Desenvolvimento de agentes encapsulantes com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios

Pedro Alexandre Gonçalves Faria Desenvolvimento de agentes encapsulantes com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios outubro de 2019 UMinho | 2019 Pedro Faria Desenvolvimento de agentes encapsulantes com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios Universidade do Minho Escola de Ciências Pedro Alexandre Gonçalves Faria Desenvolvimento de agentes encapsulantes com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios Tese de Mestrado Biofísica e Bionanossistemas Trabalho efetuado sob a orientação de Professora Doutora Andreia Ferreira de Castro Gomes Mestre Catarina Dias Costa Universidade do Minho Escola de Ciências outubro de 2019 ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial CC BY-NC https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ iii Agradecimentos Em primeiro lugar queria agradecer às minhas orientadoras. À Professora Andreia Gomes e à Mestre Catarina Costa por todo o apoio e acompanhamento ao longo deste ano, sem elas era impossível concretizar este projeto. Aos restantes mentores que me foram ajudando, ao Nuno Azoia pelas ideias e acompanhamento constante, à Inês Pinheiro pela ajuda com os ensaios no GC e à Verónica Bouça pela ajuda com o ensaio de solidez da coloração. É de referir que este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto “TEXBOOST – LESS COMMODITIES MORE SPECIALITIES” (ref. POCI-01-0247-FEDER-024523), cofinanciado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), no âmbito do Portugal 2020 através do COMPETE2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI). Por isso, não posso deixar de agradecer ao projeto TexBoost , ao CeNTI e a todos os CeNTIstas, pela forma como me receberam e pelo fornecimento das condições necessárias à elaboração deste trabalho. Agradeço também à Unidade Tintureira do Citeve e ao Laboratório de Biologia Animal da ECUM, onde se realizaram partes deste projeto. Como não poderia deixar de ser, ficam aqui expressos o meu carinho e gratidão a todos os estagiários CeNTIanos 2018/2019, pelo espírito de companheirismo, entreajuda, amizade e diversão. Desejo-vos a todos muito sucesso e espero profundamente que nos voltemos a cruzar. Aos meus gerentes, pelo esforço que fizeram em agilizar os horários permitindo-me conciliar o trabalho e os estudos da melhor forma possível, nos últimos dois anos. Agradeço também ao Zé, à Dani, à Maria, ao Gilberto, à Rafa, ao Sérgio e ao Cristiano, pelo vosso apoio, motivação, amizade e presença em todos os momentos, dentro e fora do trabalho. Foram como uma família ao longo de todo este tempo e espero continuar a ter-vos por perto. Quero ainda deixar um agradecimento à minha família mais próxima, que me viu afastado de alguns momentos importantes. Espero que a partir de agora o ritmo acalme e possa compensar-vos. Por fim, e porque um agradecimento não chega, tenho de dedicar este documento aos meus pais, Elisa e Francisco, e à minha irmã Francisca. Este também foi um ano atribulado para vocês e foram os mais sacrificados com a minha ausência, espero que tenha valido a pena e que fiquem orgulhosos. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Desenvolvimento de agentes encapsulantes com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios Resumo O processamento do leite na indústria do queijo gera um subproduto, do qual vários produtos com valor acrescentado podem ser obtidos, o soro de leite. Portanto, a sua aplicação noutros setores industriais tem ganho alguma importância. O soro de leite em pó contém cerca de 12 % de proteínas, que podem ser processadas até aos 80 e 90 % (concentrados e isolados de proteína do soro de leite, respetivamente). Alguns caminhos para a sua valorização incluem o desenvolvimento de novos acabamentos têxteis, tais como micro/nanocápsulas para agentes bioativos, que podem conferir uma grande variedade de propriedades funcionais aos substratos onde são incorporadas, como por exemplo: propriedades anti estáticas, antioxidantes, antimicrobianas, prebióticas e neutralizadoras de odores. Neste projeto, as proteínas do soro de leite foram usadas para encapsular compostos bioativos hidrofóbicos, como a Vitamina E, combinando a capacidade antioxidante de ambos, que foi maximizada com sucesso através de um planeamento fatorial. Estas emulsões foram caracterizadas e utilizadas para revestir substratos têxteis através de foulardagem. O revestimento das fibras foi observado por SEM, e a presença de novos grupos amina nas fibras, provenientes das proteínas, foi confirmada através da técnica de Acid Orange , mesmo após um ciclo de lavagem. No entanto, as propriedades antioxidantes acrescidas aos substratos e confirmadas pelo ensaio de descoloração do ABTS•+ não resistiram ao primeiro ciclo de lavagem. Em alguns casos, a capacidade antioxidante acrescida aos substratos, antes da lavagem, foi suficiente para proteger nódoas coloridas da fotodegradação, quando expostas a radiação UV, indicando uma potencial aplicação destas formulações em têxteis com proteção da coloração à radiação UV. Palavras chave: Antioxidantes; Micro/Nanoencapsulação; Proteínas do soro de leite; Têxteis. vi Valorization of dairy industry by-products as encapsulating agents Abstract In the cheese industry, milk processing creates a byproduct from which high-value components can be extracted, the cheese whey. Therefore, their application in other industry sectors is gaining new importance. Whey powder contains about 12 % of proteins, that can be further processed and reach 80 and 90 % of protein content (whey protein concentrates and isolates, respectively). Their valorization pathways can be accomplished as textile finishing technologies, such as micro/nanoencapsulation devices, for bioactive compounds, that can provide a variety of functional properties, such as anti-static, antioxidant, antimicrobial, prebiotic and odor neutralization. In this project, whey proteins have been used to encapsulate hydrophobic bioactive compounds, such as vitamin E, combining their antioxidant activity, which was successfully optimized with an experimental design. These emulsions were used to coat fabrics through the pad-dry-cure technique. The coating of the fibers was observed by SEM, and the presence of new amine groups, from protein, was confirmed with the Acid Orange assay, even after one washing cycle. Although, according to the ABTS•+ decoloration assay, the antioxidant properties acquired by textiles were not maintained after one washing cycle. In some cases, the antioxidant properties acquired by the textiles, before washing, were strong enough to protect colored stains from photodegradation under UV light exposition, indicating a potential application of these formulations into textiles with UV light protected coloration. Key-Words: Antioxidants; Micro/Nanoencapsulation; Textiles; Whey Proteins. vii Índice Agradecimentos ........................................................................................................................ iii Resumo ..................................................................................................................................... v Abstract .................................................................................................................................... vi Lista de Abreviaturas e Símbolos ................................................................................................ x Lista de Figuras ....................................................................................................................... xii Lista de Tabelas ...................................................................................................................... xvi Lista de Equações .................................................................................................................. xvii 1 Introdução ....................................................................................................................... 1 1.1 Apresentação da empresa e contextualização do projeto ........................................... 1 1.2 Impacto socioeconómico da indústria do leite ........................................................... 2 1.3 O leite – Composição nutricional e proteica .............................................................. 3 1.4 Do fabrico do queijo ao soro de leite ........................................................................ 4 1.5 Processamento do soro de leite ............................................................................... 6 1.6 Propriedades funcionais das proteínas do soro de leite ............................................. 8 1.6.1 Proteínas do soro de leite como agentes encapsulantes ........................................ 9 1.7 Produção de novos materiais funcionais ................................................................. 11 1.7.1 Cosmetotêxteis .................................................................................................. 12 1.8 Objetivos do trabalho ............................................................................................. 14 2 Secção experimental ..................................................................................................... 15 2.1 Lista de reagentes ................................................................................................. 15 2.2 Preparação de soluções de trabalho das várias frações proteicas ............................ 16 2.2.1 Desnaturação das proteínas por efeito do solvente.............................................. 16 xiv através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Fisher para comparações. Os asteriscos indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o WPC80 nativo. ........................................ 44 Figura 34. Caracterização do potencial zeta das emulsões preparadas a partir de WPC80 nativo ou desnaturado por si só e com 0,3 % de VE ou OEO. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Fisher para comparações. Os asteriscos indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o WPC80 nativo. ......................................................... 44 Figura 35. Análise morfológica do substrato CO não funcionalizados (A e B), funcionalizados com WPC80 (C e D) e com WPC80_VE (E e F). A análise foi realizada por microscopia eletrónica de varrimento, em A, C e E ampliação 1000x e em B, D e F ampliação 5000x. ........................................................ 46 Figura 36. Análise morfológica das fibras de PES do substrato CO-PES não funcionalizados (A e B), funcionalizados com WPC80 (C e D) e com WPC80_VE (E e F). A análise foi realizada por microscopia eletrónica de varrimento, em A, C e E ampliação 1000x e em B, D e F ampliação 5000x. ................. 47 Figura 37. Morfologia das partículas de WPC80 observadas na fratura do revestimento das fibras de PES. Ampliação 100 000x. ......................................................................................................... 48 Figura 38. Fotografias dos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com algumas das formulações, após incubação com o corante Acid Orange . ................................................................ 49 Figura 39. Quantificação espetrofotométrica de aminas nos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com as diversas formulações, antes e após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Sidak para comparações. Os asteriscos e cardinais indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o branco, antes e após a primeira lavagem, respetivamente. ................................................................................................... 49 Figura 40. Potencial antioxidante dos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com as várias emulsões produzidas, antes e após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Sidak para comparações. Os asteriscos e cardinais indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o branco, antes e após a primeira lavagem, respetivamente. ................................................................................................................................ 51 Figura 41. Capacidade desodorante dos substratos funcionalizados após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Tukey para comparações múltiplas. Letras diferentes (minúsculas em CO e maiúsculas em CO-PES) representam diferenças significativas (p < 0,05). ................................................................................................... 52 Figura 42. Fotografias de alguns dos tecidos manchados sob luz visível (A) e sob luz UV (B). 53 xv Figura 43. Avaliação da solidez de cor dos substratos manchados com RhdB, após 12 h de exposição à luz UV............................................................................................................................ 53 Figura 44. Espetro de absorção nas regiões ultravioleta e visível do ABTS•+, acertando-se a absorvância a 734 nm para 0,7. ....................................................................................................... 64 Figura 45. Reta de calibração da absorvância do ABTS•+ ao longo do ensaio de determinação do potencial antioxidante. ...................................................................................................................... 65 Figura 46. Espetros da Função de Remissão de Kubelka-Munk do substrato CO funcionalizado com as diversas formulações e manchados com RhdB. Antes (A) e após 12 h de exposição à luz UV (B). ........................................................................................................................................................ 68 Figura 47. Espetros da Função de Remissão de Kubelka-Munk do substrato CO-PES funcionalizado com as diversas formulações e manchado com RhdB. Antes (A) e após 12 h de exposição à luz UV (B). ..................................................................................................................................... 69 xvi Lista de Tabelas Tabela 1. Composição média do soro de leite doce e do soro de leite ácido [23], [26] ............. 5 Tabela 2. Composição nutricional típica de WPC80 e WPI comerciais [27] .............................. 8 Tabela 3. Comparação de diferentes métodos de encapsulação, recorrendo à β-Lg como agente encapsulante [36] .............................................................................................................................. 9 Tabela 4. Lista de reagentes e respetivos fornecedores utilizados neste trabalho ................... 15 Tabela 5. Matriz de ensaios usada para o planeamento fatorial de otimização da atividade antioxidante das emulsões. A vermelho estão os pontos do primeiro bloco de pontos iniciais (1 ao 11) e a azul o bloco com os pontos do design aumentado de faces centradas (12 ao 19) ........................... 24 Tabela 6. Atividade antioxidante, tamanho hidrodinâmico, Đ e potencial zeta de cada ponto do planeamento fatorial para a otimização da atividade antioxidante. A vermelho estão os pontos do primeiro bloco de pontos iniciais (1 ao 11) e a azul o bloco com os pontos do design aumentado de faces centradas (12 ao 19) ........................................................................................................................................ 36 Tabela 7. Análise de variâncias para um modelo quadrático reduzido, aplicando aos dados a transformação 𝑦′=𝑦+𝑘,𝑐𝑜𝑚 𝑘=0 .......................................................................................... 37 Tabela 8. Estatística do ajuste, resumindo a sua qualidade ................................................... 38 Tabela 9. Equação do modelo quadrático .............................................................................. 38 Tabela 10. Taxa de formação de cápsulas para as formulações de WPC80 nativo ................. 42 Tabela 11. Taxas de expressão de cada amostra em cada substrato ..................................... 45 Tabela 12. Amostras exemplo para o cálculo da % de inibição do ABTS•+ .............................. 64 Tabela 13. Área dos picos obtidos para a amostra controlo - exemplo para cálculo ................ 66 Tabela 14. Determinação da média, desvio padrão e erro associado ao cálculo da % de redução (ORR) ............................................................................................................................................... 66 Tabela 15. Valor de % Redução obtido para o controlo CO-PES.............................................. 67 xvii Lista de Equações Equação 1. Capacidade de carga. ........................................................................................ 10 Equação 2. Taxa de formação de cápsulas. .......................................................................... 18 Equação 3. Equação de Stokes-Einstein. ............................................................................... 19 Equação 4. Equação de Henry. ............................................................................................ 20 Equação 5. Cálculo da percentagem de inibição do ABTS•+. ................................................. 23 Equação 6. Taxa de expressão de um acabamento num substrato têxtil. ............................... 26 Equação 7. Fórmula de Abbe para o cálculo do limite de resolução de um microscópio. ....... 28 Equação 8. Cálculo da percentagem de redução do odor de um marcador odorífero. ............ 29 Equação 9. Conversão da refletância difusa em unidades de absorvância, pelo função de remissão de Kubelka-Munk. .............................................................................................................. 32 Equação 10. Cálculo da percentagem de redução da nódoa após exposição à luz UV. .......... 32 Equação 11. Área média dos picos. ..................................................................................... 66 Equação 12. Desvio padrão em torno da média. .................................................................. 67 Equação 13. Erro acumulado na subtração. ......................................................................... 67 Equação 14. Subtração da área do controlo. ........................................................................ 67 Equação 15. Erro acumulado no quociente. ......................................................................... 67 1 1 Introdução 1.1 Apresentação da empresa e contextualização do projeto Este trabalho foi desenvolvido no Centro de Nanotecnologia, Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes (CeNTI), um instituto privado de investigação e desenvolvimento tecnológico (I&DT), com enfoque na criação de novos materiais com valor acrescentado para o mercado. O CeNTI acumula 12 anos de atividade e surge como uma parceria entre três universidades (Universidade do Minho, Universidade do Porto e Universidade de Aveiro), dois centros tecnológicos (Centro Tecnológico das Indústrias Têxtil e do Vestuário de Portugal e o Centro Tecnológico das Indústrias do Couro) e um instituto de novas tecnologias (Centro para a Excelência e Inovação na Indústria Automóvel), dando apoio direto aos setores industriais, tanto em projetos nacionais como europeus [1]. Neste âmbito surge então o projeto mobilizador TexBoost - less Commodities more Specialities , uma parceria entre mais de 40 entidades, sendo a maioria empresas de toda a fileira têxtil. O projeto divide-se em 6 Produtos, Processos e Serviços (PPS), onde surge o PPS5 – Economia Circular, que visa satisfazer a crescente apetência dos consumidores por produtos ambientalmente mais responsáveis, a par de uma legislação cada vez mais restrita a nível da sustentabilidade e impacto ambiental dos processos industriais. Torna-se por isso fundamental apostar numa estratégia assente na valorização de resíduos e subprodutos de outras indústrias, numa perspetiva de simbiose industrial [2]. Desta forma, o principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de agentes encapsulantes, com base na valorização de subprodutos da indústria dos laticínios e com potencial para o desenvolvimento de têxteis funcionais. Esta estratégia enquadra-se numa perspetiva de economia circular, sustentabilidade ambiental e desenvolvimento de novos materiais funcionais. 2 1.2 Impacto socioeconómico da indústria do leite Há já vários milénios que o leite de outros mamíferos está fortemente enraizado na nossa dieta, apesar de atualmente haver alguma controvérsia no que toca aos seus benefícios. Durante muito tempo o leite foi considerado um dos alimentos nutricionalmente mais completo e equilibrado [3], recomendando ainda a Associação Portuguesa dos Nutricionistas (APN) o consumo de 2 a 3 porções diárias de leite ou seus derivados [4]. Desde 2005, o consumo anual de leite, per capita , tem aumentado gradualmente, a par do aumento da população mundial, exigindo-se por isso um aumento da produção. Estima-se que em 2018 tenham sido produzidas, mundialmente, 827 milhões de toneladas de leite, revelando um aumento de mais de 170 % desde os anos 80, sendo os países em desenvolvimento os maiores responsáveis por esta expansão. A Índia é o maior produtor mundial de leite, à frente de países como os Estados Unidos da América, China e Brasil [5]. Cerca de 83 % do leite produzido mundialmente é de origem bovina, recorrendo-se ainda ao leite de búfalo, cabra, ovelha e camelo, entre outros menos recorrentes. Apesar de em 2015 grande parte do leite produzido se destinar à troca informal direta entre produtores e consumidores locais, estima-se que o restante seja igualmente distribuído pelas indústrias dos produtos frescos, manteigas e queijos (Figura 1) [6]. 46,00% Mercado informal 17,00% Produtos frescos 15.00% Manteiga 13,00% Queijo 4,00% Leite em pó 3,00% Leite magro em pó 2,00% Outros Figura 1. Consumo mundial de leite e produtos lácteos em 2015 [6]. 3 1.3 O leite – Composição nutricional e proteica O leite é uma suspensão coloidal segregada pelo tecido epitelial das glândulas mamárias das fêmeas de mamíferos, não só para alimentar os seus neonatos com todos os nutrientes essenciais, mas também para lhes transmitir alguma imunidade durante os seus primeiros meses de vida. Como tal, o leite é muito rico em água e outras biomoléculas (Figura 2), como uma grande variedade de lípidos e proteínas, blocos de aminoácidos, carboidratos (lactose), vitaminas, sais minerais, entre outros micronutrientes [3], [7]. As proteínas são o componente com maior variedade no leite dividindo-se em duas grandes subclasses, as caseínas e as proteínas do soro, que no leite bovino aparecem, frequentemente, numa proporção de 4 para 1 (Figura 3). Ao pH habitual do leite (pH ≈ 6,6) a maioria destas proteínas apresenta carga superficial negativa, o que melhora a sua estabilidade em suspensão devido a repulsões eletrostáticas [7]–[10]. As caseínas (CN), apresentam-se principalmente sob quatro formas – αS1-, αS2-, βe κ-CN – e são sintetizadas exclusivamente nas glândulas mamárias. Para além de serem uma forte fonte de aminoácidos para o neonato, são também responsáveis pelo seu elevado teor em cálcio, pois formam partículas coloidais altamente hidratadas - as micelas de caseína - com tamanhos entre os 50 e 500 nm, capazes de encapsular sais minerais divalentes e multivalentes, como o fosfato de cálcio [3], [8], [9], [11], [12]. As proteínas do soro são uma variada classe de proteínas globulares, maioritariamente β-lactoglobulina (β-Lg) e α-lactalbumina (α-La) – produzidas nas glândulas mamárias – e também albumina, lactoferrina (Lf), imunoglobulinas (Ig), entre outras, provenientes do plasma sanguíneo [8]. Sabe-se que a α-La é uma pequena metaloproteína, cuja função nas glândulas mamárias é atuar como coenzima da lactose sintase, 87,00 % Água 4,70 % Lactose 4,00 % Gordura 3,50 % Proteínas 0,80 % Resíduo Seco Figura 2. Composição nutricional média do leite bovino fresco [7]. Caseínas Proteínas do Soro 0 20 40 60 80 100 Percentagem -caseína -caseína S1-caseína S2-caseína -lactoglobulina -lactalbumina Imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) Albumina sérica Lactoferrina Outras Figura 3. Composição proteica habitual do leite bovino [9]. 4 modelando por isso a síntese de lactose [13]. A Lf é uma glicoproteína pertencente à família das transferrinas, que para além de ser uma fonte de ferro, apresenta propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias, anticancerígenas e imunomodulatórias [14], [15]. As Ig transferem, de forma passiva e temporária, o repertório imunitário da mãe para o recém-nascido [16]. Embora não haja consenso quanto às funções das restantes proteínas do soro, sabe-se que tanto a β-Lg como a albumina sérica apresentam a capacidade de ligação a moléculas hidrofóbicas com importantes funções biológicas, tais como ácidos gordos e vitaminas, atuando por isso como os seus veículos naturais [11], [17]–[20]. 1.4 Do fabrico do queijo ao soro de leite O queijo é uma variada classe de produtos derivados de leite fermentado. O seu fabrico consiste na precipitação das caseínas e gorduras, induzida pela acidificação do meio e/ou pela adição de agentes coagulantes, como enzimas, que levam à formação de coalhos, que são separados do líquido remanescente – o soro de leite ou lactosoro –, salgados, moldados e, em alguns casos, amadurecidos até atingirem os padrões desejados (paladar, cor, textura, etc. ) (Figura 4). A acidificação do meio, a redução do conteúdo em água e adição de sal contribuem para a conservação dos constituintes do queijo [21]. De 2005 a 2014 a indústria do queijo cresceu mais de 20% e, segundo a European Whey Processors Association (EWPA), a cada quilo de queijo produzido são gerados em média 0,56 kg de lactosoro em pó, cuja composição é uma mistura complexa de lactose e lactato, proteínas do soro, lípidos e sais minerais [6], [22]. Dependendo do processo usado no fabrico do queijo, a proporção entre os componentes do soro pode variar, classificando-se habitualmente o soro em duas classes, o doce e o ácido. O soro doce é o resultado do fabrico de queijo através da adição de coagulantes enzimáticos, como a renina. Este é o método usado para produzir a maioria dos queijos que são sujeitos a amadurecimento. O soro ácido provém dos queijos produzidos por acidificação do meio e, normalmente, são consumidos frescos. As principais diferenças entre o soro doce e ácido encontram-se descritas na Tabela 1 [23]. Figura 4. Representação genérica do processo de fabrico do queijo através do leite, originando soro de leite como subproduto [21]. 5 Há cerca de 50 anos atrás o soro de leite era considerado um resíduo do processamento do queijo e descartado no solo [22], [24]. No entanto, devido à grande quantidade de matéria orgânica que o compõe, a sua carência química de oxigénio é bastante elevada (50-102 g/L), tornando-o num resíduo bastante poluente, que altera drasticamente a composição dos solos e a quantidade de oxigénio dissolvida na água, afetando tanto o setor agrário, como a vida aquática [25]. Tabela 1. Composição média do soro de leite doce e do soro de leite ácido [23], [26] Constituintes Soro de leite doce (g·L-1) Soro de leite ácido (g·L-1) Sólidos totais 63,0 – 70,0 63,0 – 70,0 Lactose 46,0 – 52,0 44,0 – 46,0 Proteína 6,0 – 10,0 6,0 – 8,0 Gordura 5,0 0,4 Lactato 2,0 6,4 Resíduo Seco 5,0 8,0 Cálcio 0,4 – 0,6 1,2 – 1,6 Fosfato 1,0 – 3,0 2,0 – 4,5 Cloreto 1,1 1,1 pH 6,0 – 7,0 < 5,0 Atualmente, é possível recorrer a processos biotecnológicos para recuperar produtos com uma elevada concentração de proteínas do soro, com um elevado valor nutricional e económico acrescentado, tornando-o assim num subproduto e não num resíduo. Estes produtos apresentam a vantagem de serem Generally Recognized as Safe (GRAS), pela Food and Drug Administration (FDA), tornando-os uma excelente fonte de aminoácidos essenciais (cisteína e aminoácidos de cadeia ramificada – leucina, isoleucina e valina) e fatores de crescimento, propriedades importantes para a dieta de certos grupos, como crianças, idosos e desportistas [27]. Para além disso, o soro de leite contém vários agentes que promovem o crescimento de bifidobactérias, essenciais para o bom funcionamento da flora intestinal e maturação do sistema imunitário. Estando também descritos efeitos antienvelhecimento devido a agentes antioxidantes, anticancerígenos, anti-hipertensivos e anti-inflamatórios [18], [24], [28]. 6 1.5 Processamento do soro de leite O primeiro passo no processamento do soro de leite é a remoção dos últimos vestígios de caseínas e gorduras, que não precipitaram no fabrico do queijo, através de filtrações e centrifugações. Este processo é conhecido por clarificação. Um procedimento opcional é a descoloração do anato e/ou outros corantes utilizados no fabrico do queijo. Posteriormente, o soro deve ser refrigerado ou pasteurizado, conforme o tempo de armazenamento seja curto ou longo, respetivamente. O processamento mais simples é a concentração dos sólidos totais, através de evaporadores, osmose reversa e/ou secagem por pulverização, formando o soro de leite em pó [27]. Sendo a lactose o composto mais abundante do soro é possível isolá-la através de cristalização controlada e centrifugações, obtendo-se frações com elevado grau de pureza, interessantes para a indústria farmacêutica, e até mesmo para a produção de etanol ou outros metabolitos, recorrendo a processos fermentativos [27]. Também é possível recorrer a ultrafiltrações com cutoff molecular e a pH específicos, para fracionar individualmente as proteínas do soro com elevado grau de pureza, nomeadamente α-La e βLg, entre outras. Este processo encontra-se esquematizado na Figura 5 e baseia-se no facto de cada proteína ter o ponto isoelétrico a um pH característico permitindo a sua agregação e precipitação individual [23]. Produtos com menor grau de pureza, mas com idêntico valor acrescentado podem ser obtidos por simples ultrafiltrações, originando concentrados de proteína do soro entre os 34 e 50 % (WPC34 e Figura 5. Fracionamento sequencial das proteínas do soro, recorrendo a filtros de membrana com cutoff molecular específico e a pH apropriado [23]. 13 300 bar, e com 212 nm a uma pressão de 1200 bar. O aumento de pressão também tornou a distribuição de tamanhos mais estreita, observada por uma diminuição da dispersividade (Đ) de 0,39 para 0,18. Estes autores observaram que a presença de VE nas várias formas estudadas fez aumentar o tamanho das partículas e tornou a sua carga de superfície ainda mais negativa, explicado por um possível inchaço das cápsulas, resultado de um aumento das forças repulsivas entre aminoácidos no interior das estruturas devido à encapsulação da VE [55]. Outras fontes de compostos antioxidantes são os óleos essenciais naturais extraídos das folhas, flores, raízes, frutos, troncos e resinas de algumas ervas ou plantas. Estes extratos são complexas misturas de hidrocarbonetos aromáticos, tais como terpenos, álcoois, ésteres, aldeídos, cetonas, óxidos e fenóis. Mesmo um óleo essencial simples pode conter 80 a 300 espécies químicas diferentes. Para além das suas propriedades terapêuticas variadas, como analgésica, anti-inflamatória, antimicrobiana, antioxidante, etc ., estes extratos são altamente aromatizados e as suas fragâncias podem ser usados em aromaterapia, estando-lhes associados vários benefícios físicos e psicológicos, e até de repelência a insetos. Portanto a sua aplicação em estruturas têxteis pode acrescer diversas funcionalidades interessantes, no entanto, dada a elevada volatilidade dos compostos, a sua libertação do têxtil é muito acelerada, havendo vários estudos no sentido de os encapsular para diminuir a sua velocidade de libertação, aumentando a durabilidade das funcionalidades [56], [57]. O óleo essencial de orégãos (OEO) é conhecido pelo seu característico aroma e poderosa atividade antioxidante e antimicrobiana, os compostos mais abundantes neste óleo são dois monoterpenos fenólicos, o carvacrol (Figura 9A) e o timol (Figura 9B), que compõe cerca de 78 a 82 % do óleo e são responsáveis pelo seu odor característico e propriedades terapêuticas [58], [59]. O OEO pode ser usado como conservante na indústria alimentar, pois as suas propriedades antimicrobianas e antioxidantes previnem o crescimento de microrganismos e a formação de espécies reativas que conduzem à oxidação dos nutrientes, atrasando assim a deterioração dos alimentos durante o armazenamento [60]. Outros estudos apontam para propriedades antifúngicas, inseticidas e neuroprotetoras [61]. Em 2006, Baranauskiené e seus colegas encapsularam com sucesso OEO com WPC, através de homogeneização de alta velocidade, obtendo microcápsulas com 17,5 μm e uma eficiência de encapsulação de 71,8 % [62]. Figura 9. Estrutura molecular dos compostos mais abundantes no óleo essencial de orégão: (A) carvacrol e (B) timol. 14 1.8 Objetivos do trabalho O principal objetivo deste projeto de investigação centrou-se na valorização do soro de leite como agente encapsulante de compostos bioativos com propriedades antioxidantes, tais como a VE e o óleo essencial de orégão. Para tal, pretendeu-se estudar as propriedades emulsionantes de várias frações de proteína do soro com diferentes graus de pureza, bem como as condições ótimas que conduziam à maximização da sua atividade antioxidante. Posteriormente procurou-se desenvolver a aplicação dessas formulações em substratos têxteis, de forma a obter têxteis funcionais com valor acrescentado, devido às propriedades intrínsecas das proteínas do soro de leite e dos agentes encapsulados. Esperava-se com este trabalho adquirir soluções têxteis com elevado potencial antioxidante, de forma a poder explorar-se, no futuro, os seus benefícios para a saúde da pele. Por outro lado, pretendiase também verificar se o potencial antioxidante dos substratos era capaz de atrasar a fotodegradação causada pela radiação UV, protegendo a coloração dos tecidos dos danos causados por este tipo de radiação. Um desafio inerente a este projeto foi averiguar e tentar melhorar a resistência das funcionalidades acrescidas à lavagem doméstica. 15 2 Secção experimental 2.1 Lista de reagentes Na Tabela 4 encontra-se uma lista de todos os reagentes utilizados neste trabalho e seus respetivos fornecedores. Tabela 4. Lista de reagentes e respetivos fornecedores utilizados neste trabalho Azida de Sódio Acros Organics Alaranjado isolan K-RLS 150 % granulado DyStar Óleo essencial de hortelã-pimenta F.J. Campos β-Lactoglobulina Fração extraída e fornecida pela Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica no âmbito do projeto TexBoost Fosfato dipotássico Merck Concentrado de proteína do soro de leite (WPC80) Nutripar Isolado de proteína do soro de leite (WPI) Óleo essencial de árvore do chá Oils4life Óleo essencial de lúpulo Óleo essencial de romã Fosfato monopotássico PanReac AppliChem Óleo essencial de alecrim Plena Natura Óleo essencial de eucalipto-limão Óleo essencial de gengibre Óleo essencial de orégão Detergente padrão fosfatado B SDS Enterprises Limited Vitamina E Sigma-Aldrich Reagente de Bradford Radical 2,2’-azino-bis-(6-sulfonato de 3-etilbenzotiazolina) Persulfato de potássio Ligante X Ácido isovalérico Rodamina B 16 2.2 Preparação de soluções de trabalho das várias frações proteicas Prepararam-se soluções aquosas de WPC80, WPI e β-Lg a 10 e 20 % (m/V). Estas soluções foram preparadas com 0,02 % de azida de sódio (NaN3) de modo a prevenir o crescimento microbiano. Para tal pesaram-se 25 e 50 g, respetivamente, de cada fonte proteica e 50 mg de azida de sódio (NaN3), que foram dissolvidos em 250 mL de água destilada, com agitação magnética durante, aproximadamente, 4 h, de forma a promover a hidratação completa das proteínas. As soluções foram devidamente rotuladas e conservadas a 4 °C, até serem necessárias. 2.2.1 Desnaturação das proteínas por efeito do solvente De acordo com Nikolaidis e seus colegas, várias pesquisas apontam para que os álcoois sejam capazes de induzir a desnaturação das proteínas. No caso específico das proteínas do soro de leite os seus estudos apontam para um efeito máximo a cerca de 50 % (V/V) de etanol. Mais ainda, mesmo após remoção do etanol por evaporação ou redução do seu conteúdo por diluição, a desnaturação não se reverte por completo [39], [63]. Neste trabalho, o processo de desnaturação das proteínas foi realizado através da adição de etanol a soluções aquosas de proteína. Para isso, dissolveram-se 10 g de proteína e 2 mg de NaN3 em 50 mL de água destilada e após 4 h de agitação magnética adicionaram-se 50 mL de etanol absoluto, de forma a obter uma solução de 10 % (m/V) de proteína em etanol 50 % (V/V). Esta mistura foi deixada em agitação magnética durante aproximadamente mais 4 h. Posteriormente, recorreu-se a um evaporador rotativo (Figura 10) para evaporar o etanol, aquecendo-se a mistura a 65 °C e a uma pressão de 70 mbar. Após a evaporação perfez-se o volume inicial de 100 mL com água destilada, de forma a obter uma solução de proteína desnaturada a 10 % (m/V). Figura 10. Evaporador rotativo utilizado no processo de desnaturação das proteínas. 17 2.3 Preparação das formulações de proteína com incorporação de vitamina E ou óleo essencial por ultrassonicação Todas as emulsões foram preparadas por simples mistura das frações proteicas preparadas anteriormente (nativas ou desnaturadas) com os óleos desejados, nas proporções pretendidas. Posteriormente, cada mistura foi emulsionada através de ultrassonicação, com a sonda UIP1000hdT (1000 W, 20 kHz) da hielscher , a 100 % de amplitude, e pelos períodos pretendidos (Figura 11). Durante a irradiação as amostras forma mantidas em banho de gelo para contornar o aquecimento causado pelos ultrassons, no final todas as amostras foram centrifugadas a 9000 rpm por 15 min, de forma a remover os fragmentos libertados pela sonda. A irradiação com ultrassons destabiliza a interface entre duas fases imiscíveis, gerando um excesso de energia que possibilita a formação de novas interfaces, permitindo a dispersão de gotas de uma das fases pela outra, mesmo sem a adição de emulsionantes ou surfactantes. As ondas de ultrassons criam sucessivamente forças de rarefação e compressão, que expandem e contraem as gotas dispersas, respetivamente, até estas atingirem um tamanho crítico e colapsarem, criando localmente condições de pressão e temperatura muito elevadas, agitação e ondas de choque, um fenómeno conhecido por cavitação acústica que leva à fragmentação das bolhas em partículas de tamanhos mais reduzidos. A emulsificação ultrassónica apresenta várias vantagens relativamente a outros processos, tais como homogeneizações de alta pressão ou de alta velocidade. Para além de ser mais simples, rápida e económica, facilmente se ajusta o tamanho das partículas formadas alterando simples parâmetros de irradiação, como o tempo de exposição, a frequência, a amplitude e a potência da radiação [64], [65]. Figura 11. Sonda de ultrassons usada para produzir as emulsões. 18 2.4 Caracterização das emulsões 2.4.1 Rendimento de formação de partículas Para determinar a taxa de formação de cápsulas, procedeu-se à separação das partículas dos restantes reagentes livres, para tal recolheram-se alíquotas das amostras, que foram centrifugadas com Amicons ™ de 30 kDa ( MilliporeSigma ™) durante 10 min a 5000 rpm, numa centrífuga 2-16K da Sigma . A concentração de proteína livre nos filtrados foi determinada pelo método de Bradford, um método simples e de alta sensibilidade para a quantificação de proteínas em solução. Para tal, 100 μL de cada amostra foram colocados em triplicado numa placa de 96 poços, bem como vários pontos de uma reta de calibração de proteína e, a cada um, adicionaram-se 100 μL de reagente de Bradford. A placa foi mantida ao abrigo da luz e incubada numa estufa a 37 °C, durante 30 min. Por fim, leu-se a absorvância de cada poço a 595 nm com um leitor de microplacas Spectra max plus 384 da Molecular Devices (Figura 12), contruindo-se uma reta de calibração e extrapolando a partir daí a concentração de proteína em cada amostra. Este ensaio baseia-se no desvio do pico de absorvância do corante Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG), presente no reagente de Bradford, quando este se liga a proteínas. Na sua forma aniónica livre este apresenta um pico máximo de absorvância a 470 nm que se desvia para os 595 nm aquando da sua ligação aos resíduos de arginina, triptofano, tirosina, histidina e/ou fenilalanina das proteínas em solução [66]. Sabendo-se a concentração inicial de proteína (Pi) e a concentração de proteína livre nos filtrados (Pl), determinou-se a taxa de formação de cápsulas através da Equação 2. 𝑇𝑎𝑥𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑐á𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑠 =[𝑃𝑖]−[𝑃𝑙] [𝑃𝑖]×100 Equação 2 Figura 12. Leitor de microplacas utilizado na quantificação de proteínas, pelo método de Bradford. 19 2.4.2 Tamanho hidrodinâmico O tamanho hidrodinâmico das partículas foi avaliado pela técnica de dispersão dinâmica de luz (DLS), que permite analisar a distribuição de tamanhos médios de partículas numa suspensão. Para tal a amostra é atingida por um feixe laser monocromático e a cada vez que este atinge uma partícula sofre dispersão em todas as direções, gerando-se interferências destrutivas e construtivas. As interferências construtivas são registadas por um detetor em intervalos de tempo regulares e um correlador relaciona as flutuações de sinal com o movimento browniano das partículas e, por sua vez, com o seu tamanho. Partículas menores apresentam movimentos brownianos mais rápidos, gerando mais flutuações no sinal, ao passo que partículas maiores se movem mais lentamente, diminuindo a frequência das flutuações do sinal. Como o movimento browniano das partículas é traduzido pelo seu coeficiente de difusão translacional (Dτ), é possível calcular o seu raio hidrodinâmico (Rh), recorrendo à equação de StokesEinstein (Equação 3), onde kB é a constante de Boltzman, T a temperatura absoluta e η a viscosidade do meio [67]. 𝐷𝜏 = 𝑘𝐵𝑇 6𝜋𝜂𝑅ℎ Equação 3 Recorrendo a vários algoritmos esta técnica permite obter distribuições de tamanho, volume e número em função da intensidade de luz dispersa. Mais ainda, através da análise de cumulantes e assumindo um sistema unimodal, é possível obter informação acerca da dispersividade (Đ), que traduz a largura adimensional de uma distribuição gaussiana aplicada aos dados. Valores de Đ altos indicam sistemas polidispersos enquanto que valores mais próximos de zero indicam sistemas monodispersos. A polidispersão pode ser indicativa de agregação quando observada ao longo do tempo, ou então de um sistema multimodal, cuja medição do tamanho por DLS não é viável. Todas as análises foram realizadas num Zetasizer Nano - ZS90 (Figura 13), da Malvern Instruments , em cuvetes descartáveis (DTS0012), a 25 °C, com um tempo de equilíbrio de 120 segundos, diluindo as amostras para uma concentração de proteína de 1 g·L-1, com Figura 13. Instrumento de dispersão dinâmica de luz utilizado para determinar o tamanho hidrodinâmico e potencial zeta das partículas. 20 água (viscosidade 0,8872 cP e índice de refração 1,330). As medidas foram recolhidas a 90° e realizadas em triplicado. O número e duração de cada corrida, bem como da força do atenuador, foram deixados em modo automático e otimizados pelo equipamento a cada leitura. 2.4.3 Potencial zeta (ζ) O potencial zeta é uma medida indireta da carga superficial das partículas, o que permite retirar conclusões acerca da sua estabilidade em suspensão. Quanto maior for o módulo da sua carga e, por conseguinte, do potencial zeta, maiores serão as forças repulsivas entre as partículas e menor será a sua tendência para agregarem. Por norma convenciona-se que as partículas adquirem maior estabilidade quando o módulo do potencial zeta é superior a 30 mV. Este parâmetro é determinado através da aplicação de um campo elétrico de força conhecida na amostra e medindo a mobilidade eletroforética (Ue) das partículas, por Velocimetria Laser de Doppler (LDV), de onde se pode determinar o potencial zeta (ζ) através da equação de Henry (Equação 4), onde ε é a constante dielétrica do meio, η a viscosidade dinâmica do meio e [f(κa)] a função de Henry. 𝑈𝑒 = 2𝜀𝜁𝑓(𝜅𝑎) 3𝜂 Equação 4 A LDV recorre aos fenómenos de dispersão de luz para determinar a velocidade de partículas em movimento num fluído. Fazendo um feixe laser incidir nas partículas em movimento, as flutuações na intensidade do sinal de luz dispersa são registadas a 17° e a sua frequência é proporcional à velocidade das partículas (Figura 14). Como neste caso o movimento das partículas é causado pela aplicação de um campo elétrico externo, falamos de dispersão eletroforética de luz (ELS). Figura 14. Representação da célula e método utilizado para a medição do potencial zeta das emulsões [68]. 21 O potencial zeta não corresponde diretamente à carga superficial das partículas, mas sim ao potencial elétrico que existe no seu plano de cisalhamento hidrodinâmico. Este plano é uma barreira virtual entre os iões que se movem com a partícula e os restantes, uma vez que partículas carregadas têm adsorvidos à sua superfície uma bicamada elétrica, composta por uma primeira camada de contraiões fortemente aderidos à superfície da partícula, a camada de Stern, e uma segunda camada difusa de iões e contraiões, em equilíbrio e com maior mobilidade (Figura 15) [69], [70]. Figura 15. Representação esquemática de uma partícula com carga superficial positiva e da sua bicamada de interface composta por iões e contraiões do solvente. As análises foram realizadas num Zetasizer Nano - ZS90 (Figura 13), da Malvern Instruments , em cuvetes capilares descartáveis (DTS1060), a 25 °C, com um tempo de equilíbrio de 120 segundos, diluindo as amostras para uma concentração de proteína de 1 g·L-1, com água (viscosidade 0,8872 cP, índice de refração 1,330 e constante dielétrica 78,5). As medidas foram realizadas em triplicado. A diferença de potencial e força do atenuador foram otimizadas pelo equipamento para cada amostra. 2.4.4 Potencial Antioxidante O potencial antioxidante das várias amostras foi avaliado pelo ensaio espetrofotométrico de descoloração do radical 2,2’-Azino-bis-(6-sulfonato de 3-etilbenzotiazolina) (ABTS•+), adaptado de Re et al . 1999, com algumas modificações [71]. O ABTS é uma molécula incolor que se oxida na presença de persulfato de potássio (K2S2O8), originando um radical livre catiónico, o ABTS•+. Esta espécie química é 22 um cromóforo azul esverdeado com um espetro de absorção característico, com picos máximos de absorção a 415, 645, 734 e 815 nm (Figura 16). Figura 16. Espetro de absorção do ABTS•+ [71]. Na presença de espécies antioxidantes, de qualquer natureza química, o ABTS•+ é novamente reduzido a ABTS (Figura 17), havendo uma descoloração da solução, que pode ser espetrofotometricamente acompanhada pela consequente diminuição da intensidade dos picos de absorção previamente descriminados, relativamente ao espetro original. Figura 17. Reação de oxidação do ABTS pelo persulfato de sódio, gerando um radical catiónico com coloração azul esverdeada, e reversível redução por agentes antioxidantes. Para tal preparou-se uma solução mãe de ABTS•+, fazendo reagir o ABTS a 7 mM, com 2,45 mM de K2S2O8, em água ultrapura. Esta solução foi mantida no escuro durante um período mínimo de 16 h e a 4 °C. Posteriormente preparou-se a solução ABTS•+ de trabalho, diluindo a solução mãe em tampão fosfato (pH 7,4) e acertando a sua absorvância a 734 nm para 0,7, usando tampão fosfato como branco e recorrendo ao espetrofotómetro Lambda 35 UV/Vis Spectrometer (PerkinElmer, precisely) . Por fim, a 30 μL de cada emulsão adicionaram-se 3 mL da solução ABTS•+ de trabalho e mediu-se a absorvância 29 espetrofotometricamente a diminuição da concentração de corante no banho, que será proporcional à quantidade de grupos amina no têxtil. 2.8.3 Solidez da funcionalidade antioxidante após lavagem À semelhança do potencial antioxidante das emulsões, o potencial antioxidante dos substratos têxteis também foi avaliado pelo ensaio de descoloração ABTS•+ antes e depois da lavagem, prolongandose o tempo de reação para 12 min e fazendo 0,125 g de substrato reagir com 5 mL da solução de ABTS•+ de trabalho. Por fim leu-se a absorvância de cada amostra a 734 nm, num Lambda 35 UV/Vis Spectrometer (PerkinElmer, precisely) (Figura 23), calculando-se a percentagem de inibição do ABTS•+, tal como descrito na Equação 5. 2.8.4 Avaliação da capacidade desodorante Segundo resultados obtidos anteriormente no laboratório do CeNTI, sabe-se que a proteína do soro de leite, em estudo neste projeto, poderá fornecer aos têxteis propriedades desodorantes. Assim, com o intuito de avaliar se os substratos teriam multifuncionalidade, foi determinada a capacidade desodorante dos substratos têxteis funcionalizados, através de cromatografia gasosa (GC), seguindo uma adaptação da parte 3 da norma ISO 17299:2014 – Textiles: Determination of deodorant property — Part 3: Gas chromatography method. Com esta técnica é possível avaliar a capacidade de um têxtil reduzir odores desagradáveis, como o suor, seguindo a percentagem de redução de odor (ORR) (Equação 8), de um marcador odorífero sintético, contido na fase gasosa de um recipiente, com ou sem amostra teste, após um determinado período, onde 𝑥𝐶 corresponde à área média do pico do controlo e 𝑥𝐴 à área média do pico da amostra [73]. 𝑂𝑅𝑅=𝑥𝐶−𝑥𝐴 𝑥𝐶 × 100 Equação 8 Figura 23. Espetrofotómetro utilizado nos vários ensaios. 30 Para tal cortaram-se triplicados de cada amostra com uma determinada área definida, colocados numa estufa ventilada a 40 °C durante 2 h, em caixas de petri e guardados num exsicador até serem analisados. Para se proceder à análise, cada triplicado foi colocado num matraz de 500 mL previamente limpo com etanol, e vedados com uma película EVAL ® film e parafilme. Em cada matraz injetou-se um volume definido de marcador odorífero representativo do suor (ácido isovalérico) com uma seringa, evitando o contacto do marcador com a amostra, e selando novamente com parafilme. Após um período de contacto definido na norma, agitaram-se os matrazes vigorosamente e recolheu-se, com a ajuda de uma seringa, 1 mL da atmosfera de cada frasco, que foram imediatamente injetados no equipamento de cromatografia gasosa com detetor de ionização de chama (GC-FID) (Figura 24). O GCFID utilizado é constituído por uma coluna capilar apolar, da marca Teknokroma modelo Meta.X5 , com 50 m de comprimento, diâmetro interno de 0,20 mm e espessura do filme de 0,33 μm. Além disso o cromatógrafo possui um injetor do tipo “split/splitless” , regulado para uma razão de split de 1:5. A obtenção dos cromatogramas foi conseguida através do software GC Solution version 2.4 , específico da Shimadzu . As condições de temperatura utilizadas nos ensaios cromatográficos, são os definidos na norma. Foram utilizados fluxos de hidrogénio e ar sintético, sendo que o gás de arraste utilizado foi o hélio. Os picos referentes ao marcador odorífero obtidos em cada cromatograma foram integrados e as respetivas áreas calculadas, recorrendo-se posteriormente à Equação 8 para determinar a percentagem de redução do odor de cada amostra. No Anexo B – Cálculos da análise por cromatografia gasosa com deteção por ionização de chama (GC-FID) (página 66), encontra-se exemplificado o cálculo da ORR de uma das amostras, através das áreas dos picos obtidos no cromatograma, e dos respetivos erros associados. Figura 24. Equipamento de cromatografia usado no ensaio de determinação da capacidade desodorante. 31 2.8.5 Avaliação da solidez da coloração à radiação UV De forma a avaliar a aplicação das cápsulas antioxidantes como agentes protetores de radiação UV, realizou-se um ensaio experimental em que os substratos funcionalizados eram manchados com Rodamina B (RhdB) e determinado se conseguiam proteger a nódoa da sua fotodegração, quando exposta a radiação UV. Na Figura 25 é possível observar o espetro de absorção da RhdB na região do visível, onde se pode verificar a sua banda de absorção entre os 450 e os 600 nm. Desta forma, mancharam-se os diversos substratos com 30 μL de uma solução fresca de RhdB a 0,02 g·L-1, em seguida mediram-se os espetros de refletância difusa de cada nódoa, na região do visível, com recurso ao espetrofotómetro Lambda 35 UV/Vis Spectrometer (PerkinElmer) e uma esfera integradora. A cada análise o equipamento foi calibrado com um padrão certificado de refletância difusa da labsphere (SRS-99-010 AS-01160-060). Para facilitar o tratamento de resultados também se realizou o espetro de refletância de cada substrato não funcionalizado. As amostras foram então expostas à radiação UV, recorrendo a uma lâmpada de luz negra com 15 W de potência e a emitir a 365 nm (VDL15UV da HQ-Power™) a 1 cm de distância dos substratos. Ao fim de 12 h de exposição voltaram a medir-se os espetros de refletância difusa nas mesmas condições. Os espetros foram normalizados e converteram-se as percentagens de refletância em função de remissão de Kubelka-Munk, F(R), através da Equação 9, onde K e S são, respetivamente, as constantes de absorção e difusão características do material e R∞ a refletância difusa. 400 500 600 700 0,0 0,2 0,4 0,6 Comprimento de onda (nm) Absorvância Figura 25. Espetro de absorvância da Rodamina B a 0,02 g·L-1. 32 𝐹(𝑅)=𝐾 𝑆=(1−𝑅∞)2 2∙𝑅∞ Equação 9 Por fim, integraram-se as bandas de absorção dos 450 aos 650 nm, de forma a obter as suas áreas e calculou-se a percentagem de redução da nódoa ao fim das 12 h, através da Equação 10, onde Ai é a área da banda antes da exposição e Af a área da banda após 12 h de exposição à luz UV. % 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑑𝑢çã𝑜 𝑑𝑎 𝑁ó𝑑𝑜𝑎=𝐴𝑖−𝐴𝑓 𝐴𝑖 Equação 10 Nas Figuras 46 e 47 do Anexo C – Espetros do ensaio de avaliação da solidez da coloração à radiação UV (páginas 68 e 69), podem consultar-se os espetros da função de remissão de Kubelka-Munk, em função do comprimento de onda, utilizados para calcular a percentagem de redução das nódoas de RhdB nos tecidos funcionalizados. 33 3 Resultados e discussão Nesta secção serão apresentados e discutidos os resultados obtidos ao longo deste trabalho. Em primeiro lugar será apresentado um estudo preliminar das propriedades emulsionantes e antioxidantes de três frações diferentes de proteína do soro de leite, que serviu para se escolher a fração mais indicada para o restante trabalho. Em seguida será apresentado um estudo de otimização das condições experimentais, cujo objetivo era maximizar a atividade antioxidante das emulsões. Após esta otimização produziram-se diversas formulações, cuja caracterização será apresentada. Por fim, apresentar-se-á a caracterização de dois substratos têxteis diferentes, funcionalizados com as diversas formulações, bem como os testes a diferentes propriedades funcionais acrescidas e a sua resistência à lavagem. 3.1 Estudo preliminar da capacidade emulsionante e propriedades antioxidantes das diferentes fontes de proteína do soro Este ensaio foi conduzido com o objetivo de avaliar as propriedades emulsionantes das diferentes frações de proteína do soro (WPC80, WPI e β-Lg) com VE, de forma a selecionar as melhores formulações para prosseguir com outros estudos. Para tal preparam-se emulsões a 5,0 % (m/V) de cada fração proteica na ausência e na presença de 0,5 % (V/V) de VE, por ultrassonicação durante 15 min. Determinou-se o potencial antioxidante de cada formulação pelo ensaio de descoloração do ABTS•+, bem como o seu tamanho hidrodinâmico e potencial zeta, por DLS e ELS, respetivamente. A evolução do seu tamanho foi acompanhada ao longo de 90 dias, para se verificar a estabilidade das emulsões em solução. No gráfico de barras da Figura 26 pode observar-se o potencial antioxidante de cada emulsão preparada, com e sem VE. Verificou-se que na ausência de VE a fração β-Lg apresentava o potencial antioxidante mais elevado (95,52 %), comparativamente aos 66,37 % do WPC e 63,19 % do WPI. Este resultado já era de esperar, uma vez que a atividade antioxidante do soro de leite está maioritariamente associada ao grupo tiol livre da β-Lg, e esta fração é mais enriquecida nessa proteína [29]. 34 WPC80 WPI -Lg 0 20 40 60 80 100 % de Inibição do ABTS•+ sem VE 0,5 % VE a b bb aa Figura 26. Potencial antioxidante das emulsões de WPC80, WPI e β-Lg a 5 % (m/V) na ausência (a azul) e na presença de 0,5 % (V/V) (a vermelho) de vitamina E, produzidas por ultrassonicação durante 15 min. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Tukey para comparações múltiplas, letras diferentes representam diferenças significativas (p < 0,05). Quando se adicionou VE às emulsões, o potencial antioxidante da fração β-Lg não se alterou significativamente, provavelmente por já se encontrar no máximo de deteção do ensaio de descoloração do ABTS•+. A atividade antioxidante da fração de WPI também não foi significativamente melhorada pela adição da VE, o que se pode dever a baixa encapsulação durante a irradiação com ultrassons e posterior separação da VE durante a centrifugação. No entanto, a adição de VE à fração de WPC80 causou um aumento significativo, em cerca de 30 %, da atividade antioxidante, o suficiente para se tornar semelhante às formulações de β-Lg. Na Figura 27 pode observar-se a evolução do tamanho hidrodinâmico das emulsões formadas com proteína e VE ao longo de 90 dias, bem como a Đ associada e o potencial zeta de cada emulsão medido após a sua preparação. Todas as emulsões apresentaram potencial zeta negativo, pois as proteínas do soro de leite apresentam carga superficial negativa ao pH próximo da neutralidade. Portanto, seria ainda de esperar que com o aumento de pureza das frações proteicas, mais intenso fosse o potencial zeta. No entanto, isto só se verificou entre o WPC80 e o WPI, uma vez que o WPI tem maior percentagem de proteína e menos componentes na sua composição que possam interferir na carga. A fração de β-Lg apesar de ser a mais rica em proteína, apresentou o potencial zeta mais baixo, porque durante o processo de fracionamento se perdem outras proteínas que podem contribuir para uma carga superficial mais intensa. 35 1 dia 15 dias 30 dias 45 dias 60 dias 75 dias 90 dias 1 dia 15 dias 30 dias 45 dias 60 dias 75 dias 90 dias 1 dia 15 dias 30 dias 45 dias 60 dias 75 dias 90 dias 0 100 200 300 400 500 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Tamanho (nm) Dispersividade ✱ ✱ ns Đ 5% WPC - 0.5% VE 5% WPI - 0.5% VE 5% -Lg - 0.5% VE Dispersividade -40 -30 -20 -10 0 Potencial zeta (mV) Figura 27. Avaliação da estabilidade das emulsões através do seu tamanho hidrodinâmico e Đ ao longo de 90 dias e do seu potencial zeta. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Dunnett para comparações múltiplas, o asterisco indica diferenças significativas (p < 0,05) entre os dias 1 e 90 e ns diferenças não significativas (p > 0,05). Para além disso, como o potencial zeta é uma medida da estabilidade das partículas em suspensão, podemos afirmar que as partículas de WPI seriam as mais estáveis, seguidas das de WPC80 e por fim as de β-Lg. Seguindo a evolução do tamanho das partículas ao longo do tempo confirmam-se estes resultados, uma vez que as partículas de WPI foram as únicas que não sofreram alterações significativas de tamanho. As partículas de WPC80 manifestaram ligeiros aumentos de tamanho, já as de β-Lg sofreram grandes variações pois, como apresentaram um potencial mais baixo, terão maior probabilidade de sofrer agregação. Como as partículas se destinam à impregnação em substratos têxteis, a sua estabilidade em suspensão não é um fator crucial para o produto final, pois as partículas encontrarse-ão no estado sólido. No entanto, isto seria uma mais valia, pois permitiria que as partículas fossem preparadas com alguma antecedência, sem necessidade de serem imediatamente aplicadas nos substratos. Tendo em conta estes fatores e apesar das partículas de WPI apresentarem maior estabilidade, decidiu-se prosseguir o estudo de planeamento fatorial com o WPC80, pois as partículas formadas apresentaram maior atividade antioxidante, tamanhos ligeiramente menores (indicativo de maior afinidade pelos substratos têxteis) e associados a valores de Đ mais baixos, o que mostra maior homogeneidade na distribuição de tamanhos das partículas. Para além disso, trata-se de um produto com menor grau de pureza e, portanto, mais barato. 36 3.2 Planeamento fatorial para otimização da atividade antioxidante das formulações Seguindo a matriz de ensaios da Tabela 5 (ver secção 2.5, página 23), produziram-se então várias emulsões recorrendo à VE e ao WPC80, variando a concentração de cada um e o tempo de irradiação com ultrassons. O potencial antioxidante de cada emulsão foi determinado pelo ensaio de descoloração do ABTS•+ e encontram-se listados na Tabela 6, bem como o seu tamanho hidrodinâmico, Đ e potencial zeta. Tabela 6. Atividade antioxidante, tamanho hidrodinâmico, Đ e potencial zeta de cada ponto do planeamento fatorial para a otimização da atividade antioxidante. A vermelho estão os pontos do primeiro bloco de pontos iniciais (1 ao 11) e a azul o bloco com os pontos do design aumentado de faces centradas (12 ao 19) Ordem padrão % de Inibição do ABTS•+ Diâmetro hidrodinâmico (nm) Đ Potencial zeta (mV) 1 63,157 ± 0,011 194,0 ± 4,9 0,367 ± 0,011 -29,8 ± 1,5 2 61,255 ± 1,430 405,7 ± 6,4 0,155 ± 0,045 -20,8 ± 0,7 3 79,786 ± 0,369 281,3 ± 2,4 0,184 ± 0,158 -21,3 ± 0,2 4 51,664 ± 2,245 388,8 ± 8,5 0,200 ± 0,037 -21,4 ± 0,2 5 58,352 ± 5,292 130,3 ± 0,5 0,276 ± 0,014 -18,2 ± 0,7 6 88,224 ± 0,283 158,7 ± 0,7 0,254 ± 0,012 -25,3 ± 2,1 7 74,780 ± 1,242 320,9 ± 22,5 0,148 ± 0.131 -21,0 ± 0,8 8 90,567 ± 0,716 191,6 ± 5,6 0,236 ± 0,013 -25,5 ± 0,4 9 95,168 ± 0,309 136,3 ± 0,3 0,171 ± 0,028 -25,0 ± 1,1 10 95,159 ± 0,020 177,6 ± 3,5 0,200 ± 0,026 -24,5 ± 1,5 11 90,409 ± 1,006 195,0 ± 0.3 0,288 ± 0,023 -29,6 ± 0,5 12 96,376 ± 0,749 183,3 ± 0,7 0,241 ± 0,003 -33,9 ± 0,6 13 88,297 ± 0,301 198,9 ± 7,7 0,309 ± 0,052 -27,5 ± 2,4 14 80,241 ± 0,779 146,8 ± 0,9 0,183 ± 0,012 -22,2 ± 2,2 15 82,039 ± 0,788 223,2 ± 7,2 0,339 ± 0,030 -30,0 ± 1,2 16 76,424 ± 0,233 217,0 ± 3,2 0,221 ± 0,076 -28,9 ± 1,0 17 95,772 ± 0,622 188,8 ± 3,9 0,203 ± 0,030 -29,7 ± 1,6 18 92,294 ± 0,363 208,0 ± 2,9 0,314 ± 0,028 -30,2 ± 1,2 19 89,156 ± 0,363 181,1 ± 1,8 0,273 ±0,017 -28,6 ± 0,3 37 Procedeu-se então à análise de variâncias da % de Inibição do ABTS•+, segundo um modelo quadrático e transformando os dados pela sua raiz quadrada, de forma a melhorar a sua normalidade. Os resultados desta análise e do teste F estão sumariados na Tabela 7. O modelo estudado apresentou um valor-F de 28,48, o que se traduz num modelo significativo, cuja probabilidade de se dever a ruído é de apenas 0,01 %. Os coeficientes com valor-p menor que 0,05 foram os fatores/interações que o modelo previu terem maior significância para a resposta analisada (C, AB, AC, B2 e C2). No entanto A e B tiveram de ser inseridos no modelo para suportar a hierarquia fatorial. O valor-F da falta de ajuste (3,13) não foi significativo, havendo 18,88 % de probabilidade de a falta de ajuste se dever ao ruído. Tabela 7. Análise de variâncias para um modelo quadrático reduzido, aplicando aos dados a transformação 𝑦′= √𝑦+𝑘,𝑐𝑜𝑚 𝑘=0 Soma de quadrados Graus de liberdade Média de quadrados valor-F valor-p Bloco 1,78 1 1,78 Modelo 9,51 7 1,36 28,48 < 0,0001 Significativo A – [WPC80] 0,0129 1 0,0129 0,2697 0,6148 B – [VE] 0,2208 1 0,2208 4,63 0,0569 C – Tempo de sonicação 1,88 1 1,88 39,44 < 0,0001 AB 0,7814 1 0,7814 16,38 0,0023 AC 2,56 1 2,56 53,61 < 0,0001 B2 1,54 1 1,54 32,29 0,0002 C2 0,7128 1 0,7128 14,94 0,0031 Resíduos 0,4770 10 0,0477 Falta de ajuste 0,4195 7 0,0599 3,13 0,1888 Não significativo Erro puro 0,0575 3 0,0192 Total 11,77 18 Na Tabela 8 estão sumarizados alguns descritores estatísticos do modelo, dando alguns indícios da sua qualidade. É de salientar que a diferença entre os R2 previsto e ajustado foi inferior a 0,2, mostrando uma coerência razoável entre ambos. A precisão adequada foi superior a 4, indicando uma boa razão entre o sinal e o ruído, que permitiu então construir a superfície de resposta. Na Tabela 9 está então esquematizada a equação do modelo, que permite calcular a √% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑜 𝐴𝐵𝑇𝑆•+, em função dos fatores estudados, e assim prever o potencial antioxidante das emulsões. 38 Tabela 8. Estatística do ajuste, resumindo a sua qualidade Desvio padrão 0,2184 R² 0,9522 Média 8,97 R² ajustado 0,9188 Coeficiente de variação 2,43 R² previsto 0,7617 Precisão adequada 16,1144 Tabela 9. Equação do modelo quadrático √% 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒊𝒃𝒊çã𝒐 𝒅𝒐 𝑨𝑩𝑻𝑺•+ = + 6,897 - 0,117 * [Proteína] + 5,129 * [Vitamina E] + 0,186 * Tempo de sonicação - 0,154 * [Proteína] * [Vitamina E] + 0,017 * [Proteína] * Tempo de sonicação - 3,591 * [Vitamina E] 2 - 0,009 * Tempo de sonicação 2 Na Figura 28A pode observar-se o gráfico de probabilidade normal, mostrando que os resíduos se ajustam de forma dispersa a uma linha reta, concluindo-se que a transformação pela raiz quadrada foi suficiente para melhorar a normalidade dos dados. Na Figura 28B está a distribuição dos resíduos de cada amostra em relação à resposta crescente prevista pelo modelo. Como os resíduos se dispersaram de forma aleatória pode assumir-se uma variância constante entre as amostras, sem necessidade de mais transformações. A B Figura 28. Gráfico de probabilidade normal (A) e distribuição de resíduos em função da resposta prevista crescente (B). Design-Expert® Software Sqrt(Inibição do ABTS) Resíduos Studentizados % -2,00 -1,00 0,00 1,00 2,00 3,00 1 5 10 20 30 50 70 80 90 95 99 Design-Expert® Software Sqrt(Inibição do ABTS) Valores Previstos Resíduos Studentizados -6,00 -4,00 -2,00 0,00 2,00 4,00 6,00 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 4,11138 -4,11138 0 45 3.5 Funcionalização e caracterização dos substratos têxteis com as diversas formulações preparadas Todas as emulsões foram impregnadas em dois substratos diferentes, CO e CO-PES, após a impregnação do Ligante X a 2,5 % (V/V). Na Tabela 11 está representada a taxa de expressão de cada amostra, em cada substrato, bem como do próprio Ligante X que serviu como controlo. Tabela 11. Taxas de expressão de cada amostra em cada substrato Taxas de expressão (%) 100% Algodão (CO) 63% Algodão – 37 % Poliéster (CO-PES) 2,5 % Ligante X 66,72 83,96 WPC80 59,96 85,55 WPC80_VE 58,22 82,69 WPC80_OEO 63,34 93,20 dWPC80 60,09 73,14 dWPC80_VE 60,03 81,43 dWPC80_OEO 59,53 75,81 Média 61,13 ± 2,911 82,25 ± 6,571 Calculou-se ainda a taxa de expressão média para cada substrato, que resultou em 61,13 % para o CO e 82,25 % para o CO-PES. Sendo estes valores uma razão entre a massa de banho absorvida e a massa do têxtil seco, e as condições de impregnação foram iguais para os dois substratos, podemos concluir que o substrato CO-PES apresenta maior afinidade e capacidade de adsorver os agentes funcionais desenvolvidos. 3.5.1 Análise morfológica do revestimento dos substratos Nas Figuras 35 e 36 podem observar-se imagens de SEM dos substratos CO e CO-PES, respetivamente. As imagens pretendem mostrar a forma como o processo de foulardagem ancorou nos substratos as partículas produzidas. Analisaram-se os tecidos funcionalizados com WPC80 e com WPC80_VE e os respetivos controlos de cada tecido (não funcionalizado), como termo de comparação. 46 A B C D E F Figura 35. Análise morfológica do substrato CO não funcionalizados (A e B), funcionalizados com WPC80 (C e D) e com WPC80_VE (E e F). A análise foi realizada por microscopia eletrónica de varrimento, em A, C e E ampliação 1000x e em B, D e F ampliação 5000x. 47 A B C D E F Figura 36. Análise morfológica das fibras de PES do substrato CO-PES não funcionalizados (A e B), funcionalizados com WPC80 (C e D) e com WPC80_VE (E e F). A análise foi realizada por microscopia eletrónica de varrimento, em A, C e E ampliação 1000x e em B, D e F ampliação 5000x. 48 Numa primeira análise consegue-se perceber que ambas as formulações resultaram na formação de um filme heterogéneo que reveste as fibras e os seus interstícios. No caso do substrato CO, o revestimento observado é igual nas fibras todas, uma vez que estas são todas do mesmo tipo. Relativamente ao substrato CO-PES, observou-se um comportamento distinto consoante o tipo de fibra. Nas figuras apenas foram representadas as fibras de PES, visto que o comportamento nas fibras de CO é igual ao das figuras do substrato CO. No caso das fibras de PES, o revestimento formado tem o aspeto de placas. Desta forma, na fratura de uma destas placas foi possível observar a morfologia das partículas formadas (Figura 37). Figura 37. Morfologia das partículas de WPC80 observadas na fratura do revestimento das fibras de PES. Ampliação 100 000x. Apesar de não se observaram partículas individualizadas, conseguiu ainda assim verificar-se uma morfologia esférica. Contudo, uma vez que estão agregadas em placas, a medição de tamanhos por esta técnica foi impedida e, por esse motivo, não se justificou a análise das restantes amostras. Por outro lado, e uma vez que todas as formulações apresentavam Đ baixa e semelhante, deduz-se que as restantes amostras apresentassem um revestimento idêntico ao analisado. 49 3.5.2 Resistência das cápsulas proteicas à lavagem Na Figura 38 podem observar-se alguns dos tecidos funcionalizados após a incubação com o corante Acid Orange , os resultados deste ensaio encontram-se nos gráficos da Figura 39. Como se pode verificar, tanto em CO como em CO-PES, o processo de funcionalização com todas as formulações levou a um aumento significativo do sinal gerado pelo corante Acid Orange , relativamente aos respetivos brancos, indicando a presença de novos grupos amina nos substratos, provenientes das proteínas utilizadas nas diferentes formulações. A B Figura 38. Fotografias dos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com algumas das formulações, após incubação com o corante Acid Orange . Branco WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Abs484 nm ** * * * * # # # # Branco WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Abs484 nm * * * * * * # # # # # # S/ LAV 1 LAV A B Figura 39. Quantificação espetrofotométrica de aminas nos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com as diversas formulações, antes e após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Sidak para comparações. Os asteriscos e cardinais indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o branco, antes e após a primeira lavagem, respetivamente. 50 Mesmo após um ciclo de lavagem as várias amostras mantiveram uma densidade de grupos amina superior à dos respetivos brancos, com exceção de duas amostras no CO (WPC80_VE e dWPC80), que apresentaram erros associados muito elevados e deverão ser repetidas futuramente. Segundo estes resultados, as amostras mais promissoras aparentam ser as de dWPC80 em COPES, pois revelaram os sinais mais intensos, tanto antes como após a lavagem. Isto vai de encontro ao facto de este substrato apresentar maiores taxas de expressão. Além disso, o processo de desnaturação das proteínas expõe grupos que, na forma nativa da proteína, não estariam acessíveis ao corante. 3.5.3 Solidez do potencial antioxidante à lavagem Relativamente ao potencial antioxidante, os resultados do ensaio de descoloração do ABTS•+ nos substratos podem ser observados nos gráficos de barras da Figura 40. Em ambos os substratos, o Ligante X não apresentou uma influência positiva na capacidade antioxidante dos substratos, indicando que em todas as amostras o sinal observado se deverá unicamente à presença das emulsões nos substratos. Como se pode verificar, antes da primeira lavagem todas as emulsões conferiram aos substratos percentagens de inibição do ABTS•+ significativamente superiores às do branco. Como seria de esperar, os substratos com OEO apresentaram os sinais mais intensos, estando de acordo com o potencial antioxidante das emulsões por si só. No entanto, após um ciclo de lavagem, todas as amostras perderam grande parte da atividade antioxidante acrescida, para níveis idênticos e, em alguns casos, inferiores aos do branco. No substrato CO, apenas a emulsão de OEO em dWPC80 apresentou um sinal significativamente superior ao do controlo. No entanto, perdeu cerca de 63 % do potencial antioxidante. Já no substrato CO-PES, as emulsões que apresentaram sinal significativamente superior ao do controlo após a lavagem, foram as de VE tanto em WPC80 como em dWPC80, apesar das perdas de 46 e 47 % do potencial antioxidante, respetivamente. É de salientar que até os substratos funcionalizados só com WPC80 e dWPC80 perderam a sua atividade antioxidante. Esta observação pode indicar que, durante a lavagem, não se deu apenas a libertação dos agentes encapsulados (OEO ou VE), mas que houve também uma desagregação das proteínas do substrato. Apesar de o ensaio anterior continuar a revelar uma densidade de grupos amina na superfície do substrato significativa, após a primeira lavagem. Uma futura análise dos substratos lavados no SEM seria interessante para uma observação qualitativa da perda de material do revestimento. 51 Branco Controlo WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO 0 20 40 60 80 100 % de Inibiçção do ABTS•+ * * ** * * # # # # Branco Controlo WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO 0 20 40 60 80 100 % de Inibiçção do ABTS•+ * * ** * * # # # S/ LAV 1 LAV A B Figura 40. Potencial antioxidante dos substratos CO (A) e CO-PES (B) funcionalizados com as várias emulsões produzidas, antes e após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Sidak para comparações. Os asteriscos e cardinais indicam diferenças significativas (p < 0,05) entre cada amostra e o branco, antes e após a primeira lavagem, respetivamente. Com estes resultados concluímos que, futuramente, deveremos procurar formas mais eficazes de realizar a ancoragem das cápsulas aos substratos têxteis, como testar outros agentes ligantes, para além do Ligante X, pré-tratamentos aos substratos para criar grupos funcionais mais reativos ou até funcionalização das cápsulas com outros grupos químicos, como, por exemplo, através da sua complexação com outros polímeros biológicos. 3.5.4 Avaliação da capacidade desodorante Os resultados do ensaio para avaliação da capacidade desodorante podem ser observados no gráfico de barras da Figura 41. Este teste mostrou, desde logo, uma capacidade de redução do odor superior por parte do CO, relativamente ao CO-PES. Este resultado era esperado visto que o algodão apresenta mais grupos que reagem com o ácido isovalérico (nomeadamente grupos -COH), do que o poliéster. Desta forma, quanto maior a quantidade de CO, maior será a capacidade desodorante do substrato têxtil. É de notar que, dada a sensibilidade desta técnica e uma vez que as injeções são todas manuais, os resultados são acompanhados de desvios padrão consideráveis. 52 Branco Controlo WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO Branco Controlo WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO 0 20 40 60 80 100 % de Redução do Odor CO CO-PES a b bb b A A,B B A,B A,B Figura 41. Capacidade desodorante dos substratos funcionalizados após um ciclo de lavagem. A análise estatística foi realizada através de uma two-way ANOVA, usando o teste de Tukey para comparações múltiplas. Letras diferentes (minúsculas em CO e maiúsculas em CO-PES) representam diferenças significativas (p < 0,05). Numa primeira análise, é observado um ligeiro incremento da capacidade de redução do odor nos têxteis funcionalizados com as várias formulações, relativamente aos têxteis não funcionalizados (brancos). No entanto, notou-se desde logo uma interferência do agente de ligação no ensaio pois os substratos controlo também apresentaram aumentos. Por outro lado, segundo resultados obtidos anteriormente no grupo de trabalho do projeto TexBoost , esperava-se que no substrato CO-PES, os valores de percentagem de redução do odor do substrato funcionalizado com WPC80 atingissem pelo menos os 80 %, com resistência a pelo menos 20 ciclos de lavagem doméstica. Tal não se verificou e poderá dever-se, também, à interferência do agente de ligação. O Ligante X é equivalente, em termos de grupos funcionais, ao ligante utilizado no projeto TexBoost , mas não é o mesmo composto e poderá não estar a ancorar a proteína tão eficazmente ou estar a impedir que esta tenha interação com o marcador odorífero. De forma a confirmar estes resultados inesperados, todo o ensaio foi repetido, para ambos os substratos, mas foram obtidos valores semelhantes. Assim, e sendo que esta análise é extremamente demorada e sensível, só se procedeu à avaliação das formulações com proteína nativa. 53 3.5.5 Avaliação da solidez da coloração à radiação UV Fotografias dos tecidos manchados sob luz visível e sob luz UV podem ser observados na Figura 42. Os resultados do ensaio de solidez da coloração à radiação UV estão representados no gráfico de barras da Figura 43. Dado que as amostras lavadas tinham revelado a perda da atividade antioxidante, só se avaliaram as amostras antes da lavagem. A B Figura 42. Fotografias de alguns dos tecidos manchados sob luz visível (A) e sob luz UV (B). Branco WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO Branco WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO 0 25 50 75 100 % de Redução da Nódoa CO CO-PES Figura 43. Avaliação da solidez de cor dos substratos manchados com RhdB, após 12 h de exposição à luz UV. 54 Ao fim das 12 h de exposição à radiação UV, o substrato CO não funcionalizado (branco) revelou uma degradação de 51,9 % da nódoa. A funcionalização deste substrato com qualquer uma das formulações atrasou o processo de fotodegradação da RhdB, pois passadas as 12 h de exposição nenhuma das nódoas tinha ainda atingido os 25 % de redução. Estes resultados estão concordantes com os resultados anteriormente obtidos para a capacidade antioxidante, onde todas as formulações apresentam valores de percentagem de inibição do ABTS•+ superiores a 60%. Estes resultados vêm mostrar a possibilidade de recorrer a este tipo de formulações para produzir substratos têxteis com proteção acrescida à radiação UV, evitando assim a descoloração. Já o substrato CO-PES apresentou logo à partida menor degradação da nódoa (34,1 %), o que pode ser explicado pela presença de anéis aromáticos nas fibras de poliéster, que também absorvem parte da radiação UV, protegendo a nódoa. A funcionalização deste substrato com as emulsões desenvolvidas só melhorou a resistência da nódoa à fotodegradação em alguns casos, nomeadamente as formulações WPC80, WPC80_VE e dWPC80_OEO. Aliás, esta última apresentou os melhores resultados de todo o ensaio, onde houve uma redução da nódoa de apenas 9,7 %, revelando uma proteção superior a 90 %. Uma vez que este substrato é uma mistura de dois tipos de fibras, o acabamento poderá não estar homogéneo e os resultados obtidos neste ensaio podem ser dependentes do local de medição no substrato. Assim, não é rigoroso comparar os resultados obtidos neste ensaio e os resultados do potencial antioxidante. É de salientar que não foi possível testar a reprodutibilidade deste ensaio e, por isso, não se calcularam médias nem desvios padrão para cada amostra. No entanto, fica evidenciado o potencial observado neste teste, que poderá ser confirmado e melhorado futuramente. 61 [47] F. S. Ghaheh, A. Khoddami, F. Alihosseini, S. Jing, A. Ribeiro, and A. Cavaco-Paulo, “Antioxidant cosmetotextiles: Cotton coating with nanoparticles containing vitamin E,” Process Biochem., vol. 59, pp. 46–51, Aug. 2017. [48] C. Alonso, M. Martí, V. Martínez, L. Rubio, J. L. Parra, and L. Coderch, “Antioxidant cosmeto-textiles: Skin assessment,” Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 84, no. 1, pp. 192– 199, May 2013. [49] M. K. Singh, V. K. Varun, and B. K. Behera, “Cosmetotextiles: State of art,” Fibres Text. East. Eur., vol. 87, no. 4, pp. 27–33, 2011. [50] K. Son, D. I. Yoo, and Y. 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[25-Jul-2019]. 64 6 Anexos 6.1 Anexo A – Cálculos da % de inibição ABTS•+ usados nos ensaios de determinação do potencial antioxidante A Figura 44 mostra o espetro de absorção do ABTS•+, com o pico de absorvância a 734 nm acertado para 0,7. 200 300 400 500 600 700 800 0,0 1,0 2,0 3,0 Comprimento de onda (nm) Absorvância Figura 44. Espetro de absorção nas regiões ultravioleta e visível do ABTS•+, acertando-se a absorvância a 734 nm para 0,7. Na Tabela 12 estão os valores de absorvância de cada amostra (Absreal) em duplicado (linhas brancas). Dada a sensibilidade do ABTS•+ à luz, entre amostras leu-se a absorvância de um controlo do radical exposto à luz (linhas verdes), de forma a eliminar essa interferência dos resultados. Tabela 12. Amostras exemplo para o cálculo da % de inibição do ABTS•+ # Amostras Absreal Absprevista ΔAbs Abscorr. %AA 1 ABTS 1 0,656 0,656 - - - 2 1.1 0,278 0,653 0,004 0,282 56,863 3 1.2 0,273 0,649 0,007 0,280 56,847 4 ABTS 2 0,646 0,646 0,011 - - 5 2.1 0,228 0,642 0,014 0,242 62,266 6 2.2 0,236 0,638 0,018 0,254 60,243 7 ABTS 3 0,635 0,635 0,021 - - 8 3,1 0,101 0,631 0,025 0,126 80,048 9 3.2 0,100 0,628 0,029 0,129 79,525 10 ABTS 4 0,624 0,624 0,032 - - 65 Para isso construi-se uma reta de calibração, exemplificada na Figura 45, que permitiu extrapolar a absorvância do ABTS•+ a cada momento do ensaio (Absprevista). Com esses dados calculou-se a absorvância perdida pelo radical a cada leitura (ΔAbs), somada posteriormente à Absreal, de forma a obter uma absorvância corrigida (Abscorr.). Esta foi a absorvância utilizada para calcular a % de inibição do ABTS•+, de acordo com a Equação 5 descrita na secção 2.4.4 (página 23). 0 2 4 6 8 10 0,62 0,63 0,64 0,65 0,66 Ordem da amostra (#) Abs734 nm Y = -0,0036 * X + 0,6599 Figura 45. Reta de calibração da absorvância do ABTS•+ ao longo do ensaio de determinação do potencial antioxidante. 66 6.2 Anexo B – Cálculos da análise por cromatografia gasosa com deteção por ionização de chama (GC-FID) Os resultados foram obtidos segundo a linha de cálculo apresentada: Tabela 13. Área dos picos obtidos para a amostra controlo - exemplo para cálculo Amostra Área dos Picos (u.a.) 1 2 3 Ácido Isovalérico 48655,4 49183,5 48724,1 CO-PES 26223,5 30401,1 28129,8 Na Tabela 13 estão indicadas as áreas obtidas para o marcador odorífero, bem como os resultados obtidos para a primeira amostra controlo CO-PES, que serão utilizados para o exemplo de cálculo. Segue-se a Tabela 14 com a média (𝑥), desvio padrão(σ) e erros associados ao cálculo. Tabela 14. Determinação da média, desvio padrão e erro associado ao cálculo da % de redução (ORR) Cálculo do Erro Amostra 𝑥 σ Erro da Subtração Subtração da área do marcador Ácido Isovalérico 48854,3 287,1 - - CO-PES 28251,5 2091,5 2111,1 20602,9 Determinou-se a área média (𝑥) pela seguinte Equação 11: 𝑥= ∑𝑥i 𝑛 Equação 11 Em que, 𝑥i– área do pico de cada ensaio 𝑥 – área média 𝑛 – número de ensaios 67 O desvio padrão (𝜎) determinou-se pela Equação 12: 𝜎=√∑(𝑥i−𝑥) 𝑛 Equação 12 O erro acumulado na subtração (ES) determinou-se pela seguinte expressão (Equação 13): 𝐸𝑆=√σC2 − σA2 Equação 13 Em que, 𝜎𝐶 – Desvio padrão do controlo 𝜎𝐴 – Desvio padrão da amostra A subtração da área do Controlo (AN) determinou-se pela seguinte expressão (Equação 14): 𝐴𝑁=xC−xA Equação 14 Em que, 𝑥𝐶 – Área média do controlo 𝑥𝐴 – Área média da amostra A percentagem de redução de odor (ORR) e respetivo erro estão apresentados na Tabela 15. Tabela 15. Valor de % Redução obtido para o controlo CO-PES Amostra ORR EQ CO-PES 42 4,3 Determinou-se a % Redução (ORR) segundo a Equação 8 presente na secção 2.8.4, sendo o erro acumulado no quociente (EQ) dado pela Equação 15: 𝐸𝑄=𝑂𝑅𝑅 × √(𝐸𝑆 𝐴𝑁)2+ (σA xA)2 Equação 15 68 6.3 Anexo C – Espetros do ensaio de avaliação da solidez da coloração à radiação UV 450 500 550 600 650 700 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 Comprimento de onda (nm) F(R) Branco Ligante X WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO A 450 500 550 600 650 700 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 Comprimento de onda (nm) F(R) Branco Ligante X WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO B Figura 46. Espetros da Função de Remissão de Kubelka-Munk do substrato CO funcionalizado com as diversas formulações e manchados com RhdB. Antes (A) e após 12 h de exposição à luz UV (B). 69 450 500 550 600 650 700 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 Comprimento de onda (nm) F(R) Branco Ligante X WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO A 450 500 550 600 650 700 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 Comprimento de onda (nm) F(R) Branco Ligante X WPC80 WPC80_VE WPC80_OEO dWPC80 dWPC80_VE dWPC80_OEO B Figura 47. Espetros da Função de Remissão de Kubelka-Munk do substrato CO-PES funcionalizado com as diversas formulações e manchado com RhdB. Antes (A) e após 12 h de exposição à luz UV (B).