Presencia de cianotoxinas en suplementos alimenticios a base de cianobacterias

PRESENCIA DE CIANOTOXINAS EN SUPLEMENTOS ALIMENTICIOS A BASE DE CIANOBACTERIAS MARÍA GARCÍA-TOMÉ SÁNCHEZ-ARJONA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia PRESENCIA DE CIANOTOXINAS EN SUPLEMENTOS ALIMENTICIOS A BASE DE CIANOBACTERIAS Trabajo de Revisión Bibliográfica María García-Tomé Sánchez-Arjona Facultad de Farmacia, Sevilla. 21 de Septiembre 2016 Tutores Dra. Sara Maisanaba Hernández Dra. Remedios Guzmán Guillén Dpto. Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal Área de Toxicología Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia RESUMEN Las cianobacterias son organismos procariotas, de amplia diversidad morfológica y una reconocida antigüedad evolutiva. Estos organismos contienen una gran cantidad de compuestos que pueden ser empleados para suplir necesidades nutricionales y energéticas de la población, dando lugar a los conocidos suplementos alimenticios a base de cianobacterias (BGAs). No obstante, el mayor riesgo que se presenta es que también pueden producir toxinas (cianotoxinas) a partir del metabolismo secundario, las cuales están relacionadas con efectos negativos sobre la salud humana. Los riesgos por exposición a estas cianotoxinas presentes en BGAs han sido evaluados y revisados por distintos autores. De hecho, la Organización Mundial de la Salud ha propuesto límites provisionales para el agua de consumo para determinadas cianotoxinas, así como una ingesta diaria tolerable (IDT) de las mismas, con el fin de proteger a los consumidores de los efectos adversos. No obstante, aunque no se excedan los límites propuestos, se debe prestar atención especialmente al consumo crónico, la acumulación y las posibles consecuencias y riesgos de exposición, ya que no existe un nivel de dosis establecido para BGAs. La bibliografía actual demuestra que las cianotoxinas pueden estar presentes y acumularse en una amplia variedad de organismos de consumo humano incluso a concentraciones superiores a la IDT. La acumulación de cianotoxinas en BGAs da consciencia de la importancia de los alimentos como vía de exposición y entrada de las mismas al cuerpo humano. Los resultados obtenidos hasta el momento dejan ver la necesidad de dar información clara a los consumidores sobre posibles riesgos para la salud derivados del consumo de estos suplementos, así como de la formulación e implementación de medidas a través de leyes nacionales e internacionales necesarias para preservar la salud humana. Palabras claves: Blue green algae supplements (BGAs); microcistinas; cianotoxinas; cianobacterias; Spirulina 1 ÍNDICE RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………...…2 1.1. Cianobacterias y cianotoxinas ................................................................ ..2 1.2. Clasificación de cianotoxinas .................................................................. ..2 1.2.1. Hepatotoxinas ....................................................................... ..3 1.2.2. Neurotoxinas…. ..................................................................... ..5 1.2.3. Citotoxinas ............................................................................ ..5 1.3. Vías de exposición a cianotoxinas ........................................................... ..6 1.4. Efectos por exposición a cianotoxinas .................................................... ..7 1.5. Suplementos alimenticios a base de cianobacterias (BGAs) .................. ..7 1.5.1. Spirulina ................................................................................ ..8 1.5.2. Aphanizomenon flos-aquae .................................................. ..8 1.6. Métodos para la detección de cianotoxinas ........................................... ..9 2. OBJETIVO .................................................................................................................... ..10 3. METODOLOGÍA ........................................................................................................... ..10 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................ ..12 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... …19 6. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... …….21 2 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Cianobacterias y cianotoxinas Las cianobacterias (antiguamente llamadas algas verdes-azuladas) son organismos unicelulares, procariotas, capaces de realizar la fotosíntesis oxigénica, ampliamente distribuidos en ambientes acuáticos, suelo y otras superficies húmedas (Doyle, 2011). Aunque son más frecuentes en zonas tropicales, pueden sobrevivir en ambientes muy inhóspitos tales como manantiales calientes, desiertos y la tundra ártica (Doyle, 2011; Chatziefthimiou y cols., 2016). Debido a la eutrofización progresiva de las masas de agua, al cambio climático, a determinadas condiciones de luz y temperatura y al aumento de los niveles de nutrientes, particularmente fósforo y nitrógeno procedente de actividades agrícolas, las cianobacterias pueden crecer rápidamente formando una lámina verde viscosa conocida como “floración” o “bloom”, cubriendo grandes áreas de la superficie (Doyle, 2011). Las floraciones de cianobacterias se consideran perjudiciales cuando conducen a impactos ambientales negativos, como la mortalidad y la inestabilidad de los ecosistemas (Chorus, 2001). Se estima que el 2575% de las floraciones de cianobacterias son tóxicas (Chorus, 2001), por su capacidad de producir una amplia gama de toxinas, llamadas cianotoxinas (Carmichael y cols., 2001). Esto supone una preocupación ya que son un riesgo tanto para los seres humanos y animales que los consumen, como para el medio ambiente (Quesada y cols., 2006; O’Neil y cols., 2012). Los principales géneros de cianobacterias, por la repercusión sanitaria y medioambiental, así como por la producción de toxinas son: Anabaena, Chrysosporum (Aphanizomenon), Cylindrospermopsis, Microcystis, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria y Lyngbya (Corbel y cols., 2014). 1.2. Clasificación de las cianotoxinas Las cianotoxinas son muy diversas tanto por su estructura química como por su toxicidad (Briand y cols., 2003), y se pueden clasificar de la siguiente manera según los sistemas y órganos donde ejercen sus efectos preferentemente (Wood, 2016): 3  Hepatotoxinas: microcistinas y nodularinas.  Neurotoxinas: anatoxina-a, homoanatoxina-a, anatoxina-a (S), saxitoxinas.  Citotoxinas: cilindrospermopsinas.  Dermatotoxinas: aplisiatoxina y lingbyatoxinas.  Toxinas irritantes: lipopolisacáridos (LPS). De todas las cianotoxinas, las más ampliamente distribuidas y estudiadas son las microcistinas (MCs) (Chorus y Bartram, 1999). 1.2.1. Hepatotoxinas: Dentro de este grupo podemos destacar las MCs, las cuales son péptidos cíclicos que constan de siete aminoácidos. Hasta la fecha se han descrito más de 100 variantes estructurales diferentes, dependiendo de los aminoácidos en las posiciones 2 y 4 y las desmetilaciones en posiciones 3 y 7 (Wu y cols., 2014). El aminoácido ADDA (3-amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-trimetil-deca-4,6-ácido dienoico) es común a todas ellas y el más característico por considerarse responsable de su toxicidad. Así, tenemos los congéneres más comunes: MC-LR con leucina (L) y arginina (R), MC-RR con dos residuos de R, y MC-YR con tirosina (Y) y R en las posiciones 2 y 4, respectivamente (Carmichael, 1998) (Fig.1). Figura 1. Estructura química de las microcistinas. Las MCs son térmicamente estables y solubles en agua y están generalmente contenidas en las células vivas, pero son liberadas al medio cuando las células mueren o se lisan, como por ejemplo, tras el tratamiento de las aguas con sulfato de cobre. Son 4 producidas por varios géneros de cianobacterias, como Microcystis, Planktothrix spp., Anabaena y Nostoc spp. (Funari y Testai, 2008). Su mecanismo de acción está asociado con la inhibición específica de fosfatasas de las proteínas serina/treonina (PP1 y PP2A), alterando la fosforilación de las proteínas celulares implicadas en la transducción de señales (Gehringer, 2004). El estrés oxidativo también constituye un importante mecanismo de acción por la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO) demostrado in vitro (Nong y cols., 2007; Pichardo y cols., 2007; Puerto y cols., 2009b,c, 2010; Zhang y cols., 2008) e in vivo (Atencio y cols., 2008; Ding y cols., 1998; Jos y cols., 2005). También pueden actuar como promotores tumorales. En este sentido, la MC-LR ha sido clasificada como “posiblemente cancerígena para los seres humanos” (grupo 2B) por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC). Los riesgos para la salud por exposición a MCs, han llevado a la Organización Mundial de la Salud (OMS), (WHO, 1998) a establecer una ingesta diaria tolerable provisional (IDTP) de 0,04 µg MC-LR/kg de peso corporal/día y un valor guía recomendado de 1 µg/L en el agua potable (van Apeldoorn y cols., 2007). Por otro lado, las nodularinas (NODs) comparten con las MCs una estructura química similar, ya que son péptidos cíclicos con 5 aminoácidos (Fig. 2) y cuentan también con la capacidad de producir inhibición de fosfatasas (Yoshizawa y cols., 1990). Figura 2. Estructura química de las nodularinas. Aunque las NODs son promotoras de tumores (Song y cols., 1999), de acuerdo con la evaluación de la IARC no son clasificables en cuanto a su carcinogenicidad en 5 seres humanos (Grupo 3), debido a la escasez de datos disponibles hasta el momento (IARC, 2006). 1.2.2. Neurotoxinas Aunque con diferentes mecanismos, todas las neurotoxinas que se conocen actúan sobre el sistema neuromuscular mediante el bloqueo de los músculos esqueléticos y respiratorios, lo que lleva a la muerte por insuficiencia respiratoria. Las principales toxinas englobadas en este grupo son anatoxinas y saxitoxinas. La anatoxina-a es el éster fosfórico de N-hidroxiguanidina, que inhibe irreversiblemente la actividad de la acetilcolinesterasa en las uniones neuromusculares, bloqueando la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina, que se acumula provocando hiperexcitabilidad del sistema nervioso (Carmichael y Falconer, 1993). 1.2.3. Citotoxinas Dentro del grupo de las citotoxinas cabe destacar la cilindrospermopsina (CYN), la cual es un alcaloide tricíclico derivado de la guanidina combinado con un grupo de hidroximetiluracilo (Fig. 3). Figura 3. Estructura química de la cilindrospermopsina. Hasta la fecha se han descubierto 5 variantes: la CYN, 7-epicilindrospermopsina, 7-desoxicilindrospermopsina, 7-desoxi-desulfo-cilindrospermopsina, 7-desoxi-desulfo12-acetilcilindrospermopsina (Wimmer y cols., 2014). Se considera una citotoxina, ya que produce efectos tanto hepatotóxicos como nefrotóxicos, aunque otros órganos como son bazo, intestinos, timo y corazón, entre otros, también pueden resultar dañados tras la exposición a la misma (Ohtani y cols., 1992; Terao y cols., 1994; Falconer y cols., 1999; Seawright y cols., 1999). La CYN es altamente hidrófila, 6 encontrándose disuelta en el agua en un 70-98%, lo que la hace una toxina principalmente extracelular (Van Apeldoorn y cols., 2007). El mecanismo de acción de la CYN se ha asociado con la inhibición irreversible de la síntesis de proteínas (Terao y cols., 1994) y de glutatión (GSH) (Runnegar y cols., 1994; Humpage y cols., 2005), con la fragmentación del ADN (Žegura y cols., 2011) y, demostrado más recientemente por estudios in vitro e in vivo, con el estrés oxidativo (Gutiérrez-Praena y cols., 2011a, b; Guzmán-Guillén y cols., 2013; Puerto y cols., 2011; Wimmer y cols., 2014). Debido a la toxicidad y ubicuidad de la CYN, la OMS está estudiando establecer como valor guía en aguas de consumo el propuesto por Humpage y Falconer (2003) de 1 μg CYN/l. Este valor de seguridad también ha sido adoptado por el gobierno de Nueva Zelanda, aunque Brasil ha establecido uno muy distinto (15 μg/l) (Burch, 2006). El resto de los países, entre ellos España, carece de legislación al respecto. Del mismo modo, no se ha adoptado todavía ningún valor guía para la CYN en aguas recreativas y de baño. En cuanto a los límites de consumo de la CYN, la ingesta diaria tolerable (IDT) es 0,03 µg/kg p.c. (Humpage y Falconer, 2003). 1.3. Vías de exposición a cianotoxinas Los seres humanos pueden estar expuestos a cianotoxinas directa o indirectamente. Las vías de exposición directas incluyen la ingestión a través del agua potable, así como el contacto dérmico por baño o natación, la inhalación de partículas de aerosol durante duchas, o, el contacto durante la realización de deportes acuáticos, así como la vía intravenosa a través de procedimientos médicos. La exposición indirecta puede ocurrir a través del consumo de productos animales o vegetales que han sido expuestos a cianotoxinas incluyendo los suplementos alimenticios a base de cianobacterias (Blue green algae supplements, BGAs). De todas, la vía oral constituye la más importante, a través del consumo de agua potable o alimentos contaminados (incluyendo los suplementos), o por la ingestión de agua durante actividades recreativas (Wood, 2016). Se ha demostrado que las cianotoxinas pueden bioacumularse de forma que sus efectos tóxicos pueden verse magnificados en la cadena alimentaria (Berry y Lind, 2010). 13 el inconveniente de que podría haber pérdidas de toxina durante el proceso (Testai y cols., 2016). Otro de los principales problemas reside en el control de la ingesta, ya que el consumo de toxinas presentes en el agua potable está naturalmente limitado por las tasas de consumo (con un promedio de 1,5 a 2 l/día), pero existe una problemática importante en el caso de los BGAs, ya que no hay un límite de la cantidad que se puede consumir. Usuarios de estos productos han informado de que las tasas de consumo pueden llegar hasta 20 g/día. Así, la exposición a MCs a través de BGAs puede llegar a ser mayor que a través del agua potable (Gilroy y cols., 2000). La contaminación de BGAs puede deberse a la ubicación inadecuada de los estanques de cultivo (por ejemplo, cerca de las zonas rurales, industriales o agrícolas). La calidad ambiental de estos estanques puede verse afectada por algunos contaminantes tales como metales y especies de cianobacterias potencialmente tóxicas como M. aeruginosa (Vichi y cols., 2012). La posibilidad de cambios en los perfiles toxicológicos de las toxinas producidas por algunas especies, bajo estrés ambiental, es un problema adicional con motivo de preocupación (Bernard y cols., 2011). Se ha demostrado ampliamente que estos elementos contaminantes (metales y cianotoxinas) poseen una gran capacidad de bioacumularse en cianobacterias a través de procesos de absorción, por lo tanto, los productos finales fabricados a partir de dicha biomasa pueden ser potencialmente peligrosos para la salud humana (Rzymski y cols., 2014a, b). Además, como algunos BGAs están específicamente dirigidos a bebés y niños con trastornos de hiperactividad de déficit de atención (TDAH), estos grupos de consumidores podrían estar potencialmente más expuestos a MCs (Dietrich y Hoeger, 2005; Ibelings y Chorus, 2007; Heussner y cols., 2012; Vichi y cols., 2012). Cada cianotoxina puede ser producida por más de una especie de cianobacteria, como también la misma especie tiene la capacidad de producir más de una toxina y de esta forma contaminar en gran medida los productos finales. Dentro de una sola especie, pueden concurrir distintos genotipos, algunos de los cuales poseen el gen para producir toxinas y otros no (Kurmayer y cols., 2002). Por tanto, las 14 variaciones en las concentraciones de cianotoxinas detectadas en los lagos son el resultado de poblaciones dinámicas (Dittman y Börner, 2005). Para proteger a los consumidores de los efectos adversos de toxinas y, mediante la aplicación de un enfoque similar al utilizado por la OMS para el agua potable, con un valor límite provisional de 1 μg/l para MC-LR, y una IDT para MC-LR en BGAs de 1 μg/g p.s. (WHO, 1998, 2006), la División de Salud y el Departamento de Agricultura de Oregón establecieron un límite reglamentario de 1 μg MCs/g p.s. de BGAs, al encontrar MCs en 85 de 87 muestras analizadas, con 63 muestras (72%) que contenían concentraciones > 1 μg/g (Gilroy y cols., 2000). Sin embargo, este límite no tiene ningún valor legal, y se han encontrado niveles superiores de dichas cianobacterias en un número considerable de muestras comercializadas (Gilroy y cols., 2000; Dietrich y Hoeger, 2005). En cuanto a los análisis realizados en BGAs a base de Spirulina, productos procedentes de EE.UU. analizados mediante ELISA presentaban un rango promedio de 0,15 a 0,52 μg MC-LR eq/g y la concentración máxima fue 2,12 μg MC-LR eq/g, siendo MC-LR la variante de MC más tóxica, el congénere predominante junto a MC-LA (Tabla 1) (Gilroy y cols., 2000). Debido a que la potencia tóxica de esta última es similar a la de MC-LR (Harada, 1996), es probable que el uso de ELISA para el análisis de MCs en BGAs subestime, hasta cierto punto, la presencia de MCs tóxicas (Gilroy y cols., 2000). Posteriormente, Jiang y cols. (2008) analizaron 36 tipos de productos comerciales de Spirulina de diversos orígenes, detectando cantidades muy pequeñas de las tres MCs más comunes (-LR, -RR e -YR) mediante LC-MS/MS, conteniendo el 94% de las mismas concentraciones en un rango medio de 2-136 ng/g de MCs y un máximo de 0,163 μg MCs/g (Tabla 1). A pesar de que la Spirulina se encuentra en la lista de sustancias GRAS (generalmente reconocida como segura) de la FDA (Testai y cols., 2016), se han identificado epoxianatoxina-a e hidrohomoanatoxina-a en BGAs de Spirulina (Draisci y cols., 2001). Además, también fue evidenciada su capacidad de producir pequeñas concentraciones de MCs y anatoxinas (Ballot y cols., 2004, 2005). 15 Es posible comparar el nivel de MC-LR ingerido diariamente con el valor provisional de IDT propuesto por la OMS de 0,04 μg/kg/día; cuando los niveles de exposición son inferiores a la IDT, se puede anticipar que el consumo crónico de BGAs no compromete la salud. En caso de que la exposición se aproxime al valor de la IDT, sería apropiado considerar también otras fuentes de exposición. De hecho, el consumo de productos contaminados, agua potable o pescado podría contribuir de manera significativa a superar el umbral de preocupación por el valor de la IDT y podría ser útil estimar el porcentaje de la ingestión total atribuible a BGAs (Funari y Testai, 2008). En cuanto al empleo de AFA como base de productos BGAs disponibles comercialmente, se recolecta en su mayoría en el lago Klamath (Oregón, EE.UU.) donde crece de forma natural a altas densidades. Por lo tanto, existe la posibilidad de incluir otros organismos como cianobacterias productoras de toxinas en su recolección, en contraste con otras cianobacterias que se utilizan para el consumo humano tales como Spirulina (que generalmente se cultiva en estanques artificiales) (Carmichael y cols., 2000). Diversas investigaciones han encontrado altos niveles de cianotoxinas en productos BGAs (Lawrence y Menard, 2001; Saker y cols., 2005), a veces incluso mayores que el valor guía provisional de 0,1 μg/g p.s propuesto por la División de Salud y por el Departamento de Agricultura de Oregón, observándose una concentración máxima de 18,40 μg MC-LR eq/g de AFA (Gilroy y cols., 2000). Un nivel máximo inferior se ha observado en productos testados procedentes de Suiza de 4 μg MCs/g (MC-RR, -YR, -LR, -LA) (Ortelli y cols., 2008). Por otro lado, Vichi y cols. (2012) detectaron y cuantificaron niveles de MCs en una variedad de marcas de BGAs disponibles en herboristerías y otros negocios de Roma (Italia) usando LC-MS/MS en combinación con ELISA y PCR, obteniéndose 0,86 µg MCs/g como valor medio y 5,20 µg MCs/g como valor máximo (valor referido a la suma de MCs) (Tabla 2). Los productos de Spirulina analizados por estos mismos autores por el contrario mostraron niveles por debajo del límite de detección Seis muestras de AFA evaluadas dieron positivo para la contaminación de MCs, con un rango de 0,4-2,2 µg/g MC-LR, la mayoría también contenían trazas de MC-LA 16 siendo detectada por el test de inhibición de la fosfatasa alcalina (PPIA), ELISA y LCMS/MS (sin mostrar diferencias significativas entre ellos) (Heussner y cols., 2012). Gracias a esta combinación de métodos no sólo se detecta la presencia de toxinas, sino que también permiten conocer la fuente de producción de las mismas (Vichi y cols., 2012). Sólo una publicación investigó el análisis de NODs en BGAs, demostrando que estas toxinas no se detectaron en 18 muestras de productos a base de AFA, Spirulina y Chlorella del mercado alemán por PPIA, ELISA and LC-MS/MS (Heussner y cols., 2012). Tabla 1. Estudios referentes a BGAs de Spirulina Spirulina, Valor Máximo (y rango medio) Referencia y técnica analítica 2,12 µg MC-LR eq/g (0,15-0,52 µg MC-LR eq/g) Gilroy y cols., 2000 (EE.UU.) ELISA Por debajo del límite de detección: 0,00120,015 µg/g (suma de MCs, MC-RR, -YR, -LR, - LA) Vichi y cols., 2012 (Italia) LC-MS/MS Por debajo del límite de detección: 0,1 µg/g (suma de MCs, MC-RR, -YR, -LR, -LA) Ortelli y cols., 2008 (Suiza) UPLC/MS Rango medio: 0,047 μg MC-LR eq/g Yu y cols., 2002 (Taiwan) ELISA 0,163 µg MCs/g (0,014 µg MCs/g) Jiang y cols., 2008 (China) LC-MS/MS 17 Tabla 2. Estudios referentes a BGAs de AFA AFA, Valor Máximo (y rango medio) Referencia y técnica analítica 18,40 µg MC-LR eq/g (2,15-10,89 µg MC-LR eq/g) Gilroy y cols., 2000 (EE.UU.) ELISA 5,20 µg MCs/g (0,86 µg MCs/g) (suma de MCs, MC-RR, -YR, -LR, -LA) Vichi y cols., 2012 (Italia) LC-MS/MS 4 µg/g (suma de MCs, MC-RR, -YR, -LR, -LA) Ortelli y cols., 2008 (Suiza) UPLC/MS 2,531 µg MC-LR eq/g Vinogradova y cols., 2011 (Irlanda) SPR Rango medio: 0,050 μg MC-LR eq/g Yu y cols., 2002 (Taiwan) ELISA Respecto a los BGAs de Chlorella, los niveles obtenidos van desde valores por debajo del límite de detección (0,01 μg/g) a 0,036 μg MC-LR eq/g en productos de Taiwan por ELISA (Yu y cols., 2002). Otro estudio realizado con productos de mercados alemanes y suecos demostró que 8 de cada 13 productos excedieron el límite propuesto de 0,1 µg/g (Hoeger y cols., 2004). Antes del aumento general de la concienciación y de que las regulaciones empezasen a ser implantadas, se hallaron niveles de MCs en BGAs de hasta 35 μg/g (Gilroy y cols., 2000; Lawrence y Menard, 2001), con un porcentaje importante de muestras que alcanzaron niveles de MC-LR ≥1 μg/g p.s. (Dietrich y Hoeger, 2005; Saker 18 y cols., 2005). Cuando se secuenciaron dos genes del clúster MC sintetasa en muestras de BGAs, los resultados mostraron que M. aeruginosa era la fuente de contaminación (Saker y cols., 2005), sugiriendo que, aparte de Spirulina y AFA, se pueden obtener otras cianobacterias productoras de toxinas accidentalmente durante los procesos de recolección de la naturaleza (Funari y Testai, 2008). Los métodos químicos o bioquímicos tales como HPLC, ELISA y PPIA utilizados en estudios previos no proporcionan ninguna información sobre la fuente del contaminante, no se emplean para identificar sólo detectan la presencia de toxinas (Gilroy y cols., 2000). Saker y cols. (2005) proponen para el re-análisis de las muestras recolectadas en el estudio realizado por Health Canada (Lawrence y Menard, 2001) una técnica molecular que involucra la amplificación del gen 16s ARNr, el operón de la ficocianina y los dos genes del gen clúster de MC sintetasa. Con esta técnica se pudo demostrar que las 12 muestras de BGAs testadas, con diverso origen y que contenían AFA no tóxica, también presentaban cianobacterias toxigénicas. La presencia de MCs en BGAs se confirmó por ELISA, con concentraciones dentro del rango de 0,1-4,72 µg/g de BGAs por kg (equivalentes de MC-LR) (Saker y cols., 2005). La presencia de cepas toxigénicas de Microcystis en todos los suplementos alimenticios producidos a partir de la cianobacteria no tóxica AFA también fue demostrada por Saker y cols. (2007) usando la técnica MúltiplexPCR. El creciente interés en el uso de técnicas moleculares conduce a la identificación de los genes responsables de la producción de algunas otras toxinas de cianobacterias como CYN (Schembri y cols., 2001) y NOD (Moffitt y Neilan, 2001). Si se utilizan en combinación con otras técnicas químicas y bioquímicas tales como HPLC, ELISA y el PPIA, las técnicas moleculares podrían ser útiles para la rápida y sensible detección, monitorización y control de calidad de los productos destinados al consumo humano que contienen cianobacterias (Saker y cols., 2005). Además, para la industria, se podrían determinar así periodos de cultivo más seguros (Saker y cols., 2007; Vichi y cols., 2012). Por otro lado, también pueden usarse como “prescreening” para determinar qué muestras requieren una evaluación continua de toxinas, ayudando en las evaluaciones del riesgo para el establecimiento de concentraciones límite BGAs (Yakes y cols., 2015). No obstante, ninguno de los métodos ha sido aún validado 19 totalmente para el análisis de cianotoxinas en BGAs (Heussner y cols., 2012; Saker y cols., 2007), excepto el método de screening basado en biosensores SPR, que ha sido evaluado como método cuantitativo para la detección de MCs en agua y en BGAs (Yakes y cols., 2014). En el "peor caso" de exposición, un adulto puede consumir diariamente 20 g de BGAs que estén contaminados con el mayor nivel de MC-LR hallado en estos productos (35 μg/g p.s.), dando lugar a la ingestión de 700 μg/día para un adulto de 70 kg, que sería 250 veces mayor a la IDT (2,8 μg/día para un adulto de 70 kg). Este caso descrito implicaría una dosis tan alta que representaría también un efecto agudo. De hecho, haciendo referencia a la dosis aguda sin efecto (2,5 μg/kg p.c.), un adulto estándar de 70 kg puede ingerir hasta 175 μg MCs sin experimentar efectos apreciables en su salud. Por lo tanto, la dosis ingerida (700 μg/día) sería lo suficientemente alta como para producir efectos agudos hepáticos significativos. En tal caso, el lote contaminado de BGAs debe ser inmediatamente retirado del mercado, ya que es imposible controlar su consumo individual. Asimismo, habría que dar indicaciones de reducción de la dosis. También se debe tener en cuenta el uso continuado durante 2 ó 3 meses (es decir, durante un régimen de dieta hipocalórica para perder peso), donde podría ser útil considerar la dosis de referencia aguda, que es 0,4 μg/kg p.c./día para MC-LR, correspondiente a 28 μg/día para un adulto de 70 kg. En este caso, el consumo sería 25 veces mayor que el umbral para un adulto de 70 kg (700 μg/día), y mucho mayor para los niños cuando se administran como tratamiento para el TDAH. De hecho, en esta etapa, teniendo en cuenta un menor peso corporal, incluso considerando un consumo reducido de BGAs, la ingesta de MCs puede tener como consecuencia un grave riesgo para su salud (Funari y Testai, 2008). 5. CONCLUSIONES De lo anteriormente expuesto se puede concluir lo siguiente: En conjunto, los hallazgos mencionados indican la necesidad de un control sistemático de la calidad y la evaluación de los BGAs disponibles en el mercado. Esto 20 puede, sin embargo, ser un serio desafío si se considera el gran número de diferentes fabricantes y las distintas vías de distribución, incluyendo las ventas on-line que están menos sujetas a control. Debido a la actual falta de reglamentación adecuada, la seguridad de los suplementos alimenticios reside en la investigación científica que parte de un programa de monitorización a fondo. Ante esta problemática se debería implantar una normativa más estricta formulando medidas a través de leyes internacionales y nacionales necesarias para preservar ambientes acuáticos así como la salud humana, que no sólo contemplen el consumo único sino también el crónico. Además, se debería incluir la implementación de planes de prevención, información y alerta sobre la toxicidad a consumidores y vendedores por parte de las autoridades así como su inclusión en el correspondiente etiquetado. La ausencia de advertencias de los productos de venta junto a las grandes campañas de publicidad y marketing que se están lanzando en los últimos años, destacando la reciente en la Exposición Internacional de Milán (2015) que portaba el eslogan «Alimentar el planeta, energía para la vida», les proporciona una falsa identidad de inocuidad, lo que atrae mayor consumo. De hecho, en esta última campaña se pretende usar la Spirulina para luchar contra la malnutrición escolar denominándose “el alimento de los dioses”. Atendiendo a los resultados estudiados, los métodos de detección empleados resultan ser de gran utilidad como control de calidad. Cabe destacar la eficiencia en el uso de distintos métodos (técnicas analíticas y moleculares) en combinación, ya que no sólo se detecta la presencia de toxinas sino que también permiten conocer la fuente de producción de las mismas, resultando de gran importancia los métodos moleculares como pre-screnning y clean-up inicial evitando posibles interferencias en técnicas analíticas usadas posteriormente. Además, la información recogida en estos trabajos puede emplearse en alertar a los productores de los períodos en los que se debería incrementar la vigilancia sobre todo en productos obtenidos directamente del medio ambiente, así como la monitorización continua de agua, alimentos y BGAs. Y, lo más importante, la necesidad de controlar la eutrofización y, subsecuentemente, reducir la exposición a cianotoxinas. 21 6. BIBLIOGRAFÍA -Atencio L, Moreno IM, Pichardo S, Jos A, Moyano R, Blanco A, et al. Dose-dependent antioxidant responses and pathological changes in Tenca (Tinca tinca) after acute oral exposure to microcystins from toxic cyanobacterial blooms. Toxicon. 2008; 5: 1–12. -Ballot A, Krienitz L, Kotut K, Wiegand C, Metcalf JS, Codd GA, et al. Cyanobacteria and cyanobacterial toxins in three alkaline Rift Valley lakes of Kenya-Lakes Bogoria, Nakuru and Elmenteita. J. Plankton Res. 2004; 26: 925–935. -Ballot A, Krienitz L, Kotut K, Wiegand C, Pflugmacher S. Cyanobacteria and cyanobacterial toxins in the alkaline crater lakes Sonachi and Simbi, Kenya. Harmful Algae. 2005; 4: 139–150. -Belay A, Ota Y, Miyakawa K, Shimamatsu H. Production of high quality Spirulina at Earthrise Farms. In: Phang et al., eds. Algal Biotechnology in Asia-Pacific Region. 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