Optimización del proceso de compactación de ácidos nucleicos mediante el uso de vectores catiónicos derivados de azúcares

OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE COMPACTACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EL USO DE VECTORES CATIÓNICOS DERIVADOS DE AZÚCARES TRABAJO FIN DE MÁSTER David Pérez Alfonso Sevilla, Julio 2019 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE COMPACTACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EL USO DE VECTORES CATIÓNICOS DERIVADOS DE AZÚCARES TRABAJO FIN DE MÁSTER MÁSTER EN ESPECIALIZACIÓN PROFESIONAL EN FARMACIA: ESPECIALIDAD ALIMENTACIÓN Y SALUD Alumno: David Pérez Alfonso Tutor/a: Manuel López López María Luisa Moyá Morán Departamento: Química Física (Facultad de Química) Sevilla, Julio 2019 Resumen: En este trabajo se ha estudiado la interacción entre el vector polimérico catiónico PUMan y dos moléculas distintas de ácido desoxirribonucleico: ADN de timo de ternera, ADNct, y el ADN plasmídico Phyco69. Para ello, se ha llevado a cabo un estudio de carácter multidisciplinar, realizándose ensayos para determinar la toxicidad del polímero usado como vector, así como una gran variedad de técnicas de caracterización fisicoquímica (fluorescencia, potencial Z, dispersión de luz dinámica, dicroísmo circular y microscopía de fuerza atómica). En primer lugar se llevaron a cabo dichos ensayos con el ADNct, que es comercial, para comprobar que el vector polimérico PUMan interaccionaba con los ácidos nucleicos. Posteriormente se estudió la formación del poliplejo PUMan/Phyco69 para diseñar y ejecutar un protocolo de transformación genética en la microalga unicelular Chlamydomonas reinhardtii usando este complejo. La importancia de los ensayos realizados en el presente trabajo radica en la posibilidad de optimizar diversos sistemas químicos utilizados como vectores en el campo de la ingeniería genética. Palabras Clave: Polímero, ADN, poliplejo, transformación genética, C. reinhardtii. Abstract: The interactions between the cationic polymer PUMan and two different DNA molecules: calf thymus DNA, ctDNA, and the plasmidic DNA, Phyco69, have been studied in this work. In order to do this, a multidisciplinary study has been carried out. The evaluation of the polymer’s toxicity as well as a complete physicochemical characterization of the polymer/nucleic acid complexes using fluorescence, Z potential, dynamic light scattering, circular dichroism and atomic force microscopy were done. The work began using the commercial ctDNA in order to obtain information about the interactions between PUMan and nucleic acids. Once the formation of PUMan/ctDNA complexes was demonstrated, the PUMan/Phyco69 polyplex was studied and, subsequently, a genetic transformation protocol in the unicellular microalgae Chlamydomonas reinhardtii by using this polyplex was run. The importance of the experiments developed in the present study lies in the possibility of optimizing different chemical systems used as vectors in the field of Genetic Engineering Keywords: Polymer, DNA, polyplex, genetic transformation, C.reinhardtii. Índice 1. Introducción. ...................................................................................................... 1 1.1. Agentes terapéuticos usados en Ingeniería Genética: ácidos nucleicos. ................. 2 1.1.1. ADN plasmídico (ADNp). ..................................................................................................... 3 1.2. Vehiculización del material genético: vectores. ..................................................... 4 1.2.3. Vectores poliméricos. .............................................................................................................. 5 1.3. Empleo de los complejos vector polimérico - ácido nucleico en las células diana. .. 6 1.3.1. Transformación genética. ................................................................................................... 6 1.3.2. Transfección celular. ........................................................................................................... 8 1.4. Relevancia del estudio. ......................................................................................... 9 2. Objetivos. ........................................................................................................ 10 3. Materiales y métodos. ..................................................................................... 11 3.1. Disolventes y tampones empleados. ................................................................... 11 3.2. Preparación de los poliplejos. .............................................................................. 12 3.3. Ácidos nucleicos utilizados. ................................................................................. 12 3.3.1. ADN de timo de ternera (Calf thymus DNA, ADNct). ....................................................... 12 3.3.2. ADN plasmídico. ................................................................................................................ 12 3.4. Polímero catiónico. ............................................................................................. 13 3.4.1. PUMan. .............................................................................................................................. 13 3.5. Medidas de Fluorescencia en estado estacionario. .............................................. 14 3.6. Medidas de potencial zeta. .................................................................................. 15 3.7. Medidas de dicroísmo circular (CD). .................................................................... 16 3.8. Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). ............................................................... 17 3.9. Electroforesis en gel de agarosa. ......................................................................... 18 3.10. Estudio de fitotoxicidad in vivo. ........................................................................... 18 3.11. Transformación genética de Chlamydomonas reinhardtii. ................................... 19 3.11.1. Agitación mediante perlas de vidrio. ........................................................................... 20 4. Resultados y discusión. .................................................................................... 21 4.1. Estudios de fitoxicidad de los vectores poliméricos: ............................................ 21 4.2. Caracterización fisicoquímica de la interacción entre PUMan y el ADNct. ............ 22 4.3. Caracterización fisicoquímica de la interacción entre el vector polimérico PUMan y el plásmido Phyco69. ....................................................................................................... 26 4.4. Ensayos de Ingeniería genética: Transformación genética de C. reinhardtii. ......... 31 5. Conclusiones. ................................................................................................... 33 6. Bibliografía. ..................................................................................................... 34 ANEXOS ................................................................................................................... 39 6 § Polímeros catiónicos y ácidos nucleicos. El interés en utilizar polímeros catiónicos reside en su capacidad de condensar el ADN y en la eficacia que presentan para transportar el ADN a través de la membrana celular (Vijayanathan et al., 2002). Las interacciones entre los polímeros catiónicos y los ácidos nucleicos son fundamentalmente de tipo electrostático, debido a la atracción entre los grupos aniónicos fosfato del esqueleto carbonado del ADN y los grupos cargados positivamente del polímero en cuestión, como por ejemplo, aminas primarias (Tang and Szoka, 1997). La capacidad para formar complejos vector polimérico/ácido nucleico vendrá determinada por la estructura del polímero, su distribución de cargas, la fuerza iónica del medio y pH. En disolución, el polímero catiónico se encuentra en una conformación extendida, pero al interaccionar con el ADN se produce la compactación del mismo, formándose un complejo polímero/ADN, de morfología globular, denominado poliplejo. (Figura 3) (Pack et al., 2005). Figura 3. Representación esquemática de la formación de complejos vector polimérico catiónico/ácido nucleico. 1.3. Empleo de los complejos vector polimérico - ácido nucleico en las células diana. 1.3.1. Transformación genética. La transformación genética consiste en la alteración genética de una célula mediante la introducción de material genético exógeno. Es por tanto, el proceso mediante el cual se 7 consigue modular la expresión de determinados genes con el fin de obtener u optimizar la obtención de un sustrato. • Transformación genética de microalgas: Chlamydomonas reinhardtii. Las microalgas constituyen un grupo diverso de organismos procariotas y eucariotas, encontrándose entre ellas especies con capacidad de generar productos de interés biotecnológico (Apt and Behrens, 1999; Becker, 2004; Yan et al., 2016) como por ejemplo anticuerpos, inmunotoxinas, agentes antimicrobianos (Yan et al., 2016) o biocombustibles entre otros (Ng et al., 2017). Las microalgas son diana de ingeniería genética para optimizar su productividad en la obtención de algún sustrato de interés, así como con el fin de mejorar sus límites de tolerancia medioambiental o incrementar la resistencia a pesticidas y/o a patógenos (Khatoon and Pal, 2015). Chlamydomonas reinhardtii es una especie de microalga fotosintética, unicelular y biflagelada, con un tamaño aproximado de 10 micrómetros que ha sido estudiada durante más de 30 años como modelo en investigaciones en el ámbito de la biología molecular (Figura 4) (Scaife et al., 2015). Figura 4. Incremento del uso de C.reinhardtii como sistema modelo en biología molecular (Scaife et al., 2015) 8 Hay un interés creciente en el uso de Chlamydomonas reinhardtii con propósitos biotecnológicos debido entre otros factores, a la alta rentabilidad económica de la expresión en dicho organismo de proteínas recombinantes. La caracterización completa de los genomas mitocondriales, cloroplásticos y nucleares de este organismo lo convierte en una plataforma ideal para realizar estudios de transformación genética (Pratheesh et al., 2014). Chlamydomonas reinhardtii se caracteriza entre otras cosas por la facilidad para su manipulación en cultivos in vitro, ya que presentan una alta tasa de división y una gran adaptabilidad a diversas condiciones ambientales (Merchant et al., 2010) Por las diversas aplicaciones expuestas, se han diseñado en los últimos años diversos protocolos y metodologías de modificación genética en dicho organismo para mejorar el proceso de transformación genética y conseguir una expresión óptima de los genes de interés. 1.3.2. Transfección celular. La transfección celular es el procedimiento que permite la introducción en una célula animal de material genético exógeno (ya sea ADN o ARN) con el fin de modificarla genéticamente. La transfección celular es una útil herramienta analítica para dilucidar el funcionamiento y regulación de genes de interés, así como para estudiar funciones proteicas (Kim and Eberwine, 2010). Se distinguirá entre una transfección estable (Figura 5.A) y una transfección transitoria (Figura 5.B): - Transfección estable: El material genético introducido generalmente contiene una secuencia marcador que servirá como método de selección. El material genético se integrará en el genoma de la célula diana y éste pasará a la célula hija cuando se produzca la replicación (Glover et al., 2005). - Transfección transitoria: Los genes de interés se expresarán en este caso solo durante un periodo limitado de tiempo y estos no se integrarán en el genoma de la célula huésped (Recillas-Targa, 2006) 9 Figura 5. Diagrama esquemático de los dos modelos de transfección en función de la duración temporal (Kim and Eberwine, 2010). Se distinguen además una gran variedad de técnicas para llevar a cabo el proceso de transfección, realizando una elección del método en función del sistema y el tipo celular que se esté estudiando con el fin de optimizar la eficiencia de este proceso (Kim and Eberwine, 2010): - Métodos biológicos: como por ejemplo, transfección mediada por virus (Pfeifer and Verma, 2001) - Métodos físicos: entre ellos, la microinyección directa, la biobalística, o la electroporación (Mehier-Humbert and Guy, 2005). - Métodos químicos: son los más extendidos para introducir genes en células de mamíferos. Generalmente, se basan en el uso de polímeros catiónicos, lípidos catiónicos o aminoácidos catiónicos para llevar a cabo el proceso de Transfección (Tymms et al, 2003; Holmen et al., 2014). 1.4. Relevancia del estudio. Por todo lo expuesto anteriormente, queda patente la importancia de encontrar vectores con capacidad de formar sistemas estables con los ácidos nucleicos, para posteriormente ser aplicados en distintos ámbitos de la biotecnología, ya sea con un fin terapéutico o con un fin industrial. En el presente trabajo se ha estudiado la interacción del polímero catiónico PU[(MCis)DTDI] (PUMan) con el ADN de timo de ternera (ADNct) y con el plásmido de ADN circular Phyco69, así como su aplicación a la transformación genética de la microalga C. reinhardtii. 10 2. Objetivos. El propósito del proyecto consiste en evaluar si el polímero catiónico PUMan, podría usarse como vector en la formación de poliplejos, con el fin de aplicarlo finalmente a ensayos de ingeniería genética. Se plantean por tanto los siguientes objetivos: a) Realizar la caracterización fisicoquímica de la interacción entre el ADNct y el polímero PUMan. Se inicia el estudio con este sistema porque el ADNct es comercial y mucho más económico que los plásmidos, pero estas investigaciones permitirán comprobar si hay interacción entre el polímero y los ácidos nucleicos. Una vez comprobado que dicha interacción se produce, se pasa a investigar la interacción del polímero con un plásmido cuya expresión en el núcleo celular pueda medirse experimentalmente. b) Realizar la caracterización fisicoquímica de la interacción entre el ADN plasmídico Phyco69 con el polímero PUMan. c) Diseñar y ejecutar un protocolo de ingeniería genética con los complejos, lipoplejos, PUMan/ Phyco69: - Protocolo de transformación genética de la microalga C. reinhardtii 11 3. Materiales y métodos. 3.1. Disolventes y tampones empleados. - Agua desionizada: Se empleó para preparar el tampón HEPES. Se obtuvo gracias al sistema Millipore Milli-Q. Presentó una conductividad inferior a 10-6 S·m-1. - HEPES 10 mM, pH 7,4: Disolución tampón compuesta por ácido 4-(2-hidroxietil) piperazin-1-etanolsulfónico. Se adquirió en la casa comercial Sigma-Aldrich. - Disolución Tris-HCl (1 M): Disolución tampón compuesta por tris(hidroximetil)aminometano. - Disolución TAE 50X: Disolución usada para la preparación del gel de agarosa. - 242g de Tris, 57,1 mL de Ácido acético; 100 mL de solución EDTA 0,5 M pH 8,0; 900 mL de H2O; pH 8,5. - Medio TAP: Se utilizó para cultivar la microalga C. reinhardtii y para realizar los ensayos de fitotoxicidad. Se prepara a partir de las siguientes disoluciones (Stern et al., 2008) o Disolución Tris (1M): 121 g·L-1. o Disolución A (por litro): 5 g de CaCl2·2H2O, 10 g de MgSO4·7H2O y 40 g de NH4Cl. o Disolución B (por litro): 115 g de K2PO4 y 6 g de KH2PO4. o Disolución de Hutner (Hunter, 1950). o Para preparar el medio TAP se dispone de las siguientes cantidades por litro: § 10 mL de la disolución A. § 1 mL de la disolución B. § 20 mL de la disolución de Tris 1M. § 1 mL de la disolución de Hutner. § 0.95 mL de ácido acético glacial. § Agar al 1.5% (para cultivos sólidos). 12 3.2. Preparación de los poliplejos. En este estudio los poliplejos se prepararon mezclando los polímeros con los ácidos nucleicos, manteniendo invariante en cada ensayo la concentración de ácido nucleico y añadiendo cantidades crecientes de polímero con el objetivo de obtener un buen intervalo de valores de ratio N/P (Ecuación 1). El ratio N/P hace referencia a la relación entre el número de grupos amina del polímero (N; grupos catiónicos) respecto a los fosfatos del ácido nucleico (P, grupos aniónicos) (Cheraghi et al., 2017): !!𝐍 𝐏= !! Polímero! ( µg ) ·nº!cargas! ( + ) !en!la!subunidad!repetida Subunidad!repetida!del!polímero! ( Pm ) ADN! ( µg ) ·nº!cargas! ( − ) !Pm!ADN !!!!!!!!!(1) El Peso molecular del ADN es de 618 g/mol por par de bases. El ADN se considera que tiene carga -2 por cada 618 g (Muñoz-Úbeda et al., 2011). 3.3. Ácidos nucleicos utilizados. 3.3.1. ADN de timo de ternera (Calf thymus DNA, ADNct). Para llevar a cabo los ensayos previos de caracterización fisicoquímica de los complejos ADN-polímero catiónico se usó ADN de timo de ternera (ADNct), comprado en la casa comercial Sigma-Aldrich. En todos los ensayos se añadió una cantidad de ADN final tal que la concentración fuese 1.854·10-2 g L-1 (3·10-5 M). 3.3.2. ADN plasmídico. Una vez concluidos los ensayos con ADNct, se pasó a la realización de los estudios utilizando el plásmido Phyco69, de 4846 pb (Anexo I) que presenta como marcadores selectivos para su seguimiento los genes de resistencia a los antibióticos ampicilina y paranomicina. 13 • Phyco69. Este plásmido fue el empleado para llevar a cabo la transformación genética de la microalga Chlamydomonas reinhardtii. En cada uno de los experimentos de caracterización físicoquímica, la concentración final de Phyco69 fue de 1.854·10-2 g·L.1 (3·10-5 M). En los ensayos de transformación genética, se utilizó una concentración final de 1.4·10-3 g·L-1 (2.265·10-6 M) del plásmido Phyco69. 3.4. Polímero catiónico. Para formar los distintos poliplejos se utilizó como vector un polímero catiónico derivado del azúcar manitol (Apartado 3.4.1) - PU[(MCis)DTDI]: PUMan. Figura 6. Poliuretano derivado de Manitol (PUMan). El polímero catiónico fue sintetizado en el laboratorio de la Profesora Mª de Gracia García Martín, por la Dr. Lucía Romero Azogil y la Dr. Elena María Benito Hernández (Romero-Azogil, 2018), pertenecientes al departamento de Química Orgánica y Farmaceútica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. 3.4.1. PUMan. Tiene un peso molecular de Mw = 3500 g·mol-1, estimado mediante 1H-RMN. Presenta una carga neta por cada subunidad monomérica de Q=+4 a pH fisiológico. 14 3.5. Medidas de Fluorescencia en estado estacionario. La fluorescencia es el proceso mediante el cual una molécula, tras ser excitada con radiación electromagnética, libera parte del exceso de la energía absorbida en forma de fotones para poder relajarse a su estado fundamental (Skoog et al., 2004). Para estudiar la capacidad de compactación del ADN con el polímero catiónico PUMan se utilizó un compuesto con propiedades fluorescentes: el reactivo Bromuro de 3,8diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio, también denominado Bromuro de Etidio (EB) (Mishra et al., 2016). Este reactivo se adquirió en Sigma-Aldrich (Riqueza > 95%). La interacción entre los ácidos nucleicos y el Bromuro de Etidio se produce mediante intercalación. Por este motivo, al EB se le atribuye la propiedad de agente intercalante (Lepecq et al., 1967; Zhang et al., 2012). El EB emite fluorescencia cuando es irradiado a una longitud de onda de 480nm, siendo a 589nm la longitud de onda a la cual la emisión de energía alcanza su valor máximo (Ozluer et al., 2014; Zhu et al., 2014). La capacidad del EB de emitir fluorescencia es mayor cuando se encuentra intercalado entre los pares de bases del ADN que cuando se encuentra en disolución acuosa. Por este motivo, se puede utilizar el EB para obtener información sobre las interacciones entre el ADN y otras moléculas mediante ensayos competitivos. Si al añadir una especie a la disolución ADN+EB se produce una disminución de la emisión de fluorescencia del EB, ello nos indica que está siendo desplazado hacia la disolución al interaccionar el ácido nucleico con la especie añadida (Zhu et al., 2014). Para realizar las medidas se utilizó un espectrofluorímetro Hitachi F-2500, con una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz. Las medidas se realizaron a una temperatura constante de 303.0 ± 0.1K ya que se conectó la celda de medida a un criostato Lauda mediante un flujo de agua. Cada valor representa la media de 3 mediciones. Todas las disoluciones se prepararon utilizando HEPES 10 mM, manteniendo unas concentraciones finales fijas de EB de 2.43·10-6 M y de ácidos nucleicos (tanto de ADNct 15 como de ADNp) de 3·10-5 M. Las concentraciones de los distintos polímeros catiónicos se fueron variando para abarcar un intervalo amplio de ratios N/P. Las condiciones experimentales para las experiencias fluorimétricas fueron: lexcitación: 480nm; lemisión: 590nm; Rendijas de excitación y emisión: 5nm; Voltaje de la lámpara: 400V. 3.6. Medidas de potencial zeta. El potencial zeta es la diferencia de potencial eléctrico a través de la capa iónica alrededor de un ion coloidal o macromolécula cargada en disolución. Representa la intensidad del campo eléctrico estático existente entre la doble capa formada por el límite de la partícula medida y el medio que la rodea. Las medidas de potencial Z se realizaron con un Zetasizer Nano ZS Malvern Instrument, que emplea un velocímetro Doppler láser (LVD) para medir la movilidad electroforética de la muestra a partir de la velocidad de las partículas. Se utilizó una celda capilar de policarbonato DTS1070. La temperatura se mantuvo constante mediante un sistema Peltier. Este equipo se encuentra en los Servicios Generales de Caracterización Funcional, ubicado en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). (Figura 7) (Zetasizer Nano SeriesManual, 2004). Figura 7. a) Representación gráfica de la variación del valor de Potencial Z en función del pH; b) Representación esquemática de una celda de medida de Potencial Z. 22 Se realizó un seguimiento de la viabilidad celular a las 24h, 48h y 72h, en presencia de diversas cantidades del polímero catiónico PUMan, que se usará como vector catiónico. Como se observa en la Figura 9, el polímero catiónico PUMan es fitotóxico a altas concentraciones pero presenta inocuidad a menores valores, sin llegar a comprometer la supervivencia del microorganismo. Así pues, teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se trabajará en un rango de concentraciones de PUMan no nocivo para el microorganismo para así optimizar así el proceso de transformación de C.reinhardtii. 4.2. Caracterización fisicoquímica de la interacción entre PUMan y el ADNct. La interacción entre el ADN y los polímeros catiónicos se produce mediante el enrollamiento de estos últimos sobre la superficie de la doble hélice, tras la neutralización de las cargas por la interacción de los grupos fosfato del polinucleótido con la cargas positivas del polímero catiónico (Dinçer et al., 2005). Este enrollamiento produce la formación de complejos que condensan a la molécula de ADN en forma toroidal [20]. Los complejos formados reciben el nombre de poliplejos. El estudio fisicoquímico de las interacciones ADN/PUMAN se comenzó usando como ácido nucleico el ADNct. ara ello se realizó una serie de ensayos, añadiendo concentraciones crecientes de PUMan y manteniendo constante la concentración de ADNct. En primer lugar, como se expone a continuación, se llevó a cabo el seguimiento de la intensidad de emisión de fluorescencia de la sonda EB. Esta sonda fluorescente consigue intercalarse entre los pares de bases del polinucleótido mediante interacción no covalente, dada la estructura aromática y plana que posee. Cuando el EB se encuentra entre las bases del ADN, estará inmerso en un ambiente hidrofóbico y presenta una intensidad de fluorescencia mayor que cuando se encuentra 23 en el seno de la disolución. La interacción con el ADN atenúa los modos de desactivación no radiativa (Cosa et al., 2004). Figura 10. Variación de I/I0 a una l589 de la sonda fluorescente EB, respecto a la relación N/P (PUMan/ADNct), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; [EB]f=2.43·10-6 M; T=298K. Como se observa en la Figura 10, a medida que se produce un aumento en la relación N/P (se incrementa el contenido del polímero catiónico en la disolución), la intensidad de emisión de fluorescencia experimenta un decaimiento, aproximándose progresivamente al valor de la intensidad de fluorescencia que presenta el EB en disolución acuosa (en ausencia de ADNct; línea continua en color rojo). Los datos obtenidos en este experimento indican que, en ausencia de polímero, el EB se encuentra interaccionando con el ADNct ya que al encontrarse inmerso en un medio apolar presenta una mayor capacidad de emitir fluorescencia tras ser irradiado a una longitud de onda de 480 nm. A medida que se va añadiendo mayor cantidad de polímero catiónico PUMan (aumento del rango de N/P), el polímero interacciona mediante fuerzas electrostáticas con el 24 ADNct y esto provoca un desplazamiento progresivo del EB desde el ADNct a la disolución. Esto explicaría la disminución de la intensidad de fluorescencia observada en la Figura 10. Sin embargo, parece ser que no todo el EB es desplazado del material genético al seno de la disolución, ya que a pesar de que parece producirse la interacción entre PUMan/ADNct, el valor de I/I0 obtenido a relaciones N/P altas no llega a equipararse al valor de la intensidad de emisión que presenta la sonda fluorescente en disolución acuosa. A continuación se procedió a investigar en mayor profundidad la naturaleza del poliplejo formado. Para ello, se realizó un estudio de la variación del potencial Z y del tamaño del poliplejo formado con la relación N/P. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 11. Figura 11. Potencial Zeta y tamaño de partícula del complejo PUMan/ADNct a diferentes relaciones N/P (PUMan/ADNct), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. El punto de electroneutralidad a partir del cual el poliplejo presenta una carga neta positiva, se alcanza a unos valores de N/P de en torno a 6. 25 En cuanto al tamaño del complejo PUMan/ADNct formado, el incremento de la concentración de PUMan origina un aumento del tamaño del poliplejo como consecuencia de la disminución de las repulsiones electrostáticas, lo que permite que dichos complejos formen agregados dispersos. Figura 12. Espectro de dicroísmo circular del ADNct a distintos rangos de N/P (PUMan/ADNct), en disolución acuosa de HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Para complementar los datos anteriores, se obtuvo el espectro de dicroísmo circular del ADNct y se comparó con los espectros del poliplejo PUMan/ADNct a distintos, valores de N/P. Los espectros aparecen en la Figura 12. En el caso de ADNct puro (N/P:0), se pueden observar las dos bandas características del ADN de doble hebra en su forma B (negativa, a una longitud de onda de 247 nm y positiva, a una longitud de onda de 278 nm). A medida que aumenta la relación N/P, la intensidad de la banda positiva (correspondiente a las interacciones debidas al apilamiento de bases) disminuye, y a valores elevados de N/P prácticamente desaparece. Esto nos indica que se está produciendo una interacción entre el polímero PUMan y el ADNct que está originando un cambio conformacional en el mismo. -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 225 250 275 300 q/mdeg l/nm PUMan/ADNct N/P 0 N/P 1,2 N/P 2,1 N/P 2,9 N/P 11,6 N/P 21,4 26 4.3. Caracterización fisicoquímica de la interacción entre el vector polimérico PUMan y el plásmido Phyco69. Una vez finalizados los ensayos entre el vector catiónico PUMan y el ADNct, se pasó a realizar el estudio del poliplejo formado por PUMan y el plásmido Phyco69. Figura 13. Variación de I/I0 a una l589 de la sonda fluorescente EB, respecto a la relación N/P (PUMan/Phyco69), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; [EB]=2.43·10M; T=298K. Para ello se comenzó estudiando los cambios en la intensidad de emisión de fluorescencia del EB en una disolución en presencia de plásmido, cuando se añadía el polímero, para distintos valores de N/P. Al igual que en el caso de PUMan/ADNct (Figura 13), se produce un decaimiento de la emisión de fluorescencia con el aumento de N/P. Sin embargo, en este caso el valor el valor de la intensidad de emisión de fluorescencia llega a alcanzar el valor que presenta cuando el EB se encuentra en la disolución. Es decir, a altos valores de N/P todo el EB presente ha sido totalmente desplazado desde su lugar de intercalación entre los pares de bases del nucleótido hacia la disolución. Esto 27 podría deberse a que la interacción del polímero catiónico PUMan con el ADN plasmídico produce cambios conformacionales de la estructura del ADN-B mayores a los producidos en el ADNct. Para seguir avanzando en el estudio de la interacción entre el PUMan y el Phyco69, se realizaron medidas de potencial Zeta y de tamaño de partícula de PUMan/Phyco69, a diferentes valores de N/P. Figura 14. Potencial Z y tamaño de partícula del complejo PUMan/Phyco69 a diferentes relaciones N/P (PUMan/Phyco69), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Como se puede ver en la Figura 14, se observa que el potencial Zeta sigue una tendencia sigmoidal, produciéndose la electroneutralidad para un valor de N/P de en torno a 15 y dándose la inversión total de carga para valores altos de N/P. Es un comportamiento semejante al encontrado para los poliplejos PUMan/ADNct. En cuanto al tamaño, para un valor de N/P=0 (Phyco69 en ausencia de PUMan) se observa un tamaño pequeño, lo que concuerda con la naturaleza del material genético 28 estudiado en este ensayo, ya que el plásmido Phyco69 presenta un tamaño mucho menor que el ADNct. Conforme la relación N/P se va a aproximando al punto en el que el potencial Z es cero, el tamaño va aumentando. Un aumento posterior de N/P resulta en una disminución del tamaño del poliplejo. Estas últimas observaciones pueden explicarse si se tiene en cuenta que cuando los poliplejos tienen carga cero se pueden producir procesos de agregación entre los mismos. Una vez la carga pasa a ser positiva y aumenta, las repulsiones electrostáticas evitan la formación de estos agregados. Otra técnica que proporciona información acerca de las interacciones entre polinucleótidos y diferentes especies es la electroforesis. La Figura 15 muestra los resultados obtenidos cuando se realizaron experimentos en gel de agarosa para diferentes valores de N/P. Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa de Phyco69 digerida con la enzima EcoRI para distintas relaciones N/P. Se observa que el plásmido Phyco69 en ausencia de PUMan presenta una banda característica a 4846 pb, que se ha desplazado hacía el polo positivo, como es de esperar si se considera la carga negativa del plásmido. A medida que aumenta N/P, este desplazamiento es cada vez menor, hasta que permanece sin moverse para valores de 29 N/P³10,7. Esto se debe a que las moléculas positivamente cargadas de polímero se asocian al plásmido de carácter aniónico, disminuyendo su carga negativa y llegando a producir una inversión de carga, como han mostrado los datos de potencial Z. Una vez el poliplejo adquiere una carga positiva, no se desplaza hacia el polo positivo. Con el fin de investigar los posibles cambios conformacionales causados en el plásmido de doble hebra Phyco69 cuando interacciona con el polímero, se registraron los espectros de dicroísmo circular para distintos valores de N/P (ver la Figura 16). Figura 16. Espectro de dicroísmo circular del ADNct a distintos rangos de N/P (PUMan/Phyco69), en disolución acuosa de HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. En la Figura 16 se observa una disminución progresiva de la intensidad de la banda positiva, correspondiente al apilamiento de bases, a medida que aumenta el valor de N/P. Además, se produce la desaparición de la banda negativa, asociada a la supraestructura de la molécula, para valores elevados de N/P. Esto parece indicar un cambio conformacional del plásmido, que podría producirse debido a la compactación del mismo al formarse el poliplejo PUMan/ Phyco69. Para comprobar si esta hipótesis es acertada, se realizaron medidas de microscopía de fuerza atómica, AFM, que permiten la visualización de los poliplejos a diferentes valores de N/P. Las imágenes obtenidas utilizando AFM aparecen en la Figura 17. -5 -3 -1 1 3 5 225 250 275 300 q/mdeg l/nm Phyco69/PUMan Phyco69 N/P 1,2 N/P 3,2 N/P 6,4 N/P 12,9 N/P 64,3 30 Figura 17. Imágenes topográficas de AFM de disoluciones de PUMan/Phyco69 con distinto rango de N/P en HEPES 10 mM pH 7,4. Los poliplejos de adsorbieron sobre una superficie de mica modificada con APTES. Como puede verse, para una relación N/P=0 (ausencia de polímero catiónico), el plásmido Phyco69 adopta una conformación extendida, de acuerdo con lo esperado para una conformación B de un ácido nucléico de doble hebra. Sin embargo, a medida, que la relación N/P va aumentando, se observa una compactación gradual del plásmido, hasta llegar a formar estructuras compactas de forma globular. Así, para un valor de N/P=64,3 se puede observar una compactación completa del Phyco69, lo que apoya la hipótesis realizada con los resultados de dicroísmo circular. N/P=0 4.64 nm 0.13 nm 150nm N/P=0 7.44 nm 0.00 nm 150nm N/P=1,2 6.42 nm 0.01 nm 260nm N/P=64,3 31 4.4. Ensayos de Ingeniería genética: Transformación genética de C. reinhardtii. En base a los resultados obtenidos en los ensayos de caracterización fisicoquímica de los poliplejos formados, se diseñó y ejecutó un protocolo de transformación genética de C. reinhardtii. Para ello se eligieron valores de N/P de 5,3 y de 10,7, que corresponderían a un poliplejo ligeramente negativo y ligeramente positivo, respectivamente. Los experimentos, además, se han realizado en presencia y ausencia de polietilenglicol (PEG) (Figura 18), que es un poliéter que aumenta la estabilidad de los poliplejos formados y facilita la liberación del material genético en el interior de la célula. Figura 18. Número de colonias transformantes obtenidas tras las transformación de C.reinhardtii. A) PUMan/Phyco69 en presencia de PEG; B) PUMan/Phyco69 en ausencia de PEG. Cada medida corresponde al valor medio de tres medidas. Como se observa en la Figura 18.A, al realizar la transformación genética utilizando PEG en ausencia de PUMan, se obtiene un número elevado de colonias transformantes (Ver Figura 18.B) Sin embargo, al realizar el mismo ensayo pero añadiendo además polímero catiónico, el número de colonias transformantes se va reduciendo gradualmente a medida que aumenta el rango N/P. La Figura 18.B, muestra que al realizar la transformación en ausencia de PEG, se observa el efecto contrario, ya que se obtiene mayor cantidad de colonias transformantes conforme va aumentando el valor N/P. A la luz de estos resultados parece ser que la presencia simultánea de PEG/PUMan tiene un efecto antagonista en términos de eficiencia en el proceso de transformación de C.reinhartdii. 38 - Zhu J, Chen L, Dong Y, Li J, Liu X. Spectroscopic and molecular modeling methods to investigate the interaction between 5-Hydroxymethyl-2furfural and calf thymus DNA using ethidium bromide as a probe. Mol Biomol Spectrosc. 2014; 124-78-83. 39 ANEXOS 40 Anexo I (AI). Plásmido Phyco69: 41 Anexo II (AII). Desglose de Figuras: Figura 1: Representación esquemática del ADN: a) Fragmento lineal, con bucle cerrado y con topologías superenrollada; b) ADN plasmídico superenrollado. Figura 2: a) Distintos vectores que pueden ser utilizados para introducir ácidos nucleicos en el interior celular; b) Propiedades óptimas que deben presentar los vectores diseñados sintéticamente para optimizar los ensayos de terapia génica. Figura 3: Representación esquemática de la formación de complejos vector polimérico catiónico/ácido nucleico. Figura 4: Incremento del uso de C.reinhardtii como sistema modelo en biología molecular. Figura 5: Diagrama esquemático de los dos modelos de Transfección en función de la duración temporal. Figura 6: Poliuretano derivado de Manitol (PUMan). Figura 7: a) Representación gráfica de la variación del valor de Potencial Z en función de pH; b) Representación esquemática de una celda de medida de potencial Z. Figura 8: Proceso detallado de la preparación de muestras para la visualización mediante AFM. Figura 9: Ensayo de fitotoxicidad de Chlamydomonas reinhardtii en presencia del polímero catiónico PUMan tras un tiempo de exposición de 1 semana. Figura 10: Variación de I/I0 a una l589 de la sonda fluorescente EB, respecto a la relación N/P (PUMan/ADNct), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; [EB]f=2.43·10-6 M; T=298K. 42 Figura 11: Potencial Zeta y tamaño de partícula del complejo PUMan/ADNct a diferentes relaciones N/P (PUMan/ADNct), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Figura 12: Espectro de dicroísmo circular del ADNct a distintos rangos de N/P (PUMan/ADNct), en disolución acuosa de HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Figura 13: Variación de I/I0 a una l589 de la sonda fluorescente EB, respecto a la relación N/P (PUMan/Phyco69), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; [EB]=2.43·10M; T=298K. Figura 14: Poencial Z y tamaño de partícula del complejo PUMan/Phyco69 a diferentes relaciones N/P (PUMan/Phyco69), en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Figura 15: Electroforesis en gel de agarosa de Phyco69 digerida con la enzima EcoRI para distintas relaciones N/P. Figura 16: Espectro de dicroísmo circular del ADNct a distintos rangos de N/P (PUMan/Phyco69), en disolución acuosa de HEPES 10 mM, pH 7,4. [ADNct]=3·10-5 M; T=298K. Figura 17: Imágenes topográficas de AFM de disoluciones de PUMan/Phyco69 con distinto rango de N/P en HEPES 10 mM pH 7,4. Los poliplejos de adsorbieron sobre una superficie de mica modificada con APTES. Figura 18: Número de colonias transformantes obtenidas tras las transformación de C.reinhardtii. A) PUMan/Phyco69 en presencia de PEG; B) PUMan/Phyco69 en ausencia de PEG. Cada medida corresponde al valor medio de tres medidas. 43 Figura 19: Placas de colonias transformantes de C.reinhardtii. A) Control negativo; B) Control positivo; C) N/P 5,3 PUMan/Phyco69 con PEG; D) N/P 10,7 PUMan/Phyco69 con PEG; E) N/P 5,3 PUMan/Phyco69 sin PEG; F) N/P 10,7 PUMan/Phyco69 sin PEG.