Caracterización de los sistemas de Quorum Sensing en rizobios. Importancia durante el dialógo molecular en la simbiosis rizobio-leguminosa.

Departamento de Microbiología Facultad de Biología Caracterización de los sistemas de Quorum Sensing en rizobios. Importancia durante el dialógo molecular en la simbiosis rizobio-leguminosa. Francisco Pérez Montaño Sevilla, 2012 Departamento de Microbiología Facultad de Biología Caracterización de los sistemas de Quorum Sensing en rizobios. Importancia durante el dialógo molecular en la simbiosis rizobio-leguminosa. Memoria presentada por el Licenciado en Biología Francisco Pérez Montaño para optar al grado de Doctor. Sevilla, 2012 Departamento de Microbiología Facultad de Biología LOS DIRECTORES DE LA TESIS Fdo. Dra. Rosario Espuny Gómez y Dr. Ramón Bellogín Izquierdo Profesores Titulares Departamento de Microbiología Universidad de Sevilla Fdo. Francisco Pérez Montaño Mi agradecimiento al Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España y a la Universidad de Sevilla por haber hecho posible la realización de este trabajo. “Es imposible determinar simultáneamente y con exactitud, la posición y la velocidad de un electrón” Principio de Incertidumbre Werner Heisenberg ÍNDICES ÍNDICE I.- INTRODUCCIÓN ............................................................................ 1 1.1.- Comunicación celular: Quorum Sensing ...................................................... 3 1.2.- Mecanismos Moleculares del QS ................................................................... 5 1.2.1.- Autoinductores ............................................................................................... 5 1.2.1.1.- N-acil homoserina lactonas...................................................................... 6 1.2.1.2.- Autoinductor-2 ........................................................................................ 8 1.2.1.3.- Dipéptidos cíclicos .................................................................................. 9 1.2.1.4.- Bradyoxetina ........................................................................................... 10 1.2.1.5.- Alquil-quinolonas .................................................................................... 11 1.2.1.6.- Otros tipos de AI ..................................................................................... 12 1.2.2.- Sintasas de autoinductores ............................................................................. 13 1.2.2.1.- Sintasas de AHL ...................................................................................... 13 1.2.2.2.- Sintasas de AI-2 ....................................................................................... 15 1.2.2.3.- Sintasas de otro tipos de AI ..................................................................... 16 1.2.3.- Reguladores del Quorum Sensing .................................................................. 17 1.2.3.1Reguladores de tipo LuxR ........................................................................ 17 1.2.3.2.- Reguladores de tipo LuxP/Q ................................................................... 17 1.2.4.- Regulación negativa del Quorum Sensing ..................................................... 18 1.2.4.1.- Proteínas antiactivadoras ......................................................................... 18 1.2.4.2.- Proteínas homólogas a los reguladores de tipo LuxR ............................. 19 1.2.4.3.- Enzimas que degradan la AHL ................................................................ 20 1.2.4.4.- Represión mediante ARNi ....................................................................... 20 1.3.- Biosensores bacterianos de QS ....................................................................... 21 1.3.1.- Chromobacterium violaceum CV026 ......................................................... 21 1.3.2.- Agrobacterium tumefaciens NT1 (pZRL4) ................................................ 22 1.3.3.- Escherichia coli JM109 (pSB536) ............................................................. 22 1.3.4.- Biosensores que expresan la enzima lactonasa .......................................... 23 1.4.- Simbiosis entre bacterias fijadoras de nitrógeno y leguminosas ................ 23 1.4.1.- Bacterias fijadoras de nitrógeno ................................................................. 24 1.4.2.- Fases de la simbiosis .................................................................................. 25 1.4.2.1.- Colonización de raíces y formación de biofilm ................................... 26 1.4.2.2.- La infección y el desarrollo del nódulo ............................................... 28 1.4.2.3.- Fijación biológica de nitrógeno ........................................................... 31 1.4.3.- Bases moleculares de la interacción simbiótica ......................................... 32 1.4.3.1.- Los flavonoides .................................................................................... 33 1.4.3.2.- Los factores de nodulación .................................................................. 36 1.4.3.3.- Los polisacáridos de superficie ............................................................ 37 1.4.3.4.- El sistema de secreción de tipo III ....................................................... 37 1.5.- QS en bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno ..................................... 38 1.5.1.- Rhizobium leguminosarum ......................................................................... 40 1.5.1.1.- cinI y cinR ............................................................................................ 40 1.5.1.2.- raiI y raiR ............................................................................................ 42 1.5.1.3.- rhiI y rhiR ............................................................................................ 42 1.5.1.4.- traI y traR ............................................................................................ 42 1.5.1.5.- otros reguladores de tipo luxR ............................................................. 43 1.5.2.- Rhizobium etli ............................................................................................. 44 1.5.2.1.- cinI y cinR ............................................................................................ 44 1.5.2.2.- raiI y raiR ............................................................................................ 45 1.5.2.3.- traI y traR ............................................................................................ 46 1.5.3.- Rhizobium sp. NGR234 .................................................................................. 46 1.5.3.1.- traI y traR ............................................................................................ 47 1.5.3.2.- ngrI y ngrR .......................................................................................... 48 1.5.4.- Sinorhizobium meliloti ................................................................................... 48 1.5.4.1.- sinI y sinR ............................................................................................ 48 1.5.4.2.- Sistema mel .......................................................................................... 49 1.5.4.3.- traI y traR .................................................................................................... 50 1.5.4.- Bradyrhizobium japonicum ............................................................................ 50 1.6.- Interferencia en los sistemas de QS bacteriano ............................................ 50 1.6.1.- Furanonas halogenadas ............................................................................... 51 1.6.2.- L-canavanina ............................................................................................... 52 1.6.3.- Opinas ......................................................................................................... 52 1.6.4.- Flavonoides ................................................................................................ 53 1.6.5.- Hormonas humanas .................................................................................... 54 1.6.6.- Otros que interfieren en los sistemas de QS .............................................. 55 2.- OBJETIVOS ..................................................................................... 57 3.- MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 61 3.1.- Bacterias, plásmidos y medios de cultivo ...................................................... 63 3.1.1.- Bacterias y plásmidos ................................................................................. 63 3.1.2.- Medios de cultivo para Sinorhizobium, Rhizobium y Agrobacterium ........ 66 3.1.3.- Medios de cultivo para Escherichia coli y Chromobacterium violaceum CV026 .................................................................................................................... 67 3.1.4.- Agentes selectivos e identificativos ........................................................... 68 3.1.5.- Flavonoides ................................................................................................ 68 3.1.6.- Medidas de pH y espectrofotométricas ...................................................... 69 3.1.7.- Solución de congelación ............................................................................. 69 3.2.- Técnicas microbiológicas ................................................................................ 69 3.2.1.- Métodos de transferencia de ADN entre bacterias ..................................... 69 3.2.1.1.- Conjugación ......................................................................................... 69 3.2.1.2.- Transformación de Escherichia coli .................................................... 70 3.2.2.- Determinación de la actividad β-galactosidasa .......................................... 71 3.2.3.- Visualización de exopolisacáridos (EPS) ................................................... 73 3.2.4.- Estudio del lipopolisacárido (LPS) ............................................................. 73 3.2.4.1.- Extracción del LPS .............................................................................. 73 3.2.4.2.- Electroforesis del LPS ......................................................................... 74 3.2.4.3.- Tinción del LPS ................................................................................... 74 3.2.5.- Estudio de las proteínas extracelulares ....................................................... 75 3.2.5.1.- Extracción de las proteínas extracelulares ........................................... 75 3.2.5.2.- Electroforesis de las proteínas ............................................................. 75 3.2.5.3.- Tinción de las proteínas con plata ....................................................... 76 3.2.6.- Estudios de la movilidad bacteriana ........................................................... 77 3.2.7.- Estudios de la formación de biofilm bacteriano ......................................... 77 3.3.- Métodos de biología molecular ...................................................................... 78 3.3.1Extracción de ADN genómico .................................................................... 78 3.3.2.- Extracción de ADN plasmídico .................................................................. 78 3.3.3.- Restricción del ADN .................................................................................. 79 3.3.4.- Electroforesis del ADN .............................................................................. 80 3.3.5.- Aislamiento del ADN de geles de agarosa ................................................. 80 3.3.6.- Desfosforilación del ADN .......................................................................... 80 3.3.7.- Conversión de extremos cohesivos en romos ............................................. 81 3.3.8.- Ligación del ADN ...................................................................................... 81 3.3.9.- Amplificación del ADN por PCR .............................................................. 82 3.3.10.- Cuantificación de la expresión de genes mediante qPCR ........................ 82 3.3.11.- Hibridación ADN/ADN ........................................................................... 84 3.3.11.1.- Transferencia del ADN a filtros de nylon .......................................... 85 3.3.11.2.- Marcaje de la sonda ........................................................................... 85 3.3.11.3.- Hibridación de la sonda al ADN del filtro ......................................... 86 3.3.11.4.- Detección inmunológica .................................................................... 86 3.3.12.- Secuenciación del ADN ........................................................................... 87 3.3.13.- Análisis informático de secuencias de ADN y proteínas ......................... 88 3.3.14.- Análisis por qPCR .................................................................................... 88 3.4.- Métodos utilizados para los estudios con las plantas ................................... 88 3.4.1.- Plantas ........................................................................................................ 89 3.4.2.- Soluciones nutritivas para las plantas ......................................................... 89 3.4.3.- Desinfección y germinación de semillas .................................................... 89 3.4.4.- Inoculación y cultivo de plantas ................................................................. 90 3.4.5.- Ensayos de nodulación y colonización ....................................................... 91 3.4.5.1.- Secado de la parte aérea de la planta ................................................... 92 3.5.- Técnicas para el estudio de los sistemas de QS bacteriano ......................... 92 3.5.1.- Obtención de AI de los sobrenadantes de cultivos bacterianos .................. 92 3.5.2.- Ensayos de detección de AI ........................................................................ 92 3.5.3.- Extracción y separación de AI mediante cromatografía en capa fina (TLC) 3.5.4.- Detección de AI en cromatoplacas ............................................................. 93 3.5.5.- Análisis por HPLC ..................................................................................... 93 3.5.4.1.- Separación y cuantificación de AI ....................................................... 93 3.5.4.2.- Determinación estructural de los AI mediante espectrometría de masas ............................................................................................ 94 3.6.- Técnicas para el estudio de la interferencia del QS bacteriano .................. 95 3.6.1.- Obtención de material vegetal: exudados de semilla y raíces, extractos de semilla y raíces de plantas ..................................................................................... 95 3.6.2.-Ensayos para la detección de moléculas que interfieren ............................ 96 en el QS bacteriano ................................................................................................ 96 3.6.3.- Cromatografía en capa fina ........................................................................ 97 3.6.4.- Análisis por HPLC ..................................................................................... 98 3.6.4.1.- Separación y cuantificación de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano ........................................................................................................ 98 3.6.4.2.- Determinación estructural de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano mediante espectrometría de masas ..................................................... 98 3.7.- Técnicas microscópicas ................................................................................... 100 3.7.1.- Microscopía confocal ................................................................................. 101 3.7.2.- Microscopía de epifluorescencia ................................................................ 101 3.7.3.- Microscopía electrónica de barrido (MEB) ................................................ 102 3.8.- Análisis estadístico .......................................................................................... 103 4.- RESULTADOS ................................................................................ 105 4.1.- Caracterización de los sistemas de QS .......................................................... 108 4.1.1.- Detección y cinética de producción de AI .................................................. 108 4.1.2.- Cromatografía en capa fina (TLC) ............................................................. 109 4.1.3.- Análisis estructural de los AI ..................................................................... 110 4.1.4.- Detección, aislamiento y secuenciación de genes de síntesis de AI ........... 121 4.1.5.- Mutación de los genes de síntesis de AI y del gen nodD1 de S. fredii SMH12 ......................................................................................................... 123 4.1.5.1.- Mutagénesis dirigida de traI de S. fredii SMH12 ................................ 125 4.1.5.2.- Mutagénesis dirigida de nodD1 de S. fredii SMH12 ........................... 127 4.1.5.3.- Mutagénesis dirigida de raiI de R. etli ISP42 ...................................... 128 4.1.6.- Obtención de estirpes de rizobios defectivas en la producción de AHL .... 132 4.1.7.- Determinación del AI sintetizado por cada gen de síntesis de AHL .......... 134 4.2.- Influencia de los flavonoides e la producción global de AI y en la expresión de genes de síntesis de AI ............................................................................................. 138 4.2.1.- Efecto de distintos flavonoides sobre la expresión de genes de nodulación .................................................................................................. 138 4.2.2.- Influencia de flavonoides en la producción de AI ...................................... 140 4.2.2.1.- Ensayos de difusión en placa ............................................................... 140 4.2.2.2.- Ensayos de actividad β–galactosidasa del biosensor NT1 (pZRL4) inducido con sobrenadantes bacterianos obtenidos en presencia y ausencia de flavonoides ................................................................................................................ 142 4.2.2.3.- Análisis mediante TLC de los AI producidos por las estirpes en presencia y ausencia de los flavonoides inductores de los genes de nodulación ....................... 143 4.2.2.4.- Ensayos de actividad β–galactosidasa con fracciones obtenidas por HPLC 4.2.2.5.- Análisis mediante espectrometría de masas ........................................ 145 4.2.2.6.- Cuantificación mediante qPCR de la expresión de genes .................. 149 de síntesis de AI ................................................................................................. 150 4.2.3.- Curvas de crecimiento ................................................................................ 152 4.3.- Papel de los sistemas de QS en la simbiosis con la leguminosa ................... 154 4.3.1.- Fenotipos simbióticos ................................................................................. 154 4.3.2.- Influencia de flavonoides inductores de los genes de nodulación sobre el gen traI en diferentes fondos genéticos de SMH12 ..................................................... 157 4.3.3.- Proteínas extracelulares .............................................................................. 159 4.3.4.- Polisacáridos superficiales: Exopolisacáridos y Lipopolisacáridos ........... 161 4.3.5.- Movilidad bacteriana tipo swimming ......................................................... 161 4.3.6.- Biofilm ........................................................................................................ 165 4.3.6.1.- Estudio de la adhesión a superficies abióticas ..................................... 165 4.3.6.2.- Estudios del desarrollo del biofilm mediante microscopía confocal ... 166 4.3.7.- Estudios de la colonización de raíces mediante microscopía de epifluorescencia y microscopía electrónica de barrido .......................................... 169 4.3.8.- Curvas de crecimiento ................................................................................ 172 4.4.- Interferencia en los sistemas de QS bacteriano ............................................ 178 4.4.1.- Detección en plantas de arroz y judía de moléculas que interfieren en el QS bacteriano .................................................................................................................. 178 4.4.1.1.- Ensayos con exudados de semilla, exudados de raíz y extractos de semilla ............................................................................................ 178 4.4.1.2.- Ensayos con raíces de plantas .............................................................. 180 4.4.2.- Determinación de las moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano ............................................................................................................... 183 4.4.2.1.- Análisis mediante cromatografía en capa fina (TLC) ......................... 183 4.4.3.- Caracterización química de las moléculas que interfieren con los sistemas de QS bacteriano ......................................................................................................... 184 4.4.3.1.- Influencia del pH ................................................................................. 184 4.4.3.2.- Ensayos con biosensores que expresan la enzima lactonasa ............... 184 4.4.3.3.- Análisis mediante cromatografía en capa fina y revelado con biosensores portadores del gen de la lactonasa ......................................................................... 188 4.4.3.4.- Análisis mediante HPLC y ensayo biológico con el biosensor portador del gen de la lactonasa de las fracciones obtenidas de los extractos de semillas de plantas ............................................................................................................... 189 4.4.3.5.- Análisis estructural de las moléculas que interfieren en los sistemas de QS ............................................................................................ 192 5.- DISCUSIÓN ..................................................................................... 195 6.- CONCLUSIONES............................................................................ 229 7.- BIBLIOGRAFÍA .............................................................................. 233 Figura 4.42. Seguimiento de la movilidad tipo swimming. ...................................... 163 Figura 4.43. Movilidad tipo swimming a los 7 días. ................................................. 164 Figura 4.44. Adhesión relativa de las diferentes estirpes derivadas de SMH12 a placas microtítulo de poliestireno tras 6 días de cultivo. ...................................................... 165 Figura 4.45. Formación de biofilm a los 4 días al microscopio confocal. ................. 167 Figura 4.46. Formación de biofilm a los 7 días al microscopio confocal. ................. 168 Figura 4.47. Imágenes al microscopio de epifluorescencia de la colonización de raíces de soja Osumi por diferentes estirpes de rizobios. .................................................... 170 Figura 4.48. Imágenes al microscopio electrónico de barrido de la colonización del tronco de la raíz de soja Osumi por diferentes estirpes de rizobios. ......................... 171 Figura 4.49. Visualización al microscopio electrónico de barrido de la colonización del ápice de la raíz de soja Osumi por diferentes estirpes de rizobios. ........................... 172 Figura 4.50. Imágenes al microscopio electrónico de barrido de la colonización de las raíces laterales de soja Osumi por diferentes estirpes de rizobios. ............................ 173 Figura 4.51. Curva de crecimiento de SMH12 y derivados en medio YM(3) .......... 174 Figura 4.52. Ensayos de difusión en placa de exudados de semilla (ES) y exudados de raíz (ER) de plantas de arroz (A) cv Puntal y judía cv BBL (J). ............................... 179 Figura 4.53. Ensayos de difusión en placa de extractos de semillas (EX) de plantas de arroz (A) cv Puntal y judía cv BBL (J). ..................................................................... 180 Figura 4.54. Ensayos en placa con raíces de plantas de arroz cv Puntal y de judía cv BBL en presencia de los diferentes biosensores. ....................................................... 181 Figura 4.55. Separación mediante TLC y revelado de moléculas que IQS. .............. 183 Figura 4.56. Ensayos de difusión en placa de EX de plantas de arroz cv Puntal y judía cv BBL tras tratamiento alcalino. .............................................................................. 185 Figura 4.57. Ensayos de difusión en placa con biosensores portadores del gen de la lactonasa. ................................................................................................................... 186 Figura 4.58. Ensayos en placa con raíces de plantas de arroz cv Puntal y judía cv BBL en presencia de biosensores expresando la enzima lactonasa. .................................. 187 Figura 4.59. Separación y revelado de moléculas que IQS. ...................................... 188 Figura 4.60. Ensayos de inducción de A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) con fracciones de extractos de semillas de arroz ............ 190 Figura 4.61. Ensayos de inducción de A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) con fracciones de extractos de semillas de judía. ........... 191 Figura 4.62. Ensayos de inducción de A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) con diferentes concentraciones del patrón...................... 191 Figura 4.63. Ensayos de inducción de A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) en placas microtítulo.. .................................................... 192 DISCUSIÓN Figura 5.1. Principales señales moleculares durante la simbiosis. ............................ 206 Figura 5.2. Modelo de interferencia en los sistemas de QS bacteriano a través de exudados radicales. .................................................................................................... 211 Figura 5.3. Hipótesis de activación de los sistemas de QS en S. fredii SMH12. ...... 215 Figura 5.4. Modelo de comunicación celular en la rizosfera..................................... 226   INTRODUCCIÓN   Introducción  3  1.1.- Comunicación celular: Quorum Sensing En 1970, Kenneth H. Nealson y John W. Hastings, de la Universidad de Harvard, observaron que una bacteria, Vibrio fischeri, presentaba dos comportamientos diferentes según fuese la densidad de su población, de tal forma que esta bacteria producía bioluminiscencia únicamente a altas densidades celulares (Nealson y Hastings, 1970). Basados en esta observación, postularon que la bioluminiscencia desarrollada por estos microorganismos posiblemente se debía a unos mensajeros moleculares que viajaban entre las células. Llamaron a estos mensajeros “autoinductores” (AI), ya que los sobrenadantes de los propios cultivos disparaban la transcripción de los genes implicados en la bioluminiscencia. Investigaciones posteriores dieron la razón a esta hipótesis, y once años más tarde se identificó por primera vez la naturaleza molecular del autoinductor de V. fischeri, era una N-acil-homoserina lactona (AHL) (Eberhard et al, 1981). Pero V. fischeri no es la única bacteria capaz de percibir la densidad de su población y llevar a cabo una respuesta conjunta. En general, los microorganismos perciben las condiciones ambientales que les rodean y se comunican entre ellos mediante compuestos químicos, los autoinductores, que son difusibles, permeables a través de la membrana celular y se liberan al medio. Conforme aumenta la densidad celular de la población, el autoinductor se acumula hasta que, al alcanzar una concentración determinada, se incorpora de nuevo al interior de la célula. Ya dentro de la célula, interacciona con proteínas activadoras de la transcripción que, a su vez, inducen la expresión de los genes específicos que regulan. Este mecanismo permite a los microorganismos coordinar su comportamiento ya que, debido a los cambios continuos que se producen en el medio, necesitan reaccionar de manera rápida para adaptarse a estos cambios y sobrevivir. Al sistema de comunicación célula-célula que emplea AI producidos en respuesta a la densidad celular de la población de microorganismos se le denomina “Quorum Sensing” (QS). Vibrio fischeri es una bacteria Gram-negativa que vive como simbionte en algunas especies animales marinas. En esta relación, el hospedador provee nutrientes a la bacteria y la bacteria, a cambio, genera luz que sirve al pez para atraer presas, alejar depredadores u otras actividades. Engebrecht y Silverman (1984 y 1987) demostraron que se necesitan dos componentes reguladores para dirigir el proceso de Introducción  4  bioluminiscencia en V. fischeri, estos componentes son LuxI, que cataliza la producción del AI y LuxR, un regulador transcripcional que, al unirse al AI, forma un dímero junto a otro elemento LuxR-AHL y activa el operón lux, que posee los genes que codifican la luciferasa. Además, una de las características más importantes del QS es que el gen de síntesis de AI (luxI) es uno de los genes que aumenta su expresión en presencia de AI. Esto genera una retroalimentación positiva que permite una rápida generación de bioluminiscencia. Por otro lado, LuxR está regulada a nivel transcripcional mediante una proteína receptora de AMPc (CRP) (Dunlap y Greenberg, 1995) y, presumiblemente, a nivel post-transcripcional por GroEL (Dolan y Greenberg, 1992). A bajos niveles de AI, luxR está expresándose, sin embargo, a altas concentraciones de AHL, la propia proteína LuxR reprime su expresión (Figura 1.1). Figura 1.1. Modelo de quorum sensing en V. fischeri. A bajas densidades celulares, la transcripción del operón luxICDABE es basal, de tal forma que la expresión del gen luxI, que codifica una AHL sintasa, así como la producción de AHL es basal. La alta densidad celular implica una acumulación de AHL, que se une y activa al regulador transcripcional LuxR. LuxR activo se une al promotor del operón y recluta a la ARN polimerasa (RNAP), con lo que la expresión del operón luxICDABE se estimula. La expresión del gen luxR está regulada por varias vías, por la proteína receptora de AMPc (CRP), o a altas densidades celulares por la propia proteína LuxR. Introducción  5  Los sistemas de QS también están presentes en las bacterias Gram-positivas, si bien están menos estudiados. En estos microorganismos, las moléculas AI son, por lo general, oligopéptidos modificados que, al entrar en la célula, generan una cascada de fosforilaciones que finalizan con el incremento en la transcripción de una serie de genes diana (Reading y Sperandio, 2006). En cualquier caso, ya sea en Gram-positivas o Gram-negativas, los sistemas de regulación dependientes de QS están implicados en el control de funciones de comportamiento o fisiológicas muy diversas, entre ellas, la bioluminiscencia, la transferencia de plásmidos por conjugación, la producción de antibióticos y bacteriocinas, la expresión de factores de virulencia, la formación de biopelículas, la motilidad, la producción de polisacárido, etc. Todas estas funciones tienen en común que sólo se ejecutan si el número de células de la población del microorganismo es lo suficientemente alto como para asegurar el éxito del proceso (Fuqua et al. 1994). En esta Tesis, se estudian diferentes aspectos de los sistemas de QS presentes en tres estirpes de rizobios: S. fredii SMH12, R. etli ISP42 y R. sullae IS123 (bacterias Gramnegativas). Es por ello, por lo que la introducción se centrará en la descripción general de los sistemas de QS de bacterias Gram-negativas descubiertos hasta la fecha, poniendo especial énfasis en los sistemas de QS presentes en los rizobios. 1.2.- Mecanismos moleculares del QS 1.2.1.- Autoinductores Los autoinductores son pequeñas moléculas que difunden libremente a través de la membrana celular bacteriana (aunque a veces pueden ser transportadas activamente) hacia el exterior celular (Aendekerk et al., 2002). Cuando la concentración extracelular alcanza un umbral, estos AI vuelven a entrar en la célula y se unen a reguladores transcripcionales que se activan y regulan la expresión de una serie de genes (Alt-Mörbe et al., 1996). En las bacterias Gram-negativas, los AI más comunes y numerosos son las N-acil-homoserina lactonas, aunque existen otros tipos de AI, como el AI-2, la bradyoxetina, los dipéptidos cíclicos, etc (González y Keshavan, 2006).   1.2. 1 E n mec a que s AI s o el a n Fi gu anill o espe c en l a oxoS e gene cade n grad o las A un g r et al . L a acil o cara c celu l pote n libre m Así vari a 1 .1.- N-aci n la mayor í a nismos de s on activad o o n las AH L n illo lactóni c u ra 1.2. Es t o lactónic o c ificidad y v a presencia o hidroxi-. e gún la lon g ral en AH L n a larga (e n o de satura c A HL, de tal r upo oxo o . , 2002). a estructura o tiene hid r c terística p e l ar (aunque n ciado por m ente en e l pues, la l o a bilidad y e l-homose r í a de las b QS son si m o s por esto s L . Estas mo l c o (HSL) u n t ructura d e o común. v ariabilida d o ausenci a g itud de la c L de caden a n tre 10 y 1 c ión de la m forma que un grupo h i química d e r ofobicida d e rmite a las en las AH L proteínas t l medio ext r o ngitud y e e specificid a r ina lacto n b acterias G m ilares a lo s s sistemas. E l éculas con s n ido a una c e las N-aci l Es la cad e d de las A H a de sustitu y c adena acil o a corta (ent r 8 carbono s m isma es l o el carbono i droxilo (T a e las AHL d y el anil l AHL difu n L d e caden a t ransportad o r acelular o e l grado d e a d de estos 6 n as ra m -negati v s descritos p E s por ello s tan de un g c adena late r l -homoseri n e na lateral H L. Pueden y ente en el o lateral, l a r e 4 y 8 ca r s ). Además o que da la de la posi c a bla 1.1.) ( L las hace m l o lactónic o n dir librem e a larga el pa o ras (Pear s dentro del c e saturació n AI. Para m v as caracte p ara V. f isc h por lo que g rupo cons e r al variable n a lactona . de tipo a variar en l a carbono 3 a s AHL se p r bonos en l de la long i variabilida d c ión 3 pue d L eadbetter y m oléculas a n o (HSL) p e nte a travé s so a través s on et al., c itoplasma c n de la c a m ayor com p riza d as ha s h eri, difirie n el grupo m e rvado co m de tipo aci l . Todas las a cilo la q u a longitud d (R), que p p ueden cla s a cadena l a i tud de la c d y la espe c d e aparecer y Greenber g n fipáticas, y p roporciona s de la me m de la mem b 1999)), pe r c elular (Fu q a dena later a p lejidad, l a Introd u s ta la fech a n do en los g m ás importa n m ún a todas l o (Figura 1 AHL pose e u e determi n e la cadena p uede ser d e s ificar de m a teral) y A H c adena late r c ifidad den t reducido, p g , 2000) (P e y a que la c a hidrofilia. m brana anfi p b rana pued e r o también q ua et al., 2 a l determi n a mayoría d u cción  a , los g enes n te de ellas, .2.). e n un n a la (n) o e tipo m anera H L de r al, el t ro de p oseer e llock a dena Esta p ática e estar estar 2 001). n an la d e los Introducción  7  microorganismos no producen un único tipo de AHL y diferentes microorganismos pueden producir la misma AHL (Hardman et al., 1998). Tabla 1.1. Tipos de N-acil-homoserina lactonas. Compuesto químico Nº de C C3 Abreviatura N-butiril-homoserina lactona 4C - C4-HSL N-hexanoil-homoserina lactona 6C - C6-HSL N-octanoil-homoserina lactona 8C - C8-HSL N-decanoil-homoserina lactona 10C - C10-HSL N-dodecanoil-homoserina lactona 12C - C12-HSL N-tetradecanoil-homoserina lactona 14C - C14-HSL N-hexadecanoil-homoserina lactona 16C - C16-HSL N-octodecanoil-homoserina lactona 18C - C18-HSL N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona 6C oxo 3-oxo-C6-HSL N-(3-oxo-octanoil)-homoserina lactona 8C oxo 3-oxo-C8-HSL N-(3-oxo-decanoil)-homoserina lactona 10C oxo 3-oxo-C10-HSL N-(3-oxo-dodecanoil)-homoserina lactona 12C oxo 3-oxo-C12-HSL N-(3-oxo-tetradecanoil)-homoserina lactona 14C oxo 3-oxo-C14-HSL N-(3-oxo-hexadecanoil)-homoserina lactona 16C oxo 3-oxo-C16-HSL N-(3-oxo-octodecanoil)-homoserina lactona 18C oxo 3-oxo-C18-HSL N-(3-hidroxi-butiril)-homoserina lactona 4C hidroxilo 3-OH-C4-HSL N-(3-hidroxi-hexanoil)-homoserina lactona 6C hidroxilo 3-OH-C6-HSL N-(3-hidroxi-octanoil)-homoserina lactona 8C hidroxilo 3-OH-C8-HSL N-(3-hidroxi-decanoil)-homoserina lactona 10C hidroxilo 3-OH-C10HSL N-(3-hidroxi-dodecanoil)-homoserina lactona 12C hidroxilo 3-OH-C12HSL N-(3-hidroxi-tetradecanoil)-homoserina lactona 14C hidroxilo 3-OH-C14HSL N-(3-hidroxi-hexadecanoil)-homoserina lactona 16C hidroxilo 3-OH-C16HSL N-(3-hidroxi-octodecanoil)-homoserina lactona 18C hidroxilo 3-OH-C18HSL Nº de C: número de carbonos de la cadena lateral acilo. C3: sustituyente en el carbono 3. Recientemente, Thiel et al, (2009) demostraron que en dos bacterias, Aeromonas culicicola y Jannaschia helgolandensis, se producen AHL modificadas en las que la cadena acilo porta un grupo metilo, de tal forma que estos tipos de AHL poseen Introducción  14  • De tipo LuxI LuxI es la enzima responsable de la síntesis de AHL en los sistemas de QS de V. fischeri. Los genes de síntesis de AHL de otras muchas bacterias, incluidas especies de Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Serratia, Erwinia y Burkholderia, son homólogos a luxI y sus productos poseen residuos aminoacídicos conservados necesarios para la actividad catalítica (Costa y Loper, 1997; Gonzalez y Marketon, 2003; Khan et al., 2005; Labbate et al., 2004; Lewenza et al., 1999). Las proteínas sintasas de la familia LuxI catalizan la unión de S-adenosilmetionina (SAM) con una acil-proteína transportadora de acilos (acil-ACP). Esto implica que las AHL provienen de un grupo homoserina lactona derivado del metabolismo de los aminoácidos y una cadena acilo lateral derivada del metabolismo de los ácidos grasos (Figura 1.10.). A partir de esta base se generan las diferentes AHL caracterizadas por la longitud de la cadena lateral y por el grado de oxidación del carbono 3, que puede poseer un sustituyente de tipo oxo, de tipo hidroxi o estar totalmente reducido (Fuqua et al. 2001). Figura 1.10. Reacción catalizada por proteínas de la familia LuxI. La síntesis de AHL tiene lugar mediante la reacción entre S-adenosil metionina (SAM) y una acilACP (proteína transportadora de grupos acilo), catalizada por enzimas de la familia LuxI. Introducción  15  • De tipo LuxM/AinS Los productos de los genes luxM de V. harveyi y ainS de V. fischeri intervienen en la síntesis de AHL a pesar de no presentar homología con LuxI (Bassler et al. 1993). Estas dos sintasas comparten un dominio muy conservado y dirigen la síntesis de 3-OH-C4-HSL y C8-HSL, respectivamente. Estudios in vitro indican que AinS cataliza la síntesis de C8-HSL a partir de SAM y una acil-ACP (como ocurría en el caso de LuxI), pero también a partir de SAM y una acil coenzima A (Hanzelka et al., 1999). • De tipo HdtS Un tercer tipo de AHL sintasa, la proteína HdtS, fue descubierta en P. fluorescens F113. Cuando el gen hdtS de esta bacteria se introdujo y expresó en E. coli, se detectó la presencia en los sobrenadantes de cultivos de esta bacteria la 3-OH-C14-HSL, la C10-HSL y la C6-HSL. Esta proteína no presenta homología ni con LuxR ni con LuxM, sino con proteínas de la familia de la ácido lisofosfatídico acil transferasa. Esta familia de proteínas son las responsables de la transferencia de grupos acilos al ácido lisofosfatídico para generar el ácido fosfatídico. Se ha sugerido que HdtS podría transferir cadenas acilo desde el acil-ACP o el acil-CoA a SAM, generándose las AHL (Laue et al., 2000). 1.2.2.2.- Sintasas de AI-2 LuxS es la sintasa responsable de la producción del AI-2 en V. harveyi (Surette et al., 1999). Esta enzima es una S-ribosilhomocisteinasa que cataliza la rotura del enlace tioéter de la S-ribosilhomocisteina para producir L-homocisteína y 4,5-dihidroxi-2,3pentanodiona (Figura 1.11.). Este último es el precursor común del AI-2, ya que éste puede variar en su forma final según la especie que lo produzca (Figura 1.3.) (Miller et al., 2004). La síntesis del AI-2 depende del gen luxS (Surette et al., 1998), que no tiene homología con ningún otro gen de síntesis de AHL (luxI, luxM/ainS o htdS). Esta catálisis, además, es común tanto para bacterias Gram-negativas como para bacterias Gram-positivas. Se han identificado un gran número de genes homólogos al gen luxS de V. harveyi en bacterias Gram-negativas y en bacterias Gram-positivas, aunque hasta la fecha no se han identificado en α-Proteobacterias.   E s sitio s los a Lud w Fi gu la 4 , ribo s (SA M Lux S 1.2. 2 H a dipé p de s ami n debe E n depe Fe 3+ , et al . L a cara c HH Q s tudios de c r s activos id a utores cad w ig, 2001; L u ra 1.11. B i , 5-dihidrox i s ilhomocist e M ) y requi e S , la S-ribo s 2 .3.- Sinta s a sta la fec h p tidos cícli c s obrenadan t n oácidos y c r ser de no v n el caso de ndiente de l , pero no s e . , 2002b). a ruta de s c terizada. E Q ). La pri m r istalografí a énticos en l a sitio acti v L ewis et al. i osíntesis d i l-2,3-pent a e inasa. El p e re una me t s ilhomocist e s as de otr o h a no se co n c os. Sin e m t es de cu l c on una úni v o (Holden la bradyo x l a densida d e conoce qu s íntesis de E xisten dos m era tiene l u a por rayos - l a interfase v o contien e , 2001; Ru z el precurs o a nodiona e s p roceso de t iltransfera s e ína. o s tipos d e n oce qué g m bargo, se h l tivos de P ca fuente d et a l . 1999 ) x etin a ocurr e d celula r y, e é gen o ge n las alquilq vías de sí n u gar a par t 16 - X muestra n de unión e n e un ión m z heinikov e t o r del AI-2 s llevada a síntesis se s a y una nu c e AI en o genes h a comprob a P . aerugi n e carbono, ) . e algo pare c e specialme n n es están i m q uinolonas, n tesis de l o t ir del ácid o n que LuxS n tre cada d í m etálico cat t al., 2001). . La biosín t a cabo por inicia a p a c leosidasa p están imp l a do que es t n osa creci d de tal form a c ido, se sab n te, en med i m plicados e n por el co o s AI de ti p o siquímic o es un hom í mero. Seg ú alítico, el Z t esis del pr e la proteín a a rtir de S-a d p ara produ c l icados en l t os compue s d a en me d a que la sí n e que se pr o i os de culti v n la síntesi s ntrario, es t p o alquil-q u o y la segu n Introd u odímero c o ú n la mayo r Z n 2+ (Hil g e cursor del a LuxS, u n d enosilmeti c ir el sustr a l a síntesis d s tos son ai s d io mínim o n tesis de est o duce de m v o deficien t s de este AI t á perfecta m u inolona ( P n da, a part u cción  o n dos r ía de g ers y AI-2, n a Sonina a to de d e los s lados o sin os AI m anera t es en (Loh m ente P QS y ir del Introducción  17  triptófano. En cualquiera de los dos casos se llega al mismo precursor, el ácido antranílico. La catálisis de este precursor hasta el AI HHQ es llevada a cabo por el producto del operón pqsABCDE y la síntesis de la PQS a partir de HHQ es llevada a cabo por el producto del gen pqsH (Dubern y Diggle, 2008). 1.2.3.- Reguladores del Quorum Sensing 1.2.3.1.- Reguladores de tipo LuxR La regulación de genes dependiente de QS es llevada a cabo por proteínas reguladoras de la transcripción que se activan tras su unión a los AI. LuxR es el activador transcripcional en V. fischeri (Stevens et al., 1994). Esta proteína se une a la 3-oxo-C6-HSL (AI sintetizado por LuxI) en su dominio de unión a inductor (extremo amino-terminal) y forma un dímero con otro elementro LuxR-AHL. En su extremo carboxi-terminal posee un dominio hélice-giro-hélice de unión al ADN que se une a una secuencia específica denominada lux box (Eberhard et al., 1981). Estudios de cristalografía llevados a cabo en A. tumefaciens sugieren que, tras la unión de la AHL, la proteína TraR (homóloga a LuxR) sufre un cambio conformacional, forma un dímero y activa así la transcripción de ciertos genes, que suelen poseer la secuencia lux box precediendo al inicio del gen (Zhu y Winans, 2001). Las proteínas de tipo LuxR, una vez unidas al ADN, reclutan a la ARN polimerasa, iniciándose la transcripción génica (Stevens et al., 1994; Stevens et al., 1999; Stevens y Greenberg, 1997). La inmensa mayoría de los complejos AHL-LuxR activan la transcripción de genes, aunque se ha descrito la inhibición de la expresión de genes en ciertos casos (Andersson et al., 2000; Beck von Bodman y Farrand, 1995; Beck von Bodman et al., 1998). 1.2.3.2.- Reguladores de tipo LuxP/Q Los sistemas de QS que utilizan el AI-2 basan la detección de esta molécula en dos proteínas, LuxP y LuxQ. LuxP es un receptor periplásmico que se une al AI-2. LuxP modula la actividad del sensor-quinasa LuxQ, que está en la cara citoplásmica de la membrana, por lo que transmite la captación del AI-2 al interior celular. LuxP pertenece a la familia de las proteínas de unión periplásmica que se unen a ligandos atrapándolos Introducción  18  entre dos dominios. LuxQ es una proteína híbrida de dos componentes, un dominio sensor periplásmico y una dominio histidina-quinasa (Henke y Bassler, 2004; Mok et al., 2003). A bajas densidades celulares, LuxQ actúa como una quinasa y autofosforila residuos histidina dentro del propio dominio histidina quinasa. Se inicia entonces una cascada de fosforilaciones que termina en la fosforilación de LuxO. LuxO-fosfato es la responsable de la represión de LuxR, el regulador transcripcional activador de la luminiscencia en V. harveyi. A altas densidades celulares, la unión del AI-2 a LuxP, inicia la desfosforilación de LuxQ, con lo que la cascada de fosforilaciones se invierte y LuxO pierde el fosfato, inactivándose. Es así como LuxR deja de reprimirse, activándose la expresión de genes implicados en la producción de bioluminiscencia (Mok et al., 2003; Nealson et al., 1970). 1.2.4.- Regulación negativa del Quorum Sensing Las bacterias poseen una serie de mecanismos para degradar o inhibir la producción de AI. Algunos de estos sistemas son completamente necesarios para el correcto funcionamiento de los propios sistemas de QS de las bacterias. En otros casos, su cometido es interferir en los sistemas de QS de otras bacterias. 1.2.4.1.- Proteínas Antiactivadoras En A. tumefaciens, a la actividad de la proteína reguladora del QS TraR se opone otra proteína, TraM. Tanto el gen traR como el traM se encuentran en el plásmido Ti de esta bacteria, pero también están presentes en los plásmidos simbióticos de bacterias de la familia Rhizobiaceae (Luo et al., 2000; Swiderska et al., 2001). La actividad inhibidora de la proteína TraM es completamente necesaria para el funcionamiento normal de los sistemas de QS de A.tumefaciens. El sistema tra de QS regula la transferencia por conjugación y replicación del plásmido Ti en esta bacteria. De esta forma, el mutante traM es hiperconjugador, incluso a bajas densidades celulares (Zhu y Winans, 2001). Es por ello por lo que la función de TraM es permitir la conjugación del plásmido Ti únicamente a elevadas densidades celulares. Así pues, con bajas densidades celulares, TraM se une a las proteínas TraR disponibles formando un heterodímero que interacciona con la caja tra, impidiendo la activación de los genes de transferencia de Introducción  19  plásmidos. Sin embargo, a altas densidades celulares, la concentración de AI aumenta y empieza a competir con TraM por la unión a TraR, iniciándose la activación de los genes regulados por el complejo TraR-AHL. Entre los genes regulados por TraR-AHL se encuentra el propio gen traR, por lo que se incrementa la cantidad de proteínas TraR disponibles para su activación por unión de las AHL (Hwang et al., 1999; Piper y Farrand, 2000). 1.2.4.2.- Proteínas homólogas a los reguladores de tipo LuxR TrlR (TraR-like regulator) es otra proteína cuya función se opone a la de la proteína TraR en A. tumefaciens. TrlR posee un extremo amino-terminal muy parecido al de la proteína TraR (181 aminoácidos), pero debido a una mutación de cambio de fase, la zona carboxi-terminal ha perdido completamente la homología. Esto quiere decir que reconoce a las AHL y puede formar dimeros con TraR-AHL, pero no puede inducir la expresión de los genes regulados por TraR. Al igual que en el caso de TraM, esto impide, junto con la acción de TraM, que a bajas densidades poblacionales, cuando la síntesis de AHL es basal, TraR se active. Solo a altas densidades poblacionales, cuando la concentración de AHL es alta, estos AI compiten por la unión a TraR (Chai et al., 2001). Pero A. tumefaciens no es la única bacteria que posee este tipo de proteínas antagonistas. En P. aeruginosa, la proteína QscR (quorum sensing control repressor) es un homólogo de LasR y RhlR, los reguladores transcripcionales de los sistemas de QS de esta bacteria. La función de QscR es reprimir los sistemas de QS Las y Rhl en los estadíos iniciales del crecimiento, de hecho un mutante en el gen qscR expresa mucho antes los genes lasI y rhlI que la estirpe silvestre y, consecuentemente, la producción de AHL es prematura (Chugani et al., 2001; Ledgham et al., 2003). Estudios recientes muestran que esta proteína se une a una de las AHL, la 3-oxo-C12-HSL, que es sintetizada por LasI, y activa su propio operón, por lo que compite con LasR en la unión al AI (Lee et al, 2006). Introducción  20  1.2.4.3.- Enzimas que degradan las AHL El gen attM codifica una enzima que hidroliza el anillo lactónico de la 3-oxo-C8HSL, el AI producido por el sistema Tra de QS de A. tumefaciens (Zhang et al., 2002). Este gen es reprimido por attJ durante la fase exponencial de crecimiento, de tal forma que se acumulan AHL durante esta fase. En la fase estacionaria, el gen aatJ deja de expresarse y attM deja de reprimirse, con lo que se degradan rápidamente las AHL presentes en el medio. Zhang et al. (2004) demostraron que esta degradación está mediada por la alarmona ppGpp. Esta molécula, en las condiciones de déficit nutricional que se dan en la fase estacionaria, induce la degradación de las AHL por la lactonasa AttM, inhibiéndose así el proceso de la conjugación, que es muy costoso energéticamente. En diferentes especies del género Pseudomonas se han descubierto enzimas con actividad degradadora de AHL, acilasas y lactonasas (Huang et al., 2003). Estas enzimas tienen especificidad por AHL de cadena larga, e incluso algunas especies crecen usando como fuente de carbono a las propias AHL. Por último, existen también algunos microorganismos que inactivan las AHL mediante rotura del enlace amida de las AHL (Lin et al., 2003) o incluso por oxidación del carbono 3 de las 3-oxo-HSL (Uroz et al., 2005). 1.2.4.4.- Represión mediante ARNi Lenz et al. (2004) descubrieron que los sistemas de QS de V. harveyi y V. cholerae están regulados por moléculas pequeñas de ARN reguladoras, los ARN interferentes (ARNi). Ambas bacterias poseen un sistema de regulación similar en el que, a bajas densidades celulares se dan una serie de fosforilaciones que finalizan con la fosforilación de LuxO. LuxO-fosfato activa la expresión de un represor que inhibe la expresión del operón lux. Los cuatro ARNi descubiertos, qrr1,qrr2, qrr3 y qrr4, se unen además a los ARN mensajeros del gen luxR de estas bacterias, favoreciendo su rápida degradación. De esta forma, a bajas densidades celulares los sistemas de producción de bioluminiscencia están totalmente reprimidos, pero preparados para una rápida activación cuando la densidad celular sea la adecuada (Lenz et al., 2004). Introducción  21  1.3.- Biosensores bacterianos de QS Una forma de detectar la presencia de AI es mediante la utilización de biosensores bacterianos. Estas bacterias detectan gran variedad de AI a concentraciones muy bajas (Cha et al. 1998). Un resultado negativo no implica la ausencia de AI en la muestra sino que puede deberse a que no se superó el límite de detección del biosensor o a que no puede reconocer a ese tipo de moléculas AI. Los biosensores bacterianos se usan para detectar AI en ensayos de difusión en placa, en cromatografía en capa fina, en fracciones provenientes de HPLC, etc. 1.3.1.- Chromobacterium violaceum CV026 C. violaceum CV026 es una estirpe mutada en el gen cviI mediante inserción del transposón Tn5 (Throup et al., 1995). A diferencia de la estirpe silvestre, el mutante carece de la sintasa CviI, que interviene en la producción de la hexanoil homoserina lactona (C6-HSL) que, a su vez, induce la producción del pigmento púrpura violaceína (Ballantine et al., 1958). No obstante, la producción de pigmento se restaura cuando las células se incuban con un cultivo de la estirpe silvestre de Chromobacterium productora de AHL o bien cuando se agrega al medio AHL exógena. Se han descrito dos tipos de bioensayos con C. violaceum CV026, directo y reverso, que revelan la presencia de diferentes tipos de AI (McClean et al., 1997). Bioensayo directo. Este bioensayo permite detectar la presencia de AI exógenos procedentes de sobrenadantes bacterianos o exudados de semillas que se añaden al medio de cultivo donde crece la bacteria. Los AI exógenos activan la producción de violaceína, por lo que el resultado positivo implica la producción del pigmento violeta (Figura 1.12.A). Este bioensayo típicamente detecta AHL de cadena corta: la C4-HSL, la C6-HSL, la 3-oxo-C6-HSL, la C8-HSL y la 3-oxo-C8-HSL (McClean et al., 1997). Bioensayo reverso. El ensayo reverso permite detectar la presencia de AI exógenos que compiten con la C6-HSL sintética (propia de esta bacteria) que se añade al medio de cultivo donde crece C. violaceum CV026. La adición de C6-HSL sintética activa la producción de violaceína en C. violaceum CV026, mientras que los AI exógenos (normalmente AHL de cadena larga) que se detectan impiden la acción de la C6-HSL sintética. El mecanismo de competencia generalmente se produce porque los AI Introducción  22  exógenos se unen al regulador transcripcional (proteína de tipo LuxR), por lo que no se da la activación de los genes implicados en la producción de violaceína. El resultado positivo del ensayo reverso se traduce en la no producción de violaceína (Figura 1.12.B). Suele emplearse para detectar AHL de cadena larga (C10-HSL, 3-oxo-C10HSL, C12-HSL y 3-oxo-C12-HSL) y moléculas que interfieren en el QS bacteriano (McClean et al., 1997; Teplistki et al., 2000). 1.3.2.- Agrobacterium tumafaciens NT1 (pZRL4) La estirpe A. tumefaciens NT1 (pZLR4), que carece del plásmido Ti, está transformada con el plásmido pZLR4 que contiene una fusión traG::lacZ y el gen traR del plásmido pTiC58 (Cha et al., 1998). Por lo tanto, se trata de una estirpe incapaz de producir su propio autoinductor y en la que la fusión lacZ sólo se expresa en presencia de AI exógenos. Los bioensayos con este biosensor son positivos cuando aparece un halo azul, que resulta de la degradación del sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranósido (X-Gal) que contiene el medio de cultivo, sobre el fondo blanco correspondiente a las células crecidas de A. tumefaciens (Figura 1.12.C). Es un biosensor especialmente sensible y con un rango de detección de diferentes AI muy alto, ya que detecta la C6-HSL, la C8-HSL, la C10-HSL, la C12-HSL, la C14-HSL, y sus respectivos derivados oxoe hidroxi- (Farrand et al., 2002). 1.3.3.- Escherichia coli JM109 (pSB536) E. coli JM109 (pSB536) es una estirpe que porta la construcción génica ahyRPahyI::luxCDABE en el plásmido pSB536. Los genes ahyR/I provienen de Aeromonas hidrófila, una bacteria Gram-negativa que es patógeno oportunista de ciertos mamíferos y peces. En este plásmido, se ha clonado el gen que codifica el receptor de los AI (AhyR) y el promotor del gen de síntesis de AI (PahyI), que está regulado por AhyRAI, fusionado al operón de bioluminiscencia (luxCDABE). Este biosensor en presencia de AI, especialmente AHL de cadena corta, emite bioluminiscencia (Figura 1.12.D). Posee una sensibilidad y rango de detección intermedios entre CV026 y NT1 (pZRL4) ya que detecta la C4-HSL, la 3-oxo-C4-HSL, la C6-HSL, la 3-oxo-C6-HSL, la C8-HSL,   la 3 - (Swi Fi gu Bioe CV0 Bioe 1.4 . leg u La s espe c legu m (Ho w unas for m A. C. - oxo-C8-H S ft et al., 19 9 u ra 1.12. E nsayo con C 26 en en s nsayo con E . - Simb u minos a s legumin o c ies distri b m inosas se w ieson et a b acterias m ación de n ó S L, la C109 7). E nsa y os d C . violaceu s ayo rever s E . coli JM1 iosis e n a s o sas perten e b uidas geo g han usad o al ., 2000). M del suelo ó dulos en l a HSL, la 3o d e difusió n m CV026 e s o. C. Bi o 09 (pSB53 6 n tre ba c e cen a la f g ráficament e o como fu e M uchas leg u denomina d a s raíces de 23 o xo-C10H n en plac a e n ensayo d o ensayo c o 6 ). c terias f amilia Le g e por todo e nte de al i u minosas e d as rizobi o la planta a u B. D. H SL, la C1 2 a con bi o d irecto. B. B o n A.tume fa fijador a g uminosae, el mundo i mentación e stablecen u o s. Esta r e u nque, a ve c 2 -HSL y la o sensores b B ioensayo c fa ciens N T a s de n que agrup a . Desde la y como p u na relació n e lación tie n c es, puede d Introd u 3-oxo-C12 b acteriano s c on C. viol a T 1 (pZRL4 ) n itrógen o a más de 1 antigüeda d lantas forr a n simbiótic a n e como f d arse tamb i u cción  -HSL s . A. a ceum ) . D. o y 1 8000 d , las a jeras a con f in la i én su Introducción  30  para originar diversos tipos celulares y formar la compleja estructura nodular. El extremo del tubo de infección avanza hacia el primordio recién desarrollado, donde comienza a ramificarse y extenderse. Los rizobios que han penetrado en la raíz van a llegar a través de los tubos de infección hasta la región central del nódulo en formación. Los tubos de infección carecen de pared celular en su extremo apical, lo que permite la liberación de los rizobios en el interior de las células vegetales mediante un proceso de endocitosis. Los rizobios liberados del tubo de infección se diferencian a bacteroides, bacterias modificadas con forma irregular rodeadas de una membrana de origen vegetal llamada membrana peribacteroide. Esta membrana constituye una interfase esencial para el intercambio de metabolitos entre la célula vegetal y la bacteria. Los bacteroides se multiplican y se rodean, bien individualmente o en pequeños grupos, de la membrana peribacteroidea, constituyendo unas unidades llamadas simbiosomas. En su última etapa de desarrollo, los bacteroides dejan de dividirse y se diferencian hasta bacteroides maduros, capaces de reducir el nitrógeno atmosférico a amonio por la acción del complejo enzimático denominado nitrogenasa. Aunque probablemente los bacteroides totalmente diferenciados ya no son capaces de dividirse, dentro del nódulo existe un reservorio de bacterias no diferenciadas que pueden volver al suelo y colonizarlo (Kahn et al., 1998). La forma y anatomía del nódulo dependen exclusivamente de la planta. Existen dos grandes tipos de nódulos (Figura 1.14.): indeterminados, formados principalmente por leguminosas de climas templados como Medicago sativa (alfalfa) o Pisum sativum (guisante), y determinados, típicos de leguminosas tropicales o subtropicales como Phaseolus vulgaris (judía) y Glycine max (soja). En los nódulos indeterminados, el primordio se origina en el córtex interno de la raíz y da lugar a un meristemo apical persistente, de modo que continuamente se generan nuevas células que van siendo infectadas, por lo que el nódulo adopta una forma cilíndrica (Figura 1.14. A). El primordio de los nódulos determinados se origina en el córtex externo y da lugar a un meristemo cuya actividad es transitoria, de modo que genera una masa esférica de células que se diferenciarán al unísono (Figura 1.14. B). Introducción  31  Figura 1.14. Tipos de nódulos. A. Nódulo indeterminado. Se detallan las siguientes zonas: I, meristemo; II, zona de infección; II-III, interzona; III, zona de fijación; IV, zona de senescencia. B. Nódulo determinado. Se detallan las siguientes zonas: FN: zona de fijación, S: zona de senescencia, V: haz vascular, C: córtex de la raíz. 1.4.2.3.- Fijación biológica de nitrógeno El nitrógeno se encuentra en el suelo de forma combinada y constituye un factor limitante para el crecimiento vegetal. Las fuentes de nitrógeno en la rizosfera son diversas: la materia orgánica en descomposición, el aporte exógeno (fertilización química) y la fijación biológica del nitrógeno atmosférico. Ésta última se lleva a cabo exclusivamente por organismos procariotas denominados diazotrofos (Masson-Boivin et al., 2009). Los procesos biológicos de fijación de nitrógeno dependen básicamente de la capacidad de estos microorganismos, ya sean de vida libre o en simbiosis con otros organismos, de convertir el nitrógeno atmosférico (N2) en amonio (NH4+) mediante la acción de un complejo enzimático llamado nitrogenasa. El amoníaco producido en el proceso de la reducción del nitrógeno es incorporado a esqueletos carbonados, de forma que el producto final de la fijación del nitrógeno (generalmente amidas, ureidos o aminoácidos) es utilizado directamente por la planta (Vessey et al., 2004). La nitrogenasa es un complejo enzimático sensible al oxígeno que está formado por dos componentes: el componente I, también llamado dinitrogenasa o ferromolibdoproteína, es un heterotetrámero α2β2 que contiene cuatro grupos Fe4S4 y un cofactor que contiene hierro y molibdeno. El componente II, también denominado nitrogenasa reductasa o ferroproteína, es un homodímero que contiene un grupo Fe4S4 (Fischer, 1996). La función de la dinitrogenasa reductasa o componente II es la de Introducción  32  transportar los electrones desde un donador fisiológico (flavodoxina) hacia el componente I o dinitrogenasa para que en su centro activo, el cofactor de hierro y molibdeno, tenga lugar la reducción del nitrógeno. Por su parte, la flavodoxina recibe los electrones de reacciones como la descarboxilación oxidativa del piruvato hasta acetil-CoA y CO2, reacción catalizada por la piruvato flavodoxina oxidorreductasa. Para que tenga lugar el tránsito electrónico desde el componente II al componente I, se requiere la hidrólisis de al menos dos moléculas de ATP por cada electrón transferido. La nitrogenasa de las bacterias simbióticas posee características similares a la enzima de las bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre, incluyendo la sensibilidad al O2 y la capacidad de reducir acetileno, además de nitrógeno. La formación de H2 es parte del mecanismo de la nitrogenasa, lo que representa una pérdida significativa de energía. Además de la nitrogenasa, la fijación ó reducción de nitrógeno hasta dos moléculas de NH3, requiere poder reductor (8e-) y un mínimo de 16 moléculas de ATP. La reducción de N2 está siempre acoplada a la reducción de H+ a H2 mediante la siguiente reacción: N2 + 8 e- + 8 H+ + 16 ATP Æ 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi En condiciones fisiológicas normales, se requieren entre 20 y 30 moléculas de ATP por cada molécula de nitrógeno fijado. En consecuencia, la fijación de nitrógeno puede consumir una fracción significativa de la reserva celular de ATP, que es provista por la respiración aeróbica. Por tanto, la principal limitación que encuentran los fijadores libres de nitrógeno es que es un proceso muy costoso energeticamente. En cambio, en la simbiosis rizobio-leguminosa la planta hospedadora cede parte de los productos de la fotosíntesis a la bacteria, que los oxida y obtiene así ATP y poder reductor, necesarios para llevar a cabo la fijación del nitrógeno (Masson-Boivin et al., 2009). 1.4.3.- Bases moleculares de la interacción simbiótica La nodulación es un proceso complejo que requiere un diálogo molecular entre los dos miembros de la simbiosis y la expresión coordinada de genes de la bacteria y de la planta. La presencia del rizobio induce la formación del nódulo, pero el desarrollo de este órgano es llevado a cabo por la planta (D’Haeze y Holsters, 2002; Patriarca et al., 2004). A lo largo del proceso de la simbiosis intervienen una serie de moléculas Introducción  33  producidas tanto por la planta como por la bacteria que permiten el reconocimiento y la puesta en marcha de los diferentes mecanismos que finalmente permitirán la formación de nódulos fijadores de nitrógeno. Entre las moléculas implicadas en este diálogo molecular se incluyen los flavonoides, los factores de nodulación, los polisacáridos superficiales, las proteínas extracelulares denominadas proteínas Nop (Nodulation outer proteins) o las moléculas de tipo AI que regulan los sistemas de QS bacteriano (Broughton et al., 2000; Perret et al., 2000). 1.4.3.1.- Los flavonoides Los flavonoides se secretan a bajas cantidades de manera continua por las raíces, pero su concentración aumenta en la rizosfera si en ésta existen rizobios compatibles con la leguminosa (Broughton et al., 2000). Estos compuestos activan en la bacteria la expresión de los genes de nodulación (Perret et al., 2000; Spaink, 2000), que son los responsables de que la bacteria sintetice y secrete los factores de nodulación, moléculas señal que van a desencadenar en la planta diversas respuestas como la deformación y curvatura de los pelos radicales o el inicio de la organogénesis nodular (Spaink, 2000; D’Haeze y Holsters, 2002; Geurts y Bisseling, 2002). Los flavonoides son derivados de la 2-fenil-1,4-benzopirona, y su estructura está constituída por dos anillos aromáticos, A y B, y un anillo de pirona o pirano heterocíclico, el anillo C. Las modificaciones específicas de esta estructura básica producen diferentes clases de flavonoides (Tabla 1.4.): chalconas, flavanonas, flavonas, flavonoles, isoflavonoides, coumestanos y antocianidinas (Harborne y Williams, 2001). Los flavonoides se suelen almacenar y liberar en forma de glicósidos (unidos a uno o más azúcares), con lo que se aumenta su solubilidad. No todos los flavonoides son inductores de los genes de nodulación. Cada leguminosa secreta un conjunto específico de flavonoides, de manera que cuanto mayor sea el número de flavonoides reconocidos por un rizobio, mayor podrá ser, en principio, su rango de nodulación (Parniske y Downie, 2003). Introducción  34  Tabla 1.4. Estructura química de algunos flavonoides utilizados en esta Tesis. Flavonoide Estructura Masa molecular Flavonas Flavona O O 222 Apigenina O O OH HO OH 270 Morina O O OH HO OH OH HO 302 Flavanonas Flavanona O O 224 Naringenina O O OH HO OH 272 Isoflavonas Daidzeína O O HO OH 254 Genisteína O O HO OH OH 270 Coumestanos Coumestrol O O HO OOH 268 Introducción  35  1.4.3.2.- Los factores de nodulación En respuesta a los flavonoides exudados por la planta hospedadora, el rizobio sintetiza y secreta una familia de lipo-quitín-oligosacáridos (LCO) denominados factores Nod. Los genes bacterianos responsables de la biosíntesis y secreción de los factores Nod se denominan genes de nodulación, entre los que se incluyen los genes nod, nol y noe. La expresión de estos genes requiere también la participación de la proteína bacteriana NodD, que se transcribe constitutivamente en los rizobios (Broughton et al., 2000). La proteína NodD es un regulador transcripcional perteneciente a la familia LysR de reguladores de la transcripción. Los flavonoides secretados por las raíces de las leguminosas inducen cambios conformacionales en la proteína NodD. El conjunto NodD-flavonoide se une a una región de ADN altamente conservada de 49 pb denominada caja de nodulación o caja nod, situada delante de los genes de nodulación, activando su transcripción. El mecanismo exacto de cómo NodD responde al inductor para iniciar la transcripción de los genes nod todavía no se conoce. Se ha sugerido que el complejo NodD-flavonoide se forma en la caja nod. La existencia de este complejo aún no se ha demostrado, pero existen evidencias indirectas que indican que se produce una interacción entre ambas moléculas (Peck et al., 2006). Junto a NodD, existe otro activador, SyrM, perteneciente también a la familia LysR de reguladores transcripcionales, que corregula la producción de factores Nod en ausencia de flavonoides (Hanin et al., 1998). También se ha descrito la presencia de represores como NolR que, en S. meliloti, reprime la transcripción de los genes nodD1, nodD2 y nodABC (Kondorosi et al., 1991) y en S. fredii, donde actúa como represor de los genes nodA, nodD1, nolO, nolX, noeL, rhcJ, hesB, y y4pF, todos ellos con importancia durante la simbiosis (Vinardell et al., 2004) La mayor parte de los genes de nodulación codifican enzimas involucradas en la producción de los factores de nodulación (Spaink, 2000). La estructura de los factores Nod consiste básicamente en una cadena lineal de 3 a 6 unidades de N-acetil-Dglucosamina (NAcGlc). El extremo no reductor presenta un nitrógeno que está acilado con un ácido graso (Figura 1.15.). Esta estructura presenta una serie de sustituciones o decoraciones de diferente naturaleza que varían en los distintos rizobios. Cada rizobio produce y secreta no sólo un factor Nod, sino una familia de moléculas que actúan de Introducción  36  modo cooperativo para inducir la respuesta adecuada en la planta hospedadora (Minami et al., 1996). Figura 1.15. Estructura de los factores de nodulación. En Sinorhizobium fredii, n varía entre 1, 2 y 3; H es el radical presente en R1, R2, R3, R4, R6 y R7, y fucosa o metil-fucosa en R5. El ácido graso presente puede ser C16:0, C16:1, C18:0 y C18:1. Los genes de nodulación son los responsables de la síntesis del esqueleto básico del oligosacárido, de su decoración y de su transporte (Spaink et al., 1995; Downie, 1998; Spaink, 2000). Entre los primeros se encuentran los genes nodABC, que forman un operón y que codifican una aciltransferasa, una quitina desacetilasa y una Nacetilglucosamina transferasa, respectivamente. Estos genes se encuentran presentes en todos los rizobios. Las mutaciones en nodABC impiden la producción de factores de nodulación y, en consecuencia, la nodulación. Otros genes de nodulación presentes en todos los rizobios son nodIJ, que codifican proteínas que son miembros de la familia de los transportadores ABC y que están involucradas en la secreción de los factores Nod (Spaink et al., 1995) Existe una gran variedad de genes de nodulación que participan en la decoración de los LCO y cada rizobio sólo posee una parte de ellos. Las decoraciones de los LCO también juegan un papel importante en la determinación del conjunto de leguminosas que puede nodular un determinado rizobio (Lerouge et al., 1990). Los factores de nodulación desencadenan, una vez se unen a ciertos receptores, diversas respuestas en la planta, como la despolarización de la membrana de la célula del pelo radical, la deformación y curvatura del pelo radical o la inducción de la organogénesis nodular (Ferguson et al., 2010). O O N R1 Ácido graso O R3 O R2 CH2 O R4 CH2OH NH O=C CH3 HO O NH O R7 CH2 O R5 n R6 O O O O=C CH3 Introducción  37  Entre los receptores de los factores Nod se encuentran las quinasas receptoras con dominios extracelulares ricos en leucina (LRR), cuya inactivación impide la interacción de la planta tanto con rizobios como con micorrizas, aunque el pelo radical sigue deformándose en respuesta a la presencia de los factores Nod. También se han encontrado otras quinasas receptoras, con motivos LysM en su dominio extracelular, y que sí son esenciales para la deformación del pelo radical en presencia de los LCOs (Ferguson et al., 2010). 1.4.3.3.- Los polisacáridos de superficie Para el establecimiento de la interacción simbiótica, además de los factores Nod, son necesarias otras moléculas como los polisacáridos de superficie. Los rizobios producen diversas clases de polisacáridos que juegan un papel importante en la interacción con la leguminosa hospedadora. Los más importantes en cuanto a su relevancia simbiótica son los β-glucanos cíclicos (GC), los lipopolisacáridos (LPS), los exopolisacaridos (EPS) y los polisacáridos capsulares tipo antígeno-K (KPS) (Fraysse et al., 2003; Gage, 2004). Todos estos polisacáridos podrían actuar protegiendo a la bacteria frente a condiciones ambientales o frente a las respuestas defensivas de la planta y también como señales durante el proceso de nodulación (Mithöfer, 2002; D’Haeze y Holsters, 2002). En S. meliloti, algunos polisacáridos de superficie como el succinoglucano o el exopolisacárido II (EPSII) permiten a la bacteria invadir eficientemente la raíz de Medicago sativa para establecer una simbiosis fijadora de nitrógeno (Pellock et al., 2002). Se ha descrito que la síntesis del EPSII está regulada por la proteína ExpR, que únicamente se activa en presencia de uno de los AI sintetizado por la proteína SinI, la 3oxo-C16:1-HSL (Marketon et al., 2003). 1.4.3.4.- El sistema de secreción de tipo III La primera evidencia de la existencia en los rizobios de genes que pueden estar implicados en la biosíntesis del sistema de secreción de tipo III (T3SS) se obtuvo tras comprobar que S. fredii USDA257, en presencia de flavonoides inductores de los genes de nodulación, secretaba una serie de proteínas al medio extracelular, que posteriormente se han denominado como proteínas Nop (“Nodulation outer proteins”). Introducción  38  Tras secuenciar el plásmido simbiótico de Rhizobium sp. NGR234 (Freiberg et al., 1997) se identificaron los genes involucrados en la biosíntesis del T3SS rizobiano, que se agrupan en la denominada región tts. Al secuenciar el genoma de la estirpe MAFF303099 de M. loti (Kaneko et al., 2000) y la isla simbiótica de B. japonicum USDA110 (Göttfert et al., 2001) se han identificado otros sistemas de secreción. Además, dos estirpes de S. fredii, USDA257 y HH103, también poseen el T3SS (Krishnan et al., 2003; de Lyra et al., 2006). Todas las agrupaciones de genes del T3SS de los rizobios secuenciadas hasta el momento contienen 10 fases abiertas de lectura u ORF (del inglés, Open Reading Frame) que son homólogas a los genes ysc y hrc (Hueck, 1998; Bogdanove et al., 1996). Las proteínas Ysc, de Yersinia spp., y Hrc, de bacterias patógenas de plantas, son absolutamente necesarias para la secreción de los factores de virulencia. En los rizobios, se ha postulado que las proteínas Nop están implicadas en la determinación del rango de hospedador, ya que estas proteínas pueden modular la respuesta de defensa de la planta en las fases iniciales de la simbiosis (Lopez-Baena et al., 2009). 1.5.- QS en bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno Como previamente se ha descrito, las bacterias de los géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium y Azorhizobium, conocidos como rizobios, tienen la capacidad de infectar raíces de las leguminosas e inducir la diferenciación de unos órganos, los nódulos, donde se reduce el nitrógeno atmosfético hasta amonio, asimilable por las plantas. Se ha demostrado que muchos de los aspectos necesarios para esta interacción bacteria-planta están mediados por sistemas de QS, entre ellos el control de funciones necesarias para la colonización de la rizosfera, la competitividad, el establecimiento de la simbiosis, la formación del simbiosoma, la fijación de nitrógeno, etc. (Tabla 1.5.). Introducción  39  Tabla 1.5. Algunos sistemas de QS en bacterias de la familia Rhizobiaceae. Organismo Genes (localización) Autoinductor Fenotipo regulado Referencia A. tumefaciens traR/traI (pTi) 3-oxo-C8-HSL Transferencia de plásmido Piper et al. (1993) y Fuqua et al. (1994) R. leguminosarum bv. viciae cinR/cinI (C) 3-OH-C14:1-HSL Inhibición del crecimiento Lithgow et al. (2000) rhiR/rhiI (pRL1JI) C6-C7-C8-HSL Eficiencia en la nodulación Cubo et al. (1992) y Rodelas et al. (1999) traR/traI (pRL1JI) 3-oxo-C8-HSL, C8-HSL Transferencia de plásmido Wilkinson et al. (2002) y Danino et al. (2003) bv. phaseoli raiR/raiI (pNS) 3-OH-C8-HSL, C8-HSL Desconocido Wisniewski-Dye et al. (2002) R. etli CNPAF512 cinR/cinI (C) 3-OH-cadena larga-HSL Fijación de nitrógeno, desarrollo del simbiosoma, inhibición del crecimiento. Daniels et al. (2002) raiR/raiI (C) cadena corta-HSL Supresión de la nodulación de la fijación de nitrógeno, inhibición del crecimiento. Daniels et al. (2002) CFN42 traR/traI (p42a) 3-OH-C8-HSL, 3-oxo-C8-HSL Transferencia de plásmido Tun-Garrido et al. (2003) S. meliloti Rm1021 sinR/sinI (C) C12-HSL, 3-oxo-C14-HSL, C16:1-HSL, 3-oxo-C16:1-HSL 3-OH-C16:1-HSL, C18-HSL Producción de EPSII, swarming Marketon et al. (2002,2003) y Gao et al. (2005) melR/melI (putativo) C8-HSL y cadena corta-HSL Desconocido Marketon et al. (2002) Rm41 traR/traI (pRm41a) 3-oxo-C8-HSL Transferencia de plásmido Gonzalez y Marketon (2003) Rhizobium sp. NGR234 traR/traI (pNGR234a) 3-oxo-C8-HSL Transferencia de plásmido, Inhibición del crecimiento He et al. (2003) Genes desconocidos, otras AHL Desconocido He et al. (2003) ngrR/ngrI, AHL desconocidas Desconocido Schmeisser et al. (2009) (Bradyrhizobium japonicum USDA110 Desconocido, bradyoxetina Control de los genes nod Brelles-Marino y Bedmar 2001) y Loh y Stacey (2003) pTi: plásmido Ti, pNS: plásmido no simbiótico, C: cromosoma, p42a: plásmido 42a Introducción  46  1.5.2.3.- traI y traR La disposición de los genes de transferencia en el plásmido p42a de R. etli CFN42 es idéntica a los de pRL1JI de R. leguminosarum bv. viciae y, probablemente, ambos están regulados de manera similar al sistema tra de A. tumefaciens y están implicados en la transferencia del plásmido. La estirpe R. etli CNPAF512 no posee estos genes de QS (Sánchez-Contreras et al., 2007). 1.5.3.- Rhizobium sp. NGR234 Rhizobium sp. NGR234 forma nódulos simbióticos, fijadores de nitrógeno en un amplio rango de leguminosas hospedadoras gracias, en gran parte, a las funciones presentes en el plásmido simbiótico pNGR234a. La secuenciación de este plásmido reveló la presencia de los genes nod, fix y nif, que dirigen las interacciones durante la simbiosis, y el sistema de QS tra (Freiberg et al., 1997). Esta bacteria produce 3 AHL diferentes, la 3-oxo-C8-HSL, codificada por TraI y al menos una AHL de cadena corta y otra de cadena larga (He et al., 2003). Se desconocen los genes de síntesis de AHL implicados en la producción de estos AI, pero es seguro que no se encuentran en pNGR234a, ya que las estirpes curadas de este plásmido siguen produciendo estas dos AHL (He et al., 2003). Con la secuenciación de NGR234 (Schmeisser et al., 2009) se detectó la presencia de un segundo sistema de QS en el cromosoma, formado por los genes ngrI/R (Figura 1.18.), que podría ser uno de los genes implicados en la producción de estas AHL. Introducción  47  Figura 1.18. Sistemas de QS en Rhizobium sp. NGR234. Esta bacteria porta el plásmido simbiótico pNGR234, que posee los genes del sistema de QS tra. Este sistema produce la 3-oxo-C8-HSL y controla a través de TraR-AHL, la transferencia del plásmido. Sin embargo, la presencia de la proteína antiactivadora TraM, hace necesaria la presencia de un inductor, aún desconocido, que active la expresión de traR. Por otro lado, el complejo TraR-AHL potencia la producción de las otras AHL. No se conocen los genes de síntesis de las otras AHL detectadas, aunque probablemente, el sistema de QS ngr descubierto tras secuenciar el genoma de NGR234, sea uno de los implicados en la producción de estos AI. 1.5.3.1.- traI y traR Es posible que la transferencia del plásmido simbiótico en NGR234 esté regulada por QS, ya que los genes traI y traR se localizan en él. Además de esta pareja de genes, también se ha encontrado el gen traM, que codifica para la proteína antiactivadora TraM. El sistema por lo tanto, podría parecerse al sistema tra de A. tumefaciens. Sin embargo, en condiciones de laboratorio, la transferencia del plásmido ocurre con muy baja frecuencia (He et al., 2003), por lo que los autores sugieren que debe existir, como ocurre en A. tumefaciens con las opinas, un inductor del sistema tra. Parece claro sin embargo, que este sistema está implicado en la inhibición del crecimiento, ya que la adición externa de 3-oxo-C8-HSL a los cultivos ocasiona una reducción significativa en la tasa de crecimiento (He et al., 2003). Por otro lado, la sobreexpresión de traR genera Introducción  48  una mayor producción de todos los AI producidos por esta bacteria, lo cual sugiere que el sistema tra controla al resto de sistemas de QS de NGR234. 1.5.3.2.- ngrI y ngrR La secuenciación en 2009 del genoma de Rhizobium sp. NGR234, permitió la identificación de los genes ngrI y ngrR en el cromosoma. Hasta la fecha no se han llevado estudios sobre este sistema de QS de NGR234. En el trabajo de He et al. en 2003, se demostró que el mutante traI seguía produciendo una AHL de cadena corta y otra de cadena larga, por lo que se propuso la presencia de otros genes de síntesis de AHL. ngrI podría ser uno de estos genes. 1.5.4.- Sinorhizobium meliloti La regulación por QS en S. meliloti ha sido estudiada en tres estirpes diferentes: Rm1021, Rm41 y AK631. Sin embargo, es en la estirpe 1021, que está secuenciada, donde más a fondo se han estudiado los sistemas de QS. La estirpe Rm1021 posee al menos dos sistemas de QS, mel y sin. La estirpe Rm41 porta, además, el sistema tra para la transferencia del plásmido simbiótico (Figura 1.19.) (Marketon et al., 2002). 1.5.4.1.- sinI y sinR La proteína SinI es responsable de la síntesis de varias AHL de cadena larga, desde la C12-HSL hasta la C18-HSL. La mutación del gen sinI determina un retraso en la aparición de nódulos, así como un descenso en la cantidad de nódulos fijadores de nitrógeno, lo que sugiere que este sistema puede estar implicado en la simbiosis con Medicago sativa (Marketon et al., 2002). Se ha demostrado que el sistema sinI/R es necesario para la producción del EPSII, un polisacárido superficial que juega un papel importante durante la simbiosis. Sin embargo, para la producción de EPSII es necesaria la proteína reguladora ExpR, que se activa por la presencia de C16:1-HSL, producida por SinI. ExpR es un regulador positivo de los genes exp, implicados en la síntesis del EPSII (Marketon et al., 2003). Parece, por lo tanto, que la mutación en sinI impide la Introducción  49  activación de la producción del EPSII, ya que la AHL que activa a la proteína reguladora ExpR deja de producirse. Esto tiene como consecuencia el retraso en la formación de nódulos y la pérdida de la capacidad de fijación de nitrógeno de los mismos. Figura 1.19. Sistemas de QS en Sinorhizobium meliloti. La estirpe de S. meliloti Rm41 posee tres sistemas de QS, mientras que la estirpe Rm1021 sólo posee dos, ya que no tiene el plásmido pRm41a y, por lo tanto, no tiene el sistema tra. Este sistema, especialmente a través de la 3-oxo-C8-HSL regula la transferencia del plásmido. El sistema sin está en el cromosoma de ambas estirpes y está implicado en la regulación de la producción del exopolisacarido II (EPSII), de gran importancia en la simbiosis. En esta activación se requiere la presencia de la C16:1-HSL y de otro regulador, ExpR. Ambas bacterias sintetizan, además, AHL de cadena corta, pero los genes correspondientes aun no han sido identificados. 1.5.4.2.- Sistema mel La mutación en el gen de síntesis de AHL del sistema sin, impide la producción de las AHL de cadena larga, pero no así la producción de las AHL de cadena corta. Por lo tanto, se ha propuesto la existencia de un segundo sistema de QS, que se ha denominado Introducción  50  mel, responsable de la síntesis de estos AI (Marketon et al., 2002). Sin embargo, el análisis del genoma de Rm1021 no mostró la presencia de más genes de síntesis de AHL de tipo luxI, si bien, sí que se ha encontrado un homólogo a la proteína de síntesis de AHL HtdS de P. fluorescens. Sin embargo, la implicación de esta proteína en la producción de AHL de cadena corta no está demostrada. 1.5.4.3.- traI y traR Mientras que en la estirpe Rm1021 no existe el sistema tra, la estirpe Rm41 sí que posee un sistema de QS tra muy similar al que está presente en A. tumefaciens y en Rhizobium sp. NG234, ya que posee los genes traI, traR, traM y el operón para la transferencia del pRm41a (Gonzalez y Marketon, 2003). 1.5.5.- Bradyrhizobium japonicum Todos los rizobios descritos hasta la fecha usan AHL como moléculas de comunicación intercelular. La excepción es B. japonicum que usa como molécula autoinductora la bradyoxetina. La bradyoxetina está implicada en la represión de los genes nod a altas densidades poblacionales de la bacteria. La síntesis de este AI está favorecida por condiciones de déficit en hierro soluble y, de hecho la estructura química de este AI es similar a la de ciertos antibióticos y sideróforos (Loh et al., 2002). 1.6.- Interferencia en los sistemas de QS bacteriano La expresión coordinada de genes implicados en virulencia, colonización y simbiosis es crucial en la interacción bacteria-hospedador (Crespi y Galvez, 2000). En el caso de los patógenos es especialmente importante no activar genes implicados en la virulencia, ya que éstos pueden inducir en el hospedador una respuesta defensiva temprana ante la presencia de la bacteria, lo cual supone una clara ventaja para el hospedador ante una población bacteriana poco desarrollada (Zhang, 2003).   L o inter mol é estr u aque quór u 1.6. 1 El Esta s (Fig u regu l que mov i f isch fura n degr a adic i Fi gu halo g estr u A d siste m swa r De h o s eucariot a fieren con é culas impl i u ctura y/o f u llos que i n u m (Kesha v 1 .- Fura n alga roja D s molécula u ra 1.20.) y l ados medi a interfieren i lidad tipo s eri (Danie l n onas halo g a dación de i ón de la fu r u ra 1.20. E g enadas se u ctura quím i d emás de e n m as de Q S r ming y re d h echo, estu d a s, incluid a los siste m i cadas en l a u nción, aq u n terfieren c v an et al. 2 0 n onas hal o D elisea pu s poseen u y , de hecho , a nte QS ba c las furan o s warming m l s et al. 2 0 g enadas se esta prot e r anona se a ñ E structura considera n i ca con las A n S. liquefa S basados d uciendo si g d ios con m i a s las pla n m as de QS a IQS b act e u ellos que a n on las AI 0 05). og enadas lchra prod u u n enorme , se ha de m c teriano (M a o nas halog e m ediante el 0 04). Medi a unen al e l e ína. Sin e m ñ ade la AH L química d n molécula s A HL. ciens, las f u en el AI2 g nificativa m i croarray ll e 51 n tas, puede bacteriano e riano está n n tagonizan sintasas o u ce de for m parecido e m ostrado qu a nefield et a e nadas es sistema de a nte estudi o l emento re g m bargo, es t L adecuad a d e las fu r s mimética u ranonas h a 2 , inhibien m ente la fo r e vados a c a n produci r (IQS) (G a n aquellas q los AI (Te p los regula d m a natural e structural e pueden i n a l., 1999). U Serratia l i QS swr, ho o s in vitro g ulador S w t e fenóme n a (Manefiel d r anonas h a s estructur a a logenadas do comple t r mación de a bo en esta r diferentes a o et al. 2 q ue mimet i p lits k i et al . d ores de l a las furano n con las A H n terferir en U na de las b i quefaciens , mólogo al s se ha de m wr R y pro m n o se inhib e d et al. 200 2 a lo g enadas a les por s u interfieren t amente la biofilm ( R bacteria a Introd u s molécula s 2 003). Ent r i zan a los A . 2000) e i n a percepció n as haloge n H L de ba c ciertos pr o b acterias so b , que reg u s istema lux m ostrado q u m ueven la r e si previ o 2 ). . Las fura n u similitud en E. coli e movilida d R en et al., 2 la que se a ñ u cción  s que r e las A I en n cluso n del n adas. c terias o cesos b re la u la su de V. u e las r ápida o a la n onas en la e n los d tipo 2 001). ñ adió   AI-2 mov i las f u 1.6. 2 L a enc u ellas com o pue d que s alter a Fi gu del a Si n inter inter mol é regu l 1.6. 3 A. (Esc o tien e o furano n i lidad y sí n u ranonas h a 2 .- L -can a a L -canava n u entra excl u puede sup o o fuente d e d e inhibir e l s e incorpor a a das (Rose n u ra 1.21. E s a minoácido n embargo, fiere tamb i ferecia es i n é cula en cu l ada por Q S 3 .- Opin a tumefacie n o bar y Da n e los genes d n as haloge n n tesis de fla a logenadas ( a vanina n ina (Figur a u sivamente o ner el 5% e nitrógeno l crecimien t a en la sínt e n tal, 2001). s tructura q L -arginina. Keshavan i én en los n dependie n ltivos de S . S . a s n s es una n dekar, 200 3 d e virulenc i n adas most r gelos se ac ( Ren et al., a 1.21.) es en las se m del peso se para las s t o de ciert a e sis de pro t q uímica d e et al. (20 0 sistemas d e n te del efec t . meliloti e bacteria q u 3 ). Esta ca p i a y, adem á 52 r aron que tivaban po r 2005). un amino á m illas de le g co de la se m s emillas du r a s bacterias t eínas en l u e la L -cana v 0 5) demostr e QS del b t o en el cre c s suficient e u e causa t p acidad pat á s, parte de 44 genes i r el AI-2 y á cido deri v g uminosas y m illa (Wea k r ante la ge además de u gar de la L - v anina. Es t aron que e s b iosensor C c imiento. A e para inhi b t umores en ogénica re s su ADN ( A i mplicados se inhibía n v ado de la y , de hech o k s, 1977). A rminación, tener efec t - arginina y t a molécul a s te derivad o C . violaceu m A demás, la p b ir la prod u cientos d e s ide en su p A DN T ) se p u Introd u en quimi o n en presen c arginina q u o , en algu n A demás de s la L -cana v t o insectici d genera pro t a es un der o de amin o m CV026 y p resencia d e u cción de E e dicotiled ó p lásmido T i u ede transf e u cción  o taxis, c ia de u e se n as de s ervir v anina d a, ya t eínas ivado ácido y esta e esta E PSII, ó neas i , que e rir al   inter i unos por l espe c tra. S dens i Tra M de c i prot e plás m exis t octo p prot e Fi gu ami n de o p incr e 1.6. 4 R e flav o aeru g En e (Tul . QS e i or del núc l tipos de d e l a bacteria c ies de A. t S in embarg o i dad óptic a M . En esas c i ertas opina s e ína TraR, p m ido (Oger t en dos tip o p ina, y ca d e ína TraR ( O u ra 1.22. E n oácidos pr o p inas. La e s e menta la e x 4 .- Flavo n e cientemen t o noide co m g inosa PA O e se trabajo . ) Jongkind e sta bacteri a l eo de la cé e rivados de en el tu m t umefacien s o , la proteí n a adecuada, c ondicione s s , y la cant i p or lo que s y Farrand, o s de opin a d a una de e O ger y Far r E structura o ducidos p o s tructura q u x presión de l n oides t e, en el t r m o molécul a O 1, que co n se obtuvie r y se comp r a . El fracci o lula vegeta l aminoácid m o r (Zhu e t s , es transf e n a TraR, in c no es acti v s , la expresi ó i dad de pro t s e activan l 2001; Og e a s que acti v e llas, medi r and, 2002). química o r la planta u e se mues t l gen traR. r abajo de V a que inte r n trolan la p r r on extract o r obó que r e o namiento d 53 l . Este AD N os, las opi n t al., 2000 ) e rido por c o c luso cuan d v a ya que e ó n de traR t eína TraM l os sistema s e r y Farran d v an la exp ante rutas de las o p inducidos p t ra es de la V andeputte r fiere en l o r oducción d o s de hoja s e ducían la p d e los extra N induce a l n as (Figura ) . Este plá s o njugación d o la pobla c e stá unida a se increme n no es sufic i s de QS y s d , 2002) (P i resión del diferentes, p inas. Las p or la bact e agrocinopi n et al. (20 o s sistema s d e factores s y corteza p roducción d ctos y su a n l a célula v e 1.22.), que s mido, ent r mediante e c ión de la b a a la proteí n n ta únicam e i ente para b s e inicia la t i per et al., 1 gen traR, l increment a opinas s o e ria. Existe n n a B, una d 10), se ha s del QS d de virulen c de Comb r d e factores n álisis per m Introd u e getal a sint son consu m r e las dife r e l sistema d a cteria alca n n a antiactiv e nte en pre s b loquear a t o t ransferenc i 1 999). Al m l a nopalin a a la cantid a o n derivad o n diferentes d e las opin a identifica d d e Pseudo m c ia mediant e r etum albi fl dependien t m itió identi f u cción  etizar m idos r entes d e QS n za l a adora s encia o da la i a del m enos a y la a d de o s de tipos a s que d o un m onas e QS. fl orum t es de f icar a   un fl flav a desc e b act e med i las p Fi gu prod u fact o inhi b 1.6. 5 El coli E por secr e (Sir c prot e nora d rece p hum a fl avonoide c a n-3-ol cate e nso en la e ria, así co m i ante siste m arejas de g e u ra 1.23. E u cido por l a o res de vir u b ición de lo s 5 .- Horm o cuerpo hu m E HEC el s i ejemplo l a e ción de ti p c illi et al., 2 e ínas se re s d renalina ( S p tores adr e a nas. (Figu r c omo una d quina. Se c producció n m o en la fo m as de QS y e nes las y r h E structura a planta C o u lencia de s sistemas d o nas hu m m ano pued e i stema de Q a patogenic i p o III, que 2 004). Sorp r s tauraron e n S perandio e e nérgicos b r a 1.24.). d e las mol é c omprobó, a n de pioci a fo rmación d y , de hecho, hl (Figura 1 química o mbretum a la bacteri d e QS bact e m anas e también i n Q S dependi e i dad y la son básic o r endenteme n una esti rp e t al., 2003 ) loqueó la 54 é culas que a demás, qu e a nina y el a d e biofilm. la presenc i 1 .23.). de la fla v lbiflorum ( T a Pseudo m e riano. n terferir co n e nte de Lu x secreción d o s en la vi r nte, los fe n rp e mutant e ) . Además, activación interferían e la catequ i a stasa, fac t Todos est o i a del flavo n v an-3-ol c a T ul.) Jong k m onas aeru g n los siste m x S control a d e proteín a r ulencia a n n otipos de p e luxS con el tratami e del muta n en los sis t i na purifica d t ores de vi r o s procesos n oide inhib e a tequina. k in d inhibe l g inosa PA m as de QS b a diferentes a s a través n te células atogenicid a las hormo n e nto con an t n te luxS p o Introd u t emas de Q d a provoca b r ulencia d e están reg u e la expresi Este flavo l a producci O1 media n b acteriano. E fenotipos c del siste m epiteliales a d y secreci n as adrena l t agonistas d o r las hor m u cción  Q S, la b a un e esta u lados ón de n oide ó n de n te la E n E. c omo, m a de HeLa ón de l ina y d e los m onas   Fi gu hum a nora d 1.6. 6 E n que med i que l Así, inhi b QS. acti v exu d QS d com o O t exu d acti v b ios e b asa d fuer o semi Ahy R u ra 1.24. E s a nas activa n d renalina. 6 .- Otros n 2000, Te p denominar o i ante QS. A l a naturale z las semilla s b ían la pro d Además, o v idades pro t d ados de se m d e otros bi o o AhyR de A t ros estudi o d ados de se v an o inhi b e nsores ba c d os en los r o n activado lla, inhibi e R (A. hydr op s tructura q n los siste m compues t p listki et a l o n AHL-m i A pesar de z a química d s de guisan t d ucción de o tros feno t t easa y ex o m illas. Esto o sensores b A eromona s o s llevados a milla de e s b en especí f c terianos b a r eguladores s en prese n e ron a bio s op hila), Las R q uímica de m as de QS d t os que i n l ., descubri e i mic que a no identifi c d e las mis m t e (Pisum s a violaceína t ipos regu l o quitinasa, f s exudados , b asados en s hydrophil a a cabo en M s ta planta, e f icamente f a sados en v CepR (P. p n cia de ext r s ensores b a R (P. aeru g 55 la adrena l d e E. coli E n terfiere n e ron varias ctivaban l a c ar químic a m as era dife r a tivum) y s u en C. viol a l ados por f ueron inhi b , además, a c diferentes a o LasR de M edicago t r e xisten ent r f enotipos r v arios regul a p utida), La s r actos de e x a sados en l g inosa) y L u l ina y nor a E HEC. Der e n en los si s moléculas a expresión a mente a e r ente según u s exudado s a ceum, un f QS en es t b idos susta n c tivaban va r elementos P.aerugin o r uncatula i n r e 15 o 20 egulados m a dores d e t s R (P. aeru g x udados de os regulad o u xR (V. f is c a redranila. e cha: adre n s temas d e de plantas de varios stas moléc u la planta q u s contenían f enotipo re g t a bacteria , n cialmente r ios fenoti p reguladore o sa. n dicaron q u compuest o m ediante Q t ipo LuxR. g inosa) y L u semilla. O t o res CviR c heri) (Gao Introd u Estas hor m n alina. Izqu i e QS superiores genes reg u u las, const a u e las prod u compuest o g ulado me d , como so n en presen c p os regulad o s de tipo L u e, en semi o s diferente Q S en dife r Los biose n u xR (V. f is c t ros extrac t (C. violac e et al., 2003 u cción  m onas i erda: a las u lados a taron u jese. o s que d iante n las c ia de o s por L uxR, llas y s que r entes n sores c heri) t os de e um), ).   Materiales y Métodos  63  3.1.- Bacterias, plásmidos y medios de cultivo 3.1.1.- Bacterias y plásmidos Las estirpes bacterianas y los plásmidos utilizados en esta Tesis se recogen en la siguiente Tabla 3.1. Tabla 3.1. Bacterias y plásmidos utilizados. Estirpe Características relevantes Referencia Sinorhizobium fredii SMH12 Estirpe silvestre, ApR Rodríguez-Navarro et al. 2003 SMH12 (pMP240) SMH12 con el plásmido pMP240, portador del promotor del gen nodA fusionado a lacZ, TcR Dardanelli et al. 2010 SMH12 (pME6863) SMH12 con el plásmido pME6863, portador del gen que codifica la proteína lactonasa, TcR Esta Tesis SMH12 (pMP2463) SMH12 con el plásmido pMP2463, portador del gen que codifica la proteína fluorescente verde, GmR Esta Tesis SMH12 (pMP6863) (pMP2463) SMH12 con los plásmidos pME6863 y pMP2463, portadores de los genes que codifican la proteína lactonasa y la proteína fluorescente verde, respectivamente, TcR GmR Esta Tesis SVQ646 SMH12 traI::lacZ-GmR Esta Tesis SVQ646 (pMP2463) SVQ646 con el plásmido pMP2463, portador del gen que codifica la proteína fluorescente verde, GmR Esta Tesis SVQ648 SMH12 nodD1::lacZ-GmR Esta Tesis SVQ648 (pMP2463) SVQ648 con el plásmido pMP2463, portador del gen que codifica la proteína fluorescente verde, GmR Esta Tesis Rhizobium etli ISP42 Estirpe silvestre Rodríguez-Navarro et al. 2000 SVQ612 ISP42, RifR Esta Tesis Materiales y Métodos  64  ISP42(pMP240) ISP42 con el plásmido pMP240, portador del promotor del gen nodA fusionado a lacZ, TcR Dardanelli et al. 2008 SVQ664 ISP42 RifR raiI:: Ω, SpcR Esta Tesis SVQ612 (pME6863) ISP42 RifR con el plásmido pME6863, portador del gen que codifica la proteína lactonasa, TcR Esta Tesis Rhizobium sullae IS123 Estirpe silvestre Espuny et al. 1987 IS123 (pMP240) IS123 con el plásmido pMP240, portador del promotor del gen nodA fusionado a lacZ, TcR Pérez-Montaño et al. 2011 Escherichia coli DH5α SupE44, ΔlacU169, 5hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, NxR Sambrook et al. 1989 Estirpes biosensoras Agrobacterium tumefaciens NT1 (pZRL4) A.tumefaciens curada del plásmido pTiC58; con el plásmido pZRL4, portador de la fusión traG::lacZ y del gen traR, GmR Cha et al. 1998 Agrobacterium tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) A.tumefaciens NT1(pZRL4) con el plásmido pME6863, portador del gen que codifica la proteína lactonasa, GmR, TcR Esta Tesis E. coli JM109 (pSB536) E. coli con el plásmido pSB536, portador de la construcción ahyR-pahyI::luxCDABE, TcR Swift el al. 1997 E. coli JM109 (pSB536) (pME6863) E. coli JM109 (pSB536) con el plásmido pME6863, portador del gen que codifica la proteína lactonasa, TcR Esta Tesis Chroombacterium violaceum CV026 C.violaceum cviI::mini-Tn5 McClean et al. 1997 Plásmido Características relevantes Referencia pGEM-T Easy Vector de clonación de productos de PCR, ApR Promega pMBL-T Vector Vector de clonación de productos de PCR, ApR MBL dominion pAB2001 Plásmido que contiene el cassette lacZGmR, ApR, GmR Becker et al., 1995 Materiales y Métodos  65  pHP45Ω Plásmido que contiene el interposón Ω , SpcR/StrR, ApR Prentki y Krisch, 1984 pK18mob Vector de clonación (suicida en los rizobios), KmR Schäfer et al., 1994 pMP92 Vector de clonación de amplio rango de hospedador IncP, TcR Spaink et al., 1987 pMP240 Plásmido pMP92 que contiene el promotor del gen nodA de R. leguminosarum bv viceae fusionado al gen lacZ, TcR De Maagd et al., 1988 pBBR-MCS-5 Vector de expresión de amplio rango de hospedador, GmR Kovach et al., 1995 pME6863 pME6000::aiiA, plásmido que contiene el gen que codifica la proteína lactonasa, TcR Reimmann et al., 2002 pMP2463 pBBR-MCS-5::egfp-1, plásmido que contiene el gen que codifica la proteína fluorescente verde, GmR Stuurman et al., 2000 pRK2013 Plásmido ayudador, KmR Figurski y Helinski, 1979 pMUS534 Plásmido pK18mob que contiene un fragmento HindIII de ~6 kb procedente de un plásmido que porta la fusión nodD1::lacZ-GmR (gen nodD1 procedente de HH103) Vinardell et al., 2004 pMUS977 Plásmido pMBL-T Vector que porta un fragmento de PCR de ~1,2 kb que contiene el gen traI de SMH12 Esta tesis pMUS979 Plásmido pMBL-T Vector que porta un fragmento de PCR de ~1kb que contiene el gen raiI de ISP42 Esta tesis pMUS989 Plásmido pK18mob que contiene un fragmento EcoRI HindIII de ~1,2 kb procedente de pMUS977 Esta tesis pMUS994 Plásmido pK18mob que contiene un fragmento EcoRI HindIII de ~1 kb procedente de pMUS979 Esta tesis pMUS996 pMUS994 con el interposón Ω inserto en un punto BamHI del gen raiI Esta tesis pMUS1009 pMUS989 con el cassette lacZ-GmRinserto en un punto AleI (romo) del gen traI Esta tesis pMUS1033 Plásmido pMBL-T Vector que porta un fragmento de PCR de ~1 kb que contiene el Esta tesis Materiales y Métodos  66  gen cinI de ISP42 pMUS1042 Plásmido pK18mob que contiene un fragmento BamHI HindIII de ~1kb procedente de pMUS1033 Esta Tesis pMUS1044 pMUS1042 con el interposón Ω inserto en un punto ClaI del gen cinI Esta Tesis pMUS1063 Plásmido pBBR-MCS-5 que contiene un fragmento EcoRI hindIII de ~1 kb procedente de pMUS1033 Esta tesis pMUS1064 Plásmido pBBR-MCS-5 que contiene un fragmento EcoRI XhoI de ~1 kb procedente de pMUS977 Esta tesis pMUS1071 Plásmido pBBR-MCS-5 que contiene un fragmento EcoRI SacI de ~1 kb procedente de pMUS979 Esta tesis pMUS1099 Plásmido pGEM-T Easy que porta un fragmento de PCR de ~1,2 kb que contiene el gen traI(2) de SMH12 Esta tesis Ap: ampicilina, Gm: gentamicina, Km: kanamicina, Nx: ácido nalidíxico, Spc: espectinomicina, Str: estreptomicina, Tc: tetraciclina. 3.1.2.- Medios de cultivo para Sinorhizobium, Rhizobium y Agrobacterium Las estirpes de Sinorhizobium, Rhizobium y Agrobacterium se cultivaron en los medios que se detallan a continuación. Los cultivos líquidos se incubaron en agitación a 180 r.p.m. Los medios se solidificaron, cuando fue necesario, añadiendo 20 g L-1 de agar. En ambos casos la temperatura de incubación fue de 28 ºC. Medio TY (Behringer, 1974) Extracto de levadura 3 g Triptona 5 g CaCl22H2O 0,65 g H2O Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Materiales y Métodos  67  Medio YM (Vincent, 1970) K2HPO4 500 mg MgSO47H2O 200 mg NaCl 100 mg Extracto de levadura 400 mg Manitol 10 g / 3 g H2O Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). El medio YM se usó tanto con 10 gramos de manitol por litro como con 3 gramos de manitol por litro de medio, según el experimento llevado a cabo. Medio MGM bajo en fosfato (100 µM) (Rinaudi y Giordano, 2010) Ácido Morfolinopropansulfonico (MOPS) 10,46 g Manitol 10 g H2O Añadir hasta los 800 ml aproximadamente El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Se preparan por separado las siguientes soluciones, que se esterilizaron en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). CaCl2 0,5 M 100 µl MgSO4 0,1 M 10 ml Biotina 0,4 mM 2 ml Glutamato sódico 380 mM 10 ml K2HPO4KH2PO4 100 mM 200 µl H2O estéril Completar hasta 1 L 3.1.3.- Medios de cultivo para Escherichia coli y Chromobacterium violaceum CV026 Para cultivar las estirpes de E. coli y el biosensor C. violaceum CV026 se utilizó el medio rico de Luria-Bertani (LB). Los cultivos líquidos se incubaron en agitación a 180 r.p.m. Los medios se solidificaron, cuando fue necesario, añadiendo 20 g L-1 de agar. La temperatura de incubación fue de 37 ºC para las estirpes de E.coli y de 28 ºC en el caso de CV026. Materiales y Métodos  68  LB (Maniatis et al., 1982). Extracto de levadura 5 g Triptona 10 g NaCl 5 g H2O Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). 3.1.4.- Agentes selectivos e identificativos Para la selección e identificación de las diferentes estirpes bacterianas y plásmidos se utilizaron los siguientes agentes selectivos, suministrados por Sigma, a las concentraciones indicadas: Antibiótico Solución stock (mg mL-1) S. fredii SMH12 (μg mL-1) R. etli ISP42 (μg mL-1) E. coli (μg mL-1) Ampicilina (Ap) 100 - - 100 Espectinomicina (Spc) 50 50 50 100 Gentamicina (Gm) 50 5 5 10 Kanamicina (Km)1 30 120 30 30 Ácido nalidíxico (Nal)3 10 - - 20 Rifampicina (Rif) 25 50 50 25 Tetraciclina (Tc)2 10 2 5 10 X-gal 20 40 40 40 X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido. La rifampicina1 se disolvió en metanol, la tetraciclina2 en etanol al 70% y el ácido nalidíxico3 en una solución de NaOH 0,1M. Los demás antibióticos se disolvieron en agua. La temperatura de almacenamiento de los antibióticos fue de -20 ºC. El X-gal, suministrado por Roche, se disolvió en N, N-dimetilformamida (20 mg mL-1) y también se conservó a -20 ºC. 3.1.5.- Flavonoides Los flavonoides, suministrados por Sigma Aldrich, se prepararon a una concentración de 1 mg mL-1 en etanol absoluto y se añadieron a los cultivos para alcanzar una Materiales y Métodos  69  concentración final de aproximadamente 3,7 μM. La temperatura de almacenamiento fue de -20 ºC. Se utilizaron 9 flavonoides para la inducción de las estirpes: una flavanona (naringenina), dos flavonoles (morina, y quercetina), dos isoflavonas (genisteína y daidzeína), dos flavonas (7, 4’-dihidroxiflavona y apigenina), una chalcona (isoliquiritigenina) y una coumarina (umbeliferona). 3.1.6.- Medidas de pH y espectrofotométricas El pH de las soluciones se midió con un pH-metro modelo pH-meter BASIC 20+ (Crison). Para realizar las medidas espectrofotométricas se empleó el espectrofotómetro Novaspec II (Pharmacia LKB). 3.1.7.- Solución de congelación Se utilizó para conservar las estirpes bacterianas durante largos periodos de tiempo. Tras cultivar las bacterias en los medios apropiados, la biomasa procedente de 5 mL de cultivo se resuspendió en 1,5 mL de una solución compuesta de peptona al 0,5% (m/v) y de glicerol al 15% (v/v) esterilizada en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Las bacterias así preparadas se conservaron a -80 ºC. 3.2.- Técnicas microbiológicas 3.2.1.- Métodos de transferencia de ADN entre bacterias 3.2.1.1.- Conjugación Se utilizó para transferir plásmidos desde distintas estirpes de E. coli a Sinorhizobium y Rhizobium. Para ello se mezclaron en un tubo eppendorf, 800 μL de cultivo de las estirpes de Sinohizobium y Rhizobium receptoras cultivadas en agitación durante 48 horas, con 200 μL de cultivo en fase logarítmica de las estirpes de E. coli donadoras de los plásmidos, cultivadas en condiciones estáticas durante 24 horas. Cuando fue Materiales y Métodos  70  necesario, se añadieron 100 μL de cultivo de la estirpe de E. coli portadora del plásmido pRK2013, también en fase logarítmica y cultivada en condiciones estáticas (24 horas), que actuó como coadyuvante en la transferencia de los plásmidos. Esta mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 13000 r.p.m. El sobrenadante se retiró con cuidado y las células se resuspendieron con una pipeta en 100 μL de agua destilada estéril. Posteriormente, se colocaron como una gota o un parche en una placa con medio TY y se incubaron a 28 ºC durante 24 horas. La masa celular desarrollada se recogió y se resuspendió en 1-2 mL de glicerol-peptona. Posteriormente se realizaron las diluciones apropiadas para sembrar placas de TY o YMA con los antibióticos adecuados y así seleccionar las estirpes transconjugantes. Las colonias desarrolladas se purificaron por sucesivas siembras en el mismo medio selectivo. La masa celular resuspendida en glicerol-peptona se conservó, cuando fue necesario, a -20 ºC. 3.2.1.2.- Transformación de Escherichia coli Se siguió el método del TSS (del inglés Transformation and Storage Solution) descrito por Chung et al. (1989). Se inocularon tubos con 3 mL de LB líquido con un cultivo de la estirpe de E. coli crecida en medio LB líquido suplementado con los antibióticos adecuados. Cuando la densidad óptica a 600 nm fue de 0,3-0,4, se transfirió 1 mL de cultivo a un tubo eppendorf, que se mantuvo durante 5 minutos en hielo, y se centrifugó a máxima velocidad durante 1 minuto. Las células se resuspendieron en 75 μL de LB estéril frío y se mantuvieron durante 5 minutos en hielo. Posteriormente, se añadieron otros 75 μL de TSS 2X frío, se mezcló todo suavemente y se mantuvo de nuevo la mezcla durante 5 minutos en hielo. De esta manera se obtuvieron células competentes de forma rápida inmediatamente antes de realizar la transformación. El ADN plasmídico que se quería transferir se añadió a las células competentes y la mezcla se mantuvo en hielo durante al menos otros 30 minutos. A continuación, las células se sometieron a un choque térmico (42 ºC durante 1 minuto y 5 minutos en hielo) para permitir la entrada del ADN plasmídico en la célula. Finalmente se añadió 1 mL de LB y se incubó a 37 ºC durante 1 hora. Materiales y Métodos  71  Los transformantes se seleccionaron sembrando la transformación en placas de LB suplementadas con los antibióticos adecuados. Cuando el plásmido transferido portaba el gen de resistencia a la gentamicina, después de incubar la mezcla de transformación en 1 mL de LB a 37 ºC durante 1 hora, se le añadió gentamicina a una concentración de 1 µg mL-1 y se incubó a la misma temperatura otra hora más antes de seleccionar las células transformantes a la concentración de gentamicina adecuada. Soluciones empleadas: TSS 2X Triptona 0,8 g, extracto de levadura 0,5 g, NaCl 0,5 g, polietilénglicol 20 g, 10 mL DMSO (dimetil sulfóxido), 10 mL MgSO4 1M. Completar con agua destilada hasta 100 mL. Ajustar el pH a 6,5. 3.2.2.- Determinación de la actividad β-galactosidasa Se realizaron ensayos de la actividad β-galactosidasa con tres objetivos diferentes: I) determinar la capacidad de inducción de diferentes flavonoides sobre los genes de nodulación en las tres estirpes estudiadas tras la introducción del plásmido pMP240 en cada una de ellas, II) comparar la producción total de AI en presencia/ausencia de diferentes flavonoides en las tres estirpes de rizobios y III) determinar el número de moléculas de tipo AI producidas por cada estirpe. Para el primer tipo de ensayo de actividad β-galactosidasa, en el que se midió la capacidad de inducción de diferentes flavonoides sobre los genes de nodulación en las tres estirpes estudiadas, se empleó el método desarrollado por Miller (1972). Se inocularon, a partir de cultivos bacterianos crecidos en fase exponencial, tubos con 3 mL de YM líquido (suplementado con flavonoides cuando fue necesario) que se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica a 660 nm de 0,15-0,30. A continuación, 200 μL de estos cultivos se mezclaron con 800 μL de tampón Z, 20 μL de cloroformo y 10 μL de SDS al 0,1% (m/v). La mezcla se agitó vigorosamente durante 15 segundos para favorecer la lisis celular. A esta mezcla se le añadieron 200 μL de ONPG (ortonitrofenil-β-D-galactopiranósido) preparado a 4 mg mL-1 en tampón Z y se esperó a que la mezcla de reacción adquiriese un tono amarillo. En ese momento se detuvo la Materiales y Métodos  78  3.2.8.- Curvas de crecimiento. Se midió el cremiento de las tres estirpes bacterianas (SMH12, ISP42 e IS123) en presencia/ausencia de flavonoides inductores de los genes de nodulación y, también se midió el crecimiento de la estirpe silvestre S. fredii SMH12 y sus derivados. En cada experimento la metodología empleada fue diferente. El crecimiento de las estirpes bacterianas se analizó cultivándolas en medio YM(3). Para ello se prepararon precultivos de los microorganismos en 5 ml de medio YM(3) y, cuando alcanzaron una absorbancia a 600 nm en torno a 1 se diluyeron 100 veces en tubos con 5 ml de medio YM(3) suplementado o no con el flavonoide adecuado (genisteína en el caso de SMH12, apigenina en el de ISP42 o daidzeína en el de IS123) en el caso de las curvas de crecimiento en presencia/ausencia de flavonoides inductores de los genes de nodulación. Se inocularon tres tubos de 5 ml por cada condición de estudio y se medió la absorbancia a 600 nm cada dos o cuatro horas hasta que los cultivos alcanzaron la fase estacionaria de crecimiento. El experimento fue llevado a cabo por duplicado. En el caso de las curvas de crecimiento de los derivados de S. fredii SMH12, el procedimiento fue diferente, ya que las bacterias se cultivaron en placas multipocillo. Así pues, se prepararon precultivos de los microorganismos en 5 ml de medio YM(3) y, cuando alcanzaron una absorbancia a 600 nm en torno a 1 se diluyeron 100 veces en placas multipocillo con 200 µl de medio YM(3) en cada pocillo. De esta forma se inocularon 6 pocillos por cada bacteria y se midió la absorbancia a 600 nm en un lector de placas Synergy HT (BioTek) cada dos o cuatro horas hasta que los cultivos alcanzaron la fase estacionaria. El experimento fue llevado a cabo por duplicado. 3.3.- Métodos de biología molecular 3.3.1.- Extracción del ADN genómico Para la purificación de ADN genómico de Sinorhizobium y Rhizobium se utilizó el kit Quantum prep Aquapure Genomic DNA isolation kit (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Materiales y Métodos  79  3.3.2.- Extracción del ADN plasmídico La extracción de ADN plasmídico se llevó a cabo mediante dos métodos, el primero de ellos siguiendo el protocolo descrito por Sambrook et al. (1989) y el segundo de ellos mediante el kits NucleoSpin Plasmid Quick Pure (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para el protocolo descrito por Sambrook se centrifugaron 1,5 mL de un cultivo en fase estacionaria a 13000 x g durante 1 minuto para recoger las células. Tras la centrifugación, se desechó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 100 μL de solución I utilizando un vórtex. A continuación, se añadieron 200 μL de solución II y se mezcló invirtiendo el tubo varias veces hasta que la mezcla se clarificó. Posteriormente, se añadieron 150 μL de solución III y se mezcló, para después centrifugar a 13000 x g. durante 10 minutos. El sobrenadante se pasó a un tubo vacío y se añadió 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se mezcló mediante vórtex y se centrifugó a 13000 x g durante 5 minutos. La fase superior acuosa se retiró cuidadosamente a otro tubo con un pipeta y se le añadió 1 volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se volvió a mezclar y se centrifugó a 13000 x g durante 5 minutos. La fase superior se pasó cuidadosamente a otro tubo y se le añadieron 2,5 volúmenes de etanol absoluto. La mezcla se mantuvo a -20 ºC durante al menos 20 minutos para que el ADN precipitara y se centrifugó a 13000 x g. durante 20 minutos. El precipitado se lavó con etanol al 70%, se dejó secar y se resuspendió en 20 μL de tampón TER. Soluciones empleadas: Solución I Glucosa 50mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM, pH 8. Solución II* NaOH 0,2M, SDS 1% (m/v). Solución III Acetato potásico 5M [60% (v/v)], ácido acético glacial 11,5% (v/v). Tampón TER Tris-HCl 10 mM, pH 8; EDTA 1 mM, pH 8; ARNasa 50 μg mL-1. * Preparar en el acto La extracción de plásmidos también se realizó utilizando los kits NucleoSpin Plasmid Quick Pure (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Materiales y Métodos  80  3.3.3.- Restricción del ADN Se utilizaron las endonucleasas de restricción suministradas por Roche y NewEngland Biolabs. En todos los casos se utilizaron los tampones y se siguieron las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la restricción se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa. 3.3.4.- Electroforesis del ADN Se llevó a cabo en geles de agarosa desde el 0,6% hasta el 2% (m/v) preteñidos con bromuro de etidio (5 µl de bromuro de etidio 0,325 mg/ml por cada 50 ml de gel de agarosa) en tampón TAE 0,5X dependiendo del peso molecular de los fragmentos que se quisieron identificar (Maniatis et al., 1982). Las muestras de ADN mezcladas con el tampón de carga se añadieron a los pocillos del gel. Como patrones de referencia se usaron diferentes marcadores de peso molecular, como el ADN del fago λ digerido con la enzima de restricción HindIII. La electroforesis se llevó a cabo utilizando el aparato Mupid-21 (Cosmo Bio) a 50 ó 100 V. Las bandas se visualizaron en un transiluminador de luz UV a 260 nm. A continuación se capturaron las imágenes utilizando el sistema de captación de imágenes Gel Doc 2000 (Bio-Rad) y analizándolas con el programa informático Quantity One (Bio-Rad). Soluciones empleadas: Tampón TAE Tris-HCl 30mM, 0,002% (v/v) EDTA 0,5M pH 8, ácido acético glacial 0,00114% (v/v). Ajustar el pH a 8. Tampón de carga Azul de bromofenol 0,25% (m/v), xileno cianol FF 0,25% (m/v), glicerol 30% (v/v). 3.3.5.- Aislamiento del ADN de geles de agarosa Para recuperar el ADN de un gel de agarosa, se cortó la porción de éste que contenía la banda de interés. El ADN se purificó mediante el kit NucleoSpin Extract (MachereyNagel), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Materiales y Métodos  81  3.3.6.- Desfosforilación del ADN Tras la restricción de un vector, se añadió a la mezcla de reacción la enzima fosfatasa alcalina (Roche) y se incubó la reacción durante 30 minutos a 37 ºC. Posteriormente se inactivó la enzima añadiendo ácido etilén-glicol tetraacético (EGTA) 0,2M pH 9,0 a la mezcla de reacción en una proporción 1:10 (v/v) e incubando durante 30 minutos a 65 ºC. Finalmente la mezcla se fenolizó y el ADN se precipitó con etanol absoluto o se purificó mediante el kit NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. 3.3.7.- Conversión de extremos cohesivos en romos Se realizó cuando las enzimas de restricción empleadas no eran compatibles para ligar vector e inserto. Si la endonucleasa origina extremos 5’ monocatenarios, éstos se pueden convertir en bicatenarios mediante la actividad polimerasa del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli en presencia de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP). Para ello, tras la digestión del ADN con la enzima adecuada en un volumen final de 20 μL, se añadió 1 μL de una solución de dNTP a una concentración de 1 mM y 1 unidad de la enzima Klenow. La reacción se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se inactivaron las enzimas presentes en la reacción calentando a 75 ºC durante 10 minutos o mediante fenolización. Si la enzima de restricción produce extremos 3’ monocatenarios, se pueden usar dos enzimas, el propio fragmento Klenow, con el mismo procedimiento que el anterior (pero sin añadir dNTP), ya que tiene actividad exonucleasa, o se realiza un tratamiento similar pero utilizando la ADN polimerasa del bacteriófago T4 que tiene actividad exonucleasa. Para ello, tras la digestión del ADN con la enzima adecuada en un volumen final de 20 μL, se añadió 1 μL de una solución de dNTP a una concentración de 2 mM y 1-2 unidades de polimerasa T4. La reacción se incubó durante 15 minutos a 12 ºC. Posteriormente, se inactivaron las enzimas presentes en la reacción calentando a 75 ºC durante 10 minutos o mediante fenolización. Materiales y Métodos  82  3.3.8.- Ligación del ADN Para clonar un fragmento de ADN en un vector, las moléculas de ADN ya digeridas con la(s) enzima(s) de restricción adecuada(s), tratadas con fenol y precipitadas con etanol absoluto, se mezclaron en las proporciones adecuadas y se les añadió 1/10 del volumen final del tampón de ligación y 1 μL (1 U μL-1) de la ligasa de T4 (Roche). La mezcla se incubó durante un mínimo de 4 horas a temperatura ambiente (para extremos cohesivos) o a 4 ºC (para extremos romos). Los productos de la reacción se utilizaron para transformar células competentes de E. coli mediante el método descrito anteriormente. 3.3.9.- Amplificación del ADN por PCR Se realizó siguiendo el protocolo descrito por Saiki (1990). Los programas usados en cada caso siguen el siguiente esquema común: 1.- Desnaturalización del ADN a 95 ºC durante 5 minutos. 2.- Desnaturalización del ADN a 95 ºC durante 30 segundos. 3.- Unión de los cebadores al ADN de cadena simple a la temperatura recomendada por el fabricante (Tib Molbiol e IDT) durante 30 segundos. 4.- Polimerización del ADN a 72 ºC variando el tiempo de polimerización en función del tamaño del ADN a amplificar (1 minuto/kb). 5.- Repetición del ciclo de polimerización (desde el paso 2), de 34 a 39 veces más. 6.- Polimerización del ADN a 72 ºC durante 5 minutos. El volumen de la mezcla de reacción varió dependiendo del experimento. Como norma general, 20 μL de mezcla reacción contenían los cebadores usados a una concentración de 0,2 μM, dNTP a 0,2 mM, tampón de PCR y 0,1 U de Taq polimerasa. Los cebadores (Tabla 3.2.) fueron diseñados utilizando el programa informático GeneFisher 1.22 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/). Los cebadores utilizados se diseñaron teniendo en cuenta que: Materiales y Métodos  83  1.- La longitud fuera de alrededor de 20 nucleótidos. 2.- El porcentaje de G + C estuviera comprendido entre 55-65%. 3.- La temperatura de fusión (Tm) estuviera comprendida entre 50-65 ºC. 4.- Los cebadores no aparearan entre sí. Tabla 3.2. Cebadores utilizados en experimentos de amplificación del ADN por PCR. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) TraI F CCAGAAGATTGGGATTGACA 20 53,5 TraI R TGTCCGCCTATCGGAAGCTCA 21 62,6 RaiIext F CCCCGGGATATCGCCTCTCGA 21 66,4 RaiIext R GCAACCATGGCGCGATGTGA 20 65,9 CinIext F GCTAATCCCCCCATCTGA 18 53,5 CinIext R GCTGAGCCTTCTTTTCGTA 19 52,4 SinIext F GCAGGAAAAGACGAGTGTCA 20 55,2 SinIext R CCGAGGGTTCTTGAGATCGA 20 57,7 MelI F GCAGATGATCGTGCTGA 17 49,7 MelI R CCAGGGAAACGGAGGA 16 54 TraI(2) F GATTCCCTCCTGCTGACA 18 52,6 TraI(2) R GACGGTTTTCTGACACGA 18 51,7 RaiIint F CCTCACCAAAGACATGCTCGAGA 22 58,1 RaiIint R CATGCCGCTATCGGCGAGA 19 62,8 CinIint F GCTGCCATCTCCAGGAA 17 53,9 CinIint F CCTATCTCGTCTGGTGCA 18 51,5 SinIint F GATCAGGATAGTGAACGGAA 20 50,2 SinIint R GAAGCAGACTTCTCGACA 18 48,1 Materiales y Métodos  84  3.3.10.- Cuantificación de la expresión de genes mediante qPCR Se realizó siguiendo el protocolo descrito por Pérez-Montaño et al. (2011). Los programas usados en cada caso siguen el siguiente esquema común: 1.- Desnaturalización del ADN a 95 ºC durante 5 minutos. 2.- Desnaturalización del ADN a 95 ºC durante 30 segundos. 3.- Unión de los cebadores al ADN de cadena simple a la temperatura recomendada por el fabricante (Tib Molbiol e IDT) durante 30 segundos. 4.- Polimerización del ADN a 72 ºC durante 15 segundos. 5.- Lectura de la fluorescencia. 6.- Repetición del ciclo de polimerización (desde el paso 2), 39 veces más. 7.- Polimerización del ADN a 72 ºC durante 5 minutos. 8.- Melting Curve desde 60 ºC a 90 ºC. El volumen de la mezcla de reacción fue de 20 μL. Las mezclas de reacción contenían los cebadores usados a una concentración de 0,3 μM y 10 µl de FastStar SYBR Green Master (Roche). Los cebadores (Tabla 3.3.) fueron diseñados utilizando el programa informático GeneFisher 1.22 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/). Los cebadores utilizados se diseñaron teniendo en cuenta que: 1.- La longitud del oligonucleótido era de aproximadamente 20 nucleótidos. 2.- El porcentaje de G + C estuviera comprendido entre 50-60%. 3.- La temperatura de fusión (Tm) estuviera comprendida entre 50-65 ºC. 4.- Los cebadores no aparearan entre sí. 5.- El tamaño del amplicón debía estar comprendido entre 150-180 nucleótidos. Materiales y Métodos  85  Tabla 3.3. Cebadores utilizados en experimentos de cuantificación de la expresión de genes mediante qPCR. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) TraI-RT F CCCACCTACATCCTAGCCGTA 21 57,7 TraI-RT R CAAGGAAGGTGTCCACGCAA 20 60,9 RaiI-RT F CCGATACGACGAGGCTGA 18 56,4 RaiI-RT R GCATGCGGATGAAGGCAA 18 59,3 CinI-RT F GTCTGGTGCAACGACA 16 49,5 CinI-RT R GCATCGATGTTGGGGAA 17 53,7 NodA-RT F CGTCATGTATCCGGTGCTGCA 21 62,8 NodA-RT R CGTTGGCGGCAGGTTGAGA 19 64,2 16S-RT F TAAACCACATGCTCCACC 18 52,3 16S-RT R GATACCCTGGTAGTCCAC 18 51,2 3.3.11.- Hibridación ADN/ADN Se empleó un sistema no radiactivo que se basa en el marcaje al azar de ADN con digoxigenina-dUTP y la detección de los híbridos ADN/ADN-digoxigenina mediante enzimoinmunoensayo. Para esta detección se utilizó un anticuerpo conjugado (antidigoxigenina conjugado con la enzima fosfatasa alcalina). El resultado de la hibridación se obtuvo por reacción colorimétrica en el mismo filtro de hibridación. 3.3.11.1.- Transferencia del ADN a filtros de nylon Una vez realizada la electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de ADN, junto con el marcador de peso molecular marcado con digoxigenina (Roche), se transfirieron a filtros de nylon (Southern, 1975) Hybond-N (Amersham Biosciences). Para ello, el gel inmediatamente después de la electroforesis, se sumergió en HCl 0,25M durante 20 Materiales y Métodos  86  minutos con agitación suave. Posteriormente, se lavó con agua destilada y se mantuvo en una solución de desnaturalización durante 30 minutos en agitación. La transferencia del ADN a los filtros se realizó por capilaridad del tampón de transferencia alcalino a través de papel whatman durante 4-15 horas en presencia del tampón de transferencia alcalino. Transcurrido ese tiempo, se marcaron los pocillos en la membrana con un lápiz y los filtros se lavaron en SSC 2X durante 5 minutos. Finalmente, el ADN se fijó al filtro por exposición a la luz ultravioleta durante 2 minutos. Soluciones empleadas: SSC 20X NaCl 2,1M, citrato de sodio 0,3M. Ajustar el pH a 7. Solución de desnaturalización NaCl 1,5M, NaOH 0,5M. Tampón de transferencia alcalino NaCl 1,5M, NaOH 0,25M. 3.3.11.2.- Marcaje de la sonda El marcaje de la sonda se realizó mediante el uso de la técnica de la PCR: Se realizó una PCR en la que se añadió a la mezcla normal de PCR, 1 μL de dNTP 10X que contiene UTP marcado con digoxigenina. 3.3.11.3.- Hibridación de la sonda al ADN del filtro El filtro nylon se introdujo en una bolsa y se le añadió la solución de prehibridación (entre 1 y 10 mL, dependiendo del tamaño del filtro), que contenía esperma de salmón (100 μg mL-1) previamente desnaturalizado por calor (95 ºC durante 10 minutos y 5 minutos en hielo). El filtro se prehibridó con esta solución incubándolo de 2 a 6 horas a 28, 32 ó 37 ºC en condiciones de heterología o a 42 ºC en condiciones de homología. Transcurrido este tiempo, se retiró la solución de prehibridación y se añadió la sonda, previamente desnaturalizada por calor (95 ºC durante 10 minutos y 5 minutos en hielo) y diluída en 2,5 mL de solución de prehibridación. El filtro se incubó con esta nueva solución durante toda la noche a la misma temperatura que se usó en la prehibridación. Materiales y Métodos  87  Soluciones empleadas: SSC 20X NaCl 2,1M, citrato de sodio 0,3M. Ajustar el pH a 7. SDS 20%a SDS 200 g L-1. Solución de prehibridaciónb 100 mL SSC 20X (v/v), 0,4 mL SDS 20% (m/v), 100 mL agua Milli-Q, 20 g de reactivo de bloqueo (Roche), 0,4 g N-laurilsarcosina. a Calentar 800 ml de agua destilada, añadir y disolver el SDS, ajustar el pH a 7,2 y enrasar a 1 L con agua destilada. b Disolver el reactivo de bloqueo con agitación magnética y calor y añadir el mismo volumen de formamida desionizada. Se almacena a -20 ºC. Transcurrido este tiempo se procedió a lavar el filtro. Los lavados son distintos dependiendo de las condiciones de estringencia elegida: 1. Heterología: El filtro se lavó dos veces con una solución de SSC 2X, SDS 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se lavó otras dos veces con la misma solución a 42 ºC durante 15 minutos. 2. Homología: El filtro se lavó dos veces con una solución de SSC 2X, SDS 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente, después se lavó otras dos veces con SSC 1X, SDS 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente y, por último, dos lavados más con SSC 0,1X, SDS 0,1% durante 15 minutos a 68 ºC. 3.3.11.4.- Detección inmunológica Después de realizar los lavados, el filtro se incubó durante 5 minutos en 100 mL de tampón 1 a temperatura ambiente y con agitación para eliminar los restos de SDS. Posteriormente, los filtros se introdujeron en bolsas de hibridación junto con 10 mL de tampón 2 y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se retiró el tampón 2 y se cambió por una nueva solución de tampón 2 que contenía el anticuerpo antidigoxigenina en una proporción de 1:5000 (v/v). El filtro se incubó en esta solución durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Para eliminar el anticuerpo no fijado, el filtro se extrajo de la bolsa y se lavó dos veces durante 15 minutos en 100 mL de tampón 1 a temperatura ambiente con agitación. Finalmente, el filtro se equilibró en 50 mL de tampón 3 durante 5 minutos. Materiales y Métodos  94  10/40 ml de cultivo del biosensor crecido hasta fase estacionaria y 40/160µl de X-Gal (40 mg/mL). Finalmente, se vertió la mezcla sobre la placa TLC que previamente fue colocada en placas de Petri cuadradas del tamaño adecuado. Se incubó durante 48 horas a 28 ºC o hasta la aparición de las manchas correspondientes. 3.5.5.- Análisis por HPLC Todos los análisis por HPLC fueron llevados a cabo en colaboración con el grupo del Profesor Antonio Gil Serrano, del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla. Estos análisis se usaron con dos finalidades, por un lado para la separación por fraccionamiento de los extractos de sobrenadantes para su posterior cuantificación y, por otro lado, para la determinación química de los AI mediante espectrometría de masa. En ambos casos, se crecieron los rizobios en 500 ml de medio YM durante 6 días en agitación y a 28 ºC, suplementados, cuando fue necesario, con flavonoides, Los cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes se extrajeron dos veces con 1 volumen de diclorometano. Se tomó la fase orgánica y se evaporó hasta sequedad. Los extractos se disolvieron en 1 ml de metanol:agua (1:1 v/v) conteniendo 0,1% (v/v) de ácido fórmico, se microfiltraron (0,2 µm) y se inyectaron 20 µl en el sistema HPLC equipado con una columna Tracer Hyperyl ODS (250 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 µm) (Teknokroma). La elución se llevó a cabo a temperatura ambiente con una tasa de flujo de 400 µl min-1 usando un gradiente de metanol agua, ambos acidificados con 0,1% de ácido fórmico (Morin et al., 2003). Los análisis de HPLC fueron llevados a cabo en un sistema de HPLC Waters Alliance 2695 (Waters) acoplado a un colector de fracciones Gilson FC203B (Gilson) para los ensayos de cuantificación en microplacas mediante actividad β-galactosidasa con el biosensor A. tumefaciens NT1(pZRL4) (mirar más abajo). Las fracciones recogidas fueron de 1ml. En el caso de los análisis de HPLC acoplados a espectrometría de masas se usó un sistema de HPLC Perkin-Elmer Series 200 (Waltham). Materiales y Métodos  95  3.5.5.1.- Separación y cuantificación de AI Para cuantificar la producción de AI tras el fraccionamiento por HPLC se usaron los ensayos de actividad β-galactosidasa con el biosensor A. tumefaciens NT1(pZRL4). Las fracciones de 1 ml obtenidas mediante HPLC se evaporaron bajo flujo de aire para eliminar todo el metanol y se reajustó el volumen de cada fracción a 1ml con agua estéril. Los experimentos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos de poliestireno con fondo en U (Greiner Bio-One). Como se describe en el apartado 3.2.2. se añadieron alicuotas de 100 µl de cada fracción a los pocillos de la placa que contenían 100 µl de cultivo de A.tumefaciens NT1 (pZRL4) en fase logarítmica (DO660 = 0,4-0,6). Como controles se añadieron 100 µl de agua destilada estéril y 100 µl de patrones de AHL a diferentes concentraciones a pocillos con el biosensor. Tras incubar la placa 4 días a 28 ºC, se midió la absorbancia de cada pocillo de la placa con un lector de placas automático OASYS UVM 340 (Anthos Labtec Instruments). Se tomaron 40 µl de cada uno de los pocillos y se colocaron en una nueva placa microtítulo, en la que se llevaron a cabo los experimentos de actividad β-galactosidasa usando el protocolo adaptado de Miller, y teniendo en cuenta que en lugar de cloroformo se usó tolueno, para evitar la degradación de la placa. 3.5.5.2.- Determinación estructural de los AI mediante espectrometría de masas El estudio de la estructura química de las moléculas autoinductoras producidas por cada bacteria se llevó a cabo mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas (MS/MS) en tándem (Cataldi et al., 2009, Ortori et al., 2007) en colaboración con el grupo del Profesor Antonio Gil Serrano, del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla. Multiple-Reaction ion Monitoring (MRM) es un método en tándem de MS/MS en el que los iones específicos seleccionados son transmitidos a través del primer analizador (un quadrupolo, Q1) y los fragmentos específicos seleccionados resultantes de la descomposición inducida por colisión (CID) en Q2 son introducidos en un segundo analizador (Q3). Esta técnica es adecuada para la identificación y el estudio de componentes de mezclas complejas de sustancias, como es el caso de los sobrenadantes bacterianos que contienen Materiales y Métodos  96  normalmente una mezcla de diferentes AI. Es necesario que tanto los iones precursores (normalmente el ion pseudomolecular, [M+H]+) como los iones producto sean indicados previamente al inicio de los análisis. Además, los compuestos a identificar deben haber sido bien caracterizados antes de llevar a cabo este tipo de identificación química. En nuestro caso, la familia de las AHL tiene en común el anillo lactónico. La fragmentación mediante CID genera un producto común en m/z 102, que corresponde al atómo de nitrógeno NH3+ del anillo lactónico, junto con iones productos correspondientes a [M+H-101]+. Además, todas las AHL muestran picos pseudomoleculares en [M+H]+ cuando el electroespray es llevado a cabo en modo positivo. La tabla 4.1. resume los valores usados en el analisis de HPLC-MS/MS. Un segundo método, el ion precursor, fue usado como técnica complementaria para registrar aquellos compuestos que generan fragmentos en m/z 102 en Q3. Esta técnica es complementaria al MRM, ya que permite detectar compuestos que no están incluidos en la lista MRM Q1/Q3 (Makemson et al., 2006). Además de los métodos de identificación química citados, se verificaron las estructuras de las AHL dectectadas por comparación del espectro de masas de los estándares según el método de potenciamiento de la producción de iones (EPI). Todos los experimentos de espectrometría de masas fueron llevados a cabo en un espectrómetro de masas 2000 QTRAP hybrid triple-quadrupole-linear trap (Applied Biosystem) equipado con una fuente turbo de iones usados con el modo de electroespray de iones positivos. 3.6.- Técnicas para el estudio de la interferencia del QS bacteriano 3.6.1.- Obtención de material vegetal: exudados de semillas y raíces, extractos de semilla y raíces de plantas Las semillas de Oryza sativa cv. Puntal y de Phaseolus vulgaris cv. BBL fueron desinfectadas superficialmente, germinadas y colocadas en los tubos de ensayo con rejilla como previamente se ha descrito. Las plantas de arroz y judía fueron crecidas Materiales y Métodos  97  bajo condiciones controladas en cámaras de cultivo de plantas iluminadas usando como solución nutritiva de Rigaud-Puppo con nitrógeno (KNO3). Las condiciones aplicadas fueron 18 horas de luz con 25 ºC de temperatura y 60% de humedad; y 6 horas de oscuridad con 22 ºC de temperatura y 70% de humedad. Para la obtención de exudados de semillas, tras desinfectar 1 g de semillas se sumergieron en 5 ml de agua destilada estéril durante 16 horas a 4 ºC. Para la obtención de exudados de raíz, se tomó la solución nutritiva de las plantas tras su crecimiento durante 10 días. En el caso de los extractos de semillas, las semillas de ambas plantas fueron desinfectadas como previamente se ha descrito, congeladas con nitrógeno líquido y machacadas hasta polvo. Por cada gramo de polvo de semilla se añadieron 5 ml de una mezcla metanol:agua (1:1 v/v), y se dejó durante 16 horas a 4 ºC en agitación. Por último, las raíces de plantas se obtuvieron en los mismos ensayos en los que se obtuvieron los exudados de raíz. En todos los casos, se llevaron a cabo controles de contaminación tomando 100 µl de los exudados o extractos vegetales y cultivándolos en placas de Petri con TY a 28 ºC. 3.6.2.- Ensayos para la detección de moléculas que interfieren en el QS bacteriano Los biosensores C. violaceum CV026, E. coli JM109 (pSB536) y E. coli JM109 (pSB536) (pME6863) se crecieron durante 12 horas en agitación y los biosensores A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) se crecieron durante al menos 48 horas en agitación. En el caso de los 3 primeros biosensores, se añadieron 200 µl de cultivos bacterianos crecidos a 4 ml de LB con 0,8% de agar. En el caso concreto de los ensayos reversos con C. violaceum CV026, se añadieron, además, 30 µl de C6-HSL (5 µg/ml). Para A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863), 400 µl de cultivo bacteriano en fase logarítmica de crecimiento se mezclaron con 4 ml de YM con 0,8 % de agar y se añadieron 40 µl de X-gal (40 mg/mL). Para la detección de moléculas que interfieren en el QS bacteriano se llevaron a cabo ensayos similares a los realizados para la detección de AI bacterianos (apartado 3.5.2.). En cada pocillo se añadieron 200 µl de muestra, tanto para exudados de semilla o raíz, como para extractos de semilla. En el caso de ensayos con raíces, se separó asépticamente el tallo de la raíz y ésta se colocó en placas de Petri con el medio de cultivo adecuado para cada biosensor. Acto seguido se añadió el agar de cobertera con Materiales y Métodos  98  el biosensor ensayado. En los ensayos para ver el efecto del pH sobre los compuestos que interfieren en el QS producidos por las plantas, se añadieron 100 µl de extractos de semilla más 100 µl de agua destilada estéril a pH7 o 100 µl de extractos de semilla más 100 µl de tampón Tris-HCl 1M pH 9,5. 3.6.3.- Cromatografía en capa fina (TLC) Los extractos de semilla de arroz y judía se analizaron también mediante TLC usando a los biosensores A.tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863). La metodología fue similar a la aplicada en los estudios de AI bacterianos (apartado 3.5.3.), con la salvedad de que no se evaporaron los extractos, sino que directamente se añadieron 40 µl de cada muestra. 3.6.4.- Análisis por HPLC Este apartado se realizó en colaboración con el grupo del profesor Antonio Gil Serrano, del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla 3.6.4.1.- Separación y cuantificación de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano Se realizaron con extractos de judía BBL y extracto de arroz Puntal. En primer lugar, los extractos se filtraron con lana de vidrio para eliminar los precipitados existentes y se concentraron a sequedad en el rotavapor a temperatura ambiente. El residuo resultante se redisolvió en agua y se liofilizó. Los residuos secos se redisolvieron en metanol 50% (Ex. judía: 5 ml y Ex. Arroz: 6 ml) y se procedió al fraccionamiento en cartuchos de SPE-C18 (Teknokroma, 1000 mg/6 ml). El procedimiento empleado fue el siguiente: 1.- Se limpió el cartucho con agua (3 x 5 ml). Se desechó el agua. 2.- Se lavó el cartucho con metanol (3 x 5 ml). Se desechó el metanol. Materiales y Métodos  99  3.- Se acondicionó el mismo con metanol 50% (3 x 5 ml). Se desecha el metanol 50%. 4.- Se pasó a través del cartucho la muestra que previamente se había disuelto en metanol 50%. Esta fracción se recogió y corresponde al control (A). 5.- Se eluyeron las moléculas que IQS con disoluciones de metanol-agua en distintas proporciones: metanol 50% (3 x 5 ml) (B), metanol 60% (3 x 5 ml) (C), metanol 70% (3 x 5 ml) (D), metanol 80% (3 x 5 ml) (E), metanol 90% (3 x 5 ml) (F), metanol 100% (3 x 5 ml) (G). Un tercio del volumen de las fracciones recogidas (A a G), es decir, 5 ml de cada una de ellas a excepción de A que se toma un volumen de 1,5 ml, se pasaron a tubos de ajuste y se concentraron a sequedad en el rotavapor a temperatura ambiente. Por último, las fracciones recogidas se resuspendieron en 500 µl de agua milliQ. Estas muestras se usaron para la cuantificación de las moléculas que IQS producidas por plantas de arroz y judía. Los ensayos de cuantificación de las moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano se llevaron a cabo usando a los biosensores A. tumefaciens NT1 (pZRL4) y A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) a partir de las fracciones de extractos de semilla obtenidas anteriormente. Los experimentos se realizaron en placas de 96 pocillos con fondo en U (Greiner Bio-One). En primer lugar se añadió a cada pocillo 100 µl de una mezcla madre que consiste en 20 ml de YM(3) con agar al 1,2%, 10 ml de NT1 (pZRL4) o NT1 (pZRL4) (pME6863) en fase logarítmica de crecimiento (DO660 = 0,4-0,6) en medio YM(3) y 80 µl de X-gal (20 mg/mL). Una vez solidificados, en cada pocillo se añadieron 50 µl de cada fracción de extractos de semilla. Como control negativo se añadieron a los pocillos con biosensor 50 µl de agua destilada estéril. Como control positivo se añadieron 49 µl de agua destilada estéril y 1 µl del patron 3-oxo-C6-HSL a diferentes concentraciones (desde 100 ng/µl hasta 1,5 ng/µl). Acto seguido, se midió la absorbancia a 615 nm de cada pocillo de la placa con un lector de placas automático Synergy HT (BioTex). Tras incubar la placa 24 horas a 28 ºC se volvió a medir la absorbancia a 615 nm en el mismo lector de placas automático. Los niveles de inducción del biosensor se obtienen midiendo el incremento de absorbancia a 615 nm tras el periodo de incubación. Materiales y Métodos  100  3.6.4.2.- Determinación estructural de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano mediante espectrometría de masas La determinación estructural de las moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano consistió en determinar la presencia de moléculas de tipo AHL, y se llevó a cabo mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas. La separación cromatográfica se realizó con un sistema de HPLC Perkin Elmer Series 200 acoplado con un sistema híbrido QTRAP LC-MS/MS (Applied Biosystems MDS Sciex). El análisis por HPLC se llevó a cabo con una columna analítica en fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C18, 2,1 x 150 mm, 3,5 μm). El flujo empleado fue de 250 µl·min-1. La separación cromatográfica se realizó usando un gradiente binario de agua (A) y metanol (B), conteniendo ambos eluyentes ácido fórmico al 0,1% (v/v) para favorecer la ionización. La elución tuvo lugar utilizando diferentes mezclas de metanol-agua. El perfil de elución consistió en: isocrático durante 5 minutos con B al 50%, lineal durante 15 minutos hasta alcanzar el 90% de B, isocrático durante 5 minutos con B al 90% y, por último, isocrático durante 5 minutos con B al 50%. Para el estudio estructural de las posibles AHL presentes se han usado dos tipos de experimentos MS/MS, el experimento Ion Precursor, que consiste en fijar un ion producto en Q3 y únicamente registrar el ion pseudomolecular del que procede. El ion producto que se ha fijado en el caso de las AHL es el ion a m/z 102,1, que es uno de los más intensos porque proviene de una rotura preferente y se encuentra presente en todas las estructuras posibles de las AHL; y el método MRM (Multiple Reaction Ion Monitoring), en el que se selecciona con el primer cuadrupolo un ion precursor y se elige un ion producto con el tercer cuadrupolo, procedente de una o varias fragmentaciones características. Sólo cuando se observe esa fragmentación particular se registrará señal. Los patrones de AHL empleados tanto para la optimización del método cromatográfico como del método de masas fueron: C4-AHL (pureza 98,7%), C6-AHL (pureza 98,7%), C7-AHL (pureza 97,6%), C8-AHL (pureza 99,5%), C10-AHL (pureza 99,3%), C12-AHL (pureza 97,3%), C14-AHL (pureza 99,1%), 3-oxo-C6-AHL (pureza 99,0%), 3-oxo-C8-AHL (pureza 99,0%), 3-oxo-C10-AHL (pureza, 100%), 3-oxo-C12- Materiales y Métodos  101  AHL (pureza, 99,0%), 3-oxo-C14-AHL (pureza 99,0%), 3-OH-C12-AHL (pureza 98,1%) y 3-OH-C14-AHL (pureza 96,8%) adquiridos de la casa comercial SigmaAldrich S.A. 3.7.- Técnicas microscópicas Todas las técnicas microscópicas se realizaron en colaboración con el grupo del Profesor Javier Lloret Romero del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid. 3.7.1.- Microscopía confocal La microscopía confocal se usó para los estudios de formación de biofilm suplementarios a los que se llevaron a cabo en placas microtítulo. Para ello, a las estirpes a ensayar se les introdujo un plásmido que porta los genes que codifican para la proteína fluorescente verde (EGFP-1) (Stuurman et al. 2000). Estas estirpes marcadas con la proteína fluorescente verde se cultivaron durante 2 días a 28 ºC en el medio MGM bajo en fosfato suplementado con los antibióticos adecuados. Trascurrido este tiempo, se midió la densidad óptica a 600 nm y se llevaron a cabo las diluciones oportunas hasta un valor de D.O.600 ≈ 0,2 en un volumen final de 400 µl del mismo medio de cultivo (suplementado con el flavonoides en el caso en el que se requirió). El cultivo de las bacterias se llevó a cabo en las cámaras de 8 pocillos Lab-Tex Chamber Slide System (Thermo Fisher Scientific Inc.) durante 4, 7 y 11 días a 28 ºC y sin agitación (soporte cristal). En cada uno de estos tiempos se llevó a cabo la captura de imágenes mediante el microscopio confocal espectral Leica TCS SP2. Para el tratamiento in silico de reconstrucción 3D de las imágenes obtenidas se usó el programa informático Bitplane, de Imaris software. 3.7.2.- Microscopía de epifluorescencia Los experimentos de microscopía de epifluorescencia se usaron para estudiar la colonización de raíces de soja por las diferentes estirpes bacterianas. Al igual que en el Materiales y Métodos  102  caso de la microscopía confocal, las bacterias fueron marcadas previamente con el plásmido que lleva el gen de la proteína fluorescente verde. Para llevar a cabo los experimentos de colonización, las semillas de soja fueron desinfectadas, germinadas, crecidas e inoculadas mediante el sistema descrito anteriormente. Tras los 7 días de crecimiento y para evitar la autofluorescencia de las raíces, éstas se sumergieron durante 3 minutos en cristal violeta al 0,5%. Acto seguido se sometieron a 3 lavados de 5 minutos con agua destilada estéril, se colocaron las raíces en un portaobjetos y se taparon con cubreobjetos. La toma de imágenes se llevó a cabo con el microscopio de epifluorescencia Olympus BH2-FRCA con una cámara Leica MTV-3. 3.7.3.- Microscopía electrónica de barrido (MEB) La microscopía electrónica de barrido se usó como método complementario a la microscopía de epifluorescencia para estudiar la colonización de raíces de soja por las diferentes estirpes bacterianas. Los experimentos de colonización se llevaron a cabo con plantas de soja desinfectadas, germinadas, crecidas e inoculadas mediante el sistema descrito anteriormente. Para cada planta y bacteria, se cortó 1 cm de raíz de las regiones apical, anterior y lateral y se colocó en eppendorf de 2 ml. En cada eppendorf se añadieron 2 ml de una solución de glutaraldehído (2,5%) y se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 minutos. Tras esto, se retiró la solución y se añadieron 2 ml de solución de cacodilato sódico y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este paso se repitió una vez más. La deshidratación progresiva se llevó a cabo sumergiendo las muestras cada 20 minutos en etanol al 10%, 30%, 50%, 70%, 90% y 100% (v/v). Una vez concluida la deshidratación, se guardaron las muestras en etanol 100% a 4 ºC. Por último, se montaron las muestras en portaobjetos especiales para MEB y se introdujeron en una cámara que suministró CO2 líquido (a 0 ºC) y mediante centrifugación se reemplazó el etanol por el CO2. Tras el intercambio se incrementó la temperatura hasta los 40 ºC, convirtiéndose así el CO2 en gas, que pasa a la atmósfera. El último paso, fue aplicar una capa de oro por electrolisis en una cámara de vacío. La toma de imágenes se llevó a cabo con el MEB Philip XL30. Materiales y Métodos  103  Soluciones utilizadas en la preparación de muestras para el MEB Cacodilato sódico 32 g/l Glutaraldehído Glutaraldehído comercial (25%) : Cacodilato sódico 1:9 (v/v) El pH de la solución de cacodilato sódico 0,2 M se ajustó a pH 7,1 con HCl. 3.8.- Análisis estadístico Los datos para el análisis de los fenotipos simbióticos (número de nódulos, peso fresco de nódulos y peso seco de la parte aérea de las plantas), así como para el análisis de los valores de producción total de AI en presencia de diferentes flavonoides, fueron sometidos a un análisis de varianza no paramétrico, mediante el test de Mann-Whitney, con un nivel de significación (α) de 5 ó 1%.   en e s de I S HSL Fi gu silv e de f a cont r inter m las m ISP 4 4.1. 3 C o AI e n de e grac i s tudio prod u S P42 y S M . En SMH1 u ra 4.2. C r e stres de ri z a se reversa r oles se u m edia), C6 m anchas co r Estos exp e 4 2 al meno s 3 .- Análi s o mo se ind i n las tres e s spectromet r i as a la col a A u ce dos AI M H12, ade m 2 apa r ece u r omato g ra z obios. S M C 18 y una u saron las -HSL (D s u r respondien t e rimentos i s 3 e IS123 s is estruc t i có en Mat e s tirpes en e s r ía de mas a a boración c con movil i m ás, se pro d u n cuarto A I fía en ca p M H12(A), I S mezcla m e AHL co m u perior) y l a t es a los di f i ndican q u al menos 2 t ural de l o e riales y M é s tudio se ll e a s en tánd e on el grup o B 110 i dad simila r d uce un AI I con movil p a fina d e S P42(B) y I e tanol:agu a m erciales C a 3-oxo-C6 f erentes AI. u e SMH12 2 . o s AI é todos, la i d e vó a cabo e m, el mu l o del profes C r a la C8H con movili idad simila r e los extr a I S123(C). S a (60:40 v/ v C 10-HSL ( -HSL (E). C produce a d entificaci ó m ediante H l tiple-reacti o or Antonio H SL y deri v dad inferio r a la 3-ox o a ctos de l a S e utilizar o v ) como fa ( D inferio r C on flecha s a l menos 4 ó n química d H PLC acopl o n ion mo n Gil Serran o D Res u v ados. En e l r al patrón o -C6-HSL. a s tres es t o n cromato p se móvil. C r ), C8-HS L s están señ a 4 AI difer e d e las mol é ada a un m n itoring ( M o , de la Fa c E u ltados  l caso C10t irpes p lacas C omo L (D a ladas e ntes, é culas étodo M RM) c ultad Resultados  111  de Química de la Universidad de Sevilla. Los iones seleccionados en Q1 y Q3 usados en espectrometría de masas en tándem para la detección de las diferentes AHL se muestran en la Tabla 4.1. Los tiempos de retención para diferentes estándares analizados se encuentran recogidos en la Tabla 4.2. Un segundo método complementario, el ion precursor, se usó para identificar moléculas no detectadas mediante el MRM. Por último, se verificaron las AHL detectadas mediante la comparación de espectros de masas de estándares mediante la técnica EPI. En S. fredii SMH12, los cromatogramas obtenidos tanto por el método MRM como por el método ion precursor mostraron la presencia de dos AHL (Figura 4.3.), una en el pico cromatográfico a 17,48 min y otra en el pico cromatográfico a 26,13 min. La comparación de los tiempos de retención y de los EPI de estos picos con los patrones indicó que el primero de ellos se corresponde con la 3-oxo-C8-HSL y el segundo con la C8-HSL (Figura 4.4. y Figura 4.5.). Los EPI de los demás picos cromatográficos encontrados no se corresponden con moléculas de tipo AHL. Estos picos son impurezas que provienen del propio medio de cultivo, ya que también se han encontrado en los medios control sin inocular. Para ISP42, la espectrometría de masas determinó, tanto por el método MRM (Figura 4.6.) como por el del ion precursor, la presencia de tres picos cromatográficos: uno a los 19,75 min, otro a los 26,84 min y el último, a los 33,44 min (Figura 4.6.). La comparación de los tiempos de retención y de los EPI de estos picos con los patrones indicó que el primero de ellos se corresponde con la 3-OH-C8-HSL, el segundo con la C8-HSL y el último, con la 3-oxo-C14-HSL (Figura 4.7., Figura 4.8. y Figura 4.9.). Como ocurrió en SMH12, los demás picos cromatográficos son impurezas que provienen del propio medio de cultivo. Por último, en R. sullae IS123 los cromatrogramas obtenidos tanto por MRM como por ion precursor, mostraron la presencia de dos picos cromatográficos correspondientes a AHL, uno a los 18,45 min y otro a los 26,74 min (Figura 4.10.). La comparación de los tiempos de retención y de los EPI de estos picos con los patrones indicó que en el primero de ellos, aparece una mezcla de dos AHL, la 3-oxo-C8-HSL y la 3-OH-C8HSL, mientras que el segundo se corresponde con la C8-HSL (Figura 4.11., Figura 4.12. y Figura 4.13.). Como anteriormente, los demás picos cromatográficos corresponden con impurezas del medio de cultivo. Resultados  112  Tabla 4.1. Iones seleccionados en Q1 y Q3 usados en espectrometría de masas en tándem (mediante MRM) para la dectección de las diferentes AHL. AHL Q1 Q3 C4-HSL (N-butanoil-homoserina lactona) 172.2 102.1 / 71.2 3-oxo-C4-HSL (N-(3-oxo-butanoil)-homoserina lactona) 186.2 102.1 / 85.2 C5-HSL (N-pentanoil-homoserina lactona) 186.2 102.1 / 85.2 3-oxo-C5-HSL (N-(3-oxo-pentanoil)-homoserina lactona) 200.3 102.1 / 99.2 C6-HSL (N-hexanoil-homoserina lactona) 200.3 102.1 / 99.2 3-oxo-C6-HSL (N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona) 214.3 102.1 / 113.2 C7-HSL (N-heptanoil-homoserina lactona) 214.3 102.1 / 113.2 3-oxo-C7-HSL (N-(3-oxo)heptanoil-homoserina lactona) 228.3 102.1 / 127.2 C8-HSL (N-octanoil-homoserina lactona) 228.3 102.1 / 127.2 3-oxo-C8-HSL (N-(3-oxo-octanoil)-homoserina lactona) 242.3 102.1 / 141.2 3-OH-C8-HSL (N-(3-hidroxi-octanoil)-homoserina lactona) 244.3 102.1 / 143.2 C9-HSL (N-nonanoil-homoserina lactona) 242.3 102.1 / 141.2 3-oxo-C9-HSL (N-(3-oxo-nonanoil)-homoserina lactona) 256.3 102.1 / 155.2 C10-HSL (N-decanoil-homoserina lactona) 256.3 102.1 / 155.2 3-oxo-C10-HSL (N-(3-oxo-decanoil)-homoserina lactona) 270.3 102.1 / 169.2 C11-HSL (N-undecanoil-homoserina lactona) 270.3 102.1 / 169.2 3-oxo-C11-HSL (N-(3-oxo-undecanoil)-homoserina lactona) 284.3 102.1 / 183.2 C12-HSL (N-dodecanoil-homoserina lactona) 284.3 102.1 / 183.2 3-oxo-C12-HSL (N-(3-oxo)dodecanoil-homoserina lactona) 298.3 102.1 / 197.2 3-OH-C12-HSL (N-(3-hidroxi-dodecanoil)-homoserina lactona) 300.3 102.1 / 199.2 C13-HSL (N-tridecanoil-homoserina lactona) 298.3 102.1 / 197.2 3-oxo-C13-HSL (N-(3-oxo-tridecanoil)-homoserina lactona) 312.3 102.1 / 211.2 C14-HSL (N-tetradecanoil-homoserina lactona) 312.3 102.1 / 211.2 3-oxo-C14-HSL (N-(3-oxo-tetradecanoil)-homoserina lactona) 326.3 102.1 / 225.2 C15-HSL (N-pentadecanoil-homoserina lactona) 326.3 102.1 / 225.2   Fi gu pres e 3-ox X: ti e Fi gu corr e repr e u ra 4.3. C r e ncia de do o-C8-HSL y e mpo en m i u ra 4.4. EP e sponde co n e sentada en r omato g ra m s picos cro m y el pico cr i nutos. Eje Y I del pico c n el del pa t la figura. E m a MRM m atográfic o omatográfi c Y : intensid a c romato g r t rón 3-oxoC E je X: tiem p 113 de los AI o s. El pico c o de los 2 6 a d en cuent áfico de S M C 8-HSL. L p o (min). Ej aislados d que de los 6 ,13 min c o a s por segu n M H12 a lo s L a estructur a e Y: intens i d e SMH1 2 17,48 min o rresponde a n do (cds). s 17,48 mi n a de la A H i dad (cuent a Res u 2 . Se mues t correspond a la C8-HS L n utos. El E H L detectad a a s por segu n u ltados  t ra la e a la L . Eje E PI se a está n do).   Fi gu corr e repr e Fi gu pres e OHC últi m (mi n u ra 4.5. EP e sponde c o e sentada en u ra 4.6. C r e ncia de tr e C 8-HSL, e l m o, el pico d n ). Eje Y: in t I del pico c o n el del p la figura. E r omato g ra m e s picos cr o l pico cro m d e los 33,4 4 t ensidad (c u c romato g r p atrón C8H E je X: tiem p m a MRM o matográfic m atográfico d 4 min se c o u entas por s 114 áfico de S M H SL. La e p o (min). Ej de los A I os. El pico d e los 26,8 4 o rresponde s egundo). M H12 a lo s e structura d e Y: intens i I aislados de los 19, 7 4 min corr e con la 3-o x s 26,13 mi n d e la AH L i dad (cuent a de ISP42 . 7 5 min cor e sponde a l a x o-C14-HS L Res u n utos. El E L detectad a a s por segu n . Se mues t r responde a a C8-HSL, L . Eje X: ti u ltados  E PI se a está n do). t ra la la 3y por empo   Fi gu corr e repr e Fi gu corr e repr e u ra 4.7. E P e sponde co n e sentada en u ra 4.8. E P e sponde c o e sentada en P I del pico n el del pa t la figura. E P I del pico o n el del p la figura. E cromato gr t rón 3-OHC E je X: tiem p cromato gr p at r ón C8H E je X: tiem p 115 r áfico de I C 8-HSL. L p o (min). Ej r áfico de I H SL. La e p o (min). Ej SP42 a lo s L a estructur a e Y: intens i SP42 a lo s e structura d e Y: intens i s 26,84 mi n a de la A H i dad (cuent a s 19,75 mi n d e la AH L i dad (cuent a Res u n utos. El E H L detectad a a s por segu n n utos. El E L detectad a a s por segu n u ltados  E PI se a está n do). E PI se a está n do).   Fi g cor r repr e Fi gu pres e mez c min segu n g ura 4.9. E r esponde c o e sentada e n u ra 4.10. C e ncia de d o c la de la 3o correspon d n do). E PI del pic o o n el del pa t n la figura. E C romato g r a o s picos cr o o xo-C8-HS d e a la C8H o cromato g t rón 3-OHC E je X: tiem p a ma MR M o matográfi c L y la 3-O H H SL. Eje X 116 g ráfico de I C 14-HSL. L p o (min). E j M de los A c os. El pic o H -C8-HSL , X : tiempo ( SP42 a los L a estructu r j e Y: intens A I aislado s o de los 18 , y el pico c ( min). Eje 33,44 min u r a de la AH L idad (cuent s de IS123 ,45 min c o c romatográ f Y: intensi d Res u u tos. El EP I L detectada as por seg u . Se mues t o rresponde a f ico de los 2 d ad (cuent a u ltados  I se está u ndo). t ra la a una 2 6,84 a s por   Fi gu se c o repr e Fi gu se c o repr e u ra 4.11. E P o rresponde c e sentada en u ra 4.12. E P o rresponde c e sentada en P I del pic o c on el del p la figura. E P I del pic o c on el del p la figura. E o cromato gr p atrón 3-ox o E je X: tiem p o cromato g p atrón 3-O H E je X: tiem p 117 r áfico de I o -C8-HSL. p o (min). Ej ráfico de I H -C8-HSL. p o (min). Ej S123 a los La estruct u e Y: intens i S123 a los La estructu e Y: intens i 18,45 min u u ra de la A H i dad (cuent a 18,45 min ra de la A H i dad (cuent a Res u u tos (A). E H L detectad a a s por segu n utos (B). E H L detectad a a s por segu n u ltados  E l EPI a está n do). E l EPI a está n do).   Fi gu corr e repr e S e quí m AH L cons i de l a gala c Prev i emp í paso enco E n nive l incr e Por frac c u ra 4.13. E P e sponde c o e sentada en e utilizó un m ica media n L identifica d i ste en rec o a s tres bact e c tosidasa e n i amente, m í ricamente por la H ntrarían es t n S. fredii S l es más al t e mento de i n último, en c iones 5, 81 P I del pic o o n el del p la figura. E segundo m n te espectro m d as en los o ger las dif e e rias tras su n placa mi c m ediante e los tiempo s H PLC y s e t as molécul a S MH12 (Fi g t os de ind u n ducción s e R. sullae 1 0, 12-13, y o cromato g p atrón C8H E je X: tiem p m étodo co m m etría de m sobrenada n e rentes frac c paso por l a c rotítulo u s e nsayos d s de retenc i e pudo de t a s AI (Tabl a g ura 4.14. A u cción. E n e apreció cl a IS123 (F i y 25. 118 g ráfico de I H SL. La e p o (min). Ej m plementar i m asas para c n tes de las t c iones o b te n a HPLC pa r s ando el bi o d e inducci ó i ón de los d t erminar la a 4.2.). A ), las fracc i n el caso d a ramente e n i gura 4.14. I S123 a lo s e structura d e Y: intens i i o a la det e c omprobar l t res bacteri n idas de lo s r a llevar a c o sensor A. ó n con b d iferentes p fracción i ones 5, 79 d e R. etli n las fracci o C), el inc r s 26,74 mi n d e la AH L i dad (cuent a e rminación l a activida d as estudia d s extractos d abo ensayo tumafacie n b iosensores p atrones di s aproximad a 9 , 12, 15 y ISP42 (Fi g o nes 6-8, 1 2 r emento se Res u n utos. El E L detectad a a s por segu n de la estr u d biológica d d as. Este m d e sobrena d s de activi d n s NT1(pZ R se calc u s ponibles t r a en la q u 24-26 mos t g ura 4.14. B 2 , 14-17 y 2 e detectó e u ltados  E PI se a está n do). u ctura d e las étodo d antes d ad βR L4). u laron r as su u e se t raron B ), el 2 4-26. n las Resultados  119  Tabla 4.2. Tiempos de retención y fracción aproximada para diferentes AHL patrones tras su paso por HPLC. AHL tr (min) Fracción aprox. C4-HSL (N-butanoil-homoserina lactona) 9,2 3-4 C6-HSL (N-hexanoil-homoserina lactona) 16,8 6-7 3-oxo-C6-HSL (N-(3-oxo-hexanoil)-homoserina lactona) 9,7 3-5 C8-HSL (N-octanoil-homoserina lactona) 26,6 11-12 3-OH-C8-HSL (N-(3-hidroxi-octanoil)-homoserina lactona) 19,0 7-9 C10-HSL (N-decanoil-homoserina lactona) 31,2 12-13 C12-HSL (N-dodecanoil-homoserina lactona) 34,2 13-14 C14-HSL (N-tetradecanoil-homoserina lactona) 38,7 15-17 Los tiempos de retención (tr) para algunos estándares están indicados en la columna del medio. Cada fracción (1ml) tarda aproximadamente 2,5 min en obtenerse, por lo que la fracción aproximada en la que eluyen los diferentes estándares se obtiene dividiendo el tiempo de retención entre 2,5. Tomando en consideración los tiempos de retención de los patrones de AHL obtenidos en HPLC-MS/MS (Tabla 4.2.) y equiparándolos con las fracciones de HPLC obtenidas para los bioensayos en placas microtítulo, se pudo establecer que los picos presentes en las fracciones 7-9, con tiempos de retención en torno a 19 minutos, deben corresponder a la 3-OH-C8-HSL y a la 3-oxo-C8-HSL, aquellos que aparecen entre las fracciones 11-12, con tiempos de retención superiores a los 26 minutos, se deberían a la C8-HSL y por último, los que estaban en la fracciones 15-17, con más de 38 minutos de tiempo de retención, a las C14-HSL y sus derivados oxoe hidroxi-. La mayoría de estos picos están presentes en las tres estirpes de rizobios. Algunos de los picos, especialmente aquellos presentes en las fracciones 24-25, no se corresponden con ninguna AHL patrón, por lo que a pesar de inducir al biosensor su naturaleza química parece no ser de tipo AHL. Discusión  222  de aminoácido, en Medicago sativa y la flavan-3-ol catequina, un flavonoide, en Combretum albiflorum. Por todo ello, parece ser que cada planta interfiere en los sistemas de QS mediante un mecanismo diferente, es decir, posiblemente a través de moléculas diferentes. Hasta la fecha no se ha descrito que plantas de Phaseolus vulgaris produzcan moléculas que IQS. Sin embargo, sí se ha demostrado que las plantas de Oryza sativa contienen moléculas que interfieren con los sistemas de QS de tres biosensores bacterianos diferentes. Estas moléculas, además, son susceptibles de degradación por la enzima lactonasa, por lo que los autores proponen que la estructura química de estas moléculas debe ser similar o incluso idéntica a las de las AHL (Degrassi et al., 2007). Para determinar la naturaleza química de las moléculas IQS detectadas en los ensayos con los extractos de semilla de arroz y de judía, se llevaron a cabo distintos estudios, desde la separación mediante TLC, el tratamiento con pH alcalino para provocar la lactonolisis, y el empleo de biosensores que han perdido la capacidad de detectar las AHL y que fueron construidos durante este Tesis para tal fin [A. tumefaciens NT1 (pZRL4) (pME6863) y E. coli JM109 (pSB536)]. A pesar de que el tratamiento de alcalinización hasta pH 9,5 de los extractos de semilla de arroz y judía determinó la pérdida de su actividad, al igual que la de las AHL patrón, usando al biosensor NT1 (pZRL4) (Figura 4.56.). Sin embargo, los extractos de semilla de ambas plantas sin tratar mantenían su capacidad de inducir a NT1 (pZRL4) (pME6863) (Figura 4.57.), por lo que se podría pensar que las moléculas IQS del arroz cv Puntal y de la judía cv BBL no son de naturaleza AHL. Datos que fueron corroborados cuando se realizaron ensayos con las raíces completas, ya que se observó que tanto las raíces de arroz como las de judía seguían induciendo al biosensor JM109 (pSB536) (pME6863), portados de la lactonasa (Figura 4.58.). Los análisis mediante TLC y revelado con NT1 (pZRL4) y NT1 (pZRL4) (pME6863) (Figura 4.55. y Figura 4.59.) demostraron la presencia de moléculas muy escasa movilidad en ambos extractos de semilla, que disminuyeron en intensidad en el caso de EXA, pero en el de EXJ, con el biosensor portador de la lactonasa. Por lo que aún cabe pensar que en los dos extractos se encontrarían moléculas de naturaleza distinta a las AHL, sin descartar su presencia en el caso de extractos de arroz (EXA). Discusión  223  Finalmente, para intentar determinar más específicamente cuántas moléculas y de qué tipo están presentes en los extractos de semillas de arroz cv Puntal y judía cv BBL se diseñó un método consistente en la concentración de los extractos de semilla de ambas plantas hasta sequedad, para disolverlo finalmente en metanol 50 % y fraccionarlo en cartuchos de extracción en fase sólida SPE-C18. Las fracciones fueron obtenidas mediante una primera elución con metanol al 50 % (A), y eluciones sucesivas con metanol al 50% (B), 60 % (C), 70 % (D), 80 % (E), 90 % (F) y 100 % (G). Las fracciones, una vez evaporadas y tratadas, fueron analizadas para determinar su actividad β-galactosidasa en placas microtítulo usando como biosensores a NT1 (pZRL4) y NT1 (pZRL4) (pME6863). Los resultados con las fracciones provenientes de los extractos de semilla de arroz (Figura 4.60. y Figura 4.63.) mostraron que aparecen al menos dos tipos de moléculas capaces de inducir al biosensor sin lactonasa, una en las fracciones más polares [metanol 50% (B) y metanol 60%(C)], y otra en las fracciones más apolares [metanol 90% (F) y metanol 100% (G)]. Las fracciones más polares (B y C) inducían también al biosensor con la lactonasa. Sin embargo, las moléculas presentes en las fracciones más apolares (F y G) eran susceptibles del ataque por la enzima lactonasa, lo que indica que estas moléculas pueden ser de tipo AHL (Figura 4.60. y Figura 4.63.). Todos estos resultados parecen indicar que en los extractos de semilla de arroz existen dos tipos de moléculas capaces de inducir a los biosensores: una de ellas con estructura química similar a la de las AHL y, la otra, con estructura química diferente. Esto explicaría que en los ensayos de TLC se apreciara una reducción en la intensidad de la señal de los extractos de semilla de arroz cuando se usó al biosensor con lactonasa (Figura 4.59.). En el artículo de Degrassi et al. (2007), en el que se demostraba que las moléculas que IQS producidas por arroz eran susceptibles del ataque por lactonasa, se discute la procedencia de estas moléculas, no descartando el posible origen bacteriano. Hasta la fecha se ha descrito la presencia de varias bacterias Gram negativas endofítas en plantas de arroz (Tan et al., 2001). A pesar de que la densidad de estas bacterias dentro de la planta no es muy alta (menos de 107 células por gramo de material vegetal), no se puede descartar la producción de AHL por estas bacterias en el interior de la planta (You et al., 2005). Son necesarias, por lo tanto, pruebas adicionales que demuestren la producción de AHL por las bacterias endófitas para sustentar o descartar esta hipótesis. Discusión  224  Cuando se realizó el mismo tipo de estudio con los extractos de semilla de judía, se detectó la presencia de una única molécula en extractos de semilla de judía presente en la fracción más polar [metanol 50% (B)], además de en el control (fracción A). Esta molécula, como cabía esperar, no era susceptible a la acción de la enzima lactonasa, por lo que su naturaleza química debe ser diferente a la de las AHL. Las fracciones A y B, debido a la alta inducción obtenida con ambos biosensores, se utilizaron en experimentos de HPLC acoplada a espectrometría de masas en los que se buscaron moléculas de tipo AHL. No se encontraron moléculas de tipo AHL en las fracciones A y B de los extractos de semilla de judía cv BBL mediante espectrometría de masas. La naturaleza química de las moléculas capaces de inducir al biosensor con lactonasa detectadas en los extractos de semilla de judía, y en los extractos de semilla de arroz, es aún desconocida. El fraccionamiento de los extractos de semilla es un primer paso en la identificación química de estas moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano. Sin embargo, la caracterización final de estas moléculas puede ser complicada, ya que no existe un único tipo de moléculas que lleven a cabo esta acción (ej., flavonoides, derivados de aminoácidos, etc.) y, de hecho, la naturaleza química en la mayoría de las plantas en las que se ha detectado este tipo de moléculas está aún por determinar. Los exudados radicales de las leguminosas tienen un enorme poder de atracción sobre las bacterias en general y sobre los rizobios en particular. En estos últimos, los flavonoides exudados por la planta disparan respuestas quimiotácticas que dirigen directamente al rizobio hacia un hospedador compatible. Además, estos flavonoides específicos son detectados por la proteína NodD1, iniciándose la transcripción de los genes de nodulación, que codifican una batería enzimática encargada de la síntesis de los factores de nodulación. La planta, a su vez, cuando detecta los factores de nodulación, inicia un proceso de diferenciación celular en las raíces que culmina con la formación del nódulo (Murray, 2011). El protagonismo de estas moléculas ( flavonoides y factores de nodulación) en los inicios de la interacción simbiótica no resta importancia al papel de otras muchas moléculas necesarias para la simbiosis, tales como los polisacáridos de superficie, las proteínas Nop, los AI o las moléculas que IQS bacteriano. Se sabe que la producción de ciertos polisacáridos simbióticamente importantes, así como la síntesis de proteínas Nop están reguladas directa o indirectamente por la proteína NodD1 tras su activación por flavonoides específicos de Discusión  225  los genes de nodulación (Murray, 2011). En esta Tesis, los resultados indican que, además de en todas estas funciones, los flavonoides también podrían estar implicados en el incremento general en la producción de AI y, por lo tanto, podrían potenciar los sistemas de QS de las bacterias simbiontes. De hecho, los sistemas de QS controlan numerosos fenotipos implicados en mayor o menor medida en una simbiosis eficiente, tales como la formación de biofilm, la transferencia de plásmidos, la movilidad o la síntesis de polisacáridos; por lo que no es de extrañar la activación de estos fenotipos en los rizobios en presencia de flavonoides específicos sintetizados por sus plantas hospedadoras. La rizosfera posee unas condiciones nutricionales que favorecen la proliferación bacteriana, por lo tanto, es un hábitat especialmente favorable para la comunicación celular, ya que la densidad y variedad de bacterias es elevada. De hecho, aproximadamente el 20% de todas las bacterias cultivables presentes en ambientes rizosféricos poseen sistemas de QS (D´Angelo-Picard et al., 2004). Parece evidente por lo tanto que estas poblaciones bacterianas además de tener una comunicación intraespecífica, puedan tener una comunicación interespecífica. De hecho, bacterias poco relacionadas filogenéticamente producen el mismo tipo de moléculas AI, y éstas son capaces tanto de inducir sus propios sistemas de QS, como el de bacterias que posean receptores para estos AI (Steidle et al., 2002). Además, recientemente se ha descubierto que muchos microorganismos tienen genes homólogos al gen luxR de V. fischeri pero sin poseer el homólogo a luxI. De esta forma estas bacterias, independientemente de que tengan o no otros sistemas de QS con los dos genes (homólogos de luxI y luxR), pueden censar las moléculas autoinductoras producidas por otras bacterias (Subramoni y Venturi, 2009). Por lo tanto, en la rizosfera las diferentes poblaciones bacterianas pueden activar cruzadamente sus sistemas de QS para iniciar la colonización e infección del hospedador, tanto en bacterias patógenas como en bacterias beneficiosas para la planta. Según Mathesius et al. (2003), las plantas pueden detectar AHL a concentraciones muy bajas incrementando la expresión de genes, entre los que predominan los implicados en la respuesta defensiva de plantas. Además, diferentes AHL generan incrementos de expresión de diferentes genes, lo que sugiere que las plantas pueden distinguir entre los diferentes tipos de AI (Mathesius et al., 2003). En este mismo trabajo, además, se comprobó que los tipos y/o la cantidad de moléculas que IQS Discusión  226  producidas por Medicago truncatula cambiaba tras la exposición de las raíces de esta planta a AHL. Por ello, las plantas, mediante la producción de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano, podrían potenciar unos sistemas de QS e inhibir otros de manera más o menos específica. Figura 5.4. Modelo de comunicación celular en la rizosfera. Las bacterias activan sus sistemas de QS mediante la producción de AI, coordinando la activación de fenotipos necesarios para la colonización del hospedador. Además, las bacterias de diferentes especies pueden activar cruzadamente sus sistemas de QS. Por otro lado, la planta puede reconocer específicamente los AI bacterianos y modificar las moléculas que exuda a través de la raíz. Algunas de estas moléculas pueden potenciar o inhibir específicamente los sistemas de QS bacteriano. Recientemente se ha descrito que, uno de los compuestos exudados por Combretum albiflorum, el flavonoide catequina, reduce la producción de factores de virulencia regulados mediante sistemas de QS en la bacteria patógena P. aeruginosa PAO1 (Vandeputte et al., 2010). En esta Tesis, sin embargo, se ha demostrado que los flavonoides inductores de los genes de nodulación potencian los sistemas de QS en los tres rizobios analizados. Estos sistemas, al menos en SMH12, parecen estar implicados en la correcta colonización de la raíz de la leguminosa y, de hecho, son necesarios para una simbiosis óptima. Las leguminosas hospedadoras, por lo tanto, podrían de manera Discusión  227  específica activar los sistemas de QS de rizobios compatibles mediante la producción de flavonoides inductores de sus genes de nodulación. Los estudios de detección e inicio de caracterización de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano realizados en la Tesis parecen indicar que las moléculas producidas por plantas de arroz y judía que interfieren en los sistemas de QS bacteriano no son de tipo AHL y, sin embargo, son capaces de activar o inhibir estos sistemas en diferentes estirpes biosensoras. Por ello, probablemente las plantas produzcan a través de sus exudados varias moléculas capaces de interferir específicamente en los sistemas de QS, potenciando unos e inhibiendo otros, como primera línea de defensa de la planta (Figura 5.4.). La complejidad de la red de señales que controlan las interacciones entre las plantas y los microorganismos asociados en la rizosfera genera un enorme reto para las futuras investigaciones sobre los sistemas de quorum sensing de los rizobios y la interferencia en estos sistemas por parte de las leguminosas hospedadoras. No se deben estudiar cada una de las señales por separado, puesto que todas están de algún modo conectadas, y únicamente mediante ensayos globales de proteómica, transcriptómica, metabolómica, etc., se podrá comenzar a dilucidar el papel de cada una de estas señales durante la comunicación intercelular que ocurre entre el rizobio y la leguminosa.     CONCLUSIONES   Conclusiones  231  1. Sinorhizobium fredii SMH12, Rhizobium etli ISP42 y Rhizobium sulle IS123 producen como moléculas autoinductoras la C8-HSL y al menos uno de sus derivados oxoo hidroxi-. SMH12 y ISP42 producen además la C14-HSL y la 3-oxo-C14-HSL, respectivamente. 2. S. fredii SMH12 posee al menos tres genes de síntesis de AHL: traI, implicado en la síntesis de la 3-oxo-C8-HSL, traI(2) y sinI. R. etli ISP42 posee al menos dos genes de síntesis de AHL: raiI, implicado en la síntesis de la C8-HSL y la 3-OH-C8-HSL; y cinI. 3. Los genes de nodulación de SMH12 son inducidos por un amplio rango de flavonoides. En el extremo opuesto se encuentra IS123, cuyos genes de nodulación se inducen por un bajo número de flavonoides; mientras que en ISP42 encontramos un caso intermedio. 4. Los flavonoides inductores de los genes de nodulación, genisteína en S. fredii SMH12, apigenina en R. etli ISP42 y daidzeína en R. sullae IS123 incrementan la producción total de autoinductores y la expresión de sus genes de síntesis: traI de SMH12 y raiI y cinI de ISP42. Este efecto no se observa en presencia de flavonoides no inductores de los genes de nodulación (umbeliferona para SMH12 e ISP42 y apigenina para IS123). 5. El incremento de expresión del gen traI de S. fredii SMH12 por genisteína es dependiente de la presencia de AHL. NodD1 reprime la expresión del gen traI en SMH12. Además, en presencia del flavonoide inductor de los genes de nodulación, NodD1 deja de reprimir la expresión del gen traI. 6. La capacidad de nodulación de la soja cv Osumi por S. fredii SMH12 se ve disminuida por la reducción en la producción de AHL por esta bacteria. 7. La reducción en la producción de AHL por SMH12 no altera la producción de otras moléculas bacterianas importantes para la simbiosis, como los EPS, LPS y proteínas Nop. Bibliografía  238  Chugani SA, Whiteley M, Lee KM, D´Argenio D, Manoil C, Greenber EP. 2001. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:2752-2757. Chung C, Niemela SL, Miller RH. 1989. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 6:2172-2175. Costa JM, Loper JE. 1997. EcbI and EcbR: homologs of LuxI and LuxR affecting antibiotic and exoenzyme production by Erwinia carotovora subsp. betavasculorum. Can. J. Microbiol. 43:1164-1171. 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