzida Aumento da expressão e da atividade da matriz metaloproteinase Níveis reduzidos de ácido Hialurónico Flacidez Diminuição da expressão dos pró colagénios Híper queratose Danos à função da barreira da pele Produção anormal de melanina Hipertrofia dérmica Aumento da vulnerabilidade 17 A radiação solar UV penetra na derme para atingir o tecido subcutâneo e afeta os componentes epidérmicos e dérmicos da pele, seus efeitos deletérios são cumulativos, irreversíveis e atualmente são uma grande preocupação para a saúde. Ela é capaz de produzir alterações bioquímicas e fisiológicas, incluindo alterações no colágeno e nas fibras elásticas, perda de tecido adiposo subcutâneo e alterações foto carcinogénicas (Cefali et al ., 2016). Os radicais peroxil, o oxigênio molecular singleto e os aniões superóxido são os principais ERO formados na pele humana exposta à irradiação UV, o que pode resultar na degradação de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. Essa degradação resulta em várias condições patológicas da pele, como eritema, envelhecimento prematuro e até carcinomas dermatológicos (Kashif et al ., 2017). Além disso, a oxidação proteica estimula a liberação de moléculas de sinais inflamatórios e a peroxirredoxina 2 (PRDX2) tem sido reconhecida como um sinal inflamatório. Muitos autores têm documentado a relação entre stress oxidativo e inflamação. As evidências indicaram que o stress oxidativo desempenha um papel patogênico nas doenças inflamatórias crônicas (Tarique Hussain et al ., 2016). A inflamação é um mecanismo de defesa natural contra patógenos e está associada a muitas doenças patogênicas, como infeções microbianas e virais, exposição a alérgenos, radiação e produtos químicos tóxicos, doenças autoimunes e crônicas, obesidade, consumo de álcool, uso de tabaco e dieta hipercalórica (Tarique Hussain et al ., 2016). Ela é geralmente mediada por diferentes estímulos exógenos e endógenos que podem ativar o sistema imunológico celular levando-o a produzir algumas citocinas próinflamatórias. A ciclooxigenase-2 (COX-2) na pele humana é o principal agente-chave na inflamação induzida por UV, formação de rugas, edema, hiperplasia epidérmica e carcinogénese (Kashif et al ., 2017). O lipopolissacarídeo (LPS) é uma endotoxina bacteriana exógena que pode ativar macrófagos, resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias, como fator necrótico tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), óxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2). A inflamação é regulada pela hemeoxigenase-1 (HO-1), que inibe a síntese de citocinas pró-inflamatórias. O fator-kB nuclear (NF-kB) tem sido considerado um fator importante envolvido na resposta imune e inflamatória. As citocinas pró-inflamatórias podem induzir também a expressão de moléculas de adesão vascular e dérmica, quimiotaxia de células inflamatórias e ativação de outros mediadores inflamatórios como leucotrienos e prostaglandinas (Kashif et al ., 2017). A inflamação crônica acompanhada de uma reação inflamatória fraca pode ocorrer repetidamente e sem sinais como inchaço, febre, erupção e dores. A inflamação crônica é a reação inflamatória constante propagada pela produção de citocinas e migração de células imunes, que é induzida por 18 ligantes endógenos, quando as células são expostas ao stress e danos e também pode ser uma reação inflamatória devida a xenobióticos extrínsecos. Ela resulta em síndromes metabólicas, tumores malignos, resposta autoimune, doenças alérgicas, cardiovasculares e neurodegenerativas (Inoue, 2017). Neste contexto, as pesquisas na área dermatológica e de cosméticos têm evoluído na busca por novos métodos de estudo e novas matérias primas, com o objetivo de desenvolver produtos capazes de melhorar e/ou reverter os sinais do envelhecimento, mantendo sempre a segurança de uso, estabilidade e eficácia, propiciando maior bem-estar aos consumidores. Cosméticos Atualmente, com o aumento da esperança média de vida, há pressão da opinião pública para a manutenção de uma aparência jovem até uma idade mais tardia, a preservação da aparência jovem representa socialmente, um requisito para a idealização da beleza. Entretanto, este fenómeno não é recente, uma vez que a história da humanidade demonstra uma constante busca da juventude e a superação do envelhecimento (Makrantonaki & Zouboulis, 2007). Há rastros de que os cuidados cosméticos são utilizados pelo homem desde o Paleolítico, quando utilizavam gorduras animais para proteger o corpo e argilas com sumos de plantas e sementes para adorná-lo. Milhares de anos depois nas culturas orientais antigas, extratos de ervas, sementes e águas aromatizadas, eram usados como ingredientes cosméticos. Sumérios e Babilónios preparavam unguentos e comercializavam essências aromáticas e perfumes, entretanto foram os egípcios que se especializaram na produção dos cosméticos e Cleópatra se converteu em um expoente da beleza que se exaltava com o uso de remédios e cosméticos naturais (Nardinic et al. , 2015). De acordo com as normas europeias, o “REGULAMENTO (CE) N.o 1223/2009 DO PARLAMENTO EUROPEU E DO CONSELHO,” define produto cosmético, como qualquer substância ou mistura destinada a ser posta em contato com as partes externas do corpo humano (epiderme, sistemas piloso e capilar, unhas, lábios e órgãos genitais externos) ou com os dentes e as mucosas bucais, tendo em vista, exclusiva ou principalmente, limpá-los, perfumá-los, modificar-lhes o aspeto, protegê-los, mantê-los em bom estado ou corrigir os odores corporais, com exceção das substâncias ou misturas que se destinem a ser ingeridas, inaladas, injetadas ou implantadas no corpo humano. A definição de cosméticos é muito similar em todo o mundo, apesar disto existem diferenças entre os países no que diz respeito às definições legais de medicamentos e cosméticos, requisitos de registro e restrições ao uso de ingredientes podem fazer alguns produtos, como os filtros solares, serem 19 regulamentados como cosméticos na Europa, enquanto são regulamentados como medicamentos nos Estados Unidos (Toklu et al ., 2019). Como demonstrado na Figura 7, uma ampla gama de produtos pode ser categorizada como cosméticos e cosmecêuticos. Eles podem ser classificados em produtos para cuidados com a pele, cuidados com os cabelos, agentes colorantes, fragrâncias e produtos para cuidados gerais. Figura 7 - Os principais tipos de produtos cosméticos e/ou cosmecêuticos disponíveis no mercado, divididos por categorias. Adaptado de Cavinato (2018). Os produtos para a pele são projetados para alterar a aparência ou a textura da pele. Os produtos capilares, por sua vez, têm a função de modificar a aparência, a estrutura ou a cor dos cabelos. Os corantes são produtos decorativos capazes de alterar temporariamente a cor da pele, do cabelo e das unhas. As fragrâncias são formulações perfumadas direcionadas para alterar os odores naturais do corpo. E os produtos de cuidados gerais são aqueles projetados para promover a limpeza e o cuidado de outras partes do corpo além da pele e do cabelo. Cada uma dessas categorias pode ser dividida em várias subcategorias, sendo que alguns produtos podem pertencer a mais de uma categoria ao mesmo tempo e, dessa forma, exercer mais de uma função (Cavinato, 2018). 20 O mercado de cosméticos está em crescimento e, apesar da crise econômica mundial dos últimos anos, mais de 5 bilhões de produtos cosméticos ainda são vendidos a cada ano, sendo os itens mais consumidos os cuidados com a pele (Barbulova et al ., 2015). Avanços científicos e tecnológicos significativos promoveram a convergência entre as indústrias farmacêutica, nutricional e cosmética, permitindo a criação de novas áreas de atividade e novas classes de produtos de cuidados pessoais, como cosmecêuticos, nutracêuticos e nutricosméticos. O termo cosmecêutico deriva da interseção entre produtos farmacêuticos e cosméticos. Cosmecêuticos ou dermocosméticos são definidos como produtos de aplicação tópica que não são apenas cosméticos, pois têm a capacidade de alterar a estrutura e fisiologia da pele e cabelos, mas não são considerados medicamentos, pois não são submetidos aos mesmos testes rigorosos (Husein el Hadmed & Castillo, 2016). Exemplos de cosmecêuticos populares incluem hidratantes, retinoides, antioxidantes e despigmentantes (Brandt et al ., 2011). Devido às crescentes demandas de marketing, muito investimento foi feito em pesquisas para explorar os efeitos potenciais dos ingredientes ativos na pele. Atualmente a indústria de cosméticos e cosmecêuticos comprovam suas alegações de eficácia com dados científicos e ensaios clínicos. A vasta gama de técnicas disponíveis para investigar as respostas da pele a múltiplos estímulos, com base em um entendimento robusto da fisiologia da pele e suas respostas variadas aos insultos ambientais, trouxe uma nova era no desenvolvimento cosmético e dermocosmético (Cavinato, 2018). A importância da pesquisa cosmética não está relacionada apenas à melhoria da aparência geral da pele, mas também visa oferecer uma melhor qualidade de vida, atuando através da prevenção e tratamento de desordens da pele relacionadas ao processo de envelhecimento, com benefícios não apenas para a própria pele, mas para o organismo como um todo (Rodan et al ., 2016). Produção de cosméticos com plantas O reino vegetal oferece infinitos benefícios ao homem, que soube utilizá-los de inumeráveis formas e para múltiplos propósitos. Se utilizadas com sabedoria, as plantas, através de suas cores, aromas e princípios ativos, são capazes de restituir a força, aliviar condições físicas adversas e trazer bem-estar e beleza (Nardinic et al. , 2015). Uma variedade de constituintes das plantas tem efeitos positivos na pele. Os polifenóis são uma grande família destes constituintes que ocorrem naturalmente nas plantas e podem ser encontrados principalmente em frutas, vegetais, nozes, folhas, cascas e sementes. Eles são muito conhecidos por sua forte atividade antioxidante e por possuírem substancial efeito de fotoproteção da pele (André et al ., 21 2017). Eles funcionam como antioxidantes exógenos, devido a um grupo hidroxilo (-OH) ligado a um anel aromático que atua como um doador de hidrogênio ou eletrão para radicais livres ou outras espécies reativas (Campa & Baron, 2018). Os flavonóides são utilizados em dermatologia e cosméticos há muito tempo. A principal razão para a crescente popularidade dessas substâncias são suas atividades bioquímicas benéficas e a sua capacidade de penetrar na pele. Os dados disponíveis indicam que os compostos desse grupo penetram pelo do estrato córneo e podem atingir as camadas viáveis da epiderme e derme (Piana et al ., 2013) Novos compostos de materiais vegetais, com capacidade de absorver ou bloquear a radiação UV, foram extensivamente pesquisados para o desenvolvimento de produtos para a proteção da pele contra a radiação solar (Cefali et al ., 2016). Há também um número crescente de estudos avaliando os efeitos antioxidantes de extratos de plantas incorporados em cremes e loções para uso tópico. Alguns compostos fenólicos, como epigalocatequina-3-galato (EGCG) do chá verde, demonstraram proteger contra danos no ADN induzidos por UV e supressão imunológica, permitindo que esse componente seja incorporado em formulações convencionais de filtro solar para aumentar a foto proteção fornecida pelos filtros UV (Matsui et al ., 2009). Globalmente, os cosméticos derivados de plantas têm mercados amplos com tendência de crescimento a cada ano. Analisando a razão pela qual estes produtos vêm se destacando no mercado internacional, pode-se constatar que em parte decorre das várias funções terapêuticas que eles exercem sobre a pele, que recentemente tem recebido grande atenção por parte das pessoas, além de normalmente terem características de baixa toxicidade se comparados aos cosméticos tradicionais (Yujuan Li et al ., 2018). Produtos botânicos são definidos como produtos derivados de plantas. Em várias pesquisas estes produtos têm demonstrado o potencial de neutralizar alguns dos sinais de envelhecimento da pele, apresentando funções de fotoproteção, diminuição da perda transepidérmica de água (TEWL - Transepidermal Water Loss) , aumento da elasticidade da pele, aumento da formação de colagénio, diminuição da pigmentação facial e efeitos antioxidantes na pele (Campa & Baron, 2018). Alguns destes produtos, com suas aplicações e tipos de estudos realizados serão demonstrados na Tabela 6. 22 Tabela 6 - Exemplos de produtos botânicos com suas funções antienvelhecimento e os tipos de estudos e resultados observados. Adaptado de (Campa & Baron, 2018) Produto botânico Tipos de estudos Potenciais efeitos antienvelhecimento Efeitos antienvelhecimento observados em humanos Óleo de Argão ( Argania sponosa ) Estudos em animais e em humanos. Diminuição da hiperpigmentação devido a inibição da tirosinase, diminuição da perda de água transepidérmica, melhora da elasticidade e efeito antioxidante. Diminuição da perda de água transepidérmica, melhora da elasticidade. Óleo de coco ( Cocos nucífera ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Emoliente, umectante, diminuição da perda de água transepidérmica, antiinflamatório, diminuição do tempo de cicatrização, aumento do colagénio. Diminuição da perda de água transepidérmica. Açafrão ( Crocus sativus ) Estudos in vitro. Antioxidante, protege o esqualeno contra a peroxidação induzida por UV, evita a liberação de mediadores inflamatórios, anti-inflamatório. N/A Matricária ( Tanacetum parthenium ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Anti-inflamatório (inibe NF-κB), melhora a atividade endógena de reparo do ADN, diminui a liberação de citocinas pró-inflamatórias, antioxidantes. Antioxidante, diminui o eritema causado por radiação UV. Chá verde ( Cammelia sinensis ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Antioxidante, fotoprotetor, imunomodulador, anti-angiogênico, anti-inflamatório. Diminuição do VEGF e HIF-1α, prevenção parcial de danos oxidativos causados por UV, redução da depleção de células de Langerhans. Margarida ( Calendula officinalis ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Antioxidante Melhora a tensão da pele. Romã ( Punica granatum ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Anti-inflamatório, protege o fibroblasto da morte celular induzida por UV, aumento do reparo do ADN. Diminuição do eritema facial, diminuição da pigmentação facial devido à inibição da tirosinase. Soja ( Glycine maxi ) Estudos in vitro , em animais e em humanos. Antioxidante, aumento da proliferação de fibroblastos e aumento da síntese de colágeno I e III, diminuição da MMP1, aumento do colágeno e elastina. Aumento do colágeno facial tipo I e III, diminuição do eritema após a exposição a radiação UVB, melhora da pigmentação facial, melhora da textura da pele, redução de linhas finas, melhora do tom de pele. Para que uma planta possa ser incorporada a um produto tópico, como os cosméticos ou cosmecêuticos, elas passam por um processo altamente complexo, com várias etapas de processamento químico, que influenciam muito o resultado final do extrato botânico a ser adicionado à fórmula. Uma única planta tem centenas de fitoquímicos e compostos ativos, sendo que a parte da planta escolhida para se obter o extrato é, portanto, crucial e pode incluir frutos, folhas, raízes, cascas, flores e caule. As diferentes partes da planta possuem constituintes químicos variados, além disso, condições sazonais e 29 MÉTODOS Recolha do material vegetal O material vegetal para fazer os extratos foi colhido em Portugal, numa quinta na cidade de Santo Tirso, distrito do Porto. As folhas verdes foram colhidas nos meses de fevereiro, abril e julho de 2017 e as vermelhas no mês de outubro de 2017. Estes períodos foram escolhidos no intuito de comparar as principais diferenças nos compostos ativos e a ação dos extratos nos diferentes ensaios celulares e bioquímicos. Para coleta, foram considerados os aspetos gerais das folhas, como: o estado de conservação, cor e aparência, sendo colhidas somente folhas sem danos visíveis ou manchas. Os frutos que deram origem ao subproduto da fermentação alcoólica foram colhidos durante o mês de outubro de 2017, na mesma quinta em Santo Tirso. O material para o extrato de resíduo alcoólico foi fornecido pela investigadora Bárbara Ferreira e é resultante da biomassa de uma fermentação alcoólica de dióspiro ( Diospyros kaki ) usada na produção de vinagre em novembro de 2017. Preparação dos extratos Para a preparação dos extratos de folhas vermelhas e de folhas verdes, as folhas selecionadas foram lavadas e secas inicialmente à temperatura ambiente e posteriormente colocadas numa estufa a uma temperatura constante de 40ºC por um período de uma semana. Após o processo de secagem, as folhas foram moídas num copo triturador e transformadas em pó fino e homogêneo; 100g deste pó foi pesado e colocado em um litro de solução de metanol e água destilada na proporção de 80:20 pelo período de sete dias à temperatura ambiente e em local escuro. Após esse tempo, a solução resultante foi filtrada com auxílio de um filtro de papel, foi centrifugada durante 5 minutos a 5000 RPM. O sobrenadante foi recolhido para um balão de vidro e o metanol foi evaporado no Rotavapor, sob pressão controlada e à temperatura de 35ºC. O concentrado foi congelado a -80ºC e posteriormente liofilizado. O extrato seco obtido foi pesado e armazenado à temperatura ambiente e em local escuro para posterior utilização. Para o extrato de resíduo alcoólico, biomassa resultante da fermentação alcoólica do dióspiro foi recolhido e filtrado com o auxílio de um tecido de organza, para que se retirasse o excesso de líquido ainda existente. Após liofilização do material sólido este foi moído num copo triturador e transformado em pó fino e homogêneo, 100g do pó foram adicionados num litro de solução de metanol e água destilada na proporção de 60:40 durante sete dias à temperatura ambiente e em local escuro. Tal como 30 anteriormente a solução obtida foi filtrada e centrifugada por 5 minutos a 5000 RPM, o sobrenadante foi recolhido num balão de vidro e o metanol foi evaporado no Rotavapor, sob pressão controlada à temperatura de 35ºC. O concentrado foi congelado a -80ºC e posteriormente liofilizado. O extrato seco obtido foi pesado e armazenado à temperatura ambiente e em local escuro para posterior utilização. Tanto os extratos de folhas como o de resíduo alcoólico foram ressuspendidos em DMSO na concentração de 100mg/mL, armazenados em frascos âmbar que foram identificados e conservados em frigorífico à temperatura de 4ºC durante todo o período da realização dos ensaios. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) A cromatografia líquida de alta performance (HPLC) é uma técnica versátil, robusta e amplamente utilizada para o separação de compostos naturais e é usada na química analítica e fitoquímica para identificar e quantificar os componentes individuais de uma mistura. Ela consiste na separação de diferentes constituintes de uma mistura, conforme as suas diferentes afinidades e polaridade, usando pressões altas para mover solventes através de uma coluna (Boligon & Athayde, 2014; Piana et al ., 2013). Vários autores descrevem o uso de HPLC para caracterização e quantificação de metabolitos secundários em extratos vegetais, principalmente compostos de fenol, esteróides, flavonóides, alcalóides (Boligon & Athayde, 2014). Esta técnica utiliza uma coluna que contém uma fase estacionária, uma move a fase móvel e um detetor que mostra os tempos de retenção das moléculas. O tempo de retenção é caracterizado pelo tempo em que determinado composto sai da coluna e varia de acordo com as interações entre a fase estacionária, as moléculas analisadas e o solvente usado (Malviya et al ., 2010). A cromatografia de fase reversa é a técnica de separação mais usada em HPLC devido à sua ampla gama de aplicações. Estima-se que mais de 65% de todas as separações por HPLC são realizadas no modo de fase reversa. As razões para isso incluem a simplicidade e versatilidade deste método, pois ele é capaz de lidar com compostos de polaridade e massa molecular diversas para identificar metabolitos secundários das plantas (Boligon & Athayde, 2014). Para o processamento das amostras de folhas vermelhas, folhas verdes e resíduo alcoólico de dióspiro, foi utilizado o aparelho de HPLC-DAD (HITACHI, LaChrom Elite, Japão) controlado pelo software de computador EZChrome Elite. Os procedimentos foram realizados conforme método descrito em Dias et al. (1999). 31 As amostras para analise qualitativa de HPLC foram preparadas a partir dos extratos descritos anteriormente, para uma concentração final de 7,5 mg/mL em solução de metanol-água na proporção (80:20). Para a identificação dos compostos foi injetado 20 µL de cada extrato. A separação dos compostos foi realizada em uma coluna de fase reversa (LiChrospher 100. RP-18e. 5 µm) à temperatura ambiente. A deteção foi realizada numa faixa entre 250-600 nm e os cromatogramas foram registados a 260, 280 e 350 nm. O sistema de solvente utilizado foi um gradiente de metanol, tendo-se usado o eluente A (ácido fórmico 0,1% em metanol) e o eluente B (ácido fórmico 0,1% em água ultrapura). A eluição foi efetuada usando o gradiente descrito na Tabela 9. Tabela 9 – Descrição do gradiente de eluição da análise por HPLC-DAD. Tempo (minutos) Eluente A (%) Eluente B (%) 0 5 95 5 5 95 30 50 50 40 90 10 45 90 10 50 5 95 60 5 95 Ensaios bioquímicos para avaliação da atividade antioxidante in vitro A atividade antioxidante das plantas tem recebido grande atenção por parte dos investigadores, uma vez que o elevado dano oxidativo foi identificado como responsável pelo desenvolvimento e progressão de diversas doenças. A atividade antioxidante não deve ser concluída com base em um único modelo de ensaio antioxidante, e na prática, vários procedimentos de ensaios in vitro são realizados para avaliar as atividades antioxidantes com as amostras de interesse. Atualmente, aproximadamente 19 métodos in vitro são usados para fins de avaliação de antioxidantes (Alam et al ., 2013). Nestes ensaios, as plantas são geralmente avaliadas pela sua função como agentes redutores, doadores de hidrogénio, inibidores da produção de oxigénio singleto ou quelantes de metais (Pisoschi & Negulescu, 2012). Neste trabalho foram escolhidos os métodos DPPH, ICA, óxido nítrico e superóxido como pormenorizado em seguida, para avaliar os potenciais antioxidantes, sequestradores de radicais livres e como quelantes dos extratos de folhas e do resíduo alcoólico do dióspiro. 32 Atividade de sequestro do Superóxido Os aniões superóxido desempenham papel importante na formação de espécies reativas de oxigénio, como peróxido de hidrogênio, radical hidroxilo e oxigénio singleto, que induzem danos oxidativos em lipídios, proteínas e ADN (Sun et al ., 2011). Eles são formados in vivo , através de três mecanismos principais: cadeia respiratória da mitocôndria, xantina oxidase e pela NADPH oxidase nos fagócitos (Apel & Hirt, 2004). Um sistema não enzimático pode ser usado para avaliar o potencial de sequestrar o radical superóxido: o metossulfato de fenazina (PMS) é reduzido pela nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e reage com o oxigênio para produzir radicais superóxido. Esses radicais reagem com o cloreto de nitroazul-tetrazólio (NBT), reduzindo-o a formazano, um composto azul com absorção máxima a 560nm. Na presença de substâncias capazes de captar radicais superóxido, a taxa de redução de NBT diminui e, consequentemente, há uma diminuição na intensidade da cor que pode variar de amarelo claro a roxo escuro (Hanson et al ., 2006). Neste ensaio foi usado a metodologia de (Valentão et al ., 2001) com algumas modificações. Para avaliar a atividade de sequestro do anião superóxido, os extratos foram diluídos em tampão fosfato nas seguintes concentrações: folhas vermelhas (6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL), folhas verdes (12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) e resíduo alcoólico (62,5; 125; 250; 500 e 1000 µg/mL). Numa microplaca de 96 poços, foi adicionado a cada poço, 50 µL de extrato dissolvido em tampão, 50 µL de uma solução de NADH 1,97 mM, 150 µL de uma solução de NBT 81,5 µM e 50 µL de uma solução de PMS 16 µM. O ácido ascórbico, um antioxidante padrão, foi usado como referência química para comparar com o poder antioxidante dos extratos. Os ensaios foram realizados à temperatura ambiente e a atividade anti-radicalar foi determinada espectrofotometricamente no leitor de microplacas a 560 nm após 5-7 minutos de reação, em que o tempo 0 corresponde à adição da solução de PMS. Todas as soluções foram preparadas diariamente e mantidas no escuro a 4ºC. Para calcular a percentagem de atividade de sequestro do anião superóxido foi usada a seguinte equação: % 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑑𝑢çã𝑜 𝑁𝐵𝑇 = 𝐴𝑐−(𝐴𝑎− 𝐴𝑏) 𝐴𝑐 ×100 33 Onde: 𝐴𝑐 – absorvância do controlo 𝐴𝑎 – absorvância da amostra 𝐴𝑏 – absorvância do branco Os resultados estão expressos em EC50, ou seja, a concentração necessária para eliminação de 50% do radical superóxido e foram obtidos através da percentagem de inibição da redução de NBT em relação ao controlo. Portanto, na presença de extratos capazes de eliminar o anião superóxido, a taxa de redução do NBT diminui e, consequentemente, diminui a absorvância. Foram realizados no mínimo três ensaios independentes e todos os parâmetros determinados graficamente usando o software GraphPad Prism 8.0 . Atividade quelante de Ferro (ICA) Os metais de transição possuem um papel importante na geração de ERO nos organismos vivos. O ferro existe em dois estados de oxidação distintos: iões ferrosos (Fe2+) e férricos (Fe3+), sendo os últimos a forma biologicamente inativa do ferro. Entretanto, o Fe3+ pode ser reduzido à forma ativa Fe2+, com produção de radicais hidroxilo, podendo estes causar peroxidação lipídica, modificação de proteínas e danos no ADN. A presença de agentes quelantes pode inativar os iões metálicos e potencialmente inibir os processos dependentes de metais (Andjelković et al ., 2006). O ensaio da atividade quelante de ferro (ICA) que avalia a capacidade quelantes de Fe+2 dos extratos é quantificado espectrofotometricamente utilizando um complexo que resulta da conjugação de ferrozina (FZ) com ferro (Fe+2) (Russo et al ., 2005). Neste trabalho foi utilizado um ensaio com base no método colorimétrico da ferrozina proposto por Carter (1971), que na presença do ião ferro, forma um complexo de cor magenta, cuja absorvância pode ser medida a 562 nm. Neste método, o potencial antioxidante é observado pela diminuição da absorvância visível pela descoloração da reação, que determina a quantidade de iões ferro remanescentes não quelados na mistura reacional. Dessa forma, quanto menor for a absorvância e a intensidade da coloração, maior será a capacidade de quelação dos iões ferro, e consequentemente, maior será o potencial antioxidante (Carter, 1971; Min et al ., 2011) Numa microplaca de 96 poços foram adicionados respetivamente, 50 µL de extrato (nas concentrações de 62,5; 125; 250; 500 e 1000 µg/mL, para folhas verdes e 156,25; 312,5; 625; 1250 e 2500 µg/mL para folhas vermelhas e resíduo alcoólico), 50 µL de sulfato de ferro (0,12 mM) preparado 34 com água ultrapura e 50 µL de ferrozina (0,6 mM) preparada com água ultrapura. Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente e no escuro, a placa foi levada ao leitor de placas SpectraMaxPlus onde foi feita a leitura da absorvância a 570 nm. Para os brancos foi utilizada água ultrapura em substituição à Ferrozina. O EDTA foi utilizado como referência para fazer uma curva de calibração e como referência química para comparação com o poder de quelação de ferro dos extratos. As diferentes soluções foram preparadas nos dias dos ensaios e mantidas protegidas da luz. A atividade quelante de ferro expressa em percentagem de ferro quelado é calculada conforme a fórmula apresentada pela seguinte equação: % 𝐼𝐶𝐴 = Ac−(Aa− Ab) Ac ×100 Onde: Ac– absorvância da ferrozina com ferro, sem extrato; Aa – absorvância da ferrozina com ferro e extrato; Ab – absorvância do extrato sem ferrozina. Os resultados expressos em EC50 foram obtidos a partir da percentagem de ICA relativamente à concentração de extrato e representam a concentração necessária para inibir a formação de 50% do complexo Fe-Ferrozina. Foram realizados no mínimo três ensaios independentes e todos os parâmetros determinados graficamente usando o software GraphPad Prism 8.0 . Ensaio de redução do DPPH Este ensaio é comumente aplicado na avaliação da atividade antioxidante de alimentos e plantas devido à sua simplicidade, eficiência e custo. O DPPH• é um radical livre que pode aceitar eletrões ou átomos de hidrogénio de antioxidantes. Conforme pode ser observado na Figura 9, após reagir com uma substância antioxidante, o DPPH é reduzido a hidrazina e sua cor púrpura característica muda para amarelo. Essa alteração colorimétrica permite avaliar a atividade antioxidante de diferentes substâncias através da leitura espectrofotométrica (Carmona-Jiménez et al ., 2014), sendo a tonalidade da solução proporcional à sua capacidade antioxidante (Miguel, 2007). 35 Figura 9 - Diagrama esquemático do ensaio DPPH. A doação de hidrogênio do antioxidante (AOX) para a molécula DPPH, origina a sua forma reduzida DPPH:H que causa a uma diminuição na cor da amostra e consequentemente na sua absorvância. Adaptado de Kusumawati & Indrayanto, (2013). Para avaliar a atividade anti-radicalar, foram preparadas várias diluições dos extratos em etanol 100%, de forma a obter as seguintes concentrações finais: folhas vermelhas (3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL), folhas verdes (6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL) e resíduo alcoólico (50; 100; 250; 500 e 1000 µg/mL). Na microplaca de 96 poços foram adicionados 10 µL de cada concentração de extrato e 140 µL de solução de DPPH (400 µM), exceto para os brancos em que foram adicionados 10 µL de cada concentração de extrato e 140 µL de etanol 100%. Para controlo positivo foi usado Trolox, um antioxidante de referência, em concentrações de (6.25; 12,5; 25; 50 e 100 µM) preparadas a partir de uma solução stock de 2 mM. O controlo negativo foi obtido pela adição de 10 µL de etanol e 140 µL da solução de DPPH. As amostras foram agitadas e mantidas à temperatura ambiente e no escuro por 60 minutos. Após esse tempo, foi medida a absorvância a 517 nm no leitor de microplacas SpectraMaxPlus. A solução de DPPH foi preparada no dia do ensaio e armazenada no escuro a 4ºC. A atividade de redução do DPPH é expressa em percentagem e é calculada de acordo com seguinte equação: % 𝑟𝑒𝑑𝑢çã𝑜 𝐷𝑃𝑃𝐻 = 𝐴𝑐−(𝐴𝑎− 𝐴𝑏) 𝐴𝑐 ×100 Onde: 𝐴𝑐 – absorvância do controlo 𝐴𝑎 – absorvância da amostra 𝐴𝑏 – absorvância do branco Os resultados estão expressos em EC50 obtidos em relação ao controlo e variam de acordo com a concentração de antioxidante necessária para causar uma diminuição de 50% na absorvância do DPPH. 36 Foram realizados no mínimo três ensaios independentes e todos os parâmetros determinados graficamente usando o software GraphPad Prism 8.0 . Inibição da produção de Óxido Nítrico O óxido nítrico, por conter um eletrão desemparelhado, é classificado como um radical livre exibindo uma reatividade importante com certos tipos de proteínas e outros radicais livres. A inibição in vitro do radical óxido nítrico é uma medida da atividade antioxidante. Sabe-se que o composto nitroprussiato de sódio (SNP) se decompõe em solução aquosa a pH fisiológico produzindo óxido nítrico. Em condições aeróbias, o NO• reage com o oxigénio para produzir produtos estáveis (nitrato e nitrito). Os iões nitrito diazotizados com N-(1naftil) etilenodiamida (NED) produzem um cromóforo rosa, cujas quantidades podem ser determinadas usando o reagente de Griess (Alam et al ., 2013; Boligon et al ., 2014). O método baseia-se no fato de que, na presença de antioxidantes, há uma inibição da produção do radical óxido nítrico em solução salina que pode ser determinado com o reagente de Griess a 562 nm. Uma metodologia modificada a partir de (Colle et al ., 2012) foi utilizada para quantificação do NO. Para avaliar a capacidade de captação de óxido nítrico dos extratos de dióspiro, foram preparadas diluições dos extratos em água ultrapura nas seguintes concentrações: 23,4375; 46,875; 93,75; 187,5 e 375 µg/mL para os extratos das folhas verdes e de folhas vermelhas e de 25; 50; 100; 250; 500 e 1000 µg/mL para o extrato de resíduo alcoólico. Numa microplaca de 96 poços foi adicionado 50 µL de SNP com 50 µL de cada concentração de extrato para as amostras e brancos das amostras e 50 µL de água ultrapura e 50 µL de SNP para o controlo e branco do controlo. A placa ficou por 140 minutos à luz e a temperatura ambiente. Após o período de incubação, foi adicionado 50 µL de reagente de Griess (Sulfanilamida a 1% e NED a 0,1% numa proporção de 1:1) às amostras e ao controlo. Aos brancos, do controlo e da amostra, foram adicionados 50 µL de tampão de ácido fosfórico, quando foi incubado por mais 10 minutos no escuro e à temperatura ambiente. Após este período, a absorvância foi lida no leitor de microplacas a 570 nm. O ácido ascórbico, um antioxidante padrão, foi usado como referência química para comparar com o poder antioxidante dos extratos. Os valores são expressos em percentagem de inibição da produção de nitrito relativamente ao controlo. Portanto, se os extratos tiverem uma boa capacidade de eliminar o NO·, a produção de nitrito diminui, assim como a absorvância. 37 Para calcular a percentagem de inibição da produção de óxido nítrico, foi utilizada a seguinte equação: % inibição da produção de NO =(Ac− 𝐴𝑏𝑐) − (Aa− Aba) (Ac− 𝐴𝑏𝑐)×100 Onde: Ac – absorvância do controlo (SNP com reagente de Griess, sem extrato); Aa – absorvância da amostra (SNP com reagente de Griess e extrato); 𝐴𝑏𝑐 – absorvância do branco do controlo (SNP, sem extrato e sem reagente de Griess); Aba – absorvância do branco da amostra (extrato com SNP, sem reagente de Griess). Os resultados estão expressos em EC50 e foram obtidos a partir da percentagem de inibição da produção de óxido nítrico em relação à concentração do extrato, e representam a concentração de extrato necessária para inibir a produção de 50% de óxido nítrico. Foram realizados no mínimo três ensaios independentes e todos os parâmetros determinados graficamente usando o software GraphPad Prism 8.0. Ensaios in vitro usando fibroblastos L929 e queratinócitos HaCaT como linhas celulares O cultivo de células se iniciou no princípio do século XX com Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912. Esta técnica foi desenvolvida como um método para estudar o comportamento de células animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado. Ainda hoje é uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratórios do mundo inteiro (Emanuele, 2014). Existem muitas vantagens no uso de cultura de células como modelo experimental. Quando comparada ao uso de animais, a economia, o uso de um ambiente controlado e a homogeneidade da amostra são as principais vantagens dessa técnica. Atualmente a cultura de células, apesar de ser um modelo in vitro , que apresenta algumas diferenças em relação ao modelo in vivo , é a principal alternativa para a substituição dos animais nos experimentos de pesquisas (Emanuele, 2014). Neste trabalho foram utilizadas duas linhas celulares, os queratinócitos humanos (linha celular HaCaT, ATTC) e os fibroblastos de ratinho (linha celular L929, ATTC) como principais meios para avaliação da citotoxicidade e citoproteção dos extratos de dióspiro. Ambas linhas celulares foram 38 fornecidas pela professora Ana Isabel Freitas T. Oliveira, da Escola Superior de Saúde do Instituto Politécnico do Porto. Manutenção da Cultura Celular Inicialmente, uma ampola de células congeladas de cada linhagem celular, armazenado em nitrogênio líquido, foi descongelado e o conteúdo, foi transferido para um tubo falcon de 15 mL, onde foi cuidadosamente ressuspenso em 6 mL de meio completo. A suspensão de células foi então centrifugada a 1000 rpm durante 5 minutos e o sedimento ressuspenso em 6 mL de meio completo fresco, que foi transferido para uma frasco T25 de cultura estéril. Para o procedimento de subcultura e preparação de ensaios, as soluções de meio de cultura, do PBS (Tampão Fosfato Salino) e da tripsina foram aquecidas em banho-maria, a 37ºC. Todos os procedimentos foram realizados em camara de fluxo laminar. Para a desagregação das células do substrato, foi efetuada a sua lavagem com PBS e foi adicionada tripsina a 0,25%. Após confirmação ao microscópio que as células se encontravam destacadas foi colocado meio de cultura nos frascos, de modo a inibir a tripsina e o conteúdo foi suspenso de modo a ficar homogéneo. As células de fibroblastos L929 foram cultivadas e mantidas em meio DMEM ( Dulbecco’s modified Eagle’s medium ) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS – Fetal bovine serum ) e 1% de antibióticos. Foram subcultivadas 2 vezes por semana quando atingiam pelo menos 80% de confluência. As células de queratinócitos HaCaT, foram cultivadas em meio RPMI ( Roswell Park Memorial Institute ) suplementado com 10% de FBS 2% de Glutamina e 1% de antibióticos. Foram subcultivadas 1 vez por semana quando atingiam pelo menos 80% de confluência. As culturas foram mantidas a 37ºC numa incubadora de CO2 humidificada contendo 5% de CO2. Avaliação de viabilidade celular através do ensaio colorimétrico com MTT Este ensaio parte do princípio de que as células metabolicamente ativas, têm a capacidade de reduzir o sal de tetrazólio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2, 5-difeniltetrazólio), através da ação das enzimas desidrogenase mitocondriais. O sal de MTT tem coloração amarela, em solução aquosa. Após redução, precipita, convertendo-se em formazano de cor púrpura, conforme ilustração da Figura 10. O formazano intracelular resultante pode ser solubilizado e quantificado espectrofotometricamente sendo proporcional à quantidade de células viáveis (Mosmann, 1983). Neste trabalho foi utilizada metodologia de Ali-Boucetta et al . (2011) com algumas modificações. 45 Para avaliar se os cremes produzidos não estavam contaminados com microrganismos acima do permitido, eles foram submetidos a um teste microbiológico para se detetar possíveis contaminações. Este teste baseia-se na quantificação de microrganismos mesófilos viáveis, com capacidade de desenvolvimento em meios de cultura e temperaturas de incubação que permitem o crescimento da grande maioria destes microrganismos. Em um tubo falcon de 15 mL foi colocado 1 g de creme e acrescentado 9 mL de meio LB líquido (1% de Triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl), o falcon foi agitado no vórtex até a mistura estar homogénea. Após isto, foi pipetado 1 mL do conteúdo do falcon para uma placa de Petri contendo meio LB sólido (1% de Triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl e 2% de agar), distribuindo uniformemente com auxílio de um espalhador; a placa foi selada com Parafilm e foi incubada numa estufa a 35°C durante 48 horas. As placas foram analisadas quanto a formação de colónias de microrganismos quando completaram 24 horas de incubação e após o término das 48 horas. Testes de estabilidade por centrifugação Para avaliar a estabilidade, amostras dos cremes foram submetidos a um teste de centrifugação para observar a ocorrência de separação de fases, que indicam instabilidade ou incompatibilidade dos componentes da formulação. Em um tubo falcon de 15 mL foram pesados, em uma balança analítica AG245, 6 g de cada formulação a ser testada. Os falcons foram levados à centrifuga Sigma 2-16k e centrifugados a 5000 rpm, por 30 minutos em temperatura ambiente, por 2 ciclos consecutivos com intervalo de 10 minutos entre os ciclos. Após término do segundo ciclo, os falcons foram levados a banho maria com a temperatura de 45ºC por 30 minutos e novamente levados à centrifugação por 30 minutos a 5000 rpm. Ao fim as amostras foram analisadas macroscopicamente em relação ao aparecimento de sobrenadante ou separação de fases. Avaliação in vivo dos efeitos imediatos da aplicação da formulação cosmética Com o objetivo de avaliar a segurança e os efeitos imediatos dos cremes, foram usados equipamentos de medição biometrológica da pele para avaliar parâmetros como hidratação, perda transepidérmica de água (TEWL) e formação de eritema na pele de voluntários. Para avaliação destes parâmetros, uma série de técnicas não invasivas foram desenvolvidas e validadas permitindo uma avaliação dos efeitos dos cosméticos mediante dados objetivos e mensuráveis. Um exemplo de 46 equipamento que se utiliza destas técnicas é o Cutometer® dual MPA 580 do fabricante Courage & Khazaka, que apresenta sondas para avaliação de vários parâmetros que são registados no software fornecido com o aparelho. As sondas Corneometer® CM 825 (hidratação), Tewameter® TM 300 (perda de água transepidérmica) e Mexameter® MX 18 (eritema), são amplamente utilizadas e foram escolhidas para a avaliação in vivo dos efeitos imediatos das formulações deste trabalho. Figura 12 - Equipamento Cutometer® dual MPA 580 do fabricante Courage & Khazaka, com as sondas Corneometer®, Tewameter® e Mexameter® utilizadas neste trabalho. Para a realização desta avaliação, 7 voluntários (6 mulheres e 1 homem) com idade entre 20 e 35 anos foram esclarecidos sobre o propósito, procedimentos, riscos e benefícios do teste. Eles receberam indicações para que não fossem aplicados outros produtos tópicos na região dos antebraços nas 24 horas antes do início e durante o período de teste, bem como para evitarem a exposição solar e o uso de roupas apertadas na área de teste. Para os testes foram feitas 2 marcações na parte interna inferior de cada braço, perfazendo um total de 4 marcações por voluntário, conforme ilustrado na Figura 13, sendo uma marcação para formulação controle (fc), uma para formulação com folhas verdes (fvd), uma para formulação com folhas vermelhas (fvm) e uma para controle negativo (cn), onde é analisada a pele sem aplicação de nenhum creme. Após as marcações no braço dos voluntários, foi realizada a primeira medição (t0) para avaliação de cada local demarcado sem a aplicação dos produtos. As leituras foram feitas com as sondas Corneometer® CM 825, Tewameter® TM 300 e Mexameter® MX 18, respetivamente. Após a primeira medição, os cremes foram espalhados em suas respetivas áreas, com movimentos circulares e o tempo foi registado. A segunda medição (t6) foi realizada após 6 horas da primeira medição. Todas as medições foram feitas após 20 minutos de aclimatação em temperatura e humidade do ar controlados (20-22ºC e 45-55%, respetivamente). 47 Figura 13 - Esquema de marcação nos braços dos voluntários para avaliação dos efeitos das formulações. Foram realizadas 4 marcações: (cn) para controle negativo, sem aplicação de nenhum produto; (fc) para formulação controlo, sem os extratos de dióspiro; (fvm) para formulação de folhas vermelhas; e (fvd) para formulação de folhas verdes. Determinação da perda transepidérmica de água (TEWL) As medições da perda transepidérmica de água na pele são úteis para identificar danos na pele causados por certos produtos químicos, insultos físicos (como “fita adesiva”) ou condições patológicas como eczema, pois as taxas de TEWL aumentam na proporção do dano, mesmo antes que ele seja clinicamente visível. Portanto, pode ser considerada a ferramenta que avalia a função no que diz respeito à integridade da barreira física da epiderme (Fluhr, 2011). Para determinação da TEWL, foi utilizada a sonda Tewameter® TM 300 (Cutometer® dual MPA 580). Esta sonda usa o método de câmara aberta (Figura 14), sendo a TEWL calculado a partir da medição fornecida por dois sensores de humidade e temperatura precisamente orientados dentro da câmara (Fluhr, 2011). A medição é baseada no princípio de difusão descrito por Adolf Fick e os resultados são expressos em gramas por metro quadrado por hora (g/m²/h) (Rogiers, 2001). De acordo com o manual do equipamento os valores variam de 0-10 para pele muito saudável, 10-15 para pele saudável, 15-25 pele normal, 25-30 pele cansada e acima de 30 pele em estado crítico. A sonda do aparelho permaneceu por aproximadamente 1 minuto sobre a pele dos antebraços e o valor médio das 10 medidas obtidas após a estabilização dos valores foi empregado nos cálculos. 48 Figura 14 - Camara aberta da sonda Tewameter que mede a perda transepidérmica de água da pele através de sensores de temperatura e humidade. Adaptado de Rogiers (2001). Determinação da hidratação da pele Para a determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação da pele) foi utilizada a sonda Corneometer CM 825 (Cutometer® dual MPA 580), que através de elétrodo (Figura 15) mede o teor de hidratação do estrato córneo baseado no princípio da medida da capacitância elétrica, ou seja, na variação da constante dielétrica do meio em função da quantidade de água presente. A capacitância variável total da superfície da pele é convertida em unidades arbitrárias (UA) de hidratação da pele e varia de 0 a 130, onde <30 corresponde a muito secas, de 30-40 a seca e >40 a suficientemente hidratada. Estes valores são válidos para pele saudável e em ambientes em condições normais de temperatura e humidade (20ºC e 40-60% de humidade). Foram efetuadas 10 medições por área no antebraço dos voluntários, sendo calculada a média dos valores obtidos. Figura 15 - Representação esquemática da sonda de medição de capacitância do aparelho (Corneometer CM 825). Vistas frontal e lateral dos elétrodos interdigitais. Os elétrodos são cobertos com um material vitrificado e, consequentemente, não estão em contato direto com a superfície da pele. 49 Determinação de formação de eritema na epiderme Para a determinação da formação de eritema na pele, o que poderia indicar reações indesejáveis às formulações testadas, foi utilizada a sonda Mexameter® MX 18 do equipamento Cutometer® dual MPA 580, onde a medição se baseia na absorção/reflexão de luz (Figura 16). Ela emite luz LED em três comprimentos de onda, sendo que a luz refletida é detetada e usada para calcular a luz absorvida pelo eritema e melanina de acordo com fórmulas predefinidas. Os resultados correspondem aos picos de absorção espectral de melanina e eritema, respetivamente, fornecendo índice de melanina e índice de eritema em uma escala de 0 a 999 em unidades arbitrárias (UA). (Wright et al ., 2016) Figura 16 - Sonda Mexameter® MX 18 usada para avaliação de eritema e melanina na pele. A sonda contém 16 diodos emissores de luz dispostos circularmente que emitem luz em três comprimentos de onda: 568 nm (verde), 660 nm (vermelho) e 880 nm (infravermelho). A luz refletida pela pele é medida por um fotodetector, um medidor simples de refletância. Adaptado de Busch et al ., (2016). O Mexameter foi calibrado diariamente usando uma referência padrão. Um anel de proteção da luz foi usado na sonda durante as medições nos participantes para bloquear a luz externa. Foram realizadas 10 medições para cada marcação no braço dos voluntários, sendo calculada a média dos valores obtidos. Análise Estatística As diferenças estatísticas nos grupos experimentais foram avaliadas pelo método de teste não paramétrico ( ANOVA ) e o valor de p foi considerado significativo quando p ≤0,05. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando o programa GraphPad Prism 8 . 50 RESULTADOS E DISCUSSÃO Análise dos extratos de dióspiro por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) O HPLC é ideal para o processamento rápido de extratos vegetais a serem estudados em ensaios biológicos, caracterizando e quantificando seus metabolitos secundários, principalmente, compostos fenólicos, esteróides e alcalóides (Boligon & Athayde, 2014). Os extratos brutos de folhas verdes, folhas vermelhas e do resíduo alcoólico de Diospyros kaki foram submetidos à análise por HPLC-DAD e os cromatogramas obtidos são mostrados nas Figuras 17, 18 e 19 respetivamente. Para identificação dos principais compostos, os cromatogramas foram comparados com padrões de referência e valores da literatura. O cromatograma do extrato de folhas verdes revelou a presença de nove compostos principais, sendo eles: um derivado do ácido clorogénico, dois derivados glicosilados do kaempferol, um derivado glicosilado da quercetina, um derivado glicosilado da luteolina, dois flavonóis derivados do kaempferol, quercetina e kaempferol (Tabela 13). Figura 17 - Cromatogramas HPLC-DAD dos extrato de folhas verdes de Diospyros kaki . O extrato de folhas vermelhas revelou uma composição fitoquímica muito parecida com o de folhas verdes, com a presença de oito compostos principais, sendo eles: dois derivados glicosilados do kaempferol, um derivado glicosilado da quercetina, dois flavonóis derivados do kaempferol, quercetina e kaempferol (Tabela 13). 51 Figura 18 - Cromatograma HPLC-DAD (350 nm) do extrato de folhas vermelhas de Diospyros kaki . O extrato de resíduo alcoólico como esperado, demonstrou ter uma composição bem diferente dos extratos de folhas. Foram identificados dois ácidos fenólicos simples, quatro catequinas, flavonóide glicosilado, procianidina, quercetina e kaempferol (Tabela 13). Figura 19 - Cromatograma HPLC-DAD (260 nm) do extrato de resíduo alcoólico de Diospyros kaki . Estes resultados demonstraram que ambos extratos de folhas são constituídos, principalmente, por compostos fenólicos, nomeadamente flavonóis (kaempferol, quercetina e seus derivados) e flavonas (derivados de luteolina), o que vai de encontro aos compostos reconhecidos em extratos de folhas de dióspiro, em trabalhos anteriores (Kawakami et al., 2011; Xie et al., 2015; Xue et al., 2011; Zhi Zhou et al., 2019). Os flavonóis de folhas de dióspiro são relatados como tendo efeitos preventivos contra hipertensão, dermatite e lesão induzida por peróxido de hidrogênio (Kawakami et al ., 2011). Em sua pesquisa 52 Kawakami et al . (2011) isolaram 8 glicosídeos de flavonóis das folhas de dióspiro em desenvolvimento. Segundo eles os glicosídeos de flavonóis são uma família diversificada de compostos comumente encontrados em frutas e vegetais que apresentam atividades biológicas especiais, como atividades inibitórias contra a xantina oxidase, atividade antioxidante e inibição da expressão da enzima óxido nítrico sintase. Tabela 13 – Compostos obtidos através da análise de HPLC dos extratos de dióspiro. Amostra Pico nº Composto Folhas verdes 149 Derivado do ácido clorogénico 152 Derivado glicosilado do kaempferol 155 Derivado glicosilado da quercetina 156 Derivado glicosilado do kaempferol 158 Derivado glicosilado da luteolina 159 Flavonóis derivados do kaempferol 160 Flavonóis derivados do kaempferol 163 Quercetina 166 Kaempferol Folhas Vermelhas 149 Derivado glicosilado do kaempferol 152 Derivado glicosilado da quercetina 153 Derivado glicosilado do kaempferol 155 Derivado glicosilado da luteolina 156 Flavonóis derivados do kaempferol 157 Flavonóis derivados do kaempferol 160 Quercetina 162 Kaempferol Resíduo Alcoólico 2 Ácidos fenólicos simples 3 Ácidos fenólicos simples 4 Catequina 11 Catequina 13 Catequina 15 Catequina 17 Catequina 22 Flavonóide glicosilado 25 Procianidina 32 Quercetina 37 Kaempferol 53 No que diz respeito ao extrato de resíduo alcoólico de dióspiro, ainda não existem referências na literatura. Este tipo de extrato metanólico resulta da biomassa fermentada do dióspiro e não diretamente do fruto (Pérez-Burillo et al ., 2018) ou sumo (Jiménez-Sánchez et al ., 2015), onde já foram efetuados estudos. A presença dos compostos identificados neste extrato (Tabela 13) indicam à partida, uma boa capacidade antioxidante, já que os compostos fenólicos, como os flavonóides e derivados de ácidos fenólicos, são referidos na literatura como compostos que possuem capacidade antioxidante (Kawakami et al ., 2011; Xie et al ., 2015; Xue et al ., 2011). Assim, a partir da análise fitoquímica, é possível antecipar que os extratos de Diospyros kaki possuam um bom potencial antioxidante. No entanto, são necessários uma variedade de outros ensaios para confirmar esta capacidade, tal como se descreve em seguida. Ensaios bioquímicos para avaliação da atividade antioxidante in vitro Atividade de sequestro do radical Superóxido (O2•-) Os extratos metanólicos de folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro demonstraram capacidade de sequestro do radical superóxido (Figura 20). As concentrações testadas de extrato de resíduo alcoólico apresentaram resultados inconclusivos e, portanto, não foram considerados. F. verdes F. vermelhas Ac. Ascórbico 0 10 20 30 400 500 600 700 800 Superóxido EC50 (g/mL) Figura 20 - Gráfico representativo do EC50 dos extratos de dióspiro para o ensaio de eliminação do superóxido, comparando com o Ácido Ascórbico (antioxidante padrão). Ambos extratos exibiram uma boa capacidade de sequestro do radical superóxido, superior ao antioxidante de referência (ácido ascórbico). O extrato de folhas vermelhas apresentou um EC50 de 12,75 ±0,6192 µg/mL, e o de folhas verdes, um EC50 de 23,11 ±1,959 µg/mL (Tabela 14). Em 54 contrapartida, o ácido ascórbico utilizado como antioxidante de referência apresentou valor médio de 601,7 ±112 µg/mL. Quando comparados entre si, os extratos não apresentaram diferenças significativas ( p= 0,9329). Entretanto, ao serem comparados com o ácido ascórbico ambos apresentaram alto nível de significância ( p <0,0001), demonstrando sua eficiência na eliminação do radical superóxido (Tabela 14). Tabela 14 - Atividade de eliminação do superóxido dos extratos de folhas de dióspiro e do antioxidante ácido ascórbico e comparação da significância dos resultados. Amostras EC50 (µg/mL) Diferença estatística Ácido Ascórbico 601,7 ± 112 Ácido Ascórbico vs. F. verdes p< 0,0001(****) F. verdes 23,11 ± 1,96 Ácido Ascórbico vs. F. vermelhas p< 0,0001(****) F. vermelhas 12,75 ± 0,62 F. verdes vs. F. vermelhas P= 0,9329 (ns) Com estes resultados é possível notar uma elevada atividade antioxidante das amostras em estudo (extratos metanólicos das folhas vermelhas e verdes), indicada pelo seu baixo valor de EC50, inferior ao ácido ascórbico, usado como referência neste ensaio. Resultado semelhante foi obtido por Sun et al ., (2011) ao analisarem o extrato de folhas de Diospyros kaki , cujo EC50 foi de 41,58 ± 0,21 µg/mL, valor significativamente melhor que os da rutina, composto antioxidante de referência (EC50 130,58 ± 3,58 µg/mL) usado naquele estudo. A elevada atividade “ Scavenging” de superóxido do extrato foi atribuída à presença dos seus constituintes bioativos (Sun et al ., 2011). Cabe salientar que o extrato de folhas obtido por Sun et al ., (2011) demonstraram menor capacidade antioxidante que os extratos analisados neste trabalho, embora tenham especificado a colheita das folhas no mês de outubro, mesmo mês em que as folhas vermelhas foram colhidas. Tal diferença, na eliminação do radical superóxido entre os extratos, pode estar relacionada às variáveis ambientais locais, ao tipo de cultivo, clima, manejo ou processamento da matéria-prima. Os extratos de produtos naturais possuem compostos bioativos que podem variar qualitativamente e quantitativamente, agindo de diversas formas frente à inativação dos diferentes radicais livres. Os radicais superóxido matam células, inativam enzimas e degradam o ADN, as membranas celulares e os polissacarídeos. Desempenham ainda um papel importante durante a peroxidação de ácidos gordos insaturados (Sakanaka & Ishihara, 2008). Por este motivo, o estudo dos efeitos sequestradores de radical superóxido dos nossos extratos, é uma das formas mais importantes de esclarecer o mecanismo da atividade antioxidante (Zhishen et al ., 1999) e demonstrar seus benefícios terapêuticos atuando na redução do stress oxidativo. 61 Para a determinação das concentrações não tóxicas dos diferentes extratos de dióspiro (extrato de resíduo alcoólico-ERA, extrato de folhas verdes e extrato de folhas vermelhas) foi utilizado o ensaio de viabilidade celular do MTT. No grupo de controlo de vida (negativo) não foi aplicado nenhum extrato, ou seja, as células deste grupo foram apenas cultivadas em meio de cultura (DMEM) para os fibroblastos L929 e RPMI para os queratinócitos HaCaT, os valores deste grupo correspondem a 100% de viabilidade celular. Foi também efetuado um grupo de controlo de morte (controlo positivo), em que as células foram incubadas com 20% DMSO, os resultados para este controlo apresentaram valores sempre abaixo de 10% para a viabilidade celular, uma redução significativa ( p <0,0001), por isso não foram mostrados nos gráficos. Para verificar se as diferenças observadas na viabilidade das células expostas às várias concentrações de extratos são estatisticamente significativas, foi usado o teste ANOVA One-Way. Assim, foi possível avaliar a significância estatística dos valores obtidos para cada concentração de extrato. 5.3.1.1 Linha celular fibroblastos L929 A Figura 24 representa graficamente os resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular dos fibroblastos L929 expostos aos extratos do dióspiro por 5 horas. Figura 24 - Gráficos representativos da citotoxicidade dos extratos de dióspiro em fibroblastos L929, com 5 horas de incubação com extratos. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo negativo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. A incubação com o extrato de resíduo alcoólico apresentou citotoxicidade significativa nas concentrações de 250 µg/mL ( p <0,0001) e de 50 µg/mL (p=0,0139) (Figura 24A, Tabela 18). O extrato de folhas verdes demonstrou aumento da viabilidade celular significativo para a concentração de 50 µg/mL (p=0,0267). Já o extrato de folhas vermelhas apresentou valores de viabilidade celular superiores aos do controlo, estatisticamente significativos para as concentrações de 100 µg/mL ( p= 0,0003) e 50 62 µg/mL ( p= 0,0009). Este aumento da viabilidade celular nas concentrações de 100 µg/mL e 50 µg/mL pode indicar um aumento na proliferação celular ou da atividade metabólica das células, provocado pelo extrato de dióspiro. Existem métodos mais específicos para avaliar a proliferação celular, como a citometria de fluxo (Lili Wang et al ., 2011) e o ensaio de citotoxicidade baseada na enzima lactato desidrogenase - LDH (Smith et al ., 2011), que deverão ser futuramente realizados. De facto, Sun et al. , (2011) também observaram aumento significativo de células viáveis em ensaios com extratos de folhas de Diospyros kaki em células de osteoblastos MC3T3-E1 de rato. Para um período de incubação de 4 horas com extratos, os resultados revelaram aumento significativo ( p < 0,01) na viabilidade celular para todas as concentrações testadas (5 µg/mL, 10 µg/mL e 20 µg/mL). Eles justificaram este resultado referindo que o extrato de dióspiro pode atuar facilitando a captação de glicose e subsequentemente aumentando as concentrações de piruvato, levando ao aumento da energia celular e à proliferação das células. Tabela 18 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas. Citotoxicidade L929 - 5h 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 89,6 ±9,493 97,12 ±7,987 95,37 ±7,434 97,54 ±9,183 - Folhas Verdes - 104,5 ±18,66 109,2 ±11,47 101,7 ±12,99 95,33 ±12,97 Folhas Vermelhas - 166,4 ±30,04 144,2 ±25,26 105,6 ±12,48 88,14 ±9,865 A Figura 25 apresenta os gráficos da viabilidade celular demonstrada pelos fibroblastos L929 nos ensaios com os extratos de dióspiro após 24 horas de incubação. Figura 25 - Gráficos representativos da citotoxicidade dos extratos de dióspiro em fibroblastos L929, com 24 horas de incubação com extratos. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo negativo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. 63 Tal como os resultados obtidos para os ensaios anteriores (5 horas de incubação), o extrato de resíduo alcoólico mostrou toxicidade significativa para a concentração de 250 µg/mL ( p <0,0001) (Figura 25A, Tabela 19) após 24 horas de incubação. O extrato de folhas verdes apresentou valores de viabilidade celular superiores para todas as concentrações testadas (Tabela 19). Este aumento da % de viabilidade celular é estatisticamente significativo em relação ao controlo para as concentrações de: 100 µg/mL ( p= 0,0006); 50 µg/mL ( p< 0,0001) e 25 µg/mL ( p= 0,0058). De igual modo o extrato de folhas vermelhas apresentou aumento significativo na viabilidade celular para as concentrações de 50 µg/mL ( p= 0,0001) e 25 µg/mL ( p= 0,0006). No entanto na de 100 µg/mL, este extrato mostrou citotoxicidade visto ter diminuído significativamente ( p= 0,0057) a viabilidade celular (81,55 ±13,08%) em comparação com o controlo. Tabela 19 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas. Citotoxicidade L929 - 24h 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 85,53 ±12,29 100,3 ±10,27 102,4 ±11,23 102,5 ±9,724 - Folhas Verdes - 121,6 ±16,53 119,7 ±14,35 115,4 ±17,56 108,6 ±20,76 Folhas Vermelhas - 81,55 ±13,08 121,3 ±10,43 117,6 ±11,4 107,8 ±14,91 Quando comparados os ensaios de 5 horas e 24 horas de incubação, o extrato de folhas vermelhas, apresentou aumento da toxicidade relacionada ao tempo de incubação para a concentração de 100 µg/mL, que teve citotoxicidade significativa no ensaio de 24 horas. Já o extrato de folhas verdes, após 24 horas de incubação, apresentou aumento da viabilidade celular para todas as concentrações, com aumentos significativos para as três maiores concentrações testadas. 5.3.1.2 Linha celular queratinócitos HaCaT Os ensaios de citotoxicidade também foram realizados com a linha celular HaCaT e os resultados estão representados na Figura 26 (5 horas de incubação com extratos) e na Figura 27 (24 horas de incubação com os extratos). 64 Figura 26 - Gráficos representativos da citotoxicidade dos extratos de dióspiro em queratinócitos HaCaT, com 5 horas de incubação com extratos. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo negativo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. O extrato de resíduo alcoólico apresentou viabilidades celulares (Tabela 20) bem próximas das células tratadas apenas com meio (controlo), não evidenciando citotoxicidade nesta linha celular, quer após 5 horas (Figura 26A) ou 24 horas (Figura 27A) de incubação. De igual modo, o extrato de folhas verdes não mostrou qualquer toxicidade após 5 ou 24 horas de incubação. Após de 5 horas de incubação com este extrato, houve um aumento significativo para a concentração de 50 µg/mL ( p =0,0226). O mesmo se verificou após 24 de incubação para as concentrações de 100 e 50 µg/mL ( p <0,0001), em comparação com as células controlo (Tabela 21), podendo ser devido a um efeito de proliferação celular ocasionado por este extrato. Tabela 20 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas. Citotoxicidade HaCaT - 5h 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 100,7 ±5,506 102 ±7,286 100,5 ±4,502 96,84 ±3,69 - Folhas Verdes - 104,2 ±12,02 106,8 ±8,552 102,6 ±5,296 100,7 ±5,202 Folhas Vermelhas - 70,77 ±9,59 95,94 ±7,894 97,21 ±7,923 96,02 ±7,113 Já o extrato das folhas vermelhas apresentou viabilidades celulares muito próximas do controlo negativo, com exceção da concentração de 100 µg/mL, que mostrou citotoxicidade significativa quer após 5 horas de incubação ( p <0,0001) (Figura 26C) quer após 24 horas de incubação ( p <0,0001) (Figura 27C). 65 Figura 27 - Gráficos representativos da citotoxicidade dos extratos de dióspiro em queratinócitos HaCaT, com 24 horas de incubação com extratos. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo negativo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. Shon et al ., (2014) avaliaram a citotoxicidade de 20 extratos etanólicos de frutas e de ervas medicinais cultivadas na Coreia em queratinócitos humanos, incluindo 3 extratos etanólicos de dióspiro ( Matsumoto Wase Fuyu, Nishimura Wase e Taishu ). Os extratos foram testados nas concentrações de 100 µg/mL e 400 µg/mL com pré-incubação de 24 horas. Na concentração de 100 µg/mL, nenhum dos extratos de dióspiro apresentou diminuição significativa da viabilidade celular, já à concentração de 400 µg/mL apenas o extrato de dióspiro Taishu ocasionou redução significativa da viabilidade celular. Tabela 21 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citotoxicidade com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas. Citotoxicidade HaCaT - 24h 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 96,18 ±8,835 91,8 ±10,55 94,79 ±9,482 93,9 ±9,137 - Folhas Verdes - 126,7 ±9,32 118 ±10,21 103,9 ±15,85 109,8 ±8,422 Folhas Vermelhas - 57,46 ±8,521 98,64 ±17,96 101,7 ±19,43 90,06 ±15,4 Os ensaios de citotoxicidade permitem determinar se um extrato contém quantidades significativas de compostos químicos biologicamente prejudiciais, portanto, sendo úteis para a triagem, pois servem para separar materiais tóxicos dos não tóxicos, fornecendo evidências preditivas de segurança deste extrato (Miret et al ., 2006). Globalmente, verifica-se que os extratos não exercem citotoxicidade significativa sobre as células da linha celular HaCaT, com a exceção do extrato de folhas vermelhas na concentração de 100 µg/mL em ambos os períodos de incubação (5 horas e 24 horas). Após determinar as concentrações não tóxicas dos extratos, ou seja, seguras, é importante verificar se os extratos apresentam efeitos de citoproteção nas linhas celulares testadas. 66 Ensaio de Citoproteção contra insulto t-BHP Com este estudo pretendeu-se avaliar os potenciais efeitos antioxidantes e citoprotetores dos extratos metanólicos de dióspiro contra danos oxidativos induzidos pelo insulto t-BHP em células de fibroblastos L929 e queratinócitos HaCaT. Os extratos foram pré incubados por 2 horas ou 21 horas e posteriormente co-incubados com o t-BHP, durante 3 horas. 5.3.2.1 Linha celular fibroblastos L929 5.3.2.1.1 Duas horas de pré-incubação dos fibroblastos da linha L929 com os extratos Neste ensaio, os fibroblastos da linha celular L929 foram pré-incubados 2 horas com os extratos e posteriormente co-incubados com o insulto oxidativo t-BHP (4 mM) durante 3 horas. A incubação das células com o t-BHP 4 mM (controlo positivo) durante 3 h, conduziu a uma diminuição significativa de cerca de 40% da viabilidade celular ( p <0,0001). Figura 28 - Gráficos representativos da citoproteção dos extratos de dióspiro em fibroblastos L929, com 2 horas de préincubação com extratos e 3 horas de co-incubação com extratos e o insulto t-BHP. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo positivo (t-BHP 4mM). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. Nas condições anteriores, a pré-incubação com o extrato do resíduo alcoólico, originou um efeito citoprotetor (verificada pelo aumento da viabilidade celular em relação ao controlo positivo) significativo ( p =0,0157) apenas na concentração de 100 µg/mL (Fig. 28A). Já a pré-incubação com o extrato de folhas verdes (Figura 28B) originou um efeito citoprotetor significativo nas concentrações 50 µg/mL ( p <0,0001) e 25 µg/mL ( p =0,0008) e a pré-incubação com o extrato de folhas vermelhas apresentou um efeito citoprotetor significativo ( p <0,0001) na concentração de 25 µg/mL (Figura 28C). Apesar das concentrações de 50 µg/mL e 10 µg/mL apresentarem um aumento na viabilidade celular em relação ao controlo positivo, estes (aumentos) não foram significativos (Figura 28C, Tabela 22). 67 Tabela 22 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas (pré-incubação por 2 horas e coincubação por 3 horas com t-BHP). Citoproteção L929 - 2h pré-incubação + 3h co-incubação t-BHP 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 66,53 ±6,96 76,07 ±13,55 78,82 ±8,38 73,58 ±7,62 67,9 ±5,80 - Folhas Verdes 64,77 ±15,03 - 53,31 ±12,53 92,46 ±11,25 78,5 ±11,08 66,52 ±10,64 Folhas Vermelhas 64,77 ±15,03 - 32,33 ±13,63 74,24 ±13,15 92,3 ±10,9 72,37 ±14,09 Em suma, a pré-incubação de 2 horas com os extratos seguido de 3h de co-incubação com o insulto oxidativo, originou citoproteção significativa (aumento da viabilidade celular em relação ao controlo positivo) nas seguintes situações: (1) extrato do resíduo alcoólico (100 µg/mL), extrato de folhas verdes (50 e 25 µg/mL) e extrato de folhas vermelhas (25 µg/mL). Deste modo, o extrato de folhas verdes e de folhas vermelhas apresentam ter melhor potencial em relação ao de resíduo alcoólico visto que evidenciam citoproteção a concentrações menores. 5.3.2.1.2 Vinte e uma horas de pré-incubação dos fibroblastos da linha L929 com os extratos Para verificar se o tempo de pré-incubação com os extratos influencia o efeito citoprotetor nas células, foram realizados ensaios com 21 horas de pré-incubação com os extratos seguido de 3 horas de co-incubação com o insulto oxidativo. Os resultados deste ensaio podem ser observados na Figura 29 e na Tabela 23. Figura 29 - Gráficos representativos da citoproteção dos extratos de dióspiro em fibroblastos L929, com 21 horas de préincubação com extratos e 3 horas de co-incubação com extratos e o insulto t-BHP. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo positivo (t-BHP 4mM). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. Neste ensaio, a incubação das células com o t-BHP 4 mM (controlo positivo) durante 3h, conduziu a uma diminuição significativa da viabilidade celular ( p< 0,0001) de cerca de 80%, superior à ocorrida no 68 ensaio anterior (pré-incubação de 2 h com os extratos). Este resultado pode ter sido devido ao maior período de pré-incubação que pode ter conduzido a uma situação de maior suscetibilidade celular face a insultos oxidativos. Verifica-se que a pré-incubação com o extrato de resíduo alcoólico origina citoproteção significativa nas concentrações de 250 µg/mL, 100 µg/mL e 50 µg/mL ( p< 0,0001 ) (Figura 29A). De igual modo, todas as concentrações testadas do extrato de folhas verdes apresentam citoproteção (Figura 29B) significativa ( p< 0,0001 ). Já a incubação com o extrato de folhas vermelhas mostrou capacidade de citoproteção significativa ( p< 0,0001 ) para todas a concentrações testadas (Figura 29C, Tabela 23) com exceção da maior concentração (100 µg/mL) que anteriormente tinha se mostrado citotóxica (ensaios de citotoxicidade, Figura 25C). A concentração de 25 µg/mL deste extrato (116,7 ±14,14%, Tabela 23), apresentou o melhor efeito citoprotetor contra o insulto oxidativo t-BHP para este ensaio. Tabela 23 - Viabilidade celular dos fibroblastos L929 (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 24 horas (pré-incubação por 21 horas e coincubação por 3 horas com t-BHP). Citoproteção L929 - 21h pré-incubação + 3h co-incubação t-BHP 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 17,23 ±7,5 63,49 ±5,07 46,58 ±3,94 38,58 ±6,58 16,66 ±5,59 - Folhas Verdes 20,13 ±8,32 - 92,06 ±11,9 100,6 ±10,44 86,91 ±11,7 63,03 ±8,55 Folhas Vermelhas 27,9 ±11,12 - 31,07 ±15,7 67,81 ±8,77 116,7 ±14,14 89,28 ±9,82 Comparando os resultados dos ensaios de pré-incubação com os extratos (após 2 horas e 21 horas de pré-incubação), verifica-se que as concentrações que originam melhor efeito citoprotetor são 50 µg/mL para o extrato de folhas verdes e 25 µg/mL no caso do extrato de folhas vermelhas em ambos os ensaios. Já o extrato de resíduo alcoólico, os resultados divergiram: após 2 horas de pré-incubação, a única concentração estatisticamente significativa foi a de 100 µg/mL; após 21 horas de pré-incubação, verificou-se um aumento significativo da viabilidade celular em comparação com o controlo positivo, portanto citoproteção, para as concentrações de 250, 100 e 50 µg/mL. Globalmente podemos inferir que os extratos de folhas apresentaram melhores resultados de citoproteção que o de resíduo alcoólico. Adicionalmente, é possível inferir que os extratos de folhas vermelhas originam uma maior citoproteção do que os de folhas verdes já que este efeito foi originado a uma concentração inferior (25 µg/mL no caso do extrato de folhas vermelhas; 50 µg/mL no caso do extrato de folhas verdes). 69 Não foram encontrados na literatura ensaios de citoproteção com extratos de dióspiro para as linhas celulares utilizadas neste trabalho. Contudo, Sun et al . (2014) estudaram os efeitos de extratos etanólicos de folhas de dióspiro nos danos oxidativo induzidos por H2O2 em osteoblastos de rato MC3T3E1, abordando seus potenciais efeitos terapêuticos ou tóxicos. Naquele trabalho, eles fizeram um prétratamento das células com o extrato de dióspiro durante 24 horas e após este período, incubaram com o insulto oxidativo H2O2 durante 6 horas. As três concentrações do extrato estudado apresentaram atividade anti-apoptótica significativa nas células tratadas com o extrato, revelando este um efeito citoprotetor. Este estudo evidenciou ainda os flavonoides presentes no extrato como responsáveis pela prevenção da apoptose e proteção das células contra os radicais de oxigênio. Atualmente, estudos farmacológicos e clínicos indicam que o extrato de folhas de dióspiro, especialmente seus flavonóides, exibem uma ampla gama de atividades terapêuticas, incluindo propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas e antialérgicas (Sun et al ., 2014). Já Wattel et al. (2003) citam os flavonóides como antioxidantes naturais que eliminam vários tipos de radicais em uma ampla gama de sistemas de oxidação química. Os resultados de Sun et al . (2014) são concordantes com os apresentados no presente trabalho que indicaram um efeito citoprotetor significativo dos extratos estudados contra o insulto oxidativo t-BHP, principalmente dos extratos de folhas. Deste modo, pode-se inferir que os vários flavonoides identificados na análise HPLC-DAD (Tabela 13) podem contribuir grandemente para este efeito citoprotetor. 5.3.2.2 Linha celular queratinócitos HaCaT Os ensaios de citoproteção também foram realizados com os queratinócitos HaCaT para os períodos de pré-incubação de 2 e 21 horas com 3 extratos de dióspiro estudados. Os resultados podem ser observados nos gráficos da Figura 30 e na Tabela 24 (2 horas de pré-incubação) e Figura 31 e Tabela 25 ( 21 horas de incubação). Do mesmo modo, após o período de pré-incubação com extratos, as células foram co-incubadas 3 horas com o insulto oxidativo (t-BHP). Esta linha celular mostrou ser mais sensível aos efeitos do t-BHP visto que após 3 horas de incubação com t-BHP 1 mM (concentração 4x inferior à usada na linha celular L929), a viabilidade celular diminuiu para cerca de 40%. 5.3.2.2.1 Duas horas de pré-incubação dos queratinócitos da linha HaCaT com os extratos O extrato de resíduo alcoólico apresentou valores bem próximos do controlo positivo (t-BHP 4mM) não mostrando efeito protetor significativo para nenhuma concentração testada (Figura 30A). 70 Figura 30 - Gráficos representativos da citoproteção dos extratos de dióspiro em queratinócitos HaCaT, com 2 horas de préincubação com extratos e 3 horas de co-incubação com extratos e o insulto t-BHP. AExtrato de resíduo alcoólico; BExtrato de folhas verdes; CExtrato de folhas vermelhas. Os asteriscos (*) indicam a diferença significativa relativamente ao controlo positivo (t-BHP 4mM). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001. A sua ausência indica que a diferença não é significativa. O extrato de folhas verdes mostrou um efeito citoprotetor significativo (p<0,01) para as concentrações de 100 e 50 µg/mL (Figura 30B). Já o extrato de folhas vermelhas apesar de apresentar aumento da viabilidade celular em relação ao t-BHP (41,34 ±6,11) para as concentrações de 50 µg/mL (51,47 ±10,32) e 25 µg/mL (48,83 ±10,61), este aumento não foi estatisticamente significativo (Figura 30C e Tabela 24). Tabela 24 - Viabilidade celular dos queratinócitos HaCaT (representada em %) no ensaio de citoproteção com incubação dos extratos de resíduo alcoólico, folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro por 5 horas (pré-incubação por 2 horas e coincubação por 3 horas com t-BHP). Citoproteção HaCaT - 2h pré-incubação + 3h co-incubação t-BHP 250 100 50 25 10 Resíduo Alcoólico 39,7 ±7,55 36,89 ±8,04 40,2 ±6,74 35,34 ±7,14 34,79 ±7,20 - Folhas Verdes 21,7 ±7,35 - 38,9 ±11,37 34,11 ±7,87 29,33 ±5,62 22,14 ±5,88 Folhas Vermelhas 41,34 ±6,11 - 31,18 ±5,70 51,47 ±10,32 48,83 ±10,61 30,16 ±7,39 5.3.2.2.2 Vinte e uma horas de pré-incubação dos queratinócitos da linha HaCaT com os extratos Assim como demonstrado no ensaio com 2 horas de pré-incubação, após 21 horas, o extrato do resíduo alcoólico não mostrou capacidade citoprotetora significativa para nenhuma concentração testada (Figura 31A). 77 Os resultados da avaliação da perda de água das formulações de folhas verdes (fvd) e folhas vermelhas (fvm) de dióspiro, além da formulação sem os extratos de dióspiro (fc) e da pele sem aplicação de cremes (cn), podem ser observados na Figura 33. Este gráfico compara as médias do tempo 0 (t0), quando não havia aplicação de cremes na pele, com as medias do tempo 6 (t6), após 6 horas de aplicação do cremes. (cn)-t0 (cn)-t6 (fc)-t0 (fc)-t6 (fvd)-t0 (fvd)-t6 (fvm)-t0 (fvm)-t6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Avaliação da perda transepidérmica de água Perda de água (g/m²/h) **** *** Pele muito saudável Pele saudável Figura 33 – Gráfico representativo da avaliação da perda transepidérmica de água. O controlo negativo (cn) e as formulações controlo (fc), folhas verdes (fvd) e folhas vermelhas (fvm) foram avaliadas no tempo 0 – t0 (sem aplicação dos cremes) e no tempo 6 – t6 (6 horas após a aplicação dos cremes) quanto a variação da perda de água das regiões demarcadas nos antebraços dos voluntários. Diferença estatística: *** p = 0,0001 e **** p < 0,0001 Ao analisar os resultados, podemos verificar que a média dos valores apresentada, comparada com a escala fornecida pelo fabricante do equipamento, revela que a pele dos voluntários é muito saudável, já que os valores se mantiveram entre 0-10. O controlo negativo (cn) apresentou um aumento de 6,509 ± 1,842 g/m²/h para 7,794 ± 2,153 g/m²/h e a formulação controlo (fc) apresentou um aumento de 5,551 ± 1,661 g/m²/h para 7,713 ± 1,412 g/m²/h na perda de água, entre a primeira leitura (t0) e a segunda leitura (t6), variações consideradas muito significativas. Já as duas formulações que continham os extratos de dióspiro, não obtiveram aumento significativa na perda de água entre os períodos verificados. Estes resultados revelaram que a formulação do creme, sem os extratos, não foi capaz de reduzir a perda de água da pele dos voluntários, que pode ter sido causada por fatores externos, já que houve aumento significativo também na área onde não foi aplicado nenhum creme (cn). Este ensaio foi realizado nos meses de verão e a diferença de 6 horas entre as medições pode ter sido influenciada pela exposição da pele dos voluntários no decorrer do dia, à luz solar e à altas temperaturas. 78 Vários fatores podem provocar alterações na perda transepidérmica de água. Em relação à influência ambiental, a incidência de luz direta pode promover o aquecimento da pele, causando aumento da transpiração, além disto, a estação do ano e o clima influenciam na humectação cutânea. Outros fatores importantes são o estilo de vida, a alimentação, o consumo regular de nicotina e álcool, o stress e o uso de produtos farmacêuticos e cosméticos (Gonçalves & Campos, 2009). As formulações de folhas verdes (fvd) e de folhas vermelhas (fvm), por não terem exibido aumento na TEWL, podem indicar que estas substâncias ativas influenciaram na manutenção da água na pele, já que a única diferença entre estes cremes e a formulação controlo (fc) foi a adição dos extratos de dióspiro. Provavelmente os extratos de dióspiro promoveram melhora na função de barreira da pele, impedindo que os fatores externos, ou até mesmo intrínsecos, aumentassem a evaporação de água da pele nas áreas tratadas com estes cremes. Segundo Huang & Chang, (2008), quando a pele é danificada, sua função de barreira é prejudicada, resultando em maior perda de água. Como não ocorreram aumentos significativos na TEWL nas áreas de aplicação dos cremes de dióspiro, infere-se que eles não causaram danos imediatos ou lesões na pele dos voluntários. Entretanto para verificar se as formulações não apresentaram efeitos adversos na pele, outros parâmetros devem ser avaliados. Determinação da hidratação da pele Para avaliar a capacidade que uma formulação cosmética tem para hidratar a pele, a avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo é indispensável (O’Goshi & Serup, 2005; Wiedersberg et al ., 2009). Assim, nesse trabalho foi utilizado o equipamento Corneometer que emprega o método da capacitância para analisar se as formulações em estudo seriam capazes de alterar a hidratação da pele após 6 horas de sua aplicação. A capacitância variável total da superfície da pele é convertida em unidades arbitrárias (UA) de hidratação da pele e varia de 0 a 130, onde <30 corresponde a muito secas, de 30-40 a seca e >40 a suficientemente hidratada. Os resultados da avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo das formulações estão expressos na Figura 34. Este gráfico compara as médias iniciais (t0), quando não havia aplicação de cremes na pele, com as médias finais (t6), após 6 horas de aplicação dos cremes. 79 (cn)-t0 (cn)-t6 (fc)-t0 (fc)-t6 (fvd)-t0 (fvd)-t6 (fvm)-t0 (fvm)-t6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo Conteúdo aquoso do estrato córneo (em UA) Pele muito seca Pele seca Pele suficientemente hidratada **** **** **** Figura 34 – Gráfico representativo da avaliação hidratação da pele. O controlo negativo (cn) e as formulações controlo (fc), de folhas verdes (fvd) e de folhas vermelhas (fvm) foram avaliadas no tempo 0 – t0 (sem aplicação dos cremes) e no tempo 6 – t6 (6 horas após a aplicação dos cremes) quanto a variação do conteúdo aquoso do estrato córneo das regiões demarcadas nos antebraços dos voluntários. Diferença estatística: **** p < 0,0001 Ao analisar os valores obtidos para o conteúdo aquoso presente na pele dos voluntários, verificase que na primeira medição t0, ainda sem a aplicação dos cremes, todas as médias ficaram entre 3040, indicando uma “pele seca”. Entretanto, na medição t6 após a aplicação dos cremes os valores ficaram maiores que 40, com alteração na hidratação da pele para “pele suficientemente hidratada”, mudança que não ocorreu para o controlo negativo (cn), indicando que provavelmente fatores externos e fatores intrínsecos, não influenciaram na hidratação da pele, visto que o controlo negativo (cn) não apresentou diferenças significativas na hidratação da pele. Já ao comparar a medição t0 e t6 de cada área, o controlo negativo também não apresentou aumento significativo, ao contrário das três formulações que apresentaram um aumento significativo ( p < 0,0001) do conteúdo aquoso (Figura 34). Estes resultados indicam que os componentes das formulações possuem efeito hidratante da pele e que estes efeitos ainda podem ser observados após 6 horas de aplicação. As formulações deste trabalho foram preparadas a partir de emulsão O/W. O tipo de emulsão, óleo em água (O/W) ou água em óleo (W/O), influencia o comportamento de hidratação da pele. As medições de capacitância para uma emulsão O/W mostram normalmente um aumento imediato e significativo na hidratação da pele após aplicação do produto (Serup et al ., 2006). Dependendo da eficácia do produto, os valores de capacitância podem ser mantidos por várias horas. A eficácia do produto depende da natureza e quantidade de humectantes que mantem a água na formulação (Serup et al ., 2006). 80 As formulações cosméticas são compostas por ingredientes que tem efeitos hidratantes na pele, como por exemplo, o glicerol, que atua como humectante devido sua alta propriedade higroscópica (Roussel et al ., 2012), a betaína que tem função humectante e condicionadora da pele e cabelos (Burnett et al ., 2018), alguns óleos essenciais, que além da função de aromatizantes podem desempenhar efeitos hidratantes e aumento da elasticidade da pele (Sarkic & Stappen, 2018). Outra “molécula chave” envolvida na humidade da pele é o ácido hialurónico, que possui capacidade única de reter água (Papakonstantinou et al ., 2012). Estes e outros compostos presentes nas formulações testadas (fc, fvd e fvm) influenciaram o resultado de hidratação demonstrado nos resultados. Todas as formulações testadas (fc, fvd e fvm), com e sem extratos de dióspiro, apresentaram aumento muito significativo do conteúdo aquoso do estrato córneo, o que pode indicar que os extratos não tiveram papel fundamental no aumento da hidratação da pele. Esta afirmação pode ser corroborada quando se compara estatisticamente a medida t0 de todas as formulações, que não apresentaram diferenças significativas e posteriormente as medidas t6, onde também não foram constatadas alterações significativas, ou seja, as formulações demonstraram efeito hidratante equivalente em todas as regiões. A comprovação dos efeitos hidratantes das formulações é de grande interesse, pois manter a pele adequadamente hidratada melhora o seu aspeto geral, retarda o envelhecimento cutâneo e previne ou trata determinadas doenças de pele (Gonçalves & Campos, 2009). Enfim, as formulações apresentaram importante efeito hidratante da pele, que preliminarmente não foram causados pelos extratos de dióspiro. Como estes ensaios são para verificar a preservação da função de barreira da pele e a ausência de efeitos adversos causados pelos extratos, podemos inferir que os mesmos não apresentaram efeitos negativos na pele. Determinação de formação de eritema na epiderme Complementarmente e não menos importante, é fundamental avaliar a formação de eritema, que é um dos primeiros e principais reações da pele a agentes externos. O eritema é uma reação inflamatória cutânea aguda caracterizada por sinais de inflamação, incluindo vermelhidão, calor, sensibilidade e edema (Akhtar et al ., 2012). Ele é um indicador da integridade da barreira cutânea e ocorre quando a pele é exposta a substâncias irritantes, como produtos químicos, produtos de limpeza, alérgenos ou raios UV (Khosrowpour et al ., 2019). 81 Para avaliar se as formulações provocaram alguma reação adversa imediata na pele causando a formação de eritema, foi utilizado o equipamento Mexameter que através da medição dos picos de absorção espectral de hemoglobina fornece o índice de eritema, que varia de 0 a 999 unidades arbitrárias (UA). De acordo com o manual do fabricante, valores entre 0-170 indicam ausência de eritema, entre 170-330 eritema mínimo, entre 330-450 vermelhidão difusa, entre 450-570 presença de eritema forte e maior que 570 eritema extremo. Os resultados da avaliação da formação de eritema nas áreas de aplicação das formulações são expressos na Figura 35. Este gráfico compara as médias iniciais (t0), quando não havia aplicação de cremes na pele, com as médias finais (t6), após 6 horas de aplicação dos cremes. Figura 35 – Gráfico representativo da avaliação da formação de eritema. O controlo negativo (cn) e as formulações controlo (fc), de folhas verdes (fvd) e de folhas vermelhas (fvm) foram avaliadas no tempo 0 – t0 (sem aplicação dos cremes) e no tempo 6 – t6 (6 horas após a aplicação dos cremes) quanto a variação do índice de eritema das regiões demarcadas nos antebraços dos voluntários. Ao se comparar as médias das medições do índice de eritema antes da aplicação (t0) e após 6 horas da aplicação (t6) das formulações (fc, fvd e fvm), não foi observado nenhum aumento significativo nos valores, o que indica que não provocaram irritação ou aumento da vermelhidão nos locais testados. O mesmo foi observado na área onde não houve aplicação de nenhum creme. Mostrando assim que a pele teve comportamento semelhante em todos os locais testados e os cremes não tiveram nenhuma (cn)-t0 (cn)-t6 (fc)-t0 (fc)-t6 (fvd)-t0 (fvd)-t6 (fvm)-t0 (fvm)-t6 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Avaliação da formação de eritema Índice de eritema (em UA) Sem Eritema Eritema Mínimo Vermelhidão Difusa 82 influência para este ensaio. O que é positivo, já que demonstram uma boa compatibilidade cutânea e ausência de potencial alergénico. No período dos ensaios não foi observado nenhum sinal visual que indicasse algum tipo de reação aos cremes e os voluntários não relataram nenhum tipo de desconforto ou queixa após os períodos de teste, corroborando os resultados apresentados. Globalmente, os resultados dos efeitos imediatos dos cremes na pele demonstraram que as formulações de folhas de dióspiro apresentam compatibilidade cutânea, sendo, portanto, consideradas seguras para aplicação na pele humana. Ademais indicam que os extratos de folhas de dióspiro exibem bom potencial para aplicações cosméticas e dermatológicas, muito provavelmente devido aos compostos fenólicos que os constituem. O baixo custo de produção e o elevado valor acrescentado destes extratos no campo cosmético é particularmente interessante, no entanto, são necessários mais estudos para se obter resultados mais conclusivos, principalmente no que diz respeito a um ensaio de eficácia clínica dos cremes. 83 CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS Os cosméticos/cosmecêuticos à base de extratos de plantas têm despertado muito interesse por parte dos consumidores, que buscam cada vez mais, produtos naturais, sustentáveis, eficientes e seguros. Esta demanda, faz com que, quer as indústrias farmacêuticas e de cosméticos, quer grupos de investigação, invistam em pesquisas, procurando compreender os mecanismos de ação dos fitoquímicos mais conhecidos e buscando novas plantas e compostos naturais para serem usados nesta categoria de produtos. O Diospyros kaki é uma planta que tem uma composição fitoquímica muito rica e por isso tem inúmeros benefícios para a saúde, muitos já conhecidos. Entre eles, os benefícios à pele, tornam esta planta uma boa opção a ser utilizado em formulações cosméticas. De facto, a literatura apresenta inúmeros efeitos benéficos de extratos de dióspiro à pele que têm sido associados à sua rica composição em polifenóis . Nesta pesquisa foram investigados alguns dos benefícios do dióspiro, principalmente seus efeitos antioxidantes. Para isso foram utilizados extratos das folhas e do resíduo da fermentação alcoólica do fruto, para realização de ensaios bioquímicos (com metodologias conhecidas) e ensaios in vitro com linhas celulares da pele. Nos ensaios bioquímicos, os extratos de folhas verdes e de folhas vermelhas apresentaram potente atividade antioxidante com destaque para o ensaio de superóxido e de inibição de óxido nítrico em que se obtiveram resultados de EC 50 significativamente inferiores aos compostos de referência testados. No ensaio de quelação de ferro, os resultados foram mais modestos, mostrando alguma atividade de quelação sendo esta, no entanto, bastante inferior ao composto de referência usado. No ensaio de sequestro do radical DPPH, os dois extratos de folhas apresentaram atividade significativamente superior à do composto de referência utilizado. Diante dos resultados apresentados os dois extratos de folhas têm grande potencial antioxidante, podendo ser muito benéficos em formulações cosméticas antienvelhecimento, por exemplo. A epiderme pode ser danificada pelo stress oxidativo causado por radicais livres, riscos químicos e radiação UV. Os queratinócitos constituem mais de 80% das células epidérmicas, portanto, a sua proteção contra o stress oxidativo é uma estratégia anti-envelhecimento importante. 84 Os ensaios com as linhas celulares queratinócitos HaCaT e fibroblastos L929, indicaram globalmente as concentrações não citotóxicas dos extratos que poderão ser utilizadas em formulações cosméticas. Algumas concentrações dos extratos de folhas vermelhas e de folhas verdes apresentaram viabilidades maiores que as do controlo, indicando provavelmente o aumento na proliferação ou aumento no metabolismo das células, o que pode ser um bom indicativo, já que os queratinócitos estão em constante proliferação e os fibroblastos sintetizam colagénio e elastina e ambos são importantes fatores para a renovação e manutenção da vitalidade da pele. Todos os extratos apresentaram concentrações capazes de proteger as células contra insulto oxidativo t-BHP. Globalmente o extrato de folhas verdes apresentou melhor capacidade de citoproteção, seguido pelo de folhas vermelhas e o de resíduo alcoólico. No ensaio com DCFDA, o extrato de folhas verdes confirmou os resultados anteriores, apresentando uma diminuição significativa das ERO intracelulares causadas pelo t-BHP. Estes resultados em linhas celulares revelaram uma atividade de proteção significativa dos extratos, confirmando os ensaio bioquímicos anteriores, indicando-os como potenciais matérias-primas para produção de formulações cosméticas para a pele. Deste modo, foram produzidas duas formulações cosméticas com folhas verdes e folhas vermelhas de dióspiro, respetivamente. Elas foram testadas com a utilização de equipamentos biometrológicos muito utilizados na avaliação de cosméticos e indicaram resultados satisfatórios quanto aos seus efeitos imediatos na pele. Os cremes aumentaram a hidratação da pele, não induziram formação de eritema e não aumentaram a perda transepidérmica de água, demonstrando que eles não provocaram reações indesejadas e preservaram a função de barreira da pele. Como perspetivas futuras seria interessante avaliar a capacidade anti-inflamatória dos extratos de dióspiro nas linhas celulares utilizadas neste trabalho para aplicação em outros tipos de cosméticos. Adicionalmente, seria igualmente importante fazer um ensaio de eficácia clínica das formulações, a longo prazo, para verificar se os efeitos antioxidantes demonstrados nos ensaios bioquímicos e celulares serão observados também na pele, já que devido a inúmeros fatores, a reprodutibilidade dos efeitos demonstrados em ensaios in vitro pode ser bem diferente dos apresentados in vivo . 85 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ahmed, E., Arshad, M., Khan, M., Amjad, M., Sadaf, H., Riaz, I., … Sabaoon, N. (2017). Secondary metabolites and their multidimensional prospective in plant life. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry , 6 (2), 205–214. Akagi, T., Katayama-Ikegami, A., & Yonemori, K. (2011). Proanthocyanidin biosynthesis of persimmon (Diospyros kaki Thunb.) fruit. Scientia Horticulturae , 130 (2), 373–380. Akbulut, M., Ercisli, S., Yildirim, N., Orhan, E., & Agar, G. (2008). The comparison of persimmon genotypes (Diospyros kaki Thunb.) by using RAPD and FAME data. 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