Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico

ES 2 529 265 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 529 265 Número de solicitud: 201300685 51 Int. CI.: A01N 1/02 (2006.01) A61B 6/03 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (100.0%) Pabellón de Brasil, Pº de las Delicias s/n 41013 Sevilla (Sevilla) ES 72 Inventor/es: CORRAL SOUSA , Ariadna ; OLMO FERNÁNDEZ , Alberto ; BALCERZYK , Marcin ; REGALADO LAMPREA , David ; COBOS SABATÉ , Joaquín y RISCO DELGADO , Ramón 22 Fecha de presentación: 18.07.2013 43 Fecha de publicación de la solicitud: 18.02.2015 Fecha de la concesión: 30.09.2015 45 Fecha de publicación de la concesión: 07.10.2015 56 Se remite a la solicitud internacional: PCT/ES2014/000121 57 Resumen: La invención objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomografía axial computarizada (TAC) para la monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico. El uso del TAC permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de detección de la concentración de crioprotector en los procesos de criopreservación y detección de la formación de hielo en muestras biológicas. La presente invención se enmarca dentro del sector de la investigación o análisis de materiales por determinación de sus propiedades químicas o físicas, y dentro de éste, es de interés tanto en la conservación convencional de alimentos, como en criopreservación de material biológico de todo tipo (tanto en congelación lenta, vitrificación rápida u otros). Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: Monitorizacion mediante TAG de procesos de preservacion en frio y criopreservacion de material biolOgico 5 Objeto de la invencion La invencion objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomografia axial computarizada (TAG) para la monitorizacion de procesos de preservacion en frio y criopreservacion de material biologic°. El uso del TAG permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de 10 detecci6n de la concentracion de crioprotector en los procesos de criopreservacion y detecci6n de la formed& de hielo en muestras biologicas. La presente invencion se enmarca dentro del sector de la investigacion o analisis de materiales por determinaci6n de sus propiedades quimicas o fisicas, y dentro de este, es de interes tanto en la conservaciOn convencional de alimentos, como 15 en criopreservacion de material biologic° de todo tipo (tanto en congelacion lenta, vitrificaciOn rapida u otros). Estado de la tecnica El almacenamiento de material biologic° (celulas, tejidos, etc.) juega un papel 20 esencial dentro de muchas parcelas de la actividad humana: agricultura (semillas) y ganaderia (semen), trasplantes (piel, corneas, huesos, valvulas, Organos), injertos, tejidos artificiales, sangre, medicamentos, material reproductor en casos de infertilidad, alimentos, etc. Las principales tecnicas empleadas para conseguir la conservaciOn del material biologic° se basan en la utilizacion de bajas 25 temperaturas para ralentizar y detener las reacciones quimicas responsables del envejecimiento y deterioro celular. El almacenamiento a largo plazo requiere de muy bajas temperaturas, tipicamente entre -140°C y -180°C. La aparicion de hielo durante la preservacion y 30 criopreservacion es un problema, ya sea intracelular, causando danos irreparables en los distintos organulos celulares, o extra-celular, rompiendo y desestructurando el tejido u 6rgano en cuestiOn. Para evitar la formacion de hielo suelen utilizarse los agentes crioprotectores, aunque una concentracion elevada de estos supone un problema igualmente grave para la supervivencia celular. 35 ES 2 529 265 A1  2 ES 2 529 265 B1 2 DESCRIPCIÓN En el caso de celulas aisladas, existen dos tecnicas que consiguen la criopreservacion de forma satisfactoria: el enfriamiento lento y la vitrificacion. El enfriamiento lento es hasta ahora el procedimiento mas usado. Se basa en el control de la tasa de enfriamiento, y por tanto del ritmo de crecimiento de hielo 5 extracelular con el objetivo de crear un delicado equilibrio entre los distintos factores que causan den° celular, entre los que se encuentran la formed& de hielo intracelular, fracturas y una excesiva deshidrataci6n de la celula. La vitrificacion es un proceso mediante el cual un liquido se solidifica en una fase no cristalina (fase vitrea) con un rapido descenso de la temperatura y un aumento en 10 la viscosidad. La vitrificacion elimina completamente la formaci6n de cristales de hielo, mejorando en gran medida los resultados obtenidos por el enfriamiento lento para determinados tipos celulares dificiles de criopreservar. En lo que se refiere a la conservacion de tejidos y organos, los principios de 15 conserved& en filo son los mismos que los aplicables al caso de celulas aisladas. Sin embargo, aqui el problema es mucho mas complejo, debido sobre todo al mayor tamano de la muestra, lo que dificulta la transferencia de masa (crioprotector) y calor (frio). 20 En 1957 se perfunde por primera vez un Organ° de mamifero con glicerol, enfriado y preservado a -20°C, en un trabajo publicado por Audrey Smith (A.Smith, 1957) [1]. En estos experimentos pioneros un corazon de hamster fue perfundido con 2M de glicerol y expuesto a -20°C. Tras el recalentamiento y lavado del crioprotector, algunas contracciones debiles podian apreciarse en el 6rgano, pero el 25 funcionamiento de este estaba todavia bastante lejos del deseado. En el ano 1965, Farrant y Huggins /2/ ambos de manera independiente, idearon un nuevo camino hacia la criopreservacion de organos que involucraba una fuerte supresion o incluso total eliminacion de la formacion de hielo, sin la necesidad de 30 un enfriamiento rapid°. El metodo de Farrant consistia en ir aumentando la concentracion del agente crioprotector a la vez que enfriando en milltiples pasos, de manera que la muestra siempre estuviera sobre la curve del punto de fusion del diagrama de fases ternario del sistema DMSO-agua-NaCI. En sus experimentos Farrant utilizo tejido de musculo liso de tater° de conejo. Las muestras fueron 35 almacenadas a -79°C utilizando DMSO como agente crioprotector. La adicion de las soluciones crioprotectoras durante el enfriamiento y calentamiento fueron ES 2 529 265 A1  3 ES 2 529 265 B1 3 Ilevadas a cabo por pasos. Tras la recuperacion de las muestras observO que no solo se habia evitado la formacion de hielo sino que se obtenia una funcionalidad del mOsculo mucho mayor que las enfriadas por el metodo de enfriamiento lento. 5 En 1970, en colaboracion con Farrant, el equipo de Mill Hill en Londres, y Adem y Harness construyeron el primer equipo capaz de perfundir un Organ° entero con un agente crioprotector y eliminarlo posteriormente de una forma adecuada y bien documentada. Aim asi, para un sistema ternario DMSO-agua-NaCI, el metodo de Farrant resultaba de dificil manejo experimental, debido al cuidado que se requiere 10 en el diagrama de fases, ya que las perturbaciones debidas al cambio de condiciones de contorno en concentracion y temperatura pueden Ilevar a una desviacion significative de la curve del punto de fusion. No obstante, el grupo del profesor David E. Pegg en la Universidad de York ha 15 mejorado este metodo, obteniendo un mejor control y estudiando las distintas tolerancias a las que un organ° puede prestarse ante un dano osmOtico debido al crioprotector. El trabajo presentado por Pegg en 2006 (Pegg 2006) ( 3 , 4 , 5 ) obtuvo excelentes resultados en criopreservaciOn de cartilago con el metodo llamado Liquidus-Tracking. El objetivo de este era seguir apropiadamente la curve de 20 liquid° del sistema DMSO-agua-NaCI con un aumento continuo de la concentracion al mismo tiempo que disminula la temperatura. Esto ha conducido a un mejor entendimiento del concept° de vitrificaciOn de un organ°, o preservacion libre de hielo en un estado amorfo. Para incrementar la concentracion de crioprotector utilizaba dos bombas (una para el medio isotonic° y otra para el 25 crioprotector) conectadas a un intercambiador de calor dentro de la maquina de enfriamiento. El programa de control estaba basado en experimentos previos, donde termopares y un conductivimetro eran empleados para medir la temperatura y concentraciOn de crioprotector respectivamente. En estos experimentos el conductivimetro media sOlo la concentracion del flujo de perfusion 30 residual, y no la concentracion de crioprotector dentro del material biologic°, lo cual supondria una necesaria y crucial mejora del metodo. Por otra parte, en 1998 Gregory Fahy empezo a estudiar corm obtener mejoras en el control de la toxicidad de los crioprotectores y del proceso de nucleacion y del 35 crecimiento de cristales de hielo. Sus estudios se basan en la tolerancia de las muestras de distintas mezclas de crioprotectores perfundidas a distintas ES 2 529 265 A1  4 ES 2 529 265 B1 4 temperaturas, siempre probando la toxicidad en rifiones de conejo. Una de sus soluciones vitrificantes con mejores resultados es la denominada M22, donde el ntamero hace referencia a la conveniencia de incubar los ritiones con esta solucion a -22°C (Fahy e t a l , 2004) [ 6 ] . En un reciente trabajo (Fahy e t a l . 2009) [7], Fahy 5 presento los resultados de un rill& de conejo vitrificado que fue posteriormente trasplantado sin presentar rechazo alguno y con evidencias de funcionalidad. En cualquier caso, ya sea con la utilizacion de los crioprotectores presentados por Fahy, con el metodo de Liquidus-Tracking de Pegg, o como parte de otros 10 protocolos de criopreservacion, conocer la concentracion de crioprotector durante el proceso de enfriamiento es muy importante, ya que nos proporciona informaciOn fundamental para optimizar dichos protocolos, ajustando los tiempos de perfusion y minimizando de esta forma tanto la toxicidad causada par el crioprotector coma la posibilidad de formaciOn de hielo. De igual forma, obtener informacion acerca de 15 la eventual formacion de hielo en el organ° es fundamental, al ser los danos producidos par este uno de los mayores problemas a solucionar para conseguir la correcta criopreservacion (Pegg 2006) [ 3 , 4 , 5 ] . Diferentes metodos han sido desarrollados con el fin de poder monitorizar la 20 concentracion de crioprotector junto a la temperatura. Dr. Pegg, en su trabajo de criopreservacion de cartilago, comenzo midiendo la concentracion de crioprotector basdndose en el trabajo de Elford de 1969 /8/ que muestra que cuando una pieza de tejido es sumergida en una solucion de crioprotector, los tiempos de cambio de peso sumergido pueden ser usados para monitorizar el proceso de permeacion de 25 crioprotector en el tejido. En 2007, Dr. Pegg (Pegg 2007) [ 9 ] mejoro su medida de crioprotector mediante volumetria y cromatografia. Para determinar el contenido de agua us6 la reaccion de Karl Fischer (KF). Colocaba el tejido en un exceso de reactivo KF y, una vez 30 que toda el agua habia reaccionado, el exceso era valorado con una solucion conocida de agua en metanol. Cada dia estandarizaba el sistema anadiendo una cantidad conocida de agua, sobre 10 mg, al mismo volumen de reactivo de KF. El contenido de DMSO se media mediante HPLC (High Pressure Liquid Cromatography). Los datos eran expresados en terminos del peso de tejido y la 35 concentracion del CPA venia dada por la siguiente formula: ES 2 529 265 A1  5 ES 2 529 265 B1 5 p e s o . no r m a l i z a d o . M e 2 S 0 x 1 00 p e s o . no r m a l i z a d o . a g u a + p e s o . n o r m a l i z a d o . M e 2 S 0 % w / w 5 Fuller (Fuller, Busza and Proctor 1989) 1 1 0 ] utilizO tecnicas de resonancia nuclear magnetica (NMR) para la medida de concentracion de crioprotector en higado de rata y Taylor y Busza (1992) (11] para la medida en cornea. Poco despues, en 1994, Bateson ( 1 2 ) y su grupo usaron el NMR para medir la concentracion de DMSO al penetrar en la arteria carOtida de un conejo. 10 Este metodo ha sido tambien utilizado con otros crioprotectores, por ejemplo por Po-Wah y Fuller en 2001 (Fuller, Takahashi and Hurrell 2001) 1 1 3 ] para determinar la difusion de solutos en higado de rata durante almacenamiento hipotermico (histidina y carnosina). Los protones aromaticos de la histidina y las frecuencias de 15 resonancia del grupo histidilo de la carnosina eran observados en el espectro. La integracion de las resonancias permitia establecer la cantidad de soluto presente en la muestra, aunque el principal inconveniente del NMR protOnico esta en su relativamente baja precision, ya que los errores son del mismo orden de magnitud que las medidas. 20 Los metodos anteriormente descritos sOlo dan una idea global sobre la cantidad de crioprotector que ha entrado en la muestra, pero no dan ninguna informaciOn sobre la distribucion de este crioprotector dentro del tejido. Esta informacion es fundamental, puesto que podria haber regiones del tejido cargadas con un exceso 25 de crioprotector, mientras que otras podrian estar cargadas con una concentracion insuficiente. Por tanto, ninguno de estos metodos descritos hasta ahora alcanza la precision necesaria para un control de la concentraciOn del crioprotector requerido para una vitrificacion con exit°. El proceso de la eventual formacion de hielo tampoco ha sido medido hasta ahora con precision en el interior de Organos, 30 reduciendose esta medida a inspecciones visuales a posteriori y poco cuantitativas. D O CU M E N T O S R E L E V A N T E S 35 [ 1 ] A . U . S m i t h , P r o c e e d i n g s o f t h e R o y a l S o c i e t y S e r i e s B 1 4 7 (1 9 5 7 ) 533 - 5 44 . ES 2 529 265 A1  6 ES 2 529 265 B1 6 [ 2 ] J . F a rr a n t , N a t u r e 205 ( 1 9 6 5 ) 1 28 4 - 1 28 7 . [ 3 ] D . E . P e gg , M . C . W u s t e m a n , L . W a n g , C r y o b i o l o g y 52 ( 20 0 6 ) 3 35 - 3 4 6 . [ 4 ] D . E . P e gg e t a l , C r y ob i o l o gy 5 2 ( 2 0 0 6 ) 3 4 7 - 3 59 . [ 5 ] D . E . P e gg , L . W a n g , D . V a u g h a n , C r y o b i o l o gy 5 2 ( 200 6 ) 36 0 - 3 6 8 . 5 [ 6 ] G . M . F a h y e t a l , C r y ob i o l o g y 4 8 ( 2 00 4 ) 1 5 7 . [ 7 ] G . M . F ah y e t a l , O r g a n o g O n e s i s 5 : 3 ( 20 0 9 ) 1 6 7 - 1 7 5 . [ 8 ] B . C . E l f o r d e t a l , N a t u r e N e w B i o l o g y 236 ( 1 9 7 2 ) 5 8 . [ 9 ] D . E . P e gg e t a l , C r y ob i o l o g y ( 200 7 ) 55 : 1 38 - 1 4 7 . 10 [ 1 0 ] B . J . F u ll e r , A . L . B u s za a n d E . P r o c t o r , C r y o b i o l o gy 2 6 ( 1 98 9 ) 1 1 2 . [ 1 1 ] M . J . T a y l o r a n d A . L . B u sz a , C r y o - Le t t . 1 3 ( 1 99 2 ) 2 7 3 . [ 1 2 ] E . A . B a t e s o n e t a l , C r y o b i o l o gy 3 1 , ( 1 994 ) 3 9 3 . [ 1 3 ] P . W a h a n d B . J . F u ll e r , C r y ob i o l o g y 4 2 ( 200 1) 30 7 - 3 1 3 . 15 [ 1 4 ] N a t i o n a l I n s t i t u t e o f S t a n d a r d s a n d T e c h n o l o g y : http://physics.nist.00v/PhysRefData/Xcom/html/xcoml.html 20 Descripcion del contenido de las figuras Figura 1. En esta grafica se muestra la atenuaci6n de masa (cm2/g) en el eje de ordenadas para una soluciOn 50% v/v de DMSO en PBS debido a los diferentes tipo de scattering (Fotoelectrico, Rayleigh y Compton) y debido a la suma de 25 todos los efectos (Total), en funci6n de la energia utilizada en KeV(eje de abscisas). En el caso de la energia caracteristica de nuestros experimentos, en tomb a 20 KeV, la primera curva (de mayor coeficiente de atenuacion de masa) corresponde al total de todos los efectos, muy seguido del scattering correspondiente al efecto fotoelectrico, siendo este el efecto con mas relevancia 30 en el caso de las energias utilizadas en nuestro TAC. Figura 2. Representaci6n en escala logaritmica (Figura 2 a) y en escala lineal (Figura 2 b) de la atenuaciOn de nnasa (cm2/g) respecto a la energia (KeV) para distintas soluciones: 5% v/v y 70% v/v de DMSO en PBS, 5% v/v y 70% v/v de 35 Glicerol en PBS, 5% v/v y 70% v/v de Etilenglicol en PBS, y agua pura (H20). En el rango de energias correspondiente a nuestros experimentos, en tomb a 20 KeV,  ES 2 529 265 B1 7 se observa una mayor atenuaci6n de masas para el caso de la solucion 70% v/v de DMSO, seguida de la solucion 5% v/v de DMSO. Para el resto de las soluciones la atenuacion es del mismo orden que la atenuaci6n de masa debido at H20. Ambas graficas muestran la influencia del atom° de azufre del DMSO en la 5 atenuacion de los rayos X. Las curvas para el glicerol 5% y el etilenglicol 5% se solapan. Tambien las curvas para el glicerol 70% y el etilenglicol 70% se solapan. Por ello resultan dificiles de distinguir en la figura. Figura 3. Valores de TAO en unidades Hounsefields (HU) obtenidos para las 10 siguientes soluciones, de izquierda a derecha: PBS, 2, 4, 6 y 8 M de DMSO en PBS. El eje x representa la distancia en mm del corte a lo largo del eje z de la camilla del TAC donde estan dispuestas las muestras. La grafica muestra unos valores de TAO crecientes para mayores concentraciones de DMSO. 15 Figura 4. Valores de TAO (HU) obtenidos para soluciones, de derecha a izquierda, de PBS, 1, 3, 5 y 7 M de DMSO en PBS. El eje x muestra la distancia en mm del cone a lo largo del eje z de la cannilla del TAO donde estan colocadas las muestras. La grafica vuelve a mostrar valores de TAC mas elevados para mayores concentraciones de crioprotector (DMSO). 20 Figura 5. Representacion del n° de pixeles (esferas de 2 cm de diametro) que tienen el mismo valor de TAO (eje de ordenadas) para cada una de las concentraciones PBS, 10% v/v, 20%v/v... hasta 80%v/v de DMSO en PBS. El eje de abscisas muestra el valor de TAO para las distintas soluciones desde la curva 25 de PBS (menor valor de TAO) hasta la de 80%v/v DMSO (mayor valor de TAO). Esta grafica muestra adernas la dispersion de los datos, siendo mayor en las soluciones de mayor concentracion de crioprotector (curva de mas anchura). Figura 6. RepresentaciOn del numero de pixeles (esferas de 2 cm de diametro) 30 que tienen el mismo valor de TAO para tres soluciones distintas de PBS. La grafica muestra como para la misma soluciOn las curvas tienen la misma forma y se mantienen entre los mismos valores de TAO, reflejando la reproducibilidad del TAO como metodo de medida. Figura 7. Representacion de la curva de calibracian que relaciona la 35 concentracion de DMSO (M) frente al valor de TAO calculada a partir de los resultados de los experimentos previos (figura 3 y figura 4). La grafica muestra una  ES 2 529 265 B1 8 linealidad entre la concentracion del crioprotector y las sefiales obtenidas en el TAC con un coeficiente de correlaciOn de r = 0,990. Esta curva permite calcular la concentraciOn de crioprotector para cualquier muestra de concentraci6n desconocida a partir de una medida de TAC sobre la muestra con los 5 correspondientes valores de TAC obtenidos en la medida. Descripcion de la invencion Se ha desarrollado un sistema basado en la tomografia axial computarizada (TAC) para la deteccion de hielo dentro del material biologic°, asi como para la medida de la concentracion de crioprotector perfundido en los procesos de 10 criopreservaciOn en tiempo real. Convencionalmente la tomograffa axial computerizada es una tecnica de imagen medica que utiliza radiaci6n X para obtener proyecciones o secciones de objetos anatOmicos con fines diagnOsticos. Los rayos X son la radiaciOn del espectro 15 electromagnetic° comprendido en el rango aproximado de 3x1016 Hz a 3x1019 Hz (i.e., energias de entre 120 eV y 120 keV). A partir de 12 keV la capacidad de penetracion de esta radiacian los hacen adecuados para el estudio de tejidos vivos. El TAC esta basado en la medida de la perdida de intensidad de rayos X a traves de distintas direcciones en el objeto, lo que permite reconstruir el factor de 20 atenuaci6n tridimensionalmente en todo el volumen a partir de tecnicas de reconstruccion. Dicho factor de atenuaciOn permite discernir que tipo de material existe en cada punto. Las senates del TAC reflejan la atenuaciOn de las sustancias y se expresan en unidades Hounsefields (HU). Se toma como referencia la densidad del agua o valor de TAC, obteniendo cada pixel un valor determinado 25 (HU) que se corresponde con un color en la escala de grises (de blanco a negro),. El uso novedoso del TAG para la caracterizaciOn de la concentraci6n de crioprotector y deteccion de hielo dent° de material biologic° se describe a continuacion. Cuando un haz de rayos X incide en un objeto, a una distancia d, la 30 intensidad del haz se ha reducido de la manera: I = lo exp(- p = lo exID(- (pip) p d), donde lo es la intensidad del haz a la entrada, p es una caracteristica del material denominada atenuacion, y p es la densidad (masica) del material. La constante 35 p/p se denomina atenuaci6n de masa del material. Esta atenuacion puede deberse  ES 2 529 265 B1 9  ES 2 529 265 B1 16  ES 2 529 265 B1 17  ES 2 529 265 B1 18  ES 2 529 265 B1 19