Optimización de cepas bacterianas aisladas de los arrozales de las marismas del Guadalquivir para su aplicación en la síntesis biotecnológica de precursores de polímeros utilizados en la fabricación de bioplásticos

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Optimización de cepas bacterianas aisladas de los arrozales de las Marismas del Guadalquivir para su aplicación en la síntesis biotecnológica de precursores de polímeros utilizados en la fabricación de bioplásticos. MARÍA FERNÁNDEZ GÓMEZ SEVILLA 2016 i Índice 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................... pág. 1 1.1. LOS PLÁSTICOS ..................................................................................................................................... pág. 1 1.2. LOS BIOPLÁSTICOS ............................................................................................................................. pág. 6 1.2.1. Monómeros producidos por vía biotecnológica ............................................... pág. 7 1.2.1.1. 2,3-butanodiol ........................................................................................................ pág. 8 1.2.2. Poliuretano ............................................................................................................................. pág. 10 1.3. BIOTECNOLOGÍA EN LA INDUSTRIA ........................................................................................... pág. 11 1.3.1. Microbiología industrial ................................................................................................. pág. 12 1.3.2. Manipulación de vías metabólicas para la sobreproducción de bioproductos de interés industrial ....................................................................................... pág. 14 1.4. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA OBTENCIÓN DE BIOPRODUCTOS ............................................................................................................................................ pág. 16 1.4.1. Cáscara de naranja ............................................................................................................. pág. 17 1.4.2. Pulpa de remolacha .............................................................................................. pág. 18 1.4.3. Desechos de piña .............................................................................................................. pág. 19 1.5. FAMILIA BACTERIANA ENTEROBACTERIACEAE ................................................................. pág. 20 1.5.1. Descripción de la familia Enterobacteriaceae .................................................... pág. 20 1.5.2. Patogenia de la familia Enterobacteriaceae ........................................................ pág. 20 1.5.3. Fermentación en la familia Enterobacteriaceae ............................................... pág. 23 1.5.4. Obtención de bioproductos por enterobacterias ............................................. pág. 23 1.5.5. Asociación a plantas en enterobacterias ............................................................... pág. 24 1.6. LA PLANTA DE ARROZ COMO FUENTE DE BACTERIAS CON CAPACIDAD DE PRODUCCIÓN DE 2,3-BDO ................................................................................................................ pág. 25 1.7. CULTIVO DE ARROZ EN LAS MARISMAS DEL GUADALQUIVIR ....................................... pág. 26 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................................................... pág. 26 3. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................................................... pág. 27 3.1. MUESTREO Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS ......................................................................... pág. 27 3.1.1. Toma de muestras .............................................................................................................. pág. 27 3.1.2. Tratamiento de muestras .............................................................................................. pág. 28 3.1.2.1. Tratamiento de muestras de suelo rizosférico ........................................ pág. 28 3.1.2.2. Tratamiento de muestras de raíz y parte aérea ....................................... pág. 29 3.2. MEDIOS DE CULTIVO .......................................................................................................................... pág. 29 ii 3.3. SOLUCIONES TAMPÓN ....................................................................................................................... pág. 32 3.4. COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS .............................................................................................. pág. 32 3.5. MÉTODOS DE AISLAMIENTO .......................................................................................................... pág. 33 3.6. MATERIAL BIOLÓGICO ...................................................................................................................... pág. 33 3.6.1. Cepas bacterianas ............................................................................................................... pág. 33 3.6.2. Condiciones de cultivo y conservación de las cepas ....................................... pág. 34 3.6.3. Plásmidos ................................................................................................................................. pág. 34 3.7. EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y MANIPULACIÓN DE ADN ................................................ pág. 35 3.7.1. Extracción de ADN genómico ........................................................................................ pág. 35 3.7.2. Extracción de ADN plasmídico ..................................................................................... pág. 35 3.7.3. Determinación de la concentración y pureza del ADN .................................. pág. 36 3.7.4. Amplificación de ADN mediante PCR ....................................................................... pág. 36 3.7.4.1. PCR ................................................................................................................................ pág. 36 3.7.4.2. PCR fingerprinting ................................................................................................. pág. 37 3.7.4.3. Primers utilizados .................................................................................................. pág. 37 3.7.5. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ............................................................... pág. 37 3.7.6. Secuenciación de ADN ....................................................................................................... pág. 38 3.7.7. Digestión de ADN con enzimas de restricción ..................................................... pág. 38 3.7.8. Ligación de fragmentos de restricción .................................................................... pág. 38 3.8. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS ........................................................................................................ pág. 38 3.9. MÉTODOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO .............................................. pág. 39 3.9.1. Conjugación ............................................................................................................................ pág. 39 3.9.2. Transformación .................................................................................................................... pág. 39 3.9.3. Recombinación homóloga .............................................................................................. pág. 40 3.10. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA ............................................................................................... pág. 40 3.10.1. Características morfológicas ..................................................................................... pág. 40 3.10.1.1. Características macroscópicas ....................................................................... pág. 40 3.10.1.2. Morfología ............................................................................................................... pág. 40 3.10.2. Características fisiológicas ......................................................................................... pág. 41 3.10.2.1. Crecimiento ............................................................................................................ pág. 41 3.10.2.2. Tolerancia a diversos factores ....................................................................... pág. 42 3.10.3. Pruebas bioquímicas ...................................................................................................... pág. 43 3.10.3.1. Prueba oxidasa ...................................................................................................... pág. 43 iii 3.10.3.2. Prueba catalasa ..................................................................................................... pág. 43 3.10.3.3. Pruebas IMViC ....................................................................................................... pág. 43 3.10.3.4. Batería de pruebas API 20E ............................................................................. pág. 45 3.10.3.5. Producción de ácido y gas a partir de carbohidratos ........................... pág. 45 3.10.3.6. Determinación de actividades enzimáticas .............................................. pág. 46 3.10.3.6.1. Medida de actividad enzimática BDH ...................................... pág. 47 3.10.3.6.2. Medida de actividad enzimática GAPDH ................................ pág. 48 3.10.3.6.3. Medida de actividad enzimática LDH ...................................... pág. 48 3.11. SENSIBILIDAD FRENTE A ANTIBIÓTICOS ............................................................................... pág. 49 3.12. OBTENCIÓN DE 2,3-BDO .................................................................................................................. pág. 50 3.12.1. Ensayo de producción de 2,3-BDO mediante fermentación ..................... pág. 50 3.12.2. Recuperación de metabolitos resultantes de la fermentación ............... pág. 50 3.13. OBTENCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES A PARTIR DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES .................................................................................................................................... pág. 50 3.13.1. Pre-tratamiento de los residuos ............................................................................... pág. 50 3.13.2. Hidrólisis ácida ................................................................................................................... pág. 50 3.13.3. Hidrólisis enzimática ...................................................................................................... pág. 51 3.13.4. Autohidrólisis ...................................................................................................................... pág. 51 3.13.5. Detoxificación de los hidrolizados .......................................................................... pág. 51 3.14. MÉTODOS ANALÍTICOS .................................................................................................................... pág. 51 3.14.1. Cuantificación de metabolitos resultantes de la fermentación .............. pág. 51 3.14.1.1. Cuantificación mediante cromatografía ..................................................... pág. 51 3.14.1.2. Cuantificación por método enzimático ....................................................... pág. 52 3.14.2. Cuantificación de sacarosa ........................................................................................... pág. 52 3.14.2.1. Cuantificación por cromatografía ................................................................. pág. 52 3.14.2.2. Cuantificación por refractometría ................................................................ pág. 53 3.14.2.3. Cuantificación de la concentración celular ............................................... pág. 53 3.15. ADHESIÓN A CÉLULAS AUCARIOTAS ............................................................................................ pág. 54 4. RESULTADOS ................................................................................................................................................. pág. 55 4.1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS ...................................................................................... pág. 55 4.2. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CEPAS SELECCIONADAS ................. pág. 56 iv 4.2.1. Identificación por secuenciación del gen ARN ribosomal 16S (ADNr 16S) ........................................................................................................................................................... pág. 56 4.2.2. Identificación por PCR fingerprinting (huella genética) ............................... pág. 58 4.3. SELECCIÓN DE UNA CEPA PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3-BDO ...................................... pág. 59 4.3.1. Screening de producción de 2,3-BDO de las cepas seleccionadas ............ pág. 59 4.3.2. Utilización de carbohidratos ......................................................................................... pág. 60 4.3.3. Caracterización de la cepa E. aerogenes SC10 ...................................................... pág. 62 4.3.3.1. Caracterización fenotípica .................................................................................. pág. 62 4.3.3.2. Pruebas bioquímicas ............................................................................................. pág. 63 4.3.3.3. Sensibilidad frente a antibióticos .................................................................... pág. 64 4.3.3.4. Crecimiento ............................................................................................................... pág. 64 4.3.3.5. Producción de 2,3-BDO ........................................................................................ pág. 66 4.4. MEJORA DE LA CEPA E. aerogenes SC10 PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3-BDO ........... pág. 67 4.4.1. Sobreproducción de 2,3-BDO mediante modificación de vías implicadas en la producción de metabolitos en la ruta metabólica de síntesis de este compuesto ........................................................................................................... pág. 67 4.4.1.1. Modificación de la vía metabólica de síntesis de lactato ....................... pág. 68 4.4.1.1.1. Efecto de la síntesis de lactato en la producción de 2,3BDO en E. aerogenes ............................................................................................ pág. 68 4.4.1.1.2. Estudio in silico del gen codificante de la enzima lactato deshidrogenasa (ldhA) ......................................................................................... pág. 69 4.4.1.1.3. Obtención de una cepa con interrupción del gen ldhA .......... pág. 69 4.4.1.2. Modificación de la vía metabólica de oxidación de gliceraldehído3-fosfato .................................................................................................................... pág. 71 4.4.1.2.1. Efecto de la oxidación de gliceraldehído-3-fosfato en la producción de 2,3-BDO en E. aerogenes ........................................................ pág. 71 4.4.1.2.2. Estudio in silico del gen codificante de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA) ...................................... pág. 73 4.4.1.2.3. Obtención de una cepa con sobreexpresión del gen gapA ... pág. 73 4.4.1.3. Modificación de la vía metabólica de reducción de acetoína ............... pág. 74 4.4.1.3.1. Efecto de la reducción de acetoína en la producción de 2,3-BDO en E. aerogenes ..................................................................................... pág. 74 4.4.1.3.2. Estudio in silico del gen codificante de la enzima acetoína reductasa/butanodiol deshidrogenasa (bdh) ............................................. pág. 75 4.4.1.3.3. Obtención de una cepa con sobreexpresión del gen bdh ...... pág. 76 v 4.4.1.4. Obtención de cepas con modificación de varios genes .......................... pág. 77 4.4.1.4.1. Doble sobreexpresión de los genes bdh y gapA ........................ pág. 77 4.4.1.5. Caracterización de las cepas mutantes obtenidas .................................... pág. 78 4.4.1.5.1. Estudio de crecimiento ...................................................................... pág. 78 4.4.1.5.2. Estudio de utilización de carbohidratos ..................................... pág. 80 4.4.1.5.3. Estudio de tolerancia a distintos factores .................................. pág. 80 4.4.1.5.4. Estudio de actividades enzimáticas .............................................. pág. 85 4.4.1.6. Estudio de producción de 2,3-BDO por las cepas mutantes ................ pág. 86 4.4.1.6.1. Optimización de las condiciones de producción de 2,3BDO en E. aerogenes ............................................................................................ pág. 86 4.4.1.6.2. Ensayo de producción de 2,3-BDO por las cepas mutantes pág. 90 4.5. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3BDO ...................................................................................................................................................................... pág. 94 4.5.1. Caracterización de residuos agroindustriales .................................................... pág. 94 4.5.2. Obtención de azúcares fermentables a partir de residuos agroindustriales ................................................................................................................................. pág. 94 4.5.3. Detoxificación de los residuos ...................................................................................... pág. 97 4.5.4. Ensayos de crecimiento .................................................................................................... pág. 98 4.5.5. Producción de 2,3-BDO a partir de los residuos ............................................... pág. 98 4.6. OBTENCIÓN DE CEPAS SEGURAS PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3-BDO ........................ pág. 99 4.6.1. Estudio in silico de los genes de síntesis de fimbrias ....................................... pág. 100 4.6.2. Obtención de una cepa con interrupción del gen fimD .................................. pág. 100 4.6.3. Caracterización de las fimbrias en las cepas con interrupción del gen fimD ........................................................................................................................................................... pág. 103 4.6.3.1. Caracterización fenotípica de las cepas con deleción de las fimbrias ....................................................................................................................................... pág. 103 4.6.3.2. Ensayo de adhesión a células eucariotas ...................................................... pág. 104 4.6.3.3. Estudio de efectos en el crecimiento .............................................................. pág. 104 4.6.3.4. Estudio de efectos en la producción de 2,3-BDO ...................................... pág. 104 5. DISCUSIÓN ...................................................................................................................................................... pág. 105 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................................................ pág. 119 7. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................................. pág. 121 vi Índice de tablas Tabla 1. Principales productos microbianos de interés en microbiología industrial y biotecnología. Tabla 2. Antibióticos utilizados en este trabajo. Tabla 3. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo. Tabla 4. Plásmidos utilizados en este trabajo. Tabla 5. Primers utilizados en este trabajo. Tabla 6. Programas bioinformáticos utilizados en este trabajo para el análisis de ADN. Tabla 7. Diferentes aspectos tenidos en cuenta para determinar la morfología de las colonias bacterianas. Tabla 8. Cepas aisladas a partir de las diferentes zonas de muestreo. Tabla 9. Cepas seleccionadas y similitud con especies de la base de datos según secuenciación del ADNr 16S. Tabla 10. Datos de producción de 2,3-BDO a las 24 h de cultivo de las especies aisladas. Tabla 11. Resultados de prueba de utilización de glucosa y sacarosa. Tabla 12. Características macroscópicas de la cepa E. aerogenes SC10 y la cepa de referencia E. aerogenes CECT 684T. Tabla 13. Sensibilidad a distintos antibióticos de las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T. Tabla 14. Resultados de utilización de diversos carbohidratos por parte de la cepa silvestre y mutantes de E. aerogenes SC10. Tabla 15. Azúcares obtenidos mediante tratamientos de hidrólisis de los distintos residuos. Tabla 16. Cuantificación de azúcares de autohidrolizado de naranja antes y después de su detoxificación. Tabla 17. Crecimiento de la cepa E. aerogenes SC10 medios de cultivo preparados a partir de residuos. vii Índice de figuras Fig. 1. Momificación utilizando polímeros naturales en el antiguo Egipto. Fig. 2. Evolución de la producción mundial de plásticos en los últimos años. Fig. 3. Proceso de fabricación de plástico a partir de petróleo. Fig. 4. Gránulos de poliéster en células de Bacillus megaterium. Fig. 5. Esteroisomeros del 2,3-BDO. Fig. 6. Esquema de la ruta microbiana de síntesis de 2,3-BDO a partir de piruvato. Fig. 7. Proceso industrial de obtención de zumo y subproductos a partir de naranja. Fig. 8. Proceso industrial de obtención de azúcar y subproductos a partir de remolacha. Fig. 9. Proceso industrial de obtención de pulpa de piña. Fig. 10. Adhesión de enterobacteria a célula huésped a través de fimbrias tipo I (Mulvey et al., 1998). Fig. 11. Planta de arroz. Fig. 12. Cultivo de arroz sano (izquierda) y cultivo afectado por Akegare (derecha). Fig. 13. Marismas del Guadalquivir, cultivo de arroz. Fig. 14. Situación de las diferentes zonas de recogida en las marismas del Guadalquivir y de las unidades de cultivo o tablas (T1, T2, T3) dentro de cada zona de recogida; Los Pobres (A), Hato Ratón (B) y La Compañía (C). Imagen obtenida a partir de plano de GoogleEarth (http://earth.google.com). Fig. 15. Toma de muestras de plantas de arroz. Fig. 16. Distintas divisiones de la planta de arroz: tallos y hojas (TH), raíces (R) y suelo rizosférico (S). Fig. 17. Patrón de crecimiento bacteriano típico. Parámetros para el cálculo de la velocidad específica de crecimiento. Fig. 18. Resultados para la prueba de rojo fenol. Fig. 19. Esquema de obtención de extracto libre de células a partir de cultivo bacteriano. Fig. 20. Reacción catalizada por la enzima butanodiol deshidrogenasa. Fig. 21. Reacción catalizada por la enzima gliceraldehído-3-P deshidrogenasa. Fig. 22. Reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa. Fig. 23. Distribución porcentual de las cepas aisladas agrupadas por género. Fig. 24. Perfiles obtenidos a partir de la PCR-ERIC, agrupados por aislados pertenecientes a la misma especie (a) y gráficas obtenidas a partir de los patrones de bandas mediante el programa ImageJ (b) 1 1. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N Introducción 1 1.1. LOS PLÁSTICOS El plástico es el primer material sintético creado por el hombre, aunque antes de su aparición, ya se utilizaban algunos polímeros naturales, como el betún, la goma y el ámbar. Se tienen referencias del uso de estos materiales hacia el año 2000 a.C. en Egipto (figura 1) y Babilonia, para diversas aplicaciones, desde la fabricación de artículos rituales hasta la impregnación de los muertos para su momificación (García, 2009). Los plásticos son compuestos con forma de cadena, conocidos químicamente como polímeros, formados por la unión de moléculas más pequeñas denominadas monómeros. El nombre común de plásticos se debe a la propiedad que tienen de ser deformables por plasticidad (frente a la elasticidad), bajo la influencia del calor, la presión o de ambos a la vez. Este término abarca productos que difieren entre sí por su estructura química, sus propiedades físicas, sus aplicaciones prácticas y sus procesos de fabricación (Elías, 2000). En función de su procedencia los plásticos pueden clasificarse en:  Naturales: se obtienen directamente de materias primas vegetales como resinas, almidón, fibras de madera, algodón, cáñamo o aceites de semillas, o materias primas animales como la caseína de la leche.  Sintéticos (artificiales): se elaboran a partir de compuestos derivados de petróleo, gas natural o carbón. En la actualidad, la mayoría de los plásticos comercializados, al igual que la mayoría de productos químicos de gran volumen, pertenecen al segundo grupo, y son obtenidos a partir de petróleo. El primer plástico semisintético, obtenido por transformación de polímeros naturales, fue el nitrato de celulosa, descubierto a finales de la década de 1850, y presentado como primer plástico del mundo por su inventor, Alexander Parkes. Se comercializó con los nombres de Parkesina y Xylonita, aunque su desarrollo comercial fue escaso. Figura 1. Momificación utilizando polímeros naturales en el antiguo Egipto. Introducción 2 La comercialización se impulsó más tarde gracias a la fabricación de bolas de billar en Estados Unidos con este material en sustitución del marfil (datos de PlasticsEurope). En 1907 el químico neoyorquino Leo Baekeland patenta el primer plástico realmente sintético, la baquelita, que se utilizó en el desarrollo de las nuevas tecnologías, con aplicaciones como carcasas de teléfonos y radios. En los años posteriores se sucede otra serie de descubrimientos, entre ellos el del celofán y el PVC. El desarrollo de los plásticos modernos se vió impulsado en 1922 a partir de la entrega del Premio Nobel al químico alemán Staudinger. Posteriormente, la Segunda Guerra Mundial supuso un fuerte estímulo para la investigación en el campo de los plásticos, ya que se produjo la necesidad de encontrar sustitutos a los materiales tradicionales, de los cuales había falta de suministro. En 1940, se inician la industrialización y la comercialización de los plásticos, favorecidas por el bajo coste del petróleo en esa época, y a principios de los años 70 los plásticos son ya los materiales más utilizados en todo el mundo (datos de la Asociación Española de Industriales del Plástico (ANAIP)). Hoy en día, los plásticos reemplazan ya a la mayoría de materiales tradicionales como la madera, el metal, el vidrio, y el papel. Esto es debido a que poseen propiedades como facilidad de manipulación, bajo peso, durabilidad y resistencia a la corrosión, que a su vez hacen que su uso sea más económico frente a otros materiales (Kuhlke y Walsh, 2002). Entre los usos más representativos de los plásticos se encuentran los siguientes (Domenech, 1994):  Industria médica y sanitaria: lentes de contacto, prótesis, instrumental.  Industria del automóvil y otros medios de transporte: carrocerías y piezas.  Industria del envase y embalaje: bolsas, recipientes, cajas, bandejas.  Industria de la construcción: ventanas, puertas, revestimientos, cañerías, aislantes, tanques.  Industria textil: tejidos industriales y telas para confección de prendas de vestir.  Electricidad y electrónica: cables, piezas para teléfonos móviles, etc.  Deporte y ocio: ropa, zapatillas, balones, equipos de seguridad, etc. Introducción 3  Agricultura: tuberías, macetas, contenedores, invernaderos, etc.  Industrias varias dedicadas a la fabricación de artículos para el hogar: muebles, juguetes, elementos para cocina y baño, electrodomésticos, etc. Observando los datos de producción mundial de plásticos, podría decirse que estos materiales han inundado nuestra vida cotidiana:  La producción mundial de plásticos pasó de 1,5 millones de toneladas (Mt) al año en 1950 a 299 Mt en 2013, de los que sólo en Europa se produjeron 64 Mt.  El consumo anual mundial de plásticos sintéticos experimenta un incremento anual de entre un 3 y un 15 % (figura 2).  La producción durante los últimos diez años ha sido equivalente a la de todo el siglo XX.  Se calcula que en 2020 se comercializarán en la UE 66,5 Mt de plástico y que la producción mundial de plásticos podría triplicarse de aquí a 2050 (Libro verde, Comisión Europea). Figura 2. Evolución de la producción mundial de plásticos en los últimos años. Modificado de PlasticsEurope (2015). Centrándonos en España, en nuestro país se consumen un total de 115 kilos de plástico por persona y año, por lo que el sector de los plásticos tiene una importancia notable en la economía española. Lo confirman datos de la Asociación Española de Industriales de Plásticos (ANAIP), considerando este sector en España un sector en alza que representa el 2,2% del Producto Interior Bruto del país, y el 26% dentro de la industria química. Introducción 4 De esta forma, la industria de transformación de plásticos en España es hoy una de las 9 más desarrolladas del mundo. Por delante de España se encuentran EE.UU., China, Japón, Alemania, Francia, Italia, Canadá, y Reino Unido (datos de la ANAIP). El elevado consumo de plásticos, que como se ha mencionado anteriormente, derivan en su mayoría del petróleo, conlleva una serie de consecuencias negativas para el medio ambiente, principalmente la disminución de las reservas fósiles y la liberación de emisiones al suelo, agua y atmósfera que incluyen metales pesados, clorofluorocarbonos, compuestos orgánicos volátiles, óxidos de azufre y polvo. Estas emisiones dan lugar a efectos globales como la disminución de la capa de ozono, aumento del efecto invernadero y lluvia ácida (Andrady, 2003). En cuanto al consumo de petróleo, según datos de la Agencia Internacional de Energía (IEA), la fabricación industrial a escala global de productos químicos, entre los que se encuentran los polímeros y sus productos intermediarios, consumen 3 billones de barriles de petróleo por año, además de las materias primas y energía. Esto da lugar a dos tipos de problemas: por un lado, los impactos ambientales mencionados y, por otro la limitación de reservas y su futuro agotamiento. La disponibilidad del petróleo en el futuro está a debate, se trata de un recurso no renovable que tarde o temprano llegará a su fin y aunque no se ha definido cuándo la producción mundial de petróleo empezara a declinar, investigaciones de diversos organismos, como la Association for the Study of Peak Oil and Gas (ASPO), apuntan a que el descenso en la producción mundial de petróleo tendrá lugar en el presente siglo. Así, el aumento continuado de la extracción de petróleo a partir de fuentes convencionales presenta cada vez más riesgos, ya que los nuevos descubrimientos no reponen el petróleo extraído, y estos riesgos constituyen un serio obstáculo para asegurar la demanda existente a medio plazo (IEA, 2008). Por último, cabe mencionar los conflictos, tensiones políticas entre países productores y el terrorismo ocasionados a causa de la producción y comercio del petróleo. Además de la problemática del petróleo, la síntesis química de plásticos requiere de caros y complejos procedimientos de obtención y separación para lograr la pureza deseada del producto final, así como costes significativos asociados con el tratamiento de los desechos. Introducción 5 El proceso de obtención de plásticos a partir del petróleo es un proceso largo y complejo (figura 3) que incluye las siguientes etapas: 1. Formación natural de petróleo y gas natural a partir de plancton sedimentado en el fondo marino durante millones de años. El petróleo bruto es una mezcla compleja de miles de componentes, por lo que para ser útil, debe procesarse. 2. Proceso de destilación llevado a cabo en una refinería, donde el petróleo crudo es separado en diferentes fracciones más ligeras. Para ello el petróleo es calentado y convertido en gas. Este gas se hace pasar por una columna y posteriormente se condensa en líquidos que constituyen las diferentes fracciones. Cada fracción es una mezcla de hidrocarburos con diferente tamaño y estructura molecular. Una de estas fracciones, la nafta, es el elemento crucial para la fabricación de los plásticos. 3. Proceso de fragmentación de la nafta en moléculas de hidrocarburo más pequeñas como etileno, propileno y butileno. 4. Proceso de polimerización de estas moléculas pequeñas en cadenas formando los polímeros. Cada polímero tiene sus propiedades diferentes, su estructura y su tamaño dependiendo de los distintos tipos de monómeros básicos que se utilicen. 5. Proceso de transformación en el que se convierten los polímeros en los productos plásticos finales (PlasticsEurope). Además, durante la fabricación de los plásticos se incorporan aditivos para mejorar sus propiedades, como plastificantes para incrementar la flexibilidad y resistencia del polímero, o pigmentos, para conferir a los plásticos un color determinado. Figura 3. Proceso de fabricación de plástico a partir de petróleo. Introducción 6 1.2. LOS BIOPLÁSTICOS: La problemática generada por el uso indiscriminado de plásticos sintéticos y su persistencia en el ambiente junto con la disminución de las reservas de petróleo y las constantes fluctuaciones en su precio, han estimulado la búsqueda de fuentes alternativas para la fabricación de los materiales plásticos así como para la síntesis de otros productos, entre los que se encuentran los biofueles y los bioplásticos. Los bioplásticos constituyen una familia de materiales con distintas propiedades y rango de aplicaciones que se clasifican en las siguientes categorías principales:  Plásticos procedentes de materiales renovables. En este grupo se incluyen tanto los extraídos directamente a partir de biomasa, como el almidón y la celulosa, como aquellos cuyos monómeros pueden producirse mediante fermentación de recursos renovables, aunque el proceso de polimerización posterior sea por vía química convencional.  Polímeros biodegradables que cumplen todos los criterios de las normas científicamente reconocidas para biodegradabilidad y compostaje de plásticos y productos plásticos. En Europa esta norma es la UNE-EN 13432:2001.  Bioplásticos sintetizados por vía biotecnológica. Aquí se incluyen tanto la síntesis de los monómeros requeridos para la fabricación de los bioplásticos cuya polimerización se lleva posteriormente a cabo por vía química, como la síntesis integral de los bioplásticos mediante procedimientos biotecnológicos (FEDIT, 2008). Los primeros datos de producción de bioplásticos se remontan a 1926, cuando científicos del Instituto Pasteur de París lograron producir poliéster a partir de la bacteria Bacillus megaterium (figura 4). Sin embargo, no fue hasta 1973, debido a la crisis del petróleo, cuando proliferaron los estudios enfocados en este tipo de plásticos. Figura 4. Gránulos de poliéster en células de Bacillus megaterium. Introducción 7 En la actualidad, la producción mundial de bioplásticos representa tan solo un 1% de los plásticos que cada día se ponen en el mercado. Pero las previsiones de crecimiento son muy alentadoras para esta industria, ya que si en 2012 se produjeron en todo el mundo 1,4 Mt de estos materiales, en 2017 se espera haber multiplicado por cuatro esta cifra hasta alcanzar los 6,2 Mt (EuropeanBioplastics). El crecimiento de la producción de bioplásticos en los últimos años, es sin duda una respuesta a las necesidades de mercado y al alto precio del petróleo y su futuro agotamiento. En cuanto a sus aplicaciones, la mayor parte se encuentran en el sector agrícola, sector de envases y embalajes y algunas aplicaciones emergentes en el sector textil. 1.2.1. Monómeros producidos por vía biotecnológica De entre los diferentes tipos de bioplástico, son los monómeros producidos por vía biotecnológica en los que se centra nuestro trabajo. En la actualidad la mayor aportación de la biotecnología a la producción de bioplásticos consiste en la síntesis de estos monómeros en masa a partir de biomasa (materias primas renovables que forman parte de residuos agrícolas o industriales ricos en carbohidratos) mediante tecnologías de fermentación microbiana (FEDIT, 2008). La materia prima o sustrato para la realización de las fermentaciones son los azúcares fermentables, fundamentalmente la glucosa y otras hexosas. A partir de estos azúcares, los microorganismos producen energía y compuestos químicos necesarios en su metabolismo, a la vez que generan una serie de subproductos. Así, el uso de materias primas renovables y la sustitución de procesos químicos por procesos biológicos en la síntesis de bioplásticos hacen que estos contribuyan positivamente a la conservación de los recursos naturales y a la protección del medio ambiente. Entre los monómeros que pueden producirse por vía biotecnológica se encuentran el ácido láctico, 1,3-propanodiol, ácido succínico, ácido adípico y butanodiol, que posteriormente pueden utilizarse para la síntesis de poli(ácido láctico) (PLA), poli(tereftalato de trimetilenglicol) (PTT), poliéster poli(tereftalato de butilenglicol) (PBT), poliamida y poliuretano, respectivamente. Nuestro trabajo se ha centrado en la obtención de 2,3-butanodiol por vía biotecnológica para la fabricación de poliuretano. Introducción 8 1.2.1.1. 2,3-butanodiol El butanodiol es un compuesto de cuatro carbonos con grupos hidróxido en distintas posiciones. El 2,3-BDO, también conocido como 2,3-butilenglicol, es el único que se produce de manera natural por varios microorganismos, no existiendo rutas metabólicas naturales que den lugar a 1,4-BDO o 1,3-BDO. Su fórmula molecular es C4H10O2, su masa molecular es de 91.12, tiene su punto de ebullición entre 177 y 182ºC y punto de congelación a -60 ºC. Puede encontrarse en forma de líquido incoloro e inodoro o en forma cristalina (Celinska y Grajek, 2009). Existen tres esteroisomeros para el 2,3-BDO: los ópticamente activos, con forma dextro (2S, 3S) o levo (2R, 3R) y el ópticamente inactivo o meso (figura 5). Figura 5. Esteroisomeros del 2,3-BDO. Además de su aplicación para la fabricación de uretano, el 2,3-BDO tiene un gran número de aplicaciones industriales, entre las que se encuentran la fabricación de tintas, perfumes, agentes suavizantes o explosivos, así como aplicaciones en la industria alimentaria y farmacéutica (Syu, 2001). Las formas ópticamente activas son productos con alto valor en la síntesis dirigida de compuestos quirales, compuestos esenciales en la fabricación de productos farmacéuticos (Sabra et al., 2015). Mediante diversas reacciones químicas (deshidratación, deshidrogenación, cetalización y esterificación), pueden obtenerse distintos derivados del 2,3-BDO que proporcionan diferentes aplicaciones. De esta forma, pueden obtenerse disolventes a partir de su deshidratación, aditivos alimentarios a partir de su deshidrogenación, agentes de mezcla para gasolina a partir de su cetalización y plastificantes a partir de su esterificación (Haveren, 2008). Según datos de finales del año 2014, la producción mundial de butanodiol es de 3,35 Mt. Además, la producción de 2,3-BDO crece actualmente a un ritmo anual de un 47% debido al incremento de la demanda de muchos de sus derivados (Li, 2012; 2013). Por todo esto, puede afirmarse que se trata de un producto altamente demandado y con alto interés comercial. Introducción 15 El desarrollo de las técnicas de ingeniería genética y las aplicaciones bioinformáticas, junto con la secuenciación de genomas completos de diversos organismos, ha facilitado la utilización de la ingeniería de vías metabólicas para mejorar la producción industrial de diversos productos. Dentro de la ingeniería de vías metabólicas pueden distinguirse distintas categorías:  Expresión de genes heterólogos para la síntesis de proteínas.  Ampliación del rango de sustratos utilizables: en algunos procesos industriales es interesante extender el rango de sustratos utilizables por el microorganismo de interés para hacerlo más eficiente en cuanto a aprovechamiento de residuos.  Modificación de vías para la síntesis de productos: creación de microorganismos que sinteticen diferentes productos de interés, además de los que producen de forma natural, y microorganismos que los sinteticen de forma más eficiente. Se lleva a cabo mediante la modificación de las vías metabólicas existentes o inserción de nuevas vías.  Vías para la degradación de xenobióticos: generación de nuevas vías o modificación de las existentes para la degradación de diferentes xenobióticos por parte de un mismo microorganismo.  Modificación de las funciones celulares para la mejora de procesos de producción: incluye expresión de genes heterólogos, deleción de genes y sobreexpresión de genes homólogos, para por ejemplo mejorar la tolerancia a ciertas condiciones.  Eliminación o reducción de productos secundarios: eliminación de productos no deseables que pueden interferir en la síntesis de los productos de interés.  Mejora del rendimiento o productividad de distintos productos: puede obtenerse incrementando la actividad de síntesis del producto de interés mediante la inserción de copias adicionales del gen correspondiente, modificando la regulación de las vías implicadas o modificando el metabolismo central del carbono (Nielsen, 2001). Nuestro trabajo puede incluirse en las categorías de modificación de vías metabólicas para síntesis de productos, eliminación y reducción de productos secundarios no deseables y mejora del rendimiento y productividad. Introducción 16 Eliminación o reducción de productos secundarios En los procesos fermentativos, debido a la complejidad del metabolismo celular, resulta inevitable que se formen productos secundarios además del producto deseado. La formación de estos productos da lugar a un consumo de carbono necesario también para la síntesis del producto de interés, dando lugar por tanto a pérdidas en el rendimiento. Mejora de rendimiento y productividad El rendimiento en la producción industrial es realmente importante en cuanto a los costes de producción. El rendimiento depende fundamentalmente de los flujos metabólicos, por lo tanto, es posible incrementar el rendimiento de la producción de cierto producto mediante la redirección de los flujos metabólicos hacia el metabolito de interés. Lo mismo ocurre cuando se desea mejorar la productividad. 1.4. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA OBTENCIÓN DE BIOPRODUCTOS Los procesos agroindustriales generan grandes cantidades de subproductos o residuos que si no son reciclados o tratados apropiadamente se acumulan en la naturaleza generando diversos problemas ambientales (liberación de CO2, contaminación de cursos de agua, malos olores), a la vez que suponen un problema de gestión para las empresas productoras. Por otra parte se pierden potenciales materias primas para la industria, ya que estos residuos poseen un alto contenido en compuestos como azúcares, pigmentos, fibra alimentaria y proteínas, entre otros, que pueden ser útiles al transformarlos mediante tratamientos químicos o microbiológicos en productos de elevado valor (Barragán et al., 2008). Estos problemas han provocado el interés de la comunidad científica en el aprovechamiento de los residuos agroindustriales para la obtención de productos de alto valor. La mayor parte de los residuos agroindustriales corresponden a biomasa lignocelulósica rica en polímeros de celulosa y hemicelulosa que pueden ser desdoblados en monosacáridos y disacáridos fermentables, a partir de los cuales se pueden obtener productos de interés (Sánchez et al., 2010). Introducción 17 La conversión de biomasa lignocelulósica hacia productos de alto valor mediante procesos biotecnológicos (bioproductos) constan de diversas etapas: generación de biomasa, pretratamiento de la biomasa (fraccionamiento de los diversos componentes), hidrólisis de los polisacáridos a azúcares fermentables, bioprocesamiento (fermentación), separación y purificación de los bioproductos. En la actualidad se utilizan fundamentalmente dos fuentes de azúcares en los procesos de fermentación: almidón, procedente de cereales y patatas, y sacarosa, derivada de cultivos de caña de azúcar y frutales. La hidrólisis de almidón genera únicamente glucosa, mientras que la de sacarosa da lugar a una mezcla equimolar de glucosa y fructosa, además de poder ser utilizada directamente por los microorganismos. Entre los residuos utilizados como fuente de sacarosa se encuentran la cáscara de naranja, la pulpa de remolacha y la pulpa de piña. 1.4.1. Cáscara de naranja España es uno de los principales países productores de naranja del mundo, así como el mayor productor de la Unión Europea. Con una producción de 5,16 millones de toneladas, ocupa el sexto lugar a nivel mundial detrás de China, Brasil, Estados Unidos, India y Méjico (FAO, 2013). La producción de esta fruta se destina tanto a su consumo en fresco como a la industria de elaboración de zumos. Esta actividad industrial genera cada año un millón de toneladas de desechos, y esto es debido a que durante el proceso, entre el 45 y 60 % en peso de la fruta se obtiene como residuo (figura 7), en su mayoría cáscaras (Marina et al., 2005; Martín et al, 2009). Lavado y calibrado Extracción Retirada impurezas Emulsión Figura 7. Proceso industrial de obtención de zumo y subproductos a partir de naranja. Introducción 18 La cáscara de naranja se compone de carbohidratos simples (16.9%), almidón (3.75%) pectina (42.5%), celulosa (9.21%), hemicelulosa (10.5%), proteínas (6.5%), aceite esencial (4.8) y cantidades trazas de lignina (Ecónomos et al., 1998; Ayala et al., 2013). Este desecho se utiliza para la fabricación de pienso animal, obtención de aceites esenciales y pigmentos y extracción de pectina (Marina et al., 2005). Además, debido a sus propiedades antioxidantes se ha propuesto su empleo en el desarrollo de alimentos funcionales (Gorinstein et al., 2001). Para todas estas aplicaciones la cáscara de naranja debe ser primero desecada, debido a su rápida pudrición por su elevado contenido en agua, por lo que no resultan demasiado rentables (Mamma et al., 2008). Por ello se han propuesto vías alternativas para su utilización en la síntesis de productos resultantes de la fermentación, principalmente etanol (Grohmamn et al., 1996; Oberoi et al., 2010). 1.4.2. Pulpa de remolacha La pulpa de remolacha es un subproducto originado en la industria de obtención del azúcar de mesa a partir de remolacha. El cultivo de este vegetal así como su procesamiento se lleva a cabo en todos los países de la Unión Europea (a excepción de Luxemburgo), y representa un papel importante en la economía de muchas áreas rurales, con alrededor de 300.000 explotaciones dedicadas a este cultivo (Berlowska et al., 2016). En el proceso de obtención de azúcar a partir de remolacha se obtienen además una serie de subproductos como raíces, hojas, pulpa y melaza (figura 8). La pulpa y la melaza constituyen los principales subproductos, pudiéndose obtener a partir de una tonelada de remolacha una media de 160 kg de azúcar, 500 kg de pulpa fresca y 38 kg de melaza. La pulpa puede emplearse como tal (pulpa fresca) con un contenido en materia seca del 10-12%, prensada con un contenido en materia seca del 20-25%, o bien deshidratada hasta conseguir un producto con un 88-90% de contenido en materia seca (Calsamiglia et al., 2004). Lavado Difusión Secado y prensado Evaporación Cribado Cristalización Figura 8. Proceso industrial de obtención de azúcar y subproductos a partir de remolacha. Introducción 19 La pulpa de remolacha está compuesta principalmente de polisacáridos como celulosa (22-30%), hemicelulosa (24-32%), lignina (1-2%) y pectina (38-62%). Además contiene proteínas (7-8%), ácidos urónicos (21-23%) y sacarosa residual (0.5%) (Michel et al., 1988; Berlowska et al., 2016). La producción anual de este subproducto de la remolacha en la Unión Europea ronda los 8 millones de toneladas en su forma prensada y 5.5 millones de toneladas de pulpa desecada (Barjol et al., 2003). Su principal uso es la fabricación de pienso para animales, aunque existen numerosos trabajos en los que se ha estudiado su uso como materia prima para la obtención de bioproductos como etanol y biodiesel, entre ellos los de Rezić et al. (2013), Bellido et al. (2105) y Madian et al. (2015). Menos numerosos son los estudios sobre su uso en la síntesis de 2,3-BDO, como el llevado a cabo por Sikora et al. (2015). 1.4.3. Desechos de piña La piña es la segunda fruta tropical a nivel mundial en cuanto a volumen de producción, con un valor estimado de 18 millones de toneladas. (FAO, 2009; Adegbite et al., 2014). Los desechos de industrialización de esta fruta suponen hasta un 60%, generándose gran cantidad de residuos que pueden ser utilizados para otras aplicaciones (Aguilar et al., 2005). A partir de la piña se obtienen diversos productos, entre los que se encuentran piña fresca pelada, piña enlatada, piña deshidratada, zumo o néctar de piña y mermeladas. Su composición incluye pulpa (33%), corazón (6%), cáscara (41%) y corona (20%) (Benítez et al., 2010). En el proceso industrial se extrae la pulpa, quedando como desechos la corona, el corazón y la cáscara (figura 9), que suponen hasta un 50% del peso total de la piña. Además de en la industria, estos residuos se generan diariamente en hoteles, restaurantes y mercados. Extracción de pulpa Figura 9. Proceso industrial de obtención de pulpa de piña. Introducción 20 Los residuos de piña presentan un contenido del 4-8% de proteína, 60-72% de fibra y 35-45% de azúcares solubles (70% de sacarosa, 20% de glucosa y 10% de fructosa), además de minerales en pequeña cantidad. (Abdullah y Hanafi, 2008; Wadhwa y Bakshi, 2013; Pardo et al., 2014). Los principales usos que se le han dado a los residuos de piña han sido la extracción de bromelina (Hebbar et al., 2008), la producción de vinagre (Raji et al., 2012), producción de ácido cítrico (Kareem et al., 2010) y alimentación animal (Sruamsiri, 2007). Además, se han llevado a cabo trabajos sobre su utilización para la síntesis de bioetanol (Nigam, 1999; Hossain, 2010). No existen sin embargo estudios encaminados a la obtención de otros productos resultantes de la fermentación a partir de este residuo como el 2,3-BDO. 1.5. FAMILIA BACTERIANA ENTEROBACTERIACEAE Y SU APLICACIÓN EN LA OBTENCIÓN DE BIOPRODUCTOS 1.5.1. Descripción de la familia Enterobacteriaceae Los miembros de la familia Enterobacteriaceae se caracterizan por ser bacilos aerobios o anaerobios facultativos, Gram negativos, no esporulados, reductores de nitrato a nitrito, catalasa positivos y oxidasa negativos. Algunos forman cápsulas, principalmente los del género Klebsiella y también algunas cepas de Enterobacter y Serratia. La mayoría de los géneros de la familia son móviles, presentando flagelos peritricos (Ristuccia y Cunha, 1985). La mayor parte de estas bacterias se encuentran en el intestino del hombre y de otros animales, aunque también existen enterobacterias saprófitas de vida libre en suelo, agua y plantas. Algunas enterobacterias actúan como agentes infecciosos, siendo responsables de infecciones nosocomiales. 1.5.2. Patogenia de la familia Enterobacteriaceae Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae pueden actuar como patógenos, causando infecciones nosocomiales. Las infecciones son especialmente comunes en pacientes que han recibido terapia antimicrobiana y en aquellos ingresados en unidades de cuidados intensivos. La colonización y las infecciones nosocomiales producidas por enterobacterias están asociadas frecuentemente con instrumentación y dispositivos médicos contaminados (Sanders y Sanders 1997). Introducción 21 Las enterobacterias presentan diferentes factores de virulencia: adhesinas, como las fimbrias y proteínas de membrana externa, secreción de toxinas y producción de sideróforos.  Sideróforos: La presencia de sideróforos permite la supervivencia en los tejidos del organismo hospedador, ya que la disponibilidad de hierro supone un factor limitante en el proceso de infección bacteriana. En el cuerpo humano, el hierro se encuentra adherido a moléculas transportadoras tales como la hemoglobina, lactoferrina y transferrina, y existe poco hierro de forma accesible para los microorganismos. Por ello, estas bacterias poseen sistemas de alta afinidad que solubilizan el hierro y lo importan a la célula, los sideróforos (Bullen et al., 2005).  Secreción de toxinas: La secreción de toxinas en enterobacterias hace referencia principalmente a la bacteria Escherichia coli, productora de las toxinas Shiga, toxina termolábil (TL) y toxina termoestable (TE).  Cápsula: La presencia de cápsula en ciertas bacterias de la familia Enterobacteriaceae contribuye a evadir las defensas del sistema inmune del organismo hospedador. Está formada por unidades repetidas de polisacáridos conocidos como antígenos K. Éstos protegen a la bacteria de la fagocitosis (Grimont y Grimont, 2005).  Membrana externa: La membrana externa de las enterobacterias consiste en una docle capa de fosfolípidos que incluyen lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas, proteínas porinas multiméricas y otras proteínas de la membrana externa. El LPS tiene tres dominios principales: el esqueleto de lípido A, el oligosacárido fosforilado central (core) y las cadenas laterales de oligosacárido de repetición. Introducción 22 El lípido A, también conocido como endotoxina, es la parte biológicamente activa de la molécula que el huésped reconoce. El oligosacárido de repetición unido al LPS se conoce como antígeno O, cuya presencia ofrece resistencia a bactericidas (Bannerman, 2003; Puerta-García y Mateos-Rodríguez, 2010). Durante las infecciones por enterobacterias y en general, bacterias Gram negativas, la replicación bacteriana y la muerte celular liberan gran cantidad de lipopolisacáridos al torrente sanguíneo, que se une a las proteínas circulatorias y provoca la secreción de citoquinas inflamatorias (Peri et al., 2010).  Fimbrias: En enterobacterias se han encontrado fundamentalmente fimbrias de tipo I y tipo III (Adegbola y Old, 1985; Hornick et al., 1991). Entre las fimbrias mejor caracterizadas están las fimbrias de tipo I de las enterobacterias. Son estructuras con un tamaño aproximado de 0,21 µm de longitud y 7 nm de ancho que se distribuyen de forma uniforme sobre la superficie de las células. Participan en la fijación al organismo hospedador (figura 10) a través de la unión a residuos de manosa de glicoproteínas de superficie situadas en las células epiteliales hospedadoras para iniciar el proceso de anclaje. Se trata de heteropolímeros formados por una subunidad principal, FimA, que constituye más de un 95 % de la fimbria, y una serie de componentes secundarios: FimF y FimG que tienen un importante papel en la biogénesis de la fimbria y FimH que proporciona a las fimbrias su sensibilidad a manosa (Krogfelt y Klemm, 1988; Russell, 1992). A los componentes FimC y FimD se les atribuye la función de ensamblaje de los componentes de la fimbria, ya que bacterias mutantes con deleción de dichos componentes no son capaces de sintetizar fimbrias aún funcionando correctamente la síntesis de la subunidad principal FimA (Orndorff y Falkow, 1984; Klemm et al., 1985). Las fimbrias de tipo III contribuyen a la adhesión de la bacteria a diversas células hospedadoras, aunque no es muy claro su papel en la patogénesis y no está muy bien definido su receptor (Schroll et al., 2010). Figura 10. Adhesión de enterobacteria a célula huésped a través de fimbrias tipo I (Mulvey et al., 1998). Introducción 23 Según la legislación española en cuanto a agentes biológicos (Real Decreto 664/1997 sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo), la mayoría de especies de enterobacterias se consideran agentes biológicos del grupo 2. Por agente biológico del grupo 2 se entienden aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. 1.5.3. Fermentación en la familia Enterobacteriaceae  Fermentación ácido mixta: Se trata de un tipo de fermentación que es llevada a cabo principalmente por la familia Enterobacteriaceae. Bajo condiciones de anaerobiosis o microaerobiosis estas bacterias fermentan la glucosa dando lugar a una mezcla de ácidos: acético, fórmico, láctico, succínico, y etanol, con la posibilidad también de que se produzcan gases (CO2 y H2). Tiene lugar en los géneros Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Klebsiella, y Shigella.  Fermentación butanodiólica: Al igual que en el caso anterior, mediante esta fermentación se forma una mezcla de ácidos y gases, pero además se sintetiza 2,3-BDO a partir de piruvato así como su intermediario acetoína. Tiene lugar en los géneros Enterobacter, Serratia y Erwinia (Jurtshuk, 1996). La formación de 2,3-BDO se describe más detalladamente en el anterior apartado 1.2.1.1. 1.5.4. Obtención de bioproductos por enterobacterias Las enterobacterias son capaces de generar gran cantidad de productos de interés para la industria como los descritos en el anterior apartado 1.3.1. Dentro de la familia Enterobacteriaceae existe una amplia diversidad de fenotipos que permite que sus aplicaciones sean muy diversas (Chauhan y Varma, 2009). Se ha descrito el uso de enterobacterias en la producción de biofloculantes (Lu et al., 2005), hidrógeno (Han et al., 2012), etanol (El Asli et al., 2002), butanodiol (Saha et al., 1999; Perego et al., 2000), ácidos orgánicos (Kim et al., 2002). Introducción 24 1.5.5. Asociación a plantas en enterobacterias En el suelo existen bacterias asociadas a una multitud de plantas, ya sea como bacterias epifíticas, endófitas o en simbiosis con las plantas. Estas bacterias pueden establecer distintos tipos de relación con la planta, pudiendo actuar como patógenos, organismos beneficiosos, o no tener efecto directo en las plantas.  Bacterias endófitas: Los microorganismos endófitos son capaces de entrar en los tejidos de la planta sin causar daños y pudiendo establecer una relación de mutualismo con ella, bien atacando a los patógenos de la planta, eliminando contaminantes, produciendo fitohormonas o contribuyendo a la disponibilidad de nitrógeno asimilable por las plantas, entre otros (Hallman et al., 1997). La penetración de las bacterias endófitas en la planta puede ocurrir por estomas, heridas o áreas de emergencia de raíces laterales. La mayoría no inducen respuesta de hipersensibilidad y por ello la planta no desarrolla mecanismos de defensa contra ellas. Existen estudios que prueban los efectos beneficiosos de los endófitos sobre las plantas (Barka et al., 2000), que indican que cuando las plantas son inoculadas con bacterias de carácter endofítico, son más vigorosas y poseen mayor resistencia a tóxicos y patógenos y menor mortalidad. Las características de las bacterias endófitas permiten que puedan ser utilizadas para incrementar el crecimiento y la producción vegetal, ya sea promoviendo el crecimiento de la planta o actuando como control biológico frente a patógenos.  Bacterias rizosféricas: La rizosfera se define como una zona de intensa actividad microbiana alrededor de las raíces cuya influencia estimula el crecimiento y aumenta la densidad de microorganismos respecto al resto del suelo. Los microorganismos de esta zona no están íntimamente asociados a las raíces, sin embargo tienen un efecto importante en el crecimiento de las plantas (Markova et al., 2005). En la rizosfera, los microorganismos pueden desempeñar diversas e importantes funciones como la producción de sustancias de crecimiento y la captación de nutrientes. 3 3. . M MA AT TE ER RI IA AL L Y Y M MÉ ÉT TO OD DO OS S Material y métodos 27 3.1. MUESTREO Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS 3.1.1. Toma de muestras Las muestras para el estudio se tomaron en diferentes zonas de los arrozales de las marismas del Guadalquivir, y más concretamente en tres tablas o unidades de cultivo distintas dentro de cada zona de recogida. Como se muestra en la figura 14, las zonas de recogida fueron:  Zona “La Compañía” (C): zona situada en la margen izquierda del río Guadalquivir, con agua de riego de buena calidad en cuanto a contenido salino.  Zona “Los Pobres” (A): zona situada en la margen derecha del río, con agua de riego de mayor contenido salino y por lo tanto de una calidad inferior para el cultivo.  Zona “Hato Ratón” (HR): zona situada en la margen derecha del río, con agua de riego de pozo y sistema de cultivo ecológico. C P HR T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 PHR C Figura 14. Situación de las diferentes zonas de recogida en las marismas del Guadalquivir y de las unidades de cultivo o tablas (T1, T2, T3) dentro de cada zona de recogida; Los Pobres (A), Hato Ratón (B) y La Compañía (C). Imagen obtenida a partir de plano de GoogleEarth (http://earth.google.com). Material y métodos 28 Las plantas de arroz de las distintas zonas fueron arrancadas de raíz junto con parte de la rizosfera (figura 15) y trasladadas al laboratorio con el fin de ser tratadas para el posterior aislamiento de los microorganismos presentes en las mismas. Figura 15. Toma de muestras de plantas de arroz. 3.1.2. Tratamiento de muestras Una vez recogidas, las plantas de arroz se dividieron en tres partes: parte aérea, que comprende tallos y hojas, suelo rizosférico y raíces (figura 16). Figura 16. Distintas divisiones de la planta de arroz: tallos y hojas (TH), raíces (R) y suelo rizosférico (S). 3.1.2.1. Tratamiento de muestras de suelo rizosférico Las muestras de suelo rizosférico fueron obtenidas limpiando la tierra pegada a las raíces y recogiéndola en tubos Falcon. Las muestras que no se analizaron inmediatamente se guardaron a -80ºC para su conservación. Material y métodos 29 3.1.2.2. Tratamiento de muestras de raíz y parte aérea Las raíces y parte aérea fueron esterilizadas superficialmente con NaClO al 5% antes de proceder con el aislamiento de los microorganismos objeto de estudio. Para ello se lavaron las raíces con etanol al 70% durante 5 minutos, posteriormente con NaClO al 5% durante 10 minutos y finalmente se hicieron 5-6 lavados con agua estéril. Una vez esterilizadas, se tomaron cantidades de 1 gramo de raíces o parte aérea de cada zona de recogida y se trituraron junto con 5 mL de NaCl 0.9% estéril con el homogeneizador POLYTRON® PT 2100 (Kinematica, Lucerna, Suiza). Las muestras que no se analizaron inmediatamente se guardaron a -80ºC para su conservación. 3.2. MEDIOS DE CULTIVO A continuación se detalla la composición de los diversos medios de cultivo utilizados. El pH de todos ellos de ajustó a un valor aproximado de 7 con NaOH 1M y la esterilización se realizó en autoclave a una temperatura de 121ºC durante 20 minutos, a excepción del medio Mossel, que no se autoclavó y se esterilizó calentándolo a 100ºC durante 30 minutos. Medio TSB. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Difco (Nueva Jersey, EE.UU.), a una concentración de 30 g/L, con la siguiente composición: Digerido pancreático de caseína ….……………. 17 g/L Peptona de soja ……………………….……....………. 3 g/L Dextrosa ………………………………….…………........ 2.5 g/L NaCl …………………………………………….................. 5 g/L K2HPO4 ………………………………………....……….... 2.5 g/L H2O .................................................................................. c.s.p. 1 L Medio Mossel. Medio de enriquecimiento para enterobacterias. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Oxoid, a una concentración de 45 g/L, con la siguiente composición: Digerido pancreático de gelatina ............... 10 g/L Verde brillante .................................................. 15 mg/L Dextrosa ............................................................... 5 g/L NaCl ........................................................................ 5 g/L Na2HPO4 ............................................................... 8 g/L Oxgall .................................................................... 20 g/L KHPO4 ................................................................... 2 g/L H2O ......................................................................... c.s.p. 1 L Material y métodos 30 Medio MacConkey agar. Medio de diferenciación selectivo para enterobacterias y otros bacilos gram negativos. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Oxoid (Hampshire, Reino Unido), a una concentración de 35 g/L, con la siguiente composición: Peptona ............................ 20 g/L Lactosa ............................. 10 g/L NaCl ................................... 5 g/L Sales biliares .................. 5 g/L Rojo neutro .................... 0.075 g/L Agar ................................... 12 g/L H2O .................................... c.s.p. 1 L Medio Clark-Lubs. Medio recomendado para las pruebas de rojo de metilo y VogesProskauer para la diferenciación del grupo coli-aerogenes. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Oxoid (Hampshire, Reino Unido), a una concentración de 17 g/L, con la siguiente composición: Peptona .............. 7 g/L Glucosa ............... 5 g/L K2HPO4 ............... 5 g/L H2O ....................... c.s.p. 1 L Medio agua de peptona. Medio recomendado para estudiar la fermentación de carbohidratos, así como para realizar la prueba de indol. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Oxoid (Hampshire, Reino Unido), a una concentración de 15 g/L, con la siguiente composición: Peptona ................. 10 g/L NaCl ........................ 5 g/L H2O ......................... c.s.p. 1 L Medio agar citrato de Simmons. Medio para la diferenciación de bacterias gram negativas mediante la utilización de citrato. Se preparó a partir de un preparado comercial de la marca Oxoid (Hampshire, Reino Unido), a una concentración de 23 g/L, con la siguiente composición: MgSO4 ...................................................... 0.2 g/L NaNH4HPO4 · 4 H2O ........................... 0.8 mg/L (NH4)2HPO4 ........................................... 0.2 g/L NaCl ........................................................... 5 g/L Na3C6H5O7 .............................................. 2 g/L Azul de bromotimol ........................... 0.08 g/L Agar ........................................................... 15 g/L H2O ............................................................. c.s.p. 1 L Material y métodos 31 Medio LB (Luria Bertani). Medio utilizado para mantener y propagar cepas de E. coli. (Miller, 1972). Se preparó en el laboratorio a partir de sus distintos componentes adquiridos en la casa Difco (Nueva Jersey, EE.UU.), en las siguientes proporciones: Triptona ........................................ 10 g/L Extracto de levadura ............... 5 g/L NaCl ................................................ 10 g/L H2O .................................................. c.s.p. 1 L Para preparar LB agar, se añadió a la anterior mezcla agar a una concentración de 15 g/L. Medio EA. El medio de cultivo EA se preparó en base al trabajo de Petrov y Petrova (2009), con la siguiente composición: Na2HPO4 ............................................................................................... 6.8 g/L KH2PO4 .................................................................................................. 3 g/L Na2SO4 .................................................................................................. 0.28 g/L (NH4)2SO4 ........................................................................................... 5.35 g/L MgSO4 · 7 H2O ................................................................................... 0.26 g/L KCl .......................................................................................................... 0.75 g/L Ácido cítrico ...................................................................................... 0.42 g/L Extracto de levadura ..................................................................... 5 g/L Solución de microelementos* .................................................... 3 mL/L H2O ......................................................................................................... c.s.p. 1 L * ZnCl2 (34.2 g/L), MnCl2 (10 g/L), H3BO3 (0.31 g/L), FeCl3 (2.7 g/L), CuCl2 (0.85 g/L) Medio para prueba de utilización de carbohidratos (rojo fenol). Para determinar la utilización de azúcares por medio de la prueba de rojo fenol, se preparó un medio de cultivo con la siguiente composición: Peptona ........................ 20 g/L NaCl ............................... 5 g/L Rojo fenol .................... 5 g/L H2O ................................. c.s.p. 1 L Medio SOB (Super Optimal Broth). Medio utilizado para obtener una alta eficiencia de transformación de células de E. coli. Peptona .................................................. 20 g/L NaCl .......................................................... 5 g/L Extracto de levadura ........................ 5 g/L KCl ............................................................ 0.2 g/L MgCl2 ....................................................... 1 g/L MgSO4 ...................................................... 2.5 g/L H2O ............................................................ c.s.p. 1 L Material y métodos 32 Medio P1. autohidrolizado de residuo de piña. Medio P2. Medio preparado a partir de autohidrolizado de residuo de piña. Autohidrolizado de residuo de piña ............ c.s.p. 1L Extracto de levadura .......................................... 5 g/L Medio N1. autohidrolizado de residuo de naranja. Medio N2. Medio preparado a partir de autohidrolizado de residuo de naranja. Autohidrolizado de residuo de naranja ............ c.s.p. 1L Extracto de levadura ................................................. 5 g/L 3.3. SOLUCIONES TAMPÓN Tampón imidazol. Tampón utilizado en la preparación de soluciones para determinar actividades enzimáticas. Imidazol-HCl, pH 7 ................ 50 mM KCl ................................................ 0.1 M MgCl2 ........................................... 5 mM H2O ............................................... c.s.p. 1 L Tampón fosfato pH 7. Tampón utilizado en la preparación de soluciones para determinar actividades enzimáticas. Na2HPO4 0.2M ................... 305 mL/L NaH2PO4 0.2M ................... 195 mL/L H2O ......................................... c.s.p. 1 L 3.4. COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS En la tabla 2 se incluyen los compuestos antimicrobianos adicionados a los medios de cultivo cuando resultó necesario. Todos ellos fueron proporcionados por la casa Sigma. Se muestran los disolventes y concentraciones de las soluciones stock, así como la concentración habitual del uso de los antibióticos para E. coli. Las soluciones preparadas en agua destilada se esterilizaron por filtración mediante filtros de membrana de 0.22 µm de diámetro (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania). Todas las soluciones se conservaron a -20ºC. Material y métodos 33 Tabla 2. Antibióticos utilizados en este trabajo. ANTIBIÓTICO DISOLVENTE CONCENTRACIÓN STOCK (mg/mL) CONCENTRACIÓN FINAL PARA E.coli (µg/mL) Ampicilina H2O destilada estéril y NaOH 100 150 Estreptomicina H2O destilada estéril 100 20 Gentamicina H2O destilada estéril 200 20 Kanamicina H2O destilada estéril 100 50 3.5. MÉTODOS DE AISLAMIENTO Para el aislamiento se tomaron cantidades de 1 gramo de cada zona de recogida, cada tabla y cada parte de la planta de arroz, que se inocularon en matraces con 100 mL de medio TSB, y se incubaron a 28 ºC durante 24 horas. De los cultivos anteriores se tomaron alícuotas de 1 mL y se pasaron a otros matraces con 100 mL de medio de enriquecimiento Mossel, que fueron incubados a 37ºC durante 24 horas. A partir de los cultivos en medio Mossel, se realizaron diluciones seriadas en NaCl 0.9%, y se tomaron alícuotas de 100 µL de las correspondientes a 10-6, 10-7 y 10-8 para sembrarlas en placas de agar MacConkey, que se incubaron a 37 ºC durante 24 horas. Se seleccionaron las colonias de color rosado en este medio, por ser indicativas de fermentación de lactosa, característica propia de enterobacterias. Las colonias seleccionadas se purificaron sembrándolas en placas independientes de agar MacConkey. 3.6. MATERIAL BIOLÓGICO 3.6.1. Cepas bacterianas En la tabla 3 se muestra la relación de cepas que se han utilizado en el presente trabajo. Tabla 3. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo. CEPA BACTERIANA CARACTERÍSTICAS FUENTE O REFERENCIA Escherichia coli DH5 α F-, lacZ ΔM15, recA1, hsdR17,supE44, Δ(lac ZYA arg F) Hanahan, 1983 Enterobacter aerogenes CECT 684TCepa silvestre CECT1 Enterobacter aerogenes SC10 Cepa silvestre Este trabajo Enterobacter aerogenes EAB Enterobacter aerogenes SC10 con sobreexpresión del gen bdh. KmREste trabajo Enterobacter aerogenes EALD Enterobacter aerogenes SC10 con deleción del gen ldhA.KmREste trabajo Enterobacter aerogenes EAG Enterobacter aerogenes SC10 con sobreexpresión del gen gapA.GmREste trabajo Enterobacter aerogenes EAGB Enterobacter aerogenes SC10 con sobreexpresión de los genes gapA y bdh. GmR Este trabajo Enterobacter aerogenes EALD-GB EALD con sobreexpresión de los genes gapA y bdh . GmR, KmREste trabajo Enterobacter aerogenes EA-SF Enterobacter aerogenes SC10 con deleción del gen fimD. KmREste trabajo Enterobacter aerogenes EAGB-SF EAGB con deleción del gen fimD. KmREste trabajo 1CECT: Colección Española de Cultivos Tipo. Material y métodos 34 3.6.2. Condiciones de cultivo y conservación de las cepas La temperatura habitual de crecimiento para las cepas del estudio fue de 37ºC. Los cultivos se realizaron en condiciones de microaerobiosis o, en algunos casos, anaerobiosis. Los cultivos en condiciones de microaerobiosis se desarrollaron de la forma habitual. Los cultivos en condiciones de anaerobiosis se llevaron a cabo en matraces redondos sellados con tapón de septum, creando las condiciones de anaerobiosis haciendo vacío e introduciendo argón. Para conservar las cepas se prepararon cultivos líquidos de cada una de ellas en medio TSB, que se conservaron en criotubos junto con glicerol al 40% en relación 1:1 cultivo/glicerol, mediante congelación a -20ºC y -80ºC. 3.6.3. Plásmidos En la tabla 4 se presentan los plásmidos utilizados en la presente Tesis Doctoral. Tabla 4. Plásmidos utilizados en este trabajo. PLÁSMIDO CARACTERÍSTICAS FUENTE O REFERENCIA pGEM-T AmpR, vector de clonación Promega1 pUC4-KIXX Derivado de pUC4K. KmRVieira y Messing, 1982 pME-LDH AmpR, gen ldhA clonado en pGEM-T Este trabajo pJQ200-SK GmR, sac B, vector suicida Quandt y Hynes, 1993 pRK600 Plásmido "helper", oriColE1, Tra+, CmRKessler et al., 1992 pBBR1-MCS2 Vector de clonación. KmR, pBBR1 replicon, mob+Kovach et al., 1995 pBBR1-MCS5 Vector de clonación. GmR, pBBR1 replicon, mob+Kovach et al ., 1995 pME1-kLDH KmR, derivado de pME-LD en el que se ha intoducido un casette de km en el gen ldhA Este trabajo pME2-kLDH GmR, derivado de pJQSK200, con la construcción de pME1-Kldh Este trabajo pME-GP GmR, gen gapA clonado en pBBR1-MCS5 Este trabajo pME-BD KmR, gen bdh clonado en pBBR1-MCS2 Este trabajo pME-GB GmR, genes gapA y bdh clonados en pBBR1-MCS5 Este trabajo pME-F AmpR, gen fimD clonado en pGEM-T Este trabajo pME-FX AmpR, derivado de pME-F con inserción de punto Xho I en el gen fimD Este trabajo pME-FXK AmpR, KmR, derivado de pME-FX con casette de km insertado en el gen fimD Este trabajo pME2-FXK GmR, KmR, derivado de pJQSK200, con la construcción de pME-FXK Este trabajo 1Promega, Wisconsin, EE.UU. Material y métodos 41 Tinción de cápsula. Para determinar la presencia o no de cápsula, se llevó a cabo una tinción negativa, específica para observar la cápsula bacteriana. Mediante esta tinción, el fondo de la preparación queda teñido, sin embargo, los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. La tinción se llevó a cabo mediante un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio a partir de de datos de la bibliografía (Tortora et al., 2007): Tinción negativa 1. Extensión sobre portaobjetos de colonia de cultivo fresco 2. Fijación al aire 3. Gota de tinta china en un extremo del portaobjetos 4. Frotis con tinta china sobre la extensión 5. Secado al aire 6. Tinción con fucsina básica, 1 min 7. Lavado con H2O destilada 8. Secado al aire 9. Observación al microscopio con objetivo de inmersión 3.10.2. Características fisiológicas 3.10.2.1. Crecimiento Para establecer las posibles diferencias en el patrón de crecimiento entre las distintas cepas objeto de estudio, en distintas condiciones de cultivo, se realizaron curvas de crecimiento. Para ello se llevó a cabo el siguiente protocolo: Curva de crecimiento 1. Pre-inóculo de la cepa en tubo de ensayo con 5 mL de medio de cultivo a partir de colonia fresca 2. Incubación: 37ºC, 24 h 3. Inoculación en matraces con 50 mL de medio de cultivo 4. Incubación: 37ºC 5. Medida de DO600 en espectrofotómetro a partir de la extracción de 1 mL de cultivo hasta alcanzar fase estacionaria. Blanco: medio de cultivo estéril A partir de los datos de densidad óptica obtenidos se elaboró una gráfica para representar la curva con las distintas fases de crecimiento (figura 17) y se calculó la velocidad específica de crecimiento (µ) de cada cepa a partir de la ecuación de la pendiente de la curva calculada en fase exponencial. Material y métodos 42 Latencia Exponencial Estacionaria Muerte t0t x0 xt Figura 17. Patrón de crecimiento bacteriano típico. Parámetros para el cálculo de la velocidad específica de crecimiento. Pendiente= µ (h-1)= Xt-X0/(t-t0) µ= velocidad específica de crecimiento t0 = tiempo en h al que comienza la fase exponencial t = tiempo en h al que termina la fase exponencial X0 = valor de DO600 al principio de la fase exponencial Xt = valor de DO600 al final de la fase exponencial 3.10.2.2. Tolerancia a diversos factores Para determinar la tolerancia de las distintas cepas a diversos factores que podrían afectar a su crecimiento, así como a la producción de 2,3-BDO, o que pudieran resultar una ventaja para la producción industrial de este compuesto, se llevaron a cabo ensayos de recuento de UFC en placas de medio TSA como base, modificado según los factores a evaluar. En primer lugar se prepararon cultivos en tubos de ensayo con 5 mL de medio TSB, que se incubaron a 37ºC durante 24 h. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de los cultivos y se sembraron alícuotas de 100 µL en placas de medio TSA con las diferentes condiciones y se incubaron durante 48 h. Tras la incubación se llevó a cabo el recuento de UFC en cada una de las placas, y se expresaron los resultados según la siguiente fórmula: Ufc/mL = N° de colonias en placa x inverso de la dilución/0.1. Tolerancia a pH. Para evaluar la tolerancia a distintos valores de pH, se prepararon placas de TSA ajustando el pH a valores de 4, 5, 6, 7 y 8. Material y métodos 43 Tolerancia a sacarosa. Para evaluar la tolerancia a distintas concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo, se prepararon placas de medio TSA adicionando sacarosa para obtener concentraciones finales de 100, 200 y 300 g/L de sacarosa. Tolerancia a 2,3-BDO. Para evaluar la tolerancia a distintas concentraciones de 2,3-BDO en el medio de cultivo, se prepararon placas de medio TSA adicionando 2,3-BDO para obtener concentraciones finales de 50, 60, 70, 100 y 150 g/L de 2,3-BDO. Tolerancia a temperatura. La tolerancia de las cepas a la temperatura se evaluó mediante el crecimiento en placas de medio TSA incubadas a diferentes temperaturas: 28ºC, 37ºC y 45ºC. 3.10.3. Pruebas bioquímicas Con el objeto de determinar las características metabólicas de las bacterias del trabajo, se realizaron una serie de pruebas bioquímicas. 3.10.3.1. Prueba oxidasa. Se siguió el método de Kovacs (1956). Para ello, sobre un cuadrado de papel de filtro se extendió con asa de siembra una colonia bacteriana procedente de un cultivo fresco en agar nutritivo y sobre la muestra se añadieron unas gotas de reactivo diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% (Difco, Nueva Jersey, EE.UU.). Se consideró un resultado positivo la coloración azul-violeta del papel del filtro al cabo de 1 min a temperatura ambiente. 3.10.3.2. Prueba catalasa. Sobre un portaobjetos se realizó una extensión bacteriana con un asa de siembra partiendo de una colonia de un cultivo fresco en agar nutritivo. Sobre esta extensión se colocó una gota de peróxido de hidrógeno y se observó la formación inmediata de burbujas, determinando un resultado positivo la formación de burbujas bien visibles. 3.10.3.3. Pruebas IMViC Se llevaron a cabo una serie de pruebas bioquímicas denominadas IMViC que consisten en: prueba de indol, prueba de rojo de metilo, prueba de Voges-Proskauer y prueba de citratos. Material y métodos 44 Este conjunto de pruebas permite diferenciar bacterias dentro de la familia Enterobacteriaceae, principalmente se establecen diferencias entre E. coli y el grupo formado por los géneros Klebsiella, Enterobacter y Serratia. Para este grupo, los resultados de las pruebas IMViC son (--++), criterio que se siguió para la selección de los aislados, ya que los géneros del grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, son los que se han descrito anteriormente como endófitos habituales de plantas de arroz con características de promoción del crecimiento de plantas y posibles productores de biopolímeros. Prueba de indol: se determina si la bacteria posee la enzima triptofanasa, que hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando el reactivo específico de Kovacs. Para dicha determinación, se inocularon las bacterias en tubos de ensayo con 5 mL de medio agua de peptona (que contiene triptófano). Los tubos se incubaron a 37ºC durante 48 h, y tras esta incubación se añadieron unas gotas de reactivo de Kovacs para revelar la prueba, identificando como reacciones positivas aquellas que generaron un anillo rosa-rojizo en la superficie del cultivo, resultado de la reacción entre el indol producido y el p-dimetilamino benzaldehído contenido en el reactivo de Kovacs. Prueba de rojo de metilo: mediante esta prueba se determina si la bacteria lleva a cabo la fermentación ácido-mixta. Se detecta la formación de ácidos como el acético y fórmico, que son relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo el indicador rojo de metilo al cultivo. Para esta determinación se inocularon las bacterias en tubos de ensayo con 5 mL de medio de Clark-Lubs, y se incubaron a 37ºC durante 48 h. Tras la incubación se añadieron a los tubos unas gotas de rojo de metilo y se observó si se producía viraje del color del medio. Las reacciones positivas se identificaron como aquellas en las que el medio viró a color rojo. Prueba de Voges-Proskauer: mediante esta prueba se detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se produce un precursor del butanodiol, acetoína, que se oxida en presencia de oxígeno para dar lugar a diacetilo. El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio de cultivo. Para incrementar la sensibilidad de la reacción se utiliza el reactivo alfa-naftol. Para la realización de esta prueba se inocularon las bacterias en tubos de ensayo con 5 mL de medio Clark-Lubs, mismo medio utilizado para la prueba anterior, y se incubaron a 37ºC durante 48 h. Material y métodos 45 Tras la incubación, se añadieron a los tubos unas gotas de alfa-naftol, y se dejaron en reposo durante 20 minutos. Posteriormente se efectuó la lectura, considerando un resultado positivo la aparición de una coloración roja y un resultado negativo la no aparición de dicha coloración. Prueba de citratos: mediante esta prueba se determina la utilización de citrato como única fuente de carbono y energía. Se emplea un medio con citrato como única fuente carbonada, el medio citrato de Simmons, que contiene citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). Se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato y el consecuente viraje del color verde del medio hacia azul. Para detectar la utilización de citrato, las bacterias se sembraron en tubos de ensayo preparados con agar citrato de Simmons mediante la técnica de agar inclinado. Se incubaron a 37ºC durante 48 h, y tras la incubación se llevó a cabo la lectura. Las reacciones positivas fueron aquellas en las que se produjo un viraje del color del medio de verde a azul. 3.10.3.4. Batería de pruebas API 20E Se llevó a cabo una batería de pruebas bioquímicas utilizando el kit comercial API 20E® (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). Las galerías fueron incubadas a 37ºC durante 24 h, y posteriormente se procedió a su lectura e interpretación según indicaciones del fabricante. 3.10.3.5. Producción de ácido y gas a partir de carbohidratos La capacidad de producción de ácido y gas a partir de carbohidratos por parte de las diferentes cepas se evaluó empleando un medio de cultivo conteniendo los distintos carbohidratos junto con el indicador ácido-base rojo fenol. Así, si la bacteria inoculada era capaz de fermentar determinado carbohidrato con la consiguiente formación de ácido, se pondría de manifiesto mediante el viraje del color del medio a amarillo, color del indicador a pH ácido (Cowan y Steel, 1982). El protocolo seguido fue el siguiente: al medio de cultivo con rojo fenol se añadieron los carbohidratos previamente esterilizados por filtración a una concentración final del 1%. Se prepararon tubos de ensayo con una campana de Durham (para detectar la producción de gases) con 5 mL de medio de cultivo, y se inocularon tomando colonias de las distintas cepas de placas con cultivos frescos con asa de siembra. Material y métodos 46 Los tubos se incubaron a 37ºC durante 48 h. Se efectuaron lecturas de los resultados a las 24 y 48 h de cultivo, observando el viraje del medio (figura 18) y la existencia de burbujas de aire dentro de la campana de Durham. En otros casos, para determinar la formación de ácido por la fermentación de carbohidratos se utilizó un medio de cultivo como base con CaCO3, al que se fueron añadiendo soluciones de los distintos azúcares a probar. El medio se distribuyó en placas de Petri que se sembraron con las cepas a ensayar a partir de cultivos frescos, y se incubaron a 37ºC durante 24 h. Tras la incubación se llevó a cabo su lectura, considerando un resultado positivo la aparición de un halo de solubilización del medio alrededor de las colonias. 3.10.3.6. Determinación de actividades enzimáticas Se llevó a cabo un análisis cuantitativo de actividades enzimáticas butanodiol deshidrogenasa (BDH), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y lactato deshidrogenasa (LDH) a partir de extractos libres de células de las diferentes cepas. Los extractos se prepararon mediante un protocolo elaborado a partir del descrito por Lino et al. (2002): Obtención de extracto libre de células 1. Pre-inóculo en tubo de ensayo con 5mL de medio TSB a partir de colonias de cultivo fesco 2. Incubación: 37ºC, 24 h 3. Inoculación en matraces con 100 mL de medio TSB 4. Incubación a 37ºC hasta alcanzar fase exponencial 5. Recogida de 50 mL del cultivo en un tubo Falcon 6. Centrifugación a 4ºC, 8000 r.p.m., 20 min 7. Lavado 2 veces del pellet con tampón fosfato (50 mM, pH7) 8. Resuspensión del pellet final en 20 mL de tampón fosfato (50 mM, pH7) 9. Lisis mediante sonicador a 70 W, 10 pulsos de 60 s, con pausas de 15 s en hielo 10. Centrifugación a 11000 r.p.m., 4ºC, 30 min 11. Recuperación del sobrenadante La concentración en proteínas de los extractos libres de células obtenidos por lisis (figura 19) se determinó mediante espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, EE.UU.). Figura 18. Resultados para la prueba de rojo fenol. +, producción de ácido; ++, producción fuerte de ácido; ±, producción de ácido intermedia; -, resultado negativo. ++ + ± - Material y métodos 47 cultivo bacteriano célula lisada extracto libre de células resuspensióncentrifugación sonicado centrifugación Figura 19. Esquema de obtención de extracto libre de células a partir de cultivo bacteriano. 3.10.3.6.1. Medida de actividad enzimática BDH La determinación de la actividad enzimática BDH se realizó en base a la siguiente reacción (Nicholson 2008): NAD+NADH 2,3-BDO acetoína BDH Figura 20. Reacción catalizada por la enzima butanodiol deshidrogenasa. Fuente: KEGG (Kanehisa y Goto, 2000). Se preparó un tampón de reacción compuesto por NAD+ 0.2 mM disuelto en buffer fosfato (pH 7.6, 20 mM). En una cubeta con volumen final de 2 mL, se añadió el tampón de reacción, extracto libre de células a 10 mM, e inmediatamente antes de medir, 2,3-BDO a 0.1 M para iniciar la reacción. A partir de ese momento, se midió la absorbancia a 340 nm cada minuto mediante espectrofotómetro, para monitorizar la reducción de NAD+ a NADH hasta que la absorbancia llegó a un valor estático. El valor de actividad enzimática se cuantificó mediante la fórmula: 1 U actividad BDH= 1 µmol NAD+ consumido/min/mg proteína. La cantidad de NAD+ consumida se determinó a partir del valor de su coeficiente de extinción (ε= 16900 M-1 cm-1), mediante la ecuación de la ley de Lambert Beer: A= ε·c·l (A= absorbancia, ε= coeficiente extinción, c= concentración, l= longitud de paso de la luz). Material y métodos 48 3.10.3.6.2. Medida de actividad enzimática GAPDH La determinación de la actividad enzimática GAPDH se realizó en base a la siguiente reacción: NAD+NADH ortofosfato gliceraldehído-3-P 3-fosfoglicerol-P GAPDH Figura 21. Reacción catalizada por la enzima gliceraldehído-3-P deshidrogenasa. Fuente: KEGG (Kanehisa y Goto, 2000). Se preparó un tampón de reacción compuesto por trietanolamina 40 mM, EDTA 0.2 mM y NAD+ 10mM disueltos en buffer fosfato (pH 7.6, 20 mM), modificando el protocolo descrito por Ferdinand (1964). En una cubeta con volumen final de 2 mL, se añadió el tampón de reacción, extracto libre de células a 10 mM, e inmediatamente antes de medir, gliceraldehído-3-fosfato a 10 mM para iniciar la reacción. Posteriormente se midió la absorbancia a 340 nm cada minuto mediante espectrofotómetro, para monitorizar la reducción de NAD+ a NADH hasta que la absorbancia llegó a un valor estático. El valor de actividad enzimática se calculó mediante la fórmula: 1 U actividad GAPDH= 1 µmol NAD+ consumido/min/mg proteína. La cantidad de NAD+ consumido se determinó a partir del valor de su coeficiente de extinción (ε= 16900 M-1 cm-1), mediante la ecuación de la ley de Lambert Beer descrita anteriormente (apartado 3.10.3.6.). 3.10.3.6.3. Medida de actividad enzimática LDH La determinación de la actividad enzimática LDH se realizó en base a la siguiente reacción reversible: D-lactato NAD+ piruvato NADH LDH Figura 22. Reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa. Fuente: KEGG (Kanehisa y Goto, 2000). Material y métodos 49 Se preparó tampón imidazol en el que se disolvió NADH 3 mM. En una cubeta con volumen final de 2 mL, se añadió el tampón de reacción, extracto libre de células a 10 mM, e inmediatamente antes de medir, piruvato 5 mM para iniciar la reacción. A continuación se midió la absorbancia a 340 nm cada minuto mediante espectrofotómetro, para monitorizar la oxidación de NADH a NAD+ hasta que la absorbancia llegó a un valor estático. El valor de actividad enzimática se calculó mediante la fórmula: 1 U actividad LDH= 1 µmol NADH consumido/min/mg proteína. La cantidad de NADH consumida se determinó a partir de su coeficiente de absorción (ε= 6.22 · 103 M-1 cm-1) mediante la ecuación de la ley de Lambert Beer anteriormente descrita (apartado 3.10.3.6.). 3.11. SENSIBILIDAD FRENTE A ANTIBIÓTICOS La determinación de la sensibilidad a antibióticos de las cepas de objeto de estudio se llevó a cabo por el método de difusión en agar de Kirby Bauer (Ferraro, 2000). Este método consiste en depositar en la superficie de una placa con medio sólido previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antibióticos a estudiar. Cuando el disco entra en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde por el agar, formándose un gradiente de concentración. Tras la incubación, los discos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibición de crecimiento bacteriano. Se utilizaron discos comerciales (Bio-Rad, California, EE.UU.) de diámetro conteniendo los siguientes antibióticos: tetraciclina, ampicilina, kanamicina, neomicina, estreptomicina, ácido nalidíxico, cloranfenicol y amoxicilina/ácido clavulánico. El protocolo seguido fue el siguiente: Antibiograma disco-placa 1. Cultivo bacteriano en medio LB hasta turbidez de 0.5 en escala Macfarland 2. Siembra en césped en placa de LB agar de 100 µL del cultivo 3. Colocación de los discos de antibiótico sobre la placa 4. Incubación a 37ºC durante 18 h 5. Lectura La lectura e interpretación del ensayo se llevó a cabo mediante la medición del diámetro de los halos de inhibición formados y la comparación de dichas medidas con criterios estandarizados de interpretación basados en el método de Kirby-Bauer, según normas del Comité Nacional de Normas de Laboratorios Clínicos (NCCLS, EE.UU.). Material y métodos 50 Según el diámetro del halo de inhibición existen distintos valores de sensibilidad (resistente, intermedio, sensible) en función de cada antibiótico. 3.12. OBTENCIÓN DE 2,3-BDO 3.12.1. Ensayo de producción de 2,3-BDO mediante fermentación Para la producción de 2,3-BDO, se realizó un pre-cultivo de cada cepa por triplicado en tubos con 5 mL de medio EA, que se incubaron a 37ºC durante 24 h. Tras la incubación, los pre-cultivos se inocularon en matraces con 50 mL de medio EA, al que se añadió la fuente de carbono utilizada en cada caso (glucosa o sacarosa), y se incubaron en condiciones de microaerobiosis a 37 ºC. 3.12.2. Recuperación de metabolitos resultantes de la fermentación Los metabolitos producidos se recuperaron del medio de cultivo mediante la recogida de 5 mL de cada cultivo en distintos momentos durante la incubación y su posterior centrifugación durante 10 min a 7000 r.p.m. para extraer el sobrenadante, a partir del cual se cuantificó la producción de metabolitos. 3.13. OBTENCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES A PARTIR DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES 3.13.1. Pre-tratamiento de los residuos Previamente a la extracción de los azúcares presentes en los residuos mediante procesos de hidrólisis, se llevó a cabo un pre-tratamiento mecánico de los mismos consistente en su trituración. De esta forma se consigue la disminución del tamaño de las partículas y el grado de polimerización de los residuos, facilitando así el proceso de hidrólisis y reduciendo su duración (Delgenes et al., 2003). 3.13.2. Hidrólisis ácida La extracción de azúcares mediante hidrólisis ácida se llevó a cabo a partir de cantidades variables del residuo a hidrolizar previamente triturado, al que se añadió H2SO4 al 0.5% en una proporción 1:8. La mezcla se sometió a autoclave durante 15 min a 120ºC y posteriormente se centrifugó a 8000 r.p.m. durante 8 min, recuperando el sobrenadante y eliminando el pellet resultante. Resultados 55 4.1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS Para el aislamiento de las diferentes cepas se utilizaron los medios de cultivo Mossel y MacConkey según lo descrito anteriormente (apartado 3.5. de material y métodos). A partir de la siembra en medio MacConkey y la posterior selección de las cepas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae en función de su pigmentación, se obtuvieron un total de 60 aislados. De ellos 46 fueron aislados de muestras de suelo rizosférico, 10 de muestras de raíces y 4 de parte aérea. En cuanto a las zonas de muestreo, en la tabla 8 se muestran las cepas aisladas de cada una de ellas. Tabla 8. Cepas aisladas a partir de las diferentes zonas de muestreo. ZONA DE MUESTREO TABLA CEPAS AISLADAS TOTAL 111 2 9 3 6 1 5 2 2 3 8 1 5 210 3 4 La Compañía Hato Ratón Los Pobres 26 15 19 Tras su caracterización preliminar como enterobacterias, a las 60 cepas aisladas se les realizó la serie de pruebas bioquímicas IMViC (apartado 3.10.3.3. de material y métodos). De esta forma se confirmó que los microorganismos aislados pertenecían a la familia Enterobacteriaceae y se diferenciaron las cepas que pertenecían al grupo formado por los géneros Klebsiella, Enterobacter y Serratia, descritos como productores de 2,3BDO, con resultado (--++) para estas pruebas. A partir de estos resultados se seleccionaron 25 de las 60 cepas aisladas, que fueron caracterizadas más detalladamente. Resultados 56 4.2. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CEPAS SELECCIONADAS 4.2.1. Identificación por secuenciación del gen del ARN ribosomal 16S (ADNr 16S) Las 25 cepas seleccionadas se identificaron mediante secuenciación del gen del ARNr 16S, rrs o también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S). Mediante la técnica de PCR se amplificó el gen ADNr 16S de las cepas seleccionadas y se secuenció con los primers que se describen en la tabla 4 del apartado 3.7.4.3. de material y métodos. Una vez obtenidas las secuencias de dicho gen, de un tamaño aproximado de 1500 pb, se compararon con las secuencias disponibles en la base de datos GenBank, con la ayuda del programa Blast del servidor del NCBI y de la aplicación EzTaxon-e (Kim et al., 2012). Se obtuvieron identificaciones a nivel de género y especie de cada una de las cepas, a partir de los datos de similitud con cepas descritas previamente (tabla 9). Se consideró que una cepa pertenecía a una especie depositada en la base de datos cuando el porcentaje de similitud fue igual o superior a un 97%, según lo establecido por Ludwig et al. (1998). Tabla 9. Cepas seleccionadas y similitud con especies de la base de datos según secuenciación del ADNr 16S. DESIGNACIÓN DE LA CEPA ZONA DE MUESTREO PARTE DE LA PLANTA ESPECIE MÁS PRÓXIMA FILOGENÉTICAMENTE SIMILITUD (%) SC1 La Compañía suelo rizosférico Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae 99,71 SC2-a La Compañía suelo rizosférico Klebsiella singaporensis 96,59 SC2-b La Compañía suelo rizosférico Klebsiella singaporensis 98,27 SC4 La Compañía suelo rizosférico Enterobacter ludwigii 99,03 SC10 La Compañía suelo rizosférico Enterobacter aerogenes 99,56 SC13 La Compañía suelo rizosférico Enterobacter ludwigii 99,15 SC17 La Compañía suelo rizosférico Leclercia adecarboxylata 99,64 SHR6 Hato Ratón suelo rizosférico Enterobacter ludwigii 99,64 SHR7 Hato Ratón suelo rizosférico Leclercia adecarboxylata 99,71 SHR8 Hato Ratón suelo rizosférico Klebsiella oxytoca 98,8 SHR9 Hato Ratón suelo rizosférico Citrobacter freundii 98,87 SHR12 Hato Ratón suelo rizosférico Enterobacter cancerogenus 99,65 SA2 Los Pobres suelo rizosférico Enterobacter ludwigii 99,36 Resultados 57 Tabla 9. (Cont) DESIGNACIÓN DE LA CEPA ZONA DE MUESTREO PARTE DE LA PLANTA ESPECIE MÁS PRÓXIMA FILOGENÉTICAMENTE SIMILITUD (%) SA4 Los Pobres suelo rizosférico Enterobacter asburiae 98,42 SA6 Los Pobres suelo rizosférico Enterobacter hormaechei 99,22 SA11 Los Pobres suelo rizosférico Citrobacter freundii 98,54 SA12 Los Pobres suelo rizosférico Enterobacter cancerogenus 98,78 SA14 Los Pobres suelo rizosférico Enterobacter cancerogenus 99,15 RC1 La Compañía raíces Enterobacter cancerogenus 99,36 RC2 La Compañía raíces Enterobacter cancerogenus 99,86 RA1 Los Pobres raíces Enterobacter cancerogenus 99,92 RA2 Los Pobres raíces Enterobacter cancerogenus 99,43 RHR1 Hato Ratón raíces Klebsiella variicola 98,55 RHR2 Hato Ratón raíces Enterobacter cancerogenus 98,27 RHR3 Hato Ratón raíces Enterobacter cancerogenus 97,34 La mayor parte de las cepas seleccionadas se identificaron como pertenecientes al género Enterobacter (64%), seguidas del género Klebsiella (20%), y en menor proporción, los géneros Citrobacter y Leclercia (ambos con un 8%), como se muestra en la figura 23. Klebsiella 20% Enterobacter 64% Citrobacter 8% Leclercia 8% Figura 23. Distribución porcentual de las cepas aisladas agrupadas por género. Se obtuvieron un total de 11 especies distintas, siendo Enterobacter cancerogenus la especie que se aisló con mayor frecuencia. Fue además la única especie presente en todas las zonas de muestreo. El resto de especies aisladas se encontraron en una única zona de muestreo, y en algunos casos en dos de ellas. Resultados 58 En cuanto a las distintas zonas de muestreo, Hato Ratón es la zona con mayor diversidad entre los aislados, ya que entre las 8 cepas provenientes de la misma se diferencian 7 especies distintas. Con respecto a las distintas partes de la planta de arroz, en la tabla 9 se puede observar que la mayoría de cepas se aislaron de muestras de suelo rizosférico, encontrándose en las raíces un 28% de los aislados, que pertenecen en su mayoría a la especie Enterobacter cancerogenus. 4.2.2. Identificación por PCR fingerprinting (huella genética) Para determinar la existencia de distintas cepas entre las bacterias identificadas como de una misma especie según la anterior secuenciación del ADNr 16S, se llevó a cabo la amplificación de las secuencias consenso repetitivas intergénicas de enterobacterias (ERIC) mediante PCR-ERIC. Como resultado se obtuvieron patrones de bandas de ADN específicos de cada especie y cepa, que fueron comparados visualmente y a continuación se trataron con el programa de procesamiento de imágenes ImageJ (Abramoff et al., 2004) (figura 24). A SC2-a SC2-b K. singaporensis SC4 SC13 SHR6 SA2 E. ludwigii SC17 SHR7 L. adecarboxylata SHR9 SA11 C. freundii SA4 E. asburiae E. hormaechei SA6 SA12 E. cancerogenus RC1 RC2 RA1 RA2 SHR12 RHR2 RHR3 SA14 SC1 K. pneumoniae K. oxytoca SHR8 SC10 E. aerogenes K. variicola RHR1 Resultados 59 B E. cancerogenus SA12 RC1 RC2 RA1 RA2 SHR12 RHR2 RHR3 SA14 SHR8 K. oxytoca SC1 K. pneumoniae SC10 E. aerogenes RHR1 K. variicola SC2-a K. singaporensis SC2-b SC17 L. adecarboxylata SHR7 SHR6 SA2 SC4 E. ludwigii SC13 SHR9 C. freundii SA11 SA4 E. asburiae Figura 24. Perfiles obtenidos a partir de la PCR-ERIC, agrupados por aislados pertenecientes a la misma especie (A) y gráficas obtenidas a partir de los patrones de bandas mediante el programa ImageJ (B) (Abramoff et al., 2004). La comparación de los perfiles de bandas (huellas genéticas) resultantes de la electroforesis muestra que para algunas especies se aislaron cepas con patrones diferentes, tratándose por lo tanto de cepas distintas y no clones. Esta variación indica que dichas cepas han sufrido una serie de variaciones genómicas. 4.3. SELECCIÓN DE UNA CEPA PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3-BDO 4.3.1. Screening de producción de 2,3-BDO de las cepas seleccionadas Para determinar la capacidad de producir 2,3-BDO por parte de las distintas cepas aisladas e identificadas, se llevó a cabo un ensayo de producción de este compuesto tal como se describe en el apartado 3.12.1. de material y métodos, utilizando glucosa como fuente de carbono a una concentración final de 60 g/L. La cantidad de 2,3-BDO producido se cuantificó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), obteniendo los resultados que se muestran en la tabla 10. Resultados 60 Tabla 10. Datos de producción de 2,3-BDO a las 24 h de cultivo de las especies aisladas. meso ópticamente activo K. pneumoniae nd 6.60 ± 0.3 K. singaporensis nd 8.40 ± 0.3 E. ludwigii nd 8.13 ± 0.3 K. variicola nd 6.23 ± 0.3 E. aerogenes nd 13.20 ± 0.3 L. adecarboxylata nd 6.40 ± 0.3 C. freundii nd 8.21 ± 0.3 K. oxytoca nd 10.80 ± 0.3 E. asburiae nd 6.60 ± 0.3 E. hormaechei nd 8.30 ± 0.3 E. cancerogenus nd 10.00 ± 0.3 ESPECIE 2,3-BDO 24 H (g/L) nd= no detectado Los datos muestran la producción media de 2,3-BDO entre las distintas cepas aisladas agrupadas por especies. Todas las especies aisladas fueron capaces de producir 2,3-BDO a partir de glucosa, aunque como se puede observar, ninguna bacteria produjo una cantidad detectable de 2,3-BDO en su forma meso-, predominando la forma ópticamente activa. Como se muestra en la tabla 10, la especie que produjo una mayor cantidad de 2,3BDO fue Enterobacter aerogenes. 4.3.2. Utilización de carbohidratos Como se vió en la introducción, la ruta de síntesis de 2,3-BDO parte de moléculas de glucosa. Sin embargo, económicamente sería más rentable la adición de sacarosa al medio de cultivo para llevar a cabo la fermentación, en lugar de añadir glucosa pura. Además la sacarosa es una hexosa que forma parte de los residuos agroindustriales de material lignocelulósico, que podrían utilizarse como materia prima en la producción de 2,3-BDO, abaratando los costes de producción y valorizando estos residuos frente a otras materias primas más costosas o perjudiciales para el medio ambiente. Por ello, para determinar la capacidad de las distintas cepas de utilizar sacarosa, descomponiéndola en glucosa y fructosa, y asimilar la glucosa para producir 2,3-BDO, se llevó a cabo un ensayo de fermentación de ambos azúcares en placas de medio con CaCO3 (apartado 3.10.3.5. de material y métodos), basado en la formación de ácido como resultado de la fermentación. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 11. Resultados 61 Tabla 11. Resultados de prueba de utilización de glucosa y sacarosa. CEPA IDENTIFICACIÓN GLUCOSA SACAROSA SC1 Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ++ ++ SC2-a Klebsiella singaporensis + + SC2-b Klebsiella singaporensis + + SC4 Enterobacter ludwigii + - SC10 Enterobacter aerogenes ++ ++ SC13 Enterobacter ludwigii ++ ++ SC17 Leclercia adecarboxylata +++ SHR6 Enterobacter ludwigii ++ ++ SHR7 Leclercia adecarboxylata +++ SHR8 Klebsiella oxytoca + + SHR9 Citrobacter freundii ++ ++ SHR12 Enterobacter cancerogenus ++ ++ SA2 Enterobacter ludwigii ++ + SA4 Enterobacter asburiae ++ ++ SA6 Enterobacter hormaechei +++ SA11 Citrobacter freundii +++ SA12 Enterobacter cancerogenus + - SA14 Enterobacter cancerogenus ++ ++ RC1 Enterobacter cancerogenus + + RC2 Enterobacter cancerogenus ++ ++ RA1 Enterobacter cancerogenus + + RA2 Enterobacter cancerogenus + + RHR1 Klebsiella variicola + + RHR2 Enterobacter cancerogenus + - RHR3 Enterobacter cancerogenus + - (+) = presencia de halo, (-)= ausencia de halo, (++)= presencia de halo de mayor tamaño Como se puede observar todas las cepas estudiadas fueron capaces de fermentar glucosa, sin embargo, no todas tienen la capacidad de metabolizar sacarosa y disociarla en fructosa y glucosa para utilizar dichos monosacáridos. Las diferencias de utilización de azúcares tuvieron lugar entre aislados de distintas especies así como entre diferentes cepas de la misma especie. En algunos casos también se observan diferencias dentro de la misma especie y cepa pero proveniente de diferentes puntos de muestreo (por ejemplo RC1 y RHR3). En función de los resultados de producción de 2,3-BDO obtenidos, su capacidad para utilizar tanto glucosa como sacarosa, su fácil cultivo y los datos existentes en la bibliografía, se seleccionó la cepa Enterobacter aerogenes SC10 como cepa de trabajo. Resultados 62 Previamente a los distintos ensayos de producción realizados con la misma, se llevaron a cabo una serie de determinaciones en paralelo con una cepa tipo comercial de E. aerogenes obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), E. aerogenes CECT 684T. De esta forma se podría confirmar la identificación preliminar de nuestra cepa, realizada anteriormente por pruebas IMViC y secuenciación del ADNr 16S. 4.3.3. Caracterización de la cepa E. aerogenes SC10 4.3.3.1. Caracterización fenotípica En primer lugar se llevó a cabo un estudio de caracterización macroscópica, observando las características de las colonias de la cepa E. aerogenes SC10 y la cepa de referencia E. aerogenes CECT 684T, crecidas en placas de medio nutritivo TSA, así como en medio selectivo MacConkey (figura 25). E. aerogenes CECT 684TE. aerogenes SC10 A C B D Figura 25. Aspecto de las colonias de de la cepa E. aerogenes SC10 y la cepa de referencia E. aerogenes CECT 684T sembradas en medio TSA (imágenes A y B) y medio MacConkey (imágenes C y D). La descripción de las colonias se detalla en la tabla 12. Resultados 63 Tabla 12. Características macroscópicas de la cepa E. aerogenes SC10 y la cepa de referencia E. aerogenes CECT 684T. CEPA MEDIO DE CULTIVO FORMA BORDE ELEVACIÓN SUPERFICIE PIGMENTACIÓN TSA circular entero convexa lisa, brillante, cremosa traslúcida, amarillogrisácea MacConkey circular entero convexa lisa, brillante, cremosa opaca, rosa oscuro TSA circular entero convexa lisa, brillante, cremosa traslúcida, amarillogrisácea MacConkey circular entero convexa lisa, brillante, cremosa opaca, rosa oscuro E. aerogenes CECT 684T E. aerogenes SC10 Posteriormente, se determinó la morfología de ambas cepas mediante tinción de Gram y tinción negativa. Mediante la tinción de Gram se observó que tanto la cepa objeto de estudio como la cepa de referencia presentaban la siguiente morfología (figura 26): bacilos Gramnegativos, rectos, con un tamaño celular de 1-2 µm de longitud y 0.25-0.5 µm de ancho. La tinción negativa reveló la presencia de cápsula en las dos cepas. E. aerogenes SC10E. aerogenes CECT 684T A B Figura 26. Microfotografía de las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T teñidas mediante tinción Gram (A) y tinción negativa (B). 4.3.3.2. Pruebas bioquímicas Al igual que para la caracterización fenotípica de la cepa E. aerogenes SC10, para su caracterización bioquímica se tomó como referencia la cepa E. aerogenes CECT 684T. Las dos cepas se sometieron a las pruebas de catalasa, oxidasa y la batería de pruebas API 20E. Los resultados para ambas fueron catalasa positiva y oxidasa negativa. Resultados 64 En cuanto a las 20 pruebas de la batería API 20E los resultados fueron también iguales para ambas cepas, determinándose que las dos cepas examinadas presentan las actividades lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, triptófano desaminasa y son capaces de fermentar glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramnosa, sacarosa, melobiosa, amigdalina y arabinosa, perfil que corresponde con la especie Enterobacter aerogenes. 4.3.3.3. Sensibilidad frente a antibióticos Mediante el método de antibiograma disco-placa se determinó la sensibilidad a diversos antibióticos de las dos cepas de E. aerogenes estudiadas (tabla 13). Tabla 13. Sensibilidad a distintos antibióticos de las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T. E. aerogenes SC10 E. aerogenes CECT 684 Tetraciclina R I Ampicilina R R Kanamicina I I Neomicina R S Estreptomicina S S Ácido nalidíxico I S Cloranfenicol S S Amox./clav. R R CEPA ANTIBIÓTICO R= resistente, S= sensible, I= intermedio Se determinó que la cepa objeto de estudio presenta mayor resistencia a los antibióticos tetraciclina, neomicina y ácido nalidíxico que la cepa tipo. 4.3.3.4. Crecimiento Se evaluó el crecimiento de las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T mediante la elaboración de curvas de crecimiento (apartado 3.10.2.1. de material y métodos). Se realizaron curvas en medio nutritivo (TSB) sin adición de carbohidratos, y en el medio utilizado para la producción de 2,3-BDO (medio EA), añadiendo sacarosa a una concentración final de 90 g/L (figura 27). Resultados 71 Fragmento genómico ldhA 1050 pb PGEM®-T 3015 pb Ligación + transformación pME-LDH 5065 pb PUC4-KIXX 5300 pb Digestión BamHI Digestión BamHI Ligación + transformación pME1-KLDH 6365 pb PJQ200-SK 4000 pb Digestión NotI/SpeI Ligación + transformación pME2-KLDH 7350 pb Casette resistencia Km 1300 pb BamHI BamHI BamHI NotI SpeI NotISpeI Figura 32. Estrategia utilizada para la obtención de la cepa con interrupción del gen ldhA. 4.4.1.2. Modificación de la vía metabólica de oxidación de gliceraldehído-3-fosfato 4.4.1.2.1. Efecto de la oxidación de gliceraldehído-3-fosfato en la producción de 2,3-BDO en E. aerogenes Como se ha visto anteriormente, la producción de 2,3-BDO parte del piruvato originado a partir de glucosa. La formación de piruvato a partir de glucosa implica una serie de reacciones mediante la cual la glucosa se oxida a gliceraldehído-3-fosfato (G3P), que a su vez es oxidado a 1,3-bifosfoglicerato (1,3-PG), y este último a piruvato por medio de otra serie de reacciones. La reacción oxidación de G3P hacia 1,3-PG es dependiente de NAD+, que se reduce a NADH, y es catalizada por la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (figura 33). Resultados 72 La enzima GAPDH por lo tanto, afecta a la producción de 2,3-BDO, ya que interviene en la formación del sustrato necesario para su formación (piruvato) y además genera NADH necesario para las rutas dependientes de este poder reductor, entre ellas la de síntesis de 2,3-BDO a partir de acetoína. Por ello en este trabajo se decidió incrementar la producción de 2,3-BDO y mejorar la productividad de los cultivos de la cepa del estudio llevando a cabo la sobreexpresión del gen que codifica la enzima GAPDH. Figura 33. Esquema del metabolismo de la glucosa en E. aerogenes. En rojo, señalada enzimagliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (código EC:1.2.1.12 según nomenclatura IUBMB), responsable de la conversión de G3P a 1,3-PG. Fuente: KEGG (Kanehisa y Goto, 2000). Resultados 73 4.4.1.2.2. Estudio in silico del gen codificante de la enzima gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (gapA) La enzima GAPDH en E. aerogenes (EC:1.2.1.12) es codificada por el gen gapA. Para estudiar este gen, en primer lugar se localizó la región del genoma en la que se encontraba (EAE 21720) y se realizó un análisis de su entorno genómico (figura 34) mediante la herramienta web Absynte (Despalins et al., 2011). EAE 21720 EAE 21715 EAE 21725 EAE 21710 gapA Metionina sulfoxido reductasa B Proteína desconocida Aldosa 1-epimerasa Proteína familia MipA Quitinasa II EAE 21730 EAE 21705 Figura 34. Contexto genómico del gen gapA en E. aerogenes. Esquema construido a partir de datos obtenidos de la herramienta web Absynte (Despalins et al., 2011). Las regiones promotoras se indican con flechas grises. Para determinar si el gen gapA formaba una única unidad transcripcional, se llevó a cabo una búsqueda in silico de promotores (figura 34), mediante la herramienta web BDGP (Reese et al., 1996). 4.4.1.2.3. Obtención de una cepa con sobreexpresión del gen gapA Para la sobreexpresión del gen gapA, en primer lugar se amplificó un fragmento de ADN de 1060 pb que contenía dicho gen, utilizando ADN genómico de la cepa silvestre de E. aerogenes SC10 como molde. Para la reacción de PCR se diseñaron los cebadores gapA_F y gapA_R (apartado 3.7.4.3. de material y métodos), a los que se añadieron en sus extremos puntos de corte de las enzimas de restricción XhoI y HindIII para facilitar su posterior clonaje. En este caso la reacción de PCR se llevó a cabo utilizando una enzima ADN polimerasa de alta fidelidad (Expand High Fidelity PCR System, Roche) y las condiciones descritas en el apartado 3.7.4.1. de material y métodos. Resultados 74 El producto de PCR obtenido fue comprobado mediante electroforesis en gel de agarosa, digerido con las enzimas de restricción XhoI y HindIII, y ligado al vector PBBR1MCS5, digerido previamente con las mismas enzimas. De esta forma se obtuvo el plásmido pME-GP (figura 35), con el que se transformaron células competentes de E. coli DH5α mediante electroporación. Los transformantes se seleccionaron en placas de medio LB con gentamicina, IPTG y X-gal, conservando las colonias blancas y descartando las azules. PBBR1-MCS5 4950 pb Fragmento genómico gapA 1060 pb Digestión XhoI/HindIII Digestión XhoI/HindIII Ligación + transformación pME-GP 6010 pb XhoIHindIII Figura 35. Estrategia utilizada para la obtención de la cepa con sobreexpresión del gen ldhA. La correcta inserción del fragmento genómico en el plásmido se confirmó por PCR y secuenciación. La transferencia del plásmido pME-GP a las células de E. aerogenes se realizó mediante transformación por electroporación de células competentes previamente preparadas. La cepa mutante obtenida se denominó EAG. 4.4.1.3. Modificación de la vía metabólica de reducción de acetoína 4.4.1.3.1. Efecto de la reducción de acetoína en la producción de 2,3-BDO en E. aerogenes La acetoína es reducida a 2,3-BDO mediante una reacción dependiente de NADH. Esta reacción es catalizada por la enzima acetoína reductasa/butanodiol deshidrogenasa (BDH). La enzima BDH por lo tanto, afecta directamente a la producción de 2,3-BDO, ya que interviene en la última reacción necesaria para su síntesis (figura 36). Resultados 75 Además contribuye a regenerar el NAD+ necesario para las rutas dependientes de este compuesto. Con estos antecedentes, se propuso como objetivo incrementar la producción de 2,3-BDO y mejorar la productividad de los cultivos de la cepa del estudio mediante la sobreexpresión del gen que codifica la enzima BDH. Figura 36. Esquema del metabolismo del butanoato en E. aerogenes. En rojo, señalada enzima acetoína reductasa (código EC:1.1.1.76, 1.1.1.304 y 1.1.1.- según nomenclatura IUBMB), responsable de la conversión de acetoína a 2,3-BDO. Fuente: KEGG (Kanehisa y Goto, 2000). 4.4.1.3.2. Estudio in silico del gen codificante de la enzima acetoína reductasa/butanodiol deshidrogenasa (bdh) La enzima BDH en E. aerogenes (EC: 1.1.1.76, 1.1.1.304, 1.1.1.-) es codificada por el gen bdh. Para estudiar este gen, en primer lugar se localizó la región del genoma en la que se encontraba (EAE 17490) y se realizó un análisis de su entorno genómico (figura 37) mediante la herramienta web Absynte (Despalins et al., 2011). Resultados 76 EAE 17490 EAE 17495 EAE 17485 EAE 17500 bdh Acetolactato sintasa α-acetolactato descarboxilasa Proteína citocromo CcmF EAE 17505 Gluconato deshidrogenasa subunidad C Regulador transcripcion al familia LysR EAE 20585 EAE 17480 Figura 37. Contexto genómico del gen bdh en E. aerogenes. Esquema construido a partir de datos obtenidos de la herramienta web Absynte (Despalins et al., 2011). Las regiones promotoras se indican con flechas grises. Para determinar si el gen bdh formaba una única unidad transcripcional, se llevó a cabo una búsqueda in silico de promotores (figura 37), mediante la herramienta web BDGP (Reese et al., 1996). 4.4.1.3.3. Obtención de una cepa con sobreexpresión del gen bdh Para la sobreexpresión del gen bdh, en primer lugar se amplificó un fragmento de ADN de 850 pb que contenía dicho gen, utilizando ADN genómico de la cepa silvestre de E. aerogenes SC10 como molde. Para la reacción de PCR se diseñaron los cebadores bdh_F y bdh_R, añadiendo en sus extremos puntos de corte de las enzimas de restricción HindIII y SacI para facilitar su posterior clonaje. La reacción se llevó a cabo utilizando una enzima ADN polimerasa de alta fidelidad (Expand High Fidelity PCR System, Roche) con las condiciones descritas en el apartado 3.7.4.1. de material y métodos. Tras la reacción se llevó a cabo la comprobación de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente el producto de PCR fue digerido con las enzimas de restricción HindIII y SacI y ligado al vector PBBR1-MCS2, digerido previamente con las mismas enzimas, obteniéndose el plásmido pME-BD (figura 38). Con este plásmido se transformaron células competentes de E. coli DH5α mediante electroporación. Los transformantes se seleccionaron en placas de medio LB con kanamicina, IPTG y X-gal, escogiendo las colonias blancas y descartando las azules. La correcta inserción del fragmento genómico en el plásmido se confirmó por PCR y secuenciación. Resultados 77 PBBR1-MCS2 5144 pb Fragmento genómico bdh 850 pb Digestión HindIII/SacI Digestión HindIII/SacI Ligación + transformación pME-BD 5994 pb HindIII SacI Figura 38. Estrategia utilizada para la obtención de la cepa con sobreexpresión del gen bdh. La transferencia del plásmido pME-BD a las células competentes de E. aerogenes previamente preparadas se realizó mediante transformación por electroporación. La cepa mutante obtenida se denominó EAB. 4.4.1.4. Obtención de cepas con modificación de varios genes 4.4.1.4.1. Doble sobreexpresión de los genes bdh y gapA Para la sobreexpresión de los genes bdh y gapA utilizando un único vector, en primer lugar se digirió el plásmido pME-GP utilizando las enzimas de restricción HindIII y SacI, de forma paralela a la digestión con las mismas enzimas del producto de PCR del gen bdh obtenido anteriormente. Posteriormente, se llevó a cabo la ligación del plásmido abierto con el producto de PCR digerido, obteniéndose el plásmido pME-GB (figura 39). Con este plásmido se transformaron células competentes de E. coli DH5α mediante electroporación, y los transformantes fueron seleccionados en placas de LB con gentamicina. La correcta inserción del fragmento genómico en el plásmido se confirmó por PCR y secuenciación. Resultados 78 pME-GP 6010 pb Fragmento genómico bdh 850 pb Digestión HindIII/SacI Digestión HindIII/SacI Ligación + transformación pME-GB 6860 pb HindIII SacI Figura 39. Estrategia utilizada para la obtención de la cepa con sobreexpresión de los genes bdh y gapA. El plásmido pME-GB se transfirió a células de E. aerogenes SC10 (cepa silvestre) y E. aerogenes ΔldhA (EALD) mediante transformación por electroporación de células competentes previamente preparadas de ambas cepas. Las cepas mutantes se denominaron EAGB y EALD-GB, respectivamente. 4.4.1.5. Caracterización de las cepas mutantes obtenidas 4.4.1.5.1. Estudio de crecimiento Para evaluar el crecimiento de las distintas cepas mutantes obtenidas, se realizaron curvas de crecimiento (apartado 3.10.2.1. de material y métodos) en medio EA suplementado con sacarosa, puesto que en el caso de existir alguna diferencia de crecimiento en las cepas mutantes, debería evaluarse en las condiciones en las que se utilizarían para la producción de 2,3-BDO. Las curvas de crecimiento obtenidas están representadas en la figura 40. Resultados 79 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 DO 600 Tiempo (h) E. aerogenes SC10 EALD EAB EAG EAGB EALD-GB Figura 40. Curvas de crecimiento obtenidas para las distintas cepas en medio EA suplementado con sacarosa. Se observó un tipo de crecimiento diáuxico para las cepas mutantes, al igual que para la cepa silvestre E. aerogenes SC10. A partir de las curvas se calculó la velocidad específica de crecimiento para las distintas cepas en la primera y segunda fase exponencial, obteniendo así los datos que se muestran en la figura 41. No se detectaron diferencias significativas en el crecimiento de ninguna de las cepas mutantes con respecto a la silvestre, aunque en todos los casos se alcanzaron valores de D.O. más altos al final de la curva. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 µ 1 µ 2 Figura 41. Velocidades específicas en la primera y segunda fase exponencial (µ1 y µ2) de la curva de crecimiento diáuxico de las diferentes cepas de estudio. Estos resultados sugieren que la sobreproducción de las enzimas GAPDH y BDH y la supresión de la enzima LDH no afectaron al crecimiento de E. aerogenes. Resultados 80 4.4.1.5.2. Estudio de utilización de carbohidratos La capacidad de producción de ácido y gas a partir de carbohidratos por parte de las diferentes cepas mutantes se evaluó mediante la prueba de rojo fenol (apartado 3.10.3.5. de material y métodos). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 14. Tabla 14. Resultados de utilización de diversos carbohidratos por parte de la cepa silvestre y mutantes de E. aerogenes SC10. 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h SC10 ++ ++ + + - ± + + EAB ++ ++ + + ± + + + EAG ++ ++ + + - - + + EALD ++ ++ + + + + + + EAGB ++ ++ + + - - + + EALD-GB ++ ++ + + - ± + + LACTOSA SACAROSA CEPA GLUCOSA FRUCTOSA +, producción de ácido; ++, producción fuerte de ácido; ±, producción de ácido intermedia; -, resultado negativo. A partir de los resultados se puede determinar que todas las cepas produjeron ácidos a partir de glucosa, fructosa y sacarosa. En el caso de la utilización de lactosa como fuente de carbono, la producción de ácido se vió más limitada. Las cepas EAG y EAGB no produjeron ácido a partir de dicho carbohidrato. 4.4.1.5.3. Estudio de tolerancia a distintos factores  Tolerancia a temperatura: Con el objetivo de determinar posibles alteraciones en la tolerancia a temperatura de las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre, se llevó a cabo un estudio de crecimiento a distintas temperaturas. Además, el uso de microorganismos tolerantes a un rango de temperatura más amplio para la producción de 2,3-BDO permite abaratar el proceso, ya que se evita el uso de sistemas de enfriamiento, que son muy costosos y evita paradas debidas a sobrecalentamientos, además de reducir la posibilidad de contaminación de los medios (Laluce, 1991). Por ello, se determinó si existían cepas entre las estudiadas con una mayor capacidad de crecimiento a alta temperatura. Resultados 87  Condiciones de aireación: La disponibilidad de oxígeno en el proceso de fermentación butanodiólica determina la predominancia de formación de unos metabolitos respecto a otros (Perego et al., 2000). Por ello, para determinar la condición óptima en la que se produce 2,3-BDO por encima de otros metabolitos, se ensayó la producción de 2,3-BDO en condiciones de microaerobiosis y anaerobiosis. En condiciones de anaerobiosis no se detectó producción de 2,3-BDO, formándose otros productos como ácido succínico, ácido láctico y 1,3-propanodiol. En condiciones de microaerobiosis sí se obtuvo 2,3-BDO, en cantidades variables en función del resto de condiciones del cultivo.  Medio de cultivo utilizado (nutrientes): Para la producción de 2,3-BDO se ensayaron 3 medios distintos de cultivo: TSB, SRT y EA, cuya composición se describe en el apartado 3.2. de material y métodos, suplementados con sacarosa a una concentración final de 90 g/L. Los resultados de crecimiento y producción de 2,3-BDO a las 24 h de cultivo en los tres medios ensayados se encuentran representados en la figura 49. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 5 10 15 20 25 TSB EA SRT DO 600 (nm) 2,3-BDO (g/L) 2,3-BDO (g/L) DO600 Figura 49. Crecimiento y producción de 2,3-BDO en los medios de cultivo TSB, EA y SRT. Se observó un mayor crecimiento en el medio EA, debido posiblemente a la mayor cantidad de sustancias nutritivas respecto a los otros medios de cultivo, que se verían limitados a las 24 h de cultivo. Resultados 88 Además, en este medio se produjo un 245% más de 2,3-BDO que en medio TSB y un 83% más que en medio SRT. A partir de estos datos, se eligió el medio EA como medio de cultivo para los ensayos de producción de 2,3-BDO con las cepas de E. aerogenes. Con el objetivo de optimizar la producción en los cultivos en medio EA, y obtener valores mayores de crecimiento y producción de 2,3-BDO, se estudió la adición de una fuente nutritiva (extracto de levadura) al medio de cultivo a las 24 h. De esta forma se evitaría una posible limitación en el crecimiento por el agotamiento de nutrientes y las bacterias podrían seguir produciendo 2,3-BDO a partir de las 24 h de cultivo. Para ello se realizaron cultivos en paralelo en medio EA con 90 g/L, con un suplemento de extracto de levadura a las 24 h de cultivo a una concentración e 2,5 g/L (50% de la cantidad inicial), y medio EA con 90 g/L de sacarosa sin dicho suplemento (figura 50). 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 0 5 10 15 20 25 A B DO 600 (nm) 2,3-BDO (g/L) 2,3-BDO (g/L) DO600 Figura 50. Crecimiento y producción de 2,3-BDO en medio de cultivo con y sin extracto de levadura (A y B respectivamente) a las 24 h. A partir de los datos obtenidos se pudo concluir que la adición de extracto de levadura al cultivo tras 24 h provoca un aumento del crecimiento entre las 24-48 h mayor que cuando el medio no es suplementado, así como una mayor producción de 2,3-BDO. El crecimiento es de un 18% mayor la producción de 2,3-BDO se incrementa en un de un 24%. Resultados 89  Azúcares Se estudiaron las posibles diferencias de producción de 2,3-BDO utilizando glucosa pura como fuente de carbono, que sería directamente utilizada por la bacteria para iniciar la ruta de producción de 2,3-BDO, y sacarosa, que tendría que ser descompuesta en sus dos monosacáridos (fructosa y glucosa) antes de ser utilizada para sintetizar 2,3-BDO. Se prepararon medios de cultivo con medio EA como base al que se añadió glucosa (60 g/L) o sacarosa (90 g/L). No se observaron diferencias en el crecimiento de la cepa de estudio a las 24 h de cultivo, por lo que se puede afirmar que éste no se vió afectado en función de la fuente de carbono utilizada (glucosa o sacarosa). En cuanto a la producción de 2,3-BDO, con la utilización de sacarosa se obtuvo una mayor cantidad de este compuesto con respecto al producido a partir de glucosa. Así, se obtuvo que la cepa E. aerogenes SC10 produce un 31% más de 2,3-BDO utilizando sacarosa como azúcar en lugar de glucosa pura.  Cantidad de células: Se estudió el efecto de la cantidad inicial de células en el cultivo en la producción de biomasa y 2,3-BDO. Para ello se compararon datos de biomasa en cultivos de 24 h con los datos de producción de 2,3-BDO en ese mismo momento (figura 51). 0 5 10 15 20 25 30 3,75 4,75 8,5 9,2 12 2,3-BDO (g/L) Biomasa (g/L) Figura 51. Relación biomasa/2,3-BDO en cultivos de 24 h de E. aerogenes. Resultados 90 El mejor resultado de producción de 2,3-BDO se obtuvo cuando se alcanzó una biomasa de 12 g/L en el cultivo. Este valor de biomasa se obtuvo al inocular un pre-cultivo de la bacteria con una DO600 de 6 en el medio de cultivo de producción a una concentración final de un 4%. Por lo tanto se determinó que estas deberían ser las condiciones iniciales del cultivo para obtener cantidades considerables de 2,3-BDO.  Tiempo de fermentación Se determinó el momento óptimo para recoger las muestras y recuperar el 2,3BDO producido del medio de cultivo. Para ello se comparó la concentración de este compuesto en el medio a diferentes horas a lo largo del cultivo (figura 52). 0 5 10 15 20 25 6 12 24 36 48 72 2,3-BDO (g/L) Tiempo de cultivo (h) Figura 52. Evolución de la concentración de 2,3-BDO por E. aerogenes a diferentes horas de cultivo. En vista de los resultados obtenidos, el período seleccionado para la toma de muestras en los posteriores ensayos fue de las 24 h a las 48 h de cultivo, donde se observó un mayor crecimiento en la concentración de 2,3-BDO. A partir de las 48 h de cultivo la concentración comenzó a descender. 4.4.1.6.2. Ensayo de producción de 2,3-BDO por las cepas mutantes El ensayo de producción de 2,3-BDO por parte de las distintas cepas se llevó a cabo con las condiciones optimizadas a partir de la cepa E. aerogenes SC10 y según el protocolo descrito en el apartado 3.12.1. de material y métodos. Se estudiaron los efectos de las sobreexpresiones de los genes bdh y gapA y la interrupción del gen ldhA en la producción de biomasa, 2,3-BDO, ácido láctico, ácido succínico y etanol, así como en el consumo de sacarosa. Resultados 91 El consumo de sacarosa (figura 53a) se vió incrementado en la cepa con sobreexpresión del gen gapA (EAG), a la vez que la velocidad de consumo, siendo esta un 28% mayor que en la cepa silvestre. Como se esperaba, la tasa de consumo de sacarosa (y por tanto glucosa) fue mejorada por la sobreproducción de la enzima GAPDH, y por consiguiente el ratio de glucólisis y la formación de piruvato como sustrato para la síntesis de 2,3-BDO. En las cepas EALD y EALD-GB, con interrupción del gen ldhA, también aumentó el consumo de sacarosa, siendo de un 23% y 24% mayor que en la cepa silvestre respectivamente, a la vez que la producción de 2,3-BDO fue mayor que en la cepa silvestre. En las cepas son sobreexpresión del gen bdh se produjo una ligera reducción en la tasa de consumo de sacarosa, aunque esto no afectó a la producción de 2,3-BDO, que aumentó al igual que en todas las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre, de las misma forma que la velocidad de producción de este compuesto (figura 53b). 0 10 20 30 40 50 60 0 12 24 48 Sacarosa (g/L) Tiempo (h) SC10 EAB EAG EALD EAGB EALD-GB A 0 5 10 15 20 25 30 0 12 24 48 2,3-BDO (g/L) Tiempo (h) SC10 EAB EAG EALD EAS5GB EALD-GB B Figura 53. Evolución del consumo de sacarosa (A) y producción de 2,3-BDO (B) por las cepas de estudio a lo largo del cultivo. Resultados 92 Para analizar la redistribución de los flujos metabólicos en la ruta de síntesis del 2,3-BDO como consecuencia de las modificaciones genéticas realizadas, se determinaron las concentraciones obtenidas de los principales metabolitos en todas las cepas a las 24 h de cultivo (figura 54). 0 5 10 15 20 25 30 2,3-BDO (g/L) A 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Succinato (g/L) B 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 etanol (g/L) C 0 10 20 30 40 50 60 70 ácido láctico (mg/L) D 0 1 2 3 4 5 6 7 acetoína (g/L) E 0 2 4 6 8 10 12 14 biomasa (g/L) F Figura 54. Concentraciones obtenidas para los principales metabolitos producidos en la ruta de síntesis de 2,3-BDO por la cepa silvestre y mutantes. La producción de ácido láctico experimentó un descenso importante en las cepas con interrupción del gen ldhA, siendo esta reducción de un 86% y un 89% con respecto a la cepa silvestre en las cepas EALD y EALD-GB, respectivamente, confirmando la correcta interrupción de dicho gen. Resultados 93 Sin embargo, la formación de este metabolito se vió incrementada en las cepas EAG y EAGB, con sobreexpresión del gen gapA. Esto podría explicarse por la mayor disponibilidad de NADH y piruvato, necesarios para la producción de ácido láctico, debido a la mayor actividad de la enzima GAPDH. La cepa EAG también incrementó la producción con respecto a la cepa silvestre de otros metabolitos dependientes de NADH y piruvato producidos en la ruta (acetoína, succinato y etanol). En cambio, en la cepa EAB, con sobreproducción de la enzima BDH, disminuyó la producción de esos metabolitos en favor de la producción de 2,3-BDO. El 2,3-BDO fue el metabolito producido en mayor cantidad en todas las cepas del estudio. En cuanto a la producción de biomasa, como se muestra en la figura 54f, no se vió afectada en ninguna de las cepas mutantes. Por ello, se puede confirmar que las modificaciones genéticas realizadas no tienen efectos en el crecimiento, como se observó también en el apartado 4.4.1.5.1. El rendimiento de producción de 2,3-BDO (figura 55) fue mayor en casi la totalidad de las cepas mutantes en comparación con los valores de la cepa silvestre, exceptuando la cepa EAG, que no presentó diferencias significativas con respecto a la silvestre. El mayor aumento se observó en las cepas con sobreexpresión del gen bdh. 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 productividad (g/L/h) A 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 rendimiento (g BDO/g sacarosa) B Figura 55. Productividad (A) y rendimiento (B) de la producción de 2,3-BDO obtenidos para las distintas cepas del estudio. La productividad se vió incrementada en todas las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre llegando a ser incluso un 58% mayor para la cepa EALD-GB. Resultados 94 4.5. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA PRODUCCIÓN DE 2,3BDO 4.5.1. Caracterización de residuos agroindustriales Se determinó la composición en cuanto a azúcares de residuos de naranja, piña y remolacha, para conocer de esta forma si podían ser utilizados para la producción de 2,3BDO. En primer lugar se determinó el tipo de azúcares presentes en los residuos mediante cromatografía en capa fina (TLC). El análisis mediante TLC se llevó a cabo en el Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química (Universidad de Sevilla). Como resultado se obtuvo que el residuo de piña contenía monosacáridos y disacáridos y los residuos de naranja y remolacha contenían además restos de polisacáridos (figura 56). D MM D P M DP Piña RemolachaNaranja Figura 56. Placas de TLC en las que se aprecian disacáridos (D), monosacáridos (M) y polisacáridos (P) provenientes de residuos de naranja, piña y remolacha. 4.5.2. Obtención de azúcares fermentables a partir de los residuos agroindustriales En primer lugar, los distintos residuos fueron sometidos a un pre-tratamiento mecánico que consistió en su trituración, con el objetivo de disminuir el tamaño de las partículas del residuo en cuestión y facilitar así los procesos posteriores. A continuación se llevó a cabo un proceso de hidrólisis (autohidrólisis, hidrólisis enzimática e hidrólisis ácida), según los procedimientos descritos en el apartado 3.13. de material y métodos para liberar los azúcares presentes en los mismos y hacerlos disponibles para los microorganismos productores de 2,3-BDO. Posteriormente se determinó la concentración de los azúcares obtenidos para cada tipo de residuo y cada tratamiento realizado (tabla 15) mediante cromatografía líquida de alta resolución. Resultados 95 Tabla 15. Azúcares obtenidos mediante tratamientos de hidrólisis de los distintos residuos. Arabinosa (g/L) Fructosa (g/L) Glucosa (g/L) Sacarosa (g/L) trazas 15.3 12.7 8.4 0.4 9.4 12 0.77 trazas 14.3 12.8 7.97 Tratamiento Autohidrólisis Hidrólisis ácida RESIDUO DE PIÑA Hidrólisis enzimática Arabinosa (g/L) Fructosa (g/L) Glucosa (g/L) Sacarosa (g/L) trazas 0.1 0.9 6.8 2.77 0.42 0.48 trazas 0.54 0.31 0.28 1.14 RESIDUO DE REMOLACHA Tratamiento Autohidrólisis Hidrólisis ácida Hidrólisis enzimática Arabinosa (g/L) Fructosa (g/L) Glucosa (g/L) Sacarosa (g/L) nd 15.4 11.9 7.3 nd 8.1 7.5 6.8 nd 13.9 10.2 12.1 RESIDUO DE NARANJA Tratamiento Autohidrólisis Hidrólisis ácida Hidrólisis enzimática nd= no detectado. A partir del residuo de piña se obtuvo como azúcar predominante la fructosa, seguido de glucosa y sacarosa. Las cantidades de arabinosa obtenidas fueron prácticamente despreciables. En cuanto a la concentración de azúcares totales, la autohidrólisis fue el proceso con el que mayor valor se alcanzó (36.4 g/L), seguido de la hidrólisis enzimática (35.07 g/L) y la hidrólisis ácida (22.57 g/L). Con respecto a los azúcares de utilidad para la síntesis de 2,3-BDO (sacarosa y glucosa), se obtuvo mayor cantidad mediante el proceso de autohidrólisis (21.1 g/L). Los tratamientos de hidrólisis de residuo de remolacha dieron lugar a cantidades reducidas de azúcares, predominando la sacarosa en los procesos de autohidrólisis e hidrólisis enzimática y la arabinosa en el proceso de hidrólisis ácida. La mayor concentración de azúcares totales (7.8 g/L) se obtuvo mediante autohidrólisis, que fue también el tratamiento mediante el que se logró mayor concentración de azúcares utilizables para la producción de 2,3-BDO (sacarosa y glucosa), con un valor de 7.7 g/L. El residuo de naranja liberó mayoritariamente fructosa tras los distintos tratamientos de hidrólisis, seguida de glucosa y sacarosa. La concentración de arabinosa obtenida a partir de este residuo también fue despreciable. La concentración de azúcares totales fue superior en el tratamiento por hidrólisis enzimática (36.2 g/L), seguida de la autohidrólisis (34.6 g/L) y la hidrólisis ácida (22.4 g/L). Los azúcares utilizables para la Resultados 96 síntesis de 2,3-BDO (sacarosa y glucosa) predominaron en el residuo tratado por hidrólisis enzimática, obteniendo una concentración de 22.3 g/L. Entre los tres tipos de residuo tratados, los de piña y naranja liberaron cantidades de azúcares similares mediante los tres procesos de hidrólisis, aunque fue el residuo de naranja el que liberó mayor cantidad de azúcares aprovechables para la producción de 2,3-BDO, tanto glucosa que podría entrar directamente en la vía de formación de piruvato como sacarosa, que podría hidrolizarse para así obtener la glucosa contenida en la misma. Tras determinar la cantidad de azúcares obtenida de los residuos, se calcularon los rendimientos de cada proceso en función de la cantidad de residuo utilizado para preparar los hidrolizados y la cantidad de azúcares obtenidos a partir de éste, medidos en gramos totales de azúcares obtenidos por gramo de material empleado (figura 57). 0 5 10 15 20 25 30 35 naranja piña remolacha Rendimiento (%) Figura 57. Rendimientos en % obtenidos para la autohidrólisis (gris), hidrólisis enzimática (verde) e hidrólisis ácida (naranja) de los distintos residuos tratados. Los rendimientos obtenidos en los distintos tratamientos del residuo de naranja fueron del 29.2 % para la autohidrólisis, 24 % para la hidrólisis enzimática y 21% para la hidrólisis ácida. Valores similares se obtuvieron a partir del procesamiento del residuo de piña: 27.7% (autohidrólisis), 26.3% (hidrólisis enzimática) y 17% (hidrólisis ácida). Sin embargo, en el caso del residuo de remolacha los valores de rendimiento alcanzados disminuyeron significativamente, siendo del 6.5%, 1.8% y 3% respectivamente. Estos resultados indican que el proceso con mayor rendimiento en todos los casos y que por lo tanto resultaría más rentable es la autohidrólisis, así como la hidrólisis ácida sería la menos provechosa. Resultados 103 pME-FX Ligación + transformación KmR PUC4-KIXX PJQ200SK Digestión XhoI pME-FXK Digestión NotI/SpeI Ligación + transformación pME2-FXK Figura 61. Estrategia utilizada para la interrupción del gen fimD. La transferencia del plásmido pME2-FXK a las células de E. aerogenes se llevó a cabo mediante transformación por electroporación. Las cepas mutantes resultantes que formaron un evento de recombinación homóloga se seleccionaron en placas de LB con kanamicina y un 10% de sacarosa, identificándose como aquellas colonias con fenotipo KmRGmSSacR. Posteriormente, el mutante se comprobó por PCR y posterior secuenciación. La cepa mutante obtenida se denominó EA-SF. 4.6.3. Caracterización de las fimbrias en las cepas con interrupción del gen fimD 4.6.3.1. Caracterización fenotípica de las cepas con deleción de las fimbrias Morfología de colonias. Se sembraron placas de TSA con la cepa E. aerogenes silvestre y las cepas con deleción del gen fimD, mediante siembra por agotamiento, para observar posibles diferencias en la forma de las colonias debido a la ausencia de fimbrias. Observación mediante microscopía electrónica. Para observar la superficie celular y la existencia de cambios estructurales o desaparición de las fimbrias, se llevó a cabo la observación de las cepas con deleción del gen fimD junto con la cepa silvestre, como control. Resultados 104 4.6.3.2. Ensayo de adhesión a células eucariotas Para evaluar la capacidad de adhesión de las bacterias con la síntesis de fimbrias afectada, se llevó a cabo un ensayo de adhesión a células de levadura, como modelo de célula eucariota. Se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en el apartado 3.15. de material y métodos. 4.6.3.3. Estudio de efectos en el crecimiento Para determinar si la interrupción del gen fimD y la consiguiente alteración en la síntesis de fimbrias dio lugar a cambios en el crecimiento de las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre, se llevaron a cabo curvas de crecimiento en medio de cultivo TSB que se encuentran representadas en la figura 62. 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DO 600 Tiempo (h) E. aerogenes SC10 E. aerogenes EA-SF Figura 62. Curvas de crecimiento en medio de cultivo TSB. El crecimiento de la cepa EA-SF se vió afectado por la interrupción del gen fimD, observándose valores más bajos de DO600 con respecto a la cepa silvestre SC10 en todos los puntos de la curva de crecimiento. A partir de la pendiente de la curva en la fase de crecimiento exponencial, se calcularon las velocidades específicas de crecimiento de ambas cepas obteniendo como resultado una velocidad específica de 0.67 para la cepa E. aerogenes SC10 y de 0.63 para la cepa E. aerogenes EA-SF. 4.6.3.4. Estudio de efectos en la producción de 2,3-BDO Para determinar si la alteración en la síntesis de fimbrias afectó a la producción de 2,3-BDO por parte de las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre, se llevó a cabo un ensayo de producción de 2,3-BDO a partir de sacarosa como el descrito en el apartado 3.12. de material y métodos. 5 5. . D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N Discusión 105 Existen numerosos estudios encaminados a la búsqueda de microorganismos asociados a plantas de arroz y al estudio de sus propiedades de promoción del crecimiento vegetal (PGP), que pueden tener aplicaciones para la agricultura (Cottyn et al., 2000; Mano, 2008; Hardoim, 2011). En nuestro laboratorio se realizaron diversos estudios de dichos microorganismos asociados a plantas de arroz provenientes de los arrozales de las Marismas del Guadalquivir, en su parte sevillana, mediante los que se determinó que en esta zona existe una gran diversidad bacteriana, siendo las enterobacterias las más predominantes, probablemente debido a su capacidad de adaptación a amplios rangos de condiciones físico-químicas y nutricionales, y sus mecanismos de colonización. A partir de dichos estudios se estimó interesante realizar un trabajo en mayor profundidad de las enterobacterias de los arrozales, así como de su posible aplicación para la industria de los bioplásticos. Como se ha indicado anteriormente, existe una nutrida relación de trabajos sobre actividades PGP de bacterias asociadas a plantas de arroz, pero no se ha prestado mucha atención a su utilidad en la fabricación de bioplásticos. Sin embargo, la alta diversidad de bacterias aisladas de arroz sugiere la existencia de un ambiente complejo en el que pueden encontrarse bacterias con numerosas aplicaciones, como resultado de su adaptación a dicho ambiente. Con este propósito se aislaron un total de 60 cepas de enterobacterias de plantas de arroz, de distintas zonas, obteniéndose un mayor número de aislados de la zona denominada La Compañía, zona con menor contenido salino y con riego directo del río. Es conocido que en el agroecosistema del arroz, la población microbiana refleja las condiciones del agua de riego (Pelczar et al., 1996), que se ve influenciada por otras prácticas agrícolas, así como industriales y domésticas. Por lo tanto, el mayor contenido en enterobacterias aisladas de esta zona puede explicarse por las descargas de aguas residuales y efluentes de diferentes industrias y explotaciones ganaderas vertidos al río Guadalquivir, que favorecen la presencia de estas bacterias en el agua del río, y por lo tanto en las tierras regadas con este agua. Discusión 106 Posteriormente, los aislados se diferenciaron en función de su capacidad de producir 2,3-BDO mediantes las pruebas IMVIC, seleccionando así 25 de los aislados como posibles productores de este compuesto. Estos últimos fueron identificados mediante amplificación y secuenciación del gen ADNr 16S, y tras realizar el correspondiente análisis comparativo de la secuencia obtenida con las secuencias depositadas en la base de datos, se obtuvo la identificación de cada uno de ellos. Se obtuvo que los géneros bacterianos más abundantes entre los aislados son Enterobacter y Klebsiella, que coinciden junto con el género Pantoea en ser los géneros de la familia Enterobacteriaceae más comúnmente encontrados en plantas de arroz (Cottyn et al., 2001). En cuanto a los distintos puntos de muestreo, en las zonas de Hato Ratón y La Compañía se obtuvieron aislados de distintos géneros en proporciones similares en ambas: 25-33% Klebsiella, 50-55 % Enterobacter, 11-12.5% Leclercia. En la zona de Los Pobres sin embargo, excepto uno de los aislados todos pertenecen al género Enterobacter, lo que supone un 87.5% del total de aislados de esa zona. El agua de riego en esta zona arrocera se ve sometida a una mayor recirculación entre distintas parcelas agrícolas y canales de desagüe, pues no cuenta con una toma directa del río. El mayor número de bacterias del género Enterobacter podría indicar una mejor adaptación de estas bacterias a la alteración en la composición de nutrientes y sales del agua de riego al someterse a recircularización. En el estudio de fingerprinting llevado a cabo mediante PCR-ERIC se observó que entre los aislados identificados como pertenecientes a la misma especie por secuenciación del gen ADNr 16S, existían cepas distintas. En el caso de los aislados identificados como E. cancerogenus, se hallaron dos cepas del grupo diferentes al resto. Estas dos cepas fueron aisladas de suelo rizosférico, en lugar de raíces, de donde provienen las demás. Esto puede explicar el hecho de que se trate de cepas distintas, puesto que las cepas aisladas de raíces poseen carácter endofítico que podría determinar diferencias a nivel de genotipo. Discusión 107 Entre los aislados de E. luwigii y C. freundii también se observó la existencia de distintas cepas. En estos dos casos todas las cepas provienen de suelo rizosférico, aunque de distintas zonas de muestreo, lo que probablemente sea causa de la diversidad entre ellas debido a la adaptación a distintas condiciones ambientales. En cuanto a la producción de 2,3-BDO, los resultados obtenidos en este trabajo del screening de las diferentes enterobacterias aisladas (tabla 10) están de acuerdo con trabajos publicados anteriormente en cuanto a la capacidad de producción por parte de estos microorganismos, donde se señala que las bacterias que producen 2,3-BDO de forma efectiva pertenecen principalmente a la familia Enterobacteriaceae, destacando las especies Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca y Enterobacter aerogenes (Sabra et al., 2015). Además, en esta Tesis Doctoral se ha puesto de manifiesto la capacidad de producción de 2,3-BDO por parte de otras especies menos estudiadas como son K. singaporensis, E. ludwigii, K. variicola y Leclercia adecarboxylata. Es importante destacar que en nuestro trabajo las cepas productoras sintetizaron únicamente 2,3-BDO en su forma ópticamente activa, sin detectarse la mezcla de dos esteroisomeros de 2,3-BDO (meso) como sí se obtuvo en otros trabajos (Celinska y Grajek, 2009). Esto puede suponer una ventaja para la industria, puesto que se trata de una forma más pura, con gran valor para la síntesis de diversas moléculas. Una vez determinada la capacidad de las cepas seleccionadas para producir 2,3BDO a partir de glucosa pura, se estudió la posibilidad de sustituir este carbohidrato por sacarosa como fuente de carbono, ya que esto supondría un menor coste en la síntesis de 2,3-BDO y además pondría de manifiesto qué cepas serían capaces de asimilar la sacarosa presente en los residuos agroindustriales a la hora de utilizar estos como materia prima. Del total de aislados, tan solo un 16% utilizaron la glucosa produciendo ácido como resultado pero no fueron aptas para la utilización de sacarosa. El resto sin embargo pudieron utilizar ambos carbohidratos, por lo que contamos con 21 cepas que potencialmente podrían producir 2,3-BDO a partir de residuos agroindustriales con contenido en sacarosa. Discusión 108 En la mayoría de trabajos sobre producción de 2,3-BDO mediante bacterias se ha utilizado glucosa como materia prima, por lo que consideramos interesantes los resultados obtenidos, suponiendo una ventaja frente a éstos al economizar el proceso de producción. Por otra parte, a partir de los resultados se observa que existen diferencias en cuanto al metabolismo de los carbohidratos entre distintas cepas de la misma especie, así como entre aislados de la misma cepa pero provenientes de diferentes zonas de muestreo. Esto pone de manifiesto la gran diversidad bacteriana presente en los arrozales de las Marismas del Gudalquivir, existiendo bacterias de diferentes géneros y especies, distintas cepas y distintas capacidades metabólicas dentro de una misma cepa, que de nuevo podría explicarse por la elevada variedad de condiciones ambientales en los arrozales debido al manejo del suelo y el agua de riego. La cepa con la que se obtuvo mayor producción de 2,3-BDO corresponde a la especie E. aerogenes. La bacteria E. aerogenes posee un gran potencial biotecnológico, ya que se le atribuyen numerosas aplicaciones de interés industrial. Así, se ha descrito su uso para biorremediación en zonas contaminadas con plomo y mercurio (Piñón-Castillo et al., 2010; Mehta y Vaidya, 2010), biodegradación de compuestos orgánicos como la acrilamida (Buranasilp y Charoenpanich, 2011), producción de biocombustibles (Han et al., 2012; Lee et al., 2012), producción de enzimas (Geckil y Gencer, 2004), tratamiento de aguas residuales mediante la producción de biofloculante (Lu et al., 2005) y agente de control biológico en cultivo de cítricos (Meca et al., 2009). También el género Enterobacter, y concretamente E. aerogenes, se ha considerado un microorganismo interesante para la síntesis de 2,3-BDO en diversos trabajos (Olson et al., 1948, Barret et al., 1983, Perego et al., 2000). Llegados a este punto decidimos centrar nuestro trabajo en la producción de 2,3BDO por la cepa E. aerogenes SC10. Para ello en primer lugar se procedió a su caracterización fenotípica y bioquímica, de forma paralela a la cepa de colección E. aerogenes CECT 684T, con el objetivo de determinar si existían diferencias con respecto a esta. Discusión 109 Como resultado se obtuvo que las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T son idénticas en cuanto a su caracterización fenotípica. Los resultados de las pruebas bioquímicas también fueron idénticos para ambas cepas, y se corresponden con los resultados esperados para la especie E. aerogenes. Aunque las cepas E. aerogenes SC10 y E. aerogenes CECT 684T como se ha visto poseen una elevada semejanza, algunas pruebas difirieren entre ellas, como son la sensibilidad a antibióticos y el crecimiento en medio con carbohidratos. En cuanto a la sensibilidad frente a antibióticos, la cepa E. aerogenes SC10 presentó mayor resistencia a algunos de los antibióticos ensayados (tabla 13) que la cepa de colección. Una posible explicación de ello sería la adquisición de resistencia a antibióticos de las enterobacterias que se liberan al medio ambiente desde las plantas de tratamiento de aguas residuales, y que a través del agua de riego proveniente del río llegan a los cultivos, en este caso, al cultivo de arroz. Estas enterobacterias provenientes de restos fecales poseerían dicha resistencia a antibióticos debido al excesivo uso por parte de la población de estos medicamentos, y una vez liberadas al ambiente no sólo mantienen la resistencia sino que la dispersan entre las comunidades bacterianas del medio a través de procesos de intercambio genético. También se probó el crecimiento de ambas cepas en medio de cultivo simple y con una fuente de carbohidratos (sacarosa). En medio sin carbohidratos el crecimiento fue igual para ambas, mientras que en medio con sacarosa la cepa E. aerogenes SC10 experimentó un mayor crecimiento. Esta diferencia puede deberse a que la cepa proveniente de colección ha sido cultivada en medios específicamente diseñados para cubrir sus necesidades nutricionales, mientras que la cepa aislada del medio natural se ha visto obligada a desarrollar mecanismos para obtener del ambiente los nutrientes necesarios, que normalmente no se encuentran disueltos sino que se han de obtener de fuentes más complejas. Por ello la cepa E. aerogenes SC10 es capaz de asimilar con mayor velocidad la sacarosa (y de forma más eficiente) y obtener a partir de ésta la glucosa para su crecimiento. Este hecho se consideró muy interesante ya que supondría una ventaja de la cepa aislada del arrozal frente a la cepa de colección a la hora de utilizar residuos como materia prima para la obtención de 2,3-BDO. Discusión 110 Por último se probó la capacidad de producción de 2,3-BDO de las dos cepas, obteniéndose un 58,1% más de producción en la cepa E. aerogenes SC10 que en la cepa tipo E. aerogenes CECT 684T. La ventaja en la producción podría deberse la adaptación de la cepa E. aerogenes SC10 a su hábitat y la frecuente activación de su mecanismo fermentativo debido a la existencia de condiciones anaeróbicas o con poca disponibilidad de oxígeno en el suelo de los arrozales. Además, se ha estudiado que la producción de 2,3-BDO supone un mecanismo de asociación a plantas, pudiendo actuar este compuesto como promotor del crecimiento vegetal (Lugtenberg y Kamilova, 2009), y a la vez que es sintetizado la bacteria toma nutrientes de los exudados radicales de la planta. Teniendo en cuenta estos resultados se determinó que la cepa E. aerogenes SC10 aislada de los arrozales presenta ciertas ventajas que la hacen más competitiva para la producción de 2,3-BDO frente a la cepa tipo, por lo que se escogió como cepa de trabajo. Los procesos convencionales de obtención de 2,3-BDO no resultan económicamente competitivos, ya que como se mencionó en el apartado 4.4.1. de resultados, de forma simultánea a la producción de este compuesto, se originan otra serie de metabolitos como etanol, acetoína, ácido láctico o ácido succínico, lo que da lugar a un menor rendimiento en la producción de 2,3-BDO así como a un incremento en los costes de recuperación y purificación de éste (Fond et al., 1985). Por este motivo, se han llevado a cabo diversos trabajos con el fin de lograr una producción de 2,3-BDO más eficiente y económica mediante la mejora de las cepas productoras. Así, se ha llevado a cabo la mejora genética de cepas bacterianas como Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae y Serratia marcescens para alcanzar un mayor rendimiento y productividad en la producción de 2,3-BDO, y reducir a la vez la producción de otros metabolitos de la misma vía metabólica (Xu et al., 2014). También varios autores han estudiado el metabolismo de la glucosa en Enterobacter aerogenes y han realizado trabajos de mejora para la producción de 2,3-BDO por parte de esta bacteria. Discusión 117 Mediante los procesos de hidrólisis llevados a cabo sobre los residuos se liberaron los azúcares presentes en los mismos, siendo el proceso de autohidrólisis el más efectivo por liberar mayor cantidad de azúcares, seguido de la hidrólisis enzimática y la hidrólisis ácida. Del residuo de remolacha se obtuvieron cantidades de azúcar entre los 0.1 y 7 g/L, que no se consideraron suficientes para su utilización en la síntesis de 2,3-BDO, por lo que se descartó la utilización del mismo. A partir de los residuos de naranja y piña sí se obtuvieron cantidades de azúcar que consideramos suficientes para la producción de 2,3BDO. Como se describe en el apartado 4.5.3. de resultados, el residuo de naranja fue detoxificado para eliminar el compuesto furfural, inhibidor del crecimiento microbiano, que fue detectado en el análisis de azúcares realizado por cromatografía en capa fina, así como el limoneno, presente de forma natural en los cítricos. La detoxificación supuso una pérdida mínima de azúcares (7% de glucosa y fructosa y 1.3% de sacarosa), asumible puesto que la presencia de compuestos tóxicos que inhibiesen el crecimiento bacteriano supondría una merma mayor en la producción de 2,3BDO. En cuanto al crecimiento bacteriano, éste se logró en ambos tipos de residuos utilizados, naranja y piña, al igual que la producción de 2,3-BDO. La producción de este compuesto a partir de piña y naranja alcanzada a las 24 h de cultivo fue del orden de la obtenida partir de los ensayos realizados con sacarosa comercial por la bacteria E. aerogenes. Utilizando residuos de naranja, se obtuvieron 0.15 g de 2,3-BDO por 1 g de cáscara de naranja. Utilizando residuos de piña se obtuvieron 0.05 g de 2,3-BDO por 1 g de pulpa de piña. La mayoría de los trabajos sobre producción biológica de 2,3-BDO se han centrado en el uso de sustratos puros (glucosa, sacarosa). Los costes de producción de 2,3-BDO dependen en gran medida de la materia prima empleada, por lo que la obtención de este compuesto a partir de materias primas de bajo coste como son los residuos de piña y naranja supone una gran ventaja económica para la industria. Discusión 118 En comparación con la producción de 2,3-BDO a partir de sacarosa comercial, el rendimiento de producción de 2,3-BDO a partir de residuos de piña y naranja que hemos obtenido es bajo. Sin embargo, teniendo en cuenta que se trata de residuos poco aprovechados y con un alto volumen de producción en los sectores de industria y hostelería, a gran escala puede considerarse una alternativa de interés. La cáscara de naranja puede considerarse especialmente interesante debido a su composición química, disponibilidad y bajo coste. Normalmente este residuo se ha utilizado para la producción de pienso animal. En este trabajo se ha puesto de manifiesto la posibilidad de su uso para la producción de 2,3-BDO por medio de bacterias, en nuestro caso E. aerogenes, adquiriendo este material un valor añadido. En vista de los resultados obtenidos a partir de los diferentes ensayos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral se podría afirmar que se ha logrado obtener una producción de 2,3-BDO de bajo coste para la industria, puesto que se han obtenido cepas bacterianas que sintetizan este compuesto en un corto período de tiempo, mejorando su rendimiento y productividad con respecto a la cepa silvestre, y además se ha puesto a punto la utilización de residuos como materia prima, lo que minimiza el coste de los sustratos. 6 6. . C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S Conclusiones 119 I. El estudio realizado en las Marismas del Guadalquivir ha puesto de manifiesto que existe una amplia diversidad de enterobacterias en las mismas, debido a la variedad de condiciones ambientales que se dan en el agroecosistema del arroz. Así, se aislaron enterobacterias de 4 géneros distintos y 11 especies, y se determinaron varias cepas entre los aislados pertenecientes a una misma especie. II. Gran cantidad de las enterobacterias aisladas fueron capaces de sintetizar 2,3BDO, seleccionando entre ellas la cepa SC10 para un estudio más detallado. En base a sus características fenotípicas y genotípicas se identificó como Enterobacter aerogenes, constituyendo la cepa E. aerogenes SC10. III. El estudio comparativo entre la cepa E. aerogenes SC10 y la cepa de colección E. aerogenes CECT 684T nos ha permitido comprobar que las condiciones cambiantes del arrozal dan lugar a la existencia de cepas con una mayor capacidad de adaptación de su metabolismo que las cepas de colección, lo que supone una ventaja de las primeras para su utilización en la síntesis de compuestos precursores de polímeros como el 2,3-BDO, convirtiéndolas en microorganismos atractivos a nivel industrial. IV. Mediante la aplicación de la ingeniería de vías metabólicas conseguimos mejorar la producción de 2,3-BDO en E. aerogenes SC10, incrementando los valores de rendimiento y productividad, a la vez que se disminuyó la producción de metabolitos no deseados resultantes de la fermentación y se incrementó la producción de otros que podrían ser interesantes para otro tipo de aplicaciones industriales. El mayor incremento de producción de 2,3-BDO fue alcanzado por la cepa triple mutante EALD-GB, con una productividad un 58% mayor que la alcanzada por la cepa silvestre. V. La evaluación llevada a cabo en este trabajo de diversos residuos agroindustriales como sustrato en la síntesis de 2,3-BDO ha permitido establecer su uso como alternativa a los azúcares puros, contribuyendo de esta forma a la viabilidad económica de los procesos de obtención de 2,3-BDO por vía biotecnológica. A la misma vez se han revalorizado dichos residuos y se ha contribuido a la disminución del impacto ambiental que genera la eliminación de los mismos. Conclusiones 120 VI. En vista de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, se puede afirmar que se ha logrado obtener 2,3-BDO mediante el uso de procesos biotecnológicos. De esta forma se logra rebajar la dependencia del petróleo y los procesos químicos en la fabricación de polímeros como el poliuretano y otros productos derivados del 2,3-BDO. 7 7. . B BI IB BL LI IO OG GR RA AF FÍ ÍA A