Lipasa Lipbl y sus aplicaciones

ES 2 389 103 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 389 103 Número de solicitud: 201031636 51 Int. CI.: C12N 9/16 (2006.01) C12P 19/00 (2006.01) (2006.01) C12N 11/02 (2006.01) C07H 13/04 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: LIPASA LIPBL Y SUS APLICACIONES. 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA PABELLÓN DE BRASIL, PASEO DE LAS DELICIAS S/N 41013 SEVILLA (Sevilla) ES y CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) 72 Inventor/es: PÉREZ GÓMEZ, Dolores; VENTOSA UCERO, Antonio; MELLADO DURÁN, Encarnación; GUISAN SEIJAS, José Manuel; FERNÁNDEZ LORENTE, Gloria y FILICE, Marco 74 Agente/Representante: TEMIÑO CENICEROS, Ignacio 22 Fecha de presentación: 08.11.2010 43 Fecha de publicación de la solicitud: 23.10.2012 Fecha de la concesión: 03.09.2013 45 Fecha de publicación de la concesión: 13.09.2013 57 Resumen: Lipasa LipBL y sus aplicaciones. La presente invención se refiere al uso de la lipasa LipBL para la hidrólisis de distintos sustratos seleccionados de entre p-nitrofenoles, tributirina, Tween 80, aceites, sustratos quirales y proquirales, aceite de pescado, azúcares paracetilados o nitrocefin y a un procedimiento enzimático de monodesprotección regioselectiva de azúcares paracetilados para la obtención de azúcares monodesacteilados. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: LIPASA LIPBL Y SUS APLICACIONES CAMPO DE LA INVENCION La presente invencion se encuadra de forma general en el campo de la microbiologfa enzimatica y mas en particular se ref iere a biocatalizadores qufmicos, farmaceuticos o 5 alimentarios. ESTADO DE LA TECNICA Las lipasas constituyen el grupo de biocatalizadores mas importante par sus aplicaciones biotecnologicas. Las razones de este enorme potencial biotecnologico de las lipasas microbianas se debe a que son estables en disolventes organicos, no 10 requieren cofactores, poseen un amplio rango de especificidad de sustrato y presentan una alta enantioselectividad (Jaeger y Reetz, 1998, Trends Biotechnol, 16: 396-403). Adernas, pueden ser producidas en grandes cantidades, ya que la mayorfa se obtienen can gran rendimiento de microorganismos tales coma hongos o bacterias (Jaeger y Eggert, 2002, Curr Opin Biotechnol., 13: 390-397). 15 La utilizacion de lipasas coma catalizadores en numerosos procesos industriales esta cada dfa mas extendida, ya que presenta una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biologicos (Arroyo, 1998, Ars Pharm 39: 23-39): poseen una gran actividad catalftica, muestran una gran especificidad de sustrato, son muy activas a temperatura ambiente y presion atmosferica. Sin embargo, 20 determinados factores coma, el hecho de que la mayorfa de las lipasas no son estables en las condiciones de trabajo y son diffcilmente reutilizables, han contribuido a que su uso industrial no se haya generalizado. La inmovilizacion de estas enzimas ha ayudado a superar estos inconvenientes, Ilevandose a cabo un proceso mediante el cual se restringen, completa o parcialmente, 25 los grados de libertad de movimiento de enzimas, organulos, celulas, etc. par su union a un soporte (Taylor, 1991, Marcel Dekker). La union a soportes es el metodo de inmovilizacion mas utilizado. La eleccion del soporte y del tipo de enlace es fundamental en el comportamiento posterior del biocatalizador. Los soportes de naturaleza hidrofobica, se utilizan adernas de para inmovilizar lipasas, para la 30 purificacion de las mismas aprovechando el distinto comportamiento que muestran   2 ES 2 389 103 B1 DESCRIPCIÓN estas hacia los diferentes soportes de esta naturaleza. Hasta el momenta, hay una gran cantidad de soportes de diferente naturaleza descritos para la inmovilizacion de estas enzimas: par ejemplo, para la mejora de sus propiedades, la lipasa de P en i c i H i u m s i m p li c i ss i m u m fue inmovilizada en soportes hidrofobicos (union reversible) 5 (Cunha y col., 2009, Appl Biochem Biotechnol., 156: 133-145), otra lipasa descrita coma la de B a c ill u s t he r m oc a t enu l a t u s , se inmovilizo en el soporte glioxyl agarosa para aumentar su estabilidad debido a que en este soporte la union es covalente y la estructura de la enzima fijada a el es mas rigida (Fernandez-Lorente y col., 2008, Biomacromolecules 9: 2553-2561) y otras lipasas descritas coma la de Y a rr o w i a 10 l i p o l y t i c a se inmovilizo a soportes de diferentes caracteristicas para estudiar su comportamiento en cada uno de ellos (Cunha y col., 2008, Appl Biochem Biatechnol., 146: 49-56). En cuanto a los metodos de purificacion de estas enzimas, existen multiples procesos dependiendo si la purificaci6n se realiza desde el microorganismo original que las 15 produce coma es el caso de las lipasas de S t a p h y l ococc u s w a r ne r i (Volpato y col., 2010, J Chromatogr A. 1217: 473-478) y de P en i c illi u m s i m p li c i ss i m u m (Cuhna, y col., 2009, App l Biochern Biotechnol., 156: 133-145), si se realiza desde E s c he r i c h i a co li par clonacion del gen que codifica la proteina en vectores de expresi6n coma pBC o pKS coma es el caso de la penicilin G acilasa (Fuentes y col., 2007, 20 Biomacromolecules., 8: 703-707.), o si se realiza desde E . co li par clonacion del gen en un vector inducible que le anade a la proteina colas de polihistidinas, en cuyo caso, la purificacion es bastante mas sencilla coma es el caso de numerosas enzimas coma la lipasa de C l o n o r c h i s s i nen s i s (Hu y col., 2009, Zhongguo., 27: 95-101). Los acidos grasos poliinsaturados omega-3 (PUFAs) desempenan funciones muy 25 importantes en la gestacion, lactancia e infancia ya que son constituyentes de los fosfolipidos de las membranas celulares y forman parte de las estructuras neuronales. Estos acidos grasos esenciales tienen muchos efectos beneficiosos en el organismo: son importantes para mantener la estructura y la funcion de la membrana celular y las membranas subcelulares, para producir las prostaglandinas que regulan procesos 30 coma la inflamacion y la coagulacion, para un correcto desarrollo de vasos sanguineos y nervios y adernas mantienen la piel y otros tejidos jovenes y flexibles debido a su capacidad lubricante (O'Keefe, 2002, Akoh CA, Min DB (eds) Marcel Dekker Ltd, NY,   3 ES 2 389 103 B1 pp: 1-40). Debido a sus propiedades antiinflamatorias, los PUFAs podrfan contribuir a mejorar los sfntomas en enfermedades coma la artritis reumatoide, o el asma (Wijendran y Hayes, 2004, Annu Rev Nutr., 24: 597-615). Adernas, existen algunos estudios que indican que los PUFAs podrfan prevenir o reducir la progresion de ciertos 5 tipos de cancer (Simopoulos, 2002, J Am Coll Nutr., 21: 495-505; Oh y col., 2005, Cancer Epidemiol. Biomarkers 14: 835-841). Las principales fuentes de EPA (acido eicosapentaenoico) y DHA (acido docosahexaenoico) son los aceites de pescado obtenidos habitualmente coma subproducto del procesamiento del mismo (Schmitt-Rozieres y col., 2000, JAOCS., 77: 329-332). Estos aceites contienen alrededor de un 30% de PUFAs omega-3 combinados con diferentes acidos grasos, principalmente en forma de trigliceridos. Se han desarrollado varios metodos para la purificacion de PUFAs a partir de este tipo de aceites mediante metodos qufmicos o metodos enzimaticos (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240). En cuanto a los metodos 15 qufmicos, mediante cromatograffa es posible separar acidos grasos en funci6n de su numero de atomos de carbono asf coma del grado de insaturaciones que posean, utilizando HPLC o cromatograffa con resina de plata (Robles Medina y col., 1998, Biotechnol. Adv. 16: 517-580; Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240). La destilacion molecular se ha utilizado para la separacion 20 parcial de mezclas de esteres de acidos grasos. Este metodo tiene la ventaja de las diferencias en el punto de ebullicion y el peso molecular de estas moleculas bajo una presion reducida (0,1-1,0 mmHg). Un inconveniente que presenta esta metodologfa es que se requieren elevadas temperaturas (2502C) que favorecen la oxidacion, polimerizacion e isomerizacion de los dobles enlaces presentes en estos acidos 25 grasos (Rosu y col., 1998, J. Mal. Catal. B., 4: 191-198; Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240). Par este motivo, los trigliceridos son transformados en etil o metil esteres que tienen puntos de ebullicion mas bajos y pueden ser separados mas facilmente par destilacion en vacfo. La principal desventaja de este metodo es el uso de grandes cantidades de disolventes tanto para la reaccion 30 coma para la separacion de los productos. Otros metodos qufmicos para concentrar PUFAs omega-3 son la cristalizacion a baja temperatura y la formacion de complejos con urea (Shahidi y Wanasundara, 1998,   4 ES 2 389 103 B1 Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240; Robles Medina y col., 1998, Biotechnol. Adv. 16: 517-580). El primero se basa en las diferencias de solubilidad de las grasas en disolventes organicos. Esta solubilidad disminuye cuando se incrementa el peso molecular y aumenta cuando el numero de insaturaciones es mayor. Por otro lado, los 5 acidos grasos saturados de seis o mas atomos de carbono forman complejos con urea que precipitan. La formacion de estos complejos se dificulta cuando se incrementan el numero de insaturaciones presentes en la molecula (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240). Por otro lado, en cuanto a los metodos enzimaticos, en los Oltimos anos diversos investigadores han utilizado lipasas de origen microbiano para producir concentrados de PUFAs omega-3 a partir de la hidrolisis de aceites de pescado. En funcion del tipo de microorganismos del que proceden, existen lipasas que muestran preferencia por los esteres de DHA frente a los esteres de EPA y viceversa (Okada y Morrissey, 2008, J Food Sci., 73: 146-50). 15 El principal inconveniente del metodo enzimatico es que la actividad de las lipasas microbianas frente a los esteres de acidos grasos poliinsaturados es baja debido a los impedimentos estericos derivados de la estructura de esas moleculas. El lo se debe a la aparicion de "codas" en la molecula a causa de los dobles enlaces, de forma que el grupo metilo terminal del acido graso aparece proximo al enlace ester (Shahidi y 20 Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240). Los PUFAs EPA y DHA contienen, respectivamente, 5 y 6 insaturaciones en sus cadenas hidrocarbonadas por lo que se dificulta enormemente el acceso de la lipasa al enlace ester entre estos y el glicerol. Tanaka y col. (1992, JAOCS 69: 1210-1214) utilizaron seis tipos de lipasas para 25 hidrolizar aceite de atun y comprobaron que la lipasa de C an d i d a c y li n d r a c ea mostraba baja actividad frente a esteres de DHA, incrementando la concentracion de este acido graso en forma de glicerido, al doble que en el aceite original. Adernas, en el mismo trabajo, comprobaron que el contenido de EPA en aceite de atun disminufa tras la hidrolisis con las lipasas de R h i z o p u s d e l e m a r y R h i z o p u s j a v an i c u m . 30 Shimada y colaboradores (Shimada y col., 1994, JAOCS 71: 951-954; Shimada y col., 1995, JAOCS 72: 1577-1581) hidrolizaron aceite de atun con la lipasa I de   5 ES 2 389 103 B1 G a l a c t o m y c e s g e o t r i c h i u m logrando incrementar el contenido de EPA y DHA en la fraccion no hidrolizada en un 54,5% y 57%, respectivamente. Al realizar este mismo proceso con la lipasa de C . c y li n d r a c ea obtuvieron gliceridos con un 65,6% de DHA y un 34,5% de EPA. El contenido en PUFAs puede enriquecerse, en la fraccion de 5 acidos grasos libres, mediante una esterificacion selectiva en presencia de etanol y glicerol, y empleando una lipasa que tenga baja actividad sobre PUFAs en comparacion con el resto de acidos grasos de la mezcla (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9:230-240; Shimada y col., 2001, J. Biosc. Bioeng., 91: 529-538). Desafortunadamente existen muy pocas lipasas que realicen este 10 proceso de forma eficiente. Algunas lipasas muestran diferente selectividad entre los PUFAs omega-3 y, en general, la actividad suele ser mayor frente a EPA que frente a DHA. Asf, las lipasas de C an d i d a r u g o s a , R h i z o p u s o r y zae y C an d i d a li p o l y t i c a discriminan moderadamente a favor del EPA. El origen de esta selectividad podrfa deberse a los, ya mencionados, impedimentos estericos (Nagao y col., 1993, J. 15 Biochem., 113: 776-780; Holmquist, 1998, Chem. Phys. Lipids., 93: 57-65). Adernas, otro estudio realizado most() que la lipasa de B a c ill u s li c hen i f o r m i s MTCC 6824 aumentaba el contenido en EPA del aceite de sardina de un 46,29 a un 55,38% y el contenido en DHA de un 4,02 a 5,08% considerandola como una fuente potencial de enriquecimiento en PUFAs omega-3 (Chakraborty y Paulraj, 2008, J Acrid, Food Chem, 20 56: 1428-33). Por otra parte la hidrolisis parcial y regioselectiva de azucares peracetilados presenta un gran interes. Los productos de estas reacciones: azucares con un Unica hidroxilo desprotegido son compuestos intermedios de gran importancia farmaceutica (antitumorales, antiinflamatorios, ...) tal como se describe en la patente europea n2 25 ES2267559 (2007). A partir de estos intermedios se puede obtener oligosacaridos disefiados a medida, glicoaminoacidos y glicoconjugados (por ejemplo modificaciones regioselectivas con acidos grasos), etc, pero la monodesacetilacion qufmica de carbohidratos complejos presenta enormes dificultades tecnicas debido a su multifuncionalidad, por lo que frecuentemente se tiene que recurrir a largas secuencias 30 de proteccion-desproteccion. El empleo de enzimas en disolventes organicos ha contribuido a resolver este problema, por lo que lo ideal serfa disponer de diferentes lipasas capaces de desacetilar a diferentes velocidades y en diferentes posiciones   6 ES 2 389 103 B1 para obtener asi una bateria de monohidroxiderivados en cada una de las posiciones de un azucar. DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invencion proporciona una lipasa que hidroliza distintos sustratos de forma 5 eficiente y solventando los problemas descritos en el estado de la tecnica. Asi pues, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere al uso de la lipasa LipBL para la hidrolisis de distintos sustratos que son seleccionados de entre pnitrofenoles, tributirina, Tween 80, aceites, sustratos quirales y proquirales, aceite de pescado, azucares paracetilados o nitrocefin. 10 Mas en particular, la lipasa LipBL se encuentra unida a un soporte, mas en particular el soporte es seleccionado de entre octil agarosa, dextrano sulfato, glioxil agarosa, aminoglioxil o bromocianageno. En un aspecto mas en particular, el sustrato usado en la presente invencion es un pnitrofenol, mas en particular, es seleccionado de entre acetato, butirato, octanoato, 15 decanoato, laurato, miristato o palm itato. En otro aspecto mas en particular, el sustrato usado en la presente invencion es un sustrato quiral y proquiral, mas en particular, es seleccionado de entre dimetil 3-fenil glutarato, metil 3-fenil glutarato, madelato de metilo, acido 2-0-butiroil mandelico, 4feni1-2-hidroxietilbutirato o hexaacetil lactal. 20 En otro aspecto mas en particular, el sustrato usado en la presente invencion es un sustrato beta-lactarnico, mas en particular, el sustrato beta-lactarnico es nitrocefin. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa en un rango de temperatura comprendido entre 5-902C. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa a 25 pH comprendidos entre 4-9, mas en particular, el pH optima es 7. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa en un rango salino comprendido entre 0-3 M de NaCI.   7 ES 2 389 103 B1 La presente invencion proporciona adernas, una metodologfa enzimatica para la obtencion de una monodesproteccion regioselectiva de un precursor de un disacarido peracetilado en su posicion primaria de gran interes en la industria farmaceutica por la sfntesis de glicoconjugados de alto valor anadido como es el caso de los esteres con 5 acidos grasos de los disacaridos, que pueden presentar actividades insecticidas, antibioticas y antitumorales dependiendo de la estructura del disacarido y del acido graso utilizado (Plou y col., 2002, J. Biotechnol., 96: 55-66). Asf pues, en un segundo aspecto, la presente invencion se ref iere a un procedimiento para la monodesproteccion regioselectiva de azucares paracetilados para la obtencion 10 de azucares monodesacetilados caracterizado porque la monodesproteccion regioselectiva de dichos azucares es Ilevada a cabo enzimaticamente mediante la lipasa LipBL. En un aspecto mas en particular, el azucar peracetilado es un disacarido peracetilado, mas en particular, el azucar monodesacetilado es el hexaacetil lactal. En otro aspecto mas en particular, el azucar monodesacetilado obtenido en el 15 procedimiento de la presente invencion es el 3, 6, 2', 3', 4'-penta-0-acetil lactal. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL esta unida a un soporte seleccionado de entre octil agarosa, dextrano sulfato, glioxil agarosa, aminoglioxil o bromocian6geno. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa 20 en un rango de temperatura comprendido entre 5-902C. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa a pH comprendidos entre 4-9, mas en particular, el pH optima es 7. En otro aspecto mas en particular, la lipasa LipBL de la presente invencion, es activa en un rango salino comprendido entre 0-3 M de NaCI. 25 Kit que comprende la lipasa LipBL para la obtencion de azucares monodesacetilados a partir de la monodesproteccion regioselectiva de azucares peracetilados segun las reivindicaciones 12-16.   8 ES 2 389 103 B1 DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Muestra el ensayo en papel de filtro con MUF-butirato para detectar la actividad lipolitica de las distintas fracciones celulares de la bacteria halofila moderada M a r i n o b a c t e r li p o l y t i c u s , a) membrana, b) periplasma y c) citoplasma 5 Figura 2: Zimograma de la fraccion intracelular de M a r i n o b a c t e r li p o l y t i c u s (Gel SDSPAGE 10%) para determinar el numero de lipasas intracelulares responsables de la actividad lipolitica. Figura 3: Esquema del clan pFP formado par el vector pBC KS+ y el gen l i p B L . A partir de este clan se neva a cabo la purificacion de la lipasa LipBL. 10 Figura 4: Secuencia de nucleotidos y aminoacidos de LipBL. Los cuadros indican los motivos tipicos de la familia VIII de las lipasas. El primer motivo resaltado can un cuadro can lineas continuas, es comun can el motivo tipico de la clase C de la betalactamasas y el segundo motivo resaltado can un cuadro can lineas discontinuas es el pentapeptido tipico de las lipasas. 15 Figura 5: Gel SDS-PAGE 12% que muestra el resultado de la purificacion de LipBL a partir del clan pFP. 1. Marcador de pesos moleculares; 2. Extracto crudo del clan pFP; 3. LipBL pura. Figura 6: Ensayo de MALDI-T0Fde la enzima LipBL. Se neva a cabo mediante el analisis de los fragmentos resultantes tras la digestion can tripsina de LipBL tras la 20 purificacion a partir del clan pFP. La secuencia de LipBL que coincide can esos fragmentos es la secuencia subrayada. Figura 7: Muestra el efecto de la temperatura y termoestabilidad de LipBL. a) Efecto de la temperatura en la actividad de LipBL. LipBL soluble (rombos) y derivado LipBL-octil agarosa (cuadrados). b) Termoestabilidad de LipBL soluble a distintas temperaturas a 25 lo largo del tiempo. Figura 8: Efecto del pH y cloruro sodico sabre LipBL. a) Efecto del pH a 252C en la actividad de LipBL. LipBL soluble (negro) y derivado LipBL-octil agarosa (blanco). Para los experimentos de estabilidad, se utilizaron diferentes tampones a una concentracion de 50 mM segun el valor de pH ensayado: tampon acetato sodico (triangulos), tampon   9 ES 2 389 103 B1 Coomassie, se lay() de nuevo durante 5 minutos con tampon fosfato soclico 50 mM a pH 7. De este ensayo se dedujo, que el numero de enzimas responsables de la actividad eran dos (Figura 2). 5 Ejemplo 3. Aislamiento del g e n l i p B L responsable de la actividad lipolitica de M . l i p o l y t i c u s El gen responsable de esta actividad lipolftica en M a r i n o b a c t e r li p o l y t i c u s se aislo mediante la construccion de una genoteca a partir de la cual, y tras un proceso de screening se aislo uno de los cosmidos (pSM9) con actividad. A partir de este cosmido 10 se !ley() a cabo la clonacion del gen responsable de la actividad en el vector pBC KS(+) (cloranfenicol resistente) constituyendo el clon pFP (Figura 3) que se transform() en E . co li DH5 y se credo en el medio de cultivo LB (Bacto-triptona (Difco): 10 g; Extracto de levadura (Difco):5 g; NaCI (Panreac):10 g; Agua destilada c.s.p. 1000 ml; ajustar el pH a 7,2) suplementado con el antibiotico correspondiente. Al gen 15 responsable de esta actividad lipolftica intracelular se le denomino f i p a . A partir de la secuenciacion de dicho gen, obtuvimos la secuencia que fue analizada mostrando una alta homologfa con la clase C de las beta-lactamasas adernas de presentar el motivo tfpico de la familia VIII de lipasas descritas por Arpigny y Jaeger (1999, Biochem J . , 343: 177-183). El motivo tfpico de estas dos familias de enzimas 20 coincide, estando formado por un residuo de serina, dos aminoacidos variables y un residuo de lisina (S-X-X-K) (figura 4). Por tanto cabrfa esperar una doble actividad lipasa-beta lactamasa. Este gen consta de 1215 nucleotidos, 404 aminoacidos, y el peso estimado es de 45 kDa. Adernas LipBL presenta proximo al carboxilo terminal el pentapeptido conservado tfpico de las lipasas que se muestra en la figura 4. 25 Ejemplo 4. Procedimiento para la purificaci6n de LipBL a partir del clan pFP Con el objetivo de purificar la enzima se procedi6 a obtener la fracci6n intracelular de E . co ll . Para extraer dicha fraccion se resuspendio el sedimento de celulas obtenido tras un proceso de centrifugaci6n en tamp6n fosfato 50 mM y se procedi6 a la rotura de las mismas mediante el uso de una Prensa French, la cual rompe las celulas por 30 presi6n hidrostatica. Una vez rotas las celulas se volvio a centrifugar para separar los   16 ES 2 389 103 B1 restos de pared celular (sedimento) del contenido proteico intracelular (sobrenadante). Para la conservacion de la fraccion intracelular, al sobrenadante obtenido se le adiciono benzamidina 3 mM (Sigma) coma inhibidor de proteasas y azida sodica (Sigma) al 0,1-0,2% para evitar el crecimiento de otros microorganismos. 5 A partir del clan pFP, se consiguio su purificacion siguiendo el protocolo que se detalla a continuacion. Con este procedimiento se consigue una purificaci6n de LipBL con un rendimiento del 60% y un factor de purificacion superior a 100 (Figura 5). Con el objeto de comprobar que la banda obtenida en el gel correspondia con LipBL, se le realizo un MS-MALDI-TOF usando la base de datos MASCOT, obteniendose resultados positivos 10 (Figura 6). La localizacion de la lipasa en cada momenta (soporte o sobrenadante), se determino mediante la medida del incremento de absorbancia a 348 nm utilizando coma sustrato p-nitrofenil butirato. i) Primero, el extracto crudo de E s c he r i c h i a co li que contenia la enzima recombinante 15 se incubo con un exceso de sulfopropil agarosa (30 mg/ml de proteinas) al cual LipBL no se adsorbia. El sobrenadante resultante, se ofrecio a dextrano-sulfato agarosa al cual se adsorbio la enzima. Este soporte con la enzima adsorbida, se lava con 100 mM de cloruro sodico con el fin de eliminar otras proteinas. Finalmente, la enzima fue desorbida con 350 mM de cloruro sodico. 20 ii) El sobrenadante obtenido tras desorber la enzima desde el dextrano-sulfato agarosa, se ofrecio a un soporte quelato IDA (acido inminodiacetico)-Cu altamente activado (conteniendo 20 Eqs de quelatos par gramo de gel agarosa 4%) al cual la enzima se adsorbia. Este soporte se lava con 50 mM de imidazol para la eliminacion de proteinas contaminantes. La enzima, fue entonces desorbida con 100 mM de 25 imidazol a una fuerza ionica de 150 mM de cloruro sodico. El sobrenadante obtenido fue dializado frente a tampon fosfato 10 mM pH 7. Las membranas de dialisis usadas fueron de Medicell internacional Ltd (Dialysis Tubing MWCO: 12-14,000 Da !tons; Size 6; 27/32"; 21,5 mm). iii) La enzima dializada se adsorbio en octil agarosa y el complejo, se lava en 30 presencia de 0,1% de Triton X-100 (mas del 80% de la enzima quedo retenida aun en   17 ES 2 389 103 B1 el soporte) y se eliminaron impurezas. Finalmente, la enzima fue desorbida a una concentracion de 0,3% de Triton X-100. Ejemplo 5. Construed& de derivados enzimaticos Con el objetivo de conseguir derivados estables de la enzima se construyeron 5 derivados de LipBL utilizando coma soportes: bromuro de cianogeno activado, glioxil agarosa, amino-glioxil agarosa, dextrano sulfato y octil agarosa. En todos los casos, la solucion enzimatica se mezclo con cantidades especfficas de los diferentes soportes a los valores de pH optimos para cada proceso. Para ver el grado de inmovilizacion de la enzima en cada soporte, se tomaron pequefias alfcuotas de sobrenadante (solucion 10 enzimatica) y de suspension (solucion enzimatica-soporte) y se determino la localizacion de la enzima mediante la medida del incremento de la absorbancia utilizando coma sustrato el p-NPB. - Preparacion de los derivados octil agarosa, dextrano sulfato y sepharosa Q Para la preparacion de dichos derivados, se mezclo la solucion enzimatica con el 15 soporte de interes y se incubo a temperatura ambiente y agitacion orbital hasta que la enzima se hubo adsorbido al soporte. - Preparacion del derivado bromocian6geno Para la preparacion del derivado bromocian6geno se utilizo el soporte bromuro de cianogeno activado. Para activarlo, se resuspendio en agua destilada y se ajusto el pH 20 a 2, se dejo en agitacion orbital en un agitador de rodillos (Movil-Rod P-Selecta) 1 hora y luego se lava con tampon fosfato soclico 10 mM a pH 8. Una vez activado y lavado el soporte se le adiciono el extracto crudo del clan pFP, se ajusto el pH a 8 y se mantuvo durante 15 minutos a 42C y con agitacion magnetica. Una vez unido al soporte el 30% o mas de la cantidad total de lipasa, se filtra la suspension formada par el soporte y el 25 extracto crudo. Una vez filtrado, se separa el soporte el cual Ileva unido la lipasa y se procede a la inactivacion del derivado con etanolamina (Sigma) 1M pH 8 durante 2 horas. Una vez transcurrido este tiempo, se vuelve a filtrar la suspension y se lava el soporte con agua destilada varias veces. - Preparacion del derivado glioxil agarosa   18 ES 2 389 103 B1 Para la preparacion del derivado glioxil, se utilizo el soporte glioxil agarosa 6 BCL el cual se mezclo con el extracto crudo diluido con tampon bicarbonato soclico 0,1 M a pH 10. La inmovilizacion se Hey() a cabo durante toda la noche a temperatura ambiente. Una vez adsorbida la mayor parte de la enzima, el derivado obtenido se 5 bloqueo con borohidruro de sodio (Sigma-Aldrich) adicionando 1 mg de este por cada ml de suspensi6n de derivado. El proceso se Hey() a cabo con agitacion magnetica durante 30 minutos y el frasco abierto, debido al desprendimiento de gas hidrogeno. Posteriormente se Mfr.() la suspensi6n y el derivado obtenido se lava con agua destilada varias veces. 10 -Preparacion del derivado amino-glioxil agarosa Para la preparacion del derivado heterofuncional amino-glioxil agarosa, primero se expuso la solucion enzimatica al mismo y una vez adsorbida la enzima se filtro la mezcla para obtener el soporte con la enzima adsorbida a los grupos aminos. Posteriormente, se adiciono tampon bicarbonato soclico 5 mM pH 10 para activar 15 entonces los grupos glioxil. Se incubo el mayor tiempo posible (en este caso 2 horas). El derivado obtenido se bloqueo con borohidruro de sodio (Sigma-Aldrich) adicionando 1 mg de este por cada ml de suspension de derivado. El proceso se Hey() a cabo con agitacion magnetica durante 30 minutos y el frasco abierto, debido al desprendimiento de gas hidr6geno. Posteriormente se Mfr.() la suspensi6n y el derivado obtenido se lava 20 con agua destilada varias veces. Ejemplo 6. Caracterizaci6n bioquimica de LipBL Todos los ensayos realizados a continuacion se Ilevaron a cabo usando el pNPbutirato como sustrato. Influencia de la temperatura, pH y NaCI 25 Una vez purificada la enzima, para estudiar la influencia de la temperatura, el pH y la concentracion de NaCI, se utilizo la enzima soluble y el derivado octil de la misma. La influencia de la temperatura en la hidrolisis de p-NPB por LipBL se ensay6 en un amplio rango (5-902C) manteniendo un valor de pH de 7, en cuanto al pH, el rango ensayado fue de 2 a 9 manteniendo la temperatura a 252C y para determinar la   19 ES 2 389 103 B1 influencia del NaCI el rango ensayado fue de 0 a 3 M, manteniendo un valor de pH de 7 y la temperatura a 252C. El perfil de termoestabilidad se realizo incubando la enzima soluble a varias temperaturas (252C, 372C, 502C, 602C), seguido de la medida de actividad residual a 5 diferentes tiempos usando el ensayo estandar de lipasa. De estos ensayos se dedujo que LipBL es estable en un amplio rango de temperaturas (presentando actividad maxima a 802C) (Figura 7a), y valores de pH (siendo el optima pH 7) (Figura 8a) y es mas estable en ausencia de cloruro soclico, sin embargo, mantiene un 20% de actividad relativa hasta un rango de 3 M de esta sal (Figura 8b). De la curva de 10 termoestabilidad se deduce que LipBL presenta su maxima estabilidad a 372C (Figura 7b). El derivado octil presenta incrementados sus valores de estabilidad. Influencia de distintos solventes organicos Por otro lado, para el estudio del efecto de los solventes organ icos en la estabilidad de la enzima pura soluble, se expuso LipBL a diferentes compuestos que normalmente se 15 utilizan en reacciones de hidrolisis: dimetil sufoxido (DMSO), N,N-dimetilformamida, metanol, acetonitrilo, etanol, dietileter, acetona, 1-propanol, 2-propanol, (al 30% en tampon fosfato soclico 25 mM pH 7) y tolueno y hexano (al 5% en tampon fosfato soclico 25 mM pH 7). El ensayo se Hey() a cabo a la temperatura de 252C con agitacion orbital durante 30 minutos. Como control negativo, se utilizo la enzima soluble en 20 ausencia de solventes bajo las mismas condiciones experimentales. LipBL result() ser estable en todos los solventes organicos ensayados (Tab la 1). Efecto de distintos detergentes Debido al fen6meno de hiperactivacion que suelen producir los detergentes sobre algunas lipasas, se ensayo el efecto de concentraciones crecientes de distintos 25 detergentes sobre LipBL, observandose que solo el Triton X-100 y el laurato de sucrosa producen una pequena hiperactivacion a una baja concentracion (0,001%) (Figura 9). Ejemplo 7. Hidrolisis de diferentes sustratos -Tributirina   20 ES 2 389 103 B1 Para el estudio de la actividad lipolftica cualitativa, se adiciono tributirina al media base. La tributirina al tratarse de un triacilglicerol, es insoluble en agua y para la elaboracion del media fue necesario su sonicaci6n durante al menos 10 minutos can el fin de conseguir una adecuada homogeneizaci6n. Para ello, se utilizo un sonicador 5 Labsonic (Braun Biotech International). Las placas se incubaron a 372C durante 2 dfas, tras los cuales se observo un halo de hidrolisis alrededor del crecimiento del clan pFP (Figura 10a) -Tween 80 Se adiciono Tween 80 a una concentracion del 1%. La presencia de actividad lipolftica 10 dio lugar a la aparicion de un precipitado alrededor de las colonias coma consecuencia de la reaccion entre el CaCl2 y los acidos grasos liberados par la hidrolisis del Tween 80 (Cowan y Steel, 1982, CECSA: Mexico) (Figura 10b). -Aceite de oliva Para la detecci6n de la hidrolisis del aceite de oliva, se Hey() a cabo un ensayo en 15 placa. El media utilizado fue LB al que se le adiciono 1-2% de aceite de oliva y 0,001% de rodamina B. El aceite de oliva fue mezclado can 3 ciclos de sonicacion de 10 minutos cada uno al 100% de potencia (Labsonic, Braun Biotech International). El pH del media se ajusto a 7,4 y se esterilizo (1212C, 20 min). En caso de hidrolisis de observa fluorescencia al exponerlo a la luz UV (Figura 10c). 20 Par tanto, tras la observacion de estas placas se concluye que LipBL hidroliza todos los sustratos anteriormente citados. A continuacion se procedio a estudiar la especificidad de sustrato, para ello se utilizaron para-nitrofenoles de distinta longitud de cadena (acetato, 02; butirato, 04; octanoato, 08; decanoato, 010; laurato, 012; miristato, 014 y palmitato, 016). Una vez 25 extrafda la fraccion intracelular coma se describe en el apartado 2 se procedio al ensayo enzimatico siguiendo el siguiente protocolo: Se mezclo en un eppendorf: 100 microlitros de fraccion intracelular del clan pFP, 800 microlitos de tampon fosfato 0,05 M pH 7,2 y 100 microlitros de sustrato 5 mM.   21 ES 2 389 103 B1 Se incubo a 372C durante 20 minutos en agitacion. Y se midi6 el incremento de absorbancia a 405 nm. Una unidad internacional enzimatica se definio coma la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 iimol de sustrato par minuto bajo las condiciones descritas 5 anteriormente (Bastida y col., 1998). 10 15 La actividad, en unidades internacionales par mililitro (Ul/m1), se determino mediante la siguiente ecuacion: A = Abs/min x Vc x 1000 Cex Ve A = actividad (Ul/m1) Abs/min = Absorbancia par minuto (348-420 nm) Vc = volu men total de la cubeta Ce = coeficiente de extincion molar (5150) Ve = volu men de solucion enzimatica Los resultados obtenidos tras este ensayo indicaron que LipBL mostro mayor especificidad par sustratos de corta a media longitud de cadena pero que tambien hidrolizo, aunque en menor medida, sustratos de mayor longitud de cadena (Figura 11). La actividad especffica calculada para el p-nitrofenil butirato fue de 55 U/mg. 20 Con el fin de estudiar la enantioselectividad de la enzima, se utilizaron los diferentes derivados enzimaticos realizados (apartado 5): dextrano sulfato, bromocianogeno, glioxil, amino-glioxil y octil agarosa. Ejemplo 8: Hidrolisis enzimatica de esteres El sustrato dimetil 3-fenilglutarato (compuesto 1), se disolvio en tampon fosfato soclico 25 10 mM a 252C y diferentes valores de pH. Par cada 5 ml de esta solucion se afiadio 0,25 g de derivado. Durante la reaccion, el valor del pH se mantuvo constante usando   22 ES 2 389 103 B1 un pH-stat Mettler Toledo DL50. El grado de hidrolisis se analizo por HPLC de fase reversa (Spectra Physic SP 100 acoplado con un detector UV Spectra Physic 5P8450). Para este ensayo, se utilizo una columna Kromasil 018 (25x0,4 cm) y una fase movil de acetonitrilo y 10 mM de tampon fosfato (35-65%, v/v) a un pH final de 3. 5 La deteccion mediante luz UV en este caso se neva a cabo a 225 nm. La unidad de actividad enzimatica se definio como micromoles de sustrato hidrolizado por minuto y por mg de proteina inmovilizada (figura 13). A continuacion se determino el exceso enantiornerico del metil 3-fenilglutarato (compuesto 2). El exceso enantiornerico de dicho compuesto, (a un porcentaje de 10 conversion de un 15 a un 30%) se analizo por HPLC quiral de fase reversa. La columna usada fue Chiracel OD-R y la fase movil una mezcla isocratica de acetonitrilotampon fosfato amonico 10 mM (25:75, v/v) a pH 3. La deteccion de los compuestos, fue Ilevada a cabo a 225 nm (figura 13). El sustrato (+)-mandelato de metilo (compuesto 4) se disolvio en 3 ml de tampon 15 fosfato sodico 10 mM para una concentracion final de 2 mM de sustrato a 252C y pH 7 bajo diferentes condiciones (pH y temperatura), adicionando 0,6 g de derivado de LipBL (figura 14). El sustrato acido 2-0-butiroil mandelico (compuesto 5) se disolvio en 3 ml de solucion 10 mM de buffer fosfato sodico para una concentracion final de 0,5 mM de sustrato y se le adiciono 0,5 g de derivado (figura 15). 20 Otro sustrato usado fue el 4-feni1-2-hidroxietilbutirato (compuesto 7), que se disolvio en 3 ml de tampon fosfato sodico 10 mM para una concentracion final de 2 mM a 252C y pH 7,5 bajo diferentes condiciones (pH, temperatura), a la mezcla se anadio 0,1 g de derivado (figura 16). Durante la reaccion, el pH se mantuvo constante mediante el uso de pH-stat Mettler 25 Toledo DL50. La actividad enzimatica fue definida como micromol de sustrato hidrolizado por minuto y por mg de proteina inmovilizada. El grado de hidrolisis se analizo mediante HPLC de fase reversa (Spectra Physic SP 100 acoplado con un detector UV Spectra Physic SP 8450). Para el sustrato acido 2-0-butiroil mandelico, se utilizo una columna Kromasil 018 (25x0,4 cm) usando como fase movil acetonitrilo30 tampon fosfato amonico a pH 2,95 en una proporcion 35:65 (v/v), para el mandelato de metilo, se uso la misma columna con la misma fase movil pero a la proporcion 30:70   23 ES 2 389 103 B1 (v/v) y para el 4-feni1-2-hidroxietilbutirato se uso la proporcion 40:60 (v/v). La deteccion mediante luz UV, se neva a cabo a 254 nm para los sustratos 2-0-butiroil mandelico y mandelato de metilo y a 270 nm para el sustrato 4-feni1-2-hidroxietilbutirato. Determinacion del exceso enantiornerico y enantioselectividad: El exceso 5 enantiornerico (ee) calculado a un porcentaje de conversion entre 10 y 15% para cada sustrato, se analizo mediante HPLC quiral de fase reversa. La columna usada fue Chiracel OD-R y la fase movil, una mezcla de acetonitrilo y NaC104/HC104 0,5 M en una proporcion 5:95 (v/v) para los compuestos 4 y 5 y 20:80 v/v para el compuesto 7 a un pH final de 2,3 y un flujo de 0,5 ml/min. La deteccion mediante luz UV se neva a cabo a 225 nm. La enantioselectividad se calculo usando la ecuacion de Chen et al. (1982) (figuras 14, 15 y 16). En primer lugar, se ensayaron los diferentes sustratos quirales y proquirales citados anteriormente (acido 2-0-butiroil mandelico, mandelato de metilo, dimetil-3-fenil glutarato, 4-feni1-2-hidroxietilbutirato) con el derivado dextrano sulfato con el que no se 15 observo una enantioselectividad significativa, aunque hidrolizo todos los sustratos ensayados (tabla 2). Tab la 2. Hidrolisis de diferentes sustratos quirales y proquirales con el derivado LipBLdextrano sulfato. a[sustrato]: 1 mmol, biocatalizador (0.2g), NaH2PO4 2 mL, 25C. 20 b[sustrato]: 10 mmol, biocatalizador (0.2g), NaH2PO4 2 mL, 25C. cVelocidad de hidrOlisis calculada a un 15-30% de rendimiento. S u s t r a t o p H T i e m po ( h ) C o n y e r s & ( % ) V h ( U l / g * 1 0 - 2 ) c A c t i v . e s p ec i f i c a ' e , E A c i d o 2 - 0 - b u t i r o i l m a n de l i c o a 7 0 , 7 5 1 00 4 0 0 , 85 S - 1 , 2 5 0 , 5 1 00 n d n d n d M a n d e l a t o d e M e t i l o b 7 2 4 1 7 1 , 1 8 0 , 0 2 5 R - 1 . 4 3 D i m e t i l - 3 - f e n i l g l u t a r a t o a 7 1 8 7 5 2 0 , 0 4 2 R - 2 , 3 4 - F e n i 1 - 2 - h i d r o x i e t i l b u t i r a t o a 7 0 , 5 1 00 32 0 , 68 1 dActividad calculada por cada Unidad pNPB / g derivado.   24 ES 2 389 103 B1 eEnantioselectividad El sustrato frente al que LipBL mostro una mayor enantioselectividad fue el dimetil-3fenil glutarato, por lo que este se probo con diferentes derivados (tabla 3). 5 Tab la 3. Hidrolisis del dimetil-3-fenil glutarato con diferentes derivados de LipBL. D e r i va d o C o n v e r s i O n ( 0 / 0 ) V h ( U l / g * 1 0 - A c t i v i d a d 2 ) 0 d e s p ec i f i c a M o n o e s t e r ( 0 / 0 ) D i - A c i d o ( 0 / 0 ) E e B r C N a 68 22 1 , 7 4 66 , 5 1 , 5 R - 2 . 2 G li o x y l a 6 7 2 0 1 , 5 2 65 2 R - 2 . 3 G li o x y l 33 6 , 3 1 , 1 32 1 R - 2 , 1 A m i n o a O c t i l b 7 5 3 8 1 , 6 7 1 4 R - 2 , 2 a[DMFG]: 1 mmol, biocatalizador (0.5g), NaH2PO42 mL, pH 7, 25C, 24h b[DMFG]: 1 mmol, biocatalizador (0.32g), NaH2PO4 2 mL, pH 7, 25C, 24h Velocidad de hidrOlisis calculada a un 15-30% de rendimiento. dActividad calculada por cada Unidad pNPB / g derivado. 10 eEnantioselectividad Los resultados obtenidos, indicaron que la union de la enzima a los distintos soportes no afecto a la enantioselectividad de la misma (tabla 3). Ejemplo 9: Hidrolisis de aceite de pescado Debido a la importancia fisiologica que presentan los acidos grasos esenciales 15 eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA), se ensayo la produccion de los mismos con diferentes derivados de esta enzima a partir de aceite de pescado. La hidrolisis del aceite de pescado se neva a cabo en un sistema de dos fases (organica:acuosa). El procedimiento seguido fue el siguiente: se preincubaron 5 ml de hexano, 5 ml de tampon fosfato 0,1 M, pH 6 y 0,5 ml de aceite de pescado durante 30 20 minutos y posteriormente, se adiciono 0,3 gramos de derivados de LipBL con agitacion a 150 rpm. Para mantener constante el pH durante la reaccion, se uso un pH-stat Mettler Toledo DL50. La concentracion de acidos grasos poliinsaturados libres se determino a diferentes tiempos por HPLC.   25 ES 2 389 103 B1 11. Uso de la lipasa LipBL segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la monodesproteccion regioselectiva de azucares peracetilados. 12. Uso de la lipasa LipBL segun la reivindicacion 1, para la obtencion de azucares monodesacteilados a partir de la monodesproteccion regioselectiva de azucares 5 peracetilados 13. Uso segun la reivindicacion 12, donde el azucar peracetilado es un disacarido peracetilado. 14. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde el azucar peracetilado es el hexaacetil lactal. 10 15. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el azucar monodesacetilado obtenido es el 3, 6, 2', 3', 4'-penta-0-acetil lactal. 16. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 12-15, donde la lipasa esta unida a un soporte seleccionado de entre octil agarosa, dextrano sulfato, glioxil agarosa, aminoglioxil o bromocianageno. 15 17. Kit que comprende la lipasa LipBL para la obtencion de azucares monodesacetilados a partir de la monodesproteccion regioselectiva de azucares peracetilados segun las reivindicaciones 12-16.   32 ES 2 389 103 B1  ES 2 389 103 B1 33  ES 2 389 103 B1 34  ES 2 389 103 B1 35  ES 2 389 103 B1 36  ES 2 389 103 B1 37  ES 2 389 103 B1 38  ES 2 389 103 B1 39  ES 2 389 103 B1 40 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: 201031636 22 Fecha de presentación de la solicitud: 08.11.2010 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas X A A A A A MARTÍN S. et al "Marinobacter lipolyticus sp. nov., a novel moderate halophile with lipolyticactivity" International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (septiembre 2003),Vol. 53, N°. 5, páginas 1383-1387; DOI 10.1099/ijs.0.02528-0; todo el documento. SALAMED M. et al. "Lipases from extremophiles and potential for industrial applications" Advances in Applied Microbiology (2007), Vol. 61, páginas 253-283; DOI 10.1016/S0065(06)61007-1; todo el documento HOSHINO T. et al. "Selective hydrolysis of fish oil by lipase to concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids" Agric. Biol. Chem. (1990) Vol.54, N°. 6, páginas 1459-1467; todo el documento. WANASUNDARA U. N. et al. "Lipase-assisted concentration of n-3 polyunsaturated fatty acids in acylglycerols from marine oils" Journal of the American Oil Chemists' Society (1998) Vol. 75, N°. 8, páginas 945-951; DOI 10.1007/s11746-998-0271-9; todo el documento. FERNÁNDEZ-LORENTE G. et al. "Lecitase ultra as regioselective biocatalyst in the hydrolysis of fully protected carbohydrates, strong modulation by using different immobilization protocols" Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (26 noviembre 2007) Vol. 51, páginas 110-117; DOI 10.1016/j.molcatb.2007.11.017; todo el documento. FILICE M. et al. "Effect of ionic liquids as additives in the catalytic properties of different immobilized preparations of Rhizomucor miehei lipase in the hydrolysis of peracetylated lactal" Green Chemistry (29 junio 2010) Vol. 12, páginas 1365-1369; DOI 10.1039/c003829f; todo el documento. 1,4,8-10 1-17 1-10 1-10 11-17 11-17 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado  para todas las reivindicaciones  para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe 08.10.2012 Examinador M. Á. García Coca Página 1/4