Optimización de procesos fermentativos de batata en almíbar

Universidad de Sevilla Escuela Politécnica Superior de Sevilla Trabajo de Fin de Máster en Tecnología e Industria Alimentaria OPTIMIZACIÓN DE PROCESOS FERMENTATIVOS DE BATATA EN ALMÍBAR Autor Diana Mileidy Pinzón Mateus Tutores María de la Montaña Durán Barrantes Carlos Medina Morillas Marzo de 2025, Sevilla 2 Agradecimientos Primeramente, quiero darle las gracias a Dios por permitirme y darme la vida para ir a España a realizar mis estudios de máster, sin su bendición esto no hubiera sido posible. También quiero agradecer enormemente a mi mamá, quien me acompañó durante este camino, con su cariño y soporte pude enfrentarme a muchas adversidades que juntas pasamos. A mi hermana y mi sobrina, por ser esa ayuda en los días donde no veía solución alguna ya que ellas me motivaban a seguir siempre adelante. Por último, quiero agradecerles a mis tutores, los doctores María de la Montaña y Carlos, por su tiempo, conocimiento y ayuda, siempre me brindaron orientación cuando estaba realizando la parte experimental y la parte escrita de este trabajo, además tenían siempre una buena actitud lo cual permitió que todo este trabajo se realizara de forma exitosa. 3 Contenido Índice de Tablas .............................................................................................................................. 5 Índice de Figuras ............................................................................................................................ 5 Índice de Gráficas .......................................................................................................................... 6 Resumen ........................................................................................................................................... 7 1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN .................................................................................. 8 2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 10 2.1. Batata ........................................................................................................................... 10 2.2. Gránulos de Kéfir de Agua..................................................................................... 11 2.3. Fermentación espontánea ..................................................................................... 13 2.4. Fermentaciones con kéfir de agua ...................................................................... 14 3. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 16 3.1. Objetivo General ............................................................................................................. 16 3.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 16 4. MATERIALES, TÉCNICAS Y MÉTODOS ......................................................................... 17 4.1. Materiales ............................................................................................................. 17 4.2. Técnicas para análisis fisicoquímicos en los procesos fermentativos ........... 18 4.2.1. Acidez Total .................................................................................................................. 18 4.2.2. Materia seca soluble (M.S.S.) ................................................................................... 18 4.2.3. Densidad Relativa ....................................................................................................... 19 4.2.4. pH ................................................................................................................................... 19 4.3. Técnicas para análisis Microbiológico en los procesos fermentativos .......... 19 4.3.1. Densidad Óptica .......................................................................................................... 20 4.3.2. Siembras en medio y conteo ..................................................................................... 20 4.3.3. Tinción de Gram y observación en microscopio (Bacterias) ................................ 20 4.3.4. Tinción de Levaduras .................................................................................................. 20 4.4. Técnicas de caracterización filogenética de los microorganismos obtenidos de la fermentación espontánea ................................................................................. 21 4.4.1. Extracción de ADN ...................................................................................................... 21 4.4.2. Amplificación del ADN mediante PCR ..................................................................... 21 4.4.3. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ............................................................... 22 4.4.4. Purificación y concentración de ADN ....................................................................... 22 4.4.5. Secuenciación ADN para determinación filogenética ............................................ 22 4.4.6. Búsqueda de secuencia bases de datos BLAST ................................................... 22 4 4.5. Métodos ............................................................................................................... 23 4.5.1. Diseño Experimental (Diseño factorial completo) .................................................. 23 4.5.2. Montajes de fermentación espontánea y fermentación dirigida con kéfir .......... 24 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 26 5.1. Análisis fisicoquímicos en los procesos fermentativos ................................... 26 5.2. Resultados del Diseño de Experimentos ........................................................... 31 5.3. Conteo de placas, Observación y Tinción de Bacterias y Levaduras ............. 40 5.4. Electroforesis ...................................................................................................... 46 5.4.1. Electroforesis de ADN de Bacterias y Levaduras .................................................. 46 5.4.2. Electroforesis de ADN de Levaduras (segunda y tercera lectura) ...................... 47 5.5. Búsqueda de secuencias de ADN en BLAST .................................................... 49 5.5.1. Secuenciación y comparación Bacteria 1 ................................................................ 50 5.5.2. Secuenciación y comparación Bacteria 2 ................................................................ 51 6. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 53 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 55 5 Índice de Tablas Tabla 1. Parámetros operación termociclador .................................................................. 21 Tabla 2. Diseño experimental de Fermentaciones de Batata ........................................... 23 Tabla 3. Valores medios acidez total ............................................................................... 27 Tabla 4. Análisis estadístico experiencias 9 y 15 ............................................................. 31 Tabla 5. Ecuaciones de regresión 2 días de Fermentación .............................................. 34 Tabla 6. Resumen del modelo ......................................................................................... 34 Tabla 7. Ecuaciones de regresión 4 días de Fermentación .............................................. 36 Tabla 8. Resumen del modelo ......................................................................................... 37 Tabla 9. Optimización para máximo grado de acidez. ...................................................... 39 Tabla 10. Conteo placas de siembra por experiencia....................................................... 40 Tabla 11. Observación y Tinción de Bacterias y Levaduras ............................................. 42 Índice de Figuras Figura 1. Batata ............................................................................................................... 11 Figura 2. Gránulos de Kéfir de agua ................................................................................ 13 Figura 3. Producción de bebida de kéfir ........................................................................... 15 Figura 4. Montajes Fermentación Batata ......................................................................... 25 Figura 5. Diagrama de Pareto efectos estandarizados ..................................................... 32 Figura 6. Diagrama de cajas y bigotes acidez en fermentación espontánea y dirigida con Kéfir ................................................................................................................................. 32 Figura 7. Análisis de Varianza – 2 días de Fermentación ................................................ 33 Figura 8. Diagrama de Pareto efectos estandarizados ..................................................... 34 Figura 9. Superficies de respuesta Acidez 2 días de Fermentación espontánea.............. 35 Figura 10. Superficie de respuesta Acidez 2 días de Fermentación dirigida con kéfir ...... 35 Figura 11. Análisis de Varianza 4 días de Fermentación ................................................. 36 Figura 12. Diagrama de Pareto 4 días de Fermentación .................................................. 37 Figura 13. Superficie de respuesta acidez 4 días de Fermentación espontánea .............. 38 Figura 14. Superficie de respuesta acidez 4 días de Fermentación dirigida con Kéfir ...... 38 Figura 15. Placas de siembra medios YPD y LS Fermentación espontánea .................... 41 Figura 16. Placas de siembra medios YPD y LS Fermentación dirigida con kéfir ............. 41 Figura 17. Electroforesis extracción ADN Bacterias (izquierda) y Levaduras (derecha) ... 47 Figura 18. Electroforesis extracción ADN Levaduras – segunda lectura .......................... 48 6 Figura 19. Electroforesis extracción ADN Levaduras – tercera lectura ............................. 49 Figura 20. Secuencia filogenética Bacteria 1 ................................................................... 50 Figura 21. Comparación en BLAST secuencia filogenética para Bacteria 1 ..................... 50 Figura 22. Secuencia filogenética Bacteria 2 ................................................................... 51 Figura 23. Comparación en BLAST secuencia filogenética Bacteria 2 ............................. 52 Índice de Gráficas Gráfica 1. Acidez Total Fermentación espontánea ........................................................... 26 Gráfica 2. Acidez Total Fermentación dirigida con kéfir ................................................... 26 Gráfica 3. Densidad Relativa Fermentación espontánea ................................................. 27 Gráfica 4. Densidad Relativa Fermentación dirigida con Kéfir .......................................... 27 Gráfica 5. pH Fermentación espontánea.......................................................................... 28 Gráfica 6. pH Fermentación dirigida con Kéfir .................................................................. 28 Gráfica 7. Materia seca soluble Fermentación espontánea .............................................. 29 Gráfica 8. Materia seca soluble Fermentación dirigida con Kéfir ...................................... 29 Gráfica 9. Densidad Óptica Fermentación espontánea .................................................... 30 Gráfica 10. Densidad Óptica Fermentación dirigida con Kéfir .......................................... 30 7 Optimización de procesos fermentativos de batata en almíbar Resumen Los alimentos fermentados son unos de los alimentos funcionales con mayor importancia en la dieta alimenticia debido a que tiene propiedades nutricionales únicas, además el proceso fermentativo hace que se produzcan cambios en la textura, sabor y la digestibilidad del alimento. Por esto, en el presente estudio de investigación a partir del diseño experimental en donde se tomaron dos factores numéricos y un factor categórico se lograron conocer las condiciones óptimas y obtener la mayor cantidad de acidez en procesos fermentativos espontáneos y dirigidos con kéfir de agua, de la batata en almíbar, con lo cual se obtuvo que al añadir de 3,71% de azúcar y 50g de batata se pueden obtener de acidez total 0,1022 mol/L a los dos días y 0,10728 mol/L a los cuatro días de fermentación Palabras Clave: Batata, gránulos de kéfir, fermentación espontánea, fermentación dirigida con kéfir. Optimization of sweet potato fermentation process in syrup Abstract: Fermented foods are one of the most important functional foods in the diet because they have unique nutritional properties, and the fermentation process changes texture, flavor and digestibility of the food. Therefore, in the present research, based on the experimental design where it was taken two numerical factors and one categorical factor, it was possible to know the optimal conditions for obtaining the highest amount of acidity in spontaneous fermentation and fermentation with kefir of sweet potato in syrup, with which it was obtained that by adding 3.71% sugar and 50g of sweet potato, a total acidity of 0.1022 mol/L can be obtained after two days and 0.10728 mol/L after four days of fermentation. Keywords: Sweet potato, kefir granules, spontaneous fermentation, fermentation with kefir. 8 1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN Los alimentos fermentados son catalogados por tener un potencial beneficioso para la salud debido a que cuentan con propiedades prebióticas y probióticas. En la actualidad se considera que la mayoría de la población está migrando a la ingesta de alimentos saludables, además se ha evidenciado que en los últimos años los consumidores están interesados en alimentos funcionales que no provengan de fuentes lácteas, debido a los efectos alérgicos que estos pueden tener en la salud huma (Yerlikaya & Kinik 2022). Por lo tanto, como respuesta a esta gran necesidad ha emergido la producción de alimentos y bebidas fermentadas sin la presencia de productos lácteos, es aquí donde las industrias han buscado otras fuentes para obtener alimentos de calidad y de alto valor nutricional, sin recurrir a la integración de sustitutos ni compuestos dañinos para la salud humana. Los gránulos de kéfir de agua, son uno de los ingredientes que ha ganado bastante atención mundialmente. Cuenta con cultivos simbióticos de bacterias y levaduras en una matriz de polisacáridos, dichos gránulos usan como fuente de carbono azúcares, frutas y vegetales dentro de sus procesos fermentativos, haciendo variar sus metabolitos y, por ende, las propiedades nutricionales del líquido de kéfir, las cuales pueden ir desde promover la salud intestinal hasta reforzar el sistema inmunológico (Esatbeyoglu et al. 2023). La adaptabilidad de los gránulos de kéfir de agua a diferentes matrices de alimentos lo hace versátiles para la producción de bebidas fermentadas y alimentos. La bebida resultante de esta fermentación es refrescante, con bajo contenido de azúcar, levemente acida, carbonatada y con un bajo contenido de alcohol (Wen et al. 2024). Por otro lado, desde tiempo antiguos se conocen técnicas tradicionales para la producción de alimentos fermentados, en donde se utilizan los microorganismos autóctonos del medio, como por ejemplo el kéfir, kimchi, miso y entre otros; gracias a los microorganismos presentes se produce su transformación. Por esto, en este estudio se pretende o realizar una comparación de ambos procesos fermentativos, por un lado evaluando la fermentación espontánea realizada por los microorganismos autóctonos provenientes de la batata y por el otro analizando la fermentación dirigida con gránulos de kéfir de agua, por lo que se analizaron diversos criterios fisicoquímicos como acidez total, densidad relativa, pH, materia seca soluble y 9 otros aspectos microbiológicos como la densidad óptica, todo esto para estudiar el comportamiento y optimización de ambos procesos fermentativos. 16 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General  Evaluar las condiciones de fermentación, mediante método espontáneo y dirigido con kéfir, de la batata en almíbar a 28ºC. 3.2. Objetivos específicos  Estudio de la evolución de parámetros fisicoquímicos como pH, materia seca soluble, acidez total y densidad relativa, para confirmar el desarrollo y evolución en ambos tipos de fermentaciones.  Evolución de la densidad óptica para confirmar el crecimiento microbiológico.  Estudio de caracterización microbiológica mediante siembras de cultivos microbianos en medios enriquecidos.  Mediante un Diseño Central Compuesto de experimentos, se buscan las condiciones óptimas de acidez, desde el punto de vista de la concentración de azúcares en el almíbar y la cantidad de batata, en ambos procesos fermentativos, espontáneo y dirigido con kéfir de agua. 17 4. MATERIALES, TÉCNICAS Y MÉTODOS A continuación, se indican la materia prima, materiales utensilios, equipos, técnicas y métodos, utilizados para las fermentaciones realizadas en el presente trabajo de investigación durante la evaluación de cada una de las experiencias, de acuerdo con el diseño experimental. 4.1. Materiales Materia Prima (Procesos Fermentativos Espontáneo y dirigido con Kéfir)  Batata, origen España  Azúcar moreno, marca HACENDADO  Agua potable  Cultivo vivo de Kéfir de agua (Lactobacillus hordei, Leuconostoc mesenteroide, Leuconostoc citreumentre otros), marca Kefiralia Utensilios  Cuchillo de cocina  Tabla de cocina  Rallador  Envases de vidrio con volumen de 212 ml, con tapa metálica twist off. Equipo y material de laboratorio  Autoclave  Cámara de incubación de 28°C  pH metro  Refractómetro (ºBrix)  Balanza de precisión  Espectrofotómetro  Matraz aforado 1000 y 100 ml  Vasos de precipitado 500ml  Picnómetro  Bureta de 10 ml  Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) 0,5 M 18  Fenolftaleína  Agua destilada  Agua estéril  Eppendorf  Medios de cultivo TSA, YPD y LS (placas de Petri)  Micropipeteadores  Puntas para Micropipeteadores  Vórtex 4.2. Técnicas para análisis fisicoquímicos en los procesos fermentativos Los análisis indicados abajo fueron realizados para confirmar, por medio de métodos fisicoquímicos, la evolución de los procesos fermentativos, tanto de manera espontánea como dirigida con kéfir, a diferentes concentraciones de solución 2,5%, 3,75% y 5% y diferentes cantidades de masa de batata (25g, 37,5g y 50g). 4.2.1. Acidez Total Para la determinación de la acidez se tomó una alícuota de 25 ml de la muestra en un Erlenmeyer de 250ml, la cual se valoró empleando una solución de Hidróxido de sodio (NaOH), concentración 0,5 M y fenolftaleína como reactivo indicador (viraje entre pH:8,2 y 10) hasta un pH en torno a 8,4, mediante la incorporación del pH metro para tener mayor exactitud en la lectura. Debido a que no existe un ácido predominante en las fermentaciones, el dato de Acidez Total se dará en mol/L, de acidez generada. 4.2.2. Materia seca soluble (M.S.S.) En cuanto a la determinación de materia seca soluble se empleó un refractómetro manual marca ATAGO N-1, escala de 0 a 32 °Brix, con precisión de 0,5 °Brix. La medición se realizó colocando una pequeña gota de la muestra en el prisma del instrumento y por medio de la lente ocular se hizo la lectura. 19 4.2.3. Densidad Relativa Para la determinación de la densidad relativa, se empleó un picnómetro Afora de 25ml y una balanza analítica marca RADWAG modelo AS 220.R2 en donde se procedió con su pesaje y se hizo su comparación con la densidad del agua. 4.2.4. pH En cuanto a la determinación del potencial de hidrogeno se empleó un pH metro digital marca METRIA, modelo M21, con un rango de medición de 0 a 14 y una precisión de 0,01 unidades. Las mediciones fisicoquímicas indicadas anteriormente en las fermentaciones espontáneas fueron realizadas antes de colocar los frascos en la cámara de incubación, luego, se realizaron estas mismas mediciones los 2 (dos) días de fermentación y, por último, a los 4 (cuatro) días de estudio. Mientras que, en las fermentaciones dirigidas con kéfir, las mediciones de parámetros fisicoquímicos se realizaron al líquido de kéfir una vez fueron retirados los gránulos de kéfir de agua ,para confirmar si había presencia de microorganismos responsables en un proceso de fermentación inicial en cada una de las soluciones de almíbar, para luego agregar la batata en cada frasco, las mediciones fueron ejecutadas normalmente como en la fermentación espontánea, a los 2 (dos) y 4 (cuatro) días de fermentación. 4.3. Técnicas para análisis Microbiológico en los procesos fermentativos Una vez efectuados los diferentes análisis fisicoquímicos, se emplearon diversas técnicas analíticas microbiológicas para determinar e identificar los microorganismos responsables de las fermentaciones, por lo que se realizaron las siguientes determinaciones: 20 4.3.1. Densidad Óptica Para la caracterización del crecimiento microbiano se utilizó el Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific Genesys 20 Modelo 4001/4, las lecturas de absorbancia de las alícuotas tomadas se realizaron a una longitud de onda de 660 nm. 4.3.2. Siembras en medio y conteo Para las siembras en medio de cultivo se realizaron diluciones seriadas en medio estéril de las alícuotas que se tomaron el último día de cada una de las experiencias (cuarto día), de manera que la concentración de microorganismos se va diluyendo para poder realizar el conteo en cada una de las cajas de Petri mediante el uso del contador de colonias LBX CC100 Colony Counter. Los medios de siembra empleados para la determinación de bacterias fueron indistintamente TSA, y LS (según disponibilidad) y para levaduras YPD. Los medios fueron adquiridos en Sigma y preparados según las indicaciones del fabricante. 4.3.3. Tinción de Gram y observación en microscopio (Bacterias) Seguidamente del crecimiento de los microorganismos en las placas de siembra, se procedió a realizar la identificación de las bacterias como gramnegativas o grampositivas. Para esto, se tomaron muestras de las colonias más representativas de las placas que fueron sembradas, realizándose un frotis bacteriano el cual se puso en el portaobjetos, dichas muestras fueron observadas en el microscopio Leica DM 300 empleando aceite de inmersión y una lente de 100X, Para conocer si las bacterias eran grampositivas o gramnegativas se utilizó el método de tinción de Gram que, por medio de emplear cristal violeta, lugol, alcohol al 96°, agua y safranina se puede determinar su clasificación. 4.3.4. Tinción de Levaduras En cuanto a la identificación de levaduras, se tomaron muestras de las colonias de las placas de Petri designadas como levaduras, las cuales también fueron 21 observadas mediante el uso del microscopio Leica DM 300, teñidas con azul de metileno y observadas con aceite de inmersión con la lente de 100X. Cabe aclarar que en esta tinción solamente se pueden visualizar las levaduras muertas. 4.4. Técnicas de caracterización filogenética de los microorganismos obtenidos de la fermentación espontánea 4.4.1. Extracción de ADN Para la extracción del ADN de los diferentes microorganismos, se empleó el kit de la casa (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. 4.4.2. Amplificación del ADN mediante PCR Luego de obtener el ADN de los microorganismos responsables en las fermentaciones espontaneas, se llevó a cabo la ampliación del mismo mediante reacciones en cadena de Polimerasa (PCR) para obtener gran cantidad del fragmento de ADN en cuestión, haciendo uso del kit PCR Clean-UP System (Promega) junto con sus instrucciones, mediante el termociclador de la marca comercial BIO RAD T100™ Thermal Cycler. Para la amplificación del ADN en cuestión se usó la enzima ADN polimerasa, la cual genera varias copias de una parte determinada de ADN. Luego de las moléculas de ADN se amplifican el ARN ribosómico mediante el uso de primers 16S para Bacterias y 18S para Levaduras, los cuales se unen a las secuencias complementarias del ADN que se va a amplificar. Los procesos de PCR se realizan en el equipo termociclador anteriormente mencionado, los ciclos realizados se indican en la tabla 1, los ciclos del 2 al 4 se ejecutan 35 veces en el equipo. Dicha información es ingresada en el equipo una vez se dispone de los fragmentos de ADN Tabla 1. Parámetros operación termociclador Ciclo Temperatura (°C) Tiempo 1 95 3 min. 22 2 95 30 segundos 3 65 30 segundos 4 72 1 min. 5 72 5 min. 4.4.3. Electroforesis de ADN en gel de agarosa Mediante esta técnica se puede hacer la identificación y separación del ADN, en función del tamaño y carga molecular. Las moléculas cargadas negativamente se desplazan a lo largo de la superficie del gel de agarosa al 1% y junto a los marcadores de peso molecular de ADN a los cuales se les aplicó un voltaje entre 25 a 100V haciendo uso del equipo Mupid®- One Avanced. Luego de la electroforesis, se tiñe el gel de agarosa con el agente intercalante BrEt (Bromuro de Etidio) para la visualización del ADN cuando la muestra se expone a la luz ultravioleta (360 nm) emitida por el equipo BIO RAD Molecular Imager® Gel Doc™ XR+, además de obtenerse un registro fotográfico del desplazamiento y concentración de las moléculas en el gel de agarosa. 4.4.4. Purificación y concentración de ADN Para la purificación y concentración del ADN se utilizó el kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) junto con las instrucciones que brinda el fabricante del kit comercial. 4.4.5. Secuenciación ADN para determinación filogenética Los fragmentos de ADN fueron secuenciados por un laboratorio externo a la universidad y mediante el uso de terminadores fluorescentes se puede conocer cuál es la base nitrogenada que le corresponde, para hacer la formación de la hélice. 4.4.6. Búsqueda de secuencia bases de datos BLAST Una vez se tiene la secuenciación del ADN de los microorganismos en cuestión, se realiza la búsqueda en la base de datos en donde se hace una comparación con 23 secuencias de ADN similares y de esta manera se puede determinar qué tipo de microorganismo son los responsables de dichos procesos fermentativos. La base de datos usada para tal fin es la base publica NCBI (por sus siglas en inglés, National Center for Biotechnology Information), que mediante su programa BLAST, permite realizar la comparación. 4.5. Métodos 4.5.1. Diseño Experimental (Diseño factorial completo) En el presente trabajo de investigación se empleó la metodología D.O.E. (Design of Experiments), concretamente, el método de Superficie de Respuesta, con el que se estudia la interacción entre 3 factores: 2 factores numéricos (concentración de azúcar en el almíbar y concentración de batata) y un tercer factor categórico (tipo de fermentación, espontánea, o bien, dirigida con kéfir). Para cada uno de dichos factores numéricos se aplican 3 niveles o valores:  2,5%, 3,75% y 5%, para la concentración de azúcar en el almíbar  25%, 37,5% y 50%, para la concentración de batata Haga clic o pulse aquí para escribir texto. Haga clic o pulse aquí para escribir texto.A continuación, se muestra la tabla arrojada por el programa estadístico Minitab sobre el diseño de experimento para este trabajo de investigación, consistente en 20 experiencias que se realizarán de forma aleatoria para amortiguar el error humano. Tabla 2. Diseño experimental de Fermentaciones de Batata OrdenEst PtCentral Azúcar % Batata g/tarro Fermentos 1 1 2,5 25 Espontáneo 2 1 5 25 Espontáneo 3 1 2,5 50 Espontáneo 4 1 5 50 Espontáneo 5 1 2,5 25 Kéfir 6 1 5 25 Kéfir 7 1 2,5 50 Kéfir 8 1 5 50 Kéfir 9 1 2,5 25 Espontáneo 10 1 5 25 Espontáneo 11 1 2,5 50 Espontáneo 24 12 1 5 50 Espontáneo 13 1 2,5 25 Kéfir 14 1 5 25 Kéfir 15 1 2,5 50 Kéfir 16 1 5 50 Kéfir 17 0 3,75 37,5 Espontáneo 18 0 3,75 37,5 Kéfir 19 0 3,75 37,5 Espontáneo 20 0 3,75 37,5 Kéfir 4.5.2. Montajes de fermentación espontánea y fermentación dirigida con kéfir Se prepararon disoluciones de almíbar al 2,5%, 3,75% y 5%, empleando azúcar moreno y agua potable. Por otra parte, se lavó la batata retirando solamente los restos de tierra, a continuación, fue cortada en bastones delgados y, posteriormente, pesados de acuerdo con cada una de las experiencias a evaluar, tal y como se indica en el diseño experimental. Se colocaron las masas de batata en los frascos de vidrio añadiéndoles a cada frasco 100 ml de disolución de almíbar para las experiencias de fermentación, En cuanto a las fermentaciones dirigidas con kéfir, se tomaron las disoluciones de almíbar anteriormente dichas para realizar el proceso de fermentación con los gránulos de kéfir dos días antes para luego ser empleados en las experiencias bajo esta condición. En cada frasco se dejó un espacio de cabeza de 2 a 3 cm para la generación de CO2 proveniente del proceso fermentativo. Luego de rellenar los frascos de vidrio con la masa de batata y el almíbar correspondiente, de acuerdo con la experiencia a evaluar, se realizaron las mediciones iniciales de los distintos parámetros fisicoquímicos, así como de densidad óptica para confirmar la presencia de microorganismos. Seguidamente, fueron puestos en la cámara de incubación a 28°C, en donde permanecieron hasta que se realizaron los análisis propuestos, tanto para el segundo día (48 horas de fermentación) y el cuarto día (96 horas de fermentación) de experimentación. 25 Figura 4. Montajes Fermentación Batata Fuente: Elaboración propia 32 Figura 5. Diagrama de Pareto efectos estandarizados En el diagrama de Pareto (Figura 5.) se pueden observar las frecuencias de ocurrencia más altas junto con las frecuencias de ocurrencia más bajas de los escenarios aquí evaluados. Ello implica un nivel significativo de aceptación para los factores “cantidad de batata” y “tipo de fermentación” Figura 6. Diagrama de acidez en fermentación espontánea y dirigida con Kéfir En este diagrama se puede apreciar que la fermentación espontánea muestra un mejor resultado en la producción de acidez. 33 No obstante, para buscar una mejor aproximación de un modelo estadístico lineal, se deciden eliminar ambas experiencias 9 y 15, para volver a plantear el estudio estadístico, ahora con 18 experiencias, obteniéndose valores de R2 superiores al 90%, y bastante aproximados a su correspondiente R2adj, ya sea para la respuesta de la producción de acidez total a los 2 días como a los 4 días. Seguidamente de realizar los ajustes al modelo estadístico lineal, se realiza un análisis de varianza para los dos días de fermentación, tanto espontanea como dirigida con kéfir, el cual se puede observar en la Figura 7, así como su diagrama de Pareto correspondiente (Figura 8). Como se observa por los valores de p (probabilidad de obtener los valores observados, con un nivel de significancia del 95%), para el factor %azúcar, así como para la multiplicación de %azúcar con % Batata y %azúcar con tipo de fermentación, no hay suficiente evidencia para firmar que existen diferencias significativas. Pero, los factores %batata y el tipo de fermentación sí son significativos. Es decir, la cantidad de batata y la fermentación son los que afectan, principalmente, al proceso estudiado. Figura 7. Análisis de Varianza – 2 días de Fermentación Partiendo de este análisis se puede obtener la ecuación de regresión en unidades no codificadas para ambos escenarios, la cual se muestra a continuación (Tabla 5): 34 Tabla 5. Ecuaciones de regresión 2 días de Fermentación Fermentos (2 día) Espontáneo AV −1,87 + 1,822 Azúcar% + 0,0777Batata g tarro − 0,2240 Azúcar% ∗ Azúcar% − 0,00314 Azúcar% ∗ Batata g tarro Kéfir AV −0,96 + 1,774 Azúcar% + 0,0357 Batata g tarro − 0,2240 Azúcar% ∗ Azúcar% − 0,00314 Azúcar% ∗ Batata g tarro Figura 8. Diagrama de Pareto efectos estandarizados Resumen del modelo Tabla 6. Resumen del modelo S R2 R2 (ajustado) R2 (pred) 0,209122 95,74% 92,76% 86,04% Seguidamente se podrán observar en las figuras 9 y 10, las superficies de respuesta luego de dos días de experimentación para cada uno de los escenarios 35 evaluados, en donde se aprecia la presencia de un máximo (curvatura ascendente) para ambos casos Figura 9. Superficies de respuesta Acidez 2 días de Fermentación espontánea Figura 10. Superficie de respuesta Acidez 2 días de Fermentación dirigida con kéfir 36 A continuación, se muestran los valores estadísticos del estudio de superficie de respuesta para la fermentación a los 4 días, cuyo análisis de varianza (Figura 11) muestra como significativo, al igual que antes, la cantidad de batata y el tipo de fermentación. Sin embargo, donde a los 2 días daba un valor significativo de p para la interacción %batata con fermentación, ahora ya ha perdido ese nivel de significancia, como ya pasaba en los demás tipos de interacciones desde el estudio a 2 días. Esto se puede ver más claramente en el diagrama de Pareto (Figura 12). Figura 11. Análisis de Varianza 4 días de Fermentación Por otra parte, también se obtuvo la ecuación de regresión en unidades no codificadas para los cuatro días de experimentación, para cada una de las fermentaciones, las cuales se indican en la Tabla 7 : Tabla 7. Ecuaciones de regresión 4 días de Fermentación Fermentos 4 días Espontáneo AV −1,15 + 2,246 Azúcar% + 0,0468Batata g tarro − 0,282 Azúcar% ∗ Azúcar% − 0,00150 Azúcar% ∗ Batata g tarro 37 Kéfir AV −1,46 + 2,184 Azúcar% + 0,0347Batata g tarro − 0,282 Azúcar% ∗ Azúcar% − 0,00150 Azúcar% ∗ Batata g tarro Figura 12. Diagrama de Pareto 4 días de Fermentación Resumen del modelo Tabla 8. Resumen del modelo S R2 R2(ajustado) R2 (pred) 0,321808 89,47% 82,09% 65,81% En las figuras 13 y 14, a continuación, se encontrarán superficies de respuesta para los cuatro días de experimentación de cada uno de los fermentos, a partir de los cuales se puede extraer la configuración óptima para la respuesta a la acidez total, frente a la cantidad de azúcar y de batata, además de que se puede observar cómo los cambios en una de las variables afecta la respuesta de interés, en este caso, el valor de la acidez, cuando aumenta o disminuye la cantidad de los otros dos parámetros. 38 Figura 13. Superficie de respuesta acidez 4 días de Fermentación espontánea Figura 14. Superficie de respuesta acidez 4 días de Fermentación dirigida con Kéfir 39 5.2.1. Estudio de optimización (condiciones necesarias para obtener el máximo grado de acidez) Por último, se calcula la optimización de la respuesta a la acidez total, en los 2 y 4 días de fermentación, tanto para la fermentación espontánea como para la fermentación dirigida con kéfir (Tabla 9). En ambos tipos de fermentación coinciden las condiciones óptimas, las cuales son: 3,71% de azúcar con 50 g de batata para una fermentación espontánea, dando el máximo de producción de Acidez total en 5,11ml de NaOH (0,1022 mol/L) a los 2 días y un 5,364 ml de NaOH (0,10728 mol/L) a los 4 días (Figura 15). Tabla 9. Optimización para máximo grado de acidez. Solución Azúcar % Batata (g/tarro) Fermentos AV(2d) Ajuste AV(4d) Ajuste 1 3,71212 50 Espontáneo 5,11007 5,36354 Figura 15. Gráficas de optimización para la acidez total a los 4 días 40 5.3. Conteo de placas, Observación y Tinción de Bacterias y Levaduras Como se indicó en el apartado de materiales, técnicas y métodos, se realizó la siembra en medios ricos para el conteo de microorganismos luego del cuarto día de fermentación de cada una de las experiencias, por esto, en la tabla abajo se pueden observar la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC) y el medio empleado, TSA, LS e YPD: Tabla 10. Conteo placas de siembra por experiencia OrdenEst Experiencia Fermentos UFC medio YPD UFC 1 2,5%A - 25g B Espontáneo 8,2 x 10 E7 1,13 x 10 E7 - TSA 2 5%A – 25g B Espontáneo 5,2 x 10 E7 9,9 x 10 E7 - TSA 3 2,5%A – 50g B Espontáneo 18,4 x 10 E7 3,36 X 10 E8 - TSA 4 5%A – 50g B Espontáneo 12,4 x 10 E7 1,90 X 10 E7 - TSA 5 2,5%A -25g B Kéfir 1,9 x 10 E7 1,00 X 10 E8 - LS 6 5%A – 25g B Kéfir 9 x 10 E6 3,5 X 10 E7 - LS 7 2,5%A - 50g B Kéfir 3,0 x 10 E7 1,19 X 10 E8 - LS 8 5%A – 50g B Kéfir 1,7 x 10 E7 5,2 X 10 E7 - LS 9 2,5%A – 25g B Espontáneo 8,2 x 10 E7 7,5 X 10 E7 - LS 10 5%A – 25g B Espontáneo 8,6 x 10 E7 1,13 X 10 E8LS 11 2,5%A – 50g B Espontáneo 4,3 x 10 E7 5,0 X 10 E7 - LS 12 5%A – 50g B Espontáneo 5,8 x 10 E7 5,0 X 10 E7 - LS 13 2,5%A – 25g B Kéfir 4,4 x 10 E7 6,3 X 10 E7 - LS 14 5%A – 25g B Kéfir 1,3 x 10 E7 2,1 X 10 E7 - LS 15 2,5%A – 50g B Kéfir 5,1 x 10 E7 2,76 X 10 E8 - LS 16 5%A – 50g B Kéfir 1,7 x 10 E7 9 X 10 E7 - LS 17 3,75%A – 37,5g B Espontáneo 14,3 x 10 E7 6,5 X 10 E7 - LS 18 3,75%A – 37,5g B Kéfir 1,6 x 10 E7 6,5 X 10 E7 - LS 19 3,75%A – 37,5g B Espontáneo 2,7 x 10 E7 1,03 X 10 E8 - LS 20 3,75%A – 37,5g B Kéfir 1,6 x 10 E7 8,5 X 10 E7 - LS Luego de realizar el conteo, se llevaron a cabo la observación y tinción de las bacterias y levaduras, para esto fue necesario extraer parte de la biomasa de algunas de las experiencias durante este estudio de investigación, se tomaron alícuotas las cuales fueron diluidas y se siguió el procedimiento de siembra de acuerdo a como se indican en las técnicas descritas en el presente artículo. Dichas placas con medio ricos en TSA, YPD y LS, fueron colocadas en cámara de incubación durante dos días para promover el crecimiento microbiano. 41 A continuación, se pueden observar algunas imágenes de las placas de siembra para ambas fermentaciones en donde se pueden visualizar las colonias de los microorganismos Figura 16. Placas de siembra medios YPD y LS Fermentación espontánea Figura 17. Placas de siembra medios YPD y LS Fermentación dirigida con kéfir 48 Figura 19. Electroforesis extracción ADN Levaduras – segunda lectura Marcador 1 Kb 49 Figura 20. Electroforesis extracción ADN Levaduras – tercera lectura De acuerdo con estas extracciones y el material obtenido se procedió a hacer la secuenciación del ADN de las Bacterias 1 y 2, con ayuda de un laboratorio externo (Macrogen) y de esta manera conocer con exactitud los microorganismos responsables del proceso fermentativo espontáneo de las batatas en almíbar. 5.5. Búsqueda de secuencias de ADN en BLAST Las secuenciaciones de ADN emitidas por el laboratorio externo para ambas bacterias fueron puestas en el buscador BLAST, en donde el sistema ejecuta un proceso comparativo y realiza comparaciones en la base de datos de microorganismos que tienen similares secuencias de ADN y de acuerdo con esto se puede determinar con exactitud a que microorganismo pertenece dichos nucleótidos. A continuación, se pueden observar en las figuras 21 y 22 parte de las secuenciaciones de ADN para ambas bacterias entregadas por el laboratorio externo, además de los resultados Marcador 1 Kb 50 arrojados por la herramienta BLAST una vez se realizó la comparación de dichas secuencias. 5.5.1. Secuenciación y comparación Bacteria 1 Figura 21. Secuencia filogenética Bacteria 1 1 Figura 22. Comparación en BLAST secuencia filogenética para Bacteria 1 51 De acuerdo a las comparaciones realizadas en el buscador, los resultados arrojados para la Bacteria 1 indicaron que su secuencia nucleotídica es similar a la de la bacteria Leuconostoc mesenteroides. Dicha bacteria hace parte del conjunto de bacterias LAB (bacterias del ácido láctico), perteneciente al grupo de las grampositivas que son responsables de llevar a cabo procesos fermentativos. Además de tener propiedades probióticas, tienen la capacidad de producir metabolitos beneficiosos para la salud humana, incluyendo la actividad antimicrobiana contra la influenza aviar y que, con ayuda de diferentes fuentes de carbono, como por ejemplo la degradación de sacarosa en el almíbar, puede tener funciones prebióticas debido a que incorpora diversos metabolitos beneficiosos como los ácidos grasos de cadena corta (Zhang et al. 2024, Cuervo mulet et al. 2010). Por otra parte, esta bacteria en condiciones anaerobias produce grandes cantidades de ácido láctico, etanol y CO2 partiendo de las concentraciones de glucosa del medio. Dichas sustancias se forman a través de la vía de la fosfocetolasa (enzima que metaboliza hexosas y pentosas). Esta es una de las razones por las cuales, al analizar los diferentes parámetros fisicoquímicos (graficas de acidez, densidad relativa, pH y materia seca soluble (°Brix) expuestas arriba) de las experiencias mediante fermentación espontánea presentaran un incremento en comparación con los valores iniciales (KIM Ji-Won et al. 2018). 5.5.2. Secuenciación y comparación Bacteria 2 Figura 23. Secuencia filogenética Bacteria 2 52 Figura 24. Comparación en BLAST secuencia filogenética Bacteria 2 Conforme con los resultados obtenidos mediante el buscado BLAST y como se observa en las figuras 23 y 24, se pudo conocer que el segundo microorganismo tiene similitud en secuenciación del ADN a: Staphylococcus warneri, Staphylococcus sp., y Staphylococcus pasteuri. Estas tres especies de bacterias pertenecen a bacterias grampositivas, y son estafilococos que crecen con facilidad en todos los medios enriquecidos. No forman parte de ningún proceso fermentativo, pero se pueden encontrar en la mucosa y piel de los humanos, mamíferos y aves. Generalmente son conocidas como patógenos que cuentan con la capacidad de causar infecciones potencialmente mortales (Czarneckaet al. 2025). Dicho esto, se puede determinar que este microorganismo pertenece a una contaminación del medio o de la piel de la batata, debido a que no se le realizo ningún proceso de esterilización ya que uno de los enfoques del presente trabajo era realizar la fermentación espontanea única y exclusivamente con la microbiota presente en la piel de tubérculo. 53 6. CONCLUSIONES  Las experiencias realizadas bajo fermentación espontánea arrojaron mayores valores de acidez total que los mostrados en las experiencias de la fermentación dirigida con kéfir, fenómeno que se da por la presencia de diferentes microorganismos que se encuentran adheridos en la piel de la batata.  De acuerdo con los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo de investigación de optimización de procesos fermentativos de la batata en almíbar, se puede determinar que a partir de los procesos fermentativos espontáneos se puede obtener una reducción del 50% en el pH durante los primeros dos días de fermentación.  Luego de realizar el proceso de optimización junto con el diseño experimental se pudieron conocer que las condiciones en donde se pueden obtener mayores resultados en el valor de acidez total, es cuando se emplean 3,71% de azúcar y 50g de Batata durante la fermentación espontánea.  A partir de las fermentaciones espontáneas se pudo conocer con exactitud la bacteria responsable de los procesos fermentativos, los cuales hacen parte del conjunto de bacterias LAB (bacterias ácido lácticas), mientras que en la fermentación dirigida con kéfir es un conglomerado simbiótico de bacterias y levaduras que varían de acuerdo con los sustratos que se emplean a este tipo de procesos.  Conforme a los estudios e investigaciones consultadas en este trabajo de investigación sobre las fermentaciones en donde se emplean los gránulos de kéfir, se de agua El emplear la batata como fuente de nutrientes para una segunda fermentación dirigida con kéfir, pueden hacer de esta otra opción de alimento funcional ya que se le está otorgando los beneficios del tubérculo.  Una vez realizado el conteo de colonias formadoras en los diferentes medios, se pudo conocer que las fermentaciones espontáneas presentan mayor cantidad de microorganismos luego de cuatro días del proceso fermentativo en las experiencias 54 donde se emplea mayor cantidad de batata (50 g), mismo comportamiento se puede observar en las experiencias dirigidas con kéfir que también arrojaron los mayores valores de cantidad de colonias.  Durante el inicio de las siembras se pudo determinar que era mejor realizar el cambio de TSA a LS, debido a que este medio permite el crecimiento de una especie de bacterias específicas como son las pertenecientes a las bacterias acido lácticas, adicionalmente, este medio genera una coloración rosada alrededor de las bacterias, lo cual permite fácilmente su detección.  En las experiencias en las cuales se utilizó el kéfir como medio fermentativo, se pudo conocer que la materia seca soluble puede llegar a valores bastante inferiores con respecto a los obtenidos durante las experiencias por medio de fermentación espontánea, fenómeno que se debe como consecuencia de la gran cantidad de microorganismos existentes en los gránulos.  En base a los resultados obtenidos, el presente trabajo de investigación pueden ser una guía a futuros estudios de procesos fermentativos en almíbar de tubérculos similares a la batata y demás vegetales que poseen las mismas características nutricionales, con el fin de obtener posibles alimentos funcionales vegetales. 55 7. 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