Función de Brd2 en la coordinación entre proliferación y diferenciación en el sistema nervioso central de vertebrados

Función de Brd2 en la Coordinación entre Proliferación y Diferenciación en el Sistema Nervioso Central de Vertebrados Trabajo realizado en el Departamento de Células Troncales, Reprogramación y Diferenciación Celular, CABIMER, para optar al grado de Doctor en Biología por el Licenciado Pablo García Gutiérrez, siguiendo el programa de doctorado de Biología Molecular y Biomedicina de la Universidad de Sevilla, y bajo la dirección del doctor Mario García Domínguez Sevilla, Abril de 2013 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Proliferación celular y diferenciación 1 1.1.1. La regulación del ciclo celular eucariótico 1 1.1.2. El destino celular se decide en la fase G1 del ciclo celular 6 1.1.3. Función de componentes del ciclo celular en diferenciación 7 1.1.4. Desarrollo del sistema nervioso de vertebrados y diferenciación neuronal 10 1.2. Proteínas BET 18 1.2.1. Familia de proteínas BET 18 1.2.2. Brd2 23 1.3. Objetivos 28 2. MATERIALES Y MÉTODOS 31 3. RESULTADOS 58 3.1. Análisis funcional de distintos dominios de la proteína Brd2 58 3.1.1. Las secuencias NLS1 y NLS2 están implicados de manera independiente en la localización nuclear de Brd2 58 3.1.2. Mutaciones en los bromodominios de Brd2 mutada tienen un efecto dominante negativo sobre la incorporación de BrdU 64 3.1.3. Los bromodominios de Brd2 no son suficientes para la asociación de la proteína con los cromosomas mitóticos 66 3.2. Análisis funcional del motivo B 69 3.2.1. El motivo B es necesario para la asociación de las proteínas Brd2, Brd3 y Brd4 con los cromosomas mitóticos 69 3.2.2. El motivo B es necesario para la correcta asociación de la proteína Brd2 con la cromatina en interfase 75 3.2.3. Identificación de proteínas que interaccionen con Brd2 a través de la región que contiene el motivo B 78 3.2.4. El motivo B media la interacción entre proteínas de la familia BET 80 3.2.5. La sobreexpresión del motivo B interfiere con la unión de Brd2 a los cromosomas mitóticos 89 3.2.6. La deleción del motivo B afecta a la estimulación del ciclo celular asociada a la sobreexpresión de Brd2 90 3.2.7. La sobreexpresión de Brd2 interfiere con la diferenciación, siendo el efecto dependiente del motivo B 97 3.3. Caracterización funcional de la interacción entre Brd2 y Pleiotrofina 101 3.3.1. Brd2 interacciona con Pleiotrofina 101 3.3.2. Detección de las proteínas Brd2 y Ptn en células P19 109 3.3.3. Ptn neutraliza la interferencia con la diferenciación neuronal mediada por la sobreexpresión de Brd2 112 3.3.4. Expresión de los genes Brd2 y Ptn en el tubo neural durante el desarrollo 114 3.3.5. Antagonismo entre Brd2 y Ptn en el tubo neural en desarrollo 117 3.3.6. Ptn interfiere con la interacción de la proteína Brd2 consigo misma y con su asociación con la cromatina 121 4. DISCUSIÓN 126 4.1. Función de Brd2 en los procesos de proliferación y diferenciación celular 126 4.2. El motivo B constituye un dominio de dimerización entre proteínas BET esencial para la función de éstas 135 4.3. Pleiotrofina es un antagonista de Brd2 durante el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados 141 5. CONCLUSIONES 149 6. BIBLIOGRAFÍA 151 ÍNDICE DE FIGURAS 1. Etapas del ciclo celular 2 2. La formación del tubo neural 11 3. La migración intercinética nuclear 12 4. Estructuras asociadas al tubo neural 16 5. Esquema de dominios de las proteínas BET 18 6. Proteinas que interaccionan con Brd2 24 7. Los niveles de expresión de los genes Brd2, Brd3 y Brd4 se mantienen tras inducir el proceso de diferenciación neuronal en células P19 59 8. Localización de la proteína Brd2 endógena en células P19 60 9. La pérdida de la región NLS2 no afecta a la localización subcelular de Brd2 61 10. Localización celular de distintos fragmentos de Brd2 62 11. Alineamiento de los motivos conservados A y B en proteínas BET 63 12. Efecto de la sobreexpresión de distintos mutantes de la proteína Brd2 sobre la incorporación de BrdU 65 13. La proteína Brd2 endógena se asocia con los cromosomas mitóticos 67 14. La proteína Brd2 carente de la mitad carboxilo-terminal pero con los bromodominios intactos no se asocia con los cromosomas mitóticos 68 15. a doble mutación Y152KN428A afecta a la cpacidad de Brd2 de interaccionar con los cromosomas 69 16. El motivo B de Brd2 está implicado en la asociación de la proteína con los cromosomas mitóticos 70 17. El motivo B está implicado en la asociación de Brd3 y Brd4 con los cromosomas en mitosis 71 18. La proteína Brd2 carente del motivo B recupera la capacidad de asociarse con los cromosomas en las últimas fases de la mitosis 72 19. Las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B también recuperan la capacidad de asociarse con los cromosomas durante las últimas fases de la mitosis 73 20. La proteína Brd2 carente del motivo B no se disocia de los cromosomas mitóticos en presencia del inhibidor de desacetilasas de histonas TSA 74 21. Las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B no se disocian de los cromosomas mitóticos en presencia de TSA 75 22. La asociación de Brd2 con la cromatina requiere la presencia del motivo B 76 23. El motivo B es necesario para la asociación in vitro de Brd2 con un péptido correspondiente a la cola de la histona H3 diacetilada 77 24. Identificación mediante la técnica de dos híbridos de proteínas que interaccionan con Brd2 79 25. Brd2 interacciona con un fragmento de Brd3 en el sistema de dos híbridos 80 26. El motivo B de Brd2 interacciona con el motivo B de Brd3 en el sistema de dos híbridos 81 27. El motivo B media la interacción entre proteínas BET 82 28. La interacción del motivo B de Brd2 consigo mismo es directa 83 29. Interacción de la proteína Brd2 consigo misma y con las proteínas Brd3 y Brd4 en extractos celulares 84 30. Interacciones entre las proteínas Brd3 y Brd4 en extractos celulares 85 31. El motivo B y el primer bromodominio está implicados en la interacción de la proteína Brd2 consigo misma 86 32. El motivo B está implicado en la interacción de Brd2 con Brd3 87 33. El motivo B está implicado en la interacción de la proteína Brd2 sobreexpresada con la proteína Brd2 endógena 87 34. Interacción de la proteína Brd2 consigo misma y con la proteína Brd3 mediante FRET 88 35. La sobreexpresión del motivo B de Brd2 interfiere con la unión de Brd2 a los cromosomas mitóticos 90 36. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de los genes de ciclina D1 y ciclina A2 92 37. El motivo B es necesario para la asociación de Brd2 con los promotores de los genes de ciclina D1 y A2 93 38. El tratamiento de células P19 con ácido retinoico induce una disminución de la expresión de los genes CcnD1 y CcnA2 94 39. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de los genes de ciclina D1 y A2 en presencia de ácido retinoico 95 40. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la estimulación del ciclo celular 96 41. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la diferenciación neuronal inducida en células P19 98 42. Expresión de Brd2 en el tubo neural embrionario 99 43. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la diferenciación neuronal en embriones 101 44. La proteína Brd2 interacciona con la proteína Ptn en el sistema de dos híbridos 104 45. La proteína Brd2 interacciona con la proteína Ptn in vivo e in vitro 105 46. Ptn interacciona selectivamente con Brd2 a través de una región acídica 106 47. La región acídica de Brd2 no está conservada en otros miembros de la familia 107 48. Ptn interacciona con una región acídica de Brd2 ausente en Brd3 y brd4 108 49. Brd2 interacciona con Ptn y Mdk 108 50. Expresión de Brd2 y Ptn en células P19 tratadas con ácido retinoico 110 51. Fraccionamiento celular y análisis de las proteínas Brd2 y Ptn en células tratadas con ácido retinoico 111 52. Las proteínas Brd2 y Ptn endógenas interaccionan en células P19 tratadas con ácido retinoico 112 53. Ptn anula el efecto de la inhibición de la diferenciación neuronal inducida en células P19 provocado por Brd2 113 54. Expresión de los genes Brd2, Ptn y Mdk en el tubo neural de embriones de pollo 116 55. Ptn anula el efecto de inhibición de la diferenciación neuronal inducida en el tubo neural embrionario provocado por Brd2 118 56. Antagonismo entre Brd2 y Ptn en la migración de la cresta neural 120 57. Ptn desestabiliza la unión de Brd2 a la cromatina 122 58. Ptn interfiere con la interacción de Brd2 consigo mismo 123 59. El motivo B muestra una estructura de tipo coiled coil 138 !  1  1. INTRODUCCIÓN 1.1. PROLIFERACIÓN CELULAR Y DIFERENCIACIÓN El desarrollo de los distintos órganos y tejidos que constituyen el cuerpo de los metazoos requiere una adecuada coordinación entre el proceso de proliferación y el proceso de diferenciación celular, por medio del cual las células adquieren características fenotípicas peculiares que le permiten desempeñar funciones especializadas en el organismo. A pesar de la cantidad de información existente acerca de la relación entre los mecanismos de regulación que dirigen la diferenciación celular y elementos clave de la división celular, la compleja interconexión entre ambos procesos a lo largo del desarrollo sigue siendo poco conocida (Hindley y Philpott., 2012). Sin embargo, cada vez se conocen mejor los mecanismos que modelan el destino celular en la generación de estructuras pluricelulares y cómo la desregulación de estos mecanismos puede contribuir a la fisiopatología de multitud de enfermedades, como procesos neurodegenerativos o cancerosos (Wang et al., 2009). 1.1.1. La regulación del ciclo celular eucariótico El ciclo celular implica una serie estereotipada de eventos regulados de forma precisa, necesaria para la adecuada formación de dos células hijas a partir de una célula madre. Más de cuatro décadas de estudio mediante aproximaciones bioquímicas, genéticas y embriológicas han conducido al establecimiento de un esquema común de etapas en el ciclo celular de las células eucarióticas: una fase de síntesis o replicación del DNA (fase S), una fase de reparto equitativo del material genético a las células hijas (fase M o mitosis) y dos fases intermedias, G1 (ó Gap 1) entre la fase M y la fase S y G2 (ó Gap 2) entre la fase S y la fase M , en las que se produce un crecimiento celular y la evaluación y preparación de las condiciones adecuadas para las fases S y M. La sucesión de etapas que constituyen el ciclo celular eucariótico parece a su vez estar regulada y coordinada en gran medida por un mecanismo celular conservado en organismos eucarióticos: la regulación cíclica de la actividad enzimática de Cdks, kinasas de residuos de serina o treonina dependientes de ciclinas (Cross et al., 2011). Las ciclinas implicadas en la regulación del ciclo celular, cuyos niveles en la célula están a su vez regulados por una sucesión periódica y coordinada de eventos de síntesis y degradación, son activadores de las Cdks, responsables en parte de la regulación de éstas. En el caso de Saccharomyces cerevisiae, la kinasa Cdc28, regulada por varias ciclinas y otras proteínas, coordina la  8  creciente del papel que desempeñan componentes fundamentales del ciclo celular en el proceso de diferenciación, con independencia de su función en el ciclo, ha conducido a una revisión de la supuesta especificidad funcional de estos factores en la regulación de la proliferación (Budirahardja y Gönczy, 2009; Hindley y Philpott, 2012; McClellan y Slack, 2006; Miller et al., 2007). La primera evidencia de funciones específicas de factores del ciclo en diferenciación se obtuvo a partir de la observación de que ratones carentes de algunas de estas proteínas mostraban fenotipos asociados a defectos específicos en diferenciación. Por ejemplo, la falta de Ciclina D1 se ha asociado a defectos en el desarrollo de la retina, defectos neurológicos y en la formación de lóbulos alveolares a partir del epitelio mamario (Fantl et al., 1995; Sicinsky et al., 1995). La falta de Ciclina D2 provoca un reducido número de células de los gránulos y la casi ausencia total de neuronas esteladas en el cerebelo (Huard et al., 1999), así como defectos en la neurogénesis adulta (Kowalczyk et al., 2004). La falta de Cdk6 provoca defectos hematopoyéticos relacionados con problemas en la expansión de compartimentos diferenciados más que con defectos en la proliferación de precursores hematopoyéticos tempranos (Malumbres et al., 2004). La falta de p27 se ha asociado con defectos en la migración radial y en la diferenciación de neuronas en la corteza cerebral (Kawauchi et al., 2006; Nguyen et al., 2006). La falta de p21 y p57 se ha asociado con defectos en el proceso de diferenciación muscular a miotubos (Zhang et al., 1999). La falta de p57 se ha asociado con un defecto en la diferenciación de neuronas dopaminérgicas (Joseph et al., 2003), con defectos neurológicos y osteogénicos (Takahashi et al., 2000) y con defectos gastrointestinales (Yan et al., 1997). La ausencia de pRb se ha asociado con un defecto en la diferenciación y la supervivencia neuronal en los ganglios sensoriales y el sistema nervioso central, así como con defectos hematopoyéticos (Lee et al., 1994). La ausencia de la proteína p107 se ha relacionado con un defecto en la diferenciación de los progenitores neuronales (Vanderluit et al., 2007). La falta de la proteína p130 se ha asociado con defectos en el número de neuronas en la médula espinal y los ganglios de la raíz dorsal, así como en el número de miocitos en el miotomo (LeCouter et al., 1998). Además del efecto específico observado en algunos eventos de diferenciación en ausencia de algunos elementos reguladores del ciclo, estudios genéticos y bioquímicos han evidenciado un papel activo de algunos de ellos en procesos de diferenciación celular. Por ejemplo, se ha propuesto que la Ciclina D1 inhibe por interacción directa al factor de transcripción C/EBPβ, importante en la diferenciación de preadipocitos, de manera independiente a su interacción con Cdks (Lamb et al.,  9  2003). A su vez, la Ciclina D1 inhibe también al factor de transcripción PPARγ, implicado también en la adipogénesis, y recluta desacetilasas de histonas a elementos del DNA regulados por dicho factor (Fu et al., 2005). Curiosamente, tanto factores E2F activadores como Cdk4 promueven la expresión de PPARγ, estableciéndose una interacción funcional según la cual la adipogénesis requiere en primer lugar la activación de Cdk4 y factores E2F para la expresión de factores de transcripción adipogénicos, y en segundo lugar la inhibición de la Ciclina D1 para la activación de PPARy (Caldon et al., 2010). Asimismo, se ha descrito la regulación mediada por Ciclina D1 de otros factores de transcripción implicados en la diferenciación, como vMyb (Ganter et al., 1998), BETA2/NeuroD (Ratineau et al., 2002), MyoD (Skapek et al., 1995), E2A (Chu et al., 2001) y los receptores de andrógenos y estrógenos (Neuman et al., 1997; Reutens et al., 2001). Otras ciclinas se han relacionado también con la regulación de factores de transcripción, como la Ciclina D3 con la activación de PPARγ (Sarruf et al., 2005) o la represión del factor hematopoyético Runx1 (Peterson et al., 2005), o la Ciclina D2 con la regulación del factor miogénico MyoD (Skapek et al., 1995). A su vez, algunas Cdks se han implicado en la regulación de factores transcripcionales específicos mediante su fosforilación, como la regulación negativa mediada por Cdk2 del factor Cdx2, importante para la diferenciación de células intestinales (Gross et al., 2005), o la inhibición de MyoD por Cdk4 (Zhang et al., 1999). Los factores inhibidores de las kinasas Cdk de la familia Cip/Kip también se han relacionado con la regulación de procesos específicos en varios modelos de diferenciación celular. Por ejemplo, se ha propuesto que la proteína p27 tiene un papel en la diferenciación neuronal independiente de su papel en el ciclo, estabilizando el factor neurogénico Neurogenina-2 (Nguyen et al., 2006), así como en la migración de varios tipos celulares, como neuronas de la corteza cerebral o células endoteliales (Goukassian et al., 2001; Nguyen et al., 2006). Curiosamente, p57 y p21 se han implicado también en la migración celular, y las tres proteínas Cip/Kip actúan a distintos niveles de la vía de las proteínas Rho, implicada en la reorganización del citoesqueleto (Besson et al., 2004; Tanaka et al., 2002; Yokoo et al., 2003). Otras proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular con papeles específicos en la diferenciación son las proteínas “bolsillo”, clásicamente asociadas al control de la transición de G1 a S, pero recientemente implicadas también en reparación del DNA, apoptosis o diferenciación (Korenjak y Brehm, 2005). Por ejemplo, se ha propuesto que la proteína pRb hipofosforilada puede interaccionar con factores de transcripción como C/EBP-β, NPR/B o MyoD y favorecer la inducción de la diferenciación mieloide, neuronal y muscular respectivamente (Lipinski y Jacks, 1999). A su vez, la proteína  10  p107 interacciona con el factor de transcripción NeuroD, favoreciendo la diferenciación de células pituitarias (Batsche et al., 2005). 1.1.4. Desarrollo del sistema nervioso de vertebrados y diferenciación neuronal El sistema nervioso de vertebrados se subdivide en dos grupos estructurales diferenciables en su origen embriológico: el sistema nervioso central (SNC), compuesto por el encéfalo y la médula espinal y el sistema nervioso periférico, compuesto por los nervios craneales y espinales y por los ganglios periféricos. Ambos grupos de estructuras derivan en última instancia del ectodermo. En el desarrollo embrionario temprano, una porción del ectodermo dorsal (el llamado ectodermo neural) se especifica para dar lugar a la placa neural, constituida por células de morfología columnar. En un proceso conocido como neurulación, la placa neural da lugar al tubo neural, del que deriva el SNC. En la parte más dorsal del tubo neural se distingue una población de células con capacidad de autorenovación y un extraordinario potencial de migración y diferenciación que originan la cresta neural, de la que derivan el sistema nervioso periférico y otras estructuras. Durante el desarrollo embrionario temprano el tubo neural se forma por invaginación de un surco longitudinal en la línea media de la placa neural (surco neural), seguido de la curvatura de dicha placa en torno al surco neural y el posterior cierre en la línea media dorsal (Figura 2). De esta manera se forma una estructura cilíndrica separada del ectodermo superficial, compuesta originalmente por una única capa de células epiteliales que conforman el neuroepitelio. Todas las neuronas y células de la macroglía del SNC derivan de dicho neuroepitelio, cuyas células tienen propiedades de células troncales como la capacidad de autorenovación y cierto grado de pluripotencia (Yamashita, 2012). Aunque una tinción nuclear del neuroepitelio revela la presencia de núcleos celulares dispersos a distintos niveles, dicha estructura está constituida por una única capa de células polarizadas cuyos núcleos se distribuyen a lo largo del eje apico-basal, por lo que se trata de un monoepitelio pseudoestratificado (Chenn et al., 1998). Estas células contactan entre sí a través de distintos tipos de uniones especializadas hacia el lado apical, donde también contactan con el lumen central o ventrículo (Schoenwolf y Kelley, 1980). A nivel basal, la conexión entre las células es más laxa y menos especializada, y éstas conectan con la lámina basal del neuroepitelio (Rodríguez-Boulan y Nelson, 1989). La apariencia  11  pseudoestratificada del neuroepitelio tiene como causa el movimiento en el eje apicobasal del núcleo de estas células acoplado a la progresión del ciclo celular, fenómeno conocido como migración intercinética nuclear (Chenn y McConnell, 1995). Figura 2. La formación del tubo neural. Etapas en la formación del tubo neural embrionario. Adaptado de Gilbert, 2006. Como consecuencia de este fenómeno, la mayor parte de las mitosis se observan sólo en la porción más apical del neuroepitelio (hacia la luz del tubo), mientras que los núcleos de células en fase S se localizan preferentemente en la zona más basal (revisado en Götz y Huttner, 2005). Así, el núcleo de estas células se mueve tras la mitosis del polo apical al basal, donde tiene lugar la replicación del DNA, para volver en G2 al polo apical, donde se divide (Figura 3). A pesar de que existe mucha información acerca de componentes del citoesqueleto y otras proteínas implicadas en la regulación de esta migración, y se han descrito defectos asociados a la perturbación de este proceso, las causas, la regulación y las consecuencias en el destino de las células neuroepiteliales de la migración intercinética nuclear aún no han sido esclarecidas por completo (Willardsen y Link, 2011). En el tubo neural se distinguen dos estructuras mediales constituidas por células postmitóticas que no contribuyen a la neurogénesis dentro del tubo, pero que constituyen centros de señalización importantes para el patrón territorial de neuronas en el tubo neural: la placa del techo, en la parte más dorsal y la placa del suelo, en la parte más ventral. Tubo neural Células de la cresta neural Epidermis Cresta neural Curvatura dorsolateral Notocorda Surco neural Placa neural Precursores de la cresta neural Epidermis  12  Las células neuroepiteliales, con capacidad de auto-renovación son el origen de neuronas y macroglía (la microglía deriva de precursores hematopoyéticos) (Kessaris et al., 2008). La formación de neuronas, o neurogénesis, en distintas áreas del tubo neural está coordinada espacio-temporalmente. Figura 3. La migración intercinética nuclear. Esquema de la relación entre la fase del ciclo celular y la localización apico-basal del núcleo de células neuroepiteliales. Adaptado de Gilbert, 2006. Así, en el tubo neural espinal, se inicia en la región ventral con anterioridad a la dorsal, y en el desarrollo del cerebro o del cerebelo, las neuronas de las capas más externas se originan después que las de las capas más internas (McConnell, 1988). Con la generación de las primeras poblaciones neuronales, el neuroepitelio da lugar a una estructura compartimentalizada en la que se distinguen dos regiones fundamentales: una zona que da hacia el ventrículo o luz del tubo neural, llamada zona ventricular, y otra más externa llamada manto, donde migran los progenitores que abandonan el ciclo celular para diferenciarse (Figura 4). Entre ambas capas, se puede distinguir a su vez una capa de células postmitóticas en proceso de migración aunque aún no expresan marcadores de diferenciación terminal, la zona G1 S G2 M G1 Fases del ciclo celular basal apical lumen  13  subventricular. A medida que avanza el desarrollo, el manto se engruesa por la aportación de nuevas neuronas desde la zona ventricular, cuyo tamaño se reduce progresivamente. En algunas estructuras derivadas del tubo neural, como el cerebro o el cerebelo, esta estructura en tres capas se complica para dar lugar a estructuras más complejas con varias capas diferenciadas. A su vez, en el tubo neural, un gradiente dorso-ventral de señales extracelulares genera diferentes zonas a partir de las cuales se generarán diversos tipos neuronales (Lewis, 2006). Por ejemplo, a nivel de la médula espinal, sólo células neuroepiteliales de la zona ventricular del tercio ventral darán lugar a motoneuronas, mientras que los progenitores más dorsales darán lugar a diversos tipos de interneuronas (revisado en Lewis, 2006). A este nivel, se ha observado que estructuras ventrales como la notocorda en primer lugar y la placa del suelo en segundo lugar, secretan la proteína Sonic hedgehog (Shh), y que estructuras dorsales como el ectodermo en primer lugar y la placa del techo posteriormente secretan proteínas BMP. De esta manera se establece un gradiente dorso-ventral de señales que regulan una compartimentación funcional del tubo neural (revisado en Lewis, 2006). Teniendo en cuenta que la diferenciación terminal de los progenitores neuronales requiere la parada del ciclo celular en la fase G1, la interacción entre los factores neurogénicos y la maquinaria que regula la progresión del ciclo celular resulta esencial para la adecuada generación de poblaciones neuronales funcionales (Swiss y Casaccia, 2010; Willardsen y Link, 2011). Se ha descrito que los progenitores neuronales pueden dividirse de manera asimétrica generando dos progenitores neuronales (división proliferativa) o dos neuronas (división neurogénica) o de manera asimétrica generando un progenitor y una neurona (también conocida como división neurogénica) (Willardsen y Link, 2011). A su vez, la división asimétrica puede tener lugar sin que ninguna de las células hijas pare el ciclo celular, generando progenitores con diferente restricción de linaje (Willardsen y Link, 2011). El fenómeno mejor caracterizado implicado en la determinación del destino de células neuroepiteliales es la partición de factores determinantes en la citocinesis (Willardsen y Link, 2011). Por ejemplo, se ha propuesto que, si bien en vertebrados el plano de división no se correlaciona tan exactamente con el tipo de división como en invertebrados, la segregación asimétrica del dominio apical sí se correlaciona con la generación de neuronas (Alexandre et al., 2010; Kosodo et al., 2004). Además se ha puesto de manifiesto que varias proteínas, como EGFR o TRIM32, se distribuyen asimétricamente en células hijas de progenitores neuronales que se dividen neurogénicamente (Schwamborn et al., 2009; Sun et al., 2005). A su vez, se ha indicado que en el neuroepitelio cortical de ratón, la mayoría de las células que heredan el centrosoma joven tienden a diferenciarse en neuronas mientras que las  14  que heredan el centrosoma materno tienden a mantenerse en la zona ventricular (Wang et al., 2009). Otro fenómeno asociado a la regulación del destino de los progenitores neuronales es la cinética del ciclo celular (Willardsen y Link, 2011). Particularmente, la duración de la fase G1 se ha asociado a la decisión de los progenitores corticales de generar una progenie proliferativa o diferenciada (Calegari et al., 2005; Pilaz et al., 2009). Según la hipótesis de la longitud del ciclo celular, los factores determinantes de la diferenciación sólo funcionan en una “ventana” temporal restringida del ciclo celular, en la fase G1, de manera que células con una fase G1 más corta responden de manera diferente a éstos (Willardsen y Link, 2011). Así, se ha descrito que impedir o favorecer la expansión de la fase G1 en progenitores neuronales, tiene efectos negativos o positivos respectivamente en la neurogénesis (Lange et al., 2009). Sin embargo, la manipulación de la duración del ciclo celular requiere actuar sobre componentes reguladores del ciclo, como el complejo Ciclina D1/Cdk4, y discriminar entre funciones específicas del ciclo y otras funciones relacionadas con el programa de diferenciación es muy complicado (Willardsen y Link, 2011). Por ejemplo, como se comentó anteriormente, se han descrito varias funciones específicas de la Ciclina D1 no relacionadas con el ciclo celular, como la regulación de determinados factores de transcripción (Fu et al., 2004) o la activación de factores proneurales (Lukaszewicz y Anderson, 2011). De hecho, se ha propuesto que la sobreexpresión de un mutante de Ciclina D1 que no interacciona con Cdk4/6 favorece la diferenciación neuronal de progenitores neuronales espinales y la disminución de los niveles de Ciclina D1 la inhibe, lo que se ha descrito como funciones de Ciclina D1 independientes del ciclo celular (Lukaszewicz y Anderson, 2011). Por otro lado, la inhibición conjunta del complejo Ciclina D1/Cdk4 (Lange et al., 2009), así como la inhibición parcial de Cdk2 (Calegari y Huttner, 2003), favorecen la neurogénesis, y la sobreexpresión conjunta de Ciclina D1 y Ciclina E1 (Pilaz et al., 2009) o del complejo Ciclina D1/Cdk4 (Lange et al., 2009) impiden el enlentecimiento de la fase G1 y afectan negativamente a la diferenciación neuronal. Además, en progenitores neurogénicos se ha observado una menor duración de la fase S (Arai et al., 2011). Por lo tanto, además de que factores del ciclo desempeñen funciones específicas en la diferenciación, la expansión de la fase G1 del ciclo de progenitores neuronales parece claramente asociada a la diferenciación neuronal. Otro fenómeno relacionado con la diferenciación neuronal es la migración intercinética nuclear (Willardsen y Link, 2011). Se ha propuesto que, en células neuroepiteliales de la retina del pez cebra, cuanto más tiempo pase el núcleo de un progenitor neural cerca del polo basal, mayor es la probabilidad de que se divida neurogénicamente en la siguiente mitosis (Baye y Link, 2007). Por lo tanto, si bien la regulación y los mecanismos implicados en la generación  15  de neuronas a partir de progenitores neuroepiteliales no se han caracterizado plenamente, una gran cantidad de estudios sugieren que el destino neurogénico de los progenitores está influenciado por múltiples procesos celulares y requiere la implicación de la maquinaria reguladora del ciclo celular (Willardsen y Link, 2011). De hecho, factores proneurales de la familia bHLH (basic helix-loop-helix) como la proteína Neurogenina-2 (Ngn2), implicada en la diferenciación neuronal, inducen una rápida reducción en el nivel de expresión de reguladores del ciclo celular como CcnD1, CcnE1/2 o CcnA2 (Lacomme et al., 2012). El sistema nervioso periférico se origina a partir de la cresta neural. La cresta neural se forma en la parte más dorsal del tubo neural, en el límite donde la placa neural se encuentra con el ectodermo precursor de la epidermis. Durante la formación del surco neural, en células de la frontera entre la placa neural y el ectodermo precursor de la epidermis, varias señales como proteínas BMP, Wnt o FGF inducen la expresión de un conjunto de factores de transcripción, como Pax3 o Distalless-5, y Slug o FoxD3 posteriormente, que especifican el destino de cresta neural (Bang et al., 1999; Garcia-Castro et al., 2002; Lewis et al., 2004; Monsoro-Burq et al., 2003). Tras el cierre del tubo neural (incluso antes del cierre en algunas regiones) esas células, que quedan entre la parte más dorsal del tubo neural y el ectodermo precursor de la epidermis, forman la cresta neural (Figura 2), una población transitoria de células de extraordinaria capacidad migratoria y de diferenciación (Kulesa et al., 2009). Además de generar el sistema nervioso periférico, la cresta neural contribuye a la formación de estructuras esqueléticas faciales, de órganos endocrinos y paraendocrinos (como la médula adrenal o las células secretoras de calcitonina), de las células pigmentarias de la piel y de estructuras de tejido conjuntivo como las papilas dentales, la dermis, músculo liso y tejido adiposo del cuello y la cabeza, y tejido conjuntivo de varias glándulas, como el timo o el tiroides (Dupin y Sommer, 2012). La cresta neural es una estructura transitoria, ya que las células que la constituyen terminan por dispersarse poco después del cierre del tubo neural, y puede dividirse en cuatro regiones principales: la cresta neural craneal (que migra dorso-lateralmente para contribuir a tejidos faciales), troncal (que en primer lugar migra ventro-lateralmente para formar los ganglios de la raíz dorsal, los ganglios simpáticos, la médula adrenal y los nervios que rodean la aorta, y en segundo lugar dorso-lateralmente para formar los melanocitos de la piel), vagal y sacral (que genera los ganglios parasimpáticos entéricos) y cardíaca (que contribuye a la formación del tejido conjuntivo y muscular de arterias de los arcos aórticos y el septum entre la arteria aorta y la arteria pulmonar, además de otras estructuras). En el caso de la cresta neural troncal, la primera ola de migración sigue  16  una ruta ventral, a través de la sección anterior de los esclerotomos (cordones mesodérmicos metaméricos que darán lugar al cartílago vertebral), para dar lugar a células sensoriales (ganglios de la raíz dorsal), neuronas simpáticas, células adrenomedulares y células de Schwann (Figura 4). Figura 4. Estructuras asociadas al tubo neural. Diagrama donde se muestran las distintas partes que se distinguen en un corte transversal de tubo neural embrionario donde se ha iniciado la migración de la cresta neural y la neurogénesis. Las células de la cresta neural que da a la mitad posterior de los esclerotomos migran en el eje antero-posterior para reponer células perdidas y contribuir a esta primera ola migratoria. Posteriormente, las células de la cresta remanentes migran dorsolateralmente, entre la epidermis y la dermis (derivada de cordones mesodérmicos metaméricos conocidos como dermotomos) para formar los melanocitos de la piel. La migración de las células de la cresta neural requiere la transición del fenotipo epitelial a un fenotipo mesenquimal (transición epitelio-mesénquima) y la separación del resto de células de la cresta, un proceso conocido como delaminación (Ahlstrom y Erickson, 2009; Kulesa et al., 2009). Esta migración tiene lugar en haces discretos de patrón metamérico de manera sincrónica, programada rostro-caudalmente, lo que contribuye al patrón metamérico del sistema nervioso periférico (Krull, 2001). La delaminación de Cresta neural Ganglio de la raíz dorsal Placa del techo Lumen Zona ventricular Ganglio simpático Notocorda Placa del suelo Manto  17  células de la cresta neural implica el cambio de moléculas de superficie implicadas en la adhesión celular y, teniendo en cuenta que la migración tiene lugar de manera sincrónica en la fase S, requiere la coordinación de los mecanismos de delaminación y migración con la maquinaria reguladora del ciclo celular (Burstyn-Cohen et al., 2004). La posterior migración ventral de las células sigue vías estereotipadas primero entre los somitos epiteliales y luego invadiendo el esclerotomo para formar los ganglios de la raíz dorsal o acercándose ventralmente hacia la aorta para dar lugar a los ganglios simpáticos y las células cromafín (Gammill y Roffers-Agarwal, 2010). Aunque las células de la cresta no se diferencian hasta alcanzar el nicho en el que formarán los ganglios, se ha propuesto que el destino de las células de la cresta está en cierta medida restringido desde el inicio de la migración (Krispin et al., 2010). Por ejemplo, algunas células de la cresta están restringidas hacia destinos sensoriales o autónomos (Gammill y Roffers-Agarwal, 2011), y los progenitores melanocíticos están especificados antes de iniciar la migración (Wilson et al., 2004). La migración de las células de la cresta neural está influida por multitud de señales, receptores y proteínas de la matriz extracelular que ejercen efectos atrayentes y repelentes sobre las células que migran (Gammill y Roffers-Agarwal, 2011). En este sentido, se ha descrito que las células de la cresta neural expresan varios receptores Eph cuyos ligandos están restringidos a estructuras específicas, lo que se ha propuesto como uno de los mecanismos de guía (Santiago y Erickson, 2002). A diferencia de otros linajes del sistema nervioso periférico y del SNC, la neurogénesis en los ganglios simpáticos no está asociada a la parada de ciclo, sino que neuronas inmaduras pero diferenciadas siguen varias rondas de división antes de la diferenciación terminal (DiCicco-Bloom et al., 1990; Rohrer y Thoenen, 1987; Rothman et al., 1978; Tsarovina et al., 2008). De esta manera, la parada del ciclo celular y la diferenciación terminal ocurren en un amplio periodo del desarrollo y los mecanismos celulares y moleculares que regulan la gangliogénesis no se han caracterizado en detalle. Aún así, se ha propuesto que la coordinación adecuada entre la proliferación y la diferenciación es importante en este modelo de neurogénesis ya que, por ejemplo, factores de transcripción importantes para la diferenciación primaria de neuronas simpáticas son importantes también para la proliferación de las neuronas inmaduras y la supervivencia neuronal (Rohrer, 2011). Por lo tanto, la adecuada coordinación entre factores determinantes de la diferenciación neuronal y elementos del ciclo celular resulta esencial para dar origen a las compleja estructuras del sistema nervioso de vertebrados. Una coordinación inapropiada entre ambos procesos se ha asociado en adultos con enfermedades del  24  vitro como in vivo con la histona H4 acetilada en la lisina 12 (H4K12Ac) a través de los bromodominios, y que la especificidad de esa interacción es una propiedad intrínseca de los bromodominios de Brd2 (Kanno et al., 2004). Esta evidencia, junto con la capacidad de Brd2 de transactivar genes del ciclo y su interacción con E2Fs activadores, sugiere que Brd2 puede, bajo inducción mitogénica, favorecer la progresión del ciclo celular reclutando factores de transcripción y coactivadores a promotores de genes del ciclo celular específicamente acetilados (Sinha et al., 2005). Consistentemente, se ha visto que la interacción de Brd2 con H4K12Ac es esencial para el aumento de transcripción del gen de la Ciclina E inducido por expresión constitutiva de Brd2 (Kanno et al., 2004). Por otro lado, la interacción directa de Brd2 con TBP (TATA-binding protein) ha llevado a proponer que Brd2 puede actuar reclutando al factor TBP a un complejo transcripcional que incluye a E2F-1 (Peng et al., 2007). Además, la interacción entre Brd2 y E2F-2 requiere la presencia de histonas acetiladas (Crowley et al., 2002) lo que sugiere que la interacción bromodominiohistona acetilada puede tener un efecto alostérico que altere la conformación de la proteína, estabilizando su unión a otras proteínas. De esta manera, y dado que Brd2 también interacciona con otras proteínas implicadas en la transcripción como NSD3 o JMJD6 (Rahman et al., 2011) y con proteínas del complejo “Mediator” (componente multimérico esencial de la maquinaria general de transcripción por la RNA Polimerasa II) como Cdk8, TRAP220 así como con la subunidad mayor de la RNA Polimerasa II (Crowley et al., 2002), es posible que Brd2 medie el reclutamiento de factores reguladores y la formación de un complejo transcripcional activador de genes del ciclo celular en regiones de la cromatina acetiladas (Figura 6). Figura 6. Proteínas que interaccionan con Brd2. Esquema de los dominios de la proteína Brd2 y de las interacciones descritas entre cada uno de ellos y distintas proteínas. Se indica también que los motivos A y B probablemente contienen señales de localización nuclear (NLS1 y NLS2). Brd2 BD2 NETBD1 SEEDAB ET E2F-1 E2F-2 NSD3 JMJD6 CHD4 GLTSCR1 ATAD5 NLS2NLS1 H4ac H3ac H4ac H3ac TBP  25  A su vez, experimentos de inmunoprecipitación de cromatina o ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation), han mostrado que Brd2 interacciona físicamente con el promotor de los genes de Ciclina A2 (Sinha et al., 2005) y Ciclina D1 (LeRoy et al., 2008). La interacción de Brd2 con el gen de la Ciclina D1 se ha verificado en distintas regiones, incluida la región promotora, y es dependiente de la acetilación de H4K12 (LeRoy et al., 2008). La localización de Brd2 a lo largo del gen de Ciclina D1, junto con la evidencia de que Brd2 favorece la transcripción por la RNA Polimerasa II a lo largo de un polinucleosoma hiperacetilado in vitro (eliminando el bloqueo nucleosomal de la RNA Polimerasa II) (LeRoy et al., 2008), han llevado a proponer que Brd2 favorece la transcripción mediante el reclutamiento de factores de transcripción y coactivadores, así como ejerciendo una actividad intrínseca como chaperona de histonas (LeRoy et al., 2008). Un aspecto interesante de Brd2 es su relocalización celular concomitante con la salida de ciclo y/o diferenciación. Se ha descrito que en fibroblastos de ratón (BALB/3T3), Brd2 (tanto la proteína endógena como expresada mediante transfección) aparece deslocalizada por todo el volumen celular cuando se para el ciclo celular privando al cultivo de suero, mientras que la reactivación del ciclo mediante la adición de suero reestablece la localización nuclear de Brd2 en pocas horas (Guo et al., 2000). Esta relocalización nuclear de Brd2 inducida por mitógenos en células que proliferan activamente es consistente con un papel en la transactivación de genes del ciclo celular dependientes de factores E2F. Se ha descrito que una región de seis aminoácidos (507KKKKRK512), definida como señal de localización nuclear o NLS (Nuclear Localization Signal) monopartita, es necesaria para la relocalización (Beck et al., 1992; Fukazawa y Masumi, 2012; Guo et al., 2000). Estudios del patrón de localización de Brd2 en el epitelio mamario de ratón adulto, donde Brd2 se expresa abundantemente (Rhee et al., 1998), evidencian un cambio en la localización subcelular de la proteína a medida que el epitelio se diferencia a alveolo glandular maduro con la entrada en la lactancia (Crowley et al., 2002). Concretamente, la proteína Brd2 se localiza en el núcleo de células epiteliales de alveolos mamarios de ratón que proliferan durante el embarazo, pero sólo se detecta en el citoplasma de estas células cuando abandonan el ciclo celular para diferenciarse en el momento de la lactancia (Crowley et al., 2002). Entre dos y cinco días después de la lactancia, la lámina basal de los alveolos se degrada produciendo una involución de los anillos alveolares concomitante con una entrada en apoptosis de las células alveolares. En este estadio, Brd2 vuelve a localizarse en el núcleo de las células alveolares (Crowley et al., 2002). Este patrón sugiere que Brd2, además de su función en la regulación  26  transcripcional de genes del ciclo, puede tener una función en la inducción de la apoptosis, posiblemente mediante la transactivación de genes proapoptóticos (Crowley et al., 2002; Zhou et al., 2006). Curiosamente se ha descrito la capacidad de E2F-1 de inducir apoptosis mediante la activación de genes proapoptóticos (Iaquinta et al., 2007). El cambio de localización celular de Brd2 asociado a una salida del ciclo celular en el contexto del desarrollo de tejidos también se ha observado durante el desarrollo del SNC en embriones de ratón (Crowley et al., 2004). Se ha descrito que la expresión de Brd2 en embriones de ratón (de 11,5 dpc) es especialmente alta en el neuroepitelio del cerebro anterior y posterior, en los ganglios de la raíz dorsal y en la médula espinal (Crowley et al., 2004). Experimentos de inmunohistoquímica en cortes transversales del tubo neural embrionario muestran que a 9 dpc, cuando la mayoría de células están proliferando, la proteína Brd2 es nuclear. Sin embargo, a medida que avanza el desarrollo y se produce la neurogénesis (11-12 dpc), Brd2 se localiza en el núcleo de progenitores que siguen proliferando, pero muestra una localización citoplásmica en células postmitóticas que se diferencian en neuronas. En la región dorsal, donde la mayoría de progenitores interneuronales siguen proliferando a 11-12 dpc, se observa una mayor localización nuclear frente a la región ventrolateral de motoneuronas, donde el proceso de diferenciación se encuentra más avanzado (Crowley et al., 2004). En el caso de los ganglios de la raíz dorsal, se observa una localización nuclear de Brd2 en cortes histológicos de embriones de 11,5 dpc, estadio del desarrollo en que las células proliferan activamente, mientras que en estadios posteriores (15 dpc) Brd2 aparece mayoritariamente en el citoplasma, coincidiendo con el proceso de diferenciación neuronal (Crowley et al., 2004). Los cambios de localización de Brd2 asociados a la salida del ciclo celular y a la diferenciación permiten especular con la posibilidad de que Brd2, además de estar implicado en la progresión del ciclo celular, desempeñe funciones adicionales durante el proceso de diferenciación, o en la coordinación entre ambos procesos. De hecho, una disminución en el nivel de la proteína Brd2 en ratones, se ha asociado con una reducción del número de neuronas GABAérgicas en varias estructuras cerebrales (Velisek et al., 2011). Por otro lado, embriones de ratón carentes de la proteína Brd2 muestran una disminución en la expresión de genes importantes para la diferenciación neuronal, como NeuroD1 o NeuroD4 (Gyuris et al., 2009). A su vez, la pérdida de la proteína, que resulta letal en estadios tempranos del desarrollo (11-13,5 dpc), se ha asociado con defectos en el cierre del tubo neural (Shang et al., 2009) y exencefalia (Gyuris et al., 2009), en consonancia con la abundante expresión de Brd2 en el tubo neural (Crowley et al., 2004; Shang et al., 2009). La carencia de Brd2 también conlleva  27  una reducción significativa del tamaño de los embriones en estadios previos a la degeneración (Gyuris et al., 2009; Shang et al., 2009).  28  1.3. OBJETIVOS Teniendo en cuenta el cambio de localización de la proteína Brd2 asociado a la diferenciación neuronal (Crowley et al., 2004), el alto nivel de expresión de Brd2 en el sistema nervioso embrionario así como los defectos en la correcta estructuración del sistema nervioso central asociados a la carencia de dicha proteína (Shang et al., 2009) y la implicación de Brd2 en la regulación del ciclo celular (LeRoy et al., 2008) el objetivo general de esta tesis fue la caracterización funcional de la proteína Brd2 en el contexto de la diferenciación neuronal en el SNC de vertebrados. Los objetivos específicos de este trabajo fueron: 1Estudiar la localización celular de Brd2 y la importancia de los dominios en la localización y función de esta proteína 2Buscar proteínas que interaccionen con Brd2 3Estudiar la funcionalidad de la interacción entre Brd2 y Brd3 y entre Brd2 y Pleiotrofina.  29   30   31  2. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES: 2.1.ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO 2.1.1 Líneas Celulares Animales. 2.1.1.1 Líneas celulares. Las líneas celulares animales utilizadas en este trabajo son la línea de ratón P19 y la línea humana HEK293T. La línea P19 deriva de un teratocarcinoma de ratón (McBurney y Rogers, 1982) y conserva cierto grado de pluripotencia. La línea humana HEK293T deriva de riñón embrionario (Graham et al., 1977) y se utilizó principalmente para la expresión de proteínas en experimentos de coinmunoprecipitación. Ambas líneas fueron suministradas por el Dr. José Carlos Reyes Rosa (Laboratorio de Epigenética. Departamento de Biologia Molecular, CABIMER. Sevilla) 2.1.1.2 Condiciones de Cultivo. Todas las líneas fueron mantenidas en incubadores HEPA Class 100 (Thermo), a 37º C y con una atmósfera húmeda de CO2 al 5%. Como medio de cultivo rutinario se utilizó: -Para células P19: α-Modified Eagle (α-MEM) provisto comercialmente de 4500 mg/l de glucosa, 584 mg/l de L-Glutamina y 110 mg/l de piruvato sódico (PAA Laboratories) suplementado con un 2,5% de suero fetal bovino (v/v) y un 7,5% de suero de ternera recién nacida (PAA Laboratories) y 10 ml/l de una solución de antibióticos compuesta por penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (10 mg/ml) (PAA Laboratories). -Para células HEK293T: Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM) provisto comercialmente de 4500 mg/l de glucosa, 584 mg/l de L-Glutamina y 110 mg/l de piruvato sódico (PAA Laboratories) suplementado con un 7% de suero fetal bovino (v/v) (PAA Laboratories) y 10 ml/l de una solución de antibióticos compuesta por penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (10 mg/ml) (PAA Laboratories).  32  El tratamiento de células P19 con TSA se hacía añadiendo al cultivo TSA (500ng/ml) 4 horas antes de procesar las células para su análisis en el microscopio confocal. La inducción con suero en células P19 para ver el efecto de la sobreexpresión de Brd2 y otras proteínas relacionadas se hizo cultivando las células P19 en medio αMEM suplementado con 0,1% de suero fetal bovino (v/v) durante 48 horas. Luego, el medio se cambió por α-MEM suplementado con un 2,5% de suero fetal bovino (v/v) y un 7,5% de suero de ternera recién nacida (v/v) durante 18 horas antes de procesar las células para su análisis. Las transfecciones se realizaban 36 horas antes del procesamiento de las células, según un protocolo adaptado de Sinha et al., 2005. El tratamiento con ácido retinoico de células P19 para acumular células en la fase G1 se hacía añadiendo ácido retinoico a una concentración final de 0,5 µM a las células cultivadas en placas adherentes durante 16 horas, según un protocolo adaptado de Pao et al., 2011. Las transfecciones se realizaban 18 horas antes del tratamiento. La inducción de Ptn con ácido retinoico para el Western Blot o las inmunofluorescencias se hacía siguiendo el mismo protocolo, procesando las células 48 horas después del inicio del tratamiento. La inducción de Ptn para el experimento de ChIP se realizaba cultivando las células P19 en placas no adherentes con una concentración final de ácido retinoico de 0,5 µM durante 48 horas, según un protocolo adaptado de Brunet-DeCarvalho et al., 2003. La diferenciación de células P19 mediante tratamiento con ácido retinoico se hacía según el protocolo desarrollado por McBurney y colaboradores (McBurney et al., 1982). Brevemente, 1,5x106 células P19 se sembraban en cajas de cultivo no adherentes con medio α-MEM suplementado con un 5% de suero fetal bovino (v/v) y 0,5 µM de ácido retinoico durante 4 días, con un cambio de medio a los 2 días. Luego, se tripsinizaban las células y se sembraban a una densidad de 105 células por ml en placas adherentes con medio α-MEM suplementado con un 2,5% de suero fetal bovino (v/v) y un 7,5% de suero de ternera recién nacida (v/v), sin ácido retinoico, durante 6 días con cambio de medio cada dos días. A partir del segundo día se añadía al cultivo arabinósido C a una concentración final de 5 µM para evitar la proliferación de células no neuronales.  33  2.1.2 Bacterias. 2.1.2.1 Estirpes. En esta tesis se han utilizado dos estirpes de Escherichia coli como herramientas para técnicas de clonación molecular del DNA y para la inducción y purificación de proteínas, respectivamente: DH5α y BL-21(DE3). Sus características genotípicas son: -DH5α: supE44 ∆alac U169 (Φ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 -BL21 (DE3): hsdS ga1 (λcIs857 ind1 Sam7 nin5 lac UV5-T7 gene1) 2.1.2.2 Condiciones de Cultivo. El medio de cultivo habitual de las estirpes bacterianas fue el medio Luria-Bertani (LB). Los antibióticos utilizados para la selección de bacterias transformadas fueron ampicilina (100 μg/ml) o kanamicina (50 μg/ml), según el plásmido. Los cultivos en medio líquido crecieron en incubadores con una temperatura estable de 37º C y una agitación continua de 200 rpm. Para los cultivos en medio sólido se utilizaron estufas a la misma temperatura. LB: 10 g/l de NaCl; 10 g/l de bactotriptona; 5 g/l de extracto de levadura. Añadir 15 g/l de bacto-agar para el medio sólido. 2.1.3 Levaduras. 2.1.3.1 Estirpes. La levadura Saccharomyces cerevisiae fue utilizada para llevar a cabo los escrutinios de dos híbridos con el sistema DUALhybrid Kit (Biotech). En concreto se usó la estirpe NMY51 que suministra el fabricante. 2.1.3.2 Condiciones de Cultivo. El medio estándar de crecimiento de la estirpe NMY51 era YPDA. Cuando se necesitaba un medio mínimo para establecer alguna de las restricciones de crecimiento del sistema, ese medio era el SC, que se preparaba a partir de sobres con medio de crecimiento sin histidina, leucina y triptófano (SC-His-Leu-Trp) (Q·BIOgene), y se suplementaba con los aminoácidos que hicieran falta en cada caso.  40  TBE 0,5X: Tris-borato 45 mM; EDTA 1 mM (pH 8). Tampón de carga 10X: azul de bromofenol 0,25% (p/v); xileno-cianol FF 0.25% (p/v); glicerol 30% (v/v). 2.5.4.2. PCR. La amplificación de fragmentos de DNA se realizó mediante PCR utilizando un aparato T-personal (Biometra). Los oligonucleótidos utilizados como cebadores fueron sintetizados por la firma SIGMA-Genosys. Para una reacción típica se utilizaban concentraciones de 1 μM de cada cebador, 2 mM de cada desoxirribonucleótido y 1 mM de MgCl2, así como 5 μl del tampón comercial 10X de la DNA polimerasa, de 20 a 50 ng de DNA molde, 2.5 U de DNA polimerasa y H2O Milli-Q hasta un volumen final de 50 μl. Si el amplicón presentaba un alto porcentaje de G+C, entonces la mezcla de reacción incorporaba también un 5% de DMSO (v/v) para ayudar a la rotura de los triples enlaces existentes entre este par de nucleótidos. Se ha utilizado el sistema Expand High Fidelity PCR System (Roche). 2.5.4.3. PCR a tiempo real. Para la PCR a tiempo real se utilizaban placas de 96 pocillos (Applied Biosystems) y el kit comercial SensiMix SYBR Low-ROX kit (BIOLINE) en un termociclador 7500 FAST Real-Time PCR System de Applied Biosystems. Se siguieron las instrucciones del fabricante. Para los experimentos de ChIP, se analizaban 3 µl de una dilución 1/10 del DNA final por cada caso, siempre por triplicado. Para el análisis del cDNA de células P19, se analizaban 3 µl de una dilución 1/10 del cDNA total, por triplicado en cada caso. Para la normalización se utilizaba la expresión del gen GAPDH endógeno o, en el caso en el que las células analizadas hubieran sido transfectadas, la expresión de la ORF de GFP expresada a partir de un vector cotransfectado. El algoritmo para el análisis relativo está descrito en Pfaff et al., 2001. 2.5.5. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE RNA. 2.5.5.1. Método de aislamiento de RNA. El aislamiento de RNA, tanto de células como de órganos animales, se llevaba a cabo con el sistema RNeasy® (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante. 2.5.5.2. Electroforesis de RNA en geles de agarosa.  41  Las electroforesis de RNA se realizaron de la misma manera que las de DNA, aunque el porcentaje de los geles de agarosa siempre era del 1% (p/v) y nunca se utilizaba patrón. Tampón de carga 10X: azul de bromofenol 0,25% (p/v); xileno-cianol FF 0,25% (p/v); glicerol 30% (p/v). 2.5.5.3. Experimentos de RT-PCR. Para la obtención de cDNA a partir de RNA se utilizó el sistema Super-ScriptTM First-Strand Synthesis for RT-PCR (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron tal como ya se ha descrito, a partir de 1 μl de la reacción de retrotranscripción. 2.6. MÉTODOS DE SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. 2.6.1. Inducción de la síntesis de proteínas heterólogas en E. coli. Para la expresión de polipéptidos fusionados con la proteína Glutatión Stransferasa (GST) o con una etiqueta de 6 residuos de histidina se clonaba la secuencia del polipéptido de interés en el vector pGEX-6P-3 (GE Healthcare) o pET28a+ (Novagen), se transformaba la estirpe BL21 (DE3) de E. coli y se inducía la expresión de la proteína mediante la adición de IPTG. El ensayo a pequeña escala tenía como objetivo comprobar que la inducción de la síntesis de la proteína funcionaba correctamente. Para ello se electroporaba un vial de la estirpe BL21 (DE3) de E. coli con el plásmido de interés y se inoculaba 1/10 del volumen en 25 ml de LB suplementado con el antibiótico correspondiente. Se dejaba crecer el cultivo hasta una DO600 de 0,6, se recogía 1 ml como control (muestra 1) y al resto se le añadía IPTG 1 mM para inducir la síntesis de la proteína de fusión. Tras 2 h de inducción, se recogía 1 ml del cultivo (muestra 2). Para evitar la acción de las proteasas, las células de las muestras 1 y 2 se resuspendían en 1 ml de PBS 1X suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Después, y siempre en frío, se rompían con 6 pulsos de ultrasonidos de 30 s cada uno, separados por intervalos de reposo de la misma duración para mitigar el calentamiento. Los ultrasonidos se suministraban mediante un dispositivo Digital Sonifier S-450D (Branson) dotado con una bocina de 13 mm y una micropunta de 3 mm. La amplitud del aparato se fijaba al 40% W y Hz. Tras centrifugar a 15000 x g y 4º C durante 10 min, se añadían entre 300 y 500 µl de tampón de carga desnaturalizante 1X a los sobrenadantes (citosol) y a los precipitados (membranas y cuerpos de inclusión).  42  Posteriormente, todas las muestras se sometían a una electroforesis en gel de acrilamida y en presencia de SDS (SDS-PAGE) para comprobar de visu la inducción de la síntesis en la muestra 2 y la solubilidad de la proteína inducida. Si se observaba que la proteína de fusión se sintetizaba en buena cantidad y permanecía soluble en el citosol, se podía proceder a su purificación repitiendo previamente el proceso de inducción a gran escala. En estos casos se solía inocular una fracción del volumen del vial completo de BL21 (DE3) por cada 250 ml de LB. A título orientativo, para la rotura de las células procedentes de 1 l de cultivo se empleaban 30 ml de PBS 1X con PMSF 1mM y se suministraban 10 pulsos de ultrasonidos con la bocina de 13 mm y la punta estándar del aparato. 2.6.2 Purificación de Proteínas Recombinantes. Las proteínas recombinantes fusionadas con la GST se purificaron mediante cromatografía de afinidad por glutatión con la matriz Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare). Las proteínas recombinantes fusionadas con una etiqueta de seis aminoácidos histidina se purificaron mediante cromatografía de afinidad por niquel en columnas HisTrap (GE Healthcare). En ambos casos se siguieron las instrucciones del fabricante. 2.6.3. Ensayos de pull down in vitro. Para el pull down, las proteínas basadas en Brd2 fusionadas a GST habían sido purificadas previamente por cromatografía de afinidad por glutatión y en algunos casos escindidas de la GST mediante tratamiento con la enzima PreScission (GE Gealthcare), siguiendo instrucciones del fabricante. Las proteínas etiquetadas con colas de 6 residuos de histidinas habían sido purificadas mediante una resina de unión a níquel (His-trap, Novagen). Para el ensayo de pull down , de 0,5 a 1 g de las proteínas de fusión a GST unidas a una matriz de sefarosa cargada de Glutatión (GE Healthcare) se incubaron con 500 ng de proteínas purificadas etiquetadas con colas de 6 residuos de histidinas o con un epítopo Flag en 200 µl de tampón 1 y se lavaron con el tampón 1 y luego con el tampón 1 suplementado con 400 mM de NaCl. Las muestras se hirvieron en tampón de Laemmli y se analizaron mediante Western Blot Para el pull down con los péptidos correspondientes a colas de histonas acetiladas, se utilizaron péptidos biotinilados con gran afinidad por las matrices comerciales de estreptavidina. En este caso se combinaba 1 µg de proteína de fusión a GST con 2 µg de péptido biotinilado (Upstate) y tampón de interacción hasta un volumen final de 200 µl. La mezcla se incubaba a 4º C y en agitación parabólica  43  durante 2 h. Se añadían 15 µl de matriz magnética de estreptavidina Dynabeads M280 Streptavidin (Dynal Biotech) y se completaba la incubación durante 1 h más. Posteriormente, la matriz se lavaba 3 veces con tampón de interacción utilizando el dispositivo imantado Dynal MPC-S Magnetic Particle Concentrator (Dynal Biotech). Se añadían 20 µl de tampón de carga desnaturalizante 2X y se agitaba la matriz en vortex para soltar las proteínas agregadas. La muestra se sometía a SDS-PAGE y se analizaba por Western Blot. Tampón 1: 20mM Tris-HCl, pH 7.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 0.01% Nonidet P-40 Tampón de interacción: HEPES 20 mM (pH 7,5); NaCl 500 mM; EDTA 1 mM; NP-40 0,2% (v/v); BSA 0,25% (p/v); cóctel de inhibidores de proteasas 1X Complete EDTA-free (Roche). Tampón de carga desnaturalizante 4X: Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8); glicerol 32% (v/v); SDS 6,4% (p/v); 2mercaptoetanol 16% (v/v); azul de bromofenol 0,005% (p/v). 2.6.4 SDS-PAGE. Se seguía el protocolo de Laemmli para geles discontinuos de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Para preparar los extractos de células animales apropiados para esta técnica, las células se recogían y resuspendían con tampón de urea. Si se trataba de células de crecimiento adherente, antes era necesario desprenderlas de sus cajas. Para ello, y tras un lavado con PBS 1X, se rascaba la superficie de las mismas con un trozo de goma plana y estéril, en presencia de este mismo tampón. Si el extracto resultaba demasiado viscoso, se podía terminar de homogeneizar con jeringuillas de 1 ml antes de proceder a su cuantificación. Para asegurar la desnaturalización proteica, las muestras se hervían durante 5 min en tampón de carga desnaturalizante 1X justo antes de ser aplicadas al gel. Si las proteínas de interés no superaban los 100 kDa, se añadía el patrón de masas moleculares SDS-PAGE Molecular Weight Standards Low Range (Bio-Rad), con proteínas entre los 97,4 (Fosforilasa B) y los 14,4 kDa (Lisozima). Si superaban los 100 kDa, el patrón añadido era el SDS-PAGE Molecular Weight Standards High Range (Bio-Rad), con proteínas entre los 200 (Miosina) y los 45 kDa (Ovoalbúmina). Las proteínas se visualizaban tras incubar el gel en una solución de azul de Coomassie a RT, durante 15 min y en agitación suave. El exceso inespecífico de tinción se contrarrestaba con 2 o 3 lavados con la solución desteñidora.  44  Tampón de urea: Tris 10 mM (pH 8); urea 8 M. PBS 1X: NaCl 0,136 M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4·12H2O 10 mM; KH2PO4 1,4 mM. Gel de empaquetamiento: Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8); poliacrilamida (Acrilamida y bis-Acrilamida 29:1) 4% (v/v); SDS 0,1% (p/v). Se polimeriza con APS 0,1% (p/v) y TEMED 0,05% (v/v). Gel de separación: Tris-HCl 0,375 M (pH 8,8); poliacrilamida (acrilamida y bis-acrilamida 29:1) 7-12% (v/v); SDS 0,1% (p/v). Se polimeriza con APS 0,1% (p/v) y TEMED 0,05% (v/v). Tampón de carga desnaturalizante 4X: Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8); glicerol 32% (v/v); SDS 6,4% (p/v); 2mercaptoetanol 16% (v/v); azul de bromofenol 0,005% (p/v). Tampón de electroforesis: Tris 25 mM; glicina 192 mM (pH 8,3); SDS 0,1% (p/v). Solución de azul de Coomassie: Coomassie R-250 (SIGMA) 0,1% (p/v); ácido acético 10% (v/v); metanol 40% (v/v). Solución desteñidora: ácido acético 10% (v/v); metanol 40% (v/v). 2.6.5 Determinación de la Concentración de Proteínas. Los extractos de células para SDS-PAGE se cuantificaron según el método de Bradford, usando el reactivo de Bio-Rad según las instrucciones del fabricante. Para las rectas patrón se utilizaban cantidades crecientes de una solución comercial de BSA de concentración conocida (TaKaRa). 2.6.7 Sistema de Dos Híbridos en levaduras. El sistema de dos híbridos DUALhybrid Kit (Biotech) se utilizó para investigar interacciones proteína-proteína. Su fundamento es el siguiente: la secuencia de una proteína problema se clonaba fusionada a la del dominio de unión al DNA (DBD) del factor transcripcional dimérico LexN (en el plásmido pLexAN, que permite el crecimiento de la levadura en medio sin triptófano). A su vez, la secuencia de otra proteína problema se clona fusionada a la de su dominio de transactivación (AD) (en el plásmido pGAD-HA, que permite el crecimiento de la levadura en medio sin leucina). Si existe interacción entre ambas, el factor transcripcional queda reconstituido y es capaz de activar la transcripción de los genes reporteros de la estirpe NMY51 de S. cerevisiae, como HIS3 (que permite el crecimiento en medio sin histidina) o LacZ (cuya expresión produce color en los ensayos con 2-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) y X-Gal), entre otros.  45  Utilizando como cebo una construcción de expresión de un fragmento carboxilo-terminal de Brd2, este sistema fue aprovechado para rastrear una genoteca de cDNA en busca de nuevas interacciones. Se eligió para ello una genoteca comercial de embrión de ratón de 11 dpc clonada en el plásmido pGAD-HA (Biotech). Antes de las transformaciones masivas necesarias para analizar toda la genoteca (al menos 106 dobles transformantes), fue necesario valorar la activación de HIS3 que provocaban por sí solas las proteínas cebo y que podía provocar el crecimiento de numerosos falsos positivos. Estas pruebas de autoactivación se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante e implicaban la adición al medio selectivo final de 3AT, un inhibidor competitivo del producto de HIS3 que, a la concentración apropiada, era capaz de contrarrestar esa activación basal pero no una activación más potente provocada por una interacción real del sistema. La concentración de 3AT utilizada en el escrutinio de esta tesis fue de 3 mM. Los dobles transformantes capaces de crecer en medio selectivo sin histidina y con 3AT se sometían a ensayos cualitativos de actividad β-galactosidasa, a modo de segunda verificación. Si ésta resultaba positiva, sus plásmidos pGAD-HA eran extraídos y su secuencia analizada. Si se deseaba concretar qué dominios estaban implicados en las interacciones descubiertas, se procedía de la misma manera pero subdividiendo las secuencias originales y comparando, mediante ensayos cuantitativos de actividad β-galactosidasa, los diferentes niveles de expresión de LacZ generados por cada par de plásmidos. 2.6.8. Ensayo de la actividad β-Galactosidasa. Para el análisis de la actividad β-Galactosidasa, se sembraban las colonias problema y sus controles en cajas de medio selectivo de 10 cm de diámetro y se incubaban a 30º C durante 72 h. Una vez se adquiria la biomasa suficiente, se calentaban 5 ml de tampón de fosfato potásico 1 M (pH 7) a 50º C, se fundían 5 ml de agarosa 1% (p/v) en H2O Milli-Q y se dejaban reposar a la misma temperatura. Todo lo anterior se combinaba con 100 μl de SDS 10% (p/v), 600 μl de N, N’-dimetil-formamida (DMF) y 100 μl de X-Gal 4% (p/v) en DMF y la mezcla se vertía directamente sobre las levaduras. La caja se dejaba secar durante 5 min y se incubaba en oscuridad a 30º C. Los resultados eran visibles tras un periodo de entre 30 min y 12 h, según la estabilidad de la interacción.  46  Tampón de fosfato potásico 1 M (pH 7): 174,2 g/l de K2HPO4; 136,1 g/l de KH2PO4. 2.6.9. Extracto diferencial con distintas cantidades de sal. Para el extracto diferencial, 3,5x106 células P19 se resuspendían primero en 250 µl de tampón A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Triton X-100, Complete protease inhibitor cocktail (Roche)) con 100 mM de NaCl. Tras 10 minutos de incubación a 4ºC y una centrifugación de 10 min a 3.500xG, el sobrenadante resultante constituía la fracción A y el pellet resultante se incubaba con 250 µl del mismo tampón pero en este caso contenía una concentración de NaCl de 520 mM. Tras 30 min de incubación a 4ºC, se centrifugaba a 12.000xG durante 15 min y el sobrenadante resultante constituía la fracción B. Se analizaban por Western Blot 12 µl de cada fracción. 2.7. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS E INMUNOHISTOQUÍMICOS. 2.7.1. Experimentos de Western Blot. Para realizar los ensayos de Western Blot, en vez de teñir las proteínas analizadas mediante SDS-PAGE, éstas se transferían a una membrana de nitrocelulosa Trans-Blot® Transfer Medium (Bio-Rad) o de PVDF (Biorad). La transferencia se llevaba a cabo con un aparato de transferencia semi-seca Fastblot B 33 (Biometra). El proceso se verificaba tiñendo las proteínas de la membrana con una solución de rojo Ponceau S, tras lo cual se añadía solución de bloqueo durante 1 h. Los anticuerpos contra la proteína problema (anticuerpos primarios) se añadían en la misma solución, y se dejaban actuar durante 90 min en una cámara húmeda. Posteriormente, la membrana se lavaba durante 3 periodos de 8 min con solución de lavado y se incubaba de nuevo durante 45 min con anticuerpos conjugados con peroxidasa, capaces de reconocer la región constante de los primarios. Tras 3 nuevos lavados, la membrana se revelaba con el sistema de inmunodetección quimioluminiscente ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la detección de la señal luminosa se utilizaban películas fotográficas Hyperfilm MP (GE Healthcare) y el aparato Hyperprocessor SRX-101A (GE Healthcare). Tampón de transferencia semi-seca: Tris 48 mM; SDS 0,0375% (p/v); glicina 39 mM; metanol 40% (v/v).  47  Solución de bloqueo: leche desnatada en polvo (Central Lechera Asturiana) 5% (p/v) en solución de lavado o BSA (SIGMA) 5% (p/v) en solución de lavado. Solución de lavado (PBT): monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween-20) 0,1% (v/v) en PBS 1X. PBS 1X: NaCl 0,136 M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4·12H2O 10 mM; KH2PO4 1,4 mM. Solución de rojo Ponceau S: Ponceau S (SIGMA) 0,1% (p/v); ácido acético 5% (v/v). 2.7.2 Inmunoprecipitación de proteínas. Tras un lavado con PBS 1X, las células de una caja de 10 cm de diámetro (5·106 células) se desprendían mediante un rascador en presencia de 1 ml de PBS frío. Después, y siempre en hielo, las células se rompían en un tubo de 1,5 ml mediante incubación con 250 µl de tampón IP. Tras incubar durante 10 min en agitación y a 4ºC, se añadía gota a gota NaCl hasta una concentración final de 600 mM. Tras incubar 10 min en agitación a 4ºC, se centrifugaba a 3.500xG durante 10 min a 4ºC y se descartaba el pellet. El sobrenadante se diluía 3 veces con tampón de dilución. Se utilizaban 400 ng de proteína total por ensayo y se incubaban toda la noche con 30 µl de una matriz anti-flag M2 Affinity Gel (SIGMA) equilibrada al 50% en tampón IP, en el caso de proteínas transfectadas. Para proteínas endógenas, se utilizaban 30 μl de matriz rProtein A Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada al 50% en tampón IP. Las mezclas se incubaban a 4º C y en agitación parabólica durante 1 h. Con esto se eliminaba el posible ruido de fondo debido a la unión inespecífica a la matriz de algunas proteínas del extracto. En el caso de las proteínas endógenas, los sobrenadantes se incubaban o/n, a 4º C y en agitación parabólica con la cantidad apropiada de anticuerpo capaz de precipitar la proteína de interés (siguiendo instrucciones del fabricante ó 5 µl del suero del anticuerpo antimBrd2I generado en el laboratorio, según el caso). En el caso de las proteínas endógenas, se añadían a cada tubo 30 μl de matriz Protein A Sepharose 4 Fast Flow equilibrada al 50% en tampón IP. Las mezclas se incubaban a 4º C y en agitación parabólica durante 1 h. Durante este tiempo la matriz quedaba unida a la región constante de los anticuerpos presentes en las muestras. En cualquier caso, la matriz de cada tubo se lavaba 3 veces con tampón de lavado y se resuspendía agitando en vortex con 20 μl de tampón de carga desnaturalizante 2X. Las muestras se analizaban mediante SDS-PAGE y experimentos de Western Blot. PBS 1X: NaCl 0,136 M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4·12H2O 10 mM; KH2PO4 1,4 mM.  48  Tampón IP: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Triton X-100, Complete protease inhibitor cocktail (Roche), 150 mM NaCl. Tampón de dilución: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, Complete protease inhibitor cocktail (Roche). Tampón de lavado: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,3% Triton X-100, Complete protease inhibitor cocktail (Roche), 150 mM NaCl. Tampón de carga desnaturalizante 4X: Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8); glicerol 32% (v/v); SDS 6,4% (p/v); 2mercaptoetanol 16% (v/v); azul de bromofenol 0,005% (p/v). 2.7.3 Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP). 1 x 106 células HEK293T o P19 sembradas en placas de 100 mm se transfectaban con lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se fijaban 48 horas después añadiendo la solución de fijación, que contenía formaldehido, directamente al medio de cultivo (la concentración final de formaldehido era 1%) y se incubaba 10 min a 37ºC. Luego, la fijación se paraba añadiendo Glicina a una concentración final de 0,1M e incubando la placa durante 5 min a temperatura ambiente. El medio se cambiaba y las células se lavaban dos veces usando PBS frío complementado con el coctel de inhibidores de proteasas Complete (Roche). Luego, las células se recogían con un rascador en PBS con inhibidores y se centrifugaban durante 5 min a 3600 x g y 4ºC y se resuspendían en 1 ml de tampón de lisis. El lisado se sonicaba en hielo para obtener fragmentos de DNA de entre 400 y 500 pb usando un baño de ultrasonidos Bioruptor (Diogenode), fijado a la máxima potencia y con ciclos de encendido y apagado de 30 segundos durante 7,5 minutos. Después de la sonicación, el material se centrifugaba 5 min a 3600 x g y 4ºC para tomar el sobrenadante (cromatina) y descartar el pellet (restos celulares). Una alícuota de la cromatina se trataba con Proteinasa K y el DNA se recuperaba mediante extracción con fenol/cloroformo para cuantificar la concentración del DNA y comprobar el tamaño de los fragmentos de DNA en un gel de agarosa al 1,2%. Para llevar a cabo la inmunoprecipitación de la cromatina, se utilizaban de 20 a 30 µg de cromatina diluida 10 veces en tampón de ChIP. Para reducir la precipitación inespecífica, la cromatina diluida se incubaba con 30 µl de matriz de Agarosa conjugada a proteína A (GE Healthcare) bloqueada con DNA de esperma de salmón y BSA durante 4 horas a 4ºC en agitación. La cromatina se separaba de la matriz por centrifugación, se le añadían 30 µl de una matriz de sefarosa conjugada con anticuerpos que reconocen el epítopo Flag (Sigma) al 50% en tampón de ChIP, y se  49  incubaba durante toda la noche a 4ºC en agitación. En el caso de que se inmunoprecipitara la proteína Brd2 endógena, se añadían a la cromatina 20 µl del suero de conejo que contenía el anticuerpo anti-mBrd2N (o el mismo volumen de suero pre-inmune como control) y se incubaba toda la noche a 4ºC en agitación. En este último caso, a la mañana siguiente se añadían 30 µl de matriz de Agarosa conjugada a proteína A (GE Healthcare) bloqueada con DNA de esperma de salmón y BSA y se incubaba durante 2 horas a 4ºC en agitación. En todos los casos, se retiraba una alícuota de cromatina para el análisis de la cantidad inicial de DNA problema en cada caso. Tras la incubación, la matriz se compactaba por centrifugación (1 min a 1500 x g a 4ºC) y el sobrenadante, que contenía cromatina no retenida, se descartaba. La matriz se lavaba durante 5 min a 4ºC en rotación con cada uno de los tres tampones de lavado (1, 2 y 3) y luego dos veces con el tampón TE. El DNA se eluía incubando dos veces la matriz lavada con tampón de elución durante 15 min a temperatura ambiente y en rotación. El sobrenadante se recuperaba por centrifugación (5 min a 1500 x g a temperatura ambiente) y se añadía NaCl 0,2M a las muestras para incubarlas toda la noche a 65ºC y revertir la fijación inicial con paraformaldehido. Posteriormente, se trataban las muestras con Proteinasa K y el DNA se recuperaba mediante extracción con fenol/cloroformo. El DNA se precipitaba con 100% de etanol, 10% de acetato sódico y 0,1% de glicógeno, lavando con 70% de etanol y finalmente se resuspendía el pellet de DNA en 30-40 µl de agua libre de DNasas. La cuantificación de las regiones de interés del DNA resultante se realizaba mediante PCR a tiempo real con el sistema 7500 FAST Real-Time PCR System de Applied Biosystems. Tampón de fijación: 50mM Hepes pH8.0; 0.1M NaCl; 1mM EDTA pH8.0; 0.5mM EGTA pH8.0. Tampón de lisis: 5mM Pipes pH8.0; 85mM KCl; 0.5% NP-40 Tampón de lisis nuclear: 1% SDS; 10mM EDTA pH8.0; 50mM Tris-HCl pH8.1 Tampón de ChIP: 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA pH8.0; 16.7 mM Tris-HCl pH8.1; 167mM NaCl Tampón de lavado 1: 0.1% SDS; 1% Triton-X100; 2mM EDTA pH8.0; 20mM Tris-HCl pH8.1; 150mM NaCl Tampón de lavado 2: 0.1% SDS; 1% Triton-X100; 2mM EDTA pH8.0; 20mM Tris-HCl pH8.1; 500mM NaCl Tampón de lavado 3: 0.25M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxicholate; 1mM EDTA pH8.0; 10mM Tris-HCl pH8.1 Tampón de elución: 1% SDS, 0.1M NaHCO3  56  El número de acceso de las secuencias de aminoácidos utilizadas en los alineamientos de secuencias era: hBrd2: NP_001106653.1 hBrd3: NP_031397.1 hBrd4: NP_490597.1 hBrdt: NP_001229735.1 mBrd2: NP_034368.2 gBrd2: NP_001025845.1 xBrd2: NP_001128282.1 cBrd2: NP_871879.1 oBrd2: BAD93258.1 dBrd2: NP_001259321.1 sBdf1: CAA79377 sBdf2: CAA98636.1   57   58  3. RESULTADOS 3.1. Análisis funcional de distintos dominios de la proteína Brd2 3.1.1. Las secuencias NLS1 y NLS2 están implicadas de manera independiente en la localización nuclear de Brd2 Teniendo en cuenta que la función mejor caracterizada de la proteína Brd2 es su papel en la transactivación de genes importantes para la progresión del ciclo celular, como CcnD1, CcnA2 o Dhfr, (Denis et al., 2000; LeRoy et al., 2008; Sinha et al., 2005) y la creciente evidencia del papel que factores implicados en la regulación del ciclo celular desempeñan en la diferenciación neuronal (McClellan et al., 2006), resulta de gran interés el estudio de la implicación de Brd2 en la coordinación de los procesos de división celular y diferenciación neuronal. Dicho interés se ve reforzado por la abundante expresión del gen Brd2 en el sistema nervioso central de embriones de ratón (Crowley et al., 2004; Gyuris et al. 2009; Shang et al., 2009; Shang et al., 2011; Taniguchi et al., 2001), por los defectos en el desarrollo del tubo neural asociados a la ausencia de la proteína Brd2 (Gyuris et al., 2009) y por la evidencia de que la proteína Brd2 se detecta tanto en progenitores en proliferación como en neuronas postmitóticas en el tubo neural y en los ganglios de la raíz dorsal del embrión de ratón (Crowley et al., 2004). Otro aspecto interesante de la proteína Brd2 consiste en que tanto en el tubo neural como en los ganglios de la raíz dorsal del embrión de ratón, si bien la proteína se detecta en el núcleo en progenitores neuronales que proliferan, su localización se vuelve parcialmente citoplásmica en neuronas postmitóticas (Crowley et al., 2004). Las células P19, derivadas de un teratocarcinoma de ratón (Jones-Villeneuve et al., 1982) se pueden diferenciar in vitro a tipos celulares de linaje endodérmico, mesodérmico y ectodérmico (McBurney et al., 1982). Se ha demostrado que el tratamiento de células P19 con ácido retinoico induce su diferenciación neuronal (Jones-Villeneuve et al., 1983). El protocolo de diferenciación incluye dos fases (Jones-Villeneuve et al., 1983). En la primera fase las células se mantienen en suspensión en presencia de ácido retinoico durante 4 días. En este período se induce una parada del ciclo celular en la fase G1 y las células se agregan formando unas estructuras esféricas llamadas cuerpos embrioides. En la segunda fase los cuerpos embrioides se disgregan y se transfieren a placas adherentes donde se mantienen varios días en ausencia de ácido retinoico. En este período tiene lugar la emisión de neuritas y se produce la diferenciación terminal. Se ha escogido este modelo de  59  diferenciación neuronal para analizar en primer lugar la expresión de los genes Brd2, Brd3 y Brd4 durante el proceso de diferenciación neuronal. En la Figura 7, en la que se representa el nivel relativo de expresión de los genes Brd2, Brd3 y Brd4 en células P19 en condiciones de crecimiento, tratadas con ácido retinoico durante 4 días y tras 6 días en placas adherentes después de retirar el ácido retinoico, se observa que la expresión de dichos genes se mantiene a lo largo del proceso de diferenciación neuronal. En el análisis se incluye el nivel de expresión del gen Oct4, marcador de pluripotencia cuya expresión es reprimida al inicio del programa de diferenciación (Yamada et al., 2013) y la expresión del gen Nfmt (neurofilamentos), marcador neuronal que se activa tras la inducción de la diferenciación neuronal (Weber et al., 1983). Figura 7. Los niveles de expresión de los genes Brd2, Brd3 y Brd4 se mantienen tras inducir el proceso de diferenciación neuronal en células P19. Niveles de expresión de los genes indicados determinados mediante PCR en tiempo real a partir de cDNA obtenido por retrotranscripción de RNA total de células P19 no tratadas (control), tratadas con ácido retinoico durante 4 días (AR) o diferenciadas a neuronas (DIF) tras 6 días de cultivo en placas adherentes después del tratamiento con ácido retinóico. La expresión de Oct4, marcador de pluripotencia, se reduce drásticamente al principio del proceso de diferenciación mienras que la expresión de Nfmt, marcador espécifico de neuronas, se incrementa a lo largo del proceso. El valor de expresión para cada gen y condición se normalizó respecto al valor de expresión del gen control de expresión constitutiva Gapdh en cada condición. Los valores representados se relativizaron al valor de expresión correspondiente a células P19 no diferenciadas (control). En la gráfica se han representado valores medio y desviación estándar correspondientes a tres determinaciones independientes. Teniendo en cuenta que el gen que codifica la proteína Brd2 mantiene sus niveles de expresión a lo largo del proceso de diferenciación neuronal, se procedió a continuación a analizar la expresión de la proteína en células en condiciones de 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 control AR DIF Neurofilamentos Oct4 Brd2 Brd3 Brd4 Niveles relativos de expresión Nfmt Oct4 Brd2 Brd3 Brd4  60  crecimiento y de diferenciación. Para ello se utilizaron anticuerpos desarrollados en nuestro laboratorio que reconocen selectivamente la proteína Brd2 de ratón. Mediante experimentos de inmunofluorescencia se detectó la proteína en el núcleo de células P19 en condiciones de crecimiento y parcialmente en el citoplasma tras inducir el proceso de diferenciación neuronal (Figura 8). Figura 8. Localización de la proteína Brd2 endógena en células P19. Inmunofluorescencia de células P19 en condiciones de proliferación (-AR) y tras aplicarles el protocolo completo de diferenciación mediado por ácido retinoico (+RA). La proteína endógena Brd2 se detectó con anticuerpos obtenidos contra Brd2 (verde) y el marcador neuronal βIII-tubulina con el anticuerpo Tuj-1 (rojo). El DNA se tiñó con DAPI. La barra de escala equivale a 20 µm. Este cambio de localización puede ser relevante para el proceso de diferenciación neuronal e implicar una alteración de las funciones de Brd2. Un cambio de localización celular de Brd2 ha sido previamente descrito en fibroblastos de ratón BALB/3T3, donde la proteína aparece parcialmente en el citoplasma en células cultivadas en ausencia de suero. La adición de suero al cultivo tiene un efecto mitogénico e induce la acumulación de Brd2 en el núcleo, perdiéndose la señal citoplásmica (Guo et al., 2000). En esta línea celular, se ha demostrado que la secuencia conservada KKKKRK (que incluye los residuos de aminoácido 552 a 557), constituye una señal de localización nuclear o NLS (Nuclear Localization Signal) responsable de la acumulación de Brd2 en el núcleo tras la adición de suero (Guo et Brd2 DAPIβIII-tubulina +AR -AR  61  al., 2000). Esta NLS se encuentra en una región conservada localizada entre el segundo bromodominio y el dominio ET, denominada motivo B (Paillisson et al., 2007), y no estudiada previamente. Sin embargo, se comprobó que en células P19 la pérdida de esta secuencia no impedía la localización nuclear de la proteína (Figura 9). Figura 9. La pérdida de la región NLS2 no afecta a la localización subcelular de Brd2. (A) Esquema de las proteínas analizadas. Se indica a la derecha la deleción (∆) realizada en la construcción ∆NLS2. (B) Localización celular de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag expresadas en células P19 mediante transfección transitoria. Las proteínas se visualizaron mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra el epítopo Flag y microscopía confocal. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 75 células analizadas. La barra de escala equivale a 10 µm. BD1, bromodominio 1; BD2, bromodominio 2; mA, motivo A; mB, motivo B; ET, dominio extra terminal; NET, dominio N-terminal del dominio ET; SEED, dominio rico en residuos de S, T, E y D. Con el objetivo de definir el dominio o los dominios involucrados en la localización nuclear de Brd2 en células P19, se analizó mediante inmunoflourescencia, la localización celular de distintos fragmentos de la proteína Brd2 etiquetados con un epítopo Flag (Figura 10A). Así, se comprobó que tanto la mitad amino-terminal (fragmento BD1+2, que incluye los residuos de aminoácido 1 a 472) como la mitad carboxilo-terminal (fragmento ∆BD1+2 que incluye los residuos de aminoácido 473 a ∆NLS2 ∆544-560 Flag DAPI Brd2∆NLS2 ET BD2BD1 mB NET SEED Brd2 mA 85 173 267 336 358 446 509 555 637 701 771 798 A B  62  798) de Brd2 mostraban una localización nuclear, lo cual indicaba la presencia de secuencias implicadas en el importe nuclear en cada una de las mitades (Figura 10). Figura 10. Localización celular de distintos fragmentos de la proteína Brd2. (A) Esquema de los distintos fragmentos de la proteína Brd2 analizados. En la parte superior se indican los distintos dominios descritos en la proteína Brd2. Los números indican los residuos de aminoácido que delimitan los distintos dominios. A la izquierda se muestra el nombre utilizado para designar cada fragmento y a la derecha se indican los aminoácidos que constituyen, o de los que carece (∆), cada proteína. (B) Localización celular de las proteínas indicadas en el esquema etiquetadas con un epítopo Flag, expresadas en células P19 y visualizadas mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal con anticuerpos contra el epítopo Flag. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 70-100 células analizadas por construcción. La barra de escala equivale a 10 µm. Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las proteínas Brd2, Brd3 y Brd4 de ratón revela la presencia de dos secuencias conservadas ricas en residuos básicos (Figura 11): las secuencias 274KKKGVKRK281 y 544KRKREKKKKKKKRKEKH560, localizadas respectivamente en dos regiones conservadas y designadas previamente como motivos A y B (Paillisson et al., 2007). BD1+2∆BRO∆mA+ ∆2xNLS ∆mA+/mB+ ∆mB+ Flag DAPI BD1+2 1-472 ∆BRO 473-798 ∆mA+ ∆192-344 ∆514-619 ∆mA+/mB+ ∆194-344/514-619 ∆2xNLS ∆274-281/544-560 ∆mB+ ET BD2BD1 mB NET SEED Brd2 mA 85 173 267 336 358 446 509 555 637 701 771 798 A B  63  La segunda secuencia incluye el fragmento 552KKKKRK557, previamente caracterizado como NLS en fibroblastos BALB/3T3 de ratón (Guo et al., 2000). Dada la conservación de ambas secuencias, y teniendo en cuenta que la presencia de residuos básicos es característico de secuencias NLS (Xu et al., 2010), se analizó el impacto de la pérdida de los motivos A y B, en la localización celular de Brd2. Como se observa en la Figura 10, tanto la proteína carente del motivo A (∆mA) como la proteína carente del motivo B (∆mB) se localizan en el núcleo. Sin embargo, la pérdida conjunta de ambos motivos (∆mA/∆mB) conduce a una localización citoplásmica y a la exclusión nuclear de Brd2. Una deleción más reducida de ambas regiones (fragmentos señalados en la Figura 11) también conduce a una localización mayoritariamente citoplásmica (Figura 10, proteína ∆2xNLS), demostrando la implicación de ambas secuencias, que hemos designado como NLS1 y NLS2, de manera independiente, en la localización nuclear de Brd2. Figura 11. Alineamiento de los motivos conservados A y B en proteínas BET. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones que incluyen los motivos conservados A (parte superior) y B (parte inferior) de las proteínas Brd2, Brd3 y Brd4 de ratón. El fondo negro indica los residuos conservados en al menos dos de las secuencias. Los motivos A (mA) y B (mB), según se describen en (Paillison et al., 2007) aparecen subrayados en verde. Los recuadros rojos indican secuencias conservadas ricas en residuos de aminoácido básicos (regiones 273-282 y 552-557 en la proteína Brd2). BD2BD1 mB NET SEED Brd2 mA  64  3.1.2. Mutaciones en los bromodominios de Brd2 tienen un efecto dominante negativo sobre la incorporación de BrdU Teniendo en cuenta el papel de la proteína Brd2 en la transactivación de genes de ciclo celular, se investigó el efecto de la sobreexpresión de la proteína Brd2 y de versiones mutantes de éstas en la incorporación de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), nucleótido sintético análogo de la timidina que se incorpora en el DNA durante la replicación del mismo (fase S del ciclo celular). Para los ensayos de incorporación, el BrdU se añadía al medio de cultivo dos horas antes de procesar las células. Teniendo en cuenta que se ha descrito que la asociación de Brd2 a la cromatina tiene lugar a través de los bromodominios (Dey et al., 2003) y que Brd2 interacciona con el factor de transcripción E2F1 a través de la región carboxilo-terminal (Denis et al., 2000), también se incluyeron en los ensayos versiones de Brd2 carentes de la mitad aminoterminal (∆BRO), que incluye los bromodominios, o de la región carboxilo-terminal implicada en la interacción con el factor E2F1 (∆Cter). Además se ha descrito que el cambio de glutamina a alanina en la posición 78 de Brd2 (Q78A) y el cambio de asparagina a alanina en la posición 382 (N382A) afectan respectivamente a la capacidad del primer y el segundo bromodominio de Brd2 para interaccionar in vitro con un péptido correspondiente a la cola de la histona H4 acetilada en la lisina 12 (Nakamura et al., 2007; Huang et al., 2007). Por lo tanto, para evaluar el efecto de la pérdida de función de cada bromodominio por separado, también se incluyeron en este análisis los mutantes Q78A y N382A de Brd2. Por último, se ha indicado que el gen Brd2 da lugar a dos transcritos de diferente tamaño (3,8 Kb y 4,6 Kb) en la mayoría de los órganos analizados (Thorpe et al., 1998), de los cuales sólo el transcrito de 3,8 Kb da lugar a una proteína Brd2 completa (Shang et al., 2011). Se han propuesto dos codones de inicio de la traducción en este transcrito (Thorpe et al., 1998). Estos codones de inicio de la raducción (ATG1 y ATG2) se localizan en regiones del transcrito que corresponden a exones diferentes. Existe otro transcrito alternativo de 3 Kb del gen Brd2 específico de testículos (Thorpe et al., 1998) y que sólo incluye el segundo de los dos codones de inicio de la traducción. Si bien la proteína Brd2 completa se traduce a partir de ATG1, el transcrito de 3Kb solo incluye en su secuencia ATG2, por lo que la proteína de Brd2 traducida a partir de ese transcrito carece de los primeros 119 residuos de aminoácido, y por lo tanto de parte del primer bromodominio (Thorpe et al., 1998). La funcionalidad de esta isoforma alternativa (Brd2-iso) no había sido caracterizada previamente y decidimos incluirla en nuestro estudio de incorporación de BrdU. En la Figura 12A se muestra un esquema de las distintas proteínas utilizadas en los ensayos de incorporación. Tras transfectar  65  células P19 con vectores de expresión de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag, y después de someterlas a un pulso de dos horas en presencia de BrdU, las células se analizaron mediante inmunofluorescencia para detectar el epítopo Flag y la molécula BrdU. Como control, todas las construcciones se co-transfectaron con un vector de expresión de la proteína GFP. En la Figura 12B se muestra la proporción de células que incorporaban BrdU, respecto del total de células transfectadas (células que expresaban la proteína GFP). Figura 12. Efecto de la sobreexpresión de distintos mutantes de la proteína Brd2 sobre la incorporación de BrdU. (A) Esquema de las proteínas analizadas. Se indica la posición de los residuos de aminoácido Q78 y N428, mutados en las construcciones Q78A y N428A respectivamente. (B) Porcentaje de incorporación de BrdU, tras un pulso de dos horas, en células P19 transfectadas con vectores de expresión de las proteínas indicadas. Como control se utilizó el vector de expresión vacío. La molécula BrdU se detectó mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra BrdU. Todas las construcciones se cotransfectaron con un vector de expresión de la proteína GFP y el porcentaje de incorporación se refirió en cada caso al total de células transfectadas, determinado por expresión de este marcador. Se representa el valor medio y la desviación típica correspondiente a tres experimentos independientes. La significación de las diferencias respecto al control se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student, obteniéndose los siguientes valores de significación respecto a las diferencias con el control: *P=0.2-0.8, **P=0.1, ***P<0.02. Como se observa en la Figura 12, la sobreexpresión de las proteínas ∆BRO y ∆Cter no tuvo un efecto significativo sobre la incorporación de BrdU respecto al caso control y respecto a la sobreexpresión de Brd2, que indujo un pequeño aumento en la proporción de células que incorporaban BrdU. En cambio, la sobreexpresión de las 0 10 20 30 40 50 60 Control Brd2 ∆BRO ∆Cter Q78A N428A Brd2-iso % incorporación de BrdU ∆BRO 473-798 ET BD2BD1 mB NET SEED Brd2 mA 85 173 267 336 358 446 509 555 637 701 771 798 Q78 N428 ∆Cter 1-721 Brd2-iso 120-798 A B * ** *** * * ***  72  Como se observa en la Figura 17, la adecuada asociación de las proteínas Brd3 y Brd4 con los cromosomas requiere, al igual que en el caso de Brd2, la presencia del motivo B. Un análisis detallado de la dinámica de asociación de Brd2 con los cromosomas a lo largo de la mitosis reveló que la proteína Brd2 carente del motivo B, aunque aparece completamente disociada de los cromosomas en las primeras fases de la mitosis (profase y metafase), recupera cierta capacidad de asociación a partir de anafase (Figura 18). Figura 18. La proteína Brd2 carente del motivo B recupera la capacidad de asociarse con los cromosomas en las últimas fases de la mitosis. Localización de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag, expresadas en células P19 y visualizadas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra el epítopo Flag y microscopía confocal. Se analizó la localización de las proteínas indicadas durante las primeras (profase-metafase; temprana) o últimas (anafase-telofase; tardía) fases de la mitosis. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 14-25 células analizadas por construcción. La barra de escala equivale a 10 µm. Este fenómeno se observó también en el caso de las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B, como se muestra en la Figura 19. Esta observación sugiere que la interacción de las proteínas Brd2, Brd3 y Brd4 con los cromosomas sigue una dinámica bifásica a lo largo de la mitosis: una primera fase (mitosis temprana) que comprende desde profase a metafase, donde el motivo B es más importante para la retención de Brd2 y una segunda fase (mitosis tardía) que comprende desde el inicio de la anafase al final de la mitosis, donde se observa un cierto grado de reasociación cromosómica en ausencia del motivo B. Se ha descrito previamente que la mitosis discurre siguiendo una dinámica bifásica respecto a los niveles de acetilación de las histonas (Kruhlak et al., 2001). Al inicio de la mitosis se observa una desacetilación Brd2 temprana tardía ∆mB tempranatardía Flag DAPI  73  global de las histonas y a partir de metafase algunas marcas de acetilación comienzan a recuperarse, por lo que se observa un incremento en los niveles globales de acetilación de las histonas (Kruhlak et al., 2001). Figura 19. Las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B también recuperan la capacidad de asociarse a los cromosomas durante las últimas fases de la mitosis. Localización de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag, expresadas en células P19 y visualizadas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra el epítopo Flag y microscopía confocal. Se analizó la localización de las proteínas indicadas durante las primeras (profase-metafase; temprana) o últimas (anafase-telofase; tardía) fases de la mitosis. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 14-25 células analizadas por construcción. La barra de escala equivale a 10 µm. Teniendo en cuenta que la interacción de la proteína Brd2 con los cromosomas tiene lugar a través de los bromodominios y que éstos reconocen selectivamente marcas de acetilación en las histonas, se investigó la posibilidad de que el motivo B estuviera implicado en la estabilización de la unión de la proteína Brd2 a los cromosomas especialmente en condiciones de hipoacetilación de las histonas. Para investigar este aspecto se analizó mediante inmunofluorescencia la localización de las proteínas silvestre y carente del motivo B etiquetadas con un epítopo Flag durante etapas tempranas de la mitosis en células P19 tratadas con el inhibidor de desacetilasas de histona Tricostatina A (TSA). Como se observa en la Figura 20, en estas condiciones la proteína Brd2 carente del motivo B se mantenía unida a los cromosomas durante la mitosis temprana, por lo que dicho motivo resultaba especialmente importante para el reconocimiento o la estabilidad de la asociación con los cromosomas hipoacetilados. Como control negativo, se comprobó que la proteína Brd2 carente de un fragmento del primer bromodominio (del residuo de aminoácido 109 al 167) no interaccionaba con los cromosomas mitóticos en presencia de TSA Brd4∆mB tardía temprana Brd3∆mB tempranatardía Flag DAPI  74  (proteína ∆BD1, Figura 15), poniendo de manifiesto una vez más la esencialidad de la integridad de los bromodominios para el adecuado reconocimiento de las colas de histona acetiladas por parte de la proteína Brd2. Figura 20. La proteína Brd2 carente del motivo B no se disocia de los cromosomas mitóticos en presencia del inhibidor de desacetilasas de histonas TSA. (A) Esquema de las proteínas analizadas. (B) Localización de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag, expresadas en células P19 y visualizadas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra el epítopo Flag y microscopía confocal. Se analizó la localización de las proteínas indicadas en células P19 tratadas con 500 ng/ml TSA (+TSA), o sin tratar (-TSA), durante 4 horas antes de procesarlas para su análisis. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 14-25 células analizadas por construcción. La barra de escala equivale a 10 µm. Por último, se investigó si, al igual que ocurre con Brd2, la inhibición de la desacetilación de histonas mediante tratamiento con TSA durante la mitosis temprana impedía la disociación de las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B de los cromosomas. Como se observa en la Figura 21, las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del Brd2∆mB -TSA +TSA-TSA +TSA ∆BD1 -TSA+TSA Flag DAPI Flag DAPI B ET BD2BD1 mB NET SEED Brd2 mA 85 173 267 336 358 446 509 555 637 701 771 798 ∆BD1 ∆109-167 A ∆mB ∆505-557  75  motivo B se mantuvieron unidas a los cromosomas durante la mitosis temprana en células P19 tratadas con TSA, por lo que, al igual que ocurre con Brd2, el motivo B es especialmente relevante para la asociación de las proteínas Brd3 y Brd4 con los cromosomas en condiciones de hipoacetilación de histonas. Figura 21. Las proteínas Brd3 y Brd4 carentes del motivo B no se disocian de los cromosomas mitóticos en presencia de TSA. Localización de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag, expresadas en células P19 y visualizadas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra el epítopo Flag y microscopía confocal. Se analizó la localización de las proteínas indicadas tratadas con 500 ng/ml TSA (+TSA), o sin tratar (- TSA), durante 4 horas antes de procesarlas para su análisis. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos el 95% de 14-25 células analizadas por construcción. La barra de escala equivale a 10 µm. 3.2.2. El motivo B está implicado en la asociación de la proteína Brd2 con la cromatina en interfase Con el objetivo de investigar si el motivo B resultaba también importante para la asociación de la proteína Brd2 con la cromatina en interfase se comparó, en células P19 creciendo exponencialmente, la capacidad de extracción con distintas concentraciones de sal de la proteína silvestre con la de la proteína Brd2 carente del motivo B. En condiciones de crecimiento exponencial se determinó una proporción de células en interfase de 94%±3. Como control negativo se utilizó una construcción de expresión del mutante doble Y152KN428A de Brd2, descrito anteriormente (Figura 15), afectado en la capacidad de cada uno de los bromodominios de reconocer marcas de acetilación y por tanto de interaccionar con los cromosomas. Para analizar la estabilidad de la asociación a la cromatina de las proteínas indicadas, las células P19 se transfectaron con construcciones de expresión de dichas proteínas etiquetadas con un epítopo Flag, para a continuación someterlas a extracción nuclear con dos Brd3∆mB -TSA +TSA -TSA +TSA Brd4∆mB Flag DAPI  76  cantidades distintas de sal y detección de las proteínas etiquetadas mediante la técnica de Western Blot. Así, las células fueron sometidas secuencialmente a extracción con concentraciones de NaCl de 100 y 520 mM. Cuanto más estable es la unión de una proteína a la cromatina, mayor es la cantidad de sal requerida para su extracción. Figura 22. La asociación de Brd2 con la cromatina requiere la presencia del motivo B. Células P19, transfectadas con las construcciones indicadas, etiquetadas con un epítopo Flag, fueron sometidas secuencialmente a extracción de proteínas con concentraciones de NaCl de 100 y 520 mM. Las proteínas extraídas fueron analizadas mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo Flag. En cada carril se analizó un 10% del volumen total de cada extracto. YKNA, Y152KN428A. Como se observa en la Figura 22, la extracción de la mayor parte de la proteína Brd2 requiere una concentración alta de NaCl (520 mM), mientras que la mayor parte de la proteína Brd2 carente del motivo B era extraída con concentraciones de NaCl de 100 mM, de manera similar a la proteína mutada en los bromodominios. Este resultado indica que la estabilidad de la asociación de Brd2 con la cromatina en células que se encuentran mayoritariamente en interfase se ve comprometida en ausencia del motivo B, por lo que el requerimiento del motivo B para la adecuada interacción con la cromatina no está restringido a la mitosis. Con el objetivo de poner en evidencia una implicación del motivo B de Brd2 en el reconocimiento de marcas de acetilación en histonas, se realizó un ensayo de pulldown in vitro con extractos de células P19 transfectadas con distintas construcciones de expresión Brd2 y un péptido sintético correspondiente a la cola de la histona H3 acetilada. Se ha descrito que, si bien los bromodominios son dominios que reconocen histonas acetiladas, existe cierta selectividad en el patrón de marcas de acetilación que cada bromodominio es capaz de reconocer (Hassan et al., 2007). En el caso de la kDa 130 100 130 100 130 100 Brd2 ∆mB YKNA WB anti-Flag  77  proteína Brd2, se ha determinado la interacción in vitro de cada uno de los bromodominios con varias marcas de acetilación de las histonas H3 y H4 (véase la sección de introducción). En experimentos in vivo con la proteína Brd2 humana completa también se ha puesto de manifiesto su interacción con varias de estas marcas, incluida la marca de acetilación de la lisina 14 en la histona H3 (H3K14Ac) (Ito et al., 2011; Kanno et al., 2004; LeRoy et al., 2008), por lo que para los experimentos de pull-down se utilizó un péptido de histona H3 diacetilado que incluía esta marca. El péptido, biotinilado e inmovilizado mediante microesferas magnéticas acopladas a estreptavidina, se incubó con extractos celulares procedentes de células transfectadas con construcciones de expresión de la proteína Brd2 y de la proteína Brd2 carente del motivo B etiquetadas con un epítopo Flag. Como control negativo, se utilizó la proteína Brd2 con la doble mutación Y152KN428A. Mediante la técnica de Western Blot se analizó y comparó la cantidad de proteína presente en los extractos celulares con la cantidad retenida por el péptido acetilado. Figura 23. El motivo B es necesario para la asociación in vitro de Brd2 con un péptido correspondiente a la cola de la histona H3 diacetilada. Extractos totales de proteínas de células P19 transfectadas con las construcciones de expresión de las proteínas indicadas, etiquetadas con un epítopo Flag, se incubaron con microesferas magnéticas acopladas a estreptavidina, cargadas con un péptido sintético biotinilado correspondiente a la cola de la histona H3 acetilada en los residuos K9 y K14. Las proteínas retenidas, así como el 20% de cada extracto utilizado, se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo Flag. Como se observa en la Figura 23, la proteína Brd2, en ausencia del motivo B, pierde gran parte de su capacidad de interaccionar con el péptido acetilado, aunque retiene algo de capacidad de asociación en comparación con el control negativo, el mutante Y152KN428A afectado en los bromodominios. retenido 20% extracto kDa 130 100 130 100 WB anti-Flag  78  3.2.3. Identificación de proteínas que interaccionen con Brd2 a través de la región que contiene el motivo B La importancia del motivo B en la localización nuclear de Brd2 y en su interacción con la cromatina en interfase y con los cromosomas durante la mitosis nos llevó a interesarnos por la caracterización funcional de dicho motivo. Como primer abordaje, se optó por la búsqueda de proteínas capaces de interaccionar con la región que incluye el motivo B en la proteína Brd2. Se han descrito previamente varias interacciones entre Brd2 y otras proteínas (véase la sección de Introducción). A pesar de las interacciones descritas, hasta la fecha del inicio del presente estudio no se había demostrado ninguna interacción que tuviera lugar gracias al motivo B, o a través de éste, que nos permitiera inferir un posible mecanismo que implicara al motivo B en la interacción de Brd2 con la cromatina. Para identificar proteínas capaces de interaccionar con la región de Brd2 que incluye al motivo B se realizó un escrutinio de dos híbridos en levaduras, utilizando como cebo una fusión de la mitad carboxiloterminal de Brd2 (del aminoácido 463 al 798) y la proteína LexA de E. coli, clonado en el vector pLexA-N del sistema DUALhybrid kit de Biotech (Figura 24A). Dicho fragmento incluía el motivo B de Brd2 y carecía de los dos bromodominios, evitando así el efecto negativo que conlleva la sobreexpresión de los bromodominios en el crecimiento del cultivo de las levaduras transformadas. La construcción cebo se cotransformó en la estirpe de levadura NMY51 junto con una genoteca comercial de embrión de ratón de 11 días de desarrollo, clonada en el vector pGAD-HA de Biotech. Se analizaron alrededor de 2x106 transformantes, de entre los cuales, 150 crecieron en medio selectivo. El análisis de los 150 clones aislados dio como resultado la identificación de 8 proteínas diferentes (Tabla 2). La interacción de estas proteínas con el fragmento de Brd2 codificado en la construcción cebo fue recomprobada mediante un ensayo de actividad β-galactosidasa. Así, en la Figura 24B se muestran colonias de levaduras cotransformadas con la construcción cebo y con las construcciones presa indicadas, sembradas en medio no selectivo en presencia del compuesto X-gal, sustrato de la enzima β-galactosidasa. En el caso de interacción entre las proteínas expresadas por el sistema de dos híbridos se induce el gen lacZ, que codifica la enzima β-galactosidasa. Esta enzima es responsable de la hidrólisis del sustrato X-gal, generándose un compuesto azul insoluble que colorea las colonias de levadura.  79  Figura 24. Identificación mediante la técnica de dos híbridos de proteínas que interaccionan con Brd2. (A) Esquema de la proteína recombinante de Brd2 carente de los bromodominios y fusionada al dominio de unión al DNA de LexA (Lex), utilizada en el escrutinio de dos híbridos. A la derecha se indican los aminoácidos incluidos en el fragmento. (B) Ensayo β-galactosidasa de levaduras cotransformadas con la construcción de Brd2 utilizada como cebo (pLexAN-Brd2) o el vector de expresión vacío como control (pLexAN), junto con cada uno de los clones presa indicados que se aislaron (clonados en el vector pGAD-HA). Como control negativo se cotransformaron levaduras con pLexAN-Brd2 y el vector de expresión pGAD-HA vacío. El color azul muestra interacción entre las proteínas. Tabla 2. Proteínas que interaccionan con Brd2 identificadas en el escrutinio de dos híbridos. *N, nuclear; C, citoplásmica; E, extracelular. Pleiotrofina Nipbl Brd3 Lyar Miosina-4 Brd7 Zfhx3 Laminina β-1 pLexAN-Brd2 + pGAD-HA + pLexAN-Brd2 + pLexAN + pLexAN-Brd2 + pLexAN pLexAN-Brd2 BD2BD1 mB NET SEED Brd2 M1-G798 T463-G798Lex A B Pleiotrofina Nipbl Brd3 Lyar Miosina-4 Brd7 Zfhx3 Laminina β-1 ID proteína Fragmento aislado (aminoácidos) Dominios deducidos (aminoácidos) Número de clones aislados 2 NP_032999.1 A32-A151 Región básica carboxiloterminal 1 NP_081983.2 I210-Q449 Región rica en glutamina (418 a 462) 141 NP_075825.3 Motivo B (432 a 501) 1 NP_079557.2 T154-K388 Posible NLS bipartita (182-198) y (280-295) 1 NP_034985.2 T941-K1047 Región rica en ácido glutámico (848 a 1586) 2 NP_036177.1 M1-P166 Bromodominio (148 a 218). NLS (67 a 82) 1 NP_796237.2 A552-A768 Homeobox (617 a 665). NLS (648 a 662) 1 NP_032508.2 G1715-K1805 - Localización celular * N,C N N N C N N E K402-K501  80  3.2.4. El motivo B media la interacción entre proteínas de la familia BET Sorprendentemente, 141 de los 150 clones analizados se correspondieron con un fragmento de la proteína Brd3 que incluía el motivo B de dicha proteína junto con secuencias adicionales (la mayoría de fragmentos analizados se correspondieron con la región de Brd3 comprendida entre los aminoácidos 402 y 501). En la Figura 25 se muestra un esquema del fragmento de Brd3 mayoritariamente aislado en el escrutinio de dos híbridos y la recomprobación, mediante crecimiento de las levaduras cotransformadas en medio selectivo, de su interacción con el fragmento de Brd2 utilizado para el escrutinio. Figura 25. Brd2 interacciona con un fragmento de Brd3 en el sistema de dos híbridos. (A) Esquema del fragmento de Brd3 codificado en la mayoría de los 141 clones aislados en el escrutinio. (B) Crecimiento en medio selectivo de levaduras cotransformadas con la construcción de Brd2 utilizada como cebo en el escrutinio (Lex (Brd2)) y con uno de los clones aislados que codifican el fragmento de Brd3 (GAD (Brd3)). Como control negativo, se cotransformaron los vectores correspondientes, pLexA y pGAD-HA vacíos (-).  Teniendo en cuenta que tanto la construcción cebo de Brd2 como la construcción presa de Brd3 aislada en el escrutinio contenían secuencias adicionales al motivo B, se determinó con precisión qué región estaba implicada en la interacción. Para ello, se realizó un ensayo de actividad β-galactosidasa en levaduras cotransformadas con las diferentes construcciones de expresión de los fragmentos de Brd2 y Brd3 indicados en la Figura 26. Al igual que en el escrutinio, las construcciones cebo fueron basadas en el vector pLexA-N y las construcciones presa en el vector pGAD-HA, indicando la coloración azul interacción entre las proteínas expresadas. Como se observa en la Figura 26, un fragmento correspondiente al motivo B de Brd2 no selectivo selectivo Lex (Brd2) GAD (Brd3) BD2 mB NET SEED BD2 mB BD2BD1 mB NET SEED Brd3 Fragmento aislado A B  81  era capaz de interaccionar con un fragmento correspondiente al motivo B de la proteína Brd3, así como con un fragmento correspondiente al motivo B de Brd2. Figura 26. El motivo B de Brd2 interacciona con el motivo B de Brd3 en el sistema de dos híbridos. Interacción entre las proteínas expresadas por las construcciones cebo (Lex) y presa (GAD) y los correspondientes vectores vacíos (-), según se indica en el esquema, visualizada por coloración azul de ensayos β-galactosidasa. Todas las construcciones cebo están basadas en Brd2 y todas las construcciones presa en Brd3, salvo en los casos indicados entre paréntesis. Considerando la conservación del motivo B entre las proteínas BET, se comprobó si el fragmento correspondiente al motivo B de la proteína Brd2 era capaz de interaccionar con un fragmento correspondiente al motivo B de la proteína Brd4, así como el resto de combinaciones posibles entre fragmentos con el motivo B de las proteínas Brd2, Brd3 y Brd4. Como se observa en la Figura 27, el motivo B de Brd2, Brd3 o Brd4 era capaz de interaccionar por sí solo con el motivo B de cualquiera de las tres proteínas en el sistema de dos híbridos en levaduras.  88  Finalmente, para tener una evidencia más de la función del motivo B en la interacción de la proteína Brd2 consigo misma, así como de la interacción entre proteínas BET in vivo, se realizó un ensayo de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) en células P19. Figura 34. Interacción de la proteína Brd2 consigo misma y con la proteína Brd3 mediante FRET. (A) Análisis de FRET en células P19 cotransfectadas con vectores de expresión de la fusión GFP-Brd2 y de vectores de expresión de fusiones RFP con las proteínas indicadas: Brd2, ∆mB, YK∆mB y Brd3, correspondientes respectivamente a las proteínas Brd2, Brd2 carente del motivo B, Brd2 carente del motivo B y con la mutación puntual Y152K y Brd3. En los paneles se muestra la emisión de la proteína GFP (GFP), la emisión de la proteína RFP (RFP) y la emisión debida a FRET (FRET) en cada caso. (B) Cuantificación de la eficiencia de FRET a partir de cinco experimentos independientes. Se muestran valores medios y desviación estándar. La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. Los valores de significación para las diferencias con el control YK∆mB fueron: *P<0,001 y **P=0,6. La barra de escala equivale a 10 µm. Para ello se cotransfectaron células P19 con vectores de expresión de una fusión de la proteína Brd2 con la proteína fluorescente roja (RFP, Red Fluorescent Protein) y de fusiones de las proteínas Brd2, Brd2 carente del motivo B, Brd2 carente del motivo B en combinación con la mutación Y152K y Brd3. En el caso de la fusión con RFP, la proteína Brd2 se colocó en la región amino-terminal de la proteína de fusión (Brd2-RFP), mientras que en el caso de la fusión con GFP, las proteínas se GFP RFP FRET Brd2∆mBYK∆mBBrd3 100 80 60 40 20 0 ** ** % FRET AB  89  colocaron en la región carboxilo-terminal de la proteína de fusión (GFP-Brd2, GFP- ∆mB, GFP-Y152K/∆mB y GFP-Brd3). La técnica de FRET permite analizar la aproximación entre dos flouróforos debida a la interacción entre las proteínas recombinantes. Sólo cuando la distancia entre los fluoróforos es menor de 100Å (Pollok et al., 1999), debido a la interacción entre las proteínas recombinantes, la energía emitida por el fluoróforo donador tras su excitación puede excitar a su vez al fluoróforo aceptor. De esta manera, la señal debida a la energía emitida por el aceptor tras ser excitado por del donador, se utiliza como indicativo de la interacción entre las proteínas recombinantes. En este caso el fluoróforo GFP actúa como donador para el fluoróforo RFP, que actúa como aceptor, ya que el rango de emisión de la GFP solapa con el de excitación de la RFP (Liu et al., 2008). Las células transfectadas con las construcciones indicadas fueron procesadas para el análisis mediante microscopía confocal y se analizó, tras excitar el fluoróforo donador, tanto la emisión de éste como la señal debida a la interacción entre el fluoróforo donador y el aceptor (señal de FRET). La señal de FRET obtenida en los distintos casos se normalizó teniendo en cuenta la emisión de los flouróforos donador y aceptor por separado siguiendo una normalización ratiométrica. Como se observa en la Figura 34, se obtuvo una señal FRET positiva para los pares de proteínas GFP-Brd2/Brd2-RFP y GFP-Brd3/Brd2RFP, significativamente mayor a la observada para los pares GFP-∆mB/Brd2-RFP y GFP-Y152K/∆mB. Estos resultados confirman la interacción entre proteínas BET in vivo, así como la importancia del motivo B en la interacción de la proteína Brd2 consigo misma. Resulta especialmente interesante la observación de que, utilizando la técnica de FRET, la pérdida del motivo B (GFP-∆mB) es suficiente para reducir el nivel de la señal de FRET hasta un nivel semejante al de la señal de la proteína que combina la pérdida del motivo B con la mutación en el primer bromodominio que afecta a la dimerización a través de éste (GFP-Y152K/∆mB), lo que refuerza la importancia del motivo B en la interacción. 3.2.5. La sobreexpresión del motivo B de Brd2 interfiere con la capacidad de Brd2 de interaccionar con los cromosomas mitóticos Teniendo en cuenta que los resultados anteriormente expuestos demuestran la relevancia de la interacción a través del motivo B para la asociación de Brd2 con los cromosomas, se investigó la posibilidad de interferir con dicha capacidad mediante la sobreexpresión de un fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B. Este fragmento, al interaccionar con el motivo B de la proteína Brd2 silvestre podría afectar a la  90  capacidad de ésta de asociarse con los cromosomas. Para investigar esta posibilidad, se cotransfectaron células P19 con vectores de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2) junto con vectores de expresión de una fusión entre la GFP y un fragmento de Brd2 (aminoácidos 463 al 565) que incluye al motivo B (GFP-mB). Como control, se cotransfectaron las células con el vector de expresión de la proteína GFP. La localización de la proteína Flag-Brd2 se analizó en las primeras fases de la mitosis y, como se muestra en la Figura 35, dicha proteína apareció disociada de los cromosomas sólo en el caso en el que las células se cotransfectaron con el plásmido de expresión de la proteína de fusión GFP-mB. Este resultado confirmó la importancia de la interacción mediada por el motivo B en la asociación de Brd2 con los cromosomas mitóticos. Figura 35. La sobreexpresión del motivo B de Brd2 interfiere con la unión de Brd2 a los cromosomas mitóticos. Localización de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag en células P19 transfectadas con vectores de expresión de la GFP como control (GFP) o de una fusión de GFP con el motivo B de Brd2 (GFP-mB), visualizada por inmunofluorescencia con microscopio confocal. El DNA se tiñó con DAPI. Las imágenes son representativas de al menos 7 de 8 células analizadas. La barra de escala equivale a 10 µm. 3.2.6. La deleción del motivo B afecta a la estimulación del ciclo celular asociada a la sobreexpresión de Brd2 Se ha demostrado previamente un papel de Brd2 en proliferación como activador transcripcional de genes relacionados con el ciclo celular (véase la sección de Introducción). Concretamente se ha demostrado que la sobreexpresión de Brd2 estimula la expresión del gen CcnA2 y la progresión del ciclo celular en fibroblastos de rata (Sinha et al., 2005) y que la disminución de los niveles de la proteína Brd2 induce una reducción en el nivel de expresión del gen CcnD1 en células humanas de la línea GFP GFP-mB GFP Flag DAPI  91  HEK293 (LeRoy et al., 2008). Teniendo esto en cuenta, se investigó si la sobreexpresión de Brd2 en las células P19 provocaba un incremento en la expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 y si dicho efecto era dependiente de la presencia del motivo B. El efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión del gen CcnA2 en fibroblastos de rata se observó en condiciones de estimulación con suero (Sinha et al., 2005), por lo que se optó por cultivar las células P19 en medio con bajo suero (0,1%) durante 48 horas para luego estimular la proliferación añadiendo suero (10% final) durante 18 horas antes de procesar las células para el análisis de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1. Las células se transfectaron 12 horas antes de la inducción con suero con vectores de expresión de las proteínas Brd2 y Brd2 carente del motivo B (∆mB). Como control positivo del experimento se utilizó un vector de expresión de la proteína Brd2 carente del fragmento que incluye los aminoácidos 475 al 513 (∆NmB), que no tiene afectado el motivo B y en consecuencia es capaz de interaccionar con los cromosomas (Figura 16). Como control negativo, se utilizó un vector de expresión de la proteína Brd2 con las mutaciones puntuales Y152K y N428A (Y152KN428A) en los bromodominios que, como se mostró anteriormente, está afectada en su capacidad de interaccionar con la cromatina (Figura 15, 22 y 23). El nivel de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 se normalizó respecto al nivel de expresión del gen Gapdh. En la Figura 36A se muestra el nivel de expresión de los genes indicados relativizado al nivel de expresión de los mismos genes en células P19 transfectadas con el vector de expresión vacío y sujetas al mismo tratamiento con suero. Como se observa en dicha figura, la sobreexpresión de Brd2 en estas condiciones produjo un incremento en la expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 y este efecto dependía de la presencia del motivo B. Como se esperaba, la proteína ∆NmB tuvo el mismo efecto que la proteína Brd2 silvestre, mientras que la proteína Y152KN428A no tuvo efecto significativo en la expresión de los genes analizados. Las condiciones de transfección fueron puestas a punto para conseguir el mismo nivel de expresión de proteínas a partir de las distintas construcciones utilizadas, según se determinó mediante Western Blot a partir de extractos de proteínas realizados a partir de una fracción de las mismas células utilizadas para las extracciones de RNA total (Figura 36B). Como se comentó en la sección de Introducción, se ha descrito que la proteína Brd2 se asocia con el promotor del gen que codifica la ciclina D1 en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, Chromatin Immunoprecipitation) en células HEK293 transfectadas con vectores de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (LeRoy et al., 2008). Teniendo en cuenta el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la transactivación de los genes CcnA2 y CcnD1 en células  92  P19 y la importancia del motivo B en dicho efecto, se investigó la interacción de Brd2 con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1 en esta línea celular, así como el efecto de la pérdida del motivo B en dicha interacción. Figura 36. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de los genes de ciclina D1 y A2. (A) Niveles relativos de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 determinados mediante PCR en tiempo real a partir de la retrotranscripción de RNA total de células P19 transfectadas con vectores de expresión de las proteínas indicadas, etiquetadas con un epítopo Flag, y sujetas a estimulación con suero. Los niveles de expresión se normalizados respecto al nivel de expresión del gen Gapdh y se relativizaron al nivel de expresión en las células P19 transfectadas con el vector de expresión vacío (-). La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. Los valores de significación para las diferencias fueron: entre el control (-) y Brd2 o ∆NmB, P≤0,01; entre el control (-) y ∆mB o YKNA, P≥0,45. (B) Western Blot con anticuerpos contra el epítopo Flag de las distintas proteínas utilizadas en (A) expresadas en células P19. Se analizaron 10 µg de proteína total por carril. ∆mB, deleción del motivo B; ∆NmB, deleción de 38 aminoácidos anteriores al motivo B; YKNA, mutación doble Y152KN482A. Se utilizaron nuevamente los mismos controles que en los experimentos anteriores, las construcciones de expresión de las proteínas ∆NmB e Y152KN428A como controles positivo y negativo respectivamente. Para analizar la interacción de estas proteínas con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1 se realizó un ensayo de ChIP en células P19 transfectadas con vectores de expresión de las proteínas Brd2, ∆mB y los controles ∆NmB e Y152KN428A, todas ellas etiquetadas con un epítopo kDa 130 100 anti-Flag 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 -- -- niveles de expresión relativos ciclina A2 ciclina D1 A B  93  Flag. La cromatina de las células transfectadas fragmentada por sonicación se incubó con una matriz de sefarosa conjugada con anticuerpos contra el epítopo Flag. Los fragmentos de DNA eluídos se analizaron mediante PCR en tiempo real con cebadores específicos de las regiones promotoras de los genes CcnA2 o CcnD1. El valor obtenido en cada caso se normalizó al nivel obtenido utilizando como molde el DNA total procedente de un 10% del extracto de cromatina previo a la precipitación y los valores normalizados se relativizaron al valor obtenido para la proteína Brd2. Figura 37. El motivo B es necesario para la asociación de Brd2 con los promotores de los genes de ciclina D1 y A2. Niveles de asociación de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1 en células P19 transfectadas, determinados por experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con anticuerpos contra el epítopo Flag. Se utilizaron las mismas proteínas descritas en la Figura 36. Los niveles de asociación se relativizaron a los de la construcción Brd2 silvestre (100%). La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. Los valores de significación para las diferencias fueron: entre Brd2 y ∆mB o YKNA, P≤0,001, y entre Brd2 y ∆NmB, P≥0,5. Como se muestra en la Figura 37, el motivo B resultó ser esencial para la adecuada asociación de Brd2 con las regiones promotoras de los genes CcnA2 y CcnD1. Como se esperaba, la proteína ∆NmB tuvo la misma capacidad de interaccionar con las regiones analizadas que la proteína Brd2 silvestre, mientras que la proteína Y152KN428A, al tener afectada la estructura de los bromodominios, perdía la capacidad de asociarse con estas regiones. Según se ha descrito en (Pao et al., 2011), el tratamiento con ácido retinoico provoca en células P19 una parada del ciclo celular en la fase G1, concomitante con el 100 80 60 40 20 0 % ChIP ciclina A2 ciclina D1  94  inicio del proceso de diferenciación neuronal. Teniendo en cuenta el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de genes del ciclo celular, nos preguntamos si dicha sobreexpresión podría interferir con la parada del ciclo celular inducida por ácido retinoico y si dicho efecto sería dependiente de la integridad del motivo B. En primer lugar, se comprobó que el tratamiento con ácido retinoico a una concentración de 0,5 µM durante 18 horas inducía una disminución en los niveles de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 en células P19. Figura 38. El tratamiento de células P19 con ácido retinoico induce una disminución de la expresión de los genes CcnA2 y CcnD1. Niveles relativos de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 determinados mediante PCR en tiempo real a partir de la retrotranscripción de RNA total de células P19 transfectadas con el vector de expresión vacío y tratadas (+) o no (-) durante 18 horas con ácido retinoico (AR). Los niveles de expresión se normalizados respecto al nivel de expresión del gen Gapdh y se relativizaron al nivel de las células transfectadas con el vector de expresión vacío y no tratadas con ácido retinoico. La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. El valor de significación para las diferencias debidas a la adición de AR fue de P<0,005. Como se observa en la Figura 38, el nivel relativo de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 determinado mediante PCR en tiempo real, disminuyó en torno a un 45 y 80% respectivamente. En segundo lugar, se transfectaron células P19 con vectores de expresión de las proteínas Brd2, Brd2 carente del motivo B (∆mB) y los mutantes ∆NmB e Y152KN428A y se analizó el nivel de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 tras el tratamiento con ácido retinoico (Figura 39). Las células se transfectaron 6 horas antes del tratamiento con ácido retinoico y el nivel de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 se determinó mediante PCR en tiempo real. En la Figura 39 se muestra el nivel de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 en cada condición, 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 niveles de expresión relativos --++AR ciclina A2 ciclina D1  95  normalizado al nivel correspondiente de expresión del gen Gapdh y relativizado al nivel de expresión en células P19 transfectadas con el vector de expresión vacío y no tratadas con ácido retinoico. Figura 39. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de los genes de ciclina D1 y A2 en presencia de ácido retinoico. Niveles relativos de expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 determinados mediante PCR en tiempo real a partir de la retrotranscripción de RNA total de células P19 transfectadas con el vector de expresión vacío y tratadas (+) o no (-) durante 18 horas con ácido retinoico (AR). Los niveles de expresión se normalizados respecto al nivel de expresión del gen Gapdh y se relativizaron al nivel de las células transfectadas con el vector de expresión vacío y no tratadas con ácido retinoico. Se utilizaron las mismas construcciones descritas en la Figura 36. La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. Los valores de significación para las diferencias fueron: de la adición de AR, P<0,005; entre el control y Brd2 o ∆NmB en presencia de AR, P<0,02; entre el control y ∆mB o YKNA en presencia de AR, P≥0,4. Como se observa, la sobreexpresión de Brd2 anuló la inhibición de los genes CcnA2 y CcnD1 inducida por el tratamiento con ácido retinoico, siendo dicho efecto dependiente de la presencia del motivo B. Como se esperaba, el efecto de la proteína ΔNmB fue similar al observado con la proteína Brd2 silvestre y el efecto de la proteína Y152KN428A similar al de la proteína ΔmB. Finalmente se investigó si el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 en células tratadas con ácido retinoico se correlacionaba con un efecto fenotípico en el perfil del ciclo celular. Para ello, se analizó por citometría de flujo el perfil del ciclo de células P19 transfectadas con los vectores de expresión utilizados en el experimento anterior (correspondientes a las 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 niveles de expresión relativos ---- +AR +AR ciclina A2 ciclina D1  96  proteínas Brd2, ∆mB, ∆NmB e Y152KN428A) tratadas o no con ácido retinoico. Se utilizaron las mismas condiciones de transfección y el mismo tratamiento con ácido retinoico que en el experimento anterior y se comparó, en cada caso, el perfil del ciclo de células tratadas con el perfil del ciclo de células no tratadas. Figura 40. El motivo B es necesario para el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la estimulación del ciclo celular en presencia de ácido retinoico. (A) Perfil del ciclo celular determinado por citometría de flujo a partir de células P19 transfectadas con vectores de expresión de las proteínas indicadas o con el vector de expresión vacío (-) y tratadas (+AR) o no (-AR) con ácido retinoico. Se utilizaron las mismas construcciones descritas en la Figura 36. (B) Relación entre el número de células en la fase G1 del ciclo celular respecto al número de células en el resto de fases de cada uno de los casos descritos en (A). Se representa el valor medio y la desviación estándar de cuatro experimentos independientes. La significación de las diferencias entre los casos se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student. Los valores de significación para las diferencias fueron: para el control o ∆mB debido al tratamiento con AR, P<0,02; para Brd2 debido al tratamiento con AR, P=0,58; para las diferencias entre control, Brd2 y ∆mB en ausencia de AR, P≥0,3; entre Brd2 y el control o ∆mB tras el tratamiento con AR, P<0,02; entre el control y ∆mB tras el tratamiento con AR, P=0,35. Las proteínas ∆NmB e YKNA se comportaron como las proteínas silvestre y ∆mB respectivamente. En la figura 40A se muestra el perfil del ciclo de una muestra representativa de cada caso y en la Figura 40B se muestra una gráfica donde se representa para cada caso la relación entre el número de células en la fase G1 del ciclo celular respecto al número de células en el resto de fases del ciclo. Como se observa en dicha gráfica, el 80 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 80 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 100 500 FL2-A 0 0 nº de célulasnº de células -AR + AR -- -- Brd2 Brd2 ∆mB ∆mB ∆NmB ∆NmB YKNA YKNA 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ratio G1/S+G2-M -AR + AR -- A B  97  tratamiento con ácido retinoico en células transfectadas con el vector de expresión vacío indujo una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular (un cambio aproximadamente de 0,7 a 1,5 que refleja un incremento del 40% al 60% de células en G1). Como se puede observar, la sobreexpresión de Brd2 anuló la acumulación de células en la fase G1 inducida por ácido retinoico, siendo el efecto dependiente de la presencia del motivo B. Una vez más, la proteína ∆NmB mostró el mismo efecto que la proteína Brd2 silvestre, mientras que la proteína Y152KN428A, al igual que la proteína ∆mB, no tuvo un efecto significativo. 3.2.7. La sobreexpresión de Brd2 interfiere con la diferenciación neuronal, siendo el efecto dependiente del motivo B Teniendo en cuenta que la sobreexpresión de Brd2 en células P19 neutralizaba la acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular inducida por tratamiento con ácido retinoico, nos preguntamos si dicho efecto podría tener consecuencias sobre el proceso de diferenciación neuronal que normalmente induce el ácido retinoico. Una forma alternativa al uso de ácido retinoico para inducir diferenciación neuronal en células P19 consiste la transfección de éstas con vectores de expresión del factor neurogénico NeuroD2 y de su cofactor E12 (Farah et al., 2000). Este protocolo resulta más sencillo de aplicar, más controlable y de menor duración que el uso de ácido retinoico. Si bien la eficacia depende del porcentaje de transfección, en condiciones normales el porcentaje de transfección de células P19 es de al menos un 50%. Así, el porcentaje de neurogénesis se determinó analizando solo las células transfectadas (células que expresaban GFP a partir de un vector de expresión que se contransfectaba en todas las condiciones), y calculando el porcentaje de estas que expresaban el marcador neuronal ßIII-Tubulina. La aplicación de este protocolo resultaba en la expresión del marcador ßIII-Tubulina en el 60% de las células transfectadas tres días después de la transfección (Figura 41). Por lo tanto, se realizaron experimentos de neurogénesis para analizar como afectaba a este porcentaje la sobreexpresión de la proteína Brd2 silvestre o carente del motivo B (∆mB). Así, vectores de expresión de estas proteínas, o el vector de expresión vacío como control, se cotransfectaron junto con vectores de expresión de NeuroD2, E12 y GFP, y se evaluó el porcentaje de neurogénesis a los tres días. Como se muestra en la Figura 41, la sobreexpresión de Brd2 redujo significativamente la proporción de células transfectadas que expresaban el marcador neuronal ßIII-Tubulina (aproximadamente un 23%), dependiendo este efecto de la presencia del motivo B.  104  proteína Ptn etiquetada con un epítopo HA (Ptn-HA), y los extractos se incubaron con anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de sefarosa. Como control se analizaron células transfectadas sólo con el vector de expresión de la proteína Brd2. Figura 44. La proteína Brd2 interacciona con la proteína Ptn en el sistema de dos híbridos. Crecimiento en medio selectivo y no selectivo de levaduras cotransformadas con la construcción de Brd2 utilizada como cebo en el escrutinio de dos híbridos (Lex -Brd2) y uno de los clones presa aislados en el escrutinio, que se corresponde con un fragmento de la proteína Ptn (GAD-Ptn). Como control negativo, se utilizaron los vectores correspondientes, pLexA y pGAD-HA vacíos (Lex y GAD respectivamente).  Como se muestra en la Figura 45A, la proteína Ptn eficientemente coprecipitaba con Brd2, demostrando la interacción entre ambas. Para investigar si la interacción entre las proteínas Brd2 y Ptn era directa, se realizó un ensayo de pulldown in vitro en el que se utilizó un fragmento de la proteína Brd2 (aminoácidos 50 al 651) etiquetado con una cola de histidinas, y una fusión de la proteína GST y Ptn (GST-Ptn) o la proteína GST como control. Las tres proteínas se expresaron en la estirpe BL21 de E. coli y se purificaron bien con una matriz de agarosa cargada con níquel en el caso de la proteína Brd2, bien con una matriz de glutatión-sefarosa en el caso de las proteínas GST y GST-Ptn. Las proteínas GST y GST-Ptn se dejaron unidas a la matriz y se incubaron con el fragmento de Brd2 purificado, para determinar si este era retenido en los precipitados. Como se observa en la Figura 45B, la proteína GST-Ptn (y no la proteína GST) era capaz de retener eficazmente el fragmento de Brd2. Para investigar si la proteína Ptn era capaz de interaccionar también con las proteínas Brd3 y Brd4, se analizó el crecimiento en medio selectivo de levaduras cotransformadas con construcciones cebo que codificaban las proteínas Brd2, Brd3 o Brd4 carentes de los bromodominios fusionadas a la proteína Lex (Figura 46A) junto con construcciones presa que expresan la proteína Ptn. Como se muestra en la Figura 46B, sólo las levaduras cotransformadas con vectores de expresión correspondientes a las proteínas Brd2 y crecieron en medio selectivo. no selectivo selectivo Lex-Brd2 + GAD-Ptn Lex-Brd2 + GAD Lex + GAD-Ptn  105  Figura 45. La proteína Brd2 interacciona con la proteína Ptn in vivo e in vitro. (A) Ensayos de coinmunoprecipitación de extractos de células HEK293T transfectadas con un vector de expresión de la proteína Ptn etiquetada con un epítopo HA (Ptn-HA), junto con vectores de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2) o el vector de expresión vacío como control. Para la precipitación se utilizaron anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de agarosa. Las proteínas coinmunoprecipitadas se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA (IP (anti-HA)). Un 10% del extracto también se analizó mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA o el epítopo Flag para determinar la cantidad de proteína etiquetada con los epítopos Flag y HA presente en los extractos antes de la precipitación. (B) Experimentos de pull-down in vitro del fragmento purificado de Brd2 (aminoácidos 50 al 651) etiquetado con 6 histidinas y la proteína de fusión entre GST y Ptn (GST-Ptn) o la proteína GST como control, ambas inmovilizadas en matriz de glutatión-sefarosa. Las proteínas retenidas (retenido) y un 10% de volumen de la proteína purificada (10% proteína) se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo de histidinas. El 100% de las proteínas GST o GST-Ptn utilizadas por ensayo se muestran en una tinción de Coomassie del gel de proteínas. Por lo tanto, sólo la proteína Brd2, y no Brd3 ni Brd4, era capaz de interaccionar con Ptn. Dado que el fragmento de la proteína Brd2 utilizado en el escrutinio de dos híbridos contenía diferentes dominios de la proteína, se investigó qué región de Brd2 mediaba la interacción con Ptn. Teniendo en cuenta que la secuencia de Ptn contiene un número elevado de aminoácidos básicos (Zhang et al., 1999), el fragmento de Brd2 utilizado en el escrutinio se dividió en dos regiones: una aminoterminal rica en residuos acídicos (ac) y otra carboxilo-terminal (Cter) que incluía el resto de la proteína (Figura 46A). Por otro lado, se ha descrito que la secuencia de Ptn muestra dos regiones básicas ricas en lisinas (aminoácidos 33 al 45 y 154 al 165) y que la pérdida de la región básica carboxilo-terminal (aminoácidos 143 al 168) tiene consecuencias funcionales (Bernard-Pierrot et al., 2001; Zhang et al., 1999). Por lo tanto, en el análisis de interacción se incluyó una construcción de expresión de la proteína Ptn carente de la región carboxilo-terminal (Ptn∆C). IP (anti-HA) 10% extracto (anti-HA) 10% extracto (anti-Flag) kDa 15 15 100 25 25 130 kDa 55 55 31 70 70 45 retenido (anti-His) 10% proteína (anti-His) < GST-Ptn < GST AB  106  Figura 46. Ptn interacciona selectivamente con Brd2 a través de una región acídica. (A) Esquema de las proteínas analizadas en el estudio de la interacción entre proteínas BET y Ptn mediante la técnica de dos híbridos. (B) Crecimiento en medio selectivo de levaduras cotransformadas con las construcciones cebo y presa indicadas. Como control se utilizaron los vectores correspondientes, pLexA y pGAD-HA, vacíos (LexA y GAD respectivamente). La interacción entre los fragmentos descritos se analizó mediante la técnica de dos híbridos por crecimiento en medio selectivo. Como se observa en la Figura 46B, la Brd2∆Cter Brd2∆ac BD2BD1 mB NET SEED Brd2 Brd2 ac Cter Brd3 Brd3 Brd4 Brd4 Ptn NC Ptn∆C A cebo presa no selectivo selectivo B  107  proteína Ptn era capaz de interaccionar con el fragmento de Brd2 que contenía los residuos acídicos (ac) pero no con el fragmento Cter. Por otro lado, la proteína Ptn carente de la mitad carboxilo-terminal era incapaz de interaccionar con Brd2. Un alineamiento de las secuencias de Brd2, Brd3 y Brd4 mostró que Brd3 y Brd4 carecían de la región acídica de Brd2 responsable de la interacción con Ptn (Figura 47), lo cual explicaría la especificidad de la interacción entre Brd2 y Ptn. Figura 47. La región acídica de Brd2 no está conservada en otros miembros de la familia BET. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de un fragmento de las proteínas Brdt, Brd4, Brd3 y Brd2 de ratón. El fondo negro indica los residuos conservados en al menos tres de las secuencias. El fondo gris indica cambios de aminoácido conservativos entre secuencias. El motivo B aparece subrayado en rojo, y un motivo acídico (ac) de la proteína Brd2, en azul. Para investigar la especificidad de esta interacción en la línea celular HEK293T se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación. Para ello, se cotransfectaron las células con vectores de expresión de las proteínas Brd2, Brd2 carente de la región acídica, Brd3 y Brd4, etiquetadas con un epítopo Flag (Flag-Brd2, Flag-Brd2∆ac, FlagBrd3 y Flag-Brd4 repectivamente), junto con un vector de expresión de la proteína Ptn etiquetada con un epítopo HA (Ptn-HA). Los extractos celulares se incubaron con anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de sefarosa y las proteínas precipitadas o en los extractos se analizaron mediante Western Blot. Como se observa en la Figura 48, la proteína Ptn precipitaba eficientemente con la proteína Brd2, pero no con el resto, confirmando la especificidad de la interacción con Brd2 y el requerimiento de la región acídica. Finalmente, dada la homología entre Ptn y Mdk, se investigó si la proteína Brd2 era capaz de interaccionar también con Mdk. Para ello se cotransfectaron células HEK293T con un vector de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2), junto con vectores de expresión de las proteínas Ptn o Mdk, etiquetadas con un epítopo HA (Ptn-HA y Mdk-HA respectivamente). Los extractos celulares se incubaron con anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de sefarosa y las proteínas precipitadas o en los extractos se analizaron mediante Western Blot. ac motivo B mBrdt 376 mBrd4 459 mBrd3 415 mBrd2 453  108  Figura 48. Ptn interacciona con una región acídica de Brd2 ausente en Brd3 y Brd4. Ensayos de coinmunoprecipitación de extractos de células HEK293T transfectadas con un vector de expresión de la proteína Ptn etiquetada con un epítopo HA (Ptn-HA) junto con vectores de expresión de las proteínas indicadas etiquetadas con un epítopo Flag (Flag-Brd2, Flag-Brd2∆ac, Flag-Brd3 y Flag-Brd4). Para la precipitación se utilizaron anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de agarosa. Las proteínas coinmunoprecipitadas se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA (IP). Un 10% de los extractos también se analizó mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA o el epítopo Flag para determinar la cantidad de proteína eriquetada con los epítopos Flag y HA presente en los extractos antes de la precipitación. Figura 49. Brd2 interacciona con Ptn y Mdk. Ensayos de coinmunoprecipitación de extractos de células HEK293T transfectadas con un vector de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2) junto con plásmidos de expresión de las proteínas Ptn o Mdk etiquetadas con un epítopo HA (Ptn-HA y Mdk-HA respectivamente). Para la precipitación se utilizaron anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de agarosa. Las proteínas coinmunoprecipitadas se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA (IP). Un 10% del extracto se analizó también mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA o el epítopo Flag para determinar la cantidad de proteína etiquetada con los epítopos Flag y HA presente en los extractos antes de la precipitación. Como se observa en la Figura 49, Mdk, al igual que Ptn, precipitaba eficientemente con Brd2, demostrando la interacción de Brd2 con ambos miembros de IP (anti-HA) 10% extracto (anti-HA) 10% extracto (anti-Flag) kDa 25 25 130 100 IP (anti-HA) 10% extracto (anti-HA) 10% extracto (anti-Flag) kDa 25 25 15 15 100 130  109  la familia. Teniendo en cuenta la redundancia funcional entre ambas proteínas, decidimos en adelante investigar sólo la función de la interacción entre Brd2 y Ptn. 3.3.2. Detección de las proteínas Brd2 y Ptn en células P19 Teniendo en cuenta el papel de la proteína Ptn en la regulación de funciones relacionadas con la diferenciación neuronal y que tanto Brd2 como Ptn se expresan abundantemente en el sistema nervioso central de vertebrados durante el desarrollo embrionario, se analizó la expresión de Ptn y Brd2 en la línea celular P19, con la finalidad de utilizar esta línea celular como modelo para investigar si la interacción entre Brd2 y Ptn tenía alguna función en la diferenciación neuronal. Ya se ha mostrado que la expresión del gen Brd2 se mantenía constante a lo largo del proceso de diferenciación in vitro de las células P19 (Figura 7). Asimismo, se ha publicado que si bien la proteína Ptn no se detecta en células P19 en condiciones de proliferación, el tratamiento con ácido retinoico induce la expresión de Ptn, detectándose de forma significativa, tanto en el medio extracelular como en el interior de las células, a partir del día 2 de tratamiento (Brunet-De Carvalho et al., 2003). Por lo tanto, se analizó la expresión de Brd2 y Ptn en células P19 en condiciones de crecimiento y tras 2 y 4 días de tratamiento con ácido retinoico. Las proteínas se analizaron mediante Western Blot anticuerpos contra Brd2 y contra Ptn (Figura 50). Como controles del proceso de diferenciación se analizó la caída de expresión del marcador de pluripotencia Oct3/4, y el incremento de expresión del marcador neuronal βIII-Tubulina. Como control de carga, se analizó la proteína de expresión constitutiva α-Tubulina. Como se observa en la Figura 50, el nivel de proteína Brd2 se mantuvo constante durante todo el proceso, mientras que la proteína Ptn se detectó a partir de los dos días de tratamiento. Como se esperaba, el nivel de la proteína Oct3/4 se redujo drásticamente al inicio del tratamiento y el nivel de la proteína neuronal βIII-Tubulina aumentó notablemente en el cuarto día de tratamiento con ácido retinoico (Figura 50). A continuación se investigó la localización celular de las proteínas Ptn y Brd2. Para ello se utilizaron células P19 en condiciones de crecimiento y sometidas a tratamiento con ácido retinoico durante dos días para inducir la expresión de Ptn. Mediante experimentos de inmunofluorescencia se detectó Ptn en células P19 tratadas con ácido retinoico, mostrando una localización mayoritariamente citoplásmica, aunque también se observó señal en el núcleo (Figura 51A).  110  Figura 50. Expresión de Brd2 y Ptn en células P19 tratadas con ácido retinoico. Western Blot de células P19 tratadas con ácido retinoico (AR) durante los días indicados en la parte superior. Se analizaron 20 µg de extracto total en cada caso y la membrana se incubó con anticuerpos contra las proteínas endógenas indicadas. La proteína Brd2, mayoritariamente localizada en el núcleo, tanto en células en condiciones de crecimiento como en células tratadas, mostró una señal perinuclear apreciable en estas últimas (Figura 51A). Para analizar con precisión las fracciones nuclear y citoplásmica de ambas proteínas se realizaron extractos fraccionados de células P19 en condiciones de crecimiento y tras dos días de tratamiento con ácido retinoico. Como controles del fraccionamiento se analizaron los marcadores Baf155 (nuclear) y α-Tubulina (mayoritariamente citoplásmico). Como se observa en la Figura 51B, la mayor parte de la proteína Brd2 se localizaba en el núcleo en cualquier condición, aunque tras el tratamiento con ácido retinoico se observó de forma minoritaria una fracción citoplásmica. En el caso de Ptn, detectada sólo tras el tratamiento con ácido retinoico, se observó una localización mayoritariamente citoplásmica, aunque también se pudo apreciar una fracción significativa nuclear. Teniendo en cuenta la coexpresión de las proteínas Brd2 y Ptn endógenas en células P19 en presencia de ácido retinoico, se investigó la interacción entre ambas mediante experimentos de inmunoprecipitación. Así, extractos de células P19 en condiciones de inducción de Ptn se incubaron con los anticuerpos generados en nuestro laboratorio contra Brd2 o con suero preinmune, y se determinó en cada caso la cantidad de Ptn coprecipitada. Para la precipitación de anticuerpos se utilizó proteína A conjugada a una matriz de agarosa. Como se observa en la Figura 52, la proteína Ptn endógena precipitaba eficientemente al utilizar anticuerpos contra Brd2 pero no suero preinmune, demostrando la interacción entre las proteínas endógenas en condiciones de inducción con ácido retinoico. Brd2 Ptn Oct3/4 βIII-Tub α-Tub 0 2 4 AR (días) kDa 100 25 55 35 55 55  111  Figura 51. Fraccionamiento celular y análisis de las proteínas Brd2 y Ptn en células P19 tratadas con ácido retinoico. (A) Inmunofluorescencia de células P19 tratadas durante 2 días con ácido retinoico (Dif.) o con vehículo (Prolif.) utilizando anticuerpos contra la proteína Brd2 de ratón y anticuerpos contra Ptn. Las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. El DNA se tiñó con DAPI. La barra de escala equivale a 10 µm. (B) Western Blot de extractos fraccionados de células P19 tratadas durante 2 días con ácido retinoico (Dif.) o con vehículo (Prolif.). 20 µg de fracción citoplásmica (C) y 5 µg de la fracción nuclear (N) se analizaron utilizando anticuerpos contra las proteínas endógenas indicadas. α-Tub, α-Tubulina. Prolif.Dif. Brd2 Ptn DAPI A Brd2 Ptn Baf155 α-Tub C N C N Prolif. Dif. kDa 100 25 130 55 B  112  Figura 52. Las proteínas Brd2 y Ptn endógenas interaccionan en células P19 tratadas con ácido retinoico. Ensayos de coinmunoprecipitación de la proteína Ptn endógena con Brd2 en extractos de células P19 tratadas durante 2 días con ácido retinoico. Para la precipitación se utilizaron anticuerpos contra la proteína Brd2 de ratón (anti-Brd2) o suero pre-inmune como control, junto con Proteína A conjugada a una matriz de agarosa. La proteína Ptn coinmunoprecipitada en cada caso se analizó, junto con un 10% del extracto, mediante Western Blot con anticuerpos contra la proteína Ptn (anti-Ptn). La proteína Brd2 inmunoprecipitada en cada caso también se analizó, junto con un 10% del extracto, mediante Western Blot con los mismos anticuerpos contra Brd2 utilizados para la precipitación (antiBrd2). 3.3.3. Ptn neutraliza la interferencia con la diferenciación neuronal mediada por la sobreexpresión de Brd2 Teniendo en cuenta que la sobreexpresión de la proteína Brd2 interfiere con la diferenciación neuronal, según se ha mostrado anteriormente (Figuras 40 y 41), y que la proteína Ptn se ha relacionado con diferenciación neuronal (Hienola et al., 2004) y se induce en células P19 al inicio del protocolo de diferenciación neuronal con ácido retinoico, se investigó el efecto de la interacción entre Ptn y Brd2 en la diferenciación neuronal en células P19. Para ello se transfectaron células P19 con construcciones de expresión de las proteínas NeuroD2 y E12 junto con vectores de expresión de GFP (para identificar las células transfectadas) y de las proteínas Brd2 y Ptn silvestres y mutantes (Figura 53). Tres días después de la transfección, las células se procesaron para su análisis mediante inmunofluorescencia del marcador neuronal βIII-Tubulina y GFP. En la Figura 53A se muestra una imagen representativa de cada caso. A partir de las imágenes adquiridas se determinó la proporción de células transfectadas que expresaban el marcador βIII-Tubulina. anti-Ptn anti-Brd2 kDa 100 25  113  Figura 53. Ptn anula el efecto de inhibición de la diferenciación neuronal inducida en células P19 provocado por Brd2. (A) Inmunofluorescencias de células P19 cotransfectadas con vectores de expresión de las proteínas GFP, NeuroD2 y E12 junto con vectores de expresión de las proteínas indicadas, o el vector de expresión vacío como control. Tres días después de la transfección, se procesaron las muestras para su análisis mediante microscopía de fluorescencia. Se evaluó la neurogénesis como el porcentaje de células transfectadas (células que expresan GFP) que también expresaban el marcador neuronal ßIII-Tubulina. El DNA se tiñó con DAPI. La barra de escala equivale a 100 µm. (B) Representación del porcentaje de neurogénesis cuantificando a partir de dos a tres áreas de cuatro experimentos independientes. La significación de las diferencias respecto al control se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student, obteniéndose los siguientes valores de significación: *P≥0.6, **P≤0.01, ***P<0.005. (C) Western Blot de extractos totales de células P19 transfectadas con los vectores shPtn o shControl, correspondientes a moléculas de interferencia de RNA tipo horquilla contra Ptn o control, y tratadas con ácido retinoico durante dos días, utilizando anticuerpos contra Ptn. Se analizaron 20 µg de proteína total en cada caso. GFP βIII-tubulina DAPI A % diferenciación B kDa 25 anti-Ptn C *** * ** ** ** ** * * * ** * * * * * *  120  Figura 56. Antagonismo entre Brd2 y Ptn en la migración de células de la cresta neural. (A) El tubo neural de embriones de pollo se electroporó a nivel dorsal con un vector de expresión del gen lacZ y con construcciones de expresión de las proteínas indicadas, o de una molécula shRNA contra Brd2, o con el vector de expresión vacío (control), y se analizó la expresión de la enzima ß-galactosidasa mediante coloración X-gal. Se muestra una vista lateral in toto del lado electroporado. Las electroporaciones se realizaron en el estadio de desarrollo HH17 y los embriones se analizaron 30 h después. (B) Secciones transversales a nivel de uno de los haces de migración de la cresta neural de los embriones mostrados en (A). Control Brd2 shBrd2 mB Ptn Ptn + Brd2 A Control Brd2 shBrd2 mB Ptn Ptn + Brd2 B  121  El efecto inhibitorio de Ptn, de ser cierto que se debía a un antagonismo sobre Brd2, indicaría que Brd2 es necesario para la migración de la cresta. Para analizar esta hipótesis se redujeron los niveles de Brd2 en las células de la región dorsla del tubo neural mediante electroporación de un vector de expresión de una molécula shRNA de Brd2. Como se observa en la figura, la expresión de la molécula shRNA de Brd2 interfirió notablemente con el proceso de migración, indicando que Brd2 era necesario para ste proceso. De hecho, la expresión del fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B, que previamente se ha demostrado que interfería con la función de Brd2 (Figuras 35 y 53), produjo un efecto similar al de la molécula shRNA. Por último, si Ptn interfiere con la función de Brd2 en la migración de la cresta nos preguntamos si el efecto de Ptn podría paliarse si junto con Ptn se sobreexpresaba también Brd2. Como se observa en la Figura 56, la sobreexpresión de Brd2 se tradujo en una notable recuperación del proceso de migración inhibido por Ptn. Estos resultados por lo tanto manifiestan de nuevo un efecto antagonista de Ptn sobre Brd2 en un proceso diferente al de la diferenciación neuronal. 3.3.6. Ptn interfiere con la interacción de la proteína Brd2 consigo misma y con su asociación con la cromatina Teniendo en cuenta el antagonismo de Ptn sobre Brd2 y que Brd2 actúa como transactivador de genes importantes para la progresión del ciclo celular (LeRoy et al., 2008), se investigó si la expresión de Ptn podría afectar a la capacidad de la proteína Brd2 de asociarse con la cromatina. Para analizar la estabilidad de la asociación de la proteína Brd2 con la cromatina, las células P19 fueron transfectadas con construcciones de expresión de Ptn o con el vector de expresión vacío como control y la proteína Brd2 endógena fue extraída del núcleo de las células con cantidades distintas de sal. Los extractos se analizaron mediante Western Blot con anticuerpos contra Brd2. Así, las células se sometieron a extracción secuencial con 100 y 520 mM de NaCl. Ya se ha mencionado (apartado 3.2.2) que una mayor estabilidad en la asociación de Brd2 con la cromatina necesita de una mayor concentración de sal para la extracción. Como se observa en la Figura 57A, en ausencia de Ptn, la extracción de la mayor parte de la proteína Brd2 requirió una concentración alta de NaCl (520mM). Sin embargo, en presencia de Ptn, una fracción mayor de la proteína Brd2 endógena pudo extraerse con una concentración de NaCl de 100 mM, indicando que la proteína Ptn desestabilizaba la asociación de Brd2 con la cromatina.  122  Teniendo en cuenta el papel de Brd2 en la activación de los genes de ciclinas CcnA2 y CcnD1 se investigó si la expresión de Ptn tenía algún efecto en la asociación de la proteína Brd2 endógena con el promotor de estos genes. Para ello se transfectaron células P19 con vectores de expresión de la proteína Ptn o con el vector de expresión vacío y se analizó la asociación de la proteína Brd2 con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1 mediante experimentos de ChIP, utilizando anticuerpos contra Brd2 generados en nuestro laboratorio o suero preinmune como control. Los fragmentos de DNA precipitados se analizaron mediante PCR en tiempo real con cebadores específicos de las regiones promotoras de los genes CcnA2 y CcnD1. En la Figura 57B se muestran los valores normalizados y relativizados al valor obtenido usando suero preinmune. Figura 57. Ptn desestabiliza la unión de Brd2 a la cromatina. (A) Células P19 transfectadas con un vector de expresión de Ptn (+Ptn) o con el vector de expresión vacío (control), fueron sometidas a extracción secuencial con el mismo volumen de tampones que contenían 100 y 520 mM de NaCl. En cada fracción se determinó la presencia de la proteína Brd2 endógena mediante Western Blot (WB) con anticuerpos contra Brd2. En cada carril se analizó un 10% del volumen total de cada extracto. (B) Células P19 transfectadas con un vector de expresión de Ptn (Ptn) o de un fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B (mB), o con el vector de expresión vacío como control (-), o sometidas a tratamiento con ácido retinoico durante 2 días (AR), se utilizaron para experimentos de ChIP con anticuerpos contra Brd2 de ratón. Los fragmentos de cromatina precipitados se analizaron mediante PCR en tiempo real con cebadores correspondientes a las regiones promotoras de los genes CcnD1 (barras blancas) y CcnA2 (barras negras). Los valores se normalizaron a los obtenidos a partir de un 10% de los extractos antes de la precipitación y a los niveles obtenidos a partir de una precipitación con suero preinmune, y se relativizaron a los niveles mostrados por el control (100%). Se muestran valores medios y desviación estándar de 3 experimentos independientes analizados por triplicado. La significación de las diferencias respecto al control se analizó estadísticamente mediante la prueba t de Student, obteniéndose un valor de significación P<0.04 en todos los casos. ciclina D1 ciclina A2 WB anti-Brd2 _ _  123  Se observa que la expresión de Ptn afectó negativamente a la asociación de Brd2 con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1. También se investigó si el tratamiento con ácido retinoico, que sabíamos que provocaba una inducción de Ptn, o la sobreexpresión del fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B, tenían un efecto similar. Como se muestra en la Figura 57B, tanto el tratamiento con ácido retinoico como la expresión del motivo B afectaron negativamente a la asociación de la proteína Brd2 endógena con las regiones promotoras mencionadas. Los resultados anteriores indican que tanto Ptn como el péptido correspondiente al motivo B provocaban el mismo efecto de disociación de Brd2 de la cromatina. Además, en apartados anteriores e ha descrito que el motivo B era necesario para la asociación de Brd2 con la cromatina, mediada por la interacción entre proteínas BET a través de este dominio. Dada la proximidad entre la región acídica de Brd2 que media la interacciona con Ptn y el motivo B, se investigó si la expresión de Ptn podría interferir con la interacción entre la proteína Brd2 consigo misma. Figura 58. Ptn interfiere con la interacción de Brd2 consigo mismo. Ensayos de coinmunoprecipitación de extractos de células HEK293T transfectadas con un vector de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2) junto con un vector de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo HA (HA-Brd2). Además, las células se transfectaron con un vector de expresión de la proteína Ptn etiquetada con un epítopo HA (Ptn-HA), o de un fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B etiquetado con un epítopo HA (HA-mB), o con el vector de expresión vacío como control. Para la precipitación se utilizaron anticuerpos contra el epítopo Flag conjugados a una matriz de agarosa y la proteína HA-Brd2 coinmunoprecipitada en cada caso se analizó mediante Western Blot con anticuerpos contra el epítopo HA (IP). Un 10% de los extractos también se analizó mediante Western Blot para determinar la cantidad de proteína etiquetada con los epítopos Flag y HA presente en los extractos antes de la precipitación.  IP anti-HA 10% extracto (anti-HA: HA-Brd2) 10% extracto anti-Flag 10% extracto (anti-HA: Ptn-HA) 10% extracto (anti-HA: HA-mB)  124  Para ello se cotransfectaron células 293T con vectores de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo Flag (Flag-Brd2) y vectores de expresión de la proteína Brd2 etiquetada con un epítopo HA (HA-Brd2), junto con vectores de expresión de la proteína Ptn o del motivo B etiquetados con un epítopo HA. Los ensayos de precipitación se llevaron a cabo con anticuerpos contra el epítopo Flag conjugado a una matriz de sefarosa y las proteínas precipitadas se analizaron mediante Western Blot. Como se muestra en la Figura 58, la expresión de Ptn tuvo un efecto negativo en la capacidad de la proteína Brd2 de interaccionar consigo misma, muy similar al efecto provocado por la sobreexpresión del péptido correspondiente al motivo B. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el antagonismo que Ptn ejerce sobre Brd2 podría deberse a que Ptn interfiere con la interacción entre moléculas de Brd2 mediada por el motivo B, y necesaria para la asociación de Brd2 con la cromatina.  125                         126  4.DISCUSIÓN 4.1. Función de Brd2 en los procesos de proliferación y diferenciación celular Hasta la fecha del inicio del presente estudio, la función mejor caracterizada de la proteína Brd2 era la transactivación de genes importantes para la progresión del ciclo celular, como los genes CcnA2 (Sinha et al., 2005), CcnD1 (LeRoy et al., 2008), Dhfr (Denis et al., 2000) o Myc (Delmore et al., 2001). Esa función de Brd2 en la regulación del ciclo celular es consistente con la observación de que Brd2 interacciona con los factores E2F-1 y E2F-2 (Denis et al., 2000) y es capaz de activar la transcripción de un gen testigo regulado tanto por sitios de unión de E2F-1 (Peng et al., 2007) como por secuencias reguladoras del promotor de los genes CcnD1, CcnA2 y Dhfr (Denis et al., 2000; Guo et al., 2000). Asimismo, la proteína Brd2 se asocia con el promotor de los genes CcnA2 y CcnD1 y la disminución en los niveles de Brd2 causa una disminución en los niveles de Ciclina D1 en células HEK293T (LeRoy et al., 2009). La observación de que factores del suero y la expresión de las proteínas H-Ras y MEKK estimulan el efecto de Brd2 en la transcripción de genes del ciclo (Denis et al., 2000; Peng et al., 2006) sugiere que la función activadora de Brd2 está sujeta a regulación por las rutas de señalización que controlan el ciclo celular. De hecho, el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la estimulación de la transcripción de los genes CcnA2 y CcnD1 es más evidente en condiciones de estimulación por suero (Figura 35A). Se ha propuesto un papel de Brd2 como adaptador que, a través de sus bromodominios, es capaz de mediar el ensamblaje de la maquinaria de transcripción sobre loci cromatínicos específicos, ricos en marcas de acetilación de las histonas (Denis et al., 2006; LeRoy et al., 2008). Este modelo de Brd2 como adaptador de la maquinaria general de transcripción se sustenta en la capacidad de Brd2 de interaccionar con distintos componentes asociados a la RNA Polimerasa II (Denis et al., 2006; LeRoy et al., 2008; Sinha et al., 2005). En este contexto, se ha descrito la interacción entre la proteína Brd2 y factores de transcripción específicos, como E2F-1 y E2F-2 (Peng et al., 2007) o cofactores como Meis 1 (Denis et al., 2006) así como la copurificación de Brd2 con enzimas modificadoras de histonas como HDAC11, CBP o p300 (Denis et al., 2006), con subunidades del complejo Mediator, que media la interacción entre el complejo de preiniciación de la transcripción y factores de transcripción específicos (Kornberg, 2005), como TRAP220 (Crowley et al., 2002), Cdk8 (Crowley et al., 2002) o TAFII250 (Denis et al., 2006) y con subunidades del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF, como Brg-1 y Baf155 (Denis et al.,  127  2006), o Brd7 (Zhou et al., 2006). También se ha descrito la copurificación de Brd2 con la subunidad mayor de la RNA Polimerasa II (Crowley et al., 2002; Denis et al., 2006) y con la proteína TBP (Peng et al., 2007). Se ha descrito que los efectos de la sobreexpresión de Brd2 en la activación de genes del ciclo celular son más evidentes en condiciones de activación mitogénica, mediada por adición de suero (Sinha et al., 2005). Un papel de la proteína Brd2 como adaptador estructural que recluta factores de transcripción y la maquinaria de inicio de la transcripción a promotores de genes del ciclo etiquetados con marcas de acetilación, explicaría que el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la expresión de estos genes sea más evidente en condiciones de estimulación por suero, en las que se inducen y acumulan muchos de los factores necesarios para la activación transcripcional. Por el contrario, en condiciones de proliferación en las que las rutas de señalización que convergen en Brd2 así como las proteínas que forman parte del complejo de activación de la transcripción estarían activas de manera virtualmente constitutiva, los efectos de la sobreexpresión de Brd2 serían menores. De hecho, la sobreexpresión de Brd2 no conlleva un efecto dramático en la incorporación de BrdU en células P19 que crecen de manera exponencial (Figura 12). En cambio, en condiciones en las que se induce una parada del ciclo celular por adición de ácido retinoico también se observa un efecto significativo de la sobreexpresión de Brd2 (Figuras 39 y 40). Es posible que en estas condiciones en las que los distintos componentes implicados en la activación de genes del ciclo se hayan aún presentes, se produzca una reducción en los niveles de Brd2, una inactivación de la proteína, o un desensamblaje de proteínas. Sin embargo, no hemos observado variaciones en los niveles de Brd2 en presencia de ácido retinoico (Figura 50). Por lo tanto, la sobreexpresión de Brd2 podría conducir a un mantenimiento de la actividad de la proteína o desplazar el equilibrio hacia la asociación de proteínas con la cromatina en condiciones en las que normalmente se desensamblan. Se ha publicado previamente que los dos bromodominios de Brd2 son capaces de interaccionar directamente con marcas de acetilación de histonas (Ito et al., 2011; Kanno et al., 2004; LeRoy et al., 2008) y que son esenciales para su función en la transcripción de genes del ciclo (Sinha et al., 2005). De hecho, se ha descrito que la droga JQ-1, capaz de bloquear la interacción de los bromodominios de las proteínas BET con histonas acetiladas (Filippakopoulos et al., 2010), inhibe la expresión de cMyc y el crecimiento e induce apoptosis en varias líneas celulares cancerosas en las que los genes BET están desregulados, como en leucemia de linaje mixto (Dawson et al., 2011), leucemia linfoblástica aguda (Ott et al., 2012), neuroblastoma (Schnep y  128  Maris, 2013), linfoma de Burkitt o leucemia mieloide aguda (Mertz et al., 2011). Consistentemente con esta observación, la proteína Brd2 con la estructura de los bromodominios alterada (mutante Y152K/N428A de Brd2) es incapaz de asociarse con los cromosomas (Figura 15), de interaccionar eficientemente con la cromatina (Figura 22) o con la cola de la histona H3 diacetilada (Figura 23) y, por tanto, su sobreexpresión no tiene efecto en la expresión de los genes CcnA2 y CcnD1 (Figura 36). Además, la expresión de un fragmento de la proteína Brd2 que carece de los bromodominios (∆BRO) no tiene efecto en la incorporación de BrdU en células P19 (Figura 12). Sorprendentemente, tanto la sobreexpresión de una proteína Brd2 con la estructura del segundo bromodominio alterada (mutante N428A, Figura 12) como de una proteína Brd2 carente de un fragmento del primer bromodominio (Brd2-iso, Figura 12) tienen un efecto negativo en la incorporación de BrdU en células P19 en condiciones de proliferación, lo que sugiere un posible efecto dominante negativo sobre la proteína Brd2 endógena. Sin embargo, la expresión de una proteína Brd2 con la estructura del primer bromodominio alterada (mutante Q78A, Figura 12) no muestra efecto en la incorporación de BrdU. Por lo tanto, tanto la pérdida de los bromodominios como la alteración de la estructura del primer bromodominio mediante la mutación Q78A tienen consecuencias funcionales in vivo diferentes a la mutación N428A que afecta al segundo bromodominio o a la pérdida de parte del primer bromodominio en la proteína Brd2-iso, a pesar de que las consecuencias de las mutaciones Q78A y N428A en la interacción de los bromodominios con histonas acetiladas in vitro son similares (Huang et al., 2007; Nakamura et al., 2007). Se ha descrito que el primer bromodominio puede mediar la dimerización de la proteína Brd2 (Nakamura et al., 2007), por lo que alteraciones que afecten a la estructura del segundo bromodominio o deleciones que afecten al primer bromodominio sin alterar la capacidad de dimerizar podrían tener como consecuencia un efecto dominante negativo sobre la proteína endógena al interaccionar con ésta y formar híbridos no funcionales. Sin embargo, la mutación Q78A, que afecta a la dimerización (Nakamura et al., 2007), no mostraría un efecto negativo en la función de la proteína endógena. Por otro lado, mutantes de Brd2, como las proteínas ∆BRO y los mutantes Q78A y Y152KN428A, que no interaccionan con la cromatina pero conservan la región carboxilo-terminal, descrita como el dominio de interacción con E2F-1 (Denis et al., 2000), también podría tener un efecto dominante, ya que podrían secuestrar a E2F-1. Sin embargo, no se ha observado dicho efecto (Figuras 12 y 36), lo que sugiere que la interacción de E2F-1 con la región carboxilo-terminal de Brd2 dependa de la integridad de la proteína, de forma que ésta pueda adoptar una conformación estructural adecuada. Consistentemente con lo publicado previamente (Sinha et al., 2005), la expresión de  129  una proteína Brd2 carente de la región carboxilo-terminal de interacción con E2F-1 tampoco afecta a la incorporación de BrdU en células P19 en condiciones de proliferación (Figura 12). La función de Brd2 como proteína adaptadora en la transcripción de genes del ciclo celular no excluye la posibilidad de que, dependiendo del contexto celular, intervenga en la activación de otros genes. Por ejemplo se ha indicado que en embriones de ratón carentes de la proteína Brd2 hay una disminución de la expresión de genes importantes para la diferenciación neuronal, como NeuroD1 o NeuroD4 (Gyuris et al., 2010) y que la proteína Brd2 se asocia con el promotor de genes que codifican citoquinas proinflamatorias, como IL-6 o TNF-α en macrófagos, siendo esta asociación requerida para la adecuada respuesta inflamatoria (Belkina et al., 2013). Además, mutaciones que causan una disminución en el nivel de expresión de BRD2 en humanos se han asociado con la epilepsia mioclónica juvenil (Cavalleri et al., 2007) y la mutación de Brd2 en heterocigosis conduce a una reducción en el número de neuronas GABAérgicas en estructuras cerebrales como la corteza, el estriado y el núcleo talámico ventromedial en ratones (Velisek et al., 2011). La expresión reducida de Brd2 en ratones se ha vinculado también a la obesidad no asociada a diabetes de tipo 2 (Wang et al., 2009) y a defectos en la producción de citoquinas pro-inflamatorias por macrófagos (Belkina et al., 2013). Teniendo en cuenta que la proteína Brd2 se ha copurificado con proteínas implicadas en la represión transcripcional, como la desacetilasa de histonas HDAC11 (Denis et al., 2006) o la proteína Brd7 (Zhou et al., 2006), además de tener un papel en la coactivación de genes del ciclo, Brd2 podría funcionar como adaptador en la represión de algunos genes. Por ejemplo, la disminución de los niveles de la proteína Brd2 causa un incremento en la expresión del gen que codifica la insulina en células beta pancreáticas, y en preadipocitos se ha propuesto un papel de Brd2 como corepresor de PPAR-γ en la inhibición de la adipogénesis (Wang et al., 2011). Curiosamente, se ha propuesto el mismo papel para la Ciclina D1, que también interacciona con PPARγ (Fu et al., 2004). La función de Brd2 como adaptador de múltiples factores conlleva un amplio abanico funcional durante el desarrollo. En este contexto, resulta interesante la observación de que los genes Brd2, Brd3 y Brd4 se expresan a lo largo del proceso de diferenciación neuronal inducida en células P19 (Figura 7). Asimismo, el nivel de proteína Brd2 se mantiene en distintas etapas de dicho proceso (Figura 50), de manera que se detecta tanto en progenitores neuronales como en neuronas postmitóticas en el tubo neural embrionario (Figura 42). Teniendo en cuenta el papel de Brd2 en la regulación de la expresión de genes del ciclo y que la diferenciación  136  Además, aunque se observa una reasociación de la proteína Brd2∆mB a los cromosomas en experimentos de inmunofluorescencia, la afinidad o la estructura de la proteína Brd2∆mB asociada podría ser diferente de la de la proteína silvestre, como indican los experimentos de ChIP (Figura 37) y de extracción diferencial (Figura 22) en cultivos asincrónicos. Nuestros resultados por lo tanto indicarían que en anafase tiene lugar una asociación aberrante de la proteína Brd2∆mB con los cromosomas que en consecuencia tendría un impacto negativo en la memoria transcripcional, siendo el motivo B relevante, no sólo para el reconocimiento físico de la cromatina acetilada, sino también para la adecuada conformación funcional de las proteínas BET. En contraste con Brd4 o Brdt, que reconocen preferentemente la cola de la histona H4 diacetilada (Dey et al., 2003; Morinière et al., 2009; Sasaki et al., 2009), Brd2 parece reconocer más eficientemente la histona H4 monoacetilada en la lisina 12 (H4K12ac) (Ito et al., 2011; Kanno et al., 2004). Sin embargo, se ha descrito la interacción de Brd2 con otras marcas de acetilación, como la histona H4 acetilada en la lisina 5 (H4K5ac) o en la lisina 8 (H4K8ac) (Kanno et al., 2004; Umehara et al., 2010b). Si bien la marca H4K12ac se mantiene durante la mitosis (Ito et al., 2011), las marcas H4K5ac y H4K8ac se pierden significativamente durante la mitosis (Kruhlak et al., 2001; Sasaki et al., 2009). Asimismo, la proteína Brd2 es capaz de reconocer la histona H3 diacetilada en las lisinas 9 y 14 (H3K9acK14ac) (Figura 23), marcas que decrecen significativamente durante la mitosis, aunque se retengan parcialmente cerca del sitio de inicio de la transcripción de genes de activación temprana (Kouskouti y Talianidis, 2005). Aunque distintos trabajos previamente publicados indican la interacción de Brd2 con diferentes marcas de acetilación de histonas, se observan aparentes discrepancias en la bibliografía sobre la selectividad de interacción de Brd2 con marcas de acetilación específicas. Estas discrepancias podrían deberse a la diferencia entre las aproximaciones experimentales utilizadas en cada caso, ya que el reconocimiento selectivo de marcas específicas se ha puesto de manifiesto mediante ensayos de pull-down o de SPR in vitro, o mediante procesamiento de imágenes fluorescentes en tiempo real in vivo, normalmente recurriendo a la sobreexpresión de proteínas: la proteína completa, o fragmentos truncados que incluyen sólo los bromodominios, e incluso proteínas quiméricas (Dey et al., 2003; Huang et al., 2007; Ito et al., 2011; Kanno et al., 2004; Morinière et al., 2009; Nakamura et al., 2007; Sasaki et al., 2009; Umehara et al., 2010b). Además, nuestros resultados indican que las proteínas BET pueden interaccionar entre sí a través del motivo B, lo que complica la caracterización de la selectividad del reconocimiento de marcas de histonas por las proteínas BET endógenas.  137  Varias evidencias apoyan el papel del motivo B en la interacción entre proteínas BET: (a) la interacción del motivo B de Brd2 consigo mismo y con el motivo B de Brd3 y Brd4 en el sistema de dos híbridos (Figuras 26 y 27); (b) la interacción del motivo B de Brd2 recombinante con la fusión GST-mB en ensayos de pull-down in vitro (Figura 28); (c) la coinmunoprecipitación de Brd2 dependiente del motivo B (Figuras 31 y 33); y (d) la señal FRET significativa entre Brd2-RFP y GFP-Brd2 o GFP-Brd3, dependiente del motivo B al menos en el caso de Brd2 (Figura 34). La función de muchos factores de transcripción depende de su capacidad para formar estructuras diméricas, ya sea entre proteínas idénticas (homodimerización) o diferentes (heterodimerización) (Almoutzias et al., 2008). Se ha propuesto previamente que el primer bromodominio de Brd2 está implicado en la homodimerización de la proteína ya que el fragmento amino-terminal de Brd2 que lo incluye es capaz de coinmunoprecipitar un fragmento equivalente fusionado a GFP o a la proteína completa recombinante (Nakamura et al., 2007). Sin embargo, nuestros resultados muestran que el motivo B es tan necesario como el primer bromodominio para la interacción de la proteína Brd2 consigo mismo (Figura 31). De hecho, el motivo B es crucial para la señal de FRET y su pérdida tiene por sí sola un efecto similar a la pérdida conjunta del motivo B junto con mutaciones en el primer bromodominio que afectan a la dimerización (Figura 34). Por lo tanto, el motivo B y el primer bromodominio de Brd2 podrían cooperar en la adquisición de una configuración funcionalmente adecuada para el reconocimiento eficiente de marcas específicas de acetilación de la cromatina por parte de los bromodominios. Además, nuestros resultados muestran que el motivo B no sólo media la interacción de Brd2 consigo mismo, sino que también media la interacción entre las distintas proteínas BET (Figuras 26, 27, 29 y 30). Teniendo esto en cuenta, es razonable especular que la interacción entre proteínas BET podría modular la funcionalidad de estas proteínas. De hecho, la ausencia de redundancia funcional entre las proteínas BET a pesar de la homología y del solapamiento en el patrón de expresión de los distintos miembros (Gyuris et al., 2009; Houzelstein et al., 2002; LeRoy et al., 2008; Shang et al., 2009) estaría de acuerdo con una función dependiente de la interacción entre proteínas BET diferentes. La secuencia de aminoácidos del motivo B está muy conservada entre las distintas proteínas BET de vertebrados (Figura 59A). Un análisis de la secuencia del motivo B de la proteína Brd2 con la herramienta bioinformática Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) indica que esta región probablemente no está desordenada, sino que se ajusta a una posible estructura tipo coiled coil. De  138  hecho, un análisis de esta secuencia con la herramienta bioinformática COIL (Lupas et al., 1991) indica una alta probabilidad de que esta región se ajuste a una estructura en coiled coil. Concretamente, se obtuvo un valor de >96% para esta región con una ventana de escaneo de 21 residuos, en contraste con la baja probabilidad (<1%) obtenida para los bromodominios, cuya estructura es bien conocida y diferente del coiled coil (Huang et al., 2007; Nakamura et al., 2007). Figura 59. El motivo B contiene un posible coiled coil. (A) Alineamiento de la secuencia de aminoácidos correspondiente a una región entre el segundo bromodominio y el dominio ET de varias proteínas BET de vertebrados. Los aminoácidos conservados en todas las secuencias aparecen en recuadros negros mientras que aminoácidos conservados en al menos 6 de las 8 secuencias aparecen en recuadros grises. La región conservada indicada constituye el motivo B (Paillisson et al., 2007). (B) Alineamiento del motivo B de diferentes proteínas BET de mamíferos a levaduras. Las tres repeticiones heptapeptídicas del posible coiled coil aparecen señaladas (I, II y III). Los recuadros negros indican residuos no polares relevantes en esta estructura y los recuadros grises indican posibles residuos expuestos al solvente (Grigoryan y Keating, 2008). También se indica la región básica conservada en posición carboxilo-terminal del motivo B. Los alineamientos se realizaron con la herramienta ClustalX 2.0.11. Además, la probabilidad obtenida para el motivo B fue similar a la obtenida para secuencias de coiled coils previamente descritas, como la cremallera de leucina clásica de la proteína GcN4 de S. cerevisiae (>99%) (O´Shea et al., 1991). El alineamiento de la secuencia del motivo B de proteínas BET de varias especies revela motivo B región básica  139  el alto grado de conservación de los residuos que definen una estructura en coiled coil (Figura 59B). Las estructuras coiled coil consisten en repeticiones de una héptada (abcdefg) con residuos de aminoácido hidrofóbicos en las posiciones a y d y residuos de aminoácidos polares expuestos al solvente en las posiciones e y g (Grigoryan y Keating, 2008). Esta disposición de residuos está conservada en la secuencia del motivo B de la proteína Brd2 de distintas especies (Figura 59B). Como los coiled coils median habitualmente la dimerización de proteínas (Grigoryan y Keating, 2008), esta observación apoya el papel del motivo B en la dimerización entre proteínas BET. Las estructuras tipo coiled coil median habitualmente la dimerización entre proteínas y la dimerización está implicada en la funcionalidad de multitud de factores y co-factores transcripcionales pertenecientes a diversas familias (Amoutzias et al., 2008). Sin embargo, no podemos descartar la implicación de otras secuencias del motivo B contiguas al coiled coil, como la región básica conservada carboxilo-terminal, en la adecuada conformación de los dímeros. De hecho, en el ensayo de FRET la interacción de la proteína Brd2 consigo mismo requería que en un caso el fluoróforo estuviera fusionado al extremo amino-terminal de Brd2 (GFP-Brd2) y en el otro al extremo carboxilo-terminal de Brd2 (Brd2-RFP) (Figura 34). Esta observación podría indicar que las dos moléculas de Brd2 interaccionan con orientaciones opuestas a través del motivo B. La presencia de residuos de aminoácido de carácter ácido hacia el extremo amino-terminal del motivo B y residuos de aminoácido de carácter básico hacia el carboxilo-terminal (Figura 59A) podría estar implicada en la orientación de la interacción entre moléculas de la proteína Brd2. Recientemente se ha descrito que en la proteína Brd4, la fosforilación de residuos de serina localizados en la región aminoterminal al motivo B mediada por la kinasa CK2 (Casein kinase 2) regula un cambio conformacional importante para la adecuada asociación de Brd4 a los genes c-Myc o c-Fos (Wu et al., 2013). Concretamente, Wu y colaboradores proponen que, en ausencia de fosforilación, esta región interacciona intramolecularmente con el segundo bromodominio, bloqueando su capacidad de interaccionar con la cromatina. La fosforilación incrementa su afinidad por la región básica del motivo B (localizada hacia el extremo carboxilo-terminal de dicho motivo), liberando el segundo bromodominio, lo que da lugar a una conformación funcional en Brd4. Aunque Wu y colaboradores proponen que la interacción entre la región fosforilada y la región básica del motivo B tiene lugar en una misma molécula de Brd4, en los experimentos que realizan para demostrar dicha interacción utilizan péptidos correspondientes a pequeños fragmentos de la proteína Brd4, por lo que no se demuestra que la interacción entre ambas regiones sea intramolecular. Teniendo en cuenta que la región fosforilable y la región básica flanquean el posible coiled coil del motivo B, cabe la posibilidad de que la  140  fosforilación estimule la homodimerización de Brd4, lo que supondría un mecanismo de regulación funcional de una proteína BET a través de la regulación de su dimerización. Dicha homodimerización liberaría el segundo bromodominio de las dos moléculas implicadas y el complejo sería funcional para la asociación con la cromatina. Curiosamente, sólo dos de los siete residuos de serina fosforilables por CK2 están conservados en la secuencia de la proteína Brd2 que, en su lugar, presenta una sucesión de residuos de ácido glutámico que le confieren carácter acídico a la región. Además, en el caso de Brd2, la pérdida de esta región acídica (proteína Brd2∆NmB) no tiene consecuencias significativas en su capacidad de asociarse con los cromosomas (Figura 16) o la cromatina (Figura 37) o de estimular la expresión de genes de ciclo (Figuras 36 y 39). Según el modelo de Wu y colaboradores, la proteína Brd2∆NmB sería constitutivamente activa. La importancia del motivo B en la función de Brd2 se ve reflejada en la incapacidad de Brd2 de asociarse con la cromatina en ausencia de dicho motivo (Figuras 16, 22, 23 y 37). De esta manera, la sobreexpresión de Brd2 carente del motivo B no tiene efecto en la expresión de los genes CcnD1 y CcnA2 (Figura 36), en la acumulación de células en la fase G1 inducida por tratamiento con ácido retinoico en células P19 (Figuras 39 y 40) o en la diferenciación neuronal en células P19 (Figura 41) o en el tubo neural embrionario (Figura 43). A su vez, la sobreexpresión de un fragmento de Brd2 que incluye el motivo B interfiere con la dimerización de la proteína Brd2 (Figura 58), afectando a la capacidad de Brd2 de asociarse con los cromosomas (Figura 35) y con las regiones promotoras de los genes CcnD1 y CcnA2 (Figura 57). Debido a su papel en la regulación del ciclo celular, la alteración del patrón de expresión de distintas proteínas BET se ha asociado con diversos tipos de cáncer (Crawford et al., 2008; Filippakopoulos et al., 2010; French, 2012; French et al., 2003; French et al., 2008; Greenwald et al., 2004; Zuber et al., 2011), y la inhibición de la asociación de las proteínas BET con la cromatina, mediada por drogas que mimetizan marcas específicas de acetilación, contrarresta eficientemente la progresión de varios tipos de cáncer en modelos de ratón (Dawson et al., 2011; Delmore et al., 2011; Filippakopoulos et al., 2010; Mertz et al., 2011; Prinjha et al., 2012; Zuber et al., 2011). En este contexto, el conocimiento preciso de las características estructurales implicadas en la asociación de las proteínas BET a la cromatina podría contribuir a mejorar el diseño de drogas, de manera que resulten más específicas y eficaces en el bloqueo de proteínas BET con fines terapéuticos.  141  4.3. Ptn es un antagonista de Brd2 durante el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados En nuestra búsqueda de proteínas capaces de interaccionar con la mitad carboxilo-terminal de Brd2, descubrimos la interacción entre Brd2 y la proteína Ptn (Figura 24), que fue verificada en el sistema de dos híbridos (Figura 44), en experimentos de coinmunoprecipitación de las proteínas recombinantes (Figura 44) y endógenas (Figura 52) en líneas celulares y en experimentos de pull-down in vitro (Figura 45). Curiosamente, la interacción entre Brd2 y Ptn tiene lugar a través de una región básica carboxilo-terminal de Ptn y una región acídica de Brd2 no conservada en las otras proteínas BET de vertebrados (Figuras 46, 47 y 48). La interacción entre ambas y el hecho de que se expresan abundantemente en el sistema nervioso central de embriones de vertebrados en los mismos estadíos (Crowley et al., 2003; Gyuris et al., 2009; Mitsiadis et al., 1995; Yanagisawa et al., 2010), además de estar presentes en los mismos compartimentos celulares en células P19 en las que se induce la expresión de Ptn mediante tratamiento con AR (Figura 51), anticipaban una relación funcional entre ambas. Como se comentó en el apartado 3.3.1. de la sección de Resultados, varios estudios han asociado la función de Ptn con la estimulación de distintos procesos relacionados con la diferenciación neuronal. A su vez, Ptn se ha relacionado con la estimulación de la proliferación en otros tipos celulares (Chauhan et al., 1993), por lo que su función en diferenciación podría relacionarse con un papel en la regulación del ciclo celular. De hecho, en células P19 en las que se induce la diferenciación neuronal mediante tratamiento con AR, se activa la expresión transitoria de Ptn al principio del tratamiento, cuando se empiezan a acumular las células en la fase G1 del ciclo (Brunet-De Carvalho et al., 2003). El hecho de que la sobreexpresión de Brd2 en células P19 interfiere con la diferenciación neuronal y que Ptn se ha relacionado con la diferenciación neuronal de progenitores neuronales, sugiere un antagonismo funcional entre ambas proteínas en el proceso de diferenciación neuronal. Varios de los resultados obtenidos apoyan esta teoría: (a) la sobreexpresión de Ptn anula el efecto antineurogénico de la sobreexpresión de Brd2 en células P19 (Figura 53); (b) dicho efecto requiere la interacción entre Brd2 y Ptn, ya que Ptn no puede anular el efecto de Brd2∆ac y Ptn∆C no puede antagonizar el efecto de Brd2 (Figura 53); (c) la sobreexpresión de Ptn anula el efecto negativo de la sobreexpresión de Brd2 en la diferenciación de progenitores neuronales del tubo neural (Figura 55); (d) Ptn interfiere con la homodimerización de Brd2 y con su asociación a la cromatina (Figuras 57 y 58). El hecho de que la inhibición de Ptn mediante el uso en células P19 de una molécula  142  shRNA muestre un efecto similar en neurogénesis al de la sobreexpresión de Brd2 (Figura 53) sugiere que gran parte de la función de Ptn, al menos en los primeros estadios de la diferenciación neuronal inducida, podría estar relacionada con antagonizar la función de Brd2. Aun así, trabajos previos han implicado la interacción de Ptn con varios receptores de superficie celular en la estimulación de la diferenciación en varios modelos (Hampton et al., 1992; Kinnunen et al., 1998; Li et al., 1990; Maeda y Noda, 1998; Muramatsu et al. 2000; Rauvala, 1989; Reiff et al., 2011; Yanagisawa et al., 2010), por lo que es posible que el efecto de Ptn en la diferenciación implique la activación de varias vías de señalización, además de ser un antagonista de Brd2. De hecho, la expresión de Ptn por sí sola no es suficiente para inducir la diferenciación en células P19 (Brunet-De Carvalho et al., 2003) ni tiene efectos dramáticos en progenitores neuronales (Figura 55), lo que indica que otros mecanismos adicionales son necesarios para especificar el destino neuronal. Teniendo en cuenta la importancia de la dimerización de Brd2 a través del motivo B para su función como transactivador de genes del ciclo y que la proteína Ptn interacciona con una región acídica próxima a este dominio, es razonable suponer que la interacción de Ptn con Brd podría interferir con la dimerización de Brd2. El efecto de Ptn sobre la dimerización de Brd2 es similar al efecto de la sobreexpresión de un fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B (Figura 58). De hecho, la expresión de Ptn interfiere con la interacción de la proteína Brd2 endógena con la cromatina y con las regiones promotoras de los genes CcnD1 y CcnA2 (Figura 57), probablemente mediante la interferencia con la formación de dímeros funcionales. Así, el antagonismo de Ptn con Brd2 durante el proceso de diferenciación neuronal probablemente tenga lugar, al menos en parte, como consecuencia de una alteración estructural de la proteína Brd2. En este sentido, la expresión de un fragmento de Brd2 correspondiente al motivo B, que afecta a la dimerización y función de Brd2 (Figura 35, 57 y 58), también favorece la diferenciación neuronal en células P19 (Figura 53). Nuestros resultados indican que la sobreexpresión de Brd3 conlleva un efecto antineurogénico similar al de Brd2; sin embargo, Ptn interacciona selectivamente con Brd2, por lo que no muestra efectos sobre la actividad antineurogénica de Brd3 (Figura 53). La homología entre las proteínas Brd2 y Brd3 y la asociación de Brd3 con el promotor de genes del ciclo (LeRoy et al., 2008) así como su papel en la activación de la proliferación (Dawson et al., 2011) explican un efecto de la sobreexpresión de Brd3 en la diferenciación neuronal similar al de Brd2 (Figura 53). Dado que el gen Brd3 mantiene su expresión en células P19 a lo largo del proceso de diferenciación neuronal (Figura 7), es razonable especular acerca de la importancia de antagonizar  143  Brd2 durante la diferenciación neuronal si otros miembros de la familia BET insensibles a Ptn se expresan. Teniendo en cuenta la posibilidad de heterodimerización entre proteínas BET, es posible que Ptn, aun cuando sólo interacciona con Brd2, tenga un efecto indirecto sobre Brd3, interfiriendo con su capacidad de dimerización con Brd2. Por otro lado, se ha demostrado que cambios en la dosis de una sola de las proteínas BET tienen consecuencias fenotípicas. Así, la mutación de Brd4 en heterozigosis conlleva defectos proliferativos en MEFs (Houzelstein et al., 2002). En el apartado 4.1. de la Discusión se comentó que el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la diferenciación podría deberse a: (1) una interferencia con el enlentecimiento de la fase G1 importante para que los progenitores neuronales se comprometan y dividan neurogénicamente o (2) una interferencia con la parada del ciclo celular tras una división neurogénica. En este sentido, el efecto positivo de Ptn en la diferenciación neuronal podría deberse a que, al interferir con la asociación de Brd2 con la cromatina, favorece tanto el enlentecimiento de la fase G1 en interfase como la parada del ciclo celular en la célula hija. Se ha publicado que una disminución en los niveles del complejo Cdk4/Ciclina D1 en progenitores neuronales se relaciona con una neurogénesis prematura (Lange et al., 2009). Sin embargo, en el caso de Ptn, la sobreexpresión de la proteína no es suficiente para inducir la diferenciación en progenitores neuronales del tubo neural (Figura 55), lo que indica que otros mecanismos adicionales son necesarios para especificar el destino neuronal. Por ejemplo, la proteína p27 estimula la diferenciación neuronal a través de su efecto en el ciclo celular y a través de efectos no relacionados con la regulación del ciclo, como la estabilización del factor neurogenina-2 o el bloqueo de la señalización por RhoA (Nguyen et al., 2006). Curiosamente, la actividad fosfatasa del receptor PTP-ζ , que es inhibida por ligandos como Ptn, se ha visto implicada en la activación de la señalización por proteínas Rho (Tamura et al., 2006). Se ha publicado que la asociación de Brd4 con los cromosomas es importante para la reactivación temprana tras la mitosis de genes importantes para el ciclo celular (Zhao et al., 2011). Teniendo esto en cuenta, es posible que el antagonismo de Ptn sea relevante de manera especial durante la mitosis en divisiones neurogénicas, por lo que investigar la interacción de Ptn y Brd2 durante la mitosis, así como determinar el efecto de la sobreexpresión de Brd2 en la duración de la fase G1 de los progenitores neuronales podría arrojar luz sobre los mecanismos de acción de Ptn. La presencia de parte de Brd2 en el citoplasma de las neuronas del manto del tubo neural o de los ganglios de la raíz dorsal (Figura 42) así como en células P19  144  diferenciadas a neuronas (Figura 8) sugiere un posible papel de la relocalización de Brd2 en la diferenciación neuronal. Esta localización se observa de forma temprana, coincidiendo con la inducción de Ptn por ácido retinoico en células P19 (Figura 51). Teniendo en cuenta que la mayor parte de la proteína Ptn se localiza en el citoplasma de éstas células, es posible que Ptn bloquee la NLS2 de Brd2 presente en el motivo B y cercana al dominio de interacción con Ptn (Figura 10), secuestrando en el citoplasma la proteína Brd2 sintetizada de novo. Este fenómeno se observa en otras proteínas, como por ejemplo Nucleolina. Esta proteína de expresión ubicua es preferentemente nucleolar pero se localiza parcialmente en la membrana plasmática de algunos tipos celulares, como en varias líneas tumorales (Hovanessian et al., 2010; Krust et al., 2011; Watanabe et al., 2010), en células endoteliales (Christian et al., 2003; Hovanessian et al., 2010), en macrófagos (Miki et al., 2012), en células musculares durante el desarrollo (Alete et al., 2006), en células del epitelio intestinal (Turck et al., 2006) y en neuronas (Kleinman et al., 1991). En la superficie de estas células Nucleolina puede interaccionar con multitud de proteínas, como laminina-1 (Kibbey et al., 1995), PTPσ (Alete et al., 2006), PTPγ o la integrina αvβ3 (Koutsioumpa et al., 2012b) y a su vez puede mediar la internalización de varios ligandos, como las proteínas Ptn y Mdk (Hovanessian, 2006; Koutsioumpa et al., 2012b). Se ha descrito que, al menos en células endoteliales, en condiciones de estimulación angiogénica es la proteína Nucleolina sintetizada de novo en el citoplasma la que se transporta a la superficie celular (Hovanessian et al., 2010). Dicho transporte requiere la activación de varias rutas de señalización, la fosforilación de Nucleolina por CK2 y su interacción con la Miosina 9 (Ding et al., 2012). Sin embargo, nuestros resultados, así como publicaciones previas, también muestran que Ptn se localiza en el núcleo (Figura 51, Blondet et al., 2005; Koutsioumpa et al., 2013; Mitsiadis et al., 1995). Es interesante destacar que Nucleolina se ha implicado en la translocación nuclear de Ptn y Mdk (Koutsioumpa et al., 2012a; Shibata et al., 2002). Curiosamente, la entrada al nucleo de Ptn mediada por Nucleolina es importante para la migración de células endoteliales (Huang et al., 2006; Koutsioumpa et al., 2012a) y la presencia de nucleolina en la superficie celular se ha relacionado con la diferenciación neuronal (Kibbey et al., 1995) y de células del epitelio intestinal (Turck et al., 2005), así como con las uniones neuromusculares (Alete et al., 2006). Además, la estimulación de Nucleolina con ligandos extracelulares se ha relacionado a su vez con la liberación de calcio y con la señalización mediada por calcio (Losfeld et al., 2008), proceso importante en varios modelos de diferenciación, incluida la neurogénesis (Jaskova et al., 2012). Por tanto, la entrada de Ptn en la célula mediada por la proteína Nucleolina, junto a la activación de otros procesos de señalización celular, parece importante en varios modelos de  145  diferenciación celular. Es interesante que la proteína Lyar (también aislada en el escrutinio de dos híbridos con Brd2) interacciona con Nucleolina impidiendo su procesamiento proteolítico, lo que es esencial para el mantenimiento de la capacidad de autorrenovación de células troncales (Li et al., 2009). Los experimentos de electroporación de la región dorsal del tubo neural del embrión de pollo confirman el antagonismo entre Ptn y Brd2 en la migración de células de la cresta neural (Figura 56). El efecto negativo de la sobreexpresión de Ptn en la migración de células de la cresta neural podría deberse a la disminución del nivel de expresión del gen CcnD1 debida a la interferencia de Ptn con la función de Brd2. Curiosamente, la estimulación exógena con AR, que induce la expresión de Ptn en células P19 (Brunet de Carvalho et al., 2003), alarga la duración de la fase G1 en células de la cresta neural de pollo e incrementa su tasa de proliferación y retención (Salvarezza y Rovasio, 1997). Por otro lado, se ha propuesto un papel de Mdk, a través de su interacción con el receptor Alk, en la proliferación de las neuronas inmaduras de los ganglios simpáticos, derivadas de la cresta neural, de manera que la interferencia con la señalización de Alk afecta negativamente al tamaño de estos ganglios (Reiff et al., 2011). Estos resultados, unidos al patrón de expresión de Ptn y Mdk en células asociadas con la cresta neural (Figura 54), sugieren una función de Ptn/Mdk en la formación de la cresta, aparentemente en contradicción con la inhibición que ejerce la sobreexpresión de Ptn en el proceso de migración (Figura 56). Por lo tanto, el antagonismo Ptn-Brd2 en la cresta neural puede contemplarse como un mecanismo de modulación en la función de ambas proteínas que no conlleva la inhibición total de la función de una o de la otra. Así, este antagonismo podría estar implicado en mantener el dinamismo y la fuente de la cresta, ya que la pérdida de células por delaminación debe compensarse con el aporte de nuevas células proliferativas de zonas dorso-laterales vecinas (Kalcheim y Burstyn-Cohen, 2005). De hecho, Ptn es esencial para la retención y la autorrenovación de una población adecuada de células troncales hematopoyéticas en el nicho vascular de la médula ósea (Himburg et al., 2012). Curiosamente, existen similitudes entre la cresta neural y el sistema hematopoyético, ya que en ambos casos, a partir de poblaciones originalmente reducidas pero con capacidad de autorrenovación, se originan amplias poblaciones de distintos tipos celulares que se dispersan por diversos órganos (Le Douarin et al., 2008). La importancia de Brd2 en el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados se refleja también en los defectos en el desarrollo del tubo neural, como defectos en el cierre dorsal del tubo, asociados a la mutación de Brd2 en ratones (Gyuris et al., 2009;