Die Gewinnung von Einzellerprotein unter Verwendung von Knallgasbakterien

Die Gewinnung on Einzelle p o ein un e Ve wendung on Knallgasbak e ien R.M.La e y, A.Mose , W.S eine Ins i u ü Biochemische Technologie und Lebensmi elchemie Technische Hochschule G az / Ös e eich Cha ak e isie ung de Knallgasbak e ien Un e den di e sen G uppen on Mik oo ganismen, die ü die Gewinnung on Einzelle p o ein (EZP) eingese z we den könn en, nehmen die G uppe de ae oben wasse s o - e we enden Mik oo ganismen eine Sonde s ellung ein. Im Ve gleich zu den meis en ande en Mik oo ganismen, die du ch chemoo ga- no ophes Wachs um de EZP-Gewinnung dienen, sind die wasse s o - e we - enden O ganismen du ch die Fähigkei chemoli o oph zu wachsen gekenn- zeichne . Die "Knallgasbak e ien" können molekula en Wasse s o oxydie en, Saue s o als Elek on-Akzep o e wenden, und die im S o wechsel gewon- nene Ene gie bzw. Reduk ionsk a ausnu zen, um CO» zu eduzie en und in Fo m on Zellma e ial es zulegen. Die Fähigkei , molekula enWasse s o zu ak i ie en, is inne halb meh e e axonomische G uppen on Mik oo ga- nismen anzu e en. Dies gil z.B. ü gewisse pho o ophe O ganismen, Clos idium ace icum, Mic ococcus deni i icans, Mycobak e ien, Co ynebak- e ien und einige Ac inomyce en z.B. Nocadia species. Die elä i nied i- gen Wachs ums a en iele diese O ganismen schließen meis ens eine p ak- ische Anwendung ü Zweckede Einzelle p o ein-Gewinnung jedoch aus. Diejenigen ae oben wasse s o - e we enden Mik oo ganismen, die ambes en ü die EZP-P oduk ion geeigne sind, gehö en en wede zu Ga ung Hyd oge nomonas ode Alcaligenes (1). Diese "Knallgasbak e ien" sind akul a i chemoli ho ophe O ganismen. Chemoo gano ophes Wachs um kann abe auch mi meh e en o ganischen Subs a en e olgen. We den chemoo gano oph wach- sende Knallgasbak e ien mi z.B. F uc ose, Ace a ode Glu ama als Sub- s a in eine Wasse s o a mosphä e geb ach , so wi d die Ve we ung die- se o ganischen Subs a e du ch einen Regula ionsp ozeß (2) un e bunden. Diese "Wasse s o -E ek " is scheinba das E gebnis eine Ka aboli - Rep ession. P oblema ik de Subs a e so gung bei chemoli ho oph wachsenden Knall- gasbak e ien Chemoli ho ophes Wachs um e olg un e eine A mosphä e on Hp, 0),und C0, in einem ein achen Mine almedium mi olgende Zusammense zung : NHC] ... 1.0 g, NagHPOg.12 HO ... 9.0 g, K HoPOg... 1.5 9, MgSQq-7,H90)...,0.2.g5 FeNH,-Ci a 0.008: 9, CaCL2.Hz0 0.0109, NaHCOz3 ... 0.5 g, Spu enelemen e, aqua des . ... ad 1000 1. Die O ganismen sind mesophil, d.h. op imales Wachs um inde zwischen 280 und 35 0 s a ; das pH-Op imum lieg zwischen 6,8 und 7,2. Das mögliche Spek um de e we ba en S icks o quellen um aß Ammoniak, Ammonsalze, Ni a und Ha ns o . Sowohl die Zusammense zung de Gasa mosphä e, insbe- sonde e das Ve häl nis Ho : 02, als auch die ela i en Ein ags a en die- se beiden Gase im e wende en Bio eak o können die Wachs ums a en und auch die Anhäu ung on in azelluld en Speiche s o en wie Poly-B-hyd oxy- bu e säu e im Fall on wild- yp-Zellen de Ga ung Hyd ogenomonas s a k beein lussen. Molekula e Wasse s o wi d du ch zwei in azellulä e Enzym- sys eme ak i ie - eine memb angebundene Hyd ogenase und eine 1ösliche Hyd ogenase. Scheinba bewi k das pa ikelgebundene Sys em Wasse s o - 88 R.M. La e y, A. Mose und W. S eine oxyda ion mi Hil e eine olls ändigen A mungske e, wäh end die lösliche Hyd ogenase, auch "Hyd ogen-Dehyd ogenase" genann , lediglich die Reduk- ion on NAD du ch Wasse s o ka alysie (3). Das eduzie e NAD is wah scheinlich ü das Funk ionie en des eduk i en Pen ose-Phospha -Zyk- lus, in dem C02 inko po ie wi d, no wendig. Fig.1 s ell in schema i- sche Fo m das chemoli ho ophe Wachs um de Knallgasbak e ien da . 0, Elek onen- a a nenese anspo sys em ? H20 TP m e ADP+P, A Hy, py c ogep- Dehyd ogenase eduk i e Pen osephospha - NAD NADH, | zyk us co, (CH,0) Zellma e ial Fig.1. Chemoli ho ophe S o wechsel de Knallgasbak e ien Bilanzmäßig kann man olgende B u ogleichung ü das chemoli ho ophe Wachs um on Knallgasbak e ien au s ellen : 6H, + 202 + 10 — —> (CH20) + 5 H20. Diese s oichiome ischen Ve häl nisse können jedoch eine gewisse Va ia ion au zeigen. In Ve suchen mi Hyd ogenomonas eu opha in Kul u en im Tu bidos a wu den C02 : O09 : Hp Au nahme a en on 1 : 1,2 : 4,5 bis 1 : 1,9 : 6,6 gemessen (4). Neue e E gebnisse mi Hyd ogenomonas eu opha S amm H 16 (Alcaligenes eu ophus) zeig en jedoch, daß 4 Mol H sowohl ü die ene gielie e nde Knallgas eak ion, als auch ü die Reduk- ion on 1 Mol COg zu Zellsubs anz un e den angegebenen Bedingungen aus- eichen (5). Auch iihe wu den on eine ande en A bei sg uppe mi dem O ganismus Hyd ogenomonas uhlandii ähnliche E gebnisse d.h. ein Ve häl - nis on 1: 1:4 ü CO2 : 09 : Ho - Au nahms a en gemessen (6). Die Ve so gung de chemoli ho oph wachsenden Kul u on Knallgasbak e ien mi den d ei gas d migen Subs a en Ho, 02 und CO» s ell höhe e Ansp üche hinsich lich Gas ans e a en an den Bio eak o aie im gewöhnlichen Falle bei de Züch ung on ae oben Mik oo ganismen, wobei lediglich die Saue - s o ein agsgeschwindigkei beg enzend au das Wachs um de Zellen wi ken könn e. Im Falle de Begasung mi Ha, O2 und CO2 kann die CO,-Ve so gung de Zellen wegen de hohen Löslichkei Giaces Gases als öllig aus eichend be ach e we den. Dagegen können die Konzen a ionen on gelös en Hy und 0, in de Näh lösung die beg enzenden Fak o en ü das Wachs um de Knall- gasbak e ien sein. Die Ve so gung de Knallgasbak e ien mi Ho und 0, in eine Fe men e anlage d.h. mi eine explosi en Gasmischung e u sach &inige echnische P oblene. Die Besei igung de möglichen Ge ah enquellen läß sich jedoch du ch Ein- hal en de no malen Vo sch i en ü das A bei en mi explosi en Gasen e - eichen. Fü kleine e Labo e suche bzw. ü die Anzuch on Fe men e -Vo - kul u en on Knallgasbak e ien können spezielle Schü elkolben mi Schi- kanen e wende we den. Die Begasung de Kul u en e olg mi els eines Gas ese oi s, das un e einem ge ingen hyd os a ischen D uck s eh . Einzelle p o ein du ch Knallgasbak e ien 89 Das Animp en on Labo e men e n e olg in de üblichen Weise mi An- s eckkanüle. Da Knallgasbak e ien - EZP bei Tie ü e ungs e suchen ein- gese z wi d, soll e die Ve wendung on An ischaummi eln im Fe men e e mieden we den. Beding du ch die An o de ung eines e ek i en Gas ans- po s, um möglichs hohe Wachs ums a en zu e eichen, en s eh das P oblem de Schaumbildung als Folge eine in ensi en Mischung auch mi einem ein- achen Mine almedium wegen Ausscheidung bzw. Bildung on Kapselsubs anzen. Ein mechanisches Schaumbekämp ungssys em is also e o de lich. Die bis- he ige E ah ung ha gezeig , daß en wede ein Umlau , bzw. ein Umwu - Mischsys em im Klein e men e (Fig.2) diese An o de ungen e üll . De Fe - men e wi d mi Meßsonden ü 02, CO2, pH und Redox-Messungen ausges a e . Die Regelung de Gas e so gung de Knallgasbak e ien-Kul u im Klein e - men e mi den d ei Gasen Hn, O0» und CO, kann en wede mi els Du ch luß- messe mi Rücki epenz eg e ode mi els Gaspumpen (Fa. Wös ho /Bochum), die kon inuie lich a iable Gas ö de a en e lauben, e olgen. — Cg ,0g,Hg = H SRI —o, CAR» u =x An ieb A —<)—H, EG, @ Näh lösungs- (4) ä pumpe > 4)—co, Gaspumpen Fig.2. Schema de kon inuie lichen Ziich ung on Knallgasbak e ien im Fe - men e . Au s ellen de Modellgleichungen ü die Mak okine ik Basie end au den bishe igen E gebnissen wu de de Ve such un e nommen, ein mak okine isches Modell des chemoli ho ophen Wachs ums on Knallgasbak e- ien au zus ellen. Ein Zweck solche Modellbildung is es, geziel e Expe i- men e du chzu üh en, welche es e möglichen, die p ozeßbes immenden G ößen, die Modellpa ame e zu messen. Dami soll e dann auch eine Ve besse ung des Modelles o genommen we den können, um die P oduk i i ä sowie das Ve - hal en des P ozesses o auszube echnen. Die Modellgleichungen ü kon inuie liche Züch ungen beziehen sich au die Konzen a ionsände ung on Zellmasse X in Abhängigkei de d ei gas o migen Subs a e Hp, 02, COo (H, 0, C) und eines möglichen limi ie enden Subs a- es in de Flüssigkei S. Dieses limi ie ende Subs a S konn e en wede 90 R.M. La e y, A. Mose und W. S eine Magnesium-, Eisen- ode die S icks o quelle sein. Mi Hil e de Monod- Beziehung wu den olgende Modellgleichungen ii diese Mul isubs a kine- ik au ges ell : y n len | A ES N 1) ae FR KO 1+O/K, Kec KeS 2) an - Be “pX + ka-(H- H) +D-(H,- H) 3) $0. “x + calO- Q) +D-(Q,- 0) 4) ee. = ye +alC- ale +D-C,-C) 5) $$--+ ux .pis-s) sx In de Gleichung (1) bedeu en die K-We e (Ky, Kg»Kes Ks) die Monod-Kon- s an en ü die e schiedenen Subs a e und Jm die maximale ela i e Wachs- umsgeschwindigkei . In diese Gleichung wu de de be ei s bekann e E ek de Saue s o inhibi ion im Falle de Knallgasbak e ien du ch den Te m Ky be ücksich ig . Wei e s wu den die Massen anspo e, welche beim kon inu - ie lichen Sys em du ch Zu- und Ab luß he o ge u en we den, du ch einen Te mde Ve dünnungsgeschwindigkei D in die Gleichungen einbezogen. In den Gleichungen 2-4 wu den ü die gas ö migen Subs a e die T anspo o - gänge du ch die S o anspo koe izien en (ky He ky Q> k c) besch ieben. Zusä zlich is beim CO,-T anspo in Gleichung 4 p inzipiell auch de Vo - gang de chemischen Reak ion mi eine Geschwindigkei skons an e ky, eine Reak ionso dnung n und einem Di usionskoe izien en D in Be ach zu zie- hen, wodu ch de Te m des S o anspo es en sp echend zu e wei e n is . Fu die Ande ungsgeschwindigkei de Subs a e wu den E agskons an en (Yx,H> Yx,0> Yx,c> Yx,s) he angezogen, welche die Rela ion zu ela i en Wachs umsgeschwindigke Y he s ellen. Säm liche Modellpa ame e , die in den Modellgleichungen o kommen, sind nun expe imen ell in eine Se ie on Ve suchen bes immba , wenn die Vo - ausse zungen hinsich lich S o anspo e üll sind. Diese be e en ne- ben dem Misch e hal en des Fe men e s o allem die Ein agsgeschwindig- kei on Wasse s o und Saue s o . In allen bishe bekann en A bei en wa en diese T anspo e limi ie end, so daß eine lange linea e s a expo- nen ielle Wachs umsphase au a . Dahe wa en die kine ischen Pa ame e e älsch . Um nun die Ein agsgeschwindigkei on Wasse s o und Saue - s o zu e besse n, s ehen die bekann en d ei Möglichkei en zu Ve ügung: l. E höhen des Konzen a ionsg adien en (c¥ - c_) du ch z.B. :Anwenden höhe- e D ücke. 2. Ve g öße n de spezi ischen Aus auschobe läche a du ch z. B.: Ve kleine n de Blaseng öße. 3. Ve g öße n des S o anspo koe izi- en en k, du ch Ve besse n de Tu bulenz in de Phaseng enz läche. Als Schluß olge ung diese Übe legungen soll e ein Fe men e eingese z we den, de diese Vo ausse zungen hinsich lich S o anspo und Misch- e hal en ha und de en sp echend de Mak okine ik eine Ve weilzei au - weis , so daß ein op imale Umsa z gewäh leis e is . Falls alle Subs a e im Übe schuß d.h. übe dem We de k i ischen Konzen a ionen angebo en we den, soll e zu e wa en sein, daß ein Fe men e mi Mischung und Rüh - nn esesesi‘“‘“ai‘“<i<i<i<i<i<i‘<i‘i‘i‘i‘i Einzelle p o ein du ch Knallgasbak e ien 91 kesselcha ak e is ik den bes en Umsa z e gib . Aus wi scha lichen Übe - legungen he aus dü e wei e s zu emp ehlen sein, die Gase in einem ge- schlossenen Gask eislau (d.h. Regelung des Zu lusses nach dem Pa ial- d uck des Gases im K eislau ) zu üh en. Um das P oblem des S o ans- po es, dem bei Mul isubs a bedingungen eine besonde e Bedeu ung zukomm , und de Explosionsge ah im Falle de Knallgasbak e ien zu lösen, is es no wendig, neue A en on Fe men e anlagen einzuse zen. Ein Bio eak o ,de sowohl einen e besse en S o anspo , als auch die Möglichkei de An- wendung eines geschlossenen Gask eislau es e möglichen könn e, is das "Tauchs ahl-Begasungssys em" (Fa. Vogelbusch/Wien). Bei diesemSys em (Fig.3) wä e das P oblem de Explosionsge ah du ch die Abwesenhei eines mechanischen Rüh sys emes besonde s gu gelös . Zudem is die inhä en e Schaum e nich ung in diesem Mischsys em besonde s e ek i , so daß wede die Zugabe on chemischen An ischaummi eln, noch eine zusä zliche mecha- nische Schaumze s ö ungsein ich ung e o de lich wä en. 619.3. Vogelbusch-IZ-Tauchs ahl- Begasungssys em. Biologische Bewe ung on Knallgasbak e ien - EZP Sowohl das o handene Spek um de essen iellen Aminosäu en (Tab.1), als auch die E gebnisse de E näh ungs e suche bei Tie en zeigen, daß Knall- gasbak e ien en wede ü die di ek e Tie e näh ung ode ü Ge eidean- eiche ungszwecke geeigne sind (7). Aminosäu e - Zusammense zung n. Calloway u. Kuma (1969) Aminosäu e Hyd ogenomonas eu opha Casein (g/16 g N) (g/16_g N) Th eonin 4.52 4,30 Me hionin 2,69 3,10 Lysin 8,61 8,06 Isoleucin 4,58 6,59 Ty osin 35,26 5,86 A ginin 8,00 4.10 Alanin 8.80 3.38 Aspa aginsäu e 9,57 7,44 92 R.M. La e y, A. Mose und W. S eine Biologische Ve we ba kei in Tie e suchen n. Calloway u, Kuma (1969) P o einquelle N-Ve we ung % Biologische We % Casein 93 77 Hyd ogenomonas eu opha 94 77 Tab.1. Aminosäu e-Zusammense zung und Biologische Ve we ba kei on Knallgasbak e ien-Einzelle p o ein. Das Lysin-Gehal on Knallgasbak e ien is z.B. mi dem des Caseins e - gleichba . Zwei wei e e k i ische P obleme beim Einsa z on EZP sind e s ens de hohe Nukleinsäu egehal on Bak e ien und zwei ens die Spei- che ung on nich e we ba en, d.h. bei höhe en Tie en, in azellulä en Speiche s o en wie Poly-ß-hydoxybu e säu e (PHB). Im Falle on Knall- gasbak e ien können diese möglichen nega i en Eigenscha en umgangen we - den. Obwohl PHB de häu igs e Speiche s o bei Mik oo ganismen is , las- sen sich Knallgasbak e ien gene isch so manipulie en, daß die PHB-Syn hese blockie is , wäh end die Wachs ums a e de Zellen un e ände bleib . Wei e hin läß sich de Nukleinsäu egehal de Zellen du ch eine Hi ze- schockbehandlung seh s a k he abse zen (8). De Ve dauungskoe izien des"Knallgas"-EZP und ande e A en on EZP häng om Zus and de Zellen,d.h. de Zellwand bzw.-memb an, ab. Tie e näh ungs- e suche haben gezeig , daßdie Ze s ö ung de Zellwand bzw. de Zel1Imen- b an die Ve daulichkei desEZP in allen Fällen e höh (9). Da die Knall- gasbak e ien (Hyd ogenomonas spec.) g am-nega i e Mik oo ganismen sind, de en Zellwands uk u physikalisch schwäche als diede g am-posi i en O ganismen is , dü e pe se ein Zellau schluß mi wenige Ene gie e Einhei de Biomasse du chzu üh en sein. Die Me hoden des Zellau schlusses und die anschließende Au a bei ung desEZP sind zum Teil bis je z wenig un e such wo den. Zellau schluß und EZP-Behandlung beein lussen nich nu die Wi scha lichkei des P ozesses, sonde n auch die biologische We ig- kei des P oduk es. Es is z.B. bekann , daß ein Ve lus an Lysin du ch zu hohe Tempe a u en bei de Sp üh ocknung onEZP au e en kann. Knallgasbak e ien als eine EZP-Quelle besi zen den Vo eil, daß un e che- moli ho ophen Wachs umsbedingungen nu ein ache, physiologische, unbedenk- liche Subs a e e wende we den. Siche lich können die bishe e wende en Näh lösungen op imie we den; auch eine meh malige Ve wendung de Näh lö- sung dü e möglich sein. Wei e hin wu de in le z e Zei es ges ell , daßeinige Knallgasbak e ien a mosphä ischen S icks o zu ixie en e mö- gen (10). Diese Aspek des S o wechsels de Knallgasbak e ien könn e zu eine wei e en Ve ein achung de Gewinnung on EZP mi Hil e de Knallgas- bak e ien üh en. Li e a u (1) ochlegel,H.G. ,La e y,R.M. ,Ad .Biochem.Eng.1,(1970) 143-168. (2) Schlegel ,H.G. ,Ebe ha d ,U.(1972) Ad .Mic obiol.Physiol.7,205-242. (3) P i zne ,J.,(1972) Zb1.Bak .Hy.,I.Ab .O ig.A220, 396-401. (4) Ammann ,E.C.B.e al. ,(1968)App] .Mic obiol.16, 822-826. 5) Rob a,K.H., Vo ag 2 es Symp.Gö ingen 1974. 6) Packe ,L.,Vishniac,W.,(1955) J.Bac e iol.70, 216-223. (7) Calloway,D.H.,Kuma ,A.M. , (1969) Appl .Mic obiol.17, 176-178. (8) Ruwaida,R.,(1974) Disse a ion Uni .Gö ingen. (9) Kihlbe g,R. ‚(1972)Ann.Re .Mic obio1.26, 427-466. (10) Gogo o ,J.N. ‚Schlegel ‚H.G. ‚(1974)A ch.Mic obio1.97, 359-362. nn sssss—s—‘“‘“Cai‘“<i<‘i<‘i<i‘<i‘i‘i‘i‘iCO