Epidemiología, agentes causales y métodos diagnósticos en pacientes con fiebre de duración intermedia en Gran Canaria

! ! UNIVERSIDAD!DE!LAS!PALMAS!DE!GRAN!CANARIA! ! FACULTAD!DE!CIENCIAS!DE!LA!SALUD! ! ! DEPARTAMENTO!DE!CIENCIAS!CLÍNICAS! PROGRAMA'DE'DOCTORADO:'MICROBIOLOGÍA'Y'ENFERMEDADES'INFECCIOSAS'' ! ! ! ! Epidemiología,!Agentes!causales!y!Métodos!diagnósticos! en!pacientes!con!Fiebre!de!Duración!Intermedia!en!Gran! Canaria! ! TESIS!DOCTORAL!PRESENTADA!POR!Dña.!Margarita!Bolaños!Rivero! DIRIGIDA!por!los!Profesores!Dr.!Antonio!Manuel!Martín!Sánchez,!Dra.!O.! Évora!Santana!Rodríguez!y!Dr.!José!Luis!Pérez!Arellano! ! ! EL!DIRECTOR! LA!DIRECTORA! EL!DIRECTOR! LA!DOCTORANDA! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!En!Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!!a!!23!de!Noviembre!!del!2015! ! DEDICATORIA/s! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A!mi!padre! ! ' ' A"José"Luis,"ya"que"sin"su"inestimable"ayuda,"esta"tesis"no"se"hubiera"escrito." " A"Évora,"por"su"ayuda"constante"y"sus"sabios"consejos." " A"Antonio"Manuel,"por"introducirme"en"“el"mundo"de"la"Coxiella”"y"por"su"insistencia" en"que"hiciera"este"trabajo."" " A" Cristina," porque" durante" más" de" diez" años" hemos" trabajado" en" este" tema." Y" a" Antonio" y" a" Rubén," que" fueron" los" acompañantes" fieles" en" la" recogida" de" las" garrapatas." " A"Noé"Rodríguez"y"a"Carlos"Gutiérrez,"que"me"ayudaron"en"la"recogida"de"las"muestras" y"a"entender"el"mundo"de"los"veterinarios"y"los"ganaderos." " A"todos"los"miembros"de"la"Unidad"de"Enfermedades"Infecciosas"y"Medicina"Tropical," por"su"ayuda,"por"estar"ahí"para"la"recogida"de"las"muestras"y"por"su"aportación"en"la" publicación"de"muchos"de"los"artículos."No"podría"olvidar"a"Alfonso"AngelOMoreno,"que" estaba" convencido" que" las" cepas" causantes" de" fiebre" Q" en" Canarias" tenían" que" ser" diferentes"de"las"del"resto"de"España." " A"Pino"Sosa,"por"su"ayuda"esencial""en"el"laboratorio." " A"todo"el"personal"de"Majadahonda"(Pedro,"Isa,"Raquel""y"Horacio"),"que"junto"con"el" resto" del" personal" de" los" Patógenos" Especiales" nos" enseñaron" las" técnicas" de" laboratorio"empleadas"en"este"trabajo.""Al"personal"de"Neiker,"que"nos"enseñaron"a" hacer"muestreos"ambientales,"recogida"de"garrapatas"en"animales"y"a"identificar"las" mismas." " Al" resto" de" los" participantes" en" la" beca" del" INIA," ya" que" muchos" de" los" trabajos"de"esta"tesis"se"hicieron"para"ese"proyecto." " Finalmente," a" todos" los" que" nos" trajeron" o" nos" dijeron" donde" había" " garrapatas" (hermanos," sobrinos," compañeros" de" trabajo," amigos," etc)," porque" en" determinado" momento"parecía"que"sólo"vivíamos"para"ellas."Y"ya"desde"el"principio"pensamos"que" estos"animalitos"serían"maravillosos"(aunque"no"todos"compartían"esta"idea)."" " Finalmente"debo"incluir"los"proyectos"que"han"subvencionado,"en"parte,"este"trabajo:"" •""ULPGC"con"el"proyecto"“Epidemiologia"de"la"fiebre"Q"en"las"Islas"Canarias”." •"FUNCIS" " con"los" proyectos" “Diagnóstivo"directo" de" las" rickettsiosis" prevalentes"en" nuestro"medio"("fiebre"Q"y"tifus"murino)”"(FUNCIS"26/03),"y"“Estudio"de"las"rickettsiosis" en"Gran"Canaria”"(FUNCIS"34/04)." •"FIS"con"el"proyecto"“Ecologia"y"control"de"la"fiebre"Q"en"Gran"Canaria”"(PI"051011)." •"Del"INIA"(FAU"2006O00002OC04O03),"con"el"proyecto"coordinado"de"“Ecologia"de"la" fiebre"Q"en"Gran"Canaria”."! ! ! AGRADECIMIENTOS ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ÍNDICE! ! I.X!INTRODUCCIÓN!17! 1.1!Fiebre!de!duración!intermedia!(FDI)'19' 1.1.1.'Delimitación'del'problema' 19' 1.1.2.'Concepto'de'fiebre'de'duración'intermedia' 21' 1.1.3.'Epidemiología'y'causas'de'fiebre'de'duración'intermedia'' 21' 1.2.!Fiebre!Q'23' 1.2.1.'Aspectos'históricos'23' 1.2.2.'Taxonomía'y'Microbiología' 26' ' ' 1.2.2.1.'Taxonomía' 26' ' ' 1.2.2.1.'Microbiología'27' 1.2.3.'Epidemiología'28' ' ' 1.2.3.'1.'Aspectos'generales' 34' ' ' 1.2.3.2.''Fiebre'Q'como'antropozoonosis' 34' ' ' 1.2.3.3. Transmisión'de'Coxiella!burnetii'al'ser'humano' 35' ' ' 1.2.3.4.'Patrones'epidemiológicos' 37' ' ' 1.2.3.5.'Distribución'geográfica'39' ' ' 1.2.3.6.' Resumen"de"las"características"epidemiológicas"de"la"infección" por"Coxiella!burnetii! 54! 1.2.4.'Patogenia'y'Fisiopatología'56' !!!!!!! 1.2.4.1.'Estudios'en'animales'de'experimentación' 56' ' ' 1.2.4.2.'Estudios'histopatológicos'en'humanos'' 57' ' ' 1.2.4.3.'Estudios'en'cultivos'celulares''59' ' ' 1.2.4.4.'Estudios'de'citocinas'y'células'mononucleares'circulantes' 59' ' ' 1.2.4.5.'Integración'de'los'aspectos'patogénicos'y'fisiopatológicos'de'la'fiebre' Q' ' ' ' ' 60' 1.2.5.'Manifestaciones'clínicas'y'datos'de'laboratorio'63' 1.2.6.'Diagnóstico'etiológico'y'seguimiento' 70' 1.2.7.'Tratamiento' 76' 1.2.8.'Prevención'77' 1.3.! Tifus!murino'79' 1.3.1.'Aspectos'históricos' 79' 1.3.2.'Taxonomía'y'Microbiología'79' ' ' 1.3.2.1.'Taxonomía' 79' ' ' 1.3.2.1.'Microbiología'80' 1.3.3.'Epidemiología'81' ' ' 1.3.3.1.'Aspectos'generales' 81' ' ' 1.3.3.2.'Estudios"de"seroprevalencia!82! ! ! 1.3.3.3.'Series"de"casos"clínicos"" 83"" 1.3.4.'Patogenia'y'Fisiopatología'85' ' ' 78! 1.3.5.'Manifestaciones'clínicas'y'datos'de'laboratorio'87' ' ' ' ''''! 1.3.6.'Diagnóstico'etiológico'y'seguimiento' 91' '''''1.3.7.'Tratamiento' 94' '1.3.8.'Prevención'95' 1.4.! Bibliografía'97' ' ' ' II.X!OBJETIVOS!127' ' III.X!ARTICULOS!DE!INVESTIGACION!135' ' IV.X!CONCLUSIONES!232! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 22 ! En!las!Consultas!externas!de!la!UEIMT!la!fiebre!prolongada!supone!un!problema! clínico!muy!frecuente!(19).!!Específicamente!desde!el!1!de!Junio!de!1998!al!31!de!Mayo! de!2015!se!han!evaluado!2054!pacientes!con!FDI!(Tabla!II).!! ! ! Parra!et!al! (12)! Espinosa!! (13)! Pérez! Arellano! (19)! Años! 2000K05! 1983K9! 2004K5! 1998K2015! Nº!pacientes! 233! 505! 179! 2054! Sexo*! 164!V/69M! 404V/95M! 117V/62M! 1384V/706M! Edad**! 15K89! 32.6±17.4! 39.7±15.8! 14K89! Diagnóstico!final! 34%! 81,1%! 60,9%! 43%! Fiebre!Q! 13,6%! 21,4%! 11,7%! 14,5%! Citomegalovirus! 6,8%! 2,5%! 6,7%! 3,7%! Rickettsiosis! 4,7%! 18,5%! 6%! 10,1%! Virus!Epstein!Barr! 2,5%! 5,9%! 5,5%! 4,1%! Brucelosis! 2,1%! 19,2%! 3,3%! 0%! VIH***! 0%! 0%! 4,4%! 1,1%! *V/M:!Varón!/Mujer!!!**En!años!***!Primoinfección! Tabla!II:!Series!de!Fiebre!de!duración!intermedia!en!España! ! El!análisis! global! de! los!datos! indica!tres! aspectos:! (i)! los! casos! de! esta! entidad! indican! una! incidencia! importante! en! los! tres! estudios! mencionados! (ii)! un! tanto! por! ciento! de! casos! importantes! permanecen! sin! diagnóstico! al! finalizar! el! estudio! y! (iii)# globalmente,! la! fiebre! Q! y! las! rickettsiosis! son! las! enfermedades! infecciosas! más! frecuentes!responsables!de!este!síndrome.!! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 23 1.2.!Fiebre!Q! La!fiebre!Q!es!una!zoonosis!de!distribución!mundial!causada!por!Coxiella#burnetii# (20`25).#En!este!apartado,!revisaremos!los!aspectos!más!importantes!de!esta!infección,! incluyendo! aspectos! históricos,! características! taxonómicas! y! microbiológicas,! epidemiología,! patogenia! y! fisiopatología,! manifestaciones! clínicas! y! complementarias,! métodos!diagnósticos,!posibilidades!terapéuticas!y!métodos!de!prevención.!##!!!! ! 1.2.1.!Aspectos!históricos! Las!primeras!menciones!de!la!enfermedad!referidas!en!la!literatura!corresKponden! al! final! de! la! década! de! los! 30! en! el! siglo! XX! (26,27,28).! Así,! en! 1935! apareció! una! enfermedad!que!afectó!a!nueve!trabajadores!de!un!matadero!de!Queensland!(Brisbane,! Australia)!(Figura!2).!Esta!enfermedad!recibió!!la!denominación!de!fiebre!Q!por!!E.!Derrick! (Figura!3)!quien!describió!el!cuadro!clínico!que!correspondía!a!un!síndrome!febril!con!una! duración! entre! 7! y! 24! días! acompañado! de! cefalea,! astenia,! anorexia! y! dolor! en! las! extremidades!inferiores!con!hemocultivos!y!pruebas!!serológicas!frente!a!influenza,!tifus,! leptospiras,!fiebre!recurrente,!fiebre!tifoidea!y!paratifoidea!negativos.!!La!denominación! de! esta! enfermedad! como! “fiebre! Q!“(“until# fuller# knowledge# should# allow# a# better# name”)! hace! referencia! al! “misterioso”! origen! de! la! enfermedad! (en! inglés! "query"! significa!duda,!pregunta!o!interrogación)!y!no!a!su!descripción!en!Queensland!(26).!! !!!!!!!!!!!!!! ! Figura!2:!Matadero!de!Old!Cannon!Hill!(Brisbane).!Tomado!de!la!referencia!27!! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 24 ! La!identificación!del!agente!causal!tiene!lugar,!de!forma!casi!simultánea!,en!dos! partes! del! Mundo! en! esa! época.! Por! un! lado,! el! agente! causal! fue! aislado! de! los! trabajadores!infectados!tras!inoculación!a!cobayas,!identificándose!en!el!hígado!y!bazo! como!una!rickettsia!por!F.M.!Burnet!y!M.!Freeman!en!1937!(figura!3).!En!ese!momento!se! denominó!al!microorganismo!causal!Rickettsia#burnetii.!Por!otro!lado,!en!Nine!Mile!Creek! (Montana,!EE.UU.)!!G.E.!Davis!y!H.R!Cox!(figura!4)!publicaron!en!1938!la!detección!de!un! agente!filtrable!en!un!garrapata!de!la!zona!(Dermacentor#andersoni)!al!que!denominaron! Rickettsia# diaporica.# Además,! el! propio! director! de! los! NIH! (R.E.! Dyer),! revisando! los! estudios!de!Cox!!desarrolló!un!cuadro!clínico!similar!al!descrito!por!Derrick!en!Australia!lo! que!sugirió!que!ambos!agentes!causales!eran!similares.!Teniendo!en!cuenta!que!algunas! de!las!características!de!los!microorganismos!no!correspondían!exactamente!a!las!de!las! especies!del!género!Rickettsia,!se!denominó!al!agente!causal!como!Coxiella#burnetii,!en! honor!a!dos!de!los!autores!responsables.!!!!! ! Junto! con! la! fiebre! de! las! trincheras! y! el! tifus! epidémico,! la! fiebre! Q! causó! epidemias!en!los!ejércitos!que!lucharon!en!Europa!durante!la!Segunda!Guerra!Mundial.! Así,! las! tropas! estadounidenses! que! ocuparon! Italia! presentaron! cinco! brotes! bien! documentados! de! fiebre! Q! entre! el! invierno! de! 1944! y! la! primavera! de! 1945,! principalmente! relacionados! con! la! residencia! en! edificios! ! ocupados! previamente! por! animales! domésticos.! También! los! soldados! alemanes! fueron! afectados! por! esta! enfermedad! tras! su! estancia! en! Serbia! (denominándose! Balkan# Grippe),! Italia,! Crimea,! Grecia,! Ucrania! y! Córcega.! Curiosamente,! los! civiles! residentes! habituales! de! esas! regiones!parecían!resistir!la!infección!y,!de!hecho,!se!encontraba!entre!ellos!una!alta!tasa! de!anticuerpos!residuales!frente!a!Coxiella#burnetii.!!Esto!sugería!que!la!infección!era!ya! endémica!en!la!cuenca!del!Mediterráneo!en!la!época!de!su!descripción!en!Australia.!! ! Desde!entonces!y!hasta!la!actualidad,!la!bibliografía!acerca!de!diferentes!aspectos! de! la! fiebre! Q! (caracterización! del! agente! causal,! aspectos! genéticos,! patrones! epidemiológicos,!formas!clínicas,!métodos!diagnósticos!y!medidas!teraKpeúticas)!se!han! incrementado!de!forma!exponencial.!En!apartados!posteriores!se!indicarán!los!principales! datos!de!interés.!! !! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 25 ! !!!!!! Figura!3:!Autores!de!la!descripción!de!fiebre!Q!e!identificación!de!Coxiella. burnetii. ! E.#Derrick F.M.$Burnet G.E.$Davis H.R.$Cox Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 26 1.2.2.!Taxonomía!y!microbiología!! !! ! 1.2.2.1.!Taxonomía! ! La! clasificación! taxonómica! del! único! agente! causal! de! la! fiebre! Q! (Coxiella# burnetii)! ha! ido! variando! considerablemente! desde! su! descripción! inicial.! ! Como! se! indicaba!en!el!apartado!anterior,!debido!a!las!características!fenotípicas!se!calsificó!en!el! género!Rickettsia!(R.#burnetii,!R.#diaporica).!Posteriormente,!se!detectaron!características! diferenciales!que!llevaron!a!la!clasificación!en!un!género!aislado!!(Coxiella)!dentro!de!la! familia!Rickettsiaceae!y!orden!Rickettsiales!(figura!4).! ! ! Figura!4:!!Taxonomía!clásica!de!Coxiella.burnetii!y!Rickettsia..typhi! ! Sin!embargo,!la!secuenciación!del!RNAm!y!del!genoma!completo!de!C.#burnetii!ha! permitido!reclasificar!al!microorganismo!dentro!de!la!familia!Legionalleacee,!incluida!en! la!división!γ!de!las!Proteobacterias(29)!(figura!5)!.!! !! ! ! Orden&Rickettsiales* Familia& Rickettsiaceae) Familia& Bartonellaceae Familia& Anaplasmataceae Gé nero Coxiella Género Rickettsia G é nero Ehrlichia Género Anaplasma Género Bartonella Coxiella(burnetii Rickettsia)typhi …… . ……. ……." ……." Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 27 ! Figura!5:!!Taxonomía!actual!de!Coxiella.burnetii!y!Rickettsia..typhi! ! 1.2.2.2.!Microbiología! ### Coxiella# burnetii# es! un! bacilo! pequeño! que! presenta! dos! variedades. diferentes. morfológica. y. funcionalmente:! SCV! (small# cell# variants)! y! LCV! (long# cell# variants)! (30).! Ambas!formas!han!podido!ser!separadas!para!su!análisis!mediante!gradientes!de!cloruro! de! cesio.! Las! SCV! miden! entre! 0,2! y! 0,5! µm,! tienen! forma! bacilar,! presentan! una! cromatina!condensada,!mientras!que!las!LCV!son!mayores! (>!1!µm),!pleomórficas,!con! cromatina! dispersa! y! una! estructura! típica! de! membrana! con! peptidoglicano,! espacio! periplásmico!y!membrana!externa.!Ambas!formas!son!capaces!de!infectar!células!aunque! poseen!diferencias!funcionales.!Así,!las!SCV!poseen!una!escasa!actividad!metabólica,!se! replican!de!forma!escasa!y!son!estables!en!el!ambiente,!mientras!que!las!LCV!son!muy! activas! metabólicamente,! se! replican! de! forma! activa! y! son! mecánicamente! frágiles.! Además,!se! han! identificado! en! algunas! LCV! unas! estructuras! similares! a! esporas! (SLP,! spore# like# particles)! de! significado! incierto.! En! la! figura! 6! se! muestran! imágenes! características!de!estas!formas.! ! ……. ……. ……. Proteobacterias División"α Familia&Legionellaceae G é nero Rickettsia Coxiella(burnetii Legionella)spp Francisella*spp Rickettsia)typhi …… . División"β División"γ Divisió n" δ División"ε Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 28 ! Figura!6:!!Variedades!morfológicas!de!Coxiella.burnetii. a..SCV.(small.cell.variants),.LCV.(long.cell.variants).y.SLP.(sporeDlike.particles)! ! ! El!análisis!de!la!composición!proteica!de!estas!variantes!también!ha!demostrado! diferencias!notables.!Así,!las!SCV!!presentan!una!proteína!externa!de!membrana!(OMP)! característica! OMP34! ,! a! diferencia! de! las! LCV! que! presenta! OMP! P1.! Además! las! SCV! poseen!una!gran!concentración!de!dos!proteínas!(Hq1!y!ScvA)!!de!carácter!básico!que! juegan!un!papel!importante!en!la!condensación!de!la!cromatina.!Por!el!contrario,!las!LCV! presentan! una! mayor! expresión! de! dos! proteínas! de! 35! y! 45kDa! que! desempeñan! funciones!como!factores!de!elongación.! ! Estas! características! estructurales! hacen! que! Coxiella! burnetii! posea! una! extraordinaria!capacidad! para! la.supervivencia.extracelular. y. de.resistencia. a. agentes. físicos.o.químicos.!Así,!sobrevive!de!7K10!meses!en!lana!a!15K20ºC,!durante!más!de!un! mes!en!carne!fresca!almacenada!en!frío!y!por!más!de!40!meses!en!leche!desnatada!a!4K 6ºC.!!Por!otro!lado,!se!han!recuperado!microorganismos!viables!tras!calentamiento!a!63! ºC!durante!30!minutos,!tras!exposición! a! una! solución!salina!al! 10%! durante! 180! días,! después!de!la!exposición!a!formalina!al!0,5%!y!tras!sonicación!en!agua!destilada!durante! más!de!30!minutos.!!! ! Aunque! posee! una! membrana! similar! a! la! de! los! bacilos! gramnegativos,! no! se! observa!en!la!tinción!de!Gram.!Las!principales!métodos!para!la!visualización.microscópica! en!tejidos!son!la!tinción!de!Giemsa,!la!tinción!de!Giménez!y!!la!tinción!de!Machiavello.!! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 29 ! Un!aspecto!de!gran!relevancia!en!la!biología!de!Coxiella# burnetii!es!su!variación! antigénica,! también! denominada! “variación. de. fase”.! Este! fenómeno! se! debe! a! modificaciones! en! el! principal! mecanismo! de! virulencia! del! microorganismo:! el! lipopolisacárido!(LPS).!En!la!naturaleza,!Coxiella#burnetti!expresa!antígenos!de!fase!I!!que! corresponden! a! LPS! con! cadenas! O! laterales! completas.! Este! LPS! completo! permite! enmascarar!antígenos!de!superficie!bacterianos!a!los!receptores!de!reconocimiento!de! patrones!de!las!células!dendríticas,!permitiendo!su!infección!sin!activación!posterior.!Tras! subcultivo! en! medios! celulares! o! en! el! curso! de! la! enfermedad! en! hospedadores,! se! produce!un!cambio!del!LPS!a!antígenos!de!fase!II!(con!una!cadena!O!lateral!truncada),!que! no! limita! el! acceso! de! los! anticuerpos! a! la! superficie! bacteriana.! Por! ello,! los! microorganismos!en!fase!II!son! mucho!menos!virulentos.!El!estudio!de!los!anticuerpos! generados!frente!a!ambos!tipos!de!antígenos!tiene!utilidad!en!el!diagnóstico!(ver!más! adelante).!! ! Tradicionalmente,! para! el! cultivo!de! Coxiella# burnetii!se! requieren! medios! celulares! con! condiciones! estrictas! de! aislamiento! (P3).! Sin! embargo! recientemente! se! han! desarrollado! medios! axénicos,! diseñados! atendiendo! a! las! características! de! la! vacuola! intracelular! en! la! que! se! multiplica! Coxiella# burnetii! y! a! los! requerimientos! metabólicos! de! esta! bacteria! (31).! En! la! composición! de! estos! axénicos! de! cultivo! son! necesarios!varios!requerimientos:!(i)! un! pH! moderadamente!ácido!(pH!≈! 5)! mantenido! por!un!tampón!citrato,!(ii)!una!concentración!de!iones!Na+,!K+!y!ClK!similares!a!los!del! medio! extracelular,! (iii)# un! aporte! principal! de! péptidos! (aporte! de! carbono! preferido! frente!a!los!glúcidos),!aportados!en!forma!de!neopeptona,!casaminoácidos!y!LKcisteina!y! (iv)!una!concentración!de!oxígeno!baja!(1K5%).! !El! genoma!de! Coxiella# burnetti! ha! sido! caracterizado! en! diferentes! estudios! (29,32,33).! El! tamaño! oscila! entre! 1,5! y! 2,4! M! de! pares! de! bases! (! 2,1! en! la! cepa! de! referencia! Nine! Mile).! Es! un! genoma! menor! que! el! de! bacterias! extracelulares! pero! considerablemente!superior!al!de!otras!intracelulares.!El!genoma!de!Coxiella#burnetii!está! formado!por!un!cromosoma!bacteriano!y!plásmidos!facultativos.!!! El!cromosoma#bacteriano!es!circular!(29),!aunque!en!trabajos!previos!se!sugería!la! posibilidad!de!una!estructura!lineal!(32).!El!contenido!de!G+C!es!del!42,6%!y!el!número!de! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 30 genes! codificantes! de! proteínas! es! de! 2094.! Los! genes! codificantes! más! importantes! pueden!clasificarse!en!varios!grupos:! ! •! Cuatro! intercambiadores! de! Na+/H+! probablemente! implicados! ! en! la! homeostasis!del!pH!y!la!supervivencia!en!medio!ácido.! !!! •!Tres!transportadores!osmoprotectores.! ! •! Un! número! elevado! de! sistemas! de! eflujo! de! drogas,! que! facilitan! resistencia!a!las!defensinas!en!el!fagolisosoma.! ! •!Dos!trasportadores!para!glúcidos!(xilosa!y!glucosa).! ! •! 15! transportadores! para! aminoácidos! y! tres! para! péptidos,! lo! que! ejemplifica!su!papel!básico!en!el!aporte!de!carbono.! ! •!Un!transportador!para!glutamato.! ! •!Enzimas!para!la!vía!de!EmbdenKMeyerhof!(glucólisis)!y!la!ruta!de!EntnerK Doudoroff! (vía! alternativa! que! cataboliza! glucosa! a! piruvato),! gluconeogénesis,! cadena! transportadora!de!electrones,!vía!de!las!pentosas!y!vía!de!los!ácidos!tricarboxílicos.! ! •!Enzimas!implicadas!en!la!síntesis!de!purinas!y!pirimidinas,!ácidos!grasos!y! fosfolípidos.!! ! •!Componentes!del!lipopolisacárido:!lípido!A,!“core”!y!!antígeno!O.! ! •!Trece!proteínas!con!dominio!ankirina!relacionadas!con!la!adhesión!entre! el!microorganismo!y!las!células!del!hospedador.!! Además,! el! cromosoma! de! Coxiella# burnetii! presenta! otras! características! de! interés:! (i)! A! diferencia! de! otras! bacterias! intracelulares! obligadas,! en! las! que! habitualmente! existe! escasa! oportunidad! de! intercambio! genético,! las! diferentes! variantes! de! Coxiella# burnetii# poseen! entre! 31! y! 59! secuencias# de# inserción! (IS)! pertenecientes!a!8!familias.!(ii)!En!el!gen!de!23S!!rRNA!existen!dos!tipos!de!intrones!tipo!I,! que!modulan!el!crecimiento!de!la!bacteria!y!(iii)!el!análisis!del!genoma!ha!demostrado!un! número!muy!elevado!de!pseudogenes!(hasta!207!en!la!cepa!Nine!Mile)!lo!que!sugiere!que! el!microorganismo!se!encuentra!en!una!primera!fase!de!adaptación!al!hospedador.!! !!!!!!!!!! Se! han! descrito! cuatro! tipos! de! plásmidos! en! diferentes! aislados! de! Coxiella# burnetii:! QpH1,! QpRS,! QpDG! y! QpDV! (34,35,36,37,38).! Además,! se! ha! descrito! una! secuencia!homóloga!a!la!de!estos!plásmidos!insertada!en!el!cromosoma!bacteriano!de! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 31 algunas!variantes!genéticas!(plasmidless!o!“S”)!.!Es!importante!señalar!que,!en!estudios! de! hibridación! cruzada,! se! observa! una! parte! conservada! denominada! “core”! que! representa!aproximadamente!el!50%!de!la!información!genética!de!todos!los!plásmidos!o! pseudoplásmidos! indicados.! ! La! fecha! de! detección,! origen! biológico! de! las! muestras,! cepas!y!tamaño!de!los!plásmidos!se!indican!en!la!tabla!III!.!El!plásmido!QpH1!fue!descrito! inicialmente!por!Samuel!et.!al.!en!1983!en!la!cepa!Mile!Nine!obtenida!de!garrapatas!y! tiene!un!tamaño!de!37!kb.!EL!segundo!plásmido!descrito!en!1985!por!el!grupo!de!Samuel! et!al!fue!QpRS!en!una!cepa!de!Coxiella#burnetii!(Priscilla)!procedente!de!una!placenta!de! cabra!y!tiene!un!tamaño!mayor!(39!kb)!.!La!identificación!del!plásmido!QpDG..se!realizó# en!1989!por!Mallavia!et.!al.!en!roedores!salvajes!de!Utah!(Dugway)!siendo!su!tamaño!el! mayor! de! los! plásmidos! (42! Kb).! Finalmente,! en! 1995! se! identificó! el! plásmido! QpDV# aislado! en! dos! cepas! rusas! (neumonía! en! un! paciente,! leche! de! vaca)! y! tres! francesas! (fiebre!Q!aguda,!aneurisma!aórtico!y!endocarditis!crónica),!siendo!el!de!menor!tamaño! (33,5!kb).!! ! Plásmido! Autores!(año)! Origen! Cepa! Tamaño! QpH1! Samuel!et!al.!(1983)! Garrapata! Nine!Mile! 37!Kb! QpRS! Samuel!et!al.!(1985)! Cabra! Priscilla! 39!Kb! QpDG! Mallavia!et!al.!(1989)! Roedores! Dugway! 42!Kb! QpDV! Valkova!et.!al.!(1995)! Humanos!(4)! ! ! ! Q1940! MAC! MAN! ME! 35,5!Kb! Leche!de!vaca!(1)! Q321! ! Tabla!III:!Plásmidos!de!Coxiella.burnetii. ! ! Desde! un! punto! de! vista! patogénico,! parece! que! el! papel! fundamental! de! los! plásmidos! reside! en! la! presencia! de! genes! que! codifican! sustratos! del! sistema! de! transporte!tipo!IV,!un!importante!factor!de!virulencia!(39).!Por!otro!lado,!los!plásmidos! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 38 !Dentro!de!las!formas!accidentales,!la!fiebre!Q!posee!importancia!en!dos!contextos! diferentes:! la! afectación! de! la! cabaña! ganadera! y! la! infección. en. humanos.!En! esta! revisión!se!considerarán!principalmente!los!aspectos!médicos,!señalando!exclusivamente! los!datos.veterinarios!en!relación!a!la!infección!humana.!! ! Tras! el! contacto! del! ser! humano! con! Coxiella# burnetii,! no! todos! los! sujetos! desarrollan!infección.!Por!otro!lado,!dentro!de!los!que!produce!la!infección!(detectada! por!métodos!serológicos),!no! todos! ellos!desarrollan!manifestaciones! clínicas,! es! decir,! enfermedad.!!! !La!fiebre! Q! se!presenta!habitualmente! como!enfermedad! autóctona,! aunque!el! número!de!casos.importados!!publicados!en!los!últimos!años!ha!sido!progresivamente! mayor!(63,64,65,66,67,68,69,70,71).! Los! casos! de! fiebre! Q! autóctonos! pueden! presentarse! en! forma! de!brotes,! de! mayor! o! menor! importancia! (ver! más! adelante)! o! como!casos. aislados.! En! ambas! situaciones! la! fiebre! Q! puede! manifestarse! de! forma! aguda! o! crónica! Además,! las! formas! agudas! presentan! dos! formas! principales:! neumónica!y!febril!(ver!más!adelante).! ! Figura!9:!Patrones!epidemiológicos!de!la!infección!por!Coxiella.burnetii! Infección(por(Coxiella(burnetii% Accidental Bioterrorismo! Animales Humanos Infección Enfermedad)(fiebre)Q) Casos%importados Casos%autóctonos Distribución Manifestaciones+clínicas Brotes Casos%aislados Agudas Crónicas Neumonía Síndrome'febril Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 39 1.2.3.5.!Distribución!geográfica! !La!infección!por!Coxiella#burnetii!presenta!una!distribución!mundial,!afectando!a! países!de!los!cinco!continentes.!Sin!embargo,!la!construcción!de!un!“mapa”!unívoco!de! esta!infección!se!encuentra!con!tres!problemas!fundamentales:!(i)!las!múltiples!formas! epidemiológicas!de!la!infección!señaladas!en!el!apartado!anterior!(p.!ej.!datos!clínicos,! seroprevalencia,!datos!en!animales!domésticos!y!salvajes,!infección!de!garrapatas),!(ii)!la! consideración!de!“no!declarable!de!forma!obligatoria”!de!esta!enfermedad!en!muchos! países!y!!(ii)!el!interés!en!el!estudio!de!esta!entidad.!Así,!estamos!totalmente!de!acuerdo! con! una! sentencia! clásica! de! Didier! Raoult,! uno! de! los! autores! más! importantes! en! el! estudio!de!la!fiebre!Q!y!de!las!rickettsiosis,!que!indica!acerca!de!la!fiebre!Q:!“differences## in#prevalence#are#mainly#related#to#differences#in#interest”!(72).! ! ! Las!referencias!publicadas!recogidas!en!PubMed!!(1!de!Septiembre!2015)!son!muy! numerosas!tanto!!acerca!de!la!fiebre!Q!(4.470)!!como!sobre!!Coxiella#burnetii!!(2.860).!Un! número! importante! se! refieren! a! aspectos! epidemiológicos.! En! esta! revisión! nos! centraremos! en! los! datos! de! la! bibliografía! española! señalando! algunos! aspectos! importantes!en!otros!países.!! ! ! 1.2.3.5.1!Fiebre!Q!en!España! ! !La!descripción!de!casos!de!infección!por!Coxiella#burnetii!en!España!tiene!lugar!en! torno!a!los!años!50!del!siglo!XX.!En!aproximadamente!3!años!se!describe!la!presencia!del! microorganismos! en! garrapatas! (Hyalomma# marginatum,! Rhiphicephalus# bursa!y! Rhiphicephalus# sanguineus)! ! en! Madrid! y! Sevilla! (73),! el! primer! caso! en! humanos! en! Salamanca! (74)! y! la! presencia! de! anticuerpos! en! fauna! silvestre! (conejos! y! lirones)! en! Madrid!(75).!!!!! ! ! A!partir!de!los!años!80!del!siglo!pasado,!el!interés!por!esta!enfermedad!ha!sido! creciente,!detectándose!tanto!casos!de!fiebre!Q,!aislados!como!en!brotes,!estudiándose! la!seroprevalencia!de!la!infección! en!diferentes!regiones!y!evaluándose!la!infección!en! animales!domésticos!y!silvestres.!!! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 40 ! !! En!la!tabla!VI!se!indican!las!principales!series!de!casos!publicados!de!fiebre!Q!en! España!desde!1980!hasta!la!actualidad!(12,13,73`110).!Específicamente,!en!la!Tabla!VIa!se! indica!la!fecha!de!publicación!y!el!primer!autor!responsable!de!la!misma,!la!comunidad!en! la!que!se!se!describió,!el!perfil!epidemiológico!básico!(brote!y/o!casos!esporádicos),!el! número!de!casos,!la!edad!de!los!pacientes!y!la!distribución!por!sexos.!!En!la!Tabla!VIb!se! incluyen!otros!datos!de!interés!como!el!ámbito!de!adquisición!(distinguiendo!los!casos! rurales!y!urbanos),!la!distribución!estacional![Primavera!(Marzo,!Abril!y!Mayo);!!Verano! (Junio,! Julio,! Agosto),! Otoño! (Septiembre,! Octubre,! Noviembre)! e! Invierno! (Diciembre,! Enero,!Febrero)]!o!no,!el!contacto!con!animales!y!la!forma!clínica!de!presentación!(aguda! o!crónica!y,!dentro!de!los!casos!agudos!la!presencia!de!neumonía!o!síndrome!febril!sin! foco!aparente).! ! En!la!figura!9!se!representan!las!comunidades!con!series!publicadas!de!fiebre!Q.!! Además! existen! dos! publicaciones! basada! en! los! datos! microbiológicos! sobre! la! incidencia!de!fiebre!Q!(110,111).!!! ! En!la!tabla!VII!se!indican!los!principales!estudios!seroepidemiológicos!acerca!de!la! prevalencia!de!infección!por!Coxiella#burnetii!en!humanos,!el!año!de!estudio!y!el!contexto! en!el!que!se!realizó!(114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,!124,125,126,127).! ! Los!datos!acerca!de!la!prevalencia!de!infección!por!Coxiella#burnetii!en!animales! domésticos!!(128,129,130,131,132,133,134,135)!se!expresan!en!la!tabla!VIII.! ! Finalmente,!en!la!tabla!IX,!se!indican!los!datos!acerca!de!la!infección!por!Coxiella# burnetii!en!diferentes!especies!de!garrapatas!en!varias!!regiones!españolas!(136,137).! En!las!figuras!10,!11!y!12!se!recopila!la!información!de!estos!estudios.!! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 41 ! Ref! Primer!autor! Año! Comunidad! Tipo! Nº! casos! Edad! Varone s! 76! Sobradillo!V.! 1983! Euskadi! Brote! 10! 15K59! 30%! 77! Montejo!M.! 1983! Euskadi! Esporádicos! 11! 17K65! 80%! 78! Aguirre!C.! 1984! Euskadi! Brote! 42! 5K56! 58%! 79! Martinez!F.! 1985! Andalucía! Esporádicos! 34! 8K68! 59%! 80! Fernandez!R.! 1985! Madrid! Esporádicos! 37! 13K57! 72%! 81! Montejo!M! 1985! Euskadi! Mixto! 130*! 5K67! 74%! 82! Rubiés!J! 1986! Cataluña! Esporádicos! 5! 25K38! 100%! 83! Fernández!M.!! 1998! Madrid! Esporádicos! 3! 28K43! 33,3%! 84! Sobradillo!V.! 1999! Euskadi! Esporádicos! 116! 30!±!15! 77%! 85! Millán!M.! 1989! Canarias! Esporádicos! 35! 40! 80%! 86! Rotaeche!R.! 1990! Euskadi! Brote! 5! 12K46! 60%! 87! Antón!E.! 1990! Euskadi! Esporádicos! 60! 14K87! 80%! 88! Murie!M.!! 1991! Navarra! Esporádicos! 19! 27! 83%! 89! Martinez!JM.! 1992! Euskadi! Brote! 30! 17K55! 90! 90! Bella!F.! 1994! Cataluña! Esporádicos! 17! 32!±!11! 82%! 91! Pascual!F.! 1996! Canarias! Esporádicos! 94! 39!!FID!! 54!Neumonía! ND! 92! Merino!FJ.! 1998! CastillaKLeón! Esporádicos! 13! 10K41! 85%! 93! Abad!A.! 1999! Euskadi! Esporádicos! 73! 1K68! 78%! 94! Domingo!P.! 1999! Cataluña! Esporádicos! 63! 19K72! 92%! 95! Nebreda! 2001! Soria! Brote! 18! 14K26! 86%! 96! Nuño!!FJ.! 2002! Asturias! Mixto*! 12! 24K85! 75%! 97! Alarcón!A.! 2003! Andalucía! Esporádicos! 231! 8K77! 85%! 98! Bolaños!M.! 2004! Canarias! Esporádicos! 40! 20K74! 85%! 99! Sampere!M.! 2003! Cataluña! Esporádicos! 66! 45±18! 85%! 100! Romero!MJ! 2003! Andalucía! Esporádicos! 109! 31±12! 92%! 101! Miguelez!M.! 2003! Canarias! Esporádicos! 47! 22K77! 96%! 102! Bartolomé!J.! 2004! Castilla.LaMancha! Esporádicos! 35! 7K67! 71%! 103! Ramos!JM.! 2005! Valenciana! Esporádicos! 30! ND! 73%! 104! de!los!Rios!R.! 2006! Madrid! Brote! 22! ND! ND! 105! García!M.! 2004! Asturias! Esporádicos! 60! 46!±!17! 72%! 106! Muñoz!A.! 2007! Extremadura! Esporádicos! 124! 14K77! 80%! 12! Parra!J.! 2008! Andalucía! Esporádicos! 32! ND! ND! 13! Espinosa!N.! 2010! Andalucía! Esporádicos! 111! ND! ND! 107! Ruiz!Seco!MP.! 2011! Madrid! Esporádicos! 54! ND! 81%! 108! Mogollón!MV.! 2011! Multicéntrico! Esporádicos! 83! 44!±!14! 78%! 109! Raya!M.! 2014! Baleares! Esporádicos! 87! 21K89! 79%! 110! Espejo!E.!! 2014! Cataluña! Canarias! La!Rioja! Esporádicos! 71! 85! 27! 42!±!15! 80%! *!!Incluye!pacientes!de!referencias!previas! ! ! Tabla!VI!a.!Series!de!casos!de!fiebre!Q!publicadas!en!España! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 42 Ref! Comunidad! Ámbito! Estación! Animales! Forma!clínica! 76! Euskadi! Rural! Verano! NO! Aguda!(Neumonía)! 77! Euskadi! Mixto! Rural!(50%)! K! SI! Aguda!(Neumonía)! 78! Euskadi! Rural! Primavera! SI! Aguda!(Neumonía)! 79! Andalucía! Mixto! Rural!(50%)! K! SI! (50%)! Aguda! Fiebre!(2/3)!Neumonía!(1/3)! 80! Madrid! K! Verano! SI!(30%)! Aguda!(32)/Crónica!(5)! 81! Euskadi! Rural! Prim.! SI! Aguda!(Neumonía)! 82! Cataluña! Urbana! K! NO! Aguda!(Fiebre)! 83! Madrid! K! K! K! Crónica! 84! Euskadi! Mixto! Rural!(50%)! Invier/Prim.! SI!(18%)! Aguda!(Neumonía)! 85! Canarias! Rural! Prim/!Ver! SI!(85%)! Aguda!(Fiebre)! 86! Euskadi! Rural! Invierno! SI! Aguda!!Neumonía!(3)!Fiebre!(2)! 87! Euskadi! Rural! Otoño! Si!(17%)! Aguda!(Neumonía)! 88! Navarra! K! Invier/Prim! K! Aguda!(Neumonía)! 89! Euskadi! Rural! Primavera! K! Aguda!(Fiebre)! 90! Cataluña! Urbana! K! K! Aguda!(Fiebre)! 91! Canarias! Rural! K! K! Aguda!(Fiebre)! 92! CastillaKLeón! K! K! Si!(15%)! Aguda!(Neumonía)! 93! Euskadi! K! K! K! Aguda!!Neumonía!(75%)! 94! Cataluña! Urbana! Primavera! NO! Aguda!!Fiebre!(54%)! 95! Soria! Rural! Primavera! SI!(21%)! Aguda!(Neumonía50%)! 96! Asturias! Urbana! K! SI!(25%)! Aguda!(Neumonía!)! 97! Andalucía! Mixto! Urbana!(53%)! Primavera! SI!(39%)! Aguda!!Fiebre!(90%)! 98! Canarias! Mixto! Rural!(67%)! Prim/!Ver! SI!(38%)! Aguda!Fiebre!(92%)! 99! Cataluña! Urbano! Invier/Prim! SI!(33%)! Aguda!(Neumonía!55%)! 100! Andalucía! Mixto! Rural!(50%)! K! SI!(27%)! Aguda!Fiebre!(98%)! 101! Canarias! K! K! SI!(51%)! Aguda!(Fiebre)! 102! Castilla! La! Mancha! Mixto! Urbana!(71%)! No!! SI!(27%)! Aguda! Fiebre!(71%! 103! Valenciana! Mixto! Urbano!(67%)! No! SI!(80%)! Aguda! Fiebre!(87%)! 104! Madrid! Rural! Primavera! SI! Aguda!(Fiebre)! 105! Asturias! Mixto! Urbana!(52%)! Invierno! Si!(7%)! Aguda!(Neumonía)! 106! Extremadura! Mixto! Rural!(61%)! Invierno! Primavera! SI! (47%)! Aguda!(Fiebre!94%)! Crónica!(6%)! 12! Andalucía! K! K! K! Aguda!(Fiebre)! 13! Andalucía! K! K! K! Aguda!(Fiebre)! 107! Madrid! Mixto! Urbano!(52%)! No! SI!(59%)! Aguda!(92%)!Neumonía!(55%)! Crónica!(8%)! 109! Baleares! Mixto! Rural!!(45%)! Prim/Ver! SI!(46%)! Aguda!Neumonía!(66%)! 110! Cataluña! Canarias! La!Rioja! K! K! K! Primavera! Primavera! Invierno! K! Aguda!(Fiebre!80%)! Aguda!(Fiebre!70%)! Aguda!(Fiebre!54%)! 111! Múltiple! K! K! SI!(70%)s! Crónica! ! Tabla!VI!b.!Series!de!casos!de!fiebre!Q!publicadas!en!España! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 43 ! Ref! Primer!autor! Año! Comunidad!(Nº)! Contexto!(Nº)! Técnica!/!Seroprevalencia! 114! Daza!RM.! 1980! Madrid! Donantes! Microaglutinación!6,2%! 115! Tellez!A.! 1989! Madrid! Población!general! Rural!N=130,! Urbana!N!=91! IFA!8,8%!(urbano)K15,4%(rural)! 116! Cour!MI.! 1990! ! Extremadura! CastillaKLa!Mancha! Madrid! Población!general! (180)! (86)! (577)! Fijación!de!complemento! 59,3%! 32,3%! 27,5K34,5%! 117! Ruiz!Beltrán!R.! 1990! CastillaKLeón! Población!general! (400)! IFA!:50,2%!(IgG!fase!II!≥!1:40)! 118! Pascual!!F.! 1992! Canarias!(390)! Población!general! (390)! Fijación!de!complemento! 4,7K13,5%!(IgG!fase!II!≥!1:8)! 119! Saz!J.V.! 1993! Castilla!León! Población!general! (298)! Inmunofluorescencia!indirecta!! 20.8%%(IgG!fase!II!≥!1:80)!! 120! Sanzo!J.M.! 1993! Euskadi! Población!general! (810)! IFA≥!1/20:!32,35%! IFA≥!1/40:26,4%! 121! Pérez!Trallero!E.! 1995! Euskadi! Mataderos! (39)! Inmunofluorescencia!indirecta!! 91,7%(IgG!fase!II!≥!1:80)! 122! Suárez!J! 1996! CastillaKLeón! Población!!general! (406)! IFA!!60,6%!(IgG!fase!II!≥1:80)!! 123! Pascual!F.! 1998! Cantabria! Población!general! (595)! IFA!48,6%!(IgG!fase!II!≥!1:16)! IFA!37,8%!(!IgG!faseII≥1:64)! 124! Valencia!MC! 2000! Aragón! Estudiantes! de! Veterinaria! (480)! Fijación!del!complemento≥!1:10! 10,02%!comienzo!de!curso! 11,02%!final!de!curso! 125! Cardeñosa!N.! 2006! Cataluña! Población!general! 216! IFA!15%!(IgG!fase!II!≥!1:40)!! 126! Bartolomé!J.! 2007! CastillaKLa!Mancha! Donantes!de!sangre! 863! Inmunofluorescencia!indirecta!! 23%!(IgG!fase!II≥!1:80)!! 127! González!S.! 2014! CastillaKLa!Mancha! Enfermedad! cardiovascular! 164! IFA!! 52%!(IgG!fase!II≥!!1:256)!! Tabla!VII.!Estudios!de!infección!en!humanos!por!Coxiella.burnetii!publicados!en!España! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 44 Ref! Primer!autor! Año! Comunidad! Tipo/s!de!mamífero/s! Número! Técnica/Prevalencia! 128! Palau!L.! 1989! Madrid! Rumiantes! domésticos! Bovinos!106! Fijación!de!Complemento*! 67%!(IgG!fase!II!≥1:8)! 115! Tellez!A.! 1999! Madrid! Rumiantes!domésticos! Fijación!de!complemento≥1:8! Caprino!(76,6%)! Bovino!(17,7%)! 129! Barandika!J.! 2007! Euskadi! Micromamíferos! silvestres! (253)! Apodemus#sylvaticus!(162)! Mus#domesticus!(28)! PCR! 3/253! Apodemus#sylvaticus!(1/162)! Mus#domesticus#(2/28)! 130! Ruiz!Fons!F! 2008! Andalucía! Asturias! Rumiantes!domésticos! Mamíferos!silvestres! !Inmunofluorescencia!indirecta!! (IgG!fase!II!!≥!1:16)! Corzos!(15,4%)! Ciervo!rojo!!silvestre!(5,6%)! Ciervo!rojo!doméstico!!(40%)! Ganado!bovino!(39%)! 131! Navarro!J.A.! 2009! Murcia! Ovinos! Caprinos! PCR!en!placenta! 132! Ruiz!Fons!F.! 2010! Euskadi! Rumiantes!domésticos! Ovinos!(1379)! Bovinos!(626)! Caprinos!(115)! ELISA!!con!FC!posterior! Ovinos!(11,8%)! Bovinos!(6,7%)! Caprinos!(8,7%)! 133! Astobiza!I.! 2011! Euskadi! Mamíferos!silvestres! Carnivoros!(206)! Lagomorfos!(28)! Ungulados!(199)! Pájaros!silvestres!! PCR! Carnívoros!(0%)! Lagomorfos!(7,1%)! Ungulados!(8%)! Pájaros!(2%)! 134! Alvarez!J.! 2012! Madrid! Rumiantes!domésticos! Bovinos!(1100)! ELISA***! 6,76%! 135! Mentaberre!!G.! 2013! Canarias! Camellos!(100)! ELISA****! 19%! Tabla!!VIII.!Prevalencia!de!infección!por!Coxiella.burnetii!en!mamíferos!en!España! *%Behring%%**%%ELISA%Cox%kit%***%IDVET%****%LSIVET% Ref! Primer!autor! Año! Comunidad! Nº!! Especies!(n)! Infección! por. C..burnetii! 136! Barandika!J.! 2008! Euskadi! 691! Ixodes#ricinus#(288)# Haemaphysalis#punctata#(109)# Haemaphysalis#inermis#(95)# Haemaphysalis#conncina#(52)# Dermacentor#reticulatus#(97)# Rhiphicephalus#bursa#(50)# 0%! 1!(09%)! 0%! 0%! 0%! 0%! 137! Toledo!A.! 2009! Madrid! 1482! Hyalomma'lusitanicum' Dermacentor'marginatus' Rhipicephalus'sanguineus' Rhipicephalus'pussilus' 7,7%!! (80/1039)*!! 3,4%!! (15/443)**!! 133. Astobiza!I! 2011! Euskadi! 340! Ixodes#ricinus# Ixodes#hexagonus# 0%! ! Tabla!!IX.!Prevalencia!de!infección!por!Coxiella.burnetii!en!!garrapatas!en!España! *!Aisladas!en!la!naturaleza!!**!Adheridas!a!animales! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 45 ! ! Figura!10!:!Provincias!con!series!publicadas!de!fiebre!Q!en!España! ! ! Figura!11! :! Provincias! con! datos! sero`epidemiológicos! de!infección! por! C.. burnetii!en! España! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 46 ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!Figura!12:!Estudios!de!infección!por!C..burnetii..en!animales! ! 1.2.3.5.2.!Fiebre!Q!en!otros!países!! !Existe!una!abundante!información!acerca!de!la!fiebre!Q!y!la!infección!por!Coxiella# burnetii!!en! humanos! y! animales! en! todo! el! mundo.! Una! revisión! exhaustiva! ! de! este! aspecto! escapa! a! los! objetivos! de! esta! revisión,! por! lo! que! únicamente! señalaremos! algunos!aspectos!de!especial!interés!!en!humanos!en!los!últimos!años.!! ! 1.2.3.5.2.1..Otros.países.europeos. !!!!!!!!!!En!los!últimos!años!se!han!publicado!un!número!importante!de!trabajos!sobre!la! infección! por! Coxiella# burnetii! en! varios! países! europeos! (138,139,140,141,! 142,143,144,145,146,147).! !En! Francia,# los#estudios! realizados! entre! 1982! y! 2010! muestran! una! seroprevaK! lencia!entre!el!1%!(donantes!de!sangre)!y!el!71%!en!personas!pertenecientes!a!grupos!de! riesgo!(138).!En!ese!mismo!periodo!de!tiempo,!se!han!descrito!siete!brotes!!que!incluían! desde! 5! hasta! 289! personas,! localizados! en! el! Sudeste! de! Francia! (Provenza! ,! Alpes! y! Ródano)!(138).!En!otro!trabajo,!realizado!en!el!mismo!periodo!de!tiempo!por!el!grupo!de! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 47 D.! Raoult! (139),! basado! en! la! recogida! de! datos! de! 3.723! pacientes! con! confirmación! serológica!se!observan!los!siguientes!datos:!i)#la!incidencia!anual!de!fiebre!Q!aguda!es!de! 2,5/100.000!personas!mientras!que!la!de!endocarditis!es!de!0,1/100.000!personas,!ii)!en! los!años!de!estudio!se!ha!observado!un!incremento!continuo!en!el!número!de!casos!y!iii)! la!incidencia!máxima!tiene!lugar!entre!Abril!y!Septiembre.! !En! Suiza,! la! incidencia! de! fiebre! Q! es! baja! (0,15/100.000! habitantes),! aunque! recientemente!se!ha!descrito!un!brote!de!15!personas!en!la!zona!de!viñedos!de!Lavaux! (próxima!a!las!regiones!francesas!afectadas!(140).!! !! Sin! lugar! a! dudas,! el! mayor! brote! de! casos! de! fiebre! Q! en! la! historia! hasta! la! actualidad! ha! tenido! lugar! en! Holanda! durante! los! años! 2007! a! 2010! (138,141,142,143,144).!Este!brote!afectó!a!4.026!personas!en!los!cuatro!años,!siendo!la! incidencia!máxima!en!2008!(2354).!El!análisis!de!las!características!de!este!brote!indicó! varios!aspectos!de!interés:!i)#La!edad!media!de!los!pacientes!fue!de!50!años!(RIC!21),!con! un!discreto!predominio!en!varones!62%).!ii)!La!región!que!presentó!un!mayor!número!de! casos! fue! NoordKBrabant,! que! aportó! más! del! 50%! de! los! pacientes,! iii)! existía! una! asociación!estadística!con!el!hábito!tabáquico.!iv)!Un! 21%!de!los!pacientes!requirieron! ingreso! hospitalario! v)! la! forma! clínica! más! frecuente! fue! la! respiratoria! (61,5%),! describiéndose! endocarditis! en! 3,1%! de! los! pacientes.! vi)# Aunque! existieron! datos! de! asociación!epidemiológica!en!varios!!grupos!de!paciente,!no!pudo!identificarse!un!único! origen! global! de! todo! el! brote.! vii)! Tampoco! pudo! identificarse! un! único! genotipo! en! pacientes!o!animales!estudiados,!detectándose!10!tipos!diferentes!en!el!brote.!viii)!Las! principales! razones! ! que! sustentan! la! aparición! de! este! brote! son:! el! aumento! de! la! cabaña! ganadera! en! la! región! afectada,! la! estabulación! en! áreas! abiertas,! el! método! intensivo!de!cría!,!el!aumento!del!número!de!abortos!y!la!proximidad!de!la!población!a!las! granjas! animales! (aumento! de! casos! si! la! distancia! era! <! 5! Km)! ! y! ix)! el! control! de! la! epidemia! mediante! diferentes! medidas! como! la! declaración! obligatoria! de! abortos! en! animales,!la!implementación!de!las!medidas!de!limpieza,!la!investigación!de!genoma!de! Coxiella# burnetii! en! los! depósitos! de! leche! y! la! vacunación,! inicialmente! voluntaria! y! posteriormente!obligatoria!de!los!animales.!! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 54 1.2.3.5.2.5..Oceanía. !! La! incidencia! actual! de! fiebre! Q! en! Australia! es! baja! debido! a! tres! factores:! la! vacunación,!la!falta!de!interés!en!el!diagnóstico!y!limitaciones!diagnósticas!(20).! !! ! 1.2.3.6.! Resumen! de! las! características! epidemiológicas! de! la! infección! por! Coxiella. burnetii.!! El!análisis!de!todos!los!datos!referidos!en!la!literatura!!acerca!de!la!infección!por! Coxiella#burnetii!permite!realizar!varias!generalizaciones:!! (i)! Existe! un! importante! sesgo. en. la. identificación! de! casos! de! infección! por! Coxiella# burnetii,! tanto! en! España! como! en! el! resto! del! Mundo.! A! modo! de! ejemplo,! existen! regiones! en! las! que! no! se! han! publicado! casos! clínicos! y! la! prevalencia! de! infección! y! viceversa.! Por! otro! lado,! el! número! de! casos! clínicos! publicados! en! determinadas!zonas!geográficas!es!mucho!menor!que!los!detectados!en!laboratorios!de! referencia.! (ii)!La!infección!por!Coxiella#burnetii!presenta!un!patrón.epidemiológico.similar.a. otras.enfermedades.infecciosas.intracelulares!(p.!ej.!tuberculosis),!de!tal!forma!que!del! contacto!con!el!microorganismo!no!siempre!deriva!la!infección!y,!por!otro!lado,!no!todos! los! casos! de! infección! se! manifiestan! clínicamente! (enfermedad).! Finalmente! la! enfermedad!puede!manifestarse!de!forma!aguda!o!crónica,!dependiendo!principalmente! de!las!características!del!hospedador.!!!! #(iii)!En!general,!la!fiebre!Q!es!una!enfermedad!que!afecta!predominantemente!a! adultos!en!edad.media!de!la!vida.!No!obstante,!también!se!describen!casos!en!niños!y! ancianos! dependiendo! de! las! series! estudiadas.! Entre! los! factores! implicados! se! han! descrito! las! modificaciones! hormonales! que! tienen! lugar! tras! la! pubertad,! el! riesgo! de! exposición!ambiental!y!determinadas!regiones!geográficas!(23,186).!En!algunos!estudios! se!ha!observado!que!La!media!de!edad!fue!significativamente!menor!en!pacientes!con! hepatitis!y!significativamente!mayor!en!pacientes!con!afectación!pulmonar.! (iv)! Con! algunas! excepciones,! las! diversas! series! de! fiebre! Q! muestran! un! claro! predominio!en!el!sexo!masculino.!Este!hecho!se!ha!interpretado!por!el!papel!protector! del!17KßKestradiol!en!la!expresión!clínica!de!la!infección!(192,193).! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 55 (v)! Existe! una! distribución. interanual. y. estacional! variable! de! la! fiebre! Q! dependiendo!de!los!países!!y!dentro!de!las!diferentes!regiones!de!cada!país.!De!forma! general,!predomina!en!primavera!y!verano,!lo!que!se!ha!relacionado!con!la!exposición! ambiental,! aunque! en! otras! series! se! observa! un! mayor! número! de! casos! en! otoño! o! invierno.! .(v)#Clásicamente!la!fiebre!Q!se!ha!considerado!una!enfermedad!que!predomina!en! ámbito.rural!y!en!personas!en!contacto.con.animales!(principalmente!ganado!vacuno!y! caprino).! ! No! obstante,! y! dependiendo! de! las! series,! un! número! importante! de! casos! aparecen!en!zonas!urbanas,!sin!contacto!con!rumiantes!o!relacionadas!con!contacto!con! otro!tipo!de!animales!(!gatos,!ratones).!! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 56 1.2.4.!Patogenia!y!Fisiopatología! En!los!últimos!años!se!han!publicado!múltiples!artículos!acerca!de!la!patogenia!!y! fisiopatología!de!la!fiebre!Q!tanto!en!forma!de!revisiones!(193,194,195,196,197,198,199),! como! en! estudios! realizados! en! animales! de! experimentación! (198,199,200),! datos! histopatológicos!en!enfermos!(203,204,205,206,207),!estudios!en!cultivos!celulares!(208` 216)! y! medida! de! citocinas! circulantes! y! estudio! fenotípico! de! las! células! inmunes! circulantes!(222,223,224).!Inicialmente!se!revisaran!los!datos!concretos!y!posteriormente! se!integrarán!en!una!aproximación!patogénica.! ! 1.2.4.1.!Estudios!en!animales!de!experimentación!! Existen!diferentes!modelos!animales!de!fiebre!Q!atendiendo!a!la!especie,!vía!de! administración!de!Coxiella#burnetii!y!otros!factores!(p.!e.!inmunosupresión,!modificación! genética),!cada!uno!de!los!cuales!ha!aportado!información!relevante.! ! Así,! varias! especies! singénicas! de! ratón! (particularmente! As/J! y! BALBc)! son! susceptibles! a! Coxiella# burnetii# tanto! por! vía! inhalatoria! como! intraperitoneal! (200,! 201,202,203).!De!hecho,!en!estas!especies!se!ha!establecido!el!papel!protector!del!17ßK estradiol!en!esta!enfermedad.!También!estas!especies!se!han!utilizado!en!otros!modelos! de! fiebre! Q;! en! concreto! ratonas! BALB/c! embarazadas! o! ratones! BALB/c! tratados! con! ciclofosfamida! que! desarrollan! cuadros! de! endocarditis.! Por! otro! lado,! existen! varios! modelos!murinos!que!aclaran!aspectos!importantes!de!la!patogenia!de!la!fiebre!Q,!como! las!cepas!SCID!(severe# combined# immunodeficiency)!y!el!desarrollo!de!endocarditis!con! calcificación! focal! muy! similar! a! la! humana,! los! ratones! que! sobreexpresan! ILK10! ! con! disminución! de! formación! de! granulomas! y! acumulación! de! Coxiella# burnetii!en! los! tejidos,! o! ratones! knockout! para! TLRK2! o! IFNKγ,! que! presentan! una! respuesta! febril! a! Coxiella#burnetii!fase!II.!Finalmente!la!manipulación!de!los!subtipos!de!linfocitos!B,!CD4!y! CD8! en! ratones! SCID! o! wildRtype! ha! permitido! establecer! el! papel! de! estas! estirpes! celulares!en!la!patogenia!de!la!fiebre!Q.! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 57 Otro!tipo!de!micromamífero!empleado!en!estudios!experimentales!es!el!cobaya! (200).! Tanto! por! vía! intraperitoneal! como! por! vía! inhalatoria,! la! infección! por! Coxiella# burnetti# son! muy! similares! a! la! infección! en! humanos.! Además,! la! lesión! previa! de! las! válvulas! aórticas! a! la! infección! por! Coxiella# burnetii! desencadena! una! endocarditis,! aunque!con!características!más!agudas.!! ! Aunque!no!se!han!realizado!muchos!estudios,!el!modelo!de!fiebre!Q!más!similar!al! humano! es! el! descrito! en! primates,! especialmente! en! macacos! ! (M.# fascicularis!y! M.# mulatta)!lo!que!constituye!un!dato!importante!en!el!desarrollo!de!vacunas!(203).! ! 1.2.4.2.!Estudios!histopatológicos!en!humanos!! En! la! fiebre! Q! aguda! se! describen! dos! tipos! de! afectación! histopatológica! dependiendo! del! órgano! afecto! e! independientemente! de! la! especie! animal! (66,! 204,205,206,207,208,209,210).!Así,!en!pulmón!(fig!16a),!los!hallazgos!más!!importantes! son! ! (a)! la! hipertrofia! epitelial! de! los! bronquiolos,! (b)! la! presencia! de! edema! ,! (c)! la! “bronquiolización”!del!epitelio!alveolar!y!(d)!la!aparición!de!infiltrados!inflamatorios!por! células! redondas! (linfocitos,! macrófagos)! y! plasmáticas.! Es! inhabitual! la! presencia! de! granulomas!en!pulmón.!!Sin!embargo,!en!hígado!(fig!16b),!médula!ósea!(fig!16c)!y!piel,!!la! afectación! más! característica! es! la! presencia! de! granulomas,! que! en! su! forma! más! característica! aunque! no! patognomónica,! adoptan! una! estructura! denominada! “en! doughnut”.! El! dato! característico! es! una! vacuola! lipídica! central,! con! o! sin! leucocitos! polimorfonucleares,!rodeada!de!una!empalizada!de!células!mononucleares.!La!formación! de!granulomas!bien!estructurados!se!asocia!a!una!resolución!rápida!de!la!infección.! ! ! ! ! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 58 ! Por! otro! lado,! los! datos! característicos! de! la! fiebre! Q! crónica! son! la! fibrosis! valvular,! asociada! a! calcificaciones,! vegetaciones! de! pequeño! tamaño! e! infiltrados! de! células!mononucleares!sin!formación!de!granulomas!(figura!17).!! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 59 ! 1.2.4.3.!Estudios!en!cultivos!celulares!! En!la!tabla!XI!se!indican!varios!estudios!recientes!realizados!en!cultivos!de!células! del!sistema!mononuclearKfagocítico!acerca!!de!aspectos!clave!en!la!patogenia!de!la!fiebre! Q.! Ref!! Año/Autor! Resultados! 210! 2003/Tyczka! Papel!de!la!respuesta!Th!2!en!la!fiebre!Q!en!ovinos.! 211! 2003/Ghigo! Efecto!positivo!de!ILK4!sobre!replicación!de!Coxiella#burnetii!en!monocitos.! 212! 2003/Honstettre! Diferente! patrón! de! producción! de! citocinas! en! la! forma! aguda! (hepática! o! pulmonar)!y!crónica!de!fiebre!Q! 213! 2004/Zamboni! Importancia! de! TLRK2! en! el! control! de! la! replicación! de! Coxiella# burnetii# en! macrófagos.! 214! 2008/Benoit! Polarización!de!los!macrófagos!en!la!respuesta!a!Coxiella#burnetii.! 215! 2008/Benoit! Papel!de!la!fagocitosis!de!leucocitos!apoptoicos!en!la!polarización!macrofágica! durante!la!infección!por!Coxiella#burnetii.! 216! 2010/Vazquez! Importancia!de!la!inhibición!de!la!apoptosis!por!Coxiella#burnetii#a!través!de!la! disminución!de!beclina#! 217! 2014/Faugaret! La! formación! de! granulomas! inducidos! por! Coxiella! burnetii! es! ! un! factor! protector!de!la!evolución!de!la!enfermedad!mediado!por!la!polarización!M1! 218! 2015/Conti! En! la! replicación! intracelular! de! ! Coxiella# burnetii# es! clave! la! alteración! de! la! asociación!de!TLRK2!y!TLRK4! 219! 2015/ Ammerdorffer! TLRK10! tiene! in! efecto! inhibitorio! sobre! la! producción! de! citocinas! en! macrófagos!infectados!por!algunas!cepas!de!Coxiella#burnetii.! 220! 2015/ Ammerdorffer! Los!polimorfismos!de!TLRK1,!TLR6!y!NOD!modulan!la!la!producción!de!citocinas! en!macrófagos!infectados!por!algunas!cepas!de!Coxiella#burnetii.! 221! 2015/ Schoffelen! Los! polimorfismos! de! TLRK1,! TLR6! y! MyD88! se! asocian! a! la! predisposición! de! desarrollar!fiebre!Q!crónica! ! Tabla!XI.!Estudios!en!cultivos!celulares!de!Coxiella.burnetii. . 1.2.4.4.!Estudios!de!citocinas!y!células!mononucleares!circulantes! En!estudios!realizados!sobre!citocinas!circulantes!!se!ha!observado!un!aumento!de! citocinas!proinflamatorias!(ILK6,!TNFα)!en!las!formas!agudas!y!un!aumento!de!ILK10!en!las! formas!crónicas!(222).!Por!otro!lado,!en!las!formas!agudas!no!existe!una!asociación!entre! los! polimorfismos! de! TLRK2! y! TLRK4! con! la! gravedad! o! curso! de! la! enfermedad! (223).! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 60 Finalmente,! en! las! formas! crónicas,! se! ha! observado! un! aumento! de! linfocitos! T! reguladores!(CD4+CD25+FoxP3)!circulantes!en!pacientes!con!fiebre!Q!crónica!(223).! 1.2.4.5.!Integración!de!los!aspectos!patogénicos!y!fisiopatológicos!de!la!fiebre!Q! Aunque!existen!múltiples!aspectos!sin!aclarar!en!la!patogenia!y!fisiopatología!de!la! fiebre!Q,!se!puede!establecer!un!esquema!tentativo!de!los!fenómenos!que!tienen!lugar! tras!la!entrada!en!el!ser!humano!de!Coxiella#burnetii.!! a.#Entrada.del.microorganismo.!Como!se!ha!indicado!en!apartados!previos,!la!vía! fundamental! de! penetración! en! el! ser! humano! de! Coxiella# burnetii! es! el! aparato! respiratorio.!El!tamaño!del!microorganismo!y!sus!características!estructurales!permiten!el! acceso! directo! a! la! región! alveolar! (de! hecho,! los! estudios! de! detección! en! vías! respiratorias!altas!en!pacientes!con!fiebre!Q!han!sido!infructuosos).!En!la!región!alveolar! las! células! principales! con! las! que! se! produce! la! interacción! de! C.# burnetti!!son! los! macrófagos.!! b.!Penetración.en.los.macrófagos.alveolares.(figura!18).!La!entrada!en!las!células! macrofágicas!es!diferente!en!el!caso!de!las!formas!virulentas!(fase!I)!y!avirulentas!(fase!II).! En!las!formas!virulentas!es!mediada!por!integrinas!(αVβ3)!y!moléculas!de!reconocimiento! de! patrones! (principalmente! TLRK2! y! TLR4,! aunque! también! desempeñan! un! papel! importante!TLR1,!TLR6!y!NOD)!mientras!que!las!formas!avirulentas!requieren!integrinas! (αVβ3)!y!receptor!del!complemento!tipo!3!(CR3),!sin!necesidad!de!empleo!de!moléculas! de!reconocimiento!de!patrones.!La!internalización!de!formas!avirulentas!es!más!eficiente! que!la!de!bacterias!en!fase!I,!lo!que!explica!la!menor!rapidez!de!proliferación!intracelular! de!estas.!! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 61 !!!! ! Figura!18.!!Entrada!de!Coxiella.burnetii!en!los!macrófagos!alveolares! ! ! c.!Fases.iniciales.en.el.destino.intracelular.en.los.macrófagos..La!captación!de!las! bacterias!en!fase!I!!promueve!a!través!de!las!integrinas!y!de!la!asociación!TLR2KTLR4!una! reorganización!del!citoesqueleto,!que!se!traduce!morfológicamente!en!la!formación!de!! “ruffles”!(arrugas,!frunces)!en!la!membrana!plasmática!y!en!la!activación!de!p38αKMAPK! (mitogenRactivated# protein# kinase).! Entre! otros,! la! activación! de! esta! enzima! inhibe! la! apoptosis!macrofágica,!disminuyendo!los!niveles!y/o!afinidad!de!la!beclina,!y!facilita!la! supervivencia! bacteriana.! Sin! embargo,! la! internalización! de! las! formas! avirulentas,! no! induce!estos!fenómenos!y,!por!ello!dificulta!la!proliferación!bacteriana.! d.!Formación.de.la.vacuola.parasitofórica!y!evolución.de.los.endosomas..Tanto! las! cepas! virulentas! como! avirulentas! se! encuentran! inicialmente! en! el! interior! de! los! macrófagos!en!endosomas!iniciales.!Posteriormente!adquieren!proteínas!del!hospedador! (LAMP1,!M6PR!y!VKATPasa)!y!del!propio!microorganismo!!que!permiten!una!acidificación! del! fagosoma! y! facilitan! la! captación! de! nutrientes.! Sin! embargo,! en! el! caso! de! microorganismos! virulentos,! no! se! produce! la! incorporación! de! lisosomas! (ricos! en! catepsina!D)!por!lo!que!la!destrucción!del!microorganismo!es!limitada.!Por!el!contrario,! TLR4 αvβ3 CR3 TLR2 Coxiella.burnetii TNFα IL`6 Fagosoma Lisosoma HLA Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 62 los!organismos!avirulentos,!a!través!de!la!incorporación!de!la!proteína!adaptadora!Rab7! permiten! la! fusión! con! lisosomas! que,! a! través! de! la! catepsina! D,! destruyen! al! microorganismo.!Esta!secuencia!de!fenómenos!explica!que!los!antígenos!de!fase!II!sean! expresados!precozmente!cuando!se!produce!el!control!de!la!infección,!mientras!que!en! formas!crónicas,!se!expresen!ambos!tipos!de!antígenos.!Morfológicamente,!en!las!formas! agudas! de! fiebre! Q! se! forman! endosomas! de! pequeño! tamaño,! mientras! que! en! las! formas!crónicas,!el!volumen!de!los!endosomas!es!mucho!mayor.! e)!Evolución.de.la.infección.(figura!19).!La!proliferación!de!Coxiella#burnetii!!en!los! macrófagos!infectados!es!muy!lenta! ! y! las! consecuencias!de!la!misma!van! a! depender! tanto! de! los! genotipos! del! microorganismo! (ver! apartados! anteriores)! como! de! la! respuesta!del!hospedador.!Los!tres!patrones!característicos!son!la!infección!asintomática,! la! fiebre! Q! aguda! y! la! fiebre! Q! crónica.! En! las! formas# asintomáticas,! la! respuesta! del! hospedador! corresponde! a! una! polarización! macrofágica! tipo! M1,! con! destrucción! del! microorganismo,!sin!ocasionar!manifestaciones!clínicas,!con!desarrollo!de!una!respuesta! inmune!muy!eficaz.!En!las!formas#agudas!se!produce!una!polarización!macrofágica!tipo! M2! “atípica”! caracterizada! por! una! destrucción! más! o! menos! precoz! y! más! o! menos! completa! del! microorganismo,! generándose! al! final! una! respuesta! inmune! eficaz.! Esta! respuesta! es! responsable! de! las! manifestaciones! clínicas! de! la! enfermedad.! Así,! la! hiperproducción! de! ILK6! explica! la! fiebre! elevada! de! los! pacientes! y! la! generación! de! autoanticuerpos!en!algunos!casos,!mientras!que!la!infiltación!por!células!mononucleares,! con! o! sin! formación! de! granulomas! es! responsable! de! las! manifestaciones! tisulares! (neumonía,!hepatitis,!citopenias,!etc).!Finalmente!en!las!formas#crónicas,!la!incapacidad! del! sistema! inmune! para! la! destrucción! del! microorganismo! con! una! polarización! M2! clásica,!lleva!a!su!persistencia!y!a!la!generación!de!una!inflamación!crónica!responsable!de! las! lesiones.! La! fagocitosis! de! leucocitos! apoptoicos! en! pacientes! con! valvulopatías,! la! inmunosupresión! (embarazo,! inmunodeficiencias)! llevan! a! la! producción! de! ILK10,! por! macrófagos! y! linfocitos! T! reguladores! responsables! de! la! persistencia! del! microK organismo.! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 63 ! ! Figura!19.!!Relación!entre!la!patogenia!y!la!evolución!de!la!infección.! ! 1.2.5.!Manifestaciones!clínicas!y!datos!de!laboratorio!! La!!interacción!entre!Coxiella#burnetii!y!el!ser!humano!presenta!un!perfil!evolutivo! muy!variable!y,!debido!al!de!su!espectro!clínico,!por!lo!que!debe!entrar!a!formar!parte!del! diagnóstico!diferencial!de!un!gran!número!de!síndromes!infecciosos.!! Aproximadamente! un! 60%! de! los! casos! de! fiebre! Q! son! asintomáticos.! ! Cuando! aparecen!manifestaciones!clínicas!,!estas!pueden!ser!agudas!o!crónicas.!En!el!40%!de!los! pacientes! sintomáticos,! la! mayoría! se! manifestará! como! una! enfermedad! leve! sin! necesidad!de!hospitalización.!Los!pacientes!hospitalizados!representan!sólo!el!2%!de!los! individuos!infectados,!y!el!10%!de!ellos!(0.2%)!padecerán!una!fiebre!Q!crónica!(138).!En! Francia,!la!incidencia!de!fiebre!Q!es!de!50!casos/100.000!habitantes!y!la!incidencia!de! endocarditis! por! fiebre! Q! es! de! 1/1.000.000! habitantes! (25).! ! En! el! año! 2009,! en! la! epidemia!producida!en!Holanda,!la!incidencia!fue!de!69!casos!/100.000!habitantes!en!las! Coxiella(burnetii Monocitos Monocitos/Macrófagos Macrófagos Polarización"M1 Polarización"M2"“atípica” Polarización"M2 CCR7 MR MR CD14 Control'de'la'infección Fiebre&Q&aguda ! Fiebre&Q&crónica TNF α IL1α! CCL2! CCL5 ! CCL11 ! IL`6! IL1`ra ! TGFß ! IL`10 ! IL1`ra ! TGFß ! CXCL8! CCL18! CCL16! CCL18! IL`4 IL`10 IL`4 IL`10 Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 70 fiebre! Q! aguda! es! mucho! mayor! en! embarazadas! (229)! y! (iii)! Las! complicaciones! obstétricas!incluyen!prematuridad,!retraso!en!el!crecimiento!intrauterino,!incremento!de! defectos! congénitos,! bajo! peso! al! nacer,! muerte! fetal! intraútero! o! aborto! espontáneo! (229,230).! El! pronostico! es! peor! si! la! infección! ocurre! en! el! primer! trimestre! del! embarazo.!La!aparición!de!anticuerpos!antifosfolípidos!está!asciada!al!aborto!precoz,!y! también!participa!en!las!muertes!fetales!del!primer!trimestre!(230).!! ! 1.2.6.!Diagnóstico!etiológico!y!seguimiento! !1.2.6.1.!Recogida!!y!conservación!de!las!muestras.!. # C.# burnetii! es! un! microorganismo! muy! contagioso,! por! ello! se! precisa! de! un! laboratorio!con!un!nivel!3!de!bioseguridad!y!personal!experimentado!!para!manipular!las! muestras!contaminadas!y!para!el!cultivo!del!microorganismo.! ! La! detección! directa! de! C.burnetii# puede! realizarse! en! múltiples! muestras!! biológicas! (sangre,! líquido! cefalorraquídeo,! médula! ósea,! biopsia! de! válvulas! cardíacas,!! aneurisma!vascular!o!injerto,!!biopsia!ósea,!o!muestras!de!biopsia!hepática).!En!casos!de! aborto,!se!puede!realizar!de!muestras!!de!leche,!placenta!y!muestras!fetales.!Además!se! puede!realizar!del!sobrenadante!de!los!cultivos!celulares.!La!sangre!debe!ser!recogida!en! EDTA!o!en!citrato!sódico,!y!la!capa!leucocitaria!debe!ser!guardada!!para!la!amplificación.! Las!muestras!sólidas!deben!congelarse!a!K80ºC!antes!de!analizarlas.# # C.# burnetii! puede! ser! cultivada! de! la! capa! leucocitaria! de! sangre! heparinizada! (! (pero!no!si!es!recogida!con!EDTA!o!citrato!sódico),!sangre!total,!plasma,!médula!ósea,! LCR,!biopsia!de!válvula!cardiaca,!aneurisma!o!injerto!vascular,!biopsia!ósea!o!hepática,!y!,! en!casos!de!aborto,!de!leche,!placenta!o!muestras!fetales.! ! Todas!las!muestras,!excluyendo!la!sangre!total,!deben!ser!conservadas!a!K80ºC!y! deben!ser!enviadas!en!hielo!seco!para!el!diagnostico.!La!sangre!total!debe!conservarse!a! 4ºC!(!durante!menos!de!48!horas).! ! ! ! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 71 1.2.6.2.!Diagnóstico!directo.!! . 1.2.6.2.1.!Cultivo!de!C..burnetii.! ! El! aislamiento! de! C.# burnetii! mediante! cultivo! se! realiza! en! pocos! laboratorios,! debido!al!elevado!riesgo!de!transmisión!de!la!enfermedad!en!el!personal!que!manipula! las!muestras!y!por!la!falta!de!sensibilidad!de!la!técnica.!! ! El!microorganismo!puede!ser!aislado!tras!la!inoculación!de!las!muestras!en!cultivos# celulares#clásicos#[(células!VeroK!células!de!riñón!de!mono!verde!africano)!y!fibroblastos! de!pulmón!embrionarios!humanosK!línea!celular!MRCK5)].!Otro!!sistema!disponible!es!el! shellRvial.! Las! muestras! se! inoculan! en! unos! tubos! que! poseen! en! el! fondo! en! un! cubreobjetos,! en! el! que! ha! crecido! la! línea! celular.! Para! aumentar! la! rentabilidad! se! deben! hacer! dos! o! tres! inoculaciones! por! cada! muestra! a! procesar.! Las! muestras!! centrifugan! durante! una! hora! a! 700! g! y! a! 20ºC,! para! favorecer! la! penetración! de! la! bacteria!dentro!de!las!células.!Después!de!un!período!de!incubación!de!5!a!7!!días!en!una! atmósfera!del!5%!de!CO2!y!tras!su!tinción,!se!detecta!C.burnetii!dentro!de!las!células.!El! organismo!aparece!como!un!pequeño!bacilo!que!no!se!tiñe!con!la!tinción!de!Gram!pero! que!son!visibles!después!de!hacer!la!tinción!de!Giemsa!o!Giménez.!La!identificación!de!C.# burnetii!dentro!de!las!células!se!realiza!mediante!una!inmunofluorescencia!directa!con! anticuerpos!monoclonales!o!policlonales!antiKC.burnetii!conjugados!con!isotiocianato!de! fluoresceína.! Además! el! sobrenadante! del! shellRvial! se! puede! amplificar! mediante! técnicas! de! PCR.! Los! mejores! resultados! se! obtienen! de! muestras! obtenidas! previo! al! tratamiento!antibiótico.! ! Otras! formas! de! aislamiento! se! basan! en! la! inoculación! de! la! muestra! en! saco! vitelino!de!huevos!embrionados!o!en!animales!de!laboratorio!como!el!ratón!o!cobaya.!Las! muestras!clínicas!se!inyectan!intraperitonealmente!en!el!cobaya!que!se!sacrifican!después! de!5!a!8!días.!Los!extractos!de!bazo!de!los!animales!infectados!son!las!muestras!de!mayor! valor!para!el!aislamiento!de!C.#burnetii.!En!estos!estudios,!en!presencia!de!C.#burnetii#,los! huevos!embrionarios!mueren!de!7!a!9!días!tras!la!inoculación!y!los!cobayas!desarrollan! fiebre!de!5!a!8!días!tras!la!inoculación!intraperitoneal.!Estas!técnicas!son!mas!laboriosas! que! los! cultivos! celulares! y! existe! un! alto! riesgo! de! contaminación! cruzada! entre! los! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 72 animales! infectados! y! los! no! infectados.! Sin! embargo,! el! modelo! animal! en! el! cobaya! continua! siendo! útil! para! el! aislamiento! de! C.# burnetii! de! muestras! contaminadas! con! otras!bacterias.!! ! ! !1.2.6.2.2.!Amplificación!de!material!genético.! El!elemento!de!insercion!IS1111!es!la!secuencia!diana!más!usada!para!la!detección! del!DNA!de!Coxiella#burnetii#(231).!Se!suelen!emplear!otros!genes!como!icd,!com1!o!sod! para!garantizar!la!cuantificación!y!para!evitar!la!detección!de!casos!falsos!positivos.!Se! han!realizado!varios!estudios!para!estudiar!la!rentabilidad!de!las!diversas!técnicas.!Así,! Fournier!et!al!(232)!realizó!una!PCR!en!suero,!que!amplifica!el!elemento!asociado!a!htp#AB! usando!una!nested!PCR!en!una!epidemia!en!Chamonix.!De!los!100!pacientes!estudiados,! la!detección!de!genoma!de!Coxiella#burnetii!fue!positiva!en!el!18%!de!los!pacientes.!Sin! embargo,!estudiando!sólo!los!pacientes!con!serología!inicial!negativa,!fue!positiva!en!el!! 26%!de!los!!pacientes.!!En!otro!estudio!realizado!en!Holanda!(233)!en!el!que!emplearon! una!PCR!a!tiempo!real!casera!que!usa!como!diana!las!secuencias!de!inserción!IS1111#en! muestras!de!suero#la!rentabilidad!de!la!prueba!fue!del!98!%!!En!!estudios!realizados!en! Suiza!se!comparó!una!PCR!a!tiempo!real!que!amplifica!los!genes!ompA!con!la!nested!PCR! que!amplifica!la!secuencia!IS1111!durante!un!período!de!siete!años!y!en!89!muestras,! siendo!la!sensibilidad!global!del!81,2!%.!Estos!autores!indican!que!la!muestra!de!sangre! recogida! con! EDTA! es! mas! rentable! que! el! suero! (234).! ! En! un! estudio! complicado! de! analizar,! realizado! en! el! Centro! de! Referencia! de! Rickettsias! en! Marsella! durante! tres! años,!se!empleó!una!PCR!a!tiempo!real,!que!detecta!las!secuencias!!IS1111!y!IS30a.!Este! trabajo!evaluó! diferentes!tipos! de!muestras! (! suero,! sangre! y! biopsias)! en! en! distintos! estadios!de!la!enfermedad.!Globalmente!se!analizaron!3.219!muestras!correspondientes! a!1.748!pacientes!!(235)!.!De!ellas!fueron!positivas!145!muestras!de!115!pacientes!(6,5%),! 101!muestras!de!suero!y!8!muestras!de!sangre!con!EDTA.!! La!PCR!es!un!elemento!importante!en!el!diagnóstico!precoz!en!la!fiebre!Q!aguda! cuando!la!serología!es!negativa!o!no!es!concluyente.!Los!porcentajes!de!positividad!varían! en!los!distintos!estudios,!aún!empleando!la!misma!secuencia!diana!de!ampliación.!!En!! cambio,!es!mucho!mas!rentable!en!los!casos!de!fiebre!!Q!crónica!(biopsias).! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 73 Recientemente! se! han! introducido! otras! técnicas! como! LAMP! (loop# –mediated# isothermal#amplification#assay),!que!tiene!ventajas!como!que!no!necesita!termociclador!y! se!realiza!en!60!minutos!(236).! ! 1.2.6.3.!Técnicas!indirectas.!! !En! la! mayoría! de! los! casos,! el! diagnóstico! de! fiebre! Q! se! efectúa! mediante! inmunodiagnóstico.!En!este!apartado!se!indicarán!las!principales!pruebas!diagnósticas,!la! cinética! de! aparición! de! los! anticuerpos! y! la! interpretación! práctica! de! los! datos! de! serología.!! ! 1.2.6.3.1..Pruebas.serológicas... ! Las! principales! técnicas! serológicas! empleadas! en! el! diagnóstico! de! fiebre! Q! en! humanos!y!sus!características!particulares!se!indican!a!continuación.! ! •! Inmunofluorescencia# indirecta# (IFA).! Es! el! método! de! referencia! para! el! diagnóstico! serológico! de! fiebre! Q.! Para! la! preparación! de! antígenos! para! este! test,! la! cepa!de!referencia!Nine!Mile!de!C.burnetii!en!fase!II!se!hace!crecer!en!líneas!confluentes! de!fibroblastos!de!ratón!L929.!!Los!antígenos!de!fase!I!son!obtenidos!de!bazos!de!ratón! inoculados! con! organismos! en! fase! II.! Este! método! de! preparación! ha! demostrado! producir!los!antígenos!con!la!mayor!sensibilidad!para!la!detección!de!anticuerpos!!antiK!C.# burnetii.! Este! método! puede! usarse! para! determinar! anticuerpos! de! fase! ! I! y! II! de! las! fracciones!de!IgG,!Ig!M!e!IgA.!Debido!a!que!los!resultados!pueden!ser!confusos!por!la! presencia! de! factor! reumatoide,! se! usa! un! absorbente! del! factor! reumatoide! para! eliminar!la!IgG!antes!de!la!determinación!de!IgM!!e!IgA.!Se!comienza!con!una!dilución!de! 1:50! o! 1! para! el! screening! con! antiinmunoglobulina! antifase! II.! Los! casos! positivos! se! siguen! diluyendo! para! estudiar! los! antígenos! de! fase! I! y! II! de! IgG,! IgM! e! IgA.! La! seroconversión!se!suele!detectar!de!7!a!15!días!tras!el!inicio!de!la!clínica.!Cerca!del!90%! de!los!pacientes!tienen!anticuerpos!detectables!!a!la!tercera!semana.! ! •! ! Fijación# de# complemento.! Ha! sido! ampliamente! usada,! pero! en! la! actualidad! poco! laboratorios! la! emplean.! Aunque! es! muy! especifica! (pero! menos! que! la! inmunofluorescencia!indirecta)!,!carece!de!sensibilidad,!además!de!ser!una!técnica!muy! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 74 laboriosa.!El!suero!se!inactiva!por!calor!y!se!!analiza!contra!los!!antígenos!de!C.#burnetii!en! fase! I! y! fase! II.! ! Sin! embargo,! un! fenómeno! de! prozona! puede! estar! presente! en! las! muestras! de! suero! de! ! pacientes! con! fiebre! Q! crónica! y! este! fenómeno! puede! dar! un!! resultado! falso! negativo.! Además,! las! reacciones! cruzadas! con! antígenos! de! huevo! pueden!originar!resultados!falsosKpositivos.!La!interpretación!!de!los!resultados!requiere! muestras! de! suero! de! fase! aguda! y! convaleciente.! La! seroconversión! es! detectada! de! forma!más!tardía!con!esta!técnica!!que!con!la!inmunofluorescencia!o!con!el!ELISA!(!de!10! a!20!días!del!comienzo!de!los!síntomas).!Un!título!de!anticuerpos!de!la!clase!IgG!contra!los! antígenos!de!fase!II!por!fijación!del!complemento!mayor!o!igual!de!1:40!es!diagnóstico!de! fiebre!Q!aguda!y!un!título!de!IgG!anti!fase!I!mayor!o!igual!de! 1:200!es!diagnóstico!de! fiebre!Q!crónica.! ! •! ELISA.! Fue! descrito! como! más! sensible! y! especifico! que! la! fijación! del! complemento! para! el! diagnóstico! de! fiebre! Q! por! lo! que! ha! ! sido! propuesto! como! un! buen!método!para!estudios!de!seroprevalencia.!Es!una!técnica!mas!laboriosa!y!requiere! una! considerable! experiencia! para! la! interpretación! de! ! los! resultados.! Por! ello,! su!! aplicación! para! el! diagnóstico! serológico! de! fiebre! Q! es! todavía! limitado.! Detecta! anticuerpos!anti!fase!I!y!II.! ! •!Western#blot.!!Es!un!método!sensible!y!especifico!para!el!diagnóstico!de!fiebre! Q.! Consume! mucho! tiempo! y! no! puede! usarse! como! screening.! Permite! una! diferenciación! de! la! respuesta! humoral! a! diferentes! componentes! antigénicos! del! microorganismo.! Las! diferentes! masas! moleculares! de! los! diferentes! antígenos! detectados!varían!de!10!a!100!kDa.!Los!anticuerpos!que!reaccionan!con!antígenos!de!50,! 80!y!160!kDa!se!consideran!sugestivos!de!fiebre!Q!crónica.! ! 1.2.6.3.2..Cinética.de.la.respuesta.humoral.frente.a.Coxiella..burnetii. Aproximadamente!al!séptimo!día!del!comienzo!de!los!síntomas!aparecen!títulos! significativos!de!IgM!(≥!1:80),!y!a!las!dos!semanas!aparecen!respuesta!IgG.!En!el!80%!de! los!casos,!la!IgM!persiste!a!títulos!altos!durante!6!meses.!Debido!a!que!los!anticuerpos!de! clase!IgM!especificos!preceden!a!los!anticuerpos!de!la!clase!IgG,!la!presencia!de!IgM!es! compatible!con!infección!reciente.!!! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 75 1.2.6.5.!!Interpretación!de!los!resultados!de!los!tests!serológicos.! ! El! valor! predictivo! positivo! y! negativo! depende! de! la! prevalencia! de! la! enfermedad.! Un! test! diagnóstico! necesita! ser! muy! sensible,! y! para! un! estudio! seroepidemiológico!!precisa!ser!muy!específico!para!prevenir!los!falsos!positivos!debido!a! la!reacción!cruzada!de!los!anticuerpos.!!! ! La!variación!antigénica!de!C.burnetii!!es!extremadamente!útil!para!diferenciar!la! enfermedad!en!fase!aguda!o!crónica.!En!la!fiebre!Q!aguda!predominan!los!anticuerpos! frente!a!los!!antígenos!de!fase!II!y!su!título!es!más!alto!que!el!título!de!anticuerpos!frente! a! la! fase! I.! La! IgM! es! el! primer! anticuerpo! que! aparece.! En! las! formas! crónicas! de! la! enfermedad!como!la!endocarditis,!aparecen!uniformemente!altos!títulos!de!anticuerpos! antiKfase!I.!Para!el!diagnóstico!de!fiebre!Q!aguda!se!recomienda!un!título!de!anticuerpos! por!inmunofluorescencia!de!IgG!anti!fase!II!mayor!o!igual!de!200!y!un!título!de!IgM!antiK fase!II!mayor!o!igual!de!50.!Para!el!diagnóstico!de!fiebre!Q!crónica!los!anticuerpos! de! clase!IgG!anti!fase!I!mayor!o!igual!de!1.600.!! ! En!la!fiebre!Q!aguda!los!títulos!por!inmunofluorescencia!alcanzan!su!máximo!nivel! de!4!a!8!semanas!después!del!comienzo!de!la!enfermedad!y!disminuyen!gradualmente!en! 12!meses.!La!IgM!!se!hace!indetectable!de!10!a!12!semanas.!La!técnica!de!ELISA!puede! detectar!anticuerpos!después!de!5!años!del!episodio!agudo.!! ! En!la!tabla!XIII!!se!describen!los!puntos!de!corte!de!la!IFA!para!el!diagnóstico!de! fiebre!Q!(234).! ! Fase!II! Fase!II! Fase!I! Interpretación! IgG! IgM! IgG! ! <1:!100! ! ! Fiebre!Q!improbable!! ≥1!:200! ≥!1:!50! ! Fiebre!Q!aguda(!100%VPP)! ! ! ≥!1:800! Fiebre!Q!crónica!(98%!VPP)! ! ! ≥!1:1.600! Fiebre!Q!crónica!(100%!VPP)!! ! ! !Tabla!XIII.!Puntos!de!corte!propuestos!para!el!diagnóstico!de!fiebre!Q!,! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 76 ! La!persistencia!de!altos!niveles!de!anticuerpos!anti!fase!I!a!pesar!del!tratamiento! adecuado,! o! la! reaparición! de! tales! anticuerpos! debe! hacer! sospechar! una! fiebre! Q! crónica.! Los! pacientes! con! alteraciones! valvulares! o! vasculares,! personas! con! inmunodeficiencias!y!embarazadas!se!debe!repetir!!el!estudio!serológico!si!tienen!historia! de! fiebre! Q! aguda! o! episodios! de! fiebre! inexplicable.! En! casos! de! fiebre! Q! en! estos! pacientes!se!debe!realizar!una!inmunofluorescencia!mensual!durante!6!meses.! ! 1.2.7.!Tratamiento! !El!tratamiento!antimicrobiano!está!!indicado!tanto!en!la!fiebre!Q!aguda!como!en!la! fiebre! Q! crónica.! Para! la! fiebre. Q. aguda! se! han! usado! varios! antimicrobianos! pero! el! tratamiento!de!elección!es!!doxiciclina.!La!doxiciclina!ha!demostrado!la!defervescencia!del! cuadro! clínico! en! dos! o! tres! dias! tras! el! comienzo! del! tratamiento.! Los! antibióticos! βK lactámicos!tiene!poco!efecto!en!Coxiella!pero!se!han!publicado! buenos! resultados! con! macrólidos,! cotrimoxazol,! quinolonas! y! rifampicina.! Las! guias! para! el! tratamiento! y! control! de! la! fiebre! Q! aguda! del! CDC! y! el! grupo! de! trabajo! de! la! fiebre! Q! en! adultos! recomiendan!una!dosis!de!100!mg!de!doxiciclina!dos!veces!al!dia!durante!dos!semanas! (237)!.! ! En!la!meningoencefalitis!se!considera!eficaz!un!tratamiento!con!fluoroquinolonas,! puesto! que! éstas! penetran! la! barrera! hematoencefálica.! En! la! hepatitis! por! fiebre! Q,! como! suele! estar! asociada! a! una! fuerte! respuesta! inmune,! con! producción! de! autoanticuerpos! yo! anticuerpos! antinucleares,! se! aconseja! administrar! prednisona! 40! mg/día!durante!7!días!(24).! ! El! tratamiento! de! la! fiebre. Q. crónica! es! mucho! mas! complicado.! Las! recomendaciones! actuales! son! 100! mg! de! doxiciclina! dos! veces! al! dia! con! hidroxicloroquina! 200! mg! tres! veces! al! dia! durante,! al! menos,! 18! meses.! En! caso! de! pacientes! con! prótesis! valvular! el! tratamiento! deberá! prolongarse! durante! 24! meses.!! Aunque! sigue! siendo! un! tratamiento! largo,! el! uso! de! hidroxicloroquina! he! reducido! el! tiempo! de! tratamiento,! ya! que! previamente! se! empleaba! durante! cinco! años.! Estos! pacientes! precisan! controles! oftalmológicos! semestrales! ya! que! la! hidroxicloroquina! causa! retinopatía.! ! Ademas,! ambos! fármacos! causan! fotosensibilidad.! El! diagnóstico! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 77 precoz!y!el!tratamiento!combinado!de!la!endocarditis!por!fiebre!Q!reduce!la!mortalidad! del!60%!(!la!existente!en!la!década!de!los!70)!hasta!el!5%!en!los!años!90!(238).! ! El! fármaco! recomendado! para! el! tratamiento! de! la! fiebre! Q! aguda! durante! el. embarazo!es!cotrimoxazol.!En!el!caso!de!formas!crónicas,!!debe!administrarse!!doxiciclina! y!hidroxicloroquina!tras!el!parto!durante!doce!meses.!! ! 1.2.7.!Prevención! Debido! a! la! forma! de! transmisión! de! C# burnetii! y! sus! características! epideK miológicas!es!prácticamente!imposible!evitar!de!forma!sistemática!la!exposición!!a!este!! patógeno.!Sin!embargo,!en!algunos!contextos!debe!extremarse!el!contacto!con!focos!de! alta!exposición!(embarazadas,!inmunodeprimidos!y!personas!con!valvulopatías).!Además,! el! manejo! de! laboratorio! de! muestras! presumiblemente! contaminadas! por! C.# burnetii! debe!realizarse!en!laboratorios!de!bioseguridad!P3.!! En! lo! que! respecta! al! desarrollo! de! vacunas! se! han! descrito! dos! tipos:! ! (i)! una!! vacuna! completa! (QKVax)! comercializada! en! Australia,! muy! eficaz! pero! con! efectos! secundarios!importantes!en!personas!que!hayan!padecido!la!fiebre!Q!o!con!vacunación! previa! y! (ii)! vacunas! acelulares! (tras! extracción! por! tricloroacético,! Checoslovaquia! )! o! (cloroformo!USA),!mejor!toleradas!y!aparentemente!con!similar!efectividad.!Se!requiere! la! realización! de! tests! cutáneos! previamente! al! empleo! de! las! vacunas! ya! que! se! han!! descrito!casos!graves!en!casos!de!exposición!previa!a!la!bacteria!(228).! Asimismo! se! han! ensayado! vacunas! en! el! ganado! (240,241),! con! resultados! variables. Dos!grupos!de! moléculas! no!antimicrobianas! como! las!estatinas!y! el! omeprazol! han!demostrado!cierta!actividad!frente!a!C.#burnetii.!Las!estatinas!tienen!actividad!en!la! multiplicación! de! C.# burnetii! y! en! la! secreción! de! anticuerpos! antifosfolípidos.! Sería! interesante!realizar!análisis!restrospectivos!de!la!epidemia!de!Holanda!para!determinar!si! ambas!moléculas!tienen!efecto!protector!en!la!fiebre!Q!(242).!! !! ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 78 ! Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 79 1.3.$Tifus$murino$ Los$organismos$que$causan$el$tifus$endémico$(R.typhi$y$R.(felis)$se$incluyen$dentro$ del$género$Rickettsia.$Tradicionalmente,$este$género$se$ha$subdividido$en$el$grupo$de$las$ fiebres$ exantemáticas$ (como$ la$ fiebre$ botonosa$ y$ la$ fiebre$ manchada$ de$ las$ Montañas$ Rocosas)$ y$ grupo$ tifus$ (tifus$ exantemático$ y$ fiebre$ de$ las$ trincheras).$ $ Asimismo$ se$ ha$ añadido$un$grupo$transicional$(R.(felis,(R.(australis($y$R.(akari)$$y$un$grupo$ancestral$(grupo$ de$ R.( belli$y$ el$ grupo$ de$ R.$canadensis$ (243).$ En$ todas$ las$ especies$ de$ rickettsias$ la$ localización$ de$ la$ bacteria$ es$ intracelular,$ se$ localizan$ en$ el$ citoplasma$ celular$ como$ microorganismos$libre$siendo$su$genoma$circular$y$de$pequeño$tamaño.$Además$tienen$ en$ común$ su$ corta$ viabilidad$ fuera$ de$ los$ reservorios$ y$ vectores$ que$ infectan$ y$ la$ dificultad$para$ser$cultivadas$en$el$laboratorio.$ $ 1.3.1.$Aspectos$históricos$ $ El$ tifus$ murino$ fue$ descrito$ por$ primera$ vez$ en$ 1922$ por$ F.$ Hone$ como$ una$ enfermedad$ similar$ la$ fiebre$ tifoidea.$ En$ 1926$ Maxcy$ diferenció$ ambas$ entidades$ y$ en$ 1931,$cuando$Dyer$aisló$la$nueva$especie$de$$rickettsia$en$ratas$y$pulgas,$fue$reconocida$ como$ una$ zoonosis$ de$ distribución$ mundial$ (244,245,246,247).$ Posteriormente$ se$ describieron$casos$en$múltiples$países,$entre$ellos$en$España$(9,$248,$249,250,251).$$ $ $ $ $ $$ 1.3.2.$Taxonomía$y$microbiología$ $ $ $ $ $ $$ 1.3.2.1.Taxonomía$ En$la$familia$Rickettsiaceae$se$incluyen$dos$géneros,$Rickettsia$y$Orientia.$Aunque$ el$ número$ y$ diversidad$ de$ las$ cepas$ patógenas$ en$ estos$ géneros$ son$ similares,$ la$ designación$de$las$especies,$difiere$de$forma$considerable.$La$segunda$edición$del$Manual$ Bergey$ de$ Bacteriología$ Sistemática$ (última$ revisión$ en$ 2005)$ valida$ 20$ especies$ de$ Rickettsia,$aunque$hay$otras$especies$propuestas.$$$ El$género$se$divide$dos$grupos$de$especies$pertenecientes$al$grupo$del$tifus$y$al$ grupo$ de$ las$ fiebres$ manchadas$ (SFG)$ definidas$ por$ sus$ antígenos$ lipopolisacáridos$ distintivos.$ $ El$ grupo$ del$ tifus$ esta$ formado$ por$ dos$ especies:$ Rickettsia( prowazekii$y$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 86 a$ rOmpA$ (sca0)$ y$ rOmpB$ (sca5),$ mientras$ que$ el$ gen( D$ fue$ renombrado$ como$ sca4.$ Existen$17$subfamilias$de$las$proteínas$Sca$que$constan$de$un$péptido$en$el$extremo$Ng terminal$ y$ en$ el$ extremo$ Cg$ terminal$ un$ dominio$ AT.$ La$ función$ de$ estas$ proteínas$ permanece$desconocida$aunque$se$cree$que$contribuyen$al$reconocimiento$de$diferentes$ receptores$en$la$célula$del$hospedador$(243).$La$expresión$de$rOmpB(en$Escherichia(coli$ permite$la$adherencia$y$entrada$de$la$bacteria$en$las$células$epiteliales.$Otras$adhesinas$ son$Adr1$y$Adr2,$(subunidad$ku70$dependiente$de$la$proteingcinasa).$Tras$su$adhesión,$las$ rickettsias$ penetran$ en$ las$ células$ endoteliales$ empleando$ un$ mecanismo$ denominado$ fagocitosis$ inducida$ (el$ aporte$ de$ energía$ corresponde$ al$ agente$ patógeno).$ Aunque$ inicialmente$las$rickettsias$son$englobadas$en$una$vacuola$de$fagocitosis,$antes$de$que$se$ produzca$la$fusión$lisosomagfagosoma$acceden$al$citoplasma$gracias$a$una$fosfolipasa$A2$ producida$ por$ las$ propias$ bacterias.$ En$ el$ citoplasma$ se$ produce$ la$ división$ celular$ mediante$fusión$binaria.$Las$consecuencias$de$la$infección$celular$son$la$diseminación$de$ la$infección$a$las$células$próximas$y$una$lesión$endotelial$directa$(figura$23).$ $ $$$$$$$ $ $ $$$$$$$$$$$$Figura$23.$Patogenia$general$del$tifus$murino$ $ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 87 $$$$$$$$$$$$$$Las$manifestaciones$del$tifus$endémico$dependen$principalmente$de$la$presencia$ de$endotelitis,$que$altera$la$permeabilidad$capilar$y$promueve$la$salida$de$líquidos$hacia$ los$ tejidos,$ con$ pérdida$ del$ volumen$ intravascular,$ albúmina,$ y$ electrolitos,$ y$ se$ consumen$ leucocitos$ y$ plaquetas$ en$ el$ foco$ de$ la$ infección.$ Por$ ello,$ se$ altera$ el$ funcionamiento$de$los$órganos$como$el$pulmón$y$el$sistema$nervioso$y$se$$desencadena$ una$ activación$ local$ de$ la$ coagulación.$ Otros$ factores$ asociados$ son$ la$ liberación$ de$ citocinas$ antiinflamatorias$ por$ las$ células$ endoteliales$ y$ macrófagos.$ La$ respuesta$ inmunitaria$incluye$un$componente$humoral$(anticuerpos$frente$a$las$proteínas$externas$ de$ membrana)$ y$ un$ componente$ celular$ mediado$ principalmente$ por$ linfocitos$ T$ citotóxicos$$y$células$Natural$Killer.$En$general,$el$individuo$queda$protegido$de$por$vida.$$ Para$el$inicio$de$la$infección$se$requiere$la$entrada,$supervivencia$y$replicación$de$ las$ rickettsias$ en$ la$ célula$ hospedadora,$ y$ la$ salida$ de$ la$ misma$ para$ iniciar$ una$ nueva$ infección.$$Aunque$la$célula$endotelial$es$la$célula$diana$para$la$mayoría$de$las$rickettsias$ patógenas,$ también$ la$ infección$ de$ monocitos$ y$ macrófagos$ contribuye$ al$ establecig miento$de$la$infección$y$su$patogenia.$Mediante$estudios$experimentales$en$el$ratón$se$ ha$ demostrado$ que$ R.( typhi$ causa$ citotoxicidad$ en$ los$ macrófagos$ peritoneales.$ La$$ respuesta$celular$del$hospedador$$en$el$ratón$conlleva$a$un$aumento$en$la$producción$de$ citocinas$proinflamatorias$como$la$ILg1$y$ILg6.$En$cambio,$los$niveles$de$IFNgγ.$ILg10$y$ILg12$ no$cambian$significativamente$en$el$curso$de$la$infección$(300).$$ $ 1.3.5.$Manifestaciones$clínicas$y$datos$de$laboratorio$ $ 1.3.5.1.Manifestaciones$clínicas.$$$ El$periodo$de$incubación$de$la$enfermedad$oscila$entre$seis$y$catorce$días.$Puede$ existir$ un$ período$ prodrómico$ de$ 1$ a$ 3$ días$ caracterizado$ por$ cefaleas,$ artromialgias,$ astenia$y$náuseas.$El$cuadro$clínico$inicial$se$caracteriza$por$la$triada$de$fiebre$elevada$(a$ menudo$asociada$a$escalofríos),$cefalea$intensa$y$exantema$cutáneo.$$La$frecuencia$de$ cada$uno$de$estos$datos$clínicos$varia$en$las$series$publicadas.$Así,$la$mas$frecuente$es$la$ fiebre$presente$en$el$98g100%$de$los$casos.$La$fiebre$supera$los$39ºC$en$la$mayoría$de$los$ casos,$y$resulta$difícil$de$controlar$con$los$antitérmicos$habituales.$La$cefalea$aparece$en$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 88 mas$del$75$ %$de$ los$casos,$y$ muchas$veces$ su$intensidad$hace$ sospechar$un$ síndrome$ meníngeo.$ La$ presencia$ de$ exantema$ es$ muy$ variable,$ del$ 20g80%$ de$ los$ casos,$ de$ carácter$maculopapular,$poco$intenso$y$de$$predominio$central$(tronco$y$zona$proximal$ de$las$extremidades)$(figura$24a).$$Otras$manifestaciones$clínicas$incluyen$artromialgias,$ mialgias,$hepatomegalia,$tos,$diarrea,$esplenomegalia,$detección$de$picadura$(figura$24b),$ conjuntivitis$ (figura$ 24c)$ y$ neumonía$ “redonda”$ (figura$ 24d).$ La$ frecuencia$ de$ estas$ manifestaciones$varia$en$las$diferentes$series,$lo$que$se$podría$explicar$debido$a$la$vía$de$ penetración$(picadura$o$inhalación),$y/o$la$existencia$de$diferentes$microorganismos$(R.( typhi,$R.(felis$y$probablemente$otras)$(Tabla$XVII)$.$ $ $ Figura$24:$Lesiones$clínicas$$en$pacientes$con$tifus$murino$(Cortesía$de$JLPA$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 89 Referencia$ 278$ 279$ 11$ 280$ 281$ 286$ 283$ 291$ 285$ 286$ 289$ 296$ Año$ 1991$ 1992$ 1999$ 2000$ 2001$ 2002$ 2003$$ 2012$ 2007$ 2009$ 2012$ 2014$ Nº$casos$ 80$ 137$ 104$ 30$ 97$ 83$ 22$ 90$ 21$ 41$ 81$ 49$ Fiebre$ 98$ 100$ 100$ 100$ 100$ 100$ 100$ 100$ 100$ 100$ 96,3$ 100$ Cefalea$ 75$ 41,6$ 71,1$ 77$ 76$ 88$ 90,9$ 87,8$ 29$ 14,6$ 51,9$ 83,7$ Exantema$ 54$ 20,4$ 62,5$ 80$ 63$ 80$ 68,2$ 68,9$ 57$ 63,4$ 28,4$ 73,5$ Artralgias$ 46$ 44,5$ 77,8$ 57$ 40$ 45$ 45,4$ 36,7$ g$ 26,8$ 14,8$ 26,5$ Hepatomegalia$ g$ 24,1$ 29,8$ g$ g$ 22$ 38,1$ 32,2$ 10$ 61$ $ 34,7$ Tos$ 35$ g$ 25$ 40$ 15$ 28$ 28,6$ 32,2$ 19$ 9,8$ 30,6$ 30,6$ Diarrea$ 26$ 5,1$ 5,7$ 40$ 33$ 11$ 18,2$ g$ 19$ g$ $ g$ Esplenomegalia$ g$ 5,2$ 24$ g$ g$ 23$ 14,3$ 25,6$ 24$ 46,3$ $ 22,5$ Picadura$ 39$ 0$ 3,8$ 3,3$ 34$ g$ 13,6$ g$ $ g$ $ $ Náuseas/$ vómitos$ 48$ 30,7$ 23$ 43$ 45$ 18$ 13,6$ 33,3$ 19$ 9,8$ $ 24,5$ Dolor$abdominal$ 23$ 10,9$ g$ 60$ 27$ 11$ 13,6$ $ 10$ 14,6$ $ 16,3$ Confusión$ 8$ 2,2$ 4,8$ 7$ 8$ 10$ 13,6$ 11,1$ 5$ 2,3$ $ 20,4$ Conjuntivitis$ g$ 2,2$ g$ g$ 7$ 25$ 4,5$ 21,1$ 14$ g$ $ 23,5$ $ $$$$$$$$$$Tabla$$XVII.$Manifestaciones$clínicas$en$las$principales$series$de$tifus$murino.$ $(Los$datos$se$expresan$en$tanto$por$ciento)$ $ Los$datos$analíticos$son$también$muy$variables$(tabla$XVIII).$En$el$hemograma$es$ frecuente$ la$ anemia.$ El$ recuento$ leucocitario$ es$ muy$ variable,$ pudiendo$ aparecer$ leucocitopenia,$ leucocitosis$ (con$ neutrofilia)$ o,$ lo$ que$ es$ más$ habitual,$ un$ recuento$ leucocitario$normal$en$un$paciente$en$el$que$los$datos$clínicos$apuntan$a$una$infección$ bacteriana.$ Aproximadamente$ en$ la$ mitad$ de$ los$ pacientes$ aparece$ trombocitopenia,$ aunque$en$algunas$series$este$hecho$es$menos$frecuente.$La$afección$de$la$coagulación$se$ ha$estudiado$poco.$En$nuestra$serie$aparece$un$alargamiento$del$tiempo$de$protrombina$ y$ del$ tiempo$ de$ tromboplastina$ parcial$ activado$ en$ una$ cuarta$ parte$ de$ los$ pacientes$ (283).$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 90 REFERENCIA$ 278$ 279$ 280$ 281$ 11$ 282$ 283$ 291$ 285$ 286$ 289$ 299$ Anemia$ 75$ g$ 0,96$ 57$ 69$ 25$ 18,2$ 31,1$ g$ g$ g$ 51$ Leucocitopenia$ 28$ 3,9$ 18$ 40$ 37$ 7,2$ 9,0$ 32,2$ 16,7$ 24,4$ 13,6$ 40,8$ Leucocitosis$ 29$ g$ 20$ 3$ 1$ 0$ 18,2$ g$ g$ g$ 12,3$ 16,3$ Neutrofilia$ g$ g$ g$ 63$ 77$ g$ 36,4$ g$ g$ g$ g$ g$ Trombocitopenia$ 48$ 2,9$ 19$ 60$ 43$ 51$ 45,4$ 81,1$ 28$ 39$ 37$ 53,1$ Elevación$VSG$ g$ $ 59,5$ 75$ 81$ g$ 89,5$ 93,4$ 44$ g$ g$ g$ A.tiempo$de$protrombina$ 30$ $ $ g$ g$ g$ 22,7$ g$ g$ g$ 67,9$ g$ A.$ratio$TTPA$ g$ $ $ g$ g$ g$ 27,3$ g$ g$ g$ g$ g$ Aumento$urea$ 27$ $ $ 0$ 3$ g$ 36,4$ g$ 0$ g$ g$ g$ Aumento$creatinina$ 21$ $ $ 0$ 0$ g$ 13,6$ 13,3$ 0$ g$ g$ g$ Hiponatremia$ 60$ $ $ 66$ 58$ 37$ 18,2$ 35,6$ g$ 9,8$ g$ 23,5$ Aumento$CK$suero$ 21$ $ $ g$ g$ 42$ 10,0$ 31,1$ g$ g$ g$ g$ Aumento$LDH$suero$ 87$ $ g$ g$ 100$ 82$ 81,8$ 21,1$ g$ g$ 87,5$ 65,3$ Aumento$AST$suero$ 90$ $ 67$ 67$ 82$ 86$ 77,3$ 84,8$ g$ 73$ 70,3$ 89,8$ Aumento$ALT$suero$ 73$ $ 67$ 67$ 38$ 64$ 99,9$ 87,8$ g$ 65,6$ 70,3$ 89,8$ Aumento$FA$suero$ 60$ $ 25$ g$ g$ 15$ 30,0$ g$ g$ f$ 70,6$ 16,3$ Aumento$GGT$suero$ g$ $ g$ g$ g$ g$ 57,2$ 48,9$ g$ f$ g$ 12,3$ Hipoalbuminemia$ 89$ $ g$ 46$ 87$ 82$ 54,5$ 81,1$ g$ f$ g$ 40$ Hipergammaglobulinemia$ g$ $ g$ g$ g$ g$ 75,0$ g$ g$ f$ g$ g$ $ Tabla$XVIII.$Datos$complementarios$en$las$principales$series$de$tifus$murino$ $ La$ afectación( renal$ es$ muy$ variable.$ Es$ excepcional$ en$ las$ series$ infantiles$ (280,281),$pero$aparece$una$elevación$de$la$urea$y$creatinina$hasta$en$una$cuarta$parte$ de$ los$ casos$ (278,283).$ En$ nuestra$ experiencia,$ hasta$ el$ 86,9%$ de$ los$ pacientes$ presentaban$alteraciones$en$el$estudio$de$la$orina,$principalmente$microhematuria$(283),$ lo$que$contrasta$con$la$ausencia$de$alteraciones$en$otras$series$de$casos$(11,280,281)$y$la$ menor$ detección$ (28%)$ en$ el$ estudio$ de$ Dumler$ et$ al.$ (278).$ En$ un$ estudio$ centrado$ específicamente$en$las$lesiones$renales$del$tifus$murino,$Shaked$et$al.$(298)$encontraron$ alteraciones$ urinarias$ en$ 5$ de$ los$ 27$ pacientes$ estudiados.$ En$ la$ bibliografía$ se$ han$ comunicado$14$casos$de$insuficiencia$renal$aguda$(278,282,283,298,299,300)$asociados$a$ tifus$ murino,$ cuyo$ sustrato$ anatomopatológico$ era$ una$ nefritis$ intersticial$ multifocal$ perivascular$(característico$de$las$rickettsiosis)$(299).$ La$afección(hepática$es$muy$frecuente$en$todas$las$series$revisadas.$Se$detectan$ hipoalbuminemia$ e$ hipertransaminasemia$ en$ más$ del$ 75%$ de$ los$ casos.$ La$ hipertransaminasemia$ frecuentemente$ alcanza$ el$ rango$ de$ las$ hepatitis$ virales,$ y$ es$ menos$ frecuente$ la$ aparición$ de$ colestasis$ disociada.$ Sin$ $ embargo,$ es$ excepcional$ la$ aparición$de$ictericia$$y/o$hiperbilirrubinemia,$que$se$presentan$en$$tres$circunstancias:$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 91 alcoholismo,$infecciones$concomitantes$o$deficiencia$de$glucosa$6$fosfatodeshidrogenasa$ (301).$ La$ afección( pulmonar$ es$ relativamente$ frecuente$ en$ el$ tifus$ endémico,$ y$ la$ manifestación$clínica$más$frecuente$es$la$tos$seca.$En$la$radiografía$de$tórax$se$objetiva,$ hasta$en$una$cuarta$parte$de$los$pacientes,$un$patrón$alveolar,$asociado$o$no$a$derrame$ pleural$ mínimo.$ No$ existen$ suficientes$ datos$ histológicos$ para$ explicar$ estos$ hallazgos,$ aunque$ se$ ha$ atribuido$ a$ las$ alteraciones$ de$ la$ permeabilidad$ vascular$ y/o$ a$ la$ inflamación$ alveolar$ directa$ inducida$ por$ R.( typhi.$ Además$ de$ las$ anteriores,$ se$ han$ descrito$ múltiples$ complicaciones$ como$ artritis,$ embolia$ pulmonar,$ endocarditis,$ insuficiencia$ multiorgánica,$ lesión$ retiniana,$ meningoencefalitis,$ parotiditis,$ pleurog pericarditis,$seudooclusión$intestinal$y$rotura$esplénica$(302f315).$$ La$mortalidad$global$del$tifus$endémico$se$cifra$entre$un$1g4%$y$es$más$frecuente$ en$personas$con$enfermedad$previa$y/o$edad$avanzada.$ $ $ $$ 1.3.6.$Diagnóstico$etiológico$y$seguimiento$ El$diagnóstico$etiológico$del$tifus$endémico$se$basa$en$varias$técnicas$diagnósticas,$ que$ revisaremos$ brevemente$ para$ exponer$ posteriormente$ la$ situación$ actual$ del$ diagnóstico$de$esta$entidad.$ $ 1.3.6.1.$Técnicas$diagnósticas$ 1.3.6.1.1.)Serología) La$prueba$clásica$en$el$diagnóstico$del$tifus$endémico$ha$sido$la$reacción$de$Weilg Felix$ empleando$ como$ antígeno$ Proteus( vulgaris$OXg19.$ Esta$ técnica$ se$ basa$ en$ la$ reacción$ cruzada$ entre$ la$ cepa$ mencionada$ de$ P.$ vulgaris$ y$ antígenos$ del$ grupo$ del$ «tifus»$ (y$ también$ de$ R.( rickettsii).$ La$ reacción$ de$ WeilgFelix$ detecta$ principalmente$ anticuerpos$de$isotipo$IgM,$aunque$su$sensibilidad$y$especificidad$son$muy$bajas,$por$lo$ que$su$empleo$ha$quedado$restringido$a$zonas$con$pocos$recursos$económicos$(316).$ En$ la$ actualidad,$ las$ técnicas$ serológicas$ utilizan$ material$ propio$ de$ microg organismos$del$género$Rickettsia$como$antígeno.$Los$métodos$iniciales$para$demostrar$la$ reacción$ antígenoganticuerpo$ en$ las$ rickettiosis$ fueron$ múltiples:$ fijación$ de$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 92 complemento$ (317),$ microaglutinación$ (318),$ hemaglutinación$ (319)$ o$ aglutinación$ de$ partículas$de$látex$(320).$Sin$embargo,$la$complejidad$técnica,$la$necesidad$de$una$gran$ cantidad$de$antígeno$o$la$detección$de$isotipos$aislados$limitaban$su$utilidad$práctica.$Por$ ello,$se$diseñaron$nuevas$pruebas$que$cuantificar$IgM$e$IgG$frente$a$R.(typhi$($o$al$menos$ rickettsias$del$grupo$del$«tifus»)$con$mayor$sensibilidad$y$especificidad.$Las$más$utilizadas$ son$ la$ inmunofluorescencia$ indirecta$ (IFI)$ (321)$ y$ el$ enzimoinmunoanálisis$ (322).$ La$ técnica$de$ referencia$para$ el$estudio$ de$la$ infección$y/o$ enfermedad$por$ R.(typhi$ es$la$ inmunofluorescencia$indirecta,$apareciendo$títulos$diagnósticos$aproximadamente$a$ los$ 10$ días$ del$ inicio$ de$ la$ fiebre.$ Aunque$ poco$ utilizada,$ se$ ha$ descrito$ una$ técnica$ que$ sustituye$ el$ método$ de$ detección$ final$ (fluorescencia)$ por$ un$ marcador$ cromático$ (peroxidasa)$ (323).$ Su$ ventaja$ estriba$ en$ que$ para$ su$ visualización$ no$ precisa$ un$ microscopio$de$fluorescencia.$ Otra$ técnica$ empleada$ ha$ sido$ el$ análisis$ de$ proteínas$ mediante$ SDSgPAGE:$ Mediante$esta$técnica$se$obtienen$dos$bandas$proteicas$de$elevado$peso$molecular$que$ corresponden$ a$ las$ proteínas$ OmpA$ y$ OmpB.$ Es$ un$ método$ muy$ laborioso$ y$ lento.$ además$ de$ poco$ reproducible,$ $ ya$ que$ los$ resultados$ dependen$ en$ gran$ parte$ de$ las$ condiciones$de$preparación$del$gel$y$de$su$temperatura$de$solubilización.$ $ Finalmente,$ se$ han$ desarrollado$ técnicas$ que$ adaptan$ los$ métodos$ del$ ELISA$ a$ laboratorios$ con$ menor$ dotación$ tecnológica$ (DOTgELISA)$ (324).$ De$ cualquier$ forma,$ la$ prueba$ más$ utilizada$ es$ la$ inmunofluorescencia$ indirecta$ y,$ en$ menor$ medida,$ el$ enzimoinmunoanálisis.$Las$dos$limitaciones$principales$de$las$técnicas$serológicas$son$la$ necesidad$ de$ que$ transcurra$ un$ tiempo$ mínimo$ para$ la$ síntesis$ de$ anticuerpos$ (lo$ que$ disminuye$su$utilidad$en$los$primeros$días$de$la$enfermedad)$y$las$reacciones$cruzadas$ con$otras$rickettsias$del$«grupo$del$tifus»$(tifus$epidémico$y$enfermedad$de$BrillgZinser)$ así$como$otros$microorganismos$(en$concreto$Legionella(bozemanii)$(324,325).$ $ 1.3.6.1.2.)Cultivos) $$$$$$$$$$$$$El$ método$ más$ habitual$ para$ el$ cultivo$ de$ rickettsias$ es$ la$ técnica$ de$ shellgvial$ partiendo$ de$ sangre$ anticoagulada$ con$ heparina$ (326).$ La$ sangre$ se$ deja$ sedimentar$ durante$una$hora$y$se$recoge$el$sobrenandante$para$inocular$en$shellOvials.$Un$aspecto$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 93 técnico$a$destacar$consiste$en$eliminar$los$hematíes,$ya$que$son$tóxicos$para$las$líneas$ celulares.$$ $$$$$$$$$$$$$Se$ puede$ realizar$ en$ otro$ tipo$ de$ muestras$ como$ biopsias$ cutáneas,$ que$ se$ homogenizan$con$BHI$($Brain(Heart(Infusion(Broth).$Habitualmente$se$emplean$las$líneas$ celulares$Vero$y$de$fibroblastos.$$Tras$la$inoculación$de$los$shellOvial$($habitualmente$tres$ por$muestra)$se$centrifuga$durante$un$tiempor$para$que$los$microorganismos$penetren$ en$las$células$de$la$monocapa.$Los$cultivos$se$mantiene$a$una$temperatura$entre$28$y$32$ °C$ y$ a$ las$ 72$ horas,$ 6$ días$ y$ 14$ días$ se$ “revelan”$ mediante$ métodos$ citoquímicos$ (principalmente$ la$ tinción$ de$ Giemsa$ o$ la$ tinción$ de$ Giménez),$ el$ uso$ de$ anticuerpos$ (monoclonales$o$policlonales)$o$técnicas$de$amplificación$genética$de$ácidos$nucleicos.$Si$ las$ bacterias$ se$ detectan$ en$ el$ shellOvial,$ se$ procede$ a$ la$ inoculación$ en$ cultivo$ celular$ convencional$ para$ la$ recuperación$ de$ la$ cepa$ y$ determinación$ de$ la$ especie.$ El$ aislamiento$ de$ cepas$ de$ Rickettsia$ es$ muy$ dificultoso,$ ya$ que$ implica$ mantener$ los$ cultivos$ celulares$ y$ trabajar$ en$ condiciones$ de$ extrema$ esterilidad,$ ya$ que$ no$ es$ aconsejable$ el$ empleo$ de$ antibióticos$ (como$ se$ emplea$ habitualmente$ para$ el$ aislamiento$de$virus).$ $ 1.3.6.1.3.) Identificación) de) productos) de) R.) typhi) en) material) biológico) del) hospedador) La$detección$de$antígenos$así$como$la$detección$de$DNA$y$RNA$$de$R.(typhi$se$ha$ empleado$ principalmente$ en$ estudios$ histopatológicos$ retrospectivos,$ aunque$ su$ aplicación$clínica$ha$sido$muy$limitada.$ $ $$$$$$$$$$$$1.3.6.1.4.)Técnicas)de)biología)molecular$ Estas$técnicas$incluyen$la$$reacción$en$cadena$de$la$polimerasa$(PCR)$que$permite$ amplificar$secuencias$especificas$de$ADN,$la$PCRORFLP$($polimorfismos$de$longitud$de$los$ fragmentos$de$restricción$de$los$productos$amplificados$por$PCR)$que,$$mediante$el$uso$ de$ enzimas$ de$ restricción$ que$ cortan$ el$ ADN,$ obtenemos$ una$ serie$ de$ bandas$ características$de$cada$especie$y$la)secuenciación$de$los$productos$amplificados$por$PCR$ se$ realiza$ mediante$ secuenciadores$ automáticos.$ Posteriormente$ esta$ secuencia$ se$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 94 compara$con$las$depositadas$en$las$distintas$bases$de$datos$(GenBank).$Los$genes$más$ utilizados$ para$ el$ análisis$ filogenético$ han$ sido:$ i)$genes$ que$ codifican$ la$ síntesis$ de$ RNAr16S$(rrs)$y$la$síntesis$de$la$enzima$citrato$sintasa$(gltA),$ii)$gen$htrA(que$codifica$una$ proteína$de$17kDa$iii)$genes$que$codifican$las$dos$proteínas$de$superficie$(OmpA$y$OmpB)$ y$iv)$gen$que$codifica$la$síntesis$de$la$proteína$PS120$(gen$D)$(327,328).$ $ 1.3.6.2.$Situación$actual$del$diagnóstico$del$tifus$endémico$ El$ diagnóstico$ de$ las$ dos$ formas$ principales$ de$ tifus$ endémico$ (infección$ por$ R.( typhi$o$por$R.$felis)$requiere$conocer$los$datos$epidemiológicos,$clínicos$y$biológicos$que$ hagan$ sospechar$ la$ presencia$ de$ esta$ enfermedad.$ Asimismo,$ el$ diagnóstico$ en$ fases$ iniciales,$precisa$del$empleo$de$métodos$directos$(reacción$en$cadena$de$la$polimerasa$o$ cultivo)$disponibles$sólo$en$centros$muy$especializados.$ $$ $ 1.3.7.$Tratamiento$ $ El$tratamiento$del$tifus$endémico$en$la$mayor$parte$de$los$casos$es$muy$simple,$ya$ que$ ambas$ bacterias$ (R.( typhi$y$ R.( felis)$ son$ sensibles$ a$ varios$ antimicrobianos$ y$ la$ respuesta$es$muy$rápida.$En$ambos$casos,$el$fármaco$de$elección$es$la$doxiciclina$en$dosis$ convencionales.$Las$quinolonas$constituyen$un$fármaco$alternativo$(329,330),$aunque$ya$ se$han$detectado$cepas$resistentes$a$este$grupo$(331).$La$sensibilidad$de$ambas$especies$ también$ incluye$ la$ rifampicina,$ el$ cloranfenicol$ y$ la$ telitromicina$ (329,330,332).$ Ambas$ especies$ son$ resistentes$ a$ los$ betalactámicos,$ aminoglucósidos$ y$ cotrimoxazol.$ La$ sensibilidad$a$los$macrólidos$es$diferente$en$R.(typhi$y$R.(felis,$lo$que$traduce$su$diferente$ situación$ taxonómica.$ Así,$ R.( typhi$ es$ sensible$ a$ los$ macrólidos,$ especialmente$ a$ josamicina,$ lo$ que$ supone$ una$ alternativa$ útil$ en$ el$ tratamiento$ de$ niños$ y$ mujeres$ embarazadas,$mientras$que$R.(felis$es$$resistente$a$este$grupo$farmacológico.$ No$ existen$ estudios$ comparativos$ acerca$ de$ la$ duración$ del$ tratamiento.$ En$ general$se$recomienda$que$sea$de$5$días,$aunque$presumiblemente$una$menor$duración$ (incluso$una$dosis$única)$pueda$ser$igualmente$eficaz.$ $$El$tratamiento$de$elección$es$una$tetraciclina,$principalmente$doxiciclina.$In(vitro,$ minociclina,$rifampicina,$cloranfenicol,$quinolonas,$y$azitromicina$inhiben$el$crecimiento$ Introducción Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 95 de$las$$rickettsias.$La$dosis$recomendada$es$100$mg$vía$oral$cada$12$horas,$o$intravenosa$ en$casos$de$enfermedad$grave$(333).$ $ 1.3.8.$Prevención$ $ Las$ medidas$ de$ profilaxis$ consisten$ fundamentalmente$ en$ desparasitar$ a$ los$ animales$mediante$el$uso$de$repelentes,$evitar$el$contacto$con$animales$parasitados$por$ pulgas$y$desinfectar$los$lugares$frecuentados$por$perros$y$gatos.$ $ $La$infección$puede$ser$prevenida$a$través$del$control$de$las$pulgas$en$los$animales$ domésticos,$especialmente$los$gatos$domésticos.$La$vegetación$cercana$a$los$domicilios$ debe$ser$ podada$para$que$no$sirva$ de$refugio$ a$roedores$o$ gatos$salvajes.$ También$se$ debe$evitar$la$entrada$de$animales$en$los$domicilios.$ $ Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 102 63.!Palosno!T,!Leinikki!P,!Pettersson!T!et!al.!Hazards!of!expanding!tourism:! report!of!six!cases!of!Q!fever!in!Finland.!Scand!J.!Infect!Dis.!1974;!6:!173M176.! 64.! Potasman! I,! Rzotkiewicz! S,! Pick! N,! Keysary! A.! Outbreak! of! Q! fever! following!a!safari!trip.!Clin!Infect!Dis.!2000!;30:214M5.! 65.!Brouqui!P,!Rolain!JM,!Foucault! C,! Raoult! D.! Short! report:! Q! fever! and! Plasmodium( falciparum! malaria! coMinfection! in! a! patient! returning! from! the! Comoros!archipelago.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2005;73:1028M30.! 66.!Somasundaram! R,! Loddenkemper! C,! Zeitz!M,! Schneider! T.! A! souvenir! from!the!Canary!Islands.!Lancet!2006;!367:!1116.! 67.!Cohen!NJ,!Papernik!M,!Singleton!J,!Segreti!J,!Eremeeva!ME.!Q!fever!in!an! American!tourist!returned!from!Australia.!Travel!Med!Infect!Dis.!2007;5:194M5.!!! 68.! Ta! TH,! Jiménez! B,! Navarro! M,! Meije! Y,! González! FJ,! LopezMVelez! R.! Q! Fever!in!returned!febrile!travelers.!J!Travel!Med.!2008!15:126M9.!!!! 69.!Kobbe!R,!Kramme!S,!Gocht!A,!Werner!M,!Lippert!U,!May!J,!Burchard!G.! TravelMassociated!Coxiella!burnetii!infections:!three!cases!of!Q!fever!with!different! clinical!manifestation.!Travel!Med!Infect!Dis.!2007;5:374M9.!!! 70.!Jensenius!M,!Davis!X,!von!Sonnenburg!F,!Schwartz!E,!Keystone!JS,!Leder! K,! et! al.! Multicenter! GeoSentinel! analysis! of! rickettsial! diseases! in! international! travelers,!1996M2008.!Emerg!Infect!Dis.!2009;15:1791M8.!!! 71.!Delord!M,!Socolovschi!C,!Parola!P.!Rickettsioses!and!Q!fever!in!travelers! (2004M2013).!Travel!Med!Infect!Dis.!2014;12:443M58.!!! 72.! Raoult! D.! Clinical! presentation! of! acute! australian! Q! fever.! Am! J! Med! 1994;!96:!397M398.! 73.!Sobradillo!V,! Ansola! P,! Baranda! F.! Neumonia! por! fiebre!Q!en!España.! Arch!Bronconeumol!1986;22:227M32.!! !!!!!!!!!!!!!74.!Prada!J,!LLorente!A.!Primer!caso!de!fiebre!Q!humana!en!España.!Rev!Iberica! de!Parasitologia!1950;!10:275M9.!! !!!!!!!!!!!!!!75.!Pérez6Gallardo!F,!Clavero!G,!Hernández6Fernández!S.!Investigaciones!sobre! la! epidemiologia! de! la! fiebre! Q! en! España.! Os! conejos! de! monte! y! los! lirones! como! reservorio!de!Coxiella!burnetii.!Rev!San!Hig!Pub.!1952;26:8167.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 103 76.! Sobradillo! Peña! V,! Aguirre! Errasti! C,! Villate! Navarro! JL,! Antoñana! Larrieta!JM,!Montejo!Baranda!M,!Cisterna!Cancer!R.!Fiebre!Q:!Brote!epidémico!en! el!Pais!Vasco.!Descripción!de!diez!casos.!!Med!Clin!(Barc).!1983;80:3M6.! 77.!Montejo!Baranda!M,!Senosiain!Gascue!JM,!Alvarez!Blanco!A,!Hernández! Almaraz!JL,!Aguirre!Errasti!C.!Fiebre!Q!aguda.!Estudio!de!11!casos!esporádicos!en! un!área!endémica.!Rev!Clin!Esp.!1983;171:141M4.! 78.!Aguirre!Errasti!C,!Montejo!Baranda!M,!Hernandez!Almaraz!JL,!de!la!Hoz! Torres!C,!Martinez!Gutierrez!E,!Villate!Navarro!JL,!et!al.!An!outbreak!of!Q!fever!in! the!Basque!country.!Can!Med!Assoc!J.!1984;131:48M9.! 79.!MartínezMLuengas!F,!Borobio!MV,!Gálvez!J,!León!de!Lope!M,!Corral!JL,! Mañas!R,!et!al.!!Fiebre!Q!en!Sevilla.!Comparación!con!otras!entidades.!Descripción! de!34!casos!y!revisión.!Rev!Clin!Esp.!1985;176:400M5.! 80.! Fernández! Roblas! R,! Wilhelmi! I,! Díaz! Curiel! M,! Gómez! P,! Aguado! JM,! Fernández!Guerrero!ML,!et!al.! !Fiebre!Q!aguda! y!crónica:!clínica.!epidemiología,! aislamiento!del!agente!y!datos!serológicos.!!Rev!Clin!Esp.!1985!;177:62M9.! 81.!Montejo!Baranda!M,!Corral!Carranceja!J,!Aguirre!Errasti!C.!Q!fever!in!the! Basque!Country:!1981M1984.!Rev!Infect!Dis.!1985;7:700M1.! 82.! RubiésMPrat! J,! Martí! J,! Cuxart! A.! Clotet! B.! Forma! hepática! y! febril! autolimitada!de!la!fiebre!Q.!Med!Clin!(Barc).!1986!;!86:261.! 83.! FernándezMGuerrero! ML,! Muelas! JM,! Aguado! JM,! Renedo! G,! Fraile! J,! Soriano! F,! et! al.! Q! fever! endocarditis! on! porcine! bioprosthetic! valves.! Clinicopathologic! features! and! microbiologic! findings! in! three! patients! treated! with! doxycycline,! cotrimoxazole,! and! valve! replacement.! Ann! Intern! Med.! 1988;108:209M13.! 84.!Sobradillo!V,!Ansola!P,!Baranda!F,!Corral!C.!Q!fever!pneumonia:!a!review! of!164!communityMacquired!cases!in!the!Basque!country.!Eur!Respir!J.!1989;2:263M 6.! 85.!Millán!Mon!A,!Argany!Fajardo!A,!Febles!Bethencourt!J,!González!Caloca! C,!Vento!Remedios!TE,!Fernández!Cabrera!M.!!Fiebre!Q!en!la!isla!de!La!Palma.!Una! revisión!de!35!pacientes.!An!Med!Interna.!1989;6:527M30.! 86.!Rotaeche!del!Campo!R,!Anta!Unanue!JL.!Fiebre!Q.!Brote!familiar!de!5! casos.!Aten!Primaria.!1990;7:211M2,!214M5.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 104 87.! Antón! Aranda! E,! Altuna! Basurto! E,! García! Martín! C,! Martí! Cabane! J,! Bustillo! Gutiérrez! JM.! Incidencia! y! características! de! la! fiebre! Q! en! un! hábitat! comarcal.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!1990;8:350M3.! 88.!Murie!Carrillo!de!Albornoz!M,!Pérez!de!Heredia!JH,!Sánchez!Alvarez!J,! Tiberio! López! G,! Hernández! Palacios! R,! Rivero! Puente! A.! Epidemiología! de! las! neumonías!adquiridas!en!la!comunidad!del!Área!de!Salud!I!de!Navarra.!Med!Clin! (Barc).!1991;97:50M2.! 89.! Martínez! Eizaguirre! JM,! Pérez! Rizo! M,! Olivella! Pedregal! A,! García! Ventura! S,! Cancio! Fanlo! M,! Basabe! Zapirain! M.! Fiebre! Q.! Brote! epidémico! de! la! forma!febril!pura.!Aten!Primaria.!1992!;9:425M8.! 90.! Bella! F,! Espejo! E,! Mauri! M,! Alegre! MD.! Clinical! presentation! of! acute! ustralian!Q!fever.!Am!J!Med.!1994;96:397M8.! 91.! Pascual! Velasco! F,! Borobio! Enciso! MV,! González! Lama! Z,! Carrascosa! Porras!M.!Clinical!presentation!of!acute!Q!fever!in!Lanzarote!(Canary!Islands):!a!2M year!prospective!study.!Scand!J!Infect!Dis.!1996;28:533M4.! 92.!Merino!FJ,!Nebreda!T,!Campos!A.!Most!common!clinical!presentation!of! Q!fever!in!a!province!in!the!north!of!Spain.!Eur!J!Epidemiol.!1998;14:729M30.! 93.!Abad!A,!Pardo!C,!Imaz!M.!Fiebre!Q:!estudio!retrospectivo!de!los!últimos! 10!años!en!el!área!del!Hospital!de!Basurto!(Bilbao).!Rev!Clin!Esp.!1999;199:618M9.! 94.!Domingo!P,!Muñoz!C,!Franquet!T,!Gurguí!M,!Sancho!F,!Vazquez!G.!Acute! Q!fever!in!adult!patients:!report!on!63!sporadic!cases!in!an!urban!area.!Clin!Infect! Dis.!1999;!29:874M9.! 95.!Nebreda!T,!Contreras!E,!!Merino!FJ,!Dodero!E,!Campos!A.![Outbreak!of!Q! fever!and!seroprevalence!in!a!rural!population!from!Soria!Province].!Enferm!Infecc! Microbiol!Clin.!2001;19:57M60.! 96.!Nuño!Mateo!FJ,!Noval!Menéndez!J,!Campoamor!Serrano!MT,!del!Valle! Prieto!A.!Fiebre!Q!aguda!en!Asturias.!Rev!Clin!Esp!2002;202:569M73! 97.! Alarcón! A,! Villanueva! JL,! Viciana! P,! LópezMCortés! L,! Torronteras! R,! Bernabeu!M,!et!al.!Q!fever:!epidemiology,!clinical!features!and!prognosis.!A!study! from!1983!to!1999!in!the!South!of!Spain.!J!Infect.!2003;47:110M6.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 105 98.!Bolaños!M,!Santana!OE,!PérezMArellano!JL,!AngelMMoreno!A,!Moreno!G,! Burgazzoli! JL,! et! al.! Fiebre! Q! en! Gran! Canaria:! 40! nuevos! casos.! Enferm! Infecc! Microbiol!Clin.!2003;!21:20M3.! 99.!Sampere!M!,!Font!B,!Font!J,!Sanfeliu!I,!Segura!F.!Q!fever!in!adults:!review! of!66!clinical!cases.!Eur!J!Clin!Microbiol!Infect!Dis.!2003;22:108M10!! 100.! RomeroMJiménez! MJ,! SuárezMLozano! I,! Fajardo! JM,! Benavente! A,! Menchero!A,!de!la!Iglesia!A.!Hepatitis!aislada!como!forma!de!presentación!de!la! fiebre!Q:!características!clínicas!y!epidemiológicas!en!109!pacientes!Enferm!Infecc! Microbiol!Clin.!2003;21:193M5.! 101.!Miguélez!M,!Laynez!P,!Linares!M,!Hayek!M,!Abella!L,!Marañez!I.!Tifus! murino! en! Tenerife.! Estudio! clinicoepidemiológico! y! características! clínicas! diferenciales!con!la!fiebre!Q.!Med!Clin!(Barc).!2003!;121:613M5.! 102.!Bartolomé!J,!Marín!A,!Lorente!S,!Heredero!E,!Crespo!MD.!Fiebre!Q!aguda:! 35!casos!en!CastillaMLa!Mancha.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin!2004;22:292M4! 103.!Ramos!JM,!Masía!M,!Rodríguez!JC,!Gutiérrez!F.!Fiebre!Q!aguda!en!la! Comunidad! Valenciana.! Estudio! de! 30! casos.! Enferm! Infecc! Microbiol! Clin.! 2005;23:512M3.! 104.! de! los! RíosMMartín! R,! SanzMMoreno! JC,! MartínMMartínez! F,! TébarM Betegón! MA,! CortésMGarcía! M,! EscuderoMNieto! R.! Brote! de! fiebre! Q! en! un! área! urbana!asociado!a!la!visita!a!una!granjaMescuela.!Med!Clin!(Barc).!2006;126:573M5.! 105.! GarcíaMClemente! M,! SecoMGarcía! AJ,! GutiérrezMRodríguez! M,! RomeroM Alvarez! P,! FernándezMBustamante! J,! RodríguezMPérez! M.! ! Brote! epidémico! de! neumonía!por!Coxiella!burnetii.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!2007;25:184M6.! 106.!MuñozMSanz!A,!Vera!A,!Rodríguez!Vidigal!FF.!Fiebre!Q!en!Extremadura:! una!infección!emergente.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!2007;25:230M4.! 107.! Ruiz! Seco! MP,! López! Rodríguez! M,! Estébanez! Muñoz! M,! Pagán! B,! Gómez! Cerezo! JF,! et! al! .! Fiebre! Q:! 54! nuevos! casos! de! un! hospital! terciario! de! Madrid!!Rev!Clin!Esp.!2011;!211:!240M4! 108.!Mogollón!MV,!Anguita!MP,!Aguado!JM,!Tornos!P,!Miró!JM,GálvezMAcebal! J,!et!al.!Q!fever!endocarditis!in!Spain.!Clinical!characteristics!and!outcome.!Enferm! Infecc!Microbiol!Clin.!2011;29(2):109–116! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 106 109.! Raya! Cruz! M,! Gállego! Lezaún! C,! García! Gasalla! M,! Cifuentes! Luna! C,! Forteza!Forteza!T,!FernándezMBaca!V!et!al.!Fiebre!Q!aguda!sintomática:!87!casos!en! un!área!de!Mallorca.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!2014;32:213M8! 110.! Espejo! E,! GilMDíaz! A,! Oteo! JA,! CastilloMRueda! R,! GarcíaMAlvarez! L,! SantanaMBáez!S,!et!al.!Clinical!presentation!of!acute!Q!fever!in!Spain:!seasonal!and! geographical!differences.!Int!J!Infect!Dis.!2014;26:162M4.!!! 111.!!Oteo!JA,!PérezMCortés!S,!Santibáñez!P,!Gutiérrez!E,!Portillo!A,!Blanco!JR,!! et!al.!Q!fever!endocarditis!associated!with!a!cardiovascular!implantable!electronic! device.!Clin!Microbiol!Infect.!2012;18:E482M4.!!! 112.!Montes!M!,!Cilla!G,!Vicente!D,!Nieto!V,!Ercibengoa!M,!PerezMTrallero!E.! Gipuzkoa,! Basque! Country,! Spain! (1984M2004):! a! hyperendemic! area! of! Q! fever.! Ann!N!Y!Acad!Sci.!2006;!1078:129M32.! 113.!Lepe!JA,!Guerrero!FJ,!RuizMCalderón!A,!del!Castillo!E,!GómezMSalvago!S,! JiménezMAlonso!MA,!et!al.!Epidemiología!de!la!fiebre!Q!en!la!zona!norte!de!Huelva! Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!1999;17:65M8.! 114.!Daza!Pérez!RM,!Castillo!Ribera!R,!GarcíaMCarbajosa!S,!Ojeda!Fernández! E,!Dámaso!López!D,!Moreno!López!M.!Estudio!de!la!tasa!de!anticuerpos!a!Coxiella( burnetii!en!la!población!sana.!Med!Clin!(Barc).!1980!;74!:52M4.! 115.!Tellez!A,!Martin!A,!Anda!P,!De!la!Fuente!L,!Benitez!P,!Garcia!C,!Leon!P.! Study! of! C.( burnetii! human! and! animal! seroprevalence! in! a! rural! population! in! Madrid!community.!Eur!J!Epidemiol.!1989!;5:444M6.! 116.!Cour!Boveda!MI,!González!Sinde!MC,!González!Cuadrado!S,!Palau!Beato! ML,! González! Gómez! C,! Ferro! Dalda! A.! Coxiella( burnetii:! estudio! serológico! en! diferentes!poblaciones.!!An!Med!Interna!(Madrid).!1990;7:513M6.! 117.! RuizMBeltrán! R,! HerreroMHerrero! JI,! MartínMSánchez! AM,! MartínM González! JA.! Prevalence! of! antibodies! to! Rickettsia(conorii,!Coxiella(burnetii,! and! Rickettsia( typhi! in! Salamanca! Province! (Spain).! Serosurvey! in! the! human! population.!Eur!J!Epidemiol.!1990;6:293M9.! 118.!Pascual!Velasco!F,!Rodríguez!Pérez!JC,!Otero!Ferrio!I,!Borobio!Enciso! MV.!Seroprevalence!of!Q!fever!among!the!adult!population!of!Lanzarote!(Canary! Islands).!An!Med!Interna.!1992!;9:428M32.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 107 119.! Saz! JV,! Bacellar! F,! Merino! FJ,! Filipe! A.! [Seroprevalence! of! Coxiella( burnetii!and!Rickettsia!conorii!infection! in! the! province! of! Soria].!Enferm!Infecc! Microbiol!Clin.!1993;!11:!469M73.! 120.! Sanzo! JM,! GarciaMCalabuig! MA,! Audicana! A,! Dehesa! V.! Q! fever:! prevalence!of!antibodies!to!Coxiella(burnetii!in!the!Basque!country.!Int!J!Epidemiol.! 1993;22:1183M8.! 121.!PérezMTrallero! E,! Cilla! G,! Montes!M,! SaénzMDominguez! JR,! Alcorta! M.! Prevalence! of! Coxiella( burnetii! infection! among! slaughterhouse! workers! in! northern!Spain.!Eur!J!Clin!Microbiol!Infect!Dis.!1995;14:71M3.! 122.! SuárezMEstrada! J,! RodríguezMBarbosa! JI,! GutiérrezMMartín! CB,! CastañedaMLópez! MR,! FernándezMMarcos! JM,! GonzálezMLlamazares! OR,! et! al.! Seroepidemiological!survey! of! Q!fever! in! León!province,! Spain.! Eur!J! Epidemiol.! 1996;12:245M50.! 123.!PascualMVelasco!F,!Montes!M,!Marimón!JM,!Cilla!G.!High!seroprevalence! of! Coxiella! burnetii! infection! in! Eastern! Cantabria! (Spain).! Int! J! Epidemiol.! 1998;27:142M5.! 124.! Valencia! MC,! Rodriguez! CO,! Puñet! OG,! de! Blas! Giral! I.! Q! fever! seroprevalence! and! associated! risk! factors! among! students! from! the! Veterinary! School!of!Zaragoza,!Spain.!Eur!J!Epidemiol.!2000;16:469M76.! 125.! Cardeñosa! N,! Sanfeliu! I,! Font! B,! Muñoz! T,! Nogueras! MM,! Segura! F.! Short!report:!seroprevalence!of!human!infection!by!Coxiella(burnetii!in!Barcelona! (northeast!of!Spain).!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2006;75:33M5.! 126.!Bartolomé!J,!Riquelme!E,!HernándezMPérez!N,!GarcíaMRuiz!S,!Luján!R,! Lorente!S,!et!al.!Seroepidemiología!de!la!infección!por!Coxiella(burnetii!en!donantes! de!sangre!en!Albacete.!Enferm!Infecc!Microbiol!Clin.!2007;25:382M6.! 127.! GonzálezMQuijada! S,! MoraMSimón! MJ,! MartinMEzquerro! A.! Association! between!serological!evidence!of!past!Coxiella!burnetii!infection!and!atherosclerotic! cardiovascular!disease!in!elderly!patients.!Clin!Microbiol!Infect.!2014!;20:873M8.!!! 128.!Palau!Beato!L,!Lopez!Bartolome!O,!Cour!Boveda!MI,!Gonzalez!Sinde!MC,! Cuevas! Beltran! L,! Garcia! Lerin! MC.! Coxiella( burnetii:! Un! estudio! serológico! de! bóvidos!en!la!Comunidad!de!Madrid.!Rev!Sanid!Hig!Publica!(Madr).!1989;63:43M6.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 108 129.!Barandika!JF,!Hurtado!A,!GarcíaMEsteban!C,!Gil!H,!Escudero!R,!Barral!M,! et! al.! TickMborne! zoonotic! bacteria! in! wild! and! domestic! small! mammals! in! northern!Spain.!Appl!Environ!Microbiol.!2007;!73:6166M71.!!! 130.!RuizMFons!F,!Rodríguez!O,!Torina!A,!Naranjo!V,!Gortázar!C,!de!la!Fuente! J.! Prevalence! of! Coxiella( burnetii! infection! in! wild! and! farmed! ungulates.! Vet! Microbiol.!2008;126:282M6.!!! 131.!Navarro!JA,!Ortega!N,!Buendia!AJ,!Gallego!MC,!Martínez!CM,!Caro!MR,!et! al!Diagnosis!of!placental!pathogens!in!small!ruminants!by!immunohistochemistry! and!PCR!on!paraffinMembedded!samples.!Vet!Rec.!2009;165:175M8.! 132.!RuizMFons!F,!Astobiza!I,!Barandika!JF,!Hurtado!A,!Atxaerandio!R,!Juste! RA,! et! al! Seroepidemiological! study! of! Q! fever! in! domestic! ruminants! in! semiM extensive!grazing!systems.!BMC!Vet!Res.!2010;6:3.!!! 133.! Astobiza! I,! Barral! M,! RuizMFons! F,! Barandika! JF,! Gerrikagoitia! X,! Hurtado!A,!et!al.!Molecular!investigation!of!the!occurrence!of!Coxiella!burnetii!in! wildlife!and!ticks!in!an!endemic!area.!Vet!Microbiol.!2011;147:190M4.!!! 134.!Alvarez!J,!Perez!A,!Mardones!FO,!PérezMSancho!M,!GarcíaMSeco!T,!Pagés! E,!et!al!Epidemiological!factors!associated!with!the!exposure!of!cattle!to!Coxiella( burnetii(in!the!Madrid!region!of!Spain.!Vet!J.!2012;194:102M7.!!! 135.!Mentaberre!G,!Gutiérrez!C,!Rodríguez!NF,!Joseph!S,!GonzálezMBarrio!D,! Cabezón!O,!et!al.!A!transversal!study!on!antibodies!against!selected!pathogens!in! dromedary!camels!in!the!Canary!Islands,!Spain.!Vet!Microbiol.!2013;167:468M73.!!! 136.!Barandika!JF,!Hurtado!A,!GarcíaMSanmartín!J,!Juste!RA,!Anda!P,!GarcíaM Pérez!AL.!Prevalence!of!tickMborne!zoonotic!bacteria!in!questing!adult!ticks!from! northern!Spain.!Vector!Borne!Zoonotic!Dis.!2008!;8:829M35! 137.!Toledo!A,!Jado!I,!Olmeda!AS,!CasadoMNistal!MA,!Gil!H,!Escudero!R,!et!al! Detection!of!Coxiella(burnetii!in!ticks!collected!from!Central!Spain.!Vector!Borne! Zoonotic!Dis.!2009;9:465M8.!!! 138.!Georgiev!M,!Afonso!A,!Neubauer!H,!Needham!H,!Thiery!R,!Rodolakis!A,! et! al.! Q! fever! in! humans! and! farm! animals! in! four! European! countries,! 1982! to! 2010.!Euro!Surveill.!2013;18.!pii:!20407.! 139.! Frankel! D,! Richet! H,! Renvoisé! A,! Raoult! D.! Q! fever! in! France,! 1985M 2009.!Emerg!Infect!Dis.!2011;17:350M6.!!! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 109 140.!Bellini!C,!Magouras!I,!ChapuisMTaillard!C,!Clerc!O,!Masserey!E,!Peduto!G,! et! al.! Q! fever! outbreak! in! the! terraced! vineyards! of! Lavaux,! Switzerland.! New! Microbes!New!Infect.!2014;2:93M9.!!! 141.!Speelman!P.!The!largest!Q!fever!outbreak!ever!reported.!Neth!J!Med.! 2010;!68:!380M1.! 142.! Roest! HI,! Tilburg! JJ,! van! der! Hoek! W,! Vellema! P,! van! Zijderveld! FG,! Klaassen! CH,! et! al.! The! Q! fever! epidemic! in! The! Netherlands:! history,! onset,! response!and!reflection.!Epidemiol!Infect.!2011;139:1M12.!!! 143.! Dijkstra! F,! van! der! Hoek! W,! Wijers! N,! Schimmer! B,! Rietveld! A,! Wijkmans! CJ,! et! al.! The! 2007–2010! Q! fever! epidemic! in! The! Netherlands:! characteristics! of! notified! acute! Q! fever! patients! and! the! association! with! dairy! goat!farming.!FEMS!Immunol!Med!Microbiol.!2012;64:3M12.!!! 144.!Schneeberger!PM,!Wintenberger!C,!van!der!Hoek!W,!Stahl!JP.!Q!fever!in! the! Netherlands! M! 2007M2010:! what! we! learned! from! the! largest! outbreak! ever.! Med!Mal!Infect.!2014;44:339M53.!!! 145.!Wattiau!P,!Boldisova!E,!Toman!R,!Van!Esbroeck!M,!Quoilin!S,!Hammadi! S,!et!al.!Q!fever!in!Woolsorters,!Belgium.!Emerg!Infect!Dis.!2011;!17:2368M9.!!! 146.! Hellenbrand! W,! Breuer! T,! Petersen! L.! Changing! epidemiology! of! Q! fever!in!Germany,!1947M1999.!Emerg!Infect!Dis.!2001;7:789M96.! 147.! Wallensten! A,! Moore! P,! Webster! H,! Johnson! C,! van! der! Burgt! G,! Pritchard!G,!!el!al!Q!fever!outbreak!in!Cheltenham,!United!Kingdom,!in!2007!and! the!use!of!dispersion!modelling!to!investigate!the!possibility!of!airborne!spread.! Euro!Surveill.!2010;15.!pii:!19521.! 148.!Wilson!LE,!Couper!S,!Prempeh!H,!Young!D,!Pollock!KG,!Stewart!WC,!et! al.!Investigation!of!a!Q!fever!outbreak!in!a!Scottish!coMlocated!slaughterhouse!and! cutting!plant.!Zoonoses!Public!Health.!2010;57:493M8.!!! 149.!HussainMYusuf!H,!Islam!A,!Healy!B,!Lockhart!M,!Nguyen!C,!Sukocheva!O,! et!al!An!analysis!of!Q!fever!patients!6!years!after!an!outbreak!in!Newport,!Wales,! UK.!QJM.!2012;105:1067M73.!!! 150.!McCaughey!C,!McKenna!J,!McKenna!C,!Coyle!PV,!O'Neill!HJ,!Wyatt!DE,!et! al.! Human! seroprevalence! to! Coxiella! burnetii! (Q! fever)! in! Northern! Ireland.! Zoonoses!Public!Health.!2008;!55:189M94.!!! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 110 151.!Dupont!HT!,!Brouqui!P,!Faugere!B,!Raoult!D.!Prevalence!of!antibodies! to! Coxiella( burnetii,! Rickettsia( conorii,! and! Rickettsia( typhi! in! seven! African! countries.!Clin!Infect!Dis.!1995;21:1126M33.! 152.!Letaief!AO,!Yacoub!S,!Dupont!HT,!Le!Cam!C,!Ghachem!L,!Jemni!L,!et!al!.! Seroepidemiological!survey!of!rickettsial!infections!among!blood!donors!in!central! Tunisia.!Trans!R!Soc!Trop!Med!Hyg.!1995;89:266M8.! 153.! Niang! M,! Parola! P,! TissotMDupont! H,! Baidi! L,! Brouqui! P,! Raoult! D.! Prevalence!of!antibodies!to!Rickettsia(conorii,!Ricketsia(africae,!Rickettsia(typhi!and! Coxiella(burnetii!in!Mauritania.!Eur!J!Epidemiol.!1998;14:817M8.! 154.!Okabayashi!T,!Hasebe!F,!Samui!KL,!Mweene!AS,!Pandey!SG,!Yanase!T,!et! al!Short!report:!prevalence!of!antibodies!against!spotted!fever,!murine!typhus,!and! Q!fever!rickettsiae!in!humans!living!in!Zambia.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!1999!;61:70M2.! 155.! Steinmann! P,! Bonfoh! B,! Péter! O,! Schelling! E,! Traoré! M,! Zinsstag! J.! Seroprevalence!of!QMfever!in!febrile!individuals!in!Mali.!Trop!Med!Int!Health.!2005;! 10:612M7.! 156.!Kobbe!R,!Kramme!S,!Kreuels!B,!Adjei!S,!Kreuzberg!C,!Panning!M,!et!al!Q! Fever!in!Young!Children,!Ghana.!Emerg!Infect!Dis.!2008;!14:!344–346.!!! 157.! El! Sayed! Zaki! M,! Goda! T.! ClinicoMpathological! study! of! atypical! pathogens! in! communityMacquired! pneumonia:! a! prospective! study.! J! Infect! Dev! Ctries.!2009;3:199M205.! 158.! Lacheheb! A,! Raoult! D.! Seroprevalence! of! QMfever! in! Algeria.! Clin! Microbiol!Infect.!2009;!15!Suppl!2:167M8.!!! 159.!Mediannikov!O,!Fenollar!F,!Socolovschi!C,!Diatta!G,!Bassene!H,!Molez!JF,! Sokhna!C,!Trape!JF,!Raoult!D.!Coxiella(burnetii!in!humans!and!ticks!in!rural!Senegal.! PLoS!Negl!Trop!Dis.!2010!6;4:e654! 160.!Vanderburg!S,!Rubach!MP,!Halliday!JE,!Cleaveland!S,!Reddy!EA,!Crump! JA.! Epidemiology! of! Coxiella( burnetii! infection! in! Africa:! a! OneHealth! systematic! review.!PLoS!Negl!Trop!Dis.!2014;8:e2787!! 161.!Angelakis!E,!Mediannikov!O,!Socolovschi!C,!Mouffok!N,!Bassene!H,!Tall! A,!et!al.!Coxiella!burnetiiMpositive!PCR!in!febrile!patients!in!rural!and!urban!Africa.! Int!J!Infect!Dis.!2014;28:107M10.!!! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 111 162.! Koch! A,! Svendsen! CB,! Christensen! JJ,! Bundgaard! H,! Vindfeld! L,! Christiansen!CB,!!Q!fever!in!Greenland.!Emerg!Infect!Dis.!2010;16:511M3.!!! 163.! Snedeker! KG,! Sikora! C.! Q! fever! in! Alberta,! Canada:! 1998M2011.! Zoonoses!Public!Health.!2014;61:124M30.!!! 164.!Dahlgren!FS!,!McQuiston!JH!,!Massung!RF!,!Anderson!AD!.!Q!fever!in!the! United!States:!summary!of!case! reports!from!two! national!surveillance!systems,! 2000M2012.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2015!;92:247M55.!!! 165.!Mc!Quiston!JH,!Childs!JE.!Q!fever!in!humans!and!animals!in!the!United! States.!Vector!borne!Zoonotic!Dis!2002;2:179M91.! 166.!AraujoMMeléndez!J,!SifuentesMOsornio!J,!BobadillaMdelMValle!JM,!AguilarM Cruz!A,!TorresMAngeles!O,!RamírezMGonzález!JL,!et!al!!What!do!we!know!about!Q! fever!in!Mexico?!Rev!Invest!Clin.!2012;64:541M5.! 167.!Kourany!M,!Johnson!KM.!A!survey!of!Q!fever!antibodies!in!a!high!risk! population!in!Panama.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!1980!;29:1007M11.! 168.!Wood!H,!Drebot!MA,!Dewailly!E,!Dillon!L,!Dimitrova!K,!Forde!M!et!al.! Seroprevalence! of! seven! zoonotic! pathogens! in! pregnant! women! from! the! Caribbean.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2014;91:642M4.!!! 169.!Epelboin!L,!Chesnais!C,!Boullé!C,!Drogoul!AS,!Raoult!D,!Djossou!F,!et!al.! Q! fever! pneumonia! in! French! Guiana:! prevalence,! risk! factors,! and! prognostic! score.!Clin!Infect!Dis.!2012!;55:67M74! 170.!Eldin!C,!Mahamat!A,!Demar!M,!Abboud!P,!Djossou!F,!Raoult!D.!Q!fever! in!French!Guiana.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2014;91:771M6.!!! 171.!Manock!SR,!Jacobsen!KH,!de!Bravo!NB,!Russell!KL,!Negrete!M,!Olson!JG,! et! al.! Etiology! of! acute! undifferentiated! febrile! illness! in! the! Amazon! basin! of! Ecuador.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2009!;81:146M51.! 172.!Lemos!ER,!Rozental!T,!MaresMGuia!MA,!Almeida!DN,!Moreira!N,!Silva! RG,!et!al.!Q!fever!as!a!cause!of!fever!of!unknown!origin!and!thrombocytosis:!first! molecular! evidence! of! Coxiella! burnetii! in! Brazil.! Vector! Borne! Zoonotic! Dis.! 2011;11:85M7.!!! 173.! Rozental! T,! Mascarenhas! LF,! Rozenbaum! R,! Gomes! R,! Mattos! GS,! Magno!CC,!et!al.!Coxiella(burnetii,!the!agent!of!Q!fever!in!Brazil:!its!hidden!role!in! seronegative! arthritis! and! the! importance! of! molecular! diagnosis! based! on! the! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 118 !!!!!!!243.! Merhej! V,! El! Kaekouri! K,! Raoult! D.! Whole! genomeMbased! phylogenetic! analysis!of!Rickettsiae.!Clin!Microbiol!Infect!2009;!Suppl2:336M7.! !!!!!!!244.!Mooser!H,!RuizMCastañeda!M,!Zinsser!H.!The!transmission!of!the!virus!of! mexican!typhus!from!rats!to!rat!by!polyplax!spinulosus.!J!Exp!Med!1931;1564M75.! !!!!!!245.! Azad! AF.! Epidemiology! of! murine! typhus.! Annu! Rev! Entomol! ! 1990;! 35:553M69.! !!!!!!246.!U.S.!Army!Medical!Department.!Disponible!en:! http://history.amedd.army.mil/!booksdocs/itsfirst50yrs/section1.1.htm! !!!!!!247.!Science!Nevos!Online.!Disponible!en! http://www.sciencenews.org/20010224!/timeline.asp!! !!!!!!!248.!Ortiz!Leiva!C,!Murillo!Cabezas!F,!Muñoz!Sánchez!A,!Maravi!Petri!J.!!Una! entidad! poco! frecuente! en! cuidados! intensivos:! Rickettsiosis.! Med! Intens! 1979! ;! 3:90M92! !!!!!!!249.!García!Curiel!A,!Martín!Martín!A,!Torronteras!R,!Vargas!Romero,!López! Cortés!LF.!!Rickettsiosis:!presentación!de!13!casos.!Rev!Clín!Esp!1982;!164:!119M 122! !!!!!!250.!López!Cortés!LF,!Pachón!Díaz!J,!Viciana!Fernández!P,!Cuello!Contreras!JA,! Palomino!Nicas!J,!Carneado!de!la!Fuente!J,!et!al.!R.!Tifus!murino:!revisión!clínica!y! serológica!de!42!casos.!Med!Clin!(Barc)!1983;!835M838! !!!!!!251.!Moreno!Castillo!JL,!Sanchez!Roman!J,!Pamies!Andreu!E,!Morales!Sandino!M,! Vazquez! Garcia! F,! ! Torronteras! Santiago! R.! Pleuropericarditis! causada! por! Rickettsia! mooseri.! Una! manifestación! inhabitual! del! tifus! murino! Rev! Clin! Esp!! 1984;173:125M7! !!!!!!!252.!Parola!P,!Paddock!CD,!Socolovschi!C,!Labruna!MB,!Mediannikov!O,!Kernif! T,!et!al.!Clin!Microbiol!Rev!2013;26:657M702.! !!!!!!253.!Merhej!V,!Angelakis!E,!Socolovschi!C,!Raoult!D.!Genotyping,!evolution!and! epidemiological!finding!of!Rickettsia!species.!Infect!Genet!Evol;!204:26:122M37.! !!!!!254.! McLeod! MP,! Qin! X,! Karpathy! SE,! Gioia! J,! Highlandar! SK,! Fox! GE,! et! al.! Complete!genoma!sequence!of!Rickettsia!typhi!and!comparison!with!sequences!of! other!Rickettsiae.!J!of!Bacteriol!2004;186:5842M55.! !!!!!!255.!Raoult!D,!Roux!V.!Rickettsioses!as!paradigms!of!new!or!emerging!infectious! diseases.!Clin!Microbiol!Rev!!1997;!10:694M19.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 119 !!!!!256.! Azad! AF,! Radulovic! S,! Higgins! JA,! Noden! BH,! Troyer! JM.! FleaMborne! rickettsioses:!ecologic!considerations.!Emerg!Infect!Dis!!1997;3:319M27! !!!!!257.! Higgins! JA,! Radulovic! S,! Schriefer! ME,! Azad! AF.! Rickettsia! felis:! a! new! species! of! pathogenic! rickettsia! isolated! from! cat! fleas.! J! Clin! Microbiol!! 1996;34:671M674! !!!!!!258.!Raoult!D,!Scola!BL,!Enea!M,!Fournier!PE,!Roux!V,!Fenollar!F!et!al.!A!fleaM associated!Rickettsia!!pathogenic!for!humans.!Emerg!Infect!Dis!!2001;7:73M81! !!!!!!259.!Boostrom!A,!Beier!MS,!Macaluso!JA,!Macaluso!KR,!Sprenger!D,!Hayes!J!et!al.! Geographic! association! of!Rickettsia(felisMinfected!opossums! with! human! murine! typhus,!Texas.!Emerg!Infect!Dis!!2002;!8:549M554! !!!!260.!Márquez!FJ,!Muniain!MA,!Pérez!JM,!Pachón!J.!Presence!of!Rickettsia!felis!in! the!cat!flea!from!southwestern!Europe.!Emerg!Infect!Dis!!2002;!8:89M91! !!!!!261.! Lledó! L,! Gegúndez! MI,! Saz! JV,! Beltran! M.! Prevalence! of! antibodies! to! Rickettsia!typhi!in!an!area!of!the!center!of!Spain.!Eur!J!Epidemiol!!2001;17:927M8! !!!!262.! Santibáñez! S,! Astasia! A,! VillaMReal! R,! Cámara! JA,! Oteo! JA,! Márquez! FJ.!! Serologic!study! of! Rickettsia( typhi! infection! among! the! human! population! of! southern!Spain.!Clinical!Microbiol!Infect!2009;15:!247M8.! !!!!!263.!Nogueras!MM,!Cardeñosa!N,!Sanfeliu!I,!Muñoz!T,!Font!B,!Segura!F.!Evidence! of!infection!in!humans!with!Rickettsia(typhi!and!Rickettsia(felis!in!Catalonia!in!the! Northeast!of!Spain.!AnnN.Y.Acad.!Sci.!2006:1078:159M161.! !!!!264.!Daniel!SA,!Manika!K,!Arvanmdou!M,!Antoniadis!A.!Prevalence!of!Rickettsia( conorii!and!Rickettsia(typhi!infections!in!the!population!of!northern!Greece.!Am!J! Trop!Med!Hyg.!2002!;66:76M9.! !!!!265.! PundaMPolic! V,! LekoMGrbic! J,! Radulovic! S.! Prevalence! of! antibodies! to! rickettsiae!in!the!northMwestern!part!of!Bosnia!and!Herzegovina.!Eur!J!Epidemiol.! 1995;11:697M9353.!! !!!!266.! Badiaga! S,! Benkouiten! S,! HajjiH,! Raoult! D,! Brouqui! P.! Murine! typhus! in! homeless.!Comp!Immunol!Microbiol!Infec!Dis.!2012;!35:39M43.! !!!!!!267.!Comer!JA,!Diaz!T,!Vlahov!D,!Monterroso!E,!Childs!JE.!Evidence!of!rodentM associated!Bartonella!and!Rickettsia!infections!among!intravenous!drug!users!from! Central!and!East!Harlem,!New!York!City.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2001;65:855M60! !!!!!268.! Smith! HM,! Reporter! R,! Rood! MP,! Linscott,AJ,! Mascola! LM,! ! Hogrefe! W,! Purcell!RH.!Prevalence!study!of!antibody!to!ratborne!pathogens!and!other!agents! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 120 among! patients! using! a! free! clinic! in! downtown! Los! Angeles.! J! Infect! Dis!! 2002;186:1673–6! !!!!!!!269.! Marshall! GM.! Rickettsia( typhi! seroprevalence! among! children! in! the! Southeast!United!States!Ped!Infect!Dis!J!!2000;!19:1103M1104! e!Immunology,!Microbiology!and!Infectious!Diseases!2012.35:39M43.! !!!!!!!270.!Purcell!K,!FergienJ,!Richman!K,!Rocha!L.!Murine!typhus!in!children,!South! Texas.!Emerging!Infectious!Diseases!2007;!13:926M7.!! !!!!!!!271.! AcunaMSoto! R,! CalderonMRomero! L,! RomeroMLopez! D,! BravoMLindoro! A.! Murine!typhus!in!Mexico!City.!Trans!R!Soc!Trop!Med!Hyg!!2000;94:45.! !!!!!!!272.! Meskini! M,! Beati! L,! Benslimane! A,! Raoult! D.! Seroepidemiology! of! rickettsial!infections!in!Morocco.!Eur!J!Epidemiol.!1995!;11:655M60.! !!!!!!!273.! Anstey! NM,! Tissot! Dupont! H,! Hahn! CG,! Mwaikambo! ED,! McDonald! MI,! Raoult! D,! Sexton! DJ.! Seroepidemiology! of! Rickettsia( typhi,! spotted! fever! group! rickettsiae,! and! Coxiella( burnetti!!infection! in! pregnant! women! from! urban! Tanzania.!Am!J!Trop!Med!Hyg!!1997;57:187M9! !!!!!274.!Dill!T,!Dobler!G,!Saathoff!E,!Clowes!P,!Kroidl!I,!Ntinginya!E,!Machibya!H,! Maboko!L,!Löscher!T,!!Hoelscher!M,!Heinrich!N.!High!Seroprevalence!for!Typhus! Group! Rickettsiae,! Southwestern! Tanzania.! Emerging! Infectious! Diseases! ! 2013;! 19:317M20.! !!!!!275.!Richards!AL,!Soeatmadji!DW,!Widodo!MA,!Sardjono!TW,!Yanuwiadi!B,!et!al.! Seroepidemiologic!evidence!for!murine!and!scrub!typhus!in!Malang,!Indonesia.!Am! J!Trop!Med!Hyg.!1997;57:91M5.! !!!!!276.! Strickman! D,! Tanskul! P,! Eamsila! C,! Kelly! DJ.! Prevalence! of! antibodies! to! rickettsiae!in! the! human!population! of! suburban! Bangkok.! Am!J! Trop! Med!Hyg.! 1994;51:149M53.! !!!!!277.! Maude! RR,! Maude! RJ,! Ghose! A,! Amin! MR,! Islam! MB,! Ali! M,! et! al.! Serosurveillance!of!Orientia(tsutsugamushi!and!Rickettsia(typhi!in!Bangladesh.!Am!J! Trop!Med!Hyg!2014;!580M3.! !!!!!278.!Dumler!!JS,!Taylor!JP,!Walker!DH.!Clinical!and!laboratory!features!of!murine! thypus!in!south!Texas,!1980!through!1987.!JAMA!!1991;!266:1365M70.! !!!!!!279.! Silpapojakul! K,! Chayakul! P,! Krisanapan! S.! Murine! thypus! in! Thailand:! Clinical!features,!diagnosis!and!treatment!.!Q!J!Med!1993;!86:43!M47.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 121 !!!!!280.! Fergie! JE,! Purcell! K,! Wanat! D.! Murine! typhus! in! South! Texas! children.! Pediatr!Infect!Dis!J!!!2000;!19:535M8.! !!!!!281.!Whiteford!SF,!Taylor!JP,!Dumler!JS.!Clinical,!laboratory,!and!epidemiologic! features! of! murine! typhus! in! 97! Texas! children.! Arch! Pediatr! Adolesc! Med!! 2001;155:396M400! !!!!282.! Gikas! A,! Doukakis! S,! Pediaditis! J,! Kastanakis! S,! Psaroulaki! A,! Tselentis! Y.! Murine!typhus! in! Greece:!epidemiological,!clinical!and! therapeutic! data!from!83! cases.!Trans!Roy!Soc!Trop!Med!Hygiene!!2002.!96:250M253! !!!!!283.!HernándezMCabrera!M!,!AngelMMoreno!A,!!Santana!E,!!Bolaños!M!!,!Francès! A,! MartínMSánchez! ! AM! et! al.! Murine! typhus! with! renal! involvement! in! Canary! Islands,!Spain.!Emerg!Infect!Dis.!2004;10:740M3.! !!!!!284.!Gray!E,!AtatoaMCarr!P,!Bell!A,!Roberts!S,!Mudallal!DA,!Mills!G.!Murine!typhus! :! a! new! recognised! problema! in! the! Waikato! región! of! New! Zealand.! The! New! Zealand! Medical! Journal! 2007:120:1259M61.! URL:! http://www.nzma.org.nz/journal/120M1259/2661/! !!!!!285.!Koliou!M,!Psaroulaki!A,!Georgiou!C,!Ioannou!I,!Tselentis!Y,!Gikas!A.!Murine! typhus!in!Cyprus:21!paediatric!cases.!Eur!J!Clin!Microbiol!Infect!Dis.2007;!26:491– 3.! !!!!!286.!Gikas!A,!Kokkiki!S,!Tsioutis!C,!Athenessopoulos!D,!Balomenaki!E,!Blasak!S,! Matheou! C,! Tselentis! Y,! Psaroulaki! A.! Murine! Typhus! in! children:! clinical! and! laboratory! features! from! 41! cases! in! Crete.! Clin! Microbiol! Infec.! 2009;15! (supp):211M2.! !!!!!287.!Adjemian!J,!Parks!s,!McElroy!K,!Campbell!J,!Eremeeva!ME,!Nicholson!WL,! McQuiston!J,!Taylor!J.!Murine!typhus!in!Austin,!Texas,!USA!,2008.!Emerging!Infect! Dis.!2010;16:412M7.! !!!!!!288.! Zimmerman! MD,! Murdoch! DR,! Rozmajzl! PJ,! Basnyat! B,! Woods! CW,! Richards!AL,!Belbase!RH,!Hammer!DA,!Anderson!TP,!Reller!LB.!Murine!typhus!and! febrile!illness,!Nepal.!Emerg!Infect!Dis.!2008;14:16569.! !!!!!289.!Chang!K,!Chen!YH,!Lee!NY,!Lee!HC,!Lin!CY,!Tsai!JJ,!Lu!PL,!Chen!TC,!Hsieh!HC,! Lin! WR,! Lai! PC,! Chang! CM,! Wu! CJ,! Lai! CH,! Ko! WC.! Murine! typhus! in! southern! Taiwan!during!1992M2009.!Am!J!Trop!Med!Hyg.!2012;!84:141M7.! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 122 !!!!!290.! Walker! G,! BotelhoMNevers! E,! Socolovski! C,! Raoult! D,! Parola! P.! Murine! Typhus! in! returned! travelers:! a! report! of! 32! cases.! Am! J! Trop! Med! Hyg.! 2012;! 86:1049M53.! !!!!!!291.!Chaliotis!G,!Kritsotakis!EI,!Psaroulaki!A,!Tselentis!Y,Gikas!A.!!Murine!typhus! in!central! Greece:! epidemiological,!clinical,! laboratory,! and!therapeuticMresponse! features!of!90!cases.!Intern!J!of!Infect!Dis.!2012;16:591M6.! !!!!!!292.!Znazen!A,!Hammami!B,!Mustapha!AB,!Chaari!S,!Lahiani!D,!Maaloul!I,!Jemaa! MB,!Hammami!A.!Murine!typhus!in!Tunisia:!A!negleetd!cause!of!fever!as!a!single! sympton.!Medicine!et!maladies!infectieuses!2013.!43:!226M9.! !!!!!!293.!Aouam!A,!Toumi!A,!Brahim!HB,!Loussaief!C,!Jelliti!B,!Romdhane!FB,!Yahia! SB,!Khairallah!M,!Chakroun!M.!Epidemiological,!clinical!and!laboratory!features!of! murine!typhus!in!central!Tunisia.!Médicine!et!maladies!infectieuses!2015;45:124M 7.!! !!!!!!294.!Balleydier!E,!Camuset!G,!Socolovschi!C,!Moiton!MP,!Kuli!B,Foucher!A!et!al.! Murine!typhus,!Reunion,!France,2011M2013.!Emerging!Infect!Dis.!2015;22:316M9.! !!!!!!!295.! Hamaguchi! S,! Cuong! NC,! Tra! DT,! Doan! YH,! Simizu! K,! et! al.! Clinical! and! epidemiological! characteristics! of! scrub! typhus,and! murine! typhus! among! hospitalizad!patients!with!acute!undidderentiated!fever!in!northern!Vietnam.!Am!J! Trop!Med!Hyg!2015;92:972M8.! !!!!!!!296.!Tsioutis!C!,!Chaliotis!G,!Kokkini!S,!Doukakis!S,!Tselentis!Y,!Psaraulaki!A,! Gikas!A.!Scand!J!Infect!Dis!2014.46:779M82.! !!!!!!297.! Radulovic! S,! Price! PW,! Beier! MS,! Gaywee! J,! ! Macaluso! JA,! Azad! A.! RickettsiaMmacrophage! interactions:! host! cell! responses! to! Rickettsia( akari!and! Rickettsia(typhi.!!Infect!and!Inmmun.2002;70:2576M82.! !!!!!!298.! Shaked! Y,! Shpilberg! O,! Samra! Y.! Involvement! of! the! kidneys! in! Mediterranean!spotted!fever!and!murine!thypus.!Q!J!Med!!1994;!87:103M107.! !!!!!299.!Rosenthal!T,!Michaeli!D.!Murine!typhus!and!spotted!fever!in!Israel!en!the! seventies.!Infection.!!1977;5:82M84! !!!!300.! Whelton! A,! Douglas! JV,! Elisberg! BI.! Acute! renal! failure! complicating! rickettsial! infection! in! glucoseM6Mphosphate! dehydrogenase! deficient! individuals.! Ann!Intern!Med.!!1968;69:323M8! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 123 !!!!!301.!Silpapojakul!K,!Mitarnun!W,!Ovartlarnporn!B,!Chamroonkul!N,!KhowMEan! U.!Liver!involvement!in!murine!typhus.!QJM!.!1996;89:623M9! !!!!!302.! Pascual! Velasco! F,! Borobio! Enciso! MV.! [Acute! suppurative! arthritis:! an! unusual! manifestation! of! murine! typhus! (endemic)].! Med! Clin! (Barc).1991! ;97:142M3! !!!!!303.!Potasman!I,!Bassan!HM.!Pulmonary!embolism!complicating!murine!thypus.! J!R!Soc!Med!1986;!79:!367M368! !!!!!304.!Buchs!AE,!Zimlichman!R,!Sikuler!E,!Goldfarb!B.!Murine!typhus!endocarditis.! South!Med!J!!1992!;!85:751M3! !!!!!!305.!Austin!SM,!Smith!SM,!Co!B,!Coppel!IG,!Johnson!JE.!Serologic!evidence!of! acute!murine!typhus!infection!in!a!patient!with!cultureMnegative!endocarditis.!Am!J! Med!Sci!!1987;293:320M3! !!!!!!306.!Pether!JV,!Jones!W,!Lloyd!G,!Rutter!DA,!Barry!M.!Fatal!murine!thypus!from! Spain.!Lancet!1994;!344:897M8! !!!!!!307.!BernabeuMWittel!M,!VillanuevaMMarcos!JL,!de!AlarcónMGonzález!A,!Pachón!J.! Septic!shock!and!multiorganic!failure!in!murine!thypus.!Eur!J!Clin!Microbiol!Infect! Dis!!1998;!17:131M132! !!!!308.! Hudson! HL,! Thach! AB,! Lopez! PF.! Retinal! manifestations! of! acute! murine! typhus.!Int!Ophthalmol!!1997;21:121M6! !!!!!309.!Lu!TM,!Kuo!BI,!Chung!YM,!Liu!CY!.!Murine!typhus!presenting!with!multiple! white!dots!in!the!retina.!Scand!J!Infect!Dis!!1997;29:632M3! !!!!!!310.!Manor!E,!Politi!F,!Marmor!A,!Cohn!DF.!Papilledema!in!endemic!typhus.!Am! J!Ophthalmol!!1977;84:559M62! !!!!!!!311.!Masalha!R,!MerkinMZaborsky!H,!Matar!M,!Zirkin!HJ,!Wirguin!I,!Herishanu! YO.! Murine! typhus! presenting! as! subacute! meningoencephalitis.! J! Neurol!! 1998;245:665M8! !!!!!!!312.! Massung! RF,! Davis! LE,! Slater! K,! McKechnie! DB,! Puerzer! M.! Epidemic! typhus!meningitis!in!the!southwestern!United!States.!Clin!Infect!Dis!2001;32:979M 82! !!!!!!!313.!Lozano!de!León!F,!LucioMVillegas!ME,!López!LF,!GómezMMateos!J,!GarcíaM Bragado! F.! Afectación! parotídea! en! el! tifus! murino! Enf! Infecc! Microbiol! Clin! 1991;9:585! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 124 !!!!!!314.! Rabau! MY,! Wolfstein! I.! Murine! typhusMan! unusual! cause! for! intestinal! pseudoMobstruction.!Dig!Dis!Sci!!1980!;25:314M5! !!!!!315.!McKelvey!SD,!Braidly!PC,!Stansby!GP,!Weir!WR.!Spontaneus!splenic!rupture! associated!with!murine!thypus.!J!Infect!!1991;!22:296M297.! !!!!!!316.! La! Scola! B,! Raoult! D.! Laboratory! diagnosis! of! rickettsioses:! Current! approaches!to!diagnosis!of!old!and!new!rickettsial!diseases.!J!Clin!Microbiol.!1997;! 35:!2715M2727! !!!!!317.!Hersey!DF,!Colvin!MC,!Shepard!CC.!Studies! on! the! serologic! diagnosis! of! murine!typhus!and!Rocky!Mountain!spotted!fever.!J.!Immunol.!1957;!79:409–415.! !!!!318.!!Fiset! P,! Ormsbee! RA,! Silberman! R,! Peacock! M,! Spielman! MH.! A! microagglutination! technique! for! detection! and! measurement! of! rickettsial! antibodies.!Acta!Virol.!1969;!13:60–6.! !!!!!319.! Chang! RS,Murria! ES,! Zinder! JC.! ErythrocyteMsensitizing! substances! from! rickettsiae!of!the!Rocky!Mountain!spotted!fever!group.!J!Immunol.!1954;!73:8–15.! 320.! Hechemy! KE,! Anacker! RL,! Philip! RN,! Kleeman! KT,! ! MacCormack! JN,! Sasowski!SJ,!Michaelson!EE.!Detection!of!Rocky!Mountain!spotted!fever!antibodies! by!a!latex!agglutination!test.!J!Clin!Microbiol!1980;!!12:144–150.! 321.!Philip!!RN,!Casper!EA.,!Ormsbee!RA,!Peacock!MG,!Burgdorfer!W.!MicroM immunofluorescence! test! for! the! serological! study! of! Rocky! Mountain! spotted! fever!and!typhus.!J!Clin!Microbiol!1976;!3:!51–61.! 322.!Halle!S,!Dasch!GA,!Weiss!E.!Sensitive!enzymeMlinked!immunosorbent! assay!for!detection!of!antibodies!against!typhus!rickettsiae,!Rickettsia(prowazekii! and!Rickettsia!typhi.!J!Clin!Microbiol.!1977;!6:101–110.! 323.! Kelly! DJ,! Wong! PW,! Gan! E,! Lewis! GE! Comparative! evaluation! of! the! indirect!immunoperoxidase!test!for!the!serodiagnosis!of!rickettsial!disease.!Am!J! Trop!Med!Hyg!1988;!!38:400–406! 324.! Kelly! ! DJ,! Chan! CT,! ! Paxton! ! K.! Thompson! K,! Howard! R,! Dasch! GA.! CompaMrative!Evaluation!of!a!Commercial!Enzyme!Immunoassay!for!the!Detection! of!Human!Antibody!to!Rickettsia!typhi.!Clin!Diag!Lab!Immunol!1995;!2:!356–360! 325.!Sompolinsky!D,!Boldur!I,!Goldwasser!RA,!Kahana!H,!Kazak!R,!Keysary! A,! Pik! A.! Serological! crossMreactions! between! Rickettsia( typhi,! Proteus! vulgaris! Bibliografía Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 125 OX19,!and!Legionella!bozemanii!in!a!series!of!febrile!patients.!Isr!J!Med!Sci!1986! ;22:745M52! 326.!Vestris! G,! !Rolain!JM,!Fournier!PE,!Birg!ML,Enea!M,!Patrice!JY,! et! al.! Seven!years’!experience!of!isolation!of!Rickettsia!sp.!from!clinical!specimens!using! the!shell!vial!cell!culture!assay.!Ann!NY!Acad!Sci!2003:!990:!371M374!! 327.!Renvoisé!A,!Rolain!JM,!Socolovschi!C,!Raoult!D.!Widespread!use!of!real! –time!PCR!for!rickettsial!diagnosis.!FEMS!Immunol!Med!Microbiol!2012;64:126M9.! 328.! Giulieri! S,! Jaton! K,! Cometta! A,! Trellu! LT,! Greub! G.! Development! of! dúplex! realMtime! PCR! for! the! detection! of! Rickettsia!spp.! and! typhus! group! rickettsia!in!clinical!samples.!FEMS!Immunol!Med!Microbiol!2012;64:92M97.! 329.! Rolain! JM,! Stuhl! L,! Maurin! M,! Raoult! D.! Evaluation! of! antibiotic! susceptibilities! of! three! rickettsial! species! including! Rickettsia( felis!by! a! quantitative!PCR!DNA!assay.!Antimicrob!Agents!Chemother.!2002;!46:2747M2751! 330.!Rolain!JM,!Maurin!M,!Vestris!G,!Raoult!D.!In!vitro!susceptibilities!of!27! rickettsiae! to! 13! antimicrobials.! Antimicrob! Agents! Chemother.! 1998;! 42:1537M 1541! 331.! Laferl! H,! Fournier! PE,! Seiberl! G,! Pichler! H,! Raoult! D.! Murine! typhus! poorly!responsive!to!ciprofloxacin:!a!case!report.!J!Travel!Med.!2002!;9:103M4.! 332.! Rolain! JM,! Maurin! M,! Bryskier! A,! Raoult! D.! In! vitro! activities! of! telithromycin!(HMR!3647)!against!Rickettsia(rickettsii,!Rickettsia(conorii,!Rickettsia( africae,!Rickettsia!typhi,!Rickettsia(prowazekii,!Coxiella(burnetii,!Bartonella(henselae,! Bartonella(quintana,!Bartonella(bacilliformis,!and!Ehrlichia(chaffeensis.!Antimicrob! Agents!Chemother.!2000!:!1391M3.! 333.!BotelhoMNevers!E,!Socolovschi!C,!Raoult!D,!Parola!P.!Treatment!of! Rickettsia)spp.!infections:!a!reviews.!Expert!Rev.!Anti!Infect.!Ther.2012.10,1425637. Objetivos Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 126 ! ! Objetivos! ! Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 127 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! OBJETIVOS) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ! Objetivos Epidemiología, Agentes causales y Métodos diagnósticos en pacientes con Fiebre de Duración Intermedia en Gran Canaria 134 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!ARTÍCULOS!CIENTÍFICOS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! OE#1.1#Infección#por#Rickettsia)felis#en#las#Islas#Canarias.# # Rickettsia) felis! ocasiona! un!cuadro! clínico!de! fiebre!de! duración!intermedia! y! aunque!clínicamente!es!similar!al!tifus!murino,!esta!especie!se!incluye!en!el!grupo!de! las!rickettsiosis!de!las!fiebres!exantemáticas.!En!su!ciclo!biológico!el!principal!vector!es! la! pulga! del! gato! (Ctenocephalides) felis),! aunque! probablemente! estén! implicados! otros!vectores!y!otros!reservorios.! La! importancia! de! este! artículo! estriba! en! que! por! primera! vez! en! España! se! describe!!la!infección!por!Rickettsia) felis!en!humanos.!!Las!muestras!de!suero!de!44! pacientes!cuyo!cuadro!clínico!no!se!correspondía!con!el!de!tifus!murino!se!enviaron!al! Centro! de! Referencia! de! Rickettsias! en! Marsella.! Asimismo! se! envió! una! pulga! aportada! por! uno! de! los! pacientes.! Se! realizaron! estudios! serológicos! utilizando! pruebas!de!inmunofluorescencia,!Western!blot!y!!adsorción!cruzada.!!Los!resultados! pusieron!de!manifiesto!la!presencia!de!!rickettsiosis!en!31!de!los!44!pacientes:!5!con! diagnóstico!final!de!infección!por!R.)felis,!13!por!R.)typhi!y!otros!13!con!infección!por! otras!especies!de!Rickettsia.)! Las!características!clínicas!diferenciales!de!ambas!infecciones!fueron:! !•!El!intervalo!entre!el!comienzo!de!las!síntomas!y!la!evaluación!del!paciente! fue!más!prolongado!en!los!casos!de!infección!por!R.)felis!!(!de!9R14!dias!vs.!8,5!a!10,2! en!R.)typhi).! •!!La!presencia!de!odinofagia!y!tos!seca!fue!más!frecuente!en!los!casos!de!infecR ción!por!R.)typhi.! •! La! elevación! de! las! transaminasas! (AST! y! ALT)! fue! superior! en! los! casos! de! infección!por!R.)typhi.! ! Human Rickettsia felis Infection, Canary Islands, Spain Jose-Luis Pérez-Arellano,*†1 Florence Fenollar,‡1Alfonso Angel-Moreno,*† Margarita Bolaños,*† Michele Hernández,*† Evora Santana,*† Marion Hemmersbach-Miller,*† Antonio-M Martín,*† and Didier Raoult‡ We report the first cases of human infection by Rickettsia felis in the Canary Islands. Antibodies against R. felis were found in 5 adsorbed serum samples from 44 patients with clinically suspected rickettsiosis by Western blot serology. Fleas from 1 patient’s dog were positive for R. felis by polymerase chain reaction. Rickettsia felis is an intracellular bacterium (genus Rickettsia, spotted fever group [SFG]) (1,2). Its biological cycle involves the cat flea (Ctenocephalides felis) as the main vector (3). R.felis has been found in C. felis and C. canis in the Americas, Europe, Africa, Asia, and Oceania (1,3–6). Human disease caused by R. felis was unknown until 1994 (4). Since then, R. felis infection has been reported in Mexico (3 patients) (7), Germany (1 patient) (8), Brazil (2 patients) (1), and France (2 patients) (1). The clinical manifestations of the disease include high fever, rash, and elevation of liver enzymes (1,4,7). Exposure to fleas or to flea-prone animals is sometimes recorded (7,8). On the Canary Islands (Atlantic islands of Spain), autochthonous cases of murine typhus have been reported (9). Although we suspected that some patients with a clinical picture of murine typhus actually had R. felis infection, we were not able to confirm this hypothesis. Therefore, 44 serum samples from 44 patients from the Canary Islands with suspected murine typhus were sent to the Unité des Rickettsies in Marseille, France, for specific serologic tests. Here, we describe the first 5 human infections caused by R. felis on the Canary Islands. The Study Forty-four patients were recruited for a prospective study of fever of intermediate duration (i.e., fever without focal symptoms lasting 7–28 days). Demographic, clinical, and laboratory data were collected for all patients. Chest radiographs and blood and urine cultures were taken. Antibodies against R. typhi were tested by direct immunofluorescence test (bioMérieux, Marcy L’Etoile, France) in the Canary Islands. Among the 44 patients, 24 showed a positive serologic result. Antibodies against other agents (Coxiella burnetii, R. conorii, Leptospira spp., EpsteinBarr virus, cytomegalovirus, HIV, and hepatitis B virus) were also tested; all were negative. To search for evidence of infection with R. felis, all serologic results were confirmed by microimmunofluorescence (MIF) in France, as previously described (10). Systematic testing of SFG rickettsia antigens present in Europe and Africa was performed in parallel. The MIF procedure was followed by the use of Western blot and cross-adsorption studies. An immunofluorescence assay was considered positive if immunoglobulin G (IgG) titers were >1:64 or if IgM titers were >1:32. When cross-reactions were noted between the rickettsial antigens, the analysis comprised 3 steps. First, a rickettsial antigen was considered to represent the agent of infection when IgG or IgM antibody titers against this antigen were >2 serial dilutions higher than titers of IgG or IgM antibody against other rickettsial antigens (11). Second, when the difference in titers between R. felis and other antigens was <2 dilutions, Western blot assays were performed. A rickettsial antigen was considered the agent of infection when sera reacted only against the specific protein of this antigen. Expected molecular masses of the specific proteins were ≈125 kDa for R. typhi and 31 kDa for R. felis. Finally, when Western blot assays were not diagnostic, crossadsorption studies were performed, as previously described (12). Specific diagnosis criteria after crossadsorptions studies included a Western blot assay that showed exclusive reactivity with specific proteins of a sole agent. If reactivity with the 2 tested agents was still observed, diagnosis of an indeterminate rickettsial disease was made. With this strategy, patients were classified by 3 types: R. felis infection, R. typhi infection, and indeterminate rickettsial disease. Five fleas from the dog of 1 R. felis–infected patient were tested by polymerase chain reaction (PCR) (3). DNA was extracted and amplified with primers that targeted the citrate synthase sequence, as previously described (3). For negative controls, we used sterile water and infection-free fleas previously tested in our laboratory; both negative controls were tested after every 7 samples. Amplicons were separated by electrophoresis on 1% agarose gels and then purified by using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany), as described by the manufacEmerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 11, No. 12, December 2005 1961 1These authors contributed equally to this article. *Hospital Universitario Insular de Las Palmas, Canary Islands, Spain; †Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Canary Islands, Spain; and ‡Université de la Mediterranée, Marseille, France turer. PCR products were sequenced by using the d-rhodamine terminator-cycle sequencing kit (PE Applied BioSystems, Courtabeuf, France), as described by the manufacturer. The sequences obtained were compared with those available in the GenBank DNA database by using the program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, version 2.0, National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A rickettsial infection was diagnosed by using MIF for 31 of the 44 patients: 5 patients with the final diagnosis of R. felis infection, 13 with the diagnosis of R. typhi infection, and 13 with the diagnosis of indeterminate rickettsioses (Table). The diagnosis of R. felis infection was based on Western blot results on adsorbed sera for all patients. All the antibodies of these patients were removed when the R. felis–adsorbed sera were analyzed with R. typhi and R. felis antigens, whereas antibodies to R. felis remained when the R. typhi–adsorbed sera were analyzed. Western blots performed with unadsorbed and adsorbed sera are represented in the Figure. Features of patients are indicated in the online appendix (http://www.cdc.gov/ ncidod/EID/vol11no12/05-0711_app.htm). Some differences were found between groups. The interval between the beginning of clinical signs and symptoms and evaluation was significantly more prolonged in the R. felis group than others. In the R. typhi group, odynophagia, cough, and rash were more frequent. When we compared biologic data, no difference was observed between R. typhi and DISPATCHES 1962 Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 11, No. 12, December 2005 R. felis groups, except for milder hypertransaminasemia in the latter group. Finally, 2 PCR products were obtained and sequenced from 2 fleas. Both sequences were 100% similar to R. felis citrate synthase gene in GenBank accession no. AF210692. No fleas were positive for R. typhi. Amplification was unsuccessful in all negative controls. Conclusions In the past 10 years, application of molecular tools has resulted in discovery of several new species of pathogenic rickettsiae, including R. felis. Since then, this bacterium was cultivated, and its genome was sequenced (1,13). Its pathogenic role was recently demonstrated in patients with serologic evidence of infection in Brazil, France, and Germany (1). R. felis DNA has also been detected in sera in Texas, Mexico, Brazil, and Germany (1,4,8,14). Autochthonous human rickettsioses that occur in the Canary Islands include murine typhus; SFG infections have never been reported (9). We diagnosed 5 cases of acute R. felis infection (15). The clinical picture is globally similar to murine typhus (4). However, the R. felis infection in our study seemed to be milder, and no skin rash was observed. The incidence of R. felis infection in the Canary Islands is probably underestimated; therefore, serologic tests for R. felis should be performed in patients with prolonged fever or suspected rickettsioses. Cross-reactions in serologic testing for R. felis are unpredictable (3). In our study, patients with R. felis infection more frequently had high antibody titers (IgM >1:32 and IgG >1:64) to R. conorii and R. typhi (2 of 5 patients) than did patients with R. typhi infection (0 of 13). On the basis of R. felis data, we conclude that patients with R. felis infection may have no cross-reactivity with other rickettsiae, cross-reactivity with SFG rickettsiae, or cross-reactivity with both SFG rickettsiae and R. typhi. Genetic support for cross-reactivity with R. conorii is plausible because most membrane proteins of SFG and R. felis are extremely close (surface cell antigen [Sca] family). Genome analysis showed that several genes were present in R. felis and R. typhi and absent for other SFG, which could explain the cross-reactivity between R. felis and R. typhi (13). Finally, if <2-fold differences in IgG/IgM titers between R. felis and other SFG and typhus group rickettsiae are observed, only Western blot and cross-adsorptions will allow a specific diagnosis once reactivity has disappeared after adsorption with R. felis antigen. By contrast, a band of ≈31 kDa for the R. felis antigen persists after adsorption with R. conorii and R. typhi. Acknowledgments We thank Kelly Johnston and Silpak Biswas for reviewing the manuscript. This research was supported in part by a grant from the Canary Foundation of Investigation and Health. Dr Pérez-Arellano is chief of the Infectious Diseases and Tropical Medicine Service and professor in the Department of Medical and Surgical Sciences, Health Sciences Faculty, University of Las Palmas de Gran Canaria. His main research interests are imported and emerging infectious diseases. References 1. Raoult D, La Scola B, Enea M, Fournier PE, Roux V, Fenollar F, et al. A flea-associated Rickettsia pathogenic for humans. Emerg Infect Dis. 2001;7:73–81. Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 11, No. 12, December 2005 1963 Figure. Results of Western blot performed with serum samples from patient 5 with Rickettsia felis infection and patient 10 with R. typhi infection. Molecular masses (in kilodaltons) are given to the left of panels. A) Patient with R. felis infection; a, untreated serum analyzed by using R. conorii (lane 1), R. typhi (lane 2), and R. felis (lane 3); b, R. felis–adsorbed serum analyzed by using R. conorii (lane 1), R. typhi (lane 2), R. felis (lane 3); all antibodies were removed; c, R. typhi–adsorbed serum analyzed by using R. typhi (lane 1) and R. felis (lane 2); antibodies to R. felis remained; d, R. conorii–adsorbed serum analyzed by using R. conorii (lane 1), R. typhi (lane 2), R. felis (lane 3); antibodies to R. felis remained. B) Patient with murine typhus; e, untreated serum analyzed by using R. typhi (lane 1) and R. felis (lane 2); f, R. felis–adsorbed serum analyzed by using R. typhi (lane 1) and R. felis (lane 2); antibodies to R. typhi remained; g, R. typhi–adsorbed serum analyzed by using R. typhi (lane 1) and R. felis (lane 2); all antibodies were removed. Human Rickettsia felis Infection, Canary Islands DISPATCHES 1964 Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 11, No. 12, December 2005 2. La Scola B, Meconi S, Fenollar F, Rolain JM, Roux V, Raoult D. Emended description of Rickettsia felis (Bouyer et al. 2001), a temperature-dependent cultured bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 2002;52:2035–41. 3. Rolain JM, Franc M, Davoust B, Raoult D. Molecular detection of Bartonella quintana, B. koehlerae, B. henselae, B. clarridgeiae, Rickettsia felis, and Wolbachia pipientis in cat fleas, France. Emerg Infect Dis. 2003;9:338–42. 4. Schriefer ME, Sacci JB Jr, Dumler JS, Bullen MG, Azad AF. Identification of a novel rickettsial infection in a patient diagnosed with murine typhus. J Clin Microbiol. 1994;32:949–54. 5. Parola P, Sanogo OY, Lerdthusnee K, Zeaiter Z, Chauvancy G, Gonzalez JP, et al. Identification of Rickettsia spp. and Bartonella spp. in from the Thai-Myanmar border. Ann N Y Acad Sci. 2003;990:173–81. 6. Kelly PJ, Meads N, Theobald A, Fournier PE, Raoult D. Rickettsia felis, Bartonella henselae, and B. clarridgeiae, New Zealand. Emerg Infect Dis. 2004;10:967–8. 7. Zavala-Velazquez J, Ruiz-Sosa J, Sanchez-Elias R, Becerra-Carmona G, Walker D. Rickettsia felis in Yucatan. Lancet. 2000;9235:1079–80. 8. Richter J, Fournier P, Petridou J, Häussinger D, Raoult D. Rickettsia felis infection acquired in Europe and documented by polymerase chain reaction. Emerg Infect Dis. 2002;8:207–8. 9. Hernandez CM, Angel-Moreno A, Santana E, Bolanos M, Frances A, Martin-Sanchez MS, et al. Murine typhus with renal involvement in Canary Islands, Spain. Emerg Infect Dis. 2004;10:740–3. 10. Teysseire N, Raoult D. Comparison of Western blot immunoblotting and microimmunofluorescence for diagnosis of Mediterranean spotted fever. J Clin Microbiol. 1992;30:455–60. 11. Raoult D, Fournier P, Fenollar F, Jensenius M, Prioe T, De Pina J, et al. Rickettsia africae, a tick-borne pathogen in travelers to SubSaharan Africa. N Engl J Med. 2001;344:1504–10. 12. La Scola B, Rydkina L, Ndihokubwayo JB, Raoult D. Serological differentiation of murine typhus and epidemic typhus using crossadsorption and western blotting. Clin Diag Lab Immunol. 2000;7:612–6. 13. Ogata H, Renesto P, Audic S, Robert C, Blanc G, Fournier PE, et al. The genome sequence of Rickettsia felis identifies the first putative conjugative plasmid in an obligate intracellular parasite. PLoS Biology. 2005;3:248. 14. Zavala-Velazquez JE, Zavala-Castro JE, Vado-Solis I, Ruiz-Sosa JA, Moron CG, Bouyer DH, et al. Identification of Ctenocephalides felis fleas as a host of Rickettsia felis, the agent of a spotted fever rickettsiosis in Yucatan, Mexico. Vector Borne Zoonotic Dis. 2002;2:69–75. 15. La Scola B, Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases. J Clin Microbiol. 1997;35:2715–27. Address for correspondence: D. Raoult, Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, Faculté de Médecine, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille CEDEX 05, France; fax: 33-4-91-38-7772; email: Didier[email protected] Search past issues All material published in Emerging Infectious Diseases is in the public domain and may be used and reprinted without special permission; proper citation, however, is required. OE# 1.2.# Anaplasma(phagocytophilum# no# es# un# agente# causal# de# la# fiebre# de# duración#intermedia#en#Gran#Canaria.# # Siguiendo) el) protocolo) de) estudio) de) las) fiebres) de) duración) intermedia,) en) aquellos) pacientes) en) los) que) no) se) llegó) a) demostrar) su) causa) y) se) disponía) de) muestras)de))suero)en)fase)aguda)y)de)convalescencia)(suero)a)las)2<3)semanas),)se) estudio) la) presencia) de) anticuerpos) de) tipo) IgG) e) IgM) frente) a) Anaplasma( phagocytophilum) mediante) una) técnica) de) inmunofluorescencia) Indirecta) (Focus) Diagnostics,)San)Diego,)California).)Los)pocillos))de)los)portaobjetos)tienen)fijados)la) línea) celular) HL60) infectada) con) la) cepa) HGE<1.) Para) la) realización) de) la) técnica) se) siguieron)las)instrucciones)del)fabricante)y)empezamos)a)una)dilución)de)1/20)y)en)los) casos)que)eran)positivos)se)seguían)titulando)a)diluciones)dobles)seriadas.)) Se)estudiaron))73)pacientes,)con)una)edad)media)de)36,4)años)y)el)64,4)%)eran) varones.) Aunque) se) detectaron) ) cuatro) pacientes) con) títulos) positivos,) ninguno) de) ellos)cumplió)los)criterios)de)infección)por)Anaplasma(phagocytophilum.)) Por) todo) ello) concluimos) que) Anaplasma( phagocytophilum) no) es) causa) significativa)de)fiebre)de)duración)intermedia)en)Gran)Canaria.) ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Imagen!de!la!IFI!frente!a!Anaplasma(phagocytophilum!! ! ! 10.1111/j.1469-0691.2008.02729.x Anaplasma phagocytophilum is not an aetiological agent of fever of intermediate duration in Gran Canaria (Spain) M. Bolan ˜os 1 , E. Santana 1,2 , C. Carranza 3,4 , P. Anda 5 , I. Jado 5 , M. Herna ´ndez-Cabrera 3,4 , A. M. Martı ´n-Sa ´nchez 1,2 and J. L. Pe ´rez-Arellano 3,4 1 Servicio de Microbiologı ´a, Hospital Universitario Insular, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 2 Departamento de Ciencias Clı ´nicas, Universidad de las Palmas de Gran Canaria, Spain, 3 Unidad de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical, Hospital Universitario Insular, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 4 Departamento de Ciencias Me ´dicas y Quiru ´rgicas, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Spain and 5 Laboratorio de Espiroquetas y Pato ´genos Especiales, Centro Nacional de Microbiologı ´a-ISCIII, Madrid, Spain INTRODUCTION Fever of intermediate duration (FID) is defined as non-localised fever occurring in the community, lasting from 1 to 4 weeks, and having no diagnostic orientation after basic clinical, analytical and radiological evaluations are completed. [1]. In Spain, the most frequent causes of FID (70%) are systemic infectious diseases (mainly rickettsioses, brucellosis, bartonellosis, anaplasmosis and agents of infectious mononucleosis), localised infections (i.e. intraabdominal abscesses or prostatitis), vasculitis and neoplasms, and other aetiological agents. In Gran Canaria (Spain), the most frequent causes of FDI are Coxiella burnetii [2], Rickettsia typhi [3] and Rickettsia felis [4]. However, many patients with FDI, without data suggestive of occult bacterial infections, vasculitis or neoplasms, have a clinical response to the use of doxycycline but no microbiological diagnosis. So, the aim of this work was to evaluate the aetiological role of Anaplasma phagocytophilum in patients with FDI in Gran Canaria. PATIENTS, MATERIAL AND METHODS All autochthonous adult outpatients with FID evaluated in the Infectious Diseases Unit from 1 October 2004 to 31 December 2006 were investigated for their aetiological diagnosis. Demographic, clinical and laboratory data were collected for all patients. Chest X-ray, three sets of blood cultures and urine culture were systematically performed. Antibodies against Coxiella burnetii (immunofluorescence (IFA); IgG and IgM (bioMe ´rieux, Marcy l’Etoile, France)), Rickettsia typhi (IFA; IgG and IgM (bioMe ´rieux)), Rickettsia conorii (IFA; IgG and IgM (bioMe ´rieux)), Leptospira spp. (MAT, bioRad, Marnes la Coquette, France), Epstein-Barr virus (EBV) (enzymeimmunoassay (EIA); IgG-VCA (Trinity Biotech, Bray Co. Wicklow, Ireland), IFA; IgM (Palex Medical, Meridian Bioscience, Cincinnati, OH, USA)), Cytomegalovirus (CMV) (EIA; IgG and IgM (Abbott Laboratories, Delkenheim, Germany)), Toxoplasma gondii (EIA; IgG and IgM (Abbott Laboratories), IgA (diaSorin, Milano, Italy)), human immunodeficiency virus (HIV)(EIA, Abbott Laboratories), with positive results confirmed by immunoblot test (INNOLIA, Innogenetics, Gent, Belgium), hepatitis A (EIA, Abbott Laboratories), hepatitis B (EIA; surface antigen—BsAg-antibodies for core - antiHBc- (Abbott Laboratories)) and hepatitis C (EIA, Abbott Laboratories) virus were tested for in all patients. Serological evaluation of Brucella spp. was not included because this infection is absent in Gran Canaria. A definite diagnosis of these diseases was the presence of a compatible clinical picture and conventional serological criteria. FDI patients with epidemiological characteristics suggestive of imported diseases, and ⁄or with only a serum sample, were excluded. Anaplasma phagocytophilum antibodies (IgG and IgM) were evaluated in patients without a definite diagnosis when two serum samples were available (acute and convalescent phase). A commercial Corresponding author and reprint requests: M. Bolan ˜os, Servicio de Microbiologı ´a, Hospital Universitario Insular, Las Palmas de Gran Canaria, Spain E-mail: [email protected] No conflicts of interest declared. 2009 The Authors Journal Compilation 2009 European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases adaptation of the organism to the intracellular environment was proposed [6], although this association was also challenged by other authors [7]. More recently, different attempts have been made to classify isolates of C. burnetii in different genomic groups (GG). Based on restriction fragment length polymorphism (RFLP) of the entire genome, Hendrix et al. [8] resolved 36 isolates of different origin in 6 GG; Jager et al. [9] performed pulsed field gel electrophoresis (PFGE) in 80 isolates that were classified into 4 GG; a Multispacer Sequence Typing method [10], based on the sequencing of 10 intergenic spacers classified 173 isolates, mainly from chronic disease, into 3 monophyletic groups and 30 GT; later, a reduced MST method was published by Mediannikov et al. [11], targeting 3 spacers in a single PCR, detecting 3 MST GTs; Svraka et al. [12] amplified different variable number tandem repeats (VNTR) in 7 PCR protocols, describing 5 clusters and validating previous GG ascriptions; Arricau-Bouvery [13] applied infrequent restriction site-PCR and multilocus variable number of tandem repeats analysis (MLVA) for the typing in a scheme of 17 PCR protocols leading to a classification into 6 clusters and 36 GT; later, Roest et al. [14], used the same method but reducing the 17 described targets to 10, to study an outbreak in the Netherlands and describing 13 MLVA types; Beare et al. [15] added two more GG, totalling up to 8, in a microarray-based whole genome comparison; Denison et al. [16] performed 20 PCRs for the characterization of the region within and near the transposase IS1111, describing 5 GG among 21 reference strains and 9 animal samples; Huijsmans et al. [17] developed a method for a singlenucleotide-polymorphisms (SNP)-based typing, applying 10 real time PCR protocols that resolved 28 reference strains and 40 samples from an outbreak into 9 SNP genotypes, while a previous study on the same 28 reference strains [13] had disclosed 14 MLVA types; finally, Hornstra et al. [18] performed 14 SNP-based real time PCR assays that classified 63 isolates into 6 GG and 35 MST genotypes. Recently, an outer membrane protein-coding gene named acute disease antigen A (adaA) was described as associated with acute Q fever-causing strains, whereas adaA negative strains were linked to chronic cases [19]. Therefore, the hypothesis of its association with a specific clinical presentation of the disease together with its immunodominant nature lead the authors to suggest that adaA may be a virulence factor for the pathogenesis of Q fever. Consequently, adaA may be a relevant genetic marker for differentiation among isolates. In general, there has been a good correlation between typing methods although with different discriminatory capabilities. However, although 2 previous descriptions have been applied directly to clinical samples [16,17], both rely on the amplification of several targets performing between 10 and 20 PCR protocols, which make it not always feasible for their use in a clinical setting due to the frequent scarcity of testable sample-size, which hampers the acquisition of global data; the method of Mediannikov et al. [11], consisting of a multiplex PCR targeting 3 intergenic spacers, exhibited however a limited discriminatory power (3 MST types) in the samples studied. In this study, based on the previous descriptions of Beare et al. [15] and Zhang et al. [19], a fast, reproducible and sensitive multiplex PCR that amplifies 8 targets in the same run for a rapid GT determination, has been developed to be applied to both isolates and PCR-positive samples. With this method, C. burnetii could be classified into 8 GG and up to 16 GT. Based on this methodology, a comprehensive study on the variability of C. burnetii in Spain have been made with samples from patients with acute and chronic Q fever, domestic and wild mammals and ticks, demonstrating a high variability of this organism and an association between genotypes and human disease. Methods Samples Fifteen C. burnetii reference isolates were used to validate the typing method (Additional file 1: Table S1). Also, human and animal samples (livestock, wild animals and ticks) sent to the National Reference Laboratory at the Instituto de Salud Carlos III and to the clinical and veterinarian collaborating laboratories for diagnosis of Q fever were included in the study, including defibrinated blood, plasma, biopsy material, ruminant placentas, mostly from abortions with the exception of 3 cattle placentas from normal parturitions (Additional file 1: Table S1), and other tissues from domestic and wild animals, and questing ticks, that were collected from different areas in Central Spain: 4 areas in Madrid (Cercedilla, Aranjuez, Perales and Valdeolmos) and 1 in Toledo (Oropesa). In all the areas the presence of livestock was documented (cattle in all areas and sheep and swine only in Oropesa). There were remarkable high densities of rabbits (Oryctolagus cuniculus) in all the areas except Cercedilla. The study protocol was approved by the Bioethics and Animal Welfare Committee of the Instituto de Salud Carlos III, Spain (ref. CBBA/4 2006), where the study was conducted, respecting individual privacy according to relevant data protection legislation and animal welfare. Also, human clinical samples used in the study were made available to us in an anonymized manner. Culture Standard shell-vial methodology was used as previously described [20] to grow C. burnetii in Vero E6 cells (European Collection of Cell Cultures; provided by Sigma-Aldrich Química S.A., Tres Cantos, Madrid, Spain). All the propagative methods and those related to Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 2 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 the manipulation of domestic ruminant placentas were performed under Biosafety level 3 (BSL3) conditions. Molecular detection of C. burnetii DNA was extracted from samples and isolates with the Qiagen Tissue kit (IZASA S.A. Barcelona, Spain). For arthropods, specimens were first crushed in 1.5 ml eppendorf tubes with the help of a pestle (Sigma-Aldrich Química S.A., Barcelona, Spain), as described [21], and extracted as before. DNA was quantified in a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies Inc. Wilmington, Delaware USA), and about 200 ng were used for each PCR. Previous to the genotyping, a screening assay (IS1111-based PCR coupled with hybridization with a specific probe by reverse line blotting -RLB) was used for the detection of C. burnetii [22-24]. C. burnetii genotyping An analysis based on a previous report [15] was performed to identify which genes/ORFs defined the ascription of each isolate to a specific GG, and seven of them were selected (CBU0007, CBU0071, CBU0168, CBU0598, CBU0881, CBU1805 and CBU2026), whose combination of presence/absence seems to determine the GG (Table 1). Also, the detection of adaA (CBU0952) [19] was included in the method. Primers and probes were designed for their molecular detection by PCR and subsequent RLB hybridization (Additional file 2: Table S2) by using Oligo6 software (Molecular Biology Insights, Inc. Cascade, CO, USA). Incompatibility among primers was avoided by in silico analysis of the formation of secondary structures, and oligonucleotides forming dimers with energy values lower than −6 kcal/mol and hairpins with Tm higher than 40C were discarded. The specificity of the oligonucleotides was first assessed by blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides). The reaction mix included 80 μg/tube of bovine serum albumin (Roche España, Madrid, Spain), 3.75 mM MgCl 2 (Applied Biosystems), 200 μM dNTPs (Applied Biosystems) and 4U of AmpliTaq Gold W DNA Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Cerdanyola del Vallès, Barcelona, Spain). Primer concentrations ranged from 0.6 to 1 μM(Additionalfile2: Table S2). The amplification cycles included an initial cycle of 94C for 9 min, followed by 40 cycles of 94C 30 s, 60C 1min,and72C1min,withafinalextensionat72Cfor 10 min. The amplifications were performed in an MJ Research PTC-200 (Bio-Rad Laboratories, S.A., Alcobendas, Madrid, Spain) in volumes of 50 μl. Hybridization by RLB was performed as described [25] using 48C for the hybridization and 40C for the conjugate and the washing steps. Concentration of probes ranged from 0.8 to 6.4 pmols/μl(Additionalfile2:Table S2). Two overlapping films (SuperRX, Fujifilm España S.A., Barcelona, Spain), were used in each assay to obtain a less and more exposed image for each membrane. The sensitivity of the technique was checked with serial 10-fold dilutions of a purified DNA stock of the isolate Nine Mile phase II (NMII) and the specificity was studied by subjecting to the method 10 4 genome equivalents of a selection of other bacterial species causing zoonoses or related illness (Orientia tsutsugamushi, Rickettsia conorii, R. typhi, Legionella pneumophila, Francisella tularensis subsp. holarctica, Bartonella henselae, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma pneumoniae). To assess the reproducibility of the methodology, DNA extracted from 2 different passages (n and n+10) of 5 reference isolates (NMI, CS-27, Priscilla, SQ217, F2) and a local isolate from cattle (273) (Additional file 1: Table S1) were analyzed. The results of the GT study were further analyzed by using InfoQuest ™ FP 4.50 (BioRad, Hercules, CA, USA). Clustering analyses used the binary coefficient (Jaccard) and UPGMA (Unweigthed Pair Group Method Using Arithmetic Averages) to infer the phylogenetic relationships. Results Samples included in the study A total of 90 autochthonous samples were included: 24 from human patients (11 from acute and 13 from chronic cases) and 66 from animals and ticks (15 from sheep, 7 from goats, 7 from cattle, 3 from rats, 1 from a wild boar and 33 from ticks); also, 15 reference strains were used to validate the method (Additional file 1: Table S1). Sensitivity, specificity and reproducibility of the method The detection limit of the method using purified NMII DNA was 10 genome equivalents. No reactivity was detected when testing 10 4 genome equivalents from 8 other bacterial species causing zoonoses or related illness (data not shown). To check for reproducibility, passages “n”(Figure 1, lanes 1–6) and “n+10”(Figure 1, lanes 7–12) from 5 reference isolates and a local isolate from cattle were checked without any loss of sensitivity during in vitro Table 1 Scheme of the presence/absence of the Coxiella burnetii ORFs selected for the determination of genomic groups Target GGI GGII GGIII GGIV GGV GGVI GGVII GGVIII CBU0007 ++ + −++ + + CBU 0071 ++ + + −++ − CBU 0168 ++ + −++ −+ CBU 0598 ++ −+++ + + CBU 0881 ++ + + + −− − CBU 1805 ++ + + −++ + CBU 2026 +−++++ + + Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 3 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 passages in any of the targets assayed. Also, it is to note that NMI (phase I) and NMII (phase II) isolates presented the same results in this characterization; consequently, only one of them (NMI) was used throughout the study. Genotyping of reference isolates and samples From the 15 reference isolates that were tested with the method described here for GG adscription (Table 1), and from which data from previous studies were available, all of them fell in the same GG as previously described, the topology of the tree being consistent with previous data. None of the reference isolates tested was found to belong to GG III, VI and VIII (Additional file 1: Table S1, Figure 2). Local human samples were found to belong to GG I, IV, VII and VIII, as follows: 13 samples from chronic cases (7 endocarditis, 3 vascular infections, 1 infected aneurism, 1 osteomyelitis and 1 chronic hepatitis) from 8 different regions were all infected with GG IV, except for one vascular infection (GG VIII); acute cases (10 samples of FID with liver involvement and 1 sample of pneumonia; 4 regions) showed GG I, IV, VII and VIII (Additional file 1: Table S1, Table 2, Figures 2 and 3). Among livestock samples, those from sheep (15 samples from 8 provinces) were found belonging to GG I, II, III, IV and VIII; goats (7 samples from 4 provinces) were infected with GG III, IV and VIII; cattle (7 samples from 4 provinces) were all infected by GG III; rats (3 samples from 1 province)andawildboarshowedGGIV;finally,33ticksof 3 species, from 4 areas of 2 adjacent regions, carried always GG VII, except for one that carried GG VI. In summary, samples from GG I, II, III, IV, VI, VII and VIII were identified (Additional file 1: Table S1; Table 2, Figures 2 and 3). adaA detection Samples from GG I, II and III were always adaA positive; all GG IV were adaA negative, except for a sheep placenta that was adaA positive; GG VII samples were adaA negative, except for a tick specimen; GG VIII samples were positive, except for a human sample of acute hepatitis; finally, theonlysampleavailablefromGGVI(oneH. lusitanicum tick) was adaA negative (Additional file 1: Table S1, Table 2, Figure 2). All the samples from cases of acute FID with liver involvement (10 samples from 3 distant regions; Figure 3) were adaA negative and the only sample available from a patient with pneumonia was adaA positive. Figure 1 Sensitivity and reproducibility of the method of characterization of Coxiella burnetii. Reproducibility. Lanes 1–6: Isolates NMI, CS-27, local cattle isolate 273, Priscilla, SQ217 and F2, passage “n”; lanes 7–12: same isolates, passage “n+10”. Results using clinical, veterinary and arthropod samples. Lane 13: specimen of R. sanguineus (M28CE4GA7C); lanes 14–16: specimens of H. lusitanicum (M28P1GA8A, M28PE14GV5C and M28PE14GV5F); lane 17: specimen of D. marginatus (M28P2GA45C); lane 18: human serum (2172); lane 19: sheep placenta (70924); lane 20: goat lung (67025); lane 21: cattle endocervical exudate (70814); lane 22: human clot (BZO18); lane 23: human plasma (0904); lane 24: rat liver (78); lane 25: negative control. Sensitivity. Lanes 26–28: 10 3 ,10 2 and 10 genome equivalents of isolate NMII. Left panel: position of the probes for each ORF. Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 4 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 Figure 2 Dendogram construct from hibridization data of 58 local samples and reference strains. Biological and geographical origin of the samples is shown. Black boxes indicate presence of the selected ORFs; reference isolates used to validate the method are framed. Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 5 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 In summary, from the theoretically possible 16 GT (8 GG positive or negative for adaA), 10 were identified in the samples studied (Table 2). Discussion A multiplex PCR coupled with hybridization by RLB for the characterization of C. burnetii was designed, allowing for its classification into the previously known 8 GG [15] and into up to 16 genotypes, depending on adaA presence/absence. For validation, 15 reference strains characterized in previous studies were used (Additional file 1: Table S1). All of them fell in the same GGs as previously described, when data was available, or grouped in the same clade as described [810,12,13]. Consequently, an excellent correlation with some previously published schemes and, specifically, with the microarray-based whole genome typing of Beare et al. [15] was observed: the 4 isolates studied by Beare et al. that were also analyzed in this study (NMI, GG I; Henzerling, GG II; Priscilla, GG IV; and Scurry Q217, GG V) were classified with this method into the same GG as described. Also, the analysis of the results by InfoQuest disclosed a tree whose topology was similar to that of Beare et al. [15], with the Figure 3 Map of Spain showing sampling sites, type of samples and results. Table 2 Summary of the results of the characterization GT Human samples Livestock Acute hepatitis Acute pneumonia Chronic Sheep Goat Cattle Wild animals Ticks Total I+* 1 1 2 II+ 1 1 III+ 5 3 7 15 IV+ 1 1 IV6 12 5 1 4 28 VI11 VII+ 11 VII3 31 34 VIII+ 1 2 3 6 VIII1 1 Total 10 1 13 15 7 7 4 33 90 *: plus and minus signs refer to adaA presence/absence, respectively. Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 6 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 only exception of GG VIII, which in this study grouped together with GGs I, II and III, instead of with GGs IV, V, VI and VII as in the Beare study. With this methodology, a preliminary characterization of C. burnetii variants circulating in Spain has been performed showing a high variability of this organism in clinical and environmental settings, identifying 7 GG, with the exception of GG V, and 10 different GTs. In Spain, while a respiratory disease is observed in about 80% of cases reported from the Northern region of the Basque Country [26,27], the Southern regions of Andalusia and the Canary Islands report a clear predominance (about 90% of cases) of FID with liver involvement [28-34]. This last has also been described in Australia, France, Greece, or Taiwan [35-38], among others. Even taking into account the limited size of this study and the constraint of an extrapolation, a strain-associated factor that might explain the different clinical presentations of acute Q fever is hypothesized for our country. The pattern observed in cases of acute Q fever indicates an association between absence of adaA and FID with liver involvement, produced in this study by adaA negative strains in both regions (the Southern regions of Andalusia and the Canary Islands), although is not statistically significant in this study (p=0.09) due to low number of samples. Also, another sample of a case of hepatitis from the north (Basque Country) yielded an adaA negative result as well. The same applies for the 2 reference isolates from hepatitis cases analyzed in this study: F2, a French isolate and SQ217, recovered in the USA from a case of chronic hepatitis, are both adaA negative as well. In contrast, pneumonia predominates over liver involvement in Northern Spain, being the only case of this clinical form available for the study produced by an adaA positive strain. No other marker used in this study correlated with the clinical presentation of acute Q fever. Availability of samples from cases of acute Q fever for genotyping is much less frequent than from cases of chronic Q fever, even though acute Q fever is much more prevalent. In this study, 11 samples from acute cases were analyzed, although only one was from a case with respiratory symptoms, reflecting the limited availability of such samples, which may be due to a poor clinical awareness. From the 10 GTs found in the country, only 5 have been detected in humans and, among them, GT IVis the most frequently found in acute and chronic cases (75% of cases). This GT has also been found in many mammal species (sheep, goat, wild boar and rats). Whether this could be interpreted as a higher tendency of this GT to cause illness in humans can not be inferred by this study, mainly considering that most of the acute cases (8/11) came from the same area (Gran Canaria Island). In any case, GT IVis highly prevalent also in our chronic cases that came from 8 distant areas of the country, showing a more intensive circulation of this GT in humans. The association previously proposed between adaAnegative strains and chronic disease [19] has been reproduced here for all chronic cases studied (13 cases), except for a sample from a vascular infection that was adaA positive. Beare et al. [15] hypothesized that the association between GG IV and chronic cases (as in 12 out of 13 chronic cases studied here) could be related to the slow growth of isolates from this genotype and, therefore, the induction of a decrease in the immune response. On the other hand, Zhang et al. hypothesized that adaA positive strains were related to acute cases [19], as it is the case of the only sample from a patient with acute pneumonia available. However, in our study, acute cases of FID with liver involvement were all produced by adaA negative strains. GTs found in humans were also found in sheep, goats, rats, wild boar and ticks. This distribution of GTs suggests that sheep and goats are responsible for the transmission of C. burnetii to humans in Spain, as in other areas [39], and exhibit a high variability of GT. However, although in general domestic ruminants are important reservoirs for C. burnetii and play a relevant role in its transmission to humans, 4 of 24 human samples were found carrying GTs not found in ruminants in this work. A recent Spanish study [40] has also detected C. burnetii in roe deer, wild boar, carrion birds and hares. Although there is no data available on the genotyping of these specimens, more studies are needed to characterize the enzootic cycle of C. burnetii and its GT distribution in wildlife, as well as to ascertain whether other sources could be responsible for the transmission of C. burnetii to humans. GG VII was only found in ticks (H. lusitanicum, Dermacentor marginatus and Rhipicephalus sanguineus) and in 3 cases out of 10 of FID with liver involvement. It is to note that, while reference isolates from ticks belonged mostly to GG II, this GG has not been found in ticks in our study. Although the analyzed tick specimens came from 5 different areas, they were all from Central Spain, which could be biasing this data. Transmission of Q fever by tick bite still remains controversial [41,42], and cases of simultaneous or consecutive infections with C. burnetii and other tick-borne agents have been described [43]. Whether C. burnetii can be transmitted by tick bite or not, the detection in ticks of GT VII-, found only in human patients revives this debate. More studies are needed to definitely clarify this question. On the other hand, given that GG VII isolates have not been found in cattle, sheep and goats in this study, we could think of other unknown reservoirs that could be involved as a source of infection of this GG for both ticks and humans. Traditional mammal species on which the tick species analyzed in this study feed on include rabbits (frequent all over Spain) for the immature stages of H. lusitanicum, which seems to be very important for the maintenance of populations of this tick species, small mammals Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 7 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 for those of D. marginatus, and canids for all stages of R. sanguineus.AdultH. lusitanicum and D. marginatus normally feed on large ungulates. Animals present in the tick study areas included, apart from cattle, high densities of rabbits and other wildlife. It is to note that 40 liver samples from rabbits hunted in Gran Canaria analyzed by PCR were all negative (data not shown), although more studies are needed. Whether some of the above mentioned animals may act as reservoirs for GG VII C. burnetii remains to be studied. Interestingly, in 7 cattle samples from 4 distant regions, only GG III was detected. In the study of Arricau-Bouvery [13] most of the cattle isolates (12/14) analyzed by MLVA also grouped together in a clade that is close but different to the one that include GG I isolates, as in this study. In Beare’s study GG III is also philogenetically close to GG I and both clades appear together in the tree. This GG having never been found in humans in Spain so far lead us to hypothesize that cattle could represent a low risk for Q fever transmission to humans in our country. One of the added values of the method described here is that it could be applied to any PCR-positive sample carrying at least 10 genome equivalents of the target organism, thus avoiding the need for culturing the organism to obtain data on the global circulation of C. burnetii. The frequent lack of human isolates from outbreaks, which are needed to apply the yet described methods, hamper a correct outbreak study that are necessary to identify the source of infection. This methodology allows the characterization directly from clinical samples avoiding the culture step of this fastidious bacterium, and proves to be valuable identifying so far 10 different GTs circulating in Spain. This method can be performed in any laboratory with basic equipment. It can easily determine relationships among C. burnetii from different origins by using PCR-positive samples, thus helping in the identification of the source of an outbreak in a rapid analysis. Conclusions The method described here is rapid, reproducible and sensitive. It can be applied directly to clinical and environmental samples, and is able to identify up to 16 GT. This will facilitate the acquisition of global data on the circulation of GT of this organism. We have found a high variability of C. burnetii in Spain, with 10 GTs found in different settings, 5 of them in human samples. Interestingly, all the samples from acute cases of FID with liver involvement were produced by adaA negative microorganisms, while the only case of pneumonia availableforthestudywascausedbyaadaA positive strain. Moreover, the majority (12 cases) of the 13 chronic cases studied were produced by organisms of GG IV-, except for a case of vascular infection (GG VIII +). Regarding livestock, human cases share GTs with sheep and goats, but the only GT found in cattle has never been found in humans. The most frequent GT found in ticks (GT VII-; 31 out of 33 specimens studied) was also found in human samples of cases of FID with liver involvement. Although the hypothesis of transmission of Q fever by tick bite still remains controversial, to further study this point is of interest. Additional files Additional file 1: Table S1. Samples and reference isolates used in the study. Additional file 2: Table S2. Oligonucleotides used in the study. Acknowledgements We thank Dr. Marco Quevedo, from the Institute of Virology, Bratislava, Slovakia, and Dra. Fatima Bacelar from the Centro de Estudos de Vectores y Doenças Infecciosas, Aguas de Moura, Portugal, for their help in setting up the culture method for C. burnetii, and Aleida Villa, from EXOPOL, Zaragoza, Spain, for providing local strains from livestock. We are grateful to COST action B28 C05.0103 “Array technologies for BSL3 and BSL4 pathogens”for providing a platform of cooperation and for the exchanging of bacterial strains with other European laboratories, specifically with the Bundeswehr Institute of Microbiology, Munich, Germany (Dr. Dimitrios Frangoulidis) and the Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia (Dr. Rudolf Toman). Grant support for this work was from FIS PI10/00165, FUNCIS 26/03 from the Gobierno de Canarias “Diagnóstico directo de rickettsiosis prevalentes en nuestro medio (fiebre Q y tifus murino)”, from the “Departamento de Agricultura y Pesca, Gobierno Vasco”“Ensayo de control de la fiebre Q en la cabaña ovina lechera de la CAPV”, INIA FAU2006-00002-C04-01 to -04 “Ecología y control de la fiebre Q: Epidemiología molecular de Coxiella burnetii”, and AGL2010-21273-C03-01-GAN from CICYT “Interacciones-inmuno endocrinas materno-fetal y con Coxiella burnetii en vacas lecheras de alta producción”. Author details 1 Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales, Department of Bacteriology, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Ctra. de Pozuelo km 2.6, Majadahonda, Madrid 28220, Spain. 2 Microbiology Service and Infectious and Tropical Diseases Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Av Marítima del Sur, s/n, 35016 Las Palmas, Spain. 3 Department of Production and Animal Health, NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Berreaga Kalea, 1, Derio, Bizkaia 48160, Spain. 4 Department of Animal Health, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Avda. Puerta de Hierro, s/n, Madrid 28040, Spain. 5 Department of Animal Production, Universidad de Lleida, Pl. de Víctor Siurana, 1, Lleida 25003, Spain. 6 Internal Medicine Service, Hospital Comarcal de Laredo, Avda. de los Derechos Humanos, s/n, Laredo, Cantabria 39770, Spain. 7 Hospital Universitario Donostia and CIBERES, P° Doctor José Beguiristain s/n, Donostia-San Sebastián, Guipúzcoa 20014, Spain. 8 Department of Animal Medicine and Surgery, Facultad de Veterinaria, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus Universitario de Arucas s/n, Arucas, Las Palmas 35413, Spain. 9 Present address: Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Infectious Diseases, Stony Brook University, Stony Brook, NY 11794-5120, USA. Authors’contributions IJ, HG, RE and PA participated in the design of the study. CCR, MB, JLPA and NFR studied clinical and environmental samples from Canary Islands suspected of C. burnetii infection and provided the positives to the Centro Nacional de Microbiología-Instituto de Salud Carlos III (CNM-ISCIII) for molecular analysis. JFB, IA and ALGP studied livestock and tick samples from the Basque Country and provided the positives to the CNM-ISCIII for characterization. AT and ASO studied environmental samples from Madrid Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 8 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 and provided the positives to the CNM-ISCIII for characterization. BS and FLG studied livestock samples from Catalonia and provided the positives to the CNM-ISCIII for molecular analysis. FPV and GC studied samples from Q fever patients and provided the positives to the CNM-ISCIII for molecular analysis. IJ, CGA and MRV participated in the culture and manipulation of the isolates in the BSL3 laboratory. IJ and PA designed the method of characterization. IJ, RE, CGA, BL and MRV evaluated and carried out the genotyping method. HG and PA performed the phylogenetic analysis. IJ, HG, RE and PA participated in the interpretation of data and drafted the manuscript. All authors have critically read and approved the final version of the manuscript and also concur with further revisions of it. Received: 31 October 2011 Accepted: 1 June 2012 Published: 1 June 2012 References 1. Raoult D, Marrie TJ, Mege JL: Natural history and pathophysiology of Q fever. Lancet Infect Dis 2005, 5:219–226. 2. Rotz LD, Khan AS, Lillibridge SR, Ostroff SM, Hughes JM: Public health assessment of potential biological terrorism agent. Emerg Infect Dis 2002, 8:225–230. 3. Minnick MF, Heinzen RA, Reschke DK, Frazier ME, Mallavia LP: A plasmidencoded surface protein found in chronic-disease isolates of Coxiella burnetti.Infect Immun 1991, 59:4735–4739. 4. 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Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: • Convenient online submission • Thorough peer review • No space constraints or color figure charges • Immediate publication on acceptance • Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar • Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit Jado et al. BMC Microbiology 2012, 12:91 Page 10 of 10 http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/91 OE# 3.1.# Seroprevalencia# # de# la# infección# por# Coxiella( burnetii# en# las# Islas# Canarias. # Los$objetivos$de$este$estudio$fueron:$ •$ Conocer$ la$ seroprevalencia$ de$ la$ infección$ por$ Coxiella( burnetii$ en$ las$ Islas$ Canarias.$ •$$Evaluar$las$características$epidemiológicas$asociadas.$ •$$Comparar$la$influencia$de$los$distintos$puntos$de$corte$en$el$diagnóstico$de$ infección$pasada.$ Para$ ello,$ se$ analizó$ una$ muestra$ representativa$ de$ la$ población$ canaria,$ compuesta$por$662$individuos.$Para$la$detección$de$anticuerpos$de$clase$IgG$frente$a$ Coxiella( burnetii$ fase$ II$ se$ empleó$ una$ inmunofluorescencia$ indirecta,$ comenzado$ a$ una$dilución$1/20.$En$los$casos$en$los$que$la$IgG$fue$≥1/80$se$realizó$la$IgM$frente$a$ Coxiella(burnetii$en$fase$II.$ La$seroprevalencia$global$observada$fue$del$21,5%,$oscilando$entre$el$13,2%$en$ la$ isla$ de$ Fuerteventura$ al$ 32,5$ %$ en$ la$ isla$ de$ Lanzarote.$ La$ seroprevalencia$ en$ Tenerife$fue$del$17,7%$y$en$Gran$Canaria$fue$del$23,5%.$$$ En$todos$los$grupos$de$edad$se$detectaron$individuos$con$anticuerpos$frente$a$ Coxiella( burnetii,$ siendo$ del$ 13$ %$ en$ menores$ de$ 16$ años$ ($ la$ muestra$ recoge$ a$ individuos$ mayores$ de$ 6$ años).$ $ Asimismo$ se$ detectaron$ anticuerpos$ tanto$ en$ los$ individuos$del$medio$rural,$semiurbano$y$urbano.$$ En$ este$ estudio$ se$ hizo$ una$ comparación$ de$ las$ variables$ epidemiológicas$ utilizando$distintos$puntos$de$corte$(1/20$y$1/80).$Y$salvo$en$los$individuos$dedicados$a$ la$agricultura$y$ganadería,$en$los$que$la$prevalencia$fue$mayor$del$40%,$en$todos$los$ demás$ parámetros$ estudiados$ había$ diferencias$ estadísticamente$ significativas$ al$ comparar$los$distintos$puntos$de$corte.$$ Concluimos$que$la$infección$por$Coxiella(burnetii$es$endémica$en$todas$las$Islas$ Canarias,$que$afecta$a$individuos$de$todas$las$edades$aunque$con$más$frecuencia$a$los$ varones$mayores$de$30$años$y$que$se$debería$sospechar$esta$infección$en$todos$los$ individuos$con$un$cuadro$febril$sin$localización.$ !