Biodiversidad química del litoral canario

Programa de doctorado de Oceanografía Bienio 2003-2005 Título de la tesis: Biodiversidad química del litoral canario Tesis Doctoral presentada por D. Pere Ferriol Buñola para optar al grado de Doctor por la Universidad de las Palmas de Gran Canaria. Dirigida por: Dr. D. Francisco Javier Toledo Marante El Director El Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, a 26 de octubre de 2015 ! ! ! ! ! DE RERUM NATURA Quan un científic mira una pedra no veu tan sols un objecte contundent, hi veu tot un entramat de molècules, l’estructura tridimensional dels silicats, l’acumulació ofegada de foraminífers. Quan mira un arbre coneix el perquè els seus colors, la distribució espacial dels àtoms de la clorofil·la, les cadenes de carbonis asimètrics que li han donat vida. Quan era un infant es demanava el perquè de la duresa de les roques, el canvi del vi en vinagre, per què la sobrassada torna blanca, no sospitava la bellesa dels símbols, el bell alenar del coneixement iquelamiradaseriaunactedecreació. De la natura de les coses cal extreure el plaer de viure. (Àngel Terrón, Iniciació a la Química) Als meus padrins, per ensenyar-me a sembrar i a recollir. Agradecimientos Quiero aprovechar estas líneas para expresar mi agradecimiento a aquellas personas e instituciones que de uno u otro modo me han apoyado en la realización de este trabajo. Deseo expresar mi profundo sentimiento de gratitud y sincero reconocimiento al profesor Dr. Francisco Javier Toledo Marante por todas sus enseñanzas en química orgánica y la interpretación de los espectros, y sobre todo por su valioso apoyo, supervisión, orientación, comentarios y revisiones que han hecho posible esta Tesis. Especialmente, quiero agradecer al Dr. Ignacio Brouard Martin, investigador científico del Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPNA, Tenerife) por su apoyo en el trabajo espectroscópico durante la realización de la presente Tesis. Al Dr. Francisco Estévez Rosas, catedrático de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, por su colaboración en la realización de los ensayos de actividad farmacológica. AlosprofesoresypersonalintegrantedelDepartamentodeQuímicadela Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y del Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPNA, Tenerife) por su colaboración desinteresada. A la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, al Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPNA, Tenerife) y a la Universitat de les Illes Balears, por ofrecerme los medios técnicos y materiales necesarios. AlaComunidadEconómicaEuropea-FEDER-,alGobiernodeEspaña,al Gobierno de Canarias, a la propia Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y a la Asociación Española Contra el Cáncer por la financiación de los sucesivos proyectos que han hecho posible esta Tesis. ANona,BielyToni,estoyprofundamenteendeudaportodoloquehe aprendido trabajando junto a ellos. Y al resto de compañeras y compañeros que están o han pasado por el área de ecología de la UIB, porque es un placer trabajar con buena gente. AMar,porhabertenidoelprivilegiodetrabajarconella,jugandoaser científicos con más de 5000 metros de agua bajo nuestros pies, y porque si es un honor ser amigo de una excelente oceanógrafa, todavía lo es más serlo de una excelente persona. Atodosaquellosamigosycompañerosconquieneshetenidolasuertede compartir buenos momentos, en Mallorca y en Las Palmas, en tierra y en la mar, en los laboratorios y en los bares, gracias por escuchar mis monólogos sobre las vicisitudes de las esponjas y otros bichos, y por animarme a continuar trabajando en lo que me apasiona. Muy especialmente, a mi querida Xisca, sin su amor no habría podido acabar esta Tesis. No hay palabras para agradecer su paciencia y su apoyo, por animarme en mis peores momentos, por ayudarme a encontrar aquella palabra que me bloqueaba, iluminándome con su sonrisa cuando lo veía todo negro y tranquilizándome con sus cálidos abrazos. Gracias por estar cada día a mi lado. Ygraciastambiénamigranfamiliapolítica,estandoconellosmesientocomo en casa, gracias por darme ánimos, cariño y buena comida. Finalmente, tengo que expresar mi inmensa gratitud hacia mi familia. A mi hermana, Maria, por su paciencia y generosidad y porque su fortaleza siempre será un referente en mi vida. A mis ahijados, Jaume y Caterina, porque una sonrisa suya vale más que todo el oro del mundo. A mis padres, Nofre y Catalina, por todo el esfuerzo que han hecho y toda la confianza que han depositado en mí y porque, sin llegar a entender del todo lo que estaba estudiando, me han apoyado incondicionalmente. Y sobre todo, porque los valores que ellos me han enseñado no se aprenden en ninguna Universidad. Índice general Introducción general 15 Objetivos 17 1. Productos naturales en Verongia aerophoba 19 1.1. Introducción.............................. 19 1.2. Aplisteroles .............................. 21 1.3. Ácidosgrasos............................. 26 1.4. Ácidoveróngico............................ 28 1.5. Dienona................................ 30 1.6. Aeroplysinina-1............................ 32 1.7. Verongiolido.............................. 34 1.8. 11-epi-fistularina-3.......................... 38 1.9. Fistularina-1 ............................. 49 1.10.Verongiamina............................. 54 2. Cultivo de Verongia aerophoba 61 2.1. Introducción.............................. 61 2.2. Cultivo integrado de Verongia aerophoba .............. 63 2.2.1. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 2.2.2. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 2.3. Cultivo in situ de Verongia aerophoba ............... 69 2.3.1. Material y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 2.3.2. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 3. Identificación de Myxilla sp. 83 3.1. Introducción.............................. 83 3.2. Materialymétodos.......................... 84 3.2.1. Esponjas ........................... 84 3.2.2. Preparación de las espículas . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.2.3. Observación por microscopía . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.3. Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4. Productos naturales en Myxilla sp. 93 4.1. Introducción.............................. 93 4.2. Esteroides............................... 93 4.3. Ceramidas............................... 97 4.4. Ceramidas-1-fosfato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 4.4.1. Determinación por infusión directa (HPLC-MS). . . . . . 99 amarrónpúrpuracuandoseconservaenalcoholyhastanegroalsecarse.Esto es debido a que contiene un pigmento amarillo, uranidina, que es muy inestable yseoxidarápidamentecuandoseexponealaire,dandolugaraunpolímero negro [Cimino et al., 1984]. Por esta razón recibe el nombre de aerophoba que significa “miedo al aire". Figura 1.1: Esponja marina Verongia aerophoba. Esta especie fue descrita originalmente por Nardo [1833] como Aplysia aerophoba (nótese la ortografía incorrecta del original, ya que el género Aplysia corresponde a un género de moluscos opistobranquios) y más tarde, tanto Schmidt [1866] como Bowerbank [1845] consideraron como sinónimos los géneros Aplysina yVerongia,aunquenormalmenteseusabaelgéneroAplysina (por ejemplo, Schulze [1878] redescribió la familia Aplysinidae, utilizando el nombre Aplysina aerophoba). Esto fue así hasta que De Laubenfels en 1930 empezó ausarpreferentementeVerongia yVacelet[1959]ladescribiócomoVerongia aerophoba (Schmidt) [Wiedenmayer, 2013]. Una revisión más reciente esta especie ha considerado transferirla al género Aplysina (Nardo, 1834) como nombre aceptado [Bergquist and de Cook, 2002]. Sin embargo, en esta tesis se opta por mantener el nombre citado por el tiempo transcurrido y las numerosas citas y descripciones posteriores [Cruz, 2002]. En el reino animal, las esponjas contienen la mayor variedad de esteroles. Desde los trabajos de Bergman en esteroles de invertebrados marinos a finales de la década 1940 [Bergmann et al., 1945; Bergmann, 1949], se han aislado mucho nuevos tipos de esteroles en esponjas marinas. Si llamamos esteroles “convencionales” a aquellos que que tienen un núcleo tetracíclico C19 yunacadenalateral normal C8(incluso si está modificada por la adición de uno o dos átomos de carbono en C-24), entonces podemos llamar “no convencionales” a aquellos esteroles que tengan el núcleo de colesterol y cadenas laterales con patrones de alquilación diferentes [Minale et al., 1976]. De estos esteroles “no convencionales”, 20 los primeros ejemplos de alquilación en C-26 se aislaron de Verongia aerophoba [De Luca et al., 1972]. En un trabajo posterior con 25 especies de esponjas diferentes, De Rosa et al. [1973a] encontraron que estos esteroles con un grupo metilo extra en C-26 sólo aparecían en las esponjas de la familia Verongiidae, lo cual significó una prueba quimiotaxonómica más para separar las familias Verongiidae y Spongiidae que entonces estaban clasificadas como pertenecientes al mismo orden, a pesar de que se habían encontrado grandes diferencias en el perfil de aminoácidos de ambas familias [Bergquist and Hartman, 1969; Minale and Sodano, 1977]. Para investigar el origen biogenético de estos esteroles se realizaron experimentos de incorporación de sustratos marcados con 14C, sin embargo no se observaron 26-metilesteroles radiactivos y por tanto se comprobó que estas esponjas son incapaces de biosintetizar estos esteroides. Esto hizo suponer que la esponja convierte esteroles exógenos tomados en la dieta mediante alguna ruta que, partiendo de algún precursor C29 como el fucosterol, incluya una transmetilación interna [De Rosa et al., 1973b]. La composición lipídica de la esponja Verongia aerophoba de las Islas Canarias fue estudiada mediante GC-MS y con esta técnica identificaron ácidos grasos, esteroles y compuestos volátiles [Nechev et al., 2002]. Sin embargo, en nuestro estudio se ha querido profundizar en el conocimiento de los esteroles de V. aerophoba de las Islas Canarias mediante su estudio por espectrometría de 1H-RMN y 13C-RMN (tanto en una como en dos dimensiones), así como por espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Como se ha dicho antes, un carácter quimiotaxonómico distintivo del orden Verongiida es que todas las especies de este orden poseen metabolitos secundarios derivados de la bromotirosina. La primera vez que se aislaron este tipo de compuestos se remonta a 1913, cuando Morner aisló dibromotirosina a partir de la hidrólisis de una proteína de dos especies de coral [Mörner, 1913]. No se describieron más compuestos derivados de la bromotirosina hasta que Sharma yBurkholder,en1967,aislarondoscompuestosconpropiedadesantibacterianas aislados de las esponjas Verongia fistularis yV. cauliformis [Sharma and Burkholder, 1967]. Desde entonces y motivados por sus interesantes actividades biológicas, se han publicado muchos más productos naturales marinos derivados de la bromotirosina. Hasta la fecha, se han descrito alrededor de 300 alcaloides derivados de la bromotirosina aislados de invertebrados marinos que muestran una amplia gama de actividades biológicas, en las que se incluyen: antimicrobiana, anticáncer, antiincrustante (antifouling), antiviral, reguladora de ATPasa, moduladora del canal de calcio, etc... Por todo ello, con el trabajo que se describe en el presente capítulo, se ha pretendido profundizar en el conocimiento de los productos naturales de Verongia aerophoba de las Islas Canarias, aportando nuevos datos espectroscópicos. 1.2. Aplisteroles Aislamiento, purificación e identificación de los esteroides. Las fracciones que contuvieron los compuestos mayoritarios se eluyeron con una mezcla de Hexano/AcOEt 80:20, se recromatografiaron repetidamente hasta conseguir la purificación e identificación de los esteroides aplisterol (1,63.96%), 24(28)-didehidroaplisterol (2,17.39%)y23(24)-didehidroaplisterol(3,19.57%), 21 así como sus derivados acetilados (4,5y6)(Figura1.2).Esteúltimohasido aislado aquí por primera vez como producto natural. Tanto la mezcla de aplisteroles como la de sus acetatos tienen el aspecto de un sólido blanco homogéneo por CCF. Tras cristalización a partir de MeOH se determinaron sus puntos de fusión, resultando 135-136Cparalamezcladeaplisterolesy119-120 Cparala mezcla de sus acetatos. El espectro de masas de alta resolución muestra la señal del pico del ión molecular en m/z 414.383263 que corresponde a la fórmula molecular C29H50O, así como el pico base en m/z 396.372177 (C29H48)queresultadelapérdidade una molécula de agua – delata un grupo hidroxilo –. La fórmula molecular indica que nuestro producto tiene dos carbonos más que el colesterol (éste es C27). Un estudio detallado del espectro de masas indica que los dos carbonos adicionales se encuentran en la cadena lateral, que estaría formada por diez carbonos. Así por ejemplo, picos a m/z 273.2133 (pérdida de la cadena lateral de diez carbonos) y255.2041(pérdidadelacadenalateraldediezcarbonosyagua)nosllevana proponer un núcleo tetracíclico idéntico al del colesterol. La presencia productos secundarios con una insaturación en la cadena lateral queda evidenciado por la observación del ión molecular de los mismos a m/z 412.364784 (C29H48O) y la pérdida de agua a m/z 394.353569 (C29H46). Un importante pico a m/z 314.2478, característico [De Luca et al., 1972] de insaturación en C-24 se asigna al reagrupamiento de McLafferty (ruptura del enlace C22-C23 con transferencia de hidrógeno desde C-20, Figura 1.3). Según el espectro IR, este producto presenta el mencionado grupo alcohólico ya que se observa una banda de absorción a 3608 cm−1(tensión de O–H libre). Las bandas de absorción a 3027 y 3006 cm−1son debidas a la tensión del – –C–H, delatando al menos un doble enlace, la banda ancha con varios picos entre 2961 y 2870 cm−1corresponde a la tensión de los enlaces C–H de los metilos, metilenos ymetinos.Losdospicosagudosqueaparecenen1464y1379cm −1pertenecen aladenominada"huelladactilar"dentrodelacualseobservaunaintensabanda de absorción a 1209 cm−1correspondiente a la vibración de tensión del enlace C-O del grupo alcohólico. El espectro de 1H-RMN (Figura 1.4) desplaza una señal a 5.35 (1H, dobles dobletes superpuestos) que es característica de un doble enlace entre los carbonos C5 y C6 de los tres esteroles con el mismo esqueleto del aplisterol. Una señal a 5.16 en forma de un triplete con J=5.45Hz delata la presencia minoritaria del regioisómero 23(24)-didehidroaplisterol (3). Un singlete ancho a =4.70y un multiplete a 4.68, ambas en relación 1:1 delatan el metileno olefínico del carbono 28 del 24(28)-didehidroaplisterol (2). La señal del H geminal al grupo alcohol (3.51; 1H; m) delata a un hidroxilo 3típico de los esteroles. También se observaron los singletes de los hidrógenos sobre los carbonos angulares C18 y C19 (0.68 y 1.00 respectivamente), que se corresponden con los encontrados en la bibliografía para el esqueleto del aplisterol. Las conectividades 1H–1Hobservadasenexperimentosbidimensionalesde correlación (COSY, TOCSY y NOESY) son también consistentes con las estructuras asignadas. Así, la señal a 2.24 (2H, m) está correlacionada con el protón olefínico a 5.35 (1H, m) y, por tanto, corresponde al segundo anillo del esqueleto carbonado (hidrógenos alílicos en C-7). También se observaron correlaciones entre las señales a 2.28 (m), 1.84 (m) y 1.51 (m) con la señal a 3.51, del mencionado hidrógeno geminal al grupo hidroxilo en C3, con lo cual estas señales deben pertenecer a hidrógenos del primer anillo, más concretamente, los 22 hidrógenos sobre C2 y C4. El espectro de 13C-RMN muestra la presencia de picos asignables a los 6 grupos metilo de la estructura mayoritaria propuesta, el aplisterol, además de 11 metilenos, 9 metinos y 3 carbonos cuaternarios que se observan en el espectro DEPT. Estos datos se resumen en la Tabla 1.1. Son características las señales de los carbonos C5 y C6 que conforman el doble enlace (140.7 y 121.7, respectivamente), así como las señales asignadas a C24 y C28 (39.8 y 16.5, respectivamente). Tabla 1.1: Desplazamientos de carbono del esterol mayoritario, aplisterol (1), ysuacetato(4) en Cl3CD y a 75MHz. Las asignaciones son consistentes con la bibliografía [Kelecom et al., 1979] y los datos del espectro DEPT. NoCarbono Aplisterol (1)Acetatodeaplisterilo(4) (,ppm) (,ppm) 1 (CH2)37.2 37.0 2 (CH2)31.7 27.7 3 (CH) 71.8 74.0 4 (CH2)42.3 38.1 5 (C) 140.7 139.6 6 (CH) 121.7 122.6 7 (CH2)31.9 31.9 8 (CH) 32.0 31.9 9 (CH) 50.1 50.0 10 (C) 36.5 37.0 11 (CH2)21.1 21.0 12 (CH2)39.8 39.8 13 (C) 39.7 39.7 14 (CH) 56.8 56.7 15 (CH2)24.3 24.3 16 (CH2)28.2 28.2 17 (CH) 56.1 56.1 18 (CH3) 11.8 11.8 19 (CH3) 19.4 19.3 20 (CH) 35.9 35.8 21 (CH3) 18.8 18.7 22 (CH2)33.9 33.8 23 (CH2)29.0 29.0 24 (CH) 39.8 39.8 25 (CH) 37.5 38.1 26 (CH2)25.8 25.7 27 (CH3) 15.9 15.9 28 (CH3) 16.5 16.5 29 (CH3) 12.2 12.0 CH3COO 170.5 CH3COO 21.4 23 H HH H 24 28 25 26 27 29 (R)(R) (S)(S) H H 24 28 (S)(S) H 23 (S)(S) H (63.96%) (17.39%) (19.57%) H COCH3 H COCH3 H COCH3 R1 1 1 1 1 1 1 R2 O R1 R2 1 1 1 1 4 2 5 3 6 Figura 1.2: Esteroles identificados en Verongia aerophoba 24 HO H 22 23 H24 HO - C7H14 m/z 412.3648 m/z 314.2478 -98.19 Figura 1.3: Transposición de McLafferty para el 24(28)-didehidroaplisterol (2). Figura 1.4: Protones olefínicos de la mezcla de aplisterol (1), 24(28)- didehidroaplisterol (2)y23(24)-didehidroaplisterol(3) 25 Estudio de los acetatos de aplisterilo (4), 24(28)-didehidroaplisterilo (5) y 23(24)-didehidroaplisterilo (6) Los estudios espectroscópicos que se realizaron a la segunda mezcla de esteroides aislada confirman que se trata de los acetatos de aplisterilo (4), 24(28)- didehidroaplisterilo (5)y23(24)-didehidroaplisterilo(6). En primer lugar, destaca una intensa banda de absorción en IR a 1724.24 cm−1que corresponde a la vibración de tensión del grupo C=O de ésteres que, junto al pico intenso a 1255.57 cm−1correspondiente a la vibración de tensión del enlace C-O, delata la presencia de un grupo acetoxi en C-3. El espectro de 1H-RMN también muestra la señal típica del protón olefínico en C6 a 5.37, además de la señal del hidrógeno geminal al grupo acetoxi a  4.62 (1H, m) y la señal del metilo del acetato en 2.03 (3H, s). El resto de las señales desplazadas en el espectro son consistentes con el esqueleto esteroidal del aplisterol, su esterol mayoritario. Un triplete centrado a 5.16 delata el esqueleto del 23(24)-didehidroaplisterol y dos señales a 4.70 y 4.68 delata el metileno del 24(28)-didehidroaplisterol. Las curvas integrales de estas señales son consistentes con la proporción asignada a los mismos en la figura 1. En el espectro 13C-RMN se observa la señal del carbono carbonílico del acetato a 170.5 y también las señales de los carbonos olefínicos C5 y C6 del esqueleto del aplisterol (139.6 y 122.6, respectivamente), así como el resto de señales esperadas según la biliografía1. Señales minoritarias en la zona olefínica del espectro se deben al 23(24)-didehidroaplisterol (136.0 y 132.5) y al 24(28)- didehidroaplisterol (156.5; 106.0). En el espectro de masas no se observa el pico del ión molecular a m/z 456 (M+,C 31H52O2) por la fácil pérdida de cetena (CH2C– –O) dando los picos a m/z 414.3866 (C29H50O) (pico base) y 412.3690 (C29H48O), así como la pérdida de una molécula de ácido acético, fenómeno este último que justifica el pico a m/z 396.3708 (M+-CH3COOH; C29H48). Los espectros COSY, TOCSY y NOESY son consistentes con las estructuras dadas, observándose, entre otras, la correlación del protón olefínico sobre C-6 (5.37) y el metileno alílico en C-7 (2.31) ó la del metileno olefínico en C-28 (4.69) y el metileno alílico en C-23 (2.00). Para confirmar nuestra hipótesis de que el compuesto aislado de la esponja era el derivado acetilado de la mezcla de aplisteroles descrita anteriormente, se acetiló una muestra de estos con piridina y anhídrido acético (una hora a 80 C), se extrajo de la forma usual y se purificó cromatografiando en columna de Si-gel con disolventes de polaridad creciente desde Hexano hasta una mezcla de Hexano-AcOEt 1:1. La comparacion por CCF de la mezcla natural con la sintética de reveló que, efectivamente, se trataba de los mismos compuestos, 4, 5y6. 1.3. Aislamiento y elucidación estructural de tres ácidos grasos (7, 8, 9). Una fracción que se aisló de la cromatografía general con n-hexano/AcOEt resultó homogénea por CCF pero fue identificada como una mezcla de los ácidos heneicosanoico (7,31.12%), oleico (8,30.59%)ylinoleico(9,38.30%)(Figura 1.5). Los porcentajes se dedujeron de las intensidades de los iones moleculares 26 O OH O OH O OH 7 8 9 Figura 1.5: Ácidos grasos de Verongia aerophoba:ácidosheneicosanoico(7), oleico (8)ylinoleico(9) en el espectro de masas, según se especifica en la Tabla 1.2 y fueron confirmadas por la curva integral en el espectro de 1H-RMN. También en el espectro de 13C-RMN se observan seis carbonos olefínicos –los cuatro del ácido linoleico ylosdosdeloleico–a128.6; 128.9; 129.7; 130.0; 130.5 y 130.6 además del resto de señales esperadas (C– –Oa180.5, y también los metilenos y metilos a 14-39). H3C H2 CC O OH 19 m/z 326.318718 C20H40O2C19H38O2C18H36O2 m/z 312.305351 m/z 298,291161 m/z 284.276962 - CH2CH2 C15H30O2C16H32O2C17H34O2 m/z 242.228024 m/z 256.242165 m/z 270.264053 - CH2CH2 - CH2 - CH2 Figura 1.6: Esquema de fragmentaciones observadas en el espectro de masas que confirman el ácido heneicosanoico (7). También la RMN de protón bidimensional (COSY, TOCSY y NOESY) infor27 man de correlaciones entre los protones olefínicos (5.34) y los protones alílicos (2.00) ó entre los metilenos en ↵al grupo carbonilo (2.34) y los metilenos en al carbonilo (1.62). Tabla 1.2: Composición de la mezcla de ácidos grasos. Componente m/z (M+) Intensidad (%) w/w (%) Acido heneicosanoico (7)326.318718 1.17 31.12 C21H42O2(Calc: 326.318481) Acido oleico (8)282.2621311.1530.59 C18H34O2(Calc:282.255881) Acido linoleico (9)280.246429 1.44 38.30 C18H32O2(Calc:280.240230) Total: 3.76 100 1.4. Ácido veróngico en Verongia aerophoba Aislamiento y elucidación estructural del ácido 3,5-dibromo1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil acético (10). De la fracción eluida con Hexano/AcOEt 50:50 se aisló un sólido pardo cuyo punto de fusión resultó ser 185-186C. Tras repetidas cromatografías en columna se pudo llegar a una muestra homogénea por CCF y se procedió a su elucidación estructural mediante métodos espectroscópicos. 55 66 11 22 33 44 O Br Br HO 2'2' 1'1' OH O 10 Figura 1.7: Ácido veróngico Un pico de absorción en el espectro IR que se encuentra a 3690 cm−1así como una banda ancha en el intervalo 3602-3569 cm−1indican un grupo hidroxílico y/o un grupo carboxílico, respectivamente. Además, una señal a 3026 cm−1 correspondiente a la vibración de tensión entre un hidrógeno y un carbono olefínico delata dobles enlaces, mientras que la señal en 2929 cm−1correspondería a la vibración de tensión de enlaces C-H de cadenas saturadas. Dos señales, a 28 1719 y 1690 cm−1,respectivamente,sontípicasdelavibracióndetensiónde los grupos carbonilos (el del grupo carboxílico y el de las cetonas ↵,insaturadas, respectivamente). La existencia de insaturaciones se corrobora por un pico a1603cm −1correspondiente a la vibración de tensión de dobles enlaces C– –C. Una banda de absorción aguda a 1226 cm−1se debe a la vibración de tensión del enlace C–O del grupo hidroxilo del ácido carboxílico y, finalmente, una banda de absorción a 669 cm−1sugiere la presencia de enlaces C–Br. O Br Br HO COOH 277.85 / 279.85 / 281.85 30.69% 60.08% 30.70% 305.84 / 307.85 / 309.85 37% 264.86 / 266.86 / 268.84 91% H+ - H2O O Br HO COOH C8O4Br2H6 M+: 323.85 / 325.85 / 327.85 7.81% 13.65% 6.85% - H2O 226.94 / 228.94 40.73% 40.71% 216.95 / 218.95 45.88% 44.70% - CO Figura 1.8: Principales fragmentaciones del ácido veróngico (10)enelespectrómetro de masas. En espectrometría de masas se observa un pico base correspondiente al ión molecular según la fórmula C8H6O4Br2(M+,323.85/325.85/327.85)ydado que se observa la señal como una tríada con intensidades relativas de aproximadamente 1/2/1 (7.81%/13.65%/6.85%)sepuedeafirmarqueestamolécula contiene dos átomos de bromo. Las fragmentaciones observadas para esta molécula, que se muestran en la Figura 1.8, son consistentes con una estructura relacionada con la dibromotirosina, por lo que, encaja en la ruta biogenética de los aminoácidos y, habiéndole asignado la estructura del ácido 3,5-dibromo1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil acético) (10), la hemos denominado con el nombre de ácido veróngico. En el espectro de 1H-RMN (Tabla 1.3) se observa la señal de los dos protones de la ciclohexadienona (7.65; 2H; s) y la del protón ácido como un singlete ancho a 12.51. También destaca la presencia del protón hidroxílico sobre C1 como un singlete ancho a 6.41 y un singlete agudo a 2.78 (2H) que corresponde a los hidrógenos metilénicos en ↵al grupo carbonilo (hidrógenos sobre C2’). Estos datos muestran concordancia con los de la bibliografía [Sharma et al., 1970]. El espectro de 13C-RMN confirma que la molécula contiene un metileno, dos metinos y cinco carbonos cuaternarios. Los desplazamientos químicos asignados acadacarbonosemuestranenlaTabla1.3y,siendoconfirmadosporelexperimento DEPT, se describen aquí por primera vez. Esta molécula fue descrita como derivado sintético del dimetoxicetal de la amida correspondiente [Sharma et al., 1970] y, por otra parte, como metabolito de la esponja Verongia thiona [Cruz et al., 1990]. Esta es la primera vez que se aisla de Verongia aerophoba. 29 O BrBr HN O O O NH O C13O5N2Br2H12 M+: 433.7988 / 435.8075 / 437.8013 1.64% 4.25% 1.77% - CO2 389.85 / 391.86 / 393.85 14.72% 29.69% 13.67% C4O2NH6 C9O3NBr2H6 101.034 336.8715 24.98% 34.99% 13.60% 334.87 / 336.87 / 338.87 56.97% 100% 45.00% 278.87 / 280.87 / 282.87 C11O4NBr2H10 379.8531 7.72% 16.35% 7.46% 377.85 / 379.85 / 381.85 24.98% 34.99% 13.60% 334.87 / 336.87 / 338.87 C2ONH3 57.0604 -56 O=C-N=CH2 - CO2 -44 -43 - CONH Figura 1.14: Fragmentaciones de verongiolido (14)enelespectrómetrode masas. protones aromáticos sobre C-2 y C-6 y el protón sobre C-8, lo que demuestra que éstos están próximos en el espacio. La comparación de estos datos con los aportados por la bibliografía [Norte et al., 1988] para el denominado (R,R)-5-[3,5-dibromo-4-(2-oxo-5-oxazolidinil) metoxifenil]-2-oxazolidinona de Verongia aerophoba confirma que dicho producto y nuestro verongiolido son la misma sustancia. Los datos obtenidos aquí son consistentes también con los publicados por diferentes autores [Borders et al., 1974],[Makarieva et al., 1981],[Aydogmus et al., 1999],[Kossuga et al., 2004] para hipotéticos estereoisómeros obtenidos de la ascidia Clavelina oblonga ydelas esponjas Verongia lacunosa,Aplysina cauliformis,Aplysina fistularis,Aplysina fulva,Aplysina archeri yVerongula rigida. 36 Figura 1.15: Comparación de los espectros 1H-RMN de verongiolido (14)en dos disolventes diferentes: a) DMSO–d6,500MHz;b)CD 3OD, 300MHz. 37 Tabla 1.9: Desplazamientos químicos (en ppm, Jen Hz) observados en los espectros RMN de verongiolido (14). 1H-RMN 13C-RMN (300MHz) (75MHz) Posición H(DMSO–d6)H(CD3OD) C(DMSO–d6) 1 139.2 (C) 2 7.70 (2H, s) 7.66 (1H, s) 130.7 (CH) 3 117.9 (C) 4 152.0 (C) 5 117.9 (C) 6 7.70 (2H, s) 7.66 (1H, s) 130.7 (CH) 75.58(1H,dd, 5.62(1H,dd,74,7 a(CH) J=9.0, J=8.0) J=8.7, J=7.1) 8 3.36 (1H, dd, 3.43 (1H, dd, 41.5 (CH2) J=8.5, J=8.0) J=9.3, J=7.1) 3.84 (1H, dd, 3.98 (1H, dd, J=9.0, J=8.5) J=9.3, J=8.7) 9158.8 b(C) 10 4.12 (2H, d, J=4.4) 4.23 (2H, m) 73.3 (CH2) 11 4.94 (1H, dddd, 5.04 (1H, m) 73.9a(CH) J=9.0, J=6.7, J=4.4, J=4.4) 12 3.51 (1H, dd, 3.80 (2H, m) 47.3 (CH2) J=8.8, J=6.7) 3.64 (1H, dd, 3.80 (2H, m) J=9.0, J=8.8) 13 158.5b(C) NH 7.59 (1H, s) 7.74 (1H, s) a,b Intercambiable 1.8. Aislamiento y elucidación estructural de la 11-epi-fistularina-3 (15). La 11-epi-fistularina-3 (15)seaislódelafraccióneluidaconHexano/AcOEt 30:70 como un sólido amorfo amarillento soluble en metanol y fue purificada tras repetidas cromatografías en columna de SiO2usando como fase móvil Hexano/AcOEt con polaridad creciente. Su punto de fusión fue de 125.9Cysu rotación óptica de [↵]20C D=+60o(c 1.1, MeOH), datos que lo identifican con el producto aislado por König y Wright de Agelas oroides [König and Wright, 1993] y con el aislado por Aydogmus y col. de Verongia aerophoba [Aydogmus et al., 1999]. 38 O N (S) HO BrBr 9 H N O 1010 (R) 11 1212 HO OMe O 1313 1414 1515 1616 15'15' 14'14' Br Br 1818 H N9'9' O 2'2' 1' (R) 5'5' 4'4' 3'3' O N 8'8' 6' (S) 6' OH Br Br OMe H 17 (R) 17 HO H 15 2 3 4 (R) 6 77' 15 Figura 1.16: Estructura de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 Apesardequeenelespectrodemasasnoseobservóelpicodelionmolecular, se estableció la fórmula molecular C31H30Br6N4O11 por suma de los fragmentos que sí se observan según se indica en la Figura 1.17. Obsérvese que esta fórmula supone dieciséis insaturaciones. Obsérvese también que a cada uno de los fragmentos se le han asignado dos átomos de bromo debido a que en el espectro de masas se detectaron las señales adicionales originadas por los isótopos de bromo con intensidades relativas que indican la presencia de dos bromos, es decir, tres señales separadas las unas de las otras por dos unidades de masa con unas intensidades relativas de aproximadamente 1/2/1. Así, por ejemplo, se observa una tríada a m/z 331.85 (0.68%), 333.85 (1.17%)y335.85(0.48%), además de las especificadas en la Figura 1.17. Obsérvese que este esquema de fragmentación viene apoyado por los datos obtenidos por alta resolución. Así, por ejemplo, un pico a m/z 348.875923 sólo puede corresponder a la fórmula C10O3NH779Br81Br, y otro a m/z 320.874931 a la fórmula C9O2NH779Br81Br, lo que demuestra que ambos están relacionados por la pérdida de monóxido de carbono (Figura 1.18). El espectro de IR mostró bandas características de los grupos OH y NH (3597.21 y 3422.00 cm−1,respectivamente),cadenasalifáticasa2968.00,2937.72 y2865.89cm −1,carbonilosdeamidas(1717.37cm −1), dobles enlaces (C– –Cy C– –N) a 3030.00 y 1604.32 cm−1ytensionesC–OyC–Na1224.06,1285.72 y1537.52cm −1. Otras señales de la ’huella dactilar’ de la moléculaCD3OD aparecen a 1126.42; 1069.90; 1013.37; 910.60; 797.54; 730.00; 669.08 (C–Br) y 598.00 cm−1. Las señales que aparecen en el espectro de 1H-RMN a 7.60 corresponden alosprotonesdelanilloaromáticocentralbromado,mientrasquelaseñala 6.50 corresponde al protón del C-5 y también es característica de los grupos 1hidroxi-2,4-dibromo-3-metoxi-8-carbamoil-espiro-ciclohexadienilisoxazol presentes en los metabolitos de la ruta de la dibromotirosina. El hecho de que tanto en el espectro de 1H-RMN en DMSO–d6como en CD3OD aparezcan dos singletes duplicados (6.56/6.58 en DMSO–d6y6.41/6.42 en CD3OD) nos informa de que se trata se un compuesto con dos sistemas espiránicos del tipo mencionado, ya que uno de los singletes correspondería al C-5 y el otro al C-5?. Un singlete que aparece a 3.64 en DMSO–d6ya3.72 en CD3OD que integra para 6 39 O N HO BrBr H N O OMe O Br Br H N O O N OH Br Br OMe OH OH C12O4N2Br2H13 2.26% 4.31% 2.26% 436.95 / 438.82 / 440.85 C10O3NBr2H7 7.24% 12.82% 7.38% 346.87 / 348.87 / 350.87 C9O2Br2H8 19.89% 45.47% 33.87% 303.85 / 305.85 / 307.85 C9O2NBr2H7 20.62% 48.66% 23.10% 318.87 / 320.87 / 322.87 6.40% 11.47% 6.97% 331.85 / 333.85 / 335.85 C9O2NBrH7 2.2% 2.4% 239.96 / 241.96 - CO - CH3 - Br - OH CH3Br HBr 100% 99.64% 93.94 / 95.94 79.93 / 81.92 C9OBr2H7 0.55% 1.22% 0.58% 288.87 / 290.87 / 292.87 - Br C9OBrH7 1.12% 1.21% 209.95 / 211.94 -15 -28 -79 -79 -17 C2H5NO 73.04 C9O2NBr2H9 320.90 - OH -17 0.88% 1.91% 1.28% 303.86 / 305.86 / 307.86 Figura 1.17: Fragmentaciones en espectrómetro de masas de la 11-epi-fistularina-3. protones indica la presencia de dos grupos metoxilo. La razón de que los espectros de 1H-RMN se hayan realizado con dos disolventes diferentes (DMSO–d6 y CD3OD) se encuentra en el hecho de que el DMSO–d6permite observar la señal del protón de las amidas (NH) y los grupos hidroxilos por una parte y el CD3OD permite ver parte del sistema AB de los metilenos correspondientes a las posiciones 7 y 7’. Obsérvese que las asignaciones realizadas en CD3OD vienen corroboradas por los espectros COSY, TOCSY y NOESY. Así, por ejemplo, en el espectro TOCSY se observa correlación entre los protones de los dos sistema AB sobre C-7, entre el metileno sobre C-18 y el metino sobre C-17 y el metileno 40 O N H BrBr O OMe O N H BrBr OMe C10O3NH779Br81Br Calc: 348.877219 Obs: 348.875923 C9O2NH779Br81Br Calc: 320.882305 Obs: 320.874931 -28 (CO) Figura 1.18: Espectrometría de masas de alta resolución de la 11-epi-fistularina-3. sobre C-12 y el metino sobre C-11 por un lado y el metileno sobre C-10 por otro. En el espectro COSY se observan las mismas correlaciones excepto la del metileno sobre C-10 con el metileno C-12. En el espectro NOESY se observa correlación entre los protones sobre C-7 entre sí, al igual que entre los que están sobre C-7’, entre los dos protones sobre C-10 entre sí y entre los dos protones sobre C-18 entre sí. También entre los protones aromáticos sobre C-15 y C-15’y el metino sobre C-17; también entre los protones olefínicos sobre C-5 y C-5’y los protones orientados hacia el mismo lado de los metilenos sobre C-7 y C-7’ (A=3.06yA0= 3.12 en CD3OD). Algunos detalles como las constantes de acoplamiento de los diferentes sistemas de spin se pudieron medir en el espectro en Cl3CD a 300MHz. Así, en dicho espectro se observan cuatro señales a 3.91651; 3.85488; 3.04100; 2.97937 que en conjunto conforman un sistema AB. Tratadas matemáticamente como procede nos lleva a los siguientes datos para el metileno C-7: A=3.01;B=3.88;JAB =18.5Hz Análogamente, otras cuatro señales a 3.89054; 3.82917; 3.02510; 2.96351 conforman un sistema A’B’ que tratadas de la misma forma nos dan los siguientes datos sobre el metileno C-7’: A0=2.99;B0=3.86;JA0B0=18.5Hz Similarmente, el metino C-17 y el metileno C-18 conforman un sistema ABX típico cuyo análisis nos deja los siguientes datos: X=4.75;A=3.53;B=3.65; JAX =8.07Hz, JBX =3.36Hz, JAB =13.93 Hz Por otro lado, el espectro de 13C-RMN nos confirmó la presencia de dos metoxilos (58.84) y, además, nos informó de la presencia de cuatro metilenos ( 41 38.5, 42.2, 46.1 y 74.2), seis metinos (68.4, 70.0, 73.8, 130.2, 130.5 y 130.6) y doce carbonos cuaternarios (90.7; 90.9; 112.5; 117.3; 121.2; 141.5; 147.7; 148.1; 151.6; 153.5; 153.6 y 160.2) en el esqueleto carbonado. Cabe destacar que las señales que aparecen con desplazamientos químicos muy próximos en el espectro de 13C-RMN en DMSO–d6(90.7/90.9; 147.7/148.1; 130.5/130.6 y 153.5/153.6) corresponden a carbonos del sistema espiro-ciclohexadienilisoxazolina,loque nos confirma que la molécula contiene dos grupos espiránicos de ese tipo. Por otra parte, es característica la señal de los carbonos bromados del anillo aromático (117.3), que nos confirma que estamos ante un metabolito derivado de la dibromotirosina. La comparación (Tabla 1.10) de los desplazamientos químicos observados en los espectros de 13C-RMN de la 11-epi-fistularina-3 descrita en la bibliografía [König and Wright, 1993] y nuestro producto nos confirma que ambos son el mismo. La observación de dos únicas señales para los carbonos estereogénicos, C-11 y C-17, tanto en CD3COCD3como en DMSO–d6yenCD 3OD (Tabla 1.10, Tabla 1.11 y Tabla 1.12, respectivamente) revelan que nuestro producto es de alta pureza enantiomérica. Por otra parte, la 11-epi-fistularina-3 (15)seacetilóportratamientocon piridina y anhídrido acético (1:2) para dar un tetraacetato, el cual también se purificó por cromatografía en columna de SiO2eluyendo con mezclas de n-Hexano y acetato de etilo con proporción creciente del último. También se realizaron estudios espectroscópicos para el derivado acetilado de Fistularina-3. El espectro de 1H-RMN muestra la presencia de cuatro grupos acetilo a través de un intenso singlete centrado en 2.15 ppm –la curva integral para esta señal es el doble de la del singlete producido por los dos grupos metoxilo–. Las moléculas de alto peso molecular, como la 11-epi-fistularina-3 (15)se forman por oxidación del grupo ↵-amino de la dibromotirosina hasta una cetooxima seguido de la oxidación del anillo aromático implicando un arenoepóxido que sufre apertura intramolecular dando el sistema espiroisoxazolínico (Figura 1.19). El primer producto aislado de este tipo fue la fistularina-3, encontrada en 1979 en Aplysina fulva [Gopichand and Schmitz, 1979]. Posteriormente se describe el aislamiento de la 11-epi-fistularina-3 (15)deunaesponjano-verongida, Agelas oroides [König and Wright, 1993]. La configuración absoluta de los dos alcoholes secundarios, los centros estereogénicos C11 y C17 no se había abordado hasta que Rogers y col [Rogers et al., 2005] elucidaron la estereoquímica del C-11 por un análisis denominado LCMS-Marfey’s, deduciendo que la fistularina3es11Syla11-epi-fistularina-3 es la 11R.Estonosfijalaconfiguraciónen C-11 para nuestra molécula (11R). Queda, pues, por abordar la configuración absoluta en C-17. En este estudio, en el que por primera vez se describe la 11-epi-fistularina-3 en V. aerophoba,hemosplanteadounacorrelaciónbiogenética de esta molécula con el verongiolido (14), en el que se encuentran los mismos centros quirales conservados (Figura 1.20) y, por ello, proponemos para el C-17 la misma configuración que para el verongiolido, es decir, R. Apoyando esta conclusión, podemos citar al grupo de Proksch [Ebel et al., 1997] quienes describieron que las esponjas Aplysina spp. liberan verongiolido por una fragmentación química espontánea de fistularina-3 que es inducida por daños en el tejido y catalizada por un enzima aún no definido. La extrapolación de estos razonamientos nos lleva a proponer para la descrita hemifistularina-3 [Mancini et al., 1993] la estereofórmula 16,conelcentroquiral 42 Tabla 1.10: Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros de 13C-RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15)yla11-epi-fistularina-3 descrita en la bibliografía [König and Wright, 1993] en acetona–d6. Posición 13C-RMN (75MHz) de (11R,17R)-11-epifistularina-3 (15) 13C-RMN (75MHz) de 11-epi-fistularina-3 en la bibliografía [König and Wright, 1993] 1,1’ 75.0; 75.1 (CH) 75.0; 75.1 (CH) 2,2’ 122.0; 122.1 (C) 122.0; 122.1 (C) 3,3’ 148.6; 148.6 (C) 148.6; 148.6 (C) 4,4’ 113.8; 113.8 (C) 113.7; 113.7 (C) 5,5 132.1; 132.2 (CH) 132.0; 132.1 (CH) 6,6’ 91.7; 91.7 (C) 91.8; 91.8 (C) 7,7’ 39.9; 39.9 (CH2) 39.8; 39.9 (CH2) 8,8’ 155.0; 155.1 (C) 154.9; 155.0 (C) 9,9’ 160.2; 160.4 (C) 160.4; 160.5 (C) 10 43.4 (CH2) 43.4 (CH2) 11 69.7 (CH) 69.7 (CH) 12 75.8 (CH2) 75.7 (CH2) 13 152.5 (C) 152.5 (C) 14,14’ 118.3; 118.3 (C) 118.3; 118.3 (C) 15,15’ 131.4; 131.4 (CH) 131.3; 131.3 (CH) 16 143.1 (C) 142.9 (C) 17 71.3 (CH) 71.3 (CH) 18 47.5 (CH2) 47.5 (CH2) OMe 60.2; 60.2 (CH3) 60.2; 60.2 (CH3) en C-7 con configuración R.Lacoincidenciadesusdatosespectroscópicoscon los de la parte correspondiente de nuestra (11R,17R)-epi-fistularina-3 parece apoyar esta propuesta. 43 Tabla 1.11: Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectrosde RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15)DMSO–d 6. Posición 1H-RMN (300 MHz) 13C-RMN (75MHz) 1,1’ 3.91 (2H, s) 73.8 (CH) 2,2’ 112.5 (C) 3,3’ 147.7; 148.1 (C) 4,4’ 121.1 (C) 5,5 6.56 (1H, s); 6.58 (1H, s) 130.5; 130.6 (CH) 6,6’ 90.7; 90.9 (C) 7,7’ Solapado 38.5 (CH2) 8,8’ 153.5; 153.6 (C) 9,9’ 160.4; 160.2 (C) 10 Solapado 42.2 (CH2) 11 4.06 (1H, m) 68.4 (CH) 12 3.83 (2H, m) 74.2 (CH2) 13 151.6 (C) 14,14’ 117.3 (C) 15,15’ 7.59 (1H, s); 7.58 (1H, s) 130.2 (CH) 16 141.5 (C) 17 4.68 (1H, m) 70.0 (CH) 18 3.30 (2H, m) 46.1 (CH2) 3,3’-OMe 3.64 (6H, s) 58.8 (CH3) 1,1’-OH 7.80 (2H, s) 11-OH, 17-OH 5.37 (2H, s) NH 8.41 (2H, m) 44 Tabla 1.12: Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectrosde RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15) CD3OD. Posición 1H-RMN (400 MHz) 13C-RMN (100 MHz) 1,1’ 4.11 (2H, s) 73.8 (CH) 2,2’ 112.5 (C) 3,3’ 147.7; 148.1 (C) 4,4’ 121.2 (C) 5,5 6.41 (1H, s); 6.42 (1H, s) 130.5; 130.6 (CH) 6,6’ 90.7; 90.9 (C) 7,7’ Sistema AB, A=3.06, B=solapado, J=19.4Hz Sistema A’B’, A0=3.12, B0=solapado, J=19.4Hz 38.5 (CH2) 8,8’ 153.5; 153.6 (C) 9,9’ 160.1; 160.2 (C) 10 3.82 (1H, m), 3.54 (1H, m) 42.1 (CH2) 11 4.18 (1H, m) 68.4 (CH) 12 4.03 (2H, m) 74.2 (CH2) 13 151.6 (C) 14,14’ 117.3 (C) 15,15’ 7.62 (1H, s), 7.61 (1H,s) 130.2 (CH) 16 141.5 (C) 17 4.75 (1H, m solapado con la señal del metanol) 70.0 (CH) 18 3.30 (1H, m), 3.63 (1H, m) 46.1 (CH2) 3,3’-OMe 3.72 (6H, s) 58.8 (CH3) NH 7.60 (1H, m) NH 7.36 (1H, m) 45 Tabla 1.15: Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectrosRMNdela(11R,17R)-fistularina-1 (18). 1H-RMN 13C-RMN Posición HDMSO–d6HCDCl3HCD3OD CDMSO–d6CCD3OD (300MHz) (500MHz) (300MHz) (75MHz) (75MHz) 1 Solapado 4.43 (1H, s) 4.11 (1H, d) 75.7 75.6 (CH) J=0.7Hz 2 113.3 113.0 (C) 3 147.4 147.0 (C) 4 121.1 121.2 (C) 5 6,58 (1H, s) 6,34 (1H, s) 6,41 (1H, d) 131.4 130.6 (CH) J=0.7Hz 6 90.5 90.9 (C) 7 Solapado Sistema AB Sistema AB Solapada 38.5 (CH2) A=3.02,B=3.96 A=3.10,B=3.80 JAB =18.5Hz JAB =18.4Hz 8 154.7 153.6 (C) 9 159.3 160.0 (C) 10 Solapado 3.49 (1H, dd) 3.53 (1H, m) 42.8 42.1 (CH2) J=6.8Hz; J=8.9Hz 3.49 (1H, dd) 3.75 (1H, m) J=6.8Hz; J=5.8Hz 11 Solapado 4.23 (1H, m) 4.25 (1H, m) 68.2 68.4 (CH) 52 Tabla 1.15: Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectrosRMNdela(11R,17R)-fistularina-1 (18). 1H-RMN 13C-RMN Posición HDMSO–d6HCDCl3HCD3OD CDMSO–d6CCD3OD (300MHz) (500MHz) (300MHz) (75MHz) (75MHz) 12 Solapado 4.06 (2H, m) 4.05 (2H, m) 74.7 74.3 (CH2) 13 152.6 153.0 (C) 14,14’ 118.0 117.9 (C) 15,15’ 7.69 (2H, s) 7.54 (2H, s) 7.64 (2H, s) 130.7 129.8 (CH) 16 138.9 138.5 (C) 17 5.57 (1H, dd) 5.54 (1H, dd) 5.62 (1H, dd) 73.8 73.8 (CH) J=7.6Hz; J=7.9Hz J=7.0 Hz; J=8.4Hz J=7.1Hz; J=8.8Hz) 18 Solapado 3.59 (1H, dd) 3.44 (1H, dd) 47.3 47.3 (CH2) J=7.0Hz; J=8.5Hz J=7.1 Hz; J=9.2Hz 3.99 (1H, dd) 3.99 (1H, dd) J=8.4Hz; J=8.5Hz J=8.8 Hz; J=9.2Hz 19 158.5 158.3 (C) OMe 3.64 (3H, s) 3.76 (3H, s) 3.73 (3H, s) 59.8 58.9 (CH3) 1-OH, 11-OH 5.21 (1H, s) NH 8.39 (2H, t) 53 La asignación de los picos fue asistida por la espectroscopía de RMN en dos dimensiones. Así, en el espectro TOCSY se observa correlación entre los protones sobre C-15 y el metino C-17, así como entre los protones sobre C-1 y C-5, el metino C-17 y los dos protones sobre C-18, los dos protones sobre C-18 entre sí, el metileno sobre C-12 y el metino C-11, el metileno C-12 y ambos protones sobre C-10, los dos protones sobre C-10 y el metino C-11 y los dos protones sobre C-10 entre sí. Finalmente, entre los dos protones del sistema AB sobre C-7. En el espectro COSY se observan las mismas correlaciones que en el TOCSY excepto la de los metilenos C-10 y C-12. En el espectro NOESY se observa correlación entre los hidrógenos sobre C-15/C-15’ y el metino C-17, así como entre este último y los dos protones sobre C-18, entre los dos protones sobre C-7, entre los dos protones sobre C-10, entre los dos protones sobre C-18 y entre el metino C-11 y el metileno C-12. En el espectro ROESY se observa correlación entre el metino C-17 y el metileno C-18, entre los dos protones sobre C-18 entre sí, entre los dos protones sobre C-10 entre sí y entre los dos protones sobre C-7 entre sí. Los espectros de 13C-RMN y DEPT indican la presencia de un metoxilo ( 58.9), cuatro metilenos (38.5; 42.1; 47.3; 74.3), cinco metinos (68,4; 73.8; 75.6; 129.8; 130.6) y diez carbonos cuaternarios agrupados en siete señales ( 90.9; 113.0; 117.9; 121.2; 138.5; 147.0; 153.0; 153.6; 158.3; 160.0). De nuevo se observa la señal de los carbonos aromáticos sustituidos con bromo (117.9 ppm), característica de los metabolitos derivados de la dibromotirosina. La (11R,17R)-fistularina-1 (18)seacetilaenfríoconpiridinayanhídrido acético para dar su derivado diacetilado. El espectro de 1HRMN del producto obtenido muestra la presencia de dos grupos acetoxi mediante dos singletes a 2,18 y 2,15, respectivamente cuyas curvas integrales sumadas son el doble de la mostrada por el singlete originado por el grupo metoxilo. Al mismo tiempo, los metinos C-1 y C-11, geminales a ambos grupos acetoxi, sufren los previstos desplazamientos paramagnéticos apareciendo ahora a 5.86 (singlete) y 5.28 (multiplete), respectivamente. Otras señales características de este diacetato son las que aparecen en el espectro a 6.32 (1H, s, – –CH), un sistema AB originado por el metileno sobre C-7 a A=3.08 y B=3.46 (JAB =18.0 Hz), dos protones aromáticos a 7.55 y el metino bencílico en C-17 a 5.54 (t, J=7.9Hz). La comparación de estos datos con los aportados en la bibliografía [Gopichand and Schmitz, 1979] para la denominada fistularina-1 (sin configuración asignada en C-1, C-6, C-11 y C-17) nos confirma que ambas deben de ser la misma molécula. Dado que está biogenéticamente correlacionada con verongiolido (14), y la 11-epi-fistularina-3 (15)dondesísehaesclarecidolaconfiguración absoluta de los cuatro centros estereogénicos (1R,6S,11R,17R), deducimos que nuestra fistularina-1 debe de ser 1R,6S,11Ry17R,pueselmecanismo de reacción que lleva de este metabolito a los otros no implica ni inversión ni racemización en los mencionados centros quirales. 1.10. Aislamiento y elucidación estructural de verongiamina (19). Verongiamina es un derivado de la oxazolidinona que se aisló de la misma fracción que contuvo a la fistularina-1 (18), por lo que sospechamos se trata 54 de un artefacto producido por hidrólisis ácida –catalizada por el mismo ácido silícico– del grupo amida de la mencionada fistularina-1 (18). En el espectro de 1H-RMN se detecta el anillo aromático por una señal que integra para dos protones a 7.64 y el anillo de oxazolidona por una señal de tipo doble doblete que integra para un protón a 5.62. El resto de señales son consistentes con la estereoestructura 19. Así, el metino C-2 se desplaza un multiplete que integra para un protón a 4.20, el metileno sobre C-3 resuena a 4.02, el metileno sobre C-9 aparece como dos multipletes solapados a 3.43 (1H) y 3.98 (1H). El resto de las señales corresponden al metileno sobre C-1, el protón hidroxílico, los dos protones de la amida primaria y el protón amídico del heterociclo de oxazolidona (en total, seis hidrógenos que se solapan en el intervalo 3.35-3.85. H2N 11 (R) 2 (R) 2 33 HO O44 55 66 77 6'6' 5'5' Br Br H (R) 8 (R) 8 99 NH 1010 OO H 20 Verongiamina Bibliografía Aydogmus, Z., Ersoy, N., and Imre, S. Chemical investigation of the sponge Verongia aerophoba.Turk. J. Chem.,23(3):339–344,1999. Bergmann, W., Gould, D., and Low, E. Contributions to the study of marine products; spongosterol. The Journal of organic chemistry,10:570–579,1945. Bergmann, W. 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En estos compuestos se han detectado diferentes actividades biológicas, como puede ser antimicrobiana (y antifúngica) respecto a diferentes cepas, anti-incrustante (en inglés antifouling,actividadinhibidora del crecimiento de una serie de organismos marinos asociados con el “ensuciamiento biológico”) y principalmente una importante citotoxicidad respecto a diferentes células tumorales [Peng et al., 2005]. La actividad anticancerosa de la aeroplysinina-1 ha sido la más estudiada de entre todos los derivados de la bromotirosina. En 1989, Kreuter y colaboradores evaluaron la actividad anticancerosa de la aeroplysinina-1 en experimentos tanto in vitro como in vivo,yencontraronquelaaeroplysinina-1mostrabauna pronunciada actividad citostática frente a células de linfoma, de leucemia y de carcinoma de pecho y colon, pero no mostraba ninguna actividad frente a las células humanas normales [Kreuter et al., 1989]. Otros estudios han demostrado la inhibición, por parte de la aeroplysinina-1, de la actividad de la enzima tirosina-quinasa de las células del cáncer de pecho humano [Kreuter et al., 1990], además de citotoxicidad frente a otras células tumorales [Koulman et al., 1996]. De estos datos, se concluyó que la aeroplysinina-1 es un compuesto prometedor para una quimioterapia racional [Kreuter et al., 1990]. Otros estudios, llevados a cabo por el grupo de Rodríguez-Quesada en la Universidad de Málaga, han revelado que la aeroplysinina-1 tiene una fuerte actividad antiangiogénica (impide el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos) [Rodríguez-Nieto et al., 2002]. Esto aumenta el interés farmacológico de esta molécula, ya que se sabe que interferir con la angiogénesis y/o prevenirla es un método terapéutico atractivo para el tratamiento de enfermedades dependien61 (a) (b) (c) (d) Figura 2.3: Cultivo de V. aerophoba en el tanque de sedimentación de la planta de cultivo de peces (ICCM, Taliarte, Gran Canaria). (a, b) Esponjas cultivadas en las cajas superiores, antes y después de la limpieza de algas y material sedimentado, respectivamente. (c, d) Esponjas cultivadas en las cajas inferiores, antes y después de la limpieza del material sedimentado, respectivamente. según si estaban enteras o trituradas (F1,10 =0.790,p=0.395), o si la acetona se añadió inmediatamente o después de incubar las esponjas a 20Cdurante24 h(F1,10 =0.031,p=0.864). Esto podría ser debido a una gran variabilidad en el contenido de metabolitos de cada uno de los explantes individuales. ApartirdeesteexperimentosepuedeconcluirquelasesponjasV. aerophoba tienen una alta supervivencia cuando son cultivadas con el sistema descrito en aguas residuales procedentes de plantas de acuicultura de peces. Sin embargo, las tasas de crecimiento negativas indican que es necesaria una adecuación del sistema para eliminar o minimizar los factores que limitan el crecimiento de las esponjas. Estas actuaciones se podrían dirigir hacia la integración del cultivo de esponjas en un sistema de cultivo multitrófico [Fu et al., 2007], con algunos pasos previos al propio cultivo de esponjas, como podrían ser: 1) filtros de arena donde se retendrían las partículas de mayor tamaño (las cuales incluso podrían ser consumidas por detritívoros, como holoturias) a la vez que darían soporte a bacterias nitrificantes que reducirían la carga de amonio, y 2) incluir un segundo paso con microalgas (p. ej. Chlorella sp.) que fijarían el nitrato y podrían servir de alimento al propio cultivo de esponjas [Belarbi et al., 2003; de Caralt et al., 2003]. Además, habría que incluir un mantenimiento del cultivo que controlase 68 Tabla 2.1: Concentraciones medias (en mg/g PS) de los metabolitos identificados por HPLC [11-epi-fistularina-3 (15), verongiolido (14)yácidoveróngico (10)] en las esponjas cultivadas ex situ eíndicesdebioconversión(en µmolµmol−1de verongiolido/11-epi-fistularina-3) según diferentes condiciones de cultivo y procesos de extracción. Los valores entre paréntesis corresponden al error estándar. Origen Proceso de extracción (15)(14)(10) Índice Salvaje Húmeda Entera Inmediata 24.84 4.98 3.94 2.05 (15.42) (0.76) (1.09) (1.31) Cultivo Seca Entera Inmediata 12.15 1.47 0.83 0.60 Luz (1.36) (0.13) Cultivo Húmeda Triturada Inmediata 42.25 2.23 1.89 0.15 Luz (12.81) (0.14) (0.60) (0.05) Cultivo Húmeda Triturada Incubación 0.92 0.40 1.51 1.11 Luz 24h Cultivo Seca Entera Inmediata 103.28 4.04 3.79 0.10 Oscuridad (1.85) Cultivo Húmeda Triturada Inmediata 37.04 1.29 3.52 1.30 Oscuridad (35.90) (0.15) (2.55) (1.25) Cultivo Húmeda Triturada Incubación 14.14 2.56 3.28 0.12 Oscuridad 24h (13.90) (2.88) la proliferación de epibiontes y/o predadores. 2.3. Cultivo in situ de Verongia aerophoba 2.3.1. Material y métodos Esponjas, preparación de los explantes y montaje del cultivo La esponja Verongia aerophoba se recogió mediante equipos de buceo autónomo en la Bahía de Alcúdia (Mallorca, España) a finales de Septiembre de 2009, a unos 5-6 metros de profundidad. Los fragmentos de la esponja viva se cortaron de la esponja madre con una cuchilla afilada, dejando al menos 1/3 de cada esponja para que se recuperase. Inmediatamente y bajo el agua en el mismo sitio de recogida, se prepararon los explantes para su cultivo in situ,procurando separar las chimeneas dejando aproximadamente 3-5 cm3de la base, con lo que se obtuvieron explantes de unos 8-20 cm3. La estructura de cultivo consistía en un marco cuadrado de acero inoxidable de 80 ⇥80 cm de lado, el cual sostenía dos capas de malla de polipropileno con una luz de 1.6 ⇥2.0 cm. Los explantes se fueron colocando entre las dos capas de malla, separándolos entre ellos con un hilo de nylon formando bolsillos de 16 ⇥ 16 cm. Se colocaron un total de 25 explantes provenientes de 5 esponjas madre diferentes. Finalmente, la estructura de cultivo se encadenó por un vértice al fondeo, mientras que en el vértice opuesto se amarró un cabo unido a una boya 69 subsuperficial para mantener la verticalidad y a la vez pivotar a merced de las corrientes (Figura 2.4). (a) (b) Figura 2.4: (a) Estructura de cultivo in situ en la Bahía de Alcúdia (Mallorca, Islas Baleares). (b) Explante de V. aerophoba creciendo en la malla. Obsérvese la formación de tejido nuevo sobre la malla y la aparición de ramificaciones. Crecimiento de los explantes El cultivo de esponjas in situ se mantuvo durante 315 días (de noviembre 2009 a octubre 2010). En este tiempo y con una periodicidad de entre 1 y 3 meses, se realizaron labores de mantenimiento del cultivo (limpieza de partículas indeseadas e incrustaciones biológicas, principalmente algas creciendo sobre la malla) y se monitorizó el crecimiento de los explantes. Para estimar el crecimiento de los explantes se tomaron fotografías con una cámara digital (Olympus µ1010) equipada con una carcasa submarina (Olympus PT-042), y las áreas proyectadas de los explantes se calcularon con un programa de análisis de imágenes (ImageJ). Los cambios en el área proyectada se consideraron una buena estima de los cambios en biomasa [Turon et al., 1998; de Caralt et al., 2003; Osinga et al., 2010] ya que los explantes crecieron principalmente en dos dimensiones. Apartirdeloscambiosdeláreaproyectadaenunperiododetiempo,secalculó la tasa de crecimiento TCtcon la fórmula: TCt=(AtAt1) At1t donde AtyAt1son las áreas en el tiempo t y en el tiempo de muestreo anterior, respectivamente, y teselespaciodetiempo(enmeses)entredosmuestreos consecutivos. Esta tasa de crecimiento es el cambio en área relativo al área en el tiempo anterior por unidad de tiempo [Turon et al., 1998; Duckworth and Battershill, 2001]. Después de fotografiar los explantes, se tomaban de 3 a 5 muestras de esponja (aproximadamente entre 100 y 400 mg de peso fresco), cada una de ellas de 70 explantes diferentes y provenientes de esponjas madre diferentes. Cada uno de estos fragmentos de esponja se guardaban en tubos de polipropileno de 15 ml. Seguidamente, se refotografiaban los explantes muestreados para obtener la diferencia en área área proyectada antes y después del muestreo. Extracción, biotransformación y análisis de los metabolitos por HPLC Inmediatamente después de finalizar los muestreos, cada una de las muestras tomadas se dividía en dos partes, una de ellas se extraía directamente con metanol (10 ml) mientas que la otra parte se machacaba con un pistilo dentro del propio tubo con un poco de agua de mar (aproximadamente 1 ml) y se dejaba reposar durante unas 12 horas antes de añadir el metanol para la extracción. Las muestras en metanol se guardaron a -20C hasta su análisis por HPLC. Para el análisis por HPLC, los extractos metanólicos se filtraron por 0.45 µm y se inyectaron directamente. También se hicieron disoluciones patrón a 250 ppm (0.25 mgml−1)deloscompuestos11-epi-fistularina-3 (15), verongiolido (14), ácido veróngico (10), dienona (11), aeroplysinina-1 (13)yfistularina-1 (18). Los metabolitos se separaron por HPLC mediante una columna Waters Novapak C18 (60Å, 4µm, 3.9 ⇥150 mm) en las siguientes condiciones: Inicio: 80%de agua y 20%de metanol Hasta el minuto 15: subir la composición del metanol en gradiente lineal desde el 20%al 100% Del minuto 15 al 20: mantener la elución isocrática con metanol 100% Del minuto 20 al 25: gradiente lineal aumentando la composición de agua hasta volver a las condiciones iniciales (80%de agua y 20%de metanol) Flujo: 1mlmin−1 Volumen inyectado: 10 µl Mediante un detector UV (=254nm)sepudoobservarlaseparaciónde los compuestos según se indica en la Tabla 2.2: Tabla 2.2: Tiempos de retención de los productos naturales de Verongia aerophoba que se separaron e identificaron por HPLC. Compuesto Tiempo de retención (min) ácido veróngico (10)1.8 dienona (11)4.8 aeroplysinina-1 (13)6.4 verongiolido (14)8.9 fistularina-1 (18)11.9 11-epi-fistularina-3 (15) 13.3 Una vez extraídas y analizadas las muestras, la biomasa de esponja se secó en una estufa a 110Cdurante8-12horas,paraposteriormenteobtenerelpeso seco de cada muestra. 71 Análisis de datos Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el programa R. La supervivencia se calculó como el porcentaje de los explantes que permanecían vivos en relación al número de fragmentos iniciales. Se comprobó la normalidad mediante el test de Shapiro-Wilk y no se consiguió una distribución normal con ningún tipo de transformación (logarítmica o arcoseno), por consiguiente, para el análisis estadístico de la supervivencia se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de una prueba post-hoc de Dunn. Para analizar el crecimiento, los datos de área proyectada y las tasas de crecimiento se transformaron logarítmicamente para cumplir con los requisitos de ANOVA [Zar, 1999]. La normalidad se comprobó mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y de Kolmogorov-Smirnov. Utilizando un análisis ANOVA de medidas repetidas se compararon los datos de crecimiento entre fechas y entre grupos de explantes (agrupados según procedieran de la misma esponja madre). Además, a los datos de área y tasas de crecimiento sin transformar también se les aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de una prueba post-hoc de Dunn. Las variaciones en las concentraciones de metabolitos y del índice de bioconversión entre fechas, grupos de explantes o tratamiento (esponja entera o triturada) se examinaron mediante un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor. Siempre que fuese necesario, los datos se transformaban logarítmicamente para cumplir con los requisitos de esta prueba paramétrica y la normalidad se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. 2.3.2. Resultados y discusión La supervivencia de los explantes se vio afectada principalmente por los temporales que dañaron el cultivo durante los meses de invierno y primavera, durante los cuales algunos explantees se desprendieron de la malla. A partir de los meses de verano la supervivencia se mantuvo constante, con una supervivencia promedio del 72 %(Figura 2.5). Se realizó una prueba de Kruskal-Wallis para determinar si la supervivencia entre los diferentes grupos de explantes variaba. Los resultados demostraron que hubo diferencias significativas entre grupos (H(4) = 14.135,p<0.01). Una prueba post-hoc de Dunn indicó que los explantes del grupo D se diferenciaban significativamente de los de los grupos AyE.LosexplantesdelgrupoDmantuvieronunasupervivenciadel100% durante todo el periodo de cultivo, mientras que un 40%de los explantes de los grupos A y E se hubieron desprendido de la malla ya desde el segundo muestreo (enero 2010) y permanecieron con esta tasa de supervivencia (60%)duranteel resto del experimento. Las mediciones de área proyectada se iniciaron una semana después de iniciado el cultivo (21/11/2009). Pasado este periodo de tiempo los explantes ya mostraban nuevo pinacodermo, en algunos casos incluso por encima de la malla de cultivo. En los 4 primeros meses (otoño-invierno) apenas se apreció crecimiento en términos de área proyectada, solamente se observó que las heridas se habían curado completamente y seguía formándose nuevo tejido envolviendo la malla. A principios de verano (26/06/2010) empezaron a crearse ramificaciones delgadas, que fueron creciendo durante toda la estación hasta mediados de septiembre. En el último muestreo (02/10/10) se observó que se habían perdido 72 Figura 2.5: Supervivencia de los explantes de Verongia aerophoba durante el cultivo in situ.Lasbarrasdeerrorrepresentanlavariación(errorestándar)en la supervivencia entre los diferentes grupos de explantes. algunas de estas ramificaciones, probablemente debido a un temporal acaecido afinalesdeseptiembre(Figura2.6). Figura 2.6: Ejemplo del crecimiento de un explante de Verongia aerophoba durante todo el periodo de cultivo in situ. Utilizando el análisis de la varianza (ANOVA) para comparar las áreas de los explantes entre fechas y entre grupos (agrupados según provinieran de la misma esponja madre), se observaron diferencias significativas tanto entre fechas (F5,112 =9.017,p<0.001)comoentregruposdeexplantes(F4,113 = 14.15,p< 0.001). Estas diferencias entre fechas fueron significativas al comparar las áreas de los meses de septiembre y octubre (p<0.001)conlasdelrestodelperiodo de cultivo, y además los explantes del grupo E fueron significativamente más grandes durante todo el periodo de cultivo (p<0.01)(Tabla2.3,Figuras2.7a, 2.8a). En lo que se refiere a las tasas de crecimiento, mediante la prueba ANOVA de medidas repetidas se observaron diferencias entre fechas con un bajo nivel de significación (F4,88 =2.139,p =0.083), y no se encontraron diferencias significativas entre grupos de explantes (F4,88 =0.750,p=0.561). La prueba tde Student para muestras apareadas mostró que las diferencias eran significativas cuando se comparaban las tasas de crecimiento de invierno con las de primavera 73 Tabla 2.3: Áreas proyectadas (en cm2)delosexplantesdelcultivoin situ, desglosadas por fechas y grupos de explante. Los valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar. Grupo 21/11/09a17/01/10a20/03/10a26/06/10a12/09/10b02/10/10b Ac13.98 12.26 11.38 18.65 28.42 24.43 (5.11) (1.10) (1.09) (4.58) (10.07) (7.82) Bd11.83 11.50 11.15 11.97 17.23 14.67 (2.14) (1.77) (1.55) (0.80) (1.56) (3.87) Cc14.90 14.92 14.54 16.02 18.10 20.41 (3.68) (2.45) (1.16) (2.32) (4.08) (4.17) Dc,e 16.12 17.98 16.56 19.80 22.53 23.89 (2.37) (4.12) (3.37) (3.48) (5.00) (6.59) Ee21.39 18.43 19.25 24.60 25.26 28.20 (4.26) (4.83) (4.78) (6.92) (5.36) (1.30) a,b,c,d,e Letras diferentes entre fechas o grupos de explantes indican diferencias estadísticamente significativas. (p=0.05)yverano(p<0.01). Estas afirmaciones se corroboraron realizando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis a las tasas de crecimiento sin transformar, seguidas del test post-hoc de Dunn. La máxima tasa mensual de crecimiento registrada en un explante durante todo el experimento fue un 45.3%mes1,ylamínimaun48 % mes1(es decir, una disminución en tamaño) (Figura 2.7b). Estos valores se transformaron en tasas diarias asumiendo crecimiento lineal entre muestreos, para poder comparar con la literatura [Schippers et al., 2012] y se obtuvieron valores máximos y mínimos de 0.0151 día1y0.0160 día1,respectivamente.Además de estos valores extremos, cabe remarcar que estas tasas diarias promediadas por estaciones fueron máximas en primavera y verano (con valores de 0.0027 día1y0.0030día 1,respectivamente)ymínimaseninvierno(0.0004 día1) (Tabla2.4,Figura2.8b).Salvopocasexcepciones[BattershillandPage,1996; Carballo et al., 2010] , la mayoría de las tasas de crecimiento de esponjas cultivadas se encuentran en el mismo orden de magnitud que las que se han calculado para nuestro experimento. Muchos autores calculan las tasas de crecimiento como el incremento en tamaño entre el inicio y el final del experimento [Schippers et al., 2012], y las presentan en porcentajes por año o en porcentajes indicando el periodo de tiempo que duró el cultivo. Por ello, también se calcularon de esta manera las tasas de crecimiento de nuestro cultivo, ofreciendo valores promedio del 59.3%año1(intervalo de confianza al 95%:33.4–85.1%año1) odel51.1%(intervalo de confianza al 95%:28.8–73.4%)sisoloconsideramos el periodo de muestreo (10.5 meses). Existen pocos datos sobre el crecimiento de Verongia aerophoba y, según nuestro conocimiento, hasta momento no hay ningún dato de esta esponja cultivada en mar abierto. Sin embargo, en 1979 Wilkinson y Vacelet publicaron un trabajo sobre los efectos de transplantar seis especies de esponjas marinas (entre ellas V. aerophoba)adiferentescondiciones de luz y corriente, y encontraron tasas medias de crecimiento del 80%durante 74 (a) (b) Figura 2.7: Diagrama de cajas (a) del área proyectada (cm2)y(b)delastasas de crecimiento (mes1)delosexplantesduranteelperiododecultivo.Enestos diagramas, la caja está delimitada por los cuartiles Q1yQ 3,ylalíneainterior señala la mediana. Los bigotes indican los límites superior e inferior y los valores atípicos se señalan con círculos pequeños. las 47 semanas que duró el experimento [Wilkinson and Vacelet, 1979], valor que se encontraría dentro del rango de nuestros resultados. Tabla 2.4: Tasas de crecimiento (día1)delosexplantesdelcultivoin situ, desglosadas por fechas. Los valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar. Intervalo de muestreo Media (SD) Intervalo de confianza 95% (día1)LímiteinferiorLímitesuperior 21/11/09 – 17/01/10 0,0001 (0,0035) -0,0014 0,0017 17/01/10 – 20/03/10 -0,0004 (0,0020) -0,0013 0,0005 20/03/10 – 26/06/10 0,0027 (0,0035) 0,0011 0,0043 26/06/10 – 12/09/10 0,0030 (0,0030) 0,0016 0,0044 12/09/10 – 02/10/10 0,0010 (0,0083) -0,0029 0,0048 Los resultados del análisis ANOVA de las concentraciones (expresadas en % de compuesto en el extracto) de los metabolitos identificados por HPLC comparadas según tratamiento (esponja entera o triturada) se muestran en la Tabla 2.5. Se observan diferencias significativas entre tratamientos para aeroplysinina-1 (13), verongiolido (14), fistularina-1 (18)y,conunmenorniveldesignificación, 11-epi-fistularina-3 (15). No se encontraron diferencias significativas entre tratamientos para el ácido veróngico (10)niparaladienona(11), sin embargo, únicamente en estos dos últimos compuestos sí que se encontraron diferencias entre fechas, mostrando concentraciones más bajas en las muestras de enero respecto a las del resto del año. El análisis ANOVA del índice de bioconversión, calculado como la relación molar entre el verongiolido (14)yla11-epi-fistularina-3 (15), reveló diferencias significativas según el tratamiento (F1,24 =4.371,p<0.05). Los valores medios 75 (a) (b) Figura 2.8: (a) Área proyectada (cm2)y(b)tasasdecrecimiento(mes 1)de los explantes durante el periodo de cultivo. Las barras de error representan el error estándar. Tabla 2.5: Concentraciones medias ( %)delosmetabolitosidentificadosen los explantes del cultivo in situ de V. aerophoba.Losvaloresentreparéntesis corresponden a la desviación estándar. También se incluyen el número nde muestras analizadas, el estadístico F y el p-valor Metabolito Tratamiento Media (SD) nF p-valor ácido veróngico (10)Entera 0.71(0.65)150.9840.331 Triturada 0.46 (0.54) 11 dienona (11)Entera4.21(3.09)150.2570.617 Triturada 3.63 (2.61) 11 aeroplysinina-1 (13)Entera 20.07(4.49)1544.3<0.001 Triturada 8.42 (4.29) 11 verongiolido (14)Entera1.41(0.66)157.526<0.05 Triturada 2.10 (0.60) 11 fistularina-1 (18)Entera4.70(2.79)1510.9<0.01 Triturada 1.63 (1.49) 11 11-epi-fistularina-3 (15)Entera 40.59(6.84)153.4720.075 Triturada 46.12 (8.28) 11 (y sus desviaciones estándar) de estos índices para cada uno de los tratamientos fueron de 0.088 (0.034) y 0.119 (0.040) para las esponjas enteras y trituradas, respectivamente, por tanto una mayor proporción de verongiolido respecto a 11epi-fistularina-3 en las esponjas trituradas. Esto indica que, después de dañar el tejido de la esponja, ha habido una bioconversión del metabolito de reserva 11-epi-fistularina-3, liberando verongiolido. Sin embargo, observando los valores obtenidos para las concentraciones de fistularina-1 (18)enmuestrasdeesponjas trituradas se puede apreciar que este valor es menor que el de las esponjas 76 enteras, lo que sugiere que fistularina-1 (18)tambiéndebesufriralgúntipode biotransformación enzimática cuando el tejido de la esponja es dañado. En el caso de aeroplysinina-1 (13), su concentración también disminuye claramente cuando la esponja es triturada, lo cual podría indicar que durante la incubación de la esponja dañada ha continuado la transformación de aeroplysinina-1 (13) hacia la dienona (11)ydeéstaalácidoveróngico(10), sin embargo, no se observa tal correlación entre la concentración de aeroplysinina-1 y la suma de las concentraciones de la dienona y el ácido veróngico. Una posible explicación sería que durante el largo periodo de incubación (12 h) de la esponja triturada en agua de mar se formaran radicales semiquinona no identificados por HPLC. Se sabe que los radicales semiquinona son muy tóxicos y que pueden ser los responsables, o al menos en parte, de la actividad citotóxica de aeroplysinina-1 (13)yladienona(11)[Koulmanetal.,1996]. Se puede concluir que el cultivo ex situ de V. aerophoba,utilizandoelsistema de panel de malla descrito en este trabajo, puede proporcionar biomasa de esponja para la extracción de productos químicos con interés en la industria farmacéutica. Sin embargo, antes de empezar un cultivo a escala comercial, sería aconsejable evaluar la productividad en diferentes condiciones (profundidad, corrientes, alimento –por ejemplo, en los alrededores de granjas de peces–, etc. ..) yconotrosmétodosdecultivo(ensartadasencuerdashorizontalesoverticales, en tubos de malla, etc...). Aunque se han encontrado evidencias de que después de dañar el tejido de la esponja se produce una transformación de los metabolitos de reserva hacia los alcaloides monocíclicos más activos, también hay que decir que es necesario profundizar más en el conocimiento de la bioconversión de los alcaloides isoxazolícos, con la intención de optimizar el rendimiento en los productos con mayor actividad biológica. Bibliografía Aydogmus, Z., Ersoy, N., and Imre, S. Chemical investigation of the sponge Verongia aerophoba.Turk. J. Chem.,23(3):339–344,1999. Battershill, C. and Page, M. Sponge aquaculture for drug production. Aquaculture update,16:5–6,1996. Becerro, M., Turon, X., Uriz, M., and Templado, J. Can a sponge feeder be aherbivore?Tylodina perversa (Gastropoda) feeding on Aplysina aerophoba (Demospongiae). Biological Journal of the Linnean Society,78(4),2003. Belarbi, E. H., Domínguez, M., Cerón, G. M., Contreras, G. A., García, C. F., and Molina, G. E. 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Posteriormente, se recolectaron en el mismo lugar en julio de 2006, febrero ymarzode2007.Parasurecolecciónseusaronequiposdebuceoautónomo. Después de fijarlas en formol 4%, se guardaron en etanol 70%. Se guardó un espécimen de referencia (Por.11) en la Colección de Zoología ZCM de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 3.2.2. Preparación de las espículas La identificación de la esponja se basa fundamentalmente en el examen de los caracteres esqueléticos [Cristobo et al., 1992]. Para ello fue necesario preparar las espículas de manera que pudieran ser observadas al microscopio, realizando una digestión con ácido nítrico según se describe en van Soest et al. [2001]. Brevemente, pequeños fragmentos de diferentes individuos se dejaron secar y se introdujeron en tubos de vidrio con unas gotas de ácido nítrico concentrado, que se pusieron a calentar suavemente con un mechero Bunsen. Una vez la materia orgánica se hubo digerido, la muestra se diluyó con agua destilada (aproximadamente 10 ml) y se centrifugó 5 minutos a 3000 rpm. Seguidamente se eliminó el sobrenadante y se repitió el proceso 5 veces. Finalmente, una parte de la muestra se montó en bálsamo de Canadá para su observación al microscopio óptico y la otra parte se filtró sobre un filtro de policarbonato negro con un diámetro de poro de 0.2 µm (Millipore, GTBP02500) aplicando vacío suave (<200 mm Hg) para su observación al microscopio electrónico de barrido (MEB). 3.2.3. Observación por microscopía El microscopio óptico usado fue un Leica DM 2500 equipado con una cámara Leica DFC420C y con objetivos de 63x y 100x (aceite), además del ocular 10x. Para su observación en el MEB, las muestras se recubrieron en oro y se visualizaron en un microscopio electrónico de barrido HITACHI S-3400N. 3.3. Resultados y discusión En las costas españolas se habían registrado 6 especies de este género (Tabla 3.1) [Cristobo et al., 1999] de las cuales tan solo una, Myxilla rosacea,se había citado de las costas canarias [Cruz, 2002]. Este género se caracteriza por poseer un esqueleto coanosómico formado por un retículo de acantostilos o estilos lisos sin espículas accesorias y con espículas ectosómicas con ápices espinosos. Las microscleras incluyen quelas ancoradas con 3 dientes [Hooper et al., 2002]. En general, las especies de este género se caracterizan por su apariencia masiva (hasta 20 cm), color rojo, anaranjado y de preferencias ecológicas esciáfilas. 84 Tabla 3.1: Distribución de las especies de esponjas del género Myxilla en aguas de España y Portugal. Área Especies Fuente consultada Canarias M. rosacea Cruz [2002] Selvagens M. rosacea Lopes [1995] Gorringe M. rosacea Xavier and van Soest [2007] Gibraltar M. rosacea Carballo [1994] M. iotrochotina M. tarifensis Alborán M. rosacea Maldonado [1993] Azores M. rosacea Boury-Esnault and Lopes [1985] M. macrosigma M. prouhoi Arrábida M. rosacea Naveiro [2002] M. macrosigma Portugal M. rosacea Lopes [1989] Baleares M. rosacea Bibiloni [1990] Galicia M. rosacea Cristobo et al. [1999] M. iotrochotina M. macrosigma M. incrustans M. fimbriata Cantábrico M. rosacea Preciado [2002] M. iotrochotina M. macrosigma Con respecto a sus elementos esqueléticos posee acantostilos de una sola talla, estrongilos o tornotes, isoquelas y sigmas. Los ejemplares de Myxilla sp. se encontraron en el interior de tubos de hormigón (aprox. 1.2 m de diámetro) que se habrían roto/descolocado a la hora de instalar un emisario submarino, tanto en el techo como en la parte inferior del tubo, los del techo con forma laminar (5-8 cm de alto, 10-15 cm de ancho y1-2cmdegrosor)mientrasquelosdelsueloteníanformamasiva(5-8cm altura, 8-10 cm ancho, 4-6 cm grosor). En las siguientes recogidas de muestras, se encontraron ejemplares de la misma esponja (forma masiva, algunos ejemplares de hasta 20 cm) en zonas a la sombra del tubo de hormigón, por lo que se podría pensar que se trata de una especie con preferencias esciáfilas. El entorno en el que se encuentran estos tubos es un fondo es de arena de grano medio-grueso, llano con algunas rocas bajas. En la arena y en zonas más expuestas a la luz se encontraban abundantes ejemplares de la esponja Verongia aerophoba así como algunos del género lrcinia.Enlasrocasy,principalmente, en el exterior del tubo de hormigón, esponjas del género Phorbas yBatzella. La forma es masiva, en vivo presentan una gama de colores que va del 85 naranja-amarillento a diferentes tonos de rojo (??); en alcohol es de color amarillobeige. Tiene algunos ósculos circulares dispersos en su superficie. La apariencia del coanosoma es cavernosa. Segregan gran cantidad de mucus e incorporan grandes cantidades de arena. Figura 3.1: Habitus de algunos de los ejemplares recolectados de Myxilla sp. Su esqueleto se caracteriza por la presencia de acantostilos con pocas espinas (longitud: 128.4±28.1 µm, grosor: 3.44±0.72 µm)(Figura 3.2), tornotes mucronados (longitud: 156.7±28.1 µm, grosor: 2.40±0.44 µm) (Figura 3.3), isoquelas arqueadas con tres dientes (longitud: 13.4±1.4 µm) (Figura 3.4) y sigmas (longitud: 26.1±4.2 µm) (Figura 3.5). La especie más próxima es Myxilla tarifensis de la que se diferencia claramente por la morfología de las isoquelas [Carballo and García-Gómez, 1996]. Ninguna de las especies descritas del Atlántico noreste se corresponde con la nueva especie de Canarias, por lo que para su identificación definitiva será necesario un estudio en profundidad de su disposición esquelética y la aplicación de técnicas moleculares. Agradecimientos Quiero agradecer a Ferran Hierro del servicio de microscopía electrónica de la Universitat de les Illes Balears por las imágenes tomadas en el MEB. También agradezco a Javier Cristobo, Pilar Ríos, Iosune Uriz y Tomás Cruz por sus consejos y ayuda en la identificación de esta esponja. 86 Figura 3.2: Megascleras de Myxilla sp.: tornotes (izquierda) y acantostilos (derecha). 87 (a) (b) Figura 3.3: (a) Detalle de los extremos de los acantostilos. (b) Detalle del extremo de un tornote mucronado (izquierda) y de un acantostilo con las espinas romas (derecha). Figura 3.4: Microscleras de Myxilla sp.: isoquelas arqueadas. 88 Figura 3.5: Microscleras de Myxilla sp.: sigmas. 89 Bibliografía Bibiloni, M. Fauna de Esponjas de las Islas Baleares. Variación cualitativa y cuantitativa de la población de esponjas en un gradiente batimétrico. comparación Baleares-Costa Catalana.PhDthesis,UniversitatdeBarcelona,1990. Boury-Esnault, N. and Lopes, M. T. Les Démosponges littorales de l’Archipel des Açores. In Annales de l’Institut océanographique,volume61,pages149– 225. Institut océanographique, 1985. Carballo, J. 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No hay muchos trabajos sobre productos naturales de este género, sin embargo, en uno de ellos se aisló un polisacárido sulfatado de un extracto acuoso de Myxilla rosacea,que mostró actividad anti-VIH y al que llamaron rosacelosa [Cimino et al., 2001]. Mucho tiempo antes, Kochetkov et al. [1967] aislaron glucolípidos de Myxilla incrustans,cuyasestructurasmolecularesconteníanesfingosina,fitoesfingosina, ácidos grasos y fósforo. En base a esto, decidimos realizar un estudio químico de un extracto etanólico de la esponja Myxilla sp. de las Islas Canarias, aportando nuevos datos espectroscópicos y cromatográficos de los metabolitos aislados. 4.2. Aislamiento, purificación e identificación de los esteroides de Myxilla sp. Las fracciones que contuvieron los esteroides se eluyeron con una mezcla de Hexano/AcOEt 80:20, se recromatografiaron repetidamente hasta conseguir la purificación y se identificaron los componentes como estigmasta-5-en-3- ol (-sitosterol) (21,75%), estigmasta-5,23-dien-3-ol (22,16%), estigmasta5,24(25)-dien-3-ol (23,2%)yestigmasta-5,25-dien-3-ol (24,7%). La mezcla de estigmasteroles tiene el aspecto de un sólido blanco y es homogéneo por CCF. Tras cristalización a partir de MeOH se determinó el punto de fusión de la mezcla de estigmasteroles resultando 277-278C. También se midió la rotación óptica, resultando [↵]25C D=-15.2 o(c 0.2; CHCl3). Obsérvese que ambos valores coinci93 O OH HN O CH2 P O OH HO C13H27 H C25H46NO2 m/z 392.3510 9.06% - PO4H3 C25H49NO6P m/z 490.3287 4.55% - H2O C25H47NO5P m/z 472.3176 15.66% C24H47NO6P m/z 476.3143 2.53% C23H45NO6P m/z 462.2969 8.08% - PO4H3 - CH2 - CH2 C23H42NO2 m/z 364.3201 14.88% Figura 4.4: Esquema de fragmentaciones observadas en el espectro de masas de alta resolución de la mezcla de ceramidas-1-fosfato aislada de Myxilla sp. que se muestra en la Figura 4.5, donde se ven las transiciones de cada una de las ceramidas. Se trabajó utilizando sólo el primer cuadrupolo, debido a que no se obtuvo ningún “ión hijo” estable al realizar la fragmentación de los “iones padres”. En el espectro de masas, obtenido en un espectrómetro de masas normal, y en consistencia con lo descrito antes por infusión directa en un aparato HPLCMS, se observan los iones moleculares de todos los componentes de la serie representada por la fórmula de la Figura 4.3, desde n=11 (ceramida-1P-C16) hasta n=19 (ceramida-1P-C24). Las esponjas se han revelado como una rica fuente de productos naturales incluyendo la esfingosina-1-fosfato a partir de Myxilla incrustans [Kochetkov et al., 1967]. Aparentemente, las ceramidas-1-fosfato están presentes en los tejidos del animal a niveles comparables a los de la esfingosina-1-fosfato. Según se describe en la bibliografía [Gómez-Muñoz, 2006], las ceramidas y las ceramidas-1-fosfato tienen funciones antagónicas, y es necesario alcanzar un balance correcto entre las concentraciones de ambos metabolitos para que se de la homeóstasis de las células y el tejido. La mezcla de ceramidas-1-fosfato, al ser esfingolípidos análogos al ácido fosfatídico, son metabolitos implicados en el “ciclo de la esfingomielina”. Se forman a partir de las ceramidas por la acción de una ceramida-kinasa específica, la cual debe de estar relacionada con 100 Figura 4.5: Iones moleculares de la mezcla ceramidas-1P aislada de Myxilla sp. detectados por HPLC-MS (infusión directa). la esfingosina kinasa que sintetiza la esfingosina-1-fosfato, pero es diferente de la misma. 101 Tabla 4.3: Iones moleculares de la mezcla de ceramidas-1P aislada de Myxilla sp. detectados en el espectro de masas. Sus intensidades relativas nos dan el porcentaje de cada componente en la mezcla. Ion observado Fórmula Concentración Ceramida (%w/w) (Valor de nen la Figura 4.3) 616.57 (M1+)C 34H67NO6P 6.50 Cer1P-C16 (n=11) 617.58 (M+)C 34H68NO6P 630.58 (M1+)C 35H69NO6P 6.62 Cer1P-C17 (n=12) 631.59 (M+)C 35H70NO6P 644.60 (M1+)C 36H71NO6P 32.82 Cer1P-C18 (n=13) 645.60 (M+)C 36H72NO6P 658.61 (M1+)C 37H73NO6P 9.85 Cer1P-C19 (n=14) 659.62 (M+)C 37H74NO6P 672.63 (M1+)C 38H75NO6P 28.45 Cer1P-C20 (n=15) 673.63 (M+)C 38H76NO6P 686.64 (M1+)C 39H77NO6P 8.75 Cer1P-C21 (n=16) 687.65 (M+)C 39H78NO6P 700.56 (M1+)C 40H79NO6P 3.28 Cer1P-C22 (n=17) 701.57 (M+)C 40H80NO6P 714.58 (M1+)C 41H81NO6P 2.19 Cer1P-C23 (n=18) 715.59 (M+)C 41H82NO6P 728.60 (M1+)C 42H83NO6P 1.53 Cer1P-C24 (n=19) 729.60 (M+)C 42H84NO6P Experimental: Material y métodos. Reactivos Se trabajó con una disolución patrón de 1000 mgl−1,disolviendoelextracto de ceramidas en tetrahidrofurano (Fischer Chemical). Ésta fue guardada en viales ámbar a -20C. La disolución patrón se disolvió en acetonitrilo (Panreac Química, Barcelona, España) diariamente para ser introducida por infusión directa en el equipo de espectrometría de masas. Todos los disolventes usados como fases móviles (agua, acetonitrilo y ácido fórmico) fueron también de la marca Panreac Química (Barcelona, España). Instrumentación Para la determinación de la masas de las ceramidas de estudio se utilizó un equipo ACQUITY UPLC c de Waters (Madrid, España) equipado con un autosampler modelo 2777, con una jeringa de 25 µlyunabandejaparavialesde2 ml, una bomba binaria ACQUITY para impulsar las fases móviles y un detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo (TQD) con ionización de electrospray (ESI). Todos los componentes Waters fueron controlados mediante el software MassLynx Mass Spectrometry. Los parámetros de la ionización de electrospray fueron: 102 Figura 4.6: Cromatograma de la mezcla de ceramidas. Voltaje de capilar: 4.0 kV en modo positivo Voltaje de cono: 80 V Temperatura de la fuente: 120C Temperatura de desolvatación: 450C Flujo del gas de desolvatación: 1000 lh−1 Estos parámetros fueron optimizados mediante infusión directa de la mezcla de ceramidas a una concentración de 1 mgl−1aunflujode10µlmin−1. Condiciones cromatográficas Para la separación cromatográfica se utilizó una columna analítica ACQUITY UHPLC BEH C18 de Waters (Madrid, España) de 50 mm ⇥2.1 mm con un tamaño de partícula de 1.7 µm, la cual operó a una temperatura de 30C. Se trabajó en modo isocrático 95:5 utilizando agua con un 5 mmde ácido fórmico (fase A) y acetonitrilo (fase B). El volumen de muestra inyectado fue de 10 µl. 103 4.5. Aislamiento, purificación e identificación de dos bases pirimidínicas de Myxilla sp. Las fracciones más polares el extracto contuvieron las bases pirimidinicas timina (29)yuracilo(30). Ambas bases aparecen mezcladas en forma de un sólido blanco que cristaliza espontáneamente a partir de n-hexano/ acetato de etilo. Por integración del espectro de 1H-RMN de la mezcla se dedujo la composición de la misma: Curacilo Ctimina =1.8 Tras sucesivas cromatografías en columna de gel de sílice a baja presión se consiguieron cristales de la timina (29)pura.Esteproductomostrólosdatos espectroscópicos que se muestran en las tablas Tabla 4.4 y Tabla 4.5 y, por diferencia a partir del espectro de la mezcla deducimos los espectros del uracilo (30), que se presentan también en las mencionadas tablas Tabla 4.4 y Tabla 4.5. 55 66 N H 11 22 NH 33 44 55 66 N H 11 22 NH 33 44 H3C 77 O O O O 29 30 Estructuras de la Timina (29)yUracilo(30). Tabla 4.4: Desplazamientos de RMN de protón (,ppm)delasbasespirimidínicas (29 y30)enDMSO–d 6a300MHz. Posición Timina (29)Uracilo(30) (,ppm) (,ppm) 110.63(1H,sancho) 11.00(1H,sancho) 2 311.02(1H,sancho) 11.00(1H,sancho) 4 55.46(1H,d,J=7.5Hz) 67.26(1H,sancho) 7.40(1H,d,J=7.5Hz) 71.73(3H,d,J=0.6Hz) En estudios anteriores se aislaron estas bases de extractos de esponjas marinas de Indonesia [Rao et al., 2003], sin embargo, esta es la primera vez que se describen en el género Myxilla. 104 Tabla 4.5: Desplazamientos de RMN de carbono (,ppm)delasbasespirimidínicas (29 y30)enDMSO–d 6a75MHz. Posición Timina (29)Uracilo(30) (,ppm) (,ppm) 1 2165.2 164.7 3 4151.7 151.7 5107.9 100.4 6138.0 142.5 712.0 Bibliografía Cimino, P., Bifulco, G., Casapullo, A., Bruno, I., Gomez-Paloma, L., and Riccio, R. Isolation and NMR characterization of rosacelose, a novel sulfated polysaccharide from the sponge Mixylla rosacea. Carbohydrate research,334 (1):39–47, 2001. Dressler, K. and Kolesnick, R. Ceramide 1-phosphate, a novel phospholipid in human leukemia (HL-60) cells. 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En Canarias, la familia Irciniidae está representada por las especies Ircinia dendroides (Schmidt, 1862), Ircinia variabilis (Schmidt, 1862), Ircinia oros (Schmidt, 1864), Sarcotragus foetidus (Schmidt, 1862) y Sarcotragus spinosulus (Schmidt, 1862) [van Soest et al., 2015]. En cuanto a su quimiotaxonomía, esta familia se caracteriza por contener sesterterpenos con grupos terminales furánicos o de ácido tetrónico. Los sesterterpenos furánicos tienen diversas actividades biológicas, como antiinflamatoria, citotóxica, antimicrobiana y fagorepelente [Liu et al., 2007]. El estudio de los sesterterpenos en esponjas de las Islas Canarias se reduce alostrabajosdelgrupodeAntonioGonzálezaprincipiosdeladécadade 1980, en los que describen el aislamiento de diferentes furanoterpenos de tres esponjas del género Ircinia no identificadas [González et al., 1982], de Ircinia muscarum (aceptado como Sarcotragus foetidus [González et al., 1983a], y de Ircinia dendroides [González et al., 1983b]. En este trabajo se pretende continuar investigando en los productos naturales de esta familia de esponjas, concretamente en Ircinia variabilis. 5.2. Resultados Estudio de los sesterterpenos de Ircinia variabilis Por maceración de trozos de la esponja marina Ircinia variabilis.conacetona seguida de filtración y concentración en rotavapor se obtuvo un extracto bruto de la misma como un jarabe oscuro. Por cromatografía en columna eluyendo con 107 n-hexano/AcOEt con cantidades incrementales del último se obtuvieron sucesivas fracciones que se monitorizaron por espectroscopía de resonancia magnética nuclear buscando los típicos protones furánicos de los sesterterpenos a 7.32, 7.19 y 6.25 [Faulkner, 1973; Rothberg and Shubiak, 1975]. Aislamiento e identificación de la mezcla de (8Z,13E,20Z)- strobilinina (31) y (8E,13Z,20Z)-strobilinina (32). Las fracciones que contuvieron sesterterpenos se recromatografiaron por cromatografía en columna de gel de sílice hasta llegar a una fracción homogenea por CCF. Su análisis espectroscópico permitió identificarla como una mezcla previamente descrita en la bibliografía, las strobilinias 31 (Figura 5.1) y 32 (Figura 5.2) . Ambas moléculas resultaron ser los estereoisómeros (8Z,13E,18R,20Z)- strobilinina (31)y(8E,13Z,18R,20Z)-strobilinina (32)segúnlaelucidaciónestructural que se discute a continuación. 2 11 O4 3 6 7 8 1010 1111 1212 1313 9 1515 1414 1616 1717 1818 (R) 2020 2121 O2424 2323 2222 2525 O H 1919 (E) (Z) 31 33 Figura 5.1: Estructura de (8Z,13E,18R,20Z)-strobilinina (31)ysuacetato (33). 2 11 O4 3 6 7 8 010 1111 1212 1313 9 1515 1414 1616 1717 (R) 18 2020 2121 O2424 2323 2222 2525 O H 1919 (Z) (E) 32 34 Figura 5.2: Estructura de (8E,13Z,18R,20Z)-strobilinina (32)ysuacetato (34). 108 En la Tabla 5.1 se describen los espectros de RMN de nuestro producto. Obsérvese la duplicación de las señales de los carbonos 8, (134.5/135.1), 10 (123.5/124.5), 13 (134.9/135.7) y 15 (123.9/125.1) lo que nos informa que la sustancia es una mezcla de los estereoisómeros (8Z,13E)y(8E,13Z), en concordancia con lo previamente descrito en la bibliografía [Davis and Capon, 1994]. También cabe remarcar que las asignaciones han sido apoyadas por los experimentos DEPT-135, COSY-90, HSQC y HMBC. Así, podemos destacar que en el espectro DEPT se observan siete metinos, siete metilenos y cuatro metilos, y en el espectro COSY se observan las correlaciones H-18!H-19 y H18!H-20 que delatan la unidad estructural de ácido tetrónico. Las strobilininas mezcladas dan un espectro de masas con el ión molecular a m/z 398.2457 que corresponde a la fórmula molecular C25H34O4y, además, los fragmentos previstos para un esqueleto carbonado de strobilinina (Figura 5.3). Nótese que este esquema de fragmentaciones viene apoyado por las fórmulas moleculares de los fragmentos, las cuales fueron determinadas por espectrometría de masas de alta resolución. Así, por ejemplo, al fragmento a m/z 163.1118 viene asociada la fórmula C11H15O, al fragmento a m/z 153.0548 le corresponde la fórmula C8H9O3yalfragmentoam/z 109.0649, la fórmula C7H9O, todos los cuales demuestran la presencia de un anillo furánico en el comienzo de la estructura y un grupo de ácido tetrónico al fin de la misma. OCH3CH3CH3O CH3 O OH 81.03 (65.5%) 95.04 (31.1%) 109.07 (23.4%) 163.10 (10.2%) 177.1 (4.5%) 181.09 (6.2%) 231.17 (3.0%) 167.05 (10.9%) 153.05 (30.2%) Figura 5.3: Fragmentaciones observadas en el espectro de masas de strobilinina ⇥mezcla de estereoisómeros 8Z,13E+8E,13Z(31+32)⇤. Los sesterterpenos que comienzan con un anillo furánico y terminan con un grupo de ácido tetrónico son metabolitos característicos de un gran número de esponjas marinas. El primero en ser descrito [Faulkner, 1973] de esta familia de compuestos se llamó variabilina 35.Variantesestructuralesdeéstafueron posteriormente descritas, y entre ellas, se encuentra la strobilinina [Rothberg and Shubiak, 1975], la cual, aunque no se separó cromatográficamente de su acompañante la variabilina 35,fuesinembargocaracterizadaporanálisisespectroscópico y degradación química. Mientras la variabilina 35 posee dobles enlaces en las posiciones 7 y 12, la strobilinina los posee en 8 y 13 (Figura 5.1 y Figura 5.2).Laestereoquímicadeestosdoblesenlacesen8y13nofueresuelta hasta 1994 [Davis and Capon, 1994], año en el que se esclarece que strobilinina en realidad es una mezcla de los estereoisómeros (8Z,13E,20Z)-strobilinina (31) y(8E,13Z,20Z)-strobilinina (32), justo los aislados por nosotros. 109 globan algunas de las cianobacterias filamentosas más comunes en las costas de Canarias, sin embargo, a pesar de ser un de los grupos más diverso y rico en especies también es uno de los menos caracterizados [Perkerson III et al., 2011]. Se ha demostrado que el grupo Oscillatoriales sensu classicus no es un grupo monofilético [Casamatta et al., 2005] y Komárek and Anagnostidis [2005] separaron este grupo en dos subclases (Pseudanabaenales y Oscillatoriales). Dentro de las Pseudanabaenales, el género Leptolyngbya es el más claramente polifilético, ya que contiene muchos clades y del que recientemente han surgido nuevos géneros. Aunque se sabía que algunos Phormidium (Oscillatoriales) estaban estrechamente relacionados con Pseudanabaenales [Komárek and Anagnostidis, 2005], mediante el uso de técnicas moleculares se han obtenido evidencias para transferir algunas especies de Phormidium aunnuevogéneroPhormidesmis dentro de Pseudanabaenales [Komárek et al., 2009]. En este capítulo se pretende hacer una primera aproximación a la caracterización de un tapete microbiano productor de escitonemina, utilizando técnicas moleculares y observación al microscopio. 6.2. Material y métodos 6.2.1. Tapetes microbianos Con la intención de extraer escitonemina, a finales de junio de 2011 se recogieron tapetes microbianos de la zona supramareal, durante la marea baja, en unas terrazas escalonadas que refuerzan el muro de contención de la Avenida de Canarias GC-1 (Las Palmas de Gran Canaria, 2805058.5000 N, 1524041.1800 W) (Figura 6.1). Del total de biomasa recogida para la extracción de escitonemina, se separaron 5 muestras para su estudio mediante técnicas moleculares y microscópicas, y se guardaron en etanol a -20Chastaelmomentodelanálisis.De estas 5 muestras, 1 de ellas correspondía a la parte vertical de los escalones (más expuesta a la sequedad), mientras que el resto de muestras se recogió en la parte horizontal de los bancales (continuamente inundada). Las muestras horizontales se nombraron como AVM-H# (# representa un número del 1 al 4) y la muestra vertical se nombró como AVM-V3 (puesto que se recogió cerca de AVM-H3). 6.2.2. Análisis molecular Extracción de ácidos nucleicos La extracción de ácidos nucleicos de cada una de las muestras se realizó mediante un protocolo basado en la técnica del fenol-cloroformo. Brevemente, una pequeña muestra (aproximadamente 100 mg en peso húmedo) de cada uno de los tapetes microbianos se suspendió en 600 µldeuntampóndeextracción (100 mmTris-HCl pH 8.0, 100 mmNa-EDTA pH 8.0) al que se le añadió lisozima para digerir la pared celular y proteinasa K para inactivar las nucleasas. Después de incubar durante 30 minutos a 37C, se añadieron 120 µl de NaCl 5my90µl de una solución al 10% de CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) y la mezcla se incubó durante 10 minutos a 65C. Seguidamente se congeló en nitrógeno líquido para a continuación descongelar en el baño termostático a 65C, proceso que se repitió varias veces. El siguiente paso consistió en la extracción con 800 µldeunamezcladefenol:cloroformo:alcoholisoamílico(25:24:1),ydespuésde 116 (a) (b) Figura 6.1: (a) Terrazas escalonadas en la zona supramareal donde se recogió el tapete microbiano. Nótese la diferencia de colores (y por tanto, de pigmentos) entre la parte superior y la inferior. (b) Detalle de los tapetes recogidos. Obsérvese los tapetes horizontales cubiertos de agua, mientras que los verticales están secos. centrifugar durante 5 minutos a 16200gse recogió la fase superior (acuosa) y se repitió el proceso de extracción fenólica una segunda vez. Para precipitar los ácidos nucleicos, se añadieron 60 µldeacetatosódico3mpH 0.6 junto con 360 µl de isopropanol, y se centrifugó. Eliminando el sobrenadante, el DNA precipitado se limpió con etanol 70%, se centrifugó de nuevo y una vez seco, se resuspendió con 50 µldeaguamQestéril. La concentración y calidad de los ácidos nucleicos extraídos se cuantificó mediante un espectrofotómetro UV/Vis Nanodrop 2000 (Thermo Scientific), y se diluyeron hasta obtener concentraciones de 10 a 20 ngµl−1. Clonación del gen ADNr 16S Para las muestras AVM-H3 y AVM-V3, se realizó una amplificación de los genes 16S del ADN ribosómico (ADNr) de las cianobacterias y de los cloroplastos, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores (primers): el cebador directo (forward) CYA359F (50-GGG GAA TYT TCC GCA ATG GG-30)específicoparacianobacterias[Nübeletal., 1997] y el cebador inverso (reverse)universal1492R(5 0-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-30)quevadirigidoalgen16SdelADNrtantodeprocariotas como de eucariotas [Weisburg et al., 1991]. Las reacciones de PCR contenían: 5µl de tampón de PCR 10X (incluido Mg+2) 5µl de una mezcla de nucleótidos (dNTP) 5µldeunasolución4µgµl−1de albúmina de suero bovino (BSA) 117 2.5 µldelprimer CYA359F a una concentración 10 µm 2.5 µldelprimer 1492R a una concentración 10 µm 1µldeADNaunaconcentraciónentre10y20ngµl−1 1unidad(0.25µl) de Taq-polimerasa (Takara Bio Inc., Japan) 28.75 µldeaguamQestéril La termociclación se realizó en un termociclador MyCycler (Bio-Rad) y el programa consistió en 5 minutos de desnaturalización a 95C, seguidos de 30 ciclos de un minuto a 95C, 1 minuto a 55C, 1 minuto a 72C, y un tiempo de extensión final de 6 minutos a 72C. La reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.25% y tiñiendo con bromuro de etidio. Los productos de PCR se ligaron al vector pCRTM2.1-TOPO R utilizando el TOPO R TA Cloning R Kit (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron 18 colonias de clones en total (11 de la muestra AVM-H3 y7deAVM-V3),delascuales15(9deAVM-H3y6deAVM-V3)contuvieron un fragmento de la longitud esperada (unos 1130 pares de bases, pb, del amplicón más el fragmento de aproximadamente 200 pb del vector) y el resto se descartaron, según se observó después de amplificar cada colonia mediante una PCR utilizando los primers M13F y M13R del vector proporcionados por el fabricante. De cada una de las muestras amplificadas con el fragmento esperado, se realizaron dos reacciones de secuenciación utilizando el kit BigDyeR  Terminator v3.1, una con el primer M13F y la otra con el primer M13R, y se secuenciaron en los Serveis Cientificotècnics de la Universitat de les Illes Balears utilizando un analizador genético 3130 (Applied Biosystems). Cada par de secuencias obtenidas por muestra se solapó para obtener una sola secuencia de unos 1130 pb. Estas secuencias se compararon contra la base de datos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) utilizando el algoritmo blastn,quecomparasecuenciasdenucleótidosyofrece las de mayor grado de similitud, y se seleccionaron y descargaron las secuencias con mayor similitud con las nuestras, tanto de organismos cultivados como de muestras ambientales o no cultivadas. Estas secuencias junto con las nuestras se alinearon con el programa ClustalW integrado en la herramienta de análisis molecular MEGA6. Posteriormente se recortaron los extremos de algunas secuencias para homogeneizar las longitudes del alineamiento, obteniendo así secuencias de 950 a 957 pares de bases. Se calculó una matriz de distancias entre pares de secuencias con el método de máxima verosimilitud compuesta (Maximum Composite Likelihood)ylaestimación de la varianza se realizó mediante el método bootstrap con 100 réplicas del alineamiento. Los árboles filogenéticos se construyeron a partir del alineamiento con el paquete informático MEGA6. Se utilizó el método estadístico de máxima verosimilitud (Maximum Likelihood)aplicandoelmodelodeTamura-Nei.Para estimar la robustez y confiabilidad de las topologías obtenidas se realizaron 100 réplicas bootstrap. Amplificación del gen scyC La amplificación del gen scyC,quecodificalaproteínaScyCinvolucrada en la biosíntesis de la escitonemina, se probó en las todas muestras de tapete 118 microbiano siguiendo el protocolo explicado en Balskus et al. [2011]. Brevemente, se realizó una PCR con el ADN extraído las muestras de tapete microbiano utilizando los primers degenerados scyC-F (50-GTN TAY TTY CAY TGG-30) y scyC-R (50-ADC KYT TDA TRT TCA T-30). La termociclación se realizó en un termociclador MyCycler (Bio-Rad) y el programa consistió en 1 minutos de desnaturalización a 95C, seguidos de 10 ciclos de 30 segundos a 95C, 1 minuto a 46.2C, 1 minuto a 72C, seguidos de 44 ciclos de 30 segundos a 95C, 1minutoa43.6 C, 1 minuto a 72Cyuntiempodeextensiónfinalde5minutos a72 C. La reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.25% ytiñiendoconbromurodeetidio.Seobservaronbandasdelalongitudesperada (⇠550pb) en prácticamente todas las muestras (con poca intensidad en AVMV3), pero solo se eligieron las muestras AVM-H3 y AVM-H4 para ensayar la clonación del gen scyC (Figura 6.2). Las bandas de las muestras AVM-H3 y AVM-H4 que aparecían a ⇠550 pb se recortaron del gel y el ADN se extrajo mediante el método freeze/squeeze,queconsisteencongelareltrozodegelcon nitrógeno líquido y exprimirlo dentro de una jeringa pequeña. A pesar de que la reamplificación de la banda extraída mostró nuevamente una banda de la longitud esperada, la clonación del gen scyC no dió resultado, ya que no se consiguieron clones con el gen inserto. Figura 6.2: Gel de agarosa con los productos de la PCR diseñada para la amplificación del gen scyC de los tapetes microbianos, siguiendo el protocolo de Balskus et al. [2011]. Obsérvese la banda a ⇠550 pb (rectángulo rojo) que se corresponde con la longitud esperada del amplicón del gen scyC. 6.2.3. Observación de los tapetes por microscopía Las muestras AVM-H3 y AVM-V3 se observaron al microscopio óptico y también al microscopio electrónico de barrido (MEB). Previamente, una pequeña cantidad de estas dos muestras (que se habían guardado en etanol a -20C) 119 se hidrataron con 600 µldeunamezclaquecontenía10µmde PBS (tampón fosfato salino), 10 µmde EDTA y 0.05% de Tween-20, y se fijaron con 72 µl de glutaraldehido al 25% (concentración final 3%). Se mantuvieron en agitación (180 rpm) durante 3 horas a temperatura ambiente y después se filtraron sobre membranas de policarbonato negro con un diámetro de poro de 0.2 µm (Millipore, GTBP02500) aplicando vacío suave (<200 mm Hg), finalmente se lavaron con PBS seguido de etanol 70% . La mitad del filtro se guardó para su observación en el MEB y la otra mitad se resuspendió en PBS para observarla en el microscopio óptico. El microscopio óptico usado fue un Leica DM 2500 equipado con una cámara Leica DFC420C y con objetivos de 10x, 40x, 63x y 100x (aceite), además del ocular 10x. Para su observación en el MEB, las muestras se recubrieron en oro ysevisualizaronaunasmagnificacionesdeentre2000y15000aumentosenun microscopio electrónico de barrido HITACHI S-3400N. 6.3. Resultados y discusión Con el análisis molecular de los tapetes mediante clonación y secuenciación se puede hacer una primera aproximación a la composición de la comunidad microbiana. De los 15 clones analizados, dos (AVM-H10 y AVM-V6) se descartaron porque no se obtuvieron buenas secuencias con el cebador inverso (M13-R) y por tanto no se pudo obtener la secuencia completa solapando ambos sentidos. Ytambiénsedescartóotrasecuencia(AVM-V2)queresultóserunaquimera,es decir, aproximadamente la mitad correspondía al ADNr 16S del cloroplasto de un alga rodofícea y la otra mitad correspondía a una cianobacteria. Del resto, 10 secuencias pertenecieron a cianobacterias y 2 (ambas de la muestra AVMV3, de la pared vertical de los escalones) pertenecieron a cloroplastos de algas rodofíceas (Bangiales). En la Tabla 6.1 se resumen las secuencias más cercanas a cada uno de nuestros clones, tanto de organismos cultivados como de muestras ambientales. Como se puede observar, las secuencias de 5 clones son similares a los de la cianobacteria Phormidesmis priestleyi aislada de un lago de la Antártida. Sin embargo, de estos 5 clones solo 3 (H1, H3 y H4) tienen una identidad cercana al 97% entre ellos () y con P. priestleyi,mientrasquelosotros2(H5yH7)sonidénticosentre ellos y solo comparten un 94.2% de los nucleótidos con P. priestleyi.Siseconsidera que el umbral que separa una especie de otra está en el 97% de identidad, estos dos últimos clones podrían considerarse provenientes de una especie diferente, aunque posiblemente dentro de la misma familia Pseudanabaenacea. En el árbol filogenético (Figura 6.3) se puede observar como el clon HX3-3 parece compartir identidad con los clones H1 y H3, aunque el análisis de la identidad lo relaciona más con la cepa de la cianobacteria unicelular Synechococcus sp. PCC7335. Se sabe que el género Synechococcus es claramente polifilético [Fuller et al., 2003] y, concretamente la cepa Synechococcus sp. PCC7335 está más estrechamente relacionada con cianobacterias Pseudanabaenales que con otras de su mismo género [Perkerson III et al., 2011]. El clon V7 también podría ser de una especie del grupo de las Pseudanabaenales pero con una identidad relativamente baja (93.7 %) con la especie más cercana Leptolyngbya sp. El clon H9 se relacionó con Oscillatoriales del género Lyngbya,ycabeseñalarqueapesarde que solo se encontró un clon perteneciente a este grupo, la observación al mi120 croscopio de la muestra AVM-H3 parecía estar dominada por cianobacterias del orden Oscillatoriales (Figura 6.5). Los clones H8 y V1 estarían relacionados con cianobacterias del orden de las Chroococcales (géneros Stanieria yPleurocapsa, respectivamente), pero el segundo con una identidad relativamente baja con el organismo secuenciado más cercano (93.5%). También cabe destacar la presencia de dos clones (V3 y V4) que corresponden alasecuenciadelADNr16Sdeloscloroplastosdeunalgaroja,encontrando una alta identidad (mayor o igual al 98%) con los de la rodófita filamentosa Bangia atropurpurea (Tabla 6.1, Figura 6.4). En la obsevación al microscopio de la muestra AVM-V3 se observaron filamentos uniseriados muy similares a los descritos para esta especie en sus estadios iniciales [Guiry, 2015] (Figuras 6.6d, 6.6e, 6.6f). Aunque no producen escitonemina, se sabe que las Bangiales contienen aminoácidos tipo micosporina (MAAs) para protegerse de la radiación UV [Boedeker and Karsten, 2005]. Aunque se consiguió la amplificación del gen scyC involucrado en la biosíntesis de la escitonemina, no se logró clonar este amplificado y por tanto no se tienen las secuencias de este gen. Hay que decir que la base de datos del gen scyC todavía es escasa (en la base de datos NCBI actualmente hay unas 44 secuencias que se corresponderían con esta proteína implicada en la síntesis de escitonemina), sin embargo, algunas de estas secuencias corresponden a cepas de Lyngbya sp., género que parecía dominar la muestra AVM-H3 como se observó al microscopio. De haber tenido éxito en la clonación del gen gen scyC se habría podido determinar si efectivamente la principal cianobacteria productora de escitonemina en el tapete microbiano estaba relacionada con esta oscillatorial. Futuros trabajos utilizando las nuevas técnicas de pirosecuenciación con muestras de tapetes microbianos podrían contribuir a aumentar el conocimiento sobre la diversidad de este gen funcional. Agradecimientos Este trabajo ha sido desarrollado utilizando los medios y servicios de la Universitat de les Illes Balears, y financiado por el proyecto MEDIFIX (CTM201123538) concedido por el Ministerio de Economía y Competitividad a la Dra. Nona S.R. Agawin. 121 Tabla 6.1: Emparejamientos más cercanos de las secuencias del gen 16S de los tapetes microbianos. Los porcentajes de identidad se han obtenido a partir de la matriz de distancias del alinemiento con ClustalW. Clon ID Secuencia más similar proveniente de un organismo cultivado (número de acceso) Identidad (%) Secuencia más similar proveniente de una muestra ambiental (número de acceso) Identidad (%) H1 Phormidesmis priestleyi (AY493585) 97.6 Uncultured bacterium clone HL7711.P5D1 (KC896689) 98.1 H3 Phormidesmis priestleyi (AY493585) 96.9 Uncultured cyanobacterium clone UMABcl31 (FN811215) 97.1 H4 Phormidesmis priestleyi (AY493585) 97.2 Uncultured bacterium clone HL7711.P5D1 (KC896689) 97.2 H5 Phormidesmis priestleyi (AY493585) 94.2 Uncultured cyanobacterium clone R8-B31 (DQ181689) 94.6 H7 Phormidesmis priestleyi (AY493585) 94.2 Uncultured cyanobacterium clone R8-B31 (DQ181689) 94.6 H8 Stanieria sp. PCC7301 (AB039009) 97.8 Uncultured compost bacterium clone CDM2 (KC243420) 96.6 H9 Lyngbya cf. aestuarii LEGE07165 (HQ832912) 97.2 Uncultured cyanobacterium clone Z4MB34 (FJ484833) 95.7 X3-3 Synechococcus sp. PCC7335 (AB015062) 98.0 Uncultured cyanobacterium clone UMABcl31 (FN811215) 97.5 V1 Pleurocapsa sp. HA4302 clone A (KC525078) 93.5 Uncultured compost bacterium clone CDM2 (KC243420) 93.0 V3 Bangia atropurpurea chloroplast (AF545616) 98.0 Uncultured bacterium clone LX-79 (JF514264) 93.4 V4 Bangia atropurpurea chloroplast (AF545616) 98.3 Uncultured bacterium clone LX-79 (JF514264) 93.2 V7 Leptolyngbya sp. OU 6 (GQ162217) 93.7 Uncultured cyanobacterium clone R8-R13 (DQ181690) 93.7 122 Tabla 6.2: Matriz de distancias del gen 16S de los clones obtenidos a partir de los tapetes microbianos. H1 H3 H4 H5 H7 H8 H9 HX3-3 V1 V3 V4 HX3-3 98.6 H3 97.6 96.9 H4 97.1 96.1 96.0 H5 93.7 93.6 94.5 93.1 H7 93.7 93.6 94.5 100.0 93.1 H8 87.3 86.7 86.3 87.2 87.2 87.4 H9 88.9 88.9 88.5 90.5 90.5 89.6 88.7 V1 89.7 89.3 88.7 89.9 89.9 93.0 90.9 89.8 V3 85.6 85.4 86.2 85.1 85.1 87.5 86.8 85.5 86.4 V4 85.1 84.7 85.6 84.1 84.1 86.5 86.1 85.1 85.4 98.9 V7 92.8 92.3 92.3 89.6 89.6 90.9 90.2 92.6 91.0 86.2 85.5 123 Figura 6.3: Árbol filogenético de las cianobacterias aisladas de los tapetes microbianos, realizado a partir de las secuencias del ADNr 16S utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de Tamura-Nei. En negrita se muestran las secuencias obtenidas en este estudio. 124 Figura 6.4: Árbol filogenético de cloroplastos de las rodófitas aisladas del tapete microbiano AVM-V3, realizado a partir de las secuencias del ADNr 16S utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de TamuraNei. En negrita se muestran las secuencias obtenidas en este estudio. 125 2002a,b]. 1111 1212 1313 1414 1515 1010 HO 99 33 22 8b8b 3a3a 8a8a 4a4a N 44 88 77 66 55 O H 15'15' 14'14' 13'13' 12'12' 11'11' 10'10' OH 9'9' 3'3' 2'2' 1'1' 8b'8b' 3a'3a' 8a'8a' 4a'4a' N4'4' 8'8' 7'7' 6'6' 5'5' 11 O H 36 Figura 7.1: Estructura de la escitonemina. 7.2. Resultados El primer producto en ser aislado resultó ser un polvo pardo que produce disoluciones verdes en los diferentes disolventes orgánicos. Su espectro de masas presenta el ión molecular a m/z 544.14 (43.76%)yelpicobaseam/z 543.13 ([MH]+,100%). Por espectrometría de masas de alta resolución se dedujo la fórmula molecular como C36H20N2O4.Así,elpicobaseapareceam/z 543.1346 que al corresponder a [MH]+nos da la fórmula C36H19N2O4cuya masa calculada es 543.1345. El espectro UV-visible (Figura 7.3) presenta tres máximos de absorbancia centrados a 200.5, 254.0 y 398.5 nm. El espectro de 1H-RMN a 300MHz (Tabla 7.1), enriquecido por experimentos en dos dimensiones (TOCSY y COSY) nos confirman que se trata de la escitonemina (36). Estos resultados son consistentes con la bibliografía [Proteau et al., 1993]. El segundo producto en ser aislado resultó ser un polvo pardo que produce disoluciones rojizas en los diferentes disolventes orgánicos. Su espectro de masas presenta el ión molecular a m/z 546.16 (40.89%)yelpicobaseam/z 545.15 ([MH]+,100%). Por espectrometría de masas de alta resolución se dedujo la fórmula molecular como C36H22N2O4.Así,elpicobaseapareceam/z 545.1499 que al corresponder a [MH]+nos da la fórmula C36H21N2O4cuya masa calculada es 545.1501. El espectro de 1H-RMN a 300MHz (Tabla 7.2), nos confirma, junto a los anteriores, que se trata de la dihidroescitonemina (37), de nuevo en consistencia con la bibliografía [Proteau et al., 1993]. 132 1111 1212 1313 1414 1515 1010 HO 99 33 22 8b8b 3a3a 8a8a 4a4a HN 44 88 77 66 55 O H 15'15' 14'14' 13'13' 12'12' 11'11' 10'10' OH 9'9' 3'3' 2'2' 1'1' 8b'8b' 3a'3a' 8a'8a' 4a'4a' NH 4'4' 8'8' 7'7' 6'6' 5'5' 11 O H 37 Figura 7.2: Estructura de la dihidroescitonemina. Tabla 7.1: 1H-RMN de la escitonemina (36)ycorrelacionesobservadasenlos espectros TOCSY y COSY. a Posición 1H-RMN, (H, ppm) TOCSY COSY (300MHz, piridina–d5) 57.75(2H,d,J=6.94Hz) H-6, H-8 H-6 67.48(2H,m) H-5,H-7H-5,H-7 77.21(2H,m) H-6,H-8H-6,H-8 87.86(2H,d,J=6.54Hz) H-5, H-7 H-7 97.99(2H,s) 11,15 8.97 (4H, d, J=6.84Hz) H-11!H-12 H-11!H-12 H-15!H-14 H-15!H-14 12,14 7.33 (4H, d, J=6.84Hz) H-12!H-11 H-12!H-11 H-14!H-15 H-14!H-15 aDebido a la naturaleza dimérica de este compuesto, los desplazamientos químicos que se indican corresponden a ambas mitades de la molécula (ver Figura 7.1). Análisis por HPLC. Ambos metabolitos se separan por HPLC si se emplean condiciones de fase reversa y metanol-agua como eluyente (Figura 7.4). 133 Figura 7.3: Espectro UV-visible de la escitonemina (36)aisladadeltapete microbiano. Tabla 7.2: 1H-RMN de la dihidroescitonemina (37). a Posición 1H-RMN, (H,ppm) (300MHz, piridina–d5) 57.63(2H,d,J=7.80Hz) 6,7 7.42 (4H, m) 88,40(2H,d,J=7.80Hz) 97.82(2H,s) 11,15 7.85 (4H, d, J=8.30Hz) 12,14 7.00 (4H, d, J=8.30Hz) OH 12.09 (2H, brs) NH 12.69 (2H, brs) aDebido a la naturaleza dimérica de este compuesto, los desplazamientos químicos que se indican corresponden a ambas mitades de la molécula (ver Figura 7.2). 134 Figura 7.4: Cromatograma HPLC de una fracción que contiene escitonemina 36 (Tr= 14.48 min) y dihidroescitonemina 37 (Tr= 15.55 min). Actividad citotóxica de escitonemina (36) y dihidroescitonemina (37). Tanto la escitonemina (36)comoladihidroescitonemina(37)seaplicaron auncultivodecélulasdelaleucemiahumana,HL-60,resultandoactividad citotóxica, con IC50 de 4.6µmy1.9µm,respectivamente(Figura7.5). Figura 7.5: Viabilidad de las células HL-60 frente a la escitonemina (36)y dihidroescitonemina (37). Resultados similares se obtuvieron con la línea celular de leucemia humana U937. En ambas líneas celulares se hicieron 3 experimentos de MTT independientes. 135 7.3. Experimental Obtención de la biomasa. Los tapetes microbianos se recogieron a finales de junio de 2011 de la zona supramareal, en unas terrazas escalonadas que refuerzan el muro de contención de la Avenida Marítima de Las Palmas de Gran Canaria. La biomasa de los tapetes se secó durante 24 h a 60C. La cianobacteria Nostoc sp. (cepa BEA1032B) se aisló de una colonia recogida en un camino hacia El Hornillo, en Gran Canaria, Islas Canarias, y se cultivó en el medio BG11 (Tabla 7.3) [Stanier et al., 1971] en el Banco Español de Algas, en una cámara a 20C, mediante irradiación de luz blanca fría (100 µmol fotones m−2s−1)conunfotoperíodode14:10(L:O).Posteriormentese liofilizó. Tabla 7.3: Medio BG11. Componente Concentración final Disolución Stock (gl−1H2Od) Adición para 1litrodemedio de cultivo NaNO317.6mm1.5 g K2HPO40.22mm40.0 1ml MgSO4·7H2O0.03mm75.0 1ml CaCl2·2H2O0.2mm36.0 10ml Ácido cítrico ·H2O0.03mm6.00 10ml Citrato de amonio férrico 0.02mm0.60 10ml Na2EDTA·2H2O0.002mm0.10 10ml Na2CO30.18mm2.00 10ml Elementos traza Ver Tabla 7.4 1ml Tabla 7.4: Disolución de elementos traza. Compuesto Adición para 1litrodeH 2Odd H3BO32.86 g MnCl2·4H2O1.81g ZnSO4·7H2O0.22g Na2MoO4·2H2O0.39g CuSO4·5H2O0.08g Co(NO3)2·6H2O0.05g Preparación de la disolución de cultivo Se prepararon las disoluciones stock añadiendo las cantidades indicadas de los compuestos químicos a 1000 ml de agua destilada. La disolución de metales traza se preparó en agua bidestilada. Estas disoluciones se combinaron según se indica y se ajustó el pH a 7.4 con NaOH. Finalmente se esterilizó en autoclave. 136 Extracción y purificación de los metabolitos. La biomasa seca (441 g) del tapete microbiano se extrajo con acetona por maceración (3 veces) y posteriormente mediante un aparato soxhlet. Después de evaporar el disolvente se obtuvo un extracto pardo (8.815 g) que se cromatografió en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano y cantidades crecientes de AcOEt. Se separaron 9 fracciones, en la tercera de las cuales (eluida con hexano/AcOEt 2:8 v/v) resultó ser una disolución con un intenso color rojo que presentó dos productos homogéneos por TLC (CHCl3:MeOH 9:1 v/v). Mediante la recromatografía en capa gruesa (fase normal, CHCl3:MeOH 9:1 v/v) de esta fracción se separaron los dos productos, el menos polar (283 mg, Rf=0.45) produce disoluciones color verde caqui mientras que el más polar (475 mg, Rf=0.34) produce disoluciones color rojo brillante. La biomasa liofilizada (6 g) de Nostoc sp. (cepa BEA1032B) se extrajo mediante un aparato soxhlet con acetona (250 ml). La eliminación del disolvente rindió un extracto pardo que se cromatografió con n-hexano/AcOEt con cantidades incrementales del último. Se obtuvieron sucesivas fracciones que se monitorizaron por cromatografía en capa fina en fase normal (gel de sílice) eluyendo con una mezcla de cloroformo y metanol (9:1). Se obtuvieron así dos productos homogéneos por TLC. El menos polar colorea sus disoluciones de color verde y el más polar las colorea de color rojo. Estudio del producto menos polar. Presenta en TLC (gel de sílice, 0.25 mm espesor) un Rf=0.45 cuando se eluye con cloroformo–metanol (9:1). Mancha de color verde. Fue identificada como escitonemina (36)porsuespectrode1H-RMN, tanto en una como en dos dimensiones (ver Tabla 7.1 y discusión). El espectro de absorción UV (en DMSO) dio max=254nm,389nm. Estudio del producto más polar. Presenta en TLC (gel de sílice, 0.25 mm espesor) un Rf=0.34cuando se eluye con cloroformo–metanol (9:1). Mancha de color rojo. Fue identificado como dihidroescitonemina (37)porsuespectrode1H-RMN, (ver Tabla 7.2). Análisis por HPLC. Ambos metabolitos se separaron por HPLC mediante una columna Waters µBondapak C18 (125Å, 10µm, 3.9 ⇥300 mm) mediante el siguiente programa para el eluyente: Inicio: 80%de agua y 20%de metanol Minuto 2 al 15: subir la composición del metanol desde el 20%al 100 % Flujo: 1mlmin−1 En estas condiciones, y con un detector UV (=386nm)laescitonemina(36) se eluye a 14.48 minutos y la dihidroescitonemina (37)a15.55minutos. 137 Bibliografía Balskus, E. P., Case, R. J., and Walsh, C. T. The biosynthesis of cyanobacterial sunscreen scytonemin in intertidal microbial mat communities. FEMS Microbiology Ecology,77(2):322–332,2011. Chen, J., Zhao, L., Xu, J., Yang, R., He, S., and Yan, X. Determination of oxidized scytonemin in Nostoc commune Vauch cultured on different conditions by high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry. 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The Identification and Characterization of the Marine Natural Product Scytonemin as a Novel Antiproliferative Pharmacophore. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,303(2):858–866,2002a. 138 Stevenson, C., Capper, E., Roshak, A., Marquez, B., Grace, K., Gerwick, W., Jacobs, R., and Marshall, L. Scytonemin-a marine natural product inhibitor of kinases key in hyperproliferative inflammatory diseases. Inflammation Research,51(2):112–114,2002b. 139 Capítulo 8 Estudio de los productos naturales del alga Halopteris scoparia (Stypocaulon scoparium). 8.1. Antecedentes El alga Halopteris scoparia ha sido investigada previamente en lo que se refiere a sus extractos orgánicos y los productos naturales en ellos contenidos. Así, Augier [1970] encontró triptófano (38), -indolil-acetonitrilo (39)y-indolilacetato de etilo (40), todos ellos precursores biogenéticos de una conocida hormona del crecimiento vegetal, el ácido -indolil-acético (41)oauxina. N H NH2 H CO2H N H R R CN CO2Et CO2H 38 39 40 41 Figura 8.1: Indoles. 141 Hellio, C., Thomas-Guyon, H., Culioli, G., Piovettt, L., Bourgougnon, N., and le Gal, Y. Marine antifoulants from Bifurcaria bifurcata (Phaeophyceae, Cystoseiraceae) and other brown macroalgae. Biofouling,17(3):189–201,2001. Karsten, U., Sawall, T., and Wiencke, C. A survey of the distribution of UVabsorbing substances in tropical macroalgae. Phycological Research,46(4): 271–279, 1998. López, A., Rico, M., Rivero, A., and de Tangil, M. S. The effects of solvents on the phenolic contents and antioxidant activity of Stypocaulon scoparium algae extracts. Food Chemistry,125(3):1104–1109,2011. Munda, I. M. Preliminary information on the ascorbic acid content in some adriatic seaweeds. In Twelfth International Seaweed Symposium,pages477– 481. Springer, 1987. Munda, I.-M. and Gubenšek, F. The amino acid content of some benthic marine algae from the northern adriatic. Botanica marina,29(4):367–372,1986. Orhan, I., Sener, B., and Atici, T. Fatty acid distribution in the lipoid extracts of various algae. Chemistry of natural compounds,39(2):167–170,2003. 148 Conclusiones Apartirdeltrabajorealizadoenestatesissepuedenextraerlassiguientes conclusiones: 1. De la esponja marina Verongia aerophoba se han identificado tres esteroles junto con sus derivados acetilados y, de ellos, el 23(24)-didehidroaplisterol ha sido aislado por primera vez como producto natural. También se han identificado tres ácidos grasos y seis metabolitos derivados de la bromotirosina. De estos últimos, el ácido veróngico se ha aislado por primera vez de Verongia aerophoba. 2. Verongia aerophoba mostró una alta supervivencia en cultivos ex situ recibiendo aguas provenientes de piscifactorías. Sin embargo, si se quiere integrar el cultivo de esta esponja en un sistema multitrófico, seria necesario mejorar y optimizar el método. 3. El cultivo in situ de Verongia aerophoba puede ser una técnica viable para la producción de citotóxicos de interés en la industria farmacéutica. 4. Se ha identificado una nueva especie de Myxilla sp. (Porifera: Poecilosclerida) para las Islas Canarias. 5. De la esponja Myxilla sp. de las Islas Canarias se han aislado e identificado cuatro esteroles, una mezcla de ceramidas y ceramidas-1-fosfato, y dos bases pirimidínicas. 6. Se ha elucidado la estructura y la estereoquímica absoluta de una mezcla de sesterterpenos, los estereoisómeros (8Z,13E)-strobilinina y (8E,13Z)- strobilinina aislados de la esponja Ircinia variabilis. 7. La identificación de un tapete microbiano mediante técnicas moleculares ha resultado en doce secuencias de ADN ribosomal, de las cuales diez corresponden a cianobacterias y dos a cloroplastos de algas rojas. De las secuencias cianobacterianas obtenidas, cinco están relacionadas con Pseudanabaenales del género Phormidesmis. 8. Los compuestos anti-UV escitonemina y dihidroescitonemina se han aislado e identificado de un tapete microbiano y de una cepa de Nostoc sp. Ambos compuestos presentan actividad citotóxica frente a células de leucemia humana HL-60 con valores de IC50 de 4.6 µmy1.9µm,respectivamente. 9. El alga marina Halopteris scoparia es una fuente importante de manitol. Además, de ella también se han aislado linoleato de etilo y glicerol. 149 Índice de figuras 1.1. Esponja marina Verongia aerophoba................. 20 1.2. Esteroles identificados en Verongia aerophoba ........... 24 1.3. Transposición de McLafferty para el 24(28)-didehidroaplisterol (2). 25 1.4. Protones olefínicos de la mezcla de aplisterol (1), 24(28)-didehidroaplisterol (2)y23(24)-didehidroaplisterol(3)................. 25 1.5. Ácidos grasos de Verongia aerophoba:ácidosheneicosanoico(7), oleico (8)ylinoleico(9)....................... 27 1.6. Esquema de fragmentaciones observadas en el espectro de masas que confirman el ácido heneicosanoico (7). ............ 27 1.7. Ácidoveróngico............................ 28 1.8. Principales fragmentaciones del ácido veróngico (10)enelespectrómetrodemasas........................... 29 1.9. Dienona de Verongia aerophoba ................... 30 1.10. Principales fragmentaciones de la dienona (11)observadasenel espectrómetro de masas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.11. Acetato de la dienona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 1.12.Aeroplysinina-1............................ 34 1.13.Verongiolido.............................. 35 1.14. Fragmentaciones de verongiolido (14)enelespectrómetrodemasas. 36 1.15. Comparación de los espectros 1H-RMN de verongiolido (14)en dos disolventes diferentes: a) DMSO–d6, 500MHz; b) CD3OD, 300MHz. ............................... 37 1.16. Estructura de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 . . . . . . . . . . 39 1.17. Fragmentaciones en espectrómetro de masas de la 11-epi-fistularina-3. 40 1.18. Espectrometría de masas de alta resolución de la 11-epi-fistularina-3. 41 1.19. Ruta biogenética de la dibromotirosina y formación del sistema sistema espiroisoxazolínico. (SAM=S-adenosilmetionina) . . . . . 46 1.20. Correlación de la 11-epi-fistularina-3 con verongiolido (1 mol) y aeroplysinina (2 moles). Obsérvese que los centros quirales 11R y17Rse conservan en la degradación enzimática de la primera. . 47 1.21. Estructura de la (7R)-hemifistularina-3 . . . . . . . . . . . . . . . 47 1.22. Estructura del tetraacetato de (11R,17R)-epi-fistularina-3 . . . . 48 1.23. (11R,17R)-fistularina-1........................ 50 1.24. Fragmentaciones de la (11R,17R)-fistularina-1 (18)enelespectrómetrodemasas........................... 51 1.25.Verongiamina............................. 55 151 2.1. Biotransformación de los alcaloides bromados de V. aerophoba. Las estructuras corresponden a 11-epi-fistularina-3 (15), fistularina1(18), aeroplysinina-1 (13), verongiolido (14), dienona (11), ácido veróngico (10). (Modificado de [Teeyapant and Proksch, 1993]). 64 2.2. Sistema cultivo ex situ en el tanque de sedimentación de la planta de acuicultura marina del ICCM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 2.3. Cultivo de V. aerophoba en el tanque de sedimentación de la planta de cultivo de peces (ICCM, Taliarte, Gran Canaria). (a, b) Esponjas cultivadas en las cajas superiores, antes y después de la limpieza de algas y material sedimentado, respectivamente. (c, d) Esponjas cultivadas en las cajas inferiores, antes y después de la limpieza del material sedimentado, respectivamente. . . . . . . 68 2.4. (a) Estructura de cultivo in situ en la Bahía de Alcúdia (Mallorca, Islas Baleares). (b) Explante de V. aerophoba creciendo en la malla. Obsérvese la formación de tejido nuevo sobre la malla y la aparición de ramificaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 2.5. Supervivencia de los explantes de Verongia aerophoba durante el cultivo in situ.Lasbarrasdeerrorrepresentanlavariación (error estándar) en la supervivencia entre los diferentes grupos deexplantes. ............................. 73 2.6. Ejemplo del crecimiento de un explante de Verongia aerophoba durante todo el periodo de cultivo in situ.............. 73 2.7. Diagrama de cajas (a) del área proyectada (cm2)y(b)delas tasas de crecimiento (mes1)delosexplantesduranteelperiodo de cultivo. En estos diagramas, la caja está delimitada por los cuartiles Q1yQ 3,ylalíneainteriorseñalalamediana.Losbigotes indican los límites superior e inferior y los valores atípicos se señalan con círculos pequeños. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 2.8. (a) Área proyectada (cm2)y(b)tasasdecrecimiento(mes 1)de los explantes durante el periodo de cultivo. Las barras de error representan el error estándar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 3.1. Habitus de algunos de los ejemplares recolectados de Myxilla sp. 86 3.2. Megascleras de Myxilla sp.: tornotes (izquierda) y acantostilos (derecha)................................ 87 3.3. (a) Detalle de los extremos de los acantostilos. (b) Detalle del extremo de un tornote mucronado (izquierda) y de un acantostilo con las espinas romas (derecha). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.4. Microscleras de Myxilla sp.: isoquelas arqueadas. . . . . . . . . . 88 3.5. Microscleras de Myxilla sp.:sigmas. ................ 89 4.1. Protones olefínicos de la mezcla de -sitosterol (21,75%), 23(24)- didehidro--sitosterol (22,16%), 24(25)-didehidro--sitosterol (23, 2%)y25(26)-didehidro--sitosterol (24,7%). .......... 94 4.2. Ceramidas aisladas de Myxilla sp. ................. 97 4.3. Ceramidas-1P aisladas de Myxilla sp................. 99 4.4. Esquema de fragmentaciones observadas en el espectro de masas de alta resolución de la mezcla de ceramidas-1-fosfato aislada de Myxilla sp. ..............................100 152 4.5. Iones moleculares de la mezcla ceramidas-1P aislada de Myxilla sp. detectados por HPLC-MS (infusión directa). . . . . . . . . . . 101 4.6. Cromatograma de la mezcla de ceramidas. . . . . . . . . . . . . . 103 5.1. Estructura de (8Z,13E,18R,20Z)-strobilinina (31)ysuacetato (33)...................................108 5.2. Estructura de (8E,13Z,18R,20Z)-strobilinina (32)ysuacetato (34)...................................108 5.3. Fragmentaciones observadas en el espectro de masas de strobilinina ⇥mezcla de estereoisómeros 8Z,13E+8E,13Z(31+32)⇤.... 109 5.4. Estructura de la variabilina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 6.1. (a) Terrazas escalonadas en la zona supramareal donde se recogió el tapete microbiano. Nótese la diferencia de colores (y por tanto, de pigmentos) entre la parte superior y la inferior. (b) Detalle de los tapetes recogidos. Obsérvese los tapetes horizontales cubiertos de agua, mientras que los verticales están secos. . . . . . . . . . . 117 6.2. Gel de agarosa con los productos de la PCR diseñada para la amplificación del gen scyC de los tapetes microbianos, siguiendo el protocolo de Balskus et al. [2011]. Obsérvese la banda a ⇠550 pb (rectángulo rojo) que se corresponde con la longitud esperada del amplicón del gen scyC.........................119 6.3. Árbol filogenético de las cianobacterias aisladas de los tapetes microbianos, realizado a partir de las secuencias del ADNr 16S utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de Tamura-Nei. En negrita se muestran las secuencias obtenidas enesteestudio.............................124 6.4. Árbol filogenético de cloroplastos de las rodófitas aisladas del tapete microbiano AVM-V3, realizado a partir de las secuencias del ADNr 16S utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el modelo de Tamura-Nei. En negrita se muestran las secuencias obtenidas en este estudio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 6.5. Fotografias realizadas al microscopio óptico de la muestra AVMH3. (a) Aspecto general, (b) oscillatoriales, (c) filamentos de oscillatoriales, probablemente Lyngbya sp., y una pseudoanabaenal, que podría estar relacionada con Phormidesmis priestleyi,(d)oscillatoriales y un filamento de pseudoanabaenal, (e) nostocales, la flecha indica un heterociste, y (f) filamento eucariota con células en división, que se podría atribuir a Bangia atropurpurea. ....126 6.6. Fotografias realizadas al microscopio óptico de la muestra AVMV3. (a) Filamentos de pseudanabaenales, (b) detalle de una cianobacteria pseudanabaenal, obsérvese el gran tamaño de las células, (c) chroococcales, (d) rodofíceas bangiales, (e) visión general de tapete microbiano AVM-V3, dominado por filamentos de Bangia atropurpurea unidos por una estructura rizoide, y (f) la misma fotografía que la anterior pero tomada mediante epifluorescencia, donde se observa la fluorescencia anaranjada de la ficoeritrina, pigmento que contienen tanto cianobacterias como rodofíceas. . . 127 153 6.7. Fotografias del tapete microbiano realizadas al microscopio electrónico de barrido. (a) Visión general del tapete, con un filamento de Lyngbya sp. en el centro, (b) detalle del extremo de un filamento de Lyngbya sp. (c) pseudanabaenal relacionada con Phormidesmis sp., (d) detalle de la misma pseudanabaenal que la anterior, con una chroococcal, (e) filamento no identificado, similar aunapseudanabaenal,concélulasdegrantamaño,y(f)obsérvese los pequeños filamentos centrales que podrían corresponder alasnostocalesvisualizadasenelmicroscopioóptico.... .... 128 7.1. Estructura de la escitonemina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 7.2. Estructura de la dihidroescitonemina. . . . . . . . . . . . . . . . 133 7.3. Espectro UV-visible de la escitonemina (36)aisladadeltapete microbiano. ..............................134 7.4. Cromatograma HPLC de una fracción que contiene escitonemina 36 (Tr= 14.48 min) y dihidroescitonemina 37 (Tr= 15.55 min). 135 7.5. Viabilidad de las células HL-60 frente a la escitonemina (36)y dihidroescitonemina (37). ......................135 8.1. Indoles. ................................141 8.2. Ácidos aminosulfónicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 8.3. Manitol.................................142 8.4. Esteroles. ...............................143 8.5. Ácidoalgínico. ............................143 8.6. Sorbitol.................................143 8.7. Ácido L-ascórbico (52)ydehidroascórbico(53)...........143 8.8. Aminoácidos del grupo de la micosporina (MAAs). . . . . . . . . 144 8.9. Linoleato de etilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 8.10. Glicerol (59)ysutriacetato(58). .................146 8.11. Hexaacetato del manitol (60).....................147 154 Índice de tablas 1.1. Desplazamientos de carbono del esterol mayoritario, aplisterol (1), y su acetato (4) en Cl3CD y a 75MHz. Las asignaciones son consistentes con la bibliografía [Kelecom et al., 1979] y los datos delespectroDEPT. ......................... 23 1.2. Composición de la mezcla de ácidos grasos. . . . . . . . . . . . . 28 1.3. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros de RMN del ácido veróngico (10)enDMSO–d 6. ......... 30 1.4. El ion molecular de la dienona (11)enelespectrómetrodemasas. 31 1.5. Datos de RMN de la dienona (11).................. 31 1.6. Correlaciones observadas en los espectros HSQC y HMBC de la dienona (11).............................. 32 1.7. Espectros de RMN y correlaciones observadas en los espectros HSQC y HMBC del monoacetato de la dienona (12)........ 33 1.8. Espectros de RMN de la aeroplysinina-1 (13)............ 34 1.9. Desplazamientos químicos (en ppm, Jen Hz) observados en los espectros RMN de verongiolido (14)................. 38 1.10. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros de 13C-RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15)yla11epi-fistularina-3 descrita en la bibliografía [König and Wright, 1993] en acetona–d6.......................... 43 1.11. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros de RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15)DMSO–d 6.. 44 1.12. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros de RMN de la (11R,17R)-11-epi-fistularina-3 (15) CD3OD. . . . 45 1.13. 1H-RMN del tetraacetato de (11R,17R)-epi-fistularina-3 (17)y correlaciones observadas en los espectros COSY, TOCSY y NOESY. 49 1.14. El ión molecular de la (11R,17R)-fistularina-1 (18)observadoen el espectrómetro de masas (muestra inyectada con NaCl). . . . . 50 1.15. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros RMN de la (11R,17R)-fistularina-1 (18)............... 52 1.15. Desplazamientos químicos (,ppm)observadosenlosespectros RMN de la (11R,17R)-fistularina-1 (18)............... 53 155 2.1. Concentraciones medias (en mg/g PS) de los metabolitos identificados por HPLC [11-epi-fistularina-3 (15), verongiolido (14) yácidoveróngico(10)] en las esponjas cultivadas ex situ eíndices de bioconversión (en µmolµmol−1de verongiolido/11-epifistularina-3) según diferentes condiciones de cultivo y procesos de extracción. Los valores entre paréntesis corresponden al error estándar. ............................... 69 2.2. Tiempos de retención de los productos naturales de Verongia aerophoba que se separaron e identificaron por HPLC. . . . . . . . 71 2.3. Áreas proyectadas (en cm2)delosexplantesdelcultivoin situ, desglosadas por fechas y grupos de explante. Los valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar. . . . . . . . . . 74 2.4. Tasas de crecimiento (día1)delosexplantesdelcultivoin situ, desglosadas por fechas. Los valores entre paréntesis corresponden aladesviaciónestándar... ..... ... ... ..... ... .. 75 2.5. Concentraciones medias (%)delosmetabolitosidentificadosen los explantes del cultivo in situ de V. aerophoba.Losvaloresentre paréntesis corresponden a la desviación estándar. También se incluyen el número nde muestras analizadas, el estadístico F y el p-valor ............................... 76 3.1. Distribución de las especies de esponjas del género Myxilla en aguas de España y Portugal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4.1. Desplazamientos de carbono del núcleo esteroidal presente en los cuatro esteroles (21,22,23,24)ysusacetatos(25,26,27,28) en Cl3CDya75MHz......................... 95 4.2. Iones moleculares de la mezcla de ceramidas aislada de Myxilla sp. observados en el espectro de masas de alta resolución. Sus intensidades relativas nos dan el porcentaje de cada componente enlamezcla.............................. 99 4.3. Iones moleculares de la mezcla de ceramidas-1P aislada de Myxilla sp. detectados en el espectro de masas. Sus intensidades relativas nos dan el porcentaje de cada componente en la mezcla. . . . . . 102 4.4. Desplazamientos de RMN de protón (,ppm)delasbasespirimidínicas (29 y30)enDMSO–d 6a300MHz. ..... ... .. 104 4.5. Desplazamientos de RMN de carbono (,ppm)delasbasespirimidínicas (29 y30)enDMSO–d 6a75MHz............105 5.1. Desplazamientos químicos (ppm) observados en los espectros RMN de strobilinina. La duplicación de las señales de los carbonos 8, 10, 13, y 15 nos informa de que el producto es una mezcla de los estereoisómeros (8Z,13E)y(8E,13Z)(31 y32), en concordancia con la bibliografía [Davis and Capon, 1994]. . . . . . . . . . . . . 110 5.2. Desplazamientos químicos (ppm) observados en los espectros RMN del acetato de strobilinina. La duplicación de las señales de los protones 9 y 14 y de los carbonos 8, 10, 13, 15 y16 nos informa de que el producto es una mezcla de los estereoisómeros (8Z,13E) y(8E,13Z)(33 y34), en concordancia con la bibliografía [Davis andCapon,1994])...........................112 156 6.1. Emparejamientos más cercanos de las secuencias del gen 16S de los tapetes microbianos. Los porcentajes de identidad se han obtenido a partir de la matriz de distancias del alinemiento con ClustalW................................122 6.2. Matriz de distancias del gen 16S de los clones obtenidos a partir de los tapetes microbianos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 7.1. 1H-RMN de la escitonemina (36)ycorrelacionesobservadasen los espectros TOCSY y COSY. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 7.2. 1H-RMN de la dihidroescitonemina (37). .............134 7.3. Medio BG11. .............................136 7.4. Disolución de elementos traza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 8.1. 13C-RMN del linoleato de etilo (57) en CDCl3...........145 8.2. 13C-RMN del triacetato del glicerol (58) en CDCl3. .......146 8.3. 13C-RMN del hexaacetato del manitol (60) en CDCl3.......147 157