Producción de quitinasas a partir de subproductos de la industria alimentaria: aplicación a los hongos comestibles y crustáceos

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA: Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”. Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Farmacia por: ANABELL DEL ROCÍO URBINA SALAZAR Sevilla, 2019 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia Prof. Dr. José Luis Venero Recio C / Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 3803 e-mail: [email protected] José Luis Venero Recio, Catedrático de Universidad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla (NRP: A05000880376924), Director del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, de la Facultad de Farmacia, de la Universidad de Sevilla. Informa: Que la tesis doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA: Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”, presentada por la doctoranda Anabell Del Rocío Urbina Salazar, para optar por el título de Doctor en Farmacia por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, bajo la dirección de los Drs.: Juan Dionisio Bautista Palomas y Juan Parrado Rubio, reuniendo todo los requisitos necesarios para presentarse a su defensa. Fdo: José Luis Venero Recio (Director del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular). UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia Juan Dionisio Bautista Palomas, Catedrático de Universidad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla (NRP: A0500-5159678268), y Juan Parrado Rubio, Catedrático de Universidad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla (NRP: A0500-2729451168), adscritos al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, de la Facultad de Farmacia, de la Universidad de Sevilla. Informan: Que la Tesis Doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA: Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”, realizada por Anabell Del Rocío Urbina Salazar para optar al título de Doctor en Farmacia por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (Facultad de Farmacia), Universidad de Sevilla. Y que dicha tesis reúne todos los requisitos académicos y experimentales necesarios para proceder a su presentación y defensa. Fdo.: Dr. Juan Dionisio Bautista Palomas Fdo.: Dr. Juan Parrado Rubio (Director de Tesis) (Director de Tesis) PUBLICACIONES Parte de los resultados presentados en esta Tesis doctoral, han sido publicados en los siguientes artículos: Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Falcón-García G., CarboneroAguilar P., Rodríguez-Morgado B., del Campo J.A., Parrado J., Bautista J., (2018). Chitinase Production by Trichoderma harzianum Grown on a Chitin-Rich Mushroom Byproduct Formulated Medium. Waste and Biomass Valorization. https://doi.org/10.1007/s12649-018-0328-4. Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., CarboneroAguilar P., Rodríguez-Morgado B., Parrado J., Bautista J., (2018). Hydrolytic enzymes production by Bacillus licheniformis growth on fermentation media formulated with sewage sludge. Journal of Biotech Research, 9:14-26. Parte de los resultados presentados en esta tesis doctoral han sido presentados en los siguientes Congresos y Jornadas: Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., FalcónGarcía G., and Bautista J., (2017). Production of chitinases by submerged fermentation in media formulated with colloidal chitin of fungi. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017. Urbina-Salazar A.R, Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., Cremades O., and Bautista J., (2018). Mushroom ergothioneine enriched aqueous extracts (M-ERG-EAE) suppress TNF-α and MMP-1 expression in UVirradiated human dermal fibroblasts. Póster en Congreso. IV JORNADAS DOCTORALES DE LA UNIVERSIDAD DE MURCIA. Murcia, Mayo 2018. Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., and Bautista J., (2018). Preparation of fungalnano chitin crystals: aplication to mushroom (Agaricus bisporus) by - products. Póster en Congreso. IPAP18 INNOVATIONS IN PHARMACY (ADVANCES & PERSPECTIVES). Salamanca, Septiembre 2018. Urbina-Salazar A.R., (2018). Producción de quitinasas a partir de los subproductos de la industria agroalimentaria: Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos. Comunicación Oral. III JORNADAS DOCTORALES DE FARMACIA. Sevilla, Julio 2018. Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., CarboneroAguilar P. and Bautista J., (2017). Preparation of fungal chitin from agroindustrial by-products: Aplication to edible mushrooms (Agaricus bisporus) by-products. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017. Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Cremades O. and Bautista J., (2018) “In vitro” study of mushroom ergothioneine enriched aqueous extracts (M-ERG-EAE) against oxygen activated substances. Póster en Congreso. IV JORNADAS DOCTORALES DE LA UNIVERSIDAD DE MURCIA. Murcia, Mayo 2018. Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., and Bautista J., (2018). Preparation of nanochitin from crawfish (Procambarus clarkii) byproducts. Póster en Congreso. IPAP18 INNOVATIONS IN PHARMACY (ADVANCES & PERSPECTIVES). Salamanca, Septiembre 2018. Carbonero-Aguilar P., Falcón-García G., Urbina-Salazar A.R., IncaTorres A.R., and Bautista J., (2017). Use of crayfish (Procambarus clarkii) chitin as carbon source for the production of chitinases by submerged fermentation. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017. Falcón-García G., Carbonero-Aguilar P., Inca-Torres A.R., UrbinaSalazar A.R., and Bautista J., (2017). Production of Crawfish (Procambarus clarkii) chitin enriched fractions by enzymatic procedures for fermentation uses and chitin-oligosaccharides production. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017. Rodríguez-Morgado B., Caballero Jiménez P., Inca-Torres A.R., UrbinaSalazar A.R., Parrado J., Tejada M., (2016). Obtaining a soil biostimulant from sewage sludge: Effect on soil biochemistry. Póster en Congreso. 5th International Conference Enzymes in the Environment. Ecology, Activity and Application. Bangor, Gales, Reino Unido. 2016. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia Esta Tesis se ha realizado gracias a la financiación de los siguientes Proyectos de Investigación: Proyecto: Aumento del contenido de vitamina D en champiñón fresco (CHAMPI-D). (Ref.: RTC2015-4039-2), Ministerio de Economía y Competitividad, del gobierno de España. Proyecto: Valorización de fibras celulósicas y de quitina obtenidas de subproductos de la industria agroalimentaria mediante el desarrollo de biocomposites poliméricos (VALORIZAGRO). (Ref.: PRJ201702958), FIUS, Universidad de Sevilla AGRADECIMIENTOS La gratitud es la clave que convierte los problemas en bendición y lo inesperado en regalos. Hoy es uno de esos días en el que me siento muy agradecida de tener personas tan increíbles y maravillosas en mi vida. Primeramente agradezco al Profesor Juan D. Bautista Palomas por confiar en mí y abrirme las puertas de su laboratorio brindándome todas las facilidades para poder desarrollar este trabajo de investigación, gracias por todo tu tiempo, por el apoyo, por tus consejos y por todo lo que me has enseñando… en fin me siento muy agradecida debido a que sin tu apoyo no hubiese sido posible cumplir cada una de mis metas propuestas. A mis compañeros del grupo de investigación y demás compañeros del departamento también un sincero agradecimiento. Sonrío, no porque mi vida es perfecta sino porque aprecio lo que tengo y a quien tengo a mi lado gracias Renato por ser una persona muy importante en vida, por ser mi esposo, amigo, compañero, colega y compi de piso, gracias por estar conmigo en los buenos y sobretodo en los malos momentos, gracias por ser mi apoyo incondicional y darme las fuerzas para seguir adelante siempre diciéndome “ya falta poco”, gracias por estar conmigo en esos momentos difíciles cuando en poco tiempo perdí a mis abuelitos y sin poder hacer nada ni poder estar allí en esos momentos fuiste tú quien me dio las fuerzas necesarias para poder reponerme y seguir. Gracias por todo tu amor, cariño, comprensión y sobretodo tu paciencia. Yo sé que juntos lograremos llegar al final y cumplir todas las metas planteadas. Solo tú y yo sabemos lo que nos ha costado esto. Estoy tan agradecida de ser quien soy y estar donde estoy, esto se los debo a mis padres Méntor y Juanita quienes desde muy pequeñita me han enseñado buenos valores como el respeto, humildad, honestidad, la responsabilidad y sobretodo la gratitud, quienes a pesar de estar muy lejos bastaba con unas palabras de ánimo para seguir adelante, gracias por apoyarnos en este camino y por confiar en nosotros, siempre estaré muy agradecida con ustedes……… A mis hermanos Geovanny, Jeanette y Anthony los llevo siempre en mi corazón, gracias por brindarme todo su cariño y por apoyarnos …… A mis sobrinos Naye, Dennis, Pame, Andy, Majo, Samy y Renata soy una tía muy afortunada cada uno de ustedes tiene un lugar muy importante en mi corazón. A Dn Walter, Myriam y Vale por estar siempre pendientes de nosotros. Me siento muy agradecida con Dios por darme unos padres que son mi orgullo, un esposo increíble, hermanos, sobrinos y demás familiares que han aportado de cierta manera para cumplir con cada uno de mis objetivos, gracias por guiarme siempre por el buen camino y por darme la Salud y la vida. Sabiendo que no existirá una forma de agradecer una vida de sacrificio y esfuerzo, quiero que sientan que el objetivo logrado también es de ustedes y que la fuerza que me ayudo a conseguirlo fue su apoyo. Anabell ÍNDICE Índice RESUMEN ............................................................................................. iii ABSTRACT ............................................................................................ v GLOSARIO ............................................................................................ xi 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................. 3 1.1 Quitinasas...................................................................................................... 3 1.1.1 Generalidades .............................................................................. 3 1.1.2 Clasificación de las quitinasas .................................................... 6 - Clasificación según la Comisión de Enzimas de la IUPAC.......... 7 - Clasificación basada en la secuencia aminoacídica y ordenamiento espacial (arquitectura de dominios) ....................... 7 - Clasificación basada en el mecanismo ........................................ 10 1.1.3 Importancia y Aplicaciones de las Quitinasas .......................... 12 1.3.1.1 Quitinasas y Agronomía ........................................................ 15 1.1.3.2 Quitinasas en la Industria Alimentaria ................................... 19 1.1.3.3 Otras Aplicaciones de Quitinasas .......................................... 20 1.1.4 Producción de Quitinasas por Fermentación ............................ 20 a) Fermentación en Medio Sólido ................................................... 21 b) Fermentación en Estado líquido o Sumergida ............................ 23 c) Fermentación Discontinua .......................................................... 24 d) Fermentación Continua ............................................................... 24 1.1.4.1 Microorganismos ................................................................... 25 1.1.4.2 Factores extrínsecos de Cultivo ............................................. 27 1.4.3 Medios de cultivo (Sustratos) ................................................... 28 1.2 Subproductos Agroindustriales ricos en Quitina como fuente de fermentación para la producción de quitinasas. ............................................. 30 1.2.1 Subproductos de la Industria de Hongos y Setas Comestibles . 32 1.2.2 Subproductos de la Industria de Crustáceos ............................. 40 2. OBJETIVOS ..................................................................................... 49 2.1 Objetivo General................................................................................... 49 2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 49 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................ 53 3.1. Reactivos, Materiales y Equipos ................................................................ 53 3.1.1 Reactivos ................................................................................... 53 3.1.2. Materiales ................................................................................. 57 3.1.3 Equipos ..................................................................................... 59 3.2. Microorganismos ....................................................................................... 61 3.3. Subproductos .............................................................................................. 62 3.4 Estabilización de los subproductos y generación de sustratos .................. 64 3.4.1 Secado y molienda .................................................................... 64 3.4.2 Preparación de la Fracción enriquecida de Quitina/Glucano de champiñones ........................................................................... 67 3.5 Caracterización de los Sustratos ................................................................ 69 3.5.1 Humedad ................................................................................... 69 3.5.2 Cenizas .............................................................................. 70 3.5.3 Grasas ................................................................................ 70 3.5.4 Nitrógeno Total ................................................................. 70 3.5.5 Cuantificación de Proteínas en Subproductos y Sustrato . 71 3.5.6 Hidratos de Carbono ......................................................... 71 3.6 Fermentaciones ........................................................................................... 72 3.6.1 Fermentación sumergida (FS) ................................................... 73 a) Microorganismos y preparación del Inóculo ............................. 73 b) Preparación de la fuente de carbono (Quitina coloidal) ............ 74 c) Medios de cultivo y condiciones de crecimiento ......................... 75  Condiciones de crecimiento de Bacillus licheniformis ATCC 21415 ........................................................................................... 78  Condiciones de crecimiento de Trichoderma ............................. 78 3.6.2 Fermentación en estado sólido (FES) ....................................... 78 3.7 Caracterización de las fermentaciones ...................................................... 81 3.7.1 Determinación de la Biomasa ................................................... 81 3.7.2 Ensayos Enzimáticos ........................................................ 82 a) Ensayo de Actividad Quitinasa ................................................... 83 b) Ensayo de Actividad Celulasa..................................................... 85 c) Ensayo de Actividad Xilanasa .................................................... 86 d) Ensayo de Actividad Proteasa ..................................................... 87 e) Cálculo de actividades enzimáticas en UI/mL ............................... 88 3.7.3 Cuantificación de Proteínas solubles ........................................ 89 3.8 Concentración por Ultrafiltración ................................................ 91 3.9 Estudio del secretoma ................................................................................. 93 3.9.1 Análisis electroforético (PAGE-SDS) ............................... 93  Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS) .. 95 3.9.2 Tinción por afinidad (Zimografía) ............................................ 98 3.9.3 Análisis proteómico .......................................................... 98 3.10 Estabilización de Quitinasas................................................................... 102 3.11 Producción de quitinasas en un reactor tipo tambor rotativo (escala semi-piloto). ..................................................................................................... 102 3.12 Análisis de datos ...................................................................................... 103 4. RESULTADOS Y DISCUSIONES ............................................... 107 4.1. Subproductos y sustratos ......................................................................... 107 4.1.1. Recopilación de subproductos ............................................... 108 4.1.2. Preparación de los sustratos ................................................... 109 4.1.3. Caracterización de los sustratos ............................................. 112 4.2. Fermentaciones ........................................................................................ 114 4.2.1. Fermentación sumergida (FS) ................................................ 115 4.2.2. Fermentación en estado sólido (FES) .................................... 124 4.2.3 Análisis de la producción relativa (UI/L/día) ......................... 130 4.2.4 Análisis de la producción total (UI) ........................................ 135 4.3 Aproximación al secretoma de T. harzianum CEC-T24 crecido en medios ricos en quitina................................................................................................ 141 4.4 Producción de hidrolasas ......................................................................... 174 4.5 Producción de quitinasas a escala semi-piloto. ....................................... 181 5. CONCLUSIONES .......................................................................... 185 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 191 ANEXOS .............................................................................................. 214 CEC-T24 crecido en FS y FES en diferentes medios, tras 6 días de fermentación. Tabla-R.8. Producción total de quitinasas obtenidas en FS y FES tras 6 días de fermentación. Tabla R.9. Número de Proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 con actividad hidrolítica. Tabla R.10. Proteínas específicas secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en FES en un medio formulado con HTCH. Tabla R.11. Proteínas específicas secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en FES en un medio formulado con F-Q/G. Tabla R.12. Proteínas específicas secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en FES en un medio formulado con HC. Tabla R.13. Ensayo de actividades enzimáticas. Tabla R.14. Producción y producción relativa de actividad quitinasa en un reactor tubular rotatorio a escala semi-piloto. RESUMEN P á g i n a | iii Resumen RESUMEN La quitina, es un polímero lineal β-1,4 de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), es un importante componente estructural de la mayoría de los crustáceos, insectos, algas y hongos. Las quitinasas son enzimas que degradan la quitina a quitino-oligosacáridos y acetil glucosamina y son sintetizadas principalmente por bacterias y hongos. Estas enzimas tienen aplicaciones potenciales en la industria farmacéutica, alimentaria y agronómica donde podrían desempeñar un importante papel en biocontrol y en el tratamiento de enfermedades de las plantas, debido a que no son tóxicas, son biodegradables y biocompatibles. En este trabajo se ha estudiado la producción de quitinasas por Bacillus licheniformis ATCC 21415, Trichoderma atroviride CEC-T23 y Trichoderma harzianum CEC-T24 crecidos en diferentes medios de cultivo formulados con subproductos agroindustriales ricos en quitina procedentes de hongos comestibles (Agaricus Bisporus) y crustáceos (Procambarus clarkii) como fuente principal de carbono en un intento de producir estas enzimas de una manera económicamente viable, y darle un uso práctico a estos subproductos, además del de poder utilizarse como fuente de partida para obtener quitina. Lo que es habitual en el caso de los subproductos de crustáceos pero, hasta la fecha, no lo es para los subproductos de la industria de los hongos y setas comestibles. Este trabajo es uno de los primeros, sino el primero, que aborda de manera sistemática la utilización de los subproductos ricos en quitina de la industria de los hongos y setas comestibles para obtener productos de P á g i n a | iv Resumen alto valor añadido, diferentes de la quitina y el quitosano. Concretamente nos hemos centrado en el estudio de la producción de enzimas hidrolíticas, fundamentalmente quitinasas. Para ello se ha procedido de la siguiente manera:  Estudio de la preparación y caracterización de la fuentes de fermentación a partir de subproductos agroindustriales (harina de tallos de champiñón, HTCH, Fraccion enriquecida de quitina y glucano, F-Q/G, y harina de cangrejo, CFM).  Estudio de la producción de quitinasas por fermentación en estado sólido (FES) y fermentación sumergida (FS)  Estudio de la extracción, concentración/fraccionamiento y estabilización de enzimas (quitinasas).  Estudio de la secreción de proteínas (secretoma) de B. licheniformis ATCC 21415 o T. harzianum CEC-T24 crecido en los diferentes medios de cultivo, mediante técnicas electroforéticas y proteómica.  Estudio de la producción de quitinasas a escala semi-piloto.  Estudio de la estabilización y/o inmovilización de concentrado de quitinasas en forma de nano/micropartículas para su uso como plaguicida alternativo al uso de productos químicos altamente tóxicos para el medio ambiente. De nuestros resultados podemos concluir que todos los microorganismos produjeron una mayor producción de actividad quitinasa en un medio formulado con HTCH y F-Q/G como fuente de carbono en comparación con los medios formulados con Qp o Qc. De los tres microorganismos utilizados en este estudio, T. harzianum CEC- P á g i n a | v Resumen T24 mostró la mayor productividad de quitinasa (873,98 UI L-1día-1) en el medio HTCH+A en Fermentación en estado sólido. La producción de quitinasa se controló mediante la medida de actividad y de proteína y el perfil de enzimas/proteínas secretadas al medio de cultivo se ha seguido, en un principio, por PAGE-SDS. El análisis electroforético permitió la detección de 25 proteínas diferentes entre ellas cinco quitinasas con masas moleculares 82, 65, 48, 31 y 25 kDa, respectivamente. Sin embargo, cuando se estudian las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 en los diferentes medios, es decir, cuando analizamos su secretoma, mediante técnicas proteómicas el número de enzimas/proteínas detectadas es mucho mayor: 183 en medios formulados con HTCH, 161 en medios formulados con F-Q/G y 91 en medios formulados con HC. Además cuando se crece T. harzianum CEC-T24 en un reactor tipo tambor rotatorio, a escala semi-piloto (1 Kg de medio de cultivo), bien controlado, la productividad es 4,63 veces superior a la descrita para medios aireados en matraces. Estos resultados muestran que el cultivo de T. harzianum CEC-T24 por fermentación en estado sólido, en un medio de fermentación, en un reactor tipo tambor rotatorio, con buen control de aireación y humedad, basado en el uso de subproductos ricos en quitina (HTCH), procedente de la industria del champiñón, barato y abundante representa un buen procedimiento para la producción a gran escala de quitinasas. P á g i n a | iii ABSTRACT P á g i n a | xi Glosario GLOSARIO ACN: Acetonitrilo. AOAC: Método oficial de análisis (Association of Official Analytical Chemists). APS: Persulfato amónico. ATCC: Colección Americana de Cultura Tipo (American Type Culture Collection). BSA: Seroalbúmina bovina. CAZy: Carbohydrate-Active enzymes. CID: Dominio de inserción de quitina. DNS: Ácido dinitrosalicílico. FAO STAT: Organización de las naciones unidas para la alimentación y la agricultura, división de estadística. FAO: Organización de las naciones unidas para la alimentación y la agricultura. FES: Fermentación en estado sólido. F-Q/G: Fracción de quitina/ glucano. FS: Fermentación Sumergida. g: ges o fuerza centrífuga relativa (RCF). GH: Glicosil-hidrolasas o Glicohidrolasas. GlcNAc: N-Acetilglucosamina. HC: Harina de Cangrejo. HC: Hidratos de Carbono. HTCH: Harina de Tallos de Champiñón. IUCN: Unión internacional para la conservación de la naturaleza. IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry/ Union Internacional de Química Pura y Aplicada. KDa: Kilodaltons. LB: CALDO LURIA (Luria Bertani). LTQ-FT: mA: miliamperios. Mm: Medio mínimo. mM: milimolar. MO: Materia orgánica. nm: nanómetros. Nt: Nitrógeno total. p.s: peso seco. p/p: Peso/Peso. p/v: Peso/Volumen. PAGE: Polyacrilamide gel electroporesis. PB: Potato Broth = Extracto de Patata. PDA: patata-dextrosa-agar. PM: Peso Molecular. Qc: Quitina Coloidal. QOS: Quitinoologosacáridos. Qp: Quitina en Polvo. rpm: revoluciones por minuto. SDS: Dodecilsulfato sódico. Sm: Serratia marcescens. TCA: Ácido tricloroacético. TEMED: Tetrametiletilendimina. Agente polimerizador de la acrilamida. TIM: dominio barril (β / α) 8 de la triosfosfato isomerasa. Tm: Toneladas métricas. UI: Unidad Internacional de actividad enzimática. v/v: Volumen/Volumen. %T: Transmitancia. +A= Con Aireación. -A= Sin Aireación. P á g i n a | xii Glosario INTRODUCCIÓN P á g i n a | 3 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Quitinasas 1.1.1 Generalidades Las quitinasas (E.C. 3.2.2.14) representan una clase o grupo de enzimas con un amplio rango de aplicaciones prácticas debido al papel clave que desempeñan en la degradación de polímeros cristalinos. Las quitinasas catalizan la degradación o rotura de enlaces β-14 en la quitina (C8H13O5N)n, segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. La quitina es un componente estructural de la pared de los hongos [Langner y Göhre, 2016], del exoesqueleto e intestino de los insectos y el caparazón de los crustáceos [Merzendorfer, 2003; Hamed y col., 2016]. Enormes cantidades de éste polímero se sintetizan en la biosfera, y alrededor de 1011 toneladas métricas se producen anualmente solo en la biosfera acuática [Tsujibo y col., 1998]. El quitosano se produce tras la desacetilación de este polímero. La quitina puede aparecer de tres formas distintas, que difieren en la orientación de las cadenas polisacarídicas en las microfibrillas, siendo estas: α-, βy γ-quitina (Figura-I.1) [Fortuna-González, 2010]. La αquitina es la más abundante, tiene una configuración antiparalela, presenta una estructura cristalina altamente ordenada causada por un fuerte enlace de H lo que conduce a ser una estructura muy rígida, intratable e insoluble. Las extremidades de cangrejos y conchas de P á g i n a | 4 Introducción camarón así como las paredes celulares de hongos están constituidas por este tipo de quitina [Beier y Bertilsson, 2013]. La β-quitina presenta una configuración paralela y un débil enlace de H, es inestable y soluble en agua, y mientras que la γ-quitina presenta una configuración paralela y antiparalela [Sastoque, 2005]. Las dos últimas tienen propiedades mecánicas más flexibles y son fácilmente degradadas por enzimas especialmente quitinasas. Figura I.1. Diferentes formas de la quitina. La quitina juega un papel muy importante en el esqueleto de ciertos organismos como crustáceos, moluscos, insectos, y hongos constituyendo el 75% del peso de estos organismos (Figura-I.2), siendo estos los necesarios para la producción de quitinasas . P á g i n a | 5 Introducción Figura I.2. Organismos que en su estructura contienen quitina. La hidrólisis enzimática de la quitina a N-acetil-D-glucosamina se lleva a cabo mediante un sistema que implica la participación de dos tipos de hidrolasas: Quitinasas y Quitobiasas. Las quitinasas constituyen un grupo o clase de enzimas con estructuras y mecanismos de acción diversos que determinan/condicionan su utilización/aplicación en los diferentes campos, tales como control de enfermedades de plantas, y plagas de P á g i n a | 6 Introducción insectos [Patil y col., 2000], síntesis de quitinooligosacáridos (QOS) [Yang y col., 2016a] para su uso en la industria alimentaria y química (síntesis de drogas/fármacos), aprovechamiento de residuos y subproductos marinos y agroalimentarios ricos en quitina, y en la producción de bio-fuel [Swiontek y col., 2014; Ramírez y Calzadíaz, 2016]. Aunque la clasificación, características y las aplicaciones de las quitinasas han sido tratadas en numerosas revisiones por diferentes autores [Patil y col., 2000; Swiontek y col., 2014; Herrera-Estrella y Chet, 1999; Hartl y col., 2012; Singh y col., 2014; Rathore y Gupta, 2015; Stoykov y col., 2015], ninguno ha discutido detalladamente la diversidad de las quitinasas como posible causa de sus aplicaciones prácticas. Por ello en la presente introducción pretendemos discutir estos temas haciendo especial énfasis en la diversidad de las fuentes, características estructurales y propiedades mecanicistas de las quitinasas, como principal factor limitante en el desarrollo y utilización de esta clase de enzimas en el campo industrial. 1.1.2 Clasificación de las quitinasas Bernard en 1911 observó por primera vez una fracción quitinolítica termoestable y difusible (quitinasas) al aislarlas a partir de pulpa de orquídea. Posteriormente fue confirmada por Karrer y Hoffman quienes obtuvieron enzimas quitinolíticas a partir de caracoles [Felse y Panda, P á g i n a | 7 Introducción 1999]. Actualmente las quitinasas se clasifican siguiendo diferentes criterios. - Clasificación según la Comisión de Enzimas de la IUPAC De acuerdo con las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Union Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology NC-IUBMB), de acuerdo con la reacción que catalizan las quitinasas son hidrolasas que rompen enlaces glicosídicos en moléculas de quitina, es decir, se encuentran agrupadas dentro de la clase tres, correspondiente a las Glicosil-hidrolasas (GH) o Glicohidrolasas (GH) y les corresponde por tanto como números del código de clasificación: EC 3.2.1.x., donde x representaría el número de catálogo u orden. - Clasificación basada en la secuencia aminoacídica y ordenamiento espacial (arquitectura de dominios) Las quitinasas según su secuencia aminoacídica, en la base de datos CAZy, se agrupan dentro de las siguientes tres familias: familia 18, 19 y 20 [Lombard y col., 2013] como se muestra esquemáticamente en la Figura-I.3. P á g i n a | 14 Introducción proporcionando inmunidad innata y en la digestión de alimentos. En humano, se ha encontrado niveles altos de quitinasas en pacientes con malaria, enfermedad causada por el protozoo Plasmodium falciparum. El aumento en la secreción de quitinasas en el organismo está relacionado con ciertas afecciones fisiopatológicas dominadas por las células Th2 que incluyen infección, fibrosis, alergia y asma. Puede ser utilizado como un biomarcador en casos de asma, al aumentar la secreción de quitinasa durante la inflamación a través de un mecanismo dependiente de interleucina, de modo que al inhibir la proteína se reduzca la inflamación, permitiendo ser una alternativa en la terapia del asma [Oshima y col., 2002; Shen y col., 2013; Renkema y col., 1995; Suzuki y col., 2001; Muzzarelli, 2010; Komi y col., 2016; Shuhui y col., 2009; Nagpure y col., 2014; Duru y col., 2013; Komi y col., 2018]. Las quitinasas en general son importantes debido a que tienen varias aplicaciones industriales, agrícolas y además pueden ser utilizadas en agronomía para el control de enfermedades y plagas de insectos en plantas. La capacidad que tienen las quitinasas para degradar la quitina las hace muy valiosas en la gestión de residuos, especialmente en el manejo de desechos marinos y además pueden ser utilizadas para la producción de biocombustibles [Yang y col., 2016a; Swiontek Brzezinska y col., 2014; Ramírez y Calzadíaz L, 2016]. Las quitinasas desempeñan un papel importante en la generación de: i) protoplastos fúngicos utilizados para estudiar la síntesis de la pared celular; ii) la producción de proteínas unicelulares que pueden P á g i n a | 15 Introducción ser utilizadas como un alimento o un complemento alimenticio; iii) la producción de quitooligosacáridos, N-acetilglucosaminas y glucosaminas que tienen amplias aplicaciones en la industria farmacéutica, etc. Además, pueden usarse en la atención de la salud humana, en la terapia de enfermedades fúngicas y como aditivos en cremas antimicóticas [Dahiya y col., 2006]. En la Figura-I.5 se muestra esquemáticamente el amplio espectro de usos de las quitinasas. Figura I.5. Principales aplicaciones actuales de las quitinasas según su mecanismo de acción. 1.3.1.1 Quitinasas y Agronomía Las quitinasas presentan una serie de aplicaciones biológicas importantes en agronomía debido a su efecto beneficioso sobre las P á g i n a | 16 Introducción plantas, tales como: i) mejoran el crecimiento y desarrollo, mejoran la capacidad de germinación, la longitud y actividad de la raíz, altura y tamaño de las plántulas, y floración [Falcón-Rodríguez y col., 2012]; ii) proporcionan inmunidad innata [Subha Narayan y col., 2015], brindan una mejor respuesta fisiológica [Katiyar y col., 2015], facilitan la acumulación de minerales durante su crecimiento [Schultze y Kondorosi, 1996; Chatelain y col., 2014], y ademas podrían funcionar como una posible vacuna frente a las enfermedades de las plantas [Yin y col., 2010]. Las plantas al ser sésiles han desarrollado mecanismos para adaptarse a variaciones tanto bióticas como abióticas, los quitooligosacáridos actúan directamente frente a cada una de estas variaciones proporcionándoles un mecanismo de defensa. Las quitinasas de la familia 19 son utilizadas en el control biológico y como fitopatógenos fúngicos, debido a que estas producen un mecanismo de defensa frente al ataque contra hongos patógenos [Kawase y col., 2006]. El control biológico es un método de control de plagas y enfermedades de las plantas que consiste en utilizar otros organismos vivos como mecanismo de defensa frente a fitopatógenos. Se desarrolla de manera intencional, directa por parte del hombre o indirecta mediante el manejo de interacciones existentes en el ecosistema agrícola [Flint y Dreistadt, 1998]. P á g i n a | 17 Introducción El control biológico puede llevarse a cabo de distintas maneras: utilizando sustancias y compuestos obtenidos a partir de la misma planta y en algunos casos usando otras plantas que actuarían como control biologico (alelopatía, plaguicidas botánicos, cultivos trampa, etc.), además de depredadores, parasitoides y patógenos. Entre los microorganismos patogénicos se incluyen bacterias, hongos y virus, que tienen la capacidad de matar o debilitar a sus huéspedes [Huffaker y col., 1984]. Las bacterias usadas como control biológico infectan a los insectos por vía digestiva, entre estos los más utilizados son Bacillus thuringiensis que controla mariposas, polillas, escarabajos, moscas y otros insectos plaga, se utiliza además en los cultivos para proporcionarle más resistencia frente a estas plagas y evitar el uso de otros plaguicidas [Lemaux, 2008]. Los hongos denominados como hongos entomopatógenos son aquellos organismos que producen una patogénesis letal en insectos o arácnidos, excluyendo aquellos hongos facultativos que pueden crecer sobre insectos o sustratos que contengan quitina. Estos hongos tienen la capacidad de atacar al insecto a través de la cutícula externa que está formada por una capa delgada que contiene lípidos y otra más gruesa que contiene quitina [Evans y col., 1988]. Dentro de este grupo se encuentran 89 especies de Trichoderma que son utilizados contra fitopatógenos [Fry William, 2012]. P á g i n a | 18 Introducción Entre los virus capaces de producir quitinasas y que comúnmente se utilizan como insecticida biológico destacan los baculovirus. Los beneficios de la utilización de controles biológicos en los cultivos es proporcionar sostenibilidad a los cultivadores, disminuyendo la contaminación del agua y además no perjudican la estructura del suelo y son de gran importancia económica en la agricultura. Actualmente el mercado de bioplaguicidas representa sólo una pequeña parte del mercado global, pero se espera que crezca muy rápidamente para el 2022 con tasa de crecimiento de 15,34 % [Chen, 2017]. Desde 1980 la quitina en polvo de ciertos crustáceos se ha utilizado para los cultivos como bioplaguicidas, biofertilizantes y en forma de biofilm [Ha y Huang, 2007; El Hadrami y col., 2010; Trouvelot y col., 2014]. Las quitinasas son de especial interés para los investigadores debido a que tienen varias características que determinan su actividad y su idoneidad para aplicaciones de campo. Entre estas cabe destacar: su aplicación en el control biológico de las plantas permitiendo de esta manera su uso como un pesticida alternativo, evitando el uso de pesticidas químicos que son caros, contaminan el medio ambiente y producen resistencia a ciertos patógenos, además de que no son tóxicos, son biodegradables, biocompatibles y tienen selectividad frente a una plaga [Barboza-Corona y col., 2008; Patil y col., 2000; Czaja y col., 2015]. P á g i n a | 19 Introducción 1.1.3.2 Quitinasas en la Industria Alimentaria Uno de los problemas más comunes para la industria hortofrutícola es el deterioro de frutas y hortalizas en post-cosecha, ya que representa pérdidas económicas importantes. Se estima que alrededor del 20-25% de las cosechas se deterioran por patógenos durante el manejo postcosecha [Alkan y Fortes, 2015]. Recientemente se está viendo que la quitinasas por sí solas o en combinación con otras enzimas, fundamentalmente proteasas, podrían tener un gran papel en la industria alimentaria; donde además de poder utilizarse como aditivo y potenciador del sabor [Hamed y col., 2016; Jung y Park, 2014], también podrían utilizarse en la elaboración de envases activos (antimicrobianos) utilizables para la conservación, protección y comercialización de los alimentos frescos con el objetivo de extender su vida media manteniendo su calidad nutricional y seguridad alimentaria [Ozdemir y Floros, 2010], debido a que los alimentos frescos pueden contener microorganismos que podrían deteriorar los alimentos. Por ello esta aplicación emergente de las quitinasas, bien en forma de sprays o en películas, es de gran interés, ya que su uso podría prolongar la vida media de alimentos frescos perecederos [da Silva, 2019], evitando el desarrollo de hongos y bacterias que afectan al alimento fresco, como por ejemplo manzanas, naranjas, peras, mandarinas etc., e incluso los champiñones. P á g i n a | 20 Introducción 1.1.3.3 Otras Aplicaciones de Quitinasas Actualmente las quitinasas son de gran interés a nivel industrial debido a su uso directo o más frecuentemente al uso de los productos obtenidos a partir de su acción sobre sustratos ricos en quitina. De esta manera las quitinasas y/o sus productos (quitino-oligosacáridos) son utilizados en diversas aplicaciones en la industria medico-farmacéutica, debido a que tienen propiedades hipoalergénicas, hipocolesterolémicas, antitumorales, antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes y de cicatrización de heridas, el desarrollo de sistemas de administración de fármacos, fabricación de materiales quirúrgicos e implantes y además en la preparación de suplementos dietéticos para mejorar el sistema inmunológico [Martínez y col., 2012; Askolin y col., 2001; Howard y col., 2003; Nguyen-Thi y Doucet, 2016]. 1.1.4 Producción de Quitinasas por Fermentación Las quitinasas se pueden producir mediante varios tipos o procesos biotecnológicos de fermentación, tales como: fermentación en estado sólido, o fermentación sumergida, bien bajo la modalidad de fermentación discontinua, fermentación semicontinua o fermentación continúa [Joshi y col., 1989]. Normalmente estos procesos de fermentación suelen llevarse a cabo en medios formulados con productos ricos en quitina [Bautista y col., 1986], ya que la quitina externa presente en el medio de cultivo, induce la expresión de quitinasas extracelulares. Los organismos que son capaces de producir quitinasas extracelulares consumen quitina como fuente potencial de P á g i n a | 21 Introducción carbono y nitrógeno [Dahiya y col., 2006]. Se entiende por fermentación al proceso en el que los microorganismos tienen la capacidad de producir metabolitos o biomasa mediante el uso de sustancias orgánicas en ausencia o presencia de oxígeno [Hernández, 2013]. Los microorganismos obtienen su energía y fuente de carbono a través de la degradación de los compuestos orgánicos, en este caso de la quitina, y producen ciertas enzimas, entre estas quitinasas [Ward, 1989]. A escala industrial la producción de quitinasas, aunque relativamente limitada en comparación con otras enzimas hidrolíticas, se suele llevar acabo bien en fermentación sumergida o en fermentación en estado sólido, utilizando sustratos ricos en quitina como inductor, generalmente derivados de crustáceos, procedentes del procesamiento industrial o de restos marinos [Rojas-Avelizapa y col., 1999]. Sin embargo, el uso de sustratos ricos en quitina procedentes de otros orígenes, hasta la fecha, se han utilizado mucho menos e incluso en algunos casos no se han utilizado nunca. Este sería el caso de los subproductos del cultivo de hongos comestibles, particularmente del cultivo del champiñón. a) Fermentación en Medio Sólido La fermentación en medio sólido tiene sus orígenes desde nuestros ancestros, estos procesos tradicionales se desarrollaban en diversas partes del mundo, uno de estos ejemplos es el Koji y el Tempeh, alimentos preparados por el cultivo de hongos filamentosos (Rhizopus P á g i n a | 22 Introducción oligosporus) sobre materiales sólidos que posteriormente las personas lo consumían y al igual forma los quesos Camembert y Roquefort en Europa. Tanto en Asia como Europa en la actualidad estos productos se siguen produciendo de la misma manera o ligeramente modificados [Pandey, 1992]. Este tipo de fermentaciones se suele utilizar para la obtención de enzimas fúngicas, debido a que el sustrato con una cantidad limitada de agua pueda utilizarse como soporte para el crecimiento de los hongos, evitando de esta manera el crecimiento de otros microorganismos como bacterias y levaduras. Los hongos tienden además a adaptarse de mejor manera a los sustratos sólidos húmedos, permitiendo de esta forma la obtención de productos únicos [Viniegra, 2000] gracias a la secreción de enzimas hidrolíticas que les permite obtener el alimento y la energía necesaria para su desarrollo. Las ventajas de utilización de este tipo de fermentación es que el costo de inversión, coste energético y volumen de agua residual producida es menor [Ward, 1989]. Además de que se obtienen cultivos con alta estabilidad y alta eficiencia biosintética, tienen mejor contacto con el sustrato y por lo tanto mejor difusión de oxígeno, poco gasto de energía, y menor susceptibilidad al estrés osmótico, esto se debe a que el crecimiento del microorganismo en este tipo de cultivos se presenta de forma heterogénea con la posibilidad de encontrar diferentes gradientes de concentración [Viniegra y col., 2003]. Aunque, este tipo de cultivo tiene como desventaja que no se puede controlar fácilmente el pH, y la temperatura y además la esterilización del sustrato, cuando esto P á g i n a | 23 Introducción sea necesario, no suele ser tan fácil como en el caso de las fermentaciones sumergidas, debido a la naturaleza heterogénea de éste [Raimbault, 1998]. Existen escasos artículos sobre la producción de quitinasas mediante fermentación en estado sólido. Normalmente el cultivo suele llevarse a cabo mediante el sistema de bandejas o en tanques rotatorios utilizando como sustratos diversos subproductos agroindustriales suplementados con quitina colidal [Suresh y Chandrasekaran, 1998; Suresh y Chandrasekaran, 1999]. Sin embargo, el uso de subproductos ricos en quitina directamente como sustrato no se ha estudiado. b) Fermentación en Estado líquido o Sumergida Se conoce como fermentación sumergida aquella en la que todos los nutrientes se encuentran disueltos formando una única fase, y se suele llevar a cabo mediante el control de determinados parámetros fisicoquímicos (pH, temperatura, agitación, oxígeno disuelto, etc.) [Vásquez Cárdenas, 2010]. Este método posee varias ventajas como: obtención de un producto más homogéneo, se puede controlar la temperatura, aireación, agitación y pH, la biomasa se puede medir directamente es por ello que es uno de los métodos más usados en la Industria Biotecnológica [Raimbault, 1998]. Las fermentaciones sumergidas pueden llevarse a cabo de diferentes P á g i n a | 30 Introducción 1.2 Subproductos Agroindustriales ricos en Quitina como fuente de fermentación para la producción de quitinasas. Desde de un punto de vista realista los dos principales subproductos ricos en quitina son: el exoesqueleto de crustáceos procedente del procesamiento industrial o de los grandes depósitos existentes en la Antártida, y los subproductos agroindustriales procedentes de la industria de setas y hongos comestibles [Urbina-Salazar y col., 2018] y de la producción de ácido cítrico [Muñoz y col., 2015]. La quitina al presentar una estructura resistente, inflexible e insoluble es difícil de eliminar o degradar, ocasionando de esta manera la contaminación del medioambiente donde se deposita. Dependiendo del origen de la quitina, la quitina de crustáceos se almacena en regiones costeras y/o zonas industriales de procesamiento de mariscos y la quitina de hongos comestibles (quitina fúngica) procedentes de las Industrias conserveras del champiñón y producción de ácido cítrico. En relación con los subproductos ricos en quitina procedentes de la industria agroalimentaria, a pesar de la gran cantidad de residuo/desecho que se generan anualmente hasta hoy en día no se está desarrollando métodos o procedimientos adecuados para la utilización de estos subproductos para su valorización como fuente de compuestos de interés industrial y de alto valor añadido. Estos residuos, debido a su composición, al ser procesados podrían generar compuestos de gran interés, tales como: quitosano, quitooligosacáridos P á g i n a | 31 Introducción y glucosamina, que podrían tener diversas aplicaciones industriales [Buruleanu y col., 2018]. El quitosano, obtenido por desacetilación de la quitina, bien por vía química o por vía enzimática, se ha utilizado como materiales funcionales en los campos de la alimentación, la salud o la agricultura debido a su biocompatibilidad, no toxicidad y disponibilidad de biomasa abundante y económica [Baranwal y col., 2018]. Los quitooligosacáridos, obtenidos bien por vía química o enzimática tienen aplicaciones de gran interés en el campo de la Biotecnología. Los quitooligosacáridos, obtenidos mediante procesos enzimáticos tienen un mejor control del grado de polimerización y del grado de acetilación, además no tienen efectos secundarios perjudiciales, a diferencia de los obtenidos mediante procesos químicos que forman compuestos tóxicos que son difíciles de eliminar y producen un efecto negativo para el medio ambiente [Lodhi y col., 2014]. La N-acetil-glucosamina obtenida por degradación química o enzimática de la quitina, tiene diversas aplicaciones tanto en la industria alimentaria y como en la industria farmacéutica entre estas aplicaciones está: la producción de ácido siálico [Ogata y col., 2009], bioetanol [Inokuma y col., 2016], y proteínas unicelulares [Vyas y Deshpande, 1989], y como una terapia farmacéutica para trastornos de la inflamación gastrointestinal [Salvatore y col., 2000], y artrosis [Shikhman y col., 2005]. P á g i n a | 32 Introducción Como hemos indicado, existen varios subproductos agroindustriales ricos en quitina procedentes de la industria de hongos y setas comestibles, residuos de la industria del ácido cítrico, residuos de crustáceos y moluscos. 1.2.1 Subproductos de la Industria de Hongos y Setas Comestibles Agaricus bisporus es uno de los hongos comestibles cultivados en gran escala a nivel mundial por lo que se considera de gran importancia económica. El cultivo de champiñon nació por casualidad en Francia en el siglo XVII al haber abonado su cultivo con estiércol de caballo y utilizando como agua de regadío el agua que se usó para el lavado de champiñones silvestres, observaron después de unos días que creció una nueva variedad de champiñones. De esta manera se inició el cultivo del champiñón usando tres componentes básicos: un sustrato orgánico (estiércol de caballo) utilizado como medio de cultivo del hongo, un inóculo (agua de lavado de champiñones) que contiene pequeños residuos de tejido de champiñones y un microambiente adecuado (temperatura, humedad y aireación) [Labarère, 1994]. Desde Francia se expandió el cultivo de champiñón hacia el resto de Europa. En Estados Unidos aparece en 1880 tras ser introducido por unos emigrantes españoles, en 1893 Costantin y Matruchot lograron obtener el inóculo a partir de cultivos puros de Agaricus bisporus crecido sobre un compost esterilizado (exento de patógenos) evitándose de esta manera la propagación de enfermedades. Posteriormente se realizaron P á g i n a | 33 Introducción otros estudios en los que se indicaron que el champiñón requería además de otros nutrientes esenciales como lignina, celulosa y hemicelulosa [Hayes, 1977]. En España el cultivo de champiñón se inicia a principios de los años cincuenta de manera artesanal, y se realizaba en cuevas, bodegas, principalmente en la Rioja y Castilla - la Mancha. En la actualidad el cultivo de champiñón se sigue realizando por el método del compostaje pero con procesos más controlados [Pardo, 1994]; existiendo tres métodos o procedimientos: el método francés, el método holandés y el método americano. En cuanto a la clasificación taxonómica el champiñón común, champiñón de París -cuyo nombre científico es Agaricus bisporuses una especie de hongo basidiomiceto de la familia Agaricales nativo de Europa y América del norte, cultivado extensamente para su uso alimentario. Descripción Taxonómica de Agaricus bisporus Reino: Fungi División: Basidiomycota Clase: Agaricomycetes Subclase: Agaricomycetidae Orden: Agaricales Familia: Agaricaceae Género: Agaricus Especie: Agaricus bisporus [Lange, 1926; Imbach, 1946] Nombre Común: Champiñón Nombre Científico: Agaricus bisporus P á g i n a | 34 Introducción Como puede observarse en la Figura-I.6, en la parte visible del champiñón, o cuerpo fructífero, se pueden distinguir 2 partes principales: el sombrero o píleo, y el pié, tallo o estípite, y en la parte subterránea del champiñón se encuentra el micelio, cuyas células poseen una estructura externa y rígida denominada pared celular que está protegida por la membrana plasmática cuya función es la de mantener la forma y protegerle de daños mecánicos, químicos y osmóticos. Figura I.6. Morfología de Agaricus bisporus. Estas paredes celulares contienen un alto porcentaje de polisacáridos, seguidos de proteínas, lípidos, pigmentos y sales minerales [Bartnicki-García, 1968]. Siendo el polisacárido más importante la Quitina que se presenta en forma microfibrilar unida covalentemente a un 1,3-1,6 β-glucano, a las que se asocian pequeñas proporciones de glicanos y otros componentes de naturaleza fibrilar como el mucílago [García Mendoza y col., 1987], formando de esta manera un complejo fibrilar insoluble en álcali [López, 2003]. P á g i n a | 35 Introducción Además de los polisacáridos, existen también ciertas proteínas que juegan un papel importante en la estructura de la pared celular y otras con funciones plásticas como el caso de las enzimas degradativas y biosintéticas encargadas en el proceso de crecimiento y morfogénesis. Los polisacáridos y proteínas contenidas en las paredes celulares son digeridas por sus correspondientes enzimas degradativas ya sea para cambios morfogenéticos durante su ciclo biológico o como parasitismo. A este respecto, en los hongos y en particular en Agaricus bisporus ha podido demostrarse la presencia de enzimas como glucanasas, quitinasas y proteasas [Zhang y col., 2019]. La demanda de hongos comestibles ha incrementado drásticamente en los últimos años debido al desarrollo de nuevos métodos de cultivo mecanizados y al incremento en la aceptación de este tipo de productos por parte de los consumidores, ya que cada vez se conocen más las propiedades nutricionales y saludables de éste alimento [Atila y col., 2017; Muszyńska, y col., 2017]. Según los datos obtenidos de la FAO la producción en el año 2016 fue de aproximadamente 10.790.859 Tm [FAO STAT, 2018a], de los cuales Asia se encuentra en el primer lugar con un 76% de producción, seguido por Europa (18%), América (5%); Oceanía y África con menos del 1% (ver Figura-I.7). P á g i n a | 36 Introducción Figura I.7. Produccion mundial de Hongos y setas comestibles. Adaptado de datos FAO STAT 2018a. De la producción total correspondiente al continente europeo en el año 2016 (Figura-I.8) el 9% corresponde a la producción de España (197.010 Tm), siendo la Rioja el mayor productor y líder del país, seguido de Castilla-La Mancha (La manchuela, Albacete). En Europa el 90% de la venta de hongos comestibles corresponde a la especie Agaricus bisporus, sea esto para consumo en fresco o procesado en forma de conservas [Fletcher, 2001]. Debido a su agradable sabor y valor nutricional son muy apreciados por el consumidor, aunque tienen como desventaja su corta vida media, unos 15 días a 4 ˚C, ya que son altamente perecibles en fresco, debido al pardeamiento enzimático y degradación. P á g i n a | 37 Introducción Figura I.8. Producción de Hongos y setas comestibles en Europa en el 2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018a. Agaricus bisporus al conservarse en refrigeración (2 - 4 ˚C) reduce su actividad microbiana que es el principal responsable de su deterioro y puede permanecer así por un período de vida de hasta 13-15 días utilizando películas plásticas y/o atmósferas especiales [Devece y col., 1999; Kotwaliwale y col., 2007; Beelman y col., 1989; Burlo y col., 2004]. La producción de hongos y setas comestibles en España en fresco es del 75% (147.757 Tm), mientras que la comercialización actual en conserva es del 25% (49.253 Tm) siendo un poco más alto en comparación con años anteriores debido a la alta demanda experimentada por los productos listos para el consumo, específicamente en forma de conserva (ver Figura-R.9). El champiñón en forma de conserva pasa por un tratamiento denominado escaldado, que consiste en someter al champiñon a una temperatura adecuada que tiene por objetivo reducir el pardeamiento enzimático, los champiñones P á g i n a | 38 Introducción se envasan en un recipiente de hojalata y son cerrados herméticamente evitando cualquier tipo de contaminación [Biekman y col., 1997]. Figura I.9. Consumo de Hongos y setas comestibles en España en el 2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018b. Esta gran producción de hongos y setas comestibles genera 3 tipos diferentes de subproductos o material de desecho: 1) compost agotado, 2) residuos de champiñón (tallos y champiñones no comercializables) y 3) el líquido de escaldado (Figura-I.10), representando un desafío medioambiental para las Industrias del ramo, ya que su eliminación no adecuada podría y puede generar graves problemas medioambientales [Buruleanu y col., 2018]. Descartando el compost agotado, que no se tratará en este trabajo, los otros dos subproductos generados en la producción y procesamiento del champiñón son: los tallos y champiñones no comercializables generados tanto en el procesamiento para fresco como en el procesamiento de conservas, y el líquido de escaldado, generado P á g i n a | 39 Introducción únicamente en el procesamiento de conservas. La mayor parte de estos residuos actualmente no se utiliza y en algunos casos son utilizados como alimento animal o como abono, fundamentalmente los tallos y champiñones no comercializables. Sin embargo al ser un alimento rico en quitina y proteína podría ser utilizado como fuente para la producción de quitinasas y de otros compuestos de interés para las diferentes Industrias. Figura I.10. Subproductos obtenidos del cultivo del champiñón . En cuanto al líquido de escaldado, generalmente es vertido a la red, en unos casos previo tratamiento en depuradoras y otros directamente. P á g i n a | 46 Introducción Wang y col., 2009b; Nguyen y col., 2017; Nguyen y Wang, 2017; Nguyen y Wang, 2018; Wang y col., 2008]. De lo discutido más arriba, queda claro que los subproductos agroindustriales ricos en quitina, debido a su composición, constituyen materias primas de partida, con un alto potencial de valorización para la obtención de diferentes materiales bioactivos de alto valor añadido aplicables de distintos sectores industriales. Hasta la fecha prácticamente, la gran mayoría de los trabajos se han centrado en el uso de los subproductos procedentes de la industria del procesamiento de los crustáceos y en los grandes depósitos existentes en la Antártida. Si bien, esta fuente, con el tiempo, se ha revelado finita, y actualmente tiende al agotamiento. Por otro lado, la industria del procesamiento de crustáceos no sería capaz de suministrar toda la materia prima demandada actualmente y sobre todo en el futuro. Es por ello que es necesario investigar nuevas fuentes de quitina que cubra o ayude a cubrir estas necesidades. Entre estas fuentes, las materias primas ricas en quitina de origen fúngico, por su carácter altamente renovable, y las cantidades manejables, en particular la procedente del cultivo mecanizado de setas y hongos comestibles, constituye un material idóneo para dichos fines. Por ello, en el presente trabajo de Tesis nos centraremos en el estudio de los subproductos procedentes de la industria del champiñón como fuente de fermentación para la producción de enzimas hidrolíticas y en particular de quitinasas, como una de las alternativas posibles para la valorización de este tipo de subproducto. OBJETIVOS P á g i n a | 49 Objetivos 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo General  Producir quitinasas en medios baratos ricos en quitina, utilizando subproductos de la industria alimentaria como medio de fermentación: Aplicación a los hongos comestibles y crustáceos. 2.2 Objetivos Específicos  Preparación y caracterización de las fuentes de fermentación a partir de subproductos industriales (harina de tallos de champiñón, HTCH, FQ/G y harina de cangrejo, HC).  Producción de quitinasas por fermentación:  Sumergida  Estado sólido  Estudio de la secreción de proteínas (secretoma) crecido en los diferentes medios de cultivo, mediante técnicas electroforéticas y proteómica.  Extracción, concentración/fraccionamiento y estabilización de enzimas (quitinasas). P á g i n a | 50 Objetivos  Producción de quitinasas a escala semi-piloto.  Inmovilización de concentrado de quitinasas en forma de nano/micropartículas. MATERIALES Y MÉTODOS P á g i n a | 53 M & M 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Reactivos, Materiales y Equipos 3.1.1 Reactivos Todos los reactivos utilizados en el presente trabajo de Tesis han sido de calidad analítica, y se muestran en la Tabla-M.1. Tabla-M.1. Reactivos utilizados. Reactivo Fórmula Casa Comercial Acetato de sodio C2H3NaO2 Sigma-Aldrich, España Acetona C3H6O Labbox, Barcelona-España Ácido acético CH3COOH Sigma-Aldrich, España Ácido Bórico H3BO3 Labbox, Barcelona-España Ácido Cítrico C6H8O7 Sigma-Aldrich, España Ácido clorhídrico HCl Panreac, Barcelona-España Ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) C7H4N2O7 Sigma-Aldrich, España Ácido fórmico CH2O2 Merck, Darmstadt-Alemania Ácido fosfórico H3PO4 Sigma-Aldrich, España Ácido Maleico C4H4O4 Sigma-Aldrich, España Ácido sulfúrico conc. H2SO4 Sigma-Aldrich, España ACN (Acetonitrilo) C2H3N Sigma-Aldrich, España P á g i n a | 54 M & M Acrilamida C3H5NO Bio-rad, California-USA APS (Persulfato amónico) (NH4)2S2O8 Merck, Darmstadt-Alemania Avicel PH-101 (Celulosa microcristalina) (C6H10O5)n Sigma-Aldrich, España Azocaseína (Sulfanilamida azocaseína) Sigma-Aldrich, España Azul de bromofenol C19H10Br4O5S Sigma-Aldrich, España Bicarbonato de amonio NH4HCO3 Sigma-Aldrich, España Bis-acrilamida C7H10N2O2 Bio-rad, California-USA BSA (Seroalbúmina bovina) Thermo Fisher Scientific, Madrid-España Citrato de sodio Na3C6H5O7 Sigma-Aldrich, España Cloruro de calcio dihidratado CaCl2·2H2O Merck, Darmstadt-Alemania Cloruro de Cobalto (II) dihidratado CoCl2·2H2O Sigma-Aldrich, España Cloruro de Cobre (II) dihidratado CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich, España Cloruro de magnesio MgCl2 Sigma-Aldrich, España Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich, España Cloruro de Potasio KCl Panreac, Barcelona-España Cloruro de sodio NaCl Panreac, Barcelona-España Cloruro de Zinc ZnCl2 Sigma-Aldrich, España Coomassie Brilliant Blue G-250 C45H44N3NaO7S2 Bio-Rad Laboratories, California-USA Coomassie Plus-the better (Bradford assay reagent) Thermo Fisher Scientific, P á g i n a | 55 M & M Madrid-España Dihidrógeno fosfato de potasio KH2PO4 Sigma-Aldrich, España Ergosterol C28H44O Sigma Aldrich, España Etanol C2H5OH Panreac, Barcelona-España Extracto de levadura Merck, Darmstadt-Alemania Fenol C6H5OH Sigma-Aldrich, España Fosfato de potasio dibásico K2HPO4 Sigma-Aldrich, España Fosfato disódico Na2HPO4 Panreac, Barcelona-España Glicerol C3H8O3 Sigma-Aldrich, España Glicina C2H5NO2 Sigma-Aldrich, España Glucosa C6H12O6 Sigma-Aldrich, España Hexahidrato de Cloruro de hierro (III) FeCl3·6H2O Merck, Darmstadt-Alemania Hexano C6H14 Labbox, Barcelona-España Hidróxido de sodio NaOH Panreac, Barcelona-España Kit de tinción de plata GE Healthcare, España Molibdato de sodio dihidratado Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich, España N-acetilglucosamina (N-Acetyl-D-Glucosamine) C8H15NO6 Sigma-Aldrich, España Nitrato de sodio NaNO3 Sigma-Aldrich, España Peptona Labbox, Barcelona-España P á g i n a | 62 M & M Tabla-M.4. Microorganismos utilizados. Nombre científico Cepa Colección Bacillus licheniformis ATCC 21415 American Type Culture Collection (Georgetown University, Washington, USA) Trichoderma atroviride CEC-T23 Spain Type Culture Collection (Burjasot, Universidad de Valencia, España). Trichoderma harzianum CEC-T24 Spain Type Culture Collection (Burjasot, Universidad de Valencia, España). 3.3. Subproductos Los subproductos utilizados en este trabajo han sido subproductos procedentes de la industria del champiñón, tanto los procedentes de la producción para consumo en fresco (tallos y champiñones no comercializables) como de la industria conservera (tallos) (Figura-M.1a). También se ha utilizado un subproducto procedente de la industria del procesamiento del cangrejo de río (Procambarus clarkii), constituido fundamentalmente por el cefalotórax (cabeza y pinzas) y el exoesqueleto de las colas (Figura-M.1b), que se ha utilizado como control de subproductos ricos en quitina de origen crustaceo. En la Tabla-M.5 se muestran los diferentes subproductos y su origen. P á g i n a | 63 M & M Tabla-M.5. Subproductos y sus orígenes. Subproducto Producto estabilizado Origen Tallos de champiñón y champiñones defectuosos. Harina de tallos de champiñón (HTCH) Industria del champiñón, fresco y conservas. Grupo Riberebro (Haro, La Rioja). Cefalotórax y exoesqueleto de las colas. Harina de cangrejo HC) Industria del cangrejo de río. Alfocan S.A. (Isla Mayor, Sevilla) Figura M.1. a) Agaricus bisporus, b) Procambarus clarkii. P á g i n a | 64 M & M 3.4 Estabilización de los subproductos y generación de sustratos Una vez recibidos los subproductos, debido a su naturaleza y alto contenido en agua, éstos se han estabilizado, para evitar su deterioro y pérdida. Procesos que se han llevado a cabo mediante secado, molienda, conservación en vacío y temperatura ambiente en almacén (22-23 °C). 3.4.1 Secado y molienda Para estabilizar los subproductos procedentes de la industria del champiñón, se ha utilizado una estufa de secado estático y otra de aire forzado a 90 °C (Figura-M.2a y 2b). Una vez secos se molieron en un molino de rotor, equipado con un tamiz de 0,5 mm (Figura-M.3a), y posteriormente fueron tamizados en un tamiz de 355 µm (Figura-M.3b), obteniéndose un producto al que se denominó harina de tallos de champiñón (HTCH) (Figura-M.4a). Los residuos de cangrejo siguieron un procedimiento análogo y al producto molido, en este caso, se le denominó harina de cangrejo (HC) (Figura-M.4b). Los productos así obtenidos se guardaron en bolsas de plástico, a las que se hizo el vacío, y se guardaron en almacén a temperatura ambiente (22-23 °C), manteniéndose así durante el tiempo necesario para su uso. El producto es estable durante varios meses (6 a 8 meses), no observándose peroxidación lipídica ni generación de olores durante este tiempo de conservación. P á g i n a | 65 M & M Figura M.2. a) Estufa de secado estático, b) Estufa de secado con aire forzado. P á g i n a | 66 M & M Figura M.3. a) Molino de rotor, b) Diferentes tamaños de tamices utilizados para la preparación de los subproductos. Figura M.4. a) Harina de Tallos de Champiñón (HTCH), b) Harina de Cangrejo (HC). P á g i n a | 67 M & M 3.4.2 Preparación de la Fracción enriquecida de Quitina/Glucano de champiñones Para la preparación de la fracción enriquecida en quitina y glucano (FQ/G) se ha seguido el procedimiento descrito por Cremades y col. [Cremades y col., 2012]. El procedimiento seguido se muestra esquemáticamente en la Figura-M.5. Brevemente, una vez resuspendida la HTCH al 10% en agua (p/v), se ajusta el pH a 8,5 y se procede a su hidrólisis con la proteasa Alcalasa® utlizando una relación E/S de 0,3 (p/v), siguiendo el procedimiento del pH-stat [Adler-Nissen, 1986; Parrado et al., 1993]. El hidrolizado obtenido se centrifugó a 10.000 × g, a 4 °C durante 15 min, obteniéndose por una parte un sobrenadante (material soluble o hidrolizado) y un precipitado (material insoluble, o fracción bruta enriquecida en quitina y glucanos). Seguidamente, el precipitado se ha lavado tres veces con 10 L de agua corriente, se ha resuspendido en 1 L de agua, y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 min, una vez enfriado a temperatura ambiente se centrifugó durante 15 min a 10.000 x g, desechándose el sobrenadante y nos quedamos con el precipitado, que una vez secado en la estufa de aire y tamizado, se utilizó como F-Q/G (Figura-M.6). P á g i n a | 68 M & M Figura M.5. Esquema de la obtención de la fracción enriquecida de Quitina/Glucano, mediante un tratamiento enzimático con proteasas. Figura M.6. Fracción enriquecida en Quitina/Glucano. P á g i n a | 69 M & M 3.5 Caracterización de los Sustratos Una vez obtenidos los sustratos se procedió a la caracterización de los mismos. La caracterización se ha llevado a cabo mediante la determinación de los siguientes parámetros: humedad, materia orgánica (MO), grasa bruta, nitrógeno total (Nt), proteínas, hidratos de carbono totales, quitina, etc., y pH. El contenido de humedad, ceniza, grasa bruta se determinó gravimétricamente de acuerdo con los métodos estándar de AOAC. Como se detallan a continuación [A.O.A.C, 1995; A.O.A.C, 2006]. 3.5.1 Humedad La Humedad se determinó gravimétricamente siguiendo el procedimiento estándar de la A.O.A.C. [A.O.A.C, 1995]. Para ello se pesó en una cápsula vacía 2 g de muestra, se secó en estufa a 100 °C durante 24 horas; una vez transcurrido este tiempo se retira y enfría en un desecador. Finalmente se pesa la muestra seca y se calcula el contenido de humedad mediante la siguiente fórmula: % 𝑑𝑒 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = (𝑃𝑖− 𝑃𝑓) 𝑃𝑖𝑥 100 Dónde: Pi = Peso inicial Pf = Peso final P á g i n a | 70 M & M 3.5.2 Cenizas El contenido de cenizas se determinó gravimétricamente siguiendo el procedimiento de la A.O.A.C. [A.O.A.C, 1995]. Brevemente, se taran los crisoles a peso constante en la mufla por 15-30 min a 550-600 °C. Luego se enfrian los crisoles en un desecador, pesamos nuevamente los crisoles y colocamos 2 g de muestra en cada crisol e incinerar la muestra en la mufla durante 8 horas a temperatura entre 550-600 °C, una vez transcurrido este tiempo sacamos los crisoles y dejamos enfriar y finalmente se pesa cada crisol con las cenizas. Las cenizas se calculan mediante la siguiente fórmula: % 𝑑𝑒 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎 = Peso de Cenizas x 100 Peso de la muestra 3.5.3 Grasas El contenido en grasa total se determinó por gravimetría tras la extracción de la muestra con hexano durante 12 horas en un extractor Soxhlet. Una vez terminada la extracción, el solvente se destila y el residuo graso se pesa [Clemente y col., 1997]. 3.5.4 Nitrógeno Total El nitrógeno total se determinó mediante el método Kjeldahl establecido por la A.O.A.C. 2006 [AOAC, 2006], en un equipo automático KjeltecTM 840 (Foss Iberica S.A., Barcelona) equipado con digestor y destilador. P á g i n a | 71 M & M 3.5.5 Cuantificación de Proteínas en Subproductos y Sustrato Las proteínas totales en los subproductos y sustratos se ha determinado multiplicando el nitrógeno total por el correspondiente factor de conversión en proteína: Nt x 5,45 para la HTCH y Nt x 6,24 para la HC. 3.5.6 Hidratos de Carbono Los carbohidratos totales se calcularon utilizando el método colorimétrico de Dubois, usando un reactivo de ácido fenólico sulfúrico [Dubois y col., 1956]. Los carbohidratos totales solubles fueron medidos partiendo de 0,5 g de muestra que se resuspendió en 10 mL de una mezcla H2O/fenol (80% v:v)/ácido sulfúrico concentrado (2:1:40). La muestra resuspendida se incubó durante 10 min a temperatura ambiente (22-23 °C) y se calentó lentamente hasta 95 °C, manteniendo esta temperatura durante 60 min, seguidamente se enfrió lentamente hasta alcanzar la temperatura ambiente. Se tomó una muestra, se centrifugó a 6000 x g y se midió la absorbancia a 575 nm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 2100pro UV/Visible (GE Healthcare, Barcelona, Spain) (Figura-M.7). La concentración de hidratos de carbono totales se determinó por interpolación en una curva patrón trazada con glucosa como se observa en la Figura-M.8. P á g i n a | 78 M & M  Condiciones de crecimiento de Bacillus licheniformis ATCC 21415 Una vez esterilizados los medios de cultivos, éstos se inocularon con 15 mL de inóculo de Bacillus licheniformis ATCC 21415 previamente crecido en LB, a 37 °C y pH 7 hasta que el caldo de fermentación alcance un 30% de transmitancia (aproximadamente por 18 h); y se dejaron crecer durante 14 días a 37±1 °C con agitación mecánica (150 rpm), tomándose muestras (aproximadamente 2,5 mL) periódicamente y se almacenaron a -20 °C hasta ser usada para los diferentes análisis.  Condiciones de crecimiento de Trichoderma Una vez esterilizados los medios de cultivos, éstos se inocularon con 2 mL de una suspensión acuosa (0,1 M MgCl2 / Tween 20 al 2%) de esporas 1 x 107 esporas mL−1 de T. atroviride CEC-T23 o T. harzianum CEC-T24 y se crecieron durante 14 días a 28 ±1 °C con aireación (30 L/min), y sin aireación (cultivo estático); tomándose muestras (aproximadamente 2,5 mL) periódicamente y se almacenaron a -20 °C hasta ser usada para los diferentes análisis. 3.6.2 Fermentación en estado sólido (FES) En la siguiente Tabla-M.7 se describen los medios de cultivo utilizados para la FES. En este caso se han utilizado como medios de cultivo: la F-Q/G, la HTCH y la HC, y se han preparado de modo que el P á g i n a | 79 M & M sustrato tenga la humedad suficiente para promover el crecimiento y desarrollo del microorganismo. Tabla-M.7. Composición de los medios de cultivo utilizados para la FES. Medios de cultivo Sustrato Inóculo F-Q/G-A 2% 5 107 esporas* F-Q/G+A 2% 5 107 esporas HTCH-A 2% 5 107 esporas HTCH+A 2% 5 107 esporas HC-A 2% 5 107 esporas HC+A 2% 5 107 esporas HTCH: Harina de tallos de champiñón, HC: Harina de Cangrejo, A: Aireación (*15 mL x 3.3 106 esporas/mL = 5 107 esporas) Una vez colocado el sustrato (F-Q/G, HTCH o HC) en el correspondiente matraz de 250 mL, éste se ha humedecido de manera tal que el medio de cultivo sólido esté bien y uniformemente húmedo pero no haya fase acuosa visible. Los medios de cultivo una vez preparados se esterilizaron a 121 °C durante 30 min (Figura-M.12), y posteriormente se inoculó el microorganismo (2 mL de una suspensión acuosa (0,1 M MgCl2 / Tween 20 al 2%) de esporas (1 x 107 esporas mL−1), y se cultivó durante 14 días a 28±1 °C con aireación (30 L/min), y sin aireación (cultivo estático). Cada ensayo se realizó por triplicado. P á g i n a | 80 M & M En la Figura-M.13 se muestra como se realizó el proceso de fermentación para la producción de enzimas específicamente quitinasas. Figura M.12. Medios de cultivo utilizados en FES para la producción de Quitinasas . Figura M.13. Proceso de fermentación para la obtención de quitinasas . P á g i n a | 81 M & M 3.7 Caracterización de las fermentaciones 3.7.1 Determinación de la Biomasa La biomasa se determinó directamente en las muestras descongeladas. En el caso de B. licheniformis ATCC 21415, crecido en fermentación sumergida el crecimiento o biomasa producida se determinó mediante la medición directa de la transmitancia (%T) de las muestras diluidas con agua (1:20, v/v). La concentración de biomasa, en mg/mL, se determinó por interpolación a partir de una curva estándar de biomasa vs %T (Figura-M.14). Figura M.14. Recta %T vs mg biomasa/mL para B. licheniformis ATCC 21415. (Muestras diluidas 1:5, v/v) Para T. harzianum CEC-T24 y T. atroviride CEC-T23, la biomasa se estimó indirectamente mediante la cuantificación del ergosterol. La P á g i n a | 82 M & M concentración de biomasa se calculó por interpolación en una curva estándar de ergosterol vs biomasa [Görs y col., 2007] (Figura-M.15 y M.16). Figura M.15. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. harzianum CEC-T24). Figura M.16. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. atroviride CEC-T23). 3.7.2 Ensayos Enzimáticos Para la determinación de las actividades enzimáticas excretadas al medio por cada microorganismo, las muestras se centrifugaron a 12.000 P á g i n a | 83 M & M × g durante 20 min, y los sobrenadantes obtenidos se usaron para los ensayos enzimáticos y análisis electroforéticos. a) Ensayo de Actividad Quitinasa La actividad quitinasa se determinó midiendo la cantidad de azúcares reductores producidos utilizando quitina coloidal como sustrato, mediante el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) [Miller, 1959]. Brevemente, la mezcla de reacción, que consta de 0,25 mL de quitina coloidal al 1% (p/v) y 0,25 mL de muestra (enzima), se incubó a 37 °C durante 30 min (Figura-M.17a). La reacción se detuvo mediante la adición de 1 mL de solución acuosa de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) y la mezcla se calentó durante 10 min en un baño de agua hirviendo. Después de enfriar (Figura-M.17b), se determinó la absorbancia de la solución a 575 nm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 2100pro UV / Visible (GE Healthcare, Suecia). En paralelo, el mismo volumen de agua desionizada se utilizó, en lugar de la muestra, como control negativo. Una unidad de actividad quitinasa se definió como la cantidad de enzima que produce 1 mg mL-1 de azúcar reductor, en las condiciones de ensayo, a 37 °C. o Preparación de la solución acuosa de ácido dinitrosalicílico (DNS) La solución de DNS se preparó disolviendo 10 g de DNS en 200 mL en una solución 2 M de NaOH. Posteriormente, se agregaron 300 g de P á g i n a | 84 M & M tartrato de sodio y potasio, 2 g de fenol y 0,5 g de sulfito Sódico previamente disueltos en unos 700 mL de agua desionizada caliente. Se mezclan cuidadosamente las dos soluciones y se enrrasa con agua destilada hasta 1000 mL. Figura M.17. a) Baño con control de temperatura, b) Muestras para determinación de actividad quitinasa. La concentración del azúcar reductor liberado se determinó por interpolación en una recta estándar preparada con GlcNAc (FiguraM.18). Figura M.18. Curva de calibración de N-acetilglucosamina. P á g i n a | 85 M & M b) Ensayo de Actividad Celulasa La actividad celulasa extracelular se determinó incubando 0.25 mL de celulosa microcristalina soluble (Avicel PH-101, Sigma-Aldrich) al 2% en tampón acetato 0.1 M (pH 5) junto con 0.25 mL de muestra, durante 2 horas a 37 °C. Para detener la reacción se añadió 1 mL de solución DNS [Bernfeld, 1955]. A continuación se calentó la mezcla a 95 °C durante 15 min, se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 575 nm. La concentración del azúcar reductor liberado se determinó por interpolación en una recta estándar preparada con glucosa (FiguraM.19). Una unidad de actividad celulasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 mg/mL de azúcares reductores en las condiciones de ensayo. Figura M.19. Curva de calibración de Glucosa. P á g i n a | 86 M & M c) Ensayo de Actividad Xilanasa La actividad xilanasa se determinó incubando 0.20 mL de muestra con 1,8 mL de sustrato (Solución de Xilano de beechwood, Sigma Aldrich ref. X4252) al 0,2 % en tampón Citrato de Sodio 50 mM (pH 5,3), incubar a 50 °C durante 5 min. Para detener la reacción se añadió 1,5 mL de solución DNS. Se calentó la mezcla a 95 °C durante 15 min. A continuación se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se midió las absorbancias a 540 nm. A su vez, se realizó una curva patrón empleando Xilosa 0,01 M (Figura-M.20). Una unidad de actividad xilanasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 mg/mL de azúcares reductores en las condiciones de ensayo. Figura M.20. Curva de calibración de Xilosa. P á g i n a | 87 M & M d) Ensayo de Actividad Proteasa La actividad proteásica se ha determinado mediante el método de la Azocaseina [Jones y col., 1998]. Mezcla de reacción:  0,1 g. azocaseína (Sigma Aldrich 11610)  0,2 mL etanol  4,8 mL tampón fosfato 0,1 M pH 7 Mezclar completamente la disolución hasta que sea homogéneo, se puede calentar para favorecer la mezcla. Si se forma espuma, centrifugar brevemente. Método: Mezclar 250 µL de muestra con 250 µL de mezcla de reacción. Incubar durante 10 min a 40 °C, una vez alcanzado este tiempo parar la reacción con 2,5 mL de TCA (ácido tricloroacético) al 5% (p/v). Centrifugar durante 1 min a 10 000 x g, y medir la absorbancia a 440 nm. Una unidad de actividad proteasa se define como la variación de 0,001 unidades de absorbancia por cada mL de muestra y min. También es posible realizar una recta de calibrado y extrapolar los datos obtenidos usando una proteasa de actividad conocida. Los valores de absorbancia se transformaron en actividad proteasa, P á g i n a | 94 M & M queda preparado para cargar las muestras. Tabla-M.8. Composición de los geles discontinuos de poliacrilamida.  Gel de concentración o empaque 5%  Gel de Separación o corrido 12% NOTA: El protocolo de la preparación de los diferentes tampones se encuentra en el apartado de ANEXOS. Solución A (Acrilamida 30%- Bisacrilamida 1%) 1,67 mL Solución C (Tampón de empaque 4x pH 6,8 ) 1 mL H2O 7,33 mL TEMED 25 µL APS (Persulfato amónico 50% p/v) 40 µL Volumen final 10 mL Acrilamida 30% 6 mL Bis-acrilamida 1% 2,37 mL Tampón de Separación 4X (pH 8,8) 3,81 mL H2O 2,82 mL TEMED 30 µL APS (Persulfato amónico 50% p/v) 30 µL Volumen final 15 mL P á g i n a | 95 M & M Las muestras previamente centrifugadas, se resuspenden en tampón de muestra 4X y se hirvieron durante 5 min para desnaturalizar las proteínas y facilitar la acción reductora del β-mercaptoetanol sobre los puentes di-sulfuro. Se enfrían y se centrifugan a 12.000 x g durante 5 minutos. Seguidamente se cargan las muestras (20-30 μL/pocillo, aproximadamente 40-50 μg de proteína). La electroforesis se corrió a intensidad constante (25 mA) utilizando un sistema de tampón Trisglicina que contenía SDS al 0.1% hasta que el bromofenol sale por el frente del gel. Terminada la electroforesis se desmontan los geles, se lavan, y se tiñen con azul de Coomassie o por plata, según proceda.  Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS)  Tinción con Azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250) Brevemente, se añaden unos 100 mL de solución Coomassie/gel de manera que cubra totalmente el gel, y se mantiene en agitación ¨overnight¨. Una vez transcurrido este tiempo se retira la solución de tinción y se procede a desteñir en una solución de ácido acético/metanol, 10:35, v/v, hasta que se observan claramente las bandas de color azul.  Tinción con Plata (Plus One TM Silver Staining Kit, GE Healthcare) Este tipo de tinción es unas 10 veces más sensible que la tinción con P á g i n a | 96 M & M Azul de Coomasie, el rango de detección de proteínas es de 10-100 ng/banda. Debido a la elevada capacidad reductora del ion plata (Ag+), es capaz de formar complejos con las proteínas con mayor afinidad que con la poliacrilamida, siendo estos complejos reducidos mucho más rápido que cuando el ión Ag+ esta libre. El método utilizado en el presente trabajo ha sido el método descrito por Heukeshoven y Dernick [Heukeshoven y Dernick, 1985]. Brevemente, terminada la electroforesis, si la muestra contiene baja concentración de proteínas se tiñe el gel directamente por plata, o bien primero se tiñe con Azul de Coomasie, se destiñe y tras desteñirlo se procede a la tinción por plata. La tinción por plata consta de las siguientes etapas: Fijación, Sensibilización, Lavado, Reacción de Ag+, Lavado, Revelado, Parada, Lavado, tal y como se muestra en la Tabla-M9. Tanto los geles teñidos con Azul de Coomasie como los teñidos por plata se han escaneado en un escáner (FUJIFILM FLA5100), equipado con el sistema de imágenes Gel Doc ™ XR + (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). P á g i n a | 97 M & M Tabla-M.9. Protocolo de tinción de proteínas con Plata. Paso Soluciones Tiempo Fijación de proteínas Etanol 100 mL Acido acético glacial 25 mL Volumen final 250 mL 30 min Sensibilización Etanol 75 mL *Glutaraldehido 25% (p/v) Ɨ 1,25 mL *Tiosulfato de sodio 5% (p/v) 10 mL Acetato de sodio 17 g Volumen final 250 mL 30 min Lavado Agua destilada 3 x 5 min Reacción de Ag+ Solución de nitrato de plata 2,5% (p/v) 25 mL &Formaldehido 37% (p/v) Ɨ 0,1 mL Volumen final 250 mL 20 min Lavado Agua destilada 2 x 1 min Revelado Carbonato de sodio 6,25 g Formaldehido 37% (p/v) Ɨ 0,05 mL Volumen final 250 mL  2-5 min Parada Solución EDTA-Na2-2H20 3,65 g Volumen final 250 mL Lavado Agua destilada *El glutaraldehido y el tiosulfato de sodio actúan como agentes complejantes uniéndose a las proteínas. &Formaldehido se usa como agente reductor.  Hasta que se observen la presencia de bandas. P á g i n a | 98 M & M 3.9.2 Tinción por afinidad (Zimografía) Para la realización del zimograma de la actividad quitinasa, se utilizó un gel de separación al 10% que contenía un 0,1% de quitina coloidal como sustrato de quitinasa para detectar la actividad de quitinasa. Las muestras se mezclaron con tampón de carga sin agente reductor y se calentaron antes de cargarlas en el gel de electroforesis. Después de la electroforesis, el gel se incubó en tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 5.0) a 4 °C durante 18 h. La actividad quitinasa se visualizó en el gel mediante la tinción con rojo Congo al 0,1%, y se destiño con NaCl 1M. La zona lítica en el gel observada a la luz del día sobre un fondo rojo oscuro indicó la presencia de una enzima activa [Yamabhai y col., 2008]. 3.9.3 Análisis proteómico Los análisis proteómicos se han realizado en el Gene Center de la Ludwig Maximilian Universitä, Munich (Alemania), en el laboratorio del Dr. Georg J. Arnold. Brevemente, los geles para el análisis proteómico no se han teñido, utilizándose directamente tal cual se han extraído del casette, se han lavado y estabilizado. El proceso global seguido en este estudio se muestra esquemáticamente en la Figura-M.24. Una vez cargado 50 μg de proteínas por carril, éstas se separaron por PAGE-SDS al 12%. Terminada la electroforesis, extraído el gel, separados los carriles, cortando con un bisturí, cada uno de los carriles de gel, sin teñir, se dividió en tres partes y cada parte se colocó en un tubo diferente. Seguidamente cada fragmento se procesó P á g i n a | 99 M & M individualmente, mediante "digestión triptica in gel", siguiendo el protocolo descrito por Carbonero-Aguilar [Carbonero-Aguilar, 2012]. Cada parte se incubó en NH4HCO3 40 mM, 30% (v/v) de acetonitrilo a 30 °C durante 120 min. Las proteínas dentro de las piezas se redujeron con ditiotreitol 10 mM durante 20 min. Después de lavar con NH4HCO3 40 mM, los geles se alquilaron mediante incubación en yodoacetamida 20 mM durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras alquiladas se lavaron con NH4HCO3 40 mM y se deshidrataron con 100% de ACN. Las proteínas in gel se digirieron con tripsina porcina modificada grado secuenciación (Promega, Madrid, España) en NH4HCO3 40 mM, a 37 °C durante la noche. Los péptidos trípticos, generados durante la digestión tríptica in gel, se extrajeron dos veces, de las piezas de gel, con ACN al 50% (v/v), y se secaron al vacío en una Savant. Los péptidos secos se guardaron a -80 °C hasta su análisis por nano-cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (nLC-MS/MS). P á g i n a | 100 M & M Figura M.24. Esquema del diseño experimental utilizado para el análisis proteómico del secretoma de T. harzianum CEC-T24. P á g i n a | 101 M & M Brevemente, los digeridos peptídicos se resuspendieron en agua MilliQ ultrapura y se eliminaron las sales con un tampón A (H2O 99,9% + 0,1% de ácido fórmico) en una columna atrapadora de péptidos Zorbax 300 SB-C18, 5 × 0,3 mm, (Agilent, Madrid, España) durante 10 min. Los péptidos unidos a la columna se eluyeron a una columna Picofrit empaquetada con Microm Magic C18 AQ, de 10 cm x 75 µm, y se eluyeron con un gradiente de tampón B (99,9% de acetonitrilo + 0,1% de ácido fórmico) al 5% hasta un 50% de tampón B en 75 min, y luego del 50% de tampón B al 90% de tampón B en 80 min, usando para ello un HPLC Themo Electron Surveyor. Eluyéndose los péptidos, a un flujo de 250 nL min-1, a un espectrómetro de masas Thermo Electron LTQ / FT para su análisis. Los espectros de MS y MS/MS se han obtenido en modo automático con una resolución de 100.000, y los diez iones principales de cada ciclo se sometieron a una autolisis por disociación inducida por colisión (CDI) en una trampa lineal (LTQ). Para el análisis de iones en modo MS/MS, los iones precursores fueron acelerados a 8 kV y seleccionados en la puerta de entrada de iones de trampa. Los fragmentos generados por colisión de los precursores con aire en la cámara de colisión CID, fueron además acelerados a 15 kV en la 2ª fuente y sus masas fueron analizadas después de pasar por el reflector de iones. El análisis automático de los datos de masas se realizó usando una tolerancia para los fragmentos de 0,80 Da (monoisotópica) y para los precursores de 200 ppm (monoisotópica). Permitiéndose modificaciones parciales y completas de restos aminoacídicos, así como mutaciones P á g i n a | 102 M & M puntuales y dos sitios de escisión perdidos. La validación probabilística de las identificaciones de proteínas en el secretoma de T. harzianum CEC-T24 (v. 2.0, DOE Joint Genome Institute) se ha llevado a cabo con la versión Scaffol 01.07.00 (Proteome Software, Portland, Oregón), utilizando para ello los algoritmos X-Tandem y Protein Prophet. [Craig y Beavis, 2003; Nesvizhskii y col., 2003] Los criterios mínimos para la identificación positiva se establecieron en al menos la identificación de dos péptidos y con una probabilidad> 95%. 3.10 Estabilización de Quitinasas El estudio de estabilidad de los preparados enriquecidos en quitinasas se ha llevado a cabo en preparados liofilizados, ultraconcentrados y ultraconcentrados + glicerol al 30%, así como inmovilizada en micropartículas de alginato, midiendo la actividad de las muestras al cabo de 1, 2, 4, 6 y 12 meses, previo almacenamiento a 4 °C, temperatura ambiente (22-23 °C) y 45 °C. 3.11 Producción de quitinasas en un reactor tipo tambor rotativo (escala semi-piloto). El cambio de escala de la producción de quitinasas en medios ricos en quitina se ha llevado a cabo en un reactor tipo tambor rotatorio, esquemádicamente descrito en la Figura M.25., de acuerdo con el procedimiento descrito por Pérez-Rodriguez y colaboradores para la producción de otras enzimas, xilanas y feruloil esterasa [Pérez- P á g i n a | 103 M & M Rodriguez y col., 2017]. Figura M.25. Esquema del reactor tipo tambor rotatorio utilizado para la producción de quitinasas en medios ricos en quitina. Para el seguimiento del proceso, medida de actividades, biomasa, etc., se han utilizado las mismas técnicas y procedimientos descritos más arriba. 3.12 Análisis de datos Los datos analíticos se compararon mediante el análisis de varianza (ANOVA) utilizando SAS 9.3. Se ha utilizando la prueba de rango múltiple de Duncan (DMRT), estableciendo el nivel de significancia en 0.05. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. En el caso del estudio proteómico, el análisis automático de los datos de masas se ha realizado usando una tolerancia para los fragmentos de 0,80 Da (monoisotópica) y para los precursores de 200 ppm (monoisotópica). Permitiéndose modificaciones parciales y completas de P á g i n a | 206 BIBLIOGRAFIA fermentation. Process Biochemistry, 34(3), 257-267. doi.org/10.1016/S00329592(98)00092-2 194. Suresh, P. V. & Anil PKK. ( 2012 ). Degradación mejorada de los materiales de alfa-quitina preparados a partir del subproducto del procesamiento del camarón y la producción de N-acetildglucosamina por quitinasas termoactivas de hongos mesófilos del suelo. Biodegradación, 23, pp. 597 – 607 195. Suzuki, M., Morimatsu, M., Yamashita, T., Iwanaga, T., & Syuto, B. (2001). “A novel serum chitinase that is expressed in bovine liver”. FEBS letters, 506(2), 127-130. doi.org/10.1016/S0014-5793(01)02893-9 196. Suzuki, K., Sugawara, N., Suzuki, M., Uchiyama, T., Katouno, F., Nikaidou, N., & Watanabe, T. 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Acrilamida 30% (p/v): Acrilamida 30 g H2O 100 mL 2. Bis-acrilamida 1% (p/v): Bis-acrilamida 0,5 g H2O 50 mL 3. Running buffer 4X: 1,5M Tris-HCl (pH 8,8) 36 g H2O 150 mL Ajustar pH 8,8 0,4% SDS 8 mL de SDS al 10% Revisar pH H2O csp 200 mL P á g i n a | 215 ANEXOS 4. Solución A (Solución stock de acrilamida, T= 30%, C= 2,7%) Acrilamida 29,2 g Bis-acrilamida 0,8 g H2O csp 100 mL Durante la preparación de esta solución trabajar siempre con guantes y en campana. (Acrilamida es Neurotóxica) 5. Stacking buffer 4X (Solución C): 0,5M Tris-HCl (pH 6,8) 6,05 g H2O 50 mL Ajustar pH 6,8 0,4% SDS 4 mL de SDS al 10% Revisar pH H2O csp 100 mL 6. Tampón de electroforesis 1X: Tris-HCl 25mM 3 g Glicina 190mM 14,258 g SDS 0,1% 10 mL de SDS al 10% H2O 900 mL Ajustar pH a 8,4 con HCl gota a gota H2O csp 100 mL Estable a temperatura ambiente varias semanas. Preferible preparar cada semana. 7. Tampón de muestra 4X (de carga, de disociación, Mixer): 0,02M Tris-HCl pH 6,8 2 mL de Tris-HCl 100mM 20% β-mercaptoetanol 2 mL 4,6% SDS 0,46 g 40% glicerol 4 mL de glicerol al 99% 0,01% azul de Bromofenol 0,3 mL de AdB al 0,5% (p/v) H2O csp 10 mL Hacer alícuotas y guardar a -20 ˚C P á g i n a | 222 ANEXOS Anexo 6: XIII EUCHIS & VIII SIAQ PREPARATION OF FUNGAL CHITIN FROM AGROINDUSTRIAL BYPRODUCTS: APLICATION TO EDIBLE MUSHROOMS (Agaricus bisporus) BY-PRODUCTS. Alberto Renato Inca Torres, Anabell Del Rocío Urbina Salazar, Gonzalo Falcón García, Pilar Carbonero Aguilar, and Juan Bautista Palomas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla. 41012-Sevilla, Spain. The use of chitin-oligosaccharides for use as potential elicitors requires abundant chitin rich materials, readily available and cheap (1). For this purpose, the production of enriched chitin fractions from by-products of the edible mushroom processing industry are of great interest if appropriated procedures were developed (2). Traditional methods for the commercial preparation of chitin involve alternate hydrochloric acid and alkali treatment, followed by a bleaching stage with chemical reagents to obtain a colorless product. These processes are highly contaminant. Therefore, the developments of environmental friendly processes are of high interest. In this work we report on preliminary results obtained with an enzymatic procedure, environmental friendly, based on the use on proteases and glucanases that lead to fungal chitin fraction with a chitin concentration > 80±2%. References 1. (1). Gianfranco Romanazzi, Simona Marianna Sanzani, Yang Bi, Shiping Tian, Porfirio Gutiérrez Martínez, Noam Alkan, (2016). Induced resistance to control postharvest decay of fruit and vegetables. 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ERG scavenges hydrogen peroxide (H2O2), superoxide anion (•O2−), singlet oxygen (1O2), lipid peroxides, hydroxyl radical (•OH) and nitric oxide (NO) derivatives (1). ERG exhibits potential applications as a food additive and as an antioxidant for the treatment and/or prevention of oxidative stress related diseases (2). Commercial ERG are mainly synthetic, however natural ERG is preferred by consumers. In this work we present a natural product enriched in natural ERG in the form of extract, M-ERG-EAE, obtained from the edible mushroom (Agaricus bisporus) using enzymes and membrane technology (MAE) (3). This product can be incorporated in solid or liquid foods or used as a component of cosmetic creams such as sunscreen creams. “In vitro” studies show that M-ERG-EAE, as pure ERG, scavenged the superoxide anion radical (•O2-) and singlet oxygen (1O2), preventing the formation of the high dangerous radical •OH and preventing the damage in biomolecules, mainly proteins, nucleic acids and lipids. From these results, we concluded that M-ERG-EAE, as pure ERG, scavenged •O2and 1O2, reducing the formation of the high dangerous radical •OH mainly in presence of transition metals such as Fe2+ and Cu+. References: 1. Servillo L., D’Onofrio N., Casale R., Cautela D., Giovane A., Castaldo D., Balestrieria M.L. (2017). Ergothioneine products derived by superoxide oxidation in endothelial cells exposed to high-glucose. Free Radical Biology and Medicine, 108:8–18. 2. Halliwell B., Cheah I.K., Drum C.L. (2016). Ergothioneine, an adaptive antioxidant for the protection of injured tissues? 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Alberto Renato INCA-TORRESa,b*, Anabell del Rocío URBINASALAZARa,b, and Juan BAUTISTAa. a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Sevilla, C/ Profesor García González nº2, 41012 Sevilla, Spain, [email protected] b Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias, Panamericana Sur km 1 1/2, Riobamba, Ecuador, [email protected] Abstract: Nanochitin fibers (NChC) were prepared from crawfish chitin (Procambarus clakii) by-products. Raw chitin has been obtained by two different processes: Process A consists of a first deproteinization with a protease treatments, followed by a demineralization in situ by lactic acid fermentation (1) and a second deproteinization by alkaline treatment; Process B consists of acid demineralization step, followed by an enzymatic treatment with proteases and a final alkaline treatment. The concentration of raw crab chitin obtained from Process-A and -B determined as N-acetyl-glucosamine is 85 ± 1.8% and 83 ± 2.3%, being a chitin of good quality, similar to that commercially available for food and medical uses. Subsequently, the preparation of chitin nanofibers were carried out disintegrating the chitin aggregates by a milling process. After a treatment cycle with a wet-type grinder, the chitin suspension P á g i n a | 225 ANEXOS formed a gel; disintegration was achieved due to a high surface-tovolume ratio. Obtaining highly uniform chitin fibers with a width of approximately 10 nm which still maintained their original chemical and crystalline structures (2,3). The obtained product can be used for industrial applications in pharmacy, cosmetic, agriculture and wastewater treatments. Graphical abstract REFERENCES 1. Bautista et al., (2001). Process Biochemistry, 37: 229-234. 2. Abe K.., et al., (2007). Biomacromolecules. 8: 3276–3278. 3. Ifuku S., (2014). Molecules, 19: 18367-18380. Financial support and/or acknowledgments  Spanish Ministry of Science and Innovation (project RTC-2015-4039-2), FEDER funds of the European Union.  CITIUS, Universidad de Sevilla, Servicio de Biología, Invernadero y Servicio de Microanálisis. P á g i n a | 226 ANEXOS Anexo 9: XIII EUCHIS & VIII SIAQ USE OF CRAYFISH (Procambarus clarkii) CHITIN AS CARBON SOURCE FOR THE PRODUCTION OF CHITINASES BY SUBMERGED FERMENTATION Pilar Carbonero Aguilar, Gonzalo Falcón García, Anabell Urbina Salazar, Alberto Inca Torres and Juan Bautista. There is an increasing interest in chitinases for it uses in biocontrol and control of plagues, so as for the production of chitinooligosaccharides (elicitors) (1). But an effective practical uses required a viable production of this enzymes. For that purpose it is necessary to have an abundant, easily acquired, seasonally independent and cheap fermentation media, obtained by environmentally friendly processes. Such a fermentation media can be obtained from crayfish (Procambarus clarkii) sub-products by treatment with enzymatic and chemical procedures which originate chitin enriched fraction. These chitin enriched fraction can be used as carbon sources and as an inductor for chitinases production by fermentation procedures, using defined media culture (Mesia-I, -II, -III and –IV) inoculated with a genetically modified Bacillus licheniformis ATCC 21415 (2). Production of chitinase was studied in the theses medias: Media-I: Coloidal Chitin (positive control); Media-II: P. clarkii-Chitin (65.3±2,7 %); Media-III: P. clarkii-Chitin (78±3,2 %) and Media-IV: P. clarkii-Chitin (23.1±1.03. %). Our results show that the production of chitinase activity is higher than that observed with colloidal chitin (prepared from commercial chitin, and used as positive control). Chitinase productivity after 7 days of growth was of 73.25 mU/L/day. Secretion of chitinase to culture medium was studied by electrophoretic methods, and two bands with molecular mass around 91 and 75 kDa were detected. These results show that the growth of B. licheniformis ATCC 21415 in a medium formulated with P. clarrkii-Chitin, could be a good procedure for the regular production of chitinases. References 1. S. Das, D. Roy, R. Sen., (2016). Utilization of Chitinaceous Wastes for the Production of Chitinase. Advances in Food and Nutrition Research. Volume 78, pp. 27–46 2. Saima, M. Kuddus, Roohi, I.Z. Ahmad, (2013). Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11, 39–46 P á g i n a | 227 ANEXOS Anexo 10: XIII EUCHIS & VIII SIAQ Production of Crawfish (Procambarus clarkii) enriched fractions by enzymatic procedures for fermentation uses and chitinoligosaccharides. Falcón-García G., Carbonero-Aguilar P., Inca-Torres A.R., UrbinaSalazar A.R., and Bautista J. Currently, chitin, chitosan, and their derivatives are widely used in chemistry, medicine, pharmacy, cosmetics, food technology, water treatment, etc. [1,2]. A prerequisite to increase the use of chitin is the development of environmental friendly manufacturing processes, or the development of profitable processes to recover chitin and other products such as proteins, protein-hydrolyzates and pigments, if crustacean-processing waste products are used as starting material [3]. Traditional methods for the commercial preparation of chitin from crustacean shell (exoskeleton) involve alternate hydrochloric acid and alkali treatment stages to remove calcium carbonate and proteins, respectively, followed by a bleaching stage with chemical reagents to obtain a colourless product. These processes are highly contaminant [2]. Therefore, the development of environmental friendly processes is of high interest. The in-situ production of lactic acid at low cost from agroindustrial by-products, and protease treatment could contribute to the development of this type of processes for the recovery of chitin. In this work, we report on the in-situ production of lactic acid using crayfish meal supplemented with brewer’s grains soluble as fermentation media, for the demineralization of crayfish exoskeleton followed by protease treatment as deproteinization step. References 1. Fatma Gassara, Candice Antzak, Chandran Matheyambath Ajila, Saurabh Jyoti Sarma, Satinder Kaur Brar, M. Verma. Chitin and chitosan as natural flocculants for beer clarification Journal of Food Engineering 166 (2015), 80–85 2. Imen Hamed , Fatih Ozogul, Joe M. Regenstein. Industrial applications of crustacean by-products (chitin, chitosan, and chitooligosaccharides): A review. Trends in Food Science & Technology 48, (2016), 40–50 J. Bautista*, M. Jover, J.F. Gutierrez, R. Corpas, O. Cremades, E. Fontiveros , F. Iglesias, J. Vega.Preparation of crayfish chitin by in situ lactic acid production, Process Biochemistry 37 (2001) 229–234 P á g i n a | 228 ANEXOS Anexo 10: 5th International Conference Enzymes in the Environment. Ecology, Activity and Application. Bangor, Gales, Reino Unido. 2016 OBTAINING A SOIL BIOSTIMULANT FROM SEWAGE SLUDGE: EFFECT ON SOIL BIOCHEMISTRY Bruno RODRIGUEZ-MORGADO* (bro[email protected]); Pablo CABALLERO JIMENEZ; Alberto Renato INCA TORRES; Anabell URBINA SALAZAR; Juan PARRADO RUBIO*, Dept. Biochemistry and Molecular Biology, University of Seville, Spain; Manuel TEJADA MORAL, Dept. Crystallography, Mineralogy and Agricultural Chemistry, University of Seville, Spain Sewage sludge is a byproduct of wastewater treatment plants. These sludges present a serious problem because current management consists mainly in composting, a process that requires large amounts of space and time, resulting in a final product with low added-value. In order to promote a more dynamic use of sewage sludge while increasing their added-value, we implemented a fermentative technology using Bacillus licheniformis ATCC 21415, a microorganism widely used in industry, that excreted different hydrolytic enzymes, which together with the Bacillus itself have a great potential in soil applications. We studied both the production of various enzymes associated with geochemical cycles, such as proteases, cellulases, lipases, etc., and the total production of extracellular proteins by proteomic analysis thereof. Finally, we have applied these fermented products as edafic biostimulants, evaluating its effect on the biochemical properties of soil, mainly in enzymatic activities related to microbiota, such as dehydrogenase, phosphatase and glucosidase. References 1. Parrado, J., Rodriguez-Morgado, B., Tejada, M., Hernandez, T., & Garcia, C. (2014). Proteomic analysis of enzyme production by Bacillus licheniformis using different feather wastes as the sole fermentation media. Enzyme and microbial technology, 57, 1-7. 2. Tejada, M., García-Martínez, A. M., Rodríguez-Morgado, B., Carballo, M., García-Antras, D., Aragón, C., & Parrado, J. (2013). Obtaining biostimulant products for land application from the sewage sludge of small populations. Ecological engineering, 50, 31-36. P á g i n a | 229 ANEXOS Anexo 11: Artículo 1 P á g i n a | 230 ANEXOS P á g i n a | 231 ANEXOS P á g i n a | 238 ANEXOS Anexo 12: Artículo 2 P á g i n a | 239 ANEXOS P á g i n a | 240 ANEXOS P á g i n a | 241 ANEXOS P á g i n a | 242 ANEXOS P á g i n a | 243 ANEXOS P á g i n a | 244 ANEXOS P á g i n a | 245 ANEXOS P á g i n a | 246 ANEXOS P á g i n a | 247 ANEXOS