Prevalencia de Escherichia Coli o25b: h4-st131 productor o no de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) en Sevilla

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facul ad de Medicina Depa amen o de Mic obiología TESIS DOCTORAL P e alencia de Esche ichia coli O25b:H4-ST131 p oduc o o no de Be alac amasa de Espec o Ex endido (BLEE) en el á ea de Se illa. T abajo ealizado pa a alcanza el g ado de Doc o po , la Licenciada en Fa macia, Dña. Ma ía del Ma Bellido Ba que o. Se illa, mayo de 2017 Ag adecimien os Me gus a ía da le las g acias a odos y cada uno de los que han es ado a mi lado du an e es e iempo. Quizás no pueda esc ibi el nomb e de odos los “con ibuyen es”, pe o ellos saben quiénes son. En p ime luga da le las g acias a mis dos di ec o es. Al D . Ál a o Pascual po pe mi i me ealiza es e abajo bajo su u ela, po sus sabios consejos y habe me pe mi ido compagina el desa ollo de es e p oyec o con mi o mación como Especialis a en Mic obiología. A la D a. Lo ena López Ce e o po habe me ayudado y po habe con iado en mí en es a úl ima e apa del p oyec o. Al D . Ja ie Azna ag adece le habe sido mi u o del T abajo Fin de Más e y del P oyec o de Tesis Doc o al. También mos a mi ag adecimien o a odos los Facul a i os del Se icio de Mic obiología del H. U. V. Maca ena: Anabel, Níni e, Enca na, Ma ina, Inma y Felipe. G acias po habe dejado que in i ie a iempo de la especialidad en idas y enidas a” la cá ed a”. G acias po ues as palab as de alien o, en especial al D . Muñoz. G acias, En ique. G acias po odos us consejos y g acias po escucha me, aún a día de hoy. G acias a los écnicos, en especial a Inma y Lola. G acias a Candela y Pila po las isas que nos hemos echado y nos seguimos echando. Ag adece a odos mis compañe os de “la cá ed a” po compa i an os buenos momen os y o os menos buenos; en de ini i a, g acias po compa i . G acias a So ía, José Manuel, Isabel, Cá menes, Fe nando, Ra a y, en especial, a “los niños”. G acias, Alejand a, E a, Fany, Pauli a, F an y sob e odo, a La a. G acias po odo lo que has hecho y po lo que e es, g acias po las isas que nos hemos echado y po odo lo que me has aguan ado. Deci os que sois g andes abajado es, pe o mejo es pe sonas. G acias a mis compañe os de esidencia, en especial a mi “R2”, Meme, y a mi “R chico”, Jesús. Con la especialidad se ganan muchas cosas y, una de los mejo es, los amigos. G acias a mis pad es, soy quien soy g acias a oso os. G acias po ues o apoyo incondicional. G acias a mi ma ido. Sin i, no lo hubie a conseguido. G acias po anima me a con inua y po hace me el camino más ácil. G acias a mi hija. Ella no lo sabe aún, pe o me ha dado mucha ue za pa a segui adelan e. G acias a mis amigas de oda la ida y a las más ecien es, pe o no menos impo an es. G acias, Paula, Ma ía Rosa, Emma, Ma ía, Belén, Lucía y Ma ía. 6 7 1. In oducción In oducción 9 1.1. Gene alidades de E. coli En 1885, Theodo e on Esche ich aisló Bac e ium coli commune a pa i de heces de neona os y niños sanos (1). Pe o has a el año 1954 no es denominada Esche ichia coli, en hono a su descub ido (2). Es a especie jun o con o as cinco pe enecen al géne o Esche ichia, el cual se engloba den o de la amilia En e obac e iaceae. De odas las especies del géne o, E. coli es la más impo an e pa a el se humano po o ma pa e de la mic obio a in es inal de indi iduos sanos y o os mamí e os de sang e calien e, llegando a se la bac e ia anae obia acul a i a más abundan e en el in es ino g ueso del se humano. Y po o o lado, po ag upa cepas que pueden causa in ecciones in es inales y ex ain es inales, an o en indi iduos sanos como inmunodep imidos (3). En e las in ecciones más comunes p oducidas po E. coli se encuen an las in ecciones del ac o u ina io (80- 90%), seguidas de bac e iemias, meningi is y dia eas (4). 1.2. Pa ogenia La pa ogenia de E. coli es a iable y, en unción de ella, se pueden dis ingui es g upos p incipales: E. coli comensal, E. coli pa ógeno in es inal y E. coli pa ógeno ex ain es inal. 1.2.1. E. coli comensal Las cepas comensales de E. coli cons i uyen g an pa e de la mic obio a del in es ino del se humano, mamí e os y a es. Son cepas pe ec amen e adap adas a la coexis encia con su hospedado , el cual no desa olla sin oma ología, sal o en casos de inmunodep esión. 10 1.2.2. E. coli pa ógeno in es inal Las cepas pa ógenas in es inales de E. coli a a ez se encuen an o mando pa e de la lo a ecal de indi iduos sanos, sino que son pa ógenos obligados. En la ac ualidad según la pa ogénesis y ca ac e ís icas epidemiológicas, se han de inido 6 pa o ipos de E. coli: E. coli en e o oxigénica (ETEC), E. coli en e oag ega i a (EAEC), E. coli de adhe encia di usa (DAEC), E. coli en e ohemo ágica (EHEC), E. coli en e oin asi a (EIEC), E. coli en e opa ógena (EPEC). Los es p ime os son causan es de dia eas acuosas, mien as que los es úl imos p oducen dia eas sanguinolen as y/o in asi as. Los mecanismos de acción son di e en es según el pa o ipo: p oducción de oxinas (ETEC, EHEC, EAEC), ac o es de adhe encia (EHEC, EPEC, EAEC, DAEC) e in asión del epi elio (EIEC). 1.2.3. E. coli Ex ain es inal (ExPEC) Es as cepas son epidemiológica y ilogené icamen e dis in as de las comensales e in es inales. Son capaces de causa in ecciones en los se es humanos y animales de sang e calien e, no son capaces de causa una in ección en é ica, pe o sí de ins au a se de o ma es able en el in es ino del hospedado y llega a coloniza el 20% de humanos sanos (5). En el se humano es as cepas son la causa más impo an e de in ección del ac o u ina io (UTI), en cuyo caso eciben el nomb e de cepas UPEC; seguida de bac e iemias adqui idas en la comunidad y sepsis (cepas SEC). Po o a pa e, cons i uyen una de las causas p incipales de meningi is en los ecién nacidos (cepas NMEC) que, a menudo, acaban en mue e (6)(7). Pueden causa in ecciones in aabdominales y neumonías nosocomiales y, ocasionalmen e, pa icipan en o as in ecciones ex ain es inales, ales como la os eomieli is, celuli is e in ecciones de he idas. En los animales es de especial ele ancia las ele adas pé didas económicas que padece la indus ia a ícola debido a las cepas que causan in ecciones espi a o ias y sepsis (8,9). Los animales de compañía como los pe os y ga os ambién su en in ecciones po cepas ExPEC que pueden compa i genes de i ulencia con cepas causan es de in ecciones en se es humanos (10,11). 1.2.3.1. Fac o es de i ulencia Las cepas ExPEC es án implicadas en un amplio espec o de en e medades que se pueden asocia con la p esencia de a ios ac o es de i ulencia, ales como di e sas combinaciones de adhesinas, dis in os sis emas de adquisición de hie o, p oducción de In oducción 11 oxinas y mecanismos de e asión del sis ema de de ensa del hospedado , en e o os. Sin emba go, aunque no se puede es ablece una elación en e un ac o de i ulencia ex ain es inal conc e o y una pa ología especí ica, a pa i del año 2000 su ge el concep o de ExPEC, de iniéndose como al a aquellas cepas de E. coli con capacidad i ulen a en un modelo animal o con de e minados ac o es de i ulencia que causan in ecciones ex ain es inales y que son dis in os a los encon ados en las cepas in es inales (12,13). Cabe menciona que en muchos es udios se engloba den o del pa o ipo ExPEC a cualquie cepa de E. coli aislada de una in ección ex ain es inal, pe o el c i e io pa a disc imina las cepas ExPEC de las no-ExPEC se basa en la p esencia de dos de los siguien es ma cado es de i ulencia: papC o papAH, s a/ oc, a a/d a, iu A y kpsM II (14). Las cepas ExPEC poseen dis in os ipos de ac o es de i ulencia que con ibuyen conjun amen e a po encia su pa ogenia, po lo que se conside a que su i ulencia es un enómeno mul i ac o ial. A con inuación, se desc iben los siguien es ac o es de i ulencia: • Adhesinas Es as p o eínas es án implicadas en la unión de la bac e ia a las células epi eliales del ac o u ina io, ales como: o Fimb ia común ipo 1 ( imH): p esen e en el genoma del 99% de los aislados de E. coli (15) e implicada en la adhesión e in asión de las células de la ejiga. o Fimb ia ipo P (papG): p esen e en la mayo pa e de las cepas causan es de pielone i is y u osepsis. Se enca ga de ija se a los ecep o es y coloniza el epi elio (16). o Fimb ia ipo S: asociada a cepas causan es de sep icemias y meningi is. Muchas cepas exp esan an o la imb ia ipo S como ipo P simul áneamen e (17). o Adhesina a a/D : implicada en la e asión de la espues a humo al, acili ando la in asión de las células epi eliales. Se ha asociado con cepas causan es de in ecciones u ina ias y sep icemias (18). En cuan o a la exp esión de las imb ias exis e una egulación; de modo que en la p ime a ase de la in ección que iene luga en la ejiga se exp esan las de ipo 1, 12 pe o en el iñón dejan de exp esa se y comienzan a hace lo las de ipo P y S. Es a egulación je á quica pa ece se esencial pa a el pa ógeno, ya que se asegu a que sólo las imb ias necesa ias implicadas en la adhe encia a un de e minado ejido se exp esan en un momen o dado y, así, limi an su exposición al sis ema inmune y eluden la espues a de los an icue pos (19). • Toxinas Ac úan des uyendo las células del hospedado , pa a así con inua diseminándose po sus ejidos y adqui i nu ien es y o os ac o es necesa ios du an e la in ección. o α-hemolisina (Hly): p esen e en las cepas causan es de in ecciones u ina ias y sepsis, en e o as. Con ibuye al suminis o de hie o a la bac e ia (20). o Sa (Sec e ed Au o anspo e Toxin): p esen e p incipalmen e en cepas causan es de pielone i is. P o oca e ec os ci opá icos sob e células del iñón y de la ejiga (21). o CDT (Cy ole hal Dis ending Toxin): p esen a ac i idad ca alí ica. Se conocen 5 a ian es, de las cuales la CDT-I, CDT-II y CDT-IV se han iden i icado en cepas ExPEC (22). o CNF (Cy o oxic Nec o izing Fac o ): se conocen 3 ipos, de los cuales las cepas ExPEC causan es de in ección u ina ia y sepsis p oducen la a iedad CNF1, jun o con Hly (23,24). • Side ó o os Los side ó o os son sis emas de cap ación del hie o que las bac e ias han desa ollado pa a pode c ece y sob e i i , ya que al es a secues ado en hemop o eínas o en p o eínas anspo ado as de hie o, puede llega a con e i se en un ac o limi an e (25). Es os cap ado es de hie o se sin e izan en el ci oplasma, pos e io men e son sec e ados, cap an el hie o g acias a la ele ada a inidad que ienen po él, se in e nalizan y libe an el hie o en el ci oplasma (26). • P o eínas in oluc adas en la esis encia al sue o y a la agoci osis En e las p o eínas in oluc adas en la esis encia al sue o se encuen an las lipop o eínas Iss (Inc eased Se um Su i al), que inc emen an la supe i encia al sue o In oducción 13 y las T aT, las cuales aumen an la esis encia de la bac e ia a la acción del complemen o, p oduciendo una disminución de la in e acción de la memb ana bac e iana con el complemen o y, como consecuencia, educiendo la agoci osis (27). También la cápsula juega un papel p o ec o con a la agoci osis y la ac i idad bac e icida del sue o, p incipalmen e debido a an ígenos de los g upos II y III (28). O o ac o de i ulencia que ayuda a la supe i encia de las bac e ias y a la capacidad in asi a g acias a la o mación de biopelículas es el IbeA (In asion o B ain Endo helium) (29). La i ulencia de las cepas ExPEC ha es ado clásicamen e in e samen e elacionada con la esis encia a an imic obianos, de modo que las cepas u opa ógenas de E. coli esis en es a luo quinolonas (FQ) p esen an una disminución en la exp esión de los ac o es de i ulencia en compa ación con las cepas sensibles, según han cons a ado a ios es udios. Uno de ellos lo lle a on a cabo D ews y cols., quienes es udia on la ecuencia de la be a(β)-hemólisis y de la exp esión de papEF (adhesina) en una se ie de aislados canadienses de E. coli an o comuni a ios como nosocomiales du an e los años 2003-2004. Ob u ie on que la β-hemólisis y la exp esión de papEF, an o en comuni a ios como en nosocomiales, e an signi ica i amen e menos ecuen es en e los aislados de E. coli esis en es a FQ que en e los sensibles (30). Po o o lado, La igne y cols. es udia on en F ancia o os ac o es de i ulencia (papG allele II- a ian e de la adhesina P, kpsMTK1- a ian e de kpsM y hlyA-hemolisina) en aislados de E. coli p oceden es de mues as hospi ala ias, as lo que ob u ie on que los aislados de E. coli sensibles a FQ es aban signi ica i amen e asociados con los ac o es de i ulencia en compa ación con los aislados esis en es a FQ (31). En o a se ie eu opea de aislados de E. coli, p oceden es de mues as hospi ala ias ecogidas du an e los años 1998-1999 y 2002, Johnson y cols. es udia on la p esencia de 35 ma cado es de i ulencia, de ec ándose mayo núme o de es os en e los aislados sensibles a FQ que en e los esis en es, siendo es adís icamen e signi ica i a la di e encia en 3 de ellos, yuA (side ó o o), kpsMT II y ompT (p o easa de la memb ana ex e na (32). 1.3. Di e sidad gené ica Como hemos comen ado an e io men e, den o de es a especie exis en di e en es g upos, pe o ambién se pueden dis ingui dis in os linajes o subg upos. Pa a ello se u ilizan las écnicas de ipado, en e las que se encuen an las an e io es a la e a molecula y las pos e io es a la misma. De modo que an es de dispone de in o mación 14 a ni el molecula , el es udio de la di e sidad de E. coli se lle ó a cabo con cepas di e enciadas median e se o ipado y pe iles me abólicos (MLEE). 1.3.1. Se o ipado Pa a di e encia las cepas pa ógenas de las cepas comensales p esen es en la lo a mic obiana no mal, Kau mann (33) desa olló un esquema de se o ipi icación que ac ualmen e iene 174 an ígenos somá icos (O1 a O181), 53 lagela es (H1 a H56) y 72 capsula es (K1 a K103). El an ígeno “O” es el esponsable del se og upo; la de e minación de los an ígenos somá ico y lagela (O:H) indica el se o ipo, el cual en ocasiones se asocia con un cuad o clínico en pa icula . La se o ipi icación de E. coli equie e de un g an núme o de an isue os y es una écnica muy cos osa, po lo que muchos labo a o ios de u ina usan o os mé odos de ipado. 1.3.2. MLEE (Mul ilocus Enzyme Elec opho esis) Es e mé odo analiza los pa ones de mo ilidad elec o o é ica de un g upo de enzimas me abólicas (de 15 a 30). Al habe aislados que p esen an dis in a mo ilidad enzimá ica, se conside a que ienen di e en es e siones de la misma enzima, lo que se aduce en dis in os alelos codi ican es de esa enzima. Con la inco po ación de las écnicas molecula es se an supe ando los incon enien es an e io men e desc i os, además de consegui mayo ep oducibilidad y pode de disc iminación (34). En e dichas écnicas se encuen an: pe il plasmídico, análisis del ADN c omosómico median e enzimas de es icción (Res ic ion F agmen Leng h Polymo phism “RFPL” y Pulse-Field Gel Elec opho esis “PFGE”), ibo ipado (análisis de los genes de ADN que codi ican pa a ARN 16S y 23S), écnicas de PCR (A bi a ily P imed Polyme ase Chain Reac ion, AP-PCR y Random-PCR) y secuenciación del ADN (MLST) (6,35–38). De odos ellos, cabe des aca el PFGE y el MLST po las en ajas comen adas a con inuación. 1.3.3. PFGE (Pulsed-Field Gel Elec opho esis) Es a écnica se basa en la diges ión del ADN c omosómico con una enzima de es icción de baja ecuencia, y la pos e io sepa ación de los 10-30 agmen os de ADN que se gene an median e elec o o esis en campo pulsado. Es al amen e ep oducible y iene un ele ado pode de disc iminación (analiza g an pa e del ADN c omosómico), po lo que es un mé odo de e e encia de ipado en es udios epidemiológicos locales en In oducción 15 los que in e esa de ec a cepas implicadas en b o es. Pe o es a écnica ambién p esen a cie as limi aciones, como: no pode in e cambia in o mación en e labo a o ios po la necesidad de es anda ización, su ele ado cos e, labo iosidad y iempo pa a ob ene y analiza esul ados. 1.3.4. MLST (Mul iLocus Sequence Typing) La écnica de Mul iLocus Sequence Typing “MLST” es á basada en el MLEE y de e mina la secuencia de nucleó idos de cie os genes al amen e conse ados (housekeeping). La elación de los aislados median e MLST se basa en los polimo ismos de los dichos genes; a cada secuencia gené ica se le asigna un núme o de alelo, gene ándose pa a cada cepa un pe il alélico al que le co esponde un secuencio ipo (ST) (39). Exis en dos esquemas de MLST según los genes housekeeping seleccionados. Uno de ellos es el esquema de Ach man (h p://mls .wa wick.ac.uk/mls /dbs/Ecoli), que u iliza la secuencia de 7 genes housekeeping: adk (adenila o kinasa), umC ( uma a o hid a asa), gy B (ADN gi asa), icd (isoci a o deshid ogenasa), mdh (mala o deshid ogenasa), pu A (adenilsuccina o sin e asa), y ecA (mo i o de unión ATP/GTP). El o o es el esquema de Pas eu (h p://www.pas eu . / eche che/genopole/PF8/mls /EColi.h ml), el cual usa 8 genes housekeeping: dinB (DNA polime asa), icdA (isoci a o deshid ogenasa), pabB (p- aminobenzoa o sin asa), polB (polyme asa II [Pol II]), pu P (p olin pe measa), pA (subunidad A ip ó ano sin asa), pB (subunidad B ip ó ano sin asa), y uidA (β- glucu onidasa). Es e mé odo no iene las des en ajas que p esen a el PFGE, ya que la in o mación de las secuencias es compa able y ans e ible en e labo a o ios y es al amen e ep oducible (40). Po el con a io, no iene el pode disc imina o io pa a de ec a cambios gené icos en e cepas implicadas en b o es (34) y puede ocu i que den o de un ST no exis a homogeneidad en cuan o a las p opiedades gené icas o compo amien o pa o ípico y que, al ipa las, an o aislados pa ogénicos como comensales o a i ulen os p esen en la misma combinación alélica. Los obje i os de es as écnicas de geno ipado son dis ingui los aislados pa ógenos de los inocuos y de e mina si son aislados que pe enecen al mismo clon o a g upos clonales elacionados epidemiológicamen e. Es deci , si aunque p ocedan de di e en es mues as, zonas geog á icas y quizás di e en es echas de aislamien o, ienen las mismas ca ac e ís icas eno ípicas y geno ípicas, hace que la explicación más 22 Tabla 1. Clasi icación de los an ibió icos β-lac ámicos. G upo An ibió ico Espec o de acción Penicilinas Bencilpenicilina Penicilina G. Espec o educido. Fenoxialquilpenicilina Penicilina V o enoxime ilpenicilina. Espec o educido. Isoxazolilpenicilinas Oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina. Ac i as en e a penicilinasas de S aphylococcus. Aminopenicilinas Ampicilina, amoxicilina,bacampicilina, pi ampicilina. Ac i as en e a en e obac e ias. Ca boxipenicilinas Tica cilina, ca benicilina. Ac i as en e a en e obac e ias y Pseudomonas. Acilu eidopenicilina Pipe acilina. Ac i as en e a en e obac e ias y Pseudomonas. Ce alospo inas 1ª gene ación Ce alo ina, ce azolina, ce ad oxilo, ce alexina, ce ad ina. Ac i as en e a g amposi i os y algunas en e obac e ias. 2ª gene ación Ce u oxima, ce amandol, ce onicid, ce aclo . Mayo ac i idad en e a g amnega i os que g amposi i os. Ce amicinas Ce oxi ina, ce o e án, ce me azol. Mayo esis encia a be alac amasas, incluidas las de espec o ex endido. 3ª gene ación Ce o axima, ce iaxona, ce azidima, ce podoxima, ce ixima, ce ope azona. Espec o ampliado en e a g amnega i os, incluido Pseudomonas. 4ª gene ación Ce epime, ce pi oma. Amplio espec o: g an ac i idad en e a g amposi i os y g amnega i os. Ca bapenemas Imipenem, e apenem, me openem, do ipenem. Resis encia a be alac amasas, incluidas las de espec o ex endido. Monobac amas Az eonam, ca umonam. Resis encia a be alac amasas, especialmen e de Pseudomonas. Inhibido es de β- lac amasas Ácido cla ulánico, sulbac am, azobac am. Asociados con be alac ámicos es au an su ac i idad. In oducción 23 1.5.1.2. Quinolonas Las quinolonas son an imic obianos bac e icidas cuya es uc u a química se basa en el anillo 4-oxo-quinoleína. Ac úan inhibiendo a la ADN gi asa y a la opoisome asa IV, con lo cual impiden la sín esis del ADN. Sob e el anillo se han hecho múl iples modi icaciones pa a ob ene moléculas con un mayo espec o de acción y mejo es ca ac e ís icas a macociné icas, siendo las más no ables las adiciones de un á omo de lúo en la posición 6 y de un g upo pipe acínico o me il-pipe acínico en la posición 7. Los compues os ob enidos se denomina on luo oquinolonas, en e las que cabe des aca el cip o loxacino. 1.5.1.3. Aminoglicósidos Es os an imic obianos son agen es bac e icidas cuya es uc u a química cons a de un anillo aminocicli ol ( a ía según el an imic obiano) con dos o más azúca es. El mecanismo de acción se basa en la inhibición de la sín esis de p o eínas. Se pueden clasi ica en na u ales, den o de las cuales se encuen an la ob amicina, es ep omicina y gen amicina, en e o os; y los semisin é icos, en e los que des aca la amikacina. 1.5.1.4. Co imoxazol Es e an imic obiano esul a de la asociación de ime op im-sul ame oxazol, lo que de e mina que se compo e como bac e icida. Ac úa bloqueando la sín esis del ácido ólico en dos e apas, lo que supone una po enciación de la acción. 1.5.1.5. Fos omicina Es e an imic obiano se ca ac e iza po la p esencia de un anillo epóxido y un g upo os ó ico. Se compo a como un análogo del os oenolpi u a o, impidiendo la o mación del N-ace il-mu ámico y, con ello, la sín esis de la pa ed bac e iana. 24 1.6. Resis encia a an imic obianos en E. coli En los úl imos 15-20 años, el manejo e apeú ico de las in ecciones po E. coli se ha is o di icul ado po el aumen o de los mecanismos de esis encia que p esen a el mic oo ganismo. Conc e amen e, la esis encia a FQ y al ime op im-sul ame oxazol limi a las opciones e apeú icas en los pacien es comuni a ios, mien as que la esis encia a las ce alospo inas lo hace en el caso de los pacien es hospi ala ios. Los aislados de E. coli pueden p esen a esis encia a un an imic obiano o a a ios, lo cual conlle a ía a un es ado de mul i esis encia. Po o o lado, la esis encia puede se na u al (in ínseca) o adqui ida. La esis encia na u al es p opia de cada amilia, especie o g upo bac e iano y es a si uación no es a iable. La esis encia adqui ida sí es a iable y puede o igina se po la adquisición de de e minan es de esis encia a a és de elemen os mó iles, o po la apa ición de mu aciones. A con inuación, se explican los di e en es mecanismos de esis encia de E. coli a los p incipales g upos de an imic obianos: β-lac ámicos, aminoglucósidos y quinolonas. 1.6.1. Be alac ámicos Exis en nume osos mecanismos po los que las bac e ias pueden desa olla esis encia a los β-lac ámicos, en e los que se encuen an: 1. Aquellos que impiden que el β-lac ámico llegue a la diana, ales como al e aciones en la pe meabilidad de la memb ana ex e na y bombas de expulsión. 2. Aquellos en los que se modi ican las dianas. Los cambios a ni el de las PBPs implican que los β-lac ámicos pie dan a inidad po ellas, con la consiguien e disminución de su ac i idad. Aunque es e mecanismo a ec a undamen almen e a g amposi i os. 3. Aquellos en los que exis e la inac i ación enzimá ica po p oducción de β- lac amasas. De odos es os mecanismos, el más impo an e, po su ecuencia y e icacia en aislados de E. coli, es la p oducción de β-lac amasas. In oducción 25 1.6.1.1. β-lac amasas Las β-lac amasas pueden se c omosómicas o plasmídicas. En el p ime caso pueden se an o cons i u i as como inducibles; si bien, las enzimas plasmídicas sólo son cons i u i as, cuyo g ado de p oducción es á en elación con el núme o de copias del plásmido (57,58). La esis encia que o iginan es in ínseca o adqui ida (mu ación) en el caso de β-lac amasas c omosómicas, y adqui ida, si la β-lac amasa es plasmídica. 1.6.1.1.1. Mecanismos de acción Las β-lac amasas son enzimas que hid olizan el anillo β-lac ámico an es de que el an ibió ico llegue al pun o de unión con las PBP. Se unen a los β-lac ámicos median e un enlace no co alen e, as lo cual iene luga una ace ilación en e el g upo és e del anillo β- lac ámico y el g upo hid oxilo lib e del cen o ac i o de la enzima. Finalmen e, la enzima que se encuen a ac i a es libe ada, y el an ibió ico inac i o (59). 1.6.1.1.2. Clasi icación Las β-lac amasas se han clasi icado u ilizando di e en es c i e ios, aunque p incipalmen e se han basado en su es uc u a molecula (clasi icación de Amble ) y en sus ca ac e ís icas enzimá icas (clasi icación según Bush, Jacoby y Medei os) ( abla 2): I. La clasi icación molecula de Amble (60) di ide a las β-lac amasas en cua o clases (A, B, C y D), a endiendo a la es uc u a de la p o eína. Las enzimas de los g upos A, C y D son se in-β-lac amasas, que con ienen una se ina en su cen o ac i o. Las del g upo B son me alo-β-lac amasas, enzimas que equie en pa a su acción la unión del Zn+2 a su cen o ac i o. II. La clasi icación uncional p opues a po Bush, Jacoby y Medei os en 1995, y ac ualizada en 2009 (61,62), es ablece di e en es g upos según su sus a o y el pe il de inhibición po inhibido es de β-lac amasas: 26 El g upo 1 (clase C de Amble o de ipo AmpC) incluye enzimas que pueden localiza se en el c omosoma o en plásmidos. Las c omosómicas (exp esión inducible) hid olizan ce alospo inas de 1ª y 2ª gene ación (incluidas las ce amicinas) y no son inhibidas po el ácido cla ulánico o azobac am, pe o si hay una hipe p oducción de dicha enzima, el espec o hid olí ico aumen a y llegan a a ec a a las ce alospo inas de 3ª gene ación; aunque en e a ce epime son mucho menos ac i as y ca ecen de ac i idad en e a ca bapenemas. Es e pe il de ac i idad las hace indis inguibles de las AmpC plasmídicas (exp esión cons i u i a), hecho que di icul a su seguimien o epidemiológico. Se incluyen en es e g upo las β-lac amasas c omosómicas inducibles de E. ae ogenes, C eundii, Se a ia spp., M. mo ganii, P. ae uginosa, y la c omosómica cons i u i a de E. coli. También pe enecen a es e g upo AmpC plasmídicas desc i as en K. pneumoniae, K. oxy oca, S. en e ica, E. coli, P. mi abilis, M. mo ganii y E. ae ogenes. El g upo 2 (clases A y D de Amble ) se inhibe po el ácido cla ulánico y es á compues o po 12 subg upos, de los cuales cabe des aca el 2b (incluye β-lac amasas de amplio espec o) y el 2be (incluye las Be a-Lac amasas de Espec o Ex endido “BLEE”). Las β-lac amasas de amplio espec o con ie en esis encia a penicilinas y ce alospo inas de p ime a gene ación, y las BLEE a penicilinas, ce alospo inas de p ime a, segunda gene ación (excep o ce amicinas), de e ce a y cua a (ce alospo inas de espec o ex endido) y monobac ámicos. Ambos g upos de enzimas se inhiben po el ácido cla ulánico/ azobac am. In oducción 27 Bush- Jacoby (2009) Bush- Jacoby- Medei os (1995) Clase Molecula (subclase) Cen o ac i o Sus a o p e e encial Inhibida po Enzimas ep esen a i as CLA/TAZ EDTA 1 1 C Se ina Ce alospo inas No No E. coli AmpC, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1 1e NI C Se ina Ce alospo inas No No GC1, CMY-37 2a 2ª A Penicilinas Sí No PC1 2b 2b A Penicilinas, Ce alospo inas de 1ª G. Sí No TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be 2be A Se ina Ce alospo inas Espec o Ex endido (3ª y 4ª gene ación), monobac ámicos Sí No TEM-3, SHV-2, CTX- M-15, PER-1, VEB-1 2b 2b A Se ina Penicilinas No No TEM-30, SHV-10 2be NI A Se ina Ce alospo inas Espec o Ex endido (3ª y 4ª gene ación), monobac ámicos No No TEM-50 2c 2c A Se ina Ca benicilina Sí No PSE-1, CARB-3 2ce NI A Se ina Ca benicilina, ce epime Sí No RTG-4 2d NI D Se ina Ca bapenemas Va iable No OXA-23, OXA-48 2e 2e A Se ina Ce alospo inas Espec o Ex endido(3ª y 4ª gene ación) Sí No CepA 2 2 A Se ina Ca bapenemas Va iable No KPC-2, IMI-1, SME-1 3a 3 B (B1) Zinc Ca bapenemas No Sí IMP-1, VIM-1, Cc A, IND-1 B (B3) Zinc L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1 3b 3 B (B2) Zinc Ca bapenemas No Sí CphA, S h-1 NI 4 Desconoc ido Se ina Enzima c omosómica de B. cepacia Tabla 2. Clasi icación de las β-lac amasas según su g upo uncional (Bush, Jacoby y Medei os) y clase molecula (Amble ). CLA: ácido cla ulánico; TAZ: azobac am. NI: No Incluido. 28 El g upo 3 (clase B de Amble ) incluye me alo-β-lac amasas. Es as enzimas se inhiben po agen es quelan es como el EDTA, pe o no po el ácido cla ulánico o azobac am. El g upo 4, incluido en la clasi icación inicial, no apa ece en la ac ualización del año 2009. La mayo ía de enzimas de es e g upo no es án comple amen e ca ac e izadas y pod ían se clasi icadas en los g upos an e io es. Recien emen e, Giske y han p opues o una clasi icación pa a acili a el con ol epidemiológico de las BLEE (Tabla 3), de modo que se es ablecen es g upos con di e en es subclases cada uno, de acue do con sus ca ac e ís icas eno ípicas. El g upo BLEEA ag upa a las β-lac amasas de clase 2be, donde se encuen an las BLEE más p e alen es (TEM, SHV y CTX-M). El g upo BLEEM engloba a las AmpC plasmídicas y las BLEE ipo OXA, en e o as. El g upo BLEECARBA es á compues o po ca bapenemasas (63). Be alac amasas con ac i idad hid olí ica en e a ce alospo inas de espec o ex endido y ca bapenemas BLEEA BLEEM BLEECARBA Tipos de be alac amasas BLEEA Al a p e alencia CTX-M, TEM, SHV, VEB, PER BLEEM-C (AmpC plasmídicas) CMY, FOX, MIR, MOX, DHA, LAT, BIL, ACT, ACC BLEECARBA-A KPC, GES-2, -4, -5, -6, -8, NMC, SME, IMI-1, -2 BLEEA Baja p e alencia GES-1,-3, -7, -9, SFO-1, BES-1, BEL-1, TLA, IBC, CMTa BLEEM-D (OXA-BLEE) G upo OXA-10 G upo OXA-13 G upo OXA-2 OXA-18, OXA-45 BLEECARBA-B (MBL) IMP, VIM, SMP-1, GIM-1, SIM- 1, AIM-1 BLEECARBA-D (OXA- ca bapenemasas) G upo OXA-23, g upo OXA- 24, OXA-48b, G upo OXA-58 Ca ac e ís icas Resis en es ace alospo inas de espec o ex endido. Sine gia con ácido cla ulánico. Resis en es a ce alospo inas de espec o ex endido. De ección eno ípica(BLEEM-C) y geno ípica (BLEEM-D) Resis en es a ce alospo inas de espec o ex endido y al menos a una ca bapenema. BLEECARBA de ec adas con mé odos eno ípicos y/o geno ípicos. Tabla 3. Clasi icación de BLEE p opues a po Giske y (Adap ado de Giske y 2009). a) Resis en e a ácido cla ulánico. b) Los aislados p oduc o es de OXA-48 pueden p esen a sensibilidad in i o a las ce alospo inas. In oducción 29 1.6.1.1.2.1. Be alac amasas de Espec o Ex endido (BLEE) Las BLEE son enzimas que de i an de las β-lac amasas de amplio espec o que, as su i mu aciones en el cen o ac i o (el cambio de uno o más aminoácidos implica la ape u a del si io ac i o de la enzima y un mayo acoplamien o de la cadena la e al del β- lac ámico), inc emen an su ac i idad, llegando a hid oliza no sólo penicilinas y ce alospo inas de p ime a y segunda gene ación, sino ambién de e ce a y cua a (64). Es as dos úl imas gene aciones de ce alospo inas se in oduje on en la p ác ica clínica en los años 80 debido al inc emen o de mic oo ganismos p oduc o es de β-lac amasas, pe o debido a que p esen aban meno ne o oxicidad que o os an imic obianos (aminoglucósidos y polimixinas), hubo un uso excesi o y es o, según algunos au o es, hizo que aumen a a la p e alencia de las BLEE (65). La mayo ía de es as enzimas son p oducidas po bacilos g amnega i os, p incipalmen e E. coli y K. pneumoniae, aunque ambién pueden iden i ica se en o as en e obac e ias y bacilos g amnega i os no e men ado es. Las BLEE incluyen enzimas de la clase A de Amble (g upo 2be de Bush) y enzimas de la amilia OXA de la clase D (g upo 2de) (Tabla 2). El o igen de es as enzimas es gene almen e plasmídico, aunque se han encon ado o mando pa e del c omosoma bac e iano, como en el caso de CTX-M-9 y CTX-M-15 (66,67). Desde que se desc ibie a la p ime a BLEE en 1983, el núme o de a ian es ha ido aumen ando has a alcanza hoy día ap oximadamen e 200, lo cual demues a una ápida e olución (68). 1.6.1.1.2.1.1. BLEE g upo TEM Las BLEE del g upo TEM de i an de las β-lac amasas de amplio espec o, TEM-1 y TEM-2, as modi icaciones en la secuencia de aminoácidos que, como se ha comen ado an e io men e, conlle a cambios en la es abilidad de la enzima y en el pe il hid olí ico (69). En 1987 se aisló la p ime a β-lac amasa con pa ón eno ípico de BLEE, TEM-3 (denominada o iginalmen e CTX-1 po su capacidad de hid oliza la ce o axima), la cual se o iginó a pa i de TEM-2 as dos sus i uciones aminoacídicas (70). Aquellas sus i uciones más des acables esponsables del eno ipo BLEE, con mayo capacidad de hid ólisis de 30 ce azidima que ce o axima, se p oducen en las posiciones 104 y 240 (glu ama o po lisina), en la 164 (a ginina po se ina o his idina) y en la 238 (glicina po se ina). Algunas enzimas como TEM-7 y TEM-12 no cumplen el pe il hid olí ico igu osamen e, sino que las asas de hid ólisis pa a ce azidima son mucho más ele adas en compa ación con TEM-1 y TEM-2 y, po an o, su CMI ambién aumen a. De ahí, que se hayan conside ado BLEE y es én clasi icadas den o del g upo 2be (61). Se han desc i o más de 180 a ian es de BLEE de la amilia TEM, en e las que se incluyen las IRT (Inhibi o - Resis an TEM), es deci , enzimas de amplio espec o esis en es a los inhibido es, pe o sensibles a ce alospo inas de 3ª gene ación, y las CMT (Complex Mu an TEM), que combinan los pe iles de BLEE y de IRT. La mayo ía de las enzimas de es e g upo son ce azidimasas y unas pocas son ce o aximasas. Son p oducidas p incipalmen e po E. coli y K. pneumoniae, aunque ambién po E. ae ogenes, M. mo ganii, P. mi abilis, e c. 1.6.1.1.2.1.2. BLEE g upo SHV Las enzimas BLEE del g upo SHV de i an de la β-lac amasa de amplio espec o SHV-1 (sul híd ico a iable), la cual ue iden i icada po p ime a ez en el c omosoma de K. pneumoniae (71). También pueden de i a de la a ian e alélica SHV-1-2ª (SHV-11), as sus i uciones en aminoácidos c í icos del cen o ac i o de la enzima que suponen una ampliación del espec o. En 1983 se de ec ó po p ime a ez una BLEE en un aislado de Klebsiella ozaenae con mayo ac i idad hid olí ica en e a ce o axima que a ce azidima (72); la enzima, denominada SHV-2, de i aba de SHV-1 as la mu ación Se 238Gly. O a sus i ución impo an e es la que iene luga en el aminoácido 240, como ocu e con las enzimas SHV-5 y SHV-12, cuyo cambio Glu240Lys inc emen a la ac i idad hid olí ica en e a ce azidima y az eonam. Has a la echa exis en más de 130 a ian es de β-lac amasas SHV, la mayo ía de espec o ex endido (www.lahey.o g/s udies) y con mayo capacidad de hid oliza la ce azidima que la ce o axima. Aunque se han aislado p incipalmen e en especies de Klebsiella, ambién se han desc i o en E. coli, C. di e sus y P. ae uginosa (73). In oducción 31 1.6.1.1.2.1.3. BLEE g upo CTX-M Todas las enzimas de es e g upo son BLEE y deben su nomb e a la p e e encia que mues an pa a hid oliza ce o axima y ce iaxona en e a ce azidima. En 1986 se desc ibió en Japón un aislado de E. coli esis en e a ce o axima en las heces de un pe o de labo a o io y p oduc o a de β-lac amasa FEC-1 y de codi icación plasmídica (74). En el año 1989 se aisló po p ime a ez una enzima simila a FEC-1 en un aislado de E. coli p oceden e de un exudado ó ico de un ecién nacido y que ue denominada CTX-M-1, po su ele ada ac i idad hid olí ica en e a la ce o axima y po habe se aislado en Munich (75). Simul áneamen e en A gen ina se desc ibió la enzima CTX-M-2 en cepas de Salmonella yphymu ium (75). En 1994 se de ec ó el p ime aislado de E. coli p oduc o de CTX-M-9 en F ancia, en 1996 el p ime aislado p oduc o de CTX-M- 8 en B asil (76) y en 1999 el p ime aislado de CTX-M-15 en la India (77). Las enzimas de es a amilia se clasi ican en 5 g upos (Tabla 4) en base a sus iden idades aminoacídicas. Los miemb os de un mismo g upo compa en más del 94% de dicha iden idad y menos del 90% aquellos que pe enecen a dis in os g upos (78). Es as enzimas es án es echamen e elacionadas con las β-lac amasas c omosómicas de dis in as especies del géne o Kluy e a, ya que exis e una al a homología (>90%) en e los genes c omosómicos de Kluy e a y algunos genes blaCTX-M. De ahí, que se piense que es os genes hayan sal ado del c omosoma pa a in eg a se en plásmidos y disemina se y que, po an o, es as a ias especies de es e géne o sean el o igen de las enzimas (78). El g upo CTX-M-1 de i a de β-lac amasas c omosómicas de K. asco ba a (79) y el g upo 2 de K. c yocescens, mien as que 8 y 9 lo hacen de β-lac amasas c omosómicas de Kluy e a geo giana (80). El o igen del g upo CTX-M-25 no se conoce con p ecisión oda ía, pe o pudie a es a en o os miemb os del géne o Kluy e a (80,81). 38 di e en es á eas del mundo y, cada ez con más ecuencia, en e obac e ias esis en es a β-lac ámicos y ambién a o os g upos de an ibió icos elacionadas con in ecciones comuni a ias (125). Vamos a e a con inuación cómo e a la si uación an es del año 2000 y cómo cambió a pa i de en onces. 1.7.1. Si uación has a el año 2000 Has a inales de los años 90 K. pneumoniae e a la p incipal en e obac e ia implicada en la p oducción de es as enzimas, p incipalmen e de los g upos TEM y SHV (96). También e a la más in oluc ada en b o es nosocomiales, sob e odo en unidades de cuidados in ensi os (UCI) y Pedia ía. Dichos b o es se ca ac e izaban po es a p oducidos po cepas clonalmen e elacionadas. El p ime b o e documen ado ue desc i o en F ancia en 1986 debido a que a ias cepas disemina on desde las Unidades de Cuidados In ensi os has a o as salas hospi ala ias, llegando a in ec a al 15,7% de los pacien es (126). En es e mismo país se p odujo du an e los años 1987-89 la diseminación clonal de K. pneumoniae p oduc o de SHV-4 en 14 hospi ales anceses (127). O a en e obac e ia in oluc ada en b o es nosocomiales e a E. ae ogenes, de la cual hay desc i o uno en el año 1993 debido a una cepa p oduc o a de TEM-24. Llegó a a ec a a UCI, a o a sala del mismo hospi al y a un ge iá ico localizado den o de la misma ciudad. Pe o ambién se de ec a on o as en e obac e ias p oduc o as de TEM-24, lo cual pudo se debido a la diseminación plasmídica de BLEE desde E. ae ogenes (128). De o ma pa alela a lo que es aba ocu iendo en Eu opa, se desc ibie on a ios b o es de en e obac e ias p oduc o as de di e en es ipos de BLEE en EEUU. Du an e los años 1988-90 u o luga un b o e po K. pneumoniae y E. coli p oduc o es de TEM-26 en la unidad de oncología pediá ica de un Hospi al de Cali o nia (129). También en Chicago se p odujo un b o e du an e los años 1990-1992 debido a dos cepas p oduc o as de TEM-10; una cepa de K. pneumoniae, la cual se expandió en el ámbi o hospi ala io, y o a cepa de E. coli que lo hizo en esidencias (130). A ni el nacional se desc ibió a inales de los años 80 la p ime a epidemia, la cual u o luga en un hospi al de Mad id debido a a ias en e obac e ias p oduc o as de SHV-2, de las cuales la más ecuen e ue K. pneumoniae (131). A pa i de en onces, se han comunicado di e sos b o es hospi ala ios, de los cuales uno de los más impo an es desc i o has a el momen o u o luga en e los años 1993-1995 en el Hospi al de Bell i ge. Es e b o e se debió a la diseminación clonal de una cepa de K. pneumoniae p oduc o a de In oducción 39 dos BLEE del g upo SHV y llegó a a ec a a 150 pacien es, de los cuales el 70% es aba ing esado en UCI (132). 1.7.2. Si uación a pa i del año 2000 Pe o a inales de los 90 y p incipios del año 2000 se p odujo un cambio epidemiológico muy signi ica i o. Eme gió E. coli como p incipal especie p oduc o a de BLEE, llegando a supe a a K. pneumoniae, lo cual es aba elacionado con el inc emen o de in ecciones comuni a ias po aislados de E. coli p oduc o es de BLEE del g upo CTX-M (133). Es a si uación ambién la desc ibie on Pi ou y cols. al es udia de mane a p ospec i a una se ie de aislados de E. coli p oduc o es de BLEE du an e 3 años y de ec a que el 70% e an de o igen comuni a io y el 30% nosocomial. De odos los aislados, el 71% e a p oduc o de CTX-M (134). En España ambién se de ec ó es e cambio epidemiológico. En el año 2001 se de ec a on los p ime os casos comuni a ios causados po E. coli p oduc o de CTX-M (135) pe o después se p odujo una diseminación comuni a ia de cepas p oduc o as de BLEE en odo el ámbi o nacional. Según los esul ados del p oyec o del GEIH-2000, el 50% de los aislados de E. coli BLEE ue on comuni a ios y el 66% e an mues as de o igen u ina io. En un abajo pos e io , se iden i ica on las BLEE del p oyec o an e io y encon a on que las enzimas más p e alen es ue on CTX-M-9 (27,3%), SHV-12 (23,8%), CTX-M-14 (20,5%) y TEM (19%), pe o ningún aislado ue p oduc o de CTX-M-15 (136). Seis años más a de, en el es udio del GEIH-BLEE 2006, el po cen aje de casos comuni a ios aumen ó has a un 67,2% y las BLEE más p e alen es ue on CTX-M (72%), den o del cual CTX-M-14 e a es eces más ecuen e que CTX-M-15; seguido de SHV (26,8%) con SHV-12 como enzima p edominan e y, en úl imo luga , el g upo TEM (1,2%) (124). La si uación en el á ea de Se illa e a simila a la ocu ida an o a ni el mundial como nacional. En un es udio que se lle ó a cabo en los años 2001-2002 en un hospi al de la ciudad, se con i mó que la mi ad de los casos de in ección po E. coli p oduc o de BLEE a ec a a pacien es no hospi alizados (137). En cuan o al cambio epidemiológico de las BLEE, se de ec ó du an e los años 1995-98 que los aislados de E. coli p oducían p incipalmen e BLEE del g upo SHV, si bien a pa i de 1999 p oducían cualquie a de los 3 ipos. Con el anscu so de los años des aca el no able aumen o de aislados p oduc o es de CTX-M (aunque ninguna CTX-M-15) a cos a de un descenso de SHV (108). 40 1.8. Dispe sión de los genes bla. Elemen os mó iles Desde el pun o de is a molecula , la diseminación de las BLEE se ha p oducido po un doble mecanismo: a a és de clones epidémicos, como se e á pos e io men e y, po o o lado, a a és de elemen os gené icos mó iles, los cuales se han diseminado en e dis in os clones de una especie e incluso en e dis in as especies bac e ianas. Es os elemen os gené icos mó iles, ales como plásmidos, secuencias de inse ción (IS), ansposones e in eg ones, pueden lle a además genes de esis encia a o os an imic obianos como quinolonas, aminoglucósidos y sul amidas. Las es uc u as gené icas que albe gan los genes bla pueden se muy complejas, con dis in os elemen os mó iles o pa e de ellos in eg ados en o os (in eg ón den o de ansposón y odo ello den o de un plásmido) y, además, pueden e oluciona con el iempo a consecuencia de nue os p ocesos de mo ilización, inse ción, deleción, e c. De odos ellos, cabe des aca a los plásmidos po su papel en la diseminación no clonal de los genes bla. 1.8.1. Plásmidos Los plásmidos son moléculas de ADN ex ac omosómico ci cula o lineal y au o eplicables, cuyo amaño a ía desde una a a ios cien os de kilobases. El núme o de copias plasmídicas p esen es en una célula ambién es a iable, desde una copia has a decenas. Con ienen an o genes esenciales pa a el inicio y con ol de la eplicación como genes de esis encia an imic obiana y i ulencia (138). La unidad gené ica in oluc ada en la eplicación se denomina eplicón, el cual albe ga genes que codi ican las p o eínas implicadas en el inicio de eplicación ( ep), así como o as p o eínas (inc y cop) y elemen os (ARN an isen ido) que lo con olan, y secuencias especí icas de unión de las p o eínas que colabo an en el inicio de la eplicación (139). Los plásmidos pueden se no conjuga i os o conjuga i os, den o de los cuales se incluyen los plásmidos po ado es de los genes bla. Es e ipo de plásmidos pe mi e la diseminación de es e mecanismo de esis encia no sólo en e dis in as cepas de la misma especie sino ambién en e dis in as especies bac e ianas (140,141). In oducción 41 1.8.1.1. Clasi icación de los plásmidos La clasi icación de los plásmidos comienza a se impo an e a inal de los años 50, as el descub imien o de los plásmidos R o de esis encia y el econocimien o de su ex ensión. Se conocen a ios sis emas de clasi icación, de los cuales el p ime o, desa ollado en los años 60, a endía a las ca ac e ís icas elacionadas con la capacidad de ans e encia po conjugación y a la capacidad de inhibi la ans e encia del plásmido F. Pe o la exis encia de plásmidos inclasi icables según dichos c i e ios, dio luga a sis emas pos e io es que clasi ican los plásmidos basándose en una p opiedad uni e sal a odos ellos y de ca ác e es able: “la incompa ibilidad”. Median e es a se de inie on “incompa ibles” aquellos plásmidos con el mismo con ol de eplicación o eplicones, y “compa ibles” si e a di e en e. En 1971, Hedges y Da a p opusie on un sis ema de clasi icación median e la in oducción de un plásmido en una célula po ado a de o o plásmido cuyo g upo de incompa ibilidad e a conocido (plásmido esiden e). Si en la célula hija no pe sis ía el plásmido, ambos e an clasi icados en el mismo g upo de incompa ibilidad. En el caso de que ambos coexis ie an, e an clasi icados en dis in os g upos de incompa ibilidad (142). Pe o la incapacidad de cie os plásmidos pa a ans e i se, o el hecho de que alguno no u ie a ma cado es seleccionables, ue on algunas de las complicaciones de es e sis ema. Además, la exis encia de plásmidos mul i eplicón dio luga a la apa ición de g upos de incompa ibilidad que ealmen e no exis ían. Ya que si al in oduci un plásmido con un eplicón había coincidencia con alguno de los que con enía el mul i eplicón esiden e, no e a eliminado. Pa a e i a es os incon enien es, se desa olla on écnicas molecula es que pa ían del mismo concep o. En 1988 Cou u ie desa olló un esquema de clasi icación basado en el econocimien o de los di e en es eplicones median e hib idación po Sou he n blo (139). U ilizó una colección de diecinue e sondas especí icas que con enían al menos uno de los de e minan es de incompa ibilidad asociados a las unciones de eplicación o pa ición (man enimien o). Dichas sondas de i aban de diecisie e g upos de incompa ibilidad: es de ellas ( epFIA, epFIB, epFIC) p ocedían de es eplicones de plásmidos IncFI y las dieciséis sondas es an es con enían los eplicones FIIA, com9, I1, B/O, k, HI2, L/M, N, P, 42 Q, U, W, X e Y. Debido a la al a de especi icidad po las eacciones c uzadas en e eplicones al amen e elacionados Ca a oli y desa olla on en 2005 un sis ema, que es el que se u iliza en la ac ualidad, basado en la ampli icación de los eplicones median e PCR de los 18 p incipales g upos mayo i a ios de plásmidos en en e obac e ias (HI2, HI1, I1-Iγ, X, L/M, N, FIA, FIB, FIC, W, Y, P, A/C, T, K, B/O, F y FIIAs (10). Cabe menciona que ecien emen e se ha sepa ado el g upo de incompa ibilidad L/M, el cual ue e óneamen e clasi icado según el mé odo an e io men e desc i o (143). Los plásmidos IncF me ecen una especial mención ya que es án elacionados con blaCTX-M-15 y E. coli, como e emos más adelan e. Es án asociados a ac o es de i ulencia y de esis encia en en e obac e ias, lo que con ibuye al i ness de la bac e ia hospedado a (144). También codi ican sis emas de adicción que con ibuyen a la p omoción del plásmido y a la adap ación al hospedado (145). Además, es os plásmidos ienen la peculia idad de posee una es uc u a mosaico y de pode ene más de un eplicón (es ado del mul i eplicón), po lo que no odos los plásmidos ienen el mismo esquele o; hay pa es del mismo que se han podido adqui i o pe de como consecuencia de la usión de los eplicones. De ahí que, en 2010, Villa y cols. elabo a an un esquema pa a sub ipa los basado en la ampli icación y secuenciación de las egiones implicadas en la egulación de los eplicones. En el caso del eplicón FII es el gen copA y en el caso de FIA y FIB, epE y epB, espec i amen e. Exis en di e en es alelos pa a cada una de las egiones: 31 (F1- F30) pa a FII, 3 (A1-A3) pa a FIA y 20 (B1-B19 y B23) pa a FIB. Según el alelo de cada eplicón, se puede iden i ica el plásmido siguiendo la ó mula FAB (FII:FIA:FIB) (146). Respec o a la diseminación de las BLEE es des acable la asociación en e una BLEE de e minada con plásmidos pe enecien es a un g upo conc e o de incompa ibilidad. En Mad id se han desc i o aislados p oduc o es de CTX-M-9, cuyos genes bla se han inculado p incipalmen e con plásmidos de amplio ango, IncHI2, aunque ambién a o os de es echo ango, como los del g upo IncP1 (147)En el caso de los genes blaCTX-M-15 pa ecen es a ligados a plásmidos IncFII, como se ha desc i o en Canadá, F ancia y No e de Á ica (148). Aunque ambién se ha elacionado con plásmidos IncFI (149) y con mul i eplicones FIA-FIB, FIA-FIB-FII y FIB-FII (150). En el caso de SHV-12, se ha encon ado en el á ea de Se illa que los genes bla es aban mayo i a iamen e ehiculizados po plásmidos pe enecien es al g upo de incompa ibilidad IncI1 (151). In oducción 43 1.9. Clon ST131. Descub imien o y ca ac e ís icas gene ales. Has a el año 2008 el aumen o en la diseminación de las BLEE había enido luga po pa e de di e en es aislados de E. coli epidemiológicamen e no elacionados. En es e con ex o epidemiológico, se desc ibe la eme gencia in e con inen al de un clon p oduc o de CTX-M-15, denominado O25:H4-ST131. Es e hecho u o luga as comp oba que de 41 aislados p oceden es de ocho países pe enecien es a es con inen es, 36 se aisla on en 7 países de ellos y p esen aban ca ac e ís icas simila es en cuan o a g upo ilogené ico, pulso ipo, esis encia an imic obiana y i ulencia. Aunque p esen aban pe iles de es icción simila es, los aislados de es e g upo clonal se ag upa on en a ios clus e s elacionados (152). Es a p esencia de aislados clonales a ni el mundial ambién la desc iben en o o abajo Coque y cols., quienes analiza on 43 aislados p oduc o es de CTX-M-15 p oceden es de 7 países (en e ellos España) y co espondien es al pe íodo 2000-2006. También se incluye on 6 plásmidos po ado es de blaCTX-M-15 p oceden es de la India. Se de ec a on cepas del g upo clonal ST131 en odos los países, encon ándose en la mayo ía de las cepas (37 de 43) el gen blaCTX-M-15 ehiculizado po plásmidos del g upo de incompa ibilidad IncFII. Además, la mayo ía de es os plásmidos po aban o os de e minan es de esis encia como blaOXA-1, aac(6´)-Ib-c , y blaTEM-1. Al analiza los pe iles de es icción plasmídica, se encon a on 3 plásmidos mayo i a ios, de los cuales uno es aba p esen e únicamen e en los aislados de ST131 expandidos a ni el mundia (67). 1.9.1. Ca ac e ís icas del clon ST131 Como ya se ha comen ado en el abajo de Chanoine, los aislados de E. coli pe enecien es al clon ST131, inicialmen e de ec ados, p esen aban las mismas ca ac e ís icas. Todos enían la a ian e b de O25, pe enecían al se o ipo O25b:H4, ilog upo B2 y secuencio ipo ST131. Además, compa ían la ca ac e ís ica de se mul i esis en es an o a be alac ámicos po p oducción de BLEE (CTX-M-15), como a o os an imic obianos; y de posee de e minados genes de i ulencia que los incluía como ExPEC, en e los que des acan: iha y imH (codi ica ecep o adhesina-side ó o o y imb ia ipo I, espec i amen e), sa (codi ica oxina), kpsM (codi ica p o eína implicada en sín esis polisacá ido capsula ), yuA e iu A (codi ica side ó o os), usp (codi ica p o eína especí ica 44 u opa ogénica), aT (codi ica p o eína de esis encia al sue o), ompT (codi ica p o easa de memb ana ex e na), y malX (codi ica ma cado de isla de pa ogenia) en un ele ado núme o de cepas. En meno p opo ción se encon aban es genes: hlyF (codi ica hemolisina), iss (codi ica p o eína pa a sob e i i en sue o) e i oN (codi ica side ó o o) (152,153). Es de des aca que los genes implicados en la mul i esis encia es án ehiculizados mayo i a iamen e en plásmidos IncF y que al con a io de lo que sucede con o as cepas pa ógenas, en las que ya se comen ó an e io men e que había una elación in e sa en e esis encia y i ulencia, los aislados de E. coli ST131 esis en es a quinolonas y a ce alospo inas de espec o ex endido p esen an genes de i ulencia con más ecuencia que la población sensible (152). 1.9.2. Tipado de ST131 A pesa de que es amos hablando de un clon, exis e cie a di e sidad de linajes o subg upos den o de es e g upo de mic oo ganismos. Respec o al MLST, el ipo de secuencia ST131 ue o iginalmen e iden i icado usando el esquema de Ach man (h p://mls .wa wick.ac.uk/mls /dbs/Ecoli), el cual es u ilizado po muchos in es igado es pa a iden i ica lo de mane a u ina ia. Según es e esquema, los aislados de E. coli ST131 p esen an secuencias uni o mes de los genes conse ados ( abla 5). También se puede u iliza el esquema de Pas eu (h p://www.pas eu . / eche che/genopole/PF8/mls /EColi.h ml) (Tabla 6), el cual iden i ica di e en es ST a las ob enidas median e el esquema de Ach man. Además, se ha encon ado mayo di e sidad den o del linaje de ST131 siguiendo el esquema ancés que el de Ach man. Tabla 5. Combinación alélica de ST131 según el esquema de Ach man (h p://mls .wa wick.ac.uk/mls /dbs/Ecoli). Gen dinB icdA pabB polB pu B pA pB uidA Alelo 2 65 3 10 26 7 4 57 Tabla 6. Combinación alélica de ST131 según el esquema de Pas eu (h p://www.pas eu . / eche che/genopole/PF8/mls /EColi.h ml). Gen adk umC gy B icd mdh pu A ecA Alelo 53 40 47 13 36 28 29 In oducción 45 Respec o al ipado median e PFGE es de des aca que exis en di e en es linajes den o del clon ST131, lo cual ponen de mani ies o Nicolas-Chanoine y cols. con la p ime a desc ipción de es e clon, cuando de ec a on aislados con pulso ipos simila es en zonas muy dis an es y pulso ipos muy di e gen es en á eas geog á icas elacionadas (152). Es a dis inción ambién la desc iben Johnson y cols. al es udia una colección de aislados de E. coli ST131 ecogidos du an e el pe íodo 1967-2009 y p oceden es de di e en es países. En es a as a colección se iden i ica on linajes en odos los países, mien as que o os se ci cunsc ibían a una de e minada zona (154). 1.9.3. Mé odo de sub ipado. Secuenciación de imH En el caso de ST131, odos los aislados p esen an el gen imH, el cual codi ica la imb ia ipo 1 que de e mina la unión de la manosa de la bac e ia con la célula diana (155). Exis en dos esquemas de ipado: uno basado en el análisis de los 424 pa es de bases (pb) de la secuencia de im (156) y o o en el de egión de ipado ( im-HTR) de 489 pb (157). En base a la secuencia del gen imH se di e encian a ios subclones o linajes, 46 en el caso del p ime esquema y 58 según el segundo. El esquema que ha enido mayo éxi o y al que hacen e e encia en mul i ud de es udios es el de Weissman. Basándose en es e, Johnson y analiza on la colección de e e encia de aislados ST131 (1967-2011) y ob u ie on 7 subclones con dis in os pe iles de esis encia a an ibió icos: H15, H22, H27, H30, H35, H41, H94, siendo los más p e alen es imH30, imH22 y imH41. Du an e el p ime pe íodo (1967-1999) encon a on aislados sensibles a FQ, en e los que p edominaban los subclones H22 y H35. Los aislados esis en es a FQ se de ec a on en el pe íodo 2000-2005 y se asocia on casi exclusi amen e con el subclon H30 (70% de los aislados). La mayo ía de los aislados del subclon H41 ue on sensibles a cip o loxacino y se aisla on en e los años 2006-2011 (158). 1.9.4. Aislados de E. coli ST131 p oduc o es de CTX-M-15 La eme gencia y la p opagación a ni el mundial de CTX-M-15 ha cambiado la epidemiología de E. coli p oduc o de BLEE y las enzimas p e alen es. Como hemos is o an e io men e, la diseminación del clon ST131 p oduc o de CTX-M-15 es uni e sal, aunque no es homogénea y llegan a obse a se g andes di e encias en e á eas y países. Una de las egiones mejo es udiadas es No eamé ica, como se pone de mani ies o en los siguien es es udios. En Canadá, según un es udio de bac e iemias po E. coli, du an e los 46 años 2000-2007, se p odujo un aumen o de los aislados que p oducían BLEE desde un 0,3% en el p ime año has a el 5% al inal del pe íodo. CTX-M-15 se de ec ó po p ime a ez en el año 2002, pe o su ió un acusado aumen o a pa i del año 2005. Pa alelamen e a es e inc emen o se p oducía un aumen o de los aislados de E. coli ST131, de modo que el 24% de los aislados que se de ec a on en el año 2005 ascendió has a un 57% en el año 2007 (159). Cuando se desc ibió es e clon en EE.UU., la ecuencia de aislamien o e a muy baja, pe o ecien emen e se ha obse ado un inc emen o muy impo an e, has a el pun o de que es e g upo ha sido desc i o como el p edominan e en algunas á eas. En Pensil ania el 81% de los aislados de E. coli p oduc o es de BLEE analizados en e 2007 y 2008 p oducía BLEE del g upo CTX-M. Den o de es e g upo odos los aislados p oduc o es de CTX-M-15 (80%) pe enecían al clon ST131 (160). De o ma simila a lo que es aba ocu iendo en los demás países, es e clon se de ec ó como el esponsable pa cial del aumen o de aislados p oduc o es de CTX-M-15 en el nues o. En un es udio en el que se de e minó la p e alencia y el ipo de BLEE p oducido po los aislados de E. coli du an e los años 2006-2008, se ob u o un aumen o en la p e alencia de E. coli BLEE del 3,8% en el año 2006 a un 7,4% en el 2008. Las enzimas más ecuen emen e encon adas ue on: CTX-M-14 (57,1%), CTX-M-15 (21,9%), SHV-12 (9,5%) y CTX-M-32 (6,7%). Todos los aislados p oduc o es de CTX-M-15 se englobaban en el clon ST131 (Blanco e al, 2009). En un es udio mul icén ico nacional ealizado en 2004 las enzimas p e alen es ue on CTX-M-14 (45,7%), CTX-M-9 (20,6%) y SHV-12 (21,7%). Al igual que en el es udio del GEIH-BLEE-2000 de ca ac e ís icas simila es, no se de ec a on aislados p oduc o es de CTX-M-15 (107,161). Como ya comen amos an e io men e, los aislados de es e clon que se desc ibie on po p ime a ez e an p oduc o es de CTX-M-15, lo cual se desc ibe en mul i ud de es udios. Uno de ellos es un es udio mul icén ico ealizado en Canadá el cual analiza una se ie de 209 aislados de E. coli p oduc o es de BLEE y de ec a que el 46% ue on miemb os del clon ST131, de los cuales el 91% e a p oduc o de CTX-M-15 (162). Po o a pa e, Johnson y cols. encon a on la misma asa de aislados ST131 en e aislados p oduc o es de BLEE p oceden es de 15 cen os es adounidenses du an e el pe íodo 2000-2009, si bien la p e alencia de los que p oducían CTX-M-15 e a algo meno (70%) (163). Según los p ime os es udios que se lle an a cabo en Eu opa, es e clon ambién esul a se uno de los más p e alen es en la comunidad, aunque no p oducían CTX-M-15 con an a ecuencia como en Amé ica. Cagnacci y cols. con a on con que el 23% de los In oducción 47 aislados de E. coli analizados du an e el 2003 al 2006, p oceden es de 32 cen os y 8 países, e an ST131. El 8,1% de los aislados de E. coli p oducía BLEE, siendo la más común CTX-M-15 (164). En F ancia, en un es udio ealizado du an e el 2006, se analiza on 72 aislados p oduc o es de BLEE, muchos de los cuales exp esaban enzimas CTX-M; 40 (55,5%) aislados de E. coli e an p oduc o es de CTX-M-15, de los cuales 10 (25%) co espondían al clon ST131 (165). También cabe menciona que exis en zonas donde se han diseminado o as enzimas del g upo CTX-M con mayo ecuencia que CTX-M-15. En el caso de Reino Unido CTX-M-15 es la enzima p e alen e, aunque ambién se ha de ec ado CTX-M-3. Du an e los años 2003-04 se analiza on median e PFGE 291 aislados de E. coli p oduc o es de BLEE p oceden es de 42 cen os del Reino Unido, dis inguiéndose 5 clus e de inidos como cepas A, B, C, D, E, los cuales englobaban desde 13 aislados (cepa B) has a 110 aislados (cepa A) (166). Pos e io men e se es udia on los plásmidos de 3 aislados ep esen a i os de las cepas A, B y C, encon ándose que los plásmidos de la cepas A y B ehiculizaban blaCTX-M- 15 y el de la cepa C blaCTX-M-3 (145). Sin emba go, en o as zonas como Japón, es la menos ecuen e o no llega a de ec a se. En un abajo donde se es udia on 142 aislados de E. coli p oduc o es de BLEE p oceden es de 200 hospi ales du an e el pe íodo 2002-2003, se halló que el 22% de los aislados pe enecía al clon ST131, de los cuales ninguno p oducía CTX-M-15. La enzima más ecuen e ue CTX-M-14 (74%), seguida de CTX-M-35 (15%) y CTX-M-2 (11%) (167). En o o es udio ealizado du an e el pe íodo 2001-2012 con 1079 aislados de E. coli p oduc o es de BLEE p oceden es de 10 hospi ales se ob iene que el 43% co espondía a ST131. De es os, casi la mi ad (49,6%) de los aislados p oducía CTX-M-27, un 33% p oducía CTX-M-14 y un 17% CTX-M-15 (168). Po o o lado, ambién hay que menciona que se han de ec ado aislados que no p oducen BLEE, como queda cons ancia en un abajo canadiense y o o español, en los que sólo el 6% y 7%, espec i amen e, de los aislados clonales p oducían BLEE (153,169). Y ambién es de señala que ecien emen e se han desc i o a ios casos de aislados de es e clon p oduc o es de ca bapenemasas elacionados an o con ing eso hospi ala io como con la a ención comuni a ia. En EEUU se de ec ó un aislado de ST131 p oduc o de NDM en una mues a de un pacien e con in ección u ina ia que había es ado ing esado con an e io idad en un hospi al de la India (170) y en F ancia en una mues a de una pacien e que había es ado i iendo en la India, pe o que nunca había sido hospi alizada Hipó esis y obje i os 55 2.1. Jus i icación del es udio e hipó esis de abajo Los cambios epidemiológicos p oducidos en la úl ima década espec o a E. coli ha conducido a la apa ición de in ecciones de o igen comuni a io causadas po aislados de mul i esis en e. Jun o a es os cambios iene luga la eme gencia de un clon de ec ado simul áneamen e en di e en es zonas geog á icas del mundo, que se ca ac e iza po pe enece al se og upo O25b, ilog upo B2, secuencio ipo ST131 y se esis en e a be alac ámicos po p oducción de CTX-M-15 y a o os an imic obianos, en e los que des aca el cip o loxacino. Es e clon p esen a o as ca ac e ís icas mic obiológicas di e en es a los clones de E. coli mayo i a ios has a el momen o y un mecanismo de diseminación que se desconoce. Pa a pode diseña medidas e icaces de con ol de es a expansión es necesa io conoce la p e alencia del clon que exis e en nues a á ea, así como pode iden i ica sus ías de ansmisión. Las hipó esis de es e es udio son las siguien es: 1. El clon O25b:H4-ST131 de E. coli es p e alen e en nues a á ea. 2. La p e alencia de E. coli ST131 no se debe a la adquisición de BLEE. 3. La adquisición de plásmidos con geens codi ican es de BLEE es especí ica de un subg upo o linaje del clon. 4. La p e alencia del clon de E. coli ST131 en nues o medio se debe a la in oducción muy ecien e de linajes de diseminación in e nacional. 5. Las masco as pueden juga un papel en la ansmisión a humanos. 6. El clon ST131 es á elacionado con la años ecien es. 56 2.2. Obje i os de es e es udio El obje i o gene al de es e es udio se cen a en de e mina la p e alencia del clon ST131 y es udia los posibles mecanismos implicados en su exi osa expansión. Pa a ello, se lle a on a cabo las siguien es líneas de abajo: 1. Es udia de o ma p ospec i a la ecuencia de las in ecciones causadas po el clon de E. coli O25b:H4-ST131 en nues a á ea sani a ia. 2. Compa a la dis ibución de los aislados de E. coli ST131 p oduc o es de BLEE y no p oduc o es de BLEE en nues a á ea, así como los pe iles de esis encia. 3. Ca ac e iza los plásmidos de aislados de E. coli ST131 an o p oduc o es como no p oduc o es de BLEE, en cuan o a g upo de incompa ibilidad, sub ipado de plásmidos IncF, co-de e minan es de esis encia, ac o es de i ulencia y sis emas de adicción. 4. De e mina la posible elación clonal en e aislados de o igen humano y animal de compañía p oceden es de dos zonas geo g á icas, Lisboa y Se illa. 5. Conoce cuál e a la p e alencia de ST131 en años an e io es y de e mina cómo ha e olucionado en nues a á ea sani a ia. 57 3. Ma e ial y mé odos Ma e ial y mé odos 59 3.1. Ma e ial 3.1.1. Aislados clínicos y cepas bac e ianas 3.1.1.1. Aislados clínicos 3.1.1.1.1. Colección de p e alencia Se ecogie on odos los aislados consecu i os de E. coli p oceden es de mues as emi idas a los Hospi ales Uni e si a ios Vi gen del Rocío (HUVR) y Vi gen Maca ena (HUVM) du an e el año 2010. Las mues as p ocedían de cen os de a ención p ima ia, consul as de especialidades y de ambos cen os hospi ala ios, lo cual supone la a ención de ap oximadamen e 1.000.000 de habi an es. Todos los aislados ecupe ados de las mues as del HUVR se en ia on semanalmen e al HUVM pa a su pos e io análisis. Se echaza on aquellos aislados sucesi os p oceden es del mismo pacien e, si el iempo anscu ido en e ellos e a in e io a dos semanas. Se ca ego iza on como “comuni a ias” las mues as p oceden es de a ención p ima ia, consul as de especialidades y las de pacien es con ing eso hospi ala io in e io a 48h, y como “nosocomiales” las que p ocedían de pacien es ing esados du an e más de 48h. 3.1.1.1.2. Colección his ó ica Se incluye on en el es udio los aislados del mes de Ene o que habían sido p e iamen e analizados du an e los años comp endidos en e 2002 y 2009, ambos 60 incluidos. Dichos aislados co esponden a 3 colecciones independien es pe enecien es al HUVM: Colección de Ene o Los aislados de es a colección p oceden de mues as de cualquie o igen, excep o hemocul i os. Se han incluido 206 aislados. Colección Bac e iemias Se han incluido en el es udio 91 aislados. Colección BLEE Los aislados p oduc o es de BLEE p oceden de cualquie ipo de mues a clínica, sal o hemocul i os. Se han incluido 144 aislados. 3.1.1.1.3. Colección de Lisboa Fue on obje o de es udio 59 aislados de Lisboa, los cuales ue on cedidos po la D a. Pomba. Es os aislados p ocedían de dos o ígenes: • Animal: 31 aislados p ocedían de animales (pe os y ga os) con ITU comuni a ia. Las mues as se ecogie on en el Hospi al de Ve e ina ia de Lisboa en e los años 2004 y 2009. • Humano: 28 aislados p ocedían de mues as clínicas de pe sonas que se ecibie on en el hospi al o en el labo a o io de diagnós ico comuni a io, los cuales cub en un á ea de 365.000 habi an es. Las mues as se ecogie on du an e los años 2005-2006. 3.1.1.2. Colección de e e encia de Johnson La colección de e e encia cons a de 579 aislados de E. coli ST131 p oceden es de EEUU (N=446), Canadá (N=53) y o os 11 países in e nacionales (N=80), ecogidos du an e el pe íodo 1967-2009. Las uen es son de o igen humano, animales de compañía, animales des inados a comida y agua, en e o as. Ma e ial y mé odos 61 Los aislados p oceden de colecciones de in es igado es o de cen os de e e encia seleccionados según eno ipo de esis encia, an ígeno somá ico, o igen geog á ico y/o sínd ome clínico de in e és. Los 579 aislados se co esponden con 170 pulso ipos, de los cuales 105 son únicos y 65 múl iples, es deci , un pulso ipo co esponde a un aislado o a más de uno, espec i amen e. Los pulso ipos múl iples suponen el 82% de los aislados, siendo la mi ad de es a población ep esen ada po 12 pulso ipos con 6 o más aislados cada uno. És os eciben el nomb e de pulso ipos de al a p e alencia, en e los cuales, los que p esen an mayo núme o de aislados son el 968, con el 24% de la población, el 800 y el 812. Cabe des aca que exis e una asociación en e los pulso ipos y el pa ón de sensibilidad, siendo la p oducción de BLEE especí ica de los pulso ipos de al a p e alencia, excep o el 968. En el caso de la esis encia a quinolonas, hay elación con odos los pulso ipos múl iples. Respec o al año del aislamien o es impo an e menciona que hay una dis ibución empo al, asociándose los pulso ipos de al a p e alencia con aislados de años más ecien es. El D . Johnson nos cedió 13 aislados de es a colección pa a ealiza el es udio de la elación gené ica de los aislados. 3.1.1.3. Cepas con ol Las ca ac e ís icas de las cepas bac e ianas más des acables u ilizadas en es e abajo se desc iben a con inuación: Esche ichia coli • Cepa con ol en la de ección del se og upo O25b, alelo pabB3 y g upo ilogené ico: E. coli 307. Cedida po la D a. Egea. • Cepas con ol en la p oducción de BLEE: E. coli p oduc o de BLEE del g upo CTX-M-1, cedida po la D a. Egea. E. coli p oduc o de BLEE del g upo CTX-M-9, cedida po el D . He nández. E. coli p oduc o de BLEE del g upo CTX-M-15, cedida po el D . He nández. 62 Salmonella • Cepa con ol pa a la no malización de los pulso ipos, cedida po el D . Jo ge Blanco del LREC (Lugo): S. b aende up H9812. 3.1.1.4. Cepa ecep o a en expe imen os de ans o mación • E. coli DH10B (F-mc A Δ(m -hsdRMS-mc BC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 ecA1 endA1 a aΔ139(a a, leu)7697 galUgalKλ- psL (S R) nupG) (G an ,1990.Gene ics). 3.1.2. Medios de cul i o • Aga McConkey (McC, Oxoid): medio sólido u ilizado pa a selecciona los aislados de E. coli. • Aga McConkey con ce o axima (2 mg/l): medio sólido u ilizado pa a selecciona los aislados de E. coli p oduc o es de BLEE. • Aga Muelle -Hin on (MHA, Di co): medio sólido pa a el es udio de la sensibilidad de los aislados de E. coli. • Aga Muelle -Hin on con ampicilina (100 mg/l). • Caldo Lu ia Be ani (Caldo LB, Di co): medio ico en nu ien es. • Caldo de ip ona y soja (TSB, Di co) en iquecido con un 10% de glice ol (Pan eac): medio líquido pa a la congelación de los mic oo ganismos. • Medio SOC (Di co): medio sólido u ilizado en el p o ocolo de ans o mación. Añadi 10ml de KCl 250 mM y en asa has a 1L. T as au ocla a y, una ez ío, añadi 20 ml de glucosa 1M y 5 ml de MgCl2 2M. 3.1.3. An ibió icos 3.1.3.1. Suplemen os de medios de cul i o • Ampicilina (AMP, Sigma-Ald ich). • Ce o axima (CTX, Sigma-Ald ich). Ma e ial y mé odos 63 • Ce azidima (CAZ, Sigma-Ald ich). La p epa ación de los an imic obianos se ealizó siguiendo las no mas del CLSI. Las soluciones se p epa a on a una concen ación de 4096 μg/ml y se conse a on a -70ºC has a su u ilización. Los sol en es y diluyen es que se usa on en la p epa ación se mues an en la siguien e abla: An imic obiano Sol en e Diluyen e Ampicilina Tampón os a o, pH 8, 0.1M. Tampón os a o, pH 6, 0.1M Ce o axima Agua Agua Ce azidima Ca bona o sódico Agua Tabla 7. Sol en es y diluyen es usados pa a la p epa ación de los an imic obianos. 3.1.3.2. Discos pa a es udios de sensibilidad Be alac ámicos • Ampicilina (Amp, 25 μg, Oxoid). • Amoxicilina/cla ulánico (AMC, 30 μg, Oxoid). • Pipe acilina/ azobac am (PT, 36 μg, Oxoid). • Ce u oxima (CFX, 30 μg, Oxoid). • Ce o axima (CTX, 30 μg, Oxoid). • Ce azidima (CAZ, 30 μg, Oxoid). • Ce o axima/cla ulánico (CTX/CLA, 30/10 μg, Oxoid). • Ce azidima/cla ulánico (CAZ/CLA, 30/10 μg, Oxoid). Aminoglucósidos • Gen amicina (GN, 10 μg, Oxoid).. • Tob amicina (TOB, 10μg, Oxoid). • Amikacina (AK, 30μg, Oxoid). 70 Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia chuA-1 ATGATCATCGCGGCGTGCTG 281 (47) chuA-2 AAACGCGCTCGCGCCTAAT yjaA-1 TGTTCGCGATCTTGAAAGCAAACGT 216 yjaA-2 ACCTGTGACAAACCGCCCTCA spE4.C2-1 GCGGGTGAGACAGAAACGCG 152 spE4.C2-2 TTGTCGTGAGTTGCGAACCCG gadA-1 GATGAAATGGCGTTGGCGCAAG 373 gadA-2 GGCGGAAGTCCCAGACGATATCC Tabla 11. Segundo se de cebado es u ilizados en el es udio de ilog upos (In i ogen). Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia CTX-M-1-F ATGGCGACGGCAACCGTCA 875 (205) CTX-M-1-R CAAACCGTTGGTGACGATTTTA CTX-M-9-F GTGACAAAGAGAGTGCAACGG 856 (205) CTX-M-9-R ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC SHV-1-F GGGTTATTCTTATTTGTC GC 930 (206) SHV-2-R TTAGCGTTGCCAGTGCTC Tabla 12. Cebado es especí icos pa a cada g upo de BLEE (TIB Molbiol). Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia imH-F CACTCAGGGAACCATTCAGGCA 975 (157) imH-R CTTATTGATAAACAAAAGTCAC Tabla 13. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación del gen imH (TIB Molbiol). Ma e ial y mé odos 71 Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia L/M FW GGATGAAAACTATCAGCATCTGAAG 785 (10) L/M RV CTGCAGGGGCGATTCTTTAGG N FW GTCTAACGAGCTTACCGAAG 559 N RV GTTTCAACTCTGCCAAGTTC X FW AACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGAT 376 X RV TGAGAGTCAATTTTTTATCTCATGTTTTAGC I1 FW CGAAAGCCGGACGGCAGAA 139 I1 RV TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT HI1 FW GGAGCGATGGATTACTTCAGTAC 471 HI1 RV TGCCGTTTCACCTCGTGAGTA HI2 FW TTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACAC 644 HI2 RV GGTCACTACCGTTGTCATCCT T FW TTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCAT 750 T RV CGTTGATTACACTTAGCTTTGGAC A/C FW GAGAACCAAAGACAAAGACCTGGA 465 A/C RV ACGACAAACCTGAATTGCCTCCTCCTT B/O FW GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC 159 B/O RV TCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA P FW CTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAA 534 P RV CACGCGCCAGGGCGCAGCC Y FW AATTCAAACAACACTGTGCAGCCTG 765 Y RV GCGAGAATGGACGATTACAAAACTTT W FW CCTAAGAACAACAAAGCCCCCG 242 W RV GGTGCGCGGCATAGAACCGT 72 Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia K FW GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC 160 K RV TCTTTCACGAGCCCGCCAAA F FW TGATCGTTTAAGGAATTTTG 270 F RV GAAGATCAGTCACACCATCC Tabla 14. Cebado es u ilizados pa a la ca ac e ización del g upo de incompa ibilidad median e PCR- Based Replicon Typing (PBRT) (TIB Molbiol). Cebado es Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia FII FW CTGATCGTTTAAGGAATTTT 258-262 (10) FII RV CACACCATCCTGCACTTA FIA FW CCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTG 462 FIA RV GTATATCCTTACTGGCTTCCGCAG FIB FW TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC 683 FIB RV CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT *FIBs FW TGCTTTTATTCTTAAACTATCCAC 683 FIC FW GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG 262 FIC RV TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT Tabla 15. Cebado es u ilizados pa a el sub ipado de plásmidos pe enecien es al g upo de incompa ibilidad IncF. *Usado en pa eja con FIB RV (TIB Molbiol). Ma e ial y mé odos 73 Cebado es Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia epI1 FW CGAAAGCCGGACGGCAGAA 142 (206) epI1 RV TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT a dA FW ATGTCTGTTGTTGCACCTGC 501 a dA RV TCACCGACGGAACACATGACC bA FW CGACAAATGCTTCCGGGGT 507 bA RW TCTTACAATCGACAGCCTGT sogS FW TTCCGGGGCGTAGACAATACT 291 sogS RV AACAGTGATATGCCGTCGC pilL FW CCATATGACCATCCAGTGCG 316 pilL RV AACCACTATCTCGCCAGCAG Tabla 16. Cebado es u ilizados pa a el sub ipado de plásmidos pe enecien es al g upo de incompa ibilidad IncI1(TIB Molbiol). Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia Aac6´-Ib-c -F ATGACTGAGCATGACCTT 528 (207) Aac6´-Ib-c -R GAAGGGTTAGGCATCACT Aac3´-IIa-F TGCCTCACTTAAAGCGATTG 500 (208) Aac3´-IIa-R CAAGCATCGGCATCTCATAC TEM-F ATGAGTATTCAACATTTCCG 867 (206) TEM-R CTGACAGTTACCAATGCTTA OXA-F CAGCAGCGCCAGTGCATC 694 (208) OXA-R TCCTGTAAGTGCGGACAC Tabla 17. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación de co-de e minan es de esis encia (TIB Molbiol). 74 Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia Iu A-F GGCTGGACATCATGGGAACTGG 300 (50) Iu A-R CGTCGGGAACGGGTAGAATCG HlyA-F AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT 1177 HlyA-R ACAATATAAGCGGTCATTCCCGTCA Iss-F CAGCAACCCGAACCACTTGATG 323 (209) Iss-R TTCTGCCGCTCTGGCAATGCT I on-F AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG 665 (210) I on-R GACGCCGACATTAAGACGCAG Tabla 18. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación de genes de i ulencia (TIB Molbiol). Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia PemK-up AACGAGAATGGCTGGATGC 232 (211) PemK-low CCAACGACACCGCAAAGC CcdA-up AGGAAGGGATGGCTGAGGT 230 CcdB-low GGTAAAGTTCACGGGAGAC Pa D-up ACGGACCAGCAGCACCAG 534 Pa E-low AGCCCTTGAGCCTGTCGG VagC-up GGGACCTGGATTTTGATGG 210 VagD-low GAGCAGATGTTGGTGTCG Hok-up AGATAGCCCCGTAGTAAGTT 203 Sok-low GATTTTCGTGTCAGATAAGTG PndC-up TCAATCAACCAGGGCTCT 140 PndA-low CCTCACCATCCAGACAAAA Ma e ial y mé odos 75 Cebado Secuencia (5´-3´) Tm espe ado (pb) Re e encia S nB-up ACTGATTGTAGCCTCTTCTTT 171 S nC-low CACCACTGTATTTCCCCTGT (211) RelE-up AAAAACCCGATGGCGACAG 370 RelE-low TGATAGACCAGGCGAAAAC Tabla 19. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación de sis emas de adicción (TIB Molbiol). 3.1.7. Equipos • Cabina desegu idad BIO-II-A (Tels a ). • Cáma a de o os digi al Kodak DC290 (Eas man Kodak). • Cube as de elec o o esis Sub-Cell GT (Bio-Rad). • Equipo de elec o o esis en campo pulsan e CHEF- Mappe (Con ou -clamped Homogeneus Elec ic Field) (Bio-Rad). • Equipo de documen ación de imágenes Gel Doc XR (Bio-Rad). • Fuen e de alimen ación modelo 1000-500 (Bio-Rad, He cules, Canadá). • Ki de pu i icación de ADN (Qiagen). • Mic ocen í uga Bio uge F esco (He aeus). • Secuenciado ABI PRISM 377 (Applied Biosys ems). • Te mociclado Gene Cycle (Bio-Rad). • Sis ema semiau oma izado de iden i icación y an ibiog ama Wide ® (F ancisco So ia Melguizo) y Mic oscan WalkAway® (Siemens). • Hyb igene (Techne). • UVC500 C osslinke (Hoe e Pha maciaBio ech). 76 • Mic o Pulse TM elec opo a o (Bio-Rad). 3.1.8. So wa e • Bio-Rad Canada Quan i yOne® So wa e. • Finge p in ing II SW so wa e (Bio ad). • Sis ema de análisis digi ales Kodak 1D EDAS290 (Eas man Kodak). • So wa e de análisis de secuencias: - Ch omas (h p://www. echnelysium.com.au/ch omas.h ml). - BLAST (h p://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi). - T anseq (h p://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ anseq/index.h ml). - Clus alW2 (h p://www.ebi.ac.uk/Tools/clus alw2/index.h ml). • SPSS so wa e ( e sion 17.0). 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Aislamien o e iden i icación de aislados Los aislados se ob u ie on as el p ocesamien o de las mues as según los p o ocolos es ablecidos. 3.2.1.1. Colección p e alencia La iden i icación de los aislados se ealizó median e paneles come ciales según las condiciones del ab ican e. En el HUVM se lle ó a cabo con el sis ema come cial Wide ® (F ancisco So ia Melguizo) y en el HUVR con el equipo de Mic oScan WalkAway® (Siemens). Ma e ial y mé odos 77 3.2.1.2. Colección his ó ica La iden i icación de los aislados se hizo median e paneles come ciales Vi ek® (Biomé ieux) en el pe íodo 2001-2004 y Wide ® (Fa ncisco So ia Melguizo) en el pe íodo 2005-2009. 3.2.2. De ección de ma cado es molecula es median e PCR (Polyme ase Chain Reac ion) Median e la écnica de la PCR se ob iene la ampli icación (ap oximadamen e 106 copias) de un agmen o de ADN. Pa a su pos e io es udio se isualiza on los p oduc os en geles de aga osa y se secuencia on, si p ocedía. En condiciones gene ales, la mezcla de los eac i os se hizo según se indica: Reac i o Volumen/ eacción Cebado es 2,5 µl/cebado MgCl2 2 µl dNTPs 4 µl Tampón Taq10X 5 µl Taq polime asa (In i ogen®) 0,2 µl H2O ul apu a g ado MilliQ es é il c.s.p. 48 µl Tabla 20. Volúmenes y Concen ación inal de cada eac i o. El olumen inal es de 48 µl, al cual se le adicionan 2 µl de la solución que con iene el ADN. Es e puede ob ene se a pa i de pu i icaciones o de colonias escas c ecidas en placa. Las eacciones de PCR se lle a on a cabo en e mociclado esThe malcycle 2720 (AppliedBiosys ems), siguiendo el p og ama gene al que se mues a a con inuación: 78 Tempe a u a P oceso Tiempo Nº ciclos 94 ºC Desna u alización 5 min 1 95 ºC Desna u alización 30 s 30 Según cebado es Hib idación 30 s 72 ºC Ex ensión 7 s 7 ºC Ex ensión inal 5 min 1 Tabla 21. Condiciones gene ales de PCR. 3.2.3. De ección de ST131. Colección de p e alencia e his ó ica Se han desc i o mé odos ápidos y especí icos pa a la de ección de E. coli ST131, en e los que se incluyen la ep-PCR (212), el análisis SNP de mdh y gy B jun o con O25b b (153) y la PCR del alelo 3 del gen pabB (35), siendo es a úl ima la que hemos elegido en nues o es udio. Pa a de ec a aislados pe enecien es al secuencio ipo ST131 noso os u ilizamos la siguien e combinación: 3.2.3.1. De ección del se og upo O25b Las cepas de E. coli se pueden clasi ica en base a los an ígenos “O” (an ígeno somá ico), “K” (an ígeno capsula ) y “H” (an ígeno lagela ), lo cual da luga a los dis in os se og upos y se o ipos. La sín esis del an ígeno somá ico “O” es á egulada po un g upo de genes denominado b, siendo la a iabilidad de su ex emo 5´ la que di e encia los dis in os se og upos. Tan o los aislados de la colección de p e alencia, los cuales se ecogían semanalmen e, como los de la colección his ó ica, se some ie on a c ibado median e PCR de O25b con cebado es especí icos pa a el an ígeno “O” a ian e b ( abla 8), según lo desc i o po Cle mon (204). Ma e ial y mé odos 79 3.2.3.2. De ección del alelo 3 del gen pabB La de ección del alelo 3 del gen pabB, especí ico de los aislados del clon ST131, se ealizó en odos aquellos aislados en los que de ec amos la a ian e b del se og upo O25. Se lle ó a cabo median e PCR con los cebado es que se indican en la abla 9. 3.2.3.3. Análisis de ilog upo El análisis de ilog upo se ealizó median e PCR con cebado es especí icos (Tabla 10) pa a los genes chuA, yjaA y el agmen o de ADN TspE4.C2. La in e p e ación de los esul ados se lle ó a cabo según lo desc i o po B ange ( abla 22) (213); los aislados del secuencio ipo ST131 pe enecen al ilog upo B2 subg upo B23, es deci , p esen an los 3 genes ma cado es. Debido a di e encias en e los esul ados del se og upo, ilog upo y pe il gené ico de algunos aislados, se epi ió la PCR de ilog upo, comen ada an e io men e en la in oducción, con o o se de cebado es (Tabla 11), en e los que se incluyen los de un con ol in e no. chuA yjaA TspE4.C2 Filog upo - - - A0 - + - A1 + + - B22 + + + B23 + - - D1 + - + D2 Tabla 22. In e p e ación del ilog upo según B ange (B ange , EID 2005). Los aislados con esul ado posi i o en la de ección de O25b, pabB3, chuA, yjaA y TspE4.C2 se conside a on como pe enecien es al secuencio ipo ST131. 86 secuenciación, que o o ga un ST o secuencio ipo. Los esul ados se analiza on en la página web: h p://pubmls .o g/plasmid/p ime s/incI1.sh ml. 3.2.9.3. Co-de e minan es de esis encia Los genes gene almen e asociados a la egión Mul i-D ug-Resis an o MDR, la cual ehiculiza blaCTX-M-15, son blaOXA-1, blaTEM-1, aac(6´)-Ib-c y aac(3)-II (148). Po lo que se de e minó median e ampli icación po PCR con cebado es especí icos la p esencia de es os de e minan es (Tabla 17). 3.2.9.4. Fac o es de i ulencia La secuenciación comple a de uno de los plásmidos de un aislado de E. coli ST131 e eló la p esencia de los siguien es genes de i ulencia: iu A, hlyA, i on e iss (Zhong, 2012). De ahí que ue an los que quisimos de ec a en nues a selección de aislados. Pa a ello, se ealizó una ampli icación po PCR con cebado es especí icos (Tabla 18). 3.2.9.5. Sis emas de adicción Se han desc i o a ios sis emas de adicción en plásmidos que ehiculizan blaCTX-M-15 y cuyo papel es con ibui a la diseminación del plásmido y a la adap ación al hospedado (145,148). Se es udió median e PCR con cebado es especí icos ( abla 19) la p esencia de los genes que codi ican los sis emas oxina/an i oxina: PemK-PemI “plasmid eme gency main enance”, CcdA–CcdB “coupled cell di ision locus”, RelB–RelE “ elaxed con ol o s able RNA syn hesis”, Pa D–Pa E “pa i oning sys em”, VagC–VagD “ i ulence-associa ed p o ein”; y los que es án egulados po ARN an isen ido: Hok–Sok “hos -killing, PndA–PndC (p omo ion o nucleic acid deg ada ion) y S nB–S nC “s able RNA”. 3.2.9.6. Res icción de ADN plasmídico • Diges ión de plásmidos con EcoRI. Se añadió a 10 μg de ADN ob enido median e el mé odo Takahashi 4 μl de EcoRI, 3 μl de Bu e y 13 μl de agua. Se incubó du an e 1 h en un baño a 37ºC. Ma e ial y mé odos 87 • Se co ió en un gel al 0,8% y se u ilizó como ma cado de peso molecula E. coli 50192. 3.2.10. Mé odos in o má icos El análisis de los pulso ipos se lle ó a cabo con el Finge p in ing II SW so wa e (Bio ad, He cules, CA, USA). El sis ema de análisis digi ales Kodak 1D EDAS290 (Eas man Kodak) se u ilizó pa a el es udio de las o og a ías de los geles. Pa a el análisis compa a i o de secuencias se u iliza on los siguien es so wa es: 1. Ch omas (h p://www. echnelysium.com.au/ch omas.h ml) 2. BLAST (Al schul SF., Gish W. y cols., 1990) (h p://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi) 3. T anseq (h p://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ anseq/index.h ml) 3.2.11. Mé odos es adís icos Los análisis es adís icos se ealiza on con el SPSS so wa e ( e sion 17.0; SPSS, Chicago, Illinois, Uni ed S a es). La compa ación de p opo ciones de da os no apa eados se ealiza on median e el es de la Chi cuad ado (o Fishe si p ocede), y las con inuas median e el es de la U de Mann-Whi ney, según p ocedió. 88 89 4. Resul ados Resul ados 91 4.1. Análisis de la p e alencia del clon ST131 en el á ea de Se illa Du an e el año 2010 se ecogie on 1.617 (38%) aislados de E. coli en el HUVM y 2.691 (62%) aislados p oceden es del HUVR, lo cual supone un o al de 4.308 aislados de E. coli. En la igu a se puede obse a que de és os, 3.499 (81%) aislados p ocedían de mues as de o igen comuni a io, 692 (16%) nosocomial, y de 117 (3%) se desconocía la p ocedencia (Figu a 3). Figu a 3. Rep esen ación del nº de aislados según el se icio pe iciona io. La mayo ía de los aislados p ocedía de u ocul i os (88,9%), seguida de exudados de he idas y abscesos (6%), hemocul i os (3,9%), mues as de o igen espi a o io (1%) y de o a p ocedencia (0,2%), como se puede obse a en la siguien e igu a (Figu a 4). 92 Figu a 4. Dis ibución de las mues as. Se ca ac e iza on 541 (12,5%) aislados como O25b/pabB3/B23, po lo que podíamos deci que pe enecían al clon ST131. De es os, 38 (7%) e an aislados p oduc o es de BLEE, mien as que 503 (93%) no lo e an. En la igu a 5 se puede obse a que 436 (80,6%) aislados ST131 e an de o igen comuni a io, siendo 31 (7,1%) p oduc o es de BLEE; 93 (17,2%) p ocedían del ambien e hospi ala io, de los cuales 6 (6,4%) p oducían BLEE, y 12 (2,2%) enían o igen desconocido. 0 100 200 300 400 500 Comuni a io Nosocomial Desconocido O igen Nº de aislados ST131 ST131 BLEE Figu a 5. Dis ibución de aislados ST131 y ST131 p oduc o es de BLEE en unción del o igen. Respec o al ipo de mues as, 468 (86,6%) e an de o igen u ina io, 32 (6%) p ocedían de mues as de exudados de he idas y abscesos, 13 (2,4%) de hemocul i os, 13 (2,4%) de mues as espi a o ias y 14 (2,6%) de di e sas uen es. En la igu a 6 podemos e cómo quedan ep esen ados los aislados ST131 espec o a los no Resul ados 93 ST131, según cada ipo de mues a. Podemos des aca que 467 (12,3%) u ocul i os enían un aislamien o de E. coli ST131. 0 1000 2000 3000 4000 5000 Nº de aislados U oc. EH y A. Hemoc Resp. Tipo de mues a ST131 No ST131 Figu a 6. Dis ibución de aislados ST131 y no ST131 según cada ipo de mues a. U oc: U ocul i os; EH y A; Exudados de he idas y abscesos; Hemos: hemocul i os; Resp: mues as espi a o ias. De los 295 aislados de E. coli p oduc o es de BLEE, 38 (13%) e an ST131. Respec o a la ilogenia de odos los aislados p oduc o es de BLEE, se puede e en la igu a 7 que pe enecían p incipalmen e a los subg upos B23 (33,5%) y B1 (24,3%), lo cual co espondía al 57,8% del o al. Los aislados de los ilog upos A1, D1, D2, A0 y B22 suponían el 18,9%, 8,6%, 7,1%, 6,5% y 0,01%, espec i amen e. El 57,5% de los aislados de E. coli p oduc o es de BLEE del ilog upo B23 e an ST131. Si se iene en cuen a el análisis po g upos en luga de subg upos, el más ecuen e ue B2 (33,5%), seguido de A (25,4%), B1 (24,3%) y D (15,7%). 94 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ao A1 B1 B22 B23 D1 D2 Filog upo % de aislados ST131 no ST131 Figu a 7. Dis ibución de ilog upos en aislados de E. coli p oduc o es de BLEE. Al ealiza la ca ac e ización de 161 enzimas BLEE, se ob u ie on po cen ajes muy simila es en e los g upo CTX-M-1 (38,5%), CTX-M-9 (31,7%) y SHV (29,8%). En la igu a 8 puede ap ecia se que las enzimas p edominan es ue on CTX-M-15 (31,1%), CTX-M-14 (27,3%) y SHV-12 (28,6%), espec i amen e, lo que suponía el 87%. No obs an e, ambién se de ec a on en meno cuan ía o as enzimas, como puede obse a se en la abla 24. Un o al de 35 aislados (92,1%) ST131 e an p oduc o es de CTX-M-15; dos aislados e an p oduc o es de CTX-M-32 (5,3%) y uno (2,6%) de CTX-M-14. Figu a 8. Dis ibución de los aislados en unción del ipo de BLEE. Resul ados 95 Tipo de BLEE Nº de aislados % G upo CTX-M-1 62 38,5 CTX-M-15 50 31,1 CTX-M-1 7 4,3 CTX-M-32 5 3,1 G upo CTX-M-9 51 31,7 CTX-M-14 44 27,3 CTX-M-9 5 3,1 CTX-M-27 2 1,2 G upo SHV 48 29,8 SHV-12 46 28,6 SHV-28 1 0,6 SHV-2 1 0,6 Tabla 24. F ecuencia de las los aislados p oduc o es de BLEE po g upo. En la igu a 9 se puede e la dis ibución de los ilog upos según cada g upo de BLEE. En el caso del g upo CTX-M-1, se obse a que los aislados p oduc o es de CTX-M- 15 (50 aislados) pe enecen de o ma p edominan e al ilog upo B2, de los cuales el 70% (35 aislados) e a ST131. Tan o en el g upo de CTX-M-9 como de SHV, las enzimas más ecuen es son CTX-M-14 y SHV-12, espec i amen e. Aunque es as se encuen an en odos los ilog upos, pe enecen p incipalmen e a los ilog upos A1 y B1. Todas las enzimas pe enecien es al ilog upo B2, a su ez, es aban clasi icadas en el subg upo B23, excep o una SHV-2 que pe enecía al subg upo B22. 102 4.1.3. Sub ipado ( imH) Los aislados ue on seleccionados en e los 23 pulso ipos di e en es, conside ando que, aquellos aislados con menos de 3 bandas de di e encia, pe enecían al mismo pulso ipo. De los aislados ST131 se eligie on 8 aislados con pulso ipo único y 15 aislados con pulso ipo múl iple. En el caso de los aislados ST131 p oduc o es de BLEE, los elegidos ue on odos con pulso ipo múl iple y p oduc o es en su mayo ía (13/14) de CTX-M-15. El aislado es an e e a p oduc o de CTX-M-32. En la abla 28 se de alla el núme o de aislados que se eligie on po cada ipo de pulso ipo. Pulso ipo ST131 no BLEE (n=23) ST131 BLEE (n=14) Único 8 0 Múl iple 2-5 aislados 11 9 Múl iple >5 aislados 4 5 Tabla 28. Dis ibución de los aislados seleccionados ST131 no p oduc o es y p oduc o es de BLEE según el pulso ipo. T as ealiza el análisis de imH a los 37 aislados, ob u imos 7 alelos: imH30, imH22, imH27, imH38, imH54, imH202 y imH298. En los aislados p oduc o es de BLEE se iden i ica on 3 de ellos ( imH30, imH22, imH54), mien as que en los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE hubo mayo di e sidad alélica, al y como se puede e en la igu a 11. Los dos linajes más ecuen es an o en los aislados ST131 p oduc o es como no p oduc o es de BLEE ue on H30 y H22. Se halla on di e encias signi ica i as al compa a los linajes, de modo que H30 e a signi ica i amen e más ecuen e en e los aislados ST131 p oduc o es de BLEE que los no p oduc o es (85,8% s. 26,1%; p=0,0015); mien as que el linaje H22 e a más ecuen e en e los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE espec o a los que sí p oducían BLEE, aunque la di e encia no ue signi ica i a (30,4% s. 7,1%; p=0,20), Resul ados 103 Figu a 11. Dis ibución de los alelos de imH en aislados ST131 no p oduc o es de BLEE y ST131 p oduc o es de BLEE. En la abla 29 se puede obse a que odos los aislados de los linajes H38, H202, H298 y la mayo ía (94,5%) de H30 e an esis en es a FQ. En los linajes H22, H27 y H54 el 50% de los aislados e a sensible y el o o 50% esis en e a FQ. Alelo de imH To al de aislados (%) Resis en es a FQ Sensibles a FQ FimH30 17 (94,5) 1 (5,5) FimH22 4 (50) 4 (50) FimH27 2 (50) 2 (50) FimH38 1 (100) 0 FimH54 1 (50) 1 (50) Fim202 1 (100) 0 Fim298 1 (100) 0 Null 0 2 (100) Tabla 29. Dis ibución de la esis encia a FQ según el alelo de imH en odos los aislados de ST131. 104 En las igu as 12 y 13 quedan ep esen adas las dis ibuciones de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE y de los aislados ST131 p oduc o es de BLEE, espec i amen e. En el p ime caso, se obse a que odos los aislados de los linajes H30, H38, H202 y H298 e an esis en es a FQ, si bien el 43%, 50% y 100% de los aislados pe enecien es a los linajes de H22, H27 y H54, espec i amen e, e an sensibles. En el caso de los aislados ST131 p oduc o es de BLEE, odos los aislados de los linajes H30 y H54 e an esis en es a FQ y el único aislado del subclon imH22 e a sensible. Figu a 12. Dis ibución de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE en unción de los linajes de imH. Figu a 13. Dis ibución de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 p oduc o es de BLEE en unción de los linajes de imH. Resul ados 105 4.2. Animales de compañía 4.2.1. Es udio de la elación clonal de aislados po ugueses y españoles En la siguien e abla quedan ecogidos los pulso ipos según el núme o de aislados po pulso ipo y el núme o de aislados que p esen a cada uno de ellos según su mues a de o igen. Se pueden con abiliza 72 pulso ipos únicos, de los cuales 46 p ocedían de aislados de pe sonas y 21 de animales. Po o o lado, hallamos 21 pulso ipos múl iples, de los cuales 19 enían 2-5 aislados y 2 incluían más de 5. Excep o 5 aislados que e an de animales, odos p ocedían de pe sonas. Pulso ipo Nº de pulso ipos (N=93) Nº de aislados (N=146) Pe sonas (N=115) Animales (N=31) Único 72 72 46 26 Múl iple 2-5 aislados 19 54 49 5 Múl iple con >5 aislados 2 20 20 0 Tabla 30. Dis ibución de los aislados según pulso ipo y mues a de o igen. Como se puede e en la igu a 14, hubo más dispe sión de los pulso ipos de los aislados p oceden es de masco as (el 84% de los pulso ipos de aislados de o igen animal e an únicos), si bien en el caso de los pulso ipos de aislados de o igen humano se obse ó mayo clonalidad (el 60% de los pulso ipos de aislados de o igen humano e an múl iples). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Pulso ipos múl iples Pulso ipos únicos % de aislados Indi iduos Masco as Figu a 4. F ecuencia de aislados según el pulso ipo y o igen de la mues a. Es udiamos la elación gené ica de los aislados de ambas zonas jun o con 13 de la colección de e e encia de Johnson. En la igu a 15 pueden dis ingui se 6 clus e s cuyos 106 pulso ipos ienen un índice de simili ud del 94%. Se obse a on las siguien es elaciones en e los aislados: • 3 clus e s incluían pulso ipos de aislados (5,5%) p oceden es de ambas zonas geog á icas, odos de o igen humano, según indican la líneas ojas. • 2 clus e s englobaban 8 pulso ipos de aislados de indi iduos y de e e encia: dos aislados de España enían un pulso ipo que coincidía con el in e nacional 800 y o o aislado con el 903 (líneas mo adas); los pulso ipos de 3 aislados de Po ugal y o o de España lo hacían con el pulso ipo 968 (línea azul). • Sólo hubo un clus e con un pulso ipo de aislado de o igen humano y o o animal (1,3%), ambos po ugueses. Es á señalado po la línea e de. Figu a 15. Dendog ama ob enido median e PFGE con XbaI de aislados ST131 de mues as clínicas de o igen humano y de masco as, p oceden es de España y Po ugal, y de aislados de la colección de e e encia de Johnson 1774 1593 5825 1058 192 968 642 978 939 1302 800 2496 853 704 903 858 Nº de aislado Puls. e e encia Po ugal España Indi iduo Masco a Resul ados 107 4.2.2. Sensibilidad a an imic obianos 4.2.2.1. Compa ación de aislados humanos po ugueses y españoles con los aislados de animales de compañía. Cuando se compa a on los pa ones de esis encia a los an imic obianos de los aislados de indi iduos de ambas egiones con los de masco as ( igu a 16), se obse ó que los aislados de indi iduos e an más esis en es de o ma muy signi ica i a (p<0,001) a cip o loxacino, ob amicina y ime op im-sul ame oxazol que los de masco as; mien as que en el caso del ácido nalidíxico ue on di e encias signi ica i as. También es de des aca que la ecuencia de aislados ST131 p oduc o es de BLEE ue mayo en e los aislados de pe sonas (n=57, 49%) que en e los de masco as (n=3, 10%; p <0,001). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS An imic obiano % de aislados esis en es Indi iduos Masco as Figu a 16. Dis ibución de aislados ST131 esis en es a los dis in os an imic obianos en unción del o igen de la mues a. AMC: amoxicilina- cla ulánico, PT: pipe acilina- azobac am; GEN: gen amicina; TOB: ob amicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: cip o loxacino; TMX: ime op im- sul ame oxazol; FOS: os omicina. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias muy signi ica i as. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias signi ica i as. 108 4.2.2.2. Compa ación de aislados de indi iduos con los aislados de animales de compañía, ambos po ugueses. Al compa a los pe iles de esis encia de los aislados de indi iduos con los de masco as pe enecien es a Lisboa ( igu a 17), se obse ó que los aislados de indi iduos ue on más esis en es de o ma muy signi ica i a (p<0,001) a cip o loxacino, gen amicina, ob amicina y ime op im-sul ame oxazol y de mane a signi ica i a a amoxicilina- cla ulánico (p=0,002), ácido nalidíxico (p=0,009) y os omicina (p=0,006). También es de des aca que la ecuencia de aislados de es e clon p oduc o es de BLEE e a mayo en aislados de indi iduos (n=20, 71 %) que de masco as (n=3, 10%; p <0,001). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS An imic obiano % de aislados esis en es Indi iduos Masco as Figu a 17. Dis ibución de aislados ST131 esis en es a los dis in os an imic obianos en unción del o igen de la mues a pe enecien es a una misma egión. AMC: amoxicilina-cla ulánico, PT: pipe acilina- azobac am; GEN: gen amicina; TOB: ob amicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: cip o loxacino; TMX: ime op im-sul ame oxazol; FOS: os omicina. An imic obianos pa a los que se halla on di e encias muy signi ica i as. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias signi ica i as. Resul ados 109 4.2.2.3. Compa ación de aislados de indi iduos españoles y po ugueses Teniendo en cuen a los aislados de indi iduos an o de Se illa como de Lisboa, se halla on di e encias muy signi ica i as pa a la gen amicina (p<0,001), ob amicina (p<0,001), ime op im-sul ame oxazol (p<0,001) y os omicina (p<0,001), y signi ica i as pa a el amoxicilina-cla ulánico (p=0,004), ob eniéndose mayo po cen aje de esis encia en el caso de los aislados de pe sonas de Po ugal. También se de ec a on con más ecuencia aislados p oduc o es de BLEE p oceden es de Lisboa (71%) espec o a los del á ea de Se illa (42%) (p=0,009) ( igu a 18). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS An imic obiano % de aislados esis en es España Po ugal Figu a 18. Dis ibución de aislados ST131 esis en es de mues as de o igen humano a los dis in os an imic obianos pe enecien es a dis in as egiones. AMC: amoxicilina-cla ulánico, PT: pipe acilina- azobac am; GEN: gen amicina; TOB: ob amicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: cip o loxacino; TMX: ime op im-sul ame oxazol; FOS: os omicina. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias muy signi ica i as. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias signi ica i as. 4.2.3. Ca ac e ización de plásmidos En o al se ca ac e iza on los plásmidos de los 37 aislados seleccionados. Pa a la ca ac e ización del los plásmidos de aislados ST131 p oduc o es de BLEE, se abajó con 110 ans o man es, los cuales se consiguie on en 13 de los 14 aislados. En el caso de los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE no se consiguie on ans o man es, po lo que la ex acción plasmídica y los es udios consecu i os de ca ac e ización se hicie on di ec amen e del aislado clínico. Se p ocedió de igual mane a con el aislado BLEE que no se pudo ans o ma . Como puede obse a se en la igu a 19, se halla on 23 aislados (62,2%) con un solo plásmido, de los cuales 13 (56,5%) e an ST131 no p oduc o es de BLEE y 10 (43,5%) ST131 p oduc o es de BLEE (CTX-M-15). En 13 (35,1%) de los aislados se de ec a on 2 plásmidos, siendo 9 (69,2%) aislados no p oduc o es de BLEE y 4 (30,8%) p oduc o es de BLEE (3 CTX-M-15, 1 CTX-M-32). Hubo un aislado no p oduc o de BLEE (2,7%) en el que se de ec a on 3 plásmidos. 0 5 10 15 20 25 1plásmido 2 plásmidos 3 plásmidos Nº de aislados ST131 BLEE ST131no BLEE Figu a 19. Dis ibución del núme o de plásmidos en cada aislado. 4.2.3.1. Tipado de plásmidos. G upos de incompa ibilidad y eplicones En la abla 31 se obse a que odos los aislados ST131 p oduc o es de BLEE (14; 100%) y la mayo ía de los aislados no p oduc o es de BLEE (22; 96%) con enían al menos un plásmido del g upo de incompa ibilidad IncF. El aislado es an e (4%) enía un plásmido pe enecien e al g upo IncI. En odos los plásmidos se de ec a on más de un eplicón F, siendo las combinaciones más ecuen es FII+FIA y FII+FIB con un 43,2% (n=16) cada uno. Al analiza los esul ados en unción de la p oducción de BLEE, se ob u o que en los aislados p oduc o es de BLEE los plásmidos p esen an con mucha más ecuencia los eplicones FII+FIA que en los no p oduc o es de BLEE (78,5% s. 17,4%; p= 0,003). En Resul ados 111 cambio, en los plásmidos de aislados no p oduc o es de BLEE la combinación FII+FIB ue más ecuen e que en los p oduc o es de BLEE (60,8% s.14,3%; p = 0,01). Nº de aislados (%) G upo(s) Inc ST131 no BLEE (n=23)(%) ST131 BLEE (n=14) (%) To al (%) Replicon(es) Inc F FII+FIA 4 (17) 10 (71) 14 (38,8) Inc F FII+FIB 11 (48) 1 (7) 12 (33,3) Inc F FII+FIA+FIB 3 (13) 1 (7) 3 (8,3) Inc F, IncY FII+FIA+Y 0 1 (7) 1 (2,8) Inc F, IncN FII+FIB+N 0 1 (7) 1 (2,8) Inc F, IncI1 FII+FIB+I1 2 (8) 0 2 (5,6) Inc F, IncI1 FII+I1 1 (4) 0 1 (2,8) Inc F, IncP, IncK FII+FIB+P+K 1 (4) 0 1 (2,8) Inc I1 I1 1 (4) 0 1 (2,8) To al IncF 22 (96) 14 (100) 35 (97,2) To al FII+FIA 4 (17,4) 11 (78,5) 16 (43,2) To al FII+FIB 14 (60,8) 2 (14,3) 16 (43,2) Tabla 31.Dis ibución de los g upos de incompa ibilidad plasmídica y eplicones de plásmidos de aislados ST131 no p oduc o es de BLEE y ST131 p oduc o es de BLEE. 4.2.3.1.1. Sub ipado de plásmidos IncF. Esquema FAB. En la igu a 20 se puede obse a que la ó mula FAB más ecuen e en los plásmidos IncF de aislados ST131 p oduc o es de BLEE ue F2:A1:B- (57%), seguido de F4:A1:B- (14,2%). En la misma p opo ción (7,1%) se encon a on F2:A-:B1; F11:A1:B-; F29:A-:B1 y F31:A-:B1. Sin emba go, en los aislados ST131 no p oduc o es de BLEE se de ec ó mayo a iabilidad en cuan o al sub ipado plasmídico: 23 aislados p esen a on 12 sub ipos de plásmido di e en es. De és os, los más ecuen es ue on F2:A-:B1 (17,4%) y 118 4.2.3.5. Relación gené ica T as ealiza la diges ión con EcoRI de los plásmidos de 7 aislados ST131 p oduc o es de BLEE y 3 no p oduc o es, se ob u ie on los pe iles de es icción que mues a la igu a 24. En el caso A se puede obse a que aquellos plásmidos con la misma ó mula FAB (F2:A1:B-) y p oduc o es de CTX-M-15 p esen aban pe iles de es icción muy simila es (80% de simili ud) o iguales (100%). El plásmido con una a iación alélica del eplicón FII (F4 en ez de F2) mues a un pe il con un 72% de simili ud espec o a los an e io es. Si además se p oducen cambios en la secuencia del eplicón FIA, el po cen aje de simili ud disminuye aún más. En el caso B, los plásmidos de 3 aislados (dos no p oduc o es de BLEE y uno p oduc o de CTX-M-32) con la misma ó mula FAB (F2:A-:B1) p esen an pe iles de es icción con menos del 50% de simili ud. Figu a 24. Dendog ama ob enido median e PFGE conEcoRI de plásmidos de aislados ST131 no p oduc o es y p oduc o es de BLEE ST131. Resul ados 119 4.2.4. Colección his ó ica 4.2.4.1. P e alencia de ST131 4.2.4.1.1. P e alencia o al de ST131 De los 417 aislados co espondien es al pe íodo 2002-2009, 37 (8,8%) se ca ac e iza on como O25b/pabB3/B23 (ST131). 4.2.4.1.2. P e alencia de ST131 según colección En la igu a 25 se obse a la dis ibución de los aislados ST131 según la colección de p ocedencia. Las colecciones de Ene o, Bac e iemia y BLEE con aban con 182, 91 y 144 aislados cada una, de los cuales 18 (9,9%), 7 (7,7%) y 12 (8,3%) pe enecían al clon ST131, espec i amen e. 050 100 150 200 Ene o Bac e iemia BLEE Colección Nº de aislados ST131 No ST131 Figu a 25. Dis ibución de los aislados ST131 según la colección de p ocedencia. 4.2.4.1.3. P e alencia de aislados ST131 según año de aislamien o T as analiza la dis ibución empo al del o al de aislados (Figu a 26.A), se de ec ó que los p ime os aislados ST131 da aban del año 2002, as el cual deja on de de ec a se du an e un año. A pa i de 2004 encon amos aislados ST131 odos los años. En la igu a 29.B podemos obse a que el núme o de aislados ST131 iende a i aumen ando con el 120 anscu so de los años. Al inicio del es udio el núme o de aislados ST131 es de 2 (4%), mien as que al inal del pe íodo de es udio, año 2009, llega on a con abiliza se 10 (14,5%) aislados ST131. Figu a 26.A) Dis ibución empo al del o al de aislados de E. coli. B) Dis ibución empo al de los aislados ST131. 4.2.4.1.4. P e alencia de aislados ST131 según colección y año de aislamien o En la igu a 27 podemos obse a que aquella colección en la que se de ec a on po p ime a ez aislados ST131 ue en la de Ene o, en el año 2002. En los años sucesi os hubo aislamien os, excep o en el 2003. En la colección de Bac e iemias el p ime aislado se iden i icó en 2004 y a pa i del año 2005 se de ec a on en los años al e nos. En la colección BLEE el p ime año de aislamien o ue en 2006 y, a pa i de en onces, hubo aislamien os odos los años. A B Resul ados 121 Figu a 27. Dis ibución empo al de los aislados ST131 de las colecciones Ene o, Bac e iemias y BLEE. 4.2.4.2. Filog upos 4.2.4.2.1. Dis ibución de ilog upos de odos los aislados ST131 Respec o a la dis ibución de los ilog upos de odos los aislados analizados, obse amos en la igu a 28 que el g upo p edominan e ue B2 (38,8%), seguido de A (28,6%), D (21,3%) y, en úl imo luga , B1 (10,4%). 4.2.4.2.2. Dis ibución de ilog upos según colección Al ene en cuen a las colecciones de o ma independien e, se puede dis ingui en la igu a 28 que el ilog upo p edominan e ue el B2 (53,8% y 42,9%) en el caso de las colecciones Ene o y Bac e iemias, seguido de A (19,2% y 29,7%), D (17,6% y 20,9%) y B1 122 (8,8% y 3,3%), si bien en el caso de la colección BLEE el más ecuen e ue el A (40,3%), seguido de D (25,7%), B1 (18,1%) y B2 (16%). Figu a 28. Dis ibución de ilog upos: dis ibución global, colección Ene o, colección Bac e iemias y colección BLEE. 4.2.4.2.3. Dis ibución de ilog upos según año de aislamien o Como podemos e en la igu a 29 el ilog upo más ecuen e en odos los años ue B2 (Media anual = 20%), excep uando 2002 y 2004, años en los que se de ec an con más ecuencia aislados del ilog upo A (Media = 20%), seguido de B2 (Media = 13%). En los años 2005, 2007-2009, el segundo g upo más p e alen e ue A (Media = 16,8%), si bien en 2003 y 2006 ue D (Media = 6,5%). Resul ados 123 0% 20% 40% 60% 80% 100% 02 03 04 05 06 07 08 09 Año % de aislados ST131 A B1 D B2 Figu a 29. Dis ibución empo al de ilog upos de odos los aislados de E. coli. 4.2.4.2.4. Dis ibución de ilog upos según colección y año de aislamien o Según la igu a 30 el ilog upo B2 a aumen ando de o ma g adual su p e alencia a expensas del A. En la colección de Ene o el ilog upo B2 es el más ecuen e en casi odos los años, no ándose un inc emen o g adual du an e los años 2004-2007. En las colecciones de Bac e iemias y BLEE es e aumen o se p oduce desde el año 2004 has a 2008. 124 Figu a 30. Dis ibución empo al de los ilog upos de los aislados de la colección de Ene o (A), colección Bac e iemias (B) y colección BLEE (C). 4.2.4.3. Sensibilidad a an imic obianos 4.2.4.3.1. Compa ación de odos los aislados ST131 y no ST131 Teniendo en cuen a el o al de aislados analizados du an e los 8 años de es udio, podemos obse a en la igu a 31 que los aislados que pe enecían al clon ST131 ue on más esis en es de mane a muy signi ica i a a ob amicina (29% s. 10%; p<0,001) y de o ma signi ica i a a amikacina (12% s. 4%; p<0,05), ácido nalidíxico (78% s. 25%; p<0,05) y cip o loxacino (61% s. 25%;p<0,05), que aquellos no ST131. Resul ados 125 Figu a 31. Dis ibución de la sensibilidad en e a di e sos an ibió icos de odos los aislados analizados du an e el pe íodo 2002-2009. GEN: gen amicina; TOB: ob amicina; AMK: amikacina; NAL: ácido nalidíxico CIP: cip o loxacino. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias muy signi ica i as. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias signi ica i as. 4.2.4.3.2. Compa ación de odos los aislados ST131 y no ST131 según año de aislamien o Los aislados ST131 de ec ados en los años 2006 ue on signi ica i amen e más esis en es a ob amicina (60% s. 7%; p<0,05) y en el 2007 a cip o loxacino, (88% s. 42%; p <0,05), que los que no pe enecían al clon. Respec o a los o os años y demás an ibió icos no hubo di e encias ( igu a 32). A B 126 Figu a 32. Dis ibución de odos los aislados ST131 esis en es a Gen amicina (A), Tob amicina (B), Amikacina (C), Ácido nalidíxico (D) y Cip o loxacino (E) en unción del año de aislamien o. : An imic obianos pa a los que se halla on di e encias signi ica i as. 4.2.4.3.3. Compa ación de los aislados ST131 y no ST131 según colección y año de aislamien o Aquellos aislados que pe enecían al clon ST131 de la colección de Ene o ue on más esis en es a gen amicina y ob amicina du an e los años 2006 y 2008 que los aislados no ST131 (50% s. 4%; p<0,05) ( igu a 33). No hubo di e encias en cuan o a la amikacina. Du an e los años 2006, 2007 y 2008, los aislados ST131 ue on más esis en es a ácido nalidíxico (75% s. 22%; 100% s. 18%; 67% s.19%; p<0,05) que los no ST131. En el año 2007 los aislados ST131 ue on ambién más esis en es a cip o loxacino (100% s. 5%; p<0,05), que los aislados no ST131. C D E Resul ados 127 En la colección de Bac e iemias ( igu a 34) no se de ec ó ningún aislado esis en e a gen amicina ni di e encias en los pe iles de sensibilidad en e los aislados ST131 y no ST131 du an e odo el pe íodo de es udio. Los aislados de la colección BLEE pe enecien es al clon ST131 ue on más esis en es a ob amicina (100% s. 13%; p<0,05) y amikacina (100% s. 6%; p<0,05) du an e el año 2006 y a gen amicina (20% s. 4%; p<0,05) y ob amicina (40% s. 4%; p<0,05) en el año 2009 ( igu a 35). A B C D E Discusión 135 En el es udio de p e alencia que hemos ealizado, obse amos po p ime a ez que el clon ST131 e a un clon p e alen e en nues a á ea sani a ia en e odos los aislados de E. coli, no sólo en e los mul i esis en es o esis en es a FQ. Los aislados de es e clon ue on mayo i a iamen e de o igen comuni a io y elacionados p incipalmen e con in ecciones del ac o u ina io. De odos los aislados ST131, sólo una mino ía e a p oduc o de BLEE, p incipalmen e CTX-M-15, en p opo ción simila al es o de aislados de E. coli. Respec o a la esis encia a an imic obianos, an o los aislados ST131 p oduc o es como no p oduc o es de BLEE, ue on más esis en es que los aislados que no pe enecían al clon. En e odas las esis encias an imic obianas de ec adas des acó la elación en e los aislados ST131 p oduc o es de BLEE y la esis encia a FQ. Hemos encon ado cie a homogeneidad a ni el de pulso ipo, siendo un pequeño núme o de pulso ipos múl iples los esponsables de la diseminación del clon. También obse amos que, a pesa de habe encon ado coincidencia con pulso ipos in e nacionales, la expansión del clon se debía p incipalmen e a pulso ipos locales. Todos los aislados del clon p oduc o es de BLEE y la mayo ía de los no p oduc o es con enían al menos un plásmido IncF. En el caso de aislados ST131 p oduc o es de BLEE la mayo ía de los plásmidos p esen aba los eplicones FII+FIA, mien as que en los plásmidos de aislados no p oduc o es e a FII+FIB. Sin emba go, encon amos más homogeneidad en cuan o al sub ipado plasmídico y pe iles de es icción en e los aislados ST131 p oduc o es de BLEE que en e los no p oduc o es. Los plásmidos de aislados ST131 p oduc o es de BLEE p esen aban con más ecuencia o os de e minan es de esis encia, ales como aac(6´)-Ib-c y blaOXA-1, mien as que en los no p oduc o es de BLEE ue on más p e alen es los ac o es de i ulencia. En cuan o a los sis emas de adicción, la mayo ía de los plásmidos po ado es de genes bla con la ó mula F2:A1:B- con enía la misma combinación de 5 sis emas de adicción (pemKI , ccdAB, pa DE, agCD, hok-sok). 136 En nues a á ea la ansmisión humano-animal de compañía no in e iene en la diseminación del clon, ya que excep o una pa eja de aislados, no encon amos coincidencias en e los pulso ipos. Cabe des aca que los aislados de indi iduos ue on más esis en es y p oducían BLEE con más ecuencia que los p oceden es de animales de compañía. La p e alencia del clon ST131 ob enida en el año 2010 ue del 12,5%, ci a simila a dos es udios ealizados en años an e io es ( abla 36). Uno de ellos ue lle ado a cabo po Blanco y cols. en el año 2009, quienes as es udia 500 aislados de E. coli p oceden es de 5 hospi ales de España (en e ellos HUVM) ob u ie on una p e alencia del clon ST131 del 12% (169). El o o es udio ealizado en Reino Unido analiza on 300 aislados de E. coli de o igen u ina io co espondien es a los años 2007 y 2009, de los cuales el 12% pe enecían al clon ST131 (216). Sin emba go, en EEUU el clon esul ó se más ecuen e, al y como desc iben los siguien es abajos. En uno de ellos, Johnson y cols. analiza on una colección de 127 aislados de E. coli du an e el año 2007, llegando a pe enece al clon ST131 el 16,6% de los aislados (217). En el segundo es udio ame icano as analiza 299 mues as en el año 2011, ob u ie on que el clon ST131 con aba con el 27% de los aislados (218). Dicho inc emen o pod ía debe se a la inclusión de odas las mues as an o de pacien es hospi alizados como comuni a ios o al iempo anscu ido en e ambos es udios. En el es udio de Johnson se seleccionan los aislados según sean p oduc o es de BLEE y/o esis en es a quinolonas, lo que pod ía jus i ica que su p e alencia ue a supe io a la nues a. Sin emba go, no incluye on los aislados de o igen comuni a io ni los u ocul i os, po lo que puede se que las di e encias geog á icas sean la azón po la que las asas de aislados de E. coli ST131 de los es udios ame icanos sean mayo es que la nues a. Nues o es udio de p e alencia es el más ex enso has a día de hoy y en el que se han incluido odos los aislados de E. coli p oceden es de cualquie ipo de mues a, sin lle a a cabo ninguna selección po p oducción de BLEE o esis encia a FQ. Discusión 137 País Año de es udio C i e io de selección de aislados Nº de aislados % de E. coli ST131 Re e encia EEUU 2011 Ninguno. Se incluye on odos. 299 27 (218) EEUU 2007 P oducción de BLEE y/o esis encia a FQ. Pacien es hospi alizados. Todas las mues as, excep o u ocul i os. 127 16,6 (217) España 2010 Ninguno. Se incluye on odos. 4.308 12,5 Es e es udio Reino Unido 2007 y 2009 Aislados de E. coli de pacien es con ITU. 300 12,3 (216) España 2009 Ninguno. Se incluye on odos. 500 12 (169) Tabla 36. P e alencia de aislados de E. coli ST131 espec o al o al de aislados. Respec o al o igen de las mues as, ob u imos que el 80,6% de los aislados de E. coli ST131 e an de o igen comuni a io y el 17,2% de o igen nosocomial. Es os esul ados son simila es a los del es udio de Blanco y cols., quienes encon a on que el 73% de los aislados de E. coli ST131 e an comuni a ios y el 27% nosocomiales (169). Cabe menciona que ha sido di ícil compa a nues os esul ados con o os es udios po la di e encia en cuan o a la de inición de comuni a io y nosocomial. Gib eel y cols. de inie on como aislados nosocomiales los que p ocedían de pacien es hospi ala ios, y los de o igen comuni a io los de a ención p ima ia y medicina gene al, hallando un 48% y 52%, espec i amen e (216). En el abajo de Bane jee y cols. los pacien es elacionados con cuidados sani a ios se incluye on den o de los nosocomiales, de modo que ob u ie on que el 34% de los aislados ST131 ue on comuni a ios y el 66% nosocomiales (218). En cuan o al ipo de mues a, la mayo ía de los aislados de E. coli (86,6%) e a de o igen u ina io. De és os, el 12,3% enía un aislamien o de E. coli ST131. Nues o esul ado es in e io al ob enido a ni el eu opeo po Cagnacci, en el que el 23% de los aislados de E. coli causan es de in ección del ac o u ina io e an ST131 (164). Es a di e encia puede debe se a que en el es udio de Cagnacci se selecciona on aquellos aislados de E. coli de o igen comuni a io y esis en es a cip o loxacino. De hecho, si hubié amos seleccionado nues os aislados según los mismos c i e ios que en el es udio mencionado, hab íamos ob enido un po cen aje simila al eu opeo (24% s. 23%). Nues os da os e elan que la mayo ía de los aislados del clon ST131 no e an p oduc o es de BLEE. Encon amos que la asa de los aislados ST131 p oduc o es de 138 BLEE (7%) ue in e io a la de o os es udios y simila a la de los aislados p oduc o es de BLEE no pe enecien es al clon. Johnson y cols., as analiza una colección de 579 aislados de E. coli ST131, encon a on que el 47% e an p oduc o es de BLEE (154). En o o es udio español halla on una asa de aislados ST131 p oduc o es de BLEE del 10% (169). Po o a pa e, nues a asa de aislados de E. coli ST131 p oduc o es de BLEE ue igual a la de los aislados p oduc o es de BLEE no pe enecien es al clon (7%), po lo que el clon ST131 p oduc o de BLEE es el p e alen e en nues a á ea. La p e alencia de ST131 en e odos los aislados de BLEE es a iable según la zona geog á ica. En nues o es udio el clon ST131 suponía el 12,5% de los aislados p oduc o es de BLEE, ci a muy in e io a la mayo ía ob enida en es udios a ni el mundial, en los que el clon ST131 llega a supone desde el 20% has a el 81% de los aislados de E. coli p oduc o es de BLEE, al y como se puede obse a en la abla 37. En España en un es udio mul icén ico del GEIH-BLEE-2006 el clon ST131 ep esen aba el 19% de los aislados de E. coli BLEE (219). Respec o al No e de Amé ica, en a ios es udios canadienses ST131 supone desde un 31% has a un 46% (35,194,195), mien as que en EEUU (Chicago) asciende has a un 53% (222). En la India, República de Á ica Cen al y Reino Unido el clon ST131 albe ga desde la mi ad has a un 81% de los aislados de E. coli BLEE (35,159,166,212). En Eu opa y Asia, según a ios es udios ealizados en Lugo, F ancia, No uega, Taiwan, Camboya y Japón las asas se encuen an en o no al 20-30% (35,165,167,194,223,192). Po o a pa e, cabe señala que ambién se han egis ado asas in e io es a la nues a e incluso aislados ST31 no p oduc o es de BLEE en Filipinas, Tailandia, F ancia y Mad id (35,193,224,225). En odos los es udios, sal o en los de Blanco y el nues o, se seleccionan los aislados en unción de la p oducción de BLEE. Es o pod ía se una de las azones po las que la p e alencia en la mayo ía de los países la p e alencia es mayo que en el nues o. O as explicaciones de es as di e encias pueden se la selección de aislados no solo p oduc o es de BLEE, sino además de CTX-M, como en el caso de Reino Unido; el habe isi ado una zona de al o iesgo de adquisición de una in ección po aislado p oduc o de BLEE, como la India; selecciona las mues as solo de u ocul i os de la comunidad, como Camboya y F ancia o bac e iemias, como en Canadá, Países Bajos y Taiwan. Y en lo que espec a a las p e alencias de nues o país, puede se que la hallada en Lugo sea supe io a la nues a po que g an pa e de los aislados p ocedían de esidencias, el cual Discusión 139 puede se un ese o io del clon (194); la de Mad id puede que ue a in e io po habe se ealizado el es udio 6 años an es que el nues o. Zona geog á ica Año O igen Nº de E. coli BLEE % de ST131 Re e encia UK 04-07 Colección labo a o io 103 81 (35) UK 03-04 Mues a clínicas 287 65 (166,212) India In ecciones asociadas a iajes 31 61 (221) Chicago 08 Mues as clínicas comuni a ias 30 53 (222) Rep. Á ica Cen al 04-06 Colección labo a o io 10 50 (35) Canadá 07 Mues a clínicas 209 46 (162) Canadá 04-06 Colección labo a o io 41 41 (35) Países bajos 08-09 Bac e iemias 41 34 (194) Calga y 00-07 Bac e iemias 67 31 (221) Pi sbu gh 07-08 Mues a clínicas 70 30 (160) Taiwan 05-10 Bac e iemias 122 29 (223) Camboya 04-05 ITUs comuni a ias 30 27 (35) Lugo 06-07 Mayo ía ITU 105 22 (194) Lugo 07-08 Mayo ía ITU 249 22 (194) F ancia 06 ITU comuni a ia 48 21 (194) Mul inacional 04-06 Viaje os de e o no 84 19 (159) Japón 02-03 Colección labo a o io 142 19 (167) Se illa 2010 Mues a clínicas 292 12,5 P esen e es udio Mad id 04 ITU 91 9 (224) B asil 08-09 Mues a clínicas 25 8 (226) Filipinas 07 Mues a clínicas 15 7 (225) Tailandia 1999 Colección labo a o io 5 0 (35) F ancia 06 Volun a ios sanos 100 0 (193) Tabla 37. Dis ibución geog á ica de aislados de E. coli ST131 p oduc o es de BLEE. O igina iamen e, como ya hemos comen ado p e iamen e en o as secciones, los aislados de ST131 se desc ibie on en e aislados de E. coli p oduc o es de CTX-M-15. De odos los aislados de E. coli p oduc o es de CTX-M-15 p oceden es de 8 países y 3 140 con inen es, el 88% e an aislados del clon ST131 (152). En la abla 38 podemos obse a los di e en es es udios en los que se de alla la dis ibución de los aislados ST131 p oduc o es de CTX-M-15. En nues o es udio, ob u imos una asa del 70%, simila a la de un es udio belga e in e io a la de un es udio nacional mul icén ico, ambos del año 2006, en los que el 72% y el 86% de los aislados p oduc o es de CTX-M-15 e an ST131 (177,227). Po o a pa e, en o o es udio mul inacional el clon ST131 con aba con menos de la mi ad de los aislados p oduc o es de CTX-M-15 (67), lo cual puede debe se a que los aislados p ocedían sólo de mues as de pacien es hospi alizados, mien as que en los o os es udios se incluye on an o los comuni a ios como los nosocomiales. Zona geog á ica Año O igen Nº E. coli CTX-M-15 % ST131 Re e encia Eu opa, Asia y Canadá NE Mues as clínicas y de labo a o io 41 88 (152) España 06 Mues as clínicas 37 86 (227) Se illa 10 Mues as clínicas 50 70 P esen e es udio Bélgica 06-07 Mues as clínicas 43 72 (177) Eu opa, Canadá y O ien e Medio 00-06 Colección labo a o io 43 42 (67) Tabla 38. Dis ibución geog á ica de aislados de E. coli ST131 p oduc o es de CTX-M- 15. NE: no especi icado. Del o al de nues os aislados ST131 p oduc o es de BLEE, la enzima más ecuen e ue CTX-M-15 (92,1%). Únicamen e dos aislados (5,3%) p oducían CTX-M-32 y uno (2,7%) CTX-M-14. Johnson encon ó con más ecuencia aislados de ST131 p oduc o es de BLEE (47%) en e los aislados de la colección de e e encia. Sin emba go, e an menos los aislados que p oducían CTX-M-15 (69%) (154). Nues os esul ados son simila es a los de Blanco y col, quienes halla on que el 96% de los aislados ST131 p oducía CTX-M-15 y el 4% CTX-M-14 (194), y a los de o os es udios de di e en es o ígenes. Así, en Canadá du an e los años 2000-2010 el 80% de los aislados ST131 p oducía CTX-M-15 y el 17% CTX-M-14 (228). En F ancia y Po ugal la p e alencia de CTX-M-15 en aislados ST131 se si uaba po encima del 90% (229–231). Mien as que en el caso de Rumanía, la India y la República Cen al A icana e a del 100% (232–234). Discusión 141 Una si uación di e en e ocu e en o as zonas donde CTX-M-14 se desc ibe con más ecuencia e incluso llega a se la p edominan e en e aislados de ST131. De modo que, en Aus alia y Nue a Zelanda, donde p edominan los aislados ST131 p oduc o es de CTX-M-15 (60%), ambién son muy ecuen es los que p oducen CTX-M-14 (38%) y algunas cop oducen ambas enzimas (235). En Japón, Camboya, Hong-Kong y en 11 p o incias de 7 egiones de China la enzima más p e alen e en e los aislados ST131 es CTX-M-14, con ando con 47%, 61%, 73% y 67%, espec i amen e (168,236–238). Si compa amos los esul ados de los es udios comen ados con an e io idad, podemos dis ingui que en países de Occiden e (EE.UU., Canadá y Eu opa) se ha expandido el clon ST131 p oduc o de CTX-M-15, mien as que en países de O ien e lo ha hecho el clon p oduc o de o a BLEE di e en e a CTX-M-15. Es o puede suge i que el clon se ha expandido y pos e io men e ha adqui ido los genes bla median e ans e encia ho izon al (167) o bien que se ha p oducido la adquisición de los genes bla según la zona, lo cual ha con ibuido a su diseminación. En nues o es udio des aca la asociación, an o en p oduc o es como no p oduc o es de BLEE, en e ST131 y la esis encia a amoxicilina-cla ulánico, aminoglucósidos y cip o loxacino. Hay una di e encia en cuan o a la esis encia a aminoglucósidos, según si p oducían o no de BLEE. En el caso de los aislados p oduc o es de BLEE, los ST131 son más esis en es a amikacina y ob amicina que los no ST131, mien as que en e los aislados no p oduc o es de BLEE hay mayo esis encia a los es aminoglucósidos es ados. Nues os esul ados coinciden con los de un es udio ancés (239) y o o canadiense (221) en cuan o a la esis encia de odos los aislados ST131 a cip o loxacino ( abla 39). Sin emba go, al y como se puede obse a en la abla 40, hay di e encias con los aislados p oduc o es de BLEE, ya que en el caso de los aislados ST131 anceses e an más esis en es a ime op im-sul ame oxazol y pipe acilina- azobac am y los canadienses a gen amicina y pipe acilina- azobac am que los no ST131. La esis encia a AMC puede debe se a la adquisición de OXA-1 o IRT, al y como desc iben O eo y cols. en un es udio mul icén ico en el que analizan una se ie de aislados de E.coli esis en es a amoxicilina-cla ulánico, esul ando el clon ST131 el segundo clon más ecuen e en e los aislados p oduc o es de OXA-1 y el más ecuen e en e los p oduc o es de IRT (240). En nues a á ea se ha de ec ado du an e los años 2011 y 2012 un aumen o de aislados p oduc o es de OXA-1 ecogidos con sensibilidad disminuida a 142 amoxicilina-cla ulánico debido a la diseminación de los clones ST88 y ST131, incluyéndose en es e úl imo an o aislados p oduc o es como no p oduc o es de BLEE (241). Aunque ambién la esis encia a AMC ambién puede debe se a la adquisición de TEM-1 o a la hipe p oducción de AmpC. En lo que espec a a la esis encia de los aislados de Lisboa en compa ación con los nues os, cabe menciona que los po ugueses e an más p oduc o es de BLEE y más esis en es a amoxicilina-cla ulánico, gen amicina, ob amicina, ime op im- sul ame oxazol y os omicina que los nues os. Tabla 39. Sensibilidad de los aislados ST131 y no ST131 p oduc o es de BLEE. Aislados p oduc o es de BLEE Re e encia P esen e es udio B isse, JCM 2012 Pi ou , AAC 2009 % de esis encia % de esis encia % de esis encia An imic obiano No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p Amoxicilina- cla ulánico 28,6 82,4 <0,001 89 93 Pipe acilina- azobac am 6,2 16,7 0,055 44 67 0,015 30 81 0,0002 Gen amicina 21,5 3,3 0,014 38 31 48 86 0,004 Tob amicina 19,9 80 <0,001 63 86 0,09 Amikacina 1,3 28 <0,001 15 34 0,01 A. nalidíxico 94,4 100 0,377 68 96 <0,001 Cip o loxacino 81,5 97,1 0,024 57 94 <0,001 85 100 0,004 T ime op im- sul ame oxazol 49,4 64,7 0,094 77 43 <0,001 65 67 1 Fos omicina 3,3 3,3 1 0 0 Discusión 143 Aislados NO p oduc o es de BLEE P esen e es udio B isse, JCM 2012 % de esis encia % de esis encia An imic obiano No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p Amoxicilina-cla ulánico 18 27,6 <0,001 22 33 Pipe acilina- azobac am 4,9 5,5 0,643 10 10 Gen amicina 7,7 17 <0,001 4 20 0,03 Tob amicina 7,9 20,2 <0,001 Amikacina 0,1 1,2 <0,001 1 0 A. nalidíxico 40,9 76,1 <0,001 24 73 <0,001 Cip o loxacino 32,6 72,8 <0,001 13 67 <0,001 T ime op im- sul ame oxazol 30,3 33,1 0,165 34 29 Fos omicina 1,1 1,1 0,996 1 14 Tabla 40. Sensibilidad de los aislados ST131 y no ST131 no p oduc o es de BLEE. Además de la esis encia a las ce alospo inas de espec o ex endido po la p oducción de BLEE, la esis encia a FQ es o o asgo común de los p ime os aislados desc i os del clon ST131 (67,152). En nues o es udio encon amos una asociación en e los aislados ST131 an o p oduc o es como no p oduc o es de BLEE con la esis encia a FQ, ob eniendo que el 97,1% y 72,8% de los aislados, espec i amen e, ue on esis en es a FQ. Respec o al o al de aislados de E. coli p oduc o es de BLEE y esis en es a FQ, noso os ob u imos que el 13,4% co espondía al clon ST131, lo cual es simila a lo que sucede en China, según un abajo co espondien e a los años 1998-2000 (179). Sin emba go, es muy in e io a lo hallado en o os es udios, en los que desde un 30% has a un 60% de los aislados de E. coli BLEE y esis en es a FQ pe enecían al clon ST131. Como podemos obse a en la abla 41, Ce que i encon ó en Roma en el año 2006 que el 61% de los aislados de bac e iemias e in ecciones del ac o u ina io con E. coli esis en es a FQ y BLEE e an ST131 (178). En o as zonas de Asia, Canadá y Aus alia, la p e alencia de ST131 en e aislados BLEE y esis en es a FQ es aba en o no al 25%- 35% (179,221,242,243). Puede se que la asa an ele ada de Ce que i se deba a que la