Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario "Phoenix canariensis"

TESIS DOCTORAL VARIABILIDAD GENÉTICA Y DISPERSIÓN POLÍNICA DEL ENDEMISMO CANARIO Phoenix canariensis Presentada por la Lcda. Isabel Saro Hernández Dirigida por: Dr. Pedro A. Sosa Henríquez Dr. Miguel A. González Pérez Las Palmas de Gran Canaria 2015 D. JOSÉ MANUEL VERGARA MARTÍN, SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en sesión permanente tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada “VARIABILIDAD GENÉTICA Y DISPERSIÓN POLÍNICA DEL ENDEMISMO CANARIO Phoenix canariensis” presentada por la doctoranda Dª Isabel Saro Hernández y dirigida por los Doctores Dr. Pedro A. Sosa Henríquez y Dr. Miguel A. González-Pérez. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 6 del Reglamento para la elaboración, defensa, tribunal y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a ____ de noviembre de 2015. Fdo.: José Manuel Vergara Martín Departamento de Biología Universidad de la Palmas de Gran Canaria UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA PROGRAMA DE DOCTORADO: ECOLOGÍA Y GESTIÓN DE LOS RECURSOS VIVOS MARINOS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA TESIS DOCTORAL VARIABILIDAD GENÉTICA Y DISPERSIÓN POLÍNICA DEL ENDEMISMO CANARIO Phoenix canariensis Presentada por la Lcda. Isabel Saro Hernández Dirigida por: Dr. Pedro A. Sosa Henríquez Dr. Miguel A. González Pérez El Director, Pedro A. Sosa El Director, Miguel A. González La Doctoranda, Isabel Saro Las Palmas de Gran Canaria, a ___ de noviembre de 2015 El Dr. Pedro A. Sosa Henríquez, Catedrático de Botánica de La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, y el Dr. Miguel A. González Pérez, Doctor en Biología, CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación “VARIABILIDAD GENÉTICA Y DISPERSIÓN POLÍNICA DEL ENDEMISMO CANARIO Phoenix canariensis” realizado bajo nuestra dirección por la Lcda. Isabel Saro Hernández, se considera finalizado y puede ser presentado para su exposición y defensa como Tesis Doctoral en el Departamento de Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria, a ___ noviembre de 2015. Fdo.: Pedro A. Sosa Henríquez Fdo.: Miguel A. González Pérez Es una antorcha al aire esta palmera, verde llama que busca al sol desnudo para beberle sangre; en cada nudo de su tronco cuajó una primavera. Sin bretes y eslabones, altanera y erguida, pisa el yermo seco y rudo; para la miel del cielo es un embudo la copa de sus venas, sin madera. No se retuerce ni se quiebra al suelo; no hay sombra en su follaje; es luz cuajada que en ofrenda de amor se alarga al cielo; La sangre de un volcán que enamorada del padre sol se revistió de anhelo y se ofrece, columna, a su morada. Miguel de Unamuno (1864 -1937) La Gomera) se ajusta a un patrón de ‘aislamiento por distancia’ (isolation by distance), en el caso de Tenerife el grado de diferenciación genética no se corresponde con la distancia geográfica, pudiendo ser el resultado de un fuerte aislamiento histórico de las poblaciones. Por otro lado, las islas mayores (Gran Canaria y Tenerife) mostraron un patrón más complejo de diferenciación genética de las poblaciones en comparación con La Gomera, posiblemente debido a cambios demográficos recientes. Adicionalmente, el análisis de la estructura genética espacial a escala fina reveló cierta asociación con respecto a la abundancia de la especie en el paisaje próximo a las poblaciones analizadas. Éste patrón sugiere que la discontinuidad espacial en la distribución de la especie, combinado con posibles restricciones en la dispersión de la especie, podrían influir en la agregación espacial de individuos genéticamente emparentados. La información molecular generada sobre el contexto geográfico, es de gran utilidad tanto para ser, directa o indirectamente, aplicada a las estrategias de manejo y conservación de P. canariensis, así como para aportar evidencias científicas de los patrones genéticos asociados a endemismos de amplia distribución en ambientes insulares oceánicos. ABSTRACT Knowing the reproductive biology of a species, along with the distribution of genetic diversity across populations and the factors that cause them, becomes necessary for an adequate biodiversity management and the conservation of its genetic resources. The Canarian palm (Phoenix canariensis H. Wildpret) is one of the most important and representative endemic plant species from the Canary Islands, since the species and their populations (palm groves) have always constituted a distinctive element of the Canarian landscape and ecosystems. Its widespread but uneven distribution across the Canarian archipelago, displaying both fragmented or continuous and large palm groves, makes it an attractive species for genetic flow and evolutionary studies. Specifically, this thesis aims to provide experimental information on the genetic structure and pollen dispersal of P. canariensis using nuclear microsatellites as molecular marker. For this purpose, several empirical methods have been combined to approach evolutionary questions related to different geographical scales: regional (i.e. archipelago), island and a fine-scale (local). The pollen dispersal analyses were investigated in a small isolated population of P. canariensis in the northwestern part of Gran Canaria (named Acusa Verde). Mating system analysis revealed an average of 5.8 effective pollen donors (Nep) per female. However, there was strong variation in correlated paternity rates across maternal progenies (ranging from null to 0.9), which could not be explained by the location and density of local males around focal females. Paternity analysis revealed a mean effective pollen dispersal distance of about 71 m, with approximately 70% of effective pollen originating from a distance of less than 75 m, and 90% from less than 200 m. A spatially explicit mating model also showed a clear leptokurtic pollen dispersal kernel, as well as indicating significant pollen immigration (12%) from external palm groves, and a directional pollen dispersal pattern. At regional scale, results showed that levels of within-population genetic diversity in P. canariensis depend on the island considered, with a strong decreasing pattern from the easternmost and oldest island (Fuerteventura and Gran Canaria) to the westernmost and youngest islands (Tenerife, La Gomera and La Palma). The population genetic differentiation pattern fitted with a stepping-stone model across the archipelago, according with the sequence of island emergence. Overall, the results suggest that the geographical configuration of the Canary Islands, and a relatively recent pattern of differentiation across the Canarian archipelago, appear to have had a primary influence on the genetic structure of this island taxon. Moreover, our analyses at island level revealed substantial genetic structure on each of the three central islands (Gran Canaria, Tenerife and La Gomera), despite of the potential high colonization and dispersal abilities of P. canariensis. However, while genetic differentiation on the islands where population densities are the highest (Gran Canaria and La Gomera) fit an isolation-by-distance pattern, such a pattern was not recovered on Tenerife, possibly due to long-term isolation of populations. On the other hand, largest islands (Gran Canaria and Tenerife) showed more complex patterns of population differentiation than La Gomera, possibly due to recent demographic changes. In addition, fine-scale spatial genetic structure seems to increase in those areas where P. canariensis is less abundant in the landscape around focal populations. Such pattern suggests that spatial discontinuity in the distribution of this species, combined with possible restrictions in its dispersal, may influence the spatial aggregation of genetically related individuals. The molecular information generated in a spatial context is very useful to be, directly or indirectly, applied in strategies for management and conservation of P. canariensis, and to provide scientific evidence of genetic patterns in widespread endemic species from oceanic islands. PRÓLOGO La presente Tesis Doctoral se enmarca en las actividades del proyecto de investigación titulado ‘Determinación de la estructuración y flujo genético de las poblaciones naturales de la palmera canaria y grado de introgresión con taxones afines en canarias, mediante marcadores moleculares’, financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, Dirección General de Investigación y Gestión del Plan Nacional de I+D+i (referencia CGL2009-10215), y cuyo investigador principal fue el Dr. Pedro A. Sosa, Catedrático de Botánica de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Además, una parte de esta tesis también se ha abordado con recursos procedentes del Programa de Mecenazgo Universitario INNOVA Canarias 2020®, de la Fundación Universitaria de Las Palmas (FULP). Parte de los resultados de este trabajo han dado lugar a dos publicaciones científicas, a las que se ha hecho referencia a lo largo del texto como Anexos con numeración romana, y a un tercer manuscrito que se encuentra en estos momentos en elaboración y será sometido a una revista incluida en el SCI, aunque no se expone como tal en la presente memoria. [I] Saro I, Robledo-Arnuncio JJ, González-Pérez MA, Sosa PA (2014) Patterns of pollen dispersal in a small population of the Canarian endemic palm (Phoenix canariensis). Heredity, 113: 215-223 (doi:10.1038/hdy.2014.16) [II] Saro I, González-Pérez MA, García-Verdugo C, Sosa PA (2015) Patterns of genetic diversity in Phoenix canariensis, a widespread oceanic palm (species) endemic from the Canarian archipelago. Tree Genetics & Genomes 11: 815 (doi: 10.1007/s11295-014-0815-0) ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................ 1 1.1 SISTEMA REPRODUCTOR Y DISPERSIÓN POLÍNICA ................................................................ 2 1.2 VARIABILIDAD GENÉTICA Y ESTRUCTURA GEOGRÁFICA ....................................................... 5 1.3 IMPACTO DE LOS SISTEMAS INSULARES EN LOS PATRONES DE VARIABILIDAD GENÉTICA INTRAESPECÍFICA ......................................................................... 13 1.4 ESTADO DE CONOCIMIENTO DE LA PALMERA CANARIA (Phoenix canariensis H. Wildpret ) .............................................................................................................. 15 2. OBJETIVOS .............................................................................................................................................. 23 3. MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................................................... 27 3.1 ÁREAS DE ESTUDIO Y DISEÑO EXPERIMENTAL ...................................................................... 27 3.1.1 Sistema de reproducción y función de dispersión polínica ........................................... 28 3.1.2 Diversidad y estructura genética a escala regional (archipiélago) ............................. 30 3.1.3 Diversidad y estructura genética a escala insular y local ............................................. 31 3.2 ANÁLISIS CON MARCADORES MOLECULARES ....................................................................... 32 3.3 ANÁLISIS DE DATOS ..................................................................................................................... 33 3.3.1 Sistema de reproducción y función de dispersión polínica ........................................... 33 3.3.2 Diversidad y estructura genética a escala regional (archipiélago) ............................. 36 3.3.3 Diversidad y estructura genética a escala insular .......................................................... 39 3.3.4 Estructura genética espacial a escala fina ...................................................................... 40 4. RESULTADOS .......................................................................................................................................... 45 4.1 TESTADO DE LOS MARCADORES MOLECULARES ................................................................... 45 4.2. SISTEMA DE REPRODUCCIÓN Y FUNCIÓN DE DISPERSIÓN POLÍNICA ............................. 45 4.3 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA REGIONAL ........................................... 49 4.4 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA INSULAR ............................................. 54 4.5 ESTRUCTURA GENÉTICA ESPACIAL A ESCALA FINA ............................................................. 59 5. DISCUSIÓN .............................................................................................................................................. 65 5.1 SISTEMA DE REPRODUCCIÓN Y FUNCIÓN DE DISPERSIÓN POLÍNICA .............................. 65 5.2 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA REGIONAL ........................................... 68 5.3 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA INSULAR ............................................. 72 5.4 ESTRUCTURA GENÉTICA ESPACIAL A ESCALA FINA ............................................................. 74 5.5 IMPLICACIONES PARA LA CONSERVACIÓN ............................................................................. 77 6. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 81 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................................. 85 ANEXO I........... ........................................................................................................................................... 105 ANEXO II.......... ........................................................................................................................................... 117 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS INTRODUCCIÓN Figura 1.1 Función de densidad de probabilidad o kernel de dispersión. .......................................... 4 Figura 1.2 Modelos de migración y estructura genética. ..................................................................... 8 Figura 1.3 Representación del contexto espacial de la estructura genética. ................................. 12 Figura 1.4 Distribución del género Phoenix L. ...................................................................................... 15 Figura 1.5 Ejemplares macho y hembra de palmera canaria (Phoenix canariensis). .................... 16 Figura 1.6 Inflorescencias y frutos de la palmera canaria (Phoenix canariensis). ........................ 18 Cuadro 1 Glosario. .................................................................................................................................... 20 MATERIAL Y MÉTODOS Figura 3.1 Localización de las 29 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas en los diferentes diseños experimentales. ................................................ 27 Figura 3.2 Distribución espacial de las palmeras presentes en la población de Acusa Verde. ...................................................................................................................... 29 Figura 3.3 Procedimiento de colecta, almacenaje y siembra de la cosecha de semillas procedentes de cada una de las 28 palmeras ‘madres’ muestreadas. ......................... 30 Figura 3.4 Localización de las 15 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas para el análisis de la diversidad y estructura genética a escala regional. .......... 30 Figura 3.5 Localización de las 24 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas para el análisis de la diversidad y estructura genética espacial a escala insular y a escala fina. ........................................................................................... 31 Tabla 3.1 Características geográficas de las 29 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas en los diferentes diseños experimentales. ........................ 28 RESULTADOS Figura 4.1 Histograma de frecuencias de las distancias potenciales de dispersión entre machos y hembras y las distancias de polinización efectivas estimadas mediante asignaciones fraccionales de la paternidad, en la población de Phoenix canariensis de Acusa Verde. ...................................................................................................................... 46 Figura 4.2 Análisis multivariante de coordenadas principales (PCoA) basado en las frecuencias alélicas obtenidas de las 15 poblaciones naturales de Phoenix canariensis analizadas a nivel regional. ................................................................................................... 51 Figura 4.3 Límites de diferenciación genética detectados por BARRIER y resultados de STRUCTURE en las 15 poblaciones naturales de Phoenix canariensis analizadas a nivel regional. ........................................................................................................................ 52 Figura 4.4 Test de correlación de Mantel aplicado a nivel regional. ................................................ 52 Figura 4.5 Análisis demográfico de Phoenix canariensis a lo largo del archipiélago canario usando el método ABC implementado en DIYABC. ........................................................... 53 Figura 4.6 Límites de diferenciación genética detectados por BARRIER y resultados de STRUCTURE para Phoenix canariensis a nivel insular. .................................................... 56 Figura 4.7 Autocorrelogramas de las 20 poblaciones de Phoenix canariensis analizadas a escala fina. .......................................................................................................................................... 61 Tabla 4.1 Variación a nivel familiar de los parámetros del sistema reproductor y dispersión polínica de Phoenix canariensis en la población de Acusa Verde. ................................ 47 Tabla 4.2 Parámetros de dispersión polínica estimados con NM+ en la población de Acusa Verde. ............................................................................................................................ 48 Tabla 4.3 Estimadores de variación genética calculados con 8 loci microsatélites nucleares en los ejemplares de Phoenix canariensis presentes en la población de Acusa Verde y la cosecha de semillas. ......................................................................... 49 Tabla 4.4 Comparación de los valores medios por isla de riqueza alélica (A), heterocigosidad genética balanceada (Hs) y diferenciación genética. ......................... 50 Tabla 4.5 Estimadores de variación genética calculados con 8 loci microsatélites nucleares en las 15 poblaciones naturales de Phoenix canariensis analizadas a nivel regional. ........................................................................................................................ 50 Tabla 4.6 Estimaciones de los parámetros demográficos del escenario 3 mediante el método ABC implementado en DIYABC. ......................................................................... 54 Tabla 4.7 Estimadores de variación genética calculados con 8 loci microsatélites nucleares en las 24 poblaciones naturales de Phoenix canariensis utilizadas en los análisis a escala insular y a escala fina. ................................................................. 55 Tabla 4.8 Matrices de valores pareados de diferenciación genética (FST), calculados con 8 microsatélites, entre las poblaciones de Phoenix canariensis analizadas a nivel insular en cada una de las islas centrales del archipiélago canario. .................. 57 Tabla 4.9 Resultados del análisis jerárquico espacial de la varianza molecular (SAMOVA), realizado de forma independiente en cada una de las islas centrales (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera) mediante SAMOVAv2.0. ...................................... 58 Tabla 4.10 Estructura genética espacial (SGS) a escala fina, analizada con 8 loci microsatélites nucleares en 20 poblaciones de Phoenix canariensis. .................................... 60 Tabla 4.11 Correlaciones de Spearman entre los estadísticos de variación genética y los parámetros que caracterizan la ocupación del hábitat de Phoenix canariensis en el paisaje. ............................................................................................................................ 60 INTRODUCCIÓN 6 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Los niveles de variación genética neutral o casi neutral atribuida a los marcadores moleculares, así como su estructura geográfica, están determinadas principalmente por la actuación conjunta de la mutación, migración y deriva genética (Avise, 1994; Templeton, 2006). Por un lado, la velocidad a la que se genera nueva variación genética dependerá de la tasa de mutación y el nivel de recombinación atribuido al tipo marcador molecular utilizado, pues variará según la región del genoma analizada (Avise, 1994; Petit et al., 2005). Por otra parte, como consecuencia del tamaño finito de las poblaciones, la diversidad genética puede disminuir a causa de las fluctuaciones estocásticas de las frecuencias alélicas debido al muestreo al azar entre los gametos (i.e. deriva genética), mientras que aumenta a causa de la migración, ya que provee a la población de nuevos alelos o incrementa las frecuencias de los alelos ya presentes. No obstante, éstos procesos también pueden poseer importantes efectos sobre la diversidad no neutral o adaptativa, pudiendo interaccionar con la selección natural especialmente en ambientes heterogéneos (Lenormand, 2002). Asimismo, también algunos loci supuestamente neutrales pueden mostrar señales significativas de adaptación o estar hereditariamente unidos a genes cercanos que sí se encuentran bajo selección. Esta asociación produciría un comportamiento atípico de las frecuencias alélicas bajo lo esperado en la neutralidad (Charlesworth et al., 1997), pudiendo aumentar la diversidad si se trata de la fijación de múltiples alelos de un gen, como ocurre en la ‘selección estabilizadora’, o disminuirla si son retenidos valores extremos de un gen, como ocurre en la ‘selección direccional’ (Gillespie, 1994). Mientras por un lado, esta interacción puede ocasionar malinterpretaciones en las estimaciones de diversidad y diferenciación genética neutral, por otro lado pueden advertir sobre determinadas áreas del genoma que se encuentran bajo la selección natural (Ford, 2002). Las cada vez más asequibles técnicas de secuenciación y búsqueda de polimorfismo en el genoma completo, abren nuevas puertas para abordar hipótesis sobre los factores ecológicos y genéticos que afectan a los patrones de variabilidad genética en su conjunto (Leffler et al., 2012). Los niveles de diversidad genética también pueden abordarse desde el grado de similitud o distancia genética entre dos individuos o grupo de individuos (subpoblaciones). Los datos genéticos son notablemente multivalentes, ya que contienen diferentes frecuencias de cada alelo en un locus determinado para cada población (Jombart et al., 2009). De hecho, conceptualmente, la distancia genética mide cuánto de alejadas están dos muestras genéticamente en un hiperespacio de n dimensiones en el que cada eje corresponde a la variación molecular de un solo marcador (Lowe et al., 2004). De forma ideal, alcanzará valores que varían entre cero (cuando la variación molecular observada en todos los marcadores se comparte en ambas muestras) y uno (cuando la variación molecular observada en todos los marcadores es distinta entre muestras). Por tanto, el valor evolutivo de la distancia genética está necesariamente relacionado con la divergencia entre los individuos y/o subpoblaciones, razón por la cual es un concepto clave en la sistemática molecular o asociación genética (Avise, 1994). A lo largo de las últimas décadas se han propuesto y contrastado numerosos métodos para estimar la distancia genética entre pares de individuos y/o poblaciones con diferentes tipos de marcadores moleculares (Nei, 1978; Introducción 7 Weir y Cockerham, 1984; Goldstein et al., 1995; Pons y Petit, 1996; Rousset, 2000). Particularmente, el proceso de mutación de los loci microsatélites, caracterizado por cambios escalonados del número de repeticiones de las secuencias cortas o ‘modelo de mutación escalonada’ (SMM, stepwise mutation model, en inglés), permite estimar la distancia genética mediante dos métodos cualitativamente diferentes. El primero, se basa en la presencia/ausencia de los alelos y sus frecuencias, considerando ‘alelos desordenados’, es decir, que están codificados por el número total de pares de bases que contiene, siendo el cálculo de los pares de FST el tratamiento más común (Weir y Cockerman, 1984). El segundo, se basa en las semejanzas entre ‘alelos ordenados’, los cuales están codificados según su tamaño o número de repeticiones de secuencias simples siguiendo un modelo SMM sencillo (pares de RST ; Slatkin, 1995). Así pues, en el segundo caso, la diferencia de tamaño entre alelos podría indicar la cantidad de eventos de mutación pasados, e informaría de los tiempos de coalescencia9 entre alelos (Slatkin, 1995). Cuando las poblaciones pasan por varias generaciones de aislamiento reproductivo, la diferenciación genética observada con marcadores neutrales será el resultado de la deriva o de las mutaciones acumuladas de forma independiente en cada una de ellas. Por tanto, el patrón filogeográfico resultante puede ser detectado en función de cómo varíen entre sí las estimaciones entre FST y RST , siendo iguales si prevalece la deriva, o incrementando RST con respecto a FST si una importante contribución de mutaciones escalonadas (SMM) han ocasionado la divergencia de las poblaciones (Estoup et al., 1998; Hardy et al., 2003). En términos genéticos, la población es considerada como el conjunto de subpoblaciones de individuos de una misma especie que forman una comunidad de intercambio genético a lo largo del espacio y tiempo, siendo definida por Dobzhansky (1950) como población mendeliana. Por consiguiente, el concepto de población está íntimamente relacionado al grado de flujo genético generado por la migración entre las subpoblaciones (demos). La variación genética tenderá a diferenciarse entre las subpoblaciones a causa de restricciones en el sistema reproductor y la dispersión de genes, influyendo en el tamaño de población efectiva y en el grado con que las poblaciones se subdividen por selección o deriva genética (Schoen y Brown, 1991; Glémin et al., 2006). La consecuencia más directa y común de una dispersión limitada durante varias generaciones es el cambio gradual de las frecuencias alélicas a lo largo del espacio, fenómeno denominado como ‘aislamiento por distancia’ (IBD, isolation by distance, en inglés; Wright, 1943, 1946). La alternativa de divergir mediante aislamiento por distancia, es hacerlo mediante contextos más complejos de aislamiento geográfico y/o ecológico entre las subpoblaciones de una especie, lo que en un caso extremo de inexistencia de flujo genético conduce a procesos de especiación. Para casos intermedios en que la divergencia de las poblaciones es relativa, se han ideado diferentes modelos teóricos que reflejan la estructura genética según el patrón de migración entre subpoblaciones (Figura 1.2). Wright (1951) desarrolló un ‘modelo de isla’ (island model, en inglés), 8 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis donde considera condiciones de equilibrio evolutivo entre un número infinito de poblaciones (islas) que contribuye de igual manera al conjunto de migrantes de la metapoblación, y que a su vez, tales migrantes se extienden de manera aleatoria a lo largo de todas las islas (Figura 1.2a). Ya que la distancia no influye en la posibilidad de recibir migrantes, ésta cualidad lo convierte en un modelo poco realista. Kimura (1953) redefinió este marco teórico con un modelo denominado ‘piedras de paso o piedras rodantes’ (stepping-stone, en inglés), donde considera que las poblaciones están dispuestas de forma consecutiva en una o dos dimensiones, y por tanto, cada subpoblación tendrá una tasa de migración determinada con cada una de las poblaciones vecinas (Figura 1.2b). Dado que las poblaciones más cercanas tendrán más posibilidades de intercambiar migrantes que las alejadas, también mostrarán menor grado de diferenciación genética, lo que se traducirá en un patrón clásico de ‘aislamiento por distancia’ (Kimura y Weiss, 1964). Figura 1.2 Representación de los tres modelos de migración descritos, donde cada círculo simboliza una subpoblación: A) Modelo de isla, en el cual cada población emite y recibe migrantes de un conjunto común; B) Modelo stepping-stone en dos dimensiones, donde la migración ocurre sólo entre poblaciones vecinas; C) Modelo de estructura jerárquica, definido como cuatro grupos que contienen cuatro subpoblaciones cada uno, y donde la migración es más probable dentro que entre grupos (Modificado de Fogelqvist, 2008). La construcción de ‘modelos jerárquicos’ basados en el trabajo pionero de Wright (Slatkin y Voelm, 1991), consiste en asignar las subpoblaciones en grupos entre los que existe mayor posibilidad de compartir migrantes (Figura 1.2c). Actualmente, los estadísticos F introducidos por Wright (1951) para un ‘modelo de isla’ aunque desarrollados más ampliamente por Weir y Cockerman (1984), siguen siendo uno de los procedimientos más populares para el tratamiento jerárquico de la variabilidad genética (dentro de cada subpoblación, entre subpoblaciones y en la metapoblación total). En parte se debe a la facilidad de su cálculo y su utilidad en la exploración de un amplio rango de hipotéticas estructuras genéticas en las poblaciones (Escudero et al., 2003; Hedrick, 2005). El procedimiento de análisis molecular de la varianza (AMOVA) desarrollado por Excoffier et al. (1992) proporciona un eficiente método para tal análisis, que puede ser fácilmente aplicado en matrices de distancias genética interindividuales. Actualmente, a través de simulaciones mediante métodos estadísticos más potentes, se empiezan a abordar modelos más complejos Introducción 9 incluyendo diferentes tipos de estructura genética de las poblaciones y variables como factores ambientales o tasas de migración desiguales, los cuales permiten inferir en patrones más realistas de diferenciación genética entre las poblaciones (Foll y Gaggiotti, 2008; Excoffier et al., 2009a). 1.2.2 Factores que influyen en el patrón de distribución de la diversidad genética Intuitivamente se espera que las especies ampliamente distribuidas alberguen mayores niveles de diversidad y menor diferenciación genética que las especies de distribución restringida (Hamrick y Loveless, 1989; Frankham, 1996; Gitzendanner y Soltis, 2000). En parte se debe a que poseen tamaños poblacionales relativamente estables que tienden a experimentar una menor fluctuación de las frecuencias alélicas, y que conservan grandes tamaños poblacionales efectivos (Ne), lo que posibilita mantener los niveles de variación genética a lo largo de las generaciones (Charlesworth, 2009). Inversamente, existe una serie de riesgos genéticos asociados a la reducción de las poblaciones: la pérdida de diversidad genética asociada a una mayor influencia de la deriva (Wright, 1931), así como el riesgo de sufrir procesos endogámicos por la reducción de los tamaños efectivos mínimos (Ellestrand y Ellam, 1993; Frankham, 1996; Jump y Peñuelas, 2006). La erosión genética que acarrea una reducción del tamaño efectivo de las poblaciones, así como el aislamiento de las subpoblaciones de una especie es un tema crucial en conservación genética (Ellstrand, 1992; Ellestran y Ellam, 1993; Frankham et al., 2002; Palstra y Fraser, 2012). Los niveles de diversidad genética que pueden afectar a la eficacia biológica de las poblaciones, y limitar su adaptación frente a nuevas presiones selectivas, han sido tema de debate durante años. Si bien la relación entre tamaño poblacional, heterocigosidad y eficacia biológica de las poblaciones resulta significativa en numerosos estudios empíricos (ver meta-análisis: Reed y Frankham, 2003; Leimu et al., 2006), no es tan fácil de generalizar y su uso con fines predictivos puede ser controvertido. Así, especies de amplia distribución pueden reflejar niveles bajos de variación genética (Walter y Epperson, 2001), y contrariamente, especies de distribución restringida o raras no son equivalente a bajos niveles de variabilidad genética (Gitzendanner y Soltis, 2000). De hecho, un empobrecimiento de la eficacia biológica en poblaciones pequeñas no solo puede ser consecuencia de la reducción de la diversidad genética, sino también de una compleja interacción entre los factores bióticos del ambiente y la estocasticidad demográfica (Leimu et al., 2006). En definitiva, las especies son entidades dinámicas y los patrones de distribución de la variación genética observada en el presente pueden estar reflejando el equilibrio de fuerzas evolutivas determinadas bajo el contexto actual o bien la huella temporal de procesos históricos (Epperson, 2003). Tanto las fluctuaciones demográficas a lo largo del tiempo como las variaciones asociadas al éxito reproductivo, pueden desviar considerablemente el tamaño de población efectiva del censo real de individuos en la población (Nunney, 1993; Frankham, 2007; Charlesworth, 2009). Por ejemplo, los episodios de colonización de un nuevo hábitat dan lugar a una drástica reducción de 10 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis la variación genética como consecuencia del efecto fundador10, así como a complejas modificaciones del tamaño efectivo poblacional que pueden traducirse en cuellos de botella11 (Luikart et al., 1998). Asimismo, la historia demográfica de las poblaciones puede estar sujeta a oscilaciones climáticas o eventos catastróficos que ocasionan procesos de extinción-recolonización de las poblaciones a lo largo del rango de distribución de las especies, originando complejos patrones de variación genética (Eckert et al., 2008; Excoffier et al., 2009b; Mayol et al,. 2012). Por otro lado, la fragmentación del hábitat confina la distribución de la especie a parches más o menos aislados entre sí, pudiendo sufrir las implicaciones asociadas a una reducción del tamaño poblacional efectivo y del flujo genético (Young et al., 1996). Mientras los efectos de la fragmentación a corto plazo son más evidentes en los patrones de variación genética de las semillas y plántulas producidas en las generaciones siguientes a la misma (Hamrick, 2004), los efectos a largo plazo están más relacionados con el incremento de los niveles de endogamia y deriva genética de los parches o subpoblaciones (Young et al., 1996). Con el desarrollo de la teoría de la coalescencia (Kingman, 1982), la distribución de las frecuencias y estados alélicos obtenidos con marcadores moleculares pueden interpretarse desde una perspectiva genealógica. Para este fin, el creciente uso de métodos de computación bayesiana aproximada (ABC, Approximate Bayesian computation, en inglés) se ha convertido en una de las herramientas más extensamente usadas para simular genealogías de genes bajo, prácticamente, cualquier modelo genético y demográfico (Beaumont y Rannala, 2004; Bertorelle et al., 2010), permitiendo la estimación de parámetros de importancia como tiempos de coalescencia o divergencia, tasas de migración o tamaños de población efectiva. El tamaño de población efectiva requerido para mantener los niveles de variación genética a lo largo del tiempo es fuertemente dependiente de la historia de vida de las plantas (Loveless y Hamrick, 1984; Hamrick y Godt, 1996; Nybom, 2004). Factores como el tipo de sistema reproductor, potencial para la dispersión de propágulos reproductores y la forma de vida, así como el potencial para el establecimiento de las poblaciones y su persistencia, también van a determinar los patrones de distribución de la variabilidad genética. En este sentido, los árboles suelen exhibir predominantemente una reproducción cruzada, además de poseer habilidades para la dispersión a larga distancia, lo que conduce a mantener grandes tamaños poblacionales. Ésta combinación de características promueve que, habitualmente, las especies arbóreas muestren altos niveles de diversidad genética dentro de las poblaciones y baja diferenciación genética entre ellas (Petit y Hampe, 2006), contribuyendo en aumentar su resiliencia frente a los efectos negativos de la fragmentación y/o poblaciones pequeñas (Hamrick, 2004; Jump y Peñuelas, 2006). 1.2.3 Estructura genética espacial A parte de los procedimientos tradicionales para analizar la estructura genética de las poblaciones, otro tipo de métodos incorporan el componente espacial en los análisis a fin de detectar y caracterizar la estructura genética espacial (SGS, spatial genetic structure, en inglés). El carácter Introducción 11 sedentario de las plantas promueve que los procesos que determinan la SGS operen a diferentes escalas: población, subpoblación o entre individuos próximos (i.e. a escala fina) (Escudero et al., 2003; Epperson, 2003). El nivel de flujo genético producido entre individuos y poblaciones va a ser el mayor determinante de los patrones de SGS (Loveless y Hamrick, 1984; Smouse y Sork, 2004). La vía clásica para visualizar los patrones de la variabilidad genética es por medio de gráficos basados en las matrices de distancias genéticas (principalmente, dendrogramas o análisis de componentes principales), en los que se proyectan las similitudes y diferencias genéticas en un espacio virtual. Estos métodos se muestran particularmente informativos para identificar valores atípicos o agrupaciones de las muestras que expliquen el tipo de estructura subyacente en la variabilidad genética global. Sin embargo, son menos apropiados si lo que se pretende es detectar los patrones espaciales de la distribución de la variación genética (Figura 1.3). Caracterizar la distribución espacial de la variación genética se ha convertido en un paso esencial para poder inferir en las variables ambientales y/o elementos del paisaje que interfieren en los patrones de migración y flujo genético, lo que hoy en día conforma un nuevo campo de investigación denominado ‘genética del paisaje’ (Landscape Genetics; Manel et al., 2003; Holderegger y Wagner, 2008). En lo que respecta a los factores ambientales, solo afectarán indirectamente a la distribución de la diversidad genética neutral si éstos interfieren en procesos como el flujo genético o el sistema reproductor (Kawecki, 2008; Ouborg et al., 2010). Si lo que se pretende es estimar la divergencia de las poblaciones como respuesta a las adaptaciones locales a lo largo de un gradiente ambiental, se debería estimar previamente la variación genética adaptativa (Kawecki y Elbert, 2004; Reusch y Wood, 2007; Parisod y Joost, 2010). No obstante, es de tener en cuenta que un patrón reciente de IBD o una historia filogeográfica compleja como resultado de expansiones y contracciones demográficas, puede producir patrones confusos de SGS, así como valores de FST atípicos y más pronunciados, que pueden mimetizar procesos adaptativos a determinadas escalas de análisis (Excoffier y Ray, 2008; Excoffier et al., 2009a; Holderegger et al., 2010). Una de las cuestiones espaciales más básicas en el análisis con marcadores neutrales es la evaluación del patrón IBD mediante el test de Mantel (1967). Éste consiste en correlacionar la matriz de distancias genéticas con respecto a la matriz de distancias geográficas (euclidianas) entre pares de individuos o poblaciones. También, resulta de gran interés la detección de las barreras geográficas potenciales que han podido interferir en los patrones filogeográficos observados (Figura 1.3). Para ello se suelen utilizar técnicas de superposición a través de las cuales se identifican grupos de poblaciones, barreras, discontinuidades genéticas o isolíneas (Manni et al., 2004; Holderegger et al., 2010). Una vez obtenida la SGS, se sobrepone en mapas topográficos, para detectar coincidencias geográficas en los bordes de los grupos genéticos observados. No obstante, el principal inconveniente es que la coincidencia en ambos componentes se basa simplemente en la inspección visual subjetiva (Holderegger et al., 2010). También, existen adaptaciones de los métodos clásicos de agrupación genética en los que se incorporan las coordenadas geográficas 12 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Figura 1.3 Representación del contexto espacial de la estructura genética. La asociación genética de las muestras (representadas por puntos) en diferentes grupos (color negro o blanco) puede ser visible en un análisis multivariante, pero las barreras o discontinuidades genéticas que los separan en el contexto espacial son imperceptibles. De hecho, los tres escenarios diferentes de la derecha (A, B y C) reflejan el mismo resultado obtenido con los análisis multivariantes: A) todas las poblaciones pertenecientes a cada grupo son espacialmente continuas, y por tanto, en los análisis espaciales se espera observar sólo una barrera genética entre ellos; B) Sólo un grupo (puntos blanco) es espacialmente continuo, por lo que se espera observar dos barreras genéticas; C) No existe correspondencia entre las diferencias genéticas de los grupos y su localización geográfica, por lo que los análisis espaciales no revelarán barreras genética (Modificado de Manni et al., 2004). de las muestras, como el ‘análisis espacial de la varianza molecular’ (SAMOVA, spatial analysis of molecular variance, en inglés; Dupanloup et al., 2002) o análisis multivariantes y bayesianos (Jombart et al., 2008; François y Durand, 2010). Por otro lado, mientras la mayoría de los métodos han sido aplicados a escalas amplias y/o medianas (i.e. regiones), y no proveen información por debajo de la menor subdivisión capturada en el muestreo, la SGS a escala fina (i.e. entre individuos próximos) ha permanecido durante más tiempo insuficientemente explorada (Escudero et al., 2003). El carácter hipervariable de los microsatélites nucleares, ha motivado el estudio de los procesos microevolutivos cada vez a menores escalas con el fin de comprender los procesos de flujo genético y adaptación a la escala de los paisajes naturales (Epperson, 2003). La distribución de los genotipos a lo largo del espacio será predominantemente consecuencia de las limitaciones en la dispersión de polen y semillas a cortas escalas (Vekemans y Hardy, 2004; Cavers et al., 2005), pudiendo influir en los patrones genéticos de las plantas a mayores escalas (Heer et al., 2015). En este proceso es aún más determinante el alcance de la dispersión de semillas que la dispersión polínica, así como los procesos post dispersivos, ya que son los responsables de la ubicación final de las plántulas. Restricciones Introducción 13 en alguno de estos procesos ocasionan la agregación de genotipos emparentados y la formación de estructuras familiares (Degen et al., 2001; Hampe et al., 2010). Por otro lado, la inestabilidad demográfica a lo largo del tiempo (entre clases de edades o estadios de crecimiento) y el espacio (continuidad espacial de los individuos) como consecuencia de los factores históricos, fragmentaciones y/o manejo de las poblaciones, pueden causar variaciones en los patrones de SGS a escala fina (Oddou-Morutorio et al., 2004; Wang et al., 2011; Nakanishi et al., 2015). 1.3 IMPACTO DE LOS SISTEMAS INSULARES EN LOS PATRONES DE VARIABILIDAD GENÉTICA INTRAESPECÍFICA La relativa simplicidad de las islas con respecto a las zonas continentales convierten a los sistemas insulares en ‘laboratorios biológicos’, proporcionando ejemplos que ayudan a comprender procesos universales en ecología y evolución (Carlquist, 1974; Barret, 1996; Whittaker y Fernández-Palacios, 2007; Bramwell y Caujapé-Castells, 2011). Las islas oceánicas surgen del lecho marino por la actividad volcánica y están desprovistas de vida en el momento de su emergencia, siendo pobladas paulatinamente por la biota mediante la dispersión a larga distancia (Vargas et al., 2012). El aislamiento que de forma natural ofrecen las islas, especialmente las oceánicas, condiciona en gran término la evolución de las especies que logran colonizarlas, produciendo en la mayoría de los casos una asombrosa diversificación de especies. En general, la mayoría de las investigaciones desarrolladas en islas han estado centradas en cuestiones biogeográficas o de la historia filogenética de los taxones insulares (Juan et al., 2000; Emerson, 2002; Whittaker y Fernández-Palacios, 2007). No obstante, la colonización y expansión geográfica de las especies a lo largo de los sistemas insulares no siempre se traduce en procesos de radiación adaptativa12, pudiendo causar fuertes patrones de variabilidad genética intraespecífica sin que se originen nuevas especies (Stuessy, 2007). En este sentido, las especies insulares de amplia distribución permiten investigar los factores involucrados en la colonización de varias islas sin que impliquen procesos de especiación, pudiendo inferir en los patrones genéticos a lo largo de mayores escalas geográficas (Bottin et al., 2005; García-Verdugo et al., 2010; Martins et al., 2013). En el caso de los archipiélagos, la presencia de barreras oceánicas restringe el flujo genético entre las islas, por lo que se espera que las especies ampliamente distribuidas a lo largo de los mismos presenten fuertes estructuras genéticas (Bottin et al., 2005; Kaneko et al., 2008). Asimismo, se espera que la colonización secuencial del archipiélago (i.e. modelo stepping-stone), particularmente en aquellos sistemas insulares que muestran una configuración lineal (Juan et al., 2000; Emerson, 2002; Kwon y Morden, 2002; Kaneko et al., 2008; Yamada y Maki, 2012), lleve a un decrecimiento de la diversidad genética de las poblaciones en el frente de expansión geográfica de la especie, y a un patrón de IBD por las restricciones en la dispersión a lo largo del archipiélago (Inoue y Kawahara, 1990; Kaneko et al., 2008; Yamada y Maki, 2012). Tradicionalmente, se ha sostenido la idea de que los taxones insulares están caracterizados por una reducción de los niveles de variación genética en comparación con las poblaciones 14 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis continentales (Barrett, 1996; Frankham, 1996, 1997). La baja diversidad genética observada en muchas especies insulares suele estar relacionada con cambios drásticos del número y tamaño de las poblaciones, los cuales están frecuentemente ligados a los eventos estocásticos inherentes a la colonización en las islas y/o a la fragmentación (Kaneko et al., 2008; Stuessy et al., 2014). No obstante, algunos estudios desarrollados en linajes emparentados y de amplia distribución en el continente e islas, han detectado patrones de diversidad genética inversos a los esperados, probablemente debido a un aumento de las tasas de extinción, o complejas variaciones demográficas (procesos de contracción y expansión de las poblaciones) en áreas continentales durante los periodos del Plioceno y Pleistoceno (Chiang et al., 2006; Chiang y Shaal, 2006). Esta última tendencia también ha sido sugerida para taxones macaronésicos de amplia distribución, combinado además, con el efecto que ocasionan los eventos de colonización múltiple facilitados por la proximidad de los archipiélagos macaronésicos al continente (Francisco-Ortega et al., 2000; Fernández-Mazuecos y Vargas, 2011; Désamoré et al., 2012; García-Verdugo et al., 2013). Asimismo, en particular para las Islas Canarias debido a su gran antigüedad geológica (20 Ma para Fuerteventura y Lanzarote), estas islas pueden albergar taxones muy antiguos que han podido experimentar numerosos procesos de mutación y flujo genético desde el establecimiento de las poblaciones, lo que se traduciría en un incremento de la diversidad genética (Kim et al., 1999; Francisco-Ortega et al., 2000). Po otro lado, también se ha sugerido que los síndromes de dispersión asociados con largas distancias como la anemofilia (polinización a través del viento), la anemocoria (dispersión de semillas a través del viento) o la endozoocoria (dispersión de semillas a través de la ingesta por parte de vertebrados), frecuentemente exhibidos en árboles, pueden aliviar la subdivisión de las poblaciones como resultado del aislamiento geográfico y el patrón de IBD esperado para los taxones insulares a lo largo del archipiélago (Payn et al., 2008; García-Verdugo et al., 2010; Martins et al., 2013; García-Verdugo et al., 2014). No obstante, incluso en especies que exhiben un importante flujo genético entre islas y mantienen altos niveles de diversidad y población efectiva, éstas no están exentas de sufrir variaciones espacio-temporales del tamaño, forma y conexiones entre sus poblaciones a escala intra-insular (Lu et al., 2002; Gómez et al., 2003; Rosas-Escobar et al., 2011; Shepherd y Perrie, 2011). Las especies insulares en general también están sujetas a episodios de extinción y recolonización de las poblaciones debido a perturbaciones geológicas (Gómez et al., 2003; García-Verdugo et al., 2010; Mairal et al., 2015) u oscilación del nivel del mar (Shepherd y Perrie, 2011; Mayol et al., 2012), así como a los efectos del impacto humano (Muller et al., 2009), lo que promueve restricciones del flujo genético y la divergencia de las poblaciones también a medianas escalas. En general la información disponible sugiere que los patrones de diversidad y diferenciación genética de los endemismos insulares dependen de varios factores (ver revisión en Stuessy et al., 2014), siendo los siguientes los más influyentes: tiempo que ha pasado desde la colonización, la ontogenia insular, la tasa generacional, el sistema de reproducción y los patrones de dispersión (incluyendo también la migración producida por el ser humano). Por tanto, las condiciones y características particulares de cada especie podrían desviarse de las Introducción 15 clásicas expectativas mencionadas para especies insulares (Pfosser et al., 2006; López-Sepulveda et al., 2013; Stuessy et al., 2014). 1.4 ESTADO DE CONOCIMIENTO DE LA PALMERA CANARIA (Phoenix canariensis H. Wildpret) La palmera canaria, Phoenix canariensis H. Wildpret (ver reciente revisión de la nomenclatura de P. canariensis en Rivera et al., 2013), es una de las 14 especies descritas en el género Phoenix L. (World Checklist of Arecaceae; Govaerts et al., 2011), el cual, se caracteriza principalmente por incluir todas las palmeras con hojas pinnadas-induplicadas y estar ampliamente distribuido en climas cálidos del Viejo Mundo, desde la Macaronesia hasta China, así como por poseer una gran relevancia económica en sus lugares de origen (Figura 1.4; Dransfield et al., 2008). Se trata de un género, morfológica y filogenéticamente, aislado dentro de la Subfamilia Coryphoideae (Arecaceae), formando la Tribu Phoeniceae que se constituye únicamente por el género Phoenix (Asmussen et al., 2006; Dransfield et al., 2008). La poca variación morfológica y genética, así como el alto grado de hibridación interespecífica que muestra este género (Barrow, 1998; Henderson et al., 2006), han dificultado la completa comprensión filogenética de las especies de éste género (Barrow, 1998; Pintaud et al., 2010; Henderson et al., 2006; Ballardini et al., 2013; Rivera et al., 2014), siendo prácticamente imposible la discriminación de las 14 especies mediante el uso de una única herramienta metodológica. No obstante, independientemente del método molecular utilizado, P. canariensis suele agruparse con Phoenix dactylifera, Phoenix sylvestris, Phoenix atlantica y Phoenix theophrasti, en el también denominado ‘Clado Phoenix dactylifera’. En concreto, los microsatélites nucleares han sido empleados en varias ocasiones para desarrollar estudios de diversidad y estructura genética en especies del género Phoenix (Zehdi et al., 2004, 2015; Elshibli y Koperlainen, 2008, Pintaud et al., 2013). Figura 1.4 Distribución del género Phoenix L. Objetivos 23 2. OBJETIVOS El objetivo principal del presente trabajo fue investigar, mediante el uso de marcadores moleculares nucleares e hipervariables (microsatélites), la variabilidad, estructura y diferenciación genética de las poblaciones naturales de la palmera canaria (Phoenix canariensis H. Wildpret) en el archipiélago canario, incluyendo el análisis de su dispersión polínica y sistema reproductor, así como el flujo genético desde diferentes perspectivas espaciales y geográficas (regional, insular y local), con el propósito de contribuir, directa o indirectamente, en el desarrollo de estrategias para la gestión y conservación de esta especie endémica de las Islas Canarias. Este objetivo general, se concreta en los siguientes objetivos específicos: · Estimar los principales parámetros del sistema reproductor y dispersión efectiva de polen en Phoenix canariensis, y evaluar las relaciones fenotípicas y ecológicas con los parámetros reproductivos individuales. · Caracterizar y detectar los niveles de variación genética de las poblaciones naturales de Phoenix canariensis a lo largo del archipiélago canario, evaluando el impacto de las barreras oceánicas en la estructura genética de la especie, e inferir los modelos de diferenciación más plausibles para explicar los patrones observados. · Analizar la estructura genética insular, centrando el estudio en las islas con mayor abundancia de palmerales de Phoenix canariensis (Tenerife, La Gomera y Gran Canaria), y evaluar el efecto de la localización del hábitat en los patrones genéticos observados en las poblaciones. · Estudiar la estructura genética espacial a escala fina en las poblaciones naturales de Phoenix canariensis, evaluando el efecto que ocasiona la ocupación del hábitat en la distribución espacial de los genotipos. Material y Métodos Material y métodos 27 3. Material y Métodos 3.1 ÁREAS DE ESTUDIO Y DISEÑO EXPERIMENTAL Para el desarrollo de los diferentes experimentos incluidos en esta tesis, se seleccionaron 29 poblaciones naturales (palmerales) localizadas a lo largo del rango de distribución natural de Phoenix canariensis H. Wildpret en el archipiélago canario según del arco et al. (2006). la cantidad y distribución de los palmerales muestreados en cada isla fue acorde a la abundancia de esta especie y sus poblaciones en cada una de ellas (Figura 3.1; tabla 3.1). la isla de el Hierro no fue considerada en este estudio debido a la práctica inexistencia de poblaciones de P. canariensis en esta isla. de cada población, se colectaron muestras foliares procedentes de 20 a 40 ejemplares a la vez que eran georreferenciados individualmente, excepto en la población CaC (acusa Verde; tabla 3.1) donde se muestrearon todos los individuos presentes en la población, y para la cual, se fueron utilizando diferentes submuestras según el diseño experimental. dado que distribución espacial de los individuos dentro de los palmerales puede ser de forma agregada o dispersa (sosa et al., 2007), los ejemplares fueron aleatoriamente muestreados acorde a la configuración de cada población. Como resultado, las distancias medias de separación entre individuos variaron aproximadamente entre 80m (distribución agregada) y 390m (distribución dispersa). Figura 3.1 localización de las 29 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas en los diferentes diseños experimentales del presente trabajo. las áreas verdes representan el rango de distribución actual de esta especie (obtenido a partir de datos ofrecidos por M. Márquez y a. Naranjo). Ver correspondencia entre los índices y códigos de las poblaciones en tabla 3.1. 28 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis tabla 3.1 Características geográficas de las 29 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas en los diferentes diseños experimentales del presente trabajo, así como el número de muestras colectadas en cada una de ellas (N). Nota: expo., exposición. 3.1.1 Sistema de reproducción y función de dispersión polínica la población natural elegida para desarrollar los estudios del sistema reproductor y flujo polínico de P. canariensis fue CaC (acusa Verde; Figura 3.1 y tabla 3.1), localizada en el noroeste de la isla de Gran Canaria en el municipio de artenara. la elección de esta población se justifica por su pequeño tamaño (aproximadamente 10 hectáreas), que permitió realizar un muestreo individual exhaustivo con el que abordar los análisis de paternidad, y por su grado de aislamiento geográfico con respecto a otras poblaciones (aunque la población más cercana está tan sólo a 600 m de lejanía, se encuentran separadas en diferentes barrancos). la vegetación circundante consiste principalmente en matorral de transición y pastizales, que no suponen resistencia alguna al movimiento del polen de las palmeras a través del viento. los individuos de la población se distribuyen de forma agregada, Material y métodos 29 Figura 3.2 distribución espacial de las palmeras presentes en la población de acusa Verde (CaC): hembras muestreadas como ‘madres’ (círculos cruzados), hembras no muestreadas como ‘madres’ (círculos blancos), machos (círculos grises) y ‘juveniles’ (triángulos negros). el mapa de la izquierda es el área total estudiada (las líneas grises discontinuas representan los bordes de los cultivos), y el mapa de la derecha contiene una ampliación del núcleo más denso de la población, localizado al suroeste de la misma. a excepción del límite norte del área estudiada que se encuentra fragmentada por cultivos (Figura 3.2). este palmeral es uno de las cuatro poblaciones incluidas en el Catálogo Nacional de materiales de base para la reproducción de los materiales forestales de reproducción identificados, o comúnmente denominadas ‘fuente semillera’ (Boe, 2006). se muestrearon y georreferenciaron todos los individuos presentes en la población (N=182; tabla 3.1) para determinar sus genotipos mediante los análisis moleculares. Con el fin de establecer el estatus reproductor de cada ejemplar, se revisaron las copas de cada palmera en busca de alguna evidencia de inflorescencia emergentes o pasadas (el raquis y las raquillas de la inflorescencia marchita pueden permanecen en la palmera incluso años). de los 182 individuos muestreados, se registraron: 56 hembras, 47 machos y 79 individuos no reproductores (referidos en lo sucesivo como ‘juveniles’) (Figura 3.2). entre los juveniles (independientemente de su altura y edad) fueron incluidos todos aquellos ejemplares sin rastros de inflorescencias presentes o pasadas, por lo que se asume que no han participado en el ciclo reproductor contemplado en el presente estudio. además, 50 semillas fueron aleatoriamente muestreadas de frutos en avanzado estadio de maduración, directamente colectados desde las infrutescencias de 28 palmeras hembras (referidas en lo sucesivo como ‘madres’). las progenies de cada una de estas familias maternas fueron 30 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Figura 3.3 Procedimiento (ver de izquierda a derecha) de la colecta, almacenaje y siembra de las progenies de cada una de las 28 ‘madres’ muestreadas, manteniendo controlado el origen materno de las mismas durante todo el proceso. Figura 3.4 localización de las 15 poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas para el análisis de la diversidad y estructura genética a escala regional (i.e. archipiélago). las edades geológicas de las islas están en paréntesis (Ma, millones de años). Ver correspondencia de los códigos de las poblaciones en tabla 3.1. almacenadas en bolsas independientes junto a la muestra foliar de la madre de la cual procedían. de esta manera, la contribución genética materna a cada embrión puede obtenerse a través de la muestra foliar la madre, y solo hay que deducir la contribución paterna mediante los análisis de paternidad. la parte carnosa de los frutos fue extraída para acelerar la germinación de las semillas, las cuales fueron sembradas en el Vivero Forestal del Cabildo de Gran Canaria y mantenidas hasta que la plántula tuviera un mes de crecimiento (Figura 3.3), para obtener una muestra suficiente de tejido vegetal procedente del embrión con el fin de aumentar la eficacia de los análisis moleculares. de las 50 semillas germinaron exitosamente entre un 60-90% entre las diferentes madres, para las cuales se estandarizó una muestra de 22 semillas procedentes de cada una de ellas. las 616 plántulas colectadas se usaron en los posteriores análisis moleculares, aunque éstas seguirán siendo referidas en lo sucesivo como ‘semillas’. 3.1.2 Diversidad y estructura genética a escala regional (i.e. archipiélago) las islas Canarias comprenden 7 islas volcánicas de diferentes edades geológicas (Figura 3.4; Carracedo et al., 2008), a lo largo de las cuales se seleccionaron 15 palmerales de P. canariensis y 22 ejemplares en cada uno de ellos como submuestra del total de poblaciones e individuos indicados en la Figura 3.1 y tabla 3.1, tratando de cubrir la distribución y representatividad de esta especie a lo largo del archipiélago (Figura 3.4). además, a esta escala de análisis también se incluyeron 22 individuos de Phoenix dactylifera l. procedentes de diferentes cultivos de Marruecos, que fueron utilizados como grupo externo. Material y métodos 31 Figura 3.5 localización de las poblaciones de palmera canaria (Phoenix canariensis) consideradas en las islas centrales para el análisis de la diversidad y estructura genética a escala insular, y estructura genética espacial a escala fina. las áreas verdes representan el rango de distribución actual de esta especie (obtenido a partir de datos ofrecidos por M. Márquez y a. Naranjo). Ver correspondencia de los códigos de las poblaciones en tabla 3.1. 3.1.3 Diversidad y estructura genética a escala insular y local los análisis a escala insular se llevaron a cabo en las tres islas centrales del archipiélago (Gran Canaria, tenerife y la Gomera), por ser las más pobladas por P. canariensis. se seleccionaron todas las poblaciones y muestras colectadas en estas islas (ver tabla 3.1): 9 poblaciones y 353 individuos en Gran canaria (para CaC se escogió una submuestra aleatoria con 40 individuos), 5 poblaciones y 200 individuos en tenerife, y 10 poblaciones y 382 individuos en la Gomera (Figura 3.5). los análisis de estructura genética espacial a escala fina se llevaron a cabo en todas las poblaciones indicadas en la Figura 3.5, excepto en CtF, Cat, Cso y CFa, porque no se disponía de las coordenadas geográficas individuales de los ejemplares muestreados en estas poblaciones. en este caso, para cada análisis se empleó el número total de muestras adquiridas en cada población (ver tabla 3.1). Por otro lado, también se contó con una base de datos georreferenciados (formato sHP de arcGis) de los especímenes naturales de P. canariensis a lo largo del paisaje en las distintas islas del archipiélago (datos generados por M. Márquez y a. Naranjo), cuya distribución fue registrada 38 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis distancias pareadas de FST entre las poblaciones conectadas por los bordes de dicha red. Finalmente, la combinación con valores máximos de FCT, y valores mínimos de FSC (i.e. diferenciación genética entre subpoblaciones dentro grupos), tras 100 simulaciones de procesos anillados fue seleccionada como la subdivisión geográfica más probable de las muestras, para la cual se obtienen los valores de significancia tras 1023 permutaciones. Por otro lado se aplicó una técnica de superposición para evaluar el efecto de las barreras oceánicas y geográficas en la distribución de la variabilidad genética, según viene implementado en Barrier v2.2 (Manni et al., 2004). en este caso también se modela la organización espacial de las poblaciones mediante la triangulación Delaunay, y a través del algoritmo de Monmonier, son identificados los bordes entre poblaciones vecinas que exhiben los mayores niveles de diferenciación genética. Para fortalecer la consistencia de las barreras detectadas, se utilizó un método de remuestreo siguiendo la técnica de bootstrap, en el cual se repitió el análisis para 100 matrices de distancias genéticas pareadas (basadas en la distancia de Nei). se tuvieron en cuenta sólo las barreras con mayor fortaleza estadística (aquellas con un boostrap >75 matrices), aunque también se prestó atención a aquellas barreras con un soporte moderado (50 < X< 75 matrices). Finalmente, se aplicó un test de Mantel usando el servicio web iBdWs (Jensen et al., 2005), para evaluar si el patrón de diferenciación genética de las poblaciones a lo largo del archipiélago se ajusta a un patrón de aislamiento por distancia (iBd). dicho test se basa en la correlación entre la distancia genética (usando los valores del FST linearizado, expresado como FSTL= FST /(1FST)) y la distancia geográfica entre pares de poblaciones, obteniendo el valor de significancia tras 10.000 permutaciones. Historia demográfica de P. canariensis a lo largo del archipiélago el análisis demográfico de las poblaciones se realizó mediante el método de computación bayesiana aproximada (aBC, approximate Bayesian computation, en inglés), según viene aplicado en el programa diyaBC v1.0 (Cornuet et al., 2008, 2010). el programa utiliza herramientas de coalescencia para generar la distribución de miles de datos simulados desde un conjunto de escenarios demográficos definidos por el usuario, para los cuales se construye una ‘tabla de referencia’ en base a diferentes estadísticos de diversidad genética. luego, el método aBC utiliza un criterio de similitud sobre los estadísticos estimados, midiendo las distancias entre el conjunto de datos simulados y observados para inferir en la distribución posterior de los parámetros demográficos y mutacionales, y generando una aproximación de la probabilidad posterior mediante iteraciones de MCMC. Con el fin de simplificar los escenarios testados y a la luz de los patrones generales observados en la asociación de las poblaciones (ver sección de ‘resultados’), se representó la muestra colectada en cada isla como poblaciones únicas y se excluyó del análisis la isla de lanzarote. se propusieron 4 escenarios igualmente probables para testar el patrón con mayor soporte estadístico en la divergencia de P. canariensis a lo largo del archipiélago (ver representación gráfica de los escenarios en Figura 2 del Anexo II). Material y métodos 39 · escenario 1: todas las poblaciones divergen en un único evento común. · escenario 2: ancestralmente, las islas orientales divergen de las occidentales, las cuales posteriormente se diferencian en las distintas poblaciones actuales. · escenario 3: divergencia secuencial de Fuerteventura y Gran Canaria en el transcurso de distintas generaciones, y posteriormente, las islas occidentales divergen en un evento común. · escenario 4: divergencia secuencial de cada población en diferentes y consecutivos tiempos generacionales desde el pasado hasta el presente y siguiendo una ‘regla de progresión’ desde el este al oeste. a su vez, los 4 escenarios ignoran los eventos de migración entre las poblaciones y asumen tamaños poblacionales efectivos (N) potencialmente diferentes entre las poblaciones muestreadas (islas), las cuales han experimentado una reducción del mismo con respecto a las poblaciones ancestrales (NA) como resultado del proceso de divergencia. Por un lado, los parámetros demográficos estimados a partir del escenario más probable fueron los tamaños poblacionales efectivos (N y NA) y los tiempos generacionales entre cada evento de divergencia (t), y por otro lado, los parámetros mutacionales en relación con los microsatélites fueron la tasa media de mutación (µ) y el coeficiente medio de la distribución geométrica (P) del modelo de mutación escalonada generalizado (GMs, generalized stepwise mutation model, en inglés; estoup et al., 2002). Ver los valores y límites de partida de los parámetros del modelo, número de simulaciones, y estadísticos utilizados como criterio de similitud entre datos simulados y observados en el apartado de Material and Methods del Anexo II. la bondad del ajuste de los cuatro escenarios se evaluó mediante un análisis de componentes principales (PCa, principal component analysis, en inglés) en el espacio de los estadísticos de referencia (Cornuet et al., 2010). Un parámetro de interés para interpretar los resultados de los análisis demográficos es la tasa generacional de la especie. No obstante, en el caso de las especies de palmeras es difícil proporcionar una estimación precisa de la edad de los ejemplares (Choo et al., 2012). además P. canariensis en particular, muestra diferentes ritmos de crecimiento según el ambiente en el que se encuentre, por lo que se suele usar rangos de alturas como indicador de la edad, asumiendo que los ejemplares crecen 1m cada 5-10 años (sosa et al., 2007). luego, siguiendo esta correspondencia, la categoría de alturas más frecuente es la que varía entre 5-10m, a las cuales los ejemplares alcanzan el dosel arbóreo y sus máximas capacidades reproductivas, por lo que se asumirá una tasa generacional aproximada de 25 años por generación. 3.3.3 Diversidad y estructura genética a escala insular Varios de los análisis mencionados a lo largo del apartado 3.3.2 se repitieron de manera independiente en cada una de las islas utilizadas para inferir en los patrones genéticos a escala insular (Gran Canaria, tenerife y la Gomera). 40 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Por un lado, con el fin de detectar el posible efecto de la variación del tamaño muestral en las estimaciones de diversidad, mediante el uso de Genalex v6.5 se calcularon los estadísticos estándares de diversidad genética (Na, Ne, He y Ho) para cada una de las poblaciones. el cálculo del valor de FIS, así como la comprobación del equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) de las poblaciones mediante el test exacto de Fisher, se efectuó con el uso de GeNePoP v4.2. Por otro lado, el análisis de la estructuración geográfica de la variación molecular se inició estimando la diferenciación genética entre las poblaciones de cada isla (valores pareados de FST) mediante GeNePoP v4.2. además, para examinar el grado de divergencia exhibido por cada población, se calculó el valor promedio de los pares de FST de cada población con respecto al resto de poblaciones del sistema estudiado (i.e. resto d poblaciones albergadas en la isla). también, se aplicó el método bayesiano de agrupación implementado en strUCtUre v2.2, asumiendo un modelo de mezcla genética y frecuencias alélicas correlacionadas entre las poblaciones, el cual es más robusto detectando diferencias genéticas entre grupos cercanos que comparten un ancestro común o que han experimentado considerables eventos de migración (Falush et al., 2003). en cada isla se ejecutaron 10 repeticiones de cada valor de K, desde K=1 hasta el número máximo de poblaciones muestreadas en cada isla (K=9 en Gran Canaria, K=5 en tenerife y K=10 en la Gomera). Para el resto de características del análisis, así como para la detección del número óptimo de K en cada isla, se siguió el mismo procedimiento aplicado a escala regional. Por otro lado, los patrones espaciales también se evaluaron en cada isla mediante el uso de Barrier, saMoVa v1.0 y aplicando un test de Mantel mediante iBdWs, siguiendo las indicaciones comentadas en el punto 3.3.2. 3.3.4 Estructura genética espacial (SGS) a escala fina Estimación de los índices relacionados con la SGS a escala fina la sGs a escala fina se llevó a cabo mediante la construcción de correlogramas basados en las relaciones genéticas entre los individuos de la muestra en relación a la distancia que los separa. Para ello se utilizó el coeficiente de parentesco (o estimador de coancestro Fij), aplicado según lo descrito por loiselle et al. (2005). dicho estimador se calcula como la correlación entre estados alélicos en pares de individuos, o dicho de otro modo, está definido por la probabilidad de que dos alelos escogidos al azar (i y j) en dos individuos sean idénticos por descendencia. Fij fue medido a lo largo de 10 clases de distancias geográficas, automáticamente definidas en cada análisis para contener el mismo número de pares de comparaciones entre individuos en cada intervalo. luego, mediante la regresión de los valores de Fij frente a la distancia espacial entre individuos (dij; calculada de forma lineal y logarítmica) se estima la pendiente de regresión (blin ó blog), que informará de si los individuos están estructurados genéticamente a nivel espacial. los intervalos al 95% de confianza estadística en torno a la hipótesis nula de una distribución Material y métodos 41 aleatoria de los genotipos, se obtuvieron a partir de los errores estándar aproximados para las estimaciones multi-locus en cada clase de distancia, siguiendo un procedimiento de remuestreo (jackknife) que elimina la información de un locus en cada iteración. todos los cálculos de sGs fueron llevados a cabo con el programa sPaGedi v1.3 (Hardy y Vekemans, 2002). dado que el esquema de muestreo, especialmente el número y distribución de los individuos muestreados, afecta fuertemente las estimaciones de sGs (degen et al., 2001; Vekemans y Hardy, 2004; Cavers et al., 2005), la fortaleza de la sGs puede ser mejor evaluada a través del estadístico Sp, desarrollado por Vekemans y Hardy (2004) y estimado como el radio -bF /(1 - F(1)), donde bF es la pendiente de la regresión de los coeficientes F frente a la distancia, y F(1) es la media del coeficiente Fij entre los individuos incluidos en el primer intervalo de distancia y que suele contener a todas las parejas de vecinos (Vekemans y Hardy, 2004). Por tanto, el estadístico Sp representa la tasa de disminución del coeficiente de parentesco con respecto a la distancia, pero con la ventaja de estar poco influenciado por el tipo de estrategia de muestreo utilizada. Efecto de la ocupación del hábitat en los patrones genéticos locales debido a que el hábitat de P. canariensis puede ser encontrado fuera de los márgenes del dominio potencial del bosque termófilo en las islas Canarias (del arco et al., 2006; sosa et al., 2007; Fernández-Palacios et al., 2008), se estableció la hipótesis de que las poblaciones localizadas fuera de los límites de este ecosistema pudieran ser consideradas en cierto modo marginales, y que por tanto, la ocupación del hábitat pudiera tener un efecto sobre los patrones genéticos de las poblaciones como consecuencia de estar más o menos aisladas a lo largo del paisaje. a través de las ubicaciones georreferenciadas de los especímenes naturales de P. canariensis a lo largo de las islas (ver Figura 3.5), se estimó la abundancia de la especie en el paisaje próximo a las poblaciones analizadas genéticamente. Concretamente, se calculó el número de palmeras localizadas en un radio de 600m (Npalm) desde el centroide de las poblaciones estudiadas usando herramientas de geoprocesamiento del arcGis v10.2. luego, se calcularon los coeficientes de correlación de spearman (según viene implementado en r) entre parámetros genéticos locales como la diversidad genética (Ho, He), nivel de endogamia (FIS) y grado de diferenciación genética de cada población (promedio de FST), estimados según lo indicado en el apartado 3.3.3, así como los parámetros de sGs a escala fina (Splin y Splog), y los que caracterizan la ocupación del hábitat de P. canariensis en el paisaje, como el número de ejemplares de P. canariensis alrededor de las poblaciones estudiadas (Npalm) y la altitud media (alt) a la que se encuentran. RESULTADOS Foto: Javier Gil Resultados 45 4. RESULTADOS 4.1 TESTADO DE LOS MARCADORES MOLECULARES De los 15 marcadores microsatélites nucleares probados sobre un 20% del total de las muestras, se observó que los marcadores mPdCIR016, mPdCIR035, mPdCIR044, mPdCIR090 y mPdCIR093 fueron monomórficos para Phoenix canariensis y que el locus mPdCIR015 mostró una duplicación de los fragmentos amplificados, por lo que terminó siendo excluido del análisis para evitar interpretaciones erróneas en la lectura de los genotipos de este locus. Por otro lado, el resto de loci analizados con el programa Microcheker mostraron estar en equilibrio de H-W y carecer de alelos nulos, excepto el locus mPdCIR078, que exhibió una deficiencia significativa de heterocigosis sin potenciales errores de lectura, por lo que se atribuye únicamente a la presencia de alelos nulos. Para evitar que las desviaciones de las frecuencias alélicas de este microsatélite debidas a la existencia de alelos nulos se confundan con procesos genéticos de interés, como los niveles de endogamia de las poblaciones, éste locus también se eliminó del resto de los análisis. Finalmente, el resto de muestras fueron analizadas con los 8 loci nSSR restantes (mPdCIR010, mPdCIR025, mPdCIR048, mPdCIR050, mPdCIR057, mPdCIR063, mPdCIR070, mPdCIR085) siguiendo las indicaciones del punto 3.2, los cuales presentaron un poder de exclusión conjunto del 98%, según lo indicado en el resumen de estadísticos obtenidos con CERVUS v3.0. 4.2. SISTEMA DE REPRODUCCIÓN Y FUNCIÓN DE DISPERSIÓN POLÍNICA Parámetros del sistema reproductor y correlaciones demográficas El grado de paternidad correlacionada a nivel poblacional fue moderado (rp = 0,173 ±0,032), lo que puede ser traducido en una media poblacional aproximada de 5,8 padres efectivos por hembra (Nep =1/rp). No obstante, las estimaciones de la tasa de paternidad correlacionada a nivel familiar oscilaron fuertemente entre 0 y 0,9 en las diferentes progenies maternas analizadas (rango de Nep: 1,1 - 45,4; Tabla 4.1). El análisis de asignación fraccional de la paternidad reveló que en las 606 semillas recogidas de las 28 madres muestreadas participó un tamaño poblacional de 74,3 machos reproductores (IC-95%: 70,8 - 79,6), indicando también que un 25% de la descendencia no fue engendrada por los candidatos masculinos muestreados en la población. Dentro de la población, la distribución observada de frecuencias de las distancias de polinización efectiva se desvió significativamente de la obtenida bajo la hipótesis de una dispersión aleatoria (D = 0,145, P < 0,001), siendo moderadamente leptocúrtica. La media y mediana de las distancias efectivas de dispersión de polen estimadas con PATRI fueron 71,5m y 47,9m, respectivamente, pero ambos valores fueron menores que los obtenidos para las distancias entre pares de palmeras presentes 46 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis en la población (ver tabla a pie de gráfico en Figura 4.1). Así pues, el 70% de los eventos de polinización efectiva ocurren a distancias menores de 75m entre los progenitores, con una disminución de la frecuencia con la distancia, pero manteniéndose frecuencias observables a medias y largas distancias (hasta 200 - 400m; Figura 4.1). Considerando las familias maternas por separado, las correspondientes distancias efectivas medias de dispersión de polen fueron muy variables, oscilando entre 26,6 y 192m (Tabla 4.1). Respecto a las correlaciones demográficas de los parámetros reproductivos a nivel familiar, de manera global se observó que la posición relativa y densidad local de los machos alrededor de las madres tiene un efecto sobre las medidas de distancias efectivas, pero sin influir en las tasas de paternidad correlacionadas. Concretamente, las tasas de paternidad correlacionada (rp) no se mostraron relacionadas ni con la distancia media hacia todos los machos (dmedia: rs=0,125; P>0,05) Figura 4.1 Comparación entre la distribución de las frecuencias de las distancias potenciales de dispersión entre machos y hembras (barras blancas) y las distancias de polinización efectivas (barras negras) observadas mediante asignaciones fraccionales de la paternidad, en la población de Phoenix canariensis de Acusa Verde (CAC). La tabla a pie de gráfico contiene el resumen de los valores medios, medianas, mínimos y máximos para ambos tipos de distancias estimadas a nivel poblacional. Resultados 47 Tabla 4.1 Variación a nivel familiar de los parámetros del sistema reproductor y dispersión polínica de Phoenix canariensis en la población de Acusa Verde (CAC): ID, código de identificación de las familias maternas; rp, tasa de paternidad correlacionada; Nep, número efectivo de donantes de polen; dpot, distancia de separación media entre cada palmera ‘madre’ y todos los machos (distancia de dispersión potencial); y def, distancia de separación media entre cada palmera ‘madre’ y los machos que han fertilizado sus progenies (distancias de dispersión efectiva). ni con la distancia hacia el macho más cercano (dmin: rs=0,160; P>0,05). Tampoco lo hicieron con la densidad local de machos estimada en diferentes radios alrededor de las hembras (todos las pruebas en base a Nmx, rs ≤ -0,02 y P>0,05). Aún más, incluso se muestran independientes a las medias de las distancias efectivas de dispersión de polen observadas en cada familia materna 54 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis 1.640 - 9.670), o hace 139.000 años, si consideramos para la palmera canaria una tasa generacional de 25 años/generación; (ii) la divergencia de Gran Canaria (Pop 4) de la población de Fuerteventura pudo haber tenido lugar hace 3.450 generaciones (valor medio de t3 ; IC-95%: 1.050 - 7.400), que se traduce en 86.250 años atrás; (iii) la separación de las poblaciones occidentales (Tenerife, La Gomera y La Palma) fue considerablemente reciente y simultánea, a un tiempo t2 = 1.115 (IC-95%: 219 - 2.840) que equivale a aproximadamente 27.875 años atrás; (iv) Los tamaños poblacionales efectivos de las poblaciones en el presente muestran valores de la mediana que oscilan desde N1=546 (Pop1; La Palma) hasta N4=7.660 (Pop4; Gran Canaria); (v) las poblaciones de las islas centrales (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera) exhiben una moderada expansión de sus tamaños efectivos con respecto a los de sus respectivas poblaciones antecesoras (NA2 para Gran Canaria y NA3 para Tenerife y La Gomera), contrariamente a los que se observa para Fuerteventura (NA1=7.140 pasa a N5=4.580) y, de forma más acusada, en La Palma (NA3= 1.100 pasa a N1=546). Tabla 4.6 Estimaciones de los parámetros demográficos del escenario 3 mediante el método ABC implementado en DIYABC (Cornuet et al., 2008, 2010). Se indican la media, mediana y modo de la distribución posterior para cada parámetro, junto con los intervalos al 95% de confianza. ti , escala del tiempo entre los eventos de divergencia, medido en generaciones desde el presente (t=0) y donde i varía de 2 a 4; Ni , tamaño poblacional efectivo de las poblaciones actuales, donde i varía de 1 a 5; NAi , tamaño poblacional efectivo de las poblaciones ancestrales, donde i varía de 1 a 3; Media_ μmic, tasa de mutación media de los microsatélites; Media_P, es el parámetro promedio de la distribución geométrica del modelo de mutación GSM. 4.4 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA INSULAR El aumento del tamaño muestral empleado en las islas centrales (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera) con respecto a la muestra utilizada en los análisis a nivel regional, prácticamente no produjo cambios en las estimaciones de diversidad genética (Hs), obteniendo valores que oscilaron de 0,512 (CST) a 0,692 (CTF) en Gran Canaria, de 0,350 (TMA) a 0,524 (TLS) en Tenerife, y de 0,458 (GSI) a 0,529 (GEL) en La Gomera. En cada población, los valores de Ho y Hs fueron muy similares, y las únicas poblaciones que se desviaron significativamente de las proporciones esperadas para el equilibrio de HW fueron CSO y CST en Gran Canaria (Tabla 4.7). Resultados 55 Tabla 4.7 Estimadores de variación genética calculados con 8 loci microsatélites nucleares en 24 poblaciones naturales de Phoenix canariensis seleccionadas a lo largo de las islas centrales del archipiélago canario (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera): Na, número de alelos diferentes; Ne, número efectivo de alelos; Ho, heterocigosidad observada; Hs, heterocigosidad esperada balanceada; FIS , coeficiente de endogamia; el promedio de los valores pareados de diferenciación genética entre cada población y el resto de poblaciones albergadas en la misma isla fue expresado como ‘promedio FST’. También se indican el tamaño muestral utilizado (n), altitud media (ALT) y número de palmeras en un radio próximo de 600m (Npalm), en cada población estudiada. Ver correspondencia de los códigos de las poblaciones en Tabla 3.1. Tal y como se dejó entrever en los análisis a escala regional, se confirma un notable grado de diferenciación genética a nivel insular en los tres casos analizados, que se traduce en una considerable divergencia de la mayoría de las poblaciones (Tabla 4.7), especialmente en Tenerife donde todos los valores promedio de FST fueron superiores a 0,160. En el caso de La Gomera existe un patrón geográfico, siendo las poblaciones localizadas en el noreste, este y sureste de la isla las más diferenciadas genéticamente del resto (promedios de FST >0,101), mientras que en Gran Canaria las poblaciones CAR, ubicada en el norte (promedio de FST =0,156), y CTE, localizada en el este (promedio de FST =0,147), son las que muestran un mayor grado de divergencia con respecto a las demás. Todos los valores pareados de FST entre las poblaciones de cada isla están referidos en la Tabla 4.8. El análisis de agrupación bayesiana de los individuos realizado con STRUCTURE bajo el modelo de mezcla genética y frecuencias alélicas correlacionadas, mostró un considerable nivel de estructura genética en cada isla analizada. Los resultados muestran dos grupos genéticos (K) 56 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Figura 4.6 Distribución de las 24 poblaciones de Phoenix canariensis seleccionadas a lo largo de las islas centrales del archipiélago canario, analizadas de forma independiente, con los límites de diferenciación genética detectados por BARRIER (Manni et al., 2004) sobre el contexto espacial: ‘líneas sólidas y negras’ representan un nivel alto de soporte estadístico (con valores de bootstrap >75), ‘líneas dobles’ muestran barreras con soporte moderado (50<bootstrap <75) y ‘líneas discontinuas’ indican barreras de débil soporte (bootstrap<50). También, se indican los patrones insulares de agrupación bayesiana estimados en STRUCTURE (Pritchard et al., 2000), asumiendo un modelo de mezcla genética y frecuencias correlacionadas. Los diagramas representan la proporción de asignación de los individuos a cada grupo genético dentro de las poblaciones muestreadas, asumiendo como número óptimo de agrupaciones K=6 en Gran Canaria, y K =2 en Tenerife y La Gomera. Ver correspondencia de los códigos de las poblaciones en Tabla 3.1. tanto en Tenerife como en La Gomera (Figura 4.6), coincidiendo con el patrón observado en estas islas con el análisis regional bajo un modelo de frecuencias independientes entre poblaciones (ver Figura 4.3). Contrariamente, en Gran Canaria se detectó un incremento a 6 unidades o grupos genéticos, revelando un patrón de divergencia producido en muy pocas generaciones de aislamiento (Falush et al., 2003; Rosenberg et al., 2005). Concretamente, se observa que: (i) la mayoría de individuos muestreados en CAC, CAR, CTF y CTE fueron asignados con una alta probabilidad al grupo genético dominante en cada una de estas poblaciones, y (ii) tanto CMO, localizada al suroeste, como las poblaciones ubicadas al sur de la isla, y distribuidas entre la cuenca de Fataga (CFA y CAT) y cuenca de Tirajana (CSO y CST; Figura 4.6), exhibieron un considerable nivel de mezcla genética en la ascendencia de los individuos. Resultados 57 Tabla 4.8 Matrices de valores pareados de diferenciación genética (FST; Weir y Cockerham, 1984), calculados con 8 microsatélites entre las poblaciones de Phoenix canariensis muestreadas en la misma isla (de izquierda a derecha: La Gomera, Tenerife y Gran Canaria). Ver correspondencia de los códigos de las poblaciones en Tabla 3.1. 58 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Por otra parte, el patrón de diferenciación genética observado en las poblaciones de las islas más habitadas por P. canariensis se ajusta significativamente a un IBD, observando una correlación aún más fuerte entre las distancias genéticas y geográficas en el caso de La Gomera (Test de Mantel: r =0,780; P<0,001) que en Gran Canaria (r = 0,652; P<0,001). Inversamente, en Tenerife la distancia genética entre las poblaciones no guarda relación con la distancia geográfica entre las mismas (r =-0,078; P>0,05). La configuración espacial de las discontinuidades genéticas detectadas con el uso de BARRIER (Figura 4.6), coincide considerablemente con la agrupación de poblaciones máximamente diferenciadas obtenida con SAMOVA (Tabla 4.9), así como con el patrón resultante en STRUCTURE para el caso de Gran Canaria (Figura 4.6). Globalmente, la estructura genética espacial observada explica una proporción significativa de la variación genética total detectada en cada isla, estimada en un 10,13% en La Gomera, 11,89% en Gran canaria, y en un 15,85% en Tenerife (Tabla 4.9). En este último caso, la falta de significancia estadística en la diferenciación genética estimada entre los grupos (FCT 16%, P>0,05; Tabla 4.10), podría estar relacionada con el calculo del p-valor disponiendo de prácticamente el mismo número de muestras que de grupos (I. Dupanloup, comunicación personal). Tabla 4.9 Resultados del análisis jerárquico espacial de la varianza molecular (SAMOVA), realizado de forma independiente en cada una de las islas centrales (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera) mediante SAMOVAv2.0 (Dupanloup et al., 2002), y basado en los datos genéticos obtenidos en Phoenix canariensis con 8 loci microsatélites nucleares. Resultados 59 4.5 ESTRUCTURA GENÉTICA ESPACIAL A ESCALA FINA Los análisis de autocorrelación espacial revelaron diferentes patrones de estructura genética espacial (SGS) a escala fina dependiendo de la población considerada, con valores del coeficiente de co-ancestro en la primera clase de distancia (F1) que oscilaron fuertemente entre -0,011 (GSI) y 0,072 (TEC; Tabla 4.10 y Figura 4.7). En el caso de CAC, al ser la única población que incluyó todos los ejemplares presentes en la población (n=182), fue posible estimar con mayor fortaleza estadística la significancia del Fij en cada clase de distancia. Luego, el autocorrelograma de CAC mostró una distribución no aleatoria de los genotipos sólo en la primera clase de distancia (F1=0,021; P<0,001), con las palmeras localizadas hasta 21m de separación entre ellas estando genéticamente más relacionadas que la media (Figura 4.7). Para el resto de poblaciones que se analizaron con una submuestra de entre 30 y 40 individuos cada una, sólo se observó una clara significación de la SGS en TLS y TEC (Tenerife), GEL (La Gomera) y CTE (Gran Canaria; Tabla 4.10; Figura 4.7). La cuantificación de la SGS mediante el estadístico Sp reveló resultados similares a los mostrados en los autocorrelogramas, obteniendo valores significativos de las pendientes de regresión (blin y blog) en las poblaciones mencionadas anteriormente, además de en CMO (Gran Canaria). No obstante, en general es notable que la gran mayoría de poblaciones muestran valores negativos en blin y blog (Tabla 4.10), indicando que los individuos espacialmente cercanos entre sí están, en términos medios, más relacionados genéticamente que aquellos que están separados por mayores distancias mayores. Los valores medios de Sp obtenidos a partir de la regresión lineal de Fij , se mostraron considerablemente elevados en 11 de las 24 poblaciones analizadas (Splin>0,016; Tabla 4.10), mostrando valores superiores a los esperados para árboles con dispersión anemófila y zoócora (valores de Sp entre 0,0064 y 0,0088; ver Vekemans y Hardy, 2004). Sin embargo, este patrón varía al considerar la regresión logarítmica de Fij , y los valores de Splog solo se mantienen superiores a 0,015 en las poblaciones que también mostraron valores significativos en el resto de parámetros de la SGS, aunque siendo notable que Splin y Splog se mantienen casi constantes sólo en CAC, indicando un posible efecto del tamaño muestral en las estimaciones (Tabla 4.10). La caracterización de la ocupación del hábitat de P. canariensis según la altitud media (ALT) a la que se encuentran las poblaciones de estudio, no se mostró significativamente relacionada con alguno de los parámetros genéticos locales analizados (Ho, Hs, FIS, promedio de FST, Splin y Splog). No obstante, la abundancia de P. canariensis en el paisaje próximo a las poblaciones estudiadas (Npalm en un radio de 600m) afecta relativamente a los niveles de variabilidad y estructura genética local. Por un lado, la diversidad genética de las poblaciones (Ho y Hs) no guarda relación con la abundancia de la especie en los alrededores, y tampoco está asociada con la diferenciación genética y alcance de la SGS local observada (todas las correlaciones fueron P>0,05). Por otro lado, parece existir cierta relación negativa y significativa entre el número de palmeras en el entorno próximo, y tanto la SGS (Splin y Splog) como el grado de divergencia observado en cada población (promedio de FST). Asimismo, los niveles 60 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Tabla 4.10 Estructura genética espacial (SGS) a escala fina, analizada con 8 loci microsatélites nucleares en 20 poblaciones de Phoenix canariensis: 5 poblaciones en Gran Canaria, 5 poblaciones en Tenerife y 10 poblaciones en La Gomera. F1 , promedio del coeficiente de co-ancestro (Fij) en la primera clase de distancia; blin y blog , pendientes de la regresión de los valores de Fij en la distancia espacial lineal y logarítmica, respectivamente; estadísticos Sp (Splin y Splog), indicador del alcance de la SGS, calculado como -b (1 - F1), y usando ambos tipos de pendientes (blin y blog). Tabla 4.11 Correlaciones de Spearman entre los estadísticos de variación genética y los parámetros que caracterizan la ocupación del hábitat de Phoenix canariensis en el paisaje. ALT, altitud media de las poblaciones; Npalm, número de palmeras en un radio de 600m en torno a las poblaciones analizadas; Ho, heterocigosidad observada; Hs, heterocigosidad esperada balanceada; FIS, coeficiente de endogamia; promedio FST, grado de divergencia de las poblaciones; estadísticos Splin y Splog, indicadores del alcance de la SGS. Los coeficientes de correlación que mostraron una relación significativa se muestran en negrita. de SGS dentro de las poblaciones están positiva y significativamente relacionados con los niveles de endogamia y divergencia exhibidos por las poblaciones. En la Tabla 4.11 están todos los coeficientes de correlación de Spearman y su significancia entre las variables estudiadas. Resultados 61 Figura 4.7 Autocorrelogramas de las 20 poblaciones de Phoenix canariensis analizadas a escala fina. Los promedios del coeficiente de co-ancestro (Fij) están representados en relación a la distancia geográfica de separación entre los individuos (dij). Las líneas discontinuas representan los intervalos al 95% de confianza, y los puntos que salen de estos márgenes indican una desviación significativa de la distribución espacial aleatoria (P<0,05). DISCUSIÓN Foto: Javier Gil 70 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis La implicación potencial del flujo genético mediado por el hombre sobre la estructura genética observada merece cierta atención. A diferencia de otras especies arbóreas de relevante interés económico (Logossa et al., 2011; Balaguer et al., 2011), el patón observado de decrecimiento de la variación genética desde el este al oeste, así como la significativa estructuración de las poblaciones localizadas en las islas orientales, difícilmente pudo haber sido el resultado de la propagación mediada por el ser humano. No obstante, la única población muestreada en Lanzarote (LHA) es una excepción, ya que no se ajusta a ninguno de los patrones generales que se han descrito. En primer lugar, dada la cercanía geográfica con Fuerteventura (sólo 10,6 Km separan ambas islas) y la historia biológica (Reyes-Betancort et al., 2008) y geológica que comparten (ambas islas constituyeron una única unidad hace 10.000 años; Fernández-Palacios et al., 2011), se podría esperar que ambas islas también estuvieran genéticamente emparentadas, lo cual no ha sido el caso de acuerdo con todos los análisis realizados (Figura 4.2, Figura 4.3 y Online Resource 2 del Anexo II). Además, el ajuste de los datos genéticos a un modelo IBD claramente mejoró al excluir esta población, confirmando que se trata de un caso atípico en los patrones generales. En segundo lugar, los registros históricos disponibles en relación a la presencia de P. canariensis en las Islas Canarias también son coherentes con la idea del origen antrópico de esta población. Por ejemplo, si bien la Historia Natural de Plinio señala la presencia de palmeras en las Islas Afortunadas (Hatic et palmeris caryotas ferentibus (libro 6, Capítulo 32), las primeras referencias históricas fiables se encuentran en Le Canarien, en la cual Le Bontier y Le Verrier (~1402) documentan la relación de la Conquista y exploraciones realizadas por los normandos a principios del siglo XV en las Islas Canarias, y no incluyen a P. canariensis en las descripciones de la vegetación de Lanzarote. Tampoco existen referencias de P. canariensis en los trabajos escritos de George Glas (1764), quien describió detalladamente las Islas Canarias, y especialmente la isla de Lanzarote donde permaneció un tiempo. La primera cita de esta especie es por parte de un autor anónimo que compiló escritos sobre Lanzarote y fue publicado en 1776, en donde se menciona la presencia de algunas palmeras en la población de Haría (Reyes-Betancort et al., 1998, y las referencias allí incluidas). Las evidencias escritas sugieren que la población de P. canariensis muestreada en Haría pudo haberse plantado en las postrimerías del siglo XVIII a partir de especímenes portados desde otras islas, con el objetivo de proveer la materia prima para la cestería, una de las actividades artesanales más importantes en la época (Madoz, 1845-1850). Sin embargo, estos hechos no descartan la posibilidad de que pequeños parches o individuos aislados de P. canariensis se encuentren actualmente en Lanzarote como resultado de eventos naturales de dispersión y colonización, o que la alta transformación geológica que ha experimentado esta isla a lo largo de sus historia, pudiera haber extinguido o reducido drásticamente las poblaciones naturales en esta isla. Por otro lado, los resultados del análisis demográfico mediante el método ABC, apoyaron consistentemente el escenario en el cual la población genética ancestral de P. canariensis divergió siguiendo una progresión de este a oeste acorde con la configuración de lineal del archipiélago canario. Es más, la reducción progresiva de las estimaciones de los tamaños poblacionales efectivos Discusión 71 ancestrales, tal y como indicó el análisis ABC (NA3 < NA2 < NA1), así como el patrón de IBD observado, sugieren que P. canariensis colonizó inicialmente el archipiélago canario siguiendo un modelo stepping-stone. Este patrón de colonización ha sido descrito en varios taxones canarios (Juan et al., 2000; Emerson, 2002; Talavera et al., 2013) así como en otros archipiélagos oceánicos (Harbaugh et al., 2009; Yamada y Maki, 2012). Sin embargo, las simulaciones de ABC, en concordancia con los resultados obtenidos con BARRIER y SAMOVA, también sugieren que el modelo de diferenciación stepping-stone no se sostiene en las islas occidentales, indicando claramente una divergencia común para estas islas (i.e. escenario 3) más que la diferenciación secuencial completa de este a oeste en el archipiélago (i.e. escenario 4). Estudios adicionales basados en información obtenida con marcadores plastidiales ayudarán a dilucidar el patrón y la ruta de colonización seguida por esta especie. Por otra parte, la señal moderada de expansión de las poblaciones observada en las islas centrales (Gran Canaria, Tenerife y La Gomera) coincide con el hecho de que estas islas albergan el mayor número de palmerales de P. canariensis. Así pues, la expansión demográfica detectada podría estar indicando expansión geográfica de la especie en cada isla. Las expansiones geográficas, unido al patrón general de IBD detectado a lo largo del archipiélago, podría generar la genealogía más agrupada que se ha observado en los resultados del STRUCTURE (Excoffier et al., 2009b; Logossa et al., 2011) para las islas centrales (Figura 4.3). En relación a los tiempos de divergencia estimados para los principales grupos genéticos de P. canariensis en el archipiélago, el tiempo inferido para la divergencia de la isla más oriental del supuesto ancestro continental fue bastante reciente (en torno a los 139.000 años atrás), en el periodo Pleistoceno. Estas estimaciones deben ser tomadas con cautela ya que el modelo aplicado asumió distribuciones de partida para las parámetros bastante flexibles por la falta de información previa en aspectos demográficos y evolutivos de P. canariensis, así como las mismas tasas de mutación para todos los loci, factores que pueden causar sesgos en las estimaciones. No obstante, independientemente de la incertidumbre en torno a la datación exacta de la colonización inicial de P. canariensis en las islas, el método ABC apoyó fuertemente un patrón reciente de divergencia comenzando en la isla de Fuerteventura. Además, la colonización de P. canariensis en las islas durante el Pleistoceno tardío es coherente por varias razones. Primero, es un taxón ampliamente distribuido a lo largo del archipiélago sin haber experimentado eventos de especiación, a pesar de poder estar bajo fuertes presiones selectivas a lo largo de su distribución teniendo en cuenta el amplio rango de zonas ecológicas que habita. Alternativamente, la falta de especiación podría ser explicada por un flujo genético extensivo a lo largo de las subpoblaciones debilitando la estructura genética a lo largo del archipiélago (García-Verdugo et al., 2014), pero los resultados no apoyan este escenario, al menos para las islas orientales. Segundo, otros taxones leñosos de amplia distribución que muestran considerables niveles de variación genética en las islas se cree que han colonizado esta región durante el Pleistoceno (Fernández-Mazuecos y Vargas, 2010). Sin embargo, P. canariensis muestra niveles moderados o bajos de variación genética, los cuales pueden ser explicados por una presencia reciente en el archipiélago. Además, el 72 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis patrón de distribución de esta especie, con un bajo número de individuos dispersos en la isla de El Hierro (y potencialmente en Lanzarote), unido con una reciente diferenciación genética entre poblaciones de las islas occidentales, sugieren que han sucedido pocos eventos de dispersión desde el establecimiento de las poblaciones a lo largo del archipiélago. 5.3 DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA A ESCALA INSULAR Uno de los objetivos del diseño experimental a escala insular consistió en aumentar el tamaño muestral de individuos y poblaciones analizadas con el propósito de incrementar la precisión de los análisis establecidos, y en todos los casos no dio lugar a variación en los niveles de diversidad genética de las poblaciones de P. canariensis. En la mayoría de los casos, las poblaciones alcanzan valores de diversidad genética de bajos a moderados (Tabla 4.7), comparables a los obtenidos con microsatélites nucleares para P. dactylifera en diversos cultivos de esta especie en el norte de África (rango observado de He: 0,4760,614; Zehdi et al., 2015). Por otro lado, las estimaciones confirman el fuerte patrón decreciente de este a oeste (correlación de Spearman entre la Longitud and He: r=0,604; P<0,01), por lo que el valor de diversidad genética alcanzado en las distintas islas y poblaciones es un reflejo de la colonización secuencial y relativamente reciente de P. canariensis a lo largo del archipiélago, tal y como se mencionó en apartados anteriores. Además, prácticamente todas las poblaciones siguen ajustándose a las proporciones esperadas según el equilibrio de HW, con sólo dos excepciones que muestran un déficit de heterocigosidad (GSO y CAT), aunque posiblemente relacionado con la incidencia del efecto Wahlund debido a que los ejemplares se distribuyen en grupos relativamente distanciados entre sí (González-Pérez et al., 2004). En general, los resultados señalan que P. canariensis responde a lo esperado para una especie alógama y longeva (Petit y Hampe, 2006), en la cual existe solapamiento de generaciones y se mantiene la mayor proporción de la variabilidad genética (> 79%) dentro de las poblaciones (Tabla 4.9). Incluso, con su aparente habilidad para la dispersión y establecimiento de las poblaciones en una gran amplitud de hábitats, deberíamos quizás esperar un menor grado de estructuración genética y menores niveles de diferenciación genética a los encontrados (>10%; ver Nybom, 2004). No obstante, el patrón observado en P. canariensis es acorde a varios estudios basados en endemismos canarios de amplia distribución y habilidades para la dispersión a larga distancia, que muestran una considerable estructura genética a nivel intra-insular (Gómez et al., 2003; García-Verdugo et al., 2010; Mairal et al., 2015). De forma general y para P. canariensis, se puede trazar un paralelismo entre los patrones observados en Gran Canaria y La Gomera. En primer lugar, ambas islas albergan el 86% del total de los ejemplares naturales de P. canariensis presentes en las Islas Canarias (42% en Gran Canaria y 44%, en La Gomera). Además, presentan una topografía similar, caracterizada por una Discusión 73 cadena de profundos barrancos conectados en sus cumbres como resultado de la predominancia de los procesos erosivos (ver ontogenia de las islas formadas por puntos calientes descrita en Fernández-Palacios et al., 2011). Las condiciones de humedad edáfica ofrecida en los fondos de barrancos favorecen considerablemente el establecimiento y crecimiento de las poblaciones de esta especie, por lo que posiblemente, la mayor disponibilidad de hábitats apropiados para P. canariensis en ambas islas, pudo favorecer una rápida expansión geográfica a lo largo del territorio insular. En este sentido, y aunque la distribución actual de la especie representa un vestigio de la existente en el pasado, las evidencias paleoecológicas sugieren una importante representación de P. canariensis en estas dos islas durante el comienzo del Holoceno (Nogué et al., 2013; de Nascimento et al., 2015). En segundo lugar, el patrón de diferenciación genética de las poblaciones se ajusta a un modelo de ‘aislamiento por distancia’ (Test de Mantel: r =0,652 en Gran Canaria y r=0,780 en La Gomera, en ambos casos P<0,001). Teniendo en cuenta el potencial dispersivo a largas distancias de P. canariensis, así como la abundancia de palmerales naturales en estas dos islas, se podría esperar un gran alcance del flujo genético y una débil estructura genética de las poblaciones, al menos a escala insular. Sin embargo, el hecho de que P. canariensis haya colonizado recientemente el archipiélago, y el posible efecto restrictivo que pueda tener la orografía insular sobre la dispersión de la especie, favoreciendo el intercambio genético entre palmerales ubicados en el mismo barranco o en las cercanías, parecen factores potenciales en el trazado de un cambio gradual de las frecuencias alélicas de las poblaciones con respecto a la distancia geográfica. La genealogía más agrupada que se observa en el caso de Gran Canaria, además de exhibir un patrón de IBD más débil que en La Gomera, sugieren que la historia demográfica de las poblaciones ha podido estar influenciada por un contexto más complejo de aislamiento reproductivo, pudiendo ser resultado de la divergencia producida entre las poblaciones en sólo pocas generaciones de aislamiento (Falush et al., 2003). Un escenario que coincide con el fuerte impacto que ha ocasionado el ser humano sobre los bosques canarios desde su llegada a las Islas Canarias (Naranjo, 2002; Morales, 2009), afectando al hábitat de la palmera canaria y fragmentando la continuidad espacial de sus poblaciones, aunque con menor alcance en la isla de La Gomera. Esta idea es coherente con recientes investigaciones paleoecológicas en la isla de Gran Canaria, que confirman una importante disminución de los registros de polen fósil de P. canariensis durante el Holoceno tardío asociado a los cambios humanos (de Nascimento et al., 2009, 2015), en comparación con La Gomera, donde el decremento de P. canariensis durante el mismo periodo es menos pronunciado, y en cualquier caso debido a cambios climáticos (Nogué et al., 2013). Finalmente, la fuerte separación de la población GEL (La Gomera) recreada en todos los análisis responde posiblemente a un grado de introgresión genética de la especie congénere y alóctona, Phoenix dactylifera, masivamente introducida en el archipiélago canario, incrementado la diversidad y diferenciación genética observada en este palmeral. Los resultados obtenidos con 74 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis un análisis exploratorio en STRUCTURE con toda la base de datos e incluyendo muestras de diferentes especies congéneres de Phoenix así lo indican (datos aún sin publicar), respondiendo al patrón observado en otros estudios focalizados en palmerales mixtos de ambas especies (González-Pérez et al., 2004). Por el contrario, es posible que los procesos demográficos sobrellevados por P. canariensis en Tenerife estén marcados por un escenario de mayor aislamiento reproductivo, desarrollando un cambio discontinuo y desigual de las frecuencias alélicas con independencia de la distancia geográfica (Test de Mantel: r =-0,078; P>0,05). A diferencia de las islas anteriores, la parte central de la isla de Tenerife ha sufrido una intensa transformación debida a numerosos episodios de vulcanismo secundario y mega deslizamientos gravitacionales (Ancochea et al., 1999; Boulesteix et al., 2013) que han determinado su forma actual, caracterizada por una fuerte pendiente pero sin profundos barrancos en la parte central por el poco tiempo que ha pasado de exposición erosiva. Además, la mayor parte del sur de la isla esta cubierta por lavas fonolíticas, originadas por el vulcanismo post-erosivo del volcán Las Cañadas (Ancochea et al., 1999), sobre las cuales se han desarrollado suelos de propiedades ácidas y de gran permeabilidad. Todo ello ha dado lugar a un contexto de menor disponibilidad del hábitat necesario para el establecimiento de P. canariensis, siendo coherente con la escasa representación de esta especie en la isla (≈5% del total de ejemplares presentes en el archipiélago canario), así como la práctica inexistencia de palmerales naturales en el sur de la isla (ver Figura 3.5). En este sentido, las pruebas paleoecológicas también apoyan lo comentado para esta isla, apuntando hacia una baja representación de P. canariensis al comienzo del Holoceno a diferencia de La Gomera y Gran Canaria, mostrando además un importante decremento tras el establecimiento de los asentamientos humanos en esta isla (de Nascimento et al., 2009). Es posible que el efecto del impacto humano sobre la continuidad espacial de las poblaciones de palmera canaria, hayan acrecentado aún más el aislamiento geográfico de las poblaciones en Tenerife, conduciendo por un lado a mayores niveles de diferenciación genética y a una reducción de los niveles de diversidad genética de las poblaciones en esta isla (Tabla 4.7). 5.4 ESTRUCTURA GENÉTICA ESPACIAL (SGS) A ESCALA FINA Los niveles de la SGS detectados a escala fina fueron notablemente diferentes entre las poblaciones analizadas, aunque es posible que las estimaciones puedan estar sujetas a cambios al aumentar los tamaños muestrales (Vekemans y Hardy, 2004; Cavers et al., 2005). No obstante, a la luz del parámetro más robusto Sp , más de la mitad de las poblaciones analizadas exhibieron valores considerablemente elevados (Splin>0,016; Tabla 4.10), comparables con aquellos referidos para especies con restricciones en la dispersión de polen y semillas, especialmente similares al de las especies barócoras (Sp=0,028; Vekemans y Hardy, 2004). No obstante, también fueron semejantes a los observados en especies de gran potencial dispersivo pero en áreas fragmentadas, como Discusión 75 ocurre en Pinus pinaster (Sp=0,026; De Lucas et al., 2009), o en masas de baja densidad local, como en Sorbus torminalis (Sp=0,017; Oddou-Morutorio et al., 2004). Los patrones de SGS a escala fina surgen principalmente de una compleja interacción de factores como la magnitud de la dispersión de polen y semillas, la estructura genética de la nube polínica y el conjunto de semillas dispersadas, y la densidad poblacional (Vekemans y Hardy, 2004). No obstante, los niveles de SGS entre individuos próximos también pueden variar fuertemente entre los estadios de crecimiento, siendo generalmente más potentes en los primeros estadios de vida y disminuyendo en el tiempo. De esta manera, en especies arbóreas se pueden observar niveles bajos de SGS a escala fina a pesar de llevar a cabo una dispersión polínica predominantemente a cortas distancias, gracias a procesos de reducción demográfica de plántulas genéticamente emparentadas ya sea por depresión endogámica (Nakanishi et al., 2015), competencia intraespecífica o acción de enemigos naturales cerca de los parentales (Hampe et al., 2010; Choo et al., 2012). En el caso de P. canariensis, aunque la mayor proporción de eventos de dispersión polínica ocurran a corta distancia, las medias y largas distancias de polinización efectiva detectadas en Acusa Verde (CAC) sugieren que la especie exhibe un amplio rango de dispersión polínica, y por tanto, se esperaría una mezcla eficiente de los genes dentro de la población que impidiese la formación de la SGS entre individuos próximos. No obstante, esta población exhibió una clara agregación de genotipos emparentados a menos de 20m de separación entre ejemplares, y en otras poblaciones o se confirma o se intuye la existencia de estructuras familiares locales (Tabla 4.10; Figura 4.7). Varios estudios han sugerido que la formación de la SGS dentro de las poblaciones es mayormente desencadenada por las restricciones en la dispersión de semillas que en el flujo de polen (Chung et al., 2003; Hampe et al., 2010; Choo et al., 2012; Heer et al., 2015). Especialmente en árboles que portan una gran cantidad de semillas y muchas caen por gravedad, como es el caso de la palmera canaria, se puede producir una agregación de la progenie cerca de las plantas madres incluso exhibiendo una dispersión polínica de gran alcance (Wang et al., 2011; Heer et al., 2015). No obstante, esta idea no es suficiente para explicar la variabilidad observada en las estimaciones de SGS entre poblaciones, exhibiendo en muchos casos un señal prácticamente nula de SGS. Además, por lo que se sabe hasta ahora, en la dispersión de semillas de la palmera canaria también participan las aves y los lagartos, que generalmente dispersan a largas y medias distancias, favoreciendo un solapamiento de las sombras de semillas dispersadas por diferentes vectores. Asimismo la notable acción de los escolítidos de las semillas de palmeras (Coccotrypes dactyliperda y Dactylotrypes uyttenboogaarti) podría tener un potencial efecto en la reducción de genotipos emparentados, impidiendo el establecimiento de los mismos cerca de la madre. Un análisis que aborde conjuntamente los sistemas de dispersión de polen y semillas, así como de los factores que operan en los procesos post-dispersivos de P. canariensis, podría revelar más información acerca de la contribución relativa de cada componente de la dispersión en el flujo genético efectivo entre las plántulas reclutadas y en los patrones de SGS a escala fina. 76 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis Por otro lado, los cambios físicos producidos sobre la distribución espacial de la especie por pérdida y/o fragmentación del hábitat, también pueden promover variaciones en los patrones de SGS a escala fina, a pesar de que la especie tenga de forma intrínseca gran habilidad para la dispersión (Oddou-Morutorio et al., 2004; Wang et al., 2011). Los resultados en P. canariensis muestran una correlación significativa entre el grado de divergencia genética de las poblaciones (promedio de FST) y el alcance de la SGS a escala fina en cada una de ellas (según los valores de Sp ; Tabla 4.11), así como una relación negativa entre ambos parámetros y la abundancia de esta especie en el paisaje próximo a las poblaciones estudiadas. Estas tendencias dejan entrever que las trasformaciones demográficas que ha podido sufrir el hábitat de P. canariensis como consecuencia del impacto humano (sin descartar otros factores), resultando en cambios de densidad y aislamiento geográfico de las poblaciones, podría haber causado un incremento de la estructura genética a diferentes escalas geográficas. En este sentido, la fragmentación y reducción del hábitat, puede llevar implícito la erosión de la diversidad genética, la pérdida de sitios favorables para el establecimiento de las plántulas, y variaciones en los kernels de dispersión de polen y semillas (suscitando un movimiento no aleatorio de los dispersores), que de forma conjunta promueven la distribución espacial de genotipos emparentados, y por tanto, el aumento del alcance de la SGS a escala fina (Oddou-Morutorio et al., 2004; Mayol et al., 2012). No obstante, los niveles de diferenciación genética y SGS a escala fina en las distintas poblaciones, no se corresponden con una pérdida de diversidad genética de las poblaciones (Tabla 4.11), o al menos en la isla de Gran Canaria que exhibe poblaciones genéticamente muy diversas pero también notablemente diferenciadas del resto (Tabla 4.7), y con patrones de SGS a escala fina. Tampoco parece que los niveles de diversidad genética estén influenciados por la continuidad espacial de la distribución de P. canariensis a lo largo del paisaje, sugiriendo cierta resiliencia de la diversidad genética frente a las perturbaciones demográficas. Éste patrón es coherente con resultados previos que apuntan a un débil efecto de la fragmentación sobre las estimaciones de diversidad genética en especies longevas y anemófilas (Hamrick, 2004; Hampe y Petit, 2006; Wang et al., 2011), o al menos en pocas generaciones después de producirse los cambios demográficos, a diferencia de la SGS a escala fina que se establece en pocas generaciones (De Lucas et al., 2009; Browne et al., 2015). Además, el efecto de los cambios demográficos dependerá de la historia de la perturbación y de las características del hábitat y las poblaciones, pudiendo una misma especie exhibir diferentes respuestas en la SGS (Wang et al., 2011). Teniendo en cuenta la amplitud ecológica que abarca la distribución de P. canariensis, no sería ilógico pensar que determinadas poblaciones fueran más vulnerables que otras a sufrir los efectos de la fragmentación y/o reducción del hábitat en la formación de la SGS entre individuos próximos. En definitiva, las características genéticas de las poblaciones varían en su sensibilidad frente a las perturbaciones demográficas, y particularmente la SGS a escala fina puede ser un útil indicador de los cambios genéticos producidos en áreas recientemente fragmentadas (Wang et al., 2011; Browne et al., 2015). En el caso de P. canariensis, sería conveniente investigar más a fondo las causas que determinan la SGS entre individuos próximos así como las características de las poblaciones y el hábitat que pudieran acrecentar la sensibilidad de la especie ante cambios demográficos. Discusión 77 5.5 IMPLICACIONES PARA LA CONSERVACIÓN Los niveles de diversidad y estructuración genética de las poblaciones naturales, deben constituirse como elementos a tener en cuenta en los posibles programas y planes de conservación y obtención de recursos genéticos de P. canariensis. Por un lado, ya que la población de Acusa Verde es la única catalogada como fuente semillera para la isla de Gran Canaria, han de tenerse en cuenta algunos de los patrones genéticos observados en el diseño de estrategias de muestreo para las colectas de germoplasma destinado a la conservación ex situ. La estructura genética de la nube polínica y la gran variabilidad detectada en las tasas de paternidad correlacionadas entre familias maternas, sugieren que las colectas deben establecerse de forma abundante y diversificada, y colectando semillas procedentes tanto de distintas hembras de la población como entre las diferentes infrutescencias de cada hembra. Por otro lado, la estructura genética espacial observada y las distancias medias de polinización efectiva estimadas, apuntan a que se debería respectar una distancia mínima de separación de entre 20m y 70m entre las madres con objeto de reducir el grado de parentesco entre familias maternas. Al mismo tiempo, esta medida debería combinarse con una colecta que alterne entre germoplasma procedente de distintas hembras entre los diferentes ciclos reproductivos. Por otro lado, dada la evidencia de una cantidad significativa de polen inmigrante procedente de larga distancia, no puede descartarse la posibilidad de que se puedan producir procesos de introgresión genética desde especies alóctonas del género Phoenix. Ello hace que la presencia de ejemplares de Phoenix dactylifera, cultivados y plantados extensamente en parques y jardines, y asilvestrados en muchas áreas de las Islas Canarias próximas a poblaciones naturales de P. canariensis, supongan una gran amenaza para la conservación de este endemismo insular, por lo que se torna necesario evaluar el nivel de intercambio de polen entre áreas naturales y plantadas. Uno de los intereses en la conservación de especies de amplia distribución, es mantener la representación de sus poblaciones a lo largo del gradiente ambiental que habitan, ya que puede llevar implícitos procesos de adaptación local de las poblaciones a diferentes condiciones climáticas y medioambientales. La mayor proporción de variabilidad genética de P. canariensis fue observada dentro de las poblaciones, aunque a la vez exhibiendo un considerable nivel de estructura genética a escala insular. Ello sugiere que se deba conservar una amplia representación de palmerales naturales, respetando el número mínimo de unidades genéticas detectadas en cada isla, y evitando tanto el trasiego de ejemplares entre islas (especialmente para el caso de Haría por su carácter antropogénico) como la plantación masiva de especímenes de palmera canaria sin mantener un control sobre la procedencia del material de base utilizado. Finalmente, 78 Variabilidad genética y dispersión polínica del endemismo canario Phoenix canariensis y ya que los procesos de diferenciación y estructuración genética de las poblaciones muestran una mayor sensibilidad a la continuidad espacial de la especie a lo largo del paisaje, se debe evitar los procesos de fragmentación, especialmente en islas donde la especie se ha establecido recientemente como en La Palma, ya que pueden comprometer la estabilidad evolutiva de las poblaciones naturales. 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