Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TESIS DOCTORAL INMUNOLOCALIZACIÓN DE LA SUSTANCIA P Y DEL RECEPTOR NK1 EN LAS ESTRUCTURAS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL IMPLICADAS EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER-KRAEPELIN Amparo Murciano Rosado Sevilla 2015 Agradecimientos Mi más profundo agradecimiento a mis directores de tesis. Al Dr. D. Miguel Muñoz Sáezpor su amor por el conocimiento, su necesidad de transmitir su saber y entusiasmo a todoel que esté dispuesto a recibirlo. A la Dra. Dña. Inmaculada Bueno Rodríguez por su dedicación, paciencia y disponibilidad. Por su Amistad desde la infancia y por liarme en este mundo de la investigación. A mi bisabuelo Ramón, mi abuelo Gabriel, mi tía Carmen y mi tío y padrino Ramón, a mis hermanos Antonio y Montserrat y a mi sobrina Mª Paz, tronco y sabia antigua y nueva del amor por la medicina familiar. A todos mis compañeros y amigos que me han facilitado la realización de este trabajo. A Dña Ana Moreno, responsable de Doctorado de la Universidad de Sevilla, por sus consejos y orientación que han sido claves. A Dña Isabel Mª Rodríguez del Nodo coordinador del Biobanco del SSPA, Dña Carolina Castilla, del Nodo de Biobanco de Sevilla y a Dña Carmen Pérez del Nodo de Biobanco de Córdoba, por su interés y disponibilidad en la gestión de las muestras. A D. Andrés Carranza, Patólogo de Hospital UniversaitaioVirgen del Rocío y DñaMaría García Martos, Patóloga del Hospital Universitario del Sureste de Madrid, por su disponibilidad y colaboración en el proceso de inmunohistoquímica. A mi padre, por los consejos y por el amor que me han brindado siempre, por ser un ejemplo de generosidad, trabajo, honradez y por estar ahí. A mis hermanos, que me han ofrecido siempre suayuda sus palabras de ánimo y su ejemplo. A mis sobrinos, en especial a Javier, con los que he compartido horas de estudio. A Manu, mi marido, por su apoyo y paciencia, y por haber padecido mi ausencia. Espero que este trabajo aporte un grano de arena, un poco de luz a la ciencia en la búsqueda de la mejoradel manejo terapéutico y pronóstico de los pacientes con Alzheimer, por todos nuestros pacientes, sus familias y los venideros. Tengo presente a Dios en todo lo que hago, que me acompaña y me da fuerzas. Mi fe enDios me guía y me ayuda en los momentos difíciles, es el pilar de mi vida. A mamá, luz y guía de todos mis pasos. Y voy apaciguando las palabras, las acaricio, las ordeno y, dueño, las reparto y las lanzo, bien maduras, a la cara del hombre de mi tiempo Antonio Murciano hidrógeno en blanco, nitrógeno en azul, oxígeno en rojo y flúor en amarillo (Modificado de Rosso ML, Muñoz M y Berger, 2012, p. 10). ......................................... 115 Figura 38. Los antagonistas de los RNK1 podrían bloquear la fisiopatológico acciones mediadas por la SP (Muñoz y Coveñas, 2014) ............................................................... 116 Figura 39. Acciones antagonistas RNK1 (Muñoz y Coveñas, 2015). ............................................... 123 Figura 40. Figura: Desarrollo de los cambios neurofibrilares desde el estadio I hasta el estadio VI en la formación hipocampal,regiones entorrinal y transentorrinal y la neocorteza temporal. U: Uncus; Pa: Parasubiculum; Pr: Presubiculum;S: Subiculum; RE: Región Entorrinall; RT: Región Transentorrinalll; IT: Isocorteza Temporal; CA1: PrimerSector de la Callosidad del Cuerpo Ammon. (Modificado de Braak y cols., 1995). ............................................................................................................................. 130 Figura 41. Anatomía del Hipocampo............................................................................................... 137 Índice de tablas Tabla 1. Diferencias entre los criterios NINCDS-ARDRA y NIA-AA ................................................. 63 Tabla 2. Clasificación de los neurotransmisores según el tipo de molécula y mecanismo de acción (Guyton & Hall, 2011 modificada) ........................................................................ 75 Tabla 3. Estructura de las Taquicininas. (en negrita se destaca el residuo que varía dentro de la estructura conservada, marcada como subrayado). ............................................... 78 Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 17 1. Introducción 1.1. Justificación La EA es reconocida en la actualidad como un problema creciente en el orden médico, epidemiológico, sociológico y económico. Se estima que al nivel mundial esta enfermedad afecta entre 18 y 22 millones de personas, y esta cifra llegará a 34 millones en el año 2025, fecha para la cual la población mayor de 65 años se duplicará de 390 a 800 millones (Robert PH, 2005; Barry R. 1996).La Enfermedad de Alzheimer es la demencia más prevanlente. Es progresiva y limitante para el paciente, además del deterioro cognitivo y funcional característico de estos pacientes, se añaden alteraciones neuropsicológicas, con trastornos de conducta que pueden ser severos, generando deterioro en los pacientes y gran sobrecarga en sus cuidadores. A esto se suman las consecuencias emocionales, asícomo la repercusión a nivel social, que conllevan un deterioro en la calidad de vida de los pacientes. Asimismo este tipo de demencia tiene importantes repercusiones económicas desdeel punto de vista de la necesidad de atención sanitaria, la morbilidad y el aumento de mortalidad que se asocia. Requieren alto consumo de recursos sociales, precisando muchos de ellos ingresos hospitalarios frecuentes y/o la institucionalización en centro residencial, por difícil manejo domiciliario. Por todo ello, desde hace años se está realizando una ardua investigación en el campo deLa enfermedad de Alzheimer para mejorara el conocimiento de su fisiopatología así como en búsquedade sustancias que ayuden a preservar la integridad neuronal, disminuyendo así losefectos deletéreos de la neurodegeneración. 1.2. Enfermedad de alzheimer o demencia tipo alzheimer –kraepelin 1.2.1. Definición La Enfermedad de Alzheimer-Kraepelin (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo e irreversible. Se defi ne por placas con depósitos extracelulares del péptido betaamil oide (Aβ) y la formación intracelular de ovillos neurofibrilares (ONF), integrados por proteína tau hiperfosforilada –la cual se asocia al microtúbulo hiperfosforilado– y neuritas distróficas –tales como densidades sinápticas reducidas–, particularmente en la región del cerebro involucrada en el aprendizaje y la memoria (Thompson A et al. 2008). Todo lo cual conduce a incapacidad cognitiva y conductual grave y a la muerte. Actualmente no hay cura para la EA. Los Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 18 tratamientos comunes gravitan en la terapia farmacológica y ocupacional (Gil-Gregorio P 2008). A nivel práctico, ante un paciente con deterioro cognitivo, debemos plantearnos si éste ha sido de instauración aguda (delirium o síndrome confusional), o insidiosa o crónica (demencia). En ambos casos deberemos estudiar el posible factor desencadente. Dentro de las demencias, hay diferentes etiologías, siendo la EA la más frecuente. Concepto de demencia:La palabra demencia proviene del latín, deriva de ``dementia, dementiae’’ que significa estado de deterioro progresivo de las facultades mentales, caracterizado por la disminución o pérdida de la mente, es decir, ausencia de pensamiento, caracterizado en líneas generales por un curso crónico. Rasgos que hacen clara la diferenciación con el delirium (RAE). Síndrome Confusional agudo (Delirium): Constituye uno de los diagnósticos diferenciales del síndrome demencia. Es un síndrome clínico caracterizado por una alteración aguda o subaguda de la conciencia/atención y de las capacidades mentales, y con una tendencia a las fluctuaciones a lo largo del día. Este trastorno acostumbra a ser reversible, de corta duración y acompañarse de manifestaciones asociadas en los ámbitos del ciclo vigilia-sueño, comportamiento psicomotor y emociones. Es importante reconocer sus rasgos clínicos, factores de riesgo y los datos diferenciales con la demencia. Factores de riesgo más comunes son edad, la polifarmacia, y las enfermedades médicas concomitantes. Las variables que predicen la aparición de delirium en ancianos son la afectación cognitiva, la comorbilidad médica, depresión y alcoholismo (Bermejo et al 2002). La demencia es un síndrome clínico plurietiológico, que implica deterioro intelectual respecto a un nivel previo, por lo general crónico, pero no necesariamente irreversible ni progresivo. Este deterioro intelectual implica una afectación de las capacidades funcionales del sujeto, suficiente para interferir sus actividades sociolaborales (Gª de la Rocha ML et al. 2002). Caracterizándose por un déficit adquirido en más de un dominio cognitivo, que reduce de forma significativa la autonomía funcional. Tanto el deterioro de la memoria como el del pensamiento y el razonamiento deben mostrarse con estudio neuropsicológico y ser informados por un explorador. Se apunta que el déficit cognitivo se acompaña, por lo general, u ocasionalmente es precedido, por un deterioro en el control emocional, el comportamiento social o en la motivación. El deterioro en la actividad cotidiana depende en buena medida de factores socioculturales. La demencia cursa frecuentemente con síntomas conductuales y psicológicos (SCPD), también denominados síntomas conductuales y emocionales o síntomas neuropsiquiátricos. Aproximadamente un 80% de los enfermos con demencia presenta SCPD en algún momento de su evolución (Molinuevo JL et al. 2009). Desde el punto de vista clínico, el conocimiento de algunos rasgos diferenciales van a influir en diagnóstico diferencial y por tanto hay que realizar evaluación para identificar posibles demencias reversibles, o cuadro Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 19 agudo diferenciándolo claramente, del cuadro del delirium o estado confusional agudo. Este último puede superponerse a cuadro con demencia de base. Figura 1. Zonas afectadas en EA en relación con su función Causas de demencia: Las más relevantes y/o potencialmente reversibles Vasculares: multiinfarto, estado lacunar, enfermedad de binswanger, infarto estratégico vasculitis: lupus, panarteritis nodosa, arteritis de la arteria temporal. Infecciosas: complejo demencia-sida, neurolúes, encefalitis herpética, enfermedad de whipple, meningoencefalitis brucelosa, tuberculosa, otras. Abcesos cerebrales. Tóxicas: Etilismo crónico, fármacos. Neoplásicas: tumores cerebrales primarios o metastásicos, síndromes paraneoplásicos, meningitis carcinomatosa. Traumáticas: Hematoma subdural crónico, demencia postraumática, demencia pugilística. Desmielinizantes: esclerosis múltiple. Miscelánea: Hidrocefalia normotensiva, Epilepsia, Sarcoidosis cerebral (Alayón A et al. 2009) La EA es un proceso degenerativo cerebral caracterizado por el depósito patológico de sustancias proteicas insolubles dentro y fuera de las neuronas, lo que se acompaña de una aceleración en el ritmo normal de pérdida celular que acontece con el paso del tiempo. La EA es la forma más común de demencia, es incurable y progresiva. Aparece con mayor frecuencia Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 20 en personas mayores de 65 años de edad.Por lo general, el síntoma inicial es la inhabilidad para adquirir nuevas memorias, pero suele confundirse con actitudes relacionadas con el proceso de envejecimiento o el estrés. Ante la sospecha de Alzheimer, el diagnóstico se realiza con evaluaciones de conducta y cognitivas, así como pruebas de neuroimagen Las estrategias farmacológicas diseñadas para rescatar o proteger el tejido dañado van orientadas bien a promover el crecimiento y la función neuronal, bien a interferir con los procesos neurotóxicos subyacentes (Saura C. 2012) 1.2.2. Historia El patólogo alemán Alois Alzheimer, que vivió entre los años 1864 - 1915. Celebrándose en 2015 el centenario de su fallecimiento(Egelhardt E et alt.2015). Fue el 3 de noviembre de 1906, cuando Alzheimer el neurocientífico alemán presentó el caso clínico y los hallazgos patológicos resultados de la autopsia de una mujer de 51 años, llamada Auguste D, que había padecido una grave demencia(Alzheimer A. 1907), en una reunión de Psiquiatras (XXXVII Reunión de Psiquiatras del Suroeste de Alemania celebrada en Tubingen) publicándose el caso en 1907, titulado ‘’ Sobre una enfermedad peculi ar (enigmática) del córtex cerebral’’. Y en 1910, Kraeplin la ident ifica como entidad diferenciada e inmortaliza el apellido Alzheimer (Martinez Lage JM et al. 2006).Los síntomas de la enfermedad como una entidad nosológica definida fueron identificados por Emil Kraepelin (1856-1926), mientras que la neuropatología característica fue observada por primera vez por Alois Alzheimer en 1906. Así pues, el descubrimiento de la enfermedad fue obra de ambos psiquiatras que trabajaban en el mismo laboratorio, en Munich, Alemania. Sin embargo, dada la gran importancia que Kraepelin daba a encontrar la base neuropatológica de los desórdenes psiquiátricos, decidió nombrar la enfermedad Alzheimer en honor a su compañero (Albert MJ et al, 2014). A. Alzheimer Emil Kraepelin Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 21 Cuando Alzheimer publicó su primer caso, Auguste D, quedó intrigadísimo por la edad de inicio del cuadro (51 años), por sus síntomas y por la enorme abundancia de ONF neocorticales, intraneuronales que se teñían con el método argéntico de Bielchowsky. La del precipitado de plata había sido descubierto por Golgi en 1873, la del nitrato de plata reducido por Cajal en 1903 (Engelhardt E et alt.2015). Junto con las preparaciones del segundo enfermo, Johann F., increíblemente las muestras sobrevivieron a dos guerras mundiales Auguste Deter Si Alzheimer publicó el caso el 3 de noviembre de 1906, un mes después, el 10 de diciembre de Santiago Ramón y Cajal (1952-34) y Camilo Golgi (1943-26) recibieron el Premio Nobel "en reconocimiento a su trabajo en la estructura del sistema nervioso". Estos hechos parecen no estar relacionados, pero en el Museo Cajal existen 37 preparaciones histológicas de material de pacientes que sufren de la EA, revelando que Cajal estudió también esta enfermedad (García-Marin et al 2007). Resulta sorprendente que muy pocas de las enseñanzas de Alzheimer han tenido que ser revisadas o corregidas. (Martinez Lage JM et al. 2006). El motivo por el que Kraepelin bautizó a la enfermedad fue basado en la estrecha colaboración entre ambos Kraepelin y Alzheimer. Kraepelin reconoció el mérito de su descripción anatomoclínica (Martinez Lage JM, Khachaturian ZS. 2011) . Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 22 A principios del siglo xx, el término ‘demencia’ servía para designar todo tipo de enfermedades mentales. Los hallazgos neuropatológicos descritos por Alzhiemer, sin embargo, estos hallazgos se consideraron muy raros durante muchos años, ya que la causa de la demencia que era descrita como habitual era el ‘endurecimiento de las arterias’. (Thomas M et al 1987). Durante mucho tiempo, las denominaciones de demencia ‘senil’ y ‘presenil’ en función de la edad de aparición del cuadro clínico, se mantuvieron como si fueran entidades nosológicas diferenciadas, pero en los años sesenta el grupo de Blessed demostró que aquellos pacientes con demencia senil eran indistinguibles neuropatológica y clínicamente de aquellos casos más jóvenes descritos como enfermedad de Alzheimer (EA)(Blessed G, 1968) La base de la Hipótesis colinérgica, en 1968 aparece L-Dopa, primer medicamento que controlaba de manera espectacular los síntomas de la EP, ya se había demostrado que en la E Parkinson el núcleo estriado deja de sintetizar dopamina por denervación nigroestriatal. En este contexto David Drachman dedicó su esfuerzo para estudiar las bases de la memoria, en 1974 compara la pérdida de memoria de pacientes de EA con la que ocurren a los pacientes tratados con escopolamina, que se usaba como anestésico y borraba la memoria durante el acto quirúrgico. La escopolamina anula la acción de la acetilcolina, que es esencial para formar memorias, evocar recuerdos y para el aprendizaje, formulando la hipótesis de que en la EA podría existir déficit de acetilcolina. Así surgieron los primeros medicamentos, la tacrina, se utilizaba por anestesistas tras la cirugía para revertir efectos de la escopolamina, con inicialmente excelente respuesta, que no se verificó en estudios posteriores, donde además se detectó hepatotoxicidad grave, por lo que cayó en desuso. Apareciendo anticolinestarásicos de 2ª generación, como donezepilo en 1996, rivastigmina en 1998, y galantamina en 2000, todos ellos mejoran temporalmente la sintomatología, pero no detienen el avance de la enfermedad. Además, existe en la EA una disfunción glutamatérgica (hiperfunción) con excitotoxicidad y muerte neuronal. En 2002, se aprobó el uso de memantina, antagonista del receptor N-metilD-aspartato, para tratar a los enfermos en fase moderada a grave (Molinuevo JL et al, 2009) 1.2.3. Epidemiología Hoy en día, la EA se ha convertido en la enfermedad neurodegenerativa progresiva más común y la forma más común de demencia entre las personas de edad (Jiang T. et al 2012 y 2013). Afecta a 24,3 millones de personas en el mundo y las proyecciones para el año 2040 alcanzarán a 81,1 millones de pacientes con EA (Ferri CP, 2005). Todos los estudios epidemiológicos han confirmado que la edad es el principal factor de riesgo para el desarrollo de una demencia; de manera que tanto la prevalencia como la incidencia prácticamente se duplican cada 5 años a partir de los 65 años de edad (Rocca WA 1991). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 23 Dado el incremento de la esperanza de vida y el progresivo envejecimiento de la población en los países desarrollados y en vías de desarrollo, se comprende que la demencia represente un enorme reto para los sistemas de salud públicos de esas sociedades. Diferentes revisiones sistemáticas sobre estudios epidemiológicos realizados en Europa han concluido que la prevalencia de la demencia oscila entre el 5-10% entre la población de más de 65 años(Lobo A eta al 2000; Qiu C et al 2007; Berr C et al. 2005) y que existen unos 5 millones de personas enfermas (Waldemar G et al. 2007). Existe también coincidencia en que la EA es la demencia más frecuente (60-70% de los casos, seguida de la demencia vascular 12,5-25%)(Qiu C, 2007). En España, los estudios epidemiológicos en la población de más de 65 años han mostrado cifras de prevalencia que oscilan entre el 5-14,9% y en el grupo de más de 70 años entre el 917,2%. (Molinuevo JL et al, 2009; Casado I. et al. 2009). A nivel europeo el estudio EURODEM (investigación epidemiológica multicéntrica de demencias) ha recogido datos epidemiológicos de diferentes países, aportando información de gran interés. Los resultados publicados a partir de 1999 arrojan importantes datos de la frecuencia e impacto de enfermedades neuropsiquiátricas en ancianos europeos. En relación con las demencias estimó que aproximadamente 3.286.000 personas en la UE la padecen y que surgen 824.000 casos nuevos por año. (eurodem) (Launer LJ, 2000). 1.2.4 Características clínicas de la EA La EA es una condición neurodegenerativa progresiva con rasgos clínicos y patológicos distintivos. Comienza de manera insidiosa y se caracteriza por un deterioro progresivo de las facultades cognitivas y de la capacidad de funcionamiento. Figura 2. Progresión en el deterioro de las actividades cotidianas Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 24 La pérdida de memoria a corto plazo, una característica común en las etapas iniciales de la enfermedad, continúa avanzando. El paciente ve disminuida su capacidad para recordar sucesos recientes, pierde la capacidad de comunicarse, sufre incontinencia y rigidez motora hasta que finalmente le sobreviene la muerte. En las últimas etapas de la enfermedad se observan cambios de las funciones motora y sensorial y de la conducta. (Small GW. 1998). Figura 3. Sucesión de parámetros biológicos y clínicos en la enfermedad de Alzheimer. DCL: deterioro cognitivo leve; SPCD: síntomas psicológicos y conductuales de demencia (LópezÁlvarez J et al, 2015). 1.2.5. Neuropatología en la EA: Neuropatológicamente, la EA se evalúa mediante examen macro y microscópico. La EA está caracterizada por la degeneración y muerte de neuronas en regiones cerebrales esenciales para el procesamiento de la memoria. En la histopatología de la EA se destaca una severa atrofia de la corteza cerebral, por pérdida de neuronas corticales y subcorticales y de conexiones dendríticas en áreas de la corteza y del hipocampo, formación de las denominadas placas seniles y ovillos neurofibrilares en los cuerpos neuronales (Ávila J. 2000). La secuencia patológica comienza preferentemente en las estructuras del lóbulo temporal medio, responsable de la memoria y luego progresa a las áreas frontal, temporal y parietal, Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 25 con preservación relativa de las regiones motoras, regiones corticales sensoriales y regiones subcorticales (Hu WT et al 2010; y SNS 2011: http://www.guiasalud.es/GPC/GPC_484_Alzheimer_AIAQS_compl.pdf). Examen macroscópico se observa atrofia global de los hemisferios cerebrales que afecta tanto la corteza como la sustancia blanca y los núcleos subcorticales, respetando el cerebelo y el tronco cerebral. La atrofia afecta preferentemente al hipocampo, la amígdala y la corteza entorrinal. Sin embargo, el grado de atrofia macroscópica es muy variable y coincide parcialmente con el observado en el envejecimiento normal. Por lo tanto, la atrofia macroscópica es poco útil para el diagnóstico de EA. Figura 4. Cerebro normal y EA Examen microscópico: Cuando se hace un examen microscópico del cerebro de estos enfermos, se aprecian una serie de cambios degenerativos que afectan a multitud de neuronas integradas en los circuitos nerviosos responsables del mantenimiento de las actividades cerebrales cognitivas; de hecho, muchas neuronas mueren, sobre todo en zonas como la corteza cerebral y el hipocampo, generándose una serie de lesiones características de esta enfermedad denominadas marañas neurofibrilares y placas seniles (Giannakopoulos P,1998). Las tinciones de rutina demuestran pérdida neuronal en corteza y en varios núcleos subcorticales, incluyendo el núcleo basal de Meynert. El diagnóstico microscópico de EA Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 32 La EA, es la causa más frecuente de demencia, es una enfermedad compleja en la que factores ambientales y genéticos interactúan para dar lugar al fenotipo final. Existen tres genes que se han asociado a formas preseniles autosómicas dominantes de la enfermedad: el gen que codifica para la proteína precursora del péptido Aβ (APP) y los genes de las presenilinas (PSEN1 y PSEN2). Un cuarto gen, el gen de la apolipoproteína E (APOE), es el único gen mayor de susceptibilidad para las formas, tanto esporádicas como familiares, tardías, de EA. Aunque se han realizado miles de estudios genéticos, se conoce poco sobre la arquitectura genética de la EA. Aun así, en los últimos años ha habido un salto cualitativo extraordinario gracias a la utilización de las novedosas tecnologías de genotipado masivo (desde 2007), las cuales han permitido un análisis exhaustivo del genoma. (Bettens K et al, 2013) Desde el punto de vista genético, la producción del péptido amiloide está condicionada por el estado del propio gen de la PPA, del gen BACE (origen de la beta-secretasa) y de los genes de las Presenilinas 1 y 2 (donde están codificadas varias porciones de la gamma-secretasa) Una de las evidencias más importantes del papel del amiloide en la EA es la existencia de familias con mutaciones en el gen de la PPA con el desarrollo de la enfermedad. Otra prueba viene determinada por la trisomía 21 (síndrome de Down), ya que en todos los casos se desarrollan lesiones típicas de la EA hacia los 40 años de edad. En esta enfermedad, las personas tienen una copia extra del cromosoma 21. (López deMuniain A, 1998) Los genes implicados en estas mutaciones son el gen codificador de la APP. (Chartier-Harilin MC et al, 1991) y los genes que codifican a las presenilinas, presenilina-1 (PS1) (Schellenberg GD et al 1992) y presenilina-2 (PS2). (Levy-Lahad E et al, 1996) Los pacientes con síndrome de Down presentan una doble copia del cromosoma 21 donde está localizado el gen codificador de la APP. Los pacientes con síndrome de Down que vivan hasta los 40 ó 50 años tendrán más riesgo de desarrollar la EA. (Rubinsztein DC. 1997) Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 33 Figura 5. Factores genéticos asociados a la EA Las formas familiares de EA constituyen <5% del total de casos de EA, siendo secundarias a mutaciones hereditarias, han ofrecido una aproximación para el análisis de los mecanismos moleculares implicados en la patogénesis de la enfermedad. Se ha utilizado el estudio y conocimiento de la EA familiar como punto de partida, para avanzar en la comprensión de los otros mecanismos biológicos envueltos en la neurodegeneración de la enfermedad. La sustancia βA está formada por péptidos, los principales de los cuales son el βA-40 y el βA-42, ambos formados a partir de la proteína precursora de amiloide(APP) mediante la acción de las enzimas β-secretasa (BACE1) y γ-secretasa. La síntesis de esta proteína depende de su correspondiente gen, el APP, que está localizado en el cromosoma 21 . (Acosta GB, 2013). Mutaciones en 3 genes, los que presentan una herencia autonómica dominante, han sido asociadas a la EA familiar (las cuales representan menos del 5% de los casos y que en general se inicia a edades más tempranas que la forma no-familiar, denominada EA esporádica). Los genes afectados son los que codifican para el APP, la presenilina 1 (PS1) y la presenilina 2 (PS2). Además, el genotipo apoE4 (apolipoproteina E4) es un factor de riesgo que muestra una correlación alta con el desarrollo de EA. ApoE4 aparentemente influye tanto en la formación de depósito de βA, como en la formación de ONF. Un elemento común para la EA familiar y EA esporádica es la acumulación de Aβ. Debido a esto se propuso la hipótesis de la cascada del amiloide, la cual establece que la producción excesiva de Aβ es la causa primaria de la enfermedad (Von Bernhardi R, 2005). Hasta el momento se han identificado 5 cromosomas implicados en su patogenia: 1, 12, 14,19 y 21. La primera mutación se describió en el gen de la proteína precursora de amiloide en el cromosoma 21 (los pacientes con síndrome de Down de más de 40 años desarrollan cambios similares que los enfermos de EA (López de Munain A, 1998; Cacabelos R et al, 1994; Schenk D et al, 1999). La posesión, por herencia, del gen Apo E-4, en el cromosoma 19 parece ser uno de los factores mejor caracterizados para posibilitar la aparición de la EA. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 34 La Apo E es una proteína plasmática implicada en el transporte del colesterol y otros lípidos en los diferentes tejidos. Es sintetizada primariamente por el hígado y el cerebro, y constituye la principal apolipoproteína expresada en el tejido cerebral, preferentemente en la glía. El gen Apo E tiene 3 isoformas: E2, E3 y E4. La más frecuente es la E3 (constituye el 78 % de los alelos presentes en población caucasiana) y la menos frecuente es la E2 (constituye el 7 %). Se ha observado que el E4 (15 % de alelos en población caucasiana) aumenta el riesgo de padecer la EA mientras que el E2 probablemente reduce el riesgo o es un gen protector. Sin embargo, muchas personas con EA no tienen el gen tipo E4 de la misma manera que otras personas con el gen E4 no desarrollan la enfermedad. Una copia de cada gen es heredada de cada padre, por lo que cada quien tiene 2 copias del gen Apo E. Aquellos que heredaron 2 Apo E-4, tienen mayor riesgo de desarrollar la EA, pero no todos los que los tengan, necesariamente la desarrollarán. Muchos otros genes pueden estar asociados con el riesgo de padecerla, pero el tamaño del riesgo, asociado con cada uno de estos genes es mucho menor que el del Apo E (Huang Y. 2006) 1.2.7. Fisiopatología de la EA Se han postulado para explicar el proceso degenerativo de la EA varias hipótesis: la hipótesis de la cascada amiloide, la hipótesis colinérgica y la teoría de la desconexión cerebral, excitotoxicidad, estrés oxidativo e inflamación (Angoa P et al, 2007) y otras que iremos detallando a continuación. Mecanismos moleculares y celulares Todavía no se ha establecido con precisión el mecanismo patogénico de la enfermedad. Sin embargo, parece ser un trastorno heterogéneo, con interrelación de una serie de factores genéticos y adquiridos a lo largo de la vida. Avances en estudios celulares y moleculares revelan que la formación de Aβ y otros derivados de la proteína precursora de amiloide son los principales responsables de los cambios en el cerebro de pacientes con EA, se incluyen además la disfunción mitocondrial y de neurotransmisores, el estrés oxidativo, la inflamación, los trastornos neuroinmunes y tróficos. Todos ellos convergen en un síndrome de demencia cuando se han perdido un número crítico de dendritas y sus conexiones sinápticas (Whitehouse PJ et al, 1982). Para los trastornos tales como la EA, que tienen causas heterogéneas, el tratamiento necesita en última instancia apuntar mecanismos moleculares subyacentes. La clasificación molecular racionalizará los ensayos clínicos y facilitará la futura toma de decisiones clínicas(Bettens K et al, 2013). Existen varios mecanismos de daño que están presentes en la EA, varios de ellos además serían comunes a diversas patologías neurodegenerativas. Así, la EA probablemente corresponde a un proceso de múltiples etapas que incluye eventos ambientales, epigenéticos y genéticos, lo que concuerda con las evidencias clínico-epidemiológicas y experimentales. La contribución relativa en la EA de cada uno de los mecanismos expuestos es probablemente Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 35 diferente para distintos individuos. La EA parece asociarse a un fenotipo pro-inflamatorio, con aumento de la reactividad glial y de la actividad citotóxica en el SNC. La disminución de la agregación proteica, del estrés oxidativo, el daño mitocondrial, la respuesta inflamatoria y la acumulación de metales pesados, como también el restablecimiento de la neurotransmisión y bloquear la excitotoxicidad son aproximaciones terapéuticas experimentales hoy día, pero que pueden demostrar ser beneficiosas como tratamiento el día de mañana ( Acosta GB, 2013). En un sentido general, tanto los ovillos como las placas neuríticas podrían ser precedidos por uno o varios pasos bioquímicos que podrían no resultar aparentes por la identificación de las proteínas que componen estas lesiones. Hasta ahora no se ha identificado un solo factor como la causa de la EA. Es probable que una combinación de factores, incluyendo la edad, la herencia genética, la dieta y el estado de salud en general (Herrera-Rivero M, 2010) Figura 6. Los procesos causados por Aβ y las intervenciones terapéuticas disponibles. (T. Jiang et al.2012) A continuación analizaremos las diferentes teorías fisiopatológicas: 1. Tª Cascada amiloide 2. Teoría proteína Tau 3. Tª Desconexión cortical 4. Tª Colinérgica 5. Otros neurotransmisores relevantes en la EA Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 36 Así como fenómenos fisiopatológicos concurrentes relevantes en el desarrollo de la EA (¿causa o consecuencia?) 6. Daño Oxidativo 7. Neuroinflamación 8. Neurogénesis Hipótesis o Teoría de la cascada amiloide: En 2002, John Hardy propuso "hipótesis amiloide", hizo hincapié en la acumulación de Aβ como los eventos patológicos iniciales y en la progresión de la EA (Hardy J et al, 2002). Basada en las características neuropatologías de la EA, que se caracteriza principalmente por la formación de placas neuríticas extracelulares que contienen el péptido Aβ y la acumulación intraneuronal de ONF constituidos por la proteína tau hiperfosforilada. En un cerebro normal se pro duce un péptido denominado Aβ que tiene dos isoformas Aβ40 y Aβ42 , ambos formados a partir de la PPA mediante la acción de las enzimas β-secretasa (BACE1) y γ-secretasa. La síntesis de esta proteína depende de su correspondiente gen, el APP, que está localizado en el cromosoma 21. (Acosta GB, 2013) Aβ42 es más hidrofóbica, más propensa a formar agregados, se considera una isoforma neurotóxica y es el componente mayoritario de las placas seniles. En condiciones fisiológicas se produce sobre todo Aβ40, mientras que los pacientes con EA tienen una elevada producción de Aβ42. Muchos estudios han encontrado que una sobreproducción de este péptido tiene efectos neurotóxicos. Se ha comprobado la formación de placas seniles con depósitos extracelulares Aβ y ONF que contienen a la proteína tau hiperfosforilada (Pagani L et al. 2011). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 37 Figura 7. Vías amiloidogénica y no amiliodogénica, lugar de acción de posibles terapias modificadoras de enfermedad. Sin embargo, aunque una sobreproducción Aβ tiene un efecto negativo sobre las células nerviosas, bajas concentraciones pueden potenciar a largo plazo el hipocampo y mejorar la memoria (Sun X et al, 2012). Los niveles de Aβ elevado induce a depósitos; los niveles de Aβ bajo, protegen (Reynaldo G et al, 2008) Figura 8. Placa beta-amiloide en preparación post-mortem de tehido cerebral de un paciente con EA Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 38 Las placas de amiloide contienen productos del procesamiento de la PPA, que tienden a agregarse formando sábanas beta-plegada, que son tóxicas. La PPA es una proteína que se encuentra inserta –engastada– en la membrana neuronal y está relacionada con fenómenos como la plasticidad neuronal, la extensión de las ramas neuronales, la formación de sinapsis y del esqueleto neuronal, la regulación del calcio que entra en el interior de las neuronas y otros procesos no del todo conocidos. La PPA es una proteína de membrana con una región extracelular de gran tamaño, un dominio transmembrana único y una región citoplasmática pequeña. Aunque se desconoce su función con certeza, se piensa que podría tener función como un factor de crecimiento. La isoforma que se encuentra en el sistema nervioso contiene sitios de unión a heparina y a cobre. Este último podría regular la dimerización o el procesamiento proteolíco del APP, o bien podría funcionar como un transportador de metales. Todavía no está claro el mecanismo medi ante el cual el Aβ produce daño celular. Se plantea la existencia de diversas maneras mediante las cuales podría dañar a las neuronas: activando la microglia (células del sistema inmune innato del sistema nervioso central - SNC), activando la respuesta inflamatoria y liberación de citoquinas neurotóxicas y produciendo daño oxidativo en células vecinas, induciendo mecanismos de apoptosis, dificultando la perfusión por la acumulación de amiloide en capilares y arteriolas y afectando los contactos sinápticos interneuronales. El péptido Aβ también puede unir metales, lo cual induciría el cambio conformacional hacia sábana beta-plegada, lo que resultaría en un aumento de su agregación. Figura 9. Estructura y procesamiento del APP Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 39 El depósito extracelular del péptido amiloide es el factor fundamental, aunque no único, en el desarrollo de la enfermedad, y es debido bien a un aumento en su producción, por predominio de la vía amiloidogénica, bien a una disminución en su aclaramiento. El depósito de amiloide, origen de las llamadas placas neuríticas observadas al microscopio, produce diversos efectos perniciosos para el funcionamiento neuronal, como un daño en los receptores colinérgicos, una disfunción de la transmisión glutamatérgica, o un bloqueo en la acción de factores tróficos necesarios para el buen mantenimiento del sistema nervioso (neurotrofinas o factores de crecimiento), además de generar un cierto grado de inflamación tisular y de toxicidad en el medio en el que se desarrollan las células nerviosas (excitotoxicidad), y un aumento de los radicales libres y el estrés oxidativo al que éstas están expuestas, todo lo cual conduce a una pérdida neuronal acelerada. La conexión descrita entre el depósito amiloide y la disfunción colinérgica reúne conceptualmente las dos principales hipótesis etiológicas de la EA, y ayuda a entender el efecto protector que algunos autores atribuyen a los pro-colinérgicos a largo plazo. ¿Qué es l o que causa la acumulación del Aβ? Para contestar a esta pregunta debemos recordar lo que ocurre en la mayoría de las enfermedades genéticas: las mutaciones causan una alteración en la función biológica de la proteína afectada. Por tanto, se puede explicar de manera análoga, la amiloidosis en ausencia de mutaciones de PPA por varios mecanismos que podrían alterar la función biológica de PPA. Estos mecanismos puede incluir alteraciones en otras proteínas que interaccionen con PPA (secretasas, lipoproteínas o chaperonas) o insultos ambientales, tales como la oxidación de la PPA o de A β. Un gran reto en el campo de la PPA sería la identificación de factores que aumentan el procesamiento amiloidogénico de la PPA en la EA esporádica. La producción de amiloide es la consecuencia de un procesamiento anormal de PPA, quizás de forma independiente del nivel de expresión de PPA o de una falta de eliminación de péptidos amiloide producidos anormalmente (Guimerá A et al, 2002). Ovillos neurofibrilares: proteína Tau y EA En la EA se observa degeneración neurofibrilar (DNF) debida a la acumulación intracelular de ONF, formados por agregados insolubles de otra proteína, en este caso la proteína tau (implicada también en el trasporte de sustancias por el axón neuronal, al servir como estabilizadora de la estructura interna de la neurona). Las neuronas mantienen su forma gracias a una serie de filamentos, el citoesqueleto, que está formado por microfilamentos, microtúbulos (en los que interviene la proteína tau) y neurofilamentos. Esta estructura no es rígida, pero mantiene la estructura interna. También el calcio tiene un papel importante en este proceso. Una clase de proteínas que participan en la regulación de los microtúbulos y su función, entre estas proteínas está la proteína tau, que están codificadas por un gen situado en el cromosoma 17. En la EA, las proteínas tau, que están anormalmente fosforiladas, se agregan en filamentos helicoidales apareados. Esta fosforilación (o incorporación de un fosfato Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 40 a una molécula) anormal se realiza con intervención del amiloide y de calcio y da lugar a la formación de unas variantes patológicas de la proteína tau. Estos procesos tienen lugar en determinadas áreas del cerebro selectivas y vulnerables, especialmente en el hipocampo y la corteza parietal y frontal. Esta agregación anormal de filamentos helicoidales condiciona, posiblemente, una alteración de las propiedades de los microtúbulos neuronales, que como consecuencia quedan deformados, perdiendo capacidad funcional. La agregación de Tau reduce su habilidad para estabilizar los microtúbulos, y llevaría eventualmente a la muerte neuronal. Su aparición es un evento relativamente temprano en la EA (Iqbal K et al, 1998; Hanger DP et al, 1998)). La hipótesis Tau, plantea que la proteína Tau desempeña un papel más destacado que la betaamiloide, como activadora de la neurodegeneración observada en la EA (Geerts H, 1998). En la EA, se observan altos niveles de la proteína Tau, hiperfosforilada y glicosilada (Duyuckaerts C et al, 1998; Pavia J et al, 1998). Se cree que la hiperfosforilación de la proteína Tau contribuye a la desestabilización de los microtúbulos y por último a la degeneración neuronal característica de la EA. Figura 10. Neuronas que contienen ovillos neurofibrilares Tau, por sí mismo, desempeña un papel crucial en los procesos de aprendizaje hipocámpico. Sin embargo, la hiperfosforilación anormalmente alta de tau en las taupatías dan cuenta del declive cognitivo (Sennvik K et al, 2007). Ha de ser la fosforilación anormal de tau, y no su hiperfosforilación, un fenómeno crítico en la progresión neurodegenerativa relacionada con la enfermedad. Se sabe que la agregación de ONF es un hecho incontrovertible para la reentrada al ciclo celular, sin división, que es un fenómeno inductor de apoptosis (Schindowski K et al, 2008). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 41 Figura 11. Representación esquemática de un hemisferio de un sujeto normal (izquierda) y un hemisferio de una persona afectada por EA (derecha). En escala de colores se representan los estados de ONF de Braak. Los primeros estados son entorrinales (I y II) con síntomas ausentes o leves. Los estados III y IV son llamados límbicos y se acompañan de déficit mnésico (influye la reserva intelectual) y cambios sutiles de la personalidad. En los estados corticales (V y VI) continúa el deterioro sumando regiones neocorticales con un patrón inverso a la mielinización, afectando primeramente las áreas de asociación y finalmente las áreas primarias. En la región superior se observan los estados según el número de placas seniles (Álvarez Sánchez M, et al. 2008). La presencia de A β incrementa la fosforilación y agregación de Tau en ratones transgénicos de Alzheimer. La fosforilación y agregación de tau son procesos clave implicados en la muerte neuronal de la EA. El posible papel secundario de tau en la patología en al EA ha sido cuestionado por estudios recientes que indican que tau media el efecto tóxico del Aβ. Así, el péptido Aβ no es capaz de inducir muerte en células donde se ha inactivado tau. El efecto protector de la inactivación de tau en la toxicidad mediad por Aβ se ha demostrado también en modelos transgénicos. La inactivación de tau reduce los déficits cognitivos y la muerte prematura en ratones transgénicos de APP, sin cambios apreciables en la acumulación de placas amiloides. La reducción de tau también previene los déficits en el transporte axonal inducidos por péptido Aβ. La Apo-E puede fijarse en la proteína Tau, pero en particular las formas E2 y E3. La forma E4 no sería capaz de impedir la modificación patológica de la proteína tau. (Ferrer I. 1996) Aunque tau es mayoritariamente una proteína asociada a microtúbulos , recientemente se ha detectado tau en dendritas, una localización que depende de su unión a microtúbulos.Estos datos indican que tau podría participar en diferentes funciones fisiológicas en el Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 48 resultan en toxicidad y posteriormente en muerte celular. La ruptura de la homeostasis del calcio puede tener efectos secundarios, como peroxidación lipídica y generación de especies reactivas de oxígeno. Con el tiempo, se reduce la integridad sináptica (Itkin A et al. 2011). El péptido Aβ perjudica la integridad de la mem brana citoplasmática y las causas disfunciones mitocondriales. Aβ inhibe la actividad de la fosforilación oxidativa sistema (OXPHOS), que puede dar lugar a disminución de ATP y el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) formación. La disminución de la producción de ATP conduce a la alteración de la ATP-dependientes procesos, donde todas las funciones celulares están involucrados. La disminución de potencial de membrana mitocondrial (Δψ𝑚) es seguido por apertura de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTPs) . La liberación de citocromo c (𝑐 cyt) y otros factores proapoptóticos de la intermembrana el espacio de las mitocondrias induce la activación de las caspasas y apoptosis. El factor inductor de apoptosis (FIA) es un factor proapoptótico liberada por las mitocondrias. Ello conduce a alteración de la dinámica mitocondrial, el aumento de la fisión mitocondrial, y la neurodegeneración. Además, la proteína Aβ inhibe la importación de proteínas en la mitocondria y reduce la actividad de la mitocondria Aβ alcohol vinculante deshidrogenasa (ABAD), α-cetoglutarato deshidrogenasa complejo (α-KGDH) y ciclofilina D. La capacidad de las mitocondrias para manejar el calcio se ve afectada por la PPA y Aβ; en consecuencia, la sobrecarga de calcio mitocondrial conduce a la disminución de Δψ𝑚, apertura de MPTPs, la liberación de factores pro-apoptóticos, el aumento de la producción de ROS, y la disminución de la producción de ATP. (Hroudová J et al, 2014). Entre otras hipótesis se encuentra la de la apolipoproteína P (APOE). La APOE es una glicoproteína que ayuda a la reparación neuronal, tiene propiedades antinflamatorias y facilita el crecimiento de las dendritas. Sin embargo, una de sus isoformas se relaciona con la EA porque promueve los depósitos amiloides, la neurotoxicidad, el estrés oxidativo, la formación de ovillos neurofibrilares y la inflamación del cerebro (Nishitsuji K et al 2011). Neuroinflamación y daño oxidativo en la EA La neuroinflamación es uno de los efectos secundarios de los depósitos βA y se caracteriza por la activación de las células gliales y la expresión de mediadores inflamatorios claves. La inflamación se vuelve crónica, se generan especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico y proteinasa, lo cual provoca neurotoxicidad. La reacción a la inflamación puede estimular la regeneraciónAβ y formar un círculo vicioso (Armstrong RA, 2011). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 49 Figura 15. Cascada inflamatoria mediada por la glía Un radical libre es un átomo o molécula, neutra o cargada, que contiene uno o más electrones desapareados, en su órbita externa confiriéndoles inestabilidad con un alto poder oxidante o reductor, haciéndolos reaccionar con otras moléculas para lograr estabilidad química; como consecuencia, dichas moléculas sufren alteración en su composición, estructura o función y se producen normalmente durante el metabolismo de la célula (Halliwell B et al, 1999). Los radicales libres se clasifican de acuerdo con el tipo de átomo del cuál provienen, de esta forma tenemos radicales libres derivados del oxígeno y del nitrógeno. Ambos participan en reacciones de oxidación-reducción como parte de un sistema fisiológico celular. Un desequilibrio en el estatus prooxidante/antioxidante da como resultado estrés oxidativo/nitrosativo provocando citotoxicidad. Un ejemplo es la peroxidaciónde lípidos de membranas biológicas conocido como lipoperoxidación que tiene como producto final al malondialdehido. La toxicidad de este producto se debe a su alta reactividad con proteínas y ADN para formarproductos modificados de bases nitrogenadas como la pirimidopurino-na, que es altamente mutagénica y carcinogénica. Las investigaciones encaminadas a conocer la capacidad de los antioxidantes en la dieta diaria para prevenir/revertir el estrés oxidativo/nitrosativo son de gran importancia ya que tal información puede ser usada con fines terapéuticos para el desarrollo de medicamentos efectivos y selectos, capaces de bloquear la acción de dichos radicales (Halliwell B et al, 1999). La neuroinflamación observada en la EA depende fundamentalmente de la activación glial. El desbalance entre la actividad inductora de daño inflamatorio y neuroprotectora-moduladora de la glía puede llevar a la neurotoxicidad. Este desbalance podría ser promovido por condiciones como la hipoxia e inflamación, fenómenos fisiopatológicos observados frecuentemente en el envejecimientoy que podrían actuar a través de una multiplicidad de mecanismos efectores. Estos procesos finalmente conducen a la muerte neuronal y desempeñan un papel fundamental en el deterioro progresivo que presentan los pacientes con enfermedades neurodegenerativas (Dhib-Jalbut S et al, 2006). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 50 La asociación de la inflamación con la EA se planteó a fines de los años 80 y desde entonces se han identificado mediadores de inflamación como interleuquinas, IL-1e IL-6, y TNFα (Factor de necrosis tumoral), la liberación de dichas interleuquinas está determinada por la existencia de una taquicinina, cuya acción es proinflamatoria, la sustancia P (Muñoz M y Coveñas R, 2014). Por otro lado, estudios epidemiológicos mostraron que el tratamiento crónico con antiinflamatorios no esteroideos les disminuía la incidencia de EA (Minghetti L, 2005), aunque esto no se ha confirmado en protocolos clínicos realizados con distintos anti-inflamatorios, (Zhang J et al, 2006; Von Bernhardi R. 2007), así como bloqueando la acción de la sustancia P, bloqueando sus receptores (Muñoz et al, 2011a). Por otro lado, microglia activada participa en la fagocitosis de Aβ a través de su actividad fagocítica y por lo tanto evita la deposición de Aβ y la formación de placas amiloides (Li Y.et al 2011). Siendo fundamental la comprensión sobre el papel de la microglia y la neuroinflamación en los mecanismos y la terapéutica de la EA (Teng Jiang et al. 2015) Figura 16. La microglia y la neuroinflamación La hipótesis neuroinmune de la patogenia de la EA afirma que un trastorno genético heredado o inducido por factores endógenos y/o exógenos daría lugar a una disrupción del citoesqueleto neuronal, y de la arquitectura de las membranas celulares, ocasionando la exposición de epitopos anómalos de membrana que serían reconocidos por la microglia en reposo. Una vez activada ésta, se iniciaría la síntesis de interleucina 1 (IL-1), que dispararía una cascada de episodios neuroinmunes cuyo fin común sería la destrucción de las neuronas, con formación de placas neuríticas en los focos de detritus. Esta hipótesis está basada en el hecho de que se han detectado altos niveles de IL-1 en el tejido cerebral, líquido cerebro espinal (LCE) y suero Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 51 de los pacientes con EA. En la actualidad puede concluirse que la EA cursa con activación de mecanismos inflamatorios e inmunes (Cacabelos R et al, 1994; Shenk D et al, 1999). Se ha demostrado la presencia de anticuerpos anómalos en pacientes con EA. Formulándose la hipótesis de que estos anticuerpos, en lugar de cumplir su papel fisiológico al rechazar agresores externos, podrían atacar a los componentes de la barrera hematoencefálica. Una vez que se altera la integridad de la barrera hematoencefálica, un determinado virus u otras toxinas pueden acceder al cerebro y desencadenar la enfermedad. Activación de la Microglía en la EA Las microglías son los macrófagos del tejido del cerebro, representan el sistema inmune innato. Estas células normalmente proporcionan el mantenimiento del tejido y la vigilancia inmune del cerebro. En la EA el depósito de la enfermedad amiloide cerebral provoca la activación de la microglia y la elaboración de moléculas proinflamatorias. Los receptores tipo Toll están implicados en reconocimiento microglial y la respuesta a las fibrillas de amiloide. Estas células exhiben fenotipos complejos y heterogéneos, apreciando que reflejan tanto la plasticidad de estas células y su capacidad de transición entre estados de activación. Fenotípicamente la diversidad está asociada con la inactivación de la respuesta inflamatoria y la reparación de tejidos (Cameron B et al, 2010). Hay una mutua relación entre el daño de las neuronas y la activación de la microglía. Por un lado, el daño neuronal puede promover toxicidad pequeña de pegamento para activar las células, paracrinas de citoquinas, y señalización autocrina; todo lo que puede conducir a la activación sostenida de la microglía. Por otro lado, la activación crónica de la microglía se puede utilizar como estímulo de las citoquinas cerebrales y fuente de radicales libres activos; estos factores promueven juntos daños neuronas y forman un círculo vicioso; se ha considerado una degeneración neuronal crónica como un importante mecanismo en el proceso de desarrollo de la enfermedad. Una revisión reciente (Ying Li et al, 2014) mostró que los fármacos inhibidores de la activación de la microglía pueden proteger las neuronas dopaminérgicas en cierta medida; esto es también una gran importancia en el proceso de la pérdida dopaminérgico de las neuronas de lesiones desde el lado de la activación de la microglia. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 52 Figura 17. Efectos de Microglía activada (Ying Li et al , 2014) La microglía activada y los astrocitos son los generadores principales de factores proinflamatorios, aunque también las neuronas secretan citoquinas en forma constitutiva (Asanuma M et al 2006) Figura 18. Activación de la microglía en la EA (Ying Li et al 2014) Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 53 El Aβ activaría a la microglía, ya sea activando la fagocitosis e induciendo daño sobre neuronas vecinas en forma directa, o agrediéndolas indirectamente, al liberar citoquinas inflamatorias, óxido nítrico y otras neurotoxinas capaces de dañar neuronas cercanas. Esto podría autopropagar el proceso inflamatorio en caso que fallen los mecanismos de regulación normales ejercidos por los astrocitos y las neuronas (Asanuma M et al 2004; Sayre LM et al , 2011; Salmon DP et al, 2002) La patogénesis de la EA aún no está clara en la actualidad; la mayoría estudiosos piensan que debe ser causadapor múltiples factores. En la actualidad, está en debate si la Aβ directa o indirectamente afecta a las neuronas por la actividad microglial. En una palabra, la inflamación mecanismo (inmune) puede jugar un papel fundamental en la evolución patológica, y los AINE u otros tratamientos antiinflamatorios pueden abrir nuevas vías para la prevención de la EA (Li Y. et al, 2014). Cameron et al, discuten la evidencia reciente de que el cerebro enfermo puede ser infiltrado por los monocitos circulantes y que estas células pueden comprender una subpoblación única de células mieloides que pueden ser funcionalmente distinta de la microglía endógena (Cameron B et al, 2010). Estrés oxidativo El cerebro es particularmente vulnerable al estrés oxidativo ya que presenta una elevada tasa metabólica derivada de la glucosa, posee niveles muy bajos de defensas antioxidantes, contiene altas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados, que son posible blanco de peroxidación lipídica, y además es rico en actividades enzimáticas relacionadas con metales de transición, los cuales pueden catalizar la formación de radicales libres (Halliwell B et al, 1992). El estrés oxidativo parece jugar un papel importante en la EA aunque aún se discute si es un mecanismo causal o sólo estaría envuelto en la propagación del daño (Sitte N et al, 2000) Las neuronas son altamente sensibles al estrés oxidativo, el cual actúa a diferentes niveles activando una serie de vías relacionadas con daño oxidativo y apoptosis, además de activar un proceso inflamatorio no específico. El grado de deterioro en las enfermedades neurodegenerativas está correlacionado con la degeneración y subsiguiente pérdida de poblaciones neuronales específicas. Esta pérdida de neuronas se correlaciona con lesiones patológicas que abarcan proteínas del citoesqueleto que son selectivamente vulnerables al estrés oxidativo, por lo que se tiende a especular que la química de los radicales libres juega un importante papel en estas condiciones neurodegenerativas. Sin embargo, aún no está determinado cómo los efectos del estrés oxidativo se manifiestan diferencialmente en poblaciones neuronales específicas afectadas por cada enfermedad. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 54 El estrés oxidativo parece ser la unión entre factores ambientales (pesticidas herbicidas, exposición a metales pesados), factores endógenos y factores de riesgo genético. Aún no está claro, si el estrés oxidativo puede ser un epifenómeno o tener un papel causal. Existenevidencias en ambos sentidos que indican que los oxidantes inducen distintas consecuencias patológicas que amplifican y propagan el daño y que llevan a una degeneración irreversible. La capacidad de las especies reactivas de activar el sistema inmune a través de la activación diferentes vías metabólicas puede ser las responsables de la progresión de las enfermedadesneurodegenerativas. (Angoa M et al, 2007) Varias líneas de investigación han implicado al estrés oxidativo y daño por radicales libres en la etiología y patogénesis de la EA. Este daño incluye una asociación de defectos en el metabolismo energético y la compensación de las enzimas antioxidantes (De Leo ME et al, 1998). El estrés oxidativo secundario a la disfunción mitocondrial se observa en etapas tempranas de la EA, y podría depender de daño directo o indirecto por el Aβ. Recientemente se ha descrito la interacción del Aβ con un ligando mitocondrial, l a Aβ -binding alcohol dehydrogenase (ABAD). ABAD está incrementada en las neuronas en los pacientes con EA y funcionalmente se le ha asociado a muerte celular (Angoa M et al , 2007). Figura 19. Efectos de las especies reactivas al oxígeno en el cerebro (Angoa M, 2007) Los radicales libres (RL) y las especies reactivas de oxígeno (ROS) son normalmente generados por el metabolismo celular para la obtención de energía (McCord JM, 2000). Los sistemas antioxidantes eliminan las ROS para mantener un equilibrio de óxido-reducción en el organismo. En un estado de estrés oxidativo, se presenta un exceso de pro-oxidantes que no puede ser contrarrestados por los sistemas antioxidantes. Bajo condiciones patológicas, existe un estado de estrés oxidativo donde el metabolismo celular aumenta la producción de radicales libres y ROS (Lin MT et al, 2006). Cuando los propios mecanismos celulares no Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 55 pueden contrarrestar estos cambios, se inicia una cadena de reacciones que involucran alteraciones de los canales iónicos, aumento en la liberación de calcio (Hlliwell B et al, 2006) y en la producción de óxido nítrico (ON). El aumento en los niveles de calcio y ON estimula la producción de interleucinas inflamatorias causando gliosis e incrementando el estado de estrés oxidativo. Las ROS también activan al factor nuclear kappa beta (NFkß), produciendo una alteración en la regulación del sistema inmune. Una gran cantidad de evidencias indican que el incremento en la generación de ROS, y un déficit en las defensas antioxidantes (Olanow CW et al, 1994), así como la disminución en la eficiencia de los mecanismos de reparación del DNA y la proteólisis, además de pérdida de regulación del sistema inmune, son factores que contribuyen primariamente al aumento de estrés oxidativo y llevan a daño cerebral progresivo. Las modificaciones en las proteínas, se asocian por lo general con pérdida de función y pueden llevar por un lado al desdoblamiento y degradación de las proteínas dañadas, o por el otro, a su agregación, resultando en acumulación como inclusiones citoplásmicas, tal como se observa en las enfermedades neurodegenerativas (Dalle-Donne I et al, 2005).Las proteínas oxidadas son de alta sensibilidad a la degradación por el proteasoma (Grune T et al, 1997). Estos procesos finalmente conducen a la muerte neuronal y desempeñan un papel fundamental en el deterioro progresivo que presentan los pacientes con enfermedades neurodegenerativas (Dhib-Jalbut S et al, 2006). Desde hace algunos años, las investigaciones se han centrado en los defectos de la cadena respiratoria mitocondrial para dilucidar el papel de las mutaciones en el DNA mitocondrial y de la combinación de la expresión de genes de DNA nuclear y mitocondrial (Bonilla E et al, 1999).Hay estudios que reportan la presencia de glicosilación en las marañas neurofibrilares y en las placas seniles (Moreira PM et al, 2005), modificaciones lipoxidativas en proteínas (Liu Z et al, 2003), modificaciones en neurofilamentos inducidas por grupos carbonilo y nitrotirosina (Smith MA et al, 1997) en neuronas hipocampales con EA. También se reportaron estudios que indican la presencia de un estado de estrés oxidativo regionalizado en cerebros con EA, sobre las bases de una cuantificación de daño en proteínas y DNA (Sultan R et al, 2006) Más aún, existen evidencias de un incremento en la oxidación de RNA (Shan X et al, 2006) y peroxidación de lípidos en la EA (Korolainen MA et al, 2006). A pesar de la amplia documentación de daño oxidativo en la EA, las fuentes del incremento de ROS responsables de iniciar dicho daño aún permanecen poco claras. Algunos candidatos son: a. La microglía activada, como aquella presente alrededor de las placas seniles, ya que es unafuente de óxido nítrico y superóxido, los cuales reaccionan para formar peroxinitritos. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 56 b. Los depósitos de proteínas Aβ, debido a que estos promueven la generación de ROS por su conjugación con metales de transición o por su interacción con receptores de superficie que participan en la respuesta inflamatoria (Sayre LM et al, 2001 et al, 2001) c. El estrés oxidativo puede modificar proteínas por los productos finales de glicación y lipoxidación avanzada (AGEs y ALEs, respectivamente), lo cual puede activar receptores de superficie, como los RAGE, y al receptor scavenger tipo A, para inducir un incremento en la producción de ROS (Sato T et al, 2006). Los AGEs y ALEs también pueden unirse a iones metálicos, lo cual da como resultado un incremento autocatalítico de ROS (Angoa M et al, 2007). Figura 20. Potential pathways of susceptibility genes involved in the pathogenesis of AD.( Zhangyu Zou, et al 2014) Agentes ambientales en la EA Se piensa que numerosos agentes ambientales, que incluyen metales como el aluminio y mercurio, plaguicidas, factores dietéticos y daños en el cerebro pueden contribuir a la aparición de la enfermedad (Kawahara M et al, 2011; Mutter J et al 2010. Estudios realizados in vivo e in vitro han asociado los depósitos de Aβ, formación de las placas y acumulación de proteína tau con el desbalance de la homeostasis de los iones metálicos Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 57 como el zinc y el cobre. La homeostasis de estos iones está severamente desregulada en la EA, fenómeno que afecta el metabolismo de la PPA. La proteína A β unida a estos metales y una alteración del metabolismo PPA dan lugar a procesos neurotóxicos. A principios de 1990, AshleyBush descubrió que el Zn (II) y Cu (II) inducían agregación de Aβ en su ausencia las placas seniles en muestras de tejidos celulares se disolvían. Fue establecido que la combinación de Aβ con iones metálicos generan concentraciones incrementadas de peróxido de hidrógeno, originan radicales hidroxilos que ocasionan daño oxidativo en el cerebro (Multhaup G et al, 2002). El peróxido de hidrógeno, una de las especies reactivas clave como mediadora de estrés oxidativo, es generada durante la agregación de las proteínas amiloides asociadas a algunas enfermedades neurodegenerativas. El peróxido de hidrógeno es catalíticamente convertido en el radical hidroxilo altamente agresivo en presencia de Fe(II) y Cu(I), el cual vuelvea las proteínas amil oidogénicas (ßA y α-sinucleína) vulnerables al ataque por el radical hidroxilo. Los pacientes con EA, en comparación a pacientes con otras demencias, poseen concentraciones elevadas de aluminio en plasma. Se ha publicado el hallazgo de aluminosilicatos en las placas seniles y dentro de las neuronas que contienen los ovillos neurofibrilares típicos de la enfermedad. En estudios epidemiológicos se ha relacionado el número de casos de EA y el contenido de aluminio en el agua que se consumía. Como el aluminio es un metal neurotóxico, podría estar involucrado en el mayor daño oxidativo observado en la EA, ya que puede estimular -en presencia de hierrola oxidación de lípidos y proteínas. Por otra parte, el aluminio también estimula a los fagocitos, los cuales generan grandes cantidades de especies reactivas del oxígeno. También se han hallado elevadas concentraciones de lípidos oxidados en el cerebro de ratones intoxicados crónicamente con aluminio. No obstante, el papel del aluminio en la EA es aún controvertido y permanece en el área de las hipótesis (Rondeau V, 2002; Gupta VB et al, 2005). Hipercolesterolemia En la EA también se plantea que existe una relación entre deposición amiloide y colesterolemia. Mediante la utilización de un modelo de ratón transgénico de amiloidosis, se demostró que la hipercolesterolemia inducida por la dieta daba como resultado una dramática aceleración de los cambios bioquímicos y neuropatológicos en el ratón transgénico, por otra parte, el ratón hipercolesterolémico mostró marcado incremento en la deposición de amiloide y concentraciones de péptidos Aβ si gnificativamente mayores en el SNC (Refolo LM et al, 2000).Otros investigadores también fundamentaron la conexión entre el colesterol elevado y la patología amiloide in vivo. En un estudio donde se emplearon ratones marcados con el gen de la proteína precursora de amiloide (PPA), que expresa la mutación de EA familiar Suiza, el incremento en el colesterol dietético condujo a cambios en los niveles de PPA y Ab en cerebro que correlacionaron negativamente con los niveles de colesterol en suero (Howland DS et al, 1998). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 64 grupo incluyen la rapidez de instauración del cuadro, la presencia de enfermedades psiquiátricas o de condiciones médicas o farmacológicas que puedan justificar la clínica, así como la existencia de datos que sugieran otro origen neurodegenerativo. Criterios diagnósticos de EA probable de Dubois et al: reúne los criterios de A más al menos uno de B, C, D o E. (Dubois B et al, 2007) Criterio principal: A. Presencia un trastorno de memoria episódica inicial y significativo que incluya las siguientes características: 1. Pérdida de memoria progresiva y gradual durante al menos seis meses comunicada por el paciente o un informador fiable 2.Objetivar mediante tests neuropsicológicos la pérdida de memoria episódica. Normalmente consiste en recoger fallos de reconocimiento que no mejoran o no se normalizan con claves 3.El defecto de memoria episódica puede ser aislado o asociarse a otras alteraciones cognitivas Características adicionales: B. Presencia de atrofia en el lóbulo temporal medial: Pérdida de volumen del hipocampo, la amígdala y la corteza entorrinal, evidenciada por resonancia magnética utilizando medidas visuales directas o por técnicas de volumetría C. Alteraciones de biomarcadores en líquido cefalorraquídeo: Disminución de Aβ42 o aumento de la concentración de tau total o tau fosforilada, o combinaciones de ellos Otros posibles marcadores futuros. D. Alteraciones características de neuroimagen funcional con tomografía por emisión de positrones: Hipometabolismo de glucosa bilateral en regiones temporales y parietales Otras alteraciones con radioligandos que sean validadas tal y como se prevé con el compuesto B de Pittsburgh (PIB) o el FDDNP E. Evidencia de una mutación autosómica dominante en un familiar de primer grado Tanto los criterios de Dubois et al (2007) como los criterios NIA-AA (2011) suponen un importante avance en la conceptualización de la enfermedad y en la búsqueda de un diagnóstico precoz y deberán tenerse muy en cuenta a partir de ahora. (López-Álvarez, J et al, 2015). 1.2.10. DIANAS TERAPEÚTICAS Los procesos que interactúan en la patogenia y progresión de la EA (acumulación de Aβ y otros derivados de la PPA, la disfunción mitocondrial y de neurotransmisores, el estrés oxidativo, la inflamación, los trastornos neuroinmunes y tróficos),son pasos importantes en los procesos Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 65 que conducen a la muerte neuronal, por lo que parece ser improbable que una sola línea terapéutica pueda prevenir o disminuir de forma significativa la progresión de la enfermedad, resulta más efectiva una terapéutica que incluya estrategias paralelas que confieran neuroprotección y eviten la disfunción neuronal y la neurodegeneración ((López de Silanes M). Muchos estudios y ensayos clínicos están en curso con una gran cantidad terapias que modifican la enfermedad, pero todavía nadie tiene muestra un efecto definitivo en la Fase III de ensayos clínicos. La complejidad de la patogénesis de la EA es una explicación razonable para esto. Sin embargo, no está claro si la seña de identidad patológica de EA son las placas seniles y ONF, son causales, productos finales, o incluso los mecanismos de protección en los procesos fisiopatológicos de la EA (Reynaldo G et al, 2008 ). Existen muchas terapias modificadoras de la enfermedad afectan a la patogénesis subyacente de la EA, mientras que los resultados clínicos se mantienen sin cambios. Por ejemplo, las vacunas que buscan el aclaramiento del Aβ, redujeron significativamente los niv eles, pero no tuvo efecto en la alteración la progresión de la EA (Hardy J et al, 2002) Por lo tanto, los mecanismos que subyacen en la patogénesis de la EA todavía necesita mayor investigación y verificados antes de iniciar el desarrollo de las siguientes terapias modificadoras de la enfermedad. El objetivo final sería desarrollar terapias modificadoras de la enfermedad que puedan ser introducidas de forma precoz, en un momento en que las personas todavía permanecen asintomáticas o mínimamente sintomáticas, para mantener su calidad de vida (Viloria A, 2011). Dianas terapéuticas:  Factores de riesgo La EA, y los cambios histológicos de los que se acompaña, se han relacionado con la presencia de factores de riesgo vascular (hipertensión arterial, diabetes o hipercolesterolemia, entre otros), de manera que un adecuado control de los mismos puede disminuir el riesgo de desarrollar la enfermedad a largo plazo.  Neurotransmisión colinérgica Además de poder aumentar la disponibilidad de acetilcolina a nivel sináptico por medio de los fármacos actualmente disponibles, otros inhibidores de la acetilcolinesterasa podrían ser comercializados en el futuro, como por ejemplo la Huperzina (un extracto natural, empleado en China como remedio para la demencia desde hace siglos) La Nicotina, agonista natural de los receptores colinérgicos así llamados nicotínicos, no tiene aparentes efectos sobre la memoria del paciente con demencia. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 66 Una estrategia prometedora en el tratamiento de la EA es la actuación a nivel de los mecanismos moleculares del procesamiento de la PPA y del péptido amiloide. La inactivación farmacológica de las beta y gamma-secretasas, así como la activación o potenciación de la alfasecretasa (propiedad que poseen por ejemplo los estrógenos), son mecanismos que logran disminui r la producción de Aβ42, y su depósito consiguiente La Phenserina y el Memoquin, además de mejorar la función colinérgica (evitando la degradación de la acetilcolina producida), logran, respectivamente, disminuir la cantidad de PPA producida y la cantidad de amiloide depositado. También algunos agonistas de receptores colinérgicos de tipo muscarínico (como las moléculas Cevimeline y Talsaclidine), disminuyen los niveles de Aβ en el tejido nervioso. Existen diversas moléculas que logran modificar la estructura del amiloide ya producido, evitando así su acumulación, que se encuentran en distintas fases de ensayo clínico. Los llamados MPAC -Clioquinol, PTB2 y otros- (compuestos que preservan los iones metálicos con que normalmente trabaja el sistema nervioso), el Tramiprosato o Alzhemed (análogo de los glicosaminoglicanos con que interactúa el amiloide para formar los depósitos), el iAβ5p (inhibidor del plegamiento patológico del péptido amiloide previo a su acumulación), o los inhibidores del amiloide P sérico (presente también en los depósitos amiloides, así como en el suero de los pacientes), son sustancias con efectos beneficiosos a través de este mecanismo terapéutico. La proteína GSK3, cuya función está anormalmente elevada en pacientes con EA, induce cambios en la estructura de la proteína tau (hiperfosforilación) que favorecen su agregación y acumulación patológica. La utilización de inhibidores de la GSK3, tales como el Litio, el Valproato, o los Tiadiazoles (TZDZ), está obteniendo unos buenos resultados preliminares en estudios experimentales. Dianas terapéuticas: vacuna e inmunoterapia Después de algunos intentos infructuosos de desarrollar una vacuna contra el amiloide de la EAr (debido principalmente a la aparición de algunos casos de meningoencefalitis con la vacuna AN-1792), en la actualidad esta línea de investigación está recobrando protagonismo, alentada por los resultados de nuevos experimentos más selectivos. En lugar de dirigirse contra la estructura completa del péptido amiloide, las nuevas vacunas lo hacen sólo contra pequeños fragmentos de la misma, lo que mejora la especificidad de la respuesta inmunológica desencadenada en el huésped. Otras formas de inmunoterapia se basan en la utilización de anticuerpos selectivos contra el péptido amiloide (anticuerpos monoclonales), como el Bapineuzumab, que ha mostrado ser capaz de aumentar el aclaramiento de las placas neuríticas. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 67 El Etanercept, un modulador de la respuesta inmunológica del organismo (inhibidor del factor de necrosis tumoral -TNF-), se encuentra asimismo en fase de ensayo clínico, con unos resultados preliminares esperanzadores. Dianas terapéuticas: neuroprotección Las distintas vías metabólicas por las que se produce el daño tisular en la EA acaban produciendo un aumento en el estrés oxidativo que soporta el tejido nervioso, por lo que son muy diversas las moléculas con propiedades anti-oxidantes investigadas en estos pacientes Entre las más conocidas están las vitaminas E y C (también llamadas α-Tocoferol y Ácido Ascórbico, respectivamente), la Coenzima Q10, el Ginkgo biloba, o la L-Carnitina. Algunos antiinflamatorios, como el Ibuprofeno o la Propentofilina, también han mostrado actividad antioxidante. El Ácido Indol-3-Propiónico (IPA u Oxigon), además de poseer potentes propiedades anti-oxidantes, ha demostrado actuar también como inhibidor de la formación de fibrillas de péptido amiloide Dentro de estos factores tróficos cabe citar el Factor Neurotrófico Cerebral (BDNF), el Factor Neurotrófico Glial (GDNF), el Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), o el anteriormente citado Factor de Crecimiento Relacionado con la Insulina (IGF-1), todos ellos en estudio no sólo en modelos animales, sino también en pacientes afectados por la enfermedad Uno de los factores que contribuye significativamente al proceso degenerativo puesto en marcha en la EA es un aumento en la actividad apoptótica, proceso metabólico por el cual un tejido se deshace de las células alteradas o dañadas (muerte celular programada), y que está anormalmente presente en estos casos. Siguiendo esta línea, las moléculas inhibidoras de las Caspasas, unas de las principales proteínas participantes en este proceso (ejemplos de posibles fármacos a este nivel son la Minociclina, la Cerebrolysina, o el Q-VD-Oph), o del Dimebon (Latrepirdina), un antihistamínico con propiedades frente a la apoptosis. Cabe mencionar también la estrategia anti-citotóxica de algunas moléculas moduladoras de los receptores del glutamato, como los antagonistas del receptor NMDA (la ya comercializada Memantina, o el Naromexano), o los moduladores del receptor AMPA (moléculas S18986 y CX516, por ejemplo). Dianas terapéuticas: terapia génica y terapia celular Algunas moléculas que comienzan a mostrar resultados positivos en la regulación de la actividad de genes terapéuticos son las Tetraciclinas (empleadas hasta ahora como antibióticos), la Rapamicina (utilizado para evitar el rechazo de transplantes), o el Ecdysone (un derivado hormonal). En un sentido inverso, también se están desarrollando otras moléculas Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 68 capaces de inhibir la actividad de genes patológicos o mutados (fragmentos de RNA dirigidos contra regiones alteradas de un gen -siRNA-) (López de Silanes M.) Dianas terapéuticas: Neurogénesis Aunque las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EA, tienen diferentes rasgos e inicios, todas comparten la pérdida progresiva por apoptosis de neuronas de diferentes áreas, con el declive consecuente de funciones concretas, por lo que resulta inaplazable diseñar métodos para reemplazar las funciones de las células faltantes o dañadas. Se han abordado diversas variantes de terapéuticas potenciales en neurodegeneración, que por lo general no son excluyentes entre sí y posiblemente deban buscarse efectos sinérgicos entre ellas. Se deben eliminar las sustancias tóxicas involucradas en la patogenia. Una de las posibles rutas de eliminación de la proteína Aβ es intervenir en la respuesta inmune, mediante la opsonización dirigida al anticuerpo y la eliminación de la Aβ a través de células microgliales (Thompson A et al, 2008). Se plantea el uso de Células troncales de la médula ósea como fuente alternativa de células troncales para la terapia de reemplazo celular en las enfermedades neurodegenerativas y, particularmente, en la EA. La vía MAPK modula la diferenciación celular, la proliferación, la supervivencia y la muerte neuronal, y podría ser una candidata para regular la neurogénesis de las células troncales de la médula ósea (Miloso M et al, 2008). Las células estromales, según Tondreau et al, 2008, pueden diferenciarse fiablemente en células neuronales, con expresión específica de genes y propiedades funcionales. Los animales envejecidos trasplantados en el estriado o el hipocampo recuperaron las funciones motoras o cognitivas, respectivamente, lo cual, como era de esperar, fue dependiente de la especificidad de la estructura ‘restaurada’ (Fernández CI et al, 2004). Existe un ‘condicionamiento’ previo de neuronas troncales para activar programas genéticos intrínsecos. Según Waldau y Shetty, mejorar el microambiente cerebral para fomentar la maduración de neuronas derivadas del trasplante celular será de importancia capital (Waldau B et al, 2008). No hay un agente terapéutico convincente para inducir o vigorizar la neurogénesis en el cerebro adulto después del daño cerebral (Thompson A et al, 2008). Los factores de crecimiento, son capaces de inducir y vigorizar la neurogénesis endógena (Miloso M et al, 2008), in vitro e in vivo, pero están reducidos en cerebros envejecidos y en EA, la reserva de células troncales neurales y su potencial proliferativo están disminuidos de manera acentuada (Brinton RD et al, 2006). En resumen, la neurogénesis continúa en casi toda la vida, pero disminuye marcadamente con la edad y con la progresión de fenómenos neurodegenerativos. La inducción de fenómenos endógenos mediante el tratamiento epigenético (ambiente, ejercicio, estimulación cognitiva y multisensorial...) Un factor medioambiental con posibles propiedades neuroprotectoras y neurogénicas para la EA son los cambios en el estilo de vida a Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 69 través de la dieta, a saber: el extracto de Ginkgo biloba EGb 761 (Tchantchou F, 2007) y la curcumina, una antigua especia de la India, familia del jengibre, un antiinflamatorio natural con propiedades anticancerígenas. La curcumina induce neurogénesis en el hipocampo del cerebro adulto, efecto que se asocia a la activación del ERK y la cinasa p38, que son vías de transducción de la señalización intracelular, las cuales están implicadas en la regulación de la plasticidad neuronal y la respuesta al estrés. (Panchal HD et al, 2008). 1.3. SUSTANCIA P Y RECEPTOR NK-1 1.3.1 NEUROTRANSMISIÓN El Sistema nervioso Central (SNC) es un entramado de tejidos que se ocupa de capturar y procesar estímulos para que el cuerpo pueda concretar una interacción eficaz con el medio. El SNC posee un papel sensitivo (por recibir estímulos tanto internos como externos), una función integradora (por analizar las señales captadas, guardar información y formular una reacción) y una función motora (el movimiento muscular o la secreción glandular en respuesta a los estímulos). Neurona Dentro de este excepcional sistema, la neurona adquiere un papel primordial como unidad funcional básica del sistema nervioso central (SNC). Hoy en día sabemos que el sistema nervioso (SN) contiene más de cien mil millones de neuronas. Aunque nuestros conocimientos actuales sobre el SN en general y el cerebro en particular son el resultado del trabajo colectivo de un gran número de científicos, debemos reconocer la contribución decisiva de los estudios del científico y Premio Nobel español Don Santiago Ramón y Cajal (1852-1934). Y es que los más de 30 artículos publicados por este científico entre 1888 y 1892, resumidos en su primera revisión sobre la estructura del SN (Ramón y Cajal, 1892), establecieron claramente la base de la teoría neuronal. Esta teoría establece los principios fundamentales de la organización y función del sistema nervioso al afirmar que las neuronas son las unidades anatómicas, fisiológicas, genéticas y metabólicas del mismo (Jones, 1994; Shepherd, 1991). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 70 Figura 21. Esquema de los diversos tipos de neuronas (Saunders Company. 2002) Células neurogliales: Su función es dar apoyo metabólico, mecánico y protector a las neuronas. Estas células forman en conjunto a la neuroglia. Puede haber 10 veces más neuroglia que neuronas. No reaccionan a impulsos nerviosos ni los propagan. Tipos de Neuroglías: Astrocitos; Oligodendrocitos; Células Microgliales; Células Ependimarias; Células de Schwann (están Sistema Nervioso periférico, SNP). Destacar que la microglía se localiza en todo el SNC, se origina en la médula ósea. Forman parte de la población fagocítica mononuclear, son células pequeñas, oscuras. Formadas por poco citoplasma y núcleo oval, tienen prolongaciones irregulares cortas, con espinas. Son fagocitos, presentan antígenos y secretan citocinas. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 71 Figura 22. Esquema de los diversos tipos de células neurogliales ((Saunders Company. 2002) Neurotransmisores Desde que el premio Nobel español Don Santiago Ramón y Cajal en 1888, demostrara la auténtica organización estructural del sistema nervioso en unidades celulares independientes, neuronas, se planteó la necesidad de un mediador para la transmisión sináptica, cuya naturaleza química ya lo sospechó a finales del siglo pasado Claude Bernard y Langley, y demostrada posteriormente por Sherrington C 1906. Uno de los hechos que más han influido en la evolución del conocimiento del SNC ha sido el descubrimiento de la existencia de sustancias de naturaleza peptídica en la neurona. Aproximadamente varias decenas de péptidos han sido localizados en neuronas del SNC y van mostrando, de forma cada vez más convincente, tener la capacidad de participar en la transmisión del impulso nervioso. Cuando un impulso nervioso llega a la terminación de la neurona, desde su membrana presináptica se libera una sustancia, el neurotransmisor, que se difunde en el espacio intersináptico y posteriormente se fija en la membrana postsináptica. En esta transmisión hay un retardo de 0,3 ms a 5 ms por los diferentes pasos implicados en la misma y según sea este retraso, la transmisión será rápida o lenta. El que la sinapsis sea excitadora o inhibidora depende del neurotransmisor liberado por la célula presináptica y de los receptores específicos de la membrana postsináptica (Bustamante E et al. 2007). La comunicación entre las neuronas se realiza gracias a la transmisión sináptica que puede ser eléctrica o química. Esta última es la más frecuente y está mediada por un mensajero químico al que clásicamente se le ha denominado neurotransmisor. En 1933, Dale establecía que una célula nerviosa sólo sintetiza y libera un único neurotransmisor, ‘’el principio de Dale’’. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 72 Figura 23. Representación esquemática de una sinapsis química (Imagen tomada de Tortora & Derrickson, 2009, capítulo 12). Existen diferentes clasificaciones de neurotransmisores. Una de las más aceptadas en la actualidad los divide en dos grandes grupos: los transmisores de acción rápida y molécula pequeña (neurotransmisores clásicos) y neuropéptidos (NP). Los transmisores de acción rápida y molécula pequeña son los que producen las respuestas más inmediatas del sistema nervioso (p.e. la transmisión de las señales sensitivas hacia el encéfalo y de las señales motoras hacia los músculos). En cambio los NP suelen provocar acciones más prolongadas, como son los cambios a largo plazo en el número de receptores neuronales, la apertura o el cierre duraderos de ciertos canales iónicos e incluso las modificaciones persistentes en la cantidad de sinapsis o su tamaño. 1.3.2. NEUROPÉPTIDOS Los NP conforman un grupo de neurotransmisores totalmente diferente a los neurotransmisores clásicos ya que se sintetizan de una forma distinta y desempeñan acciones diferentes. A partir de trabajos pioneros sobre la insulina y lipotropina (Lazure C et al. 1983) se formuló la hipótesis de que estos péptidos derivaban de un largo precursor que se escindía enzimáticamente. Mediante estudios de secuenciación de aminoácidos, Schwartz y Costa (1986) descubrieron las denominadas poliproteínas, llamadas así porque sirven de precursor de más de un péptido biológicamente activo. Estas proteínas, también denominadas prohormonas, serán fraccionadas después por enzimas específicas en fragmentos más Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 73 pequeños, formando de esta manera los NP que serán liberados posteriormente (Seidah NG et al. 1999). En 1919 se describen unas células neuronales gigantes, con aspecto secretor, en la médula espinal de los peces, hablándose por primera vez de la neurona como una célula secretora o neurosecretora (Speidel CC et al. 1922). Esto fue confirmado por Bargmann W (1968) que utilizando la técnica de tinción de Gomori, encontró unos gránulos en el interior de las células que se desplazaban hacia los axones. Apareció el término de "neurona secretora", ya que además de comportarse como las neuronas convencionales o colinérgicas, sintetizan enzimas o precursores peptídicos, almacenan la secreción en vesículas, la transportan axonalmente y las liberan, pudiendo además tener más de una secreción, lo que contradecía el principio de Dale. Estas secreciones son los neurotransmisores peptídicos. Cuando se habla de neuromodulador son aquellas sustancias cuya acción se considera reguladora y que actúa sobre grupos neuronales amplios de forma indirecta. Sin embargo hay neuropéptidos que cumplen todos los criterios necesarios para ser considerados neurotransmisores y no sólo neuromoduladores y, al revés, algunos neurotransmisores han demostrado también su actividad neuromoduladora en ciertas áreas cerebrales como por ejemplo la dopamina. Diferencias entre neuronas peptídicas y no peptídicas A diferencia de los neurotransmisores clásicos, que son sintetizados en la región presináptica de las terminaciones nerviosas y almacenados en vesículas hasta su utilización, los neuropéptidos se sintetizan en los ribosomas del soma, en forma de precursores de gran tamaño molecular, sin que tenga lugar recaptación ni tampoco síntesis a nivel del terminal nervioso (Hökfelt T et al. 1980). Actualmente, se realiza una clasificación más funcional de los mensajeros intercelulares desde el punto de vista de su estructura química en peptídicos y no peptídicos. Pertenecientes a este último grupo son: aminas (epinefrina, norepinefrina, dopamina, serotonina e histamina), acetilcolina y aminoácidos como glicina o glutamato. En 1967 se utiliza por primera vez el término de "Neurona Peptidérgica" para designar a aquellas neuronas que sintetizaban los octapéptidos oxitocina y vasopresina, liberaban estas hormonas a la sangre y también formaban sinapsis sobre la superficie de otras células (Bargmann W. 1968). La existencia de péptidos en el interior de la célula nerviosa presenta una serie de peculiaridades diferenciales con respecto a las características de las neuronas que contienen neurotransmisores primarios. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 80 Figura 24. Figura. Esquema del proceso general de síntesis neuronal de las TK a partir de los genesTAC1, TAC3 y TAC4 (Modificado de Pennefather JN et al., 2004) En cuanto al gen TAC3 (PPT II según anterior nomenclatura), éste codifica exclusivamente para la NKB (Hökfelt T et al. 2001) y su organización se asemeja bastante a la del gen TAC1 en humanos; aunque su procesamiento no es tan complejo, existen evidencias de la existencia en humanos de dos isoformas precursoras de TAC3, la αTAC3 y la βTAC3 (Page NM et al. 2004) y de una forma elongada de la NKB en el cerebro de rata (Lang S y Sperk G 1995). Varios estudios inmunorreactivos han dado negativos para la presencia de la NKB en tejidos periféricos (Moussaoui SM et al. 1992), pero sí que se encuentran niveles altos de ARNm de Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 81 NKB en la placenta humana (Page NM et al. 2003, 2010). Algunos investigadores proponen, que la distribución de la expresión de TAC3 en tejidos humanos era igual o incluso más amplia que la de TAC1 (Pinto FM et al. 2004). Por último, el gen más recientemente identificado perteneciente a la familia de las TK, es el gen TAC4 (anterior PPT III) (Zhang Y et al. 2000; Kurtz MM et al. 2002; Page NM et al. 2003). Éste puede ser procesado de manera que da origen a cuatro variantes alternativas: α, β, γ y δ, codificando cada una para cuatro péptidos diferentes clasificados como EKA, EKB, EKC y EKD (endokinina A, B, C, D respectivamente). Mientras que la EKB está codificada por las cuatro isoformas, la EKA y la EKC lo están sólo por el αTAC4 y la EKD por el β TAC4 (Page NM et al. 2003). La distribución de las cuatro isoformas de TAC4 no ha sido definida completamente, aunque sí se sabe que αTAC4 y δTAC4 se expresan en tejidos periféricos humanos, particularmente en la placenta (Page NM et al. 2003, 2004). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 82 Figura 25. Organización de los exones en los genes de TK de diferentes especies de mamíferos (Figura tomada de Page, 2005, p. 1358). 1.3.5. RECEPTORES TAQUICINÉRGICOS Los receptores taquicinérgicos son receptores pertenecientes a la familia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) (guanina nucleotide-binding regulatory proteins), son proteínas transmembranas responsables de la traducción de señales en el proceso de comunicación celular. Por su estructura, también se les llama receptores de los siete dominios transmembranas. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 83 Estos receptores comparten varias características estructurales siendo la más relevante, la existencia de un paquete de siete hélices transmembrana conectadas por seis bucles de distinta longitud. Aunque los GPCRs tienen una topología en común, cada uno va a presentar ciertas características diferenciadoras pudiendo variar especialmente en el tamaño del aminoterminal extracelular, bucles citoplasmáticos y el grupo carboxilo terminal. Receptor asociado a Proteína G genérico: 7 dominios transmembrana y 6 bucles. La proteína G es un heterotrímero constituido por una subunidad α y dos subunidades β y γ que forman un dímero. La subunidad α tiene actividad GTPasa. La unión de un agonista a su receptor específico en la superficie celular causa un cambio conformacional en el receptor permitiendo la interacción con la proteína G, y formándose un complejo de alta afinidad: agonista-receptor-proteína G. Lo que ocurre es que el dímero se disocia de la subunidad α quedando activa la proteína G. Todas las subunidades activadas producen una cascada de señalización intracelular por activación de sus proteínas efectoras. Figura 26. Estructura de un receptor de la familia de los Receptores acoplados a Proteínas G o de los siete dominios transmembranas. Se ilustra una representación del receptor en tres dimensiones. (Procedente de visual life science). Las proteínas G activadas median la estimulación o inhibición de enzimas efectoras(adenilato ciclasa y fosfolipasa C) y también canales iónicos (de calcio y potasio)(Strader C.D. et al. 1994; Lefkowitz R.J. 2000; Ozo et al. 2000) modulando los nivelesde segundos mensajeros intracelulares. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 84 La unión del NP a su receptor provoca la activación de una enzima, generalmente una adenilatociclasa, que convierte ATP en AMPc. Este AMPc se combina con una proteincinasa dependiente de adenilatociclasa (proteincinasa A), que consta de una subunidad reguladora y otra catalítica. La interacción del AMPc con la subunidad reguladora provoca la liberación de la unidad catalítica, que puede actuar sobre el ADN y producir efectos a largo plazo sobre el metabolismo, crecimiento y diferenciación celular. Otros NP actúan a través de la hidrólisis del fosfatidil inositol 4,5 bifosfato, que da lugar a la formación de otro grupo de segundos mensajeros, como el diacilglicerol y el inositol trifosfato. También existen receptores de NP acoplados a guanilatociclasa o tirosinacinasa. Figura 27. Regulación de la Proteína G trimérica (figura procedente de Cooper´s MARBAN). Basándose en los análisis comparativos de las propiedades farmacológicas de varias taquicininas, fue posible comprobar la existencia de tres receptores diferentes para estos mensajeros moleculares (Teichberg VI et al. 1981; Lee CM et al. 1982; Buck SH y Burcher E 1986, Maggi CA et al. 1993). Masu Y et al. (1987) fueron los primeros en clonar un receptor afín a la SP, el receptor de la Sustancia K, que fue el primer receptor clonado de un neuropéptido (Masu Y et al. 1987). Más tarde otros receptores de taquicininas fueron clonados en pocos años por Nakanishi S et al. (1991) y Betancur C et al. (1997). Por medio de clonación molecular y métodos electrofisiológicos, se han identificado los tres receptores de TK de mamíferos como un subgrupo de la superfamilia de receptores heptahelicales asociados Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 85 a proteína G, con un extremo amino extracelular y un extremo carboxilo citoplásmico (Nakanishi S et al. 1987; Harrison S y Geppetti P 2001; Höktfel T et al. 2001). De manera general, las TK se unen a sus receptores específicamente, aunque existe afinidad hacia los otros subtipos de receptores por el reconocimiento del grupo carboxilo del núcleo carboxi terminal de los diferentes neuropéptidos (Werge TM et al. 1994). Más recientemente tres receptores de taquicininas de mamíferos se clonaron (Hökfelt T et al. 2001): receptor NK1 (407 residuos), NK2 (398 aminoácidos), NK3 (receptor másdesconocido). Finalmente se ha clonado una variante del NK3 referido como NK4. El Receptor NK1 (RNK1) es el receptor taquicinérgico mejor caracterizado de los tres subtipos. Es miembro de la familia de los receptores acoplados a proteína G y más en concreto con las subunidades α de l a proteína de Gq y G11 (MacDonald SG et al. 1996). En el ser humano RNK1 se compone de 407 residuos de aminoácidos y tiene un peso molecular relativo de 46 kDa. (Hopkins et al. 1991).Dichos receptores poseen una moderada selectividad a las taquicininas endógenas. Así, la SP,NKA y NKB actúan como agonistas de los tres receptores, no obstante, no todos se unen con la misma afinidad. Así pues, la SP es el ligando más afín del receptor NK1, laNKA del receptor NK2 y la NKB a su receptor NK3. Gracias al desarrollo de los antagonistas tanto peptídicos como no peptídicos, se conoce más sobre el sitio unión de la SP al RNK1. De esta manera, se sabe que los giros extracelulares del segundo y tercer dominio transmembrana están involucrados en esta unión, debido al carácter hidrofílico de la SP. Los antagonistas no peptídicos hidrófobos se unen más profundamente entre los segmentos transmembrana (Gether U et al. 1993). El tercer bucle citoplásmico es responsable de la interacción de proteína G, mientras que el grupo carboxilo terminal que contiene serina y treonina, cuando se fosforila, causa la desensibilización del receptor en respuesta al estímulo repetido del agonista (O'Connor TM et al. 2004). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 86 Figura 28. Esquema modelo del receptor NK-1. Constituido por 407 aminoácidos. Contiene un extremo N-terminal extracelular, siete dominios que atraviesan la membrana, 3 bucles extracelulares (ECL1, ECL2, ECL3) y 3 bucles intracelulares (ICL1, ICL2, ICL3). (Imagen tomada de Steinhoff MS et al. 2014). Existen diferentes isoformas del RNK1 que se diferencian en la composición aminoacídica y en su peso molecular, aunque las posibles diferencias funcionales no son del todo conocidas. Kage et al. demostraron la existencia de dos isoformas del NK1R en rata; en la especie humana también están estudiadas y clonadas. Estas dos isoformas poseen los mismos dominios de unión pero se diferencian en la longitud del polipéptido generado, la forma larga posee 407 aminoácidos, mientras que la corta tan sólo 311. La expresión de ambas isoformas se distribuye de manera que la corta predomina en determinados sitios del cerebro y la larga en SNC y periférico. Parece ser que la forma corta tiene menor capacidad para la internalización del receptor. (Kage R et al.1993) Han sido descritos varios tipos de isoformas en un total de 5, siendo la mayoría de ellas descritas en la línea celular linfoblástica humana IM-9. Caberlotto L et al. (2003) determinaron diferentes isoformas en cerebro humano; van Ginkel FW y Pascual DW1996; Nakata Y et al. 1988 observaron isoformas de iguales pesos moleculares en cerebros de ratas. La SP no sólo activa los RNK1, sino también los receptores NK-2 (RNK-2) y receptor NK-3 (RNK3) en diversos tejidos y según diversas condiciones, como es la disponibilidad del receptor o bien las altas concentraciones del neuropéptido (Harrison S y Geppetti P, 2001). Se han clonado tres receptores de taquicininas de mamíferos (Hökfelt T et al. 2001): RNK1 (407 residuos), RNK-2 (398 aminoácidos), RNK-3 (465 aminoácidos). Ha sido clonado un cuarto receptor de taquicinina (Donaldson LF et al. 2001). Dichos receptores poseen una moderada Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 87 selectividad a las taquicininas endógenas. Así, la SP, NKA y NKB actúan como agonistas de los tres receptores, no obstante, no todos se unen con la misma afinidad. La afinidad relativa de RNK1 para la neuroquinina A y neuroquinina B es 100 y 500 veces menor que para SP, respectivamente (Gerard et al. 1991). Así pues, la SP es el ligando más afín del RNK1, la NKA del RNK2 y la NKB a su RNK3 (Nakanishi et al. 1991). Figura 29. Receptores de las Neuroquininas y sus ligandos. También han sido identificados los genes que codifican los tres receptores (Hershey AD 1991; Sasai Y y Nakanishi S, 1990). El gen que codifica el RNK1 ha sido llamado Receptor Tachykinin 1 (TACR1), el de RNK2 Receptor Tachykinin 2 (TACR2) y Receptor Tachykinin 3 (TACR3) para RNK3. Mediante RT-PCR, se ha establecido la presencia del gen TACR1 en diferentes tejidos humanos. Previamente a conocer la estructura genética de los RNK1, se conocía su distribución, así la mayor expresión en el SNC se encuentra a nivel del locus coeruleus, estriado ventral, hipocampo y núcleos amigdalares y en menor proporción en el córtex cerebral, aunque su distribución es muy amplia en todo el organismo humano, como en las células intersticiales arteriales de Cajal de vasos arteriales (Bobryshev YV et al. 2005), células endoteliales, islotes celulares en páncreas de ratones (Persson-Sjogren S et al. 2005), sistema inmune, células Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 88 musculares (Muñoz M et al. 2010a), tracto gastrointestinal (Holzer P y Holzer-Petsche U. 1997), pulmón (Chapman RW et al. 1998), fibroblastos (Ziche M et al. 1990), en tejido uterino de mujeres embarazadas y no embarazadas (Patak E et al. 2003, 2005) y tracto genitourinario (Green SA et al. 2006). Li Y et al demostraron la expresión del RNK1 en la línea de células madres hematopoyéticas humanas TF-1 y en células madre primarias derivadas de la sangre del cordón placentario humano (HPCB) (Li Y et al. 2000). El RNK1, se ha localizado en el hipocampo epiléptico de la Esclerosis Mesial Temporal (EMT) a nivel neuronal y glial (Blanco Martínez B, 2012) y también se expresan en la superficie de cardiomiocitos (Robinson P et al. 2009). Además, el ARNm RNK 1 ha sido situado en monocitos, macrófagos y linfocitos de sangre periférica humana (Ho WZ et al. 1997) y en sinoviocitos. Mediante inmunohistoquímica, Muñoz M et al. demostraron el RNK1 en el citoplasma y en la membrana celular de la placenta, cordón umbilical y membranas ovulares (Muñoz M et al. 2010a). Existen diferentes isoformas del RNK1 que se diferencian en la composición aminoacídica y en su peso molecular, aunque las posibles diferencias funcionales no son del todo conocidas. Hasta día de hoy, se han descrito siete isoformas, la mayoría de ellas en la línea celular linfoblástica humana IM-9 en las que se presentan las isoformas de 16, 33, 58, 78 y 116 kDa. (Payan DG et al. 1986; McGillis JP et al. 1987a) mientras que en los linfocitos normales humanos se presenta mayoritariamente la de 58 KDa. (McGillis JP et al. 1990). Caberlotto L et al. (2003) determinaron diferentes isoformas en cerebro humano; Van Ginkel FW y Pascual DW (1996) y Nakata et al (1988) observaron isoformas de iguales pesos moleculares en cerebros de ratas. También se ha descrito la existencia de RNK1 en tejido pancreático tanto tumoral como normal de un peso molecular de 46 kDa (Friess H et al. 2003). En los últimos años, Muñoz M et al han demostrado la presencia de isoformas de los RNK1 en líneas celulares tumorales humanas, en neuroblastoma, glioma (Muñoz M et al. 2005a), retinoblastoma (Muñoz M et al. 2007) adenocarcinoma gástrico y de colon (Rosso M et al. 2008) y en el cáncer de laringe (Muñoz M et al. 2008). Muñoz M, demuestra la expresión de RNK1, ARNm RNK1 y la sobreexpresión del gen del TAC1 en las líneas celulares CORL23 en el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y H69 en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) (Muñoz M et al. 2012c). En el año 2010 Muñoz et al. identificaron tres isoformas de RNK1 en las tres líneas de melanomas estudiadas MEL-HO, COLO 858, COLO 679; dos isoformas en la línea celular de leucemia de células B BE13 y tres en otra línea de células T SD-1 (Muñoz M et al. 2012b). En todas estas células el RNK1 está constitutivamente expresado, a diferencia que en la médula ósea, donde lo está de una manera inducible (Bandari et al. 2002). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 89 El RNK-2 está presente principalmente en la periferia y de una manera muy selectiva en ciertos núcleos cerebrales (Pennefather JN et al. 1993; Saffroy M et al. 2001; Tsuchida K et al. 1990). Por último, el RNK-3 se expresa sobre todo en el SNC aunque también se ha visto en ciertos tejidos periféricos como placenta, útero, músculo esquelético, vena porta y mesentérica de la rata, pulmón e hígado y ciertas neuronas entéricas de diferentes especies (Tsuchida K et al. 1990). 1.3.6. SUSTANCIA P La SP es la TK estudiada desde hace más tiempo, siendo la mejor caracterizada en cuanto a su distribución, liberación, acciones fisiológicas e implicación fisiopatológica en diversos procesos patológicos. En 1931 Von Euler US y Gaddun JH, tratando de encontrar acetilcolina en extractos hipotalámicos e intestinales de caballo, descubrieron una sustancia que producía contracciones del propio intestino y disminuía la presión sanguínea como consecuencia de la dilatación vascular (Von Euler US y Gaddun JH 1931). Este nuevo material fue designado sustancia P (P “powder”, polvo en inglés), se observaba que las propiedades de ese nuevo extracto se mantenían cuando se evaporaba al polvo seco en el extracto de los tejidos (Hökfelt T. et al. 2001). Imagen tridimensional de la molécula de SP. Chang M.M y Leeman S.E, en 1970, identificaron la Sustancia P como un undecapéptido formado por 11 aminoácidos (Chang M.M., et al. 1971) y en el mismo año Treager G.W. et al. fueron los primeros en sintetizar el compuesto (Treager G.W. et al. 1971). Studer RO y cos. (1973) aislaron SP de intestino de caballo. La secuencia de 11 aminoácidos de la SP es la siguiente: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 96 3. APARATO DIGESTIVO En la actualidad, el papel y la distribución de las TK en el tracto gastrointestinal son bien conocidos gracias a los trabajos de investigación que diversos autores han realizado durante más de dos décadas (Furness JB y Costa M, 1987; Holzer P y Holzer-Petsche U, 1997). Los tres subtipos de receptores de TK se expresan en neuronas entéricas, músculo liso, células epiteliales, sistema inmune y vasos sanguíneos. La SP está implicada junto con las restantes TK en las funciones de secreción de fluidos y electrolitos, motilidad intestinal, vascularización y función inmunitaria; se habla incluso de la regulación taquicinérgica intestinal, actividad secretora y del probable papel de los receptores de dichas sustancias como dianas terapéuticas. 4. SISTEMA RESPIRATORIO Nilsson G et al (1977) determinaron la inmunoreactividad de la SP en el aparato respiratorio, identificando fibras nerviosas de SP en el músculo, el tejido conectivo y el epitelio de la tráquea y el bronquio. Hoy día se sabe que es el más potente broncoconstrictor, con potente efecto vasodilatador; induce la secreción de moco y regula el mecanismo de aclaramiento mucociliar (Chapman RW et al. 1998). 5. SISTEMA CIRCULATORIO La SP es uno de los vasodilatadores conocidos más potentes; su capacidad vasodilatadora es 100 veces mayor que la de las bradicininas. La SP está implicada en la denominada vasodilatación neurogénica; se trataría de neuronas extrínsecas de tipo sensorial las cuales rodean los vasos sanguíneos adyacentes (Furness JB et al. 1982). 6. PIEL Diversos estudios sobre este órgano en humanos muestran inmunorreactividad para SP en los terminales nerviosos de las fibras existentes en la dermis papilar y epidermis. La SP aparece en las fibras C de la piel, lo que indica que cumple un papel fundamental en la nocicepción (Dalsgaard CJ et al. 1983; Bjorklund HC et al. 1985). Clásicamente, la inyección intradérmica de SP en el hombre da lugar a una respuesta tipo histamina, con habón, prurito y enrojecimiento, lo que confirma su implicación en la urticaria. Este efecto se bloquea con la administración de antihistamínicos (Hagermark O et al. 1978). 7. SISTEMA HEMATOPOYÉTICO Li Y et al (2000) demostraron la presencia del gen para SP y para RNK1 en las células madre hematopoyéticas humanas TF-1 y en células madre primarias derivadas de sangre del cordón umbilical humano (HPCB) (Li Y et al. 2000), por lo que la SP interviene en la regulación de la hematopoyesis. El control neuropeptídico del sistema inmune (SI) se inicia desde la propia Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 97 hematopoyesis medular. La MO está inervada por fibras nerviosas peptidérgicas y simpáticas, habiéndose encontrado fibras con expresión de TK (Fras C et al. 2003). Esta inervación es necesaria para la retención de CMH y otros progenitores en la propia MO (Afan AM et al. 1997) y se ha comprobado que cualquier alteración neural de la hematopoyesis se traduce en una disfunción inmunológica (Kang HS et al. 2004). Así, la liberación de neurotransmisores, entre los que destacan la SP y NKA, resultaría fundamental para mantener una homeostasis hematopoyética. Todo esto ha llevado a hablar de la existencia de un auténtico eje neuroinmune-hematopoyético (Rameshwar P y Gascon P, 1997). De esta manera, la SP y la NKA tienen efectos opuestos en cuanto a la proliferación de las CMH, regulando la misma por un mecanismo autocrino y/o paracrino. Parece que esta especificidad funcional viene determinada por la expresión del tipo de receptor taquicinérgico, bien sea el RNK1 o el RNK2, de forma que la SP/RNK1 estimula la proliferación de los progenitores hematopoyéticos y la NKA/RNK2 tiene un efecto inhibidor de la misma. Sin embargo resulta interesante que el fragmento 1-4 de la SP parece ser que compite con la propia SP por el RNK1 y realiza un efecto opuesto y una retroalimentación negativa sobre este receptor, de manera similar a la NKA (Kang HS et al. 2004). Estudios recientes señalan el probable papel de la enzima conversora de angiotensina y un sistema renina-angiotensina propio de la MO, a través del cual la angiotensina II actuaría de forma conjunta y coordinada con la SP y otros NP en la regulación de la hematopoyesis (Shen XZ y Bernstein KE, 2011). 8. RIÑÓN Y SISTEMA URINARIO La SP se expresa en pelvis renal y uréteres en forma de una densa red de fibras nerviosas. Dicha molécula es actualmente reconocida como sustancia natriurética y diurética, actuando a nivel central y localmente, favoreciendo el flujo sanguíneo renal, volumen de orina y excreción de sodio (Pernow B, 1983), efectos supuestamente relacionados con la acción vasodilatadora de la SP sobre los conductos eferentes renales. 9. SISTEMA ENDOCRINO En los últimos años se ha puesto de manifiesto el papel relevante que desempeñan las TK y especialmente la SP, en la regulación neuroendocrina de la reproducción (Lasaga M et al. 2011). Los cambios en la concentración de la SP plasmática durante el ciclo menstrual sugieren que ésta desempeña un papel importante en la regulación de la ovulación de diferentes mamíferos entre los que se encuentra el hombre (Kerdelhue B et al. 2000; 2006). También se ha relacionado a la SP con los cambios producidos por el envejecimiento a nivel del eje hipotálamo-hipofisario (Yuan M et al. 2005). La presencia de SP en la pars tuberalis de la hipófisis apunta su papel en la regulación de la secreción de prolactina (Skinner et al. 2009). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 98 10. APARATO REPRODUCTOR Útero, ovarios y vagina son también órganos donde se pueden encontrar fibras positivas para SP, NKA y sus receptores.La SP y el RNK1 se expresanen el cordón umbilical y la placenta en recién nacidos a término estudiados mediante técnicas inmunohistoquímicas. (Muñoz M et al. 2010a). Se ha comprobado la existencia de SP tanto en las células de Leydig testiculares de ratas (Ortega HH et al. 2006) como en células granulosas del ovario de estos roedores y se ha sugerido el papel de esta TK en la estimulación del ovocito sobre la contracción muscular de las trompas de Falopio y posterior implantación (Pintado CO et al. 2003). Tanto SP como NKA aumentan la motilidad de los espermatozoides humanos de forma proporcional a su concentración ya que éstos expresan tanto RNK1 como RNK2 (Ravina CG et al. 2007). 1.3.8. Fisiopatología relacionada con la SP y NK1R 1. SP Y NOCICEPCIÓN El papel de la SP en la transmisión del dolor no fue del todo aclarado hasta finales de los ochenta. Hasta entonces se consideraba como primer transmisor de la nocicepción en las fibras sensoriales aferentes relacionadas con la respuesta de estímulos cutáneos nocivos y en la participación de la conducción de fibras C. Estas fibras nerviosas aferentes también transmiten señales a la médula espinal en respuesta a la inflamación y al dolor, por tanto, la SP contribuye a la transmisión del dolor al sistema nervioso central provocado por los procesos inflamatorios (Holzer P et al. 1988). El asta dorsal es la primera estación relacionada con la señal aferente primaria donde se integra la información al cerebro, así datos presentados en los noventa informan del papel de la SP en el procesamiento de la información sensorial nociva hacia el cerebro. Hoy sabemos que la SP no sólo regula la excitabilidad de las neuronas nociceptivas del asta dorsal, sino que también está involucrada en el proceso de integración del dolor a nivel central y en la generación del estrés y la ansiedad que este desencadena (DeVane CL et al. 2001). Después de la estimulación eléctrica del ganglio del trigémino se ha demostrado la liberación de SP a partir de las terminales sensoriales primarias (Samsam M et al. 2000, 2001). Lo que sugirió que la SP podría actuar como un transmisor-modulador en la primera sinapsis central de la vía sensorial del trigémino. 2. RELACIÓN DE LA SP Y RNK1 CON EL SISTEMA INMUNE La SP está considerada actualmente como el principal mediador de la inflamación neurogénica, estimulando las células del endotelio vascular produciendo vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar, extravasación de plasma e infiltración granulocítica, así como la Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 99 activación de los neutrófilos y eosinófilos aumentando la expresión de los ICAM-1 en las células del endotelio vascular y mejorando por tanto, la migración transendotelial de neutrófilos y el aumento de la expresión de los CD11B de los neutrófilos humanos (Nakagawa N et al. 1995; Quinlan KL et al. 1998). La SP, es un modulador de la neuroinmunorregulación, en particular de las funciones inmunes de los fagocitos mononucleares. La SP es secretada por células inmunes humanas, participa en la inmunorregulación de modo autocrina y está implicada en la patogénesis de la enfermedades mediadas inmunológicamente, incluyendo enfermedades neuroinmunológicas y el SIDA (Muñoz M et al. 2011a). La SP es un potente inmunomodulador que enlaza el sistema nervioso y el sistema inmunológico (Muñoz M et al. 2011a). Figura 32. Iniciación inflamatoria neurogénica de edema vasogénico (Lewis KM et al, 2013) La SP provoca vasodilatación actuando directamente sobre las células del músculo liso e indirectamente por estimular la liberación de histamina de los mastocitos (Shibata H et al. 1985). Es una molécula neuroinmunorreguladora de los sistemas inmunes clásicos celular y humoral, ya que puede estimular la proliferación de células T (Payan DG et al. 1983), la diferenciación de células B, la degranulación de los mastocitos y estimular la diapédesis de los leucocitos (Krause JE et al. 1992; McGillis JP et al. 1990). La SP contribuye al reclutamiento de leucocitos en los procesos inflamatorios, aumenta la producción de citoquinas y favorece la quimiotaxis en los leucocitos a través de los RNK1. La SP induce la síntesis de citoquinas proinflamatorias en células de la neuroglia y células linfoides y aumenta la expresión de las IL2 en células T (Calvo CF et al. 1992; Rameshwar P et al. 1993). Estimula la producción de IL-1, IL-6 y TNF-α por los astrocitos y microglías (Gitter BD et al. 1994) y por los macrófagos (Lotz M et al. 1988; Kimball ES y Fisher MC 1988). La SP regula las funciones inmunes de los fagocitos mononucleares, activa NF-kB, un factor de transcripción, implicado en el control de la expresión de citoquinas (Marriot I et al. 2000; Lieb Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 100 K et al. 1997) y productos de genes proinflamatorios (Schreck R et al. 1991) y estimula monocitos sanguíneos periféricos humanos para producir citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-1, IL-6, IL-12 y TNF-α (Lotz M et al. 1988; Kincy-Cain T et al. 1997). Además, el ARNm de la SP y la SP han sido situados en monocitos, macrófagos y linfocitos de sangre periférica humana así como la presencia de ARNm RNK1 en la misma localización (Ho WZ et al. 1997). Lieb K et al (1997) investigarían el efecto de activación de la SP sobre el NF-kB en la línea celular del astrocitoma humano sugiriendo que sería un mediador esencial en la síntesis de citoquinas inducida por la SP, con un papel muy importante en la regulación de la expresión de moléculas proinflamatorias como IL-8 y que además participa en la regulación de la apoptosis. De ahí la estrecha relación existente entre la neuropatología de las citoquinas inflamatorias y ciertas enfermedades como la Enfermedad de Alzheimer, la demencia en el SIDA y la esclerosis múltiple en las que la SP puede iniciar ó exacerbar el proceso inflamatorio observado en estas enfermedades (Barker R et al. 1991). Debido a que la SP es secretada por monocitos y macrófagos humanos y porque participa en la inmunorregulación autocrina (Pascual DW et al. 1990; Castagliuolo I et al. 1998), el péptido puede estar implicado en la patogénesis de la enfermedades mediadas inmunológicamente, incluyendo enfermedades neuroinmunológicas y las producidas por el virus de la inmunodeficiencia humana VIH/SIDA (Azzari C et al. 1992). La regulación de la función de las células inmunes por la SP podría originarse no sólo de fuentes neuronales (nervios sensoriales e inflamación neurogénica) sino también de elementos no neuronales como eosinófilos y macrófagos; además, la expresión de la SP y de los RNK1 en estas células, están aumentados durante la inflamación (Weinstock JV et al. 1988; Cook GA et al. 1994). La SP es un importante regulador de motilidad en varias células, in vitro, media la quimiotaxis de los leucocitos de sangre periférica en humanos (Schratzberger P et al. 1997). La secuencia carboxilo-terminal de la SP induce la quimiotaxis de los monocitos humanos (Ruff MR et al. 1985). El péptido también tiene efectos quimiotácticos en eosinófilos(Dunzendofer S et al. 1998) y estimula la migración de las células natural-killer(NK) de forma dosis dependiente (Feistritzer C et al. 2003). Además, se ha demostrado que la SP induce una cambio rápido en la forma celular, incluyendo la formación de vesículas en la membrana de los fibroblastos (Meski J et al. 2009). Las células NKconstituyen la principal población linfocitaria de la inmunidad innata. Se ha descrito que la SP aumenta su citotoxicidad y reduce su actividad migratoria (Lang K et al. 2003), si bien estudios posteriores han demostrado que si se deja incubar a dichas células con SP el efecto es contrario y su citotoxicidad disminuye (y se reduce su degranulación), siendo este efecto mediado por el RNK1 (Monaco-Shawver et al. 2011). Esta aparente contradicción se podría explicar por la mayor exposición a SP a la que se sometía las células NKdel segundo estudio y puede justificar el hecho de que en circunstancias en las que se eleva la concentración plasmática de SP, como son la infección por VIH o la depresión, estas células disminuyan su capacidad funcional. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 101 Las células dendríticas (CD), pertenecientes al sistema mononuclear fagocítico, forman parte de la inmunidad innata y actúan como las más potentes células presentadoras de antígenos profesionales de nuestro sistema inmune. La liberación de SP en el foco inflamatorio es capaz de reclutar CD inmaduras hacia el mismo (Lambrecht BN et al. 2001). Y es que las CD expresan RNK1 de forma constitutiva y son capaces de aumentar la expresión de este receptor ante estímulos como lipopolisacáridos bacterianos (Janelsins BM et al. 2009; O'Connor BM et al. 2004). Además, tanto la SP como sus análogos a concentraciones fisiológicas inducen un efecto antiapoptótico sobre estas CD, mediado por el RNK1 (Janelsins BM et al. 2009). Por todo esto se cree que las CD desempeñan un papel fundamental como dianas directas del elevado número de citoquinas proinflamatorias que se liberan en el foco de inflamación. También se ha informado que SP estimula agregación de las plaquetas a través de la movilización intracelular del calcio y la degranulación (Shibata H et al. 1985). Las plaquetas expresan tanto SP y RNK1. Estos datos implican que la SP regula la función plaquetaria y los antagonistas de los RNK1 podrían inhibir agregación plaquetaria (Graham GJ et al. 2004). La inhibición del RNK1 disminuye la formación de trombos, aumenta el tiempo de sangrado en ratones y disminuye el tromboembolismo inducido experimentalmente (Jones S et al. 2008). El edema inducido por la SP es principalmente debido al aumento de la permeabilidad vascular mediada a través su acción sobre los RNK1 situados en las vénulas post-capilares en las células endoteliales (Lembeck F et al. 1992). SP induce la contracción de las células endoteliales y la extravasación de plasma posterior permiten que sustancias tales como la bradicinina e histamina puedan tener acceso al sitio de la lesión. En estos procesos, la SP también interactúa con otros neurotransmisores. La SP y otra taquicinina, la NKA, están íntimamente relacionada con la inflamación neurogénica y tienen una relación dependiente de los niveles de SP/NKA (Cao YQ et al.1998). Además, la disponibilidad de modelos animales knockout para SP/NKA ha permitido comprobar que la expresión de estas TK en las neuronas sensoriales y células hematopoyéticas es necesaria para el desarrollo de inflamación en la vía aérea tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo (Chavolla-Calderón M et al. 2003). El óxido nítrico endógeno, modula la formación de edema mediada por SP (Hughes SR et al. 1990). También se ha demostrado que la SP induce la proliferación de linfocitos T (Scicchinato R et al. 1988; Nio DA et al. 1993) y que las células inmunes producen SP y también expresan su receptor RNK1 (Lai JP et al. 1998). Por otra parte, los linfocitos T humanos contienen ARNm preprotaquicininas, que codifican y producen SP (Lai JP et al. 1998). La activación con un lipopolisacárido in vitro produce un marcado aumento de la expresión de SP en los fagocitos mononucleares y células dendríticas (Lambrecht BN et al. 1999). Además, la SP ha sido implicada en procesos inflamatorios del aparato respiratorio, gastrointestinal y sistemas musculoesquelético. En los pacientes con asma, la expresión de SP Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 102 y RNK1 está aumentada en los bronquios (Advenier C et al. 1999). La inflamación neurogénica también participa en la fisiopatología de los virus asociados a infección respiratoria y en la sarcoidosis (O´Connor TM et al. 2004). También se ha establecido su relación con el liquen plano oral, enfermedad mucocutánea inflamatoria crónica (González Moles MA et al. 2009). Los efectos de esta TK se amplifican por la pérdida de su principal enzima degradante, la endopeptidasa neutra (EPN), en las células epiteliales que resultan dañadas en los procesos crónicos (Hwang L et al. 1993). La SP también regula la contractilidad del músculo liso, el transporte epitelial de iones, la permeabilidad vascular y la función inmune en el tracto gastrointestinal. Se ha demostrado la elevación de la expresión de SP y del RNK1 en el recto y el colon de pacientes con la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (O’Connor TM et al. 2004). Se ha encontrado un aumento de los niveles de SP en el fluido sinovial y el suero de pacientes con artritis reumatoide (AR). La SP estimula la producción de prostaglandina E2 y la liberación de colagenasa por los sinoviocitos en la AR y aumenta la proliferación de estos sinoviocitos (Lotz et al. 1987). El ARNm RNK1 está incrementado en los sinoviocitos en la AR (Krause JE et al. 1992). Estos hallazgos apoyan el papel de la SP en la destrucción del cartílago, el desarrollo de la lesión ósea y la formación de pannus en la artritis. O’Connor TM et al (2004) correlacionan niveles elevados de SP en sangre y el aumento de expresión de los RNK1 en enfermedades inflamatorias como asma, enfermedad inflamatoria intestinal, sarcoidosis y artritis reumatoide. Los glucocorticoides pueden atenuar la inflamación neurogénica disminuyendo la expresión del RNK1 en células epiteliales y en células inflamatorias y por aumento de la producción de endopeptidasa (EPN), enzima que degrada la SP. Por lo tanto, la prevención de los efectos proinflamatorios de la SP, utilizando antagonistas de los RNK1pueden tener potencial efecto terapéutico en enfermedades inflamatorias tales como asma, sarcoidosis, bronquitis crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, cistitis, artritis reumatoide y de hecho en todas las enfermedades inflamatorias (O’Connor TM et al. 2004). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 103 Figura 33. Representación esquemática del mecanismo molecular en la comunicación entre células nerviosas y mastocitos. La naturaleza e intensidad de la respuesta inmune depende en gran medida de la diferenciación de las células Th (T helpers) CD4+ efectoras. Estos linfocitos Th CD4+ vírgenes pueden diferenciarse hacia Th1 (responsables de la inmunidad celular frente a virus y patógenos intracelulares), Th2 (implicados en trastornos alérgicos y control de infecciones por helmintos),Th17 y células T reguladoras (Treg). Las células Th17 inducen una respuesta inmune protectora frente a bacterias y hongos y están involucrados en la fisiopatología de las enfermedades inflamatorias crónicas (artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis...).Las células Treg frenan la respuesta efectora T celular que en caso de ser excesiva, podría dañar los tejidos del propio huésped y mantiene la tolerancia periférica de las célulasT. Figura 34. Diferenciación de las células Th. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 104 3. SP Y NEOANGIOGÉNESIS Un proceso característico de la inflamación es la neoangiogénesis, creación de nuevos vasos capilares y crecimiento de éstos a partir del sistema vascular preexistente con el consecuente incremento del flujo sanguíneo. Existen varios estudios en los que se ha relacionado la SP con la neoangiogénesis tanto in vivo como in vitro. Ziche M et al. (1990, 1994) describieron como la SP estimula la neovascularización in vivo, a través de la inducción de la proliferación de las células endoteliales, mientras que antagonistas específicos de la SP bloquean esta respuesta en córnea de conejo. Fan TP et al. (1993) confirmaron la acción proangiogénica de la SP y mostraron también su inhibición por antagonistas del RNK1 en rata (Fan TP et al. 1993). Walsh DA et al (1996), utilizando un modelo experimental en ratas, pusieron también de manifiesto que la SP aumenta la angiogénesis por una acción directa mediada por los RNK1 en la microvascularización, siendo un proceso esencial en la cura de heridas y en la inflamación. Por otra parte, experimentos in vivo han demostrado que la SP endógena podría estar implicada en la neoangiogénesis relacionada con la inflamación neurogénica (Seegers HC et al. 2003). Además, la neoangiogénesis se ha relacionado con el incremento de expresión de los RNK1 (Singh D et al. 2000). 4. CÁNCER Y SP Una de las implicaciones más relevantes de la SP es la capacidad mitogénica en varios tiposde células normales como en células del tejido conectivo, sinoviocitos, fibroblastos y linfocitos (Nilsson J et al. 1985; Lotz M et al. 1987; Ziche M et al. 1990 y Payan DG et al. 1983). Hennig IM et al. (1995) identificaron la presencia de RNK1, en células tumorales de astrocitomas, glioblastomas, carcinoma medular de tiroides, cáncer de mama y ganglioneuroblastomas. En muchos de estos tumores se encontraron receptores de la SP tanto intratumoral como en vasos peritumorales. El estudio de Hennig IM tiene mayor interés en el contexto de otros estudios donde la presencia de la SP es detectada en algunos tumores cerebrales primarios (Allen JM et al. 1985), de ahí que la combinación de ambos estudios sugieran fuertemente la presencia tanto de la SP como de su receptor en tumores cerebrales primarios y eleven la posibilidad de la existencia de un sistema autocrino en tumores cerebrales. Los estudios realizados por Muñoz M et al. han demostrado la capacidad mitogénica de la SP y la presencia del RNK1 en distintas líneas celulares tumorales humanas, neuroblastoma SKN-BE (2) y glioma GAMG (Muñoz M et al. 2004a; 2005a), retinoblastoma WERI-Rb-1 e Y-79 (Muñoz et al. 2005b; Muñoz et al. 2007b), carcinoma de páncreas (Muñoz et al. 2006), cáncer de laringe HEp-2 (Muñoz M et al. 2008), adenocarcinoma gástrico y de colon (Muñoz M, Rosso ML et al. 2008), melanomas (Muñoz M et al. 2010f) en leucemia linfoblástica aguda (Muñoz et al. 2012b) y en pulmón (Muñoz et al. 2012c). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 105 También se ha estudiado el papel de la SP y su receptor en el tejido tumoral del cáncer de páncreas (Friess H et al. 2003), tumor queratoquístico odontogénico (González Moles MA et al. 2008) y en el carcinoma oral de células escamosas (Brener S et al. 2009). Además de inducir el crecimiento tumoral, la SP tiene la capacidad de estimular la angiogénesis, favorece la migración celular y con ello la diseminación metastásica. Se ha visto con anterioridad, que la SP se relaciona con la inflamación, por lo que se piensa que este neuropéptido favorecería el desarrollo de tumores en órganos que están sometidos a inflamación crónica. Los RNK1 se sobreexpresan en los tumores y las células tumorales expresan varias isoformas del RNK1. Dicha expresión se relaciona con el grado de malignidad del tumor (Muñoz M y Coveñas R, 2013b). 5. SP EN LA EMESIS DE LA POSTQUIMIOTERAPIA Las náuseas y vómitos por la quimioterapia desempeñan un papel importante en la calidad de vida de los pacientes, por lo que controlarlos, mejoraría el estado general del enfermo oncológico. Conocemos que la SP se localiza en las regiones del troncoencéfalo asociadas a los vómitos. Navari et al. (1999), investigaron la posibilidad de bloquear SP/RNK1 con alguna molécula, debido a que ninguno de los fármacos antiemético disponibles en la actualidad son totalmente eficaces en la prevención de nauseas y vómitos. Se demostró que un antagonista de los receptores de la SP presenta efectos beneficiosos en la prevención de nauseas y vómitos en pacientes sometidos a quimioterapia (Tattersall FD et al. 1993; Bountra C et al. 1993; Gonsalves S et al. 1996; Muñoz M y Coveñas R, 2013c). 6. SP E INFECCIONES VIRALES 1. VIH La SP es un inmunomodulador que regula las funciones inmunes de los fagocitos mononucleares, estimula a los monocitos sanguíneos periféricos humanos para producir citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-1, IL-6, IL-12 y TNF-α (Lotz M et al. 1988; KincyCain T et al. 1997). Sabemos que estas citoquinas alteran la expresión del VIH en las células T y en los monocitos (Rosenberg ZF et al. 1990,1991). La SP se ha implicado en la patogénesis de las enfermedades mediadas inmunológicamente, incluyendo enfermedades neuroinmunológicas y el virus de la inmunodeficiencia humana VIH / SIDA (Azzari C et al. 1992). La SP puede jugar un papel importante en la fisiopatología de los trastornos neuropsiquiátricos, como el estrés y la depresión en personas con VIH y en la inmunopatogénesis de la enfermedad del VIH (Muñoz M et al. 2011a). Recientemente se ha Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 112 1.3.9. ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES NK1 El desarrollo de los antagonistas de la SP, sensibles y selectivos, ha permitido comprender mejor las acciones biológicas de la SP y la fisiopatología del RNK1 (Muñoz M et al. 2011b). En un primer momento, surgen los antagonistas peptídicos pero con ciertas limitaciones, como son su menor afinidad al receptor, su inestabilidad metabólica, su incapacidad para atravesar la barrera hematoencefálica, su neurotoxicidad si es administrado en el SNC y una rápida inactivación por peptidasas. Estas limitaciones motivaron la ampliación de la investigación hacia moléculas no peptídicas con capacidad de unión a los receptores de las taquicininas. Los antagonistas no peptídicos de RNK1 son pequeñas moléculas lipofílicas que actúan en el sistema nervioso central, ya que son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. La estructura química de cada antagonista es diferente, pero todos se unen al RNK1, sin embargo, todos estos compuestos químicos tienen algo en común que es su estructura tridimensional o estereoquímica, que viene determinada por la afinidad al receptor. Se sabe que hay muy poca superposición entre los sitios de unión de la SP y los antagonistas del RNK1. Todos los antagonistas de los RNK1 tienen la misma acción terapéutica, la diferencia está en la concentración del antagonista ya que son dosis dependientes y la afinidad al RNK1. Con el desarrollo del primer antagonista no peptídico de los RNK1, CP-96, 345, sintetizado por Snider RM et al. (1991), pudo ser analizado el sitio de unión del antagonista competitivo no peptídico y del neuropéptido SP, demostrándose que mientras la SP se une en los giros extracelulares de las hélices transmembrana del receptor por su carácter hidrofílico, los antagonistas no peptídicos hidrófobos se unen más profundamente entre los segmentos transmembrana (Gether U et al. 1993). Podemos hablar de más de treinta compuestos de diferente naturaleza (Giardina GAM et al. 2003). Estos antagonistas producen analgesia (Rupniak NM et al. 1996), tienen efectos antidepresivos (Kramer M et al. 1998), ansiolíticos (Quartara L y Maggi CA, 1998), antieméticos (Rupniak NM y Kramer M, 1999) y antitumorales (Lang K et al. 2004; Muñoz M et al. 2004a, 2005a, 2005b, 2007a, 2007b, 2008, 2010f, 2011c, 2012b, 2012c). Bang R et al (2003) demuestran que el L-733,060, puede ser un buen antiinflamatorio y protector hepático que reduce la inflamación, el edema, la infiltración neutrofílica, la apoptosis y la necrosis del hepatocito en un modelo de inflamación hepática en ratón. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 113 Figura 36. La SP y el aprepitant (bloqueante del RNK1) Tienen distintos sitios de unión al RNK1. El antagonista se une a los segmentos profundos transmenbranas de RNK1 y la SP a las hélices extracelulares del RNK1 (Muñoz M, 2011b, página 2). 1.3.9.1. ANTAGONISTAS PEPTÍDICOS La serie de antagonistas peptídicos se basan en el intercambio de un L aminoácido por un D aminoácido de la secuencia de la SP, con lo cual se comporta desde el punto de vista funcional como un antagonista de los RNK1 o de la SP. Se han utilizado de manera muy extensa y nombramos aquellos de mayor potencia, los más utilizados desde el punto de vista clínico. - [D-Arg1, D-Trp5,7,9, Leu11] SP - [D-Arg1, D-Pro2, D-Trp 7,9, Leu11] SP - [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] SP - [Arg6, D-Trp7, 9, MePhe8] SP (6-11) - [D-Pro2Trp7, 9] SP - [D-Arg1, D-Trp 7, 9, Leu11] SP (Spantide I) -H-D-Lys(Nicotinoyl)-Pro-[3-(3-pyridyl)-Ala]-pro-D-Phe83,4-Cl2)-Asn-D-Trp-Phe-D-TrpLeu-Nle-NH2 (Spantide II) - [D-Pro4, D-Trp 7,9,10, Phe11] SP (4-11) Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 114 - Antagonistas peptídicos de cadena corta: NY 3238, NY 3460, NY 3521 1.3.9.2. ANTAGONISTAS NO PEPTÍDICOS Los antagonistas no peptídico pueden ser amonios cuaternarios derivados de la quinuclidina, análogos de la piperazina y los compuestos piperidínicos y derivados del triptófano entre otras estructuras químicas. Desde que están disponibles los antagonistas no peptídicos de los RNK1 (Maggi CA et al. 1993; Regoli D et al. 1994), ha habido un incremento de artículos describiendo nuevos antagonistas (Quartara L y Maggi CA, 1997) y esteroides como WIN-51,708, tipo perhidroisoindolonas (RP-67,580, RP-73,467, RPR-100,893), benzilamino y benziléter, quinuclidina (CP-96,345, L-709,210), benzilamino piperidinas (CP-99,994, GR-203,040, GR-205, 171 (Vofopitant), CP122,721, benziléter piperidinas (L-733, 060, L-741, 671, L-742, 694…) y derivados del triptófano (L-732,138, L-737,488 ) (Muñoz M et al. 2011b).  SR-1, 400.333  MEN-11,467  MEN-11,149  Ezlopitant (CJ-11, 974)  CJ-12,458 (Metabolito activo del Ezlopitant)  CJ-12,764 (Metabolito activo del Ezlopitant)  MK-869 (L-754,030, aprepitant, Emend)  Fosaprepitant (Ivemend, MK-0517, L-758, 298) sal del aprepitant de uso intravenoso.  L-758,298  Maropitant L-759,274  Casopitant (GW-679,769)  Vestipitant  Rolapitant y serlopitant Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 115 Figura 37. Representación tridimensional de la estructura química de L-732,138 (a), L-733,060 (b) y aprepitant (c). Los átomos de carbono están representados en gris, hidrógeno en blanco, nitrógeno en azul, oxígeno en rojo y flúor en amarillo (Modificado de Rosso ML, Muñoz M y Berger, 2012, p. 10). Desde el punto de vista clínico, debemos destacar el papel que desempeñan los antagonistas selectivos de la SP y por tanto de los RNK1, tales como: CP-96,345, CP-99,994 , RP-67,580, L733,060, SR-1400333, GR-203040, MEN-11,467, MEN-11,149, Vofopitant (GR-205,171), CP122,721, Ezlopitant (CJ-11,974), CJ-12,458 y CJ-12,764 (metabolitos activos de Ezlopitant), MK869 (L-754,030, aprepitant), L-758,298, L-742,694 y L-759,274 (Steinhoff MS et al. 2014). Entre los antagonistas de RNK1 más destacados se hallan: El L-733,060 es un compuesto que fue desarrollado a partir de CP-99,994 que muestra una alta afinidad por RNK1 in vitro en humanos (Muñoz M et al. 2011b). Este antagonista produce analgesia, efectos antidepresivos y es utilizado para los trastornos del estado de ánimo, posee efectos antitumorales y protectores de la inflamación hepática (Rupniak NM et al. 1996; Kramer MS et al. 1998; Muñoz M et al. 2004; Rosso M et al. 2008). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 116 El L-732,138, es aproximadamente 1.000 veces más potente para el RNK1 que para el RNK-2 y RNK-3 en humanos y 200 veces más potentes en RNK1 humanos que en ratas (MacLeod, 1994). La L-732,138 es capaz de antagonizar la permeabilidad vascular de la piel, produce una atenuación de hiperalgesia (Cahill CM et al. 2002) y ejerce una acciónantitumoral contra varias líneas celulares tumorales humanas (Muñoz M et al. 2007a, 2007b, 2008, 2010f, 2011c, 2012b, 2012c). Se sabe que el MK-869 (aprepitant) muestra una alta afinidad por el RNK1 y es aproximadamente 3.000 veces más selectivos para el RNK1 que para el RNK3 y es 45.000 veces más selectivo para el RNK1 que para el RNK2. El MK-869 es utilizado para el tratamiento del dolor, la migraña, la emesis y los trastornos psiquiátricos (Kramer MS et al. 1998). Se ha demostrado que el aprepitant es un fármaco antitumoral de amplio espectro (Muñoz M et al. 2010d). 1.3.9.3. USOS TERAPÉUTICOS DE LOS ANTAGONISTAS RNK1 Figura 38. Los antagonistas de los RNK1 podrían bloquear la fisiopatológico acciones mediadas por la SP (Muñoz y Coveñas, 2014) Los antagonistas no peptídicos presentan un amplio rango de usos terapéuticos (Maggi CA et al. 1993; Harrison S et al. 1994; Regoli D et al. 1994; Quartara L y Maggi CA, 1997; Rupniak NM et al. 2000; Giardina GAM et al. 2003) de entre ellas se destacan las más relevantes: Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 117 1. ANALGÉSICO La primera generación de antagonistas no peptídico son potentes inhibidores de la excitación del asta dorsal de la médula (Radhakrishnan V y Henry JL, 1991). La molécula L-733,060, antagonista no peptídico, tiene buena penetrancia en el SNC y es de larga duración de acción (Rupniak NM et al. 1996; Cirillo R et al. 1998). Varios estudios preclínicos han sido elaborados para confirmar la capacidad de L-733,060 de antagonizar los efectos de la SP vía específica del RNK1, como demuestran los primeros estudios de Rupniak NM et al. (1996), en el que tras administrar el L-733,060 intravenoso a gerbos, lograba controlar la fase de pataleo inducida farmacológicamente por la administración de análogos de la SP, consiguiendo controlar así el dolor, bloqueando específicamente los receptores para la SP. Se ha demostrado que durante la migraña, el tratamiento con el antagonista del RNK1, L 733, 060, inhibe las fugas de proteínas plasmáticas al espacio extracelular inducido por la SP (Bolay H et al. 2002). 2. ANTIEMÉTICO El RNK1 se encuentra localizado en las neuronas troncoencefálicas que constituyen el centro del vómito en el SNC (área postrema). Una de las áreas en las que se han utilizado más los antagonistas de los RNK1, ha sido para prevenir el vómito postquirúrgico y postquimioterápico; así cabe destacar los trabajos de Tattersall FD et al. (1993), Bountra C et al. (1993) y de Gonsalves S et al. 1996), en hurones en el que concluye que el bloqueo del vómito por el antagonista no peptídico lo realiza por una acción específica contra los RNK1. La CP-99,994 puede abolir la émesis precoz y tardía tras la administración de cisplatino (Rudd JA et al. 1996). El aprepitant es el único fármaco antagonista del RNK1 aprobado por la Food and Drug American (FDA) y la Agencia Europea del Medicamento (Curran MP. 2009) y realiza también un efecto preventivo antiemético postquimioterapia a través del bloqueo del RNK1 (Muñoz M et al. 2011a). 3. ANSIOLÍTICO Y ANTIDEPRESIVO Los estudios realizados en esta área, se basaron en la presencia de RNK1 en las regiones cerebrales relacionadas con el comportamiento emocional, de ahí que se plantearan ensayos preclínicos en gerbos y cobayas por tener RNK1 de las mismas propiedades que los existentes en humanos. Destacan los ensayos realizados por Kramer MS et al. (1998), Rupniak NM et al. (2000) en que demuestran la capacidad ansiolítica de estos compuestos. De los estudios realizados en humanos cabe destacar a Kramer MS et al. (1998), que realizó un ensayo clínico a Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 118 doble ciego comparando el MK-869 (aprepitant) con la paroxetina y el placebo observando igual eficacia como antidepresivo que la paroxetina y con efectos secundarios similares al placebo. Este estudio se contradice con el realizado por Keller M, en que muestra la eficacia de laparoxetina y la ineficacia del aprepitant (Keller M et al. 2006). No obstante, las dosis deaprepitant de este estudio fueron de 160 mg/día y en el estudio de Kramer MS se administró 300 mg/día. La activación del RNK1 por la SP se ha relacionado con la modulación de la respuesta al estrés (Ebner K et al. 2004, 2007, 2008a, 2008b) y la supresión genética del RNK1 es ansiolítica y antidepresiva (Kramer MS et al. 1998; Texeira RM et al. 1996; Rupniak NM et al. 2001). 4. ANTIEPILÉPTICO La adición de un bloqueante del RNK1 al tratamiento actual con los bloqueadores de los canales de sodio como la lamotrigina, puede ser beneficioso en pacientes que sufren epilepsia refractaria (Kalinichev M et al. 2010; Muñoz M y Coveñas R, 2013c). 5. ANTITUMORAL El sistema SP/RNK1 juega un papel importante en el cáncer. SP promueve la proliferación de las células tumorales, la angiogénesis y la migración de las células tumorales (Muñoz M et al. 2015). A partir del año 2000 son muchas publicaciones las que avalan la posibilidad de la implicación de la SP y RNK1 en la oncogénesis en distintos órganos (Luo W et al. 1996; Muñoz M et al. 2004a, 2004b, 2005a, 2005b; Friess H at al. 2003; Palma C et al. 1999; Palma C et al. 2000; Singh D et al. 2000; Muñoz M et al. 2006, 2007a, 2007b, 2008, 2010f, 2011c, 2012b, 2012c; Lang K et al. 2004) . En el año 2004 fue utilizado el L-733,060 para inhibir la migración de las células del carcinoma de mama (Lang K et al. 2004). Por último, ha sido descrito que el L-733,060 actúa como un agente antitumoral en líneas celulares tumorales humanas de melanomas (Muñoz M et al. 2004b), gliomas, neuroblastomas (Muñoz M et al. 2004a, 2005a) y retinoblastomas (Muñoz M et al. 2005b, 2007b) así como en carcinoma de páncreas (Muñoz et al. 2006), carcinoma de laringe (Muñoz et al. 2008) carcinoma gastrointestinal (Rosso et al. 2008) y en leucemias linfoblásticas (Muñoz et al. 2012b). Muñoz M, demuestra la expresión de RNK1, ARNm RNK1, sobreexpresión del gen delTAC1 en las líneas celulares COR-L23 en el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y en líneas celulares H69 en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cómo antagonistas del Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 119 RNK1 (aprepitant Emend, L-733,060, L-732,138) inhiben el crecimiento y producen la muerte de las células tumorales en el cáncer de pulmón de ambas líneas celulares y esta se produce a través del RNK1. También demuestran la presencia de RNK1 y SP en todas las células tumorales de las muestras estudiadas SCLC y NSCLC (Muñoz M et al. 2012c). Además de producir inhibición de 73 líneas celulares tumorales de distintos tipos de cánceres, concentración dependiente, producen muerte celular vía apoptosis. Son líneas celulares tumorales que expresan los RNK1. La SP induce la mitogénesis en líneas celulares tumorales humanas (Muñoz M et al. 2011b). Todos estos datos indican un mecanismo común para la proliferación celular mediada por el sistema receptor SP/RNK1. Se ha demostrado que la L-733,060, en combinación con vinblastina, es sinérgico para la inhibición del crecimiento de líneas celulares de cáncer que expresan el RNK1 pero no para las células normales de fibroblastos. Esto indica que los efectos aditivos beneficiosos de ambas moléculas puede ser de utilidad clínica (Muñoz M et al. 2010e). La angiogénesis, característica del tumor en desarrollo, se asocia con un aumento de la inervación del tejido y de la expresión del RNK1, que se encuentra en vasos sanguíneos tanto intra como peritumorales y la SP estimula la proliferación de células endoteliales (Singh D et al. 2000), dicha angiogénesis es inhibida por los antagonistas de los RNK1 ( Guha S et al. 2005). La migración celular tumoral, es un prerrequisito para la invasión y metástasis y es dependiente de las sustancias de señal de los sistemas inmune, sistemas nervioso y endocrino que a su vez es regulado por neurotransmisores (Entschladen et al. 2002). Sabemos que el antagonista RNK1, L-733,060, inhibe completamente las metástasis mediada por SP/RNK1 (Lang K et al. 2004), que la SP induce cambios en la forma celular previos a la migración celular (Fackler OT et al. 2008; Meshki J et al. 2009) y que los antagonistas de los RNK1 como el aprepitant bloquean dichos cambios (Meshki J et al. 2009). En los últimos años Exadaktylos y Muñoz, han informado que el sistema SP/RNK1 podría estar involucrado en las recidivas y en las metástasis del cáncer de mama (Exadaktylos et al. 2006; Muñoz M et al. 2010g). En resumen, parece que el sistema SP/RNK1 podría regular el crecimiento de la masa tumoral, la angiogénesis y la metástasis, puesto que se sobreexpresa en células tumorales y en tejidos peritumorales ( Muñoz M et al. 2011b). Todos estos datos también indican que antagonistas de RNK1 ejercen tres acciones; antiproliferativas por inhibición del crecimiento y por apoptosis de las células tumorales, antiangiogénica y antimetastásica. Por lo tanto, los antagonistas podrían ser buenos candidatos como fármacos antineoplásicos de muy amplio espectro. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 120 El uso de antagonistas de los receptores NK1 tales como aprepitant (utilizado en la práctica clínica) como agentes antitumorales podría ser una innovación prometedora. Antagonistas de los RNK1 podrían actuar como fármacos específicos contra las células tumorales y estos antagonistas podrían ser candidatos prometedores en el tratamiento contra el cáncer. Muñoz M et al. 2015) 6. DESHABITUACIÓN ALCOHÓLICA La delección genética del RNK1, suprime la necesidad de ingestión de alcohol y el antagonista del RNK1, L-703, 606, ejerce el mismo efecto al bloquear dicho receptor. Además, se ha informado que el antagonista del RNK1, LY-686, 017, suprime la ansiedad por el consumo de alcohol y tiene un efecto beneficioso sobre el bienestar del paciente. Por lo tanto, los antagonistas del RNK1, han surgido como candidatos atractivos para el tratamiento del alcoholismo (Muñoz M et al. 2011a). 7. ANTIINFLAMATORIO La prevención de los efectos proinflamatorios de la SP, utilizando antagonistas de los RNK1, pueden tener potencial efecto terapéutico en enfermedades inflamatorias tales como asma, sarcoidosis, bronquitis crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, cistitis, artritis reumatoide, y de hecho en todas las enferm edades inflamatorias (Joos GF et al. 2000; O’Connor TM et al.2004). La inhibición por antagonista del RNK1 disminuye la formación de trombos, aumenta el tiempo de sangrado en ratones y disminuye el tromboembolismo inducido experimentalmente (Jones S et al. 2008). 8. PROTECTOR HEPÁTICO El tratamiento previo con antagonistas de los RNK1 (CP-96,345, L-733,060), protege contra la lesión hepática de forma dosis-dependiente. El bloqueo del RNK1 reduce la inflamación y el daño hepático, inhibe la producción de TNF-α y IFNγ e incrementa la síntesis de las interleuquinas hepatoprotectoras, IL-6 e IL-10 en hígado de ratón. Por lo que podrían ser potentes fármacos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del hígado, la mayoría probablemente a través de la inhibición de los efectos de la SP (George DT et al. 2008, BangR et al. 2003, 2004). 9. ANTIPRURIGINOSO Y ANTICOLESTÁSICO. Las concentraciones séricas de SP están más aumentadas en pacientes con prurito secundario a colestasis que en los debidos a otras enfermedades. En este sentido, el uso de antagonistas RNK1 podría mejorar tanto el prurito como la colestasis. El aprepitant pudo exhibir efectos Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 121 antipruriginosos en enfermedades dermatológicas como diátesis atópica y prurigo nodular (Ständer S et al. 2010). 10. NEUROPROTECTOR Los RNK1 se encuentran en las áreas del sistema nervioso central implicados en las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, la esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica y la Corea de Huntington. La administración de SP/NKA en la sustancia negra y sistema nigroestriado, aumenta la dopamina estriatal y la liberación de glutamato, en cambio, esta liberación puede ser bloqueada por antagonistas del RNK1 (Reid MS et al. 1990a, 1990b). La SP vía de los RNK1 es uno de los mediadores de los efectos psicoestimulantes de la cocaína y las anfetaminas (Loonam TM et al. 2003) y es responsable en parte de la degeneración de las terminaciones dopaminérgicas nigroestriatales, vía apoptosis, secundaria al consumo de estas drogas, debido al aumento de los niveles de SP en el sistema estriatal que actúa a través del RNK1. L-733,060 ha sido una de las moléculas empleadas en el estudio experimental en ratones que confirmó el papel de la SP y su RNK1 en la lesión degenerativa en el área nigroestriada inducida por metanfetamina, la cual aumenta los niveles de SP en el estriado En esta región, la administración de antagonistas de RNK1 (WIN-51,708 o L-733,060) previene la pérdida de los transportadores de la dopamina, la pérdida de tejido dopaminérgico y pérdida de la tirosina hidroxilasa. El uso de los antagonistas de los RNK1 podría compensar la adicción a drogas y mejorar el pronóstico de las enfermedades neurodegenerativas, ya que previene la degeneración y la apoptosis neuronal e interviene en la muerte neuronal programada (Yu J et al. 2002). Las dosis de los antagonistas del RNK1 requerida para la neuroprotección son más bajas que las necesarias para los efectos antidepresivos y los efectos secundarios de tales dosis son similares al placebo. Los antagonistas del RNK1, el L-732,138 y el L-733,060, inhiben completamente la muerte celular en las células del cuerpo estriado, inducida por la SP, confirmando que la neurotoxicidad inducida por SP está mediada por RNK1 (Castro-Obregón S et al. 2002). La SP también juega un papel importante en los estados patológicos en los se produce la muerte celular neuronal, como en la epilepsia y la isquemia. Yu Z et al. (1997) en un modelo de isquemia focal cerebral, comprobó que la administración de un antagonista del RNK1 redujo el volumen del infarto y mejoró la función neurológica (Yu Z et al. 1997). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 128 Métodos topográficos como el de Braak &Braak (Braak Heiko and Braak Eva, 1993), para determinar el estadio de severidad de la enfermedad. Criterios CERAD: El CERAD ha realizado esfuerzos para estandarizar aún más las estrategias diagnósticas y de evaluación indicadas en el informe de la NINCDS-ADRDS. El CERAD mide las manifestaciones cognitivas primarias de la EA, tales como el lenguaje, la memoria y la praxia a lo largo de un espectro de la gravedad del trastorno. Se diferencia bien entre los sujetos normales y los pacientes con demencia leve o moderada. Los criterios establecidos por el CERAD y los de Khachaturian para el diagnóstico histopatológico se basan en un número específico de placas seniles relacionados con la edad y en un grado limitado de ONF en la neocorteza. Muestra de tejido: Giro frontal medio (área 9); Giro temporal superior y medio (áreas 21 y22); Lóbulo parietal inferior (áreas 39/40-partes 7 y 19); Giro cingular anterior (área 24); Hipocampo; Amígdala y corteza entorrinal; Parte media del cerebro, incluyendo la substancia negra. Técnicas histológicas: Se recomienda Bielschowsky, pero también se aceptan otras alternativas. Criterios de diagnóstico: 1) Evaluación de placas neuríticas. 2) Evaluación semi-cuantitativa de la implicación máxima. 3) Corteza frontal, temporal o parietal. 4) Recuento de placas relacionadas con la edad. Rangos: EA posible, probable o definida. Ningún protocolo de diagnóstico individualmente es completamente satisfactorio, peroCERAD tiene los méritos de ser: Relativamente simple. Aplicado exitosamente en un gran número de centros distintos. Reconocido ampliamente a nivel internacional y actualizado regularmente. Es un protocolo de diagnóstico apropiado para la mayoría de los casos de demencia. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 129 Criterios BRAAK y BRAAK Muestra de tejido: Hipocampo anterior. Hipocampo posterior. Occipital. Técnicas histológicas: Secciones de 100 μm con Gallyas. Criterios de separación en etapas: Semi-cuantitativo (+/+++) de ONF y HN. Los estadios definidos por este sistema abarca las fases preclínicas y sintomáticas, la acumulación progresiva de placas y ONF a lo largo del tiempo, y su diseminación extensa y progresiva a través del cerebro. (Guimerà A et al 2002). Braak y Braak describieron 6 estadios en la neuropatología de la EA (43). Las células de proyección específica de la región transentorrinal perialocortical, que se localizan en las profundidades del surco rinal, son las primeras neuronas corticales que manifiestan los cambios (estadio Iclínicamente silencioso). Los casos de estadio IImuestran numerosos ONF y hilos del neurópilo en la región transentorrinal, y algunos adicionales en la región entorrinal. La destrucción cortical en elestadio II apenas impide la transmisión de la información neocortical (a través de la regiónentorrinal) a la formación hipocampal, pero sin exceder del umbral sobre el cual aparecen lossíntomas clínicos iniciales. Algunos individuos desarrollan ONF/HN iniciales a una edad sorprendentemente joven. Obviamente, la edad avanzada no es un prerrequisito para el desarrollo de la patología intraneuronal. Esta obsevación pone en duda teorías que intentan explicar los cambios como consecuencia de influencias nocivas que se espera que tengan efecto generalmente en la edad avanzada (estrés peroxidativo, disfunción mitocondrial, desequilibrio del metabolismo de la glucosa). Esto no excluye la posibilidad de que el estrés peroxidativo pueda contribuir a los cambios en los estadios avanzados de la enfermedad o influencie en el proceso patológico. Posiblemente no parece ser un factor primario en la patogénesis de las lesiones iniciales en la EA. En los casos deestadios límbicos III o IV, la destrucción cortical es ya severa, pero limitada a unas pocas regiones alocorticales y áreas adyacentes. La característica clave de estos estadios es la notable destrucción de las capas entorrinales responsables de la transmisión de datos desde la neocorteza hasta el hipocampo y viceversa. Inicialmente, la formación hipocampal se ve afectada sólo ligeramente. En el estadio IV el proceso de destrucción se difunde desde la región entorrinal hacia la amígdala, el hipocampo y especialmente hacia las áreas de asociación de la neocorteza temporal basal. Los protocolos clínicos de muchos individuos en el estadio III o IV registran un deterioro de las funciones cognitivas y presencia de cambios sutiles de la personalidad. En otros individuos, la aparición de síntomas está todavía camuflada por capacidades de reserva del individuo, las cuales compensan la destrucción local. A causa de la Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 130 expresión ocasional de los síntomas iniciales y las lesiones cerebrales características, los casos de estadios III y IV, se considera que representan la EA incipiente. Los estadios neocorticales finales muestran una gran cantidad de ONF y HN en cada subdivisión de la corteza cerebral. Una característica propia del estadio Ves la destrucción extremamente severa de las áreas asociativas neocorticales, dejando solamente poco o nada afectados a los campos motores primarios, las áreas sensoriales primarias y sus regiones circundantes. Figura 40. Figura: Desarrollo de los cambios neurofibrilares desde el estadio I hasta el estadio VI en la formación hipocampal,regiones entorrinal y transentorrinal y la neocorteza temporal. U: Uncus; Pa: Parasubiculum; Pr: Presubiculum;S: Subiculum; RE: Región Entorrinall; RT: Región Transentorrinalll; IT: Isocorteza Temporal; CA1: PrimerSector de la Callosidad del Cuerpo Ammon. (Modificado de Braak y cols., 1995). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 131 En el estadio VI, el proceso patológico se extiende a las áreas primarias. Los individuos caracterizados en los estadios V y VI de destrucción cerebral son todos dementes. Estos estadios corresponden a la EA completamente desarrollada. La secuencia y el patrón de destrucción son muy similares al progreso de mielinización cortical en el desarrollo inicial, pero en orden contrario. 3.3. Metodología del estudio inmunohistoquímico de la SP y el RNK1 Se recogieron una serie de biopsias de pacientes afectos de enfermedad de Alzheimer del banco de tejidos del Hospital Universitario Virgen del Rocío y Nodo Biobanco del Hospital Reina Sofía (Córdoba), solicitud gestionada por el Nodo Coordinador de Biobancos del Sistema Sanitario Público de Andalucía sito en Granda, con la colaboración del servicio de Anatomía Patológica (Hospital Universitario del Sureste. Arganda del Rey, Madrid). Solicitando a su vez autorización preceptiva del Comité de Bioética. De estos pacientes se obtendrán datos clínicos y estadísticos de su enfermedad, y como controles se recogerán muestras de hipocampos, amígdala y corteza entorrinal de pacientes fallecidos por una causa distinta a patología cerebral. Se realizará en ambos tejidos un estudio inmunohistoquímico para la SP y su RNK1, valorando la localización y distribución de ambos, y posteriormente se compararan los resultados del grupo control (no afecto de patología cerebral) con el grupo problema. Se incluyen dos controles negativos, uno para Ac SP y otro para Ac RNK1 (2 muestras) Casos:Procedentes del Nodo de Biobanco Sevilla: 7 casos (corteza entorrinal e hipocampo, van en mismo corte). Por protocolo de dicho Biobanco no se ha incluido la amígdala. Se determina la SP y el RNK1: 14 muestras. Procedentes del Nodo de Biobanco Córdoba: 4 casos (cortes diferenciados de hipocampo anterior; hipocampo posterior juntos; y amígdala). Dado el elevado número de muestras, por dificultades técnicas hemos decido eliminar las muestras de amígdala. Quedando 4 casos, de cada uno hay dos cortes. A cada corte se le mide SP y RNK1: total 16 muestras. Controles: (procedentes del Biobanco Córdoba): de los 6 controles por las dificultades técnicas del laboratorio, analizamos solo 3. Al proceder del Nodo de Biobanco de Córdoba, es similar a los casos descritos previamente. Desechamos la muestra de amígdala, ya que no la teníamos en los casos procedentes del Biobanco de Sevilla. Analizando 3 casos, con dos cortes (hipocampo anterior y corteza entorrinal + hipocampo posterior), a los que hay que estudiar la SP y el RNK1. En total usamos 12 muestras. En resumen, hemos analizado un total de ( 14+12+16+2 (control negativo)) 44 muestras. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 132 Metodología de la inmunohistoquímica (IHQ): Las muestras serán procesadas en un analizador automático de inmunohistoquímica Autostainer de DAKO.  Para dicho estudio IHQ ,Se emplearon los siguientes anticuerpos:  Anticuerpo policlonal de conejo anti NK1 (Sigma-Aldrich, España: Referencia 58305 y Lote 083M4759 de 2014 de; 2 ml) Dilucion 1:1000  Anticuerpo policlonal de conejo anti Sustancia P (Sigma-Aldrich, España: Referencia 51542 y Lote 030M4767 de 2014; 2 ml). DIlucion 1:2000 1.- Realización de cortes y preparación de muestras. Las muestras fueron fijadas en formaldehido al 4% e incluidas en bloques de parafina según el protocolo habitual del servicio de Anatomía Patológica del Hospital Virgen del Rocío y Hospital Reina Sofía, respectivamente. Se realizaron cortes de los tejidos entre 3-5μm con un microtomo y se montaron en portaobjetos destinados específicamente para inmunohistoquímica con el ancho adecuado para los instrumentos Autostainer, identificándolas mediante serie numerada. EL procesamiento y tinción del tejido se realizó de forma automatizada y estandarizada DakoAutostainer Link analizador (Dako, España) Y mediante Kit de inmunohistoquímica (Dako, España): EnVisionTM FLEX, High pH, (link), comercializado. Estas muestras de tejido parafinado se incubaron durante 24 horas en la estufa a 37ºC y 30 minutos antes de la realización de la inmunohistoquímica a 60º C. 2.-Recuperación antigénica inducida por calor. Se realiza con el sistema PT-link específico para la recuperación inducida por calor. Con esta técnica, se llevan a cabo la desparafinación y la rehidratación en el mismo paso de la recuperación antigénica. Se realiza a pH ácido citrato low (6.5) diluída en agua destilada (1:10), durante 20 minutos a 96ºC. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 133 3.-Inhibición de la peroxidasa endógena Tras este proceso, se introduce la gradilla con los portaobjetos en un tanque con una solución buffer de lavado (Tris) diluída (1:20) y a temperatura ambiente, durante 5 minutos. Con este procedimiento se evita la reacción de las peroxidasas endógenas con la diaminobencidina. 4.-Preparación de los reactivos. Se preparan los reactivos en los botes para rellenar con reactivos que se introducirán posteriormente en el dispositivo RACK del sistema Autostainer Link. De todas las soluciones necesarias para la realización de la inmunohistoquímica, unas se pueden incorporar directamente al RACK pues ya vienen preparadas en el kit de inmunohistoquímica (peroxidasa, hematoxilina, EnVisionTM FLEX / HRP y Linker de conejo). Sin embargo, será necesario preparar en los botes, las siguientes soluciones:  Sustrato buffer y cromógeno DAB+ (diaminobenzidina) en una proporción de 1 gota de cromógeno por cada 20 ml de sustrato.  Anticuerpos policlonales primarios de conejo y diluyente: se prepararán tres botellas para las distintas soluciones: una solución de diluyente comercial Dako, una solución de anticuerpo anti SP y diluyente en proporción 1:1000, y una solución de anti-NK1R y diluyente en proporción 1:1000. La preparación de la cantidad de solución a introducir en los botes para rellenar, ha de ser calculada según protocolo del sistema Autostainer Link. 5.-Procedimiento automatizado de tinción inmunohistoquímica en instrumento Autostainer Link. Se producirán de forma automática los procesos de incubación de los cortes en antisuero primario específico para cada anticuerpo (25 minutos), la incubación en anticuerpo secundario (15 minutos) marcado con peroxidasa y la incubación con diaminobencidina (10 minutos). Los pasos de tinción y los tiempos de incubación óptimos recomendados son preprogramados en el software del sistema. En el caso del número de portaobjetos de nuestro estudio, se requirió un tiempo de tres horas de procesamiento. 6.-Deshidratación del tejido Una vez completado el procedimiento de tinción, se han de montar las muestras. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 134 Se llevan las muestras a agua destilada, se realizará la deshidratación de las muestras mediante el paso de los portaobjetos por la batería de alcoholes en el siguiente orden: 60 % (30 segundos), 70 % (30 segundos), 80 % (30 segundos), 90 % (5 minutos), 96 % (5 minutos), 100 % (5 minutos). Finalmente se pasan las tres muestras por las tres cubetas de xiloles, para eliminar el alcohol: de forma rápida en las dos primeras (hasta que los cristales dejen de “lagrimear”) y en la tercera, el tiempo necesario hasta el montaje con el pegamento. 7. Montaje. A cada cristal recién sacado y escurrido del xilol se le añade un cubre con unas gotas de pegamento Pertex. La reacción del xilol y el pegamento hace que se unan ambos materiales. Se eliminan las burbujas que se forman durante el montaje. Una vez secado, las muestras están preparadas para la visualización del resultado con el microscopio óptico. 8. Control de calidad En las muestras de control negativo de cada caso incluidas, se siguió el mismo procedimiento que en los demás casos, excepto la exposición al primer anticuerpo, lo cual fue obviado. Se utilizó un caso de control positivo con una muestra de neuroblastoma (Muñoz et al 2007). Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 135 4. RESULTADOS Hemos analizado 11 muestras de cerebro de pacientes fallecidos con EA y 2 controles sanos. Las muestras han sido cedidas por el Biobanco del Sistema Público de Andalucía, las hemos dividido según su procedencia: Nodo Biobanco de Sevilla y del Nodo de Córdoba. Se les ha realizado inmunohistoquímica con Anticuerpos de SP y de RNK1, para identificar su localización en hipocampo y corteza entorrinal. Datos clíncos de los pacientes y controles de los que se ha podido tener acceso a través del Biobanco: Edad, sexo y el Estadío de EA según clasificación Cerad o Braak and Braak. Casos procedentes del Biobanco de Sevilla: Caso 1: varón 68 años, EA definitiva (CERAD); estadío IV-V Braak Caso 2: varón de 75 años, EA Definitiva (CERAD); estadío IV-V Braak Caso 3: varón 93 años, EA definitiva, C3 (CERAD); estadío VI Braak Caso 4: mujer 65 años, EA definitiva (CERAD); estadío VI Braak Caso 5: varón 83 años, EA definitiva (CERAD); estadío IV-V Braak Caso: Desestimado por no cumplir criterios EA Caso: mujer 69 años, EA definitiva (CERAD); estadíoIIIIV Braak. Desestimada por problemas técnicos en la inmunohistoquímica. Caso: mujer 79 años, EA posible (CERAD); estadío I-II Braak. . Desestimada por problemas técnicos en la inmunohistoquímica. Casos procedentes del Biobanco de Córdoba: Caso 6: varón 74 años, estadío V Braak Caso 7: varón 77 años, estadío IV-V Braak Caso 8: varón 77 años,estadío III Braak Caso 9: mujer 85 años, estadío VI Braak Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 136 Control 1: varón 66 años Control 2: varón 54 años Control 3: varón 85 años Control 4: varón 64 años Control 5: varón de 15 días, desestimado por edad Control 6: varón con angiopatía, patología cerebral, desestimado por ello. La edad media de los casos 77.44 años. Siendo 7 varones y 2 mujeres. La edad media de los controles fue de 67,25 años, siendo todos varones. Los estadíos de Braak and Braak que presentaban eran uno en estadío III; 4 en estadío IV-V; 3 en estadío V; y 1 en estadío VI. RESULTADOS DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA. Previamente a describir los resultados, revisamos nociones básicas sobre el hipocampo, para su más fácil comprensión. Anexo: Hipocampo El Hipocampo es la zona más representativa de la parte filogenéticamente más antigua del Telencéfalo: el Archicórtex. Hoy en día está ampliamente aceptado que el Hipocampo juega un papel importante en la memoria y en la orientación espacial. Anatómicamente el Hipocampo se divide en dos grandes zonas:  el Asta de Ammón (Cornu Ammonis) y  el Giro dentado (Fascia dentata). En primates (incluidos los humanos) ambas zonas tienen forma de "C" y ambas zonas se imbrican (una dentro de la otra) lo que le da una forma que recuerda un caballo de mar, de ahí su nombre. En otros mamíferos (como la rata) ambas zonas mantienen la forma imbricada aunque no presentan un perfil de "C". Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 137 A su vez el Asta de Ammón se divide en cuatro subregiones que se conocen como CA I, CA II, CA II y CA IV (CA= Cornu Ammonis) siendo la CA IV la que se imbrica con la Fascia dentada y la CAI la más lejana a esta. Figura 41. Anatomía del Hipocampo Tanto el Asta de Ammón como la Fascia dentada presentan una estructura en tres capas:  Capa molecular (Stratum oriens)  Capa de somas neuronales (Capa piramidal en el Asta de Ammón y Capa granular en la Fascia dentada).  Capa polimórfica En el Asta de Ammón habría que incluir una cuarta capa, el Alveus, que se correspondería con la sustancia blanca. Con la técnica de Golgi se aprecia que hay dos tipos neuronales mayoritarios en el Hipocampo:  Neuronas piramidales en el Asta de Ammón. Neuronas con un soma piramidal del que parten una dendrita apical que se puede ramificar profusamente en la capa molecular y varias dendritas que emergen del polo basal. El axón parte del polo basal y se dirige al Alveus al que se incorpora para salir del Hipocampo.  Neuronas granulares en la Fascia dentada. Estas neuronas también se conocen como células en cesto ya que todas sus dendritas parten del polo apical dando una aspecto de canasta a su árbol dendrítico que se encuentra en la capa molecular. El axón parte Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 144 6. RNK1 CA1x400 (int 2-3) (12S) 7 RNK1 CA3 x200 (13S) int 2, granular en membrana, nuclear y citoplasmático neuronal, nuclear glial 8. RNK1 CDentada capa granular x200 int 2 (18S) Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 145 Caso avanzado con hiperreactividad glial y elevación de SP y RNK1 alrededor de la placa senil RNK1 CA1x100 int 160%. Astrocitos reactivos en torno a una placa senil, con neuritas rotas (33) Caso avanzado Braak VI 10. RNK1 CA1 x200 maraña de neurita rota en torno a una placa senil (34) Caso avanzado Braak VI RNK1 CA1x100.H-E Placas seniles (27) RNK1 CA1x200.H-E Placas seniles (28) SP CA1 x200 Hematoxilina-eosina Placas seniles (11) SP CA1x200 IHQ, placas seniles con glía y SP alrededor (12) y Neurona gránulovacular Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 146 SP en Placas seniles x200 (H-E) CONTROLES SP Control CA4 x200(Cit 100% int 3, no en Núcleo)(8) RNK1 control Plexo coroideo x100, int 3 Citoplasma (9) RNK1 control x 100 Circunvolución dentada, con int 0 RNK1 control x 200 Circunvolución dentada, con int 0 Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 147 RNK1 control x 400 Circunvolución dentada, con int 0 Resumen de resultados inmunohistoquímicos Nos ha resultado llamativa la inmunotinción muy intensa de SP y muy débil para RNK1 en general, que consideramos que puede estar debido a la proporción de las diluciones que hemos utilizado, siendo SP 1/2000, y para RNK1 1/1000. Hemos identificado la Inmunolocalización de la SP y su receptor RNK1 en nuestros casos de EA y en los controles. Descripción de casos: La SP en los casos de EA: se ha objetivado la presencia de SP con intensidad elevada tanto en el citoplasma como en el núcleo. Su receptor RNK1: se identifica en citoplasma y débilmente en el núcleo de las neuronas. Descripción de los controles: SP se identifica en 100% de los citoplasmas con intensidad elevada, pero menor en el núcleo, con una media del 38.75% de intensidad leve-moderada. RNK1 se identifica en citoplasma en 22.72% con intensidad leve (control 2); no se objetiva en el núcleo, en ninguno de los controles. Esto sugiere la implicación del sistema SP/RNK1 en la EA. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 148 En la microglía: En sustancia blanca, los núcleos están marcados un 70% con intensidad elevada; en Neuropilo está marcado el 100% con intensidad elevada; en núcleo de células de hipocampo 54% con intensidad moderada-elevada La microglía en los Controles: En sustancia blanca, los núcleos están marcados un 20% con intensidad leve-moderada. En hipocampo: el núcleo está marcado en 12,8% de media con intensidad leve. Esto sugiere la implicación de la microglía en la EA. Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 149 5. DISCUSIÓN 1. Neuropatología y EA 2. La Neuroinflamación en la patogénesis de la EA a. Microglía y EA b. Implicación de la SP /RNK1 en Neuroinflamación ¿¿?? 3. Implicación de la SP/RNK1 en la Neurodegeneración de la EA a. Neurodegeneración b. SP aumenta niveles de glutamato en el hipocampo c. Efectos de la expresión de SP en la EA asociada a muerte neuronal d. SP regula la expresión del gen promotor de muerte neuronal (mediada por Kainato) 4. Resultados Inmunohistoquímicos de SP/RNK1 en la EA a. SP/RNK1 en Neoangiogénesis b. SP/RNK1 en Estrés y alteraciones de la conducta afectiva en EA 5. Relación entre el complejo SP/RNK1 y posibles implicaciones terapéuticas para la EA La EA es un problema importante de salud debido a que a pesar delos avances en medicina continúa presentando alta prevalencia y morbi-mortalidad. Es un proceso neurodegenerativo, lento y progresivo, clínicamente caracterizado por un paulatino deterioro de las funciones cognitivas e intelectuales (Cummings J, 2000). A lo que se asocian alteraciones psiquiátricas como alucinaciones, cuadros depresivos, psicóticos, denominados síntomas conductuales y psicológicos asociados a la demencia (SPCD), que determinan el declinar del paciente y la sobrecarga en los cuidadores y la sociedad. La EA es, por ser la más común, el paradigma de los procesos neurodegenerativos que se relacionan con el envejecimiento. 1. Neuropatología y EA La EA es una demencia que primero se manifiesta en el lóbulo temporal, en la zona del giro dentado del hipocampo, lo que se ha relacionado con problemas de memoria a corto plazo; posteriormente afecta al lóbulo parietal afectando a procesos de visualización espacial o a pérdida del conocimiento de hábitos y usos; y finalmente al lóbulo frontal, que puede dar lugar Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 150 a problemas de comportamiento (Wilhelmsen, 1999). Entre otras consecuencias, se produce muerte neuronal en estas zonas del cerebro. En la EA se observa una pérdida selectiva de neuronas en el hipocampo y la corteza. Los cerebros de los pacientes con EA muestran dos lesiones características: las placas seniles (PS), o de Aβ, PS con o si n signos inflamatorios, que son extracelulares, y los ovillos neurofibrilares (ONF), formados por proteína Tau hiperfosforilada, intracelulares. Se postulan múltiples mecanismos fisiopatológicos para explicar el deterioro cognitivo: la toxicidad del Aβ, disfunción colinérgi ca, alteraciones de Tau, daño oxidativo, di sfunción sináptica e inflamación secundaria a las placas. Otro planteamiento es que la inflamación y el estrés celular asociados al envejecimiento participan en el desarrollo de la EA, cuyo evento patogénico central involucraría una disfunción glial. (Von Bernhardi, 2005) La pregunta clave es si las PS y los ONF efectivamente causan la EA o corresponden al resultado de eventos patológicos más tempranos. De hecho, en los individuos con EA, la correlación entre la densidad de PS de Aβ y la severidad de la enfermedad es pobre. Por otro lado, si bien la aparición de los ONF muestra una correlación buena con el deterioro cognitivo, parece ser un evento más tardío. (Von Bernhardi. 2005). Sin embargo, aunque una sobreproducción Aβ tiene un efecto negativo sobre las células nerviosas, bajas concentraciones pueden potenciar a largo plazo el hipocampo y mejorar la memoria (Sun X et al, 2012). Los niveles de Aβ elevado induce a depósitos; los niveles de Aβ bajo, protege (Reynaldo G et al, 2008). El hipocampo está involucrado en muchas procesos funcionales que incluyen la regulación de las emociones y aprendizaje y la memoria (Eichenbaum H, 2000; Engin E, 2000). Además, después de daños en el hipocampo, en estudios con ratas se ha observado que se pueden producir alteraciones fisicoquímicas, propias de fases iniciales de demencia (Krugel U et al, 2001) y los defectos en el aprendizaje y la memoria objetivados en dichos animales (Alberini CM, 1999; Devan DB et al, 1999). Las neuronas colinérgicas que expresan receptores de la SP (RNK1) (Liang-Wei Ch et al, 2001). La mayoría de la SP presente en el hipocampo es de origen extrahipocampal, y se deriva del núcleo supramamilar. A través de las proyecciones supramamilares-hipocampales se libera la SP en la capa granular del giro dentado y en la capa de células piramidales de las regiones CA2 y CA3 del hipocampo (Kinga Toth et al 2007). La SP excita las neuronas GABAérgicas en la amígdala central de ratón a través de la activación del receptor de neuroquinina 1 (Sosulina L et al, 2015) Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 151 Los RNK1 se encuentran en las áreas del sistema nervioso central implicados en las enfermedades neurodegenerativas, como la EA, EP, la esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica y la Corea de Huntington. La administración de SP/NKA en la sustancia negra y sistema nigroestriado, aumenta la dopamina estriatal y la liberación de glutamato, en cambio, esta liberación puede ser bloqueada por antagonistas del RNK1 (Reid MS et al. 1990a, 1990b). Los diagnósticos neuropatológicos están limitados porque se han encontrado placas (PS) y ovillos (ONF) en personas sin demencia, no hay una correlación directa entre la gravedad de las lesiones y la gravedad clínica presentada por los pacientes, y es difícil valorar la influencia de la patología vascular y establecer el momento de aparición del deterioro clínico y las lesiones en el tejido cerebral. Se estima que el 30% de las personas cognitivamente normales tienen patología tipo Alzheimer y una parte de ellos llegan a cumplir criterios neuropatológicos de EA sin haber mostrado síntomas de ésta. La presencia de neuropatología tipo Alzheimer en el cerebro de sujetos sin enfermedad llevó a la demostración de la brecha existente entre la aparición de las primeras lesiones en el tejido cerebral y el inicio sintomático, es decir, que existe patología tipo Alzheimer en ausencia de demencia durante una serie de años, un periodo que puede definirse como un estadio preclínico. Numerosas evidencias científicas muestran que existe un periodo de latencia comprendido entre el inicio tras un insulto/agresión cerebral y la cronificación. (Blanco B, 2012). La actuación precoz en dicho periodo proporciona la oportunidad de aplicar terapias efectivas que puedan modificar la historia natural de la enfermedad. El concepto de neuroprotección abarca mecanismos de reparación y autoprotección que prevengan tanto el desarrollo de eventos críticos como déficits cognitivos posteriores. El diagnóstico de la EA en estadio preclínico es posible mediante el empleo de biomarcadores. Los biomarcadores se detectan en momentos diferentes del proceso fisiopatológico de la enfermedad y señalan hitos sucesivos en su progresión. En un primer momento pueden encontrarse sólo biomarcadores de acúmulo de amiloide en el cerebro, y sucesivamente aparecer biomarcadores de disfunción sináptica (daño funcional) y luego biomarcadores de pérdida neuronal (daño estructural).( López-Álvarez et al, 2015). 2. La Neuroinflamación en la patogénesis de la EA a. Microglía y EA Las células microgliales, que desarrollan funciones inmunes en el cerebro, también pueden sufrir un proceso de activación tras lesión o enfermedad (Davis EJ et al, 1994; Graeber B et al, 1990). Aunque esta activación está orientada inicialmente a contrarrestar el daño tisular, las células de microglía activa pueden excederse en sus funciones y acabar induciendo un proceso patológico (Colton CA et al, 1996: Streir WJ et al, 1999). Así, las microglías activadas no sólo cambian su morfología, sino que, además, comienzan a secretar factores de crecimiento y Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 152 citocinas;aunque estas sustancias están programadas inicialmente para restaurar la homeostasis del tejido y desencadenar la respuesta inmune más adecuada, pueden llegar a activar cascadas metabólicas de muerte celular mediante distintos mecanismos, entre los que se encuentra la producción de radicales libres (Zielasek J et al, 1996;Tamatani M et al, 1998). Los estudios realizados por nuestro grupo sobre esta población glial, que cuantificamos en corteza junto a oligodendrocitos, indicaron que, a diferencia de los astrocitos, estas células no presentan hiperplasia durante el envejecimiento fisiológico, aunque sí detectamos un aumento de las mismas en individuos con lesiones traumáticas (Peinado MA et al, 1998b). El papel dual como agentes neuroprotectores y neurotóxicos de las células gliales permite entender la presencia de células de microglía y astrocitos junto a los depósitos de Ab en las placas seniles de los enfermosde Alzheimer (Unger JW et al, 1998) Los pericitos del cerebro, células de localización perivascular, Estudios ultraestructurales demuestran que las láminas basales de los capilares se hacen más gruesas y, entre éstas y el endotelio, donde se localizan los pericitos, se observan abundantes zonas de degeneración microvacuolar no presentes en individuos jóvenes (Peinado MA et al, 1998b). Los pericitos forman parte de la barrera hematoencefálica y junto a astrocitos y microglía perivascular son responsables del mantenimiento de la homeostasis local (Mato M et al, 1996). La EA y la enfermedad de Parkinson (EP) son también las enfermedades inflamatorias del cerebro, que se caracterizan por el desequilibrio "estado redox" y la inflamación crónica, una causa principal de daño y muerte celular. Varios estudios han demostrado que las células cerebrales como microglía y astrocitos inducen y liberan diversos mediadores inflamatorios en la respuesta al estrés oxidativo (Chiurchiu V and MacCarrone M, 2011; S. Fuller et al 2010). Un aumento del número de células microgliales activadas pueden tener un nocivo efecto sobre las neuronas dopaminérgicas en la EP (H. L. Hsieh and C. M. Yang, 2013). La placa senil y neurítica de la EA se acompaña por respuestas inflamatorias en las células gliales activadas. La microglia activada produce varios mediadores inflamatorios incluyendo la COX-2 / prostaglandinas (PGs), iNOS / óxido nítrico (NO), o citoquinas, así como sustancias neurotóxicas, que se cree que son responsables de las lesiones cerebrales y enfermedades incluyendo EA y la muerte neuronal debido a la exposición de LPS, interferón-γ o Aβ (H. L. Hsieh and C. M. Yang, 2013). Por lo tanto, microglia y astrocitos desempeñan un papel importante en EA y EP. En la patogénesis de la EA, tiene gran importancia la hipótesis de la disfunción glial. Varios eventos fisiopatológicos contribuyen a la neurodegeneración en la EA. La inflamación, ya sea secundaria al envejecimiento, a diversos estímulos o lesión, pueden ser responsables de la activación glial anormal, que se acompaña de un aumento de la producción de Aβ y disfunción neuronal. En las etapas finales de la vida, está también directa o indirectamente implicada en la inducción de la neurodegeneración. De la activación glial resulta la liberación de varias citoquinas y la generación de especies reactivas, que contribuyen al proceso inflamatorio. El aumento de la expresión de los resultados de Aβ en más neuroinflamación, perpetuando la activación glial, la disfunción sináptica y el daño celular. Los mediadores inflamatorios, procesos neurodegenerativos y el efecto trófico propuesto de la APP y Aβ también podría Inmunolocalización de la sustancia P y del receptor NK1 en las estructuras del sistema nervioso central implicadas en la enfermedad de Alzheimer-Kraepelin 153 afectar la función y regulación neuronal, lo que resulta en la alteración cognitiva y perjudica su capacidad de modulación de la activación glial (Von Bernhardi, 2007). Sin embargo, los déficits cognitivos y la alteración de la función sináptica, son consecuencia del aumento de la concentración de citoquinas inflamatorias, tales como IL-1β (Murray y Lynch, 1998). La hipótesis inflamatoria en la EA hace hincapié en que la microglía hiperactiva es la causa primaria de la neurotoxicidad asociada a la EA. Por el contrario, Von Bernhardi R, propone que la EA no es causada por una microglia hiperactiva sino más bien disfuncional. Las células microgliales activas son necesarias para eliminar las células en el SNC. Sin embargo, al no responder a los mecanismos normales de retroalimentación de regulación y / o tiene un impedimento en su capacidad para lim piar A β (Paresce et al., 1997), las células microgliales pierden su capacidad de manejar los compuestos potencialmente tóxicos y se convierten en citotóxico debido a la activación inflamatoria persistente. Otros cambios relevantes en la EA también podrían depender del envejecimiento. El estrés oxidativo y la generación de radicales libres promueven procesamiento amiloidogénico de APP. La hipoxia transitoria puede llevar a una disfunción mitocondrial, lo que resulta en el estrés oxidativo, el deterioro de integridad de la membrana y acción amiloidogénica (Chen et al., 2003). Con el tiempo, la activación crónica o múltiple de la microglia y los astrocitos se convertirían neurotóxicos por la liberación de citoquinas inflamatorias, enzimas proteolíticas, factores del complemento e intermediarios reactivos. Existe abundante evidencia el que apoya la hipótesis de la desregulación glial, que conduce a citotoxicidad y al característico proceso neurodegenerativo de la EA. Las citoquinas tales como IL-1β y TGF-β y la ciclooxigenasa (COX -2) están elevadas en el cerebro de pacientes con EA (Luterman et al., 2000; Ho et al., 2001). Sin embargo, esas observaciones no establecen si esos cambios originan la enfermedad o son una reacción compensatoria al proceso degenerativo. Además, es obligatorio tener en cuenta que los mediadores inflamatorios son multifuncionales y tienen efectos tanto pro-y anti-inflamatorio, pudiendo ser concentración dependientes. Su mera presencia no indica si son beneficiosos o perjudiciales. Por el contrario, la evidencia de múltiples casos y controles y los estudios basados en la población apoyaron una reducción de aproximadamente el 50% en el riesgo de EA después de largo plazo de uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos-inflamatorios (AINE) (Stewart et al., 1997; Broe et al., 2000; Etminan et al., 2003). Sin embargo, sólo pequeños ensayos con indometacina y diclonefaco mostraron efectos positivos para los pacientes con EA. La falta de éxito puede tener varias explicaciones; el momento y la dosificación de tratamiento, y el AINE específico utilizado son algunos de las posibilidades. Sigue siendo una incógnita si la inflamación es causa o consecuencia del proceso neurodegenerativo. La inflamación favo rece el procesamiento defectuoso del Aβ y de la proteí na precursora del amiloide, (APP), favoreciendo la agregación del Aβ, pero también modificando la reactividad al Aβ. Se ha observado que la reactividad microglial al APP y Aβ es baja, pero se potencia en condiciones pro-inflamatorias,