Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico

ES 2 529 265 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Núme o de publicación: 2 529 265 Núme o de solici ud: 201300685 51 In . CI.: A01N 1/02 (2006.01) A61B 6/03 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Tí ulo: Moni o ización median e TAC de p ocesos de p ese ación en ío y c iop ese ación de ma e ial biológico 73 Ti ula /es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (100.0%) Pabellón de B asil, Pº de las Delicias s/n 41013 Se illa (Se illa) ES 72 In en o /es: CORRAL SOUSA , A iadna ; OLMO FERNÁNDEZ , Albe o ; BALCERZYK , Ma cin ; REGALADO LAMPREA , Da id ; COBOS SABATÉ , Joaquín y RISCO DELGADO , Ramón 22 Fecha de p esen ación: 18.07.2013 43 Fecha de publicación de la solici ud: 18.02.2015 Fecha de la concesión: 30.09.2015 45 Fecha de publicación de la concesión: 07.10.2015 56 Se emi e a la solici ud in e nacional: PCT/ES2014/000121 57 Resumen: La in ención obje o de la p esen e memo ia se e ie e al uso no edoso de la omog a ía axial compu a izada (TAC) pa a la moni o ización de p ocesos de p ese ación en ío y c iop ese ación de ma e ial biológico. El uso del TAC pe mi e mejo a signi ica i amen e dichos p ocesos debido a su capacidad de de ección de la concen ación de c iop o ec o en los p ocesos de c iop ese ación y de ección de la o mación de hielo en mues as biológicas. La p esen e in ención se enma ca den o del sec o de la in es igación o análisis de ma e iales po de e minación de sus p opiedades químicas o ísicas, y den o de és e, es de in e és an o en la conse ación con encional de alimen os, como en c iop ese ación de ma e ial biológico de odo ipo ( an o en congelación len a, i i icación ápida u o os). Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP. A iso: Moni o izacion median e TAG de p ocesos de p ese acion en io y c iop ese acion de ma e ial biolOgico 5 Obje o de la in encion La in encion obje o de la p esen e memo ia se e ie e al uso no edoso de la omog a ia axial compu a izada (TAG) pa a la moni o izacion de p ocesos de p ese acion en io y c iop ese acion de ma e ial biologic°. El uso del TAG pe mi e mejo a signi ica i amen e dichos p ocesos debido a su capacidad de 10 de ecci6n de la concen acion de c iop o ec o en los p ocesos de c iop ese acion y de ecci6n de la o med& de hielo en mues as biologicas. La p esen e in encion se enma ca den o del sec o de la in es igacion o analisis de ma e iales po de e minaci6n de sus p opiedades quimicas o isicas, y den o de es e, es de in e es an o en la conse aciOn con encional de alimen os, como 15 en c iop ese acion de ma e ial biologic° de odo ipo ( an o en congelacion len a, i i icaciOn apida u o os). Es ado de la ecnica El almacenamien o de ma e ial biologic° (celulas, ejidos, e c.) juega un papel 20 esencial den o de muchas pa celas de la ac i idad humana: ag icul u a (semillas) y ganade ia (semen), asplan es (piel, co neas, huesos, al ulas, O ganos), inje os, ejidos a i iciales, sang e, medicamen os, ma e ial ep oduc o en casos de in e ilidad, alimen os, e c. Las p incipales ecnicas empleadas pa a consegui la conse aciOn del ma e ial biologic° se basan en la u ilizacion de bajas 25 empe a u as pa a alen iza y de ene las eacciones quimicas esponsables del en ejecimien o y de e io o celula . El almacenamien o a la go plazo equie e de muy bajas empe a u as, ipicamen e en e -140°C y -180°C. La apa icion de hielo du an e la p ese acion y 30 c iop ese acion es un p oblema, ya sea in acelula , causando danos i epa ables en los dis in os o ganulos celula es, o ex a-celula , ompiendo y des- es uc u ando el ejido u 6 gano en cues iOn. Pa a e i a la o macion de hielo suelen u iliza se los agen es c iop o ec o es, aunque una concen acion ele ada de es os supone un p oblema igualmen e g a e pa a la supe i encia celula . 35 ES 2 529 265 A1  2 ES 2 529 265 B1 2 DESCRIPCIÓN En el caso de celulas aisladas, exis en dos ecnicas que consiguen la c iop ese acion de o ma sa is ac o ia: el en iamien o len o y la i i icacion. El en iamien o len o es has a aho a el p ocedimien o mas usado. Se basa en el con ol de la asa de en iamien o, y po an o del i mo de c ecimien o de hielo 5 ex acelula con el obje i o de c ea un delicado equilib io en e los dis in os ac o es que causan den° celula , en e los que se encuen an la o med& de hielo in acelula , ac u as y una excesi a deshid a aci6n de la celula. La i i icacion es un p oceso median e el cual un liquido se solidi ica en una ase no c is alina ( ase i ea) con un apido descenso de la empe a u a y un aumen o en 10 la iscosidad. La i i icacion elimina comple amen e la o maci6n de c is ales de hielo, mejo ando en g an medida los esul ados ob enidos po el en iamien o len o pa a de e minados ipos celula es di iciles de c iop ese a . En lo que se e ie e a la conse acion de ejidos y o ganos, los p incipios de 15 conse ed& en ilo son los mismos que los aplicables al caso de celulas aisladas. Sin emba go, aqui el p oblema es mucho mas complejo, debido sob e odo al mayo amano de la mues a, lo que di icul a la ans e encia de masa (c iop o ec o ) y calo ( io). 20 En 1957 se pe unde po p ime a ez un O gan° de mami e o con glice ol, en iado y p ese ado a -20°C, en un abajo publicado po Aud ey Smi h (A.Smi h, 1957) [1]. En es os expe imen os pione os un co azon de hams e ue pe undido con 2M de glice ol y expues o a -20°C. T as el ecalen amien o y la ado del c iop o ec o , algunas con acciones debiles podian ap ecia se en el 6 gano, pe o el 25 uncionamien o de es e es aba oda ia bas an e lejos del deseado. En el ano 1965, Fa an y Huggins /2/ ambos de mane a independien e, idea on un nue o camino hacia la c iop ese acion de o ganos que in oluc aba una ue e sup esion o incluso o al eliminacion de la o macion de hielo, sin la necesidad de 30 un en iamien o apid°. El me odo de Fa an consis ia en i aumen ando la concen acion del agen e c iop o ec o a la ez que en iando en mill iples pasos, de mane a que la mues a siemp e es u ie a sob e la cu e del pun o de usion del diag ama de ases e na io del sis ema DMSO-agua-NaCI. En sus expe imen os Fa an u ilizo ejido de musculo liso de a e ° de conejo. Las mues as ue on 35 almacenadas a -79°C u ilizando DMSO como agen e c iop o ec o . La adicion de las soluciones c iop o ec o as du an e el en iamien o y calen amien o ue on ES 2 529 265 A1  3 ES 2 529 265 B1 3 Ile adas a cabo po pasos. T as la ecupe acion de las mues as obse O que no solo se habia e i ado la o macion de hielo sino que se ob enia una uncionalidad del mOsculo mucho mayo que las en iadas po el me odo de en iamien o len o. 5 En 1970, en colabo acion con Fa an , el equipo de Mill Hill en Lond es, y Adem y Ha ness cons uye on el p ime equipo capaz de pe undi un O gan° en e o con un agen e c iop o ec o y elimina lo pos e io men e de una o ma adecuada y bien documen ada. Aim asi, pa a un sis ema e na io DMSO-agua-NaCI, el me odo de Fa an esul aba de di icil manejo expe imen al, debido al cuidado que se equie e 10 en el diag ama de ases, ya que las pe u baciones debidas al cambio de condiciones de con o no en concen acion y empe a u a pueden Ile a a una des iacion signi ica i e de la cu e del pun o de usion. No obs an e, el g upo del p o eso Da id E. Pegg en la Uni e sidad de Yo k ha 15 mejo ado es e me odo, ob eniendo un mejo con ol y es udiando las dis in as ole ancias a las que un o gan° puede p es a se an e un dano osmO ico debido al c iop o ec o . El abajo p esen ado po Pegg en 2006 (Pegg 2006) ( 3 , 4 , 5 ) ob u o excelen es esul ados en c iop ese aciOn de ca ilago con el me odo llamado Liquidus-T acking. El obje i o de es e e a segui ap opiadamen e la cu e de 20 liquid° del sis ema DMSO-agua-NaCI con un aumen o con inuo de la concen acion al mismo iempo que disminula la empe a u a. Es o ha conducido a un mejo en endimien o del concep ° de i i icaciOn de un o gan°, o p ese acion lib e de hielo en un es ado amo o. Pa a inc emen a la concen acion de c iop o ec o u ilizaba dos bombas (una pa a el medio iso onic° y o a pa a el 25 c iop o ec o ) conec adas a un in e cambiado de calo den o de la maquina de en iamien o. El p og ama de con ol es aba basado en expe imen os p e ios, donde e mopa es y un conduc i ime o e an empleados pa a medi la empe a u a y concen aciOn de c iop o ec o espec i amen e. En es os expe imen os el conduc i ime o media sOlo la concen acion del lujo de pe usion 30 esidual, y no la concen acion de c iop o ec o den o del ma e ial biologic°, lo cual supond ia una necesa ia y c ucial mejo a del me odo. Po o a pa e, en 1998 G ego y Fahy empezo a es udia co m ob ene mejo as en el con ol de la oxicidad de los c iop o ec o es y del p oceso de nucleacion y del 35 c ecimien o de c is ales de hielo. Sus es udios se basan en la ole ancia de las mues as de dis in as mezclas de c iop o ec o es pe undidas a dis in as ES 2 529 265 A1  4 ES 2 529 265 B1 4 empe a u as, siemp e p obando la oxicidad en i iones de conejo. Una de sus soluciones i i ican es con mejo es esul ados es la denominada M22, donde el n ame o hace e e encia a la con eniencia de incuba los i iones con es a solucion a -22°C (Fahy e a l , 2004) [ 6 ] . En un ecien e abajo (Fahy e a l . 2009) [7], Fahy 5 p esen o los esul ados de un ill& de conejo i i icado que ue pos e io men e asplan ado sin p esen a echazo alguno y con e idencias de uncionalidad. En cualquie caso, ya sea con la u ilizacion de los c iop o ec o es p esen ados po Fahy, con el me odo de Liquidus-T acking de Pegg, o como pa e de o os 10 p o ocolos de c iop ese acion, conoce la concen acion de c iop o ec o du an e el p oceso de en iamien o es muy impo an e, ya que nos p opo ciona in o maciOn undamen al pa a op imiza dichos p o ocolos, ajus ando los iempos de pe usion y minimizando de es a o ma an o la oxicidad causada pa el c iop o ec o coma la posibilidad de o maciOn de hielo. De igual o ma, ob ene in o macion ace ca de 15 la e en ual o macion de hielo en el o gan° es undamen al, al se los danos p oducidos pa es e uno de los mayo es p oblemas a soluciona pa a consegui la co ec a c iop ese acion (Pegg 2006) [ 3 , 4 , 5 ] . Di e en es me odos han sido desa ollados con el in de pode moni o iza la 20 concen acion de c iop o ec o jun o a la empe a u a. D . Pegg, en su abajo de c iop ese acion de ca ilago, comenzo midiendo la concen acion de c iop o ec o basdndose en el abajo de El o d de 1969 /8/ que mues a que cuando una pieza de ejido es sume gida en una solucion de c iop o ec o , los iempos de cambio de peso sume gido pueden se usados pa a moni o iza el p oceso de pe meacion de 25 c iop o ec o en el ejido. En 2007, D . Pegg (Pegg 2007) [ 9 ] mejo o su medida de c iop o ec o median e olume ia y c oma og a ia. Pa a de e mina el con enido de agua us6 la eaccion de Ka l Fische (KF). Colocaba el ejido en un exceso de eac i o KF y, una ez 30 que oda el agua habia eaccionado, el exceso e a alo ado con una solucion conocida de agua en me anol. Cada dia es anda izaba el sis ema anadiendo una can idad conocida de agua, sob e 10 mg, al mismo olumen de eac i o de KF. El con enido de DMSO se media median e HPLC (High P essu e Liquid C oma og aphy). Los da os e an exp esados en e minos del peso de ejido y la 35 concen acion del CPA enia dada po la siguien e o mula: ES 2 529 265 A1  5 ES 2 529 265 B1 5 p e s o . no m a l i z a d o . M e 2 S 0 x 1 00 p e s o . no m a l i z a d o . a g u a + p e s o . n o m a l i z a d o . M e 2 S 0 % w / w 5 Fulle (Fulle , Busza and P oc o 1989) 1 1 0 ] u ilizO ecnicas de esonancia nuclea magne ica (NMR) pa a la medida de concen acion de c iop o ec o en higado de a a y Taylo y Busza (1992) (11] pa a la medida en co nea. Poco despues, en 1994, Ba eson ( 1 2 ) y su g upo usa on el NMR pa a medi la concen acion de DMSO al pene a en la a e ia ca O ida de un conejo. 10 Es e me odo ha sido ambien u ilizado con o os c iop o ec o es, po ejemplo po Po-Wah y Fulle en 2001 (Fulle , Takahashi and Hu ell 2001) 1 1 3 ] pa a de e mina la di usion de solu os en higado de a a du an e almacenamien o hipo e mico (his idina y ca nosina). Los p o ones a oma icos de la his idina y las ecuencias de 15 esonancia del g upo his idilo de la ca nosina e an obse ados en el espec o. La in eg acion de las esonancias pe mi ia es ablece la can idad de solu o p esen e en la mues a, aunque el p incipal incon enien e del NMR p o Onico es a en su ela i amen e baja p ecision, ya que los e o es son del mismo o den de magni ud que las medidas. 20 Los me odos an e io men e desc i os sOlo dan una idea global sob e la can idad de c iop o ec o que ha en ado en la mues a, pe o no dan ninguna in o maciOn sob e la dis ibucion de es e c iop o ec o den o del ejido. Es a in o macion es undamen al, pues o que pod ia habe egiones del ejido ca gadas con un exceso 25 de c iop o ec o , mien as que o as pod ian es a ca gadas con una concen acion insu icien e. Po an o, ninguno de es os me odos desc i os has a aho a alcanza la p ecision necesa ia pa a un con ol de la concen aciOn del c iop o ec o eque ido pa a una i i icacion con exi °. El p oceso de la e en ual o macion de hielo ampoco ha sido medido has a aho a con p ecision en el in e io de O ganos, 30 educiendose es a medida a inspecciones isuales a pos e io i y poco cuan i a i as. D O CU M E N T O S R E L E V A N T E S 35 [ 1 ] A . U . S m i h , P o c e e d i n g s o h e R o y a l S o c i e y S e i e s B 1 4 7 (1 9 5 7 ) 533 - 5 44 . ES 2 529 265 A1  6 ES 2 529 265 B1 6 [ 2 ] J . F a a n , N a u e 205 ( 1 9 6 5 ) 1 28 4 - 1 28 7 . [ 3 ] D . E . P e gg , M . C . W u s e m a n , L . W a n g , C y o b i o l o g y 52 ( 20 0 6 ) 3 35 - 3 4 6 . [ 4 ] D . E . P e gg e a l , C y ob i o l o gy 5 2 ( 2 0 0 6 ) 3 4 7 - 3 59 . [ 5 ] D . E . P e gg , L . W a n g , D . V a u g h a n , C y o b i o l o gy 5 2 ( 200 6 ) 36 0 - 3 6 8 . 5 [ 6 ] G . M . F a h y e a l , C y ob i o l o g y 4 8 ( 2 00 4 ) 1 5 7 . [ 7 ] G . M . F ah y e a l , O g a n o g O n e s i s 5 : 3 ( 20 0 9 ) 1 6 7 - 1 7 5 . [ 8 ] B . C . E l o d e a l , N a u e N e w B i o l o g y 236 ( 1 9 7 2 ) 5 8 . [ 9 ] D . E . P e gg e a l , C y ob i o l o g y ( 200 7 ) 55 : 1 38 - 1 4 7 . 10 [ 1 0 ] B . J . F u ll e , A . L . B u s za a n d E . P o c o , C y o b i o l o gy 2 6 ( 1 98 9 ) 1 1 2 . [ 1 1 ] M . J . T a y l o a n d A . L . B u sz a , C y o - Le . 1 3 ( 1 99 2 ) 2 7 3 . [ 1 2 ] E . A . B a e s o n e a l , C y o b i o l o gy 3 1 , ( 1 994 ) 3 9 3 . [ 1 3 ] P . W a h a n d B . J . F u ll e , C y ob i o l o g y 4 2 ( 200 1) 30 7 - 3 1 3 . 15 [ 1 4 ] N a i o n a l I n s i u e o S a n d a d s a n d T e c h n o l o g y : h p://physics.nis .00 /PhysRe Da a/Xcom/h ml/xcoml.h ml 20 Desc ipcion del con enido de las igu as Figu a 1. En es a g a ica se mues a la a enuaci6n de masa (cm2/g) en el eje de o denadas pa a una soluciOn 50% / de DMSO en PBS debido a los di e en es ipo de sca e ing (Fo oelec ico, Rayleigh y Comp on) y debido a la suma de 25 odos los e ec os (To al), en unci6n de la ene gia u ilizada en KeV(eje de abscisas). En el caso de la ene gia ca ac e is ica de nues os expe imen os, en omb a 20 KeV, la p ime a cu a (de mayo coe icien e de a enuacion de masa) co esponde al o al de odos los e ec os, muy seguido del sca e ing co espondien e al e ec o o oelec ico, siendo es e el e ec o con mas ele ancia 30 en el caso de las ene gias u ilizadas en nues o TAC. Figu a 2. Rep esen aci6n en escala loga i mica (Figu a 2 a) y en escala lineal (Figu a 2 b) de la a enuaciOn de nnasa (cm2/g) espec o a la ene gia (KeV) pa a dis in as soluciones: 5% / y 70% / de DMSO en PBS, 5% / y 70% / de 35 Glice ol en PBS, 5% / y 70% / de E ilenglicol en PBS, y agua pu a (H20). En el ango de ene gias co espondien e a nues os expe imen os, en omb a 20 KeV,  ES 2 529 265 B1 7 se obse a una mayo a enuaci6n de masas pa a el caso de la solucion 70% / de DMSO, seguida de la solucion 5% / de DMSO. Pa a el es o de las soluciones la a enuacion es del mismo o den que la a enuaci6n de masa debido a H20. Ambas g a icas mues an la in luencia del a om° de azu e del DMSO en la 5 a enuacion de los ayos X. Las cu as pa a el glice ol 5% y el e ilenglicol 5% se solapan. Tambien las cu as pa a el glice ol 70% y el e ilenglicol 70% se solapan. Po ello esul an di iciles de dis ingui en la igu a. Figu a 3. Valo es de TAO en unidades Hounse ields (HU) ob enidos pa a las 10 siguien es soluciones, de izquie da a de echa: PBS, 2, 4, 6 y 8 M de DMSO en PBS. El eje x ep esen a la dis ancia en mm del co e a lo la go del eje z de la camilla del TAC donde es an dispues as las mues as. La g a ica mues a unos alo es de TAO c ecien es pa a mayo es concen aciones de DMSO. 15 Figu a 4. Valo es de TAO (HU) ob enidos pa a soluciones, de de echa a izquie da, de PBS, 1, 3, 5 y 7 M de DMSO en PBS. El eje x mues a la dis ancia en mm del cone a lo la go del eje z de la cannilla del TAO donde es an colocadas las mues as. La g a ica uel e a mos a alo es de TAC mas ele ados pa a mayo es concen aciones de c iop o ec o (DMSO). 20 Figu a 5. Rep esen acion del n° de pixeles (es e as de 2 cm de diame o) que ienen el mismo alo de TAO (eje de o denadas) pa a cada una de las concen aciones PBS, 10% / , 20% / ... has a 80% / de DMSO en PBS. El eje de abscisas mues a el alo de TAO pa a las dis in as soluciones desde la cu a 25 de PBS (meno alo de TAO) has a la de 80% / DMSO (mayo alo de TAO). Es a g a ica mues a ade nas la dispe sion de los da os, siendo mayo en las soluciones de mayo concen acion de c iop o ec o (cu a de mas anchu a). Figu a 6. Rep esen aciOn del nume o de pixeles (es e as de 2 cm de diame o) 30 que ienen el mismo alo de TAO pa a es soluciones dis in as de PBS. La g a ica mues a como pa a la misma soluciOn las cu as ienen la misma o ma y se man ienen en e los mismos alo es de TAO, e lejando la ep oducibilidad del TAO como me odo de medida. Figu a 7. Rep esen acion de la cu a de calib acian que elaciona la 35 concen acion de DMSO (M) en e al alo de TAO calculada a pa i de los esul ados de los expe imen os p e ios ( igu a 3 y igu a 4). La g a ica mues a una  ES 2 529 265 B1 8 linealidad en e la concen acion del c iop o ec o y las se iales ob enidas en el TAC con un coe icien e de co elaciOn de = 0,990. Es a cu a pe mi e calcula la concen aciOn de c iop o ec o pa a cualquie mues a de concen aci6n desconocida a pa i de una medida de TAC sob e la mues a con los 5 co espondien es alo es de TAC ob enidos en la medida. Desc ipcion de la in encion Se ha desa ollado un sis ema basado en la omog a ia axial compu a izada (TAC) pa a la de eccion de hielo den o del ma e ial biologic°, asi como pa a la medida de la concen acion de c iop o ec o pe undido en los p ocesos de 10 c iop ese aciOn en iempo eal. Con encionalmen e la omog a a axial compu e izada es una ecnica de imagen medica que u iliza adiaci6n X pa a ob ene p oyecciones o secciones de obje os ana Omicos con ines diagnOs icos. Los ayos X son la adiaciOn del espec o 15 elec omagne ic° comp endido en el ango ap oximado de 3x1016 Hz a 3x1019 Hz (i.e., ene gias de en e 120 eV y 120 keV). A pa i de 12 keV la capacidad de pene acion de es a adiacian los hacen adecuados pa a el es udio de ejidos i os. El TAC es a basado en la medida de la pe dida de in ensidad de ayos X a a es de dis in as di ecciones en el obje o, lo que pe mi e econs ui el ac o de 20 a enuaci6n idimensionalmen e en odo el olumen a pa i de ecnicas de econs uccion. Dicho ac o de a enuaciOn pe mi e disce ni que ipo de ma e ial exis e en cada pun o. Las sena es del TAC e lejan la a enuaciOn de las sus ancias y se exp esan en unidades Hounse ields (HU). Se oma como e e encia la densidad del agua o alo de TAC, ob eniendo cada pixel un alo de e minado 25 (HU) que se co esponde con un colo en la escala de g ises (de blanco a neg o),. El uso no edoso del TAG pa a la ca ac e izaciOn de la concen aci6n de c iop o ec o y de eccion de hielo den ° de ma e ial biologic° se desc ibe a con inuacion. Cuando un haz de ayos X incide en un obje o, a una dis ancia d, la 30 in ensidad del haz se ha educido de la mane a: I = lo exp(- p = lo exID(- (pip) p d), donde lo es la in ensidad del haz a la en ada, p es una ca ac e is ica del ma e ial denominada a enuacion, y p es la densidad (masica) del ma e ial. La cons an e 35 p/p se denomina a enuaci6n de masa del ma e ial. Es a a enuacion puede debe se  ES 2 529 265 B1 9  ES 2 529 265 B1 16  ES 2 529 265 B1 17  ES 2 529 265 B1 18  ES 2 529 265 B1 19