Un nuevo glicofosfolípido está presente en la membrana de la célula granulosaovárica y es hidrolizado por hCG y prolactina

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE MEDICINA UN NUEVO GLICOFOSFOLIPIDO ESTA PRESENTE EN LA MEMBRANA DE LA CÉLULA GRANULOSA OVÁRICA Y ES HIDROLIZADO POR HCG Y PROLACTINA MARÍA ISABEL MARRERO ARENCIBIA Las Palmas de Gran Canaria, 1990 TESIS DOCTORAL FACULTAD DE MEDICINA UN NUEVO GLKCOFOSFOLIPIDO ESTA PRESENTE EN LA MEMBRANA DE LA CELULA GRANULOSA OVARICA Y ES HIDROLIZADO POR hCG Y PROLACTINA M= Isabel Marrero Arencibia 1990 Dña LUISA FERNANDA FANJUL RODRIGUEZ, Profesora Titular de Fisiología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, y Dn CARLOS MANUEL RUIZ DE GALARRETA, Profesor Titular de Bioquimica de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, CERTIFICAN: Que Dña ISABEL MARRERO ARENCIBIA, Profesora Asociada de Fisiología de la Universidad de Las Palmas y alumna de Tercer Ciclo de la Universidad de Las Pal ;mas,, ha realizado bajo nuestra dirección la presente Tesis Doctoral, titulada: "UN NUEVO GLICOFOSFOLIPIDO ESTA PRESENTE EN LA MEMBRANA DE LA CELULA doce concluida, autorizamos su presentacibn a fin de que sea juzgada por el tribunal correspondiente. Las Palmas de G.C., Junio 1990 Fdo: Prof C.M. RuiJ de Galarreta AGRADECIMIENTOS: A la Dra. Luisa Fernanda Fanjul Rodríguez y el Dr. Carlos Manuel Ruiz de Galarreta Hernández, directores de este trabajo, por su apoyo y estimulo constantes. fii Ti--o.IesüiAnsüciadu U. Aiitüiiiu 3. Déiiiz Cáceres, por su cooperación ciéntiiica y técnica, al Sr. D. Antonio Déniz Cáceres, por su permanente comprensión y aliento, a Antonio por su enorme calidad humana. A mis compañeros del Departamento de Endocrinología Celular y Molecular, Lourdes, Juan, Pepe y José por su colaboración desinteresada; así como a Carlos, Angel, Tony, Sarmiento y Pilar. A los que fueron miembros de otros departamentos del CULP y a los que a6n lo son, por la ayuda que siempre estuvieron dispuestos a dar. A Rajan, un gran amigo. Al Profesor Asociado D. Manuel Quintana, de la Escuela de Empresariales, por la colaboración prestada en la impresión de esta Tesis. A todos aquellos que de una u otra forma han hecho posible la realización de este trabajo, tanto por su aportación cientifica como por la humana. A Paqui e Isabel A Pedro, Juan Domingo y Orlando, snn mi fsmili-., y hacen qm todo sea posible INDICE PROLOGO 1.- INTRODUCCION 1. Cómo se diferencia la célula granulosa ovárica 11. Hormonas y agonistas hormonales que diferencian la célula granulosa ovárica 111. Transmisión de la señal hormonal IV. Los Fosfatidilinositol glicanos en la transmisibn de la señal hormonal 2.- OBJETIVOS 3.- MATERIAL Y METODOS 1. Materiales utilizados 2. Obtencih y cultivo de las células granulosa 3. Marcaje, extracción, separación y caracterización del Fosfatidilinositol glicano 4, Determinación de la concentración de proteinas 5. Ensayo de la actividad del enzima 3p-Hidroxiesteroide deshidragenasa A~A~ isornerasa 6. Tratamiento estadístico 4.- RESULTADOS 1. Observaciones morfológicas con el microscopio de contraste de fases 2. Identificación de los componentes de la cabeza polar del Fosf atidilinositol glicano 3. Identificación parcial de la cabeza polar del Fosfatidilinosito1 glicano 4, Identificación parcial de los componentes y estructura del esqueleto del fosfatidilinositol glicano 5. Efecto de las diferentes hormonas reguladoras de la diferenciación de la célula granulosa en el contenido y recambio del PI-glicano 7 1 6. Efecto del f osf ooligosacárido sobre la actividad del enzima 4 5 3p-Hidroxiesteroide-deshidrogenasa A -A isomerasa 75 5.- DISCUSION 6.- CONCLUSIONES 7.- BZBLIOGRAFIA ABREVIATURAS: AA AC ACTH ADN ADP 5' AMP AMPc = AMP-cíclico [AMPcIi AMPc = dB AMPc ATP BrAMPc CSCC P450= SCC P450 ctx DAG DES DPI E2 EGF Fk FSiI G AB A Ga GDP GH Glc GlcNAc GnRH GTP hCG: LH/hCG HDL HMG-COA reductasa H-R 20a-HSD Acido araquidónico Adenilil ciclasa Hormona corticotropa Acido desoxirribonucleico 5' Adenosina dif osf ato 5' Adenosina monof osf ato 3' ,5' Adenosina monof osf ato cíclico Concentración intracelular de AMPc Dibutiril AMPc Adenosina trif osf ato 8-Bromo-AMPc Ion calcio Enzima desramificante del colesterol citocromo P450 Coleratoxina, toxina del Vibrio cholerae Diacilglicerol Dietilestilbestrol Fosf atidilinositol, 4 fosfato Estradiol Factor de crecimiento epidérmico Forskolln Hormuna füiicuiü estiriiüiaiite Acido 7 aminobutirico D-Galactosa Guanosina difosfato Hormona de crecimiento Glucosa N-Acetil-D-glucosarnina Hormona liberadora de gonadotropinas Guanosina trifosf ato Hormona gonadotropina coribgena humana Lipoproteina de alta densidad Enzima 3 hidroxi-3 metil glutaril coenzima A Reductasa Complejo hormona-receptor Enzima 2Oa-Hidroxiesteroide deshidrogenasa IGFs IGF-I= Srn C IP3 LDL LH; LH/hCG Mix NGF OMI PDGF ?E PG PKA PKC PLAZ PLC PLC-PI PLD POS PRL Pro 2Oa-OH-Pro P S SER TC A TGFP TGFa tPA TPA TPI 5 4 Enzima 3/+Hidroxiesteroide deshidrogenasa f A -A Isomerasa [E.C. l.l.l.51) Factores de crecimiento similares a la insulina Factor de crecimiento similar a la insulina-1 o Somatomedina C Inositol 1, 4, 5 trifosfato Lipoproteína de baja densidad Hormona luteinizante 3-metil-isobutil-xantina Factor de crecimienta neurogénico Inhibidar de la madusacián del oocito Acido f osf atidico Fosf atidilcolina Factor de crecimiento plaquetario CncfatiAilaf snnbamina ".,A -"&v.*" *..--..*-..... Prostaglaadina Fosf atidilinositol Fosf atidilinositol glicano Proteina quinasa A Proteína quinasa C Fosfolipasa A 2 Fosf olipasa C Fosf olipasa C especifica para fosf atidilinositol Fosf olipasa D Fosfooligosacárido, cabeza polar del fosf atidilinosito1 glicano Prolactina Progesterona ZOa-hidrox-preg-4-en-3-ona, 20a-hidroxipr-ogeste~~una Fosf atidilserina Sistema retículo endoplásmico Acido tricloroacético Transforming growth factor 13 Transf orming growth factor a Activador del plasminógeno tisular 12-0-Tetradecanoil-f orboi-13 acetato Fosf atidilinositol-4, 5-bif osf ato INTRODUCCION 7 En el FOLICULO SECUNDARIO se inicia la formación del fluido folicular, cuya acumulación da lugar a la aparición de la cavidad antral (4,241, El antro es e! signo mnrfnlbgirn &fini'nrin de esta f~_c~ fnlir~~lar~ & 5rrerimien'n progresivo depende, casi exclusivamente, el aumento del diámetro del folículo secundario, desde aproximadamente 200 p a 2 cm (4)) dependiendo de las especies. En las células granulosa tiene lugar la sintesis y secreción de los mucopolisacáridos (4,28), síntesis y secreci6n que constituye el primer paso en la fnrmari6n de! fluido folici.ilar. El f!iiido fnliciilar contiene además !a maynria de las proteinas plasmáticas en concentraciones similares a las de la circulación periferica (4), con la excepción de las gonadotropinas hipofisarias cuyas concentraciones son cuidadosamente controladas. También están presentes en el fluido folicular concentraciones inusitadamente altas de esteroides sexuales (29). Las cifras de progesterona y estradiol, al igual que las de las hormonas proteicas, sufren variaciones durante el desarrollo del folículo (30); están muy eievaáas en ei foiícuio secundario como consecuencia de ia inducción de los enzimas encargados de la sintesis de progesterona (24) y de las aromatasas (31), que ocurre en este estadio del desarrollo folicular. Estos hechos se traducen a nivel subcelular en un aumento del contenido en retículo endoplásmico (representativo del incremento de 3B-HSD en ese orgánulo, que cataliza la conversibn de pregnenolona a progesterona) y en la presencia de rnitocondrias con crestas tubulares (reflejo de la sintesis elevada del complejo enzimático que convierte el colesterol a pregnenolona), características ambas de células secretoras de esteroides (28). INTRODUCCION 8 Si la aparición del antro define al folículo secundario morf ológicamente, la aparicibn de receptores para LH (32,331 cuyo número aumenta en forma gradual a medida que avanza el desarrollo del folículo secundario, alcanzando el máximo en el foliculo preovulatorio (hasta 40 veces el valor inicial) (24) constituye la característica funcional definitoria de la célula granulosa en esta fase de la foliculogénesis. Asimismo aparecen, también por primera vez, otros receptores de membrana a la prolactina (34,351 y a prostaglandinas [PGE2 (361 y PGFZa (3711 (4). Las células granulosa del FOLICULO TERCIARIO se caracterizan por la existencia de cambios exclusivamente cuantitativos, aumentando los receptores a LH (34) y EGF (381, y disminuyen los receptores /3-adrenérgicos (20). El proceso de diferenciación celular no se detiene aquf y, tras el pico de secreción hipofisaria de gonadotropinas y la ovulación, las células granulosa pasan a ser cklulas luteinizadas o, simplemente, células luteales, variando su capacidad de respuesta a los estímulos hormonales y su producción esternidea !241.19!. Presentan variaciones cuantitativas en algunos de sus receptores con respecto a las células del folículo terciario: tienen un mayor número de receptores a PRL (341, EGF (38), lipoproteinas (191,~ menor número de receptores a FSH (40,24) y LH (24,34) así como disminución, a la mitad del número de receptores, al GnRH (41). INTRODUCCION 9 11.- HORMONAS Y AGONISTAS HORMONALES QUE DIFERENCIAN LA CELULA GRANULOSA OVARICA La FSH y la LH, las dos hormonas gonadotropas hipofisarias, son las principales protagonistas de la diferenciación terminal de la celula granulosa. Entre las dos se reparten el peso de la regulación de un proceso en el que serán auxiliadas, no obstante, por un inacabable y variado número de agonistas. LA HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH) El primer control endocrino de la célula granulosa durante la foliculogénesis lo realiza la FSH, que además mantendrá la dirección del proceso diferenciador hasta sus últimas fases. Los primeros receptores de FSH aparecen en el folículo primario (7). Tras la ocupación del receptor por la hormona se inicia un proceso de profundas transformaciones mosf ológicas que reflejan la aparición de cambios funcionales igualmente importantes. . , LGS ¿alilbiüs iii~i-f~!bg;~u~ =&Y r~!svaiites hzhyen !a t+ar;sformao:c;n de? epitelio plano y liso en epitelio cuboidal con abundantes prolongaciones citoplasmáticas (42). Las células proliferan y sucesivas capas de cdulas granulosa, entre las que se establecen numerosas uniones gap y de membrana, se superponen a la capa única existente en el folículo primordial, rodeando totalmente al oocito (4,43). La estructura y ultraestructura de la cdlula granulosa también se modifican (43). El citoesqueleto se altera, disminuyendo los haces de microfilamentos (44), y se visualizan cambios en el citoplasma compatibles con los de una c6lula con intensa actividad esteroidogénica. INTRODUCCION 1 O Cuando se mantienen en cultivo primario células granulosa indiferenciadas, cuya proliferación se ha inducido con estrógenos en medios suplementados con FSH, pueden observarse cambios muy similares a los que ocurren en el foliculo tras el tratamiento con FSH. Las células se hacen esféricas y se agregan y aumentan, al igual que "in vivo'" los puentes intercelulares (43). La función diferenciada más importante de las celulas granulosa es la de producir estrógenos, fundamentalmente estradiol, y progesterona. Las células granulosa son la principal fuente de estos esteroides durante el desarrollo f al icular y; todas las transformaciones morf ológicas relatadas; podrían pasiblemente relacionarse con los cambios en la función de las células que induce la FSH. Dos caracteristicas rnorfofuncionales de la célula granulosa son especialmente importantes para comprender la cronologia de su proceso de diferenciación y cbmo la FSH participa en este proceso: al el, carácter avascular de la célula granulosa (61, que impide el abastecimiento de colesterol desde la sangre y hace obligada su obtención a través de la sintesis "de novo" y/o su captación del almacenado en la teca interna; b) la ausencia en la bateria enzimática esteroidogenética, de la que está dotada la célula granulosa, del enzima C21-SCC P450 (17 ahidroxilasa, 17-20 aliasal (45) (Gráfica 1). Los dos estrógenos producidos por la célula granulosa, el estradiol y la estrona, empiezan a secretarse en grandes cantidades muy rápidamente después de que las cifras de FSH circulante se eleven o se administre FSH a células en cultivo (2). En ambos casos, el cambio bioquimico más importante que puede medirse en la célula es un aumento en la actividad de los enzimas que transfor- GRAFICA 1 INTRODUCCION 11 man androstendiona y testosterona en estrona y estradiol (46). La inducción temprana de las aromatasas por la FSH podría ser fundamental para el destino de ..- uu P A OULU~V l.'-.. cuiicieto. Lus estrbgeiios prudüzidos como cuiisze~cneia de fa ac tivación de las aromatasas, amplifican casi todos los efectos biológicos de la FSH y, sólo en aquellos folículos que adquieren tempranamente tal posibilidad de amplificación, la diferenciación de las células granulosa contenidas en su interior se completaría con éxito (47,481; los demás, sufrirían atresia. La androstendiona y la testosterona no son sintetizadas por la célula granulosa que, como ya se ha relatado, no posee C21-SCC P450 y es incapaz por tanto, de metabolizar la pregnenolona y la progesterona para producir andrógenos. Estos, son producidos en las células de la teca interna (49). y se acumulan en el folículo y la célula granulosa por un mecanismo aún desconocido. La transformación del colesterol en pregnenolona y de esta en progesterona tiene lugar cuando actiian dos enzimas limitantes, uno mitocondrial, el enzima desramificante del colesterol P-450 (CSCC-P 450), que paca el colesterol a pregnenolona, y otro microsomal, la 3P-hidroxiesteroide deshidrogenasa/A 5-4 Isomerasa (38 HSD), que transforma la pregnenolona en progesterona. Ambas reacciones enzimáticas irreversibles son reguladas por la FSH (46,501. El segundo esteroide producido en grandes cantidades por la célula granulosa. la progesterona (Pro), empieza a sintetizarse más tardíamente que los estrógenos, también como consecuencia de la activacibn de la HMG-COA reductasa, la CSCC-P 450 (521, y la 3P-HSD (50), que la FSH induce en la célula granulosa. La progesterona así producida, puede ser metabolizada en la célula granulosa por la 20a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (20u HSD) a 20a-hidrox-preg-4-en-3-ona (2Oa-OH-Pro), metaboIito inactivo de la progesterona. La FSH previene esta inactivación, inhibiendo la actividad de la 20a HSD (531. INTRODUCCION 12 Además del aumento en la síntesis de esteroides, el otro gran cambio funcional que caracteriza la diferenciación de la célula granulosa es la aparidAn y/= e! u~mentc Ve recept~res kcrii.mu!es. La FSH aumenta el niimero y afinidad de sus propios receptores casi desde su primer contacto con la célula granulosa (33,54). Aumenta tambidn el número de receptores a los estrógenos (23) que a su vez favorecen la captación ovárica de FSH (48), iniciándose con este efecto y el que tiene sobre la síntesis de estrógenos, una cascada amplificadora de la señal, que terminará con la lu- +-:-:---:ALULIIIL.UYI.VII de la cé!U!z gruE~!~~a. P~rg qu= &I,= pri&zcu, iA~-p~~sC~n~ii ble un iíltimo acontecimiento: la aparición de receptores a LWhCG (32,34,55), que tiene lugar, inducida por la FSH y amplificada por el Es (33,551, en el folículo secundario o a las 24 horas de la adición de la hormona a las células mantenidas en cultivo. La FSH también induce la síntesis de receptores a una amplia gama de agonistas hormonales que modulan sus propios efectos en la célula granulosa. Entre ellos los receptores a esteroides (andrógenos y progestágenos) (231, a factnren de ~reci~iento CGKX e! SmC./IGF-I ('21, e! TCFR (1!5), e! FGF (561 y la insulina; a otras hormonas hipofisarias como la prolactina (PRL) (351, y rnantiene los de péptidos similares a los hipotalámicos como el GnRH (57) (Gráfica 2). La FSH regula además el metabolismo hidrocarbonado, aumentando la captación de glucosa y la formacidn de lactato (581, así como la actividad de la glucógeno fosforilasa (19). Aumenta el transporte de aminoácidos y la sintesis proteica, en general y de algunas proteinas específicas como la inhibina (591, que regula junto con los esteroides la secreción hipofisaria de de FSH (601, o el activador del plasminógeno tisular (tPA) (61) variedad del plasminógeno con actividad colagenasa, que disminuye la viscosidad del líquido folicular y produce lisis de la pared del foliculo durante la ovulación (62). LA HORMONA LUTEINIZANTE (LH) La LH es la hormona responsable de la diferenciacibn terminal o luteinización de la célula granulosa. Su papel como hormona reguladora de este proceso está necesariamente subordinado al hecho que la célula granulosa indiferenciada no posee receptores para esta gonadotropina. Como ha sido ya puesto de manifiesto, los receptores a la LH y a su an6logo de origen placentario la hCG (hormona gonadotropina coriógena), se adquieren tarde en el proceso de diferenciacibn folicular (241, constituyen uno de los cambios funcionales que marcan la existencia' de una diferenciación en la célula granulosa y, son inducidos por la FSH (551, y multiplicados por 10s estrógenos (63). Asi pues, una c6lula granulosa, y un folfculo por tanto, sobre la que la LH actúa, es ya una célula granulosa y un folfculo con una cierta predestinacibn a la luteinizacibn y a la ovulación. Luteinización y ovulación que no tendrán lugar sin embargo, si la LH no actúa sobre el folfculo y las células granulosa contenidas en su interior. Bajo 10s efectos de la LH, las células granulosa sufren grandes cambios morfol6gicos, en algunos aspectos sólo cuantitativos con respecto a los indu- INTRODUCCION 14 cidos por la FSH, como son la pérdida definitiva de la apariencia fibroblástica (si la célula está siendo mantenida en cultivo), la formación de microvilli y una profunda reorganizacidn aei citoesqueieto ib41. En otros aspectos, los cambios son también cualitativos, y reflejan no s610 los cambios funcionales que están sucediendo en la célula, sino que ocasionalmente constituyen la señal para el inicio de alguno de dichos cambios. Las mitocondrias cambian la estructura de sus crestas a lameliforme-viliforme, y se agregan junto con los lisosomas en la región perinuclear (6,641, para faciii~ar así ei movimiento de ias grandes cantidades de es~eroicies que están siendo sintetizados por la c8lula. La proximidad entre las membranas de las distintas organelas implicadas en la sintesis, permite la formacibn de complejos enzimáticos asociados a las membranas, y una mayor movilidad de los sustratos que, por su carácter apolar, son dificilmente solubles en el medio acuoso que constituye el citoplasma celular. Un retículo endoplásmico con un desarrollo máximo y la aparición de una gran cantidad de inclusiones lipidicas son otros de los cambios morfológicos inducidos por ia ¿n, que refiejari cambios cuaiititaiivus eri ia Fuiioibii. La LH induce, por el contrario, una disminución de las uniones gap (651, lo cual permite una disgregación de las células granulosa y posibilitará la liberación del complejo cúmulo-oocitario en el momento de la ovulación (66). La desaparición progresiva de las uniones constituye además, la sefial para la reanudación de la meiosis del oocito (67,681. Además de los cambios morfológicos relatados (31, la LH posee efectos igualmente importantes sobre la función de la célula granulosa. Estimula la INTRODUCCION 20 El tratamiento combinado con insulina y FSH incrementa marcadamente la formación de uniones gap y microvilli (3) y aumenta el desarrollo del SER y cnmpl-jn de Gnlgi resperitn del prodiicidn pnr cada hnrmona por separado; Además el tratamiento combinado, produce mitocondrias mayores con crestas tubulares (3). Congruentemente con las modificaciones morfolbgicas, el tratamiento conjunto aumenta de modo significativo la secreción de progesterona (93) y estrógenos (estimula la actividad aromatasa) (94) y la formación de receptor LH (95). P'iaqtn qiia la insiilina puede unirse a los receptores a IGF-1 (de estructura similar al de la insulina) no está claro si la transformación morfolbgica inducida por la insulina está mediada por sus propios receptores o por los de IGF-1. Aunque los IGFs pueden reaccionar en forma cruzada, entre si y con la insulina en estudios de receptor de superficie, los IGFs básicos y neutros se unen preferentemente a receptores tipo 1 y 11 respectivamente (12). Por otra parte, los niveles de insulina en el liquido folicular tienden a ser menores que los de IGF-1 v, generalmente. son demasiado ba.ios para activar el receptor de alta afinidad de insulina; además, los efectos de la insulina descritos, tienen iugar a concentraciones J~M, muy superiores a ias fisioiógicas iriivi] y su efecto máximo no es aditivo con el del IGF-1, sugiriendo que insulina e IGF-1 utilizan una via común y saturable y la posibilidad de que los IGFs, más que la insulina, puedan ser los fisiológicamente relevantes en la regulación de la función ovárica (96). La SmCAGF-1 produce, a concentraciones nanornolares, una respuesta mitogénica y diferenciadora (89) potente en células granulosa de foficulos pequeiios cultivadas en medio libre de suero, estimula ligeramente la síntesis de INTRODUCCION 21 pregnenolona, progesterona (97) y SO OH-Pro (aumenta la utilización de HDL y LDL) y no modifica la actividad aromatasa. Su papel mitogénico es particularmente atrzctiv~, piestn que puede teneruna gran impnrtan~ia en e! rrirlmknto folicular autocrino (independiente de gonadotropinas) durante el período inf antil. En presencia de FSH aumenta la producción de progesterona (estimula P450 SCC y 3p-HSD)y 20 OH-Pro (96), y estrógenos (potencia la inducción de la actividad aromatasa) (98) producidos por la FSH (12) (mimetiza a la insulina, aunque su efecto es mayor). al aumentar las actividades de los enzimas biosintbticos de esteroides, de forma independiente a sus efectos promotores del crecimiento (96). De manera similar, el IGF-1 sinergiza con 178 estradiol elevando la síntesis de progesterona y pregnenolona (99). En la célula granulosa se produce también el efecto clásico del IGF-1 como factor de sulfatación. El IGF-1 aumenta la producción y secreción de proteoglicanos sulfatados en células tratadas o no con FSH (100.101). También aumenta la producción de inhibina, tanto solo como en presencia de FSH (102). - - r inaimenxe, IfF-1 sinergiza con FSE en ia inducción de recepiores ¿'i en forma tiempo y dosis dependiente (103). El potencial sinergístico de IGF-1 no se limita a la FSH; también aumenta la acumulación de progesterona y AMPc estimulada por hCG y P2 adrenérgicos, pero no la producida por PRL (12). Esto sugiere que el papel del IGF 1 no está limitado a la maduración folicular inicial, sino que modula también a los agentes luteotrópicos y P adrenérgicos implicados en la iniciación y mantenimiento del cuerpo liliteo (96). INTRODUCCION 22 Se ha demostrado la producción local de los IGFs en las células granulosa (1041, que aumenta tras estimulación con gonadotropinas (1051, EGF (1061, esunión específicos (a través de los cuales ejercen su acción) (961, cuyo número aumenta en respuesta a la FSH (100), LH, 6-adrenérgicos (96), y agonistas para la generación de AMPc (121, pero no a PRL (96); este efecto de la FSH puede ser amplificado por la GH [100), e inhibido por el GnRH (100). Se precisa de la presencia de la FSH para el mantenimiento de los receptores inducidos; alternativamente la LH puede hacerlo, pero con una eficacia menor, mientras que !u prdactii,~ time escase c ride rfeutu (IGQ!, EL PDGF Y EL TGFR El factor de crecimiento plaquetario (PDGF) es almacenado en los gránulos alfa de las plaquetas, se libera durante la formación del coágulo y puede estar implicado en procesos de reparación celular (108). Posee dos componentes con actividades diferentes; el P60-PDGF principalmente mitogénico, y el TGFB, gint&iz=& +gmhi& pcr 129 &!ij!gr grzqi~lngag y ~PC&-, 111~ tiene ~&fvi&d mitogénica y diferenciadora (incrementando la accibn de la FSH). Actúa en los estadios tempranos del desarrollo y, probablemente, en la diferenciación terminal de las células granulosa durante la fase de Corpus hemorrhagicum en el que está aumentada su concentración (108). El TGFP potencia la diferenciación inducida por la FSH, y aumenta la actividad aromatasa FSH-estimulada (109). Favorece la unión de LH a la célula granulosa, aumenta el número de receptores a LH (1101, dependiendo de la concentración de FSH presente (lll),e inhibe la acción mitogénica del EGF (112). INTRODUCCION 23 EL GnRH Como es suficientemente conocido, e1 GnRH es un decapéptido producido en el hipotálamo y vertido, a través del sistema porta, a la hipófisis anterior en la que regula la síntesis y secreción de gonadotropinas hipofisarias. Los efectos de1 GnRH a nivel gonadal han sido extensamente demostrados (113). Es sin embargo dudoso y poco probable, que estos efectos puedan atribuirse al péptido de origen hipotalámico. Parece obvio que éste nunca alcanza, debido a su escaso paso a ia circuiación generai y a su rapicia ciegraaación, niveles en plasma que permitan explicar sus efectos periféricos, A pesar de ello, no es menos obvio, que la célula granulosa posee receptores al GnRH (101, y que existen evidencias de la producción local en el ovario, de un péptido de estructura y funciones similares al hipotal&mico (114). El GnRH ejerce sus acciones gonadales a través de sus receptores de membrana con una especificidad y afinidad similar para el GnRH y sus análogos que los receptores GnRH de la hipófisis anterior. El número y afinidad de los receprores no varía cie forma susranciai ciurante ei día, ia rase dei cicio o ia hipofisectomia (41). Sin embargo, la FSH es necesaria para mantener el contenido de receptor GnRH en las células granulosa y el GnRH regula su número, aumentándolo o disminuyéndolo, según la dosis y el tiempo de tratamiento (41). Una exposición constante al péptido hace descender el número de receptores, debido a internalización y degradación posterior del complejo hormona-receptor, lo cual se traduce en una desensitización del tejido. El GnRH y sus analogos sintéticos, tienen en la célula granulosa y en general en el foliculo ovárico, un efecto bifásico cuyo signo, estimulador o in- INTRODUCCION 24 hibidor, depende del estado de maduración celular, la presencia simúltanea de otros reguladores (ej. gonadotropinas), la cronología de administración "in . , &v.-" VAYV = "it, .,ritrG" y !% &drac:Gn de la exp=si&bn. !,fiadidu c; c;!thvu de &!Ylas granulosa, durante las fases iniciales de la diferenciación inducida por FSH, interfiere y previene casi todos los cambios morfofuncionales caracteristicos de la diferenciación que son generados por la gonadotropina (43). Las células tratadas con el péptido no se agregan; su forma continúa siendo alargada y de apariencia fibroblástica, a pesar de la presencia de FSH, y nn dps-rrnl'afi '0s mi~r~villi ni lag uninfipc gap q~p ~~r~~'~ri~~~ 1- &!ula granulosa diferenciada (6,43). La producción de estradiol y progesterona no se inicia o se interrumpe como consecuencia de la inhibición que el GnRH realiza a nivel de las arornatasas (1151, 36-HSD (50) y posiblemente de la P450 SCC (87,116). Además, activa a la 2Oa-HSD (117). El GnRH previene también la inducción de receptores a LH (413,1i15) y PR-L. (87) y la formacibn d~ receptoras a FGF 114). nisminuye además el número y/o la afinidad de la FSH por su receptor (87). Administrado "in vivo", disminuye la ganancia de peso FSH inducida (118), y cuando se tratan ratas en periodo preovulatorio con un anticuerpo frente al GnRH. aumenta el número de foliculos que completan la ovulación y el número de cuerpos liiteos presentes en el ovario (118). Todas estas evidencias colocan al GnRH de origen gonadal en un puesto importante como candidato al papel de responsable de la atresia folicular. INTRODUCCION 25 Los efectos directos del GnRH a nivel gonadal no están limitados como ya se ha sugerido a la inhibición (113). Administrado a células granulosa en ausencia de agentes diferenciadores (FSH o análogos del AMPc), induce la actividad de las aromatasas y por tanto la sintesis de estrógenos (19). Es capaz de estimular la P450 SCC y la síntesis de pregnenolona (1191, y aumenta ligeramente la actividad de la 3fi-HSD (50) y de la 20a-HSD, lo que conduce a progresivos aumentos en la cantidad de progesterona (50,119) y 2Oa OH Pro (117,120) sintetizadas por las células (50,119). También estimula la sintesis proteica, especialmente de fibronectina y tPA (121) y la de prostaglandinas (122) y lact2tc !?1U!. Administrado "in vivo", mimetiza la acción luteinizante de la LH y sus efectos sobre la ovulacih (1211, probablemente más por sus efectos sobre la sintesis de prostaglandinas y activador del plasminógeno, que por su efecto directo sobre el proceso ovulatorio (121,122). EL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO Y EL TGFa La célula granulosa posee receptores al EGF (13,56); los estudios iniciales de Gosparowicz y col. (123,124) demostraron la actividad mitogénica del EGF "in vitro" en células granulosa de varias especies, con la excepción de la rata (que posee una limitada capacidad replicativa en cultivo1 (125), y la promoción del crecimiento del folículo que produce. Además de su acción mitogénica, afecta las funciones diferenciadas de la célula, incluyendo el desarrollo del receptor LH y la esteroidogénesis. El EGF INTRODUCCION 26 suprime los receptores a LH, FSH inducidos (110,126); inhibe, en forma dosis dependiente, la producción de estrógenos estimulada por la FSH: deprime la ac- ,.!".:A..A L---l PCU --*:-,.l-A.. flq'z! ...A--AAA A:--:-..:.. LLYLUaU CU ULIICILCIJCI. UQJal I.311-G~LILLlLLlCAU~ {IDVJ, aUGLLlaD UF ULUllllllULl C! SÜS~TÜ~ to disponible al inhibir la produccibn de andrógenos en la teca. El EGF disminuye también la síntesis de inhibina y OMI, estimulando la maduración del oocito (127). En contraste, parece ejercer efectos estimulatorios en la síntesis de progesterona basa1 y FSH estimulada (13,126) al aumentar la producción de pregneri~!nnz y !S mti~rridac! 3@-ESD, 2~ment.r t-~~hibn la ncti~irlzd del enzima 20a-HSD y, por tanto, la producción de 201x OH-Pro (13). Estimula, asimismo, la síntesis de ADN y proteínas (11) [ej tPA (12811. El EGF ejerce su accibn por un mecanismo mediado por su receptor (13, 126). La FSH, pero no la LH ni la prolactina, aumenta el contenido en receptores a EGF (14); a su vez el EGF incrementa la unibn de FSH a su receptor (1291, de ahí que su acción esté coordinada con el resto de los eventos hormonalmente dirigidos. El patrón general de las acciones diferenciadoras del EGF recijerda !sic z~ci~ngg rl_d Gn-R-U, que inhihn la indiiccihn de receptores a FIGP por la FSN. EGF y FSH pueden interactuar en la regulación de la célula granulosa a dos niveles: 1) por regulación de las interacciones ligando-receptor (EGF aumenta la unión de FSH a su receptor, FSH aumenta el número de receptores a EGF) 2) por regulación de la función de la c6lula mediada por el ligando: EGF modula la diferenciación mediada por FSH, FSH modula la proliferacibn estimulada por EGF. INTRODUCCION 27 El TGFa (Transforming Growth Factor al, análogo estructural del EGF y capaz de unirse al receptor común TGFn/EGF, atenúa también la sfntesis de estróFSE-iriduei& (i39). INTRODUCCION 28 Una de las funciones más importantes de la membrana plasm6tica es recibir los mensajes extracelulares y transducirlos en seí'iales intracelulares que activen las respuestas adecuadas. Definir la naturaleza de esta funcibn de transducción, particularmente la naturaleza y número de los mensajeros intracelulares involucrados en la activación celular es de gran importancia en el desarrollo del entendimiento de la funcibn de la célula. La transferencia de las sefiales hormonales desde el exterior al interior de la célula es realizada por un "segundo mensajero" generado en respuesta a la unión hormona-receptor en la membrana, que transmite y amplifica la información. La mayoria de los receptores de membrana se encuentran acoplados a uno o más de los siguientes sistemas de transducción de sefiales: íj Ei sistema aaeniiii ciciasa (A¿], cuya activacion genera Añíijc, ei cuai a su vez activa una serina-treonina proteína quinasa, la Protefna quinasa A (PKA). 2) La hidrólisis de f osf olipidos de membranas, especialmente los fosf olídos de inositol, que generan al menos dos tipos de segundos mensajeros: el ++ inositol 1,4,5 trifosfato (IP31, que moviliza Ca de los almacenes intracelulares, y el diacilglicerol (DAG) que activa una proteina quinasa, la Proteína quinasa C íi=KZj. 3) La entrada de ~a++ a travks de canales operados por mediadores qufrnicos que se generan tras la interaccibn entre el ligando y el receptor, o canales dependientes de los cambios de potencial de reposo de la membrana. INTRODUCCION 29 4) Receptores en los que alguno de sus dominios presenta actividad de proteína quinasa - tirosina quinasa. En agudo contraste con la amplitud de conocimientos adquiridos en la 61tima década acerca de los numerosos agonistas, y de la multitud de mecanismos endo, para y autocrinos que colaboran en la regulación de la diferenciación folicular, existen grandes lagunas en la comprensión de la transmisión de las señales reguladoras en el interior de la célula. Atgiinos de lns hechns prohados, y La. mrryorí. de 1nc interroga-ntes plan- - -- teados acerca de la mediación intracelular de los efectos biológicos de las principales hormonas o agonistas que regulan la proliferación y diferenciación de la célula granulosa, se describen seguidamente (Gráfica 3): HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH) El receptor de FSH se encuentra acoplado a adenilil ciclasa (131,132). - 'I'ras la unión ae ia-ñormona con el recepzor ai ser apiicaaa a un cuirivo ae células granulosa, resulta un incremento en la actividad del enzima, que empieza a ser significativo tres horas después de la unión. Aproximadamente al mismo tiempo, pueden detectarse aumentos en la cantidad de AMPc citoplasmatico (1311, La activación de la adenilil ciclasa por FSH en célula granulosa tiene lugar, presumiblemente, en una forma no diferente de la descrita clásicamente para otros receptores acoplados a adenilil ciclasa. Muy brevemente, el complejo FSH-Receptor inreracuía con ia Gs caraiizando, en un proceso deperidieritc: de rnagnesio, la sustitución del CDP unido a fa subunidad a, por GTP. Tras la hi- INTRODUCCION 3 6 a un nivel más dista1 en la cascada de trasducción. Sus efectos estimulatorios son inhibidos por la cicloheximida o la actinomicina D, indicando que se requiere de la síntesis proteica y de ARN para la plena expresión de los efectos dif erenciadores de la SmCAGF-1. Además aumenta los efectos de concentraciones máximas de efectores no dependientes de AMPc, como los estrógenos (174). PDGF Y TGFP La potenciación que realiza el TGFB de la FSH en la célula granulosa, tiene lugar, al menos parcialmente, a través de un aumento de la producción del AMPc inducida por la gonadotropina (140). Sin embargo deben estar implicados otros mecanismos, puesto que el TGFP amplifica la inducción, de receptores a LH y la producción de progesterona por la FSH más que la debida a la elevación producida en AMPc. Además tiene poco efecto sobre la producción de AMPc debida a Ctx o FK, y no obstante, aumenta su produccibn de receptores a LH (111). GnRH En célula granulosa ovárica, el GnRH previene la acumulacibn de AMPc inducida por FSH, pero no altera las cifras basales (150). El mecanismo por el cual el GnRH es capaz de disminuir el AMPc y contrarrestrar, de esta forma, los efectos diferenciadores del nucleótido, y de la FSH en consecuencia, se conoce sólo parcialmente. INTRODUCCION 37 El GnRH inhibe la actividad de adenilil ciclasa estimulada por FSH (175); sin embargo, tal inhibición no está mediada por un acoplamiento del péptido con la Gi (1761, ni por modificación de la activación de la subunidad catalítica por Gs (1761, La activación máxima de la Gs o de la subunidad catalítica de la adenilil ciclasa con toxina colérica o con diterpeno forskolín, no son capaces de vencer los efectos inhibitorios del péptido sobre la esteroidogénesis o la inducción de receptores a LH (140), por lo que difícilmente puede ser la inhibición de la adenilil ciclasa el mecanismo de acción del GnRH. La disminución de la actividad del enzima generador de AMPc, existe sin embargo, y debe ser atribuida más a una disminución en la inducción homóloga de receptores a FSH por el GnRH (1761, por un mecanismo no dilucidado todavía, que a un efecto directo del receptor de GnRH. Más aún, la asincronia entre la prevención de los efectos del AMPc (que empieza a ser evidente a las 3 horas de la adición de GnRH), y la disminución en la acumulación del nucleótido y de la actividad de la adenilil ciclasa, hablaría a favor de la existencia de un lugar primario de acción localizado después de la producción de AMPc, y otro secundario a nivel del receptor de FSH (177). En cuanto a la identidad de la(s1 etapa(s) distal(es) a la generación de AMPc sobre las que el GnRH actuaría primariamente, existen varias posibilidades. El GnRH previene los efectos inhibitorio~ de la FSH sobre la fosfodiesterasa que metaboliza AMPc, impidiendo así la acumulación del nucleótido propiciada por la FSH (143,144). Sin embargo, éste no puede ser tampoco el mecanismo básico de acción del GnRH, puesto que los análogos no metabolizables del AMPc y el inhibidor de la fosfodiesterasa, metil-isobutil xantina (MIX), no son capaces de prevenir la depresión que el GnRH produce en los efectos diferenciadores de la FSH y su mensajero (140). El GnRH disminuye el número de lugares de unión de AMPc a la subunidad regulatoria de la proteína quinasa AMPc-dependiente tipo 11, y retrasa la ac- INTRODUCCION 38 tivación de tal proteína quinasa, producida muy tempranamente por FSH, durante al menos 60 minutos (178). La FSH induce a largo plazo la síntesis de proteína quinasa AMPc-dependiente tipo 11, y este aumento de la síntesis puede ser prevenido con GnRH (178). Esta constituiría una segunda alternativa a la localización del lugar post AMPc de inhibición del GnRH, que en modo alguno agota, sin embargo, las posibilidades. Sea cual sea la identidad de la etapa del sistema de seilalización de la FSH que el GnRH interfiere prioritariamente, persiste aún el interrogante acerca de cómo se realiza tal interferencia o, expresado de otra forma, cuál es el mensajero intracelular del GnRH en célula granulosa ovárica. El GnRH aumenta el marcaje de PI y ácido fosfatfdico en célula granulosa ovarica (158) y el recambio de fosfollpidos del inositol (179,180). Ambos efectos sugieren la existencia de una hidrólisis de f osf oinositósidos acoplada al receptor de GnRH, que efectivamente tiene lugar de forma rápida tras la ocupación del receptor, con acumulación de IP3 y DAG en el citoplasma de la célula granulosa (158,181). La aplicación a la célula granulosa de ésteres de forbol, cuyo receptor intracelular es la proteína quinasa C, o de análogos del DAG, en presencia de FSH, reproduce todos los efectos biológicos del GnRH (182-184). Así pues, parece probable que el DAG sea el segundo mensajero del GnRH en célula granulosa ovárica, y los efectos de éste descritos hasta el presente sobre el sistema de señalización de la FSH, y en consecuencia sobre los efectos biológicos de la hormona, dependan de la activación/inactivación de proteínas por fosforilación con protefna quinasa C. INTRODUCCION 39 FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO (EGF) Y TGFa Las acciones estimulatorias del EGF no están relacionadas con lugares próximos a la producción de AMPc ya que el EGF disminuye la actividad adenilil ciclasa y aumenta la fosfodiesterasa, y, por lo tanto, produce una disminución de la [AMPcl intracelular (13). Además, su efecto sobre la inducción de receptores a LH y sobre la producción de estrógenos estimulada por FSH ocurre distal a la formación de AMPc; ya que suprime también la síntesis de estrógenos inducida por Ctx, (BudAMPc y PGEZ (126). De forma similar deprime la actividad aromatasa en células granulosa no estimuladas por otros agonistas. Por otra parte, es conocido que estimula la síntesis de tPA, por un mecanismo independiente de la PKC en el que se precisa de la síntesis proteica (la inducción del ARNm del tPA producida por el EGF es inhibida por la cicloheximida) (128). Y por último, recordar que su receptor está relacionado estructuralmente con el de la insulina, si bien no existe competencia entre ambas hormonas por sus receptores especificas. La unión del EGF estimula la actividad tirosina quinasa del receptor, esencial para obtener la respuesta celular, y que conduce a un aumento de la fosforilación de sus sustratos intracelulares (185). El EGF produce la fosforilación de la PLC inositol-especifica (1861, promoviendo el turnover de PI y generando DAG que activa una PKC que a su vez fosforila el receptor regulando su afinidad por el agonista, su actividad tirosina quinasa y su localizacibn intracelular. INTRODUCCION 40 1V.- LOS FOSFATIDILINOSITOL GLICANOS EN LA TRANSMISION DE LA sE~AL HORMONAL Recientemente se ha demostrado la existencia en las membranas de hepatocito (l69,l72,l87-l90), hepatoma (171,172), adipocito (lgl), células CHO (1921, miocito (1701, linfocito (1931, glomerulosa (1941, de una familia de glicofosfolípidos, que se ha relacionado con las señales bioquímicas involucradas en el mecanismo de acción de la insulina y cuya estructura básica guarda semejanzas estructurales con el Fosfatidilinositol glicano (PI-glicano o PI-G) de anclaje a membrana de determinadas proteínas existentes en bacterias y células eucariotas (195,196). Estas semejanzas incluyen que: i) son hidrolizados por la f osf olipasa C específica para f osf atidilinositol (PLC-PI) de Sta- - philococcus aureus, Bacillus cereus o Bacillus thuringiensis (171,172,192, 193). ii) El glicofosfolfpido purificado puede ser roto por deaminación con ácido nitroso dando lugar a PI, lo que sefiala la presencia de inositol fosfato unido a glucosamina no acetilada (171,172). iii) La porción diacilglicerol del fosfolípido contiene ácidos grasos saturados (palmítico y miristico) (170,- La cabeza polar del PI-glicano está fosforilada (172,193,197) y contiene otros azúcares además del inositol (169,170) y la glucosamina (170,171,193) cuya naturaleza, niímero, localización y configuración dentro de la molécula varia dependiendo del tejido del cual ha sido aislada. De forma similar, tampoco es constante, para c6lulas distintas, la composición en ácidos grasos (170,171,190,193) del PI-G. INTRODUCCION 41 El fosfatidilinositol glicano aislado de hígado y hepatoma H35 por Mato y cols., es sensible al tratamiento con 13 galactosidasa (1911, lo cual indica la presencia de residuos galactosa con enlaces R glicosídicos en la molécula. Se han identificado alrededor de cuatro de estos residuos por cada molécula de inositol (1721, y uno de ellos constituye probablemente la porci6n terminal y está f osf orilado. Larner y cols. han aislado, de hígado de rata, un PI-glicano que posee una composición de carbohidratos similar a la de los PI-glicanos de anclaje de proteínas, con inositol, galactosamina y manosa, y cuya cabeza polar podria también mediar algunas de las acciones de la insulina (190). La sensibilidad del PI-G a la PLC-PI sugiere la presencia de PI en la molécula (171,172); sin embargo, las variaciones estructurales existentes entre los PI-glicanos de diferentes tejidos afectan a la sensibilidad de la molécula a la PLC-PI (171, 192,193). El PI-glicano aislado de Rat-1 es resistente a la hidrólisis con PLC específica para PI, y al tratamiento con ácido nitroso (Alemany, Clemente y Mato, no publicado). En la gran mayorfa de los glicofosfolipidos, la mitad polar de la molecula se encuentra localizada hacia el compartimiento citoplasmático. En el caso del PI-G que nos ocupa, marcajes específicos realizados con moléculas que no pueden atravesar la membrana plasmática (1871, demuestran que, al igual que en los PI-G que forman anclaje de algunas proteínas a las membranas (1961, la cadena de oligosacáridos que forman la mitad polar, se encuentra localizada preferentemente en la superficie externa de la membrana (187,191,198). INTRODUCCION 42 La insulina activaría una fosfolipasa C específica (170,199,200) que hidroliza al fosfatidilinositol glicano produciendo diacilglicerol (DAG) y la cabeza polar, el f osf ooligosacárido (POS), Puesto que el DAG generado por la hidrólisis del PI-G no es capaz de activar proteína quinasa C (199,2011, y sólo parece responsable de un cierto aumento en el transporte de glucosa cuando es aplicado a adipocitos (2011, se ha concluido que la cadena de oligosacáridos debe ser la activa en términos de transmitir la seííal, en el caso de que los PI-G sean hidrolizados en respuesta a la interacción entre un agonista hormonal y su receptor de membrana. La hidrólisis se produce muy rápidamente (entre 15" y 2') y ha sido descrita en respuesta a la insulina, en hepatocitos (172,1871, hepatoma H35 (171,1721, adipocitos (191), linfocito T (193) y miocitos BC3H1 (170); a IGF-1 en células CHO (192) y miocitos BC 1 (203) y a EGF en miocitos BCY1 (203). Asimismo la 3II ACTH y el NGF son capaces de hidrolizar un PI-G en células glomerulosa (194) y PC-12 (204) respectivamente. Es especialmente importante, la observación realizada en hepatocito, linfocitos T (193) y células CHO (192) de la existencia de una relación entre el número de receptores de insulina, y su actividad tirosina quinasa, y los niveles de PI-G. Una parecida dependencia puede observarse para el receptor de IGF-1 y la proporción de PI-G existente en la membrana de las cblulas CHO transfectadas :on el receptor para el factor de crecimiento (192). INTRODUCCION 43 La cabeza polar del fosfoinositol glicano modula la actividad de ciertos enzimas cuando es añadida a extractos celulares o a los enzimas purificados: la fosfodiesterasa de AMPc (170,205), la adenilil ciclasa (2051, la proteina quinasa A (l93,206), la piruvato deshidrogenasa (lgO,205,2Q8), la f osfolipido metiltransferasa (207) y la caseína quinasa 11. Al contrario que otros mensajeros intracelulares que son generados en la superficie interna de la membrana, la localización de los PI-glicanos en la cara externa, conduce a una liberación de la cabeza polar (POS) en el espacio extracelular (187,198) tras su producción durante la hidrólisis acoplada a los receptores para las hormonas que se han enumerado, Además, cuando el POS es añadido a adipocitos o hepatocitos intactos, mimetiza algunas de las acciones de la insulina. Recientemente se han obtenido algunas evidencias de la existencia en la membrana del hepatocito, de un sistema de transporte' del POS, que alcanza una velocidad máxima de transporte a 37' C, y es regulado por la propia insulina, en un proceso dosis y tiempo dependiente (209). El POS asi transportado mimetiza en el hepatocito, los efectos reguladores de la insulina sobre la glicógeno fosforilasa (2101, la piruvato quinasa (2101, fosfolípido metiltransf erasa (1881, adenilil ciclasa (205,210). El transporte de POS no ha sido demostrado en adipocito. A pesar de ello, y puesto que la membrana de esta c6lula permite su paso, ha sido posible medir los efectos del POS sobre la lipólisis (189), lipogénesis (2021, metabolismo de la glucosa (202) y actividad de los enzimas fosfolípido metiltransferasa INTRODUCCION 44 (188,207) y piruvato deshidrogenasa (208). Los resultados han mostrado que el POS reproduce en este tejido casi todos los efectos atribuibles a la insulina, aunque no el transporte de glucosa (189,202). La cabeza polar del PI-glicano estimula las mismas vías de sefializaci6n que la insulina, el POS tiene efectos insulin-like en la fosforilación/ defosf orilación de los enzimas f osf olípido metiltransf erasa (2071, ATP citrato liasa, lipasa hormono sensible, glicógeno fosforilasa, una fosfoproteína 65 kD y una 50 kD , y la proteína ribosomal S6 (211). Puesto que mimetiza efectos tanto dependientes, como independientes del AMPc, se sugiere que la producción hidrolítica del POS es un paso inicial en el mecanismo de señalización de la insulina. En conjunto, ésto viene a suponer un nuevo modelo de transmisión de la señal hormonal en el que la insulina, y tal vez otras hormonas, promueve la hidrólisis de un PI-G en la superficie externa de la célula con liberación de su cabeza polar y diacilglicerol. El POS, que forma la cabeza polar, entra en la célula y modula el estado de fosforilación de proteínas clave. MATERIAL Y METODOS 52 1E.- Material cromatográf ico Los lípidos estándar (ácido f osf atídico, PA; f osf atidilcolina, PC; f osf atidilinositol, PI; fosfatidilinositol, 4-fosfato, DPI; fosfatidilinositol-4,sbifosfato, TPII se obtuvieron de Sigma. Las placas para cromatografía en capa fina de silicagel 60, unas con soporte de plástico (20x20 cm y 0.2 mm de espesor) y las otras con soporte de cristal (20x20 cm espesor de capa 0.25 mm), fueron de Merck. Los solventes utilizados: cloroformo, metanol, ácido acético glacial, acetona, éter etilico, hexano, hidróxido arnónico, piridina y acetato de etilo fueron BDH, calidad Analar. 1F.- Reactivos generales El resto de los productos utilizados en la presente tesis doctoral fueron de la mejor calidad analítica posible. 1G.- Animales Se utilizaron ratas hembra inmaduras de la cepa Sprague Dawley, criadas en el bioterio del Colegio Universitario de Las Palmas, y mantenidas en jaulas transparentes en condiciones de estabulación óptimas. Los animales estuvieron O sometidos a temperatura (23 ; 2 C) e iluminación (ciclo de 12 horas de luz, 12 de oscuridad, comenzando la luz a las 06.00) controladas y constantes. Tenían libre acceso al agua y su dieta fue la estándar de laboratorio (Biona, Las Palmas) "ad libitum". MATERIAL Y METODOS 53 2. OBTENCION Y CULTIVO DE CELULAS GRANULOSA Un esquema simplificado del proceso de obtención y ciiltivo de células granulosa, se muestra en la Fig. 1 (42, 212). 2A.- Tratamiento de animales y extracción de órganos a.-Cuando aún eran inmaduras sexualmente (entre los 23 y 25 días de edad) se iniciaba el tratamiento con DES en solución oleosa a razón de 1 mg/60 p1 de solución/rata/día, por vía subcutánea, tratamiento que se mantuvo durante 5 días y mediante el cual se estimulaba la aparicibn de folículos preantrales en igual estadio de desarrollo y la proliferación de una población homogénea de células granulosa. b.-Tras el tratamiento con DES, los animales (10 a 30 por experimento) se sacrificaron por dislocación cervical y se realizó la extracción de los ovarios en condiciones de máxima esterilidad. Brevemente, el proceso consistía en: a) Sacrificio de las ratas en el cuarto de cirugía. b) Irrigación de la región dorsal de la rata con etanol al 70% para esterilizar el campo quirúrgico. c) Extracción de los ovarios por vía retroperitoneal. Conservación de los órganos en tubos Falcon estériles de 50 m1 que contenían medio McCoy's 5a modificado a 4'~. Durante todo el proceso de sacrificio y ovariectomía no se emplearon más de 2-3 min/rata. .CULTIVO DE CELULAS GRANULOSA @ RATAS(23-25 días) DES 5 DlAS TRATAMIENTO %& / (1 mg/ rata/día/s.c.) SACRIFICIO EXTRACCION ESTERIL DE OVARIOS a ' f EXPRESION DE CELULAS 'OS Fig 1 MATERIAL Y METODOS 54 2B. Obtención Y cultivo de células rrranulosa a.-Los ovarios extraídos en el cuarto de cirugía eran trasladados al cuarto de cultivos donde, en una campana de flujo de aire laminar, eran lavados mediante pases sucesivos por 4-5 placas de cultivo estériles que contenian el mismo medio McCoy's 5a. b.-Utilizando una lupa binocular se separó el parénquima ovárico de la cubierta grasa periovárica y de los restos de trompa unidos al hilio. Tras someterlos a un nuevo proceso de lavado quedaron en disposición de ser utilizados para la obtención de las células granulosa. c.-Se colocaron a razón de 2-3 ovarios, en placa de cultivo estéril y con medio McCoy's 5a ~riodificado frio, bajo la lupa binocular y de ellos, se extrajeron las células granulosa mediante punción cuidadosa de los folículos preantrales usando agujas estériles de 27x1/2". Las células granulosa fluían con el liquido folicular al medio de cultivo. d.-Los medios correspondientes a la punción de los ovarios se recolectaron en tubos estériles de 50 ml, mantenidos en frío. El resto del tejido ovárico se desechó. :.-Se realizó el, lavado de las células mediante centrifugación en centrífuga refrigerada Beckrnan GPR de baja velocidad (4 OC, 1500 g xS min), desechándose los sobrenadantes y añadiéndose 20 m1 de medio fresco; el pellet celular se disociaba por aspiración repetida del medio con pipetas plásticas estériles de calibres decrecientes y agitación en agitador Reax 2000 de Heildolph. Tras la tercera centrifugación el pellet se resuspendió en 2.5-5 m1 de medio para realizar la evaluación del número de células existente y su viabilidad. MATERIAL Y METODOS 55 f.-El número de células existentes y su viabilidad se determinb tomando S5 p1 de la suspensión celular a los que se añadieron 25 p1 de azul de tripán. Tras agitación se contaron las células existentes en 25 p1 de esta mezcla colocados en una cámara de Neubauer. En todos los experimentos la viabilidad celular obtenida, medida en términos de la capacidad para excluir el azul de tripán, fue mayor o igual al 60% (Fig 4 B). g.-Las células granulosa fueron cultivadas en placas de cultivo Falcon de 6 35x10 mm, 10 células viables/placa en 1 m1 de McCoy's o Ham F-10 sin suero y adicionando, momentos antes de iniciarse el cultivo, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2mM. El tiempo y las condiciones de cultivo fueron variables dependiendo de los parrimetros a estudiar. A lo largo de todos los experimentos realizados, las células se mano tuvieron en un incubador Heraeus a 37 C, en una atmósfera saturada de agua y con una presión constante de CO del 5%. 2 3. MARCAJE, EXTRACCION, SEPARACION Y CARACTERIZACION DEL FOSFATIDILINOSITOL GLICANO (171,172) 3A.- Marcaje de células granulosa Las células granulosa fueron cultivadas en medio McCoy's 5a modificado o Ham F-10 a 37 OC en una atmósfera con 5% de C02 en placas de cultivo Falcon. 6 Las células (10 /placa) fueron marcadas durante tiempos variables (8, 12, 24, 48, 72 horas) en presencia de 5 pCi de [%lpalmítico, [%linosito1 o [%]mirístico, o 25 pCi de [3~lglucosamina, [ (klgalactosa o L %lmanosa. MATERIAL Y METODOS 56 3B.- Extracción del f osf atidilinositol glicano Al finalizar el período de incubación, se aspiró y desechó el medio, y se añadieron 2 m1 de ácido tricloroacético (TCA) frío al 5% a cada placa. Duo rante 15 minutos se mantuvieron las placas a 4 C; posteriormente las células de cada placa por separado fueron raspadas y transferidas a un tubo de cristal limpio (18x120 mm). Las placas se lavaron una vez con 1 m1 de TCA al 5% y se añadieron estos lavados al tubo correspondiente tras lo cual: a.- los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos a 4' C en una centrífuga Beckman GPR de baja velocidad b.- el sobrenadante se descartó y el pellet fue extraído con cloroformo/ metano1 (1:2) conteniendo HC1 0.05 N c.- despuss de permanecer 30 min a temperatura ambiente, la muestra se centriO fugó (2000 rpm, 10 min, 4 C1 y el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio d.- el pellet se extrajo de nuevo con 1.5 m1 de la misma mecla de cloroformo/ metanol/HCl; se centrifugó y el sobrenadante se unió al anterior mientras el pellet se descartó e.- a los sobrenadantes almacenados se les añadió 1.5 m1 de cloroformo y 1.5 m1 de KC1 0.1 M; se agitó la mezcla y posteriormente se separaron las fao ses orgánica y acuosa mediante centrifugación a 4 C f.- la fase acuosa se descartó, y la orgánica fue tratada con 1.5 m1 de KC1 0.1 M en metano1 al 50%; tras agitación, se almacenaron las muestras a O -20 C durante 30 min con lo que se producía la separación de las fases orgánica y acuosa. g.- la fase acuosa era desechada y la orgánica evaporada a sequedad en un baño a 40-50 OC bajo una fuente de nitrógeno. MATERIAL Y METODOS 57 -- 3C.- Separación del Fosfatidilinositol glicano Las muestras secas se disolvieron en 50 pl de cloroformo/ metanol (21) y aplicaron a un placa de cromotografía en capa fina (CCF) de silicagel con soporte de cristal. Las placas de CCF se desarrollaron por dos veces en cloroformo/acetona/ metanol/ácido acético glacial/agua (50:20:10:10:5) tras lo cual se rasparon regiones de un cm de alto y se contó la radioactividad que tenían asociada, usando 3 m1 de líquido de centelleo (Optiscint "HiSafe" de LKB Wallac), en un contador de centelleo líquido LKB/1211 Rackbeta. 3D.- Purificación del Fosfatidilinositol rrlicano Para purificar el fosfatidilinositol glicano, los lipidos marcados se cromatografiaron tal como se describe en el apartado' anterior. La silice obtenida del rascado de los dos o tres primeros centímetros se eluyó por dos veces con 2 m1 de metanol a 37'~. El metano1 de los lavados fue almacenado, llevado a sequedad bajo una fuente de nitrógeno a 40-50'~ y luego aplicado a una CCF que se desarrolló en cloroformo/metanol/NHqDH/agua (45:45:3.5:1.5). Se rascaron regiones de un cm y se determinó la radioactividad que tenían asociada en las mismas condiciones que las ya descritas. Los Rf del PI-glicano y los distintos fosfolipidos tras la separación y purificación se representan en la Figura 2. SOLVENTE 1 SOLVENTE 11 20 (ACIDO) (BASICO) DPI PA PI-G PC PI PE MEZCLA T P1 1P1 PI-G Fig 2 MATERIAL Y METODOS 58 3E.- Tratamiento con ácido nitroso Una muestra del fosfatidilinositol glicano purificado marcado con [ 3~1glucosamina fue secado bajo una fuente de nitrógeno y resuspendido en 100 p1 de acetato sódico 50 mM, pH 3.5. Después de añadirle 100 p1 de nitrito sódico (NaNOZ) 0.33 M recién preparado se incubó durante 12 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación se neutralizb con una gota de bicarbonato amónico (NH4C03) 1 M y se liofilizó. El extracto seco se resuspendió en 50 p1 de cloroformo/metanol (21) y se aplicó a una placa de CCF que se desarrolló en cloroformo/metanol/NH OWagua (45:45:3.5:1.5). Después se rasparon regiones de 1 4 cm de alto y la radioactividad asociada con cada una de ellas se determinó por contaje con líquido de centelleo. 3F.- Tratamiento con Fosfolipasa C Una muestra del fosfatidilinositol glicano purificado marcado con [ 3~1glucosamina o con [%lpalmítico fue secado bajo una fuente de nitrógeno y resuspendido en 200 p1 de tampón borato 20 mM, pH 7.5; se sonicó durante 5 minutos 3 veces y se le añadió 1 U de fosfolipasa C específica para el fosfatidilinositol (PLC-PI) de S. aureus incubándose durante toda la noche a 37' C. La reacción se par6 con 750 pl de cloroformo/metanol/HC1 (2:1:0.03 N). Se microfugó a 8000 g durante 1 min, se agitó y repitió el proceso 2 veces más. Se tomó la fase superior y se lavó la inferior con 0.5 m1 de NaCl 0.005 M en 50% metanol. Se reunieron las fases acuosas y se liofilizaron, mientras que la fase orgánica se secó. Cada fase fue redisuelta en 250 pl contándose una alfcuota de cada una. El resto se aplicó a una placa de CCF que se desarrolló en cloroformo/met;anol/ MATERIAL Y METODOS 59 NH40H/agua (45: 45: 3.5: 1.51, midiéndose a continuación la radioactividad presente en la placa que se raspó en zonas de 1 cm de alto. Hidrólisis ácida Una muestra del fosfatidilinositol glicano purificado y marcado se evaporó a sequedad y resuspendió en 200-400 p1 de HC1 4 N tras lo cual se incubó O durante 24 horas a 110 C. Al final de este periodo se le añadió 1 m1 de agua y se liofilizó. El extracto liofilizado se redisolvió en un pequeño volumen de agua que se aplicó a una placa de CCF y se desarrolló en piridindacetato de etilo/ácido acético glacial/agua (5:5:1:3). Después se rasparon regiones de 1 cm de alto y se determinó la radioactividad asociada a cada fracción. 3H.- Tratamiento con Fosfolipasa A 2 Una muestra de PI-glicano marcado con [ 3~lpalmitato o 3~lmiristato se rerusper?c!ib en, G.2 E.! de p~)!ieti!mg!icd Q.1X e11i 125 ~2.t Tris KC!, pFI 52.5, J se incubó en presencia de 2400 U/ml de fosfolipasa A2 durante 30 minutos a 37 O C, tras lo cual se secó en Speed-Vac. La muestra seca se redisolvió con 50 p1 de metanol, se aplicó a una placa de CCF que se desarrolló en cloroformo/metanol/NH40H/agua (45:45:3.5:1.5) y se rascaron regiones de 1 cm de alto. La radioactividad que tenia asociada cada fracción, se determinó por contaje con líquido de centelleo. RESULTADOS 65 1.- OBSERVACIONES MORFOLOGICAS CON EL MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES Las células recién obtenidas de los ovarios de ratas inmaduras tratadas con DES fueron principalmente células redondeadas dispersas y, ocasionalmente, en pequeños acúmulos celulares (Fig 4 A). El número de células en tales agregados no solía exceder de media docena. Cuando las células permanecían 48 h en cultivo con FSH, se formaban agregados mucho mayores (Fig 4 D y E), cada uno formado por varias docenas de células. Las células de los agregados adquirían una forma similar a células epiteliales y estaban estrechamente empaquetadas (Fig 4 D). A menudo agregados vecinos estaban interconectados (Fig 4 E) formando una estructura similar a una cadena. Después del cultivo sin añadir hormonas (C), las células estaban más aplanadas que las tratadas (E), 2.- IDENTIFICACION DE LOS COMPONENTES DE LA CABEZA POLAR DEL FOSFATIDILINOSITOL GLICANO Para determinar los azúcares que forman parte de la mitad polar del glicofosfolfpido, se estudió la incorporación al PI-G de diversos azúcares tritiados. 3 a) Incorporación de [ H]glucosamina a la molécula de PI-glicano 3 En la Fig 5, se muestra la incorporacibn de [ Hlglucosamina a las c6lulas granulosa mantenidas en cultivo primario, a las que, como se describe en Mate- RESULTADOS 66 3 rial y Métodos, se fueron incorporando 25 pCi/ml de [ Hlglucosamina a distintos tiempos antes de la terminación del experimento con TCA 5%. Extraído y purificado el PI-glicano por separación en CCF utilizando las condiciones de solventes, tal y como se han descrito, pudo observarse una incorporación significativa de [%lglucosamina al PI-glicano a las 24 horas desu adición al cultivo. Ante la imposibilidad de lograr un marcaje a actividad específica constante durante las 72 horas que se mantiene un cultivo habitualmente, se lavaron los cultivos y se adicionó medio fresco conteniendo la misma cantidad de [%lglucosamina que durante los 3 primeros dias. En estas condiciones experimentales, se obtuvo una incorporación máxima constante a partir del 5' dfa de cultivo. 3 b) Incorporación de [ lgalactosa a la molécula de PI-glicano 3 Las c.p.m. de [ Hlgalactosa incorporadas al PI-glicano de las membranas de célula, se representan en la Fig 6. b Las células granulosa (10 /placa) se cultivaron en presencia de 25 pCi/ml de [%lgalactosa durante 48, 24, 8 6 4 horas, El PI-glicano se extrajo tal y como se describe en Material y Métodos y se separó y purificó en una placa de silicagel desarrollada secuencialmente en clorof orrno/acetona/metanol/ácido acético glacial/agua y clorof ormo/metanol/NH~gua. Tras 24 horas de incubación con el isótopo, se obtuvo la máxima incorporación, que se mantuvo constante hasta las 48 horas. 3 C) Incorporacidn de [ Hlmioinositol a la molécula de PI-glicano En la Fig 7, se representan los resultados obtenidos tras incubar lo6 cblulas granulosa/placa con [%lmioinositol (5 pCi/ml) durante 8, 12, 24, 48 y 72 horas. La utilización de un medio de cultivo pobre en inositol (el Ham Flo), permitió disminuir a 5 pCi/ml la cantidad de isbtopo y obtener, no obstante, una buena incorporación del azficar a la molécula del PI-glicano. Tal incorporación fue máxima a las 24 horas y se mantuvo constante hasta 3 dlas despues de iniciado el cultivo. d) Incorporación de [d~lrnanosa a la molécula de PI-glicano 3 La [ Hlmanosa (25pCi/ml) se mantuvo en el cultivo de células granulosa 6 (10 células/placa) durante 5, 24, 48 6 72 horas. - oxtraicio ei giicof osf olipido y purificado por cromatograf la en capa fina, no pudo observarse, tal y como aparece representado en la Fig 8, una incorporación apreciable del azúcar a su molécula en ninguno de los tiempos estudiados. RESULTADOS 68 3.- IDENTIFICACION PARCIAL DE LA ESTRUCTURA DE LA CABEZA POLAR DEL FOSFATIDILINOSITOL GLICANO Hidrólisis ácida del PI-glicano Para demostrar que la radioactividad asociada al PI-glicano, tras la incubación con los distintos azúcares radioactivos, no procede de la metabolización de dichos azúcares y su posterior incorporacibn a la molécula, se sometib al PI-glicano extraido de las células y purificado en CCF, al tratamiento con HC1 en la forma en la que se describe en Material y Métodos. Este tratamiento rompe a la molécula en su componentes, En las Fig 9 y 10 se muestra que tras la cromatografia en capa fina del producto de la hidrólisis, la radioactividad aparece asociada casi exclusivamente con la glucosamina o con la galactosa, dependiendo del tipo de marcaje inicial. No obstante, en el caso del lipido marcado con glucosamina, un porcentaje no desdefiable de la radioactividad total (= 25%) aparece ligado a la forma acetilada de la glucosamina. Id6nticos resultados se obtienen cuando las células se marcan con hinositol. b) Tratamiento con ácido nitroso El tratamiento con ácido nitroso separa el grupo amino de la molécula de los aminoazúcares, y rompe cualquier enlace glucosfdico existente en el carbono adyacente a aquél en el cual se encuentra el grupo amino (216). RESULTADOS 69 En las Fig 11 y 12 se representan los resultados obtenidos al tratar fosfatidilinositol glicano, previamente marcado con [Cklglucosamina (Fig 11) o [%lgalac~usa (Fig 12) y purificado con Acido nitroso, en la forma y tiempo descritos en Material y Métodos. Como puede observarse en las Figs 11 y 12, entre un 30 y un 35 % de la radioactividad asociada a la molécula de PI-glicano desaparece tras el tratamiento con el ácido nitroso. IDENTIFICACION PARCIAL DE LOS COMPONENTES Y ESTRUCTURA DEL ESQUELETO DEL FOSFATIDILINOSITOL GLICANO a) Incorporación de ['~l~almitato al PI-glicano En la Fig 13 se representan los resultados obtenidos al incubar células n granulosa con 5 pCi/rnl de [%lpalmitato, durante 4, 8, 24, 48 0 '72 horas, tras lo cual el lípido fue extraído, cromatografiado y contado. A las ocho horas de incubación con [3~lpalmitato, se obtuvo la máxima incorporación (aproximadamente 60,000 c.p.m.1, que se mantuvo casi constante durante tiempos de incubación de hasta 72 horas. 3 b) Incorporacibn de [ Hlmiristato al PI-glicano En la Fig 14 se muestra la radioactividad asociada al PI-glicano, tras 6 incubar 10 celulas granulosdml con 5 pCi de [%lmiristato, durante 5, 24, 48 RESULTADOS 70 y 72 horas. Al finalizar los períodos de incubación el lípido fue extraído, cromatografiado y contado. La mayor incorporación de [%lmiristato a la molCcula del PI-glicano tuvo lugar, en todos los ensayos realizados (una media de tres por experimento), a las 48 h de incubación con el precursor. En tiempos más largos de incubación se produjo una reducción de la radioactividad asociada al lípido, hasta los niveles de la obtenida con sólo 8 horas de incubación con el precursor. c) Tratamiento del PI-glicano purificado con PLA 2 Para determinar si los ácidos grasos incorporados a la molécula del glicofosfolípido se encuentran esterificados con el alcohol del carbono 2 o, por el contrario, han sido metabolizados y se han incorporado inespecíficarnente a la molécula del PI-glicano, se sometieron muestras del lípido purificado y marcado con [3~lmiristato o [%lpalmitato a incubacidn con PLA en la forma y 2 tiempo que se describe en Material y Métodos. La PLA rompe específicamente el 2 enlace éster del carbono 2 y transforma el lípido en un lisofosfolípido. Tras el tratamiento con el enzima (Figs 15 y 161, la mayor parte de la radioactividad asociada al glicofosfolípido marcado con [%lpalrnitato desaparece en la cromatografia realizada a la fase orgánica (Fig 15). En cambio, un gran pico de radioactividad aparece con el mismo Rf que el ~%l~almitato que se utilizó como patrón en la CCF. Cuando se analizó el efecto de la PLAZ sobre el PI-G marcado con [3~lmiristato se encontró que la radioactividad (Fig 16) aparecía en dos picos, uno migrando con los llpidos neutros y el i!fíimiristato usado como patrón, y el otro, menor, en posición similar a la del PI-G. RESULTADOS 71 d) Tratamiento con PLC de los estractos purificados del lipido La Fosfolipasa C especifica de fosfatidilinositol, hidroliza el enlace f osfodiéster del inositol con el diacilglicerol de la molécula del f osf olípido !Q contiene, liherandn, en cnniecl~encla, 1cabeza pn1a.r del lipido y el Y-- diacilglicerol. La potencia de hidrólisis de la PLC utilizada fue medida en términos de su capacidad para romper fosfatidilinositol. Sólo el 50% del PI sometido al tratamiento con PLC fue hidrolizado. En la Fig 17 se muestra que un 25% del total de PI-G se hidrolizó tras ser sometido a una incubación con la PLC en el tiempo y forma que se describe en Material y Métodos. Sin embargo. considerando que la preparacibn de PLC usada s610 posee una capacidad de hidrólisis del SO%, podría considerarse que alrededor de la mitad del PI-G fue sensible a la hidrólisis con PLC. 5.- EFECTO DE LAS DIFERENTES HORMONAS REGULADORAS DE LA DIFERENCIACION DE LA CELULA GRANULOSA, EN EL CONTENIDO Y RECAMBIO DEL PI-GLICANO a) Efecto de la FSH sobre el contenido y recambio del PI-glicano En la Fig 18, se representan los resultados obtenidos tras administrar a 6 un cultivo de células granulosa (10 /placa) FSH (30 ng/ml), 1,200, 300, 60, 30 y 15 segundos antes de terminar el experimento con TCA 5%. Extraído ei giicuf osf olipido J pwif icv& por crnrnatngraf fa en capa fina. tal y como se describe en Material y MBtodos, no pudo observarse ningún cambio RESULTADOS 72 significativo en la cantidad de PI-G tras la adición de FSH, en ninguno de los tiempos estudiados. En la Fig 19, se representan los efectos sobre la cantidad de glicofosfo- !ipidn existente en células grmdnsa, tratadas can FSU [?O ng/ml! n con el análogo sintético del AMPc, el dibutiril AMPc 1(Bu)#MPcl (0.5 mg/ml). La incorporación de cualquiera de los dos agonistas al cultivo, a los tiempos indicados, induce un aumento en el contenido del lípido, que alcanza un máximo de 10 y 15 veces el control respectivamente, a las 48 horas de tratamiento. La incubación de células granulosa (10'/~laca) con el activador de la Gs, la coleratoxina (Ctx) (0.5 pg/ml), y el (Bu)#MPc (0.5 mg/ml) durante los tiempos indicados en la Fig 20, en presencia de [3~lglucosarnina (25 pCi/rnl), produjo asimismo un aumento en el contenido del lípido que alcanza un máximo a las 72 h, del 440 y 285 % respectivamente, al ser comparada con los controles. b) Efecto de la insulina sobre el contenido en PZ-glicano en células gr anuh su T mrrblqtlne n~gniilnc~ 6 kaa ,,,,,,, ,. ,.,,--,, (10 ./placa.!, mantenidas en cultivo primario en McCoy's 5a y marcadas con [3~lgalactosa (25 pCi/ml) fueron tratadas con inculina (1 mU) durante 1,200, 300, 60, 30 ó 15 segundos antes de añadir TCA al cultivo y extraer y purificar el PI-G, como se describe en Material y Métodos. A los 5 minutos (Fig 21) de iniciado el estimulo pudo observarse una ligera hidrólisis (35%) del lípido, que recupera los niveles basales pasados los 20 minutos de tratamiento con insulina. RESULTADOS 73 c)Efecto del IGF-1 sobre el contenido de PI-glicano en células granulosa Se midieron los efectos del IGF-1 sobre el contenido del glicofosfolipido 6 en células granulosa (10 /placa) marcadas con [ %lgalactosa (25 uCi/ml). El IGF-1 (100 ng/mll se afiadió 1,200, 300, 120, 60, 30 ó 15 segundos antes de terminar el experimento con TCA 10%. Se extrajo y purificó el lípido por crornatografía secuencia1 silicagel, tal y como se describe en Material y Métodos. LO= .--" UYLILUYV~, .l+-rlnr< rupreseritutiv~s de llna serie Le 81 menos tms experimentos, se muestran en la Fig 22. A los cinco minutos de iniciado el estímulo, el IGF-1 indujo una desaparicidn de aproximadamente el 30% del glicof osf olípido que, no recupera sus niveles basales pasados 20 minutos del inicio del experimento. d) Hidrólisis del PI-glicano de células granulosa por hCG La hCG (100 ng/ml) fue añadida en tiempos decrecientes a células granulosa, indiferenciadas o tratadas con FSH (30 ng/ml) durante 48 h para obtener su diferenciación y la expresión de los receptores a LWhCG (Fig 23). Al igual que en experimentos precedentes, la FSH produjo un aumento de aproximadamente 6 veces en la cantidad del lípido marcado con [%Ilgalactosa presente en las células diferenciadas con respecto a las indiferenciadas. La hCG indujo una rápida (60 segundos) y pronunciada i50%j desaparición del lipido, que recuperó sus niveles basales transcurridos cinco minutos de la RESULTADOS 74 iniciación del estímulo. Tal efecto fue observado únicamente en las células diferenciadas. e) Efecto del EGF en el contenido de PI-glicano de la célula granulosa ovárica 6 3 Las cClulas granulosa (10 /placa), fueron marcadas con [ Hlgalactosa (25 pCi/ml). El EGF (10 ng/rnl) se añadió 1,200, 300, 60, 30 ó 15 segundos antes de terminar el experimento con TCA y extraer y cromatografiar los lípidos como se describe en Material y Métodos. En la Fig 24 se representan los resultados obtenidos, que no muestran variación significativa en el contenido del PI-glicano en respuesta al estímulo con EGF f) Efecto del GnRH en el contenido de PI-glicano de célula granulosa ovárica El GnRH M) se afiadió a tiempos decrecientes, desde 1,200 a 15 se6 gundos, a células granulosa (10 /placa) marcadas con ~%l~alactosa (25 ,,r: /-1) ,AV'., "'A,. Tras ser extraído y purificado, el PI-glicano se contó y los resultados se representan en la Fig 25. En ninguno de los tiempos estudiados, el estímulo de la célula con GnRH produjo cambios significativos de su contenido en PI-G. GlcN v GlcN Ac v FIGURA 9.- Hidrólisis ácida de la molécula de PI-glicano marcado previamente con [3~lglucosarnina. Mediante el uso de marcadores se establecia los lugares de migración de las sustancias conocidas. Ino, inositol; GlcN, glucosamina; GlcNAc, Nacetilglucosamina. cm FIGURA 10.- Hidrólisic ácida de la molécula de PI-glicano marcado previamente con [%Ilgalactosa. En trazo dCbil (-1 se muestra la crornatograffa del PIglicano control (no tratado con C1H) y en trazo grueso (-1 la del PI-glicano hidrolizado, Inc, inositol; '(;a, galactosa; D, dioleina. - PI-G DEAMINADO Figura 11.- Tratamiento con ácido nitroso del PI-glicano. Radioactividad asociada a PI-glicana purificado marcado con 13k~~lucasamina y sometido - o no (-1 a tratamiento con ácido nitroso, extraido y cromatografiado en el solvente ácido. Figura 12.- Radioactividad asociada al PI-glicano marcado con [%lgalactosa, extraido y purificado. En trazo ddbil el control (-1, en trazo grueso (-1 el Iípido sometido a tratamiento con ácido nitroso, en ambos casos cromatografiados en TLC con solvente b4sico. -iT-i,$ $4 48 1 7 1 2 TIEMPO (horas1 Figura 13.- Incorporaci6n de [3~lpalmitato (5 pCi/rnl) al PI-glicano contenido 6 en 10 cClulas granulosa, mantenidas en cultivo primario en McCoy'Sa modificado, durante los tiempos indicados. Figura 14.- Incorporaci6n de 13~lrniristata (5 pCi/rnl) al PI-glicano de cdlulas 6 granulosa (10 /placa) mantenidas en cultivo primario en McCoy's 5a modificado, durante los tiempos indicados. -PI-G CONTROL Figura 15.- Hidrblisis con PLA del lipido marcado con I%I-palrnitato. extraí2 do y purificacio. En trazo aéoii (-1 ios conrroies, en trazo grueso i-J el PI-G tratado. PI-G v Figura 16.- Hidrdlisis con PLAl del fosfollpido marcado con [%lmiristato. extraido y purificado. PI-G, fosfatidillnosltoi gllcano; Mi, miristato Figura 17.- Hldr6lisls con PLC especifica de fosfatidilInoslto1 del PI-glicano purificado marcado con [3~lpalrnltato. FIGURA 18.- Efecto de la FSH (30 ng/ml), aííadida a los cultivos a tiempos decrecientes de 1,200 a 15 segundos, sobre el contenido de P1-glicano aislado de 6 cClulas granulosa (10 /placa) marcadas con [%lglucosarnina (25 pCVml). El enpei-iiiieato es icíjie=efitati~~ de üfio serie de u! rrienor: ~CF. Figura 25.- Efecto de GnRH (10 -'M), afiadido a los cultivos a tiempos dccrecientes de 1,200 a 15 segundos, sobre el contenido de PI-glicano aislado de 6 celulas grandosa (10 /placa) marcadas con [%lgalactosa (25 pCi/ml). Se muestra un experimento representativo de una serie de al menos tres. Figura 26.- Efecto de la prolactina (2 pg/rnl) sobre el recambio de PI-G en 6 células granulosa (10 /placa) en cultivo. La PRL fue afladida a tiempos decrecientes (300 a 15 segundos) a c8lulas granulosa pretratadas (.-a) o no (*-a) con (Bu) MPc (0.5 mg/ml) para obtener la induccibn de receptores. 2' Se muestra un experimento representativo de una serie realizada. Figura 27.- Efecto de la cabeza polar del PI-G (1, 5 y 10 nM), aíiadida a cul6 tivos de ctlulas granulosa (10 /placa) durante 48 horas, sobre la actividad del enzima 36-HSD* limitante en la sintesis de progesterona. Figura 28.- Efecto del fosfooligosac~rido (5 nM) obtenido de higado de rata, y la prolactina (2 pg/ml) sobre la actividad del enzima 3P-HSD, basa1 e inducida con (Bu) MPc (0.5 mg/rnl). 2' DISCUSION 78 En el presente trabajo, hemos aislado y caracterizado parcialmente, un fosfatidilinositol glicano (PI-G) de células granulosa indiferenciadas obtenidas por punción folicular de ovario de ratas hembra inmaduras. En las membranas de las células eucariotas existe una gran variedad de fosfolípidos, de los cuales sólo unos pocos son necesarios para constituir la arqiiii~&ii~ UC id bi~apa iipíditid Ue ia membrana. La permanencia en las membranas a lo largo de la evolución de otras formas minoritarias de fosfolipidos ha podido empezar a explicarse recientemente con la asignación a algunos de ellos de un papel, como precursores para la generación de mensajeros intracelulares (IP, DPI o TPI), como responsables de cambios en la fluidez de la membrana, que permitirian o facilitarían fenómenos tan diversos como la movilidad de receptores, los procesos secretores, la entrada de iones al citoplasma o como sistemas de anclaje de proteínas localizadas en la cara externa de las membranas (166,217). Como discutiremos más adelante, el PI-G identificado por nosotros en células granulosa, podria encontrarse entre los fosfolípidos de membrana no estructurales y que tendría, en cambio, una función en los procesos de señalización intracelular. Los datos obtenidos en nuestro laboratorio, utilizando incorporación metabólica de azúcares y ácidos grasos saturados a la molécula del PI-glicano, sugieren que el lípido presente en ias membranas de céiuias g~a-~üiüsa, time una composición semejante al que puede aislarse de hepatocito (169,172,187,- 188), linfocito [193), adipocito (191), células glomerulosa adrenocorticales (194) miocitos BC3H1 (170). La mitad polar de la molécula contiene, tal y como DISCUSION 79 se muestra en las Figs 5 a 7, mioinositol, glucosamina y galactosa. Los tres azúcares se encuentran incorporados a la molécula en una forma especifica y no metabolizada, como lo muestra su recuperación, tras la hidrólisis con ácido clorhídrico del PI-glicano previamente marcado con los correspondientes isótopos. La excepción la constituye la glucosamina, un porcentaje importante de la cual es acetilada antes o después de su incorporación a la molécula del lipido. Usando como control el contenido en glucosamina tras la incorporación con la molécula marcada, los porcentajes de incorporación de los azúcares a la molécula del PI-G, a las 24 horas, permiten aventurar la hipótesis de que la galactosa podría estar en la molécula en una proporción de 4:l con respecto a la glucosamina y al inositol. Esta es una afirmación obviamente relativa, y no puede deducirse, en lo que respecta al mioinositol, de los datos presentados en este trabajo (Figs 5 y 7). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que para ob3~ tener una incorporación apreciable de [ ]mioinositol se hizo necesario utilizar un medio (eí Ham F-lüj, en el que ei azúcar ce encuentra en muy pequeña proporción. Cuando las células se cultivan en McCoy's 5a, la incorporación de [3~lmioinositol es semejante a la obtenida con [%lglucosamina. El glicofosfolípido aislado por nosotros no contiene manosa, lo que permite diferenciarlo de otro gran grupo de fosfolipidos de membrana, los lípidos de anclaje de proteinas, presentes en las membranas de procariontes como el protozoo Trypanosoma Drucei (2i6j, en iús cuales üm pi~teiiiü se eilcue~tru asociada a la parte externa de la membrana, unida covalentemente la porción Cterminal del aminoácido con la etanolamina de una cadena glicosidica que contiene, además, manosa, galactosa, glucosamina e inositol (196). DISCUSION 80 Otras proteínas de superficie presentes en cblulas eucariotas comparten la misma estructura de anclaje con la VSG del T. brucei, Entre ellas se encuentran enzimas hidrolíticos, protefnas pertenecientes al sistema activador del complemento, antígenos de superficie y otras de función desconocida (217). El glicofosfolípido presente en la membrana de las células granulosa, tiene en común con el PI-G de anclaje de todas ellas, la composición de su cabeza polar, excepto en lo que respecta a la presencia de la manosa y probablemente de etanolamina. En cuanto a la estructura de la cadena de azúcares que compone la cabeza polar de ambos tipos de glicofosfolípidos, tanto los de anclaje como aquellos presentes únicamente en células eucariontes y cuya hipotética función es la de precursores de mensajeros intracelulares, poseen una molécula de inositol unida al glicerol con fósforo por un enlace diéster (170,171,192,193). La glucocamina se encuentra unida con un enlace glicosídico al inositol (171,172) y Ires o más moiécuias de gaiaeiüsa (i71,197), piijbab!emezte ';?idas mtrv si per enlaces P-glicosídicos (191), forman la porción terminal de la cadena de los fosfolípidos descritos hasta el presente como asociados con el procesa de ceñalizacibn intracelular. Los fosfolípidos de anclaje tienen, como ya se ha referido, residuos manosa y una etanolamina terminal (196). El glicofosfolipido aislado de células granulosa parece contener el mioinositol esterificado en el alcohol del carbono 3. La informacion acerca ciei lugar que ocupa el rnioinositol en la cadena de oligosac6rid0, se obtuvo funda- DISCUSION 81 mentalmente de los resultados de someter el PI-G a hidrólisis con PLC. Dichos resultados dependen en gran medida de la especificidad y potencia de la preparación de PLC usada. La preparación comercial utilizada por nosotros sólo libera el 50% del inositol de un fosfatidilinositol teóricamente puro, por lo que la hidrólisis corregida de aproximadamente el 50% del PI-glicano aislado de célula granulosa, sitúa a éste en lo que a sensibilidad a PLC se refiere, aproximadamente en la mitad del espectro formado por los glicofosfolipidos aislados de los diferentes tipos celulares. Tal sensibilidad presenta grandes variaciones que incluyen desde el. 100% de hidrólisis observada en el PI-G de anclaje de acetilcolinesterasa de eritrocitos bovinos y porcinos (2171, el 50% en el PI-G de hepatocitos, hepatoma H35 o miocitos BC3H1 (171) o el 14% de sensibilidad a PLC, de un PI-G aislado de linfocitos (193). En algunos casos, como el del PI-G de anclaje de la acetilcolinesterasa a la membrana de eritrocito humano, se ha especulado incluso, con la posibilidad de la existencia de una modificación en el anillo del inositol, consistente en la sustitución del alcohol en la posición 2, por un residuo esterificado de palmftico, lo cual dificultaría el reconocimiento por el centro activo de la PLC especifica de PI (2181, Asf pues, las variaciones en la resistencia del los distintos fosfatidilinositol glicanos a la hidrblisis con PLC, pueden ser explicadas, no 9610 por diferencias en la potencia del enzima utilizado, sino por la existencia de pequeños cambios en la estructura de la molécula del lípido que lo hacen insensible a la PI-PLC, sin que ésto implique renunciar a la hipótesis de que la DISCUSION 82 forma de unión entre la cadena de oligosacáridos que conforman la cabeza polar y la mitad glicerol diacilo sea un enlace diéster entre el fósforo del mioinosito1 y el alcohol del carbono 3. Por tanto, el porcentaje de hidrólisis obtenido con el lípido aislado de célula granulosa, sugiere que es un fosfatidilinositol. En el fosfatidilinositol glicano que constituye el anclaje a la membrana de la glicoproteina variante de superficie (VSG) del T. brucei (216) y en los PI-glicanos sensibles a insulina del hepatocito, adipocito, miocito BC3H1 y hepatoma H35 (170-172,191), la glucosamina se sitúa entre el mioinositol y la galactosa y demás componentes de la cabeza polar del lípido. La posición de la glucosamina y la existencia de un enlace glicosídico entre ésta y el mioinositol, puede demostrarse parcialmente, tras someter al lipido a la acción del ácido nitroso, que libera el terminal amino libre de la glucosamina, y rompe simultáneamente cualquier enlace glicosidico adyacente (216). El PI-glicano aislado por nosostros de célula granulosa, sometido a tratamiento con ácido nitroso, se dearnina en un porcentaje del 30 % del total. Existen diferencias enel grado de sensibilidad a la deaminación de los distintos PI-G aislados hasta el presente. Al igual que en el caso de la sensibilidad a PLC tales diferencias se mueven en un arco muy amplio que va desde la inactivacibn absoluta de la estructura que compone la cabeza polar tras la deaminación hasta pequedas rupturas de tan sólo el 15%. En la mayor parte de los casos, se atribuye la imposibilidad relativa del ácido nitroso para transformar en PI la moldcula de PI-glicano, a la acetilación de la molécula de glucosamina de una proporción importante del lípido, lo DISCUSION 89 limitante de la síntesis de progesterona, la 3P-HSD. Una dosis suficiente de dicha cabeza polar es capaz asimismo de prevenir la inducción del enzima por FSH o AMPc (Fig 28). El efecto es idéntico al obtenido con PRL, si bien en células indiferenciadas, la ausencia de receptores a la hormona, hace que la disminución de la actividad del enzima sea poco apreciable. Con estos datos no parece aventurado afirmar que el PI-G aislado de célula granulosa es seguramente idéntico al aislado de higado, y que tras ser aumentado su contenido en la membrana de células granulosa por la FSH, e inducidos por esta los receptores de PRL, la PRL al unirse a su receptor induce la generación a partir del PI-G de un mensajero intracelular, que media su efecto sobre la síntesis de progesterona en la célula diferenciada. Sin embargo, esta legitima conclusión, tiene un reverso inquietante y contradictorio cuando se comparan efectos biológicos y efectos sobre el recambio del PI-G de la PRL y la hCG, tal y como ya se ha sugerido antes. Si la PRL genera POS a partir del lipido, y el oligosacárido tiene un efecto inhibitorio sobre la síntesis de progesterona, como la hCG/LH, cuyo efecto sobre dicha síntesis es franca y definitivamente estimulante (el rasgo funcional más relevante de la luteinización es la gran producción de progesterona que tiene lugar durante el proceso), también induce la hidrólisis del PIG y supuestamente la liberación de su cabeza polar. En otros tejidos de los que se han aislado PI-glicanos, ha sido posible identificar más de una forma de estos fosfolípidos (170,171,1901, diferenciables entre sí por s~ resistencia al tratamiento con PLC. a la deaminación O incluso por el carhcter acilo o alquilo de la unián entre el ácido graso del DISCUSION 90 carbono 2 y el glicerol. Hasta el momento, no tenemos más que vagos indicios de la existencia de más de un PI-G en la membrana de la célula granulosa, Tales indicios consisten en la detección de dos picos claramente diferenciados de PI-G que aparecen sólo cuando el lipido ha sido marcado con los dcidos graso~, y no cuando se marca con alguno de los azúcares, Si en el futuro la profundización de los estudios ya comenzados en nuestro laboratorio, acerca de la posible existencia de más de un PI-G en la célula granulosa tuvieran éxito, y tales PI-G fueran aislados, y definidas sus diferencias estructurales, ésta podrfa ser la explicación a la paradoja, quizá s610 aparente, con la que nos enfrentamos en este momento. Si asi fuera, habremos caracterizado el tercer mensajero intracelular para la LH/hCG en célula granulosa. Mientras tanto, creemos que no es aventurado ni imprudente afirmar que la cabeza polar del PI-G aislado de célula granulosa, y similar al de hepatocito, es el primer mediador intracelular de la PRL en c6lula granulosa ovárica descrito hasta el momento. CONCLUSIONES 92 1.- El cultivo primario de c6lulas granulosa, obtenidas de ratas inmaduras tratadas con DES está formado por ctlulas en un estadio homdgeneo de indiferenciación, Tratadas con FSH, alguno de los generadores de AMPc o sus análogos sintéticos, presentan características morfofuncionales de diferenciacibn. 2.- De las células granulosa indiferenciadas se ha aislado, purificado y caracterizado, un fosfatidilinositol glicano, análogo a otros descritos en la l iteratiira. 3.- El esqueleto de dicho PI-glicano está formado por glicerol con dos ácidos grasos saturados, palmitico y mirlstico, esterificados con el alcohol de los carbonos 1 y 2. El palmitato se incorpora a la molécula en una proporción 6:l con respecto al miristato, 4.- El alcohol del carbono 3 se encuentra unido por un enlace diéster, a través de fósforo, con una cadena de oligosacáridos. 5.- La cadena de oligosacáridos nombrada contiene mioinositol, glucosamina y galactosa, esta última en proporcidn 4:l respecto al mioinositol y la glucosamina. 6.- Una porcidn importante de la glucosamina que compone la cabeza polar, se encuentra posiblemente acetilada, lo que explica la relativa resistencia a la hidrblisis con ácido nitroso. CONCLUSIONES 9 3 7,- La hormona folículo estimulante (FSH) o su mensajero intracelular, el AMPc, aumentan el contenido en el lipida asociado a la membrana, probablemente como una más de sus acciones diferenciadoras en estas c6lulas. 8.- El PI-glicano es hidrolizado en una pequeña proporción (alrededor del 30%) por la insulina y el IGF-1, al igual que nciirre en otros tejidos. 3.- Hasta un SCiX dei giicoioaioiípido sufre niaróiisis en respuesta a ia hCG/LH lo que permite suponer que alguna de los productos de dicha hidrblisis es uno de los mensajeros de la hCG/LH en célula granulosa ovárica. 10.- La Prolactina induce una rápida hidrólisis seguida de un aumento no menos rápido de la síntesis del glicofosfolípido. Este es el primer cambio descrito de un putativo segundo mensajero en respuesta a la prolactina en alguno de sus tejidos diana. 11.- El fosfooligosacárido obtenido de hígado por hidrdlisic con PLC, reproduce alguno de los efectos biológicos de la PRL en célula granulosa ovárica. 12.- Ningún otro de los agonistas hormonales estudiados con efectos sobre la diferenciación de la celula granulosa ovárica, produce cambios en el contenido o recambio del fnsfatidilinositol glicano estudiado. BIBLIOGRAFIA 95 1.- BJERSING L., CARSTENSEN H.: The role of the granulosa cell in the biosynt hesis nf ovarian it~roid hn~m~nes, Ri~chgm &~pl,p !,cta. ,06, G33-&G, 1964. 2. - ERICKSON G.F., HSUEH A. J.W.: Stimulation of aromatase activity by follicle-stimulating hormone in rat granulosa cells in vivo and in vitro. Endocrinology. 102, 1275-1282, 19'18. 3.- AMSTERDAM A., ROTMENSCH S.: Structure-function relationships during granulosa cell differentiation. 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