Interacción parásito-hospedador entre nematodos gastrointestinales y razas ovinas canarias : papel de los linfocitos T γδ y los eosinófilos

INTERACCIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR ENTRE NEMATODOS GASTROINTESTINALES Y RAZAS OVINAS CANARIAS. PAPEL DE LOS LINFOCITOS T  Y LOS EOSINÓFILOS Julia Natividad Hernández Vega Tesis Doctoral Arucas, Diciembre 2015 Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria. Programa de Doctorado: “SANIDAD ANIMAL”. Título de la Tesis “INTERACCIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR ENTRE NEMATODOS GASTROINTESTINALES Y RAZAS OVINAS CANARIAS. PAPEL DE LOS LINFOCITOS T  Y LOS EOSINÓFILOS”. Tesis Doctoral presentada por Doña Julia Natividad Hernández Vega. Dirigida por el Dr. D. Jorge Francisco González Pérez y codirigida por el Dr. D. José Manuel Molina Caballero y el Dr. D. Francisco Rodríguez Guisado. El Director, El Codirector, El Codirector, El Doctorando, Jorge F. González Pérez. José M. Molina Caballero. Francisco Rodríguez Guisado. Julia N. Hernández Vega. Las Palmas de Gran Canaria, a 14 de octubre de 2015. Índice Índice I 1. INTRODUCCIÓN 3 2. OBJETIVOS 7 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 13 3.1 EVOLUCIÓN DE LA POBLACIÓN MUNDIAL Y NUEVOS RETOS ALIMENTARIOS. GANADERÍA SOSTENIBLE 13 3.2 IMPORTANCIA DE LA PRODUCCIÓN GANADERA 15 3.2.1 PRODUCCIÓN OVINA EN EL MUNDO 15 3.2.2 PRODUCCIÓN OVINA EN EUROPA 17 3.2.3 PRODUCCIÓN OVINA EN ESPAÑA 19 3.2.4 PRODUCCIÓN OVINA EN CANARIAS 21 3.3 INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN: IMPORTANCIA DEL CONTROL PARASITARIO 24 3.3.1 PRINCIPALES NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN PEQUEÑOS RUMIANTES DE LA ISLA DE GRAN CANARIA: HAEMONCHUS CONTORTUS, TELADORSAGIA CIRCUMCINCTA Y TRICHOSTRONGYLUS SPP. 26 3.3.2 MÉTODOS DE CONTROL DE LOS PARÁSITOS 30 3.3.2.1 Tratamiento selectivo 32 3.3.2.2 Control no químico 36 3.3.2.2.1 Manejo de los pastos 36 3.3.2.2.2 Control biológico 37 3.3.2.2.3 Control a través de la alimentación 38 3.3.2.2.4 Vacunación 39 3.3.2.2.5 Selección genética 42 3.4 RESPUESTA INMUNE A NEMATODOS GASTROINTESTINALES: RESISTENCIA A HAEMONCHUS CONTORTUS 47 3.4.1. RESPUESTA INMUNE FRENTE A ESTADIO L3 54 3.4.2. RESPUESTA INMUNE FRENTE A ESTADIO L4 55 3.4.3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A ESTADIO ADULTO 56 4. RESUMEN 61 5. SUMMARY 65 6. MATERIAL Y MÉTODOS 69 6.1 CEPA PARASITARIA 69 6.2 ANÁLISIS SANGUÍNEOS 69 6.3 ANÁLISIS COPROLÓGICOS 70 6.4 MUESTRAS TRAS EL SACRIFICIO DE LOS ANIMALES 70 6.4.1 MUESTRAS DE PARED DE ABOMASO 70 6.4.2 CONTENIDO ABOMASAL 70 6.4.3 MUCUS 70 6.4.4 MUCOSA 71 6.5 OTRAS TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS 71 6.6 ANTÍGENOS DE HAEMONCHUS CONTORTUS 71 6.7 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) 72 6.8 HISTOLOGÍA 73 6.9 INMUNOHISTOQUÍMICA 74 Índice II 6.10 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA - WESTERN BLOTTING 75 6.11 PROCESADO DE IMAGEN 77 6.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 78 7. CAPÍTULOS CAPÍTULO I. DIFERENCIAS EN SUSCEPTIBILIDAD EN INFECCIONES NATURALES POR NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS CANARIOS DE PELO Y CANARIOS 81 1. RESUMEN 81 2. INTRODUCCIÓN 82 3. MATERIAL Y MÉTODOS 84 3.1 LOCALIZACIÓN DEL ESTUDIO Y ANIMALES 84 3.2 DATOS CLIMATOLÓGICOS 86 3.3 PROCESADO DE LAS MUESTRAS DE HECES 88 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 88 4. RESULTADOS 89 4.1 GRANJA 1 89 4.1.1 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas dentro de estación y de año 89 4.1.2 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas entre años y estaciones 90 4.1.3 Diferencias en los recuentos de huevos dentro de razas 90 4.1.4 Identificación Larvaria 90 4.2 GRANJA 2 91 4.2.1 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas dentro de estación 91 4.2.2 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas y estaciones 92 4.2.3 Diferencias en los recuentos de huevos dentro de razas 92 4.2.4 Identificación Larvaria 92 5. DISCUSIÓN 94 CAPÍTULO II. EL OVINO RESISTENTE CANARIO DE PELO INFECTADO EXPERIMENTALMENTE CON HAEMONCHUS CONTORTUS CONTROLA ANTES LA CARGA PARASITARIA QUE SU LONGITUD 103 1. RESUMEN 103 2. INTRODUCCIÓN 104 3. MATERIAL Y MÉTODOS 105 3.1 ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL 105 3.2 MUESTRAS SANGUÍNEAS 105 3.3 ANÁLISIS COPROLÓGICOS 105 3.4 RECOGIDA DE MUESTRAS TRAS EL SACRIFICIO 105 3.5 ANÁLISIS PARASITOLÓGICOS 105 3.6 CULTIVO DE CÉLULAS SECRETORAS DE ANTICUERPOS (ASC) 106 3.7 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) 106 3.8 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA 107 3.9 PROCESADO DE IMAGEN 107 3.10 HISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA 107 3.11 ENSAYO DE MIGRACIÓN LARVARIA (LMIA) 107 3.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 108 Índice III 4. RESULTADOS 110 4.1 PARASITOLOGÍA 110 4.2 HEMATOLOGÍA 110 4.3 INMUNOGLOBULINAS (IgAm e IgGm) EN MUCUS 112 4.4 SOBRENADANTES DE CULTIVOS DE CÉLULAS SECRETORAS DE ANTICUERPOS (ASC) 114 4.5 RESPUESTA INMUNE CELULAR 119 4.6 ENSAYO DE MIGRACIÓN LARVARIA (LMIA) 121 5. DISCUSIÓN 122 CAPÍTULO III. REDUCCIÓN IN VIVO DE LINFOCITOS T EN OVINOS DE LA RAZA RESISTENTE CANARIA DE PELO INOCULADOS EXPERIMENTALMENTE CON HAEMONCHUS CONTORTUS 133 1. RESUMEN 133 2. INTRODUCCIÓN 134 3. MATERIAL Y MÉTODOS 136 3.1 ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL 136 3.2 ANTICUERPO CC15 ANTI-WC1 136 3.3 MUESTRAS SANGUÍNEAS 136 3.4 ANÁLISIS COPROLÓGICOS 137 3.5 RECOGIDA DE MUESTRAS TRAS EL SACRIFICIO 137 3.6 ANÁLISIS PARASITOLÓGICOS 137 3.7 CITOMETRÍA 137 3.8 PROCESADO DE LOS RESULTADOS DE LA CITOMETRÍA 138 3.9 HISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA 140 3.10 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) 140 3.11 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA 140 3.12 PROCESADO DE IMAGEN 141 3.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 141 4. RESULTADOS 142 4.1 CITOMETRÍA 142 4.2 PARASITOLOGÍA 143 4.3 HEMATOLOGÍA 146 4.4 RESPUESTA INMUNE CELULAR LOCAL 148 4.5 RESPUESTA INMUNE HUMORAL 151 4.6 REGRESIÓN MÚLTIPLE DE LA VARIABLE LONGITUD EN FUNCIÓN DE LA VARIABLES EOSINÓFILOS DE ABOMASO (EOS AB.) E IgA DE MUCUS ESPECÍFICA DE ANTÍGENO SOMÁTICO ADULTO (IgAmSA) 153 5. DISCUSIÓN 154 5.1 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIWC1 EN LAS POBLACIONES SISTÉMICAS Y LOCALES DE LINFOCITOS T/WC1+ 154 5.2 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIWC1 EN LOS DATOS PARASITOLÓGICOS 155 5.3 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIWC1 EN LOS DATOS HEMATOLÓGICOS 156 5.4 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIWC1 EN LA RESPUESTA INMUNE 157 Índice IV CAPÍTULO IV. EFECTO DE LA REDUCCIÓN IN VIVO DE LA INTERLEUQUINA 5 SOBRE EL PAPEL DE LOS EOSINÓFILOS EN EL CONTROL DE LA FECUNDIDAD DE HAEMONCHUS CONTORTUS EN EL OVINO CANARIO DE PELO 163 1. RESUMEN 163 2. INTRODUCCIÓN 165 3. MATERIAL Y MÉTODOS 167 3.1 ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL 167 3.2 IL-5 RECOMBINANTE OVINA 167 3.3 ENSAYOS EN ANIMALES 167 3.4 MUESTRAS SANGUÍNEAS 168 3.5 ANÁLISIS COPROLÓGICOS 168 3.6 RECOGIDA DE MUESTRAS TRAS EL SACRIFICIO 168 3.7 ANÁLISIS PARASITOLÓGICOS 168 3.8 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) 168 3.9 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA 169 3.10 HISTOLOGÍA 169 3.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 169 4. RESULTADOS 171 4.1 INMUNOGLOBINA G ANTI-IL5rOv 171 4.2 PARASITOLOGÍA 172 4.3 HEMATOLOGÍA 173 4.4 RESPUESTA INMUNE HUMORAL FRENTE ANTÍGENOS DEL PARÁSITO 176 4.4.1 Inmunoglobulinas del mucus 176 4.4.2 Electroinmunotransferencia 177 4.5 RESPUESTA INMUNE CELULAR 178 5. DISCUSIÓN 179 5.1 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE LA RIL-5OV EN LA PRODUCCIÓN DE INMUNOGLOBULINAS ESPECÍFICAS 179 5.2 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE LA RIL-5OV EN RELACIÓN CON LOS DATOS PARASITOLÓGICOS 179 5.3 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE LA RIL-5OV EN LOS DATOS HEMATOLÓGICOS 181 5.4 EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA DE LA RIL-5OV EN LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL Y CELULAR 183 8. DISCUSIÓN GENERAL. MECANISMO NOVEDOSO DE RESISTENCIA FRENTE A HAEMONCHUS CONTORTUS 189 9. CONCLUSIONES 197 10. BIBLIOGRAFÍA 201 11. AGRADECIMIENTOS 241 Introducción Objetivos 8  Comparar asociaciones en ambas razas entre las distintas variables parasitológicas, hematológicas e inmunológicas. - Tercero. Reducir la población de linfocitos T/WC1+, administrando el anticuerpo CC15 por vía intravenosa y valorar su efecto en infecciones experimentales con 10.000 L3 de Haemonchus contortus en ovinos Canario de Pelo. En particular si afecta la longitud y fecundidad de los parásitos. o Objetivos específicos:  Reducir la población de linfocitos T/WC1+ una vez que se han establecido las larvas para verificar su papel en el control de la fecundidad de este parásito en etapas avanzadas de la infección.  Comparar el efecto de la administración del anticuerpo CC15 en la resistencia valorando las variables parasitológicas: carga parasitaria, longitud de los vermes, huevos en útero y en heces; y en la resiliencia valorando el hematocrito y las proteínas plasmáticas respecto al grupo control.  Comparar el efecto de la administración del anticuerpo CC15 en la respuesta inmune desarrollada a través de:  Recuentos de diferentes poblaciones celulares implicadas en la respuesta, tanto en sangre periférica como en la mucosa del abomaso. En concreto se analizaran los eosinófilos, mastocitos, leucocitos globulares, CD4+, CD8+, T+, T/WC1+, CD45RA+ y MHC-II+ en la mucosa del abomaso y CD2+, CD4+, CD8+, T+, T/WC1+, CD5+, CD45RA+ y plasmocitos IgG+ en sangre periférica.  Expresión de galectinas 11 y galectina 14.  IgA de mucus e IgG en suero específicas de H. contortus, y del patrón de reconocimiento proteico del antígeno somático adulto de H. contortus de la IgA del mucus.  Comparar asociaciones entre las distintas variables parasitológicas entre si y entre estas y las variables hematológicas e inmunológicas. - Cuarto. Modular el papel de los eosinófilos, a través de la reducción de los niveles de Interleuquina-5 (IL-5), tras la administración subcutánea de IL-5 recombinante ovina Objetivos 9 (rIL-5ov)/QuilA y estudiar su efecto en infecciones experimentales con 10.000 L3 de Haemonchus contortus en ovinos Canario de Pelo.  Generar inmunoglobulinas específicas frente a la Interleuquina 5 tras la inmunización con rIL-5ov que bloqueen su actividad biológica.  Comparar el efecto de la administración de la rIL-5ov subcutánea en la resistencia, valorando las variables parasitológicas: carga parasitaria, longitud de vermes, huevos en útero y heces; y de la resiliencia valorando la evolución del hematocrito y de las proteínas plasmáticas.  Comparar el efecto de la administración de la rIL-5ov subcutánea en la respuesta inmune desarrollada a través de:  Evolución de los linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y leucocitos en sangre periférica.  Recuentos de diferentes poblaciones celulares implicadas en la mucosa del abomaso en la respuesta, tales como eosinófilos, mastocitos y leucocitos globulares.  IgA del mucus específica de antígeno somático de estadio adulto y de L3 de H. contortus. Patrón de reconocimiento del antígeno somático adulto de la IgA del mucus.  Comparar las asociaciones entre las distintas variables parasitológicas. Revisión Bibliográfica Revisión Bibliográfica 13 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3.1 EVOLUCIÓN DE LA POBLACIÓN MUNDIAL Y NUEVOS RETOS ALIMENTARIOS. GANADERÍA SOSTENIBLE En el primer semestre de 2015, la población mundial alcanzó los 7.349 millones de personas y se espera que alcance los 9.700 millones en 2050 (Naciones Unidas, 2015), lo que supone incrementar la producción de alimentos de 8.400 millones de toneladas anuales a prácticamente 13.500 millones de toneladas para el año 2050 y poder satisfacer, de este modo, las necesidades que demandará la población (FAO, 2015). Este crecimiento poblacional, mayoritariamente de países en desarrollo de África y Asia (FAO 1; Naciones Unidas, 2015), va aparejado de un crecimiento de los ingresos y cambios en los hábitos alimenticios, traducidos en una mayor demanda de carne, huevos y leche (FAO, 2013). Este desarrollo demográfico y económico, supone que se generen presiones por los recursos naturales existentes, agravado por la pobreza, consumos insostenibles, el cambio climático, la escasez de agua, pérdida de la biodiversidad, la deforestación o la degradación de los suelos (FAO, 2015). En este sentido, una cuarta parte de la superficie terrestre se utiliza para el pastoreo y un tercio de la tierra cultivable se destina a alimento para el ganado, esto supone que se destinen más recursos a la agricultura animal que a cualquier otra actividad humana (FAO, 2013), agravando la competitividad por los recursos (FAO, 2015). Dada la escasez de tierra agrícola, y para evitar más deforestación, el 80% de las producciones que se requerirán en 2050 tendrían que proceder de las tierras destinadas a la producción actualmente (FAO, 2015). Con el fin de garantizar una producción intensiva sostenible que garantice ese abastecimiento de alimento partiendo de recursos naturales limitados, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (F.A.O.) propone 5 principios necesarios que van encaminados a mejorar la productividad e incluso a buscar sinergias entre sectores, a través del uso eficaz de los recursos (FAO 2) reduciendo el impacto negativo de esta actividad para proteger, conservar y mejorar los recursos naturales (FAO 3), fomentar una agricultura y ganadería de subsistencia “digna” en zonas rurales mejorando la equidad, en cuanto al acceso a recursos y conocimientos, y el bienestar (FAO 4); así como en impulsar políticas, tecnologías y prácticas que favorezcan la estabilidad de esa producción agropecuaria ante situaciones sociales y ambientales adversas (FAO 5); para lo que será necesario un entorno político-institucional eficaz que favorezcan un equilibrio entre iniciativas públicas y privadas (FAO 6). Revisión Bibliográfica 14 El sector ganadero, además de consumir recursos (agua, suelo, nutrientes), genera contaminación y gases responsables del efecto invernadero (FAO, 2015; FAO 7), por lo que es necesario llevar a cabo esas prácticas que permitan una producción eficaz más sostenible. En consecuencia, los principios de la F.A.O. sugieren favorecer la conservación de la biodiversidad y el establecimiento de una alimentación eficaz, equilibrada y precisa; proteger los recursos mediante la gestión de su uso y de los residuos generados, y controlar de manera integrada la salud de los animales (FAO, 2015). La Sanidad Animal es un pilar clave para evitar, por un lado, la propagación de enfermedades entre animales y entre estos y los hombres como consecuencia de la “masificación” (One World, One Health) y, por otro, para evitar mermas productivas y económicas que estas producen en el sector (FAO, 2013). Todo esto se traduce en incrementar la productividad de cada animal más que incrementar el número de animales. La selección durante años de aquellos animales altamente productivos se ha hecho en detrimento de aquellas especies locales altamente adaptadas al medio, seleccionados naturalmente por su resistencia a enfermedades y parásitos (FAO 8). Estas razas son de gran importancia dada la situación de producción actual dónde se busca la producción sostenible y eficiente, y dónde prima la adaptación a la cambiante situación climática. Según la F.A.O., de las más de 8.200 razas notificadas por los países miembros, más de 2.500 se encuentran en peligro de extinción o ya se han extinguido (FAO 8) ya sea por la selección de razas más productivas, la presión demográfica y pérdida de hábitats, como por el cambio climático (FAO 9). Esta merma de razas supone, por un lado la pérdida de recursos económicos –subsistenciapara las poblaciones de zonas desfavorecidas y, por otro lado, la pérdida de recursos genéticos de valor incalculable (FAO, 2010), no solo a la hora de producir mejoras genéticas en los animales, sino también a la hora de estudiar dianas farmacológicas a enfermedades, que aportarían mejoras en sanidad animal y productividad animal (FAO, 2010; Piedrafita et al., 2010). En 2013, el número de ovinos se estimaba en 1.163 millones de cabezas (FAOSTAT). En el año 2006 estaban descritas 1.409 razas, de las que se habían extinguido 180 y se encontraban en peligro de extinción 179 razas (FAO, 2010). En el año 2014 había en España 15,4 millones de ovinos (MAGRAMA, 2014a). Según el catálogo de razas de ganado (RD 2129/2008, de 26 de diciembre, por el que se establece el Programa nacional de conservación, mejora y fomento de las razas ganaderas y la Orden AAA/251/2012, de 9 de febrero, por el que se modifica anexo I del Real Decreto anterior), en España hay 43 razas ovinas autóctonas, de las que 33 están consideradas en peligro de extinción, por lo que dada la importancia de preservar y/o mantener la diversidad genética, existen programas de conservación -regulados por el mismo RDde estas Revisión Bibliográfica 15 razas en peligro entre las que se encuentran tanto el Ovino Canario (MAGRAMA 1) y el Ovino Canario de Pelo (MAGRAMA 2). 3.2 IMPORTANCIA DE LA PRODUCCIÓN GANADERA. El sector ganadero representa el 40% del P.I.B. agrario y sus productos suministran un tercio de las proteínas consumidas mundialmente (FAO, 2009). En 2050 se calcula que será necesario producir 465 millones de toneladas de carne y 1.043 millones de toneladas de leche, lo que supone doblar las producciones de 1999 (FAO, 2009). Debido a la mayor demanda de productos de origen animal por este crecimiento demográfico, el sector ganadero está sufriendo un cambio no solo por la tendencia a intensificar sus sistemas de explotación y a los cambios geográficos que sufren las explotaciones a medida que se desarrolla la región, sino también por la tendencia cambiante en la producción, seleccionando razas más productivas, dónde la extensión del sector es mayor en sistemas intensivos de aves y porcinos que en rumiantes (FAO, 2009; FAO 10). La ganadería de pequeños rumiantes, con mayor distribución en países en desarrollo (FAO, 2009), aporta alimento, lana y abono, suponiendo en muchas ocasiones una economía de subsistencia rural, dónde es frecuente la cría de razas locales mejor adaptadas al medio (FAO 8) capaces de generar beneficios con un mínimo de inversión al aprovechar gran variedad de vegetales (FAO, 2010). Los ovinos y caprinos se pueden criar en cualquier ambiente, sin embargo, las cabras suelen estar más presentes en zonas secas y abruptas, mientras que las ovejas en zonas de clima húmedo y templado (FAO, 2013). Dada la importancia de obtener productos de origen animal para satisfacer la demanda nutritiva de la población, a continuación, se hará un resumen de las producciones ovinas de carne, leche y queso a nivel mundial, europeo y español. Cabe resaltar la importancia de esta especie, pues el consumo de su carne tiene pocas restricciones en las principales religiones del mundo comparada con otros tipos de carnes, como por ejemplo el cerdo (Contreras, 2007). 3.2.1 PRODUCCIÓN OVINA EN EL MUNDO A nivel mundial, en el año 2013, el número de cabezas ovinas se sitúa alrededor de 1.163 millones (FAOSTAT) (Figura 3.1a), dónde África y Asia, tienen el mayor número de ovejas, siendo China, Australia e India los países con mayor censo ovino (FAOSTAT). En los últimos 20 años la cabaña ovina sigue una tendencia positiva a nivel mundial, observándose un incremento de más de 44 millones de animales con respecto a los 1.118 millones que había en el año 1993 (FAOSTAT), con un particular incremento en África y Asia (Figura 3.1a y 3.1b). Revisión Bibliográfica 16 Figura 3.1 Datos porcentuales del total de ovinos a nivel mundial que representa cada continente en el año 2013(a) y 1993 (b). Cifras extraídas de FAOSTAT. En cuanto a los productos obtenidos del ovino a nivel mundial, en 2013 se produjeron casi 8,6 millones de toneladas de carne, 10,1 millones de toneladas de leche fresca de ovino y 0,6 millones de toneladas de queso de ovino (FAOSTAT), experimentándose un aumento de las producciones a nivel mundial desde 1993 hasta 2013 con patrón de crecimiento similar al observado en el número de cabezas de animales, siendo el incremento de la producción en toneladas de carne (Figura 3.2a), leche entera fresca (Figura 3.2b) y queso (Figura 3.2c) mayor en África y Asia. En América y Europa el número de cabezas descendió pero se produjeron más toneladas de leche (América-Europa) y queso (América), lo que se traduce en una mejora en la producción de esos animales y una mayor tendencia a la intensificación del sistema de explotación (FAO, 2009). 28,25 % 7,42 % 44,01 % 11,17 % 9,15 % 2013 África América Asia Europa Oceanía 18,08 % 9,80 % 37,12 % 18,15 % 16,85 % 1993 Revisión Bibliográfica 17 Figura 3.2 Toneladas de carne (a), leche entera fresca (b) y queso (c) ovinos a nivel mundial de cada continente en los años 1993 y 2013. Cifras extraídas de FAOSTAT. 3.2.2 PRODUCCIÓN OVINA EN EUROPA En el año 2013 habían alrededor de 130 millones de ovinos (11,2% mundial), lo que supone un descenso de 73 millones de cabezas con respecto a 1993, año en el que habían casi 203 millones (FAOSTAT). Europa del Este es la zona que mayor número de cabezas perdió durante esos 20 años, pasando de 77 millones en 1993 a poco más de 36 millones de cabezas en 2013 (Figura 3.3a y 3.3b) (FAOSTAT). Los países con mayor censo en Europa son Turquía (31,1 millones), Reino Unido (23 millones), España (15,4 millones), Rumanía (9,5 millones) y Grecia (9 millones) (EUROSTAT, cifras para el año 2014). 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 1993 2013 Producción de Toneladas de Carne África América Asia Europa Oceanía 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 1993 2013 Producción de Toneladas de Leche 0 200000 400000 600000 800000 1993 2013 Producción de Toneladas de Queso Revisión Bibliográfica 24 permiten obtener beneficios, sin embargo, para hacer este sector más productivo sería necesario mayor formación del productor en cuanto a manejo y técnicas productiva, así como una mayor inversión en las explotaciones (GobCan 4). Por todo lo dicho anteriormente, es importante preservar estas razas de gran valor genético, capaces de producir en condiciones precarias, y de aportar un sustento económico y un producto diferenciado y de calidad. 3.3 INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN: IMPORTANCIA DEL CONTROL PARASITARIO El incremento de las producciones de los animales no se conseguirá solo suministrando una alimentación adecuada, invirtiendo en las instalaciones o criando especies altamente productivas, pues esa inversión no se verá reflejado en las producciones si los animales no gozan de un buen estado de salud, ya que las enfermedades suponen mermas productivas (FAO, 2013), causando aproximadamente el 20% de pérdidas (OIE), y pueden suponer un cierre del comercio exterior. Los parásitos gastrointestinales ocasionan pérdidas económicas y productivas, pues se caracterizan por producir enfermedades acompañadas de pérdida de peso, alteración de la aptitud reproductiva y el rendimiento de lactancia, retraso en el crecimiento, anemia e incluso muerte (Piedrafita et al., 2010) predisponiendo al desarrollo de enfermedades secundarias. Estas pérdidas productivas, principalmente por daños tisulares y pérdidas de proteínas (Fitzpatrick, 2013), son difíciles de cuantificar por el curso crónico o subclínico que frecuentemente presentan, suponiendo pérdidas estimadas de 369 millones de dólares australianos en Australia (Sackett et al., 2006), 81,8 millones de dólares americanos anuales en Etiopia (Biffa et al., 2007), 84 millones de libras anuales en Gran Bretaña (Nieuwhof y Bishop, 2005), 103 millones, 26 millones y 46 millones de dólares anuales en India, Kenia y Sudáfrica respectivamente (Waller y Chandrawathani, 2005). El control de los nematodos gastrointestinales se ha realizado tradicionalmente mediante tratamientos antihelmínticos de amplio espectro, cuyo uso indiscriminado y/o erróneo ha generado resistencias a casi todos los fármacos comerciales en todos los continentes (Van Wyk et al., 1999; Bartley et al., 2003; Čerňanská et al., 2006; Coles et al., 2006; Álvarez-Sánchez et al., 2006; Cezar et al., 2010; Saeed et al., 2010; Martínez-Valladares et al., 2013a; LyndalMurphy et al., 2014; Liébano-Hernández et al., 2015; Van den Brom et al., 2015). Esta pérdida de la principal defensa contra los parásitos, implica tener que descubrir y/o establecer nuevas medidas de control, como por ejemplo la selección de animales resistentes genéticamente o Revisión Bibliográfica 25 vacunas, pues producir nuevos fármacos es extremadamente costoso y poco rentable para las farmacéuticas (Waller, 1997a). El cambio climático, los cambios en sistemas de producción, entre otras cosas, provocan movimientos de animales, cambios de usos del suelo, etc. que afecta la dinámica de infección (Fitzpatrick, 2013), agravando aún más esta situación. La selección ovina en países desarrollados se ha hecho en favor de caracteres productivos, que unido al alto uso de antiparasitarios, ha ido en detrimento de la resistencia de los ovinos a parásitos; no obstante en los países en desarrollo, debido principalmente a las limitaciones de recursos, se mantienen razas locales menos productivas pero de alta rusticidad y adaptación al medio, sometidas a la selección natural lo que les ha conferido resistencia a especies parásitas (Piedrafita et al., 2010). Algunos ejemplos de estas razas resistentes son la Canaria de Pelo (González et al., 2008), Barbados Black Belly (Aumont et al., 2003; Gruner et al., 2003; Terefe et al., 2007a), Florida Native (Radhakrishnan et al., 1972; Amarante et al., 1999), Gulf Coast Native (Miller et al., 1998), Santa Inés (Amarante et al., 2004), St-Croix (Gamble y Zajac, 1992; Burke y Miller, 2004) o Red Massai (Mugambi et al., 1996; 1997). Estas razas son importantes - prueba de ello es el intento de conservarlas y preservar su variabilidad genética por parte de instituciones locales, nacionales e internacionalespues la identificación y entendimiento del papel de esos genes ligados a la resistencia, así como el estudio del propio mecanismo en sí, podría permitir introducir mejoras genéticas en razas más susceptibles y aportar información sobre nuevas dianas para fármacos y vacunas (Piedrafita et al., 2010). El ovino Canario de Pelo presenta un peculiar mecanismo de control de la fecundidad de Haemonchus contortus, en el que parece que la diana es el estadio adulto (González et al., 2008) y que están implicados los eosinófilos y los linfocitos T/WC1+ (González et al., 2011a). El estudio en profundidad de este mecanismo de resistencia, nos aportaría más información y nos abriría puertas para entender la compleja respuesta del sistema inmune a los parásitos gastrointestinales. De cara a entender los resultados obtenidos en esta tesis doctoral, a continuación, se hará una revisión que recoge un breve resumen sobre nematodos gastrointestinales ovinos -más frecuentes en la isla de Gran Canaria y con especial énfasis en Haemonchus contortussus signos clínicos, métodos de control y respuesta inmune. Revisión Bibliográfica 26 3.3.1 PRINCIPALES NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN PEQUEÑOS RUMIANTES DE LA ISLA DE GRAN CANARIA: HAEMONCHUS CONTORTUS, TELADORSAGIA CIRCUMCINCTA Y TRICHOSTRONGYLUS SPP. Los principales nematodos abomasales encontrados en infecciones mixtas naturales en explotaciones caprinas de la isla de Gran Canaria fueron Teladorsagia circumcincta, Trichostrongylus axei y Haemonchus contortus (Molina et al., 1997). Estas son precisamente las especies/género (Trichostrongylus spp.) más frecuentes y las principales responsables de pérdidas económicas en el sector ovino en el mundo (O’Connor et al., 2006), teniendo una prevalencia del 100% los animales en pastoreo en algunas regiones de España (Meana y Rojo, 1999). De estos tres géneros pertenecientes a la familia Trichostongylidae, el que mayor importancia tiene por su patogenicidad y distribución es Haemonchus contortus (Levine, 1978). Las características de algunos ejemplos de estas especies/género en cuanto a localización en el hospedador, morfología y distribución vienen recogidas en la Tabla 3.1. Revisión Bibliográfica 27 Fuentes Levine, 1978; Medidas vaina de la cola Van Wyk y Mayhew, 2013; Distribución de O’Connor et al. 2006. Tabla 3.1 Características morfológicas, localización y distribución Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y Trichostrongylus spp. H: hembras, M: machos. “ “ Revisión Bibliográfica 28 Todos estos nematodos se caracterizan por tener un ciclo biológico directo (Figura 3.7) en el que los huevos, incoloros y con cascara fina, salen con las heces sin embrionar (Meana y Rojo, 1999). El número de huevos dependerá del estado inmune del hospedador y/o su edad, así como de la prolificidad de la especie y la carga parasitaria, produciendo diariamente las hembras de H. contortus 5.000-10.000 huevos y Trichostrongylus spp o T. circumcincta 100-200 huevos (Meana y Rojo, 1999). El estadio larvario 1 (L1) eclosionará del huevo y sufrirá dos mudas hasta L3, siendo este último estadio el infectante y se caracteriza por estar cubierta por una vaina que no es más que la cutícula de la L2 (Levine, 1978). Esta vaina, que le impide alimentarse -la L1 y L2 se alimentan en el medio (Veglia, 1915) – obligándole a subsistir con sus reservas en las células intestinales (Levine, 1978), le confiere protección frente a la desecación (O’Connor et al., 2006). La duración de esta etapa de vida libre es de 5 a 14 días (Meana y Rojo, 1999), dependiendo de la temperatura y la humedad (Tabla 3.2), de modo que a temperaturas óptimas, generalmente más cálidas, se acorta el ciclo y las bajas lo detienen (O’Connor et al., 2006), adaptándose a las condiciones locales dominantes (Stear et al., 2007a). Cuando las condiciones de luz, temperatura y humedad son adecuadas, las L3 migran hasta la hierba desde dónde serán ingeridas, (Veglia, 1915; Soulsby, 1987). Tabla 3.2 Características de viabilidad a las condiciones climáticas de los estadios de vida libre de Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y Trichostrongylus colubriformis. Haemonchus contortus Teladorsagia circumcincta Trichostrongylus spp. T. colubriformis Huevo *No viable por debajo de 10ºC., susceptible al frio y desecación. *Viabilidad entre 0-10 ºC. Susceptibilidad baja al frio y desecación. * No viable por debajo de 5ºC. Susceptibilidad intermedia al frio y desecación. L1 –L2 *Susceptibilidad elevada al frio y desecación. *Susceptible a la desecación y media al frío. *Susceptible a la desecación y al frío. Elevada mortalidad por debajo de 5ºC. L3 *Elevada supervivencia en climas cálidos y húmedos. *Baja supervivencia bajo 0ºC, en climas fríos o cálidos y secos. *Elevada supervivencia en climas fríos, húmedos y bajo 0ºC. *Baja supervivencia en climas cálidos y secos. * Elevada supervivencia en climas fríos o cálidos con humedad. * Baja supervivencia bajo 0ºC. Tabla adaptada de la elaborada por O’Connor et al., 2006 denominada “Key differentiating features of environmental influences on the free-living stages of the major trichostrongylid nematode parasites of sheep”. Una vez ingeridas, estas L3 se desenvainan en el rumen (H. contortus, T. circumcincta, T. axei) o abomaso (Trichostrongylus spp. intestinales), proceso favorecido por los compuestos no ionizados del tampón bicarbonato-CO2, CO2 no disociado y gaseoso del aparato digestivo del hospedador que estimulan la secreción del “fluido de muda” de la larva (Soulsby, 1987; Lee, 2002). Una vez desenvainadas, estas larvas migran al abomaso en el caso de H. contortus y T. circumcincta y al intestino delgado en el caso de T. colubriformis. Las L3 de H. contortus penetran entre las glándulas epiteliales de la zona fúndica del abomaso, T. circumcincta penetra en la base Revisión Bibliográfica 29 de las glándulas gástricas de la zona antropilórica y las especies intestinales de Trichostrongylus spp. se sitúan entre el epitelio y la membrana basal del primer tercio del intestino delgado dónde mudaran al estadio L4 (Soulsby, 1987; Meana y Rojo, 1999). Durante este periodo puede tener lugar el fenómeno conocido como hipobiosis en el que las larvas quedan latentes deteniendo el desarrollo del ciclo durante varios meses, asociado a factores ambientales (condiciones adversas para los estadios de vida libre), al hospedador (resistencia) o como un mecanismo del parásito para regular su población (Soulsby, 1987). De no ocurrir esto, las L4 emergen a la luz a los 4-5 días en H. contortus (Veglia, 1915) y a los 610 días en T. circumcincta (Martínez-Valladares, 2006), o quedan embebidos en la mucosa desde los 7 días en Trichostrongylus spp. (Soulsby, 1987). Esta L4 mudará al estadio L5 (preadulto), presente en el lumen del órgano y que al madurar sexualmente se convierte en estadio adulto (Veglia, 1915) que cerrará el ciclo al eliminar huevos al exterior con las heces. El periodo prepatente es de 15-20 días para H. contortus y de 17-21 días para T. circumcincta y Trichostrongylus spp. (Soulsby, 1987; Meana y Rojo, 1999). Figura 3.7 Representación del ciclo biológico directo para Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y Trichostrongylus spp. en el ovino. *Referencia foto gota-larvas: http://www.nature.com/nature/journal/v452/n7184/fig_tab/452157a_F1.html La acción patógena va a depender de la edad de los animales y de la intensidad de la infección (Meana y Rojo, 1999). Haemonchus contortus es considerado el parásito más importante de la oveja, es hematófago desde el estadio L4, produciendo anemia, pérdida de peso, debilidad y edemas frecuentemente visible en la región submandibular como consecuencia de la Desarrollo larvario de estadio 1 a 3 Temperatura Humedad Desarrollo de L3 a Adulto * Revisión Bibliográfica 30 hipoproteinemia, produciéndose la muerte en infecciones graves (Levine, 1978). Si bien T. circumcincta es histotrofa, también ingiere sangre, pero las cantidades no son tan elevadas (Levine, 1978), y se caracteriza por el daño glandular que produce en el abomaso, causando cambios del pH que ocasionan pérdida de apetito, peso y diarrea; signos similares a los observados en Trichostrongylus spp. por los daños que producen los diferentes estadios (Soulsby, 1987). 3.3.2 MÉTODOS DE CONTROL DE LOS PARÁSITOS Tradicionalmente el tratamiento y control de los nematodos gastrointestinales se ha realizado con fármacos describiéndose resistencia a los principales antiparasitarios de amplio espectro del mercado en ovejas de todo el mundo (Coles et al., 2006; Taylor et al., 2009), definiéndose resistencia como la habilidad del parásito a tolerar la dosis terapéutica, favorecida por heterocigosis, velocidad de mutación de los alelos resistentes y la capacidad reproductiva de los parásitos (FAO, 2003). En este sentido, mantener animales dentro del rebaño que no reciban tratamiento, dónde los parásitos sin tratar, conocidos como refugio, permitirán diluir esos genes resistentes en el medio (van Wyk, 2001). En la década de los 50 se introdujeron en los mercados nuevas clases de antihelmínticos altamente eficaces y seguros (van Wyk et al., 2006) que permitieron el control de los parásitos de una forma fácil por parte del ganadero que desplazó el diagnóstico y el asesoramiento profesional (FAO, 2003). En 1957, se comunicó la primera resistencia de H. contortus a la fenotiazina y en 1964, se describió su resistencia al tiabendazol, observándose en años posteriores resistencias cruzadas entre principios activos de un mismo grupo (Soulsby, 1987) reduciéndose rápidamente la efectividad de los fármacos. A día de hoy, en el mercado hay varios fármacos clasificados principalmente en los siguientes grupos: benzimidazol, imidazotiazoles, tetrahidropirimidinas, lactonas macrociclicas, derivados amino-acetonitrilo, espiroindoles, salicilanilidas, isoquinolonas u organofosforados (http://www.wormboss.com.au/tests-tools/management-tools/drench-groups-andactives.php). Hay descritas resistencias en numerosas partes del mundo (Waller, 1997a) a muchos de los principios activos que integran estos grupos de productos utilizados en el tratamiento de nematodos gastrointestinales, como por ejemplo al albendazol (Gill, 1996), fenbendazol (Barton et al., 1985), oxfendazol (Borgsteede et al., 1997), levamisol (Barton et al., 1985; Gill, 1996), morantel (Yadav et al., 1993), ivermectina (Vieira et al., 1992), moxidectina (Scheuerle et al., 2009), abamectina (Kaminsky et al., 2011), monepantel (Scott et al., 2013), closantel (Love et al., 1992), rafoxanida (Boersema y Pandey, 1997) y organofosforados (Green Revisión Bibliográfica 31 et al., 1981). En España hay descritas resistencias a benzimidazoles, imidazotiazoles y lactonas macrocíclicas (Álvarez-Sánchez et al., 2006; Díez-Baños et al., 2008; Martínez-Valladares et al., 2013a), lo que permite hacerse una idea de la complicada situación que se está generando. Este contexto se ha agravado con la incapacidad de la industria farmacéutica de producir fármacos en un corto periodo de tiempo, a los que los parásitos no se adapten -resistenciarápidamente (FAO, 2003). Esta inversión, además resulta poco rentable para las farmacéuticas que prefieren invertir en otras especies domésticas (y en la especie humana) al considerarlos mercados más lucrativos para ellas (Waller, 1997a). Prueba de todo ello es que en 2009 salió al mercado como solución a estas multirresistencias el Monepantel (única molécula del grupo de los amino-acetonitrilo) y pocos años después se publicó el primer caso de resistencias en Nueva Zelanda (Scott et al., 2013), identificándose también recientemente en Europa, concretamente en Países Bajos (Van de Brom et al., 2015). Otro fármaco, lanzado al mercado un año posterior (2010) también en Nueva Zelanda, está formado por la combinación de Derquantel, perteneciente al grupo denominado espiroindoles, y Abamectina, una lactona macrocíclica, las cuales están consideradas el grupo de antihelmínticos con más registros de resistencias, se ha visto que tiene una eficacia dudosa frente a algunos parásitos resistentes, debiéndose de tener en consideración el espectro a la hora de aplicarlo (Kaminsky et al., 2011; George et al., 2012). Dado el impacto económico que tienen los nematodos gastrointestinales y su tratamiento en el sector ovino y la velocidad con la que los parásitos desarrollan estas resistencias, garantizar y alargar la actividad de los fármacos es absolutamente necesario. El diagnóstico a través de recuentos fecales de huevos mediante McMaster o test de reducción de recuentos fecales de huevos (siglas en inglés FECRT) en el campo o, a través de técnicas de laboratorio como el test de eclosión de huevos (siglas en inglés EHT), desarrollo (siglas en inglés LDT) y/o movilidad larvario (siglas en inglés LMT) (Kassai, 1999) permite detectar resistencias dentro de las granjas y no hacer cambios de tratamientos indiscriminadamente (FAO, 2003). Una buena estrategia, para aumentar la viabilidad de los fármacos, sería implantar un programa de manejo integrado (Walker et al., 1988) a través de la combinación de estrategias de control, tanto químicas como no químicas (Waller, 1997a, 1997b; FAO, 2003; Paul et al., 2010; Kahn y Woodgate, 2012), garantizando una producción más sostenible que reduzca los costes y la presencia de residuos en los productos (FAO, 2003). Para ello es indispensable tanto la implicación de los ganaderos (Kassai, 1999) así como de tecnologías que simplifiquen la recogida y análisis de datos y que aporten información sobre manejo de parásitos (Van Wyk et al., 2006). Revisión Bibliográfica 32 Estas medidas químicas estarían enfocadas en el tratamiento selectivo de animales a través del diagnóstico de los más susceptibles y entre las medidas no químicas se incluyen aquellas encaminadas a mejorar la respuesta del hospedador, ya sea mediante la alimentación, selección según resistencia o a través de vacunas, así como medidas de manejo del pasto y control biológico (Waller, 1999). 3.3.2.1 Tratamiento selectivo Las cargas parasitarias no se encuentra uniformemente distribuidas en la población, siendo una minoría de animales lo que presentan las mayores cargas debido a que hay animales más susceptibles y otros más resistentes, resilientes o tolerantes a la infección (Van Wyk et al., 2006; FAO, 2003). En este sentido, el tratamiento selectivo consiste en aplicar tratamiento a aquellos animales en los que la presencia de parásitos produce enfermedad y/o pérdidas productivas considerables en vez de tratar todo el rebaño (Van Wyk et al., 2006), permitiendo que se mantengan poblaciones de parásitos en refugio en el rebaño que disminuyan los niveles de resistencia antihelmíntica que se pudieran generar (Van Wyk., 2001). Para poder realizar este tratamiento selectivo con éxito, es necesario disponer de métodos que permitan identificar adecuadamente a esos animales susceptibles para poder administrar el mejor tratamiento en cada momento, lo que por otro lado también permitirá identificar y seleccionar para la cría a aquellos animales más resistentes (van Wyk et al., 2006; Preston et al., 2014). Existen varios marcadores asociados con la infección por nematodos gastrointestinales (Tabla 3.3) (Preston et al., 2014), como por ejemplo la presencia de huevos en heces, la anemia que se puede determinar/estimar por el hematocrito (Gray et al., 1987) o por el FAMACHA©(Bath et al., 1996; Van Wyk y Bath, 2002), cambios en el comportamiento animal (Falzon et al., 2013) o la pérdida de peso, estimado mediante el Happy Factor (Greer et al., 2009; 2010) o de la condición corporal (van Wyk et al., 2006; Bath y van Wyk, 2009). Revisión Bibliográfica 33 Tabla 3.3 Descripción de algunos marcadores asociados con la infección para el diagnóstico de nematodos gastrointestinales (adaptada de Preston et al., 2014). Descripción Inconvenientes Recuento de huevos en heces Permite contabilizar los huevos en heces frescas como indicador de infección de adultos. Medida directa de la infección. Laborioso en la toma de muestras, costoso y tiene alta variabilidad en los recuentos. No permite identificar la mayoría de las especies de nematodos gastrointestinales, existiendo para ello técnicas rápidas como PCR o uso de lectinas marcadas con fluorescencia. Hematocrito Permite valorar la anemia midiendo el porcentaje de células rojas en sangre. Medida directa de la infección. Invasivo. No es específico ya que otras enfermedades también producen pérdidas de sangre. FAMACHA© Permite valorar la anemia a través de comparar el color de la conjuntiva con una escala del 1 (no tratamiento) al 5 (riesgo de muerte). Rápido y no es invasivo. Subjetivo. No es específico ya que otras enfermedades también producen pérdidas de sangre. Comportamiento animal Permite, a través de GPS, identificar indirectamente animales susceptibles, basándose en que estos se movilizan más durante el pastoreo, pues necesitan consumir más, para recuperar la pérdida de proteínas y beber agua. Requiere de una alta inversión económica en dispositivos GPS. Happy Factor Permite calcular la ganancia de peso basado en la tasa de eficiencia de los alimentos. Requiriendo tratamiento aquellos que no alcancen el valor previamente estimado. Medida indirecta. Requiere de inversión económica en tecnología y pesaje de los animales cada 15 días. Puntuación de la condición corporal Permite determinar la pérdida de condición corporal mediante la palpación de diferentes estructuras del dorso del animal. Está basada en una escala del 1 (muy flaca) al 5 (muy gruesa). Medida indirecta. Subjetivo. No es específico ya que otras enfermedades también producen pérdidas de condición corporal. Algunos de los marcadores descritos anteriormente son poco prácticos en las granjas, requiriendo del envió de muestras a laboratorios o incluso de inversión económica en tecnología, quedando su aplicación limitada a la investigación (Preston et al., 2014). No obstante, existe un sistema relativamente sencillo que integra varios puntos a chequear en el animal y que puede ser útil para realizar un tratamiento, el Five Point Check© (Bath y van Wyk, Revisión Bibliográfica 40 Las vacunas de antígenos naturales se basan en el uso de antígenos de superficie o de excreción/secreción que generalmente reconoce el hospedador durante su respuesta inmune, y las vacunas de antígenos ocultos, emplean antígenos que no están en contacto con el hospedador de forma natural y que generalmente proceden del intestino del parásito, siendo generalmente eficaces cuando se trata de parásitos hematófagos como H. contortus (Newton y Meeusen, 2003). No obstante, los antígenos ocultos requieren de revacunaciones frecuentes para mantener la protección a diferencia de los antígenos naturales, que se benefician de las reinfecciones en el campo (Knox, 2000). Si bien, lo ideal de una vacuna es que sea efectiva frente a varios géneros de nematodos gastrointestinales (Klei, 1997), a día de hoy solo existen vacunas o prototipos monovalentes (Smith y Zarlenga, 2006). En las últimas décadas, se han identificado numerosos antígenos naturales que podrían ser utilizados para elaborar vacunas (Smith y Zarlenga, 2006) especialmente frente H. contortus, siendo mucho más limitada la identificación de antígenos que produzcan protección frente a otros nematodos gastrointestinales menos prolíficos (Newton y Meeusen, 2003). Sin embargo, el problema surge a la hora de la comercialización, pues estas moléculas tienen que ser seguras y eficaces tanto en animales adultos como en corderos (pues son los más susceptibles), además de fáciles y baratas de producir (Schallig, 2000). Los principales obstáculos en la producción surgen a la hora de conseguir la versión recombinante del antígeno con la configuración terciaria adecuada que induzca y mantenga en el tiempo la respuesta inmune, y a la hora de elegir el adyuvante adecuado que incremente la respuesta (Smith y Zarlenga, 2006). Un mayor entendimiento de los mecanismos de inmunidad permitiría desarrollar mejores diseños de inmunización (Newton y Meeusen, 2003). En 2014 se autorizó la venta en el mercado australiano de la primera vacuna con antígenos nativos frente a H. contortus llamada Barbervax® (Tabla 3.5), la cual está indicada, de momento, para conferir protección (75-95%) frente H. contortus en los corderos, siendo necesario aplicar 5 inyecciones subcutáneas con intervalos de 3 a 6 semanas (http://barbervax.com.au/ ; http://www.wormboss.com.au/news/articles/nonchemical-management/barbervaxa-newapproach-to-barbers-pole-worm-control.php; Smith et al., 2015). Revisión Bibliográfica 41 Tabla 3.5 Ejemplos de antígenos estudiados como vacunas frente a nematodos gastrointestinales. Revisión Bibliográfica 42 Dado lo complicado de obtener resultados prometedores con antígenos recombinantes, cabe destacar la vacuna desarrollada por Nisbet et al., 2013, que tras tres inmunizaciones en corderos (172-206 días de edad) con un pool de 8 proteínas recombinantes de T. circumcincta (cathepsin F-1 (Tci-CF-1), astacin-like metalloproteinase-1 (Tci-MEP-1), proteínas con función desconocida de 20kDa (Tci-ES20) y activation-associated secretory protein-1 (Tci-ASP-1), inmunogeno homólogo al antígeno de Ancylostoma caninum de T. circumcincta (Tci-SAA-1), macrophage migration inhibitory factor-1 (Tci-MIF-1), calcium-dependent apyrase-1 (Tci-APY-1) y un homólogo de TGF(Tci-TGH-2)), más el adyuvante Quil Ay posterior inoculación múltiple con L3 de T. circumcincta, observaron en dos ensayos diferentes, una reducción del 70% y del 58% en la media de producción de huevos acumulada y una reducción del 75% y del 56% de la carga parasitaria con respecto a los grupos control para cada ensayo, sin embargo no se observó diferencias en los grupos de animales más jóvenes. Actualmente, con el fin de optimizar este prometedor prototipo vacunal, se dispone de financiación europea dentro del programa H2020 (Societal Challenge 2-Food security, sustainable agriculture and forestry, marine and maritime and inland water research and bioeconomy, Call H2020-SFS-2014-2), denominado PARAGONE: vaccines for animal parasites (635408), con objetivos, entre otros, de identificar las causas de las variaciones en las respuestas entre individuos, las causas de la falta de protección en corderos y optimizar su administración. Otra vacuna con resultados muy interesantes -en este caso frente a H. contortuses la desarrollada por Fawzi et al., 2014, a partir de antígeno denominado Hc23, que es una proteína somática del estadio adulto de dicho parásito. Tras la inmunización de corderos con el antígeno nativo con el adyuvante, hidróxido de aluminio o una preparación inmune moduladora bacteriana, y posterior desafío con 15.000 L3, observaron reducciones superiores al 70% en el recuento de huevos y del 67% de la carga parasitaria, resultados muy esperanzadores. El ensayo de la versión recombinante de dicho antígeno (rHc23) con hidróxido de aluminio y posterior desafío en corderos (Fawzi et al., 2015), produjo reducciones superiores al 80% de los recuentos de huevos en heces y de la carga parasitaria. 3.3.2.2.5 Selección genética Seleccionar animales resistentes supone una alternativa interesante para el control de los nematodos gastrointestinales que aporta una solución sostenible a largo plazo al tratarse de un rasgo heredable (Bishop y Stear, 2003; Sayers y Sweeney, 2005; Piedrafita et al., 2010 Bishop, 2012) y al que los parásitos tardarían en adaptarse debido al alto número de genes, y por tanto “dianas”, que participan en la resistencia (Bishop, 2012). El recuento de huevos en heces, Revisión Bibliográfica 43 habitualmente empleado como indicador de resistencia (Bishop, 2012), tiene una heredabilidad entre 0,2 y 0,4 en ovejas, valores similares a los de producción lechera o ratio de crecimiento en bovino (Kassai, 1999; FAO, 2003; Stear et al., 2007a). Este valor de heredabilidad está influenciado por la edad y exposición de los animales estudiados, precisión del recuento, el número de muestras (Stear y Wakelin, 1998), especie de parásito y raza ovina (McManus et al., 2014). Para poder mejorar esta cualidad (resistencia) es necesario que exista variabilidad genética, la cual está descrita entre y dentro de raza (Vanimisetti et al., 2004a; 2004b; Stear et al., 2007a; Piedrafita et al., 2010, Bishop, 2012). No obstante, seleccionar esta característica tiene una opinión controvertida sobre su efecto en productividad, pues algunos autores han observado efecto negativo en las producciones y otros en cambio no han observado ese efecto (Piedrafita et al., 2010). En este sentido, existe otro rasgo a la hora de seleccionar a los animales, conocido como resiliencia, que viene definido como la capacidad de mantener la salud y las producciones durante la infección (Bisset y Morris, 1996). Pese a que se puede estimar a través del ratio de crecimiento, anemia, dag score y frecuencia de tratamiento, este rasgo presenta una baja heredabilidad y no reduce la contaminación del campo (Bisset y Morris, 1996). A pesar de que se ha conseguido reducir exitosamente los tratamientos e incrementar el ratio de crecimiento seleccionando animales resilientes, resulta complejo ponerlo en práctica y no mejora la resistencia (Bishop, 2012), por lo que no se reduce la trasmisión de la infección a otros animales. De todos modos, disociar entre resistencia y resiliencia como criterio de selección es, cuanto menos, controvertido puesto que, generalmente, son parámetros que se vinculan entre sí (Stear, comunicación personal). La selección mediante el recuento de huevos está ampliamente extendida y se ha conseguido establecer resistencia genética en los rebaños (Sayers y Sweeney, 2005; Piedrafita et al., 2010) al incluir este rasgo en los programas de cría (Stear y Wakelin, 1998). Una manera sencilla de mejorar la resistencia del rebaño sería eliminar como reproductores a los animales con mayores recuentos o más susceptibles (Kassai, 1999) o haciendo cruces con razas resistentes. Tal y como se describió al inicio de esta revisión bibliográfica, la FAO fomenta la conservación de las razas locales, principalmente de zonas tropicales y subtropicales, que por su adaptación a las condiciones medioambientales, han sido seleccionadas de forma natural por su resistencia a los nematodos gastrointestinales, suponiendo una fuente de recursos genéticos. Estas razas se suelen “despreciar” por asociarse a baja productividad debido, probablemente, a las pobres condiciones en las que se crían, con escasos aportes nutricionales y/o médicos, pues al compararlas dentro de su entorno con razas más productivas, las razas locales consiguen mayores producciones (Piedrafita et al., 2010). El cruce de estas razas resistentes con razas más Revisión Bibliográfica 44 productivas podría aportar mejoras en sus descendencias, sin embargo, esta teoría junto con la explotación de estas razas en ambientes diferentes esta poco estudiada, requiriéndose una mayor investigación (Piedrafita et al., 2010). El grado de resistencia conseguido tras el cruce de razas susceptibles y resistentes depende de la raza, edad y de si la infección es natural o artificial (McManus et al., 2014) y su utilidad con fines productivos puede ser controvertida. Ejemplos de cruces entre razas, es el cruce de ovinos de la raza Suffolk (susceptible) con Gulf Coast Native (resistente) del que se obtuvo corderos con mejoría en resistencia a H. contortus pero con mermas en los rendimientos productivos (Li et al., 2001). No obstante, en áreas donde la alta prevalencia parasitaria causa importantes pérdidas, este cruce podría suponer una alternativa (Li et al., 2001). Tras el cruce de machos de la raza Rhön (susceptible) con hembras de Merinoland (resistente) los corderos presentan una mejoría en resistencia a H. contortus sin efecto negativo en la productividad (Hielscher et al., 2006). La descendencia del cruce Suffolk, Ile de France, Texel y Dorper con Santa Inés (resistente) tuvo una resistencia similar a Santa Inés, manteniendo también las producciones (Amarante et al., 2009). Por otro lado, para poder seleccionar a los individuos más resistentes es necesario, obviamente, identificarlos, mediante marcadores relacionados con la infección (citados anteriormente en el apartado 3.3.2.1) o inmunológicos (Preston et al., 2014) como por ejemplo: la eosinofilia en sangre periférica (altos recuentos de eosinófilos asociados a resistencia), inmunoglobulinas (IgG1 e IgA) específica en suero, heces y en saliva (niveles altos asociado a resistenciaejemplo comercial: el test para detectar IgA en saliva específica del carbohidrato larvario de 35kDa CarLA (Harrison et al 2003; 2008; http://www.carlasalivatest.com/) o los niveles de la hormona Ghrelin (hormona reguladora de la saciedad) (Preston et al., 2014). Sin embargo, estos marcadores implican permitir el desarrollo de la infección en los animales con su correspondiente impacto en el rendimiento de la explotación (Kassai, 1999). Poder identificar a través de marcadores innatos o genéticos, como los genes asociados a caracteres cuantitativos (Quantitative trait loci – QTL) o al polimorfismo de un único nucleótido de secuencias de ADN entre cromosomas homólogos (Single nucleotide polymorphism SNP) (McManus et al., 2014), que permitan identificar a los animales resistentes independientemente del desarrollo de la infección es lo ideal, pues estos marcadores genéticos pueden predecir el estatus de resistencia del animal (Sayers y Sweeney, 2005). Se han propuesto varios marcadores de resistencia con este propósito, tales como el tipo de sangre (hemoglobina), genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y genes del Revisión Bibliográfica 45 interferón gamma (IFN-) (Preston et al., 2014). En relación al tipo de hemoglobina, algunos autores sugieren que animales que tienen hemoglobina (Hb) con alelos AA son más resistentes en infecciones con H. contortus y T. circumcincta que los que presentan HbAB y HbBB (Altaif y Dargie, 1978; Tizard, 2009), sin embargo, otros no apoyan esta asociación (Kassai et al., 1990; Gray, 1997). El complejo mayor de histocompatibilidad se corresponde con receptores presentadores de antígenos, MHC clase I (MHC-I) presente en casi todas las células nucleadas y MHC clase II (MHCII) que se localizan en las células presentadoras de antígenos (Tizard, 2009). El MHC-II es el que más se ha asociado a resistencia a nematodos (Lee et al., 2011), encontrándose alelos específicos asociados a esta resistencia (Stear et al., 2007b). La variación dentro de este complejo, localizado en el cromosoma 20, determina resistencia o susceptibilidad (Lee et al., 2011). El MHC-II esta codificado por dos genes, sin embargo se ha prestado mayor atención al HLA-DR que es más polimórfico y representativo que HLA-DQ, por su elevada expresión en las células presentadoras de antígeno (Preston et al., 2014). En este sentido se han realizado numerosos estudios que relacionan el alelo DRB1 del MHC-II con resistencia en diferentes razas de ovejas (Lee et al., 2011; Hayward, 2013), como por ejemplo frente a T. circumcincta en ovinos Scottish Blackface (Schwaiger et al., 1995). Otros estudios han encontrado esta asociación con la región Ovar-DYA del MHC clase IIb para H. contortus y T. circumcincta (Lee et al., 2011). Con el uso de chip de ADN (DNA microarray) o PCR se ha observado en numerosos estudios esta asociación con la expresión varios genes, por ejemplo el DQB1, DRA y DQA1 del MHC-II, en los animales resistentes a nematodos gastrointestinales (Lee et al., 2011). Otro de estos marcadores genéticos es el IFN-, pues se ha descrito que el polimorfismo en un alelo en un locus microsatélite situado en el primer intrón del gen de IFN- (localizado en el cromosoma 3) ha sido asociado con resistencia a la infección de T. circumcincta en ovejas Soay al reducir su expresión o afinidad del receptor de IFN-, pues su expresión, ligada a una respuesta inmune tipo Th1, resulta beneficiosa para el nematodo gastrointestinal (Coltman et al., 2001; Hayward, 2013). También se ha observado esta asociación en ovinos Texel, Romney y Merino (Sayers y Sweeney, 2005). Sin embargo, la resistencia a parásitos es un rasgo poligenético producido por muchos genes que tienen un efecto pequeño (Crawford et al., 2006), por lo que resulta difícil seleccionar resistencia identificando un único gen. Los estudios QTL podrían estar limitados por su sesgo en la varianza genética y se limitan a relativamente pocos locus y son difíciles de replicar (Hayward, 2013). La combinación de mapeo de genes y genes candidatos junto con los avances en Revisión Bibliográfica 46 genómica comparativa ayudarán a detectar mejor los cambios genéticos relacionados con la resistencia (Dominik, 2005) Los avances tecnológicos, han permitido desarrollar otros marcadores que abarcan más ampliamente el genoma (del inglés Genome-wide association studies GWAS) (Hayward, 2013). SNPs, cuyo uso está ampliamente extendido, aportan información de regiones que codifican o no proteínas (inclusive regiones reguladoras), tienen un bajo coste y se dispone actualmente de catálogos de variación dentro de especies, existiendo para caracteres productivos en ovinos los chips OvineSNP50 o OvineSNP700 genotyping BeadChip (Illumina®) que permiten caracterizar simultáneamente más de 50.000 SNPs (McManus et al., 2014; Preston et al. 2014). Kemper et al., 2011 estudiaron la posibilidad de usar el chip OvineSNP50 genotyping BeadChip (Illumina®) como marcador genético del recuento de huevos en ovinos infectados con T. colubriformis y H. contortus, obteniendo un promedio de 0.40% y 0.08% de la varianza fenotípica de los recuentos respectivamente, considerándolo un resultado consistente. McRae et al., 2014, estudiaron a través del mismo chip la asociación de los SNP con resistencia o susceptibilidad en ovinos de raza Romney y Perendale infectados naturalmente (con predominio de las especies T. colubriformis y T. circumcincta), en los que identificaron 14 nuevas regiones asociadas con resistencia y susceptibilidad. Otro marcador innato propuesto por Preston et al., 2014 es la reacción cutánea de hipersensibilidad. Preston, 2013, basándose en que la medida de la reacción de hipersensibilidad cutánea se usa como diagnóstico de algunas enfermedades y de que esta característica ha mostrado ser heredable, estudió la reacción de hipersensibilidad cutánea tras la inoculación cutánea de L3 desenvainadas de H. contortus, con el fin de encontrar asociación entre la medida de esta reacción y resistencia al parásito en ovinos con valor de cría para recuento de huevos en heces conocido, pues en una experiencia anterior observó asociaciones entre esta reacción de hipersensibilidad cutánea y parámetros parasitológicos, prediciendo la protección inducida por la vacunación con antígeno HcsL3. Sin embargo, no observaron asociaciones entre las reacciones de hipersensibilidad y la resistencia a nematodos gastrointestinales, quizás por la diversidad de mecanismos de inmunidad que la oveja podría desarrollar. Se precisan más estudios para validar este método, que aportaría información, relativamente fácil de recabar y monitorizar, sobre la respuesta inmune (Preston et al., 2014). Revisión Bibliográfica 47 3.4 RESPUESTA INMUNE A NEMATODOS GASTROINTESTINALES: RESISTENCIA A HAEMONCHUS CONTORTUS Conocer en detalle la compleja respuesta inmune frente a los nematodos gastrointestinales, sería una información muy útil para poder desarrollar nuevos fármacos o vacunas (FAO, 2003; Piedrafita et al., 2010). Esta respuesta comprende la interacción de componentes específicos e inespecíficos del sistema inmune (Miller, 1984; Bautista, 2010), teniendo importancia tanto la respuesta inmune innata como la adquirida (Bautista, 2010). A la inmunidad innata se le reconoce un papel crítico en el desarrollo de la respuesta inmune adquirida, regido por la activación inicial de este sistema (de Veer et al., 2007). Los nematodos gastrointestinales se han adaptado al hospedador y son capaces de evitar su respuesta inmune sobreviviendo y desarrollándose, estableciendo un equilibrio al producir generalmente enfermedades subclínicas y crónicas, causando enfermedad grave cuando la carga parasitaria/dosis infectiva es muy elevada o la interacción parásito-hospedador está descompensada, dependiendo esto último de factores ambientales, del hospedador (Tabla 3.6) y del parásito (Salinas, 2007;Tizard, 2009; Bautista, 2010). Tabla 3.6 Factores dependientes del hospedador. Factor Descripción Referencias Genético Esta descrita la variación en resistencia entre razas y dentro de razas. Saddiqi et al., 2011. Vanimisetti et al., 2004a, 2004b. Stear et al., 2007a. Piedrafita et al., 2010. Bishop, 2012. Edad Individuos jóvenes son más susceptibles. Asociado a factores hormonales y deficiencia de la respuesta inmune celular. Kassai, 1999. Salinas, 2007. Tizard, 2009. Bautista, 2010. Saddiqi et al., 2011. Sexo – Estado reproductivo Machos más susceptibles que las hembras. Causa aún en estudio, se ha asociado a interacciones inmuno-endocrinas y altos niveles de testosterona que producen inmunosupresión o que alteran el comportamiento y los genes influenciando en la susceptibilidad y resistencia. Las hembras en peripartos son más susceptibles. Se desconoce el motivo aunque se asocia a hormonas como la prolactina. Soulsby, 1987. Fleming, 1993. Klein, 2004. Saddiqi et al., 2011. Hayward, 2013. Nutricional Las dietas deficientes producen una respuesta inmune deficiente, agravando la situación los efectos patógenos de los parásitos. Se ha observado que la suplementación nutricional incrementa la resistencia/resiliencia de los animales. Knox, 1996. Waller, 1997b. Kassai, 1999. Strain y Stear, 2001. Saddiqi et al., 2011. Revisión Bibliográfica 48 Cuando un parásito penetra en el organismo, se produce una respuesta inmune innata o inespecífica, constituida por células y moléculas (Tabla 3.7) de activación rápida presentes previamente en el organismo y que no generan memoria inmunológica, cuyo objetivo es eliminar rápidamente al patógeno y reparar los tejidos (Cutuli, 2007). La respuesta inmune adaptativa se hace efectiva tras varios días, pues se requiere del reconocimiento antigénico y la diferenciación y activación de los linfocitos T y B (González, 2007). En la respuesta inmune también participan proteínas (citoquinas) liberadas por las células que les permite comunicarse y coordinarse durante la respuesta, las cuales actúan a dosis bajas tras unirse a receptores específicos en las células diana, y entre ellas encontramos las interleuquinas que regulan las relaciones entre los leucocitos; las quimioquinas que actúan sobre la circulación y migración de los leucocitos participando en la inflamación; los interferones, los factores de necrosis tumoral y los factores de crecimiento (García, 2007). Tabla 3.7 Principales componentes de la respuesta inmune innata (Cutuli, 2007). Tipo Integrantes Mecanismo Externos Barreras físicas Piel y superficies mucosas. Impiden la entrada a través de la integridad de estas estructuras, tos, estornudo, el peristaltismo intestinal y el mucus. Barreras químicas Ph, mucus, sustancias antimicrobianas, enzimas. Actúan inhibiendo el desarrollo o alterando las estructuras del parásito. Barreras biológicas Microbiota autóctona. Establece competencia con los agentes patógenos. Internos Factores solubles Sistema del complemento, mediadores de la inflamación y citoquinas. Favorecen inflamación y atracción y/o activación célular. Células Macrófagos, Neutrófilos, Natural killer. Fagocitosis. Presentación de antígenos, acción efectora sobre patógenos. Liberación de citoquinas. Una vez el parásito alcanza el abomaso se enfrentan al bajo pH, el cual tolera por su cutícula, y al mucus, al que se liberan sustancias mediadoras de la respuesta o con actividad antimicrobiana que facilitan la respuesta inflamatoria (de Veer et al., 2007). Al mucus del tracto gastrointestinal se liberan lectinas, como la galectina-11 producida por las células epiteliales y Revisión Bibliográfica 49 presente en el mucus 3 días después de la infección (Dunphy et al., 2000) o la galectina-14 producida y liberada por los eosinófilos durante su activación (Young et al., 2009). Estas galectinas se unen a determinados carbohidratos presentes en los parásitos y cambian las propiedades del mucus haciéndolo más viscoso, dificultando la movilidad (Miller, 1987; Dunphy et al., 2000; de Veer et al., 2007; Young et al., 2009) y/o alimentación de los vermes. Preston, 2013, observó que la galectina-11 se unía a la superficie de la L4 de H. contortus, pero no al estadio L3, inhibiendo su crecimiento y desarrollo in vitro, observándose unión de esta galectina en la región faríngea interfiriendo en la alimentación (Preston et al., 2015). Una vez superen estas barreras, entran en juego mecanismos innatos internos que tratan de evitar el establecimiento y acción patógena del parásito, comenzando con la activación y fijación del complemento, concretamente la vía alternativa, que conduce a la respuesta inflamatoria, activación de la fagocitosis por neutrófilos/macrófagos y la activación de los linfocitos B para el inicio de la respuesta humoral, en este último caso a través del reconocimiento del producto C3d por parte de receptores como por ejemplo el CD21, CD35 y CD81, aunque también son capaces de reconocer antígenos a través de su receptor de células B (BCR) (Arjona, 2007; Cutuli, 2007; Gibello, 2007). Estos componentes de la vía alternativa del complemento se unen a la superficie de los patógenos o moléculas secretadas por los parásitos, favoreciendo la atracción de células fagocitarias como neutrófilos y macrófagos o células efectoras como los eosinófilos y mastocitos (de Veer et al., 2007; Cutuli, 2007; Salinas, 2007). Los linfocitos B que han reconocido un antígeno, pueden actuar como células presentadoras de antígenos, presentándoselo a través de moléculas MHC-II a los linfocitos T para activarlos y activarse a ella misma por coestimulación de su receptor CD40 (se une al CD154) y CD86 (se une al CD28), lo que le permitirá la expresión de moléculas de superficie y receptores que cooperaran en su activación y transformación en célula plasmática productora de inmunoglobulinas (Arjona, 2007). Los macrófagos y neutrófilos vierten mediadores que potencian la inflamación y la reparación tisular (Cutuli, 2007). La respuesta desencadenada por los macrófagos va encaminada al tipo Th1 o intracelular que no resulta generalmente efectiva contra los nematodos gastrointestinales, al igual que tampoco están asociados los neutrófilos en la actividad efectora frente a los vermes (de Veer et al., 2007). Cabe resaltar el papel de los linfocitos T que son células T con un receptor TCR formado por cadenas  y  unido a un grupo de glicoproteínas denominado CD3 necesario para la transducción de señales (Arjona, 2007), además en rumiantes se presenta la molécula de Revisión Bibliográfica 56 los días 3-7 post-inoculación, es decir, en el momento en el que se producía la salida de las L4 a la luz del abomaso, al tiempo que aumentaba la viscosidad del mucus (Robinson et al., 2011). Se ha podido demostrar mediante ensayos in vitro con larvas de H. contortus que la galectina 11 dificulta la pérdida de la cutícula de L3 en su muda a L4 y que esta lectina es capaz de adherirse de forma selectiva a la región faríngea del estadio L4, reduciendo su tamaño, probablemente al dificultar la alimentación del parásito (Preston et al., 2015). 3.4.3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A ESTADIO ADULTO La respuesta inmune frente a los estadios adultos se manifiesta a través de la expulsión, cambios en la morfología (reducción de la longitud) y reducción de la fecundidad de las hembras (Balic et al., 2000b). Se ha observado la expulsión primaria, dosis dependiente, de los vermes adultos de Nematodirus battus en corderos (Lee y Martin, 1976; Winter et al., 1997; Balic et al., 2000b), sin embargo es más típico que se produzca la expulsión de nematodos gastrointestinales como H. contortus (Barger et al., 1985), T. circumcincta (Seaton et al., 1989) y T. colubriformis (Barnes y Dobson, 1990) por el desarrollo de respuesta inmune adquirida a estos parásitos tras infecciones larvarias repetidas, atribuyéndose a una respuesta inespecífica del mecanismo larvario de expulsión rápida, que incluso puede extenderse a otras especies de parásitos adultos que habiten el mismo nicho (Balic et al., 2000b). Sin embargo, también se ha asociado a inmunidad adquirida específica al estadio adulto independiente del desarrollo de resistencia larvaria, pues se ha visto que la expulsión de los adultos no se desarrolla simultáneamente con la expulsión del estadio larvario en animales continuamente infectados (Barger et al., 1985; Balic et al., 2000b) o por haberse observado esta expulsión, acompañado de daños en la cutícula y reducción de la fecundidad en vermes adultos de T. colubriformis implantados quirúrgicamente en ovinos en ausencia de infección larvaria (Emery et al., 1992; Balic et al., 2000b). En este sentido, si bien no fue una expulsión total de los vermes, González et al., 2008 observaron reducción de la carga parasitaria (2.4 veces menor) a los 28 días post inoculación (dpi) en ovino Canarios de Pelo (resistente) comparados con ovinos Canarios (susceptibles) sin encontrar diferencias en establecimiento larvario (7 dpi) en animales inoculados con una única dosis de 20.000 L3 de H. contortus, por lo que sugiere que la diana de esta raza es el estadio adulto del parásito. La reducción de la longitud y fecundidad de H. contortus, T. circumcincta y T. colubriformis se ha observado como una consecuencia de infecciones larvarias repetidas (Balic et al., 2000b). Se ha descrito a asociación entre longitud y fecundidad en H. contortus (Lacroux et al., 2006; Rowe Revisión Bibliográfica 57 et al., 2008) y T. circumcincta (Stear et al., 1995; 1997), lo que se traduce en que la reducción del tamaño producirá una reducción de la fecundidad. La reducción de la longitud y fecundidad de los adultos se ha asociado en T. circumcincta al efecto de la IgA local específica de L4 (Stear et al., 1995; 1996), sugiriendo que el control de estas variables tendría lugar en estadios previos al adulto (Balic et al., 2000b). Por otro lado, también se ha observado asociación de la longitud de las hembras adultas y el recuento de huevos en heces con la IgA local específica del estadio adulto de H. contortus en ovinos Canario de Pelo a los 28 dpi tras una única inoculación con 20.000 L3 de H. contortus, mientras que en el ovino Canario se observó asociación entre la IgA local específica de L3 y la longitud larvaria, similar a lo descrito para otras razas ovinas (Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). Por otro lado, en esta misma raza ovina CAP, está descrita asociación negativa entre los linfocitos T y eosinófilos con la fecundidad (González et al., 2008; Hernández, 2011), por lo que esta sería la primera vez que se implican a esas poblaciones celulares y la IgA específica de adulto en el control de la fecundidad en vermes adultos. Toda esta información recalca la complejidad de la respuesta inmune frente a los nematodos gastrointestinales, ya no solo frente a los diferentes estadios parasitarios y especies, sino incluso entre diferentes razas ovinas, siendo necesario estudios que aporten nueva información al respecto, que permitan esclarecer los mecanismos incluyendo las respuestas innatas que parecen tener un papel mayor del que se pensaba. Resumen Resumen 61 4. RESUMEN Cubrir de manera sostenible la demanda mundial creciente de productos animales originados por el crecimiento demográfico y económico requiere mejorar los rendimientos productivos de los animales. Los nematodos gastrointestinales debido a su patogenia, producen pérdidas productivas, por lo que su control incrementaría los beneficios obtenidos por animal. Sin embargo, el uso indiscriminado de los antihelmínticos ha generado el desarrollo de resistencias, proponiéndose otras alternativas de control que recogen prácticas de manejo encaminadas a mejorar la resistencia/resiliencia del hospedador y a reducir las cargas contaminantes. El control a través de la vacunación supondría una alternativa sostenible, pues conferiría protección, no dejaría residuos en los productos y no se generarían resistencias. Sin embargo, dada la complejidad de la respuesta parásito-hospedador y las dificultades técnicas en su desarrollo y producción, hace que sea necesario realizar más estudios al respecto. Estudiar en profundidad los mecanismos inmunes de resistencia desarrollada por los hospedadores frente a los nematodos gastrointestinales, podrían proporcionar información para identificar nuevas dianas farmacológicas potenciales. En este sentido, en una tesis previa de nuestro grupo de investigación se observó que la raza ovina Canaria de Pelo (CAP) era más resistente en inoculaciones experimentales a Haemonchus contortus que los ovinos de la raza Canaria (CAN), concluyendo que la diana de la respuesta inmune es el estadio adulto del parásito, pues se encontraron diferencias en parasitología (carga parasitaria, longitud y fecundidad de los vermes) a 28 días post-inoculación (dpi) y no a 7 dpi (González et al., 2008; Hernández, 2011). En este novedoso mecanismo de protección, el control de la longitud y fecundidad parecía estar asociado a la IgA, eosinófilos y linfocitos T+ (González et al., 2011a; Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). Ratificar estos mecanismos, y profundizar más en la relación que se establece entre los parásitos (en este caso, nematodos gastrointestinales) y los ovinos resistentes/susceptibles fueron los principales detonantes del planteamiento de esta Tesis Doctoral. Los resultados arrojados por este trabajo, indican en su primer capítulo que tanto adultos como corderos de la raza Canaria de Pelo son más resistente en infecciones naturales mixtas dónde predominan Trichostrongylus spp. y Teladorsagia circumcincta, sugiriendo resistencia multiespecífica. En el segundo capítulo, en el que se comparan ovinos de ambas razas inoculados con 20.000 L3 de Haemonchus contortus y sacrificados a 0, 7 y 21 dpi, se observaron diferencias significativas en carga parasitaria a 21 dpi, pero no en longitud ni huevos en útero entre razas, lo que sugiere que el control de carga parasitaria en los ovinos de raza Canario de Pelo tiene lugar entre los días 7 y 21 dpi y que el control de la longitud tiene lugar entre los días 21 y 28 Resumen 62 dpi. El análisis pormenorizado de la respuesta inmune y de sus asociaciones con las variables parasitarias sugieren que a 7 dpi la raza resistente (CAP) podría reconocer más antígenos parasitarios que la susceptible (CAN) a través de las células MHC-II+ localizadas en la mucosa de abomaso asociada negativamente con la carga parasitaria intramural. Esto podría desencadenar la posterior expulsión de los vermes a través de una respuesta coordinada aparentemente por los linfocitos CD4+, actuando los eosinófilos galectina 14+ como célula efectora. Los capítulos tercero y cuarto, confirman la hipótesis de que los linfocitos T+ y los eosinófilos controlan la fecundidad. Así, en el tercer capítulo se observó que los animales a los que se le administró el anticuerpo CC15 (anti-WC1, una subpoblación de los linfocitos T), lo que produjo una reducción significativa de la población de los linfocitos T/WC1+ tanto en sangre periférica como en la mucosa de abomaso, presentaron vermes significativamente más largos y prolíficos a pesar de que cuantitativamente no existieron diferencias en el recuento de eosinófilos e inmunoglobulina A (IgA), lo que sugiere que esta población linfocitaria podría estar actuando como coordinadora de la respuesta. Finalmente, en el cuarto capítulo, se analiza el efecto de la administración subcutánea de la interleuquina 5 recombinante ovina (rIL-5ov), tras la que se generó IgG específicas frente a dicha interleuquina. Los animales que recibieron dicha rIL-5ov, presentaron un mayor número de vermes, que fueron además significativamente más largos y prolíficos. Sin embargo, a pesar de esta diferencias parasitológicas, no se observaron diferencias significativas en los recuentos de eosinófilos sanguíneos o de mucosa abomasal y de los niveles de IgA entre grupos, lo que sugiere, por un lado la importancia de dicha interleuquina para la activación de los eosinófilos, y por otro el papel de dicha población en el control de la carga, longitud y fecundidad de los vermes. Hasta donde conocemos, es la primera vez que se administra una citoquina recombinante en ovinos con el fin de generar anticuerpos que permitan valorar su funcionalidad. Estos resultados, en su conjunto, sugieren un mecanismo de control de Haemonchus contortus, no descrito hasta el momento, que tiene lugar frente a estadio adulto del parásito y en el que se controla inicialmente la carga parasitaria y posteriormente la longitud y fecundidad. Summary Summary 65 5. SUMMARY Afford in a sustainable manner the growing global demand for animal products, caused by demographic and economic growth, requires improving animal production. Gastrointestinal nematodes, due to its pathogenesis, cause production losses, so their control would increase the productive profits of each animal. However, indiscriminate use of anthelmintics has generated the development of resistance, suggesting use of management of integrated control of helminth parasites that includes alternative practices to improve the host resistance/resilience, therefore reducing infective burdens. The control through vaccination would be a sustainable alternative because it would protect, without leaving residues in the products and resistance would not be generated easily against it. However, given the complexity of the parasite-host response and technical difficulties in its developments and productions; it will be need further studies. Deep analysis of the resistance immune mechanisms developed by the hosts against gastrointestinal nematodes could provide information to identify potential new drug targets. In this sense, in a previous Thesis carried out within our research group it was showed that Canaria Hair Breed sheep (CHB) was more resistant, in experimental infections with Haemonchus contortus, than Canaria sheep (CAN), concluding that the target of this immune response was the adult stage of this parasite, because differences in parasitology (worm burden, length and fecundity) were found at 28 days post-inoculation (dpi) but not at 7 dpi (González et al., 2008; Hernández, 2011). In this novel mechanism of protection, the control of worm length and fecundity seemed to be associated with IgA, eosinophils and T cells (González et al., 2011a; Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). To prove these mechanisms and deepen into the relationship established between parasites (in this case, gastrointestinal nematodes) and resistant/susceptible sheep were the main triggers of this Thesis. Results presented on the first chapter of this study indicate that both CHB adults and lambs are more resistant in predominantly Trichostrongylus spp. and Teladorsagia circumcincta natural mixed infections suggesting multi-specific resistance. In the second chapter, animals of both breeds were inoculated with 20,000 L3 of Haemonchus contortus and slaughtered at 0, 7 and 21 dpi. Significant differences in worm burden at 21 dpi but not in length or eggs in uterus, were observed between breeds, it suggests that the CHB breed sheep control worm burden between 7 and 21 dpi and the worm length between 21 and 28 dpi. The detailed analysis of the immune response and their associations with parasitic variables suggest that the resistant breed (CHB) could recognize most parasite antigens that susceptible (CAN) through MHC-II+ cells Material y Métodos 72 Tras el coprocultivo de las heces de estos animales, transcurrido el periodo prepatente y tras comprobar la presencia de huevos en las heces de los corderos de raza Canaria inoculados, la obtención de las L3 de H. contortus se llevó a cabo mediante el método de Baermann. El antígeno somático L3 se obtuvo tras someter 106 L3 en PBS (Tabla 6.3) a tres ciclos de 20 min en congelación a -80 ºC y descongelación a temperatura ambiente. Posteriormente se homogeneizaron con ultrasonidos (UP100H, Hielscher) y mecánicamente (Ultraturrax T8, IKA® Werke) a 4 ºC. El homogeneizado resultante se centrifugó a 18.000 g (Centrifuge MPW-65R, MPW) durante 30 min a 4 ºC, conservándose el sobrenadante a -20 ºC hasta su uso como antígeno larvario (método adaptado de Lacroux et al., 2006). Con el fin de obtener antígeno somático de vermes adultos, tras el sacrificio de estos animales, se recogió el contenido abomasal y se mezcló con una solución de agar (Sigma) al 1,7 % (p/v) en agua destilada a 43 ºC. Esta mezcla se vertió sobre un paño y, tras la gelificación, se incubaron verticalmente en una cubeta con PBS a 37 ºC durante 90 min. Los vermes viables fueron desprendiéndose del gel, recogiéndose en el fondo de la cubeta. Posteriormente fueron sometidos a lavados con sucesivos pases en PBS para eliminar los posibles restos de agar. Finalmente, el antígeno SA de H. contortus se obtuvo tras la homogeinización mecánica (Ultraturrax T18, IKA® Werke) y con ultrasonidos (UP100H, Hielscher) de los vermes adultos en PBS a 4 ºC. El homogeneizado se centrifugó a 4.500 g (Centrifuge MPW-65R, MPW) durante 20 min a 4 ºC, conservándose el sobrenadante a -20 ºC. Tabla 6.3 Reactivos preparación PBS. REACTIVO FÓRMULA CONCENTRACIÓN Cloruro de sodio NaCl (Sigma) 0.123M Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 (Sigma) 0.003M Fosfato disódico Na2HPO4 (Sigma) 0.01M En ambos antígenos la concentración de proteínas se determinó mediante el kit Pierce BCA (Protein Assay Kit, Thermo Scientific). 6.7 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) Los niveles de inmunoglobulinas específicas de mucus, suero y/o sobrenadante de cultivo linfocitario de cada animal, fueron determinados mediante el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (Enzyme Linked Immunosorbent Assay -ELISA). Las placas (Costar 3369, Corning) se incubaron con el antígeno SA o L3 diluido en tampón carbonato a pH 9,6 (Tabla 6.4) durante 24 h a 4 ºC. Tras esta incubación se realizaron tres lavados de 5 min con PBS - tween20 (Sigma) al 0,05 % (v/v) para eliminar el antígeno no fijado. Material y Métodos 73 Tabla 6.4 Reactivos para la preparación de buffer carbonato. REACTIVO FÓRMULA CONCENTRACIÓN Bicarbonato de sodio NaHCO3 8,4% Carbonato de sodio NaCO3 18,2% Agua destilada H2O Hasta completar 100ml El bloqueo de las reacciones inespecíficas se realizó mediante incubación durante 45 min a 37 ºC con una solución de albúmina sérica bovina al 3 % (p/v) en PBS, tras lo que se repitieron los lavados. Las muestras se diluyeron en PBS azida de sodio (Sigma) al 0,02 % (p/v) incubándose 1 h a 37 ºC, seguido posteriormente de otros tres lavados. Para el revelado de la reacción, se añadió el conjugado rabbit anti-sheep IgA (Bethyl Laboraties INC or AVIVA System Biology Corp.) en PBS, y se incubó 45 min a 37 ºC. Para eliminar el conjugado no fijado, se realizaron otros tres lavados. A continuación, se añadió el sustrato de la reacción, compuesto por 12,2 ml de ácido cítrico (VWR) al 2,1 % (p/v), 12,8 ml de fosfato sódico (Merck) al 2,8 % (p/v), 10 mg de OPD (O-Phenylene Diamine, Sigma) y 35 l de H2O2 (Panreac), incubándose aproximadamente 8 min en oscuridad. Finalmente, la reacción se frenó mediante la adición de 50 l de una solución de ácido sulfúrico (Panreac) 2 M, dejándolo actuar 5 min, procediéndose a la lectura de las placas en un lector de placas de ELISA (Multiskan Ascent) a una longitud de onda de 492 nm. Como control negativo se utilizó la muestra, pertinente según el caso, de un animal no inoculado y, como control positivo, muestra de un animal previamente inoculado. Las condiciones de concentración de antígeno y diluciones de muestras y conjugado utilizadas, se describe en cada capítulo. 6.8 HISTOLOGÍA Las muestras de abomaso se deshidrataron y se infiltraron con parafina mediante un procesador tisular (Leica TP1050), tras lo cual, se incluyeron en un bloque de parafina y se cortaron con un micrótomo con un grosor de 5 m. Posteriormente, estos cortes se desparafinaron y se hidrataron mediante pases en una batería de xilol, etanol 100 º, 96º y 70 º y por último en agua destilada. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina (Tabla 6.5) para contabilizar los eosinófilos y los leucocitos globulares, y con azul de toluidina (Tabla 6.6) para contabilizar los mastocitos. Una vez teñidos se procedió nuevamente al deshidratado (dos pases de 2 min en etanol de 70 º, 96 º y 100 º y en Xilol) y al montaje en medio DPX (Panreac). Las células de las distintas poblaciones celulares se contabilizaron en 20 campos de 0,0688 mm² a 400 aumentos (40x10x) (Olympus BH2) en una zona situada sobre lámina propia, para Material y Métodos 74 los eosinófilos, y en la zona apical de la mucosa, para los leucocitos globulares (Figura 6.1). Los mastocitos se contabilizaron en 20 campos sobre la lámina propia y en 20 en la zona apical de la mucosa, considerándose en los análisis estadísticos la suma de ambas áreas. El resultado de cada población se expresó en células/mm². Figura 6.1 Zonas delimitadas dónde se realizaron los recuentos. Tabla 6.5 Hematoxilina-eosina. REACTIVO TIEMPO Hematoxilina de Harris 15 min H2O ACLARADO Alcohol clorhídrico 4 s H2O ACLARADO Agua Amoniacal 10 s H2O 15 min Eosina 4 min Tabla 6.6 Azul de Toluidina. REACTIVO TIEMPO Azul de Toluidina (1%) 45 s Alcohol 96º Aclarado - Tiempo determinado por control positivo 6.9 INMUNOHISTOQUÍMICA Las muestras congeladas a -20 ºC fueron procesadas con un grosor de 4 m con ayuda de un criomicrotomo (Frigocut N 2800, Reichert Jung). Estos cortes de tejidos fijados en portaobjetos tratados previamente con Poli-Llisina, se dejaron secar durante 30 min y se conservaron a -80 ºC hasta su procesado. Antes de empezar la técnica, los cortes se atemperaron a 4 ºC durante 20 min y se fijaron en etanol 100 % (Panreac) – 1 % H2O2 (Panreac) durante 10 min en agitación. Posteriormente se realizaron 3 lavados de 5 min en agitación en PBS. Tras secar los portaobjetos, se procedió al bloqueo de las reacciones inespecíficas mediante 30 min de incubación en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero normal de conejo (Dako) diluido en PBS al 1 %. Los Material y Métodos 75 portaobjetos se incubaron posteriormente durante 90 min en cámara húmeda a temperatura ambiente con el anticuerpo primario diluido en RPMI 1640 (BioWhittaker®, Lonza) con Suero Fetal Bovino (SFB) al 5 %. Posteriormente se repitieron los 3 lavados en PBS y se secaron los portaobjetos. A continuación se incubaron las muestras con anticuerpo secundario polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins (IgG) biotinylated (Dako), diluido a 1:20 en RPMI-SFB 5 %, y se incubó durante 30 min en las mismas condiciones que el anticuerpo primario. Se realizaron los 3 lavados en PBS y se secaron los portaobjetos, procediendo a continuación a incubar 60 min en cámara húmeda y oscuridad a temperatura ambiente con el complejo avidina-biotinaperoxidasa (ABC, Vector) al 1 % en PBS. Tras dos lavados en PBS, los cortes se incubaron 10 min con 1 parte de tampón TRIS y 9 partes de solución salina (Tabla 6.7) en agitación a temperatura ambiente y se revelaron con 3,3’ – diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate (Sigma - Aldrich), diluida 0,035 % (p/v) en TRIS 0,1 % H2O2. La contratinción se realizó sumergiendo los portaobjetos durante 0.5 min en hematoxilina de Harris. Tras deshidratar los tejidos, se procedió al montaje de los mismos en medio DPX. Las células de las distintas poblaciones celulares inmunomarcadas fueron contabilizadas por dos patólogos en 20 campos de 0,0688 mm² a 400 aumentos (40x - 10x) (Olympus BH2) en 20 campos sobre la lámina propia y 20 en la zona apical de la mucosa - zona delimitada en Figura 6.1. El resultado de cada población se expresó en células/mm². La expresión de galectina 11 se determinó a 10x en la zona apical de la mucosa, valorando con una escala de 0 a 4, dónde 0 no presenta células marcadas y 4 es el tejido con mayor marcaje. Tabla 6.7 Composición tampón TRIS/Solución salina. REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD TRIS (Sigma) C4H11NO3 60,57gr – 500ml dH2O Ácido clorhídrico (Panreac) 1N HCl Añadir al anterior 350-400ml hasta ajustar a pH 7.6 y enrasar a 1 litro Cloruro de Sodio NaCl 8,5 gr – 1 litro dH2O 6.10 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA – WESTERN BLOTTING La electroinmunotransferencia se realizó con el fin de determinar el reconocimiento de las fracciones proteicas del antigénico somático adulto por parte de la IgA del mucus o sobrenadante de las células secretoras de anticuerpos (ASC) cultivadas in vitro. Para ello, se hicieron electroforesis del marcador LMW Calibration Kit for SDS (Amersham Biosciences) y del antígeno de SA de H. contortus en un gel SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (tras someter las muestras durante 1 min a 100 ºC) en geles de poliacrilamida al 10 % (Tabla 6.8), a 4 ºC – 100 V constante utilizando una cubeta de electroforesis Mini Protein® System Tetra Cell and PowerPac HV™ (BioRad) en tampón reservorio (Tabla 6.8). La transferencia se realizó sobre una Material y Métodos 76 membrana de nitrocelulosa BioTrace®NT (Life Sciences, Pall Corporation) a 100 V constante durante 1 h a 4 ºC (BioRad) en tampón de transferencia (Tabla 6.8). La transferencia se verificó tiñendo con solución de Ponceau (Sigma) la membrana. Posteriormente, la membrana se cortó en tiras de 6 mm y se lavaron 3 veces con PBS conteniendo tween20 (Sigma) 0,05 % (v/v) durante 5 min. Tras estos lavados, se bloquearon las reacciones inespecíficas con albúmina sérica bovina (Albumin Fraction V from bovine serum, Merck) al 3 % (p/v) incubándose durante 1 h a 37 ºC, seguido de 3 nuevos lavados. A continuación, se añadió las muestra (mucus o sobrenadante de cultivo linfocitario) y se incubó a 4 ºC toda la noche en agitación, tras lo que se realizaron otros 3 lavados en PBS-tween20 (Sigma). El conjugado (rabbit anti-sheep IgA, Aviva Systems Biology Corp) se incubó durante 1 h a 37 ºC en agitación. Para eliminar el conjugado no fijado a la membrana se realizaron 3 lavados en PBS y se procedió al revelado con el kit AEC Staining (Sigma) durante 10 min, de nuevo en agitación. La reacción se frenó sumergiendo las tiras en agua destilada. Se utilizaron muestras obtenidas de un animal inoculado como control positivo y un animal sin inocular como control negativo. Material y Métodos 77 Tabla 6.8 Reactivos para la preparación de los geles y tampones necesarios para la electroinmunotransferencia. PREPARACIÓN GELES REACTIVOS FÓRMULA GEL SEPARADOR 10 % (ML) GEL CONCENTRADOR 5 % (ML) Agua destilada H2O 7,37 3,4 Poliacrilamida 30% - 6,25 0,83 Buffer Tris - 4,75 (1.5M pH 8.8) 0,63 (1M pH6.8) SDS (Sigma) 10% C12H25NaO4S 0,187 0,05 APS (Merck) 10% (NH4)2S2O8 0,187 0,05 TEMED (Sigma) C6H16N2 0,0075 0,005 POLIACRILAMIDA 30 % REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD Acrilamida (Sigma) C3H5NO 23,04 gr Bisacrilamida (sigma) C7H10N2O2 0,64 gr Agua destilada H2O 80 ml BUFFER TRIS REACTIVO FÓRMULA 1.5 M pH 8.8 1M pH 6.8 SDS (Sigma) C12H25NaO4S 1gr 1 gr TRIS (Sigma) C4H11NO3 45,5 gr 15,1 gr Agua destilada H2O Enrasar 250 ml Enrasar 250 ml 0.5 M TRIS – HCl pH6.8 REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD TRIS (Sigma) C4H11NO3 6 gr Agua destilada H2O 50 ml Ácido clorhídrico (Panreac) 1M HCl Hasta ajustar pH - enrasar con H2O hasta 100ml TAMPÓN DE CARGA REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD TRIS (Sigma)- HCl (Panreac) - 2,.5 ml Glicerol (Sigma) C3H8O3 2 ml 2 - Mercaptoetanol (Bio-Rad) HOCH2CH2SH 1 ml SDS (Sigma) 10% C12H25NaO4S 4 ml Azul de Bromofenol (Sigma) 0.05% p/v C19H9Br4NaO5S 0.5 ml TAMPÓN RESERVORIO pH8.3 REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD Glicina (Sigma) C2H5NO2 14.4 gr TRIS (Sigma) C4H11NO3 3 gr SDS (Sigma) C12H25NaO4S 1 gr Agua destilada H2O 1 l TAMPÓN TRANSFERENCIA REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD Glicina (Sigma) C2H5NO2 14.4 gr TRIS (Sigma) C4H11NO3 3 gr Agua destilada H2O 430 ml Metanol (Panreac) CH4O 200 ml Agua destilada H2O 372 ml 6.11 PROCESADO DE IMAGEN Se capturó la imagen de la electroinmunotrasferencia o Western Blotting con un sistema de documentación de geles (BioRad Molecular Image® GelDoc™ XR+ Imaging System) y posteriormente se procesaron con el programa Image Lab™ (Software versión 2.0.1 BioRad). El Material y Métodos 78 recorte y organización de las tiras que se muestran en las distintas imágenes se realizó con el programa Adobe Photoshop CS4 Extended Versión 11.0. 6.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el software IBM SPSS Statistics versión 17 para el análisis estadístico. Los datos correspondientes con el recuento de huevos fecales (HGH) se analizaron tras modificarlos mediante su transformación logarítmica (LOG10+1). Las comparaciones de variables hematológicas entre grupos se realizaron utilizando el modelo general lineal (GLM) de medidas repetidas. Por su parte, los datos parasitológicos (carga de vermes, huevos en útero, HGH) y de las inmunoglobulinas específica se analizaron aplicando el modelo lineal generalizado considerando una distribución gamma logarítmica, añadiendo 0,1 a cada dato de la variable cuando algún dato tenía valor igual a 0 por requerimientos del análisis. La longitud de los vermes se analizó también con el modelo lineal generalizado pero considerando una distribución normal lineal. En el análisis estadístico de las variables longitud y huevos en útero se introdujo la variable animal como covariable. Se determinaron los coeficientes de correlación de Spearman y de regresión entre las variables parasitológicas, inmunológicas y/o celulares. Probabilidades con valores p≤0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Capítulo I Resumen s CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 81 CAPÍTULO I. DIFERENCIAS EN SUSCEPTIBILIDAD EN INFECCIONES NATURALES POR NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN OVINOS CANARIOS DE PELO Y CANARIOS 1. RESUMEN Conocer la epidemiología de los parásitos gastrointestinales permitirá establecer programas de control individualizados y sostenibles, optimizando el uso de tratamientos preventivos, llegando quizás, a prescindir de ellos en algunas situaciones epidemiológicas concretas. Actualmente, en numerosas partes del mundo, los tratamientos no son totalmente eficaces por las resistencias que han desarrollado los parásitos. Instaurar medidas de control alternativas o, en su defecto, tratamientos selectivos de aquellos animales que realmente lo necesitan, es una opción plausible, dejando que el resto de animales desarrollen la inmunidad adquirida y establezcan un equilibrio con los parásitos, permitiendo además poblaciones en refugio que diluyan los posibles genes resistentes a antihelmínticos de los parásitos. En la isla de Gran Canaria se explotan dos razas ovinas, la raza Canaria (CAN-susceptible) y la Canaria de Pelo (CAPresistente), en las que se ha comprobado experimentalmente que tienen diferencias en términos de resistencia a la infección por Haemonchus contortus (H. contortus), lo que podría ser relevante a la hora de establecer tratamientos preventivos. Además, a pesar del pequeño tamaño de la isla, hay importantes diferencias climatológicas que podrían modular de forma importante la carga y la distribución de las distintas especies parasitarias entre las distintas explotaciones ovinas. Por todo ello, se realizó un estudio epidemiológico de las infecciones por nematodos gastrointestinales entre los años 2008 y 2010 en dos granjas donde conviven ambas razas ovinas, ubicadas una en el Este a una altitud de 380 m sobre el nivel del mar (“templadomoderada”) y la otra en el Sur a 147 m de altitud (“desierto seco”), por lo que se trata de dos áreas climáticas totalmente diferentes. En total, se realizaron 1.299 análisis coprológicos, con dos muestreos en cada estación del año. Trichostrongylus spp. fue el género predominante, seguido por las especies Teladorsagia circumcincta y, con menor prevalencia, H. contortus en ambas granjas. Los resultados obtenidos mostraron diferencias entre granjas en la dinámica de excreción de huevos y se observaron también diferencias significativas en los huevos eliminados entre razas, siendo también la raza CAP más resistente que la CAN en infecciones naturales. Material y Métodos CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 88 3.3 PROCESADO DE LAS MUESTRAS DE HECES El recuento de huevos en heces se llevó a cabo por medio del método de McMaster modificado. En algunos muestreos, con las heces que sobraron de cada recuento se preparó un “pool” y se cultivaron a temperatura ambiente durante 12 días para conseguir la eclosión de los huevos y el desarrollo larvario hasta el estadio 3, controlando la humedad y removiendo regularmente para evitar la proliferación de hongos. La recuperación de las larvas se realizó por medio del método de Baermann, con un filtrado posterior (modificado de MAFF, 1989). La identificación larvaria de nematodos gastrointestinales se realizó siguiendo las guías descritas por van Wyk et al., 2004, utilizando para ello un microscopio invertido (Olympus CKX41) con cámara de fotos digital acoplada (ProgRes C12PLUS) que permitió tomar las medidas de longitud total y vaina de la cola y visualizar la forma de la “cabeza”. En total se identificaron en cada uno de los muestreos seleccionados, como mínimo 30 larvas elegidas al azar. 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO La variable Recuento de Huevos en Heces (HPG) se transformó mediante Log10+1 para aproximar los datos a una distribución normal. El test estadístico usado para el análisis fue el Modelo Lineal General (GLM) Univariante, teniendo en cuenta como variables LogEPG o cada género/especie parásita (Trichostrongylus spp., Teladorsagia circumcincta, o Haemonchus contortus) según el caso y, como factores fijos estación, raza y año (esta última variable solo en la granja 1). En la granja 2, la escasa producción de huevos en esta región más árida, supuso una menor cantidad de larvas identificadas, por los que no se pudo realizar el GLM para la identificación larvaria. Para la granja 1, con el fin de poder realizar el GLM de la identificación, se fusionaron los dos muestreos de cada estación en una sola variable. Probabilidades p≤0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Resultados CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 89 4. RESULTADOS 4.1 GRANJA 1 4.1.1 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas dentro de estación y de año Se observó recuento de huevos en heces significativamente mayor en el ovino CAN con respecto a CAP en Primavera 1 y en Invierno 1 en 2008, en Invierno 2 y Primavera 1 en 2009 y en Invierno 2 en el año 2010 (Figura 4.1a, 4.1b, 4.1c). Figura 4.1 Representación gráfica de los recuentos de huevos en heces transformados a Log10+1 (HPG) de las distintas razas (CAP y CAN) junto con las condiciones de temperatura máxima-mínima y precipitaciones de la zona en el momento de la toma de muestras. * Indica p≤0,05 y ** p≤0,01. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Invierno 1 Invierno 2 Primavera 1 Verano 1 HPG (Log10+1) 2010 Granja 1 LogHPG CAP LogHPG CAN Precipitación (mm) Temperatura Máxima (ºC) Temperatura Mínima (ºC) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Primavera 1Primavera 2 Verano 1 Verano 2 Otoño 1 Otoño 2 Invierno 1 HPG (Log10+1) 2008 Granja 1 LogHPG CAP LogHPG CAN Precipitación (mm) Temperatura Máxima (ºC) Temperatura Mínima (ºC) * ** 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Invierno 2 Primavera 1 Primavera 2 Verano 2 Otoño 1 Otoño 2 HPG (Log10+1) 2009 Granja 1 LogHPG CAP LogHPG CAN Precipitación (mm) Temperatura Máxima (ºC) Temperatura Mínima (ºC) ** ** ** Resultados CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 90 4.1.2 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas entre años y estaciones Sin distinción en años y estaciones, CAN presentó significativamente más huevos que CAP (p=0,000). A su vez, dentro de año, sin distinguir estaciones, CAN presentó significativamente más huevos en heces que CAP durante 2008 y 2009. Dentro de estaciones, diferenciando raza pero no año, se observó un incremento significativo en la producción de huevos en CAN con respecto a CAP, a lo largo de todo el otoño e invierno. 4.1.3 Diferencias en los recuentos de huevos dentro de razas Dentro de raza, CAP no presenta diferencias significativas entre años. Dentro de estaciones sin considerar el año, en Primavera 1 se contabilizaron más huevos que el resto de estaciones, si bien estas diferencias no fueron significativas. Entre estaciones dentro de año, se observó un incremento significativo de los recuentos de huevos en Primavera 1 con respecto Invierno 1, Invierno 2 y Verano 1 en el año 2010. Es decir, el inicio de la primavera es el momento en el que suelen excretar más huevos de parásitos los animales de esta raza en esta explotación. Por otro lado CAN presentó a modo general un recuento de huevos mayor en 2009 respecto a 2010. En cuanto a estaciones sin considerar el año como factor, presentó un mayor recuento de huevos Invierno 2, siendo solo estadísticamente significativo con respecto a Primavera 2. Sin embargo dentro de año, sólo se observó un incremento significativo de invierno 2 con respecto invierno 1 en el año 2010. 4.1.4 Identificación Larvaria El género y especies de nematodos gastrointestinales predominantes fueron Trichostrongylus spp., Teladorsagia circumcincta y Haemonchus contortus. Dada la baja prevalencia (8-10%), no se tuvieron en cuenta en el análisis de los datos la identificación de larvas de Cooperia curticei (una ocasión) y de Bunostomum spp. (dos ocasiones). El género predominante fue Trichostrongylus spp. en todos los muestreos, con una prevalencia casi siempre superior al 50% (Figura 4.2), seguido por Teladorsagia circumcincta y Haemonchus contortus. Trichostrongylus spp. globalmente, no presenta diferencias significativas en su frecuencia de aparición entre años y tampoco entre estaciones. Entre estaciones dentro de año tampoco presenta diferencias significativas desde el punto de vista estadístico. Teladorsagia circumcincta, sin considerar las estaciones como factor, mostró prevalencias significativamente mayores el año 2008, en comparación con los años 2009 y 2010. Aunque no fue estadísticamente significativo (p=0.092), 2010 presentó mayor prevalencia que 2009. Es decir, la presencia del parásito varió significativamente entre años. Dentro de estaciones, sin Resultados CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 91 tener en cuenta el año, se observaron prevalencias significativamente mayores en Primavera. Tanto en Invierno como en Verano fueron también significativamente mayores que en Otoño, siendo por tanto esta estación en la que se detectó con menos frecuencia este parásito. Haemonchus contortus no mostró diferencias significativas entre años sin considerar las estaciones. Del mismo modo, no mostró diferencias significativas entre estaciones sin tener en cuenta año. Tampoco mostró diferencias entre estaciones dentro de año. Es decir, estadísticamente no fueron significativas las pequeñas fluctuaciones en su prevalencia. Figura 4.2 Representación gráfica en columnas del % de larvas del género Trichostrongylus spp., y de las especies Teladorsagia circumcincta y Haemonchus contortus obtenidas tras la identificación larvaria de los coprocultivos de la granja 1 en los muestreos de los años 2008, 2009 y 2010, con representación en líneas y puntos de las condiciones de temperatura máxima-mínima (ºC) y precipitaciones (mm) en el momento del muestreo. La barra negra en la base del gráfico indica la separación entre años. 4.2 GRANJA 2 4.2.1 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas dentro de estación Los recuentos de huevos en heces fueron significativamente mayores en el ovino CAN, con respecto a CAP, en Invierno 1, Verano 2 y Otoño 1. (Figura 4.3). Al analizar los datos de los recuentos de huevos en heces de los corderos, se observó un incremento significativo en la raza CAN con respecto a CAP en Verano 2 y Otoño 1. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Larvas L3 Granja 1 Haemonchus contortus Teladorsagia circumcincta Trichostrongylus spp Precipitación (mm) Temperatura Máxima (ºC) Temperatura Mínima(ºC) 2008 2009 2010 Resultados CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 92 Figura 4.3 Representación gráfica de los recuentos de huevos en heces transformados a Log10+1 (HPG de las distintas razas (CAP y CAN) junto con las condiciones de temperatura máxima-mínima y precipitaciones de la zona en el momento de la toma de muestras. * Indica p≤0,05 y ** p≤0,01. 4.2.2 Diferencias en los recuentos de huevos entre razas y estaciones Globalmente los ovinos de raza CAN presentaron mayores recuentos de huevos que los CAP (p=0,000). Entre estaciones, la que tiene un recuento mayor es Otoño 1, siendo este incremento significativo con respecto Invierno 2, Primavera 1, Primavera 2, Verano 1 y Otoño 2. Aunque la diferencia no es significativa estadísticamente, las estacion que menor recuento presentó fue Primavera 1. 4.2.3 Diferencias en los recuentos de huevos dentro de razas Dentro de raza, CAP - apenas excretaron huevos en esta explotaciónno mostró diferencias significativas entre estaciones. Por otro lado, para CAN el Otoño 1 resultó ser la estación que mayores recuentos presentó, siendo estadísticamente superiores con respecto Invierno 2, Primavera 1, Primavera 2, Verano 1 y Otoño 2. Dentro de esta raza, Invierno 2 fue la estación en la que menor, aunque no estadísticamente significativo, recuento de huevos en heces se registró. 4.2.4 Identificación Larvaria El género de nematodos gastrointestinal predominante fue Trichostrongylus spp. seguido de la especie Teladorsagia circumcincta. Mucho más vestigial fue la presencia de Haemonchus contortus (Figura 4.4). 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Invierno 1 Invierno 2 Primavera 1Primavera 2 Verano 1 Verano 2 Otoño 1 Otoño 2 HPG (Log10+1) 2008 Granja 2 LogHPG CAP LogHPG CAN Precipitación (mm) Temperatura Máxima (ºC) Temperatura Mínima (ºC) ** ** ** Resultados CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 93 Figura 4.4 Representación gráfica en columnas de la identificación larvaria obtenida tras el coprocultivo de las heces recogidas en la granja 2 en los muestreos del año 2008. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Primavera 1 Otoño 1 % Larvas L3 Granja 2 Haemonchus contortus Teladorsagia circumcincta Trichostrongylus spp Discusión CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 94 5. DISCUSIÓN Los recuentos de huevos en heces (HGH) son utilizados como indicador de resistencia a parásitos por su relación con la carga parasitaria (Macchioni et al., 2007). En este sentido, en estudios comparados entre algunas razas ovinas se ha observado resistencia a nematodos gastrointestinales, ya sea en infecciones naturales o experimentales. Entre los ejemplos, se pueden destacar a la Red Maasai comparada con Dorper (Mugambi et al. 1996, 1997, 2005; Baker at al. 2004) St-Croix con Dorset (Gamble y Zajac, 1992; Burke y Miller, 2004), Santa Inés comparada con Ile France y Sulffolk (Amarante et al. 2004) Barbados Black Belly con INRA 401 (Gruner et al. 2003; Aumont et al., 2003; Terefe et al., 2007a), la Florida Native con Rambouillet (Radhakrishnan et al., 1972; Amarante et al., 1999), Texel con Suffolk (Good et al., 2006), Katahdin comparada con mestizos de Dorset y de Dorper (Vanimisetti et al., 2004b) Gulf Coast Native con Sulffolk (Miller et al., 1998) Lohi comparada con Thalli y Kachhi (Saddiqi et al., 2010) o Criolla Lanada con Corriedale (Bricarello et al., 2004). En esta línea, nuestro grupo demostró que los ovinos de la raza Canario de Pelo son más resistentes que los ovinos de la raza Canaria en inoculaciones experimentales con Haemonchus contortus (González et al., 2008). Con el fin de observar si estas diferencias entre razas también estaban presentes en infecciones naturales, se realizó este estudio de campo en el que, efectivamente, se observó que los ovinos de raza CAP presentaron menores HGH que los ovinos de la raza CAN, demostrándose que también son más resistentes en infecciones naturales. Esta diferencia en HGH no solo se observó en los individuos adultos, sino que también se observaron diferencias significativas en los HGH de los corderos, como se describió en el apartado de resultados de la granja 2, lo que sugiere que los corderos también son más resistentes. Este fenómeno también está descrito en corderos de otras razas resistentes como Barbados Black Belly (Gruner et al., 2003), Red Maasai (Mugambi et al., 1996), Florida Native (Radhakrishnan et al., 1972) y/o Gulf Coast Native (Li et al., 2001), lo que podría sugerir una respuesta más temprana a la infección por nematodos gastrointestinales de lo descrito en la bibliografía en razas comerciales (Smith et al., 1985). Actualmente, las resistencias por parte de los parásitos a los diferentes tratamientos descritas en varios países (van Wyk et al., 1999; Bartley et al., 2003; Čerňanská et al., 2006; Coles et al., 2006; Álvarez-Sánchez et al., 2006; Cezar et al., 2010; Saeed et al., 2010; Martínez-Valladares et al., 2013a; Lyndal-Murphy et al., 2014; Liébano-Hernández et al., 2015; Van den Brom et al., 2015) están comprometiendo las producciones ganaderas, por lo que establecer un adecuado calendario de tratamiento y/o establecer medidas de control alternativas, entre los que se encuentra la selección de razas/individuos resistentes, podría permitir alargar la vida útil de los fármacos. Aplicar un tratamiento correcto tiene gran importancia y seleccionar los Discusión CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 95 criterios a seguir en estos tratamientos será fundamental. Así Pedreira et al., 2006, observaron que las granjas que administraban tratamientos antihelmínticos basados en la experiencia del granjero presentaron mayores recuentos de huevos en heces que aquellas que los aplican siguiendo el criterio veterinario o basados en la recomendación comercial. Molina et al., 1997, basándose en el trabajo de Rodríguez-Ponce et al., 1995 y López-Gómez y López-Gómez, 1959, describen 4 zonas con diferencias climatológicas en la isla en un estudio epidemiológico realizado en granjas de cabras de Gran Canaria. En base a esta descripción, la granja 1 encuadraría dentro de la zona de temperatura “templada y suave” y la granja 2 estaría ubicada en un clima de “desértico seco” con temperaturas más elevadas y menores precipitaciones. Observando la evolución de la parasitología a lo largo de los tres años de muestreo de la granja 1, sin tener en cuenta las estaciones, solo hubo diferencias en los recuentos de huevos entre razas en el año 2008 y 2009, quizás porque el muestreo del año 2010 no fue completo. En todo caso, y aunque debe validarse en el futuro, esto sugiere que los planes de tratamientos quimioprofilácticos deberían amoldarse a las condiciones concretas de cada año. Por otro lado, comparando razas dentro de estaciones sin tener en cuenta los tres años en la granja 1, CAN presentó recuentos significativamente mayores en Otoño e Invierno con respecto a CAP, correspondiendo con los periodos con mayores precipitaciones (Figura 4.1), lo que favorecería la parasitosis, haciendo más evidente la diferencia en la susceptibilidad/resistencia. Además, este periodo coincide con la época de partos en la raza CAN. Comparando las dos granjas en el año 2008, la raza CAP en la granja 2 tiene un recuento de 4±2 hpg frente a los 10±4 hpg de la granja 1, no obstante, a pesar de que son recuentos muy bajos por la resistencia de esta raza, y pese a no existir diferencias significativas por la variación individual, sugiere que las diferencias climáticas Norte-Sur favorecidas por la formación del mar de nubes que suavizan las temperaturas y favorecen la retención de la humedad y precipitaciones en la zona Norte de la isla, influyen en el ciclo de los parásitos. Estos resultados contrastan con los de Molina et al., 1997, que observaron que los animales de la zona desértica presentaron mayores cargas que los animales de la zona de temperaturas suaves, sin embargo no se puede hacer una comparativa directa con este estudio, pues los hospedadores y la variable parasitológica cuantificada -vermes adultosson diferentes. Algo similar sucede con los ovinos de raza CAN en la granja 2, salvo un pico de excreción de huevos observado en esta granja más meridional, que podría atribuirse a la introducción de animales del municipio de Valleseco, con mucha más pluviometría. Estos movimientos de animales son una constante en los modelos de producción tradicionales arraigados en las islas. Discusión CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 96 Las diferencias entre razas observadas en ambas granjas en las prevalencias aparecen en los momentos en los que aumentan los recuentos de huevos de nematodos gastrointestinales en la raza CAN y coinciden con incrementos de las precipitaciones, con descensos de las temperaturas y con el periparto (Figuras 4.1 y 4.3), por lo que tienen lugar cuando las condiciones son más favorables para los parásitos (Procter y Gibbs, 1968; O’Connor et al., 2006). Visualizando los recuentos en cada raza, los recuentos en la raza CAP se mantuvieron bajos (<50 huevos por gramo en la granja 1 – Figura 4.1– y <10 en la granja 2 – Figura 4.3) y no se observaron diferencias interanuales, lo que sugiere que los tratamientos en esta raza podrían limitarse, y se debería valorar si estas pequeñas cargas realmente producen perdidas productivas que compensen los costes de los tratamientos en aquellas estaciones del año dónde se producen los picos puntuales (Figura 4.1) como es el caso de la Primavera en la granja 1 (2010) y, de la misma manera, es muy dudosa la necesidad de tratamientos en la granja 2. Es decir, dependiendo de la zona de cría del ganado, podría modificarse el plan quimioprofiláctico en granjas que exploten CAP. Por el contrario en los ovinos CAN, los recuentos son algo más elevados, aunque también bastante bajos si se comparan con otros estudios realizados con otras razas en otras situaciones geográficas (Mugambi et al., 1997; Baker et al., 2004; Amarante et al., 2004). Aunque se deberían estimar las consecuencias que estas cargas pueden tener en los rendimientos productivos de los animales de esta raza, en caso de aplicar tratamientos convendría prevenir el incremento en los recuentos experimentados en la granja 1 – y por tanto en la región de clima “templado-suave”- a principios del invierno y, a finales del verano en la granja 2 -clima más seco. De todos modos, como se discutió anteriormente, conviene señalar que el pico que se observa en la Figura 4.3 en la granja 2, pudo favorecerse por la introducción de animales sin desparasitar procedentes de una explotación situada en un municipio de la zona Norte de la isla (más húmeda) en Verano 2 (inicio del pico – Figura 4.3), viéndose probablemente los parásitos favorecidos por las condiciones climáticas y fisiológicas (periparto) de los animales. Otra observación que no debe pasar desapercibida, es la caída de recuentos en ambas razas en Invierno 1 de 2010 en la granja 1, que podría sugerir la administración de un tratamiento antihelmíntico que el ganadero no haya comunicado. Los principales géneros/especies parásitas identificadas tras el coprocultivo fueron Trichostrongylus spp., T. circumcincta y H. contortus. La presencia de estas tres especies en relación con los bajos recuentos de huevos en heces en CAP con respecto a CAN, sugieren que la raza CAP podría ser resistente también a Trichostrongylus spp. y a Teladorsagia circumcincta. En este sentido, Gruner et al., 2003 demostraron que los corderos Barbados Black Belly, reconocidos como resistentes a infecciones por Haemonchus contortus, son también resistentes Discusión CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales 97 a Trichostongylus colubriformis y, en menor medida, a Teladorsagia circumcincta. Trabajos experimentales futuros permitirán constatar si, tal y como estos datos sugieren, los ovinos de raza CAP son más resistentes que los CAN a infecciones experimentales por Trichostrongylus spp o por T. circumcincta. Es bien conocido que la humedad y temperatura son factores determinantes para el desarrollo y supervivencia de los estadios de vida libre de estas especies parásitas. O’Connor et al., 2006, citan a modo de resumen como temperaturas óptimas para el desarrollo desde el huevo no embrionado hasta el estadio infectante L3 de T. colubriformis, de 22 a 33ºC, siendo aproximadamente entre 25 y 30ºC el mejor rango; para T. circumcincta de 16 a 30ºC, considerándose aproximadamente entre 21 y 25ºC el mejor rango y, para H. contortus de 25 a 37ºC, siendo aproximadamente el rango de temperaturas más adecuado entre 31 y 34ºC; si bien las tres especies se ven afectadas por la desecación, los estadios pre-infectantes de H. contortus son los más susceptibles a esta (O’Connor et al., 2006). Por otro lado Leathwick, 2013, a través de un modelo matemático usando como base de datos varias referencias bibliográficas, estimó que la temperatura óptima de T. colubriformis es 18ºC, de T. circumcincta es 16ºC y de H. contortus es 22ºC. En este sentido, la granja 1 y la granja 2 siempre se mantuvieron dentro de estos rangos, si bien la granja 2 presentó siempre las mayores temperaturas y prácticamente sin precipitaciones todo el año, lo que viene reflejado en los bajos recuentos de huevos en heces en esta granja. La falta de heladas y la protección a la insolación que supone la bruma que producen los alisios, pueden explicar que existan parásitos todo el año en la granja 1, y por tanto, en explotaciones ubicadas en el área de temperaturas “templada y suave”. El principal factor que modula las cargas parasitarias en estas dos regiones geográficas ha sido la pluviosidad y como consecuencia la humedad, tal y como observaron Martínez-Valladares et al., 2013b o como sugieren O’Connor et al., 2006, quienes consideran que en regiones con climas de temperaturas cálidas, es la humedad el principal factor que modula el desarrollo de las fases de vida libre a la forma infectante. En la granja 1 Trichostrongylus spp. fue el género predominante a lo largo de los muestreos, seguido por fluctuaciones en la prevalencia de T. circumcincta y H. contortus (Figura 4.2), si bien la única especie que mostró diferencias significativas entre años a lo largo del estudio fue T. circumcincta, siendo más frecuente en la estación de Primavera y en el año 2008, a lo largo de los otros dos años fluctúa, pareciendo que aumenta su prevalencia cuando las precipitaciones son bajas, similar a lo observado por Molina et al., 1997, quizás por la menor dependencia a la humedad en comparación con H. contortus y, en menor medida, Trichostrongylus spp. (O’Connor et al., 2006). Por otro lado, H. contortus parece fluctuar con las temperaturas y CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Introducción CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 104 2. INTRODUCCIÓN La resistencia frente a nematodos gastrointestinales se caracteriza por una reducción en la fecundidad, del tamaño de los vermes y de la carga parasitaria. La fecundidad se ha correlacionado positivamente con la longitud y carga parasitaria en Teladorsagia circumcincta (Stear et al., 1995; Stear y Bishop, 1999; Stear et al., 1999) con longitud en infecciones por H. contortus (Ractliffe y Lejambre, 1971; Lacroux et al., 2006; Rowe et al., 2008). La reducción en la longitud de los vermes, y en consecuencia de su fecundidad (Stear y Bishop, 1999), está asociado principalmente a la producción local de IgA específica orientada a etapas larvarias del parásito en infecciones por T. circumcincta (Stear et al., 1996; Martínez Valladares et al., 2005). En infecciones por H. contortus, la IgA específica frente a estadios larvarios se asocia igualmente a reducciones en la longitud de los vermes (Lacroux et al., 2006) y a la fecundidad (Gill et al., 1993a; Strain y Stear, 2001; Amarante et al., 2005). Sin embargo, las reducciones en las cargas parasitarias se suelen vincular con reducciones en el establecimiento larvario, ya sea mediante un rechazo tardío, mediado por los eosinófilos –probablemente mediante mecanismos ADCC (Antibody Dependent Cell mediated Citotoxicity)- (Rainbird et al., 1998; Balic et al., 2000a; 2000b; 2006; Nisbet et al., 2015) u otro de respuesta más rápida, vinculado a los leucocitos globulares, que impediría a las larvas penetrar la mucosa, fenómeno conocido como autocuración (Balic et al., 2000a; 2000b; 2002). En estudios previos, se ha constatado que no hay diferencias en el desarrollo de la infección experimental con H. contortus a los 7 dpi entre dos razas ovinas autóctonas canarias, el ovino CAP y el CAN, que sí son evidentes, con diferencias significativas a los 28 dpi en carga parasitaria, longitud y fecundidad de los vermes (González et al., 2008; Hernández, 2011). Esto contrasta con la información recopilada en otras razas ovinas comerciales, en las que se ha estipulado que es el estadio larvario (L3) contra el que se establece la respuesta protectora. El objetivo de este trabajo es constatar si en un punto anterior -21 dpide la infección experimental con 20.000 L3 de H. contortus, se observan diferencias entre razas en la evolución de la infección que permitan acotar mejor el momento en el que se establecen los mecanismos protectores de la raza resistente CAP, así como caracterizar esta respuesta protectora, incluyendo la producción de inmunoglobulinas en los nódulos linfáticos locales, las poblaciones celulares de la pared del abomaso y la capacidad del mucus del abomaso para reducir la movilidad de los parásitos. CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Material y Métodos CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 105 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL Diecinueve corderos machos de la raza CAP y dieciocho de la raza CAN fueron adquiridos en el momento del destete en granjas de Gran Canaria y alojados en las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (España) hasta aproximadamente el año de edad. Los animales se alimentaron con una ración comercial de granulado para ovinos y agua ad libitum durante todo el periodo experimental. A su llegada a las instalaciones, se desparasitaron con levamisol (Cyver, Fort Dodge, España) a la dosis recomendada (1 ml/10 kg de peso corporal), manteniéndose libres de parásitos hasta el inicio de la experiencia. Catorce animales de la raza CAP y trece de la raza CAN fueron inoculados intrarruminalmente con 20.000 L3 de H. contortus con el fin de reproducir infecciones previas efectuadas por nuestro grupo (González et al., 2008; Hernández, 2011). Cinco animales sin infectar de cada raza fueron sacrificados como controles; 6 animales de la raza CAP y 5 de la raza CAN fueron sacrificados a los 7 dpi y, 8 animales de cada raza fueron sacrificados a los 21 dpi. Tal y como se ha descrito detalladamente en el capítulo de material y métodos, se utilizó la cepa de H. contortus donada por los Dres. Knox y Bartley (Moredun Research Institute, Edimburgo, Reino Unido). 3.2 MUESTRAS SANGUÍNEAS Siguiendo el procedimiento descrito en el capítulo general de Material y Métodos, se extrajo sangre a los animales los días 0, 7, 14 y 21 dpi para la hematología y la obtención de suero. 3.3 ANÁLISIS COPROLÓGICOS Se tomaron heces directamente del recto desde el día 16 pi hasta el día previo al sacrificio para el recuento de huevos mediante la técnica de McMaster modificado (MAFF, 1989). 3.4 RECOGIDA DE MUESTRAS TRAS EL SACRIFICIO Tras el sacrificio de los animales se aislaron los abomasos, se tomaron muestras de tejido de la curvatura mayor y se abrieron para recoger muestras de contenido abomasal, mucus y mucosa, tal y como se describe en el capítulo de Material y Métodos. 3.5 ANÁLISIS PARASITOLÓGICOS Se contabilizaron los vermes de las alícuotas y se midieron aleatoriamente 30 vermes a los 7 dpi y 30 vermes hembras a los 21 dpi, de las que también se contabilizaron los huevos intraútero, siguiendo el procedimiento descrito en el capítulo de Material y Métodos. La suma de las larvas CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Material y Métodos CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 106 obtenidas tras la digestión o intramurales y las larvas localizadas en la luz del abomaso corresponde con carga parasitaria de la Tabla 4.1. 3.6 CULTIVO DE CÉLULAS SECRETORAS DE ANTICUERPOS (ASC) Tras observar asociaciones negativas entre la IgA de mucus específica de vermes adultos y la longitud en los ovinos Canarios de Pelo en una experiencia previa en la que se sacrificaron los animales a los 28 dpi (Hernández, 2011), se propone valorar si hay diferencias cuantitativas y cualitativas en el reconocimiento antigénico de los animales resistentes a partir de los sobrenadantes de cultivo de linfocitos de los nódulos linfáticos abomasales en los dos momentos del sacrificio, que representan la producción específica de inmunoglobulinas frente a dos estadios parasitarios diferentes (larvarios/adultos). Para ello, tras el sacrificio de los animales se recogió un nódulo linfático abomasal para el cultivo linfocitario. Una vez que se retiró la grasa de los nódulos linfáticos, se maceraron con ayuda del émbolo de una jeringuilla y se lavaron tres veces en RPMI 1640 suplementado (Tabla 3.1) centrifugando a 250g (Mixtasel P Selecta®) durante 20 minutos, en condiciones de esterilidad. Posteriormente, tras ajustar la concentración a 5x106 células/ml, los linfocitos se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado durante 96 horas (37ºC; 5% de CO2) en placas de cultivo celular (Costar® 3526, Corning Incorporated) de 24 pocillos. Finalmente se recogió el sobrenadante, previa centrifugación a 1500g (Mixtasel P Selecta®) durante 3 minutos, y se almacenó a -20ºC hasta su uso (mod. Bowles et al. 1995). Tabla 3.1 Suplementación del medio RPMI 1640. REACTIVO PROPORCIÓN Penicilina/estreptomicina 2% L-glutamina 1% Suero Fetal Bovino Inactivado (SFB) 10% 3.7 ANÁLISIS DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (E.L.I.S.A.) Los niveles de IgA e IgG específicas en mucus y A.S.C., fueron determinados mediante el análisis de E.L.I.S.A. siguiendo el protocolo descrito en el capítulo de Material y Métodos. Las condiciones específicas seguidas en este trabajo se recogen en la Tabla 3.2. Tabla 3.2 Relación de condiciones para el antígeno, muestra y conjugado según determinación. MUESTRA INMUNOGLOBULINA CONCENTRACIÓN ANTÍGENO DILUCIÓN MUESTRA DILUCIÓN CONJUGADO Mucus IgA g/ml L3 1:2 1:100  g/ml SA 1:5 1:100  IgG 5g/ml L3 1:5 1:1000 5g/ml SA 1:5 1:1000 ASC IgA g/ml L3 1:1 1:100 g/ml SA 1:1 1:100 IgG g/ml L3 1:1 1:1000 g/ml SA 1:1 1:1000 CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Material y Métodos CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 107 3.8 ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA La electroinmunotransferencia de antígeno SA con los ASC se realizó con el fin de valorar el reconocimiento de fracciones proteicas del antígeno por parte de la IgA producida localmente. Para ello, se realizó la técnica tal y como está descrita en el capítulo de Material y Métodos. Las condiciones específicas seguidas en este capítulo se recogen en la Tabla 3.3. Tabla 3.3 Relación de condiciones para el antígeno, muestra y conjugado. MUESTRA CONCENTRACIÓN ANTÍGENO DILUCIÓN MUESTRA DILUCIÓN CONJUGADO Sobrenadante de A.S.C. 1,5g/l SA 1:1 1:500 IgA 3.9 PROCESADO DE IMAGEN Se capturó la imagen de la electroinmunotransferencia con un transiluminador de luz ultravioleta (BioRad Molecular Image® GelDoc™ XR+ Imaging System) y posteriormente se procesaron las imágenes con el programa Image Lab™ (Software version 2.0.1 BioRad). El corte y organización de las tiras que se muestran en la figura 4.6 se realizó con el programa Adobe Photoshop CS4 Extended Versión 11.0. 3.10 HISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA Las muestras de abomaso tomadas tras el sacrificio fueron procesadas (capítulo Material y Métodos) y se identificó y contabilizaron en la mucosa del abomaso los eosinófilos, leucocitos globulares, linfocitos T+,WC1+, CD4+, CD8+, CD1+, CD2+, CD5+, MHC-II+, CD45RA+, galectina 11+ y galectina 14+. 3.11 ENSAYO DE MIGRACIÓN LARVARIA (LMIA) El ensayo de migración larvaria (Kotze et al., 2006) se realizó con el fin de valorar la actividad inhibitoria del mucus. Inicialmente se incubó durante 24 horas a 37ºC con humedad, en una placa de 96 pocillos (Costar® 3596, Corning Incorporated) y por duplicado, 50 l de una mezcla formada por las L3 de H. contortus (aproximadamente 50 larvas/25 l) suplementada con anfotericina B (25 μg/ml) y penicilina/estreptomicina (100U/ml y 100 μg/ml) con el mucus (25 l) – contabilizándose las larvas por pocillo antes de depositar el mucus. Paralelamente, se preparó y se mantuvo a temperatura ambiente la placa de lavado y, también a temperatura ambiente pero en condiciones de humedad, la placa de migración con filtro Millipore Multiscreen®- MESH 20 μm (Millipore). Los pocillos de la placa de lavado contenían 250 l de una mezcla con las mismas condiciones que la placa de incubación a excepción de las larvas. En la placa de migración, sobre el filtro a través del cual van a migrar las larvas, se dispensó 75 l/pocillo de agar (0.125% p/v, Sigma). Pasadas las 24 horas, se añadieron 170 μl de la solución CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Material y Métodos CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 108 de cada pocillo de la placa de lavado en la base de la placa de migración. Se colocó la placa de los filtros sobre esta y se incubó a 37ºC durante 2 horas con el fin de que el agar se equilibrara con la solución. Tras esta incubación, se añadió los 50 μl de la placa de incubación a la placa de los filtros con el agar, respetando por supuesto el orden de los pocillos, lavando posteriormente cada pocillo de la placa de incubación con 50 μl de la placa de lavado para recuperar las posibles larvas que hayan podido quedar en ellos. La placa de migración con las larvas se incubó 24 horas a 37ºC con humedad. Pasadas las 24 horas de incubación, se realizó la lectura, contabilizando las larvas que hayan migrado a través del agar y filtro y, por tanto, se encuentren depositadas en la base de las placas de migración. Figura 3.1 Representación final de un pocillo de la placa de migración. 3.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se utilizó el software IBM SPSS Statistics versión 17 para el análisis estadístico. El animal CAP 52, perteneciente al grupo 7 dpi, se descartó del análisis estadístico por su desviación de la tendencia de la raza, valor atípico (Outlier). Los datos del recuento de huevos en heces a día 20 dpi (HGH20) se analizaron tras normalizarlos previa transformación a LOG10+1. Los datos de carga parasitaria, huevos en útero, HGH20 y de las inmunoglobulinas se analizaron aplicando el modelo lineal generalizado considerando una distribución gamma logarítmica y el método de estimación Newton Raphson con escala X2 de Pearson, salvo la IgA de mucus específica SA que se analizó con el método Híbrido. Para poder aplicar la distribución gamma, a aquellas variables en la que algún dato tuviera valor 0, se añadió 0.1 a todos los datos de la variable. En el modelo de la variable huevos en útero se introdujo la variable “animal” como covariable. La longitud de los vermes se analizó aplicando el modelo lineal generalizado sobre todas las mediciones efectuadas, pero considerando una distribución normal lineal y el método de estimación Híbrido e incorporando la variable “animal” como covariable. Los recuentos de células de los abomasos se analizaron por medio del modelo general lineal (GLM) univariante. Las comparaciones de Mucus+ L3+ Anfotericina B – Penicilina/estreptomicina sobre el Agar Agar sobre el filtro L3 que han migrado CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Material y Métodos CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 109 hematocrito, proteínas plasmáticas y eosinófilos en sangre se realizaron utilizando el GLM de medidas repetidas. LMIA fue analizado mediante una prueba no paramétrica, concretamente mediante la U de Mann Whitney. Las asociaciones entre las distintas variables se valoraron mediante la determinación de los coeficientes de correlación de Spearman entre datos parasitológicos, inmunológicos y/o celulares obtenidos y mediante análisis de regresiones entre variables. Probabilidades p≤0,05 se consideraron estadísticamente significativas. CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 110 4. RESULTADOS 4.1 PARASITOLOGÍA No se observaron diferencias significativas entre razas a los 7 dpi ni en las cargas ni en la longitud de las larvas (Tabla 4.1). A los 21 dpi los ovinos CAP mostraron reducciones significativas en los recuentos de vermes al compararlos con los CAN. Aunque inicialmente se observan diferencias raciales en longitud y fecundidad, estas parecen deberse a la variabilidad individual pues desaparecen estas diferencias entre razas cuando se incluye la variable categórica animal como covariable (Tabla 4.1). Uno de los animales de raza CAP (#52) mostró una resistencia excepcional respecto al resto de animales que se puso especialmente de manifiesto con una extraordinaria reducción de la longitud de sus larvas a los 7 dpi que midieron en promedio, tan sólo 2.8 mm, mientras que la media del siguiente animal que albergó los vermes más cortos fue de 4.367 mm. Tal y como se señaló anteriormente, este animal se consideró un outlier y no se incluyó en el análisis estadístico. Tabla 4.1 Parámetros parasitológicos (Media ± Error Estándar de la Media) obtenidos de muestras recogidas en el sacrificio a 7 y 21 dpi. HPG20= Recuento de huevos en heces Log10+1 a los 20 dpi. Longitud (mm). * Indica p≤0.05, ** p≤0.01. MEDIAS PARASITOLOGÍA Grupo Variable Parasitológica CAP CAN 7dpi Carga parasitaria (% dosis infectiva) 5005 1291 (25 %) 5803  546 (29%) Longitud 4,80  0,04 5,04  0,05 21dpi Carga parasitaria (% dosis infectiva) 1110±547* (5.6%) 3280±848* (16.4%) Longitud 13,44±0.22 14,30±0.16 HPG20 0** 1,6±0,47** Huevos en útero 20±3 63±4 4.2 HEMATOLOGÍA En general, se observa que los ovinos CAP tienen el hematocrito más elevado que los ovinos CAN incluso sin estar parasitados, siendo estas diferencias significativas a los 7 dpi en el grupo control y a los 0 y 21 dpi en el grupo inoculado (Figura 4.1a. Nota: no se representan estas diferencias en el gráfico). Las pérdidas en hematocrito fueron en promedio superiores (7%) en la raza más susceptible que en la raza resistente (3.5%) a los 21 dpi, pero fueron muy similares a los 7 y 14 dpi. De hecho, la reducción sólo fue significativa en la raza CAN. Los hematocritos de los animales de las dos razas a los 21 dpi se asociaron negativamente, aunque no significativamente, con la carga parasitaria (CAP, r = -0.566; CAN, r = -0.683), pero no con la longitud (CAP, r = -0.096; CAN r = 0.259). CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 111 Las proteínas (figura 4.1b) también experimentaron un descenso, aunque no estadísticamente significativo, que fue más pronunciado en la raza CAN que en la CAP a lo largo de la infección y se correlacionaron negativamente con la carga parasitaria (CAP r=-0,749*; CAN r=-0,567) en vez de con la longitud. Los eosinófilos (figura 4.1c) experimentaron un pico a los 7 dpi en la raza CAN y a los 14 dpi en la raza CAP. Los ovinos CAN mantuvieron una eosinofilia ligeramente superior que la raza CAP, si bien las diferencias entre las razas no fueron significativas. Figura 4.1 Representación gráfica del hematocrito, proteínas plasmáticas (g/dl) y de los eosinófilos en sangre periférica (cel/l), en ambos grupos control e infectados (7 y 21 dpi) para ambas razas. 6 6,5 7 7,5 8 0dpi 7dpi 14dpi 21dpi Proteínas plasmáticas (g/dl) Control CAP Control CAN Infectado CAP Infectado CAN 23 28 33 38 43 0dpi 7dpi 14dpi 21dpi Hematocrito Control CAP Control CAN Infectado CAP Infectado CAN 0 200 400 600 800 1000 1200 0dpi 7dpi 14dpi 21dpi Eosinófilos en sangre (cell/l) Control CAP Control CAN Infectado CAP Infectado CAN CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 112 4.3 INMUNOGLOBULINAS (IgAm e IgGm) EN MUCUS No se observaron diferencias significativas entre razas en los niveles de IgA del mucus (IgAm) con ninguno de los antígenos (L3 y SA) analizados (Figuras 4.2a y 4.2c), aunque se detectaron mayores absorbancias cuando se antigenaron las placas con antígeno de L3 en el ovino CAN mientras que en la raza CAP, estas fueron superiores al antigenar con antígeno SA. Sin embargo, sí se observaron incrementos significativos dentro de razas para la IgA específica de ambos antígenos, concretamente entre los 0 y 21 dpi (IgAmL3: pCAP=0,008 pCAN=0,000; IgAmSA: pCAP= 0,000 pCAN=0,024) y también entre los 7 y 21 dpi (IgAmL3: pCAP y CAN=0,000; IgAmSA: pCAP y CAN= 0,000) en ambas razas (Figura 4.2a y 4.2c). Los ovinos de raza CAN produjeron significativamente más cantidad de IgG del mucus (IgGm) específica, tanto frente a antígenos L3 como SA, que los ovinos CAP a los 21 dpi (Figura 4.2b y 4.2d). Al igual que sucedió con la producción de IgAm, se incrementaron los niveles de ambas inmunoglobulinas dentro de raza a medida que progresaba la infección, observándose diferencias entre el día 0 y 21 dpi (IgGmL3 pCAP=0,003 pCAN=0,000; IgGmSA pCAP y CAN=0,000) y entre el 7 dpi y 21 dpi (IgGmL3 pCAP=0,001 pCAN=0,000; IgGmSA pCAP y CAN=0,000) (Figura 4.2b y 4.2d). Figura 4.2 Nivel de IgAm (a y c) e IgGm (b y d) específica frente a antígeno L3 (a y b) y SA (c y d). * Indica diferencias significativas entre razas p≤0,05, ** p≤0,01. A los 7 dpi, la IgGmSA se asoció negativamente con larvas intramurales obtenidas tras la digestión de la mucosa en los ovinos CAP, no observándose dicha asociación en los CAN (Tabla CAP CAN CAP CAN ** * CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 113 d) 4.3Figura 4.3c y 4.3d). Por el contrario, a los 21 dpi, IgAmSA e IgGmSA se asociaron negativamente con las variables longitud y huevos en útero sólo en los ovinos CAN (Tabla 4.3). Tabla 4.3 Coeficiente de correlación de Spearman entre niveles IgAm e IgGm (L3 y SA) y variables parasitológicas en CAP y CAN a los 7 y 21 dpi. HPG= huevos por gramo. * Indica p≤0,05, ** p≤0,01. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE SPEARMAN Carga Parasitaria Longitud Huevos en Útero HPG20 CAP CAN CAP CAN CAP CAN CAP CAN 21dpi IgAmL3 -0,214 0,429 0,048 -0,679 0,167 -0,571 . 0,454 IgAmSA -0,571 0,214 -0,238 -0,786* -0,167 -0,893** . 0,233 IgGmL3 -0,048 0,190 0,286 -0,679 0,548 -0,679 . 0,415 IgGmSA -0,190 -0,095 0,262 -0,821* 0,476 -0,786* . 0,073 Figura 4.3 Dispersión gráfica entre IgAmSA y longitud de los vermes a los 21 dpi (a y b) e IgGmSA con larvas Intramurales a 7 dpi (c y d) en CAP y CAN, respectivamente. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE SPEARMAN Carga Parasitaria Lavas Intramurales Larvas Luminales Longitud CAP CAN CAP CAN CAP CAN CAP CAN 7dpi IgAmL3 0,200 -0,300 -0,800 0,100 0,200 -0,400 0,700 -0,300 IgAmSA -0,500 -0.100 -0,100 0,000 -0,500 0,000 0,400 0,600 IgGmL3 0,400 -0,100 -0,600 0,300 0,400 -0,200 -0,100 0,500 IgGmSA -0,100 -0,300 -0,900* 0,500 -0,100 -0,500 0,600 0,300 CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 120 Tabla 4.6. Recuentos medios (media ± EEM) de las poblaciones celulares T+, T+/WC1+, CD2+, CD4+, CD8+, CD1+, CD5+, MHC-II+, CD45RA+, Eosinófilos, Galectina-14, Leucocitos Globulares y Galectina-11, de las muestras de tejido de abomaso obtenidas tras el sacrificio en ambos grupos. EEM: Error Estándar de la Media. Las diferencias significativas entre razas se representan con asteriscos, donde * indica p≤0,05 y ** p≤0,01. Mismo color indica diferencias significativas entre grupos dentro de razas para cada población celular. MEDIA POBLACIONES CELULARES ABOMASO + T/WC1+ CD5+ Grupo Raza Apical Basal Total Apical Basal Total Apical Basal Total Control CAP Media±EEM 41±9 17±4 58±9 11±2 7±1 18±3 29±5 17±10 46±15 CAN 44±15 14±3 58±13 14±1 7±1 21±2 29±15 20±6 49±19 7 dpi CAP Media±EEM 78±19 49±16 127±32 28±9 11±1 39±10 145±51* 69±13 213±58 CAN 70±13 41±10 111±23 22±9 15±6 36±12 63±15* 65±4 128±16 21 dpi CAP Media±EEM 52±13* 46±7 98±14* 14±3 16±4 30±7 115±18 83±19 197±35 CAN 93±8* 62±9 155±15* 15±2 12±4 25±7 85±22 49±14 132±33 CD4+ CD8+ CD2+ Grupo Raza Apical Basal Total Apical Basal Total Apical Basal Total Control CAP Media±EEM 7±5 1±0 9±4 130±32 57±16 187±40 3±1 1±1 4±0 CAN 4±1 3±1 7±1 163±43 69±17 231±59 8±6 7±5 15±11 7 dpi CAP Media±EEM 52±11** 57±8** 100±16** 132±26 87±24 219±50 36±14 23±15 59±15 CAN 13±4** 8±1** 21±4** 113±22 66±10 179±30 25±6 17±8 42±11 21 dpi CAP Media±EEM 24±6* 22*±5* 45±10* 245±49* 97±18** 343±66* 52±9 12±3* 64±10 CAN 9±2* 10*±1* 19±3* 145±36* 38±4** 183±39* 54±7 37±9* 91±13 Al analizar las correlaciones entre las poblaciones celulares y las cargas parasitarias a los 7 dpi, se pueden destacar las asociaciones negativas y significativas observadas en la raza CAN entre los linfocitos CD4+ (CAN, r = -0.9* ; CAP r = 0.359) y los linfocitos T/WC1+ apicales (CAN, r = -0.9*; CAP r=-0.1) y los recuentos intramurales de larvas, entre los CD2+ basales y los recuentos luminales de larvas (CAN, r = -1**; CAP, r = 0.3) y entre los CD1+ y la longitud, también en la raza susceptible (CAN, r = -1**; CAP r = -0.5). La única asociación negativa y significativa observada en esta fase de la infección por estadios inmaduros de H. contortus en la raza resistente CAP fue entre el MHC-II+ basales y las cargas parasitarias intramurales (CAN, r = -0.4; CAP, r = -1**). CD1+ MHC-II+ CD45RA+ Grupo Raza Apical Basal Total Apical Basal Total Apical Basal Total Control CAP Media±EEM 56±26* 56±22 111±47* 32±9 19±5 51±14 4±3 3±2 7±3 CAN 20±5* 29±9 49±14* 37±13 35±10 72±22 7±5 6±4 12±9 7 dpi CAP Media±EEM 28±9 34±7 61±14 91±35 60±19 151±50 17±7** 11±4* 28±10** CAN 12±3 27±5 38±4 62±16 49±15 111±28 4±1** 2±1* 6±2** 21 dpi CAP Media±EEM 23±5 30±6 54±9 47±3 32±2* 79±4* 6±1 4±1 9±2 CAN 46±7 41±5 87±11 78±13 72±13* 150±23* 6±1 4±1 10±2 Eosinófilos Galectina 14 Leucocitos Globulares Galectina 11 Grupo Raza Basal Apical Apical Basal Total Control CAP Media±EEM 3±1 1±0 12±7 4±2 16±9 3±2 0,75±0,25 CAN 12±10 3±1 7±1 4±3 10±3 3±0 0,80±0,20 7 dpi CAP Media±EEM 46±7* 2±1* 19±4 17±5 36±6 4±1 1,60±0,25 CAN 119±38* 5±2* 23±8 36±16 59±23 3±1 1,40±0,51 21 dpi CAP Media±EEM 93±9 4±1 16±4 29±10 45±12 4±1 1,25±0,25 CAN 70±18 4±0 19±4 46±27 62±29 5±2 1,38±0,26 CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Resultados CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 121 A los 21 dpi, destacan las asociaciones negativas observadas en la raza CAP entre los linfocitos T + (CAN, r = -0.323; CAP, r = -0.738*) y los eosinófilos, concretamente la población galectina14+ (CAN, r = -0.429; CAP, r = -0.766*) y los huevos en útero. Las células galectina-14+, también se asociaron negativamente con la longitud de los vermes (CAN, r = -0.029; CAP, r = -0.814*) y con la carga parasitaria (CAN, r = 0.19; CAP, r = -0.826*) en la raza resistente CAP. En esta raza, los linfocitos T CD4+ se correlacionaron de forma negativa con las cargas parasitarias (CAN, r = - 0.024; CAP, r = -0.929*). En la raza CAN, sólo los linfocitos T  WC1+ se asociaron negativamente con la longitud (CAN, r = -0.757*; CAP, r = -0.323). 4.6 ENSAYO DE MIGRACIÓN LARVARIA (LMIA) No se observaron diferencias entre razas en el número de larvas que atravesaron la membrana durante el ensayo (Figura 4.7), así como tampoco entre grupos dentro de raza. Figura 4.7 Representación en diagrama de barras del porcentaje de larvas, incubadas durante 24 horas con mucus del abomaso obtenido tras el sacrificio de los animales a los 0, 7 y 21 dpi, que atraviesan el filtro de la placa de ensayo. CAP CAN CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 122 4. DISCUSIÓN La resistencia frente a nematodos gastrointestinales se caracteriza por un bajo recuento de huevos en heces (HGH) asociado con una reducción de la longitud, carga parasitaria y huevos en útero en los vermes (Ractliffe y Lejambre, 1971; Stear y Bishop, 1999; Lacroux et al., 2006). En publicaciones previas de nuestro grupo (González et al., 2008; 2011a), se observó en ovinos de la raza CAP, en relación a los ovinos CAN, una reducción en la excreción de huevos y en el recuento y longitud de vermes a los 28 días tras la administración experimental de una única dosis de 20.000 L3 de H. contortus, considerando por ello a la CAP más resistente. Sin embargo, no se encontraron diferencias en los recuentos ni en la longitud de larvas a los 7 dpi (González et al., 2008; Hernández, 2011). Estos resultados sugieren que el control de los parásitos en esta raza se establece entre los 7-28 dpi; lo que contrasta con la bibliografía previa, que sostiene que los estadios larvarios de H. contortus son la diana principal de los mecanismos de resistencia en los tejidos (Balic et al., 2000a; 2002). Con el fin de delimitar el momento del ciclo del parásito en el hospedador en el que se establece este control en la raza CAP, se realizó este segundo ensayo con sacrificios a los 0, 7 y 21 dpi siguiendo el mismo protocolo de infección. De modo que, al igual que la experiencia previa, no hubo diferencias en parasitología entre razas a los 7 dpi, pero sí disminuyó la carga parasitaria en la raza CAP a los 21 dpi, sugiriendo que el control de esta variable parasitológica tiene lugar entre los 7 y 21 dpi, controlando esta raza la longitud y la fecundidad entre los 21 y 28 dpi. La bibliografía recoge la expulsión de los vermes adultos, cambios en la morfología y reducción de la fecundidad como mecanismos de resistencia frente al estadio adulto del parásito (Balic et al., 2000b). La expulsión de vermes adultos está descrita en H. contortus en rumiantes, sin embargo requiere de una determinada dosis de L3 e infecciones repetidas y generalmente está asociado a altos recuentos de leucocitos globulares en los tejidos, la creación por parte de las células efectoras de un microambiente con tóxicos y factores paralizantes que alteren la reproducción y motilidad de los parásitos, o por el daño que pudieran causar los eosinófilos en las larvas, considerándose, en cualquier caso, un efecto indirecto de la inmunidad adquirida generada frente las larvas (Balic et al., 2000b). Sin embargo, en esta experiencia no hubieron diferencias entre razas en el establecimiento larvario ni en su desarrollo (estimado por la longitud) pero si en el número de vermes adultos a los 21 dpi. Curiosamente, dentro de razas, la reducción en el número de vermes no es significativa a los 21 dpi, pero sí lo fue a 28 dpi en la raza CAP en una experiencia anterior (Hernández, 2011; datos no publicados). Todo esto corrobora que la raza CAP es capaz de regular las cargas de vermes adultos antes que el CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 123 establecimiento larvario y al tratarse de inoculaciones únicas esta protección parece estar vinculada a la inmunidad innata. Como se ha observado en otras razas resistentes (Mugambi et al., 1996; Bahirathan et al., 1996; Amarante et al., 2004; Vanimisetti et al., 2004b) la raza CAP presenta un mayor hematocrito que la CAN (Figura 4.1a) (González et al., 2008; Hernández, 2011), indicando mayor resiliencia a la infección por parásitos hematófagos, como H. contortus, lo que parece un mecanismo de adaptación fisiológica. El hematocrito y las proteínas plasmáticas se asociaron negativamente con la carga parasitaria y no con la longitud, lo que podría explicar que el control se establezca sobre la carga parasitaria en este periodo de la infección. Las pérdidas de sangre son significativamente mayores entre razas a los 21 dpi, por lo que si consideramos que las L4 son ya hematófagas, ratificaría que la diana en esta raza son los estadios adultos. La eosinofilia se asocia al desarrollo de inmunidad, por lo que, como era de esperar, los eosinófilos de sangre presentan recuentos superiores en los animales infectados que en los controles debidos a la parasitosis (Gill, 1991; Balic et al., 2000b). Los picos de eosinófilos observados en cada raza, a los 7 dpi en la raza CAN y a 14 dpi en la raza CAP, coinciden con los descritos en una experiencia anterior (Hernández, 2011), aunque en este trabajo la raza CAN presentó mayores recuentos de eosinófilos en sangre que la raza CAP. En todo caso, estas diferencias no fueron significativas en ninguno de los ensayos. La respuesta inmune humoral frente a H. contortus está vinculada a la IgA e IgG1 específicas (Gill et al., 2000, Schallig et al., 2000), dónde los incremento de estas inmunoglobulinas en las concentraciones en el suero y en el mucus se asocian con la resistencia a la haemonchosis (Gill et al., 1993a). Dado que este parásito habita la superficie de la mucosa del abomaso, verificar la respuesta local será más representativo que a nivel sistémico (Schallig, 2000), pues nos permitirá valorar el reconocimiento de los antígenos etapa-específicos del parásito, expresados durante ese momento de la infección (Bowles et al., 1995), si bien la IgA se absorbe y alcanza la circulación (de Cisneros et al., 2014). Aunque la IgG presenta mayor concentración en la sangre, su pequeño tamaño le permite penetrar en los tejidos inflamados para contactar con facilidad con los antígenos extraños (Tizard, 2002). Esta inmunoglobulina alcanza la mucosa del abomaso y entra en contacto con el parásito, por lo que los niveles de esta inmunoglobulina en el mucus podrían reflejar aún mejor su respuesta que en el plasma (Curtain y Anderson, 1971; Muñoz-Guzman et al., 2006). Aun así, la IgG sérica se ha asociado con reducciones en cargas parasitarias y huevos en heces en infecciones por H. contortus (Muñoz-Guzman et al., 2006). Aunque el mecanismo de protección CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 124 no está del todo claro, se ha observado que la IgG de sueros de cabras inmunizadas es capaz de unirse selectivamente a la cutícula, estoma y poro excretor de Trichostrongylus colubriformis in vitro, por lo que podría comprometer la alimentación de los parásitos (Bottjer et al., 1985). Uno de los antígenos a los que se une esta inmunoglobulina podría ser el denominado CarLa, pues tras la incubación de L3 de T. colubriformis con suero o mucus de animales inmunizados y su posterior inoculación en animales no inmunizados produjo reducción del establecimiento larvario, observándose la unión de la IgG en dicho antígeno; sin embargo este efecto no se reprodujo con L3 de H. contortus o T. circumcincta (Harrison et al., 2008), lo que evidencia la complejidad de las respuestas inmunes protectoras frente a los trichostrongilidos. Aunque en esta experiencia los ovinos CAP presentaron menores cargas parasitarias, los ovinos CAN produjeron más cantidad de IgG específica de antígenos L3 y SA a los 21 dpi en el mucus. La producción en los nódulos linfáticos de esta inmunoglobulina frente a los dos antígenos no varió entre razas. Este resultado parece descartar que esta inmunoglobulina sea la responsable del control de la carga parasitaria en esta raza y en estas inoculaciones únicas. Sin embargo, se observa una asociación negativa entre la IgGmSA y los recuentos de larvas intramurales en la raza CAP (Tabla 4.3) que podrían sugerir que cualitativamente, los animales de esta raza reconocen epítopos que se vinculan específicamente con la protección, aunque este aspecto no se pueda constatar en esta experiencia. Además, no se observa esta misma asociación con las larvas luminales. En las dos razas se observaron asociaciones negativas entre IgG específicas y longitud; en la raza de pelo a los 7 dpi al analizar la IgG específica de las L3 obtenida tras el cultivo de los nódulos linfáticos y, en la raza más susceptible la asociación negativa de la IgG no sólo con la longitud de los vermes, sino también con los huevos intrauterinos a los 21 dpi, estando en este caso implicada la IgG específica de vermes adultos del mucus. La presencia de receptores en superficie para las Igs en los eosinófilos favorecería su degranulación alrededor de las larvas en la mucosa gástrica causándoles alteraciones funcionales/morfológicas (Rainbird et al., 1998; Balic et al., 2000b; 2006) que explicarían la reducción en su número (CAP) o la asociación negativa de la longitud de los vermes. En el futuro, convendría analizar específicamente el isotipo IgG1 –vinculado a protección (Gill et al., 1993a)- además de la IgG total que hemos estudiado en este trabajo, con el fin de precisar más su papel en las respuestas protectoras de la raza CAP. El control de la longitud de los parásitos se ha asociado a la IgA del mucus específica de estadios larvarios, tanto en T. circumcincta (Smith et al., 1985; Stear et al., 1995) como en H. contortus (Strain y Stear, 2001), parásito en el que también se ha vinculado con reducciones en las cargas parasitarias tanto en razas resistentes (Santa Inés) como susceptibles (Ile de France) CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 125 (Amarante et al., 2005). Una mayor producción de IgA específica está asociada a resistencia a T. circumcincta (Strain et al., 2002). Al cuantificar tanto la IgA específica en mucus como la obtenida en los sobrenadantes del cultivo de los linfocitos procedentes de los nódulos linfáticos abomasales (L3 y SA) para ambas razas, no se observaron diferencias significativas entre razas a los 21 dpi, que si fueron evidentes -en un trabajo previo realizado por nuestro grupo de investigacióna los 28 dpi en la IgAmSA, cuando los vermes recogidos en la raza CAP eran más cortos (Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). Sin embargo, parece que la IgA específica de la raza CAN presenta mayor afinidad por el antígeno L3 y la IgA específica de la raza CAP por el antígeno SA (Figura 4.2 y 4.4), tal y como sucedió en el experimento anterior (Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). A los 7 dpi, la única asociación negativa significativa que se observó fue entre la IgA de antígeno SA obtenida de los sobrenadantes de los linfocitos de los nódulos linfáticos abomasales de la raza susceptible CAN y la carga parasitaria. Este dato es similar al descrito por Amarante et al., 2005 y sugiere que el establecimiento de la respuesta inmunitaria en la raza susceptible CAN es similar al descrito en otras razas ovinas frente al estadio L3. A los 21 dpi, la IgA específica SA, se asoció negativamente con las variables longitud y huevos en útero únicamente en la raza CAN. Es posible que en este momento de la infección, en la primera etapa de los vermes adultos, estas asociaciones se deban al efecto de una inmunidad dirigida frente al estadio parasitario L4 (Stear et al., 1995; 1999), probablemente por reconocimiento de antígenos compartidos entre ambos estadios parasitarios (Keith et al., 1990). Resulta muy interesante que en la raza resistente, a los 21 dpi, no se observaran asociaciones entre IgA específica SA –tanto del mucus como de los sobrenadantes de los cultivos de los linfocitos de nódulos linfáticos abomasalesy la longitud a diferencia de la fuerte asociación negativa encontrada a los 28 dpi en animales de esta misma raza sometidos a una inoculación experimental idéntica (Hernández, 2011; Hernández et al., 2015). Esto parece reflejar que el control de la longitud –hay diferencias significativas entre razas a los 28 dpi pero no a los 21 dpise establece con posterioridad al día 21 pi, y parece consolidar que el estadio adulto es la diana de la respuesta en la infección por H. contortus en la raza CAP. Las diferencias observadas en las asociaciones entre IgA de mucus específico de vermes adultos (somático y excretor secretor) y la longitud de los vermes a los 28 dpi en ambas razas (Hernández, 2011; Hernández et al., 2015), sugieren un patrón de reconocimiento antigénico diferente entre razas, especialmente interesante en la respuesta frente al antígeno SA, que no se había vinculado previamente con protección. Para comprobarlo, se realizó una CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 126 electroinmunotransferencia de antígeno SA de H. contortus, utilizando para ello los sobrenadantes obtenidos tras el cultivo de los linfocitos procedentes de los nódulos linfáticos en esta experiencia. La Figura 4.6 muestra un patrón de reconocimiento de proteínas antigénicas diferente entre razas; siendo los ovinos de la raza resistente CAP los que presentan un mayor número de bandas, tanto a los 7 como a los 21 dpi, reconociendo específicamente proteínas de entre 48 y 86kDa (Tabla 4.5), no reconocidas por los CAN o los controles, con la excepción de la proteína 68kDA que fue reconocida por el animal #CAN13, y las proteínas 52 y 54kDa, reconocidas por el control #CAP64. Bowles et al., 1995 obtuvieron sobrenadantes de nódulos linfáticos locales en animales inoculados y posteriormente desafiados, que reconocieron proteínas de 50 y 55 KDa del antígeno SA de H. contortus. Por tanto, los animales de raza CAP parecen reconocer más proteínas de antígeno SA que los ovinos CAN y que lo observado por otros autores en otras razas, lo que es consistente con los datos previos que sugerían que el estadio adulto es la diana en la respuesta protectora de esta raza y podría deberse en parte a una mayor capacidad de reconocimiento de epítopos por parte de los animales de esta raza. Además, los animales que han reconocido proteínas con pesos moleculares de 84 y 86kDa, albergaban los vermes más cortos a los 7 y 21 dpi. También, algunos de los animales que reconocieron esas dos bandas, presentaron una carga parasitaria menor. El reconocimiento de bandas a los 7 dpi en la raza resistente utilizando un antígeno somático de verme adulto, sugiere puedan haber epítopos compartidos entre estadios parasitarios (Keith et al., 1990), pudiendo ser proteínas altamente conservadas, lo que podría explicar su reconocimiento en una única inoculación. Estos resultados indican que no sólo es importante la cantidad de IgA específica, sino también reconocer las proteínas correctas para producir una respuesta inmunitaria adecuada, siendo relevante la variabilidad individual dentro de la raza (Zajac et al., 1990; Balic et al., 2000b). En este experimento, la variabilidad individual se refleja cuando en la estadística se observaban diferencias en longitud de los vermes entre razas cuando se descarta la covariable "animal". Zhou et al., 2005 han sugerido que variaciones genéticas en la IgA se podría asociar a protección/susceptibilidad. Otros autores han encontrado resultados similares dentro de rebaño en estudios de campo, aunque luego esta variabilidad genética explica poco las variaciones en los HGH, al menos en infecciones mixtas con Nematodirus spp. y nematodos del Orden Strongylida cuando el análisis se realiza entre rebaños (Lin et al., 2009). En infecciones por T. circumcincta es la variación en la cantidad de IgA específica producida, la que modula la longitud (Stear et al., 1995) y, por tanto, la fecundidad. Considerando estos resultados, algunas proteínas podrían ser útiles en la identificación precoz de animales resistentes dentro de un CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 127 rebaño, incluso en inoculaciones únicas, antes de que se establezcan diferencias cuantitativas en la producción de la IgA específica en infecciones por H. contortus. Es posible que las dos inmunoglobulinas, IgA e IgG, actúen conjuntamente, quizás mediante la neutralización o inactivación de enzimas metabólicas que comprometan el metabolismo, capacidad motora, crecimiento o reproducción de los vermes (Gill et al., 1993a) o por la formación de inmunocomplejos en el estoma (Bottjer et al., 1985). Balic et al., 2000a observaron que la respuesta inmune celular frente a la infección primaria –en la que no se genera protección en razas comercialescon H. contortus, está caracterizada durante el estadio larvario por el reclutamiento de eosinófilos, linfocitos CD4+ y T/WC1+ y células B, mientras que durante la infección con el estadio adulto se incrementa el número de mastocitos. En este estudio, dónde se analizaron varias poblaciones celulares (Tabla 4.6), antes de la inoculación sólo se observaron diferencias significativas en los recuentos entre razas en las células CD1+ (moléculas presentadoras de antígenos presente en células dendríticas), lo que podría indicar una mayor capacidad innata de la raza CAP a la hora de reconocer antígenos. Sin embargo, estas diferencias raciales desaparecen a medida que avanza la infección. En general, tras la inoculación las poblaciones celulares se incrementaron en ambos grupos. La raza CAP mostró un incremento de los linfocitos CD4+ y CD45RA+, incrementos observados en inoculaciones similares en ovinos CAP (Hernández, 2011) y en otras razas ovinas (Balic et al., 2000a; 2002). Los aumentos experimentados por estas poblaciones celulares a los 7 dpi en los ovinos CAN no fueron, sin embargo, significativos. No se disponía de anticuerpos que reconocieran la molécula de superficie CD25+ (marcador de activación de linfocitos T y B (Tizard, 2002; 2009), por lo que no se puede confirmar que estas células estuviesen activas. De hecho, no se correlacionaron negativamente con ninguna de las variables parasitológicas analizadas a los 7 dpi. El incremento observado en la población CD5+ de la mucosa del abomaso en la raza resistente probablemente refleja el incremento de la subpoblación CD4+ al presentarse esta molécula de diferenciación celular en esa subpoblación linfocitaria (Tizard, 2002; 2009). Curiosamente en la raza susceptible si se observaron asociaciones negativas entre los CD4+ y T/WC1+ apicales con las larvas intramurales y entre las células CD2+ basales con las larvas luminales. Si bien entre razas no se observaron diferencias para estas variables parasitológicas, está descrito el papel de los linfocitos CD4+ en la expresión de resistencia genética frente H. contortus, viéndose afectado el control de la carga y de huevos en heces al reducir esta población celular en animales en los que la respuesta protectora se orienta al estadio larvario L3 (Gill et al., 1993b). La posible participación activa de los linfocitos CD4+ en esta raza CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 128 susceptible podrían explicar la eosinofilia (Tabla 4.6). A los 7 dpi, CAP solo mostró asociación negativa entre MHC-II+ basales (molécula vinculada con la presentación de antígenos) y las cargas parasitarias intramurales, asociación que también observó Hernández, 2011, aunque en su caso no fue significativa (r=-0,5). Este dato puede ser interesante porque permite relacionar esa asociación con las interacciones observadas en el mismo momento de la infección entre la variable parasitológica larvas intramurales con la IgA y la IgG específicas del mucus. De hecho, la IgGmSA, la IgAmL3 y IgAmSA se asocian positiva y fuertemente con las células MHC-II+ (r=1**- dato no mostrado anteriormente), lo que podría sugerir que se produce una presentación de antígenos en el momento intramural del estadio larvario que va a condicionar posteriormente la carga parasitaria. A los 21 dpi también se observaron diferencias entre razas en los recuentos de las poblaciones celulares. En la raza CAN se incrementaron los T+, MHC-II y CD2+, sin embargo estas poblaciones no se correlacionaron negativamente con las distintas variables parasitológicas estudiadas. La raza CAP, por el contrario, mostró recuentos significativamente mayores que la raza susceptible de linfocitos CD4+ y CD8+, estando la población CD4+ asociada negativamente con la carga parasitaria, además en esta etapa se produjo un incremento significativo (dentro de raza) de los eosinófilos en abomaso, los cuales, a través del recuento de la galectina 14+ - proteína específica de eosinófilos, considerada marcador de actividad de los mismos (Young et al., 2009)- se asociaron negativamente con las variables carga parasitaria, longitud y huevos en útero. Los eosinófilos galectina 14+ basales y los linfocitos CD4+ apicales asociaron positivamente entre sí (r=0,898** -no publicado), lo que refuerza el papel de estas dos poblaciones en el control de la carga en una respuesta conjunta. La variable parasitológica huevos en útero también asoció negativamente con los linfocitos T+. Esta asociación entre la fecundidad y los linfocitos T y eosinófilos han sido descritas en esta raza (Hernández, 2011; González et al., 2011a). La galectina 14 puede promover la adhesión celular y cambiar las propiedades del mucus (Young y Meeusen, 2004; Young et al., 2009), lo que facilitaría la eliminación de los vermes, estando implicadas en las respuestas inmunitarias innata y adaptativa (Young y Meeusen, 2004) frente H. contortus. Están descritas asociación negativas de esta lectina con carga parasitaria a los 2 dpi en ovejas de razas susceptibles tras inoculaciones seriadas y desafío con H. contortus, si bien su papel no está aún del todo claro (Robinson et al., 2011). Las asociaciones observadas entre las poblaciones celulares y las dos razas, sugieren una vez más que la CAN orienta sus respuestas en etapas más tempranas de la infección, mientras que la raza resistente la dirige frente a estadios preadultos-adultos (González et al., 2008) en animales primoinfectados mediante un mecanismo inmune único no descrito en la bibliografía, CAPÍTULO I. Diferencias en susceptibilidad en infecciones naturales Discusión CAPÍTULO II. Control de la carga de vermes antes que la longitud 129 pues los leucocitos globulares, población celular que no presentó incrementos ni asociación con los resultados parasitológicos en este experimento ni en estudios previos de nuestro grupo (Hernández, 2011), han sido vinculados con la expulsión rápida de los vermes en animales inmunizados (Balic et al.,2000b; Balic et al., 2002). Igualmente importante resulta la cinética de los eosinófilos en el abomaso, pues estos aumentan en la mucosa del abomaso a los 7 dpi en la raza susceptible para posteriormente disminuir, ajustándose a lo descrito en la bibliografía (Balic et al., 2000b), mientras que en la raza resistente su número se incrementa hasta los 21 dpi y se mantienen constantes a los 28 dpi (González et al., 2011a; Hernández, 2011) acorde a la diana parasitológica propuesta para cada raza. Aunque se ha vinculado a estas células con la expulsión larvaria en ovejas sensibilizadas (Balic et al., 2002), los resultados de este estudio sugieren que en la raza CAP también serían importantes en inoculaciones simples. Es conocido el efecto del mucus en los mecanismos de expulsión de los nematodos gastrointestinales (Balic et al., 2000b). Con el fin de determinar su efecto en este modelo se realizó el ensayo de inhibición de la migración larvaria del mucus. Sin embargo, ni a los 7 ni a los 21 dpi se observaron diferencias entre razas. No obstante, la tendencia fue diferente entre razas, con mayor inhibición de migración larvaria a los 7 dpi en la raza CAN y mayor inhibición a los 21 dpi en la raza CAP, lo que parece coherente con su estadio parasitario diana, tal y como se ha sugerido hasta ahora. El porcentaje de larvas con motilidad inhibida en la raza CAN a los 7 dpi fue del 48%, frente al 22% de CAP; a 21 días la inhibición en CAP fue del 44% y en CAN del 37%. En un ensayo anterior (González et al., 2011b) sí se observaron diferencias entre razas en la inhibición larvaria por parte del mucus a los 28 dpi, por lo que quizás la modificación del ambiente del abomaso podría ser responsable de protección en la raza CAP. Es posible que estos cambios dificulten, no solo la permanencia del verme en el abomaso, sino también la reproducción y el desarrollo, consiguiendo, que las cargas en la raza CAP sean más bajas y los vermes menos largos y fecundos (Balic et al., 2000b; González et al 2008; Hernández, 2011). Un mecanismo que se ha descrito involucra a la galectina-11, producida específicamente por las células epiteliales, que es capaz de unirse específicamente a la región faríngea de las L4 de H. contortus, comprometiendo probablemente, su alimentación y desarrollo (Preston, 2013; González et al., 2015). En conclusión, la raza CAP es capaz de controlar la carga parasitaria entre los días 7 y 21 pi, mientras que la longitud y fecundidad de los vermes entre los 21 y 28 dpi tras una única inoculación de 20.000 L3 de H. contortus, lo que sugiere que en este mecanismo de resistencia Bibliografía 232 Smith W.D., Jackson F., Jackson E., Williams J. 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Son muchas las personas que de un modo u otro me han ayudado o apoyado durante el desarrollo de mi tesis doctoral así que espero no olvidarme de nadie. Durante estos años no solo crecí profesionalmente, sino también crecí en lo personal; aquí tengo que agradecerle a mi director Dr. Jorge Francisco González Pérez el tiempo que me ha dedicado, los consejos y palabras de apoyo cuando la situación se torcía o el reconocimientos cuando las cosas salían bien. Gracias por ayudarme y escucharme siempre que te necesité, gracias por confiar en mí. A mis codirectores, el Dr. Jose Manuel Molina Caballero y el Dr. Francisco Rodríguez Guisado quiero agradecerles el conocimiento que me aportaron y la ayuda prestada cuando requerí de su experiencia, gracias. Agradecer a las “chicas del laboratorio”, que si bien parece un título de película, realmente podría serlo con todas las vivencias que tuvimos entre esas cuatro paredes y fuera de ellas, muchas gracias por todo Adassa, Arantzazu, Davinia, Jessica, Leire, Lorena, Soraya y Yaiza. Y como era de esperar, no puede haber chicas, sin “chicos del laboratorio”, Aridany, Alejandro, Álvaro, Fernando, Sergio y Yeray, quienes además de darme apoyo “logístico” cuando hacía falta, siempre tenían un chiste para amenizar la mañana, gracias por todo. También tengo que agradecer a Sara, Carlos y Roberto por la ayuda prestada. A Lita, María, Marisol y Tata que con su cariño y preocupación hacían que en los pasillos me sintiera como en casa. Bernardo, Juan, Luis, Santiago, Serafín y Ventura que siempre me ayudaron en todo lo que estuvo en sus manos cuando los necesité con los animales. Carmelo, Carmen, Loli y Luisa que con solo una llamada me daban soluciones a cualquier cosa que necesitara de las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. A Pedro Castro, Esther y Estrella por prepararme disoluciones, realizarme los pedidos y un sinfín de cosas con las que me ayudaron, gracias.