Uso de N-acetilcisteína para proteger a los peces de la intoxicación por Cilindrospermopsina

ES 2 402 477 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Núme o de publicación: 2 402 477 Núme o de solici ud: 201101162 51 In . CI.: A61K 31/198 (2006.01) A23K 1/18 (2006.01) A23K 1/16 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Tí ulo: USO DE N-ACETILCISTEÍNA PARA PROTEGER A LOS PECES DE LA INTOXICACIÓN POR CILINDROSPERMOPSINA. 73 Ti ula /es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (50.0%) OTRI-PABELLÓN DE BRASIL, PASEO DE LAS DELICIAS S/N 41012 SEVILLA (Se illa) ES y UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA (50.0%) 72 In en o /es: CAMEÁN FERNÁNDEZ, Ana Ma ía; GUTIÉRREZ PRAENA, Daniel; JOS GALLEGO, Ángeles Mencía; PICHARDO SÁNCHEZ, Sil ia; MORENO NAVARRO, Isabel; PRIETO ORTEGA, Ana Isabel; PUERTO RODRÍGUEZ, Ma ía; GUZMÁN GUILLÉN, Remedios; MOYANO SALVAGO, Mª Rosa io y BLANCO RODRÍGUEZ, Al onso 74 Agen e/Rep esen an e: GONZÁLEZ CARVAJAL, Ramón 22 Fecha de p esen ación: 20.10.2011 43 Fecha de publicación de la solici ud: 06.05.2013 Fecha de la concesión: 04.03.2014 45 Fecha de publicación de la concesión: 11.03.2014 57 Resumen: La p esen e in ención se e ie e al uso de una composición que comp ende N-ace ilcis eína (NAC) pa a el a amien o, p e ención y/o ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a Cilind ospe mopsina (CYN). También se e ie e al uso de la ci ada composición en la ecupe ación de las al e aciones his opa ológicas p oducidas en los ejidos de la lis a que comp ende hígado, iñón, co azón, b anquias y/o ac o gas oin es inal. Además, dicha composición se u iliza pa a la ab icación de un alimen o uncional, un complemen o i amínico, o un complemen o nu icional. Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP. A iso: Uso de N-ace ilcis eína pa a p o ege a los peces de la in oxicación po Cilind ospe mopsina 5 1O La p esen e in ención se e ie e al uso de una composición que comp ende N- ace ilcis eína (NAC) pa a el a amien o, p e ención y/o ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a Cilind ospe mopsina (CYN). También se e ie e al uso de la ci ada composición en la ecupe ación de las al e aciones his opa ológicas p oducidas en los ejidos de la lis a que comp ende hígado, iñón, co azón, b anquias y/o ac o gas oin es inal. Además, dicha composición se u iliza pa a la ab icación de un alimen o uncional, un complemen o i amínico, o un complemen o nu icional. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR 15 La NAC, de i ado ace ilado del aminoácido an ioxidan e que con iene g upos iol. L-cis eína, es un conocido 20 25 Las aplicaciones de la NAC se basan en que puede ac ua en e al es és oxida i o po di e en es caminos. Es un p ecu so de la sín esis de GSH ac uando como p o eedo de cis eína y es imulando la ac i idad de las enzimas ci osólicas in oluc adas en el ciclo del GSH, ales como Glu a ión educ asa (GR), que aumen a la asa de egene ación de GSH. Po o o lado, in i o e in i o ac úa di ec amen e, a a és de su g upo iol, sob e di e en es especies eac i as de oxígeno (ROS) ales como ácido hipoclo oso, adical hid oxilo y pe óxido de hid ógeno (A uoma 0.1. e al. (1989) F ee Rad. Biol. Med. 6:593-597). 30 35 Se ha desc i o que la inyección de NAC mejo a el es ado edox de GSH en el hígado de anguilas (A. anguil/a) in oxicadas con o gano os o ados (diclo os), inc emen ando su ole ancia al es és oxida i o y la nec osis p o ocadas po inges ~ de pes icidas, pa icula men e en el caso de o gano os o ados o pi e oides (ES2249167 A1). En el campo de las ciano oxinas, su uso queda es ingido a su ac i idad p o ec o a en e al es és oxida i o y la e e sión de las lesiones his opa ológicas inducidas po mic ocis inas (MCs) en peces (W02010061018 -A1, Caméan Fe nández A, e al., 201 O) ES 2 402 477 A1  2 ES 2 402 477 B1 DESCRIPCIÓN 5 10 15 20 25 30 35 Po o o lado, la CYN es una oxina p oducida po cianobac e ias óxicas p esen es en aguas supe iciales, pe enecien es al menos a seis géne os, siendo las especies iden i icadas en los momen os ac uales Cylind ospe mopsis acibo skii, Anabaena be gii, Aphanizomenon o a/ispo un, Aphanizomenon los-aquae, Umezakia na ans, y Raphidiopsis cu a a, en e o as. CYN se aisló po p ime ez de un cul i o de Cylind ospe mopsis acibo skii, ob enido de los ese o ios de agua de bebida que su ían a la población de Palm lsland, Queensland, Aus alia (Oh ani l. e al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 144:7941-7942), Se ha comp obado su acumulación en peces y c us áceos, a ec ando a la calidad y segu idad de es e ipo de alimen os y suponiendo un iesgo po encial pa a el consumido . En compa ación con los mamí e os, los es udios sob e e ec os óxicos de CYN en peces son muy escasos, des acando que puede a ec a no sólo al hígado sino ambién al iñón, co azón, b anquias, y ac o gas oin es inal. Las cianobac e ias cons i uyen pa e de la die a de di e sos cip inídos y cíclidos, como es el caso, po ejemplo, de las Tilapias (O ech omis, sp.). La Tilapia (O eoch omis sp.) es uno de los pescados que más ápidamen e se ha in oducido en acuicul u a, po la acilidad que p esen a su manejo, g an capacidad de adap ación a condiciones ad e sas y ácil ep oducción; sus dis in as a iedades son il ado as y consumido as de cianobac e ias y en Eu opa se es á despe ando un g an in e és po su cul i o. Como mecanismo de acción óxica más acep ado, la CYN es á conside ada un ci o oxina gene al que bloquea la sín esis de p o eínas en células euca io as de mamí e os y plan as (Te ao K., e al, (1994) Toxican 32:833- 843; Runnega M.T. e al. (1995) Biochem. Pha macol. 49:219-225) y disminuye los con enidos de Glu a ion (GSH). La disminución de GSH no pa ece conlle a a un inc emen o del es és oxida i o en la célula, sugi iéndose que no es un mecanismo p ima io de la oxicidad de CYN. Sin emba go, ecien emen e, se ha comp obado la pa icipación di ec a del es és oxida i o en la pa ogénesis de CYN en peces (Gu ie ez-P aena D. e al. (2011) Aqua . Tox. 105:100-106; Pue o M. e al., (2011) Eco oxicology, acep ado, en p ensa), de ec ándose un aumen o en la p oducción de especies eac i as de oxígeno (ROS), lipope oxidación (LPO) y oxidación de P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  3 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 p o eínas, así como cambios en la ac i idad de di e sas enzimas an ioxidan es en peces. Los escasos es udios oxicológicos ealizados has a la ac ualidad han conducido al es ablecimien o de una lnges a Dia ia Tole able (IDT) p o isional de 0,03 ¡Jg/Kg/día de CYN, y la p opues a de un alo guía p o isional de 1 ¡Jg/L de CYN en aguas de bebida. Ac ualmen e no exis e un a amien o an idó ico especí ico en casos de in oxicación po CYN y sus epíme os p oceden es de cianobac e ias. Has a la echa no se conoce ningún a amien o capaz de ecupe a a los humanos, mamí e os y peces in oxicados con CYN. Teniendo en cuen a la ubicuidad de es a oxina, se hace necesa io ecupe a peces que p esen en al e aciones his opa ológicas con di e en es ni eles de a ección, que pueden impedi el ciclo de ida no mal de los peces a ec ados. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La p esen e in ención se e ie e al uso de una composición que comp ende NAC pa a el a amien o, p e ención y/o ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a CYN. En ilapias (O eoch omis sp.) expues as a dosis únicas y epe idas de CYN se inducen es és oxida i o y al e aciones pa ológicas. En conc e o, se han comp obado a iaciones dosis-dependien e en la ac i idad de di e sas enzimas an ioxidan es, disminución de los ni eles de Glu a ión (GSH), aumen o de los ni eles de lipope oxidación (LPO), de oxidación de p o eínas y del ADN, en di e en es ó ganos (hígado, iñón), y múl iples al e aciones his opa ológicas en ó ganos di e sos como hígado, iñón, co azón, ac o gas oin es inal y b anquias. La NAC adminis ada en es a in ención se mues a e ec i a man eniendo el es ado de salud del pez, p e iniendo daños causados po la oxina y/o mejo ando los e ec os óxicos inducidos po CYN en di e sos ó ganos de ilapias in oxicadas. Además, el uso de NAC como adi i o alimen a io no sólo mejo a los ni eles de GSH en hígado y iñón, sino que po su p opia ac i idad an ioxidan e es P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  4 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 capaz de disminui la lipope oxidación (LPO) (hígado, iñón), la oxidación de p o eínas en iñón inducida po CYN, y ecupe a las lesiones his opa ológicas inducidas en múl iples ó ganos como hígado, iñón, co azón, ac o gas oin es inal y b anquias. En es e sen ido, un p ime aspec o de la p esen e in ención se e ie e al uso de una composición que comp ende NAC pa a la elabo ación de un medicamen o ú il en el a amien o, p e ención y/o ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a CYN. NAC es el de i ado N-ace il del aminoácido L-cis eína. La NAC es el p ecu so del glu a ión. El glu a ión iene un g upo iol (sul id ilo) que le con ie e e ec os an ioxidan es po medio de la educción de adicales lib es. La composición de la p esen e in ención comp ende, al menos, NAC. El medicamen o es á compues o, al menos, po la composición an e io . La NAC, sus sales, de i ados a macéu icamen e acep ables o sus p o á macos, se o mulan en una composición a macéu ica ap opiada, en la can idad e apéu icamen e e ec i a, jun o con uno o más ehículos, adyu an es o excipien es a macéu icamen e acep ables. El medicamen o se emplea pa a el a amien o de los e ec os óxicos en peces expues os a CYN. Po un "de i ado a macéu icamen e acep able" se en iende cualquie sal, a macéu icamen e acep able o cualquie o o compues o que después de su adminis ación, es capaz de p opo ciona (di ec a o indi ec amen e) NAC. Un " ehículo a macéu icamen e acep able" se e ie e a aquellas sus ancias, o combinación de sus ancias, conocidas en el sec o a macéu ico, u ilizadas en la elabo ación de o mas a macéu icas de adminis ación e incluye sólidos o líquidos, disol en es, ensioac i os, e c. El é mino " a amien o" al como se en iende en la p esen e in ención supone comba i los e ec os óxicos pa a es abiliza el es ado de oxicidad de los indi iduos. El medicamen o se emplea ambién pa a la p e ención de los e ec os óxicos ocasionados a los peces expues os a CYN. El é mino "p e ención" al como se en iende en la p esen e in ención consis e en e i a la apa ición de P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  5 ES 2 402 477 B1 e ec os óxicos en peces expues os a CYN. En es e caso, p e iamen e a la in oxicación po CYN, los peces es án p o egidos po un aumen o de las de ensas an ioxidan es p oducido po la acción de la NAC. El medicamen o ambién se emplea pa a la ecupe ación de los e ec os óxicos ocasionados en 5 peces expues os a CYN. El é mino "e ec os óxicos" al como se en iende en la p esen e in ención hace e e encia a la consecuencia de i ada de la exposición del pez a la CYN, es deci , la apa ición de di e sos e ec os ad e sos, como po ejemplo, un daño 1 O celula que ocasiona un daño en los ejidos biológicos, lo que a su ez puede p o oca un cambio en las unciones isiológicas y en el me abolismo celula . La CYN es una oxina de na u aleza alcaloide, en cuya es uc u a in e iene un g upo icíclico guanidinio unido a hid oxime ilu acilo. Es p oducida po al menos 15 seis géne os de cianobac e ias, que se encuen an ampliamen e dis ibuida en aguas opicales y sub opicales. Pueden exis i dos posibles epíme os de o ma na u al, cilind ospe mopsina (CYN) y 7-epicilind ospe mopsina, ambos óxicos; la comple a pé dida del g upo u acilo elimina la oxicidad de CYN. En ese as na u ales de agua se ha desc i o o a a ian e, la 7 -desoxicilind ospe mopsina, 20 cuya oxicidad apenas es á es ablecida, siendo menos óxica en a ón que CYN. Un segundo aspec o de la p esen e in ención es el uso de una composición que comp ende N-ace ilcis eína pa a la elabo ación de un medicamen o ú il en la ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a CYN. El é mino 25 " ecupe ación" hace e e encia a la desapa ición de los e ec os óxicos causados po la in oxicación con CYN. Es a ecupe ación supone la e e sión o al de los daños causados en los ejidos del pez, ecupe ando de es a o ma las unciones no males de los ó ganos a ec ados. 30 En una ealización p e e ida de la p esen e in ención, los e ec os óxicos son al e aciones his opa ológicas. El é mino "al e aciones his opa ológicas" al como se en iende en la p esen e in ención son daños p oducidos en los ejidos biológicos del pez. Es os daños son de ec ados po medio del análisis a ni el mic oscópico de las es uc u as pa ológicas de las di e en es mues as 35 ob enidas, sin exclui o as écnicas de de ección. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  6 ES 2 402 477 B1 Una ealización aún más p e e ida de la in ención, es el uso donde las al e aciones his opa ológicas son p oducidas en al menos uno de los ejidos de la lis a que comp ende hígado, iñón, co azón, b anquias o ac o gas oin es inal. Tal como se ha mencionado an e io men e, la CYN puede 5 acumula se en el ejido hepá ico y ambién puede llega a o os ó ganos u ilizando la sang e como medio de dispe sión, de es a o ma, la oxina puede causa e ec os óxicos y/o al e aciones his opa ológicas en los ci ados ó ganos. La ecupe ación de los ejidos a ec ados po las al e aciones his opa ológicas es un aspec o des acable de la p esen e in ención ya que puede supone la 1O cu ación de los peces cul i ados, peces seleccionados po di e sas ca ac e ís icas pa a la c ía, peces de especies en pelig o de ex inción o cualquie o o ipo de pez que p esen e al e aciones his opa ológicas en un g ado e e sible. 15 En o a ealización más p e e ida de la p esen e in ención, la NAC se adminis a en una can idad dia ia de en e 400 y 880 mg po Kg de peso del pez. Es a adminis ación se lle a a cabo du an e al menos una semana. P e e iblemen e la can idad dia ia inco po ada a los peces es de en e 400 y 880 mg po Kg de peso (equi alen es a 22 y 45mgNAC/Kg/día). 20 Es a composición, se puede adminis a de dis in as o mas, en e ellas, pe o sin limi a se, in ape i onealmen e, o almen e, bucalmen e, in amuscula men e o de o ma subcu ánea. Más p e e iblemen e se adminis a de o ma o al o in ape i oneal. En o a ealización más p e e ida 25 la composición se p esen a en una o ma adap ada a la adminis ación o al o in ape i oneal. Los peces in oxicados es án expues os a más de 10 ¡Jg CYN/L agua po día du an e 14 días (in oxicación subc ónica). P e e iblemen e los peces es án 30 expues os a más de 200 ¡Jg CYN/ kg de pez en exposición única. O a ealización p e e ida de la p esen e in ención, comp ende el uso de la compos1c1on an e io men e desc i a que además incluye excipien es a macológicamen e acep ables. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  7 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 El é mino "excipien e" hace e e encia a una sus ancia que ayuda a la abso ción de la sus ancia ac i a (en la p esen e in ención, NAC), es abiliza dicha sus ancia ac i a o ayuda a la p epa ación del medicamen o en el sen ido de da le consis encia o apo a sabo es que lo hagan más ag adable. Así pues, los excipien es pod ían ene la unción de man ene los ing edien es unidos como po ejemplo almidones, azúca es o celulosas, unción de endulza , unción de colo an e, unción de p o ección del medicamen o como po ejemplo pa a aisla lo del ai e y/o la humedad, unción de elleno de una pas illa, cápsula o cualquie o a o ma de p esen ación como po ejemplo el os a o de calcio dibásico, unción desin eg ado a pa a acili a la disolución de los componen es y su abso ción en el in es ino sin exclui o o ipo de excipien es no mencionados en es e pá a o. El é mino "excipien e a macológicamen e acep able" hace e e encia a que el excipien e es é pe mi ido y e aluado de modo que no cause daño a los o ganismos a los que se adminis a. En una ealización más p e e ida de la in ención, la composición comp ende además o a sus ancia ac i a. En cada caso la composición se adap a á al ipo de adminis ación u ilizada, po ello, la composición de la p esen e in ención se puede p esen a bajo la o ma de soluciones o cualquie o a o ma de adminis ación clínicamen e pe mi ida y en una can idad e apéu icamen e e icaz. O as ealizaciones p e e idas son el uso pa a la ab icación de un alimen o uncional, el uso pa a la ab icación de un complemen o i amínico y o a más es el uso pa a la ab icación de un complemen o nu icional. La NAC puede o ma pa e de un alimen o uncional, complemen o i amínico, complemen o nu icional o cualquie a de sus combinaciones. Tal como se en iende en la p esen e in ención, un alimen o uncional cumple una unción especí ica como puede se la de mejo a la salud de los peces. Pa a ello al alimen o uncional se le puede ag ega un complemen o i amínico y/o complemen o nu icional. El alimen o uncional, los complemen os desc i os o P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  8 ES 2 402 477 B1 cualquie a de sus combinaciones pueden adminis a se jun o con un pienso, o ma pa e de la composición del pienso o pueden adminis a se de o ma independien e. 5 En una ealización p e e ida, de la p esen e in ención, los peces son cul i ados. Se en iende po "peces cul i ados" aquellos peces c iados en pisci ac o ías, cha cas o cualquie con enedo de agua de cualquie amaño que pe mi a la c ía de peces y/o el engo de. Los peces cul i ados pueden se , sin limi a , peces 1o des inados a la alimen ación o a la c ía de peces o namen ales. En o a ealización p e e ida, de la p esen e in ención, los peces pe enecen al géne o O eoch omis sp. 15 Los peces pe enecien es a es e géne o se conocen como Tilapias. Las Tilapias c ecen en aguas cálidas dulces o saladas y ienen pocas exigencias espi a o ias, ápido c ecimien o y acilidad pa a la pues a. Los peces se pueden selecciona , sin limi a se, a la lis a que comp ende O. amphimelas, O. ande sonii, O. angolensis, O. au eus, O. chung u uensis , O. esculen us, 20 O. hun e i, O. ismailiaensis, O. jipe, O. ka omo, O. ka ongae, O. ko ogwe, O. Jepidu us, O. Jeucos ic us, O. /ido/e, O. mac ochi , O. malaga asi, O. mo ime i, O. mossambicus, O. mwe uensis, O. nilo icus (Nile ilapia), O. Pan ani, O. pangani gi igan, O. pangani pan ani, O. p/acidus, O. placidus placidus, O. placidus u umae, O. ukwaensis, O. saka, O. salinicola, O. 25 schwebischi, O. shi anus, O. shi anus chilwae, O. shi anus shi anus, O. spi/u us, O. spi/u us nige , O. spilu us pe ci ali, O. spi/u us spilu us, O. squamipinnis, O. anganicae, O. upembae, O. u olepis, O. u olepis homo um, O. u olepis u olepis u O. a iabilis. Más p e e iblemen e los peces pe enecen a la especie O. nilo icus (Nile ilapia). 30 A lo la go de la desc ipción y las ei indicaciones la palab a "comp ende" y sus a ian es no p e enden exclui o as ca ac e ís icas écnicas, adi i os, componen es o pasos. Pa a los expe os en la ma e ia, o os obje os, en ajas y ca ac e ís icas de la in ención se desp ende án en pa e de la 35 desc ipción y en pa e de la p ác ica de la in ención. Las siguien es igu as y P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  9 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 En los peces a los que se les adminis ó CYN jun o con 45 mg NAC/pez/día se obse ó es uc u almen e y ul aes uc u almen e una mo ología del pa énquima enal o almen e no mal (FIG. 5 G, H). A, 8: Riñón de los peces con ol. C, D: His ología de peces a ados con CYN. C. De alle de pa énquima enal con glomé ulos a ó icos (cí culo) y dila ación de la capsula de 8owman (es ella). D. Mic o ellosidades de los úbulos con o neados p oximales ume ac os y pé dida de dichas mic o ellosidades ( lecha). E, F: Tilapias expues as sólo a NAC (45 mg NAC/pez/día). E. Pa énquima enal con glomé ulo enal apa en emen e no mal. F. De alle del úbulo con o neado p oximal apa en emen e no mal. G, H: His ología del iñón de peces a ados con CYN+ NAC (45 mg NAC/pez/día) G. Glomé ulos y úbulos con apa iencia no mal. H Memb ana basal apa en emen e no mal. Ejemplo 4. NAC mejo ó las al e aciones his opa ológicas inducidas en co azón. El es udio his opa ológico ealizado sob e peces a ados con CYN mos a on es uc u almen e a ni el de co azón un p oceso de mio ib olisis, con pé dida de mio ib illas, p esencia de edemas y hemo agias. Ul aes uc u almen e se ap eció cla amen e es a mio ib olisis de la ib a ca diaca, ca ac e izada po una pé dida de las mio ib illas (FIG. 6 C, D). El co azón de los peces del lo e con ol p esen ó una es uc u a apa en emen e no mal (FIG. 6 A, 8). Los peces a ados solo con NAC (22 y 45 mg NAC/pez/dia) p esen an una mo ología de las ib as ca diacas simila es a las del g upo con ol (FIG. 6 E, F). Los p ocesos degene a i os en co azón que se obse a on en los peces a ados con CYN ue on mucho más le es en aquellos peces a ados con suplemen o de NAC a la dosis más baja (22 mg NAC/pez/dia), obse ándose cie a pé dida de mio ib illas y lige as hemo agias aisladas, de escaso in e és (FIG. 6 G, H). No se obse a on lesiones en los a ados con la dosis más ele ada (45 mg NAC/pez/día) (FIG. 6 1, J). A, 8: Co azón de peces con ol. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  16 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 C, D: His ología del co azón de peces a ados con CYN. C. Mio ib olisis, pé dida de mio ib illas (cí culo), cie os edemas (es ella). D. Pé dida y desin eg ación de las mio ib illas (cí culo). E, F: Co azón de peces a ados con NAC (dosis 45 mg NAC/pez/día) E. De alle de co azón con ib as muscula es apa en emen e no mal. F. Es uc u a de las mio ib illas p ác icamen e no mal. G, H: His ología del co azón de peces a ados con CYN+NAC (22 mg NAC/pez/día) G. De alle de mioca dio con ib as muscula es apa en emen e no males pe o con cie as hemo agias (cí culo). H. De alle de mio ib illas con escasa pé dida de ma e ial con ác il (cí culo). 1, J: His ología del co azón de peces a ados con CYN+NAC (45 mg NAC/pez/dia) l. De alle de co azón con ib as muscula es apa en emen e no mal. J. De alle de mio ib illas apa en emen e no mal. Ejemplo 5. NAC mejo ó las al e aciones his opa ológicas inducidas en in es ino. A ni el de in es ino en los peces a ados con CYN se obse a on lesiones, en e al lo e con ol (FIG. 7 A, B), ca ac e izadas po un p oceso de en e i is con nec osis de en e oci os, al mic oscopio óp ico (FIG. 7C), y al mic oscopio elec ónico, po una pé dida de mic o ellosidades muy mani ies a (FIG. 7D). T as la adminis ación de las dos dosis de NAC (22 y 45 mg NAC/pez/día, equi alen es a 400, 880 mg/kg) solo se obse ó una ac i idad mani ies a de las células calici o mes, sin in e és pa ológico (FIG. 7 E, F). Los peces a los que se les adminis ó NAC jun o con la oxina CYN mos a on una p o ección con ambas dosis, con una es uc u a apa en emen e no mal cuando ue on obse adas an o al mic oscopio óp ico como elec ónico (FIG. 7 G, H). A, B: In es ino de peces con ol. A Vellosidades apa en emen e no males con en e oci os apa en emen e no males. B. En e oci os con abundan es mic o ellosidades apa en emen e no males y células calici o mes. C, D: His ología de in es ino de ilapias a adas con CYN. C. De alle de ellosidades in es inales con en e oci os nec osados (cí culo) D. Al e ación de los en e oci os con pé dida pa cial de las mic o ellosidades (cí culo). P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  17 ES 2 402 477 B1 5 E, F: In es ino de peces a ados con NAC (dosis 45 mg NAC/pez/día) E. Vellosidades apa en emen e no males y abundan es células calici o mes ( lecha). F. En e oci os con abundan es mic o ellosidades (cí culo). G, H: In es ino de Tilapias a adas con CYN + NAC (45 mg NAC/pez/día) G. De alle de ellosidades in es inales no males con en e oci os apa en emen e no males y abundan es células calici o mes ( lecha). J. En e oci os con abundan es mic o ellosidades (ci culo) y células calici o mes apa en emen e no males ( lecha). 1o Ejemplo 6. NAC mejo ó las al e aciones his opa ológicas inducidas b anquias. en 15 Al mic oscopio óp ico las b anquias de los peces a ados con CYN p esen a on, a ni el de las laminillas p ima ias y secunda ias, p ocesos de hipe emia y pé dida de las p olongaciones !amela es (FIG. 8B). Es as lesiones no ue on obse adas en el lo e con ol, que p esen ó una mo ología apa en emen e no mal (FIG. 8A). 20 En los lo es de peces a ados con CYN y ambas dosis de NAC se demues a una ecupe ación de las lesiones p o ocadas (FIG. 8C). 25 Al mic oscopio elec ónico de ba ido (SEM) se obse ó una al e ación de la mo ología con pé dida de con inuidad del a co b anquial, y p esencia de un in il ado celula (FIG. 9C), y al mic oscopio de ansmisión elec ónica (TEM) se de ec ó una ue e hipe emia de los capila es con p esencia de células de in il ado in lama o io (FIG. 9D). Los peces del g upo con ol (FIG. 9 A, B) no p esen a on anomalías. 30 Los peces a ados con CYN y ambas dosis de NAC (22 y 45 mg NAC/pez/dia, equi alen es a 400 y 800 mglkg de NAC, espec i amen e) mos a on ecupe ación de las lesiones p o ocadas po la oxina, p esen ándose ilamen os b anquiales y a cos b anquiales apa en emen e no males (FIG 9 E, F). 35 FIG. 8 (Mic oscopia óp ica) A: B anquias de peces con ol. B: B anquias de peces a ados con CYN. De alle de ilamen o b anquial con p esencia de hipe emia en laminillas secunda ias (ci culo). P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  18 ES 2 402 477 B1 C: B anquias de peces a ados con NAC (45 mg NAC/pez/día). De alle de ilamen o b anquial apa en emen e no mal. D: His ología de b anquias de peces a ados con CYN+NAC (22 y 45 mg NAC/pez/día) . De alle de ilamen o b anquial apa en emen e no mal. 5 FIG. 9 A, B: peces con ol. C, D: B anquias de peces a ados con CYN pu a. C. A co b anquial con pé dida de con inuidad, e osionado y p esencia de un in il ado celula (cí culo). D. De alle de laminilla con hipe emia de capila es (cí culo). 1 O E, F: B anquias de peces a ados con CYN+NAC (45 mg NAC/pez/día, equi alen e a 800 mg NAC/kg pez). E. Filamen o b anquial apa en emen e no mal. F. A co b anquial apa en emen e no mal. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  19 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 REIVINDICACIONES 1. Uso de una composición que comp ende N-ace ilcis eína pa a la elabo ación de un medicamen o ú il en el a amien o y/o p e ención de e ec os óxicos en peces expues os a cilind ospe mopsina. 2. Uso de una composición que comp ende N-ace ilcis eína pa a la elabo ación de un medicamen o ú il en la ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a cilind ospe mopsina. 3. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 ó 2, donde los e ec os óxicos son al e aciones his opa ológicas. 4. Uso según la ei indicación 3, donde las al e aciones his opa ológicas son p oducidas en al menos uno de los ejidos de la lis a que comp ende hígado, iñón, co azón, b anquias o ac o gas oin es inal. 5. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 4, donde la N-ace ilcis eína se adminis a en una can idad dia ia de en e 22 y 45 mg NAC/pez/día (equi alen es a 400 y 880 mg po Kg de peso del pez, espec i amen e). 6. Uso según la ei indicación 5, donde la composición se p esen a en una o ma adap ada a la adminis ación o al o in ape i oneal. 7. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 6, donde la composición incluye excipien es a macológicamen e acep ables. 8. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 7, donde la composición comp ende además o a sus ancia ac i a. 9. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 8 pa a la ab icación de un alimen o uncional. 1 O. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 9 pa a la ab icación de un complemen o i amínico. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  20 ES 2 402 477 B1 5 11. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 1 O pa a la ab icación de un complemen o nu icional. 12. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 11, donde los peces son cul i ados. 13. Uso según cualquie a de las ei indicaciones 1 a 12, donde los peces pe enecen al géne o O ech omis sp. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  21 ES 2 402 477 B1  ES 2 402 477 B1 22  ES 2 402 477 B1 23  ES 2 402 477 B1 24  ES 2 402 477 B1 25 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solici ud: 201101162 CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K31/198 (2006.01) A23K1/18 (2006.01) A23K1/16 (2006.01) Documen ación mínima buscada (sis ema de clasi icación seguido de los símbolos de clasi icación) A61K, A23K Bases de da os elec ónicas consul adas du an e la búsqueda (nomb e de la base de da os y, si es posible, é minos de búsqueda u ilizados) INVENES, EPODOC, WPI, INTERNET, BIOSIS, HCAPLUS In o me del Es ado de la Técnica Página 2/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solici ud: 201101162 Fecha de Realización de la Opinión Esc i a: 01.10.2012 Decla ación No edad (A . 6.1 LP 11/1986) Rei indicaciones 1-13 SI Rei indicaciones NO Ac i idad in en i a (A . 8.1 LP11/1986) Rei indicaciones 1-13 SI Rei indicaciones NO Se conside a que la solici ud cumple con el equisi o de aplicación indus ial. Es e equisi o ue e aluado du an e la ase de examen o mal y écnico de la solici ud (A ículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La p esen e opinión se ha ealizado sob e la base de la solici ud de pa en e al y como se publica. In o me del Es ado de la Técnica Página 3/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solici ud: 201101162 1. Documen os conside ados.- A con inuación se elacionan los documen os pe enecien es al es ado de la écnica omados en conside ación pa a la ealización de es a opinión. Documen o Núme o Publicación o Iden i icación Fecha Publicación D01 GUTIÉRREZ-PRAENA, D. e al. 2011 D02 GUTIÉRREZ-PRAENA, D. e al. 2011 D03 ES 2249167 A1 (CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION) 16.03.2006 D04 ES 2340012 A1 (UNIV SEVILLA) 27.05.2010 D05 RUNNEGAR, M. e al. 1995 2. Decla ación mo i ada según los a ículos 29.6 y 29.7 del Reglamen o de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de ma zo, de Pa en es sob e la no edad y la ac i idad in en i a; ci as y explicaciones en apoyo de es a decla ación La in ención se e ie e, según las dos p ime as ei indicaciones, al uso de una composición que comp ende N- ace ilcis eína (NAC) pa a la elabo ación de un medicamen o ú il en la p e ención, el a amien o y la ecupe ación de e ec os óxicos en peces expues os a cilind oespe mopsina (CYN). Las ei indicaciones dependien es ca ac e izan la composición y los e ec os óxicos a los que se e ie en las dos p ime as ei indicaciones. No edad y ac i idad in en i a (a . 6 y 8 de la ley de pa en es) Los documen os D1 y D2 a an de los e ec os óxicos que p oducen la cilind oespemopsina en peces. Los peces in oxicados con CYN p esen an sín omas de es és oxida i o como demues an los bioma cado es es udiados: descenso en los ni eles de glu a ión (GSH), aumen o de oxidación lipídica y p o éica, aumen o en los ni eles de NADPH oxidasa, e c. También se de ec an al e aciones his opa ológicas en el hígado y en el iñón p oducidas po la exposición a CYN. En los documen os D3 y D4 se desc ibe la u ilización de composiciones que con ienen NAC an o pa a el a amien o de peces que p esen an es és oxida i o como pa a aumen a la de oxi icación celula de con aminan es como cie os plaguicidas o gano os o ados y las mic ocis inas. La NAC es capaz de elimina el es és oxida i o en am bos casos así como de ecupe a las al e aciones his opa ológicas de p oducidas po las mic ocis inas . La ac uación de la NAC se ealiza po di e en es caminos: po una lado unciona como an ioxidan e a a és de su g upo iol, pe o además es un p ecu so de la sín esis de GSH como p o eedo de cis eína y es á in oluc ada en el ciclo del glu a ión ya que ac i a la glu a ión educ asa, esponsable de la egene ación del GSH y la glu a ión ans e asa, in oluc ada en la de oxi icación de g an núme o de con aminan es a a és de la conjugación del óxico con el GSH. El documen o D5 es udia el e ec o de La CYN en hepa oci os de a a. Según es e documen o, el descenso de GSH que se obse a en los hepa oci os a ados con CYN se debe no an o a su u ilización del GSH en los hepa oci os (en la de oxi icación con glu a ión ans e asa o en la oxidación del GSH a GSSG) como a la inhibición en su sín esis. De hecho, el apo e de NAC, no impide la caída de GSH ni los e ec os óxicos p oducidos po la CYN. Po an o, s e conside a que, si bien el es és oxida i o ha sido a ado con composiciones que con ienen NAC (documen os D3 yD4) y se ía, po an o, uno de las posibles medicamen os, disponibles pa a a a el es és oxida i o p oducido po CYN, no se ía ob io pa a un expe o en la ma e ia, que dichas composiciones uesen a elimina o a p e eni el es és oxida i o p oducido po la CNY. El único documen o que desc ibe el empleo de composiciones con NAC en in oxicación de hepa oci os de a a con CYN (D5) no log a e i a los e ec os óxicos que la CYN p oduce. En consecuencia, se conside a que ningún documen o desc ibe ni sugie e el uso de una composición que con iene NAC pa a a a ni p e eni los e ec os óxicos que p oducen la cilind oespe mopsina (CYN) po lo que se conside a que odas las ei indicaciones de la solici ud cumplen el equisi o de no edad y de ac i idad in en i a. In o me del Es ado de la Técnica Página 4/4