Diversidad genética y estructura poblacional de caballa ("Scomber colias", Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo

Anexo I D. José Manuel Vergara Martín, SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en sesión permanente tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada “Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa (Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo” presentada por la doctoranda Dª. Carolina Medina Alcaraz y dirigida por los Doctores Pedro Sosa Henríquez y José Juan Castro Hernández. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 6 del Reglamento para la elaboración, defensa, tribunal y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 3 de Noviembre de 2015. El Secretario del Departamento Anexo II Programa de doctorado en Oceanografía. Bienio 2007-2009. Con Mención de Calidad de la ANECA. Título de la Tesis: Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa (Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo Tesis Doctoral presentada por Dª Carolina Medina Alcaraz para obtener el grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Dirigida por Dr. D. Pedro Sosa Henríquez Dr. D. José Juan Castro Hernández El Director El Co-Director La Doctoranda Las Palmas de Gran Canaria, a 9 de Noviembre de 2015 TESIS DOCTORAL Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias , Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo CAROLINA MEDINA ALCARAZ LAS PALMAS DE GRAN CANARIA 2015 xv RESUMEN En este estudio se determinó el patrón de diversidad y diferenciación genética de las poblaciones naturales de caballa (Scomber colias, Gmelin1789) en el Atlántico y Mediterráneo Occidental. Para ello, se utilizaron ocho marcadores moleculares (microsatélites) y se analizaron 604 individuos procedentes de 14 puntos de muestreo. Todas las poblaciones se encontraban en desequilibrio de Hardy-Weinberg, presentando un déficit de heterocigóticos, debido posiblemente a la existencia de una subestructuración genética de las poblaciones, ya que durante las migraciones de los peces pelágicos tiene lugar la formación de cardúmenes, los cuales están constituidos por el reclutamiento de ejemplares de distintas cohortes. Los niveles de diversidad genética detectados en las áreas estudiadas fueron considerablemente elevados, siendo levemente superiores en el área del Mediterráneo Occidental, debido posiblemente a un flujo génico hacia el interior del Mar Mediterráneo desde las poblaciones localizadas en el Atlántico Noreste, albergando así mayores niveles de variabilidad genética. El análisis de los marcadores moleculares evidenció también una sutil, pero significativa diferenciación genética entre las poblaciones y las áreas estudiadas, detectándose tres grandes agrupaciones genéticas. Estos agrupamientos parecen depender de la oceanografía de las áreas tales como remolinos, filamentos y afloramientos, jugando un papel predominante en la distribución de xvi huevos y larvas de S. colias, así como de las inestabilidades demográficas, reclutamientos locales y migraciones de adultos. Los resultados obtenidos han permitido disponer de un mayor conocimiento sobre la estructura y genética poblacional de S. colias en el océano Atlántico y mar Mediterráneo que, junto con la integración de datos de otras disciplinas, nos ha permitido elaborar un conjunto de recomendaciones para la gestión de este importante recurso pelágico. xvii ÍNDICE RESUMEN xv ÍNDICE xvii LISTADO DE TABLAS xxi LISTADO DE FIGURAS xxv 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Caballa del Atlántico, Scomber colias 3 1.2. Interés pesquero 5 1.3. La genética y la identificación de poblaciones pelágicas pesqueras 7 1.4. Antecedentes y estado actual de las investigaciones genéticas 11 2. OBJETIVOS 17 3. MATERIAL Y MÉTODOS 21 3.1. Zona de muestreo 23 3.2. Estandarización del método de conservación 26 3.3. Extracción y purificación de ADN 27 3.3.1. Protocolo de extracción 27 3.3.2. Purificación 28 3.4. Cebadores de amplificación utilizados 29 3.5. Análisis estadísticos 33 xviii 4. RESULTADOS 39 4.1. Estandarización del método de conservación 41 4.2. Cebadores funcionales 43 4.3. Frecuencias génicas 43 4.3.1. Alelos nulos 52 4.3.2. Locus bajo selección 55 4.3.3. Niveles de variabilidad genética 57 i. Variabilidad genética por locus 57 ii. Variabilidad genética por población 57 iii. Variabilidad genética por área 59 iv. Equilibrio de Hardy-Weinberg y Desequilibrio de Ligamiento 61 4.4. Diferenciación y estructura genética 64 4.4.1. Coeficiente de diferenciación genética y distancia genética 64 4.4.2. Dendrogramas de diferenciación y distancia genética 66 4.4.3. Análisis de Coordenadas Principales 71 4.4.4. Análisis de Inferencia Bayesiana 73 4.4.5. Análisis Molecular de la Varianza 78 4.4.6. Aislamiento por distancia 81 xix 4.4.7. Detección de cuellos de botella 84 5. DISCUSIÓN 89 5.1. Elección del tejido y tamaño muestral 91 5.2. Microsatélites utilizados 93 5.3. Alelos bajo selección y alelos nulos 94 5.4. Equilibrio de Hardy-Weinberg 97 5.5. Diversidad genética 99 5.6. Diferenciación y estructura genética 103 5.7. Recomendaciones para la conservación y gestión 113 6. CONCLUSIONES 117 7. BIBLIOGRAFÍA/ANEXOS 123 Anexo I. Frecuencias alélicas en Scomber colias 169 Anexo II. Coeficientes de diferenciación sin corrección de los alelos nulos 173 Anexo III. Asignación bayesiana sin loci bajo selección 175 Anexo IV. Resultados sin los loci Scja01 y Scja07 177 xxi LISTADO DE TABLAS Tabla 1. Localización geográfica e instituciones que recogieron las muestras de Scomber colias. ULPGC, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (Islas Canarias); BA.IEO, Centro Oceanográfico de Baleares del Instituto Español de Oceanografía (Islas Baleares); UVIGO, Universidad de Vigo (Galicia); AZTI, Centro Tecnológico del Mar y los Alimentos (País Vasco); UE, Universidad de Évora (Portugal); Uac, Universidad de Azores (Portugal); n, número de ejemplares estudiados…………………..……………………..…...25 Tabla 2. Descripción de 9 microsatélites para Scomber japonicus. Se indica el nombre del marcador, motivo, secuencia del cebador forward (F) y reverse (R), temperatura de hibridación y el rango de longitud en pares de bases. Cebadores marcados D3 (Beckman Dye) y D4 (Sigma-Genosys)……………………………………………...…...30 Tabla 3. Condiciones de amplificación utilizadas en cada locus en Scomber colias. Se indican las temperaturas (ºC), el tiempo y el número de ciclos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)……………………………………………………………....33 Tabla 4. Valores de absorbancia, ratio y concentración de ADN de músculo conservado en etanol al 96% y en tampón de urea 8M. Et: etanol……………………………………………………………....43 Tabla 5. Microsatélites con amplificación positiva y polimorfismo para la especie Scomber colias. Se indica el nombre del locus, motivo, secuencia del cebador forward (F) y reverse (R), temperatura de hibridación y el rango de longitud en pares de bases. Cebadores marcados D3 (Beckman Dye) y D4 (Sigma-Genosys)..…………...44 Tabla 6. Número de alelos encontrado en cada locus. Consulte la Tabla 1 para las abreviaturas de los lugares de muestreo…………………..49 xxii Tabla 7. Alelos exclusivos y frecuencia por locus y población. No se incluye la población de Faial ya que no se detectó ningún alelo exclusivo. Consulte la Tabla 1 para las abreviaturas de los lugares de muestreo. Frec.: Frecuencias………………………………………………….51 Tabla 8. Estimación de la frecuencia de alelos nulos usando el algoritmo Expectativa de Maximización (EM) por locus y población (Dempster et al. 1977)……………………………………………..54 Tabla 9. Diversidad genética de los ocho loci microsatellites analizados en la especie Scomber colias. Número de individuos analizados por locus (N), número medio de alelos por locus (A), riqueza alélica corregida por rarefacción (AR), heterocigosidad observada (HO), heterocigosidad esperada (HE) y proporción de loci polimórficos (P)……………………………………………………………….....58 Tabla 10. Parámetros de diversidad genética para las poblaciones de la especie Scomber colias. Número de individuos analizados por población (N), número medio de alelos por locus (A), riqueza alélica corregida por rarefacción (Ar), heterocigosidad observada (HO), heterocigosidad esperada (HE) y proporción de loci polimórficos (P)…………………………………………………..……………...59 Tabla 11. Parámetros de diversidad genética según el área geográfica considerada. Número de individuos analizados por área (N), número medio de alelos por locus (A), riqueza alélica corregida por rarefacción (Ar), heterocigosidad observada (HO), heterocigosidad esperada (HE) y proporción de loci polimórficos (P)……………………………………………………………….....60 Tabla 12. Test de probabilidad de desviación del equilibrio de HardyWeinberg, por locus y por población, con la corrección de Bonferroni (Método de Weir y Cockerham 1984); ns: no significativo; *: p < 0, 006………………………………….……...63 xxiii Tabla 13. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal con el método de corrección ENA (Chapuis y Estoup, 2007) y encima de la diagonal estimación de la distancia genética (DC, Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) usando el método de corrección INA (Chapuis y Estoup, 2007), entre las poblaciones muestreadas de S. colias. ns: no significativo; *: p < 0,006 (ajuste de Bonferroni)…………………………………………………..……65 Tabla 14. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal método de corrección ENA (Chapuis y Estoup, 2007) y encima de la diagonal estimación de la distancia genética (DC, Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) usando el método de corrección INA (Chapuis y Estoup, 2007), entre las áreas muestreadas de S. colias. Consulte Tabla 1 para las abreviaturas de las áreas de muestreo…………....66 Tabla 15. Estimaciones del valor de K siguiendo el método Evanno et al. 2005 para las poblaciones de Scomber colias………….……..…...74 Tabla 16. Estimaciones del valor de K siguiendo el método Evanno et al. (2005) para las áreas establecidas……………………………….…77 Tabla 17. Análisis jerárquico de la varianza molecular (AMOVA) en Scomber colias. Océano Atlántico (GC, TN, PA, FU, GO, SM, VI, PV, PO) vs. Mediterráneo (ME, VIL), Atlántico Noreste (VI, PV, PO) vs. Macaronesia (GC, TN, PA, FU, GO, SM) vs. Mediterráneo (ME, AL, VIL), Canarias (GC, TN, PA, FU, GO) vs. Resto de poblaciones (SM, ME, AL, VIL, VI, PV, PO). Consulte Tabla 1 para las abreviaturas de las poblaciones analizadas………………...…..80 Tabla 18. Probabilidad de excesos de heterocigosidad según el Test de Wilcoxon asumiendo que los loci se ajustan a un modelo de dos fases (TPM), con el ajuste de Bonferroni P < 0,006; ns: no significativo………………………………………..…………...….85 Tabla 19. Comparativa de la diversidad genética encontrada en distintas especies del género Scomber. Número de individuos analizados (N), xxiv número medio de alelos por locus (A), heterocigosidad esperada (HE)……………………………………………………………....100 Tabla 20. Comparativa de la diversidad genética encontrada en distintas especies de teleósteos. Número de individuos analizados (N), número medio de alelos por locus (A), heterocigosidad esperada (HE)…………………………………………………………...….101 Tabla 21. Coeficiente de diferenciación genética (FST), encima de la diagonal y debajo de la diagonal estimación de la distancia genética (DC, Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) (Chapuis y Estoup, 2007), entre las poblaciones muestreadas de S. colias, sin la corrección de alelos nulos; ns: no significativo; *: p < 0,006 (ajuste de Bonferroni).…173 Tabla 22. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal, con el programa GENODIVE, entre las poblaciones muestreadas de S. colias; ns: no significativo; *: p < 0,006 (ajuste de Bonferroni)……………………………………………………….174 Tabla 23. Estimaciones del valor de K siguiendo el método Evanno et al. 2005 para las áreas establecidas sin los loci bajo selección Scja01 y Scja03……………………………...……………………………..175 Tabla 24. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal, con el programa FREENA, entre las poblaciones muestreadas de S. colias, sin los loci Scja01 y Scja07………................................…177 Tabla 25. Estimaciones del valor de K siguiendo el método Evanno et al. 2005 para las áreas establecidas sin los loci Scja01 y Scja07, que presentan alelos nulos…………………………………………….179 Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 3 1.1. Caballa del Atlántico, Scomber colias La familia Scombridae contiene 15 géneros y unas 51 especies de peces migratorios y epipelágicos, que se caracterizan por poseer un cuerpo alargado y fusiforme aunque moderadamente comprimido en algunos géneros (Collette et al. 2001) (Figura 1). Ésta familia incluye caballas, bonitos y atunes, y muestra una distribución mundial desde océanos tropicales a subtropicales (Collette 2003). Scomber es un género de la familia Scombridae y una de las especies más representativas es la caballa (Scomber colias, Gmelin 1789) (CastroHernández y Santana-Ortega 2000) (Figura 1). Figura 1. Scomber colias. Autor: Walter Preeitano. Scomber colias, es una especie que habita sobre la plataforma continental, en aguas cálidas, que se encuentra principalmente a profundidades de hasta 300 m (Collette 1986; Uriarte et al. 2001; Villamor et al. 2004). Su rango de distribución abarca las costas del océano Atlántico, así como las del mar Mediterráneo (Scoles et al. 1998; Collette 1999; Infante et al. 2007; Catanese et al. 2007) (Figura 2). 4 Introducción Figura 2. Mapa de distribución geográfica mundial para Scomber colias. Modelado con el rango nativo basado en el escenario de emisiones del IPCC A2. www.aquamaps.org, version de agosto de 2013. Consultado el 6 de abril de 2015. Tiene un comportamiento gregario, en cardúmenes y realiza migraciones estacionales para encontrar áreas de alimentación y desove, como la mayoría de los escombridos (Collette y Nauen 1983). La caballa es una especie sin dimorfismo sexual visible y con fertilización externa (Kramer 1969). Esta especie crece rápidamente durante el primer año de vida, entre 35,4 y 62,6 % de la longitud máxima de la especie en cada área (Kiparissis et al. 2000, Perrotta et al. 2005, Velasco et al. 2011) y alcanzan la edad adulta entre los 3 y 4 años (Castro-Hernández y Santana-Ortega 2000). La edad máxima registrada es de 13 años en las Islas Canarias y en Azores (Lorenzo et al. 1995, Carvalho et al. 2002, Velasco et al. 2011). Normalmente, el desove se produce durante la primera mitad del año en el hemisferio norte y en la segunda mitad del año en el hemisferio sur, pero alrededor del ecuador el desove tiene lugar durante todo el año (Castro-Hernández y Santana-Ortega 2000). Ocupa una posición clave en la cadena trófica de los ecosistemas del océano Atlántico y mar Mediterráneo, ya que se alimenta de zooplancton, aunque los Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 5 cefalópodos y pequeños peces pelágicos, especialmente anchoas y sardinas, son también frecuentes en su dieta (Castro-Hernández y Santana-Ortega 2000). Se tienen evidencias de canibalismo en esta especie (Castro 1991). La caballa frecuentemente es presa de atunes, marlines, peces vela, tiburones, delfines, leones marinos y aves marinas (Castro-Hernández y Santana-Ortega 2000; Zardoya et al. 2004). 1.2. Interés pesquero Además de su importancia a nivel trófico en los ecosistemas, posee un alto valor económico para las pesquerías de varios países (Castro-Hernández y Santana Ortega 2000). Según la FAO, en 2011 las capturas de caballa realizada a nivel mundial ascendían a 1,72 millones de toneladas, además de encontrarse ese año en quinta posición dentro de las 25 especies más pescadas. Asimismo, en el noroeste de África, la pesquería de caballa es realizada por cerqueros en las costas marroquíes, arrastreros pelágicos que operan bajo el acuerdo de pesca entre Marruecos-Federación Rusa y de otros buques fletados por operadores marroquíes, y por varios arrastreros pelágicos de diferentes países (Federación Rusa, Ucrania, Unión Europea y otros), también es considerado como “bycatch”, es decir especies de descarte, por la flota artesanal senegalense (FAO 2008). En Portugal, esta especie es capturada principalmente en la pesquería de cerco dirigida a la sardina. A pesar de su escaso valor comercial, sólo es superado por la sardina en el valor total de la biomasa de desembarcos anuales y de primera venta de la pesquería (INE 2011). En Azores, la flota artesanal la incluye como una especie objetivo, pero es considerada captura “bycatch” en la pesquería demersal de palangre y 6 Introducción también es utilizada como cebo para el palangre de atún y en las líneas de mano (Carvalho et al. 2002). En las Islas Canarias, la caballa es un recurso importante para la pesquería comercial (Lorenzo et al. 1995, Lorenzo y Pajuelo 1996, Popescu y Ortega 2013). En el mar Mediterráneo (Erguden et al. 2009) y Negro, una proporción importante de S. colias es capturada por las flotas de Turquía (Sever et al. 2006), pero también es una especie de gran interés comercial para las pesquerías realizadas en aguas griegas (Kiparissis et al. 2000). La caballa también es uno de los principales sustentos de la flota cerquera que opera en el área del Mar del Plata (Perrotta et al. 2009). La serie temporal de capturas de S. colias desde 1950 hasta 2011, para las diferentes áreas del océano Atlántico y aguas adyacentes mostró un claro aumento en las capturas en el área del Atlántico Central. En esos 61 años, el Atlántico Norte se ha mantenido más o menos constante vislumbrando un leve ascenso en los últimos 11 años, siendo casi 450.000 toneladas inferior al área central. En el Atlántico Sur se apreció un descenso aproximadamente desde 1980, recuperándose lentamente a partir de 2007. Las capturas tanto en el Mediterráneo como en el Mar Negro fueron muy bajas desde 1950 empezando a elevarse a casi 30.000 toneladas en 1985, siendo inestable en los años restantes y con un máximo de 112.000 toneladas en 2009 (Figura 3). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 7 Figura 3. Series temporales de la captura total mundial de Scomber colias en el Océano Atlántico, Mar Mediterráneo y Mar Negro, en toneladas. Fuente: FAO. 1.3. La genética y la identificación de poblaciones pelágicas pesqueras La identificación de stocks de peces pelágicos constituye un componente esencial de la evaluación del estado de las pesquerías, y, por otra parte, de la gestión efectiva de pesquerías y de especies amenazadas (Fazeres 2007). Delimitar los stocks de peces es necesario para la gestión pesquera, ya que de ello depende el reparto de la captura entre pesquerías competitivas, el reconocimiento y protección de las áreas de puesta, el desarrollo de una captura óptima y de estrategias de administración (Begg et al. 1999a, 1999b; Begg y Waldman 1999). Dado que muchas de las especies se distribuyen, en algún momento de su vida, en stocks mezclados, es esencial identificar y cuantificar los distintos componentes de stocks que constituyen las pesquerías actuales. 8 Introducción La aplicación del análisis genético molecular desempeña un importante rol en la mejora de la base científica para la gestión de la pesca y para asegurar la conservación y la explotación de los recursos marinos. Los peces pelágicos son un componente sustancial de las capturas de la pesca silvestre (FAO 2014) y su aprovechamiento sostenible requiere, entre otras cosas, de una mejor comprensión de las estructuras poblacionales (Hauser y Ward 1998). Los gestores pesqueros generalmente requieren de los análisis genéticos para ayudarles a identificar las poblaciones, pero como estos peces son propensos a sufrir extinciones y expansiones periódicas, los stocks genéticos pueden contener en realidad varios pools diferentes, y por ende constituirse en diferentes stocks. Las herramientas moleculares no pueden responder a todas las cuestiones relacionadas con la gestión de las pesquerías, pero juegan un papel importante en la identificación de problemas prácticos y conceptos erróneos en los puntos de vista actuales de la ecología de los peces pelágicos. Además, no proporcionan el conocimiento de los límites geográficos entre los stocks de autoreclutamiento, pero aportan información muy valiosa sobre las fluctuaciones naturales de su abundancia que luego se pueden incorporar en los modelos de pesca (Hilborn y Walters 1992). Así mismo, la investigación sobre las relaciones filogeográficas entre cada población puede permitir la reconstrucción de rutas de colonización y la identificación de posibles fuentes de recolonización después de la extinción de una población. Los datos genéticos son muy útiles cuando son capaces de detectar diferencias entre poblaciones, y siempre deben observarse como una herramienta complementaria a otras disciplinas Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 9 (oceanografía, morfometría, ecología, pesca, paleontología…) en el momento de abordar cuestiones sobre las poblaciones implicadas o sobre la estructura de las poblaciones de peces pelágicos (Hauser y Ward 1998). También son importantes para investigar la estructura social dentro de las poblaciones de peces pelágicos, ya que su evolución puede verse afectada de manera significativa, por lo que la investigación sobre los efectos selectivos del reclutamiento puede proporcionar información valiosa sobre la especiación de muchos peces (Hedgecock 1994). En la actualidad los estudios y datos genéticos han probado ser una herramienta de gran utilidad en la determinación de diferencias evolutivas entre stocks. Por ello, en el concepto de stock ya se incluyen algunas nociones sobre integridad genética (Waldman 1999), e incluso se sugiere la validez de cualquier definición que utilice marcadores heredables que permitan caracterizar un grupo específico de peces y su respectivo hábitat (Booke 1999). Las definiciones aplicadas a las pesquerías de poblaciones de peces que mantienen su integridad genética a lo largo del tiempo están generalmente mejor determinados por marcadores genéticos, al tener estos la particularidad de ser repetitivos y estables (Fazeres 2007). Los marcadores más sensibles e hipervariables, como los microsatélites, ya se han utilizado para dar respuesta a estas preguntas (Ruzzante et al. 1997) y han permitido investigaciones minuciosas sobre la estructura de las poblaciones pelágicas en relación con las características hidrográficas. Desde su descubrimiento (Litt y Luty 1989; Tautz 1989; Weber y May 1989), y debido a las tasas de mutación más altas, los microsatélites, se han utilizado cada vez más 10 Introducción como marcadores en estudios de genética de poblaciones y de conservación, en particular, aplicados a la detección de estructura poblacional en peces pelágicos marinos (Buonaccorsi et al. 2001; Durand et al. 2005; Ruzzante et al. 2006). Los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats) son regiones hipervariables constituidas por repeticiones en tándem de unos pocos pares de bases (1 a 6), presentes en el ADN nuclear, distribuidos a lo largo de los cromosomas y cada locus microsatélite es identificable por un motivo de secuencia particular (Tautz y Renz 1984). Estos marcadores son muy informativos, ya que suelen ser muy polimórficos (a menudo con más de 10 alelos por población), lo que los hace considerablemente sensibles. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del ADN, son codominantes, neutros, poseen una alta tasa de mutación y son fácilmente amplificables mediante una PCR (Goldstein y Schlötterer 1999). Todas estas características (alta variabilidad, codominancia, fiabilidad y ubicuidad) los sitúan como uno de los mejores marcadores moleculares a utilizar a nivel infraespecífico y en ocasiones interespecífico. En las últimas décadas se han aplicado un considerable número de marcadores genéticos y de técnicas moleculares para la estimación de la estructura de la población de peces pelágicos marinos (Graves 1998; Graves y McDowell 2003). La elección del enfoque molecular más adecuado ha dependido en gran medida de la facilidad de uso, el nivel de polimorfismo del marcador y de las características genéticas y evolutivas incluyendo el modo de herencia (biparental o materna), el nivel de ploidía, la expresión del marcador (dominante o codominante), y la mutación y de las tasas de evolución de la Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 19 El objetivo principal del presente trabajo es determinar el nivel de diversidad y estructura genética de las poblaciones naturales de caballa (Scomber colias) en el área del Atlántico y Mediterráneo Occidental, mediante la puesta a punto y desarrollo de técnicas de Biología Molecular (microsatélites), como herramienta para contribuir a la gestión adecuada y sostenible de este recurso pesquero. Para ello, nos planteamos como objetivos específicos: a) Elegir el tejido de Scomber colias que mejores resultados ofreca en la extracción y análisis del ADN y escoger el procedimiento óptimo que nos permita las mejores condiciones de conservación de dichos tejidos. b) Optimizar y estandarizar los protocolos de extracción, amplificación y análisis de los marcadores nucleares, microsatélites, para Scomber colias. c) Analizar los niveles de variabilidad genética de diferentes unidades poblacionales de Scomber colias en el mar Mediterráneo Occidental y el océano Atlántico. d) Estimar el flujo génico y la estructura genética de las poblaciones naturales en dichas áreas geográficas e inferir las causas y procedimientos que pudiesen estar dando lugar a las mismas. 20 Objetivos e) Establecer (posibles protocolos) propuestas de actuación que impliquen una mejora en la gestión y conservación de este importante recurso pesquero en las áreas estudiadas. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 23 3.1. Zona de muestreo Para este estudio, un total de 604 individuos de la especie S. colias fueron obtenidas a través de capturas comerciales de cerqueros artesanales, en distintas áreas geográficas, o como consecuencia de muestras cedidas por distintas instituciones y centros científicos, obtenidas en prospecciones pesqueras de otros proyectos de investigación realizados en diferentes regiones donde la especie habita. En este sentido se procedió a un muestreo que abarca tres grandes áreas de distribución: El área del Atlántico Noreste, el área del Mediterráneo y el área del Atlántico Suroeste. El área del Atlántico Noreste incluye muestras de cinco islas del Archipiélago Canario (Gran Canaria, Tenerife, Fuerteventura, La Palma y La Gomera), además de dos localidades de Azores (São Miguel y Faial). Finalmente en este área se muestrearon tres localidades más, que fueron la costa suroriental de Portugal y dos localidades del Mar Cantábrico (Ondarroa y Vigo). Las muestras del mar Mediterráneo procedieron del mar de Alborán (Almería y Melilla) y Barcelona. Por otra parte, también se obtuvieron muestras del Mar del Plata (Argentina) en el Atlántico Suroeste (Figura 4 y Tabla 1). 24 Material y Métodos Figura 4. Mapa de la localización geográfica donde se recogieron las muestras de Scomber colias. Realizados con el programa Ocean Data View. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 25 Tabla 1. Localización geográfica e instituciones que recogieron las muestras de Scomber colias. ULPGC, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (Islas Canarias); BA.IEO, Centro Oceanográfico de Baleares del Instituto Español de Oceanografía (Islas Baleares); UVIGO, Universidad de Vigo (Galicia); AZTI, Centro Tecnológico del Mar y los Alimentos (País Vasco); UE, Universidad de Évora (Portugal); Uac, Universidad de Azores (Portugal). n, número de ejemplares estudiados. 26 Material y Métodos 3.2. Estandarización del método de conservación Se inició la estandarización del método a partir de individuos adultos procedentes de establecimientos comerciales, de los cuales se extrajeron dos tipos de tejidos: hígado y músculo. Para la conservación de estos se probó el efecto de dos tipos de conservantes: urea y etanol. La preservación de los tejidos en etanol se realizó con dos porcentajes de pureza, al 70% (Bagley et al. 1999, García et al. 2006) y al 96% (Lamprea et al. 2004; Astorga 2005), y la preservación de tejido en urea consistió en un tampón con alta concentración de urea, 8M (Asahida et al. 1996). Quince días después se cogieron muestras de aquellos tejidos cuyo tampón los preservó adecuadamente, se extrajo ADN por el método descrito a continuación (ver apartado 3.3.), se tomaron medidas de absorbancia en un espectrofotómetro (BECKMAN Coulter DU 530) y se comprobó la ratio A260/A280, que es un indicador de la presencia de elementos contaminantes en las muestras, como proteínas, fenoles o cloroformo. Mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa se verificó la presencia del ADN genómico extraído. Determinado el método ideal para la conservación de los tejidos, las muestras objeto de estudio, fueron conservadas en tubos cónicos roscados de polipropileno transparente de 50 ml (DELTALAB), debidamente etiquetados. Se cubrieron en su totalidad por etanol al 96% (Lamprea et al. 2004; Astorga 2005), manteniéndose así hasta su análisis en el laboratorio. Además, se obtuvo una réplica de las muestras que también fueron conservadas en etanol al 96%. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 33 Tabla 3. Condiciones de amplificación utilizadas en cada locus en Scomber colias. Se indican las temperaturas (ºC), el tiempo y el número de ciclos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 3.5. Análisis estadísticos Los datos obtenidos para cada individuo y locus amplificado se incluyeron en una hoja de cálculo Excel y, a partir de ahí, se modificó el formato para hacer distintas hojas de entrada para los diferentes programas de análisis genético. Las frecuencias genéticas de cada locus, localidad y área, además de la frecuencia de los alelos exclusivos fueron estimadas utilizando el programa GenAlex 6.5 (Peakall y Smouse 2012). La variación genética (número medio de alelos por locus (A), heterocigosidad observada (HO), heterocigosidad esperada (HE) y el porcentaje de loci polimórficos (P)) se calculó entre poblaciones utilizando también el programa GenAlex 6.5 (Peakall y Smouse 2012). Para comparar adecuadamente la riqueza alélica ponderada por número de muestras (Ar) entre las poblaciones, las cuales tienen 34 Material y Métodos diferentes tamaños muestrales, se ha realizado un procedimiento de rarefacción mediante el software HP-Rare (Kalinowski 2005). Se evaluó la frecuencia de alelos nulos empleando el algoritmo de Expectativa de Maximización de Dempster et al. (1977), por población, mediante el programa FREENA (Chapuis y Estoup 2007). Adicionalmente, se usó MICRO-CHECKER v2.23 (Van Oosterhout et al. 2004) para conocer si los alelos nulos podrían ser causados por errores en la genotipación, presencia de bandas numerarias (sttuters), o pérdida de alelos largos y se aplicó el ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples (Rice 1989). Se verificó la neutralidad de los microsatélites, es decir que no se encuentran bajo selección, utilizando el programa LOSITAN (1.000.000 de simulaciones, un intervalo de confianza de 99,5, valor medio de FST neutral forzado, submuestra X; Antao et al. 2008), el cual implementa el método de Beaumont y Nichols (1996), en el que considera que los niveles de endogamia que presentan loci neutrales deben ser iguales debido a su historia demográfica compartida. Teniendo esto en cuenta, se proyectaron todos los loci en una gráfica de valores de FST frente a la heterocigosidad esperada (HE), cualquier locus que se aparte significativamente de esta distribución estaría bajo el efecto de la selección. Para determinar si las poblaciones analizadas se encontraban en equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) se estimó la relación entre el número de individuos heterocigotos observados y el esperado, evaluado a partir del índice de endogamia (FIS) por locus y por población, de acuerdo con el nivel de significación estadístico determinado por medio de 10.000 iteraciones según el método de Cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) mediante el programa Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 35 GENEPOP v.4 (Rousset 2008). Además, para garantizar la segregación independiente entre los alelos de distinto loci se aplicó un test de probabilidad de Fisher utilizando GENEPOP v.4.0.10 (10.000 pasos de depuración, 100 lotes, 10.000 iteraciones por lote; Rousset 2008). Éste permite realizar un test de Probabilidad cuya hipótesis nula (HO) es la unión al azar de los gametos para cada locus. Asimismo, en dicho programa también se analizó el desequilibrio de ligamiento de cada par de loci para confirmar la independencia de los microsatélites seleccionados. La significancia estadística de estas pruebas se ajustó empleando una prueba secuencial de Bonferroni. Debido a que muchos de los microsatélites empleados en este trabajo se desviaron del equilibrio de HW, se calcularon los índices de diferenciación FST de Weir (1996) y se implementó además una corrección para la presencia de alelos nulos, mediante el programa FREENA (Chapuis y Estoup 2007). Los valores de estas matrices fueron representados en un dendrograma consenso, construido por el método del vecino más cercano, Neighbor-Joining en MEGA 4.1 Beta 3 (Kumar et al. 2008). Las distancias genéticas (DC) Cavalli-Sforza y Edwards (1967) entre individuos y poblaciones se calcularon mediante el software POPULATION 1.2.30 BETA (Langella 2005) y también se implementó una corrección para la presencia de alelos nulos, mediante el programa FREENA (Chapuis y Estoup 2007). A partir de la matriz de datos de distancia se construyó un dendrograma con fortaleza en los agrupamientos (1.000 repeticiones). Los resultados se visualizaron en MEGA 4.1 Beta 3 (Kumar et al. 2008) y TreeView v.1.1.6 (Page 1996). 36 Material y Métodos Para conocer el patrón de agrupamiento de todas las poblaciones en el espacio se realizó un Análisis de Coordenadas Principales (PCoA), que utilizó directamente los datos de la matriz de diferenciación genética, extrayendo la información relevante y generando así nuevas variables denominadas como coordenadas principales. Este análisis se llevó a cabo con el programa GenAlex 6.5 (Peakall y Smouse 2012). La estructura poblacional fue inferida por un método de agrupación bayesiana mediante el programa STRUCTURE 2.2 (Falush et al. 2007) sin información previa poblacional (suponiendo que todas las muestras pertenecen a una única población). Este programa asigna probabilísticamente el genotipo de los individuos en grupos genéticos con el fin de minimizar las desviaciones de HardyWeinberg y el equilibrio de ligamiento. La longitud de las iteraciones de MCMCs (Markov Chain Monte Carlo) y el proceso de “bur-in” se fijó en 1.000.000 de replicaciones y 100.000 períodos de prueba, respectivamente. Se utilizó un modelo de mezcla, que permite que los individuos tengan múltiples orígenes poblacionales (calculando su proporción de pertenencia a cada grupo), con un modelo de frecuencias correlacionadas, recomendado cuando la diferenciación genética no es muy marcada (Falush et al. 2003). El rango de posibles grupos (K) analizados estuvo entre 1 y 15, llevando a cabo análisis independientes para verificar la consistencia de los resultados entre los diferentes análisis para cada estimación de K. Se realizó el mismo análisis por áreas, pero en este caso el rango de posibles grupos (K) fue de 1 a 4. Los resultados obtenidos en cada análisis de STRUCTURE fueron analizados en el programa STRUCTURE HARVESTER 0.6.93 Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 37 (Earl 2012), que evalúa la probabilidad acumulada y posterior de los datos [Ln Pr(X/K)] para cada valor de K determinado. Éste infirió el valor óptimo de K a partir del valor modal de ∆K (Evanno et al. 2005) como criterio para detectar el verdadero número de grupos genéticos. La cantidad de variabilidad genética distribuida dentro y entre las poblaciones se evaluó a partir de un análisis de varianza molecular (AMOVA, Excoffier et al. 1992) en base a las frecuencias haplotípicas con 1000 permutaciones entre diferentes regiones geográficas. El AMOVA permite determinar la cantidad de variabilidad genética contenida dentro de subgrupos, dentro de grupos y entre ellos, por medio de un análisis jerarquizado mediante porcentajes de varianza e índices de fijación, F de Wright (Weir y Cockerham 1984), los cuales fueron calculados con ARLEQUIN v 3.5 (Excoffier et al. 2010). Se evaluó si la especie sigue un patrón de aislamiento por distancia, a través del test de Mantel, el cual realiza una correlación entre las distancias geográficas y genéticas (Mantel 1967). Las distancias geográficas en kilómetros lineales, entre los 14 puntos de muestreo, fueron calculadas con Google Earth y comparadas con una matriz de distancias linealizadas de Slatkin (FST/1-FST) (Slatkin y Hudson 1991) mediante 1000 pasos aleatorios en IBDWS v 3.23 (Isolation By Distance Web Service) (Jensen et al. 2005). Para comprobar la existencia de eventos de deriva genética en las poblaciones, se llevó a cabo una prueba que determina posibles cuellos de botella mediante el test de Wilcoxon de doble cola de exceso de heterocigotos que se obtienen por medio del programa BOTTLENECK v1.2.02 (Piry et al. 1999) que calcula la probabilidad de ocurrencia de un cuello de botella en función del modelo 38 Material y Métodos mutacional asumido. Para ello, se utilizó el modelo TPM (Modelo de dos fases, Di Rienzo et al. 1994) para datos de microsatélites, que asumen que un porcentaje de las mutaciones (10%) sigue el modelo IAM (Modelo de alelos infinito), y el porcentaje restante (90%) el modelo SSM. En él se implementaron 10.000 iteraciones y la significancia estadística de esta prueba se ajustó empleando una prueba secuencial de Bonferroni. Este mismo programa proporciona una salida gráfica correspondiente al método de Cornuet y Luikart (1996). El cual es de gran utilidad para visualizar la existencia de cuellos de botella recientes, pese a que es un método cualitativo y no cuantitativo. Se basa en una representación gráfica, donde el eje X representa los intervalos de frecuencia alélicas, mientras que el eje Y se corresponde con la frecuencia acumulada de dichas frecuencias. De este modo, se puede conocer el rango de frecuencias en que se incluyen la mayoría de los alelos de la población. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 41 4.1. Estandarización del método de conservación Las pruebas de conservación en tampón de urea 8M de los diferentes tejidos (hígado y músculo) ponen de manifiesto la degradación de ambos tejidos, siendo especialmente notable en el hígado (Figura 5). La valoración macroscópica de los tejidos conservados puso de manifiesto las óptimas condiciones de conservación del tejido muscular en el etanol (96% y 70%) (Figura 6). Figura 5. Hígado conservado en tampón de Urea. A la izquierda tejido recién introducido y a la derecha el mismo tejido 15 días después (diluido). Resultados 42 Figura 6. A. Músculo conservado en tampón de Urea, etanol al 96% y etanol al 70%. B. Músculo conservado en tampón de Urea, etanol al 96% y etanol al 70% (después de 15 días). Los valores de absorbancia y concentración de ADN obtenidos por espectrofotometría tras realizar la extracción de ADN y posterior purificación de las muestras de tejido muscular conservadas en etanol (96%) y urea 8M, muestran la presencia de ADN en todas las muestras independientemente del método de conservación. Sin embargo, los valores de ratio A260/A280 indican la presencia de impurezas en el ADN obtenido en muestras conservadas en urea, ya que el cociente A260/A280 debe de estar entre 1,8 y 2,0, valores menores indican contaminación con proteínas y valores superiores contaminación con fenoles, no siendo éste por tanto un ADN de la calidad adecuada para realizar las amplificaciones (Tabla 4). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 49 Tabla 6. Número de alelos encontrado en cada locus. Consulte la Tabla 1 para las abreviaturas de los lugares de muestreo. Resultados 50 São Miguel: se detectó un total de 217 alelos. Ésta población mostró el mayor número de alelos del área de Azores. El mayor número de alelos (43) fue detectado en el locus Scja06, mientras que el menor número de alelos (12) se encontró en el locus Scja03. Faial: se detectó un total de 80 alelos en ésta población, siendo el menor en el archipiélago de Azores (AZ). En los loci Scja04 y 06 se encontraron el mayor número de alelos (15) y en el locus Scja01 el menor número (4). Mar del Plata: se detectó un total de 120 alelos. En el locus Scja04 se detectó el mayor número de alelos (23) y en el locus Scja03 el menor (8). En la Tabla 7 se muestra el número de alelos exclusivos y sus frecuencias por locus y por población. La que más alelos exclusivos presentó fue la de São Miguel (8 alelos) mientras que la de Faial no presenta ningún alelo exclusivo. Las poblaciones que presentaron un mayor número de alelos exclusivos en un mismo locus fueron la de La Palma (locus Scja04 con 3 alelos) y la de Ondarroa (locus Scja01 con 3 alelos). Las frecuencias de los alelos exclusivos fueron en general bajas, no superando el 3,3%, lo cual indica que aparecieron en un escaso número de individuos. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 51 Tabla 7. Alelos exclusivos y frecuencia por locus y población. No se incluye la población de Faial ya que no se detectó ningún alelo exclusivo. Consulte la Tabla 1 para las abreviaturas de los lugares de muestreo. Frec.: Frecuencias. Resultados 52 Haciendo una descripción de la frecuencia alélica por área geográfica (Anexo I): El área del Archipiélago Canario (CA) presentó un total de 239 alelos y el mayor número de alelos exclusivos detectados (15), al compararla con las demás áreas. El área de la Costa Mediterránea (ME) presentó un total de 555 alelos y 13 alelos exclusivos. El área de la Costa Norte y Noroeste Peninsular (NNP) presentó el mayor número de alelos (605) al compararla con las demás áreas y 10 alelos exclusivos. En el área del Archipiélago de Azores (AZ) presentó un total de 297 alelos y 8 alelos exclusivos. El área de la Costa de Mar del Plata (MP) presentó el menor número de alelos (120) y de alelos exclusivos (4). 4.3.1. Alelos nulos La frecuencia de alelos nulos para cada población y locus se estimó utilizando dos metodologías: 1) los algoritmos de Chakraborty et al. (1997) y de Brookfield (1996) incluidos en el programa MICRO-CHECKER v.2.2.3; y 2) el algoritmo Expectativa de Maximización (EM) de Dempster et al. (1977) del programa FREENA. El segundo método obtiene mejores resultados que los estimadores de frecuencia de alelos nulos que proporciona MICROCHECKER (Chapuis y Estoup 2007), se muestran por locus y por población en la Tabla 8. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 53 El programa MICRO-CHECKER descartó errores en la asignación de genotipos debido a otros artefactos, tales como la pérdida completa de uno de los dos alelos en la amplificación (allelic dropout) o la presencia de elevados porcentajes de bandas tartamudas (stuttering), pero encontró evidencias de alelos nulos en todas las poblaciones. Se encontró la presencia de alelos nulos a través de las poblaciones analizadas, en las dos metodologías, lo que explicaría el significativo déficit de heterocigotos encontrado, excepto en el locus Scja05 y el locus Scja08, lo cual coincide con el análisis del equilibrio HW, pues fueron los únicos que no presentaron una desviación significativa (Tabla 12). Los loci con una mayor incidencia y frecuencia de alelos nulos en todas las poblaciones muestreadas fueron el Scja01, Scja07, los demás loci presentan en general, unas frecuencias de alelos nulos menores al 18% (Tabla 8 y Figura 7). Resultados 54 Frecuencia elevada> 0,2 Frecuencia baja < 0,2 Tabla 8. Estimación de la frecuencia de alelos nulos usando el algoritmo Expectativa de Maximización (EM) por locus y población (Dempster et al. 1977). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 55 Figura 7. Frecuencia de alelos nulos por locus y localidad usando el algoritmo Expectativa de Maximización (EM) (Dempster et al. 1977). 4.3.2. Locus bajo selección La prueba de neutralidad detectó que los loci Scja01 y Scja03 se encontraron bajo selección natural positiva o direccional. Los demás microsatélites analizados se encontraron en la región que se refiere a loci neutrales. Los resultados obtenidos fueron similares tanto en el modelo mutacional de alelos infinitos como en el modelo de mutación por pasos, por lo que en la Figura 8 se muestran los resultados del primero. Resultados 56 Figura 8. Resultados de la prueba de neutralidad para 8 loci microsatélites en Scomber colias, usando el modelo de alelos infinitos (Antao et al. 2008). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 57 4.3.3. Niveles de variabilidad genética El nivel de variabilidad genética de la especie se estimó teniendo en cuenta el total de muestras analizadas (Tabla 9). También se determinó por población (Tabla 10) y por cada una de las áreas geográficas consideradas (Tabla 11). En general, la diversidad genética detectada fue considerablemente elevada en todos los índices de diversidad utilizados. i. Variabilidad genética por locus Todos los loci analizados fueron polimórficos. El número medio de alelos per locus (A) fue muy elevado, variando entre 32,14 (Scja06) y 11,21 (Scja03). La heterocigosidad esperada presentó valores altos, siendo la heterocigosidad observada inferior a la esperada, lo cual explica el defecto de heterocigóticos detectados. La heterocigosidad observada media para todos los loci fue de 0,730, oscilando entre 0,937 (Scja05) y 0,328 (Scja01). El valor de la heterocigosidad esperada media fue 0,888, con valores muy similares en los ocho loci analizados, oscilando entre 0,949 (Scja04 y Scja06) y 0,727 (Scja03). ii. Variabilidad genética por población El número medio de alelos per locus (A) fue también alto en todas las poblaciones, variando entre 27,1 (São Miguel) y 10,6 (Faial) (Tabla 10 y Figura 9). Al estimar la riqueza alélica por rarefacción (Ar), la cual hace un ajuste considerando un tamaño de muestra reducido, los valores resultaron similares entre las poblaciones, oscilando entre 8,81 (São Miguel) y 7,85 (La Gomera). La heterocigosidad observada media para todas las poblaciones fue de Resultados 58 0,730, oscilando entre 0,789 (Melilla) y 0,662 (Faial). El valor de la heterocigosidad esperada media para todas las poblaciones fue 0,888, con valores muy similares en las catorce poblaciones estudiadas, con máximos en São Miguel (HE = 0,915) y mínimos de nuevo en Faial (HE = 0,857) (Tabla 10.) Tabla 9. Diversidad genética de los ocho loci microsatellites analizados en la especie Scomber colias. Número de individuos analizados por locus (N), número medio de alelos por locus (A), riqueza alélica corregida por rarefacción (AR), heterocigosidad observada (HO), heterocigosidad esperada (HE) y proporción de loci polimórficos (P). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 65 Tabla 13. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal con el método de corrección ENA (Chapuis y Estoup, 2007) y encima de la diagonal estimación de la distancia genética (DC, Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) usando el método de corrección INA (Chapuis y Estoup, 2007), entre las poblaciones muestreadas de S. colias. ns: no significativo; *: p < 0,006 (ajuste de Bonferroni). Valores más bajos Valores más elevados Resultados 66 De forma general, los resultados obtenidos corregidos por los algoritmos ENA para FST e INA para DC, como sin corregir (Anexo II), fueron iguales y próximos a cero en ambos índices, revelando un grado de estructuración bajo. Asimismo, en ambos análisis, se encontraron diferencias entre las poblaciones del Mediterráneo (Vilanova y Melilla) frente a las demás. Tabla 14. Coeficiente de diferenciación genética (FST), debajo de la diagonal método de corrección ENA (Chapuis y Estoup, 2007) y encima de la diagonal estimación de la distancia genética (DC, Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) usando el método de corrección INA (Chapuis y Estoup, 2007), entre las áreas muestreadas de S. colias. Consulte Tabla 1 para las abreviaturas de las áreas de muestreo. Valores más bajos Valores más elevados 4.4.2. Dendrogramas de diferenciación y distancia genética Las matrices de valores del coeficiente de diferenciación genética (FST) y distancia genética (DC) sirvieron de base para la construcción de dos dendrogramas poblacionales basados en el método de agrupamiento NJ (Neighbour-joining) establecidos sobre las poblaciones y áreas de S. colias estudiadas. A nivel poblacional se obtuvieron dos ramas principales (I y II, en Figura 10), donde las poblaciones se agruparon siguiendo un Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 67 patrón geográfico definido, a excepción de los puntos de muestreo correspondientes al Mar del Plata y a Faial, que son localidades geográficamente lejanas a las ramas en que se enrutan, probablemente debido a su bajo número de individuos. La rama que soporta mayor número de localidades (II) engloba a su vez dos subgrupos, además del mencionado Mar del Plata, otro donde se encuentran São Miguel, Canarias y las poblaciones del norte y noroeste de la Península, además de Almería. En la otra rama principal (I) encontramos las poblaciones pertenecientes a la costa Mediterránea, Vilanova y Melilla, además de Faial. Figura 10. Dendrograma NJ que agrupa las poblaciones de acuerdo al grado de diferenciación genética (FST), con el método de corrección ENA (Chapuis y Estoup 2007). Resultados 68 A diferencia que con FST, en el dendrograma de la Figura 11, obtenido a partir de las distancias genéticas (DC) de Cavalli-Sforza se obtuvieron tres ramas. La primera (I) rama soporta a las poblaciones ubicadas en el Mediterráneo. La rama central (II) contiene todas las poblaciones de Canarias y las de la Costa Norte y Noroeste de la Península (con la excepción de Almería), separadas de la del Mar del Plata. La tercera (III) soporta la población de Faial. También se realizaron dos dendrogramas con cada una de las matrices del coeficiente de diferenciación genética (FST) y la distancia genética (DC) obtenida para las áreas geográficas. La conformación general del dendrograma, a partir del FST, mostró claramente dos clados diferenciados. El primero (I) incluía el área del Archipiélago Canario (CA) y la costa Norte Noreste de la Península (NNP) y el segundo (II) el Mediterráneo (ME), Azores (AZ) y Mar del Plata (MP) (Figura 12). El dendrograma que se obtuvo a partir de DC, mostró una estructura completamente diferente. La rama (I) que soportaba más peso, contenía un clado con NNP, ME y otro con AZ. Una segunda rama (II) con el área CA y la tercera (III) soportaba el área del MP. En este caso los resultados mostraron que las áreas más cercanas geográficamente son más parecidas genéticamente (Figura 13). De forma general, los resultados obtenidos a partir de los dos índices muestran diferencias evidentes, basados en los distintos algoritmos con los que han sido analizados, pero coinciden tanto en poblaciones como en áreas en que las poblaciones del área del Mediterráneo aparecen más diferenciadas, con excepción de la Figura 13. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 69 Figura 11. Dendrograma NJ que agrupa las poblaciones de acuerdo a la distancia genética (DC), con el método de corrección INA (Chapuis y Estoup 2007). Resultados 70 Figura 12. Dendrograma NJ que agrupa las áreas de acuerdo al grado de diferenciación genética (FST), con el método de corrección ENA (Chapuis y Estoup 2007). Figura 13. Dendrograma NJ que agrupa las áreas de acuerdo al grado de distancia genética (DC), con el método de corrección INA (Chapuis y Estoup 2007). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 71 4.4.3. Análisis de Coordenadas Principales El PCoA estableció las relaciones de similitud genética para las 14 poblaciones analizadas. En este análisis se explica un 77,11% de la varianza genética obtenida entre las dos primeras coordenadas. Los resultados muestran dos grandes grupos bien diferenciados (A y B). El grupo A está formado por las poblaciones del Mediterráneo (I), Melilla y Vilanova, y el grupo B constituido por el resto de las muestras que pertenecen a las poblaciones del Atlántico: São Miguel, Vigo, Sines, Ondarroa, (II) y las de Canarias (III). La población de Almería, situada geográficamente en el Mediterráneo, es la excepción de este patrón, ya que se integra en el grupo de las atlánticas. Finalmente las poblaciones de Faial y Mar del Plata (IV) se descuelgan de todos los agrupamientos quedando en un lugar intermedio entre ambos grupos, probablemente debido al menor número de individuos analizados (Figura 14). Esto coincide con los dendogramas NJ por poblaciones basados en el coeficiente de diferenciación (FST) y las distancias genéticas (DC). Los dos grupos (A y B) como los cuatro subgrupos (I, II, III, IV), obtenidos concuerdan con los resultados extraídos para el análisis bayesiano en el siguiente apartado. Resultados 72 Figura 14. Representación gráfica del análisis de coodenadas principales de las 14 poblaciones de Scomber colias analizadas. A.: grupo de poblaciones del Mediterráneo (I). B.: grupo de poblaciones del Atlántico (II, III y IV). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 73 4.4.4. Análisis de Inferencia Bayesiana El programa STRUCTURE (Pritchard et al. 2000), identificó la separación de grupos genéticamente homogéneos. En la primera evaluación se incluyeron todos los individuos (604), correspondientes a las 14 poblaciones de S. colias muestreadas, con el 100% de los genotipos para los 8 loci. Se realizaron tres repeticiones independientes del programa probando diferentes valores de grupos genéticos posibles (K), desde K= 1 hasta K= 15. En ésta prueba, tras el análisis de la media de la desviación estándar del logaritmo de la probabilidad de los datos, la tasa de variación de la probabilidad de distribución (media), el valor absoluto de segundo orden de la probabilidad de distribución y los valores modales de Delta de K frente a los valores de los posibles grupos genéticos, se infirió que el número de agrupaciones fue de K = 4 (Figura 15), el cual muestra el valor más elevado de Delta de K = 17,804 (Tabla 15). Resultados 74 Tabla 15. Estimaciones del valor de K siguiendo el método Evanno et al. 2005 para las poblaciones de Scomber colias. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 81 4.4.6. Aislamiento por distancia Con el objetivo de vislumbrar si existía una relación directa entre las distancias geográficas de las poblaciones y las distancias genéticas, se procedió a averiguar si la posible relación estuviese integrada en un modelo de aislamiento por distancia (IBD). Para ello, se realizó un test de Mantel según el cual, se correlaciona la distancia genética determinada por FST / (1-FST) y la distancia geográfica (km), de las poblaciones muestreadas. En esta ocasión el coeficiente de correlación fue bastante bajo (r = 0,282, R2 = 0,079) y significativo P = 0,004 (Figura 19) por lo que se concluyó que no hay un claro aislamiento por distancia. Se realizó también un test de Mantel para las poblaciones de la costa Norte y Noroeste de la Península junto con Almería y otro con las poblaciones del Archipiélago Canario, ya que en ambos casos aparecían muy relacionadas entre sí en el análisis de coordenadas principales (PCoA). En ambos casos se obtuvo un bajo coeficiente de correlación, r = 0,34, R2 = 0,116, P = 0,189 para las poblaciones de Canarias y r = 0,42, R2 = 0,182, P = 0,229 para las poblaciones de la costa Norte y Noroeste de la Península-Almería, siendo no significativos (Figura 20 y 21). Por lo que muestran la inexistencia de un patrón de aislamiento por distancia. Resultados 82 Figura 19. Relación entre distancia genética (FST / (1-FST)) frente a la distancia geográfica (Km) para todas las poblaciones de Scomber colias analizadas. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 83 Figura 20. Relación entre distancia genética (FST / (1-FST)) frente a la distancia geográfica (Km) para las poblaciones de Scomber colias analizadas en el Archipiélago Canario. Resultados 84 Figura 21. Relación entre distancia genética (FST / (1-FST)) frente a la distancia geográfica (Km) para todas las poblaciones de Scomber colias analizadas en la costa Norte y Noroeste de la Península-Almería. 4.4.7. Detección de cuellos de botella El análisis demográfico realizado con el programa BOTTLENECK reflejó que en el modelo de dos fases (TPM) no se detectó evidencias de cuellos de botella en ninguna de las poblaciones (Tabla 18). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 85 Tabla 18. Probabilidad de excesos de heterocigosidad según el Test de Wilcoxon asumiendo que los loci se ajustan a un modelo de dos fases (TPM), con el ajuste de Bonferroni P < 0,006; ns: no significativo. Además los resultados del análisis de la distribución de frecuencias alélicas señalaron una distribución “en forma de L” para todas las poblaciones, descartando la existencia de cuellos de botella reciente, es decir que hay una mayor proporción de alelos en frecuencias alélicas bajas (rango 0,001-0,1) que en frecuencias alélicas intermedias. El caso contrario sería el esperado para una población que hubiese pasado por un cuello de botella (Figura 22.A. y 22. B.). Resultados 86 Figura 22. A. Distribución de frecuencias alélicas acumuladas frente a los intervalos de frecuencias alélicas de todos los microsatélites analizados en las poblaciones muestreadas para Scomber colias. Se observa una distribución “en forma de L”. Los valores a lo largo del eje X representan el valor máximo para cada clase de frecuencia de los alelos (la primera clase representa alelos con frecuencias entre 0 y 0,1; la segunda, entre 0,1 y 0,2; etc.). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 87 Figura 22. B. Distribución de frecuencias alélicas acumuladas frente a los intervalos de frecuencias alélicas de todos los microsatélites analizados en las poblaciones muestreadas para Scomber colias. Se observa una distribución “en forma de L”. Los valores a lo largo del eje X representan el valor máximo para cada clase de frecuencia de los alelos (la primera clase representa alelos con frecuencias entre 0 y 0,1; la segunda, entre 0,1 y 0,2; etc.) Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 97 5.4. Equilibrio de Hardy-Weinberg Todas las poblaciones se encontraban en desequilibrio de Hardy-Weinberg (HW), presentando un déficit de heterocigóticos (Tabla 12). El déficit de heterocigóticos en las poblaciones naturales de una especie puede ser consecuencia de diversos factores entre los cuales se encuentra la presencia de alelos nulos, como se mencionó anteriormente, el cruzamiento frecuente de ejemplares genéticamente emparentados, que haría aumentar el grado de endogamia en las poblaciones analizadas, el efecto Wahlund, consecuencia de existencia de estructuración genética intrapoblacional o la presencia de selección contra individuos heterocigóticos (Hartl y Clark 2007). La presencia de alelos nulos, principalmente en el locus Scja01, debido a la no amplificación de algunos de ellos (Dakin y Avise 2004; Chapuis y Estoup 2007) conduciría a una menor detección de alelos, ya que estando presentes en la población no se ponen de manifiesto y, por tanto, generarían unos valores de frecuencias alélicas que no estarían en equilibrio de HW. Sin embargo, encontramos defecto de heterocigóticos en la mayoría de los loci que no presentan alelos nulos (Tabla 8 y 12), por lo que podemos descartar la presencia de alelos nulos como causa principal de la existencia del defecto de heterocigóticos. En varios estudios se han encontrado que las poblaciones de peces marinos pueden presentar deficiencia de heterocigóticos consecuencia de un alto grado de endogamia (Zarraonaindia et al. 2009; Anderson y Karel 2012; McCairns et al. 2012; O’Leary et al. 2013; Cheng et al. 2014). En estos estudios el defecto de heterocigóticos es generalmente atribuido a la técnica o errores de 98 Discusión muestreo, y no suelen incluir explicaciones biológicas alternativas como la endogamia. Así autores como Hoarau et al. (2005) y O’Leary et al. (2013) sugieren que la endogamia debería ser considerada más frecuentemente como una posible causa de la desviación del equilibrio de HW en peces marinos sobreexplotados y con alta importancia comercial. Por lo que no podemos descartar el posible efecto de la endogamia en el desequilibrio de HW detectado en S. colias, sin hacer un análisis de parentesco apropiado, y disponer así de una evaluación menos sesgada de la magnitud y las causas de las desviaciones del equilibrio de HW (O’Leary et al. 2013). Sin embargo, los elevados niveles de variación genética mostrados en las poblaciones analizadas, nos hacen concluir que la endogamia no es el fenómeno biológico que hace que exista un defecto de heterocigóticos. Por último, no podemos descartar que el desequilibrio de HW sea consecuencia de la existencia de una subestructuración de las poblaciones, ya que durante las migraciones de los peces pelágicos tienen lugar la formación de cardúmenes, los cuales están constituidos por el reclutamiento de ejemplares de distintas cohortes (al menos en las fases adultas cuando existe una cierta convergencia de las talla). Es posible que en nuestras muestras se hayan analizado subestructuras genéticas inapreciables e indetectables de otra forma, y por tanto no podemos descartar el efecto Wahlund. Resultados similares se han descrito en otras especies de peces pelágicos (González et al. 2008). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 99 5.5. Diversidad Genética El estudio de la variación genética de poblaciones naturales de especies de peces pelágicos marinos ha demostrado ser particularmente difícil. Esto es debido a las peculiaridades biológicas de los mismos, incluyendo grandes tamaños efectivos de población y altas capacidades de dispersión, así como por la aparente falta de barreras físicas para el flujo de genes en el medio marino (Ward et al. 1994; Avise 1998; Graves 1998; Hauser y Ward 1998; Cowen y Sponaugle 2009). El nivel de variabilidad genética encontrada en las poblaciones de S. colias, fue globalmente alta, y similar a los niveles descritos en la bibliografía para otras especies del mismo género (Yagishita y Kobayashi 2008; Tang et al. 2009; Tzeng et al. 2009), siendo mayores a los que utilizan los mismos microsatélites (Cheng et al. 2015) (Tabla 19). Incluso, los niveles de variabilidad han sido superiores a los encontrados en otras especies tales como atún rojo, Thunnus thynnus, jurel del Pacífico sur o chileno Trachurus murphyi o caballa española Scomberomorus commerson (Carlsson et al. 2004; Cárdenas et al. 2009; Fauvelot y Borsa 2011) (Tabla 20). Estamos, por tanto, ante una especie con elevados niveles de diversidad genética, los cuales parecen distribuirse más o menos homogéneamente entre todas las regiones o áreas estudiadas. Al comparar la diversidad genética por áreas geográficas se aprecia que las poblaciones pertenecientes a la costa Mediterránea (ME) poseen una diversidad levemente superior (HE = 0,900), siendo la segunda con valores más elevados en riqueza alélica (Ar = 8,69) y número de alelos exclusivos (13). Posiblemente la separación de las poblaciones 100 Discusión estudiadas del Mediterráneo hace que tengan dichos niveles (ver apartado 5.6. Diferenciación y estructura genética). Tabla 19. Comparativa de la diversidad genética encontrada en distintas especies del género Scomber. Número de individuos analizados (N), número medio de alelos por locus (A), heterocigosidad esperada (HE). Los niveles de diversidad genética en cualquier especie son consecuencia de numerosos factores biológicos, evolutivos, históricos o geográficos, destacando la capacidad de migración, el grado de cruzamiento y la historia evolutiva de la especie (Amos y Harwood 1998). Por tanto, entendemos que los niveles de variabilidad genética detectados son posiblemente debidos a que S. colias es una especie con una alta capacidad migratoria, así como con una alta dispersión a nivel larval y por ende con un flujo genético considerable. Esto hace que mantenga un proceso de conectividad muy elevado, eliminando la estructuración genética, reduciendo los efectos estocásticos de la acción de la deriva genética y, por tanto, elevando el nivel de Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 101 variabilidad genética intrapoblacional. Hecho que se ve refrendado porque no hubo evidencias de cuellos de botella cuyo efecto haya perdurado hasta las poblaciones actuales. Tabla 20. Comparativa de la diversidad genética encontrada en distintas especies de teleósteos. Número de individuos analizados (N), número medio de alelos por locus (A), heterocigosidad esperada (HE). 102 Discusión Los procesos oceanográficos y las condiciones climáticas son los responsables de limitar la distribución espacio-temporal de los individuos, larvas y huevos a distinta escala. De este modo la diversidad intra e interpoblacional en S. colias está influida por barreras físicas creadas por la circulación de las masas de agua, los regímenes de temperatura y la topografía costera, que dificultan el movimiento de los peces y sus larvas (Dawson et al. 2001). Obviamente, la distancia geográfica y las características batimétricas existentes en las áreas estudiadas constituyen también condicionantes en la posible diferenciación y separación genética de la especie, pero las barreras físicas impuestas como los gradientes de salinidadtemperatura y las profundidades (3.000 metros entre algunos puntos de muestreo) pueden impedir la migración de adultos, sin influir en la deriva de huevos y larvas (Cuyás et al. 2004). Debido a que las fases larvarias de la caballa son planctónicas, esta especie presenta un alto potencial de dispersión pasiva durante un periodo relativamente amplio (alrededor de 29 días de período larval pasivo) (Cheng et al. 2015), durante el cual las larvas y huevos pueden ser transportados fácilmente por corrientes y flanquear barreras discernibles (Palumbi 1992), alcanzando así regiones distantes. En este contexto los resultados obtenidos para S. colias son consistentes con su naturaleza cosmopolita y con estudios previos sobre la filogeografía de la especie (Scoles et al. 1998, Zardoya et al. 2004, Infante et al. 2007, Catanese et al. 2007, 2010). Además, las características biológicas de la especie apoyan los resultados obtenidos, ya que aunque no se conocen muy bien las zonas de desove y migración de esta especie en las aguas atlánticas europeas (CastroHernández y Santana-Ortega 2000; Zardoya et al. 2004; Martins et al. Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 103 2013), se sabe que el reclutamiento de S. colias es claramente diferente al de otros escómbridos. Las larvas exhiben un comportamiento voraz con raciones diarias altas (87% del peso corporal) (Hunter y Kimbrell 1980). Presenta una alta tasa de fecundidad (una hembra de 47 cm puede llegar a poner más de 800 mil huevos por periodo reproductivo (Ciechomski y Capezzani, 1969)) el doble que el de S. scombrus (400.000 huevos por año) (Metz y Myers 1969). La alta fecundidad y el comportamiento más voraz de las larvas puedan actuar contra el reclutamiento local de la especie y prevenir la estructura genética de sus poblaciones (Zardoya et al. 2004). 5.6. Diferenciación y estructura genética Los valores medios bajos (0,02) en las estimaciones del coeficiente de diferenciación (FST) en peces marinos pueden ser debidas a errores aleatorios de muestreo (ruido) o tener significado biológico (señal), y es importante determinar la contribución relativa de cada componente (Ward et al. 1994; Waples 1998). Waples (1998) dictó una serie de directrices para determinar la importancia relativa del ruido asociado con estas señales débiles de diferenciación. Explicó que la contribución relativa del muestreo intra-locus a la proporción de señal o ruido puede ser estimada con 1/(2S), donde S es el tamaño de la muestra. Para una muestra de 25 individuos, esta proporción es 0,02, valor idéntico a la estimación del FST medio de los peces marinos. En nuestro caso los valores de FST son inferiores a la media estimada para el conjunto de peces marinos, pero es una conclusión errónea pensar que estimaciones de FST <0,02 no son biológicamente significativas (Hinton y Bremer 2007). Para este estudio, considerando 104 Discusión S= 604 y un FST medio de 0,007, significativo entre poblaciones (Tabla 17), se estimó que el nivel de ruido para el tamaño de muestra fue de 0,0008, menos del 12% de la señal. Esto implica que el error de muestreo intra-locus no juega un papel importante en la explicación del valor reportado de FST. Así, el tamaño de muestra usado se considera suficiente para reducir el error de muestreo intra-locus (ruido), y permitió detectar la señal genética. Hay que tener en cuenta que discernir poblaciones biológicas frente a las estadísticas es complicado, ya que muestras de la misma población tomadas en diferentes momentos pueden ser significativamente diferentes genéticamente (Jorde y Ryman 1996). Además de tener en cuenta las limitaciones propias de los algoritmos empleados en los análisis estadísticos. En general, las especies marinas muestran poca o ninguna diferenciación genética, en escalas geográficas de cientos o incluso miles de kilómetros, debido a la gran dispersión de las larvas pelágicas, y a la falta de barreras físicas obvias que en general se aprecian en las áreas oceánicas. (Palumbi 1994; Grant y Bowen 1998; Hellberg et al. 2002). Además, los peces pelágicos muestran habitualmente menor diferenciación genética entre poblaciones que el resto de peces marinos, debido a que presentan una amplia distribución geográfica, grandes tamaños poblacionales y movimientos migratorios (Hauser y Ward 1998). En algunas especies de peces pelágicos marinos se ha detectado una pequeña diferenciación genética, pero altamente significativa estadísticamente, lo que demuestra que las poblaciones diferenciadas genéticamente pueden surgir y persistir en ausencia de Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 105 barreras físicas aparentes o de grandes distancias (Knutsen et al. 2003; Nielsen et al. 2004; Bekkevold et al. 2005; André et al. 2011). En este mismo sentido, hemos detectado un bajo nivel de diferenciación entre las unidades poblacionales estudiadas de S. colias (0,007), muy inferiores a los valores descritos para S. japonicus (Zeng et al. 2012; Cheng et al. 2015) (0,064 y 0,049 respectivamente). Además el 99,32% de la variación genética se encontró entre los individuos dentro de las poblaciones (Tabla 17), que son resultados también superiores a los dados por Zeng et al. (2012), con un 93,5% de la variación entre los individuos dentro de las poblaciones para S. japonicus. Estos bajos valores de diferenciación genética y elevados niveles de variabilidad intrapoblacional son un fuerte indicativo de que el flujo genético, en general, es continuo en esta especie y, por tanto, la conectividad y migración de sus genes es un acontecimiento generalizado en las áreas estudiadas. Se ve igualmente refrendado en el número de alelos exclusivos, ya que de un total de 380 alelos detectados sólo 56 fueron privados. Resultados similares se han descrito en otras especies de peces marinos (Slatkin 1981a, 1985b; Ruzzante et al. 1997; Piñera et al. 2006; Roberts y Ayre 2010). Sin embargo, a pesar de la importante continuidad genética que existe entre las poblaciones y áreas, se aprecian distintas agrupaciones que demuestran la presencia de ciertas barreras a este flujo génico, manteniendo las poblaciones diferenciadas genéticamente. Este fenómeno también se ha descrito en otros casos de peces pelágicos (Knutsen et al. 2003; Nielsen et al. 2004; Bekkevold et al. 2005; André et al. 2011). 106 Discusión De hecho, los resultados del análisis de inferencia bayesiana por poblaciones establece como número de grupos más probable K = 4. Estos se corresponderían con las poblaciones del (I) Archipiélago Canario, (II) el conjunto de isla São Miguel-costa norte y noroeste peninsular y Almería, (III) Vilanova-Melilla y (IV) el resto (Faial y Mar del Plata) (Figura 16). Los valores de diferenciación genética (FST) más elevados, es decir las mayores distancias genéticas, se encontraron entre las poblaciones de Vilanova y Melilla y el resto (Tabla 13). La diferenciación de estas dos poblaciones fue confirmada por los dendrogramas poblacionales NJ (Neighbour-Joining) (Figura 9), por el análisis de coordenadas principales (PCoA) (Figura 13) y apoyada también por los resultados de la varianza molecular (AMOVA). El estrecho de Gibraltar se ha citado con frecuencia como una barrera biogeográfica para especies con distribución AtlánticoMediterránea (Galarza 2007; Galarza et al. 2009a, Galarza et al. 2009b; Sala-Bozano et al. 2009). Numerosos estudios basados en marcadores genéticos han dado evidencias de diferenciación genética entre el Mediterráneo y el Atlántico para especies como el pez espada (Xiphias gladius) (Kotoulas et al. 1995), la merluza europea (Merluccius merluccius) (Lo Brutto et al. 2004; Castillo et al. 2005), el sargo común (Diplodus sargus) (Bargelloni et al. 2005), el pejeverde (Thalassoma pavo) (Costagliola et al. 2004), la cigala (Nephrops norvegicus) (Stamatis et al. 2004) y diferentes espáridos (Bargelloni et al. 2003). Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 113 Por tanto, estas razones, de forma general, serían las causas más probables de la diferenciación genética de las poblaciones de Canarias respecto a las demás. 5.7. Recomendaciones para la conservación y gestión Las especies marinas por lo general exhiben baja diferenciación genética poblacional (Ward et al. 1994), pero estudios recientes han revelado estructuración genética entre las poblaciones que se pensaba que exhibían una estructura homogénea. Esto es incluso válido para especies altamente migratorias, con una amplia distribución espacial y alto potencial de dispersión (Jørstad et al. 1991; Hutchinson et al. 2001). Por lo tanto, aunque los gestores pesqueros se enfrentan a estructuras de poblaciones complejas y dinámicas, las herramientas de gestión establecidas y unidades de gestión espaciales siguen siendo bastante estáticas (Reiss et al. 2009). Aunque existe una gran cantidad de bibliografía acerca de la estructura genética de las poblaciones de peces marinos, pocos estudios abordan específicamente la gestión pesquera y la genética de poblaciones (Ryman y Utter 1987; Ward 2000; Smedbol y Stephenson 2001; Kenchington et al. 2003; Laikre et al. 2005; Waples et al. 2008). Estos estudios manifiestan el potencial de los datos genéticos para mejorar la comprensión de la estructura de las poblaciones, junto con la diversidad intraespecífica, y en consecuencia el desarrollo de estrategias específicas de gestión. A pesar de que S. colias posee un alto valor económico en las pesquerías de varios países (Castro-Hernández y Santana Ortega 2000), y es una de las especies más capturadas a nivel mundial (FAO 114 Discusión 2011), la única medida de gestión existente es la talla mínima de captura (TCM), la cual es distinta en función del caladero del que se extraiga dicha especie. En el caladero canario, la talla legal de captura es de 18 cm (según Real Decreto 560/1995, de 7 abril, por el que se establecen las tallas mínimas de determinadas especies pesqueras en Canarias), no coincidiendo ésta con su talla de primera madurez, que se alcanza a los 20 cm (Lorenzo y Pajuelo 1996). En el Mediterráneo Occidental esta talla también está fijada en 18 cm, mientras que en el Cantábrico no está sujeta a medidas de gestión (Alvarez et al. 2015), debido a que no es una especie objetivo. No obstante, la TCM se establece en 20 cm para los caladeros del Cantábrico, noreste peninsular y Golfo de Cádiz, tanto para S. scombrus como para S. colias (DOCE L125, 2704-98). El hallazgo de homogeneidad genética entre regiones, es relativamente poco informativo para los gestores pesqueros, ya que tal homogeneidad refleja un nivel de flujo genético suficiente para generar panmixia (Hauser y Ward 1998), lo cual no influye en las estrategias de gestión de las pesquerías. Los resultados de este estudio han revelado leve estructuración genética entre las poblaciones que se pensaba exhibían una estructura homogénea. Teniendo estos, importantes implicaciones para el manejo de las pesquerías de S. colias en el Atlántico Norte y Centro Oriental, al igual que en el Mediterráneo Occidental. Por tanto, es necesario definir los límites geográficos de las poblaciones en escalas relevantes para la gestión pesquera, ya que la identificación de los patrones de flujo genético es Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 115 importante a la hora de diseñar el esfuerzo de la conservación de los recursos marinos (Galarza 2007). Se proponen, por tanto, tres estructuras poblacionales diferenciadas. Por un lado, la de Canarias, por otro la del Atlántico Norte (Azores y costa norte, noreste y sur de la Península, hasta Almería), y una tercera a partir del frente Almería-Orán (AOF) para el Mediterráneo Occidental (Melilla y Vilanova). Teniendo en cuenta siempre que los datos genéticos deben observarse como una herramienta complementaria a otras disciplinas y que se pretende mantener el nivel máximo de las variaciones genéticas en las poblaciones, al ser vital para la preservación de los recursos genéticos, estás medidas deben tomarse con cautela. Por ello, las recomendaciones para la conservación y la gestión de este recurso, se suman a las ya dadas por otros autores (Castro et al. 2001; González 2008). Estas deben incluir un seguimiento regular y continuo de las actividades pesqueras a través de una red de información estable de pesca (captura y esfuerzo), ya que por ejemplo en las Islas Canarias se desconoce su abundancia y estado de explotación por ausencia de evaluaciones continuadas y estadísticas pesqueras (Hernández-García et al. 1998; González 2008; Martínez 2011). Además, es necesario realizar evaluaciones periódicas con técnicas hidroacústicas, así como determinar los parámetros biológicos y poblacionales que permitan un mejor conocimiento de zonas de desove y patrones de migración de esta especie en las aguas atlánticas europeas. Es más, S. colias es una de las 22 especies de escómbridos sobre la que se aconseja que se priorice una mayor investigación de su ciclo de vida, en las próximas décadas, debido a que hay pocos datos de ella y soporta una importante pesquería (Juan-Jordá 2013), cuyas capturas han 116 Discusión aumentado considerablemente en las últimas décadas y a menudo son mal clasificadas en los registros de estadísticas pesqueras de los distintos países (FAO 2010, 2013). También se requieren más análisis genéticos con marcadores moleculares de alta resolución, como los desarrollados por Catanese et al. (2010), o con los recientes avances en la caracterización genómica en la estructuración poblacional (Bradbury et al. 2012), para corroborar los resultados aquí mostrados. 119 1.- De los 9 marcadores moleculares (cebadores de microsatélites) desarrollados específicamente para Scomber japonicus por Yagishita y Kobayashi (2008), ocho amplificaron correctamente y se mostraron polimórficos en muestras de Scomber colias, lo cual demuestra la importante relación genética entre ambas especies del género Scomber. 2.- El músculo conservado en etanol (96º) fue el tejido con el cual se obtuvo las mejores condiciones de conservación y extracción de ADN y fue, por tanto, el procedimiento elegido para realizar los análisis genéticos. 3.- Se detectaron 30 alelos para el locus Scja08 y 70 para el locus Sca06, siendo la población de São Miguel, en Azores, la que mayor número de alelos diferentes (217) se detectaron. 4.- Se detectó un importante número de alelos nulos con una frecuencia considerable en los loci Scja01 y Scja07, lo cual puede ser consecuencia de que los cebadores moleculares utilizados no fueran específicos de Scomber colias. No obstante, la presencia de alelos nulos es un hecho frecuente en los estudios moleculares en peces. 5.- Las poblaciones de Azores (São Miguel y Faial) mostraron los mayores y menores niveles de diversidad genética respectivamente. En el caso de la población de Faial, estos niveles tan bajos posiblemente sean debido al reducido número de muestras analizadas. 6.- Existe un desvío significativo de las frecuencias alélicas del equilibrio de Hardy Weinberg en la mayoría de las poblaciones analizadas, detectándose un defecto de heterocigotos en las mismas. Conclusiones Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 120 Consideramos que este déficit no es consecuencia de la endogamia, ya que la especie presentó elevados niveles de diversidad genética. Al mismo tiempo, podemos descartar que sea debido al efecto de los alelos nulos, ya que dicho déficit afectó a la mayoría de los loci, independientemente de la presencia de estos. 7.- Posiblemente el defecto de heterocigóticos sea consecuencia del efecto Wahlund, es decir, de la existencia de una subestructuración genética de las poblaciones, ya que durante las migraciones de los peces pelágicos tienen lugar la formación de cardúmenes, los cuales están constituidos por el reclutamiento de ejemplares de distintas cohortes (al menos en las fases adultas cuando existe una cierta convergencia de las talla), por lo que es posible que las muestras se hayan analizado subestructuras genéticas inapreciables e indetectables de otra forma. 8.- En general, los niveles de diversidad genética detectados en la especie Scomber colias en las áreas estudiadas son considerablemente elevados y similares a los niveles reportados para otras especies de escómbridos. 9.- La variabilidad genética de Scomber colias en el mar Mediterráneo Occidental es levemente superior que la encontrada en otras áreas, debido posiblemente a un flujo de genes hacia el interior del Mediterráneo desde las poblaciones del Atlántico lo cual hace que las poblaciones del interior del Mediterráneo alberguen mayor niveles de variabilidad genética. 10.- Los marcadores moleculares no permitieron detectar una diferenciación genética elevada entre las poblaciones y áreas 121 estudiadas, lo cual se traduce en la existencia de un elevado nivel de flujo genético entre las poblaciones de Scomber colias en el océano Atlántico y mar Mediterráneo Occidental. 11.- A pesar del considerable flujo génico encontrado, los análisis realizados detectaron la presencia de cuatro grupos genéticamente diferenciables y que correspondían con las poblaciones de Canarias, por un lado, las poblaciones atlánticas de la Península Ibérica (junto Almería) incluyendo Azores, y las poblaciones de Melilla y Vilanova. Las diferencias encontradas en las muestras procedentes de Faial y Mar del Plata pueden estar muy condicionadas por el reducido número de muestras analizadas. 12.- La oceanografía de las áreas estudiadas constituye el elemento fundamental que explica la existencia de estas agrupaciones genéticas, ya que juega un papel predominante en la distribución de huevos y larvas de Scomber colias. La dinámica marina permite la homogeneizar genéticamente poblaciones procedentes de zonas alejadas y entre las cuales existe grandes profundidades, como en el caso de Azores y la Costa Norte y Noroeste de la Península, y diferenciar otras geográficamente más próximas como ocurre entre Almería y Vilanova o Melilla. 13.- Las características biológicas de Scomber colias, dada su gran capacidad migratoria, permite que exista un flujo genético efectivo derivado del movimiento de ejemplares adultos, que se desplazan alrededor de la Península, haciendo que estas poblaciones se mantengan genéticamente homogénea. Conclusiones Diversidad Genética y Estructura Poblacional de Caballa ( Scomber colias, Gmelin, 1789) en aguas del Atlántico y del Mediterráneo 122 14.- Las poblaciones de Vilanova y Melilla se diferencian genéticamente del resto de las poblaciones del Mediterráneo, debido a los remolinos que se generan en el mar de Alborán, que probablemente impiden que los huevos y larvas de la población de Almería sean distribuidas hacia las áreas más al este de la Península y norte de África (i.e.: Melilla). 15.- Desde la perspectiva de la gestión pesquera estamos ante tres unidades poblacionales (demos), donde los diferentes stock alrededor de la Península Ibérica y Azores, deben ser gestionados de forma conjunta. Del mismo modo, el área del Mediterráneo Occidental debe gestionarse como otra unidad poblacional diferenciada. La población del Archipiélago Canario constituye una única unidad, posiblemente relacionada con el stock de la costa africana próxima. No obstante, es necesario tener en cuenta que esta estructuración está basada en datos genéticos que deben tomarse como una herramienta complementaria a otras disciplinas.