Regulación de la función sináptica de neurexinas por presenilinas: Implicaciones en la enfermedad de alzheimer

N  De REG U EURE X E U N partam e U LACI Ó X INAS P N LA E N IVERSI nto de F Ó N DE L A P OR PR E N FER M TESI S Emilia S e  DAD D E F isiologí a A FUN C E SENI L M EDAD D S DOC T Servián e villa, 2 0 E SEVI L a Médic a C IÓN SI L INAS. I D E A L Z T ORAL Morilla 0 12 L LA a y Biofí s NÁPTI C MPLIC A Z HEIME R s ica C A DE A CION E R. E S     Don Dep a CE R Que titul a Impl de d   DEPAR T FACUL Francisc o artamento R TIFICA: Doña E m a do “Reg u icaciones d octor por l T AMEN T TAD DE o Gómez de Fisiol o m ilia Serv i u lación de en la enfe r a Universi T O DE FI S MEDICI N Scholl, P o gía Médic a i án Morill a la funció n r medad d e dad de S e S IOLOG Í N A. UNI V P rofesor T a y Biofísi c a ha reali z n sináptic a e A lzheim e e villa.  Í A MÉDI C V ERSID A T itular de c a de la U n z ado baj o a de neu r er ” que pre Fdo.: Sevilla a C A Y BI O A D DE S E Universid a n iversidad su direc c r exinas p o s enta par a Francisc o 6 de septi e O FÍSICA . E VILLA. a d, adscri de Sevilla c ión el tr a o r preseni l a optar al g o Gómez S embre de . to al a bajo l inas. g rado S choll 2012  Agradecimientos Después de tanto tiempo esperando a que el momento de los agradecimientos se hiciera realidad, quizás no encuentre palabras para describir los sentimientos que afloran en mi interior, pero lo voy a intentar. En primer lugar quisiera agradecer a Francisco Gómez Scholl, director de esta Tesis, la oportunidad que me brindó y la confianza depositada en mí para el desarrollo de esta maravillosa Tesis doctoral. Agradezco enormemente su pasión por la ciencia y su afán por transmitirme sus conocimientos a lo largo de todos estos años. El camino no ha sido fácil, pero gracias a él he aprendido a luchar por un objetivo. Gracias por compartir conmigo esta aventura científica y por haberme hecho mejor persona, tanto profesional como personalmente. Mi más sincero agradecimiento a Amalia Martínez Mir. Sin aquella primera entrevista en su despacho y la posterior presentación con Francisco no habría llegado hasta donde estoy. Gracias por su aportación en la escritura del artículo científico, fruto de esta Tesis doctoral y muy particularmente por habernos dado la oportunidad de formar parte del IBiS, habiéndonos sacado de aquella caracola que tan buenos momentos nos dió. Mi gratitud a los doctores: Carlos Saura, Rafael Fernández Chacón, Javier Vitorica y Alberto Pascual; por su disponibilidad y colaboración en este trabajo. Al Departamento de Fiosología Médica y Biofísica, a todos los profesores, PAS, técnicos y becarios/contratados que me han acompañado estos años. De manera especial agradecer a mis compañeros de laboratorio la ayuda y sabiduría prestada. Particularmente a Juan Antonio por haberme enseñado la mayoría de los conocimientos adquiridos. Destaco su honradez, su bondad y la paciencia que ha tenido conmigo. A Marisa, por su ayuda, su experiencia y su cariño. Por todos esos años que aún nos esperan compartiendo confidencias y amistad. Ojalá todos te vean como te veo yo. A Enriqueta, Silvia, Rafa y Luis por animarme en el sprint final. A mis queridísimos “chacones” por haberme ayudado siempre en los buenos momentos y en los no tan buenos. A Leo por esas risas compartidas, por valorarme como nunca nadie lo ha hecho y por ese cariño tan especial que nos une. A José Antonio por animarme, escucharme y por compartir conmigo esa aventura inolvidable del descenso de barrancos en el nacimiento del Guadalquivir. A Fabi por su simpatía y esa sonrisa característica que nos alegra el día. A José Luis por su amplio conocimiento y ayudarnos en todo lo que pueda y más. A Mª Carmen, Alejandro, Ángela, Josif, José Luis Rozas, Gloria, Pablo y Perico por los momentos vividos. A mis compañeros del IBiS por la acogida tan buena que tuve y por ese quinto año junto a vosotros que ojalá esté por venir. En especial a Inma, por su ánimo y compañía en estos últimos meses de trabajo. A mis amigos del departamento: Rocío, Raquel, Laura, Marga, Mª Ángeles, Imane, Eli, Ángel, Susana, Juanjo, Alexandra, José Antonio y José María por vuestro cariño, compresión y apoyo. Es estupendo mezclar el compañerismo con la amistad de todos vosotros. A mis niñas del máster: Mª Luz, Mª José, Daniela, Laura y Vero. Gracias a vosotros las tardes del máster fueron más amenas. Espero seguir compartiendo con vosotras esas cervecitas a media tarde. A mis amigos, ya que todas mis alegrías, logros, sentimientos y vivencias las he compartido con vosotros. Estoy absolutamente convencida de que puedo presumir de los grandes amigos que tengo, lo que me hace sentir una persona muy afortunada. A esos compañeros de la facultad que se convirtieron en grandes amigos. Particularmente a Cristina y Gloria por compartir este camino conmigo desde hace ya diez años y a mi Christian, la mejor persona que he conocido. De forma muy especial, quiero dejar constancia del agradecimiento a mi familia, por apoyarme incondicionalmente a lo largo de mi vida. A mis hermanos, por hacerme sentir siempre tan especial. A mis padres, por creer siempre en mí y estar ahí en todo momento. Mi lucha ha sido vuestra lucha, que sepáis que nunca lo olvidaré. Y por último y no menos importante, a ti Juan José, por arrancarme siempre una sonrisa, por ayudarme a luchar por lo que quiero, por aguantarme en los días en los que ni yo misma me aguanto, pero sobre todo, por hacerme feliz. Esta Tesis no hubiera podido ver la luz sin el apoyo de todos vosotros. Sabéis que he pasado por momentos duros, pero gracias al esfuerzo, la constancia y el trabajo, hoy estoy aquí agradeciendo todo el apoyo y cariño que he recibido de vosotros. Una vez más y que sepáis que nunca me cansaré de repetirlo: MUCHÍSIMAS GRACIAS. “La ciencia se compone de errores, que a su vez, son los pasos hacia la verdad” Julio Verne (1828-1905)   “A veces, el replanteamiento de un problema es más decisivo que el hallazgo de la solución, que puede ser un puro asunto de habilidad matemática o experimental. La capacidad de suscitar nuevas cuestiones, nuevas posibilidades de mirar viejos problemas, requiere una imaginación creativa y determina los avances científicos auténticos" Albert Einstein (1879-1955)   ÍNDICE ÍNDICE FIGURAS Figura 25. Efecto del inhibidor TAPI-1 en el procesamiento de HA-βNrx1 en cultivos de neuronas .................................................................................................................................... 99 Figura 26. Acumulación de los CTFs de las neurexinas en las fracciones sinápticas de los ratones cDKO de PS ......................................................................................................... 100 Figura 27. Reclutamiento de PS1 a las sinapsis mediadas por neurexinas-neuroliguinas ................................................................................................................................................... 102 Figura 28. Colocalización de PS1 con marcadores sinápticos en las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 .............................................................................................................................. 103 Figura 29. Esquema experimental de un ensayo de co-cultivo. ......................................... 104 Figura 30. Reclutamiento de PS1 en las hemisinapsis mediadas por neurexinaneuroliguina ............................................................................................................................. 105 Figura 31. Esquema experimental de un ensayo de infección-transfección.. .................. 106 Figura 32. Reclutamiento de neurexinas a sinapsis mediadas por HA-Nlg1 en neuronas deficientes en PS. .................................................................................................................... 107 Figura 33. Esquema experimental de un ensayo de infección-co-cultivo. ....................... 108 Figura 34. Reclutamiento de neurexinas en las hemisinapsis mediadas por HA-Nlg1 en neuronas deficientes en PS ................................................................................................... 109 Figura 35. Incubación con soluciones despolarizantes activan el procesamiento de las neurexinas en cultivos de neuronas de hipocampo ........................................................... 112 Figura 36. Cuantificación de los niveles de CTF de neurexinas en cultivos incubados con KCl ............................................................................................................................................ 113 Figura 37. La despolarización activa el procesamiento de HA-βNrx1 en cultivos de neuronas de hipocampo ......................................................................................................... 114 Figura 38. Esquema representativo del proceso de infección-transfección del ensayo experimental para el análisis de liberación vesicular ......................................................... 117 Figura 39. Efecto de la inhibición de la actividad -secretasa por DAPT sobre la liberación de vesículas sinápticas en las sinapsis mediadas por neurexinas-neuroliguinas. ......... 119 Figura 40. Cuantificación de los niveles de fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cultivos tratados con DAPT ................................................................................................... 121 Figura 41. Análisis de la liberación de vesículas en neuronas de hipocampo deficientes en PS mediante expresión lentiviral de PS1 D385A ............................................................ 123 Figura 42. Cuantificación de los niveles de fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cultivos infectados con PS1 D385A ...................................................................................... 124 ÍNDICE FIGURAS Figura 43. Acumulación de los CTFs de las neurexinas en neuronas de hipocampo que carecen de la expresión de PS............................................................................................... 127 Figura 44. Expresión lentiviral de Cre y Cre en cultivos de neuronas ............................ 128 Figura 45. Análisis de la fluorescencia de sypHy en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2+/- infectadas con Cre. .................................................................................. 130 Figura 46. Análisis de la fluorescencia de sypHy en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectadas con Cre o Cre. ...................................................................... 131 Figura 47. Cuantificación de la fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2+/- infectadas con Cre .............................................................. 133 Figura 48. Cuantificación de la fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectadas con Cre o Cre ................................................... 134 Figura 49. Cuantificación de la fluorescencia de Vamp2 en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectados con Cre o Cre.. ................................................. 135 Figura 50. PS forma un complejo con β-neurexina1 en células Hek 293T ........................ 137 Figura 51. La inhibición de PS incrementa los niveles de β-neurexina en la membrana de células MEF KO y de neuronas deficientes en PS1. ............................................................ 139 Figura 52. Distribución de las neurexinas endógenas en axones defectivos en PS. ...... 141 Figura 53. La inhibición de PS incrementa la interacción entre HA-β-neurexina y CASK. ................................................................................................................................................... 143 Figura 54. Reclutamiento de CASK en sinapsis mediadas por HA-Nlg1 en neuronas deficientes en PS1. .................................................................................................................. 144 Figura 55. Reclutamiento de CASK y neurexinas en neuronas de hipocampo KO de PS ................................................................................................................................................... 145 Figura 56. Expresión y localización del ICD de neurexinas ................................................ 147 Figura 57. El procesamiento de β-neurexina-1 está afectado por los mutantes de PS1 asociados con FAD. ................................................................................................................ 150 Figura 58. El procesamiento de las neurexinas está afectado en ratones transgénicos que expresan mutantes de PS1 asociados con FAD. ......................................................... 152 Figura 59. Alineamiento de las secuencias de neurexinas ................................................. 158 Figura 60. Modelo del procesamiento sináptico de las neurexinas dependiente de actividad. .................................................................................................................................. 167     1 INTRODUCCIÓN          INTRODUCCIÓN 21 1.1 MECANISMOS DE FORMACIÓN DE SINAPSIS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL. PAPEL DE NEUREXINAS Las sinapsis son adhesiones intercelulares especializadas entre neuronas, que permiten la transmisión del impulso nervioso. Las sinapsis tienen una estructura característica, en la que se distinguen tres zonas: el terminal presináptico, la hendidura sináptica y el terminal postsináptico. La estructura asimétrica de las sinapsis permite el sentido de la transmisión del impulso nervioso desde el terminal presináptico al terminal postsináptico. La llegada de un potencial de acción al terminal presináptico induce la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC), y como consecuencia de la entrada de calcio, se produce la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana liberando el neurotransmisor en la hendidura sináptica. La fusión de las vesículas sinápticas se restringe a una zona determinada del terminal presináptico, la zona activa, donde se concentra un complejo proteico involucrado en el anclaje y maduración de las vesículas sinápticas para la exocitosis y en el reclutamiento de VGCC (Südhof, 2012). La zona activa contribuye además a la localización precisa de los terminales prey postsinápticos enfrentados unos a otros mediante la interacción de moléculas de adhesión trans-sináptica (Südhof, 2012). Alrededor de la zona activa se encuentra una zona perisináptica donde tiene lugar la endocitosis de las vesículas sinápticas (Brodin y Shupliakov, 2006). A nivel funcional, las vesículas sinápticas pueden ser diferenciadas en tres grandes grupos: el contingente de vesículas de liberación rápida (RRP, readily releasable pool), el contingente de reserva y el de reposo (Südhof, 2000). El RRP es el contingente de vesículas importante para la liberación rápida de neurotransmisores y comprende de 5 a 9 vesículas sinápticas medidas por FM1-43 en sinapsis de neuronas de hipocampo en cultivo (Murthy y Stevens, 1999). Sin embargo, este contingente constituye sólo una pequeña fracción del conjunto total de vesículas. Tras la liberación del RRP tiene lugar el reclutamiento y la exocitosis de las vesículas del contingente de reserva que presentan una menor probabilidad de liberación que el RRP. El conjunto del RRP y el contingente de reserva constituyen el contingente de reciclaje total que contiene en torno a 21-25 vesículas en cultivo de neuronas del hipocampo (Murthy y Stevens, 1999). El contingente de reciclaje total representa un porcentaje del total de vesículas sinápticas, que en neuronas de hipocampo es de alrededor de 200 vesículas. Por tanto, la mayoría de las vesículas en las sinapsis se encuentran en un estado inactivo y constituyen el contingente de reposo. Una vez liberado, el neurotransmisor se une a receptores específicos en el terminal postsináptico activando la entrada de iones, produciéndose de esta forma la propagación del impulso nervioso. INTRODUCCIÓN 22 Durante el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), y una vez completado el proceso de guía axonal, los axones contactan y forman sinapsis con las dendritas en las células diana mediante varias estrategias celulares (Shen y Scheiffele, 2010). El contacto inicial entre las neuronas prey postsinápticas dispara la formación y posterior maduración de las sinapsis en los sitios de contacto. En los últimos años, el trabajo de varios grupos de investigación ha llevado a la caracterización de la secuencia de eventos que se producen durante la formación de sinapsis (Waites et al., 2005). En los eventos iniciales de la sinaptogénesis, la asociación de moléculas de adhesión trans-sináptica genera sitios de nucleación en las membranas prey postsinápticas, donde se insertan complejos multiproteicos que llevan al ensamblaje de los terminales prey postsinápticos, respectivamente. Se ha descrito que la polimerización de actina presináptica y la incorporación en la membrana de vesículas que contienen componentes pre-ensamblados de la zona activa ocurren durante una etapa temprana en la formación del terminal presináptico (Zhang y Benson, 2001; Maas et al., 2012). La polimerización del citoesqueleto de actina podría formar un sitio de anclaje para el reclutamiento posterior de las vesículas sinápticas (Colicos et al., 2001). El ensamblaje del terminal presináptico precede al ensamblaje del terminal postsináptico, que probablemente se forme mediante la incorporación gradual de sus componentes (Bresler et al., 2004). A pesar de que se han identificado muchos de los componentes que aparecen en las sinapsis, se desconocen en detalle los mecanismos moleculares que llevan al ensamblaje de las sinapsis una vez que se ha establecido el contacto inicial y como éstos se regulan por actividad sináptica. La oposición de las membranas sinápticas y la estabilidad de las estructuras sinápticas reflejan la presencia de mecanismos de adhesión trans-sinápticos. Existen distintos tipos de moléculas de adhesión homofílicas que participan en la formación del circuito sináptico, e incluyen a las cadherinas y a la superfamilia de proteínas con dominios inmunoglobulinas. Por otra parte, se han identificado diversos sistemas de adhesión heterofílicos que intervienen en los eventos iniciales de la formación de las sinapsis (Shen y Scheiffele, 2010). Los sistemas de adhesión heterofílicos pueden conducir al ensamblaje de terminales prey postsinápticos al ensamblar complejos asimétricos de proteínas a ambos lados de las sinapsis. Entre estos destacan los sistemas de adhesión heterofílicos mediados por EfrinaB y sus receptores EphB, NetrinasG y NGLs y el sistema de neurexinas y neuroliguinas. Las neurexinas están codificadas por tres genes en humanos y en ratón (NRXN1, 2 y 3), con dos promotores alternativos que dan lugar a las isoformas largas (α- INTRODUCCIÓN 23 neurexinas) o las isoformas cortas (β-neurexinas) (Missler et al., 1998; Ushkaryov et al., 1992). Las α-neurexinas presentan una región extracelular conformada por tres dominios similares al factor de crecimiento epidermal (EGF) flanqueados cada uno por dos dominios homólogos a laminina G (LNG), una región rica en serinas y treoninas donde se produce la O-glicosilación, una región corta que permite la inserción transmembrana, y una región intracelular que contiene un sitio de reconocimiento de motivos PDZ. Las β-neurexinas son formas cortas de α-neurexinas que contienen el último dominio LNG de la región extracelular, la región transmembrana y la región intracelular (Figura 1). Además, el dominio extracelular de las neurexinas contiene 5 sitios de splicing alternativo, siendo dos de ellos (splicing 4 y 5) comunes a αy βneurexinas. Debido a la presencia de varios genes con promotores separados y al uso extensivo de splicing alternativo se pueden generar más de tres mil isoformas diferentes de neurexinas (Ullrich et al., 1995; Tabuchi y Südhof, 2002). Sin embargo, los segmentos citoplásmico y transmembrana de las neurexinas son comunes a todas las isoformas.  Figura 1. Estructura y splicing alternativo de las neurexinas. Las α-neurexinas están compuestas de una secuencia N-terminal conteniendo un péptido señal (SP), seis dominios homólogos a laminina G (LNG) que flanquean a tres dominios similares al factor de crecimiento epidermal (EGF), seguido de una región de O-glicosilación (O-Glyc), una región transmembrana (TM) y una corta región aminoacídica intracelular que contiene un sitio de interacción a motivos PDZ en los últimos tres residuos (no mostrado). Las β-neurexinas contienen el último dominio LNG precedido de una secuencia específica de βneurexinas (βN) y un péptido señal diferente al de α-neurexinas. Las puntas de flecha indican la localización de splicing (Sp) alternativo presentes en α y β-neurexinas.  Se ha identificado una función de las neurexinas en el terminal presináptico. Las neurexinas se describieron originalmente por el grupo del Dr. Thomas Südhof como receptores axonales para α-latrotoxina, una toxina producida por la araña viuda negra que induce la fusión masiva de las vesículas sinápticas en el terminal presináptico (Ushkaryov et al., 1992; Sugita et al., 1999). Mediante abordajes bioquímicos, el INTRODUCCIÓN 24 mismo grupo identificó a las neuroliguinas como moléculas de adhesión de unión a neurexinas (Ichtchenko et al., 1995; Ichtchenko et al., 1996). Las neurexinas y neuroliguinas median adhesión heterofílica dependiente de Ca2+ como se demostró en ensayos de agregación in vitro (Nguyen y Südhof, 1997). Estos resultados sugirieron una función de neurexinas y neuroliguinas en las sinapsis. Hallazgos posteriores del grupo de Dr. Peter Scheiffele mostraron una capacidad sinaptogénica desde el terminal postsináptico de neuroliguinas, que dependía de la interacción trans-sináptica con neurexinas axonales (Scheiffele et al., 2000; Dean et al., 2003). Estos resultados llevaron a identificar por primera vez un sistema de adhesión trans-sináptico que regula la formación/establecimiento de las sinapsis. Trabajos posteriores de varios laboratorios han identificado otros ligandos postsinápticos de neurexinas con capacidad sinaptogénica, indicando que en las neurexinas convergen rutas de señalización importantes para la diferenciación sináptica. Los aspectos más importantes de estos sistemas de adhesión mediados por neurexinas se resumen a continuación. 1.2 SISTEMAS DE ADHESIÓN SINÁPTICOS MEDIADOS POR NEUREXINAS Las neurexinas presinápticas se unen a diversos ligandos postsinápticos como neuroliguinas, LRRTMs y Cbln1/GluR2, que regulan la formación de sinapsis a través del establecimiento de sistemas de adhesión con isoformas de splicing de neurexinas. 1.2.1 Neuroliguinas Las neuroliguinas son una familia de proteínas de adhesión celular presentes en el terminal postsináptico. Hay cinco genes de neuroliguinas en humanos (NLGN1, 2, 3, 4X y 4Y) y cuatro en roedores (NLGN1-4X), con una localización diferencial en las sinapsis. Neuroliguina-1 se localiza en terminales postsinápticos de sinapsis glutamatérgicas, mientras que neuroliguina-2 se localiza en terminales postsinápticos GABAérgicos in vivo (Song et al., 1999; Varoqueaux et al., 2004). La localización diferencial de neuroliguinas en el SNC está asociada a su capacidad sinaptogénica en cultivo. La sobreexpresión de neroliguina-1 en cultivos de neuronas induce preferentemente sinapsis gutamatérgicas, mientras que la sobreexpresión de neuroliguina-2 induce la formación de sinapsis GABAérgicas (Chih et al., 2005; Chih et al., 2006). Las neuroliguinas presentan en su región extracelular un dominio colinesterasa catalíticamente inactivo. Un dominio similar se encuentra en otras proteínas de adhesión neuronal (Scholl y Scheiffele, 2003). Este dominio es funcionalmente importante pues a través de él las neuroliguinas median la adhesión INTRODUCCIÓN 25 con neurexinas durante la formación de sinapsis (Dean et al., 2003). En el dominio colinesterasa se ubica un sitio de splicing alternativo (A) común a todas las neuroliguinas, aunque neuroliguina-1 presenta un sitio splicing alternativo adicional (B) (Ichtchenko et al., 1996; Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). Tras el dominio colinesterasa existe una región de O-glicosilación justo antes de la región transmembrana, que es seguida por una región intracelular con un dominio de reconocimiento PDZ (Figura 2). Figura 2. Estructura de las neuroliguinas. Las neuroliguinas están compuestas de una secuencia Nterminal que contiene un péptido señal (SP), seguido de un dominio colinesterasa sin actividad catalítica que contiene dos splicing alternativo (A y B), una secuencia de dimerización (SD) y un sitio de Oglicosilación (O-Gly). A este dominio le sigue una región transmembrana (TM) y una secuencia aminoacídica intracelular corta que contiene un motivo de reconocimiento PDZ (no mostrado). La interacción entre neurexinas y neuroliguinas está regulada por splicing alternativo. La inserción de los 8 aminoácidos que forman el splicing B en neuroliguina1 inhibe la interacción con α-neurexinas, restringiendo la interacción a isoformas de βneurexinas que carecen del splicing alternativo 4. Es decir, isoformas de neuroliguina1 (+B) se asocian a isoformas de β-neurexinas (-Sp4). Sin embargo, isoformas de neuroliguina que carecen del splicing B, como neuroliguina-2, se unen tanto a αcomo a β-neurexinas independientemente de la presencia de Sp4 (Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). En proteínas de adhesión, la glicosilación es un factor fundamental que regula la interacción entre proteínas. Se ha demostrado que la N-glicosilación que ocurre en el residuo Asp 303 localizado en el splicing B de neuroliguina-1 regula la interacción selectiva con β-neurexinas (-Sp4) (Comoletti et al., 2003; Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). Estos datos sugieren la existencia de un código transináptico entre isoformas de neurexinas y neuroliguinas para el establecimiento de las sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas (Figura 3). Sin embargo, este modelo es puramente teórico debido a que no se conoce el repertorio de isoformas de neurexinas en tipos específicos de neuronas. INTRODUCCIÓN 32 neurexinas in vivo. Estos sistemas modelo proporcionan un método alternativo para interpretar las observaciones realizadas en las sinapsis en vertebrados. En Drosophila, α-neurexina-1 se localiza en neuronas del SNC y principalmente en las zonas activas de los terminales presinápticos glutamatérgicos de las sinapsis neuromuscular (Li et al., 2007; Zeng et al., 2007; Sun et al., 2009). Mutantes nulos de α-neurexina-1 en Drosophila presentaron una disminución en el número de botones sinápticos y anomalías en la distribución de vesículas sinápticas, de proteínas de la zona activa y de proteínas de la densidad postsináptica (Li et al., 2007; Chen et al., 2010; Owald et al., 2012). Además, el análisis electrofisiológico en las uniones neuromusculares de estos mutantes presentó una disminución en la transmisión sináptica evocada correlacionada con alteraciones en la estructura sináptica (Li et al., 2007; Chen et al., 2010). Por otra parte, el doble mutante heterocigoto en neurexina y CAKI/CMG, homólogo de la proteína de mamífero CASK, mostró una disminución mayor en la liberación en vesículas sinápticas medidas con marcadores FM, que la observada por los heterocigotos simples en neurexina o en CAKI/CMG, sugiriendo que la interacción de neurexinas y CAKI/CMG juega un papel importante en la liberación de vesículas sinápticas (Sun et al., 2009). En conjunto, estos datos indican que las neurexinas se requieren para la organización y función de los terminales presinápticos. En Caenorhabditis elegans, α-neurexina-1 se expresa exclusivamente casi en la totalidad de todas las células del sistema nervioso y se localiza preferentemente en los terminales presinápticos (Haklai-Topper et al., 2011). Mutantes en α-neurexinas-1 presentan alteraciones del comportamiento, incluyendo el ciclo de defecación, la tasa de movimiento, la capacidad de exploración, la respuesta mecanosensorial y la evitación del estrés osmótico (Tesis doctoral Fernando Calahorro Núñez, 2011; Calahorro et al., 2009). Estos resultados sugieren que la función de neurexinas se requiere para la respuesta adecuada a diversos estímulos en Caenorhabditis elegans. 1.6 NEUREXINAS Y NEUROLIGUINAS EN ENFERMEDADES MENTALES La función normal del circuito sináptico se encuentra asociada a procesos de memoria y aprendizaje y defectos en la función sináptica son responsables de algunas patologías del SNC, como epilepsia, autismo y retraso mental. En los últimos años se han identificado mutaciones en genes de neurexinas que afectan a las isoformas α y β en pacientes con autismo (Feng et al., 2006; Szatmari et al., 2007; Gauthier et al., 2011; Camacho et al., 2012). Además, se ha descrito que deleciones en NRXN1 pueden conferir riesgo a padecer otras enfermedades mentales, INTRODUCCIÓN 33 como la esquizofrenia, sugiriendo cierto solapamiento en las bases moleculares de ambos trastornos (Kirov et al., 2008). La sobreexpresión de mutaciones puntuales de β-neurexinas-1 asociadas con autismo en cultivos de neuronas de hipocampo mostró una reducción de los niveles sinápticos de β-neurexina-1 (Camacho et al., 2012), sugiriendo que defectos en la función sináptica de neurexinas pueden contribuir al desarrollo de enfermedades mentales (Südhof, 2008). En paralelo a estos resultados, se han identificado mutaciones en los genes de NLGN3 y NLGN4 asociadas con autismo con o sin retraso mental (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004). En algunos casos se ha descrito que las mutaciones asociadas con autismo afectan la capacidad sinaptogénica de neuroliguina-3 y 4 (Chih et al., 2004; Zhang et al., 2009b). Por otra parte, los ratones KO en genes de NLGN muestran un fenotipo que podría estar relacionado con el descrito en el trastorno autista. En este sentido, los ratones KO en el gen NLGN3 presentan patrones de comportamiento con pérdida de interés hacia la novedad, así como una pérdida en la vocalización y emisión de sonidos empleados en su comunicación (Radyushkin et al., 2009). Los ratones KO en el gen NLGN4 muestran una disminución en las interacciones sociales y una reducción en la comunicación, con respecto a ratones silvestres (Jamain et al., 2008). Las mutaciones asociadas a autismo en los genes de neurexinas y neuroliguinas se han identificado en un bajo porcentaje de los pacientes estudiados, pero su identificación podría explicar, al menos en parte, algunos de los problemas asociados al autismo y revelar mecanismos asociados a enfermedad mental. Por otra parte, estos resultados apoyan que fallos en la señalización del sistema de neurexinas y neuroliguinas podrían estar implicados en los defectos cognitivos asociados a desordenes neurológicos del SNC en un rango amplio de enfermedades. 1.7 LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la pérdida progresiva de memoria y funciones cognitivas en los pacientes. 1.7.1 Antecedentes La AD se describió en 1907 por el neuropatólogo y psiquiatra alemán Alois Alzheimer en el artículo titulado “Sobre una enfermedad específica de la corteza del cerebro” (Alzheimer et al., 1907). El diagnóstico se realizó en una paciente de 51 años INTRODUCCIÓN 34 de edad (Auguste Deter) que murió tras sufrir durante cinco años una pérdida progresiva de la memoria, la orientación, el habla y otras funciones relacionadas con la personalidad y capacidad visual-espacial. El análisis anatomopatológico de su cerebro reveló una atrofia cerebral y la presencia de depósitos extracelulares (placas seniles) y agregados neurofibrilares (ovillos), localizados principalmente en la corteza cerebral y en el hipocampo. En 1910, el psiquiatra alemán Emil Kraepelin dio el nombre de Enfermedad de Alzheimer a esta nueva entidad clínica y patológica, denominación empleada hasta nuestros días. A finales de la década de 1960 se describió la hipótesis colinérgica de la enfermedad de Alzheimer, que consideraba que la mayoría de los síntomas de la demencia eran producidos por una pérdida de grandes cantidades de neuronas colinérgicas del núcleo basal de Meynert que proyectan a la neocorteza (Whitehouse et al., 1981; Arendt et al., 1985). Esta hipótesis no ha tenido apoyo, debido a que los medicamentos que tratan una deficiencia colinérgica no tienen efectividad en la prevención o cura del Alzhéimer. Además, se identificaron en cerebros de pacientes con AD deficiencias en otros sistemas de neurotransmisión, poniendo de manifiesto que esta enfermedad no implica la degeneración de una única clase de neuronas. A partir de entonces los estudios se centraron en el análisis de los signos patológicos más característicos de la AD, como son, las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares, descritos por primera vez por Alois Alzheimer (Kidd, 1964; Terry y Pena, 1965), con el objetivo de poder identificar los mecanismos implicados en la disfunción sináptica y en la degeneración de neuronas que presentan los enfermos. En 1990 se propusieron dos nuevas hipótesis que podrían explicar el desarrollo de la AD: - Hipótesis de la cascada del amiloide, que sostiene que el proceso neurodegenerativo observado en cerebros de pacientes de AD podría ser explicado como una serie de eventos a partir del procesamiento anormal de la proteína precursora del β-amiloide (APP), cuya consecuencia es la producción, agregación, deposición y toxicidad del péptido β-amiloide (Aβ) derivado del APP (Hardy y Higgins, 1992). - Hipótesis de la degeneración del citoesqueleto neuronal, que propone que cambios en el citoesqueleto, en los que participa la forma hiperfosforilada de la proteína tau, son los responsables de la enfermedad (Braak H y Braak E, 1991). INTRODUCCIÓN 35 1.7.2 Marcadores patológicos de la Enfermedad de Alzheimer En el cerebro de enfermos de Alzheimer se observan dos anomalías características: una abundancia de depósitos amiloides extracelulares, denominados placas Aβ y depósitos de proteínas fibrilares en el interior de las neuronas, conocidos como ovillos neurofibrilares. - Placas β-amiloide (Aβ) Las placas de β-amiloide están constituidas por depósitos extracelulares insolubles formados por varios compuestos, siendo el más abundante el péptido β amiloide (Glenner y Wong, 1984; Masters et al., 1985). El péptido Aβ tiene una longitud variable, entre 39 y 43 aminoácidos, y es un producto natural del metabolismo del APP por acción de peptidasas llamadas secretasas (De Strooper, 2010). Las isoformas más comunes son Aβ40 y Aβ42. Debido a su mayor agregación e insolubilidad el Aβ42 es más abundante en las placas que el Aβ40. Estas placas actúan como centros de degeneración neuronal en las estructuras intracerebrales involucradas en la memoria y el control emocional, la amígdala, el hipocampo y los núcleos basales colinérgicos del cerebro anterior (Van Gassen y Annaert, 2003). Por otro lado, la pérdida de sinapsis está mejor correlacionada con el declive cognitivo de la AD (Dekosky y Scheff, 1990; Terry et al., 1991; Sze et al., 1997; Masliah et al., 2001). La correlación existente entre las placas Aβ y los problemas cognitivos de la AD (Blessed et al., 1968), sugiere que dichas placas podrían alterar la integridad sináptica (Cummings y Cotman, 1995). - Ovillos neurofibrilares Son agregaciones intracelulares que se generan cuando la proteína tau se hiperfosforila, se disocia de los microtúbulos y forma, espontáneamente por polimerización, filamentos helicoidales apareados que más tarde ocasionarán los ovillos neurofibrilares en el interior de neuronas distróficas (Goedert et al., 1992; Avila et al., 2004). Los ovillos neurofibrilares que se forman en el interior de las células nerviosas de la corteza cerebral y del hipocampo y de las dendritas apicales y distales, se relacionan con la demencia. Como consecuencia, las células nerviosas degeneran y mueren debido a esas lesiones neurofibrilares. Los ovillos neurobrilares aparecen, a veces, asociados a las placas amiloides. INTRODUCCIÓN 36 1.7.3 Tipos de Enfermedad de Alzheimer - Alzheimer Esporádico Es una enfermedad de inicio tardío, aparece después de los 65 años de edad, en su mayor parte esporádico sin riesgo genético aparente y representa entre el 90 y 95% del total de los casos de AD. La aparición de AD esporádico puede estar determinado por factores que predisponen en mayor o menor grado a la enfermedad. - Alzheimer familiar Es una enfermedad de inicio temprano, los síntomas se inician entre los 30 y 60 años de edad, y se debe a una transmisión de carácter autosómico dominante. Las formas familiares de la enfermedad de Alzheimer (FAD) están asociadas con mutaciones en los siguientes genes: APP, en el cromosoma 21; PS1, en el cromosoma 14 y PS2, en el cromosoma 1 (Shastry, 1998). Aunque las mutaciones en estos genes representan menos del 5% del número total de casos de AD (Rocchi et al., 2003), la identificación de las bases genéticas de FAD ha supuesto un avance importante en el estudio de las mecanismos fisiopatológicos asociados con AD. 1.7.4 Procesamiento de la proteína precursora del péptido β-amiloide (APP) La proteína precursora del péptido Aβ o APP es una glicoproteína integral de membrana de tipo I, que contiene 695-770 aminoácidos. La síntesis del APP se realiza de manera ubicua en el cerebro y no parece guardar una correlación específica con la distribución de las lesiones cerebrales (Kang et al., 1987). Por splicing alternativo se generan diferentes isoformas de APP, siendo las más abundantes las que contienen 695, 751 y 770 aminoácidos (Selkoe, 2001). La proteína APP se procesa de forma secuencial por tres proteasas llamadas α-, βy -secretasas. Estas tres actividades enzimáticas distinguen dos vías principales para su procesamiento. Una de estas vía es la responsable de la formación de los depósitos amiloides característicos en los cerebros de los individuos afectados por AD. - Vía no Amiloidogénica: Esta vía comienza con la acción de la α-secretasa, la cual realiza un corte en la parte extracelular de APP a nivel del aminoácido 687, liberándose el fragmento Nterminal (NTF, N-terminal fragment) soluble (αAPP) al espacio extracelular, con la consecuente generación del fragmento C-terminal (CTF, C-terminal fragment) de 83 aminoácidos (APP-C83) asociado a la membrana. El segundo evento proteolítico es INTRODUCCIÓN 37 llevado a cabo por una actividad -secretasa, la cual procesa el CTF dando lugar a un pequeño péptido de 23 aminoácidos (P3) que se libera al espacio extracelular y a un fragmento citosólico de 57-59 aminoácidos (AICD, Intracellular Domain) que se libera al citosol celular (Figura 5). Esta vía se conoce como no amiloidogénica, porque no produce péptidos Aβ, ya que el sitio de hidrólisis de α-secretasa en APP se encuentra en la región del péptido β-amiloide, impidiendo con ello su formación (Checler, 1995; Ling et al., 2003). Se han identificado varias proteínas con actividad α-secretasa, todas ellas pertenecientes a la familia de las desintegrinas y metaloproteasas (ADAM, a disintegrin and metalloproteinase-family). Se han propuesto tres miembros de esta familia como los responsables de la actividad α-secretasa que procesa APP: ADAM 17 (también denominada TACE, enzima convertidora de TNF-α), ADAM 10 y ADAM 9 (Maccioni et al., 2001; Sisodia y George-Hyslop, 2002; Van Gassen y Annaert, 2003). - Vía Amiloidogénica: En esta vía, el corte del ectodominio de APP se realiza por la acción de la βsecretasa a nivel del aminoácido 671, generándose de esta forma un NTF soluble (βAPP) más corto que el producido por la acción de las α-secretasas, y un CTF de 99 aminoácidos asociado a membrana (APP-C99), cuya secuencia comienza en el residuo 1 de la región Aβ. Seguidamente, el CTF se procesa por la actividad - secretasa, liberándose al medio un péptido de 40 o 42 aminoácidos, dependiendo del sitio de corte de la enzima (Figura 5) (Takami et al., 2009). La actividad β-secretasa se atribuye a la proteína conocida como BACE 1 (β-site APP cleaving enzime 1), que es la principal y única proteína con esta actividad en el cerebro (Vassar et al., 1999; Vassar et al., 2009). Figura 5. Procesamiento de la proteína APP y generación del péptido Aβ. Representación esquemática de las vías amiloidogénica y no amiloidogénica. El Aβ sólo es generado cuando el APP es INTRODUCCIÓN 38 sustrato de la β-secretasa y a continuación de la -secretasa. Si el APP es procesado por la α-secretasa no se genera Aβ, ya que corta a nivel de su secuencia. Se han descrito varias mutaciones en el gen del APP que representan el 5% de los casos de FAD (Rocchi et al., 2003). Una lista actualizada de las mutaciones en APP se puede encontrar en www.uia.ac.be/ADMutations. Algunas de las mutaciones en APP que causan FAD alteran el metabolismo de APP, ya que se localizan cerca de los sitios de escisión de α-, βy -secretasas, con la consecuente elevación del péptido Aβ42 que conlleva a las agregaciones neurotóxicas (Suzuki et al., 1994; De Jonghe et al., 2001, Nilsberth et al., 2001) 1.8 PRESENILINAS Las Presenilinas (PS) 1 y 2 (PS1 y PS2) son proteínas transmembrana con actividad proteasa que contienen 467 y 448 aminoácidos, respectivamente. Presentan un alto grado de homología, especialmente, en los dominios transmembrana. Las PS se expresan de manera ubicua incluyendo el SNC. Respecto a la localización subcelular, diversos estudios han demostrado que PS se localizan en membranas de endosomas, en el sistema retículo endoplásmico-Golgi, en compartimentos somatodendríticos y en la membrana plasmática (Suh y Checler, 2002; Kaether et al., 2002). Las PS se sintetizan como polipéptidos de 50 kDa con 9 dominios transmembrana (Laudon et al., 2005; Spasic et al., 2006) y sufren un procesamiento endoproteolítico probablemente por autocatálisis dando lugar a heterodímeros estables, que comprenden el NTF de 27-28 kDa y el CTF de 17-18 kDa (Thinakaran et al., 1996; Wolfe et al., 1999; Fukumori et al., 2010). El procesamiento endoproteolítico de PS está regulado por factores limitantes celulares, de manera que un exceso de holoproteína no resulta en endoproteolisis y se degrada por el proteosoma (Thinakaran et al., 1996; Kim et al., 1997; Podlisny et al., 1997). Las PS forman la subunidad catalítica del complejo -secretasa encargado del procesamiento de proteínas transmembranas tipo I. Dicho complejo contiene además las proteínas: nicastrina, Aph1 y Pen2 (De Strooper, 2003; Kimberly et al., 2003) (Figura 6). Para formar el complejo -secretasa, la holoproteína de PS se incorpora al complejo dimérico formado por Aph1 y nicastrina. Posteriormente, se ensambla Pen2 y tiene lugar la endoproteolisis de PS para formar el complejo activo -secretasa INTRODUCCIÓN 39 (Takasugi et al., 2003; Verdile et al., 2007). La actividad proteasa de PS está mediada por dos residuos de aspartato dentro de los dominios transmembrana 6 y 7 (D257 y D385, respectivamente). Ambos residuos aspárticos son esenciales para la endoproteolisis de PS y para la actividad -secretasa ya que forman el centro catalítico del complejo -secretasa, haciendo que éste sea funcional (Wolfe et al., 1999). Las PS se distribuyen en múltiples compartimentos subcelulares. No se conoce con exactitud donde tiene lugar la actividad proteolítica de los diversos sustratos de PS, pero hay evidencias que sugieren que la membrana plasmática y los endosomas son los sitios principales de proteólisis de APP y otros sustratos (Kaether et al., 2006).  Figura 6. Modelo topológico del complejo -secretasa. Cuatro proteínas transmembrana se requieren para la función -secretasa: presenilina, nicastrina, Aph-1 y Pen-2. Presenilina contiene 10 dominios hidrofóbicos, de los cuales 9 son transmembrana. Los residuos catalíticos, D257 y D385 en los dominios transmembrana 6 y 7, respectivamente, se indican con círculos amarillos. PS sufre endoproteolisis dentro del dominio hidrofóbico situado en el bucle citosólico grande (flecha roja) para dar el fragmento aminoterminal (NTF) y el carboxi-terminal (CTF). Figura modificada de Lundkvist y Naslund, 2006.  Las mutaciones en los genes que codifican las PS engloban aproximadamente el 80% de los casos de FAD (Rocchi et al., 2003). Las mutaciones en PS1 son las responsables de la mayoría de los casos de FAD y causan disfunción sináptica, pérdida de memoria y neurodegeneración. Estas mutaciones, que se distribuyen por toda la molécula, se localizan principalmente en los dominios transmembranas altamente conservados y en los residuos hidrofóbicos del NTF o del dominio hidrofóbico situado en el citosol, entre los dominios transmembranas 6 y 7 (Tandon y Fraser, 2002). Actualmente se conocen unas 185 mutaciones, que se pueden encontrar en www.uia.ac.be/ADMutations (Figura 7). Por otro parte, la mayoría de las mutaciones en PS2 también se localizan en dominios transmembranas conservados INTRODUCCIÓN 40 entre las dos proteínas y actualmente hay 13 mutaciones asociadas con FAD encontradas en www.uia.ac.be/ADMutations. El mecanismo mediante el cuál las mutaciones en PS asociadas con FAD promueven la degeneración neuronal no está del todo esclarecido. Sin embargo, estudios in vitro e in vivo sugieren que actúan promoviendo la deposición del péptido Aβ, particularmente la forma Aβ42, y la formación de placas (Duff et al., 1996; Xia et al., 1997; Wang et al., 2006).  Figura 7. Mutaciones descritas en PS1. En la imagen se muestran algunas de las mutaciones encontradas en PS1 presentes en casos de Alzheimer familiar. Adaptado de Tandon y Fraser, 2002.  1.8.1 Funciones biológicas de presenilinas Las PS proporcionan el centro activo del complejo -secretasa y se descubrieron como consecuencia de sus funciones en la generación del péptido Aβ asociado a AD. Desde su descubrimiento, se han encontrado nuevos sustratos de PS y proteínas con las que interaccionan, sugiriendo una diversidad de funciones para PS durante el desarrollo y la vida adulta, algunas de las cuales podrían contribuir con la progresión de la AD. Algunas de estas funciones dependen de la actividad -secretasa y otras son independientes de su papel como proteasa (Parks y Curtis et al., 2007; De Strooper, 2012). INTRODUCCIÓN 41 1.8.1.1 Funciones de presenilinas dependientes de actividad -secretasa en adhesión celular y señalización Un número importante de los sustratos del complejo -secretasa son moléculas de adhesión o de señalización celular, como por ejemplo: nectina 1α, la subunidad β2 del canal de sodio voltaje dependiente (SCNB2), -protocadherinas, N-cadherinas, efrinas y receptores de tirosina quinasa eph, sugiriendo que la actividad -secretasa regula adhesión celular y función sináptica. Nectina 1 se localiza en uniones adherentes neuronales y está involucrada en la formación de las sinapsis (Kim et al., 2002). SCNB2 funciona como subunidad auxiliar del canal de sodio voltaje dependiente y como molécula de adhesión celular. La inhibición del procesamiento de nectina 1α y SCNB2 por actividad -secretasa bloquea la adhesión celular e induce migración, sugiriendo que el procesamiento mediado por -secretasa promueve la adhesión celular (Kim et al., 2002; Kim et al 2005). Las -protocadherinas son moléculas de la superfamilia de las cadherinas que tienen una función sináptica. Existen diferentes isoformas de -protocadherinas originadas por splicing alternativo, pero todas tienen en común el ICD, el cual se libera tras el procesamiento mediado por la actividad -secretasa y se trasloca al núcleo, regulando la transcripción génica (Haas et al., 2005). Alteración en la actividad - secretasa induce la pérdida de función de -protocadherinas y, como consecuencia, tiene lugar una degeneración neuronal parecida a la encontrada en pacientes con AD con la función de PS reducida (Hambsch et al., 2005; Weiner et al., 2005). Las cadherinas median adhesión celular homofílica dependiente de calcio y están implicadas en plasticidad y función sinápticas (Rubio et al., 2005). Se ha descrito que PS facilitan la maduración y transporte de N-cadherina del RE a la membrana plasmática. De esta forma, cuando la actividad de PS está bloqueada se reducen los niveles de N-cadherina en los contactos y adhesiones celulares (Uemura et al., 2003). Las presenilinas se concentran en los sitios de contacto sináptico o entre células epiteliales, asociándose por el lado intracelular a las cateninas, β-catenina y - catenina, promoviendo la estabilización del complejo cadherina-catenina y su asociación con el citoesqueleto de actina (Parisiadou et al., 2004). La escisión de Ecadherinas por -secretasa ocurre después del procesamiento del ectodominio inducido por calcio, produciéndose la desorganización del complejo cadherinacatenina con la consecuente pérdida de adhesión celular (Parisiadou et al., 2004;   OBJETIVOS 49 Los objetivos propuestos en esta Tesis han sido los siguientes: 1. Estudio del procesamiento proteolítico de neurexinas por PS/-secretasa in vitro e in vivo. 2. Papel de la activación sináptica en el procesamiento de neurexinas en cultivos de neuronas de hipocampo. 3. Estudio del efecto estructural y funcional del procesamiento sináptico de neurexinas por PS: reclutamiento de ligandos sinápticos y análisis de la liberación vesicular en terminales mediados por neurexinas en neuronas defectivas en PS. 4. Análisis del procesamiento proteolítico de neurexinas por mutantes de PS1 asociados con formas familiares de enfermedad de Alzheimer.               3 MATERIALES Y MÉTODOS        MATERIALES Y MÉTODOS 53 3.1 CULTIVOS CELULARES 3.1.1 Recubrimiento de placas de cultivo con poli-lisinas La poli-D-lisina y poli-L-lisina se usan para permitir la adhesión de neuronas de hipocampo de embriones de rata y de ratón en placas de cultivo, respectivamente. A partir de una solución de 20 mg/ml de poli-D/L-lisina (Sigma) en ácido bórico (75 mM, pH 8,2) se diluye a una concentración de trabajo de 0,5 mg/ml con el mismo tampón. A continuación se cubren las placas de cultivo con el volumen adecuado y se dejan toda una noche a 37ºC. Se lavan 3 veces con H2O Milli-Q (volumen suficiente para que cubra toda la superficie de los pocillos), se aspira el agua y se dejan secar 30 minutos dentro de una campana de flujo para mantener la esterilidad. Una vez secas, se irradian con luz UV durante 10-15 minutos. En determinados casos las células se siembran sobre cubreobjetos de borosilicato (Hirschmann Laborgeräte) de 12 ó 15 mm de diámetro pre-incubados con poli-D/L-lisina para realizar experimentos de inmunofluorescencia o registros de actividad sináptica, respectivamente. 3.1.2 Medios de cultivo, componentes y soluciones usadas A continuación se detalla la composición de los medios de cultivo empleados:  Medio DMEM-DB1. Medio de siembra de neuronas de rata: DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) (Hyclone), 44,4 mM de D-(+)- glucosa (Sigma), 2 mM glutamax-I (Invitrogen) y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml estreptomicina (Pen/Strep) (Gibco).  Medio Neurobasal-B27. Medio de crecimiento de neuronas de rata y ratón: Neurobasal (Invitrogen) suplementado con B27 (Invitrogen), 2 mM Glutamax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml estreptomicina (Pen/Strep).  Medio DMEM-DB1. Medio de siembra para neuronas de ratón: DMEM suplementado con 10% FBS, 2 mM Glutamax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml estreptomicina (Pen/Strep).  PBG: PBS (Invitrogen) conteniendo 0,6% de D-(+)-glucosa.  Medio de cultivo para células MEF: Medio DMEM suplementado con 10% FBS, 4 mM Glutamax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml estreptomicina (Pen/Strep). Tras el primer pase de células emplear el medio suplementado con 0,1 mg/ml G418. MATERIALES Y MÉTODOS 54  Medio de cultivo para células Hek 293T y COS: Medio DMEM suplementado con 10% FBS, 2 mM Glutamax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml estreptomicina (Pen/Strep). 3.1.3 Cultivos de neuronas de hipocampo 3.1.3.1 Cultivo de neuronas de hipocampo de rata Los cultivos de neuronas de hipocampo se generaron a partir de embriones de ratas Wistar procedentes del Centro de Producción y Experimentación Animal (CPEA) de la Universidad de Sevilla, situado en Espartinas (Sevilla). Las ratas y los embriones se trataron siguiendo las normas sobre el trato animal en experimentación establecidas por la Universidad de Sevilla. El esquema del cultivo se ilustra en la Figura 8. Ratas gestantes entre los días 18 y 19 de gestación se sacrificaron por inhalación de CO2 en una cámara sellada. El sacrificio se realiza rápidamente (tiempo medio aproximado 2 minutos) para disminuir los riesgos causados por envenenamiento de CO2 que pudieran reducir la viabilidad de las neuronas durante el cultivo. Tras el sacrificio, se extraen por cesárea ambas ramas del útero manteniendo los embriones en su interior y se colocan en una placa de Petri. Seguidamente, el útero se abre mediante una incisión longitudinal, se extraen los embriones y se colocan en una nueva placa de Petri, donde se decapitan. A continuación, se colocan las cabezas en otra placa de Petri para mantenerlos limpios de restos de sangre y líquido amniótico. Para la extracción de los cerebros, las cabezas decapitadas se mantienen sujetas con una pinza de puntas curvas y se insertan las puntas de una pinza de punta fina a través de los ojos siguiendo el eje anteroposterior, con una inclinación tal que evite dañar el cerebro. Con unas tijeras de pinza spring scissors se corta el cráneo por la línea medial, introduciendo una punta por la nuca, levantándola al cortar para no dañar el cerebro, hasta aproximadamente la altura de los ojos. Se separa con otra pinza la piel y cartílago cortados y con la ayuda de una paleta se extrae el cerebro y se coloca inmediatamente en una placa de Petri con PBG frío más antibióticos para contener la carga microbiana, manteniendo en hielo la placa con los cerebros. Una vez extraídos los cerebros de todos los embriones, se retiran las meninges de los cerebros y se extraen los hipocampos practicando incisiones a lo largo de la zona que bordea a cada hipocampo con la corteza cerebral y se colocan en una placa de Petri de 35 mm de diámetro con PBG más antibióticos, mantenida en hielo. Figu r gesta c disec c empl e punta curva s hipo c cent r min u se i n (con c con a y 2 5 min u mec á (Hir s Post e p ell e sus p pocil trata d incu b r a 8. Esquem a c ión. B) Emb c ión de hipo c e ado durante fina Moria # 5 s y paleta de e Una vez e c ampos en r ífuga de 1 u tos a 1.50 0 n cuban co n c entración f a gitación s u 5 0 µl de D u tos adicio n á nica de lo s s chmann L eriormente , e t de célul a p ensión cel u lo en plac a das con p o b ador a 37 a de un culti v riones. C-G) c ampos. H) M el cultivo. De 5 , pinza y tijer a e xtracción. El e xtraídos lo 2 o 3 part e 5 ml con 2 0 rpm elim i n 1,5 ml d f inal de trip s u ave. Segu Nasa (Ro c n ales a 37 ° s hipocam p L aborgerät e , la suspen s a s disgrega d u lar se cu e a s multipo c o li-D-lisina °C y 5% C v o de neuro n Decapitación M icroscopio i izquierda a d a de 14cm pa material pro c s hipocam p e s con una ml de PB G i nándose e d e PBG c o s ina 0,05% idamente, s c he) para d ° C en el ba p os aplican d e ) con l a s ión celula r d as se res nta en un illos Cellst a (65000 cél u C O2. Una v n as de hipoc a y extracción i nvertido Zei s d erecha y de a ra la cesárea , c ede de Fine S p os se eli m cuchilla. L o G frío sin a e l sobrenad o nteniendo ) durante 8 s e añaden 7 d etener la ño. A conti d o 5 embol a punta c r se centrif u uspende e n hemocitóm a r (Greiner ulas/1,13 c v ez que la s a mpo de rat a de cerebros s s Axio Obs e arriba abajo: , tijera de pin z S cience Tool s m ina el m e o s hipocam p a ntibióticos ante. A co n 30 µl de minutos e n 7 50 µl de s tripsinizaci ó n uación, s e adas con u c errada p a u ga durante n 1 ml de etro y se s Bio-One) d c m2). Los c s células s e MATERIA L a . A) Rata Wi s embrionarios e rverA1. I) Cámara de N z a spring scis s . e dio PBG y p os se col o y se centri n tinuación, tripsina 2 , n un baño d u ero de ca b ó n y se in e procede a na pipeta P a rcialment e 5 minutos DMEM-DB 1 iembran 6 5 d e 24 pocil u ltivos se m e han adhe r L ES Y MÉT O  s tar a los 18 d s para una p o Material de N eubauer, pin z s or; pinza de y se troce a o can en tub o i fugan dur a los hipoca ,5% (Invitr o d e agua a 3 b allo (Invitr o n cuba dura a la disgreg P asteur de e a la l a 1.000 rp m 1. Por últi m 5 000 célul a l los previa m m antienen rido al sub s O DOS 55 d ías de o sterior c irugía z as de p untas a n los o s de a nte 3 mpos o gen) 7ºC y o gen) n te 8 ación vidrio lama. m y el m o, la a s por m ente en el s trato MATERIALES Y MÉTODOS 56 (aproximadamente 2 horas) el medio de siembra DMEM-DB1 se sustituye por medio de crecimiento Neurobasal-B27. Durante el desarrollo in vitro del cultivo se forma una densa red neuronal. En la Figura 9 se muestra el aspecto del cultivo a lo largo de los días. Figura 9. Cultivos de neuronas. Se muestra el aspecto de neuronas de hipocampo de embriones de rata con 1 día de cultivo (A), 3 días de cultivo (B), 5 días de cultivo (C) y 14 días de cultivo (D). Las imágenes fueron tomadas en una lupa Olympus con objetivos de 20 aumentos (A), 10 aumentos (B) y 5 aumentos (C y D).  3.1.3.2 Cultivo de neuronas de hipocampo de ratón fPS1/fPS1 Los cultivos de neuronas de hipocampo se generaron a partir de embriones de ratón floxeados para el gen de PS1 (fPS1/fPS1) y knock-out (KO) de PS2. Los animales fPS1/fPS1 y KO de PS2 fueron cedidos por el Dr. Carlos A. Saura (Universidad Autónoma de Barcelona). Para este cultivo se empleó el mismo protocolo descrito para el cultivo de neuronas de hipocampo de rata, pero empleando los medios para cultivo de ratón y el recubrimiento de las placas de cultivo con poli-L-lisina, previamente mencionados. El genotipo de los animales se comprobó mediante PCR. 3.1.4 Líneas celulares 3.1.4.1 Líneas celulares Hek 293T y COS La línea celular humana de riñón embrionario Hek 293T es un buen modelo celular para sobre-expresar proteínas exógenas. Las células HEK 293T son una variante de la línea humana del epitelio renal 293 transformada con el gen E1A de adenovirus tipo 5, que expresa el antígeno T de SV40. Las células Hek 293T se obtuvieron de la ATCC (American Type Culture Collection). Las células COS derivan de una línea celular del mono verde africano (CV1) transformada con un virus SV40 defectivo. Ambas líneas celulares se crecen en frascos de cultivo (Thermo) con medio MATERIALES Y MÉTODOS 57 de crecimiento DMEM suplementado. El cultivo se mantiene en un incubador con un 5% de CO2 y a una temperatura de 37ºC. Cuando el cultivo alcanza aproximadamente un 80-90% de confluencia se procede a realizar el subcultivo que es necesario para mantener su capacidad mitótica. Para ello, se añade tripsina-EDTA (Invitrogen) en una cantidad suficiente para cubrir toda la monocapa de células, previo lavado con tampón salino PBS (Invitrogen) para eliminar los restos de medio y las células muertas en suspensión. A continuación, se incuba el cultivo 2-3 minutos a 37ºC observando al microscopio hasta que las células se despeguen. Una vez en suspensión se añaden 4 volúmenes de medio de crecimiento con suero. De la suspensión celular resultante se pasa un volumen de un décimo ó un quinto a un nuevo frasco de cultivo. 3.1.4.2 Fibroblastos de embriones murinos (MEF) Las células MEF (mouse embryonic fibroblasts) wild-type (WT) y knock-out (KO) para PS empleadas en este trabajo han sido amablemente cedidas por el Dr. Bart De Strooper (Katholieke Universiteit Leuven; Bélgica) (Herreman et al., 2000). Las células se mantienen en medio de crecimiento DMEM suplementado, dentro de un incubador a 37ºC y 5% C02, y se subcultivan a un décimo tres veces a la semana. 3.1.5 Descongelación-congelación de líneas celulares Los viales que contienen las líneas celulares se extraen del contenedor de N2 líquido y se descongelan rápidamente en un baño a 37ºC con agitación suave. A continuación, se coloca la suspensión celular en un tubo de centrífuga de fondo cónico y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 minutos. El pellet celular se separa por decantación del sobrenadante. Posteriormente, el pellet celular se resuspende en 5 ml de medio de cultivo y se vuelve a centrifugar de la misma forma. El precipitado celular resultante se resuspende en 1ml de medio de cultivo y se traspasa a un frasco de cultivo de 25 cm2 con 4 ml de medio de crecimiento atemperado. Para congelar las líneas celulares, el pellet celular obtenido de la tripsinización de una placa de cultivo de 75 cm2 confluente se resuspende en 2 ml de FBS con 10% de DMSO. Se distribuye un volumen de 1 ml de células por cada vial criogénico y se mantienen a -80ºC durante 24 horas para conseguir un proceso de congelación lento. Seguidamente se almacenan las células congeladas en N2 líquido. MATERIALES Y MÉTODOS 64 3.3.2 Transfección de células Hek 293T y células MEF Cultivos de células Hek 293T o de células MEF crecidos a 70-80% de confluencia se transfectan empleando Lipofectamina (Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las cantidades de plásmido a transfectar por cada pocillo de una placa de 6 pocillos son: 1,5 µg para las células Hek 293T y 5 µg para las células MEF. Para un pocillo de una placa de 24 pocillos la cantidad de plásmido a transfectar es de 0,5 µg o en el caso de co-transfecciones con una proteína fluorescente, 0,4 µg del plásmido más 0,2 µg del plásmido de la proteína fluorescente. La efectividad de transfección en células Hek 293T es de aproximadamente 60-75%, mientras que para células MEF ronda el 30%. 3.4 PRODUCCIÓN LENTIVIRAL Los vectores lentivirales permiten la integración del gen o genes exógenos en el genoma de las células que infectan, por ello tienen la ventaja de conseguir una expresión a largo plazo. La producción de lentivirus se realiza como se ha descrito previamente (Gascon et al., 2008). Las células Hek 293T se transfectan mediante el método de fosfato cálcico con los plásmidos necesarios para la construcción de las partículas virales. Estos plásmidos son: - pCAG-VSVg∆C: vector que codifica para la proteína de la cápsida del virus. La proteína vírica es del virus estomatitis vesicular (VSV), permitiendo la infección de una amplia variedad de tejidos y líneas celulares. La secuencia de la proteína VSV empleada carece del epítopo VSV para evitar problemas de reacción cruzada con anticuerpos anti VSV. - 8.9: vector que codifica para la maquinaria de retrotranscripción del virus (Gag/Pol). Gag es un gen que codifica para diferentes proteínas de la nucleocápsida y de la matriz y Pol es un gen que codifica para la transcriptasa inversa, para una proteasa y para la integrasa. - Vector lentiviral que codifica la secuencia de interés: este vector contiene la secuencia de DNA a transferir a la célula diana. En el caso de los vectores que contienen el promotor de sinapsina, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) se incorpora para aumentar la expresión del transgén. MATERIALES Y MÉTODOS 65 El día previo a la transfección se siembran placas de cultivo de 15 cm de diámetro con 12×106 células Hek 293T en medio de cultivo. Para la transfección, se mezclan los plásmidos de expresión y empaquetamiento con agua estéril y cloruro cálcico de la siguiente manera: 20 µg del vector lentiviral, 20 µg de 8.9, 10 µg de VSVg∆C, CaCl2 2,5 M y se completa con agua estéril hasta 2 ml. A continuación, se añaden a la mezcla 2 ml de 2×HBSS pH 7,05 (1,5 mM Na2HPO4, 280 mM NaCl, 50 mM HEPES) gota a gota y se burbujea durante 40 ó 50 segundos con una pipeta serológica de 1 ml. Posteriormente se añade la mezcla a la placa con las células Hek 293T gota a gota, con agitación orbital lenta y se incuba durante 4 horas en el incubador a 37°C y 5% CO2. Tras la incubación, se lava con PBS, se añade medio de crecimiento fresco y las células se mantienen durante 72 horas en el incubador. Pasadas las 72 horas se recolecta el medio con las partículas virales, se centrifuga a 2.000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante resultante se filtra con un filtro de 0,45 µm de diámetro de poro (Thermo). A continuación, el filtrado se centrifuga durante 90 minutos a 25.000 rpm (108.205 g) con un rotor SW32-Ti en una ultracentrífuga Optima L-100 XP (Beckman Coulter), se descarta el sobrenadante y el precipitado viral se resuspende con 100 µl de PBS frío. Finalmente, se alicuota y se almacena a -80°C. Para infectar los cultivos primarios de neuronas se emplean de 1 a 5 µl de la preparación viral por pocillo de placa de 24 pocillos, que se añaden directamente al medio de cultivo. Los cultivos de neuronas de hipocampo se infectan a 2-6 días in vitro y se analizan 8-10 días después de la infección. 3.5 ENSAYO DE CO-CULTIVO DE CÉLULAS HEK 293T CON NEURONAS DE HIPOCAMPO Células Hek 293T transfectadas con isoformas de neuroliguinas se co-cultivan con cultivos primarios de neuronas de hipocampo como se ha descrito previamente (Scheiffele et al., 2000). Las células Hek 293T transfectadas se tripsinizan y un número de 40.000 a 50.000 células se añaden por pocillo de cultivos de neuronas mantenidos durante 12-14 días in-vitro. Los cultivos se analizan 24-48 horas después de establecer el co-cultivo 3.6 TÉCNICAS BIOQUÍMICAS PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 3.6.1 Obtención de lisados celulares y cerebrales Para la lisis de células Hek 293T, MEF y de cultivos de neuronas de hipocampo, se incuban las células previamente lavadas con PBS frío con buffer de lisis (50 mM MATERIALES Y MÉTODOS 66 Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1:500 PNT, 1:50 inhibidores de proteasas y fosfatasas (Roche) durante 15 minutos en hielo. A continuación, se disgregan mecánicamente con una jeringa de 25½G y se mantienen en hielo durante 10 minutos más. Posteriormente, el lisado se centrifuga a 13.000 rpm durante 10 minutos para eliminar los restos celulares y el sobrenadante se calienta a 95ºC durante 5 minutos en tampón de carga de proteínas laemmli más 0,1 M βmercaptoetanol. En experimento con inhibidores químicos, las células se tratan con 2,5 µM GM6001 (Calbiochem), 20 µM TAPI-1 (Calbiochem), 5 µM GL189 (Calbiochem), 5 µM DAPT (Sigma), 100 nM -agatoxina IV (Ascent Scientific), 5 µM - conotoxina MIIC (Ascent Scientific), 4 µM Tapsigargina (Ascent Scientific), 10 µM Nifedipina (Ascent Scientific), 1 µM TTX (Ascent Scientific), durante 14 horas antes del lisado. En el caso de lisados provenientes de cerebros embrionarios y de cortezas de ratones, éstos se homogenizan mecánicamente con un potter en tampón RIPA (50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1mM Ortovanadato de sodio pH 10, inhibidores de fosfatasas y protesasas). El homogenado correspondiente al lisado total se centrifuga a 5.000 g durante 30 minutos a 4ºC, obteniéndose un sobrenadante que constituye la fracción de proteínas. La concentración de proteínas en el lisado se determina mediante el kit BCA (Pierce). Los lisados se calientan a 95ºC durante 5 minutos en tampón de carga de proteínas laemmli más 0,1 M β-mercaptoetanol. 3.6.2 Aislamiento y fraccionamiento de sinaptosomas Ratones adultos (tres animales por condición) se decapitan y las cortezas se diseccionan y se homogeneízan en buffer A frío (5 mM HEPES pH 7,4, 0,32 M de sacarosa, 1 mM de NaHCO3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl2, 1 mM NaF, inhibidores de fosfatasas y proteasas) usando el homogeneizador de Teflon-cristal. El homogenado correspondiente al lisado total se centrifuga a 1.400 g durante 10 minutos y el pellet (P1) se extrae de nuevo con buffer A, se homogeniza y se centrifuga a 710 g durante 10 minutos Los sobrenadantes (S1 + S1’) se combinan y se centrifugan a 13.800 g durante 10 minutos para recoger el pellet (P2). Dicho pellet se resuspende en 3 ml de buffer B frío (6 mM Tris pH 8,0, 0,32 M de sacarosa, 1 mM NaHCO3, 1 mM NaF, inhibidores de fosfatasas y proteasas) usando el homogeneizador y se carga en la parte superior de un gradiente discontinuo de sacarosa (0,85 M, 1 M y 1,2 M de sacarosa) y se centrifuga a 82.500 g durante 2 horas. La fracción de sinaptosomas se recoge de la interfase de las capas de 1 M-1,2 MATERIALES Y MÉTODOS 67 M de sacarosa, se diluye en buffer C (12 mM Tris HCl pH 8,0, 1% de Triton X-100) y se incuba en hielo durante 15 minutos. La suspensión se centrifuga a 32.800 g durante 1 hora para obtener el sobrenadante (fracción presináptica). El sedimento que contiene la fracción postsináptica se resuspende en buffer D frío (40 mM Tris pH 8,0, 1% de NP40). La concentración de proteína se determinó mediante el kit BCA. 3.6.3 Inmunoprecipitación La inmunoprecipitación es una técnica que consiste en precipitar el antígeno de interés en una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a ese antígeno. En primer lugar el lisado o medio condicional de las células Hek transfectadas con el plásmido correspondiente se incuban con el anticuerpo primario a una concentración saturante (1-2 µg) durante 1 hora a 4ºC en agitación. A continuación se añade la proteína G o A sefarosa (GE Healthcare) pre-equilibrada con buffer de lisis durante 30 minutos a 4ºC en agitación. La proteína G o A sefarosa se une a la cadena pesada de las inmunoglobulinas con gran afinidad. Se ha usado la proteína G para unir el anticuerpo anti-HA de rata y la proteína A para el anticuerpo contra el NTF de PS1 de conejo. Posteriormente, se centrifuga la mezcla a 3.000 g durante 5 minutos para sedimentar el complejo antígeno-anticuerpo y proteína sefarosa. El pellet se lava con buffer de lisis, se centrifuga y se mezcla con tampón de carga de proteínas laemmli más 0,1 M β-mercaptoetanol para posteriormente calentar a 95ºC y disociar el complejo. Finalmente, los inmunoprecipitados se cargan en un gel de poliacrilamida y se analizan por Western blot. 3.6.4 Biotinilización En los ensayos de biotinilización se marcan las proteínas de membrana mediante su unión covalente a la molécula de biotina. Las células Hek 293T transfectadas con el plásmido correspondiente se incuban con biotina (1 mg/ml) (EZ-Link Sulfo-NHSBiotina, Thermo Scientific) a 4ºC durante 30 minutos. A continuación las células se lisan y se incuban con avidina (NeutrAvidin Agarose Resin, Thermo Scientific) durante 1 hora a 4ºC. Posteriormente, los lisados se centrifugan y el pellet se lava con buffer de lisis, se centrifuga y se mezcla con tampón de carga de proteínas laemmli más 0,1 M β-mercaptoetanol para posteriormente calentar a 95ºC y disociar el complejo. Los precipitados se analizan por Western blot. MATERIALES Y MÉTODOS 68 3.6.5 Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida Los geles de SDS-PAGE se han usado empleando el sistema Mini-Protean 3 (BioRad). Se ha usado un sistema de electroforesis discontinuo, en el cual el gel de apilamiento posee un tamaño de poro más grande que el gel separador. El gel de apilamiento asegura el desplazamiento de las proteínas en el mismo frente de migración, mientras que en el separador las proteínas se separan por su peso molecular. Para proteínas de bajo peso molecular (de 10 a 50 kDa) se han usado geles con una concentración de acrilamida del 10-13,5% y para aquellas de peso molecular medio o elevado (de 50 a 150 kDa), del 8%. Las muestras preparadas en tampón de carga de proteínas laemmli se cargan en paralelo a marcadores con proteínas de peso molecular conocido (Bio-Rad). Acto seguido, se añade a la cubeta el buffer para electroforesis (Tris-glicina 0,1 M, 0,01% SDS), asegurando en todo momento el contacto de los geles con dicho tampón. La electroforesis se realiza a un voltaje constante de 120 V durante 20 minutos, para la formación del frente de proteínas en el gel apilador y a 100 V durante 1-2 horas, para la separación de proteínas en el gel separador. 3.6.6 Transferencia de proteínas a membranas de PVDF Las proteínas previamente separadas por el sistema SDS-PAGE, se transfieren a una membrana usando el sistema de transferencia en “sándwich” (Bio-Rad). En esta Tesis se ha usado membranas de polivinilideno de difluorido (PVDF) de 0,45 µm de poro (Millipore). La transferencia se realiza a un amperaje fijo de 220 mA durante 2 horas ó 300 mA durante 1 hora. 3.6.7 Inmunodetección de proteínas en membranas Las membranas de PVDF se bloquean durante 1 hora con TBS-T pH 7,6 (200 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 1 % Tween 20) más 5% de leche libre de grasa, para prevenir uniones inespecíficas de los anticuerpos a la membrana. Posteriormente, la membrana se lava con TBS-T para eliminar el exceso de agente bloqueante y se incuba con el anticuerpo primario diluido en TBS-T más 2,5% de leche. La incubación se realiza en una bolsita de plástico termosellada durante 1 hora a temperatura ambiente o bien durante toda una noche a 4ºC. Pasado este tiempo, la membrana se lava con TBS-T para eliminar el anticuerpo primario no unido a la membrana y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario diluido en TBS-T más 5% de leche. Los anticuerpos secundarios empleados en esta Tesis están generados en MATERIALES Y MÉTODOS 69 cabra contra anticuerpos de diferentes especies y conjugados a la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch). Finalmente, se lava con TBS-T para eliminar el exceso de anticuerpo secundario y se incuba durante 5 minutos con el reactivo SuperSignal (Pierce) o ECL-plus (Healthcare) para detectar las proteínas por quimioluminiscencia. La enzima HRP unida al anticuerpo secundario, en presencia de peróxidos, cataliza la reacción de oxidación de luminol. Una vez oxidado, el luminol emite quimioluminiscencia. La adquisición y análisis de la imagen se realiza con el equipo ChemiDoc XRS (Bio-Rad) y su posterior análisis con el programa informático Quantity One específico para Western blot. Tabla 1. Listado de anticuerpos usados para Western blot. Anticuerpo primario Especie Dilución Trabajo Banda Reconocida (kDa) Proveedor Anti-HA Rata 1:1000 (WB) 1:100 (IP) Roche Cyto neurexina Pollo 1:250 (WB) 150 (αNrx) 100 (βNrx) 14-16 (α/β Nrx-CTF) Dean et al. 2003 Anti-Nrx1 Ratón 1:500 (WB) 150 (αNrx) 100 (βNrx) BD Transduction Laboratories Anti-α/Actina Conejo 1:2000 (WB) 42 Sigma-Aldrich Anti-β/Actina Ratón 1:60000 (WB) 42 Sigma-Aldrich AntiNCadherina Ratón 1:1000 (WB) 120 35 (NCadh-CTF) Biological Laboratories Anti-CASK Ratón 1:200 (WB) 120 Biological Laboratories Anti-PS1 Conejo 1:5000 (WB) 1:100 (IP) 50 20-30 (PS-NTF) Merck Anti-PS1 (Ab2) Ratón Rata 1:500 (WB) 20-30 (PS-NTF) No reconoce a la proteína humana Merck AntiNicastrina Ratón 1:1000 (WB) 115 Biological Laboratories AntiSinaptofisina Ratón 1:120000 (WB) 37 Sigma-Aldrich Anti-PSD95 Ratón 1:2000 (WB) 90 Biological Laboratories MATERIALES Y MÉTODOS 70 Antiβamiloide Ratón 1:5000 (WB) 4.5 Signet Anti-Nlg1 Ratón 1:200 WB 120 (Nlg1) 15 (Nlg1-CTF) NeuroMab 3.6.8 Stripping de membranas de PVDF La membrana de PVDF a reutilizar se sumerge en una solución de 62,5 mM TrisHCl pH 6,7, 100 mM β-mercaptoetanol y 2% de SDS a 70ºC durante 20 minutos en agitación. Con este tratamiento se consigue que los anticuerpos que estaban unidos a la membrana se desprendan de ella. Seguidamente, se lava la membrana tres veces durante 10 minutos con TBS-T a temperatura ambiente y se procede con una nueva inmunodetección. 3.7 INMUNOFLUORESCENCIA Las células crecidas sobre los cubreobjetos se fijan empleando una solución de tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 con 4% paraformaldehído y 4% glucosa para evitar la lisis osmótica de las células. Seguidamente, se realizan 3 lavados con PBS. Las muestras se permeabilizan y se bloquean mediante la incubación con solución de bloqueo PBS con 5% de suero de cabra y 0,05% Tritón X-100 durante 1 hora. Para la detección de antígenos nucleares, las células fijadas se incuban con metanol frío a 20ºC durante 10 minutos previo a la incubación en solución de bloqueo sin Tritón X-100. Tras el bloqueo, las células se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos primarios diluidos en la misma solución de bloqueo. Pasado este periodo de incubación se realizan tres lavados con PBS y se incuban las muestras durante 1 hora con los anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo. Se han usado anticuerpos secundarios generados en burro contra anticuerpos de diferentes especies y conjugados con los fluoróforos cianida Cy2 (excitación en azul, emisión en verde), Cy3 (excitación en verde, emisión en rojo) o Cy5 (excitación en rojo, emisión en rojo lejano-e infrarrojo) (Jackson ImmunoResearch). Finalmente, las muestras se lavan 3 veces durante 5 minutos y se procede al montaje de los cubreobjetos en portaobjetos empleando Fluoromount-G (SouthernBiotech). Las muestras se conservan en frío protegidas de la acción directa de la luz. MATERIALES Y MÉTODOS 71 Tabla 2. Listado de anticuerpos usados para Inmunofluorescencia. Anticuerpo primario Especie Dilución Trabajo Proveedor Anti-HA Rata 1:1000 Roche Anti-HA Rata 1:1000 Roche Cyto-neurexina Pollo 1:250 Dean et al. 2003 Anti-Vglut1 Conejo 1:1000 Synaptic Systems AntiVamp2 Ratón 1:3000 Synaptic Systems Anti-PSD95 Ratón 1:1000 Biological Laboratories Anti-CASK Ratón 1:200 Biological Laboratories Anti-PS1 Conejo 1:500 Merck Anti-PS1 (Ab2) Ratón Rata 1:25 Merck Anti-GFP Ratón 1:1000 Synaptic Systems En esta Tesis hemos empleado diferentes tipos de microscopios para la adquisición de imágenes de inmunofluorescencia: el microscopio Zeiss invertido, Axio Observer.A1, el microscopio confocal Olympus FLUOVIEW 1000 y el microscopio confocal Leica SP2-AOBS. 3.7.1 Análisis de imagen de confocal Para cuantificar la fluorescencia de los diferentes marcadores celulares, adquirimos las imágenes de doble o triple inmunofluorescencia mediante microscopía confocal. El análisis de las imágenes con la información en canales RGB se realiza mediante el programa ImageJ. A partir del canal de fluorescencia correspondiente a HA-Nlg1 o GFP se dibuja una máscara binaria que comprende el área de interés. Dich a difer e más c ima g sele c corr e 3.8 3.8. 1 E difer e técn i Figu r (New p Asso c perfu s  emp l - M  a máscar a e ntes marc c ara. Tras l g en binari a c cionado, c e spondient e TÉCNIC A 1 Equip E n esta Te s e ntes disp o i cas de ad q r a 10. Comp o p ort). 3) Mic r c iates). 5) C á s ión. 8) Lámp a A continu a l eado: M icroscopi o Objetivo aument o a , se expo r adores, pe r l a aplicació a que co n c alculando a e s en el ca n A S DE REG os y mate r s is se ha ut i o sitivos par a q uisición de o nentes del r oscopio inve á mara (Ham a a ra de mercu r a ción se d e o Zeiss inve s de 10, 2 o s (Zeiss Pl r ta al rest o r mitiendo l a n de un va n tiene el a partir de n al sin bina r ISTRO EX P r iales expe lizado un s a el desarr o imágenes u sistema ex p rtido (Zeiss A a matsu Orca r io. 9) Ordena d e tallan los d r tido, A xio O 2 0 y 40 a u anA POC H o de canal a selección lor umbral número d la misma l r izar. P ERIMEN T rimentale s s istema de e o llo de exp e usando flu o p erimental. 1 A xio Observ e R 2 ). 6) Esti m dor para regi s d istintos c o O bserver.A u mentos ( Z H ROMAT). es que c o de los píx e para elimin e píxeles l a intensid a T AL s e xperiment a e rimentos d o rescencia ( 1 ) Jaula de F e r.A1). 4) Co m ulador (A-M s tro y adquisi c o mponente s 1. Este mi c Z eiss Achr o MATERIA L o ntienen la e les conteni ar el fondo por enci m a d promedi o a ción en el d e estimula c ( Figura 10) .  F araday. 2) M n trolador del Systems 21 0 c ión de imáge n s del siste m roscopio e s plan) y un L ES Y MÉT O informaci ó dos dentro , se obtien e m a del u o de los p í que se co m c ión de ca m . M esa anti-vi b obturador ( V 00). 7) Siste m n es. m a experi m s tá dotado d n objetivo d O DOS 72 ó n de de la e una m bral í xeles m bina m po y b ratoria V incent m a de m ental d e: d e 63 MATERIALES Y MÉTODOS 73  Filtros específicos (AHF analysentechnik AG) para detectar la fluorescencia de GFP/Cy2; Cy3/DsRed y Cy5.  Obturador Uniblitz CS25 (Vincent Associates) manejado por el controlador Uniblitz VCM-D1 (Vincent Associates) conectado a un ordenador. - Cámara de registro modelo Orca R2 Esta cámara consta de un sensor CCD con una resolución de 1344 x 1024 pixeles, siendo el tamaño del pixel de 6,45 μm de lado. En esta Tesis las imágenes se han adquirido aplicando un binning de 2 x 2 para aumentar la sensibilidad. Por lo tanto para el objetivo de 63 aumentos el tamaño del pixel es de 0,2 µm de lado tras aplicar el binning. La cámara y el obturador se controlan con el software proporcionado por el fabricante de la cámara. Concretamente, con la cámara Orca R2 se empleó el software HCImage (versiones 1.0 a 2.0). - Estimulador modelo A-M SYSTEMS 2100 Con este estimulador se configura la amplitud, duración y frecuencia de los pulsos eléctricos. Los estímulos, consistentes en trenes de pulsos bifásicos de 5 ms de duración total y 10 mA de amplitud a 20 Hz, se aplican manualmente. - Sistema de perfusión y de succión Para mantener las muestras biológicas vivas y en condiciones adecuadas durante el transcurso de los experimentos se ha empleado un sistema de perfusión continua con un flujo de 60 ml/hora. El sistema de perfusión montado en nuestro laboratorio consta de un reservorio de solución, un sistema controlador de flujo, una cámara de perfusión/estimulación, y una bomba de succión (Figura 11).  Figura 11. Sistema de perfusión y de succión. La perfusión es de 1ml/min lo que equivale a 20 gotas/min, permitiendo mantener las neuronas vivas durante el transcurso del experimento.    4 RESULTADOS    RESULTADOS 83 4.1 ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN DE ISOFORMAS DE NEUREXINAS 4.1.1 Distribución de HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C en cultivos de neuronas Las neurexinas (Nrx) son proteínas neuronales que regulan el ensamblaje y maduración de las sinapsis. Como se ha descrito en la Introducción, existen tres genes de neurexinas con 2 promotores alternativos, que dan lugar a las isoformas α y β que se diferencian en el dominio extracelular. Además el dominio extracelular de las neurexinas contiene diversos sitios de splicing alternativo (Sp), originándose más de mil isoformas diferentes de neurexinas (Ullrich et al., 1995). Sin embargo, los segmentos citoplásmico y transmembrana son comunes a todas las neurexinas. Trabajos previos empleando un anticuerpo cyto-neurexina con capacidad para reconocer a todas las isoformas han demostrado una localización sináptica de neurexinas in vivo por experimentos de microscopía electrónica. En estos estudios se detectó la presencia de neurexinas tanto en terminales presinápticos como, inesperadamente, en la membrana postsináptica, además de la presencia de un pool en el soma neuronal (Taniguchi et al., 2007). Sin embargo, se desconoce si la distribución de neurexinas se debe a la localización diferencial de isoformas o si, por el contrario, mismas isoformas de neurexinas pueden localizar en diferentes compartimentos celulares, debido a la falta de datos sobre la localización de isoformas concretas. Por otra parte, datos previos han mostrado que la localización sináptica de neurexinas puede depender del dominio citoplásmico. Missler y colaboradores describieron que la deleción de los últimos residuos de dominio citoplásmico de neurexinas que forman el motivo de unión a PDZ impide el tráfico de neurexinas a la membrana plasmática (Fairless et al., 2008). Por el contrario, otros resultados indican que el reclutamiento de β-neurexina-1 por Cbln1 es independiente del motivo de unión a PDZ (Matsuda y Yuzaki, 2011). En base a estos datos, en una primera fase de la Tesis nos interesó analizar el efecto del dominio citoplásmico en la localización de β-neurexina-1. Para ello, se infectaron neuronas de hipocampo con vectores lentivirales que expresan HA-βNrx1 WT o un mutante de deleción del dominio citoplásmico, HA-βNrx1 C (Figura 18A). Estas proteínas carecen del sitio de splicing 4 y además están marcadas con la etiqueta HA en la región extracelular, permitiendo estudiar la localización de la proteína exógena. Tras 10 días de infección los cultivos se procesaron por inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-HA y contra el marcador sináptico VGlut1 para establecer la co-localización de las neurexinas en sinapsis glutamatérgicas. En estos experimentos la localización de HA-βNrx1 WT reprodujo la distribución de las RESULTADOS 84 neurexinas endógenas (Dean et al., 2003; Taniguchi et al., 2007). Además, las imágenes de confocal mostraron una localización extrasináptica y sináptica similar para ambas construcciones de neurexinas, siendo la localización somática del mutante HA-βNrx1 C más acusada (Figura 18C). El análisis de los cultivos infectados con HA-βNrx1 WT por Western blot con el anticuerpo anti-HA reveló la presencia de dos bandas de aproximadamente 50 y 100 kDa correspondientes a la proteína no glicosilada y a la proteína madura glicosilada, respectivamente (Figura 18B). Ambas proteínas se observaron igualmente en lisados infectados con HA-βNrx1 C con una diferencia de peso molecular de aproximadamente 7 kDa, correspondiente a la deleción del dominio citoplásmico (Figura 18B). Estos resultados sugirieron que la deleción del dominio citoplásmico de las neurexinas no impide la localización en membrana y no tiene un gran efecto en la localización subcelular de β-neurexinas. RESULTADOS 85 Figura 18. Colocalización sináptica de HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C en cultivos de neuronas. A) Esquema representativo de las construcciones lentivirales de HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C. B) Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) infectados con LV que expresan: HA-βnrx1 o HA-βnrx1 C. Tras 10 días de infección, se analizó la expresión de HA-βNrx1 mediante Western blot con el anticuerpo RESULTADOS 86 anti-HA. C) Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) infectados con LV que expresan: HAβnrx1 o HA-βnrx1 C. Tras 10 días de infección, las neuronas se analizaron por inmunofluorescencia con anticuerpos contra la etiqueta HA (rojo en la colocalización) y contra el marcador Vglut1 (verde en la colocalización). Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. Barra de escala: 5μm. 4.1.2 Reclutamiento de HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C en los contactos sinápticos mediados por Nlg1AB Tras demostrar que la deleción del dominio citoplásmico de HA-βNrx1 no impidió su localización sináptica en cultivos de neuronas, se estudió en más detalle si la presencia del dominio citoplásmico se requiere para la interacción con neuroliguinas en las sinapsis. Para ello, se empleó un ensayo de infección-co-cultivo que consistió en co-cultivar células Hek 293T transfectadas con VSV-Nlg1 (AB), con cultivos de neuronas de hipocampo infectados durante 10 días con vectores lentivirales que expresan: GFP, HA-βNrx1 WT o HA-βNrx1 C (Figura 19A). En este ensayo, neuroliguina induce el reclutamiento de neurexinas axonales y la formación de terminales presinápticos en los axones que contactan dichas células Hek 293T transfectadas (Scheiffele et al., 2000, Dean et al., 2003). La isoforma de neuroliguina transfectada contiene el splicing B y se une principalmente a -neurexinas que carecen del splicing 4 (Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). Los cultivos de neuronas se procesaron para inmunofluorescencia 24 horas tras el co-cultivo con anticuerpos contra HA y VSV, para detectar las proteínas exógenas, y con anticuerpos contra la proteína de vesículas sinápticas glutamatérgicas Vglut1. En imágenes de microscopía confocal se observó un reclutamiento similar de las proteínas HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C a los terminales mediados por VSV-Nlg1 (AB). Dicha localización coincidió con los sitios de reclutamiento de vesículas sinápticas reconocidos con el anticuerpo Vglut1 (Figura 19B). Estos resultados sugirieron que la deleción del dominio citoplásmico de neurexinas no afecta a la interacción con neuroliguinas en las sinapsis. Estos resultados están en consonancia con otros resultados descritos que indican que la interacción de β-neurexina-1 con Cbln1 no depende de la integridad del dominio de unión a PDZ (Matsuda y Yuzaki, 2011). RESULTADOS 87  Figura 19. Actividad sinaptogénica de HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C. A) Esquema experimental de un ensayo infección-co-cultivo. Neuroliguina expresada en células Hek 293T induce el reclutamiento de marcadores axonales y la formación de terminales presinápticos en los axones que contactan dichas células Hek 293T. B) Imágenes de confocal mostrando el reclutamiento de HA-βNrx1 y Vglut en los axones que contactan las células Hek 293T. Cultivos de neuronas de hipocampo infectados durante 9-10 días con vectores lentivirales que expresan GPF, HA-βNrx1 WT y HA-βNrx1 C, se co-cultivaron durante 24 horas con células Hek 293T que expresan HA-Nlg1 (AB). Las neuronas se analizaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo contra la etiqueta HA (verde en la colocalización), con el anticuerpo contra la etiqueta VSV (rojo en la colocalización) y contra el marcador sináptico Vglut1 (azul en la colocalización). Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador, obtenidas a partir de secciones ópticas consecutivas. Barra de escala: 5μm.  RESULTADOS 88 4.1.3 Localización de las distintas isoformas de splicing de β-neurexinas Como hemos descrito en la Introducción, la interacción entre isoformas de neurexinas y neuroliguinas está regulada por splicing alternativo en el dominio extracelular. La inserción del splicing B en neuroliguina-1 restringe la interacción de neuroliguina-1 a isoformas de β-neurexinas que carecen del splicing Sp4 (-Sp4), mientras que la ausencia del splicing B permite la interacción de neuroliguina-1 con αneurexinas y β-neurexinas (Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). Nuestros datos anteriores obtenidos con el mutante de deleción del dominio citoplásmico sugieren que la localización de neurexinas podría depender de interacciones mediadas por el dominio extracelular. En el siguiente experimento se analizó el papel del splicing 4 en la localización de β-neurexinas, ya que, basado en la interacción con neuroliguinas, se podría esperar una localización diferencial de isoformas dependiente de Sp4. Para comparar el papel de Sp4 en la distribución de diferentes isoformas de β-neurexinas, se co-transfectaron neuronas de hipocampo con: HA-βNrx1 (-Sp4) y VSV-βNrx1 (+Sp4) o con HA-βNrx2 (-Sp4) y VSV-βnrx1 (- Sp4). Como control los cultivos se co-transfectaron con HA-βNrx1 (-Sp4) y VSV-βNrx1 (-Sp4) (Figura 20A). Tras 24 horas de expresión de los plásmidos transfectados, se procedió al procesado de las neuronas por inmunofluorescencia con anticuerpos antiHA y anti-VSV, para detectar las neurexinas exógenas, y anti-Vglut1 para localizar los terminales glutamatérgicos. Se tomaron imágenes por microscopía confocal y se analizó el patrón de localización de las diferentes isoformas (Figura 20B). En las transfecciones control, HA-βNrx1 (-Sp4) y VSV-βNrx1 (-Sp4) presentaron el mismo patrón de tinción, indicando que la inserción de las diferentes etiquetas empleadas para la detección no afectaban a la distribución de β-neurexinas. En las neuronas cotransfectadas con HA-βNrx1 (-Sp4) y VSV-βNrx1 (+Sp4) se observó el mismo patrón para ambas isoformas, con una distribución en terminales glutamatérgicos (Figura 20). De la misma forma, la distribución de VSV-βNrx1 (-Sp4) fue indistinguible de la distribución de HA-βNrx2 (-Sp4), indicando que la localización de β-neurexinas no se ve afectada por Sp4 (Figura 20). Estos resultados sugieren que Sp4 no determina la distribución subcelular de β-neurexinas en sinapsis glutamatérgicas. RESULTADOS 89 Figura 20. Colocalización de diferentes isoformas de β-neurexinas en terminales presinápticos. A) Esquema representativo de las distintas construcciones de β-neurexinas. B) Cultivos de neuronas de hipocampo se co-transfectaron con diferentes isoformas de β-neurexinas: HAβNrx1-Splice4 y VSVβnrx1Splice4, HAβNrx1-Splice4 y VSVβnrx1+Splice4 o HAβNrx2-Splice4 y VSVβnrx1-Splice4 a los 10-13 días in vitro. Las neuronas se analizaron por inmunofluorescencia con anticuerpos contra la etiqueta HA (rojo en la colocalización), contra la etiqueta VSV (verde en la colocalización) y contra Vglut1 (azul en la colocalización). Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. Las flechas indican colocalización entre marcadores. Barra de escala: 5μm. RESULTADOS 96 complejo -secretasa que se forma es inactivo, llevando a la consecuente acumulación de los sustratos -secretasas (Wolfe et al., 1999; Yu et al., 2001; Saura et al., 2005). Con el fin de estudiar si las neurexinas endógenas son procesadas por una actividad dependiente de PS/-secretasa, se abordaron varias aproximaciones. En primer lugar se analizó el procesamiento de las neurexinas en cultivos de neuronas de hipocampo tratados con DAPT. Los análisis por Western blot de los extractos de neuronas de hipocampo con el anticuerpo cyto-neurexina revelaron la presencia de la proteína madura glicosilada de αy β-neurexinas en bandas de aproximadamente 150 y 100 kDa, respectivamente, y una doble banda de 12-16 kDa correspondiente a los CTFs endógenos de las neurexinas (Figura 24A). Los CTFs de las neurexinas se incrementaron con el tratamiento con DAPT (Figura 24A). En segundo lugar se construyeron vectores lentivirales (LV) que expresan presenilina 1 wild-type (PS1 WT) y un mutante dominante negativo de presenilina (PS1 D385A) que presenta una mutación en un residuo esencial para la actividad proteolítica de PS1. Los vectores lentivirales empleados dirigen la expresión de la proteínas exógenas a neuronas pero no a células no neuronales presentes en el cultivo (Gascon et al., 2007). A continuación, se generaron lentivirus recombinantes y se infectaron cultivos de neuronas de hipocampo. De esta manera se obtienen cultivos transgénicos en los que todas las neuronas tienen bloqueada la función de PS. Tras 10 días de infección los cultivos se lisaron y se analizaron por Western blot usando el anticuerpo cytoneurexina. La sobreexpresión del mutante PS1 D385A incrementó el acúmulo de los CTFs de las neurexinas a niveles similares a los encontrados en lisados control tratados con DAPT (Figura 24A). La expresión de PS1 exógena fue confirmada por Western blot con un anticuerpo que reconoce el NTF de PS1. El anticuerpo contra PS1 detectó mayoritariamente una banda de 30 kDa correspondiente al NTF en los cultivos control o infectados con PS1 WT y una banda de 50 kDa correspondiente a la holoproteína en los lisados infectados con el mutante PS1 D385A (Figura 24A). Como control positivo se midieron los niveles del CTF de N-cadherina, un sustrato del complejo PS/-secretasa (Marambaud et al., 2003). La inhibición de la actividad - secretasa con el mutante PS1 D385A o con el tratamiento con DAPT provocó un acúmulo significativo del CTF de N-Cadherina (Figura 24A). Sin embargo, el bloqueo de la función de PS no afectó a los niveles de CASK, un ligando del dominio citoplásmico de las neurexinas (Butz et al., 1998) (Figura 24A). RESULTADOS 97  Figura 24. Acumulación de los CTFs de las neurexinas en neuronas de hipocampo deficientes en actividad PS/-secretasa. A) Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) no infectados o infectados con LV que expresan: GFP, PS1 o el mutante PS1 D385A. Los niveles de neurexinas (Nrx), PS1, N-Cadherina (N-Cadh), y CASK se analizaron por Western blot después de 10 días de infección. Los cultivos no infectados e infectados con GFP se trataron en presencia de vehículo o DAPT durante 12-14 horas. FLα: full-length α-neurexinas; FLβ: full-length β-neurexinas. B) Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) no infectados o infectados con LV que expresan: GFP, HA-βnrx1 o HA-βNrx C y tratadas con vehículo o DAPT. La expresión de β-neurexinas con la etiqueta HA y de los CTFs de las neurexinas se analizaron por Western blot usando los anticuerpo anti-HA y cyto-neurexina, respectivamente. C) Los niveles de expresión de neurexinas se detectaron mediante Western blot con dos tipos de anticuerpos, el cyto-neurexina que reconoce el dominio citoplásmico común de todas las neurexinas y un anticuerpo comercial anti-Nrx1, que reconoce las isoformas αy βde neurexina-1. Los niveles de α-actina se usaron como control de carga.  RESULTADOS 98 Si bien estos resultados nos permitieron constatar que las neurexinas endógenas son procesadas por PS/-secretasa no fue posible discernir la contribución de isoformas concretas de neurexinas, ya que todas comparten el mismo dominio citoplásmico, reconocido por el anticuerpo cyto-neurexina. Por ello, nos interesó estudiar una isoforma concreta de neurexinas, β-neurexina-1, ya que β-neurexina-1 se une con neuroliguina-1 mediando diferenciación glutamatérgica y una alteración en el procesamiento de β-neurexina-1 podría contribuir a las alteraciones en la función sináptica glutamatérgica asociada con la pérdida de función de PS (Saura et al., 2004). Para ello, infectamos cultivos de neuronas con LV que expresan HA-βnrx1 y se analizaron los niveles de los CTFs por Western blot. La sobreexpresión de HA-βnrx1 llevó a un incremento considerable de los niveles de los CTFs de las neurexinas en comparación con cultivos no infectados o infectados con GFP. Este incremento se observó tanto en cultivos sin tratar como tratados con DAPT (Figura 24B). Para confirmar que el incremento de los CTFs proviene del procesamiento de HA-βNrx1 y no de la indución de la proteólisis de cualquier otra isoforma, expresamos HA-βNrx1 C, un mutante de β-neurexina-1 que carece del dominio citoplásmico y no puede ser detectado por el anticuerpo cyto-neurexina (Figura 24B). La sobreexpresión de HAβNrx1 C no generó el incremento de los niveles de los CTFs, sugiriendo que la isoforma de β-neurexina-1 expresada es susceptible de ser procesada en neuronas. La incubación con el anticuerpo anti-HA confirmó la expresión de HA-βNrx1 y HAβNrx1 C (Figura 24B). En estos experimentos los niveles endógenos de β-neurexinas detectados con el anticuerpo cyto-neurexina fueron relativamente bajos en comparación con αneurexinas (Figura 24B). Sin embargo, un anticuerpo comercial anti-neurexina 1 detectó niveles similares de αy β-neurexinas (Figura 24C), sugiriendo que ambas proteínas se expresan en cultivos de neuronas de hipocampo a niveles similares. En conjunto, los resultados obtenidos demostraron que las neurexinas endógenas son procesadas por una actividad PS/-secretasa y que la inactivación de la actividad PS/- secretasa lleva a un incremento de los CTFs de las neurexinas en neuronas. A continuación, se estudió si el procesamiento del ectodominio en neuronas está mediado por actividad ADAM17, como ocurre con las neurexinas sobreexpresadas en células heterólogas. Para ello, se infectaron cultivos de neuronas con HA-βNrx1 y se trataron con DAPT solo o en combinación con TAPI-1. El análisis de los lisados celulares mediante Western blot con el anticuerpo cyto-neurexina, reveló una disminución del acúmulo de los CTFs de HA-βNrx1 cuando tratamos con TAPI-1, RESULTADOS 99 sugiriendo que el procesamiento del ectodominio de HA-βNrx1 en neuronas requiere actividad ADAM17. En paralelo, la inhibición del procesamiento del ectodominio mediado por ADAM17 estuvo asociada a un incremento en los niveles de la proteína madura reconocida con el anticuerpo anti-HA (Figura 25).  Figura 25. Efecto del inhibidor TAPI-1 en el procesamiento de HA-βNrx1 en cultivos de neuronas. Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) fueron no infectados o infectados con LV que expresan HA-βnrx1 y tratados con DMSO (control) o con DAPT solo o en combinación con el inhibidor TAPI-1. La expresión de β-neurexinas con la etiqueta HA y de los CTFs de las neurexinas fueron analizados por Western blot usando los anticuerpo anti-HA y cyto-neurexina, respectivamente. Se usó como control de carga -actina.  4.2.3 Acumulación de los CTFs de las neurexinas en ratones knock-out de PS Con la finalidad de estudiar si el procesamiento de las neurexinas ocurre in vivo, se examinó el procesamiento de las neurexinas endógenas en ratones KO de PS1 (PS1-/-) y en ratones KO doble condicional de PS1 y 2 (cDKO). Los ratones KO de PS1 (PS1-/-) mueren al nacer, por tanto los estudios sobre el procesamiento de las neurexinas en ausencia de PS1 se realizaron en lisados de cerebros de embriones PS1-/-. En los ratones cDKO de PS la expresión de PS1 y 2 está inhibida en las neuronas glutamatérgicas de la corteza cerebral (neocorteza e hipocampo) a partir de la tercera semana postnatal (Saura et al., 2004). Estos ratones cDKO de PS no mueren al nacer, permitiéndonos estudiar el procesamiento de neurexinas en ausencia de PS1 y PS2 en el cerebro adulto. Los experimentos con lisados provenientes de estas líneas de animales se realizaron en colaboración con el Dr. Carlos A. Saura de la Universidad Autónoma de Barcelona. Consistente con el papel de PS en la proteólisis de neurexinas, se encontró una acumulación significativa de los CTFs de las neurexinas en los extractos cerebrales de embriones PS1-/- y de ratones de 2 RESULTADOS 100 meses de edad cDKO de PS respecto a sus controles (Figura 26A). Asociada a una disminución de PS, los niveles del CTF de N-Cadherina también se incrementaron en los lisados cerebrales procedentes de los embriones PS1-/- y de los ratones cDKO de PS (Figura 26A).  Figura 26. Acumulación de los CTFs de las neurexinas en las fracciones sinápticas de los ratones cDKO de PS. A) Extractos cerebrales de embriones WT y KO de PS1 y de ratones de 2 meses WT y cDKO de PS, se analizaron mediante Western blot con el anticuerpo cyto-neurexina (Nrx), PS1 y NCadherina (N-Cadh). El incremento de los CTFs de las neurexinas y el CTF de N-Cadherina se encontró asociado con una disminución de la expresión de PS en animales que carecen de PS. B) Acumulación de los CTFs de las neurexinas en fracciones sinápticas de los ratones cDKO de PS. Lisados de corteza cerebral y las fracciones prey post-sinápticas obtenidas del fraccionamiento de los sinaptosomas de ratones controles WT y ratones cDKO de PS se analizaron por Western blot con el anticuerpo cytoneurexina, PS1, sinaptofisina (SYP) y PSD95. Los niveles de los CTFs de las neurexinas se incrementaron en los sinaptosomas y fracciones presinápticas de los ratones cDKO de PS. Sinaptofisina y PSD95 estaban enriquecidas en las fracciones presinápticas y postsináptica respectivamente. Estos experimentos se realizaron por el Dr. Carlos A. Saura. Estudios previos han mostrado una localización presináptica de neurexinas (Dean et al., 2003; Taniguchi et al., 2007) y de PS (Zhang et al., 2009a; Saura et al., 2005). De este modo, nos preguntamos si los CTFs de las neurexinas se acumulan en el terminal presináptico. Para ello, el Dr. Carlos A. Saura estudió la localización de los CTFs en fracciones de sinaptosomas de cortezas de animales adultos WT y cDKO de RESULTADOS 101 PS. Más concretamente, cada muestra analizada consistió en un pool de sinaptosomas de 3 animales de cada condición y la presencia de los CTFs de las neurexinas se analizó por Western blot. Los resultados obtenidos mostraron una acumulación de los CTFs de neurexinas en los sinaptosomas de los ratones cDKO de PS asociada con una reducción de PS1. Los niveles residuales de PS1 en los ratones cDKO se deben a la expresión de PS1 en la glía e interneuronas (Saura et al., 2005; Zhang et al., 2009a). Por otra parte, el proceso de fraccionamiento utilizado puso de manifiesto que PS1 se distribuye principalmente en la fracción presináptica enriquecida en sinaptofisina en el ratón control (Figura 26B). Los CTFs de neurexinas aparecieron muy concentrados en la fracción presináptica de los ratones cDKO de PS, aunque bajos niveles de estos CTFs también se detectaron en la fracción postsináptica (Figura 26B). Estos resultados, que concuerdan con evidencias previas sobre la acumulación de los CTFs de APP en los terminales presinápticos de los ratones cKO de PS (Saura et al., 2005), indican que PS regula el procesamiento de los CTFs de las neurexinas en los compartimentos sinápticos, sugiriendo una proteólisis de las neurexinas en el terminal presináptico. 4.2.4 La expresión de neuroliguina-1(+B) postsináptica recluta a PS1 en los terminales sinápticos Según los datos anteriores, PS1 se distribuye en los terminales presinápticos donde procesa a los CTFs de las neurexinas. Este procesamiento ocurriría, al menos, en terminales glutamatérgicos. Con el fin de comprobar si el procesamiento de neurexinas por PS ocurre en las sinapsis glutamatérgicas, decidimos estudiar en primer lugar si PS se recluta a los terminales glutamatérgicos mediados por el sistema de neurexinas-neuroliguinas. Para ello, se transfectaron neuronas de hipocampo con HA-Nlg1 (AB), una isoforma de neuroliguina con los splicing A y B (para simplificar, HA-Nlg1) que induce la formación de sinapsis glutamatérgicas. La distribución de PS y de neurexinas se analizó por inmunofluorescencia. Como control del experimento, se transfectaron cultivos de neuronas con GFP. Las imágenes de confocal mostraron un reclutamiento de neurexinas endógenas a las sinapsis inducidas por HA-Nlg1, consistente con resultados previos (Dean et al., 2003). La incubación con el anticuerpo anti PS1 mostró un aumento en la distribución de la señal de PS1 en las dendritas transfectadas con HA-Nlg1 pero no en las células vecinas sin transfectar o en dendritas transfectadas con GFP (Figura 27A). A continuación, se cuantificó tanto la intensidad como el área relativa ocupada por neurexinas y PS1 en las dendritas transfectadas. Estas cuantificaciones mostraron RESULTADOS 102 incrementos significativos tanto en área como en intensidad de las neurexinas en las dendritas transfectadas con HA-Nlg1 en comparación a las dendritas transfectadas con GFP (0,84±0,01 y 100,29±4,42, área e intensidad promedio de neurexinas en HANlg1 vs 0,30±0,02 y 42,08±2,35, área e intensidad promedio de neurexinas en GFP) (Figura 27A y Figura 27B). El reclutamiento de neurexinas debería corresponder principalmente a las isoformas β-neurexinas, ya que la isoforma de HA-Nlg1 empleada interacciona con isoformas βy no con las α-neurexinas debido a la presencia del sitio de splicing B (Boucard et al., 2005; Siddiqui et al., 2010; Chih et al., 2006). Respecto a PS1 también se observó un incremento significativo tanto en área como en intensidad en las dendritas transfectadas con HA-Nlg1 respecto a las transfectadas con GFP (0,57±0,03 y 130,32±5,14, área e intensidad promedio de PS1 en HA-Nlg1 vs 0,34±0,02 y 114,03±5,33, área e intensidad promedio de PS1 en GFP) (Figura 27A y Figura 27C). Además la observación de las imágenes mostró cierto grado de colocalización entre PS y neurexinas. En definitiva, a juzgar por los resultados obtenidos, podíamos sugerir que PS1 se concentra en las sinapsis glutamatérgicas mediadas por HA-Nlg1 donde podría procesar a las neurexinas en estos terminales sinápticos.  Figura 27. Reclutamiento de PS1 a las sinapsis mediadas por neurexinas-neuroliguinas. A) Cultivos de neuronas de hipocampo se transfectaron con GFP o HA-Nlg1 a los 10-13 días in vitro. Tras la fijación, las neuronas se procesaron para inmunofluorescencia con el anticuerpo contra la etiqueta HA a fin de identificar las células transfectadas (verde en la colocalización), con el anticuerpo cyto-neurexina (azul en la colocalización) y con el anticuerpo contra el domino N-terminal de PS1 (rojo en la colocalización). Se RESULTADOS 103 muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador, obtenidas a partir de secciones ópticas consecutivas. B) Cuantificación de píxeles totales de las neurexinas y de PS1 normalizados respecto a la superficie dendrítica. C) Cuantificación de la intensidad promedio de los píxeles positivos para neurexinas y PS1 dentro de la superficie dendrítica. Los datos se presentan como medias±error estándar, promedios de tres experimentos independientes (n=25 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (***) p<0.001; (**), p<0.05. Barra de escala: 5μm.  Para apoyar una localización sináptica de PS se estudió la distribución de PS con marcadores sinápticos en las sinapsis mediadas por HA-Nlg1. Las imágenes de microscopía confocal mostraron cierta co-localización de PS1 con el marcador presináptico sinaptobrevina-2 (Vamp2) y con el marcador postsináptico PSD95 (Figura 28). Sin embargo, estos datos no discriminan entre una localización pre o postsináptica de PS1, debido al límite de la resolución espacial de los experimentos de epifluorescencia.  Figura 28. Colocalización de PS1 con marcadores sinápticos en las sinapsis mediadas por HANlg1. A) Cultivos de neuronas de hipocampo se transfectaron con HA-Nlg1 a los 10-13 días in vitro. Las neuronas se analizaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo contra HA (verde en la colocalización), con el anticuerpo contra el dominio N-terminal de PS1 (rojo en la colocalización), y con el marcador presináptico sinaptobrevina Vamp2 (azul en la colocalización) o con el marcador postsináptico PSD95 (azul en la colocalización). Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. Las flechas señalan la colocalización de PS1 con los marcadores sinápticos en las sinapsis mediadas por HA-Nlg1. Barra de escala: 5μm. Para analizar si el reclutamiento de PS ocurre en los terminales presinápticos, se empleó un ensayo de co-cultivo de neuronas de hipocampo con células Hek 293T que expresan por transfección GFP (control) o HA-Nlg1 (Figura 29). Con este ensayo, neuroliguina induce el reclutamiento de marcadores axonales y la formación de terminales presinápticos en los axones que contactan dichas células Hek 293T (Scheiffele et al., 2000). De este modo, estudiamos únicamente el reclutamiento de mar c expr e Sch e Figu r hipoc a co-cu transi para de l a com o Hek distr i inde p imá g de l a nor m píxel célul área Nlg1 inte n pro m obs e recl u (0,6 7 0,28 ± 30B c adores pr e e san una i s e iffele et al. r a 29. Esqu e a mpo se aña d ltivo permite náptico de ne Los cultivo s inmunoflu o a s neurexin a o un enriq u 293T que i bución de p endiente m g enes de m a s neurexi n m alizados f r l es positivo a Hek 293 T como en i respecto n sidad pro m m edio de P S e rvó un i n u tamiento d 7 ±0,03 y 1 2 ± 0,03 y 76 y Figura 3 e sinápticos s oforma e s , 2007). e ma experim e d en células H e disparar la r u urexinas y ne s se fijaron o rescencia a s y de PS 1 u ecimiento expresan estos m a m ente de l a m icroscopía n as y de P r ente al ár e s para neu T . Estas cu a i ntensidad d a las tra n m edio de P S S 1 en GF P n cremento e neurexin 2 9,40±4,41 , ,71±4,49, á 3 0C). Res p en respu e pecífica d e e ntal de un e k 293T que e u ta de señali z u roliguinas. a las 24 h o con anticu e 1 en las he m del marcaj e HA -Nlg1. E a rcadores a presenci a confocal s S1 como p e a de la c é rexinas y P a ntificacion d e PS1 so b n sfectadas S 1 en HAN P ) (Figura 3 significativ o as sobre l a área e int á rea e inte n ecto al pa t e sta al con e neuroligui ensayo de e xpresan por z ación sinapt o o ras de est a e rpos cyton misinapsis e de las n e E n las célu fue simil a a de las c s e cuantific a p íxeles por é lula Hek 2 P S1 se cua es mostrar o b re las cél u con GFP N lg1 vs 0,1 9 3 0B y Figu o tanto e n a s células H t ensidad pr o n sidad pro m t rón de di s t acto con c na (Scheiff e co-cultivo. S transfección H o génica medi a blecerse e n eurexina y disparadas e urexinas y las Hek 2 9 a r en tod a c élulas He k a ron para d encima d e 2 93T. La i n ntificó den t o n un incre u las Hek 2 9 (0,33±0,0 9 ±0,02 y 93 r a 30C). E n n área c o H ek 293T t o medio de m edio de n e s tribución d c élulas no e le et al., 2 S obre el culti v H A-Nlg1. Est e ada por el si l co-cultivo y anti-PS1. por HA-Nl g y de PS1 s 9 3T que e x a s las áre k 293T (Fi d eterminar e un umbr a n tensidad p t ro del áre a mento sign 9 3T transf e 3 y 116,0 ,12±1,43, á n este sen t o mo en in t ransfectad a neurexina s e urexinas e e PS y n e RESULT A neuronale s 2 000; Bied e  v o de neuro n e sistema mo d i stema de ad y se proce s El recluta m g 1 fue dete s obre las c é x presan G F e as del c a i gura 30 A ) el recluta m a l determin a p romedio d a ocupada p ificativo ta n e ctadas co n 0 1±2,10, á r á rea e inten t ido, tambi é n tensidad e as con H A s en HA-Nl g e n GFP) ( F e urexinas e A DOS 104 s que e re r y n as de d elo de hesión s aron m iento ctado é lulas F P, la a mpo, . Las m iento a do y d e los p or la n to en n H A - r ea e sidad é n se e n el A -Nlg1 g 1 vs F igura e n las RESULTADOS 105 hemisinapsis, se observó cierto grado de colocalización entre PS1 y neurexinas. Estos datos, en consonancia con la localización presináptica de PS1 mostrada en los ensayos bioquímicos, sugieren que la expresión de HA-Nlg1 induce el reclutamiento de PS1 axonal a los terminales presinápticos mediados por β-neurexinas.  Figura 30. Reclutamiento de PS1 en las hemisinapsis mediadas por neurexina-neuroliguina. A) Cultivos de neuronas de hipocampo de 14-16 días in vitro se co-cultivaron durante 24 horas con células Hek 293T que expresa GFP o HA-Nlg1. El reclutamiento de PS1 y de las neurexinas en las células Hek 293T transfectadas se analizó por inmunofluorescencia con el anticuerpo contra PS1 de ratón (rojo en la colocalización) y con el anticuerpo cyto-nrx (azul en la colocalización). El anticuerpo de PS1 de ratón empleado (Ab2) no reconoce PS1 humana expresada en Hek 293T. La expresión de HA-Nlg1 se analizó con el anticuerpo contra la etiqueta HA a fin de identificar las células transfectadas (verde en la colocalización) y GFP se detectó por inmunofluorescencia directa. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia. B) Cuantificación de píxeles totales positivos para neurexinas o PS1 normalizados respecto a la superficie de las células Hek 293T. C) Cuantificación de la intensidad promedio de los píxeles positivos para neurexinas o PS1 dentro del área de las células Hek 293T. Los datos se presentan como medias±error estándar, promedios de tres experimentos independientes (n=20 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (***) p<0.001; (**), p<0.05. Barra de escala: 5μm. RESULTADOS 112 descritos previamente y, a su vez, similares a los obtenidos analizando los niveles de los CTFs de neurexinas (Figura 35A-C y Figura 36). Figura 35. Incubación con soluciones despolarizantes activan el procesamiento de las neurexinas en cultivos de neuronas de hipocampo. A, B y C) Western blots representativos de cultivos de neuronas de hipocampo (15 días in vitro) estimulados con 50 mM KCl solo o en combinación con DAPT RESULTADOS 113 incubado en presencia de los siguientes inhibidores: AP5 más CNQX, -agatoxina IVA, -conotoxina MVIIC, -agatoxina IVA más -conotoxina MVIIC, Cadmio, Tapsigargina, Nifedipina, TTX o GM6001, como se indica. Los CTFs de las neurexinas y el CTF de N-Cadherina se analizaron por Western blot usando el anticuerpo cyto-neurexina y el anticuerpo anti-N-Cadherina, respectivamente. Los inmunoblots se incubaron con el anticuerpo anti α-actina para normalizar la carga de proteína total por carril.   Figura 36. Cuantificación de los niveles de CTF de neurexinas en cultivos incubados con KCl. Análisis cuantitativos de los niveles de los CTFs de las neurexinas y CTF de N-Cadherina en cada una de las condiciones indicadas normalizados con respecto a la situación control sin estimular. Los datos se presentan como medias±error estándar y son promedios de 6 experimentos independientes para las condiciones experimentales: control, DAPT, KCl, KCl+DAPT, KCl+DAPT+AP5+CNQX, KCl+DAPT+- Agatoxina IVA (Aga), KCl+DAPT+Cd2+, KCl+DAPT+Tapsigargina (TH) y KCl+DAPT+GM6001, y promedios de dos experimentos independientes para las condiciones KCl+DAPT+Nifedipina y KCl+DAPT+TTX. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Bonferroni, (**), p<0.05. Los asteriscos de color negro y gris representan diferencias significativas respecto al control sin estimular con KCl y los de color rojo y azul respecto a la condición KCl+DAPT. Los resultados anteriores sugirieron que el procesamiento de las neurexinas endógenas se dispara por actividad sináptica. A continuación nos interesó analizar si el procesamiento de una isoforma concreta de neurexina, β-neurexina-1, se regula igualmente por actividad sináptica. Para ello, se infectaron cultivos de neuronas de hipocampo con LV que expresan HA-βNrx1 y tras 10 días de infección se estimularon con KCl solo o en combinación con DAPT y se analizó la presencia de los fragmentos de neurexinas por Western blot. La cuantificación de los CTFs de HA-βNrx1, reveló un RESULTADOS 114 incremento de 2,2 veces en los cultivos incubados con KCl respecto a cultivos control sin estimular (Figura 37A y Figura 37B). Los niveles de los CTFs de HA-βNrx1 inducidos por despolarización fueron superiores a los obtenidos en las células tratadas con DAPT sin estimular (Figura 37A, Figura 37B y Figura 37C).  Figura 37. La despolarización activa el procesamiento de HA-βNrx1 en cultivos de neuronas de hipocampo. A, B) Cultivos de neuronas de hipocampo (3-5 días in vitro) infectados con un vector lentiviral que expresa HA-βnrx1. Tras 10 días de infección, las neuronas se estimularon con 50 mM KCl solo o en RESULTADOS 115 combinación con DAPT y en presencia de los siguientes inhibidores: AP5 y CNQX, -agatoxina IVA (Aga) y -conotoxina MVIIC (Cono) o GM6001, como se indica. Los CTFs de las neurexinas se analizaron por Western blot usando el anticuerpo cyto-neurexina. C) Análisis cuantitativos de los niveles de los CTFs de las neurexinas normalizados con respecto a la situación control sin estimular. Los datos se presentan como medias±error estándar y son promedios de cuatro experimentos independientes para las condiciones experimentales: control, DAPT, KCl, KCl+DAPT y KCl+DAPT+GM6001, y promedios de dos experimentos independientes para las condiciones KCl+DAPT+AP5+CNQX y KCl+DAPT+Aga+Cono. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Bonferroni, (***) p<0.001; (**), p<0.05. Los asteriscos de color negro representan diferencias significativas respecto al control sin estimular con KCl y los de color rojo respecto a la condición KCl+DAPT.  Además, la incubación con KCl y DAPT incrementaron los niveles de los CTFs de neurexinas 1,4 veces respecto a la condición estimulada en ausencia de DAPT. Además, el tratamiento con GM6001 llevo a una reducción de un 34% en los niveles de los CTFs de neurexinas inducidos por la incubación con KCl y DAPT (Figura 37A, Figura 37B y Figura 37C). Resultados similares se obtuvieron cuando los cultivos de neuronas estimulados con KCl y tratados con DAPT se incubaron con AP5 y CNQX (Figura 37B y Figura 37C). Estos resultados obtenidos con una isoforma concreta de neurexina, son similares a los obtenidos con las neurexinas endógenas y sugirieron que la despolarización incrementa el procesamiento del ectodominio de, al menos, βneurexinas que conlleva a un aumento de los niveles de los CTFs. 4.3.2 Análisis de la función de PS sobre la liberación vesicular en terminales mediados por el complejo neurexinas-neuroliguinas Los resultados descritos hasta ahora demuestran que: i) las neurexinas se procesan por PS en los terminales presinápticos; ii) que los CTFs de las neurexinas se acumulan en los terminales glutamatérgicos de neuronas deficientes en PS; y iii) que la actividad sináptica estimula el procesamiento de las neurexinas. Datos recientes sugieren una función presináptica de PS en la regulación de la liberación de neurotransmisores (Zhang et al., 2009a). Los defectos observados en la LTP en el hipocampo de ratones cDKO de PS se deben a un papel de PS en el terminal presináptico regulando la liberación de neurotransmisores (Zhang et al., 2009a). Estos datos sugieren que la función de PS hacia sus sustratos en el terminal presináptico se requiere para mantener la liberación de neurotransmisores. Por otra parte, datos obtenidos por Juan Antonio Páez Gómez en el grupo han mostrado que la activación de las neurexinas por neuroliguinas incrementa la liberación de neurotransmisores en RESULTADOS 116 sinapsis glutamatérgicas. Estos datos sugirieron la posibilidad de que el incremento en la liberación mediada por neurexinas podría requerir de la actividad de PS. Para evaluar esta hipótesis, se analizó la liberación vesicular de las sinapsis mediadas por neurexinas en cultivos de neuronas defectivos o no en PS. Para ello, se desarrolló un ensayo experimental que consta de los siguientes pasos (Figura 38): 1 Infección de cultivos de neuronas de hipocampo con la sonda sináptica sypHy. La infección se realizó a los 3 días in vitro. SypHy es una proteína de fusión de una EGFP sensible a pH con la parte luminal de la proteína de vesícula sináptica, sinaptofisina (Granseth et al., 2006). En situación de reposo, el pH ácido de la vesícula sináptica impide la fluorescencia mediada por EGFP. Con la llegada de los potenciales de acción, las vesículas se fusionan con la membrana, de manera que el pH intraluminal de las vesículas se vuelve más básico al equilibrarse con el espacio extracelular, incrementando la fluorescencia de sypHy. La posterior endocitosis y re-acidificación de la vesícula induce el apagado de la fluorescencia. 2 Co-transfección de los cultivos con los plásmidos HA-Nlg1 (AB) y la proteína fluorescente DsRed2. La co-transfección se realizó a los 8-9 días de infección con sypHy (11-12 días in vitro). La isoforma de neuroliguina expresada promueve la formación de terminales glutamatérgicos e induce el reclutamiento de las βneurexinas. La co-transfección con DsRed2 nos permite identificar durante el experimento de imagen las dendritas transfectadas. 3 Estimulación eléctrica del cultivo. A las 24 horas de la co-transfección de HA-Nlg1 y DsRed2 se procede a la estimulación de campo del cultivo. Los cubreobjetos que contienen el cultivo de neuronas se montaron en una cámara de registro y se perfundieron con una solución externa, a la que se le añadió CNQX y AP5, con el fin de inhibir la actividad sináptica excitatoria glutamatérgica recurrente. Los cultivos se estimularon con 300 PA a 20 Hz, generando un campo eléctrico suficiente para activar las neuronas situadas entre los dos electrodos y simular la llegada de potenciales de acción al terminal sináptico. 4 Registro de la liberación vesicular analizada como cambios de fluorescencia de sypHy mediante la grabación de imágenes en tiempo real, empleando el software HCLmage 1.0. 5 Análisis de las secuencias grabadas mediante el software Image J. Se seleccionaron regiones de interés (ROI) que comprenden aproximadamente el área de una sinapsis. Mediante la aplicación del script Wavemetrics de Igor Pro, se c s c s d i m requ PS/ - I n - B D - I n n Figu r para sináp t los c u cultiv o c alculó el i s eleccionar o c orrespond e s ypHy que c d e ROI con m agen per o Para deter m iere de act i -secretasa n hibición d e B loqueo de D 385A. n hibición d n euronas p r r a 38. Esque m el análisis d t ica fluoresce n u ltivos infecta o expresan s y i ncremento o n dos po b e a los ter m c ontactan a trol definid o o que no c o m inar si la i vidad de P (Figura 38 ) e la activid a la función d e la expr e r ocedentes m a represent e liberación n te sypHy m e dos se co-tr a y pHy, pero s o máximo d b laciones d m inales me a la dendrit a o s como si ntactan a l a liberación d S, se empl e : a d -secret a d e PS med e sión de P de ratones a tivo del pro vesicular. G e diante el em a nsfectaron c o o lo aquellos t e infección d e fluores c d e ROI d e diados por a que exp r i tios de re s a dendrita t r d e vesícul a e aron tres a a sa median t d iante el us o P S1 y PS2 KO para P o ceso de infe eneración de pleo de lenti v o n HA-Nlg1 y erminales qu e c encia (∆F ) e ntro de c a HA-Nlg1 v r esa DsRe d s puesta de r ansfectad a a s sináptica s a bordajes d t e la incub a o de LV qu e mediante S 2 y floxea c ción-transf e cultivos de n v irus específi c y DsRed2. Vi r e contactan c transfec c ) durante e a da experi m v isualizado s d , y una se g sypHy den a con H A -N l s mediada s d e inhibició n a ción con D A e expresan el empleo dos para el e cción del e n n euronas que c os de neuro n r tualmente to d c on dendritas c ión RESULT A el estímul o m ento, un a s como siti o g unda pobl n t r o de la m lg1/DsRed. s por neur e n de la acti A PT. el mutant e o de cultiv o l gen de P S n sayo experi m e expresan la n as. Posterior m d as las sinap s que sobreex p A DOS 117 o . Se a que o s de ación m isma e xinas vidad e PS1 o s de S 1. m ental sonda m ente, s is del p resan RESULTADOS 118 HA-Nlg1, identificadas mediante la co-expresión de DsRed2, dependen del sistema de adhesión de neurexinas-neuroliguinas. Los paneles inferiores muestran esquemáticamente las modificaciones del sistema empleadas para bloquear la función de PS. El ensayo experimental empleado conjuntamente con los tres abordajes de inhibición de PS, nos permitió comparar la liberación de neurotransmisores en sinapsis no mediadas y mediadas por HA-Nlg1 y analizar el efecto de la inhibición de PS respecto a las neuronas control. La liberación sináptica se estudió como cambios en la fluorescencia de la sonda sypHy debido a la estimulación con 300 PA, estímulo suficiente para provocar la exocitosis/endocitosis del RRP y, parcialmente, del contingente de reserva de las vesículas sinápticas. Los resultados de liberación vesicular obtenidos con cada una de las aproximaciones se describen a continuación. 4.3.2.1 Análisis de la liberación de vesículas sinápticas en cultivos de neuronas con la actividad -secretasa inhibida por DAPT En primer lugar, se estudió la liberación analizada con sypHy de los terminales sinápticos formados sobre las dendritas transfectadas con HA-Nlg1 (sinapsis mediadas por HA-Nlg1) y fuera de las dendritas transfectadas (sinapsis control) en dos situaciones experimentales: sin tratar y tratadas con DAPT. Para ello, se empleó el ensayo experimental explicado anteriormente, pero añadiendo DAPT al cultivo durante las últimas 12 horas antes de proceder con la estimulación (Figura 38). El DAPT se mantuvo en la solución de perfusión. De esta forma, se pretendió mantener inhibida la actividad PS/-secretasa desde la expresión de HA-Nlg1. Durante el análisis, se observó que las neuronas respondieron al estímulo de 300 PA de manera eficiente, ya que la secuencia de imágenes registrada presentó un incremento de fluorescencia que coincidió en todo momento con el estímulo (Figura 39A). El F de las sinapsis control (reclutamiento de sypHy en sitios que no contactan con las dendritas transfectadas con HA-Nlg1) y de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (sitios de respuesta de sypHy que contactan con las dendritas transfectadas con HANlg1), se cuantificó en las dos situaciones experimentales (Figura 39). En neuronas no tratadas con DAPT, el ∆F de sypHy de las sinapsis medidas por HA-Nlg1 aumentó 3,4 veces respecto a las sinapsis control situadas en la proximidad (Figura 39D). El tratamiento con DAPT disminuyó un 33% el ∆F de sypHy de las RESULTADOS 119 sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (Figura 39D). Sin embargo, el ∆F de sypHy de las sinapsis control no se afectó por la presencia de DAPT (Figura 39). Estos resultados sugirieron que la expresión de HA-Nlg1 en la neurona postsináptica incrementa la liberación vesicular en los terminales presinápticos mediados por neurexinas. Por otra parte, la inhibición de la actividad PS/-secretasa con DAPT reduce la liberación de vesículas sinápticas específicamente en las sinapsis mediadas por el sistema de neurexinas-neuroliguinas. Estos datos sugieren que la liberación de neurotransmisores en sinapsis inducidas por β-neurexinas requiere de PS.  Figura 39. Efecto de la inhibición de la actividad -secretasa por DAPT sobre la liberación de vesículas sinápticas en las sinapsis mediadas por neurexinas-neuroliguinas. A) Neuronas infectadas con sypHy y co-transfectadas con DsRed2 y HA-Nlg1, tratadas o no con DAPT. Se representan los cambios de la fluorescencia de sypHy antes, durante y después de la aplicación de 300 PA a una frecuencia de 20 Hz. B,C) Representación de la cinética de la fluorescencia de sypHy en sinapsis control (B) o en sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (C). Las curvas están normalizadas a la situación experimental RESULTADOS 120 sin tratamiento con DAPT y provienen de un experimento representativo. D) Representación gráfica de los F de las sinapsis control y de las mediadas por HA-Nlg1, tratadas o no con DAPT. Los valores de F están normalizados a las sinapsis control de la situación experimental sin tratar con DAPT. Los datos se presentan como medias±error estándar, son promedios de tres experimentos independientes. Cultivos no tratados con DAPT: n=21 neuronas, >900 ROI por condición. Cultivos tratados con DAPT: n=21 neuronas, >750 ROI por condición. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (***) p<0.001. Barra de escala en A: 5μm. La diminución del F en las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 al inhibir la actividad -secretasa se podría deber a una reducción en los niveles de HA-Nlg1, a una disminución en el número de vesículas sinápticas o a sinapsis que responden menos al estímulo. Para descartar entre estas posibilidades, se analizaron los niveles de sypHy y de HA-Nlg1. Para ello, tras los experimentos de estimulación, los cultivos se fijaron y se cuantificaron los niveles de sypHy por fluorescencia directa y los de HANlg1 con un anticuerpo contra HA. El análisis de las imágenes de confocal mostró niveles de intensidad de HA-Nlg1 similares entre neuronas sin tratar y tratadas con DAPT (119,72±4,83, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos control vs 125,23±4,07, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos tratados con DAPT) (Figura 40A y Figura 40B), descartando una menor liberación por menor expresión de HA-Nlg1. Respecto al área e intensidad de sypHy en las dendritas que expresan HA-Nlg1, no se observaron diferencias significativas entre la condición sin tratar y tratada con DAPT (0,67±0,02 y 133,36±2,37, área relativa e intensidad promedio de sypHy en cultivos control vs 0,60±0,03 y 133,95±2,97, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos tratados con DAPT) (Figura 40A y Figura 40C), demostrando que ni la capacidad sinaptogénica ni el reclutamiento de vesículas sinápticas inducido por HA-Nlg1 está afectado por DAPT. El conjunto de estos resultados sugirieron que la disminución del F se podría deber a sinapsis que responden en menor medida al estímulo. RESULTADOS 121  Figura 40. Cuantificación de los niveles de fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cultivos tratados con DAPT. A) Neuronas infectadas con sypHy y co-transfectadas con HA-Nlg1 y DsRed2, tratadas o no con DAPT. Tras la fijación, las neuronas se procesaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo contra la etiqueta HA a fin de identificar las células transfectadas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se detectaron por fluorescencia directa. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador, obtenidas a partir de secciones ópticas consecutivas. B) Cuantificación de la intensidad promedio de los pixeles de HA-Nlg1 en las dendritas transfectadas. C) Cuantificación del área de sypHy normalizada a la superficie dendrítica (gráfica izquierda), y de la intensidad promedio de los píxeles positivos de sypHy en las dendritas transfectadas (gráfica derecha). Los datos se presentan como medias±error estándar, son promedios de tres experimentos independientes (n=20 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student. Barra de escala: 5μm.  RESULTADOS 128 sinápticos identificados por Vglut1 no expresaban GFP, permitiendo su análisis con sypHy (véase más adelante). Estos datos aseguraban un efecto de las proteínas Cre en la práctica totalidad de las células del cultivo.  Figura 44. Expresión lentiviral de Cre y Cre en cultivos de neuronas. Cultivos de neuronas de hipocampo de embriones fPS1/fPS1; PS2-/- se infectaron a los 3 días in vitro con vectores lentivirales que expresan Cre y Cre. Tras 9 días de infección, las neuronas se fijaron y se procesaron para inmunofluorescencia con anticuerpo contra el marcador sináptico Vglut1 (rojo en la colocalización). La expresión de Cre y Cre se visualizó por inmunofluorescencia directa de GFP. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. Barra de escala: 5μm.  Una vez confirmada la generación de cultivos KO de PS, mediante la expresión lentiviral de Cre con el consiguiente acúmulo de los CTFs de las neurexinas, se procedió al estudio de la actividad de los terminales sinápticos inducidos sobre las dendritas transfectadas con HA-Nlg1 (sinapsis mediadas por HA-Nlg1) y fuera de las dendritas transfectadas (sinapsis control) en dos situaciones experimentales: en cultivos control (sin infectar e infectados con Cre) o en cultivos infectados con Cre. Para ello, se empleó el ensayo experimental explicado anteriormente (Figura 38), con modificaciones: co-infección de sypHy con el LV Cre o Cre. - En un primer experimento se procedió al análisis de las respuestas de sypHy resultantes de un cultivo fPS1/fPS1; PS2+/- que arrojó los siguientes resultados: Se cuantificó el F de las sinapsis control (sitios de respuesta de sypHy que no contactan con las células transfectadas con HA-Nlg1) y de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (sitios de respuesta de sypHy que contactan con las células transfectadas RESULTADOS 129 con HA-Nlg1), en cultivos sin infectar o infectados con Cre. En neuronas sin infectar con Cre, el F de sypHy de las sinapsis mediadas por Nlg1 aumentó 3,1 veces respecto a las sinapsis control (Figura 45D). Sin embargo, la infección de Cre disminuyó un 52% el ∆F de sypHy de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (Figura 45D). Asimismo, el ∆F de sypHy de las sinapsis control en los cultivos infectados con Cre disminuyó un 37% (Figura 45D). - En un segundo experimento, se analizó la respuesta de sypHy obtenida de un cultivo fPS1/fPS1; PS2-/- infectado con Cre o Cre: En cultivos de neuronas sin infectar con Cre, el F de sypHy de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 aumentó 3,8 veces respecto a las sinapsis control (Figura 46D). La infección de Cre disminuyó un 53% el ∆F de sypHy de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (Figura 46D). Sin embargo, el ∆F de sypHy de las sinapsis control no se afectó en ninguna de las condiciones. La infección del mutante Cre no tuvo ningún efecto (Figura 46D). Los resultados obtenidos demuestran que la inactivación de la expresión de PS en neuronas de hipocampo reduce la liberación presináptica en sinapsis mediadas por el sistema de neurexinas-neuroliguinas. Estos datos, que confirman los resultados obtenidos con las dos aproximaciones anteriores con DAPT y con el mutante de PS1 D385A, sugieren además que los terminales inducidos por neurexinas requieren de una actividad de PS para mantener la liberación vesicular. El procesamiento por PS de isoformas de neurexinas, como β-neurexinas, en el terminal presináptico podría ser esencial para aspectos claves de la liberación vesicular, de forma que en ausencia de función de PS, el procesamiento anómalo de neurexinas podría afectar a la ruta sináptica mediada por neurexinas y a la liberación del neurotransmisor. RESULTADOS 130 Figura 45. Análisis de la fluorescencia de sypHy en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2+/- infectadas con Cre. A) Neuronas infectadas con sypHy o co-infectadas con Cre, se cotransfectaron con DsRed2 y HA-Nlg1. Se representan los cambios de la fluorescencia de sypHy antes, durante y después de la aplicación de un estimulo de 300 PA a una frecuencia de 20 Hz. B,C) Representación de la cinética de la fluorescencia de sypHy en sinapsis control (B) o en sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (C). Las curvas están normalizadas a la situación experimental sin infectar con Cre y provienen de un experimento representativo. D) Representación gráfica de los F de las sinapsis control y de las mediadas por HA-Nlg1, en la condición infectada o no con Cre. F normalizados a las sinapsis control de la situación experimental sin infectar. Los datos se presentan como medias±error estándar de un experimento. Cultivos no infectados con Cre: n=5 neuronas, >220 ROI por condición. Cultivos infectados con Cre: n=4 neuronas, >160 ROI por condición. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (***) p<0.001. Barra de escala: 5μm. RESULTADOS 131 Figura 46. Análisis de la fluorescencia de sypHy en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectadas con Cre o Cre. A) Neuronas infectadas con sypHy o co-infectadas con sypHy y Cre o el mutante Cre, se co-transfectaron con DsRed2 y HA-Nlg1. Se representan los cambios de la fluorescencia de sypHy antes, durante y después de la aplicación de 300 PA a una frecuencia de 20 Hz. B,C) Representación de la cinética de la fluorescencia de sypHy en sinapsis control (B) o en sinapsis mediadas por HA-Nlg1 (C). Las curvas están normalizadas a la situación experimental sin infectar con Cre y provienen de un experimento representativo. D) Representación gráfica de los F de las sinapsis control y de las sinapsis mediadas por HA-Nlg1, en cultivos no infectados o infectados con Cre o Cre. F normalizados a las sinapsis control de la situación experimental sin infectar. Los datos se presentan como medias±error estándar de un solo experimento. Cultivos no infectados: n=5 neuronas, >215 ROI por condición. Cultivos infectados con el mutante Cre: n=4 neuronas, >130 ROI por condición. Cultivos infectados con Cre: n=6 neuronas, >220 ROI por condición. La significación estadística se evaluó RESULTADOS 132 mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Bonferroni, (***) p<0.001. Barra de escala: 5μm. Para estudiar posibles alteraciones en el reclutamiento de vesículas sinápticas y en los niveles de HA-Nlg1 al inhibir la expresión de PS, se analizaron los niveles de sypHy y de HA-Nlg1. Para ello, tras los experimentos de estimulación, los cultivos se fijaron y se cuantificaron los niveles de sypHy por fluorescencia directa y los de HANlg1 con un anticuerpo contra HA. El análisis de las imágenes de confocal mostró lo siguiente: Cultivos fPS1/fPS1; PS2+/-: Los niveles de intensidad de HA-Nlg1 resultaron similares entre las neuronas sin infectar o infectadas con Cre (117,89±4,43, intensidad de HANlg1 en cultivos control vs 110,74±8,06, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos infectados con Cre) (Figura 47A y Figura 47B). La cuantificación del área e intensidad de sypHy en las dendritas que expresan HA-Nlg1 no presentó diferencias significativas entre la condición sin infectar e infectada con Cre (0,66±0,01 y 115,72±1,99, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos control vs 0,68±0,05 y 113,94±5,06, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos infectados con Cre) (Figura 47A y Figura 47C). Cultivos fPS1/fPS1; PS2-/-: Los niveles de intensidad de HA-Nlg1 resultaron homogéneos entre las neuronas sin infectar e infectadas con Cre o Cre (126,60±2,07, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos control; 112,67±4,13, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos infectados con Cre y 122,59±2,55, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos infectados con Cre) (Figura 48A y Figura 48B). La cuantificación del área e intensidad de sypHy en las dendritas que expresan HA-Nlg1, no presentó diferencias significativas entre la condición sin infectar e infectada con Cre o Cre (0,43±0,03 y 143,15±2,34, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos control; 0,57±0,07 y 141,42±5,66, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos infectados con Cre y 0,67±0,03 y 145,12±0,89, área relativa e intensidad de sypHy en cultivos infectados con Cre) (Figura 48A y Figura 48C). Los resultados reproducen los datos obtenidos con las dos aproximaciones anteriores y muestran que la inactivación de PS no afecta a la densidad de vesículas sinápticas en terminales mediados por HA-Nlg1 y que, por tanto, la disminución del F se podría deber a una menor liberación de los terminales en respuesta al estímulo. RESULTADOS 133  Figura 47. Cuantificación de la fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2+/- infectadas con Cre. A) Neuronas infectadas con sypHy o co-infectadas con sypHy y Cre, se co-transfectaron con DsRed2 y HA-Nlg1. Tras la fijación, las neuronas se procesaron para inmunofluorescencia contra la etiqueta HA para identificar a las células transfectadas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se detectaron por fluorescencia directa. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. B) Cuantificación de la intensidad promedio de los pixeles de HA-Nlg1. C) Cuantificación de pixeles totales de sypHy normalizados a la superficie dendrítica (gráfica izquierda) y de la intensidad promedio de los pixeles de sypHy en las dendritas transfectadas (gráfica derecha). Los datos se presentan como medias±error estándar de un experimento independiente: n=10 células por condición. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student. Barra de escala: 5μm.  RESULTADOS 134 Figura 48. Cuantificación de la fluorescencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectadas con Cre o Cre. A) Neuronas infectadas con sypHy solo o en combinación con Cre o Cre, se co-transfectaron con DsRed2 y HA-Nlg1. Tras la fijación, las neuronas se procesaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-HA para detectar las células transfectadas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se detectaron por fluorescencia directa. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. B) Cuantificación de la intensidad promedia de los pixeles dendríticos de HA-Nlg1. C) Cuantificación de los pixeles totales de sypHy normalizados a la superficie dendrítica (gráfica izquierda), y de la intensidad promedio de los pixeles de sypHy en las dendritas transfectadas. Los datos se presentan como medias±error estándar de un único experimento (n=7 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Bonferroni. Barra de escala: 5μm.  A continuación se estudió el reclutamiento de vesículas sinápticas empleando un marcador sináptico endógeno, Vamp2. Este análisis solo se realizó en neuronas fPS1/fPS1; PS2-/- infectadas con Cre o infectadas con Cre. La cuantificación no RESULTADOS 135 mostró diferencias significativas en la intensidad de Vamp2 entre neuronas infectadas con Cre y las infectadas con Cre (122,22±5,92, intensidad de Vamp2 en cultivos control vs 109,87±2,72, intensidad de Vamp2 en cultivos infectados con Cre) (Figura 49A y Figura 49C). Sin embargo se observaron diferencias significativas en el área de Vamp2 entre ambas condiciones experimentales (0,64±0,04, área relativa en cultivos control vs 0,48±0,04, área relativa en cultivos infectados con Cre) (Figura 49A y Figura 49C). Los niveles de HA-Nlg1 resultaron similares en ambas condiciones (141,90±7,14, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos control vs 121,26±8,86, intensidad de HA-Nlg1 en cultivos infectados con Cre) (Figura 49A y Figura 49B). Estos resultados empleando dos marcadores de vesículas sinápticas, sypHy y Vamp2, indican que el reclutamiento de vesículas sinápticas en las sinapsis mediadas por HA-Nlg1 no se encuentra afectado cuando se inhibe la expresión de PS, descartando la posibilidad que una disminución en el número de vesículas sinápticas sea la principal causa de la menor respuesta de sypHy.   Figura 49. Cuantificación de la fluorescencia de Vamp2 en cultivos de neuronas de hipocampo fPS1/fPS1; PS2-/- infectados con Cre o Cre. A) Cultivos de neuronas infectadas con LV que expresa RESULTADOS 136 Cre o Cre se transfectaron con HA-Nlg1. La localización de Ha-Nlg1 y Vamp2 se estudió por inmunofluorescencia. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. B) Cuantificación de la intensidad promedio de los pixeles de HA-Nlg1. C) Cuantificación de los pixeles totales de Vamp2 normalizados a la superficie dendrítica (gráfica izquierda), y de la intensidad promedio de los pixeles de Vamp2 en el área de las dendritas transfectadas (gráfica derecha). Los datos se presentan como medias±error estándar de un experimento independiente (n=10 células por condición. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (**) p<0.05. Barra de escala: 5μm.  4.4 IMPLICACIONES DE LA FUNCIÓN DE PS EN LA DISTRIBUCIÓN DE LIGANDOS DE NEUREXINAS. Los resultados anteriores mostraron un papel de PS en la regulación de la liberación de los terminales presinápticos mediados por neurexinas. Estos datos sugirieron la posibilidad de que la función presináptica de dichos terminales estuviera regulada por la actividad de PS hacia sus sustratos presinápticos. De esta forma, una falta de función de PS induciría el procesamiento anómalo de sus sustratos que podría contribuir a los defectos sinápticos observados en las neuronas deficientes en PS. Una vez demostrado que las neurexinas son sustratos presinápticos de PS, nos planteamos la posibilidad de que la interacción de neurexinas hacia sus ligandos sinápticos dependiera de la función de PS. Los resultados obtenidos se describen en este bloque. 4.4.1 Análisis de la asociación de β-neurexinas con PS mediante ensayos de co-inmunoprecipitación en células Hek 293T Tras identificar que las neurexinas se procesan por PS in vitro e in vivo, se analizó la existencia de un posible complejo formado por PS y β-neurexina. Para ello, se transfectaron células Hek 293T con las siguientes construcciones de HA-βNrx1: HAβNrx1 WT, HA-βNrx1 C, HA-βNrx1 LNG, HA-βNrx1 GPI. Estas construcciones contienen deleciones en el dominio citoplásmico (HA-βNrx1 C), en la región LNG del dominio extracelular (HA-βNrx1 LNG) y en la regiones transmembrana y citoplásmica pero conservando el dominio extracelular (HA-βNrx1 GPI) (Figura 50A). Como control se transfectó PS1 WT. Posteriormente, las células se lisaron y una décima parte del lisado se procesó por Western blot con los anticuerpos anti-HA y anti PS. El anticuerpo anti-HA mostró la expresión de las diferentes construcciones de neurexinas con sus tamaños esperados, mientras que el anticuerpo anti-PS1 reveló el NTF de PS1 en todos los lisados junto con una banda adicional de 50 kDa correspondiente a la RESULTADOS 137 holoproteína en los lisados transfectados con PS1 WT (Figura 50B). El resto del lisado se sometió a inmunoprecipitación con el anticuerpo de PS1 y los inmunoprecipitados se analizaron mediante Western blot con los anticuerpos anti-HA y anti PS1. El anticuerpo contra PS1 verificó la inmunoprecipitación de PS1 de los lisados celulares (Figura 50B). La presencia adicional de la banda correspondiente a la holoproteína de PS1 en los inmunoprecipitados transfectados con PS1, confirmaron la especificidad del anticuerpo (Figura 50B). El anticuerpo anti-HA detectó la presencia de HA-βNrx1 WT y de cada una de las mutaciones ensayadas en los inmunoprecipitados. Estos resultados sugirieron que HA-βNrx1 forma un complejo con PS1. Por otra parte, nuestros datos indicaron que la ausencia del dominio LNG extracelular, de la región transmembrana o del dominio citoplásmico no inhibe la formación del complejo. El hecho de que la zona yuxtamembrana del dominio extracelular no estuviera delecionada en ninguna de las construcciones ensayadas, apunta a un posible papel de esta región en la formación de complejos con PS1.  Figura 50. PS forma un complejo con β-neurexina1 en células Hek 293T. A) Esquema representativo de las distintas construcciones de deleción de HA-βNrx1. B) Las células Hek 293T se transfectaron con las diferentes construcciones de HA-βNrx1 o con PS1 WT. Los lisados celulares y los inmunoprecipitados anti-PS1 se analizaron por Western blot usando el anticuerpo anti-HA y el anticuerpo anti-PS1, como se indica. RESULTADOS 144 glutamatérgicos inducidos por el sistema neurexinas-neuroliguinas de neuronas deficientes en PS1.  Figura 54. Reclutamiento de CASK en sinapsis mediadas por HA-Nlg1 en neuronas deficientes en PS1. A) Neuronas de hipocampo se infectaron o no a los 3 días in vitro con vectores lentivirales que expresan GFP, PS1 o el mutante PS1 D385A. Tras 9 días de infección, los cultivos se transfectaron con HA-Nlg1 y se procesaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo contra CASK (azul en la colocalización) y contra la etiqueta HA (rojo en la colocalización). Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. B) Cuantificación del reclutamiento de CASK en dendritas que expresan HA-Nlg1. C) Cuantificación de la intensidad promedio de los píxeles positivos para CASK en las dendritas transfectadas. Los datos se presentan como medias±error estándar, promedios de tres experimentos independientes (n>24 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Bonferroni, (***) p<0.001. Barra de escala: 5μm. Posteriormente, y para comprobar los resultados anteriores, se analizaron los niveles de CASK reclutados a las sinapsis mediadas por el sistema de neurexinasneuroliguinas en cultivos KO de PS. La activación de neurexinas se consiguió mediante la transfección de neuroliguinas en cultivos de neuronas de hipocampo generados a partir de embriones de ratón fPS1/fPS1; PS2-/- infectados con LV Cre o RESULTADOS 145 Cre. Además, para confirmar los resultados obtenidos en experimentos previos empleando dominantes negativos de PS (Figura 32 y Figura 34), en paralelo se cuantificaron los niveles de neurexinas con el anticuerpo cyto-neurexina en los cultivos KO de PS. Los datos mostraron el incremento esperado tanto en área como en intensidad de fluorescencia en neuronas infectadas con Cre respecto a las infectadas con Cre (0,64±0,04 y 178,60±5,20; área e intensidad promedio de neurexinas en cultivos infectados con Cre vs 0,43±0,04 y 161,71±3,73, área e intensidad promedio de neurexinas en cultivos infectados con Cre) (Figura 55A y Figura 55B). Figura 55. Reclutamiento de CASK y neurexinas en neuronas de hipocampo KO de PS. A) Cultivos de neuronas de hipocampo generados a partir de embriones fPS1/fPS1; PS2-/- infectados con LV que expresan Cre o Cre se transfectaron con HA-Nlg1. Tras la transfección, las neuronas se analizaron por inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-CASK y cyto-neurexina. Se muestran imágenes de confocal con la proyección máxima de fluorescencia para cada marcador. Cuantificación de píxeles totales normalizados a la superficie dendrítica e intensidad promedio de los píxeles positivos para neurexinas (C) o para CASK (D). Los datos se presentan como medias±error estándar de un único experimento (n=10 RESULTADOS 146 células por condición). La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico de la t de Student, (***) p<0.001; (**), p<0.05. Barra de escala: 5μm.  De forma interesante, la cuantificación de CASK mostró un incremento significativo tanto en el área como en la intensidad en neuronas infectadas con Cre respecto a las infectadas con Cre (0,53±0,05 y 114,63±3,10, área e intensidad promedio de CASK en cultivos infectados con Cre vs 0,28±0,03 y 102,21±1,51, área relativa e intensidad promedio de CASK en cultivos infectados con Cre) (Figura 55A y Figura 55C). Si bien por disponibilidad de tiempo sólo se pudo analizar un único cultivo, los resultados obtenidos reproducen los datos observados con el empleo del mutante PS1 D385A y muestran que el bloqueo de la función de PS aumenta el reclutamiento de CASK en terminales mediados por HA-Nlg1. En conjunto, estos datos sugieren que la asociación de neurexinas con CASK puede estar regulada por PS y que la inhibición de esta ruta podría contribuir a la reducción en la liberación de vesículas observada en las sinapsis mediadas por neurexinas en cultivos defectivos en PS. 4.4.6 Posibilidad de un mecanismo alternativo de regulación génica El complejo PS/-secretasa está involucrado en el corte del CTF anclado a la membrana de más de 60 proteínas integrales de membrana tipo I, liberando los ICD en el citosol (Parks y Curtis, 2007; Beel y Sanders, 2008; Lleo, 2008). En algunos casos, como con APP y Notch, el ICD se trasloca al núcleo y regula la transcripción de genes dianas (Koo y Kopan, 2004). En el caso de las neurexinas, la actividad proteolítica de PS debería liberar el dominio intracelular de las neurexinas, que se debería detectar con el anticuerpo cyto-neurexina como una banda de menor tamaño molecular (aproximadamente 6-7 KDa) y la consiguiente desaparición del sustrato de 12-16 KDa (CTF). En ninguno de los ensayos bioquímicos realizados en esta Tesis, se detectó la presencia del ICD de las neurexinas, debido probablemente a una rápida degradación de éste por el proteosoma, como ocurre con otros sustratos de PS (Restituito et al., 2011). Por tanto, para estudiar la distribución del ICD de las neurexinas, se generó por PCR el dominio intracelular soluble de β-neurexina-1 (Nrx1-ICD). Posteriormente se transfectaron células Hek 293T con Nrx1-ICD o con HA-βNrx1 en presencia y ausencia de DAPT y tras 24 horas de expresión se analizaron los extractos celulares mediante Western blot, usando el anticuerpo cyto-neurexina. Dicho anticuerpo detectó el ICD RESULTADOS 147 como una banda de ~ 7 KDa, con una mayor movilidad electroforética que los CTFs de las neurexinas (Figura 56A). El DAPT incrementó los niveles de los CTFs de βneurexina. Sin embargo, no afectó los niveles del ICD, ya que éste no proviene del procesamiento proteolítico del CTF, sino de la propia sobreexpresión (Figura 56A).  Figura 56. Expresión y localización del ICD de neurexinas. A) Las células Hek 293T se transfectaron con vector vacío (control), HA-βNrx1 o Nrx1-ICD y se incubaron en presencia o ausencia DAPT, como se indica. La expresión de los CTFs y de Nrx1-ICD se analizó por Western blot usando el anticuerpo cytoneurexina. El panel inferior muestra los resultados obtenidos con un tiempo de exposición mayor. B) Las células Hek 293T se co-transfectaron con GFP y HA-βNrx1 o Nrx1-ICD y se analizaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo cyto-neurexina (rojo en la colocalización). GFP se detectó por RESULTADOS 148 fluorescencia directa (verde en la colocalización). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul en la colocalización). En el panel inferior se muestra una proyección xz mostrando la localización nuclear de Nrx1-ICD comparada con la localización en la membrana del HA-βNrx1. Barra de escala: 5μm. Estos resultados sugirieron que el anticuerpo cyto-neurexina podría detectar el ICD de las neurexinas ante un acúmulo. Para estudiar la posible localización nuclear del ICD de β-neurexina, se co-transfectaron células Hek 293T con GFP y HA-βNrx1 o βNrx-ICD. Tras 24 horas de expresión las células se fijaron con metanol y se procesaron por inmunofluorescencia con el anticuerpo cyto-neurexina. Los núcleos se tiñeron con DAPI. En células transfectadas con βNrx1-ICD, el anticuerpo cytoneurexina mostró una tinción concentrada en el núcleo y extendida en el citoplasma. Dicha localización nuclear se verificó en proyecciones xy y xz de imágenes de microscopía confocal (Figura 56B). Por lo tanto, la localización nuclear del ICD de neurexinas sugiere un papel potencial no explorado en regulación génica. 4.5 IMPLICACIONES DEL PROCESAMIENTO DE NEUREXINAS EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 4.5.1 Efecto diferencial de las mutaciones de PS1 asociadas con FAD en el procesamiento de β-neurexina-1 Mutaciones autosómicas dominantes en los genes de PS1 y PS2 son la principal causa de la mayoría de las formas familiares de la enfermedad de Alzheimer (FAD). Una característica de esta enfermedad es la acumulación de placas de β-amiloide (Aβ) procedentes del procesamiento proteolítico del APP por el complejo PS/-secretasa. Mutaciones en PS1 asociadas con FAD alteran el procesamiento de APP, llevando a un incremento de la relación Aβ42/ Aβ40, que da lugar a una mayor formación de oligómeros y formas fibrilares (Chen y Glabe, 2006; Wolfe, 2007). Tras demostrar el procesamiento de las neurexinas por PS/-secretasa, nos preguntamos si mutaciones en PS1 asociadas con FAD podrían afectar al procesamiento de neurexinas. Para analizar el efecto de mutaciones en PS1 asociadas con FAD en el procesamiento de β-neurexina-1, se optó por un abordaje experimental realizado por el Dr. Carlos A. Saura. Para ello, células MEF WT y KO de PS se transfectaron con vector vacío o se co-transfectaron con HA-βNrx1 solo o en combinación con PS1 WT o las siguientes mutaciones asociadas a FAD: PS1 M146L, PS1 H163R, PS1 C410Y, E9. El análisis de los lisados celulares mediante Western blot con el anticuerpo cytoneurexina mostró el incremento esperado de los CTFs de β-neurexina-1 en células RESULTADOS 149 MEF KO de PS que no se observó en las células MEF WT (Figura 57A y Figura 57B). La co-expresión de PS1 WT rescató el procesamiento proteolítico de las neurexinas, ya que los niveles de los CTFs se redujeron a los niveles detectados en las células MEF WT (Figura 57A). Estos resultados confirmaron que la actividad PS/-secretasa se requiere para un correcto procesamiento de neurexinas. Los mutantes de PS1 asociados con FAD, M146L y H163R, también rescataron el procesamiento normal de HA-βNrx1 (Figura 57A). Por el contrario, la co-expresión de los mutantes de PS1 asociados con FAD, E9 y C410Y, no llevó a una reducción significativa de los niveles de los CTFs (Figura 57A). Como control positivo se midieron los niveles del CTF de Ncadherina, un sustrato conocido de PS. La expresión de PS1 WT y los mutantes de PS1 M146L y H163R disminuyeron la acumulación endógena del CTF de N-cadherina en MEF KO de PS, mientras que la expresión de PS1 C410Y y PS1 E9 no alteraron los niveles del CTF de N-cadherina (Figura 57A). Para investigar si los efectos observados con los mutantes asociados a FAD se debían a defectos en la funcionalidad del complejo -secretasa generado o a la falta de incorporación de los mutantes en dicho complejo, se analizaron los niveles de nicastrina como medida indirecta de la formación del complejo. Experimentos de Western blot mostraron dos bandas de nicastrina: una banda de mayor peso molecular correspondiente a la forma madura glicosilada de la proteína, mayoritaria en las células MEF WT; y una banda de menor peso molecular correspondiente a la proteína inmadura, mayoritaria en las células MEF KO de PS. Estos datos concuerdan con el requerimiento de la formación de un complejo activo de -secretasa para la maduración de nicastrina (Edbauer et al., 2002; Leem et al., 2002a; Yang et al., 2002). La expresión de PS1 WT y de los mutantes asociados con FAD aumentó los niveles de la forma madura de nicastrina en todos los casos, indicativo de la incorporación al complejo -secretasa. Es de notar que la maduración de nicastrina fue menor con los mutantes PS1 C410Y y PS1 E9 (Figura 57A). Por otro lado, el análisis de la expresión de PS1 reveló que los mutantes PS1 C410Y y PS1 E9 carecen de actividad endoproteolítica debido a la ausencia del fragmento CTF generado por proteolisis de PS1 (Figura 57A). Estos resultados indicaron que algunas mutaciones de PS1 asociadas a FAD causan una pérdida de función en el procesamiento de neurexinas en células MEF KO de PS y sugirieron que dicho procesamiento anormal de las neurexinas podría estar asociado con la AD. RESULTADOS 150  Figura 57. El procesamiento de β-neurexina-1 está afectado por los mutantes de PS1 asociados con FAD. A) Células MEF WT y MEF KO de PS se transfectaron con vector vacío o co-transfectaron con HA-βNrx1 y las siguientes construcciones: vector vacío, PS1 WT y los mutantes de PS1 asociados a FAD, M146L, H163R, C410 o DE9. Los lisados celulares se analizaron mediante Western blot usando los anticuerpos cyto-neurexina (Nrx), N-Cadherina (N-Cadh), PS1 y Nicastrina (NCT). La expresión de PS1 fue confirmada por Western blot con dos anticuerpos diferentes, el anticuerpo anti-PS1 N-terminal que reconoce PS1 humana (PS1) y el anticuerpo ab2 que reconoce PS1 de ratón (mPS1). La forma completa de PS1 en torno a 50 KDa se endoproteoliza generando un CTF en torno a 18-20 KDa. Se usó como control de carga β-actina. B) Análisis cuantitativos de los niveles relativos de los CTFs de neurexinas normalizados con respecto a la media de expresión obtenida para la forma madura de Nrx. Los datos se presentan como medias±error estándar, promedios de tres experimentos independientes. La significación estadística se evaluó mediante el test estadístico ANOVA seguido del test de comparación múltiple Tukey, (***) p<0.001. RESULTADOS 151 4.5.2 Acumulación de los CTFs de las neurexinas en ratones transgénicos que expresan mutaciones de PS1 asociadas con FAD La enfermedad de Alzheimer familiar constituye solo el 5% del total de casos de Alzheimer (Rocchi et al., 2003), pero la identificación de sus bases moleculares ha sido extremadamente importante para el hallazgo de mutaciones en los genes APP, PS1 y PS2, responsables de las formas hereditarias de esta enfermedad (Price y Sisodia, 1998). Estos descubrimientos han llevado al desarrollo en los últimos años de diferentes modelos animales transgénicos que, aunque no reproducen la totalidad de las características de la AD, sí proporcionan una valiosa información sobre su patogénesis. En los experimentos anteriores mostramos que mutaciones en PS1 asociadas con FAD afectan diferencialmente al procesamiento de neurexinas in vitro. Para confirmar estos datos in vivo se estudió el procesamiento de las neurexinas en dos modelos de ratones dobles transgénicos de PS1xAPP que sobreexpresan ambas proteínas humanas con mutaciones asociadas a FAD. Estos ratones son considerados buenos modelos de la AD (Schmitz et al., 2004). El Dr. Javier Vitorica, de la Universidad de Sevilla, nos proporcionó extractos de hipocampo procedentes de ratones PS1 M146LxAPP, que expresan el mutante de PS1 M146L y la forma mutada de APP751-SL, y de ratones PS1 E9xAPP, que sobreexpresan el mutante de PS1 E9 y la forma mutada de APP695-S. Estos ratones a partir de 3-4 meses presentan placas de péptido β-amiloide que van aumentando conforme lo hace la edad del animal (Blanchard et al., 2003). Los niveles de neurexinas y del péptido Aβ en lisados de ratones transgénicos de 4 y 18 meses se analizaron por Western blot con los anticuerpos cyto-neurexina y 6E10, respectivamente, y se compararon con lisados obtenidos de ratones control. El anticuerpo 6E10 mostró un acúmulo de la banda de 4,5 kDa que coincide con el peso molecular de Aβ en su forma monomérica en los lisados de los ratones transgénicos de 4 meses, que no fue apreciable en el lisado del ratón PS1 E9xAPP (Figura 58A). En los lisados de ratones transgénicos de 18 meses se observó que el acúmulo del monómero de β fue superior en el lisado del ratón PS1 M146LxAPP que en el lisado del ratón PS1 E9xAPP (Figura 58B). Estos resultados son los esperados según los datos obtenidos por el grupo de investigación del Dr. Javier Vitorica. El anticuerpo cyto-neurexina detectó un aumento significativo de los CTFs de las neurexinas en los lisados de los ratones dobles transgénicos de 4 y 18 meses, respecto al control. La comparación entre ambos mutantes mostró una mayor acumulación de los CTFs de las neurexinas en el mutante de PS1 E9xAPP, sugiriendo un mayor efecto del RESULTADOS 152 mutante PS1E9 en el procesamiento de las neurexinas (Figura 58A y Figura 58B). En paralelo, la inhibición del procesamiento de los CTFs de neurexinas en el mutante PS1E9 estuvo asociada a una reducción de los niveles de la proteína madura. Estos resultados indican que el procesamiento de neurexinas está afectado in vivo en modelos animales que reproducen mutaciones asociadas con FAD. Asimismo, nuestros datos sugieren que un procesamiento defectuoso de neurexinas puede estar asociado con la enfermedad de Alzheimer en humanos.  Figura 58. El procesamiento de las neurexinas está afectado en ratones transgénicos que expresan mutantes de PS1 asociados con FAD. Extractos de hipocampo de animales controles y de dobles transgénicos, PS1 M146LxAPP y PS1 E9xAPP, que expresan mutaciones de PS1 y de APP asociadas con FAD, a dos edades del desarrollo, 4 meses (A) y 18 meses (B), se analizaron por Western blot con el anticuerpo cyto-neurexina (Nrx) y con el 6E10 (Aβ). Los ratones que expresan mutaciones en PS1 y en APP fallan el procesamiento de las neurexinas.  5 DISCUSIÓN   