Caracterización química de fibras de plantas herbáceas utilizadas para la fabricación de pastas de papel de alta calidad.

Caracterización química de fibras de plantas herbáceas utilizadas para la fabricación de pastas de papel de alta calidad Isabel María Rodríguez García Sevilla, 2006 Caracterización química de fibras de plantas herbáceas utilizadas para la fabricación de pastas de papel de alta calidad Memoria que presenta Isabel María Rodríguez García para optar al título de Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Sevilla. Sevilla, a 9 de Febrero de 2006. Caracterización química de fibras de plantas herbáceas utilizadas para la fabricación de pastas de papel de alta calidad Visado en Sevilla, a 9 de Febrero de 2006 LOS DIRECTORES EL TUTOR Dr. D. José C. del Río Andrade Investigador Científico del CSIC IRNAS-CSIC Dra. Dña. Ana Gutiérrez Suárez Científico Titular del CSIC IRNAS-CSIC Dr. D. Agustín García Asuero Catedrático de la Universidad de Sevilla Memoria que presenta Dña. Isabel María Rodríguez García p ara optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Sevilla. DOCTOR D. LUIS CLEMENTE SALAS, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CERTIFICA: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Caracterización química de fibras de plantas herbáceas utilizadas para la fabricación de pasta de papel de alta calidad”, presentada por Dña. Isabel Mª Rodríguez García para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas, ha sido realizada en el Departamento de Biogeoquímica y Dinámica de Contaminantes, bajo la dirección de los Drs. D. José C. Río Andrade y Dña. Ana Gutiérrez Suárez, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a 9 de Febrero de 2006 A mi familia y a Antonio 4.2.1.1. n-Alcanos ............................................................................... 45 4.2.1.2. n-Ácidos grasos...................................................................... 46 4.2.1.3. Hidroxiácidos......................................................................... 47 4.2.1.4. n-Alcoholes............................................................................ 48 4.2.1.5. n-Aldehídos............................................................................ 49 4.2.1.6. Hidrocarburos esteroidales..................................................... 49 4.2.1.7. Esteroles................................................................................. 50 4.2.1.8. Triterpenoles .......................................................................... 53 4.2.1.9. Acetatos de triterpenoles........................................................ 54 4.2.1.10. Cetonas esteroidales............................................................... 56 4.2.1.11. Cetonas triterpenoidales......................................................... 57 4.2.1.12. Glicósidos de esteroles........................................................... 59 4.2.1.13. Ceras....................................................................................... 60 4.2.1.14. Ésteres de esteroles ................................................................ 61 4.2.1.15. Ésteres de triterpenoles .......................................................... 62 4.2.1.16. Monoglicéridos ...................................................................... 62 4.2.1.17. Diglicéridos............................................................................ 63 4.2.1.18. Triglicéridos........................................................................... 65 4.2.1.19. Ésteres del ácido ferúlico....................................................... 65 4.2.1.20. Ésteres del ácido trans-p-cumárico........................................ 69 4.2.2. Composición química de los lípidos de las fibras ........................... 72 4.2.2.1. Fibras de lino.......................................................................... 82 4.2.2.2. Fibras de cáñamo.................................................................... 86 4.2.2.3. Fibras de kenaf....................................................................... 90 4.2.2.4. Fibras de yute......................................................................... 93 4.2.2.5. Fibras de sisal....................................................................... 101 4.2.2.6. Fibras de abacá..................................................................... 107 4.2.3. Modificación estructural de los lípidos de las fibras durante la cocción a la sosa/AQ ..................................................................... 125 4.3. Composición química de la lignina......................................................... 133 4.3.1. Composición química de la lignina de las fibras........................... 133 4.3.1.1. Análisis por Py-GC/MS ....................................................... 133 4.3.1.2. Análisis por Py/TMAH........................................................ 143 4.3.2. Composición química de la lignina en las lejías de cocción ......... 148 4.3.2.1. Análisis por Py-GC/MS ....................................................... 149 4.3.2.2. Análisis por Py/TMAH........................................................ 155 5. CONCLUSIONES......................................................................................... 161 6. REFERENCIAS ............................................................................................ 165 i RESUMEN La presente Tesis plantea el estudio de la composición química de las fibras de varias plantas herbáceas utilizadas como materia prima para la fabricación de pasta de papel de alta calidad, así como la evolución de sus principales componentes durante el proceso de cocción con objeto de obtener un mejor aprovechamiento industrial de estas fibras. Las fibras seleccionadas para este estudio fueron suministradas por la empresa Celulosa de Levante S.A., CELESA (Tortosa, Tarragona) e incluyen fibras procedentes de tallos de lino (Linum usitatissimum), cáñamo (Cannabis sativa), kenaf (Hibiscus cannabinus) y yute (Corchorus capsularis), así como fibras procedentes de hojas de sisal (Agave sisalana) y abacá (Musa textilis). El estudio se centra en una caracterización general de las fibras basada en la cuantificación de las principales fracciones (polisacáridos, lignina, extraíbles, hidrosolubles y cenizas), poniendo especial énfasis en el estudio detallado de la composición de los extraíbles lipofílicos y la lignina, fracciones que presentan una especial relevancia en la fabricación de pasta de papel. En general, las fibras estudiadas se caracterizan por un alto contenido en holocelulosa (81-92%), y un contenido bajo en lignina (4-16%). Las fibras de lino y cáñamo son las que presentan un menor contenido en lignina (2,9 y 4,6%, respectivamente) mientras que kenaf, yute, sisal y abacá tienen algo más del 10% de lignina. También se caracterizan por su bajo contenido en cenizas (0,2-2%) y extraíbles lipofílicos (0,4- 0,7%), por lo que en principio puede decirse que, respecto a la composición química, son buenas materias primas para la producción de pasta de papel. Los principales lípidos identificados en las fibras mediante GC y GC/MS fueron ceras, n-ácidos grasos, n-alcanos y n-alcoholes, así como esteroles y triterpenoles (libres y/o conjugados). Las ceras son muy abundantes en las fibras procedentes de tallos (lino, cáñamo, kenaf y yute) estando prácticamente ausentes en las fibras procedentes de hojas (sisal y abacá). En estas últimas se identificaron series de ácidos p-hidroxicinámicos (p-cumárico y ferúlico) esterificados con n-alcoholes y ω-hidroxiácidos de cadena larga. Ésta es la primera vez que se describe la presencia en plantas de p-cumaratos de ω-hidroxiácidos. El análisis de las fibras mediante Py-GC/MS permitió estudiar la composición de la lignina. Así, la pirólisis de las fibras de lino y cáñamo liberó principalmente compuestos derivados de carbohidratos, mientras que la pirólisis de las fibras de kenaf, yute, sisal y abacá liberó predominantemente compuestos procedentes de lignina y ácidos p-hidroxicinámicos, de acuerdo con el contenido en lignina en ii cada una de las fibras. En cuanto a la composición de la lignina, las fibras de lino y cáñamo mostraron una composición predominantemente de tipo guayacilo (G), mientras que las fibras de kenaf, yute, sisal y abacá presentaron una lignina predominantemente de tipo siringilo (S). En las fibras de abacá, además, se observaron cantidades elevadas de ácido p-cumárico, probablemente esterificado en el carbono γ de la cadena lateral de la lignina. El análisis por Py-GC/MS de las fibras de kenaf, yute, sisal y abacá reveló la presencia de acetatos de los alcoholes sinapílico y coniferílico, siendo la primera vez que estos compuestos se identifican tras la pirólisis de materiales lignocelulósicos. La presencia de estos acetatos indica que la lignina nativa de estas fibras está, al menos parcialmente, acetilada en el carbono γ de la cadena lateral. Se sugiere que los acetatos de los alcoholes coniferílico y sinapílico pueden ser auténticos precursores de la lignina que se ven involucrados en su polimerización al igual que los alcoholes coniferílico y sinapílico sin acetilar. El presente estudio abarcó también las modificaciones y los cambios estructurales ocurridos en los lípidos y la lignina durante la cocción alcalina. Se observó cómo las diferentes clases de lípidos tienen distintos comportamientos durante la cocción y cómo algunos de los compuestos lipofílicos presentes en las fibras sobreviven al proceso y están presentes en la pasta, lo cual puede dar lugar a diversos problemas, como la formación de depósitos de “pitch”. Las ceras y otros ésteres se hidrolizan completamente, dependiendo de la carga de álcali utilizada, los ácidos grasos forman sales solubles, mientras que los alcoholes y esteroles (y sus glicósidos), que apenas se solubilizan, permanecen en la pasta. En cuanto a la lignina de las fibras, se observó que en el proceso de cocción se produce una eliminación preferencial de las unidades S frente a las G. Esto es debido a que las unidades S están unidas preferentemente por enlaces éter (β-O-4) mientras que la lignina G es más condensada debido a la presencia de una alta proporción de enlaces C-C (en la posición 5-5´). Por tanto, la alta relación S/G de la lignina de las fibras de kenaf, sisal, yute y abacá hace que estas fibras sean más fáciles de deslignificar a causa del menor grado de condensación de la lignina, a pesar de tener un mayor contenido en lignina. En conclusión, el estudio de la composición química de las fibras, así como su comportamiento durante la producción de pasta de papel, será útil para un mejor aprovechamiento de las mismas como materias primas para la fabricación de papel de alta calidad. 1. INTRODUCCIÓN 1. Introducción 3 1.1. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LOS MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS Los materiales lignocelulósicos, incluyendo los productos de origen agrícola y forestal, están constituidos por tres polímeros estructurales - celulosa, hemicelulosa y lignina - y una serie de compuestos de bajo peso molecular solubles en agua (fracción hidrosoluble) o solventes orgánicos (los denominados extraíbles). También presentan pequeños contenidos en proteína y sales minerales (estimadas como cenizas tras combustión). La celulosa es el componente mayoritario (sobre un 50%), seguida de la lignina (alrededor de un 20%) y de la hemicelulosa (alrededor de un 15%) (Fengel y Wegener, 1984). En la Figura 1 se muestra una representación esquemática de las relaciones entre los principales constituyentes de la pared celular vegetal (celulosa, lignina y hemicelulosa). A nivel histológico, la lignina se encuentra más concentrada en la lámina media, que es la capa externa que une las paredes celulares de las fibras contiguas en los tejidos lignificados. El resto de las capas de la pared vegetal, incluyendo la pared secundaria que es la capa más gruesa, presentan también un cierto contenido de lignina pero están principalmente constituidas por celulosa (y hemicelulosa). Tal como se observa en la Figura 1, la lignina en la pared secundaria forma una matriz amorfa que protege a los polisacáridos frente a la degradación microbiana y la hidrólisis enzimática en general. En la pared vegetal existen enlaces interpolímeros que pueden ser directos, enlaces éter entre OH alcohólicos (de los polisacáridos) y fenólicos (de la lignina), o a través de puentes formados por los ácidos p-hidroxicinámicos. Estos últimos son precursores de la lignina pero en muchas plantas herbáceas se encuentran también en forma libre (incluidos en la fracción extraíble) y formando puentes lignina-polisacárido (Scalbert et al., 1985; Grabber et al., 2000; Bunzel et al., 2001; Lam et al., 2001; Sun et al., 2002). El uso de la madera y otros materiales lignocelulósicos en la industria química, así como en la alimentación animal, se basa generalmente en la utilización de la celulosa (obtención de fibras celulósicas para la fabricación de pasta de papel, o hidrólisis ácida o enzimática para obtener glucosa). Por consiguiente, la eliminación de la lignina representa el paso limitante en muchos de estos procesos. 1.1.1. Celulosa Es uno de los biopolímeros más abundantes en la Naturaleza, ya que se trata del principal componente estructural de las células vegetales. Comprende del 10% al 20% del peso seco de las hojas, el 50% del peso de la madera y la corteza de los 1. Introducción 4 árboles y aproximadamente el 90% del peso de las fibras de algodón (Streitwieser y Heathcock, 1983). Desde el punto de vista estructural, la celulosa es un polímero lineal, cuya unidad básica es la D-glucosa que se enlaza mediante un enlace glucosídico en la configuración β-(1-4) dando lugar a la unidad de celobiosa que se Lignina Celulosa Hemicelulosas A (vista axial/lateral) B (vista lateral) C D (vista axial) (vista lateral) (vista axial) Enlaces de hidrógeno Celulosa Lignina Hemicelulosas Lignina Celulosa Hemicelulosas A (vista axial/lateral) B(vista axial/lateral) B (vista lateral) C D (vista axial) (vista lateral) (vista axial) Enlaces de hidrógeno Celulosa Lignina Hemicelulosas Figura 1. Representación esquemática de las relaciones entre los principales constituyentes de la pared celular vegetal (celulosa, lignina y hemicelulosa). Este esquema, correspondiente a la pared secundaria de una angiosperma no leñosa (como el lino o el kenaf) muestra las microfibrillas de celulosa, formadas por cadenas lineales de glucosa, inmersas en una matriz amorfa de lignina, constituida por tres tipos de unidades fenilpropano unidas por diferentes enlaces en una red tridimensional, en la que también se incluye la hemicelulosa, formada por cadenas ramificadas de pentosas (hexosas en las coníferas) unidas por enlaces laterales. Las uniones entre estos polímeros se completan mediante puentes intermoleculares formados por los ácidos cinámicos, p-cumárico (pCA), ferúlico (FA) y diferúlico, que se unen por un lado a la lignina y por otro a la hemicelulosa (enlaces éster y éter), mientras que esta última se asocia a la celulosa por puentes de hidrógeno. En las plantas leñosas, que no contienen cantidades apreciables de ácidos cinámicos, existen uniones directas lignina-polisacárido en forma de enlaces éter entre hidroxilos alcohólicos. Tomado de Bidlack et al. (1992). 1. Introducción 5 repite exactamente en la cadena polimérica (Figura 2). En la pared celular, las cadenas de celulosa se agregan formando microfibrillas que constituyen el elemento base de los materiales celulósicos. 1.1.2. Hemicelulosas Son polisacáridos químicamente heterogéneos, constituidos por diferentes unidades de monosacáridos incluyendo pentosas (xilosa y arabinosa), hexosas (glucosa, manosa y galactosa) y ácidos urónicos, enlazados entre sí por enlaces glicosídicos, formando estructuras ramificadas y en general amorfas. En la Figura 3 se muestran los monosacáridos constituyentes de las hemicelulosas. Algunas hemicelulosas están asociadas a la porción celulósica, mientras que otras lo están con la lignina. Actúan como matriz soporte para las microfibrillas de celulosa en la pared celular, y son de menor masa molecular, más accesibles, más fácilmente degradables y más fáciles de disolver que la celulosa. La estructura de la celulosa es la misma en los distintos materiales lignocelulósicos. Sin embargo, en las hemicelulosas existe una considerable variación, especialmente entre las coníferas, frondosas y plantas herbáceas. En el caso de la madera de coníferas se suele apreciar una mayor cantidad de manosa y galactosa mientras que la xilosa es más abundante en las frondosas (Fengel y Wegener, 1984). En las plantas herbáceas, las hemicelulosas presentan una gran variedad en composición según las diferentes especies, siendo en algunas predominantes la manosa y la galactosa (Morrison et al., 1999b) y en otras la xilosa (Neto et al., 1996). CH 2 OH HO OH O OH O HO HO CH 2 OH O OH O OH CH 2 OH O n HO CH 2 OH OH HO OO CH 2 OH HO OH O OH OO HO HO CH 2 OH OO OH O OH CH 2 OH OO n HO CH 2 OH OH HO OO Figura 2. Molécula de celobiosa en la cadena de celulosa. 1. Introducción 6 1.1.3. Lignina Es un polímero aromático formado por la condensación oxidativa de precursores fenólicos, muy ramificado y amorfo. La lignina es un componente característico de la pared celular de las plantas vasculares, donde se forma por polimerización oxidativa de tres alcoholes p-hidroxicinamílicos - p-cumarílico (4- hidroxicinamílico), coniferílico (4-hidroxi-3-metoxicinamílico) y sinapílico (4- hidroxi-3,5-dimetoxicinamílico) - (Figura 4) dando lugar a una red tridimensional con diferentes tipos de enlaces. Este polímero es muy resistente a la biodegradación y sus funciones son proteger a la celulosa del ataque microbiano, conferir resistencia e impermeabilidad a los materiales lignificados, y mantener unidas las fibras celulósicas, tal como se ha comentado anteriormente. Figura 3. Monosacáridos componentes de las hemicelulosas (Fengel y Wegener, 1984). Desoxi-hexosas OOH OH OH CH 3 OH α-L-Ramnosa OOH OH OH CH 3 OH α-L-Fucosa Pentosas OOH HO OH OH β-D-Xilosa OOH OH OH OH α-L-Arabinopiranosa OOH HOH 2 C OH OH α-L-Arabinofuranosa Hexosas OOH HO OH OH CH 2 OH β-D-Glucosa OOH HO HOOH CH 2 OH β-D-Manosa O OH HO OH OH CH 2 OH α-D-Galactosa Ácidos hexurónicos OOH HO OH OH COOH Ácido β-D-Glucurónico O OH H 3 CO OH COOH OH Ácido α-D-4-O-Metilglucurónico O OH HO OH OH COOH Ácido α-D-Galacturónico Desoxi-hexosas OOH OH OH CH 3 OH α-L-Ramnosa OOH OH OH CH 3 OH α-L-Fucosa Desoxi-hexosas OOH OH OH CH 3 OH α-L-Ramnosa OOH OH OH CH 3 OH OOH OH OH CH 3 OH α-L-Ramnosa OOH OH OH CH 3 OH α-L-Fucosa OOH OH OH CH 3 OH OOH OH OH CH 3 OH α-L-Fucosa Pentosas OOH HO OH OH β-D-Xilosa OOH OH OH OH α-L-Arabinopiranosa OOH HOH 2 C OH OH α-L-Arabinofuranosa Pentosas OOH HO OH OH β-D-Xilosa OOH HO OH OH OOH HO OH OH β-D-Xilosa OOH OH OH OH α-L-Arabinopiranosa OOH OH OH OH OOH OH OH OH α-L-Arabinopiranosa OOH HOH 2 C OH OH α-L-Arabinofuranosa OOH HOH 2 C OH OH OOH HOH 2 C OH OH α-L-Arabinofuranosa Hexosas OOH HO OH OH CH 2 OH β-D-Glucosa OOH HO HOOH CH 2 OH β-D-Manosa O OH HO OH OH CH 2 OH α-D-Galactosa Hexosas OOH HO OH OH CH 2 OH β-D-Glucosa OOH HO OH OH CH 2 OH OOH HO OH OH CH 2 OH β-D-Glucosa OOH HO HOOH CH 2 OH β-D-Manosa OOH HO HOOH CH 2 OH OOH HO HOOH CH 2 OH β-D-Manosa O OH HO OH OH CH 2 OH α-D-Galactosa O OH HO OH OH CH 2 OH O OH HO OH OH CH 2 OH α-D-Galactosa Ácidos hexurónicos OOH HO OH OH COOH Ácido β-D-Glucurónico O OH H 3 CO OH COOH OH Ácido α-D-4-O-Metilglucurónico O OH HO OH OH COOH Ácido α-D-Galacturónico Ácidos hexurónicos OOH HO OH OH COOH Ácido β-D-Glucurónico OOH HO OH OH COOH OOH HO OH OH COOH Ácido β-D-Glucurónico O OH H 3 CO OH COOH OH Ácido α-D-4-O-Metilglucurónico O OH H 3 CO OH COOH OH O OH H 3 CO OH COOH OH Ácido α-D-4-O-Metilglucurónico O OH HO OH OH COOH Ácido α-D-Galacturónico O OH HO OH OH COOH O OH HO OH OH COOH Ácido α-D-Galacturónico 1. Introducción 13 1.2.1.2. Fibras procedentes de plantas herbáceas Los cultivos de plantas anuales constituyen una alternativa a los cultivos forestales para diferentes usos industriales. Esta posibilidad tiene especial interés para países con escasos recursos forestales y para los que disponen de residuos agrícolas fibrosos o cultivos de plantas fibrosas no madereras. En los países industrializados las fibras no madereras se utilizan para producir papeles especiales, sin embargo, en otros países (en vías de desarrollo) son la principal materia prima para la fabricación de papel, así, en China suponen el 60% de las fibras utilizadas para la producción de papel. Las especies más utilizadas son algodón, cáñamo, lino o paja de cereales. Uno de los hechos apremiantes que conducen a la utilización de materia prima no maderera es su conocida abundancia que sobrepasa la utilización actual. Un beneficio relacionado con el anterior es la reutilización de terrenos agrícolas abandonados o en vías de reconversión. Existe en Europa, en algunos sectores, una sobreproducción de alimentos y los subsidios a la agricultura son una de las principales sangrías económicas de la UE. Grandes áreas de terreno agrícola han sido ya sustraídas a la producción de alimentos y de acuerdo con la actual política agrícola comunitaria, esta reducción continuará. Una alternativa para el aprovechamiento de estos terrenos sería su utilización para cultivos agroindustriales, en el presente caso cultivos destinados a la producción de pasta de papel, o energéticos. A escala mundial, las fibras no madereras aportan una pequeña parte de la materia prima suministrada para la fabricación de papel, habiéndose incrementado su utilización en los últimos años. En el caso concreto de España, en la actualidad hay una producción de unas 12 mil toneladas de pastas celulósicas fabricadas con especies no madereras, lo que supone un 0,62% de producción de pastas de fibras no madereras respecto de la producción total de pastas papeleras (FAO, 2006) (Tabla 1). En nuestro país, la empresa CELESA fabrica pasta de papel a partir de fibras no madereras. Dicha empresa ha suministrado las fibras estudiadas en esta Tesis y utiliza lino, cáñamo, yute, sisal y abacá para fabricar pasta para papeles especiales de distintas características, tales como papeles de cigarrillo, filtros especiales o papeles dieléctricos. 1. Introducción 14 Tabla 1. Producción de pasta celulósicas en el Mundo y en España durante el periodo 2000-2004 (FAO, 2006). Producción pastas (Miles de t) 2000 2001 2002 2003 2004 Madera 171.742 165.509 167.848 171.048 174.634 Fibras no madereras 18.224 18.407 15.903 16.855 17.351 Total 189.966 183.916 183.751 187.903 191.985 Mundo % Utilización fibras no madereras 9,60 10,00 8,65 8,97 9,04 Madera 1750 1721 1721 1894 1905 Fibras no madereras 12 12 12 12 12 Total 1762 1733 1733 1906 1917 España % Utilización fibras no madereras 0,68 0,69 0,69 0,63 0,62 1.2.2. Procesos de producción de pasta de papel El objetivo de los procesos de pasteado es la separación de las fibras celulósicas que constituyen la materia prima para la obtención de la pasta que alimenta la máquina de papel. Básicamente, los procesos de obtención de pastas de papel se clasifican en mecánicos y químicos. Combinaciones de éstos dan lugar a procedimientos intermedios o semiquímicos. A continuación se incluye una breve descripción de los principales procesos. 1.2.2.1. Procesos mecánicos El tratamiento mecánico tiene como objetivo la disgregación y separación física de las fibras. La lignina que une la celulosa a las hemicelulosas no se disuelve. Las especies utilizadas para la fabricación de pasta mecánica son las maderas de coníferas aunque también se usan frondosas. La fabricación de pastas mecánicas ofrece la ventaja de dar como resultado rendimientos elevados (90-95%). 1.2.2.2. Procesos químicos En el pasteado o cocción química, la deslignificación se lleva a cabo con la ayuda de agentes químicos ácidos o básicos, en digestores o reactores a altas temperaturas y presiones. La pasta se produce con disolución de la lignina que se encuentra entre las fibras del material lignocelulósico, sin dañar sustancialmente la celulosa. En el pasteado químico los rendimientos son normalmente de 40 a 60%, ya que la mayor parte de la lignina y las hemicelulosas se pierden, el producto es más resistente y de mejor calidad. Los métodos químicos se dividen fundamentalmente en ácidos o alcalinos dependiendo del pH del reactivo. 1. Introducción 15 Proceso a la sosa. Es el más antiguo y simple de los procesos químicos alcalinos. El proceso de cocción se realiza con sosa cáustica y vapor a alta presión y temperatura. Esta operación se efectúa en digestores continuos. El hidróxido de sodio, o sosa cáustica, es un producto muy útil para la deslignificación de materias primas vegetales, principalmente de maderas, pajas de cereales y plantas fibrosas en general. Además de la sosa cáustica, en el proceso de cocción se usa antraquinona (AQ), proceso a la sosa-AQ, que funciona como catalizador. Este aditivo presenta dos efectos fundamentales como son la aceleración del proceso de deslignificación alcalino y la estabilización de los carbohidratos, mejorando además los rendimientos respecto al proceso convencional en las mismas condiciones de operación. Proceso kraft o al sulfato. El proceso kraft para la obtención de pasta de papel es un proceso químico alcalino que deriva del proceso a la sosa. En este proceso, además de hidróxido de sodio se utiliza el sulfuro sódico, siendo estos agentes de cocción conocidos como lejías blancas. El proceso se lleva a cabo en digestores que pueden ser tanto discontinuos como continuos, en los que se introducen las astillas junto a las lejías blancas llevándose a cabo la cocción a elevada temperatura (150-170ºC) y presión. De un modo general, el proceso tiene lugar con una concentración de reactivos del 16-20% (expresados como peso de Na2O, en relación al peso de la madera) y sus rendimientos varían entre un 40 y 60%. La ventaja de este proceso es que requiere tiempos de cocción relativamente bajos pues el sulfuro acelera la deslignificación reduciendo la degradación del material celulósico y produciendo así pastas de mejor calidad. La resistencia es su principal característica de donde deriva su nombre “kraft”, del alemán resistencia. Proceso al sulfito ácido. Este proceso se fundamenta en una deslignificación con sulfitos y bisulfitos, siendo el segundo grupo más utilizado en los procesos químicos de obtención de pasta de papel. Está limitado en cuanto a los tipos de madera que se pueden utilizar y por la contaminación creada al eliminar la lejía negra residual sin tratar (tratamiento muy caro). A pesar de ocurrir la digestión en medio ácido, existen variantes en las que se utilizan un medio neutro o un medio alcalino. La lejía de cocción es de ácido sulfuroso y bisulfito de calcio. En estos procesos también se degradan los hidratos de carbono por destrucción de los enlaces glicosídicos, lo que provoca una disminución del grado de polimerización todavía mayor que en los procesos kraft siendo la pasta resultante menos resistente, pero por el contrario estas pastas son más fáciles de blanquear. 1. Introducción 16 1.2.3. Proceso de blanqueo de pasta de papel Durante las cocciones químicas se elimina la mayor parte de la lignina presente en la materia prima utilizada para la fabricación de pasta de papel, pero la lignina residual que queda en la pasta presenta un color oscuro como consecuencia de las reacciones de oxidación durante la cocción. El blanqueo tiene como objetivo eliminar estos restos de lignina que son responsables del color de las pastas. Los reactivos comerciales más utilizados para el blanqueo son o han sido el cloro gas, el hipoclorito, el peróxido de hidrógeno y el dióxido de cloro. El proceso de blanqueo ha sido una de las secciones de la industria de pasta y papel que ha sufrido más cambios durante los últimos años. La decisión de eliminar el cloro y, en algunos casos el dióxido de cloro, en las secuencias de blanqueo se debe a la necesidad de reducir las emisiones de AOX en los efluentes. El desarrollo de leyes más restrictivas con respecto a los procesos contaminantes (Brooks et al., 1994) y en especial contra los compuestos clorados, calificados como contaminantes prioritarios por la EPA por su persistencia en el suelo y el agua, ha llevado a una parte de la industria europea de pasta y papel (especialmente a la de los países nórdicos) a introducir secuencias de blanqueo de la pasta de papel totalmente libres de cloro (blanqueo TCF, “totally chlorine free”) basadas principalmente en el blanqueo con peróxido de hidrógeno, oxígeno y ozono. Otra parte de la industria papelera mundial, incluyendo buena parte de la industria norteamericana de este sector, ha eliminado el Cl2 pero continúa utilizando dióxido de cloro en el blanqueo (blanqueo ECF, “elementary chlorine free”). La novedad de las secuencias de blanqueo TCF obliga a solucionar nuevos problemas que se describen en el apartado siguiente. En España, diversas empresas papeleras, incluyendo CELESA (que ha suministrado las fibras y pastas estudiadas en la presente Tesis) han realizado un considerable esfuerzo de inversión y modernización de sus fábricas con objeto de adaptarlas a las modernas tecnologías ECF y TCF. 1.2.4. Calidad de las pastas La fabricación de pastas de papel mediante tecnologías menos contaminantes ha traído consigo nuevos problemas en el blanqueo de la pasta, que no se daban al utilizar reactivos más agresivos (aunque también más contaminantes) y/o en sistemas con un menor grado de cierre de los circuitos. La acción deslignificante del oxígeno se conoce desde hace tiempo pero el desarrollo del blanqueo con oxígeno ha sido bastante lento por la degradación de la celulosa y demás polisacáridos de la madera. Como consecuencia, el blanqueo con oxígeno viene acompañado a menudo por pérdidas de rendimiento y viscosidad de la pasta. Las ventajas del peróxido se apoyan en su facilidad de manipulación y 1. Introducción 17 aplicación, su versatilidad y la naturaleza relativamente inocua de los productos de reacción. Una parte de los problemas que han surgido con la introducción de estos reactivos está relacionada con la blancura de las pastas, porque de momento ni el oxígeno ni la combinación de oxígeno y peróxido pueden igualar la eficacia de la cloración para la eliminación de los productos derivados de la lignina, responsables del color de las pastas. La modificación de los procesos de cocción, con objeto de obtener pastas con menores contenidos en lignina, representa otra alternativa para facilitar la blanqueabilidad de las pastas. Otra parte de estos problemas está relacionada con los extraíbles de los materiales lignocelulósicos descritos anteriormente. Entre los problemas causados por este tipo de compuestos ocupa un lugar importante la formación de depósitos de "pitch" en las máquinas de papel (que obligan a realizar paradas técnicas) y en la misma pasta (Allen, 1980; Hillis y Sumimoto, 1989). Estos últimos reducen drásticamente la calidad del producto final (Figura 7). Generalmente el término “pitch” se aplica tanto a los extraíbles lipofílicos de la madera como a los depósitos que estos lípidos causan durante el proceso de fabricación de la pasta y el papel. Muchos de estos compuestos estaban presentes en concentraciones más bajas cuando se utilizaban volúmenes de agua mayores en el lavado de la pasta y menor grado de cierre de los circuitos. Por otro lado, aunque no se conoce adecuadamente la posible incidencia medioambiental de estos compuestos en los vertidos (Swan, 1989), ya se ha indicado anteriormente que algunos de ellos pueden ser fuertemente tóxicos. Figura 7. Imagen de la resina en el árbol (izquierda) y de los depósitos de “pitch” en la pasta (derecha). 1. Introducción 18 La problemática del "pitch" es muy compleja porque varía con la materia prima así como con el proceso empleado para la fabricación de pasta y papel. La formación de los depósitos de "pitch" durante la fabricación de pastas de papel a partir de coníferas ha sido estudiado desde hace años, dado el uso mayoritario de este tipo de madera en los principales países productores de pasta (USA, Canadá y países nórdicos de la UE), sin embargo la formación de estos depósitos en procesos que utilizan madera de frondosas está menos estudiada y prácticamente no existe información en la literatura sobre dicha problemática en la fabricación de pasta de papel a partir de fibras de plantas herbáceas (Gutiérrez y del Río, 2005). En la presente Tesis se plantea el estudio de las fracciones de lignina y compuestos extraíbles, introducidos en los apartados precedentes, en diferentes fibras de plantas herbáceas utilizadas en nuestro país como materia prima para la fabricación de pastas de papel de alta calidad. Estas pastas de papel de alta calidad se obtienen mediante procedimientos químicos, como las cocciones alcalinas (cocción sosa-AQ) seguidas de blanqueo libre de cloro. La información obtenida en el presente estudio servirá para mejorar en el futuro algunos de los aspectos de estos procesos descritos anteriormente. 2. OBJETIVOS 2. Objetivos 21 El objetivo general de esta Tesis es llevar a cabo una caracterización química de las fibras de diversas plantas herbáceas que se utilizan para la fabricación de pasta de papel de alta calidad, con objeto de poder mejorar posteriormente los procesos industriales en los que se utilizan como materia prima. La caracterización de las fibras a estudiar se centra principalmente en dos de las fracciones que, por su difícil degradabilidad, presentan una importancia significativa en la fabricación de pasta de papel. Estas dos fracciones son: i) el polímero de lignina, cuya composición varía entre las distintas especies y ii) los compuestos extraíbles que presentan también composiciones diferentes según el tipo de material lignocelulósico. Los objetivos específicos de la Tesis incluyen: • Una caracterización general de las diferentes fibras seleccionadas (lino, cáñamo, kenaf, yute, sisal y abacá) basada en la cuantificación de las principales fracciones (lignina, polisacáridos, extraíbles totales, cenizas, etc.). • El fraccionamiento del material extraíble y la caracterización cromatográfica de los compuestos lipofílicos con objeto de definir su composición en las diferentes especies vegetales y los cambios estructurales producidos después de la cocción alcalina. • La caracterización del polímero de lignina en estas fibras y el estudio de los cambios estructurales producidos durante la cocción alcalina. Por lo tanto, también se estudia la composición de las ligninas alcalinas obtenidas después del proceso de cocción. La novedad y relevancia de los objetivos planteados radica en el hecho de que las fibras a analizar han sido escasamente estudiadas a pesar de su gran valor como materias primas industriales para la fabricación de pastas de alta calidad para papeles especiales. 3. Materiales y métodos 29 Figura 11 se muestran las fotografías de una planta de yute y de su fibra correspondiente. El yute se cultiva desde tiempos remotos en la región del Golfo de Bengala. En la actualidad, la producción se concentra principalmente en India y Bangladesh, pero se cultiva en numerosos países como Brasil, Camboya, Camerún, China, Egipto, Irán, Pakistán, Perú, Tailandia y Vietnam. La planta de yute, de tipo herbáceo, mide de 3 a 4 m de altura. El yute crece en un clima caliente y húmedo, sobre un suelo de tipo aluvial o arcillo-arenoso. La longitud de las fibras varía de 2 a 5 mm (Han, 1998) siendo la fibra de yute explotable la de los vasos de floema situados bajo el tallo principal. La principal utilización conocida del yute es la fabricación de sacos para el transporte de materias agrícolas como el café, el cacao o el arroz. Además de esta utilización, la confección de alfombras, piezas de tela, hilo y cuerdas son los principales mercados para los países en desarrollo. Estos productos son consumidos localmente o exportados tanto hacia países industrializados como hacia países en desarrollo. Como consecuencia de la severa competencia que existe por parte de los productos sintéticos y del transporte a granel, han aparecido nuevos mercados para los productos del yute. Además del uso tradicional que se le da a esta planta, se está imponiendo su plantación en la elaboración de pasta papelera debido a las propiedades de sus fibras, porosidad, largura y elasticidad. Entre sus usos destaca su utilización para bolsas de té y papel de fumar. Figura 11. Planta (izquierda) y fibra (derecha) de yute. 3. Materiales y métodos 30 3.1.1.5. Sisal El sisal (Agave sisalana) es una planta monocotiledónea de la familia de las Agaváceas. Es una planta robusta que puede soportar condiciones muy secas, siendo esencialmente una planta de zonas tropicales. Originaria de América central y México, la mayor producción se centra en Brasil, este de África e Indonesia. En la Figura 12 se muestran las fotografías de la planta de sisal y de las fibras obtenidas de sus hojas. Las fibras de sisal se obtienen de las hojas de la planta, tras ser cortadas y descortezadas. El descortezado se debe hacer tan pronto como sea posible una vez cortadas para reducir el deterioro de las fibras. Las fibras se extraen de las hojas por un proceso de trituración y de raspado para eliminar la materia verde que las rodea. La longitud de la fibra varía entre 2 y 4 mm (McDougall et al., 1993). Estas fibras se emplean principalmente en la fabricación de cuerdas y papeles especiales debido, sobre todo, a la alta porosidad de sus pastas, haciendo de las fibras de sisal un excelente material para la obtención de papel para bolsas de té, papeles dieléctricos, papel de filtro, etc. Por otra parte, también se utiliza como refuerzo para los papeles delgados (Moore, 1996). 3.1.1.6. Abacá El abacá (Musa textilis), también denominado cáñamo de Manila, es una planta herbácea monocotiledónea que pertenece a la familia de las Musáceas. Es nativa de Filipinas y las dos áreas de producción son el sur de Filipinas, Malasia y Sumatra Figura 12. Planta (izquierda) y fibra (derecha) de sisal. 3. Materiales y métodos 31 (en Asia) y Panamá, Costa Rica, Honduras, y Guatemala (en América), siendo Filipinas, el principal productor con un 85% de la producción mundial (Peralta, 1995). En la Figura 13 se representan dos fotografías, una de la planta de abacá y otra de las fibras obtenidas de sus hojas. La planta se asemeja a la del platanero, pero con hojas más pequeñas y frutos no comestibles. Es una hierba con aspecto de árbol que crece por encima de los 6 m, con un tronco formado por la superposición de hojas. Las fibras se extraen de las capas superficiales de las envolturas de las hojas. La longitud de la fibra varía entre 2,5 y 12 mm y el diámetro entre 16 y 32 µm (Moore, 1996). Es una fibra fuerte, tersa, rígida, ligera de peso, de color crema y resistente al agua salada. Su uso ha sido muy variado a lo largo de la historia, siendo la utilización más conocida la fabricación de redes de pesca. En el sector papelero, los papeles producidos son altamente porosos, una característica especialmente conveniente para la fabricación de papeles de bolsitas de té y de envolturas de embutidos. Debido a sus características, se considera una excelente materia prima para la fabricación de papel de seguridad y de alta calidad, como papel moneda, pañales, servilletas, papel tisú, filtros para maquinaria, accesorios para hospitales (mandiles, gorras, guantes) y cables de conducción eléctrica, entre otros. 3.1.2. Pastas sosa/AQ Las pastas de papel seleccionadas para este estudio fueron suministradas por la empresa CELESA e incluyen dos pastas alcalinas de lino de distinto número kappa Figura 13. Planta (izquierda) y fibra (derecha) de abacá. 3. Materiales y métodos 32 (kappa 28 y kappa 6) y una pasta de papel de kenaf (kappa 6) obtenidas tras cocción sosa/AQ (Holton, 1977). Las pastas se secaron en una estufa de aireación a 40ºC antes de los análisis. 3.1.3. Ligninas alcalinas Las ligninas procedentes de la cocción alcalina de las distintas fibras seleccionadas fueron obtenidas en la empresa CELESA, donde se aislaron de los líquidos de cocción por precipitación ácida y se lavaron con agua antes del análisis. 3.2. MÉTODOS ANALÍTICOS La determinación cuantitativa de las diversas fracciones se obtuvo mediante un fraccionamiento secuencial. En primer lugar, las fibras se extrajeron con acetona separándose la fracción lipofílica y a continuación se extrajeron con agua destilada en caliente para obtener la fracción hidrosoluble. Posteriormente, las fibras libres de extraíbles e hidrosolubles se sometieron a una hidrólisis ácida obteniéndose por una parte la lignina Klason (precipitado) y por otro lado la lignina soluble en ácido. Finalmente, se analizó la composición química de los monosacáridos neutros del hidrolizado resultante. Por otra parte, la composición química de la lignina y la determinación de las cenizas se midieron “in situ”. 3.2.1. Análisis de la fracción extraíble lipofílica 3.2.1.1. Extracción de los compuestos lipofílicos Las fibras molidas (2-5 g), así como las pastas, se depositaron en un cartucho de celulosa y se extrajeron con acetona en un Soxhlet durante 8 h. Una vez concluida la extracción se evaporó el disolvente a sequedad en rotavapor y posteriormente se pasó a un vial donde se terminó de secar con corriente de nitrógeno. Los viales, previamente tarados, se pesaron para determinar la cantidad de material extraído. Los extractos se redisolvieron totalmente en cloroformo para el análisis cromatográfico por GC y GC/MS. Las extracciones y los análisis se realizaron por duplicado. 3.2.1.2. Fraccionamiento de los lípidos mediante extracción en fase sólida (SPE) Para llevar a cabo una caracterización más detallada de algunos compuestos de interés presentes en los extractos se procedió a su aislamiento y purificación mediante SPE. En el método SPE utilizado, los compuestos lipofílicos se retuvieron en la columna y se eluyeron por orden creciente de polaridad. El 3. Materiales y métodos 33 extracto lipídico de las fibras se fraccionó por un procedimiento SPE desarrollado por Gutiérrez et al. (1998) en cartuchos (500 mg) con fase aminopropilo (Waters, Millipore). El extracto seco (5-10 mg) se suspendió en un volumen mínimo (<0.5 ml) de hexano-cloroformo (4:1) con el que se cargó el cartucho, previamente acondicionado con hexano (4 ml). La primera fracción se eluyó con 8 ml de hexano (fracción A, contiene los compuestos más apolares como ésteres de esteroles, ceras e hidrocarburos), la segunda con 6 ml de hexano-cloroformo (5:1) (fracción B, rica en triglicéridos), la tercera con 10 ml de cloroformo (fracción C, contiene principalmente esteroles y alcoholes libres) y la cuarta fracción con 10 ml de una mezcla de éter etílico-ácido acético (98:2) (fracción D, compuestos ácidos). Cada fracción aislada se llevó a sequedad con nitrógeno, se pesó y se analizó por GC y GC/MS. 3.2.1.3. Cromatografía en capa fina (TLC) La TLC se utilizó para aislar y purificar el compuesto mayoritario presente en el extracto de algunas fibras de abacá para su posterior análisis por NMR. Para ello, una pequeña cantidad del extracto disuelto en cloroformo se depositó mediante una micropipeta en la parte inferior de la placa (20 x 20 cm, silica gel 60, 2 mm, Merck) y se usó una mezcla hexano-acetato de etilo (80:20) como fase móvil. Las distintas bandas se localizaron con una lámpara de ultravioleta. Posteriormente, se recuperó el compuesto recogiendo la banda que lo contenía. Seguidamente, se filtró en un embudo y se arrastró con metanol y se recogió en un matraz de fondo redondo. Tras lavarlo varias veces más con metanol se llevó a sequedad en rotavapor y se recuperó con metanol. Una vez recuperado se secó con corriente de nitrógeno. 3.2.1.4. Saponificación de ésteres de esteroles La identificación completa de la estructura de los ésteres de esteroles por GC/MS no es posible debido a que los espectros de masas sólo muestran fragmentos procedentes de la molécula del esterol y raramente presentan iones moleculares detectables (Lusby et al., 1984; Evershed et al., 1989). La fracción A obtenida tras SPE del extracto de las fibras (enriquecida en ésteres de esteroles) se hidrolizó a reflujo con una disolución de hidróxido potásico 0,5 M al 90% en etanol durante 8 h (Gutiérrez et al., 1999). Una vez concluida la saponificación y enfriada la solución, la fracción neutra se extrajo con hexano (3 x 20 ml), eliminando los restos de humedad con sulfato sódico anhidro. Posteriormente, la fracción neutra se llevó a sequedad en rotavapor. Por otra parte, la fase acuosa se acidificó con ácido clorhídrico 6 M y la fracción ácida se extrajo con hexano (3 x 20 ml). Los ácidos grasos libres se recuperaron después de eliminar la humedad del extracto con sulfato sódico anhidro y evaporar el disolvente en el rotavapor. Ambas fracciones se analizaron por GC y GC/MS. 3. Materiales y métodos 34 3.2.1.5. Cromatografía de gases (GC) Los análisis cromatográficos de los extractos se llevaron a cabo en un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard HP-5890 equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna capilar corta de sílice fundida (DB-5HT, J&W; 5 m x 0,25 mm ID, espesor de película 0,1 µm). El programa de calentamiento del horno empezó a 100°C (1 min), seguido de un incremento de temperatura hasta 350°C (3 min) a 15°C/min. La temperatura del inyector y del detector se mantuvieron a 300°C y 350°C, respectivamente. El gas portador fue helio y la inyección se realizó en modo splitless. 3.2.1.6. Cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) El análisis por GC/MS se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases Varian Star 3400 acoplado a un detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 2000), usando una columna capilar de sílice fundida (DB-5HT, J&W; 12 m x 0,25 mm ID, con espesor de película de 0,1µm). El horno se calentó de 120°C (1 min) a 380°C (5 min) a 10°C/min. La línea de transferencia se mantuvo a 300ºC. La temperatura del inyector se programó de 120ºC (0,1 min) a 380°C con una rampa de 200ºC/min y manteniéndose hasta el final del análisis. Se usó helio como gas portador. La identidad de cada componente se determinó por comparación de sus espectros de masas con los de sustancias patrones inyectados en las mismas condiciones, con los existentes en librerías (Wiley, NIST), con espectros publicados anteriormente y por los tiempos de retención. 3.2.1.7. Métodos de derivatización Muchos compuestos orgánicos no pueden analizarse en condiciones óptimas por GC debido a su baja volatilidad y/o inadecuada separación en columnas de poca polaridad. En estos casos es necesario recurrir a métodos de derivatización para hacerlos más volátiles. Las técnicas empleadas en este trabajo incluyeron la metilación de grupos carboxilo y la silanización de grupos hidroxilo. Metilación con (trimetilsilil)diazometano. Se usó para metilar los grupos carboxílicos de ácidos grasos libres, hidroxiácidos, etc. Este método también metila los grupos fenólicos. Una vez seca la muestra, se añadió 0,1 ml de metanol y 0,025 ml de una solución de trimetilsilil diazometano 2,0 M en hexano, se mantuvo 20 min en el baño de ultrasonidos. A continuación se evaporó con nitrógeno hasta sequedad, para resuspenderla en cloroformo y analizarla por GC/MS. Silanización con N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA). Se usó para silanizar los grupos hidroxilo de alcoholes, esteroles, etc. Una vez seca la muestra, se añadió 0,1 ml de BSTFA y 0,2 ml de piridina. A continuación se 3. Materiales y métodos 35 calentó a 70ºC durante 2 h y se evaporó la mezcla con nitrógeno hasta sequedad. Posteriormente, se redisolvió en cloroformo para analizarla por GC/MS. 3.2.1.8. Métodos de cuantificación En el presente estudio se utilizaron patrones externos para la cuantificación de los extractos lipofílicos. Para ello se usó una mezcla de compuestos (nonadecano, ácido palmítico, sitosterol, oleato de colesterol y trioleína) a una concentración de 0,2 mg/ml. Dicha mezcla de patrones se inyectó en las mismas condiciones cromatográficas que los extractos lipídicos de las fibras estudiadas. Las áreas obtenidas tras la inyección del patrón se extrapolaron respecto a la concentración de patrón inyectada y se compararon con las correspondientes a cada compuesto en las muestras problema. 3.2.2. Determinación de la fracción hidrosoluble El porcentaje de los compuestos hidrosolubles se determinó según la norma Tappi T 207 om-88. Para ello, los cartuchos con las muestras de fibras tras la extracción con acetona, una vez secos, se colocaron en matraces con 100 ml de agua destilada y se tuvieron en un baño a 100ºC durante 3 h, al cabo de las cuales el extracto se concentró en rotavapor y se secó a 100ºC para su determinación gravimétrica. 3.2.3. Determinación de la lignina Klason o lignina ácido-insoluble La lignina Klason se determinó según la norma Tappi 222- om88, con algunas modificaciones. Para ello, las fibras libres de extraíbles e hidrosolubles (300 mg) se hidrolizaron con ácido sulfúrico al 72% (p/p), a 30ºC durante 1 h en frascos pyrex. Posteriormente, las soluciones se diluyeron con agua destilada hasta alcanzar una concentración de ácido sulfúrico del 4%, y se tuvieron durante 1 h a 110ºC. Una vez enfriados, se filtraron a través de filtros de vidrio poroso (Vidra FOC 663/3), previamente tarados (4 h a 100ºC). Los primeros 100 ml de los filtrados se recogieron para el posterior análisis de los azúcares libres. La lignina Klason se retuvo en los filtros de vidrio poroso. El residuo (lignina Klason) se lavó con agua destilada hasta pH neutro y se secó a 100ºC, durante 4 h. Los porcentajes de lignina Klason se calcularon por diferencia de peso. El contenido en cenizas de la lignina Klason se determinó mediante la norma Tappi 211 om-85 tal como se describe para la fibra (ver apartado 3.2.7). Dicho contenido fue deducido del porcentaje total de lignina presente en las muestras. 3. Materiales y métodos 36 3.2.4. Determinación de la lignina ácido-soluble Para la determinación de la lignina ácido-soluble se cogieron pequeños volúmenes de los hidrolizados anteriores y se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160 a una longitud de onda de 205 nm. El porcentaje de lignina ácido-soluble se calculó según la siguiente fórmula: L.A.S (%)= A205 x V (ml)/1100 x M (g), donde “L.A.S” es el porcentaje estimado de lignina ácido soluble, “V” el volumen final del hidrolizado, “A205” la absorbancia a 205 nm y “M” el peso del material de partida. 3.2.5. Determinación de la composición de los polisacáridos La composición en monosacáridos neutros de las fibras se determinó según la norma Tappi 249 om-85. Una vez realizada la hidrólisis ácida descrita en el apartado 3.2.3 se llevó a cabo la determinación de los azúcares libres presentes en las muestras. Se tomaron 3 ml de los hidrolizados y se añadió como patrón interno 1 ml de inositol (1 mg/ml) a cada muestra. Las muestras se neutralizaron con carbonato de bario hasta pH 7, y se centrifugaron a 9000 rev/min durante 5 min. Los sobrenadantes se recogieron en tubos de vidrio y se evaporaron a sequedad en rotavapor. Después, se desprendieron con agua destilada y se pasaron a un tubo de rotavapor donde se mezclaron con otros 0,5 ml de agua destilada y borohidruro sódico hasta pH básico, dejándolo reaccionar toda la noche. Posteriormente, se llevaron a pH ácido con ácido clorhídrico concentrado y se secaron en rotavapor. Al residuo se le añadieron 2 ml (x 3) de metanol que se evaporaron en el rotavapor para eliminar el borohidruro sódico. Una vez reducidas las muestras, se acetilaron con 0,25 ml de piridina y 0,25 ml de anhídrido acético, dejándolo reaccionar 1 h a 100ºC antes de secarlas en rotavapor. Los acetatos de alditol se resuspendieron en cloroformo y se analizaron por GC en un cromatógrafo Perkin Elmer Sigma 3, utilizando una columna (2 m x 2 mm) con 3% SP-2340 sobre 100/120 Supelcoport como fase estacionaria, nitrógeno como gas portador (30 ml/min), una rampa de temperatura de 10ºC/min desde 200ºC (3 min isotermo) hasta 230ºC (8 min isotermo) y un detector FID. 3.2.6. Análisis de metales y otros elementos por espectrometría de emisión por plasma (ICP-OES) Las muestras de fibras, una vez lavadas y secas (70ºC, 48 h), se molieron y se sometieron a digestión ácida. Para ello, se añadió 4 ml de ácido nítrico concentrado a 0,5 mg de muestra, manteniéndolas 15 min en un horno microondas (Jones &Case, 1990). Posteriormente se filtraron con filtro Whatman del número 2, y se 3. Materiales y métodos 37 recogieron en un matraz que se enrasó hasta 50 ml. La concentración de metales y otros elementos en la disolución obtenida se determinó por ICP-OES en un espectrómetro Thermo Jarrell Ash, modelo IRIS Advantages. 3.2.7. Determinación del contenido en cenizas Se determinó mediante la norma Tappi 211 om-85. Para ello, 200 mg de fibras se depositaron en crisoles de porcelana previamente tarados y se mantuvieron en la mufla a 575ºC durante 6 h. Para tararlos, se limpiaron con ácido clorhídrico y se introdujeron en la mufla 575ºC durante 1 h. Posteriormente se sacaron los crisoles de la mufla y se pesaron una vez que alcanzaron la temperatura ambiente en el desecador. Las cenizas resultantes se expresaron como porcentaje de la materia inicial. 3.2.8. Pirólisis-GC/MS (Py-GC/MS) La pirólisis se llevó a cabo en un pirolizador de punto de Curie (Horizon Instruments Ltd.) acoplado a un GC/MS (Varian Saturn 2000) equipado con una columna DB-5 de 30 m x 0,25 mm ID (espesor de película de 0,25 µm). Aproximadamente 100 µg de muestra finamente dividida se depositaron en un hilo ferromagnético y se insertaron dentro de un tubo de cuarzo para ser introducidos en el pirolizador. La pirólisis se realizó a 610ºC durante 4 s. El cromatógrafo se programó desde 40ºC (1 min) hasta 300ºC, con una rampa de 6ºC/min, manteniéndose 20 min la temperatura final. A su vez, el inyector se programó desde 40ºC a 300ºC siendo la rampa de 200ºC/min, mientras la interfase del GCMS permaneció a 300ºC. Para la pirólisis en presencia de hidróxido de tetrametilamonio (TMAH), 100 µg de muestra se mezclaron con 0,5 µl de TMAH (25%, en metanol) y se depositaron en un hilo ferromagnético. Posteriormente, el hilo se insertó dentro del tubo de cuarzo y se introdujo en el pirolizador. Las condiciones de pirólisis fueron las mismas que las descritas anteriormente. Los productos derivados de la pirólisis se identificaron por comparación de sus espectros con los publicados en la bibliografía (Ralph y Harfield, 1991; Faix et al., 1990) y los encontrados en las librerías Wiley y NIST. La estimación de las abundancias molares relativas de los diferentes productos de pirólisis se calculó normalizando la suma de las áreas molares de todos ellos al 100%. 3. Materiales y métodos 38 3.2.9. Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Para la determinación de la estructura del compuesto desconocido presente en algunas fibras de abacá, se recurrió a la técnica de NMR. La muestra para los experimentos de NMR se preparó en cloroformo deuterado (CDCl3), con una concentración ca. 10 mM. Los espectros de NMR se registraron en un espectrómetro Bruker AVANCE 500 MHz, equipado con una sonda triple con gradientes en el eje z, a una temperatura de 300 K. Las asignaciones de las señales se realizaron empleando las secuencias estándar COSY (Espectroscopía de correlación) (Aue et al., 1976), NOESY (Espectroscopía de efecto nuclear Overhauser) (Neuhaus y Williamson, 1989), HSQC (Correlación heteronuclear a un enlace) (Santoro y King, 1992) y HMBC (Correlación heteronuclear en enlace múltiple) (Summers et al., 1986), proporcionadas por Bruker. Los experimentos COSY y NOESY se realizaron con 16 y 48 acumulaciones, respectivamente, usando una matriz de datos de 256 incrementos en la dimensión indirecta y adquiriendo 2048 puntos en la dimensión de adquisición. La anchura espectral fue de 9 ppm en ambas dimensiones. El experimento HSQC se realizó con 16 acumulaciones, usando una matriz de datos de 256 incrementos en la dimensión indirecta y adquiriendo 2048 puntos en la dimensión de adquisición. La anchura espectral fue de 150 ppm en la dimensión indirecta y de 9 ppm, en la de adquisición. El experimento HMBC se realizó con 32 acumulaciones, respectivamente, usando una matriz de datos de 256 incrementos en la dimensión indirecta y adquiriendo 2048 puntos en la dimensión de adquisición. La anchura espectral fue de 180 ppm en la dimensión indirecta y de 9 ppm en la de adquisición. 4. Resultados y discusión 45 4.2. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS LÍPIDOS 4.2.1. Análisis por GC y GC/MS Para el análisis de las fracciones lipofílicas de las fibras por GC y GC/MS se utilizaron columnas capilares de alta temperatura de longitud corta (GC) y mediana (GC/MS). Éstas permiten la elución y separación de lípidos en un margen amplio de masa molecular, desde ácidos grasos hasta ceras, ésteres de esteroles y triglicéridos (Wakeham y Frew, 1982; Lusby et al., 1984; Evershed et al., 1989; Sitholé et al., 1992; Örsa y Holmbom, 1994; Gutiérrez et al., 1998). La identificación de los compuestos se llevó a cabo por MS, mediante comparación con compuestos patrones, con los existentes en las librerías (NIST, Wiley) o con los publicados anteriormente. A continuación se muestran los espectros de masas de compuestos representativos de las principales familias de lípidos presentes en los extractos de las fibras aquí estudiadas. 4.2.1.1. n-Alcanos Los espectros de masas de los n-alcanos son fácilmente identificables, ya que todos presentan el mismo tipo de rotura, con un pico base a m/z 57 proveniente del fragmento [CH3-(CH2)3]+ y fragmentos característicos a m/z 57 + (CH2)n. El ión molecular suele verse aunque presenta una abundancia relativamente pequeña. En la Figura 14 se muestra el espectro de masas del nonacosano, que se caracteriza por un ión molecular a m/z 408 y los fragmentos a m/z 57, 71, 85... antes mencionados. 408 100 200 300 400 m/z 100 % 57 71 85 99 113 127 141 169183 211 225 253 267 295 337 309 365 379 Figura 14. Espectro de masas del nonacosano. 4. Resultados y discusión 46 4.2.1.2. n-Ácidos grasos Los ácidos grasos se identificaron tanto sin derivatizar como formando los correspondientes ésteres metílicos. Los espectros de masas de los ácidos grasos sin derivatizar presentan un pico base característico a m/z 60, debido a la transposición de McLafferty y una serie de iones de fórmula general [HOCO-(CH2)n]+, entre ellos los fragmentos a m/z 73, 115, 129, 199, así como el ión molecular. El espectro de masas del ácido hexadecanoico (Figura 15) muestra el ión molecular a m/z 256 y los fragmentos mencionados anteriormente. Los espectros de masas de los ésteres metílicos de los ácidos grasos presentan un pico base característico a m/z 74, debido a la transposición de McLafferty y fragmentos típicos a m/z 87, 101 y 143. Los iones moleculares se pueden apreciar en el espectro. El espectro de masas del ácido hexadecanoico metilado se muestra en la Figura 16. Dicho espectro de masas se caracteriza por el pico base a m/z 74, Figura 15. Espectro de masas del ácido hexacosanoico. 50 100 150 200 250 m/z 55 73 97 115 129 185 199 226 237 256 177 69 OH O 100% Figura 16. Espectro de masas del ácido hexacosanoico metilado. 100 200 m/z 300 55 74 87 101 115 129 143 157 171 185 199 213 227 241 270 O 100% O 4. Resultados y discusión 47 por el ión molecular a m/z 270 y otros iones significativos como son los fragmentos a m/z 239 [M-31]+ (pérdida de metanol) y a m/z 227 [M-43]+ (debido a pérdidas de C2, C3 y C4 como resultado de un complejo reajustamiento), junto con una serie de iones de fórmula general [CH3OCO(CH2)n]+, a menudo con intensidad máxima a m/z 87, 143, 199. 4.2.1.3. Hidroxiácidos Los hidroxiácidos identificados en las fibras estudiadas fueron de dos tipos, α-hidroxiácidos y ω-hidroxiácidos. La detección de los hidroxiácidos requirió la metilación previa del grupo carboxilo y una posterior silanización del grupo hidroxilo. Los α-hidroxiácidos y los ω-hidroxiácidos presentan espectros de masas bien diferenciados. Los espectros de masas de los α-hidroxiácidos se caracterizan por fragmentos a [M-15]+ y [M-59]+ correspondientes a la pérdida de un grupo metilo y un grupo CO2CH3, respectivamente, siendo el ión molecular muy poco intenso. En la Figura 17 se muestra el espectro de masas del ácido 2-hidroxitetracosanoico metilado y silanizado. Dicho espectro de masas se caracteriza por el ión molecular a m/z 470 y los fragmentos característicos a m/z 455 [M-15]+ y a m/z 411 [M-59]+. Los éteres de TMSi de los metil ω-hidroxiácidos presentan espectros de masas caracterizados por los fragmentos [M-15]+ y [M-47]+, correspondientes a la pérdida de un grupo metilo y de un grupo [M-Me-MeOH]+, respectivamente. Al igual que Figura 17. Espectro de masas del ácido α -hidroxitetracosanoico metilado y silanizado. 470 411 O OTMSi 100 200 300 400 57 83 143 159 199217 255 311 367 455 73 89 97 129 427 m/z 100% O 4. Resultados y discusión 48 el caso anterior el ión molecular es muy poco intenso, aunque fácilmente reconocible por el fragmento [M-15]+. En la Figura 18 se muestra el espectro de masas del ácido 22-hidroxidocosanoico metilado y silanizado, siendo los fragmentos característicos de m/z 427 [M-15]+, 395 [M-47]+y el ión molecular de m/z 442. 4.2.1.4. n-Alcoholes Los n-alcoholes de cadena larga se analizaron como éteres de TMSi y sus espectros de masas se caracterizan por un pico base muy intenso a [M-15]+ y un pico abundante a m/z 75 proveniente del fragmento [Me2SiOH]+, mientras que el ión molecular es inapreciable en la mayoría de los casos. En la Figura 19 se muestra el espectro de masas del octanosanol silanizado. Dicho espectro de masas 100% 100 200 300 400 500 m/z 467 75 57 73 103 97 83 111 125 139 451 437 [M+]= 482 OTMSi Figura 19. Espectro de masas del octacosanol silanizado. Figura 18. Espectro de masas del ácido ω -hidroxidocosanoico metilado y silanizado. 100 200 300 400 m/z 55 73 95 131146 263 283 303 321 353 395 427 411 442 159 103 75 100% O O TMSiO 4. Resultados y discusión 49 se caracteriza por un pico base muy intenso a m/z 467 que corresponde a [M-15]+ y un pico abundante a m/z 75, siendo el ión molecular poco significativo. 4.2.1.5. n-Aldehídos Los espectros de masas de los n-aldehídos presentan un pico base a m/z 82 proveniente de la rotura [C6H10]+ y fragmentos característicos a m/z 82 + 14n y [M- 18]+. El espectro de masas del octacosanal se muestra en la Figura 20 y se caracteriza por un ión molecular a m/z 408 muy débil y por el fragmento a m/z 390 debido a la pérdida de una molécula de agua [M-18]+, además de los fragmentos antes mencionados a m/z 82, 96, 110, 138. 4.2.1.6. Hidrocarburos esteroidales Dentro de la familia de los hidrocarburos esteroidales se han seleccionado los espectros de masas de dos compuestos representativos, estigmasta-3,5,7-trieno y estigmasta-3,5-dieno, que se muestran en la Figura 21. Los espectros de masas se caracterizan por el ión molecular a m/z 394 y 396, respectivamente y por la pérdida de un grupo metilo [M-15]+ a m/z 379 y 381, respectivamente. Otros fragmentos característicos son los de m/z 143 y 147, respectivamente, provenientes de la pérdida de la cadena lateral y de los ciclos C y D. La fragmentación del estigmasta- 3,5,7-trieno es parecida a la publicada para el colesta-3,5,7-trieno (Buckley et al., 1999). Figura 20. Espectro de masas del octacosanal. 100 200 300 400 m/z 390 100% 57 82 71 96 110 138 152 408 124 O 4. Resultados y discusión 50 4.2.1.7. Esteroles Los esteroles se caracterizan por tener un grupo hidroxilo en la posición C-3 y una cadena larga de longitud variable en la posición C-17. Los esteroles se analizaron por GC y GC/MS tanto sin derivatizar como formando los correspondientes éteres de TMSi. En la Figura 22 se muestran los espectros de masas del sitosterol sin derivatizar y silanizado. El espectro de masas del sitosterol sin derivatizar (Figura 22a) se caracteriza por el ión molecular a m/z 414 y por los fragmentos a m/z 396, debido a la pérdida de una molécula de agua, y a m/z 381 debido a la pérdida posterior de un grupo metilo. Por otra parte el espectro de masas del sitosterol silanizado (Figura 22b) se caracteriza por el ión molecular a m/z 486 debido al aumento de 72 uma por la presencia del grupo TMSi y por los fragmentos a m/z 471 [M-15]+, 396 [M-90]+ y 381 [M-105]+, que corresponden a Figura 21. Espectros de masas del estigmastan-3,5,7-trieno (a) y estigmasta-3,5-dieno (b). 340 m/ z 57 81 69 147 95105 133 396 213 161 177 381 288 255 237 354 302 334 135 81 57 69 119 95 143 394 149 163 275 253 183 281 379 355 297 (a) (b) A D D A C C B B 100% 100% 4. Resultados y discusión 51 las pérdidas de un grupo metilo, un grupo HOSi(CH3)3 y a la pérdida de un metilo adicional, respectivamente. Otros fragmentos característicos aparecen a m/z 129 y 357 [M-129]+ provenientes de la rotura de los enlaces C1-C10 y C3-C4, con la transferencia de un átomo de hidrógeno (Dumazer et al., 1986). En la Figura 23 se muestra el espectro de masas del 7-oxositosterol, también presente en los extractos de yute, sisal y abacá. Su espectro de masas, al igual que el de sitosterol, se caracteriza por el ión molecular, en este caso a m/z 428 y por los fragmentos debidos a la pérdida de agua y de un grupo metilo, a m/z 410 y 395, respectivamente. Figura 22. Espectros de masas del sitosterol, sin derivatizar (a) y silanizado (b). m/z 100 200 300 400 57 95 145 213 231 255 273 303 329 354 381 396 414 (a) HO 100% m/z100 200 300 400 73 95 129 213 255 275 303 329 357 396 486 381 471 (b) TMSiO 100% 4 1 3 10 4. Resultados y discusión 52 Otro ejemplo de esterol es el 24-metiléncicloartanol, caracterizado por la presencia de dos grupos metilo en la posición 4 y un ciclopropano en el ciclo B. Su espectro de masas se muestra en la Figura 24 y al igual que el de sitosterol se caracteriza por el ión molecular, en este caso a m/z 440, y la pérdida de una molécula de agua y de un grupo metilo, dando lugar a los picos a m/z 422 y 425, respectivamente. Por otra parte, la pérdida de un grupo metilo adicional da lugar al fragmento a m/z 407. Figura 24. Espectro de masas del 24-metiléncicloartanol. 100 200 300 400 m/z 55 81 147 267 297 325 353 379 407 425 440 422 161 175 121 95 67 187 229245 100% Figura 23. Espectro de masas del 7-oxositosterol. 100% 55 91 135 161 187 227 247 269 287 327 371 395 428 O HO 100 200 300 400 m/z HO 4 A B C D 4. Resultados y discusión 53 4.2.1.8. Triterpenoles En la Figura 25 se muestran los espectros de masas de la β- y la α-amirinas. Los espectros de masas de estos compuestos, al igual que los de sus derivados, difieren sólo ligeramente en la intensidad de algunos fragmentos (Budzikiewicz, 1963). Ambos triterpenoles se caracterizan por un pico base a m/z 218, procedente de la fragmentación retro Diels-Alder en el C12 (Budzikiewicz et al., 1963; Ogunkoya, 1981). Los espectros de masas de ambos compuestos se diferencian por la intensidad relativa de los fragmentos a m/z 189 y 203, correspondientes a las pérdidas de un grupo CH3CH2 y CH3, respectivamente, del pico base. En el espectro de la β-amirina (Figura 25a) el fragmento a m/z 203 es más intenso que el de m/z 189, mientras que en el espectro de la α-amirina (Figura 25b) ambos picos presentan intensidades similares (Vilegas et al., 1997). En ambos casos el ión molecular, a m/z 426, se aprecia ligeramente. Fi g ura 25. Es p ectros de masas de la β -amirina ( a ) y de la α -amirina ( b ) . 218 100 200 300 400 m/z 100% 203 95 83 68 136 109 189 170 269 257 426 411 321 HO 100 200 300 400 m/z 100% 218 95 81 59 189 135 109 147 175 426 257 411 272 297 203 HO (a) (b) 12 12 4. Resultados y discusión 54 En la Figura 26 se muestran los espectros de masas de dos triterpenoles, identificados como motiol y glutinol, que se encontraron únicamente en las fibras de kenaf. Dichos espectros de masas se caracterizan por un ión molecular a m/z 426. Otros fragmentos presentes son los de m/z 411 (debido a la pérdida de un grupo metilo) y m/z 393 (pérdida de una molécula de agua). Por otra parte, el espectro del glutinol (Figura 26b) presenta un ión a m/z 274 procedente de una rotura retro-Diels-Alder y un ión a m/z 259, debido a la pérdida de un grupo metilo de dicho fragmento (Aplin et al., 1966). 4.2.1.9. Acetatos de triterpenoles En la Figura 27 se muestra el espectro de masas del acetato de β-amirina. El perfil de fragmentación es similar al de la β-amirina, con fragmentos característicos a m/z 189, 203 y 218 (pico base), siendo en este caso el ión molecular de m/z 468. Figura 26. Espectros de masas del motiol (a) y glutinol (b). 55 100 200 300 400 m/z 100% 69 83 95 109 133147 259 175 161 241 213185 227 255 411 273 393 295310 365 323 426 (a) HO 100 200 300 400 m/z 100% 259 134 95 81 69 55 122 107 152 231 175 161 189 204 245 274 411 286 393 355 297 325340 365 426 (b) HO 4. Resultados y discusión 61 protonado, por lo que el alcohol esterificado es el octacosanol, y por tanto el éster es el hexadecanoato de octacosilo. El fragmento a m/z 285 indica también la presencia en el mismo pico de un éster del ácido octadecanoico, que correspondería al octadecanoato de hexacosilo. 4.2.1.14. Ésteres de esteroles Los espectros de masas de los ésteres de esteroles con ácidos grasos únicamente presentan fragmentos procedentes de la parte del esterol y no suelen presentar el ión molecular (Lusby et al., 1984; Evershed et al., 1989). En la Figura 36 se muestra el espectro de masas del hexadecanoato de sitosterol. El espectro se caracteriza por los fragmentos a m/z 396 y 381 pertenecientes a la molécula de sitosterol, siendo prácticamente idéntico el espectro de masas del estigmasta-3,5- dieno. Figura 35. Espectro de masas de las ceras C44 (m=14, n=27; m=16, n=25). m/z100 200 300 400 500 600 700 800 438 57 257 71 97 111 125 129 213 285 648 341 393 364 100% CH3-(CH2 )m-CO-(CH2)n-CH3 O (CH)3-(CH 2 ) 14 -COO Figura 36. Espectro de masas del hexadecanoato de sitosterol. 100 200 300 400 500 600 m/z 81 147 213 255 355 396 381 100% [M+]= 652 4. Resultados y discusión 62 4.2.1.15. Ésteres de triterpenoles Los espectros de masas de los ésteres de triterpenoles, al igual que los de ésteres de esteroles, no presentan el ión molecular, siendo característicos los fragmentos pertenecientes a la parte del triterpenol. Un ejemplo de éster de triterpenol encontrado en las muestras analizadas es el hexadecanoato de β-amirina, cuyo espectro de masas se muestra en la Figura 37. El perfil de fragmentación es el mismo que el de la β-amirina, del acetato de la β-amirina y de la β-amirenona, con un pico base a m/z 218 y el fragmento a m/z 203 mayor que el de m/z 189. 4.2.1.16. Monoglicéridos Los monoglicéridos identificados en las fibras estudiadas se caracterizan por tener una configuración 1(3). Los espectros de masas de los monoglicéridos, como éteres de TMSi, se caracterizan por un ión molecular casi indetectable siendo característico el fragmento [M-15]+. Otros fragmentos representativos son [RCO]+ y [RCO+74]+ (Christie, 1989). En la Figura 38 se muestra el espectro de masas del hexadecanoato de 2,3- hidroxipropilo silanizado (1-monopalmitina silanizada). El ión molecular a m/z 474 es inapreciable, pero fácilmente reconocible por el fragmento a m/z 459 [M-15]+. El pico base a m/z 371 [M-103] + es característico de la rotura entre C2 y C3 en los espectros de los derivados de 1(3)-monoacilglicerol (Christie, 1989). Otros fragmentos representativos son los de m/z 239 [RCO]+ y 313 [RCO+74]+. Figura 37. Espectro de masas del hexadecanoato de β -amirina. 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z 100% 218 57 203 69 95 189 (CH)3-(CH2)14-COO [M+]= 664 4. Resultados y discusión 63 4.2.1.17. Diglicéridos Los diglicéridos presentan espectros de masas diferentes dependiendo si la configuración es 1,3 o 1,2. Estudios anteriores (Christie, 1989; Lauer et al., 1970) han sugerido la presencia del ión [M-RCOOCH2]+ como un signo de distinción de la configuración 1,3. En las fibras estudiadas se identificaron los diglicéridos en ambas configuraciones. En la Figura 39 se muestran los espectros de masas del hexadecanoato de 3- hexadecanoiloxi-2-hidroxipropilo [P2 (1,3)] y del hexadecanoato de 2- hexadecanoiloxi-3-hidroxipropilo [P2 (1,2)], como éteres de TMSi. Ambos compuestos tienen el mismo peso molecular y en los dos casos el ión molecular es indetectable, aunque fácilmente reconocible por los fragmentos a m/z 625 [M-15]+, pérdida de un grupo metilo y a m/z 550 [M-90]+, pérdida de la molécula de TMSiéter. Otros fragmentos característicos de ambos diglicéridos son de m/z 145 y 129, que contienen el grupo TMSi y parte del esqueleto de la molécula de glicerol, y de m/z 385 resultante de la pérdida de [M-RCOO]+ perteneciente al residuo aciloxi. Si bien, la mayor diferencia en los espectros de estos dos compuestos es la aparición del pico base a m/z 371 correspondiente a [M-RCOOCH2]+ en el primer caso (Figura 39a), siendo el pico base a m/z 313 [RCO+74]+en el segundo caso (Figura 39b). Figura 38. Espectro de masas del hexadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo silanizado. 100 200 300 400 m/z 57 129 147 175 203 239 355 371 401 429 459 [M+ ]= 474 83 73 313 O O OTMSi TMSiO 100% 4. Resultados y discusión 64 625 83 371 57 73 100 200 300 400 500 600 m/ z 129 285 313 343 423 451 507 550 399 385 100% (a) OTMSi O O O O Figura 39. Espectros de masas del hexadecanoato de 3-hexadecanoiloxi-2-hidroxi- propilo silanizado (a) y del hexadecanoato de 2-hexadecanoiloxi-3-hidroxipropilo silanizado (b). O O TMSiO O 100 200 300 400 500 600 m/z 129 285 313 341 385 625 73 145 329 100% (b) O [M+]= 640 [M+]= 640 4. Resultados y discusión 65 4.2.1.18. Triglicéridos Los espectros de masas de los triglicéridos se caracterizan por los fragmentos [M-RCOOCH2]+, [RCO+74]+, [RCO+128]+, entre otros (Lauer et al., 1970). El espectro de masas de la 1,2-dioleoilpalmitina (O2P) se muestra en la Figura 40. El ión molecular es de m/z 858, superior al rango de detección del espectrómetro de masas, por lo que no se pudo detectar. Esto no supuso un inconveniente a la hora de identificar el compuesto debido a la presencia de otros fragmentos característicos. El pico base es de m/z 577, correspondiente a la pérdida de la molécula oleoil (equivalente a 281 uma), [M-RCOOCH2]+, mientras que la pérdida de la molécula de palmitoil (equivalente a 255 uma) da lugar al fragmento a m/z 603. Otros fragmentos a m/z 339 y 313 corresponden a [RCO+74]+ y los fragmentos a m/z 393 y 367 corresponden a [RCO+128]+. 4.2.1.19. Ésteres del ácido ferúlico Las series de ésteres del ácido ferúlico identificadas en este estudio están formadas por la unión del ácido ferúlico con una serie de n-alcoholes grasos de cadena larga y una serie de ω−hidroxiácidos. Figura 40. Espectro de masas de la 1,2-dioleoilpalmitina. 100 200 300 400 500 600 m/z 100% 55 81 135 313339 393 449 481 506 534 577 603 265 [M]+= 858 367 O OO O O O 4. Resultados y discusión 66 Ésteres del ácido ferúlico con n-alcoholes. Los espectros de masas de los ésteres del ácido ferúlico con n-alcoholes de cadena larga se caracterizan por presentar los iones moleculares, que son a la vez el pico base del espectro. En los espectros aparecen también fragmentos abundantes a m/z 137, 150, 177 y 194, provenientes de la molécula de ácido ferúlico. El ión a m/z 194 corresponde al ácido ferúlico mientras que el ión a m/z 177 deriva de la molécula de ferulato por una simple rotura homolítica del enlace éster de ferulato. Espectros de masas similares han sido descritos por otros autores (Baldé et al., 1991; Chang et al., 2001; Correia et al., 2003). Un ejemplo representativo del espectro de masas de estos compuestos es el de ferulato de hexacosilo (Figura 41a). Dicho espectro de masas se caracteriza por un abundante ión molecular a m/z 558, que es el pico base. La identidad de esta serie de compuestos se confirmó también por la formación de los derivados metilados y silanizados. La formación de los derivados metilados de los ferulatos de n-alquilo introduce un grupo metilo en el alcohol fenólico. La fragmentación de masas de los derivados metilados muestra espectros de masas similares a los de los ferulatos sin derivatizar con la adición de 14 uma (Figura 41b). Los espectros de masas se caracterizan por un ión molecular intenso, y fragmentos a m/z 151, 191 y 208, procedentes de la molécula de ácido ferúlico metilado. Los iones a m/z 208 y 191, siendo éste último el pico base, procedentes del ácido ferúlico metilado y del fragmento feruloil, respectivamente, son los análogos correspondientes a los fragmentos a m/z 194 y 177 en los compuestos sin derivatizar. El espectro de masas de los derivados silanizados (Figura 41c) confirma las asignaciones de los compuestos llevadas a cabo por MS de la fracción sin derivatizar y metilada. Los iones moleculares son el pico base del espectro de masas, al igual que ocurre en los compuestos sin derivatizar. El grupo TMSi no se pierde de los grupos fenólicos fácilmente, por tanto, los fragmentos de los iones del ácido ferúlico aumentan a masas mayores por la adición de 72 uma. Por ello, el fragmento a m/z 249, que corresponde a feruloil silanizado, es el análogo correspondiente al ión a m/z 177 de los ferulatos de n-alquilo sin derivatizar. El ión correspondiente de ácido ferúlico silanizado es evidente también a m/z 266. La intensidad del ión a m/z 236 se relaciona con la eliminación de etano del ácido ferúlico silanizado para dar un puente éter dimetilsililo (Evershed et al., 1988). Un espectro de masas similar ha sido publicado por Freire et al. (2002) para el ferulato de docosilo silanizado, identificado en la madera de eucalipto, aunque dichos autores muestran el ión a m/z 249 como el pico base, mientras que en el presente estudio el ión molecular es el pico base. 4. Resultados y discusión 67 Figura 41. Espectros de masas del ferulato de hexacosilo; sin derivatizar (a), metilado (b) y silanizado (c). 100 200 300 400 500 600 m/z 137 194 558 1 77 1 50 (a) OH OCH3 CH=CH-COO-(CH2)25-CH 3 100% OCH3 OCH3 CH=CH-COO-(CH 2)25-CH 3 103 100 191 (b) 200 300 400 500 600 m/z 55 151 57 2 208 164 100% 192 200 300 400 500 m/z 57 145 179 219 249 630 236 209 266 (c) OTMSi OCH3 CH=CH-COO-(CH2)25-CH 3 100% 100 600 4. Resultados y discusión 68 Ésteres del ácido ferúlico con ω-hidroxiácidos. El espectro de masas de un miembro representativo de esta serie, el ácido feruloiloxihexacosanoico, se muestra en la Figura 42a. Los iones moleculares no se detectaron en el espectro de masas, sin embargo se determinaron con facilidad por los iones [M - 18]+, [M - 46]+ y [M - 62]+, los cuales corresponden a pérdidas de agua y del grupo carboxílico. El perfil de fragmentación del espectro de masas de estos compuestos muestra fragmentos característicos a m/z 145, 177, 191, 194 y 203 similares a los que se encontraron en el espectro de masas de los ferulatos de n-alquilo, y provenientes de la molécula de ácido ferúlico. El ión a m/z 194 corresponde a la molécula de ácido ferúlico mientras que el ión a m/z 177 deriva de la molécula de ferulato por rotura del enlace éster. Figura 42. Espectros de masas del ácido feruloiloxihexacosanoico; sin derivatizar (a) y metilado (b). (a) OH OCH3 CH=CH-COO-(CH2)25-COOH 100 200 300 400 500 600 m/z 55 83 145 177 526 570 191 194 203 137 542 552 [M+]= 588 100% 100 200 300 400 500 600 m/z 55 151 191 616 164 208 (b) OCH3 OCH3 CH=CH-COO-(CH2)25-COOCH3 100% 4. Resultados y discusión 69 Los grupos fenólicos y carboxílicos se confirmaron obteniendo los derivados metilados. Al metilar se introducen dos grupos metilo en la molécula. El espectro de masas del ácido feruloiloxihexacosanoico metilado, se muestra en la Figura 42b. El espectro de masas se caracteriza por los fragmentos a m/z 191 (pico base) y a m/z 151, 164, 208, procedentes de la molécula de ácido ferúlico metilada. El espectro de masas es similar al de los ferulatos de n-alquilo metilados. 4.2.1.20. Ésteres del ácido trans-p-cumárico Las series de ésteres del ácido trans-p-cumárico se identificaron únicamente en las fibras de abacá. Estos ésteres están formados por la unión del ácido trans-p- cumárico con n-alcoholes y ω-hidroxiácidos de cadena larga. Ésteres del ácido trans-p-cumárico con n-alcoholes. El espectro de masas de un miembro representativo de esta serie, el tetracosanil p-cumarato, se muestra en la Figura 43a. Los espectros de masas de los p-cumaratos de n-alquilo son similares a los de los ferulatos de n-alquilo. Se caracterizan por los iones moleculares (a m/z 500, en este compuesto), y fragmentos a m/z 107, 120, 147, 164, 166 (procedentes de la molécula ácida de p-cumárico). El ión a m/z 164 es el pico base y corresponde al ácido p-cumárico, mientras el ión a m/z 147 deriva de la molécula de p-cumarato por simple rotura homolítica del enlace éster. La identidad de estos compuestos se confirmó también por la formación de los derivados metilados y silanizados. Los derivados metilados de los p-cumaratos de n-alquilo introducen un grupo metilo en el alcohol fenólico. La fragmentación de masas de los derivados metilados muestra espectros de masas similares a los de los p-cumaratos sin derivatizar con la adición de 14 uma (Figura 43b). Los espectros de masas se caracterizan por el ión molecular y fragmentos a m/z 121, 134, 161, 178 y 180, siendo este último el pico base, procedente de la molécula del ácido pcumárico metilado. Los iones a m/z 178 y 161 corresponden al ácido p-cumárico metilado y al fragmento p-cumaroil, respectivamente, ya vistos a m/z 164 y 147 en los compuestos sin derivatizar. Los espectros de masas de los derivados silanizados (Figura 43c) se caracterizan por un ión molecular intenso (no es el pico base, al contrario que en los homólogos del ácido ferúlico). Al igual que los derivados silanizados del ácido ferúlico, el grupo TMSi no se pierde de los grupos fenólicos fácilmente, por tanto, los fragmentos de los iones del ácido p-cumárico aumentan a masas mayores por la adición de 72 uma, dando lugar a los fragmentos a m/z 179, 192, 219, 236 y 238. 4. Resultados y discusión 70 Figura 43. Espectros de masas del p-cumarato de tetracosilo; sin derivatizar (a), metilado (b) y silanizado (c). 100% (a) 100 200 300 400 500 600 m/z 57 82 107 164 500 147 120 OH CH=CH-COO- ( CH2 ) 23-CH3 100 200 300 400 500 600 m/z 55 83 121 180 514 134 161 (b) OCH3 CH=CH-COO-(CH2)23-CH3 100% 100 200 300 400 500 600 m/z 179 238 572 73 192 219 (c) OTMSi CH=CH-COO-(CH2)23-CH3 100% 4. Resultados y discusión 77 Compuestos Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá C42 4,87 1,95 0,21 0,06 0,15 - C43 - - - 0,02 - - C44 39,24 4,23 1,71 0,27 0,57 - C45 0,83 0,12 - 0,11 - - C46 78,11 4,47 8,12 1,44 0,72 - C47 0,90 0,09 - 0,31 - - C48 29,94 3,25 16,97 3,13 0,19 - C49 - 0,13 - 0,34 - - C50 8,15 3,66 1,90 3,01 0,16 - C51 - 0,14 - 0,18 - - C52 3,70 2,61 0,40 2,44 - - C53 - - - 0,16 - - C54 1,27 0,59 - 2,65 - - C55 - - - 0,16 - - C56 - - - 2,70 - - C58 - - - 1,06 - - Ésteres de esteroles y triterpenoles 1,94 26,53 0,63 - 0,21 1,75 ésteres de campesterol - - - - - 0,06 ésteres de estigmasterol - - - - - 0,06 ésteres de sitosterol 0,08 0,05 0,09 - 0,21 0,59 ésteres de cicloartenol - - - - - 0,13 ésteres de 24-metiléncicloartanol - - - - - 0,91 ésteres de taraxerol 0,80 - - - - ésteres de lupeol - 2,64 - - - - ésteres de β-amirina 1,82 18,47 0,16 - - - ésteres de α-amirina 0,04 4,57 0,02 - - - ésteres de glutinol - - 0,36 - - - Monoglicéridos - - - 0,82 2,99 3,05 tetradecanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,03 - 0,04 pentadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,01 - - hexadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,26 0,08 0,23 9-octadecenoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,19 0,05 0,56 octadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,19 0,04 0,22 hexacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - 0,65 0,80 heptacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - - 0,21 octacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - 1,59 0,88 nonacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - 0,11 0,05 triacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,05 0,46 0,06 hentriacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - - - dotriacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,06 - - tritriacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - - - - tetratriacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo - - - 0,02 - - Diglicéridos - - - 1,37 0,28 1,70 P2 (1,2) - - - 0,06 - 0,07 P2 (1,3) - - - 0,37 0,12 0,15 (Cont.) 4. Resultados y discusión 78 Compuestos Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá PSt (1,2) - - - 0,12 - 0,17 PSt (1,3) - - - 0,36 0,09 0,27 OO(1,2) - - - 0,05 - 0,33 St2 (1,2) - - - 0,14 - 0,45 St2 (1,3) - - - 0,26 0,08 0,25 Triglicéridos - - - - - 3,42 P2O - - - - - 0,48 O2P - - - - - 1,90 O3 - - - - - 1,04 Ferulatos de nalquilo - - - - 9,15 2,14 ferulato de eicosilo - - - - <0,01 0,02 ferulato de heneicosilo - - - - 0,07 0,02 ferulato de docosilo - - - - 0,39 0,85 ferulato de tricosilo - - - - 0,15 0,16 ferulato de tetracosilo - - - - 0,91 0,93 ferulato de pentacosilo - - - - 0,20 0,06 ferulato de hexacosilo - - - - 3,11 0,08 ferulato de heptacosilo - - - - 0,11 0,01 ferulato de octacosilo - - - - 4,17 0,01 ferulato de nonacosilo - - - - <0,01 - ferulato de triacontilo - - - - 0,05 - ω-Carboxialquilferulatos - - - - 0,25 0,25 ácido feruloiloxidocosanoico - - - - <0,01 <0,01 ácido feruloiloxitricosanoico - - - - - - ácido feruloiloxitetracosanoico - - - - 0,04 0,05 ácido feruloiloxipentacosanoico - - - - - 0,01 ácido feruloiloxihexacosanoico - - - - 0,10 0,10 ácido feruloiloxiheptacosanoico - - - - - 0,02 ácido feruloiloxioctacosanoico - - - - 0,11 0,07 ácido feruloiloxinonacosanoico - - - - - - ácido feruloiloxitriacontanoico - - - - <0,01 - Cumaratos de n-alquilo - - - - - 0,21 cumarato de docosilo - - - - - 0,06 cumarato de tetracosilo - - - - - 0,14 ω-Carboxialquilcumaratos - - - - - 0,03 ácido cumaroiltetracosanoico - - - - - 0,01 ácido cumaroilhexacosanoico - - - - - 0,01 ácido cumaroiloctacosanoico - - - - - 0,01 - No detectados; P: ácido palmítico; O: ácido oléico y St: ácido esteárico. 4. Resultados y discusión 79 Las fibras de lino se diferencian de las demás fibras por la gran abundancia de ceras y n-aldehídos, las de cáñamo por la gran cantidad de triterpenos de tipo β- y αamirinas, el kenaf por la presencia de los triterpenoles motiol y glutinol, el yute por la presencia de dos compuestos con estructura epoxidammarano y de las cetonas triterpenoidales isomultiflorenona y baurenona. Por otro lado, la presencia de ferulatos de n-alcoholes grasos y de ω-hidroxiácidos en las fibras de sisal y abacá y de una serie de p-cumaratos de n-alcoholes grasos y de ω-hidroxiácidos en el abacá distingue a estas fibras de las demás. Por otra parte, la caracterización estructural detallada de las ceras de alto peso molecular, realizada según sus espectros de masas tal como se explicó en el apartado 4.2.1.13., se muestra en la Tabla 6. Tabla 6. Composición de los ésteres individuales de las diferentes ceras (mg/100 g) identificadas en las fibras. Ceras Ácido graso: alcohol graso Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá C40 0,70 0,10 - 0,02 0,03 - tetradecanoato de hexacosilo C14:C26 - - - - 0,01 - hexadecanoato de tetracosilo C16:C24 0,26 0,02 - 0,01 0,02 - octadecanoato de docosilo C18:C22 0,07 0,02 - 0,01 - - eicosanoato de eicosilo C20:C20 0,24 0,06 - - - - docosanoato de octadecilo C22:C18 0,13 - - - - - C42 4,87 1,95 0,21 0,06 0,15 - tetradecanoato de octacosilo C14:C28 - - - - 0,02 - hexadecanoato de hexacosilo C16:C26 3,37 0,11 0,18 0,04 0,12 - octadecanoato de tetracosilo C18:C24 0,34 0,04 - 0,01 0,01 - eicosanoato de docosilo C20:C22 0,42 1,44 0,01 0,02 <0,01 - docosanoato de eicosilo C22:C20 0,59 0,33 0,01 - - - tetracosanoato de octadecilo C24:C18 0,13 0,03 0,01 - - - hexacosanoato de hexadecilo C26:C16 0,02 - - - - - C43 - - - 0,02 - - pentadecanoato de octacosilo C15:C28 - - - 0,02 - - C44 39,24 4,23 1,71 0,27 0,57 - tetradecanoato de triacontilo C14:C30 - - - 0,05 0,01 - hexadecanoato de octacosilo C16:C28 30,10 0,28 1,31 0,15 0,48 - octadecanoato de hexacosilo C18:C26 6,82 0,09 0,31 0,02 0,07 - eicosanoato de tetracosilo C20:C24 0,67 0,98 0,05 0,01 0,01 - docosanoato de docosilo C22:C22 1,14 2,40 0,04 0,03 0,01 - (Cont.) 4. Resultados y discusión 80 Ceras Ácido graso: alcohol graso Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá tetracosanoato de eicosilo C24:C20 0,35 0,45 - 0,01 - - hexacosanoato de octadecilo C26:C18 0,03 0,03 <0,01 <0,01 - - octacosanoato de hexadecilo C28:C16 0,06 - - 0,01 - - triacontanoato de tetradecilo C30:C14 0,07 - - - - - C45 0,83 0,12 - 0,11 - - tetradecanoato de hentriacontilo C14:C31 - - - 0,01 - - pentadecanoato de triacontilo C15:C30 - - - 0,08 - - hexadecanoato de nonacosilo C16:C29 0,32 0,01 - 0,02 - - octadecanoato de heptacosilo C18:C27 0,33 - - - - - eicosanoato de pentacosilo C20:C25 0,05 0,05 - - - - docosanoato de tricosilo C22:C23 0,10 0,03 - - - - tetracosanoato de heneicosilo C24:C21 0,03 0,03 - - - - C46 78,11 4,47 8,12 1,44 0,72 - tetradecanoato de dotriacontilo C14:C32 - - - 0,17 0,01 - hexadecanoato de triacontilo C16:C30 15,80 0,54 0,81 1,08 0,08 - octadecanoato de octacosilo C18:C28 55,10 0,24 3,14 0,05 0,59 - eicosanoato de hexacosilo C20:C26 4,69 1,75 3,96 0,02 0,03 - docosanoato de tetracosilo C22:C24 1,17 1,50 0,12 0,02 0,01 - tetracosanoato de docosilo C24:C22 0,96 0,28 0,04 0,04 0,01 - hexacosanoato de eicosilo C26:C20 0,08 0,14 0,01 0,01 <0,01 - octacosanoato de octadecilo C28:C18 0,15 0,02 0,03 0,01 - - triacontanoato de hexadecilo C30:C16 0,16 <0,01 0,01 0,05 - - C47 0,90 0,09 - 0,31 - - tetradecanoato de tritriacontilo C14:C33 - - - 0,01 - - pentadecanoato de dotriacontilo C15:C32 - - - 0,18 - - hexadecanoato de hentriacontilo C16:C31 0,12 0,01 - 0,08 - - heptadecanoato de triacontilo C17:C30 - - - 0,03 - - octadecanoato de nonacosilo C18:C29 0,48 - - 0,01 - - eicosaoato de heptacosilo C20:C27 0,16 0,03 - - - - docosanoato de pentacosilo C22:C25 0,14 0,05 - - - - tetracosanoato de tricosilo C24:C23 - <0,01 - - - - C48 29,94 3,25 16,97 3,13 0,19 - tetradecanoato de tetratriacontilo C14:C34 - - - 0,15 - - hexadecanoato de dotriacontilo C16:C32 0,63 0,11 0,32 2,47 <0,01 - octadecanoato de triacontilo C18:C30 16,60 0,13 1,18 0,35 0,10 - eicosanoato de octacosilo C20:C28 7,13 1,18 14,57 0,07 0,04 - docosanoato de hexacosilo C22:C26 4,59 0,87 0,75 0,02 0,03 - tetracosanoato de tetracosilo C24:C24 0,58 0,49 0,08 0,02 0,01 - hexacosanoato de docosilo C26:C22 0,16 0,39 0,01 0,03 <0,01 - octacosanoato de eicosilo C28:C20 0,17 0,06 <0,01 0,01 - - triacontanoato de octadecilo C30:C18 0,08 0,01 0,06 0,02 - - (Cont.) 4. Resultados y discusión 81 Ceras Ácido graso: alcohol graso Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá C49 - 0,13 - 0,34 - - tetradecanoato de pentatriacontilo C14:C35 - - - 0,01 - - pentadecanoato de tetratriacontilo C15:C34 - - - 0,15 - - hexadecanoato de tritriacontilo C16:C33 - <0,01 - 0,11 - - heptadecanoato de dotriacontilo C17:C32 - - - 0,06 - - octadecanoato de hentriacontilo C18:C31 - - - 0,01 - - eicosanoato de nonacosilo C20:C29 - 0,13 - - - - docosanoato de heptacosilo C22:C27 - <0,01 - - - - C50 8,15 3,66 1,90 3,01 0,16 - tetradecanoato de hexatriacontilo C14:C36 - - - 0,03 - - hexadecanoato de tetratriacontilo C16:C34 - 0,05 0,01 1,87 <0,01 - octadecanoato de dotriacontilo C18:C32 0,41 0,06 0,02 0,57 - - eicosanoato de tritriacontilo C20:C30 1,85 1,27 1,73 0,35 - - docosanoato de octacosilo C22:C28 4,12 1,36 0,12 0,11 0,03 - tetracosanoato de hexacosilo C24:C26 1,54 0,53 0,02 0,05 0,11 - hexacosanoato de tetracosilo C26:C24 0,07 0,09 - 0,01 0,01 - octacosanoato de docosilo C28:C22 0,11 0,20 - 0,02 - - tricontanoato de eicosilo C30:C20 0,05 0,08 - 0,01 - - C51 - 0,14 - 0,18 - - pentadecanoato de hexacontilo C15:C36 - - - 0,02 - - hexadecanoato de pentacontilo C16:C35 - - - 0,02 - - heptadecanoato de tetratriacontilo C17:C34 - - - 0,05 - - octadecanoato de tritriacontilo C18:C33 - - - 0,02 - - nonadecanoato de dotriacontilo C19:C32 - - - 0,02 - - eicosanoato de hentriacontilo C20:C31 - 0,04 - 0,02 - - heneicosanoato de triacontilo C21:C30 - - - 0,05 - - docosanoato de nonacosilo C22:C29 - 0,09 - - - - tetracosanoato de heptacosilo C24:C27 - 0,02 - - - - C52 3,70 2,61 0,40 2,44 - - tetradecanoato de octatriacontilo C14:C38 - - - 0,04 - - hexadecanoato de hexatriacontilo C16:C36 - 0,05 <0,01 0,19 - - octadecanoato de tetratriacontilo C18:C34 - 0,03 - 0,42 - - eicosanoato de dotriacontilo C20:C32 0,20 0,33 0,31 0,90 - - docosanoato de triacontilo C22:C30 1,02 1,17 0,03 0,74 - - tetracosanoato de octacosilo C24:C28 2,05 0,71 0,04 0,08 - - hexacosanoato de hexacosilo C26:C26 0,34 0,05 0,02 0,03 - - octacosanoato de tetracosilo C28:C24 0,04 0,03 - 0,02 - - tritriacontanoato de docosilo C30:C22 0,05 0,24 - 0,02 - - C53 - - - 0,16 - - pentadecanoato de octatriacontilo C15:C38 - - - 0,01 - - heptadecanoato de heptatriacontilo C17:C37 - - - <0,01 - - heneicosanoato de dotriacontilo C21:C32 - - - 0,10 - - tricosanoato de tritriacontilo C23:C30 - - - 0,05 - - (Cont.) 4. Resultados y discusión 82 Ceras Ácido graso: alcohol graso Lino Cáñamo Kenaf Yute Sisal Abacá C54 1,27 0,59 - 2,65 - - tetradecanoato de tetracontilo C14:C40 - - - 0,03 - - hexadecanoato de octatriacontilo C16:C38 - 0,01 - 0,07 - - octadecanoato de hexatriacontilo C18:C36 - <0,01 - 0,04 - - eicosanoato de tetratriacontilo C20:C34 - 0,03 - 0,46 - - docosanoato de dotriacontilo C22:C32 0,16 0,14 - 1,38 - - tetracosanoato de triacontilo C24:C30 1,11 0,30 - 0,59 - - hexacosanoato de octacosilo C26:C28 - 0,08 - 0,06 - - octacosanoato de hexacosilo C28:C26 - 0,01 - 0,01 - - triacontanoato de tetracosilo C30:C24 - 0,01 - 0,01 - - C55 - - - 0,16 - - heneicosanoato de tetratriacontilo C21:C34 - - - 0,04 - - tricosanoato de dotriacontilo C23:C32 - - - 0,08 - - pentacosanoato de triacontilo C25:C30 - - - 0,04 - - C56 - - - 2,70 - - tetradecanoato de dotetracontilo C14:C42 - - - 0,01 - - hexadecanoato de tetracontilo C16:C40 - - - 0,05 - - octadecanoato de octatriacontilo C18:C38 - - - 0,01 - - eicosanoato de hexatriacontilo C20:C36 - - - 0,08 - - docosanoato de tetratriacontilo C22:C34 - - - 0,59 - - tetracosanoato de dotriacontilo C24:C32 - - - 1,56 - - hexacosanoato de triacontilo C26:C30 - - - 0,35 - - octacosanoato de octacosilo C28:C28 - - - 0,04 - - triacontanoato de hexacosilo C30.C26 - - - 0,01 - - C58 - - - 1,06 - - tetracosanoato de tetratriacontilo C24:C34 - - - 0,39 - - hexacosanoato de dotriacontilo C26:C32 - - - 0,68 - - - No detectados. Debido a la complejidad y a la importancia de la composición lipídica de las fibras, a continuación se muestra el análisis detallado de cada fibra por separado. 4.2.2.1. Fibras de lino El extracto lipídico de las fibras del lino es del 0,7% (Tabla 2). El cromatograma del extracto lipídico, sin derivatizar, se muestra en la Figura 47. La composición detallada de los compuestos identificados se muestra en la Tabla 5. Los lípidos predominantes en las fibras de lino son las ceras (47%). Además, se identificaron cantidades significativas de n-aldehídos (17%), n-ácidos grasos (12%), n-alcanos (10%) y n-alcoholes de cadena larga (9%). También se 4. Resultados y discusión 83 identificaron cantidades menores de esteroles y triterpenos. La distribución de las diferentes series alifáticas se muestra en la Figura 48. Las ceras se encontraron en el rango de C40 a C54 con un fuerte predominio de los homólogos de cadena par sobre los de cadena impar, siendo las más abundantes las ceras C44, C46 y C48. La caracterización estructural detallada de las ceras se muestra en la Tabla 6. La distribución de los ácidos grasos y alcoholes esterificados se muestra en la Figura 48. Los ácidos grasos esterificados se encontraron en el rango de C16 a C30 y los alcoholes esterificados de C16 a C32. La parte ácida de las ceras está formada exclusivamente por ácidos grasos saturados con números de átomos de carbono pares. Los ácidos esterificados más abundantes son los ácidos octadecanoico (C18) y hexadecanoico (C16) seguidos por los ácidos eicosanoico (C20) y docosanoico (C22) y entre las moléculas de alcoholes, los más abundantes son el octacosanol (C28) seguido por el triacontanol (C30) y el hexacosanol (C26). La cera predominante es la C46, constituida principalmente por el ácido octadecanoico (C18) esterificado con el octacosanol (C28), seguido por la cera C44, formada principalmente por el ácido hexadecanoico (C16) esterificado con octacosanol (C28), y la cera C48, constituida principalmente por el ácido octadecanoico (C18) esterificado con triacontanol (C30). Figura 47. Cromatograma del extracto lipídico sin derivatizar de las fibras de lino. Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, Ah(n): serie de n-alcoholes, Ad(n): serie de n-aldehídos y C(n): serie de n-ceras; n: número de átomos de carbono. Tiempo de retención (min) C46 C44 C48 C50 C52 C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18 Al27 Ad26 Ah28 Ad30 Ac22 Al25 Ac18:1 + Ac18:2 Ad28 Al29 + Ah26 51015202530 C46 C44 C48 C50 C52 C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18 Al27 Ad26 Ah28 Ad30 Ac22 Al25 Ac18:1 + Ac18:2 Ad28 Al29 + Ah26 51015202530 51015202530 4. Resultados y discusión 84 Figura 48. Distribución de las principales series alifáticas identificadas en el extracto lipídico de las fibras de lino. Los histogramas están escalados al compuesto de mayor abundancia en cada serie. 21 23 25 27 29 31 nº átomos C A bundancia relativa 100% n-Alcanos 22 24 26 28 30 32 nº átomos C Abundancia relativa 100% n-Aldehídos 14 18:2 18:1 18 1 6 :1 16 20 22 24 26 28 30 32 nº átomos C Abundancia relativa 100% n-Ácidos grasos libres 100% 16 18 20 22 24 26 28 30 32 nº átomos C Abundancia relativa n-Alcoholes libres n-Ácidos grasos esterificados nº átomos C Abundancia relativa 100% 16 18 20 22 24 26 28 30 28 16 18 20 22 24 26 30 32 nº átomos C Abundancia relativa 100% n- A lcoholes esterificados 4. Resultados y discusión 85 Se identificaron también ácidos grasos libres en el rango de C14 a C32, con un fuerte predominio de los homólogos con número par de átomos de carbono. La serie está dominada por los homólogos saturados aunque también se identificaron los insaturados C18:1 (oleico), C18:2 (linoleico) y C16:1 (palmitoleico). El ácido hexadecanoico (ácido palmítico) es el más abundante, al igual que en los estudios realizados por Morrison et al. (2001) sobre los extractos de las fibras de diversas variedades de lino. Es interesante destacar que aunque los ácidos grasos insaturados están presentes en forma libre en las fibras del lino, no se encontraron esterificados formando parte de las ceras. La serie de n-alcanos se identificó en el rango de C21 a C31, con un fuerte predominio de los homólogos con número impar de átomos de carbono, siendo el nonacosano (C29) el más abundante. Los n-alcanos con número par de átomos de carbono también se identificaron aunque en cantidades menores. Los n-alcoholes alifáticos se identificaron en el rango de C16 a C32, con un fuerte predominio de los homólogos de cadena par sobre los de cadena impar, siendo el octacosanol (C28) el más abundante, al igual que en el trabajo publicado por Morrison et al. (2001). La distribución de la serie de alcoholes alifáticos libres es parecida a la distribución de la serie de alcoholes esterificados como se muestra en la Figura 48. Sin embargo, los alcoholes alifáticos de número impar de átomos de carbono se encontraron esterificados con ácidos grasos de cadena larga pero no se encontraron libres. La serie de n-aldehídos se identificó en el rango de C21 a C32, con un fuerte predominio de los homólogos con número par de átomos de carbono, siendo el mayoritario el octacosanal (C28). La distribución de la serie de aldehídos es similar a la de los alcoholes libres, como se observa en otras plantas, sugiriendo que los aldehídos son intermediarios en la biosíntesis de alcoholes a partir de los ácidos grasos (Tulloch, 1976; Bianchi, 1995). Entre los esteroles identificados, predomina el sitosterol. También se encontraron cantidades menores de otros esteroles libres como campesterol, estigmastanol y estigmasterol. Los triterpenoles β- y α-amirinas, están también presentes en forma libre. Tanto el sitosterol como la β-amirina se encontraron también esterificados, aunque en baja proporción. Por otro lado, en las fibras de lino se identificaron cantidades menores de glicósidos de esteroles, tales como campesteril, estigmasteril y sitosteril 3β-D-glucopiranósidos, siendo este último el más abundante. La identificación de los glicósidos esteroidales se realizó después de derivatizar el extracto lipídico con BSTFA por comparación con el espectro de masas y los tiempos de retención relativos de estándares (Gutiérrez y del Río, 2001). Por otra parte, se identificaron varios hidrocarburos esteroidales (como estigmasta-3,5-dieno y estigmasta-3,5,7-trieno) y cetonas esteroidales y triterpenoidales (como estigmast-4-en-3-ona, estigmastan-3-ona, estigmasta-7,22-dien- 3-ona y β- y αamirenonas). Finalmente, en las fibras de lino se identificaron una serie de α-hidroxiácidos 4. Resultados y discusión 86 desde el ácido 2-hidroxihexadecanoico (C16) hasta el ácido 2-hidroxihexacosanoico (C26), siendo el mayoritario el ácido 2-hidroxihexadecanoico (C16). 4.2.2.2. Fibras de cáñamo El extracto lipídico de las fibras de cáñamo es del 0,5% (Tabla 2). En la Figura 49 se muestra el cromatograma del extracto lípidico sin derivatizar. La composición detallada de los compuestos identificados se muestra en la Tabla 5. Los lípidos predominantes en las fibras de cáñamo son n-alcanos (29%), esteroles y triterpenoles (18%), ésteres de esteroles y triterpenoles (14%), seguidos de n-ácidos grasos (12%) y ceras (12%). También se identificaron cantidades significativas de otros compuestos como cetonas esteroidales y triterpenoidales, n-aldehídos, n-alcoholes de cadena larga, hidrocarburos esteroidales y glicósidos esteroidales, entre otros. La distribución de las principales series alifáticas se muestra en la Figura 50. Tiempo de retención (min) Figura 49. Cromatograma del extracto lipídico sin derivatizar de las fibras de cáñamo. Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, Ah(n): serie de n-alcoholes y C(n): serie de n-ceras; n: número de átomos de carbono; 7: sitosterol, 8: β-amirina y 14: acetato de β-amirina. 10 20 3025155 C42 C44 C48 C46 C50 C52C54 C40 Ac16 Ac18 Al29 Al27 Al28 Al31 Ah32 Ah30 Ah28 Ac20 Al25 Ac22 10 20 302515510 20 3025155 C42 C44 C48 C46 C50 C52C54 C40 Ac16 Ac18 Al29 Al27 Al28 Al31 Ah32 Ah30 Ah28 Ac20 Al25 Ac22 7 + 8 14 4. Resultados y discusión 93 sobre la composición de lípidos de las fibras de kenaf (Seca et al., 2000). Las amirinas (β- y α-) aparecen en forma libre, encontrándose la β-amirina también esterificada con ácidos grasos de cadena larga, aunque en baja proporción. Además de las amirinas, también se identificaron otros dos triterpenoles denominados motiol y glutinol. La presencia de estos triterpenoles ha sido descrita también por Seca et al. (2000) en las fibras de kenaf, confirmando la estructura del motiol por NMR. También está presente en el extracto una serie de compuestos de alto peso molecular con espectros de masas caracterizados por los fragmentos a m/z 259 y a m/z 274, similares a los de glutinol, identificándose tentativamente como ésteres de glutinol con ácidos grasos de cadena larga. Sin embargo, el lupeol, que se encontró previamente en cantidades relativamente importantes en el kenaf (Seca et al., 2000), no se detectó en este estudio. Por otra parte, se identificaron varios hidrocarburos esteroidales (tales como estigmasta-3,5-dieno y estigmasta- 3,5,7-trieno) y cetonas esteroidales y triterpenoidales (como estigmast-4-en-3-ona, estigmastan-3-ona, estigmasta-7,22-dien-3-ona, estigmasta-3,5-dien-7-ona, estigmastane-3,6-diona y β- y α-amirenonas). Por último, se identificaron también una serie de α-hidroxiácidos. Ésta es la primera vez que estos compuestos se describen en las fibras de kenaf. La serie de α-hidroxiácidos está formada por el ácido 2-hidroxihexadecanoico (C16) y por los ácidos comprendidos entre el ácido 2-hidroxidocosanoico (C22) y el ácido 2-hidroxihexacosanoico (C26), siendo el mayoritario el ácido 2-hidroxi- tetradecanoico (C24). 4.2.2.4. Fibras de yute El extracto lipídico de las fibras de yute es del 0,4% (Tabla 2). El cromatograma del extracto lípidico, sin derivatizar, se muestra en la Figura 54 y la composición detallada de los compuestos identificados se muestra en la Tabla 5. Los lípidos predominantes en el extracto de las fibras de yute son ceras (22%), n-ácidos grasos (16%), n-alcoholes (16%), esteroles y triterpenoles (13%), α-hidroxiácidos (13%) y n-alcanos (6%). En proporciones menores se encontraron ω-hidroxiácidos, cetonas triterpenoidales y esteroidales, hidrocarburos esteroidales, monoglicéridos y diglicéridos, glicósidos esteroidales, α-tocoferol y cantidades trazas de ésteres de esteroles. La distribución de las principales series alifáticas identificadas se muestra en la Figura 55. Debido a la complejidad del extracto, y para una caracterización más detallada de los compuestos lipídicos presentes en el yute, se llevó a cabo un fraccionamiento mediante SPE. Los cromatogramas de las diferentes fracciones de SPE se muestran en la Figura 56. 4. Resultados y discusión 94 Las ceras se encontraron en el rango de C40 a C58, con un fuerte predominio de los homólogos de cadena par sobre los de cadena impar, siendo las más abundantes los homólogos C48 y C50. La identificación y cuantificación de las ceras individuales en cada pico cromatográfico se basó en su espectro de masas tal como se describió en el apartado 4.2.1.13. La composición de las diferentes ceras identificadas en las fibras de yute se muestra en la Tabla 6. Es interesante destacar que en este caso aparecen ácidos grasos de número impar de átomos de carbono formando el éster en las ceras de átomos de carbono impar. De ellos el más abundante es el ácido pentadecanoico (C15), sobre todo en las ceras C47 y C49. El rango de los ácidos grasos esterificados varía de C14 a C30, con la presencia de los homólogos impares en pequeña cantidad, siendo el ácido palmítico el más abundante con una diferencia significativa. Por otra parte, no se detectaron ácidos grasos insaturados esterificados. La serie de n-alcoholes esterificados varía de C18 a C42. Los más abundantes son el dotriacontanol (C32), el tetratriacontanol (C34) y el triacontanol (C30). 510152025 C42 C46 C48C50 C52 C56 C54 C58 C44 Ah34 Ah32 Ah30 Ah28 Ah22 Ac16 Ac18:1 + Ac:18:2 Ac18 Ac22 Al29 4 57 17 510152025 C42 C46 C48C50 C52 C56 C54 C58 C44 Ah34 Ah32 Ah30 Ah28 Ah22 Ac16 Ac18:1 + Ac:18:2 Ac18 Ac22 Al29 4 57 17 Tiempo de retención (min) Figura 54. Cromatograma del extracto lipídico sin derivatizar de las fibras de yute. Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, Ah(n): serie de n-alcoholes y C(n): serie de n-ceras; n: número de átomos de carbono; 4: campesterol, 5: estigmasterol, 7: sitosterol y 17: epoxidammarano. 4. Resultados y discusión 95 Figura 55. Distribución de las principales series alifáticas identificadas en el extracto de las fibras de yute. Los histogramas están escalados al compuesto de mayor abundancia en cada serie. Ceras n- A lcanos 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 nº átomos C Abundancia relativa 100% nº átomos C 25 27 29 31 33 35 Abundancia relativa 100% n-Ácidos grasos libres nº átomos C Abundancia relativa 100% 14 18:2 18:1 18 16:1 16 20 22 24 26 28 30 32 34 36 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 n- A lcoholes libres nº átomos C Abundancia relativa 100% n- Á cidos g rasos esterificados 14 16 18 20 22 24 26 28 30 nº átomos C Abundancia relativa 100% nº átomos C Abundanci a relativa 100% 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 n- A lcoholes esterificados 4. Resultados y discusión 96 5 1015202530 (d) Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac 18:1 + Ac 18:2 (c) Ah34 Ah32 Ah30 Ah26 A, B 7 4 5 (b) (a) C42 C46 C48 C50 C52 C56 C54 C58 C44 Al29Al31 Al33 6 ** ** ** 5 1015202530 (d) Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac 18:1 + Ac 18:2 5 10152025305 10152025305 1015202530 (d) Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac 18:1 + Ac 18:2 (c) Ah34 Ah32 Ah30 Ah26 A, B 7 4 5 (c) Ah34 Ah32 Ah30 Ah26 A, B 7 4 5 (b) (a) C42 C46 C48 C50 C52 C56 C54 C58 C44 Al29Al31 Al33 6 ** ** ** (b) (a) C42 C46 C48 C50 C52 C56 C54 C58 C44 Al29Al31 Al33 (a) C42 C46 C48 C50 C52 C56 C54 C58 C44 Al29Al31 Al33 6 ** ** ** Tiempo de retención (min) Figura 56. Cromatogramas de las fracciones A (a), B (b), C (c) y D (d) de la SPE del extracto de yute. Al(n): serie de n-alcanos, Ah(n): n-serie de alcoholes y C(n): serie de n-ceras; n: número de átomos de carbono; 4: campesterol, 5: estigmasterol, 6: isomultiflorenona, 7: sitosterol, A y B: epoxidammaranos y **: contaminantes. 4. Resultados y discusión 97 La serie de n-ácidos grasos libres varía de C14 a C36, con un fuerte predominio de los homólogos con número par de átomos de carbono. Los más abundantes son el ácido palmítico (C16) y el ácido oleico (C18:1). La distribución y abundancia de los n-alcoholes libres identificados en el extracto lipídico de las fibras de yute se muestran en el histograma de la Figura 55. Los n-alcoholes alifáticos varían de C16 a C40, con la presencia de los homólogos pares únicamente. Los alcoholes alifáticos más abundantes son dotriacontanol (C32), tetratriacontanol (C34) y triacontanol (C30), al igual que en la serie de alcoholes esterificados. Por otro lado, la serie de n-alcanos varía de C27 a C35, con un fuerte predominio de los homólogos de cadena impar y máximos a tritriacontano (C33) y hentriacontano (C31). También se identificaron α- y ω-hidroxiácidos. En ambas series predominan los homólogos de cadena par, siendo los α-hidroxiácidos los más abundantes. Los más abundantes son el ácido 2-hidroxitetracosanoico (C24) para los α-hidroxiácidos y el ácido 22-hidroxidocosanoico (C22) para los ω-hidroxiácidos. Entre los esteroles se identificaron campesterol, estigmasterol, sitosterol, 7-oxocampesterol, 7-oxositosterol y, en cantidades trazas, estigmastanol. De ellos el más abundante es el sitosterol. El sitosterol, al igual que el campesterol y el estigmasterol, se encuentra también esterificado con ácidos grasos, aunque en proporciones muy bajas. También se identificaron glicósidos esteroidales aunque en proporciones bajas. Los glicósidos presentes incluyen campesteril, estigmasteril y sitosteril 3β-D-glucopiranósidos, siendo este último el mayoritario. Las cetonas triterpenoidales identificadas en las fibras de yute fueron isomultiflorenona (D:C-friedoolean-8-en-3-ona), bauerenona (D:C-friedours- 7-en-3-ona) y β- y α-amirenonas. La identificación de las amirenonas en el cromatograma del extracto total fue difícil al encontrarse en proporciones bajas y los picos cromatográficos solapados con otros compuestos. Sin embargo su identificación fue posible tras llevar a cabo un fraccionamiento por SPE. Las cetonas esteroidales y triterpenoidales se concentraron en la fracción A de SPE (Figura 56a). La isomultiflorenona destaca entre las cetonas al encontrarse en mayor proporción que las demás (teniendo en cuenta también las cetonas esteroidales). Las cetonas esteroidales se identificaron en proporciones menores, siendo las más abundantes la estigmasta-3,5-dien-7-ona, estigmast-4-en-3-ona y estigmastano-3,6-diona. También se encontraron hidrocarburos esteroidales, como el estigmasta-3,5,7-trieno y el estigmasta-3,5-dieno, entre otros. El análisis de la fracción C obtenida tras SPE permitió la identificación de monoglicéridos y diglicéridos. El rango de los monoglicéridos varía de C14 a C34, siendo los más abundantes el hexadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo (1-mono- palmitina, C16) y el 9-octadecenoato de 2,3-dihidroxipropilo (1-monooleína, C18:1). Los monoglicéridos se encuentran sustituidos en la posición 1. Por otra parte, los 4. Resultados y discusión 98 diglicéridos se identificaron en el rango de C16 a C18, y su abundancia es mayor que la de los monoglicéridos. Los diglicéridos se encuentran sustituidos en las posiciones 1,2 y 1,3, siendo estas últimas las más abundantes. El diglicérido más abundante es el hexadecanoato de 3-hexadecanoiloxi-2-hidroxipropilo [P2 (1,3)]. En ambas series se observa un predominio de los compuestos con número par de átomos de carbono. No se detectaron triglicéridos en el extracto de yute. Finalmente, en las fibras de yute se detectaron dos compuestos (A y B) que no estaban presentes en las otras fibras estudiadas. Estos compuestos se concentraron en la fracción C de SPE, lo que indica que son alcoholes. Sus espectros de masas se muestran en la Figura 57. Ambos espectros se caracterizan por el fragmento a m/z 143 (pico base), indicativo de la presencia de la cadena lateral hidroxiisopropilmetiltetrahidrofurano 100 200 300 400 500 600 m/z 59 107 143 173 227 283 365 427 552 601 627 125 191 383 401 442 100% 300 600 500100 200 400 m/z 59 107 143 177 227 285 323 367 411 525 582 648 385 349 125 427 444 191 100% (a) (b) Figura 57. Espectros de masas de los compuestos A (a) y B (b) identificados en las fibras de yute. 4. Resultados y discusión 99 (ver Figura 58), lo que implica que los compuestos son de tipo “ocotillona”, como el 20,24-epoxy-25-hidroxidammarano (Hasan et al., 1984; van der Doelen et al., 1998). Otros fragmentos característicos de estos compuestos son los de m/z 107, 125 y 191, diferenciándose en la presencia de los fragmentos a m/z 367 y 385 en el caso del compuesto A y m/z 365 y 383 en el caso del compuesto B, por lo que parece que el compuesto B tiene una insaturación más que el compuesto A. El ión molecular no se ha podido determinar a pesar de realizar diversas derivatizaciones, aunque es probable que los iones a m/z 444 y 442 correspondan a una pérdida de agua [M-18]+ por lo que los iones moleculares pudieran ser 462 y 460, respectivamente. Para confirmar los pesos moleculares e intentar determinar la estructura de estos compuestos se llevó a cabo su derivatización mediante silanización y acetilación. Los espectros de masas del compuesto A tanto silanizado como acetilado se muestran en la Figura 59. En el caso del derivado silanizado, el espectro presenta un pico base a m/z 215 que proviene del correspondiente fragmento a m/z 143, tras la adición de 72 uma, lo que indica que la silanización introduce al menos un grupo hidroxilo. Por otro lado, el espectro de masas del derivado acetilado no mostró grandes cambios, permaneciendo el fragmento a m/z 143 como pico base, lo que indica que el grupo hidroxiisopropilmetiltetrahidrofurano no se acetila. Sin embargo, el tiempo de retención del derivado acetilado aumenta, lo que puede ser indicativo de la presencia de al menos otro grupo hidroxilo en su estructura, aparte del de la cadena lateral. Por otra parte, no ha sido posible determinar con exactitud el peso molecular de estos compuestos y por tanto su estructura. O+ HO Figura 58. Estructura del fragmento a m/z 143. 4. Resultados y discusión 100 Estudios previos han mostrado la presencia de un glicósido denominado capsina en las hojas de yute, cuya hidrólisis da lugar a la capsugenina, un triterpenoide del tipo “ocotillona”, con el grupo funcional hidroxiisopropilmetiltetrahidrofurano en la cadena lateral (Hasan et al., 1984; Quader y Ahmed, 1987; Quader et al., 1990; van der Doelen et al., 1998). El espectro de masas de la capsugenina es muy similar al que presentan los compuestos A y B, con un pico base a m/z 143, y fragmentos a [M-18]+, [M-59]+, [M-77]+, diferenciándose sólo en los valores de los fragmentos. El espectro de masas de la capsugenina es m/z 474 [M-18]+ (2), 433 [M-59]+ (5), 415 [M-77]+ (16), 397(9), 207(4), 205(4), 191(8), 189(2),175(5), 143(100), 125(21), 121 (13), 107(12), 95(14), 93(12), 85(20) (Hasan et al., 1984). Por tanto, puede decirse que los compuestos detectados en las fibras de yute son parecidos a la capsugenina. Otro compuesto con estructura parecida es el denominado cabraleadiol, que también presenta un espectro de masas similar con pico base a m/z 143 y 349 100 200 300 400 500 600 m/z 73 131 175 215 269 323 367 391 457483 547 573 602 648 439 100% 100 200 300 400 500 600 m/z 107 143 175 227 269 367 436 497 550 613 638 349 100% (a) (b) Figura 59. Espectros de masas del compuesto A silanizado (a) y acetilado (b). 4. Resultados y discusión 101 fragmentos a [M-18]+, [M-59]+ y [M-77]+, ajustándose sobre todo al compuesto B, al estar presente también los fragmentos a m/z 427, 401, 383 y 125 (Nakamura et al., 1997), diferenciándose sólo por la ausencia del ión molecular a m/z 460, en el espectro. El espectro de masas de cabraleadiol m/z 460 [M]+ (2), 445 [M-18]+ (11), 427 [M-33]+ (15), 401 [M-59]+ (40), 383 [M-77]+ (85), 191(68), 143(100), 125(85) (Nakamura et al., 1997). El cabraleadiol ha sido identificado en varias plantas (Hisham et al., 1996, Nakamura et al., 1997, Rouxc et al., 1998, Qiu et al., 2001). En la Figura 60 se muestran las estructuras de la capsugenina y el cabraleadiol. Estudiando ambos perfiles de fragmentación podemos determinar que los compuestos A y B presentes en el yute son del tipo epoxidammarano con una cadena lateral hidroxiisopropilmetiltetrahidrofurano. 4.2.2.5. Fibras de sisal El extracto lipídico de las fibras de sisal es del 0,5% (Tabla 2). El cromatograma del extracto lipídico de las fibras, sin derivatizar, se muestra en la Figura 61. La composición detallada de los compuestos identificados se muestra en la Tabla 5. Las familias de compuestos más abundantes en estas fibras son n-ácidos grasos (20%), seguida de n-alcoholes de cadena larga (20%), esteroles (11%), n-alcanos (11%), ésteres del ácido ferúlico con n-alcoholes (10%) y ω-hidroxiácidos (10%). O CH 2 OH OH HO OH O HO OH (a) (b) O CH 2 OH OH HO OH O HO OH O CH 2 OH OH HO OH O CH 2 OH OH HO OH O HO OH O HO O HO OH (a) (b) Figura 60. Estructuras de la capsugenina (a) y el cabraleadiol (b). 4. Resultados y discusión 102 También se identificaron cantidades significativas de otros compuestos como hidrocarburos esteroidales, monoglicéridos, α-hidroxiácidos, n-aldehídos, ceras, glicósidos esteroidales, diglicéridos, ésteres del ácido ferúlico con ω-hidroxiácidos, entre otros. No se detectaron triterpenoles. En la Figura 62 se muestra la distribución de las principales series alifáticas identificadas en las fibras de sisal. Debido a la complejidad del extracto y para una caracterización más detallada de los compuestos presentes en el sisal se llevó a cabo un fraccionamiento por SPE. En la Figura 63 se muestran los cromatogramas de las diversas fracciones obtenidas. La serie de n-alcanos se identificó en el rango de C21 a C31, con un fuerte predominio de los homólogos con número impar de átomos de carbono y máximos para pentacosano (C25) y heptacosano (C27). Cantidades menores de n-aldehídos se identificaron en el rango de C21 a C28, siendo el octacosanal el más abundante. 510152025 F26F28 F24 F22 ω-F24 ω-F26 Ah30 Ah28 Ah26 Ac24 + Ah24 Al27 Al25 Al23 Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Ac22 C46 216 7 35 510152025 F26F28 F24 F22 ω-F24 ω-F26 Ah30 Ah28 Ah26 Ac24 + Ah24 Al27 Al25 Al23 Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Ac22 C46 216 7 35 Figura 61. Cromatograma del extracto lipídico sin derivatizar de las fibras de sisal. Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, Ah(n): serie de n-alcoholes, C(n): serie de n-ceras, F(n): serie de ésteres del ácido ferúlico con una serie de n-alcoholes, ω-F(n): ésteres del ácido ferúlico con una serie de ω-hidroxiácidos; n: número de átomos de carbono; 2: ácido ferúlico, 3: estigmastan-3,5,7-trieno, 5: estigmasterol, 7: sitosterol y 16: 7-oxositosterol. Tiem p o de retención ( min ) 4. Resultados y discusión 109 (a) Ee 51015202530 Ac18:1-2 (d) ω-F24 ω-F26 ω-F28 Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac26 pc-ω-C 26 (b) Tg 9 10 (c) F26 F24 F22 pc-C22 pc-C24 Ah22 Ah28 3 7 5 416 15 (a) Ee (a) Ee 51015202530 Ac18:1-2 (d) ω-F24 ω-F26 ω-F28 Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac26 pc-ω-C 26 5101520253051015202530 Ac18:1-2 (d) ω-F24 ω-F26 ω-F28 Ac16 Ac18 Ac17 Ac20 Ac22 Ac24 Ac26 pc-ω-C 26 (b) Tg 9 10 (b) Tg 9 10 (c) F26 F24 F22 pc-C22 pc-C24 Ah22 Ah28 3 7 5 416 15 (c) F26 F24 F22 pc-C22 pc-C24 Ah22 Ah28 3 7 5 416 15 Tiempo de retención (min) Figura 67. Cromatogramas de las fracciones A (a), B (b), C(c) y D (d) del SPE del extracto de abacá. Ee: ésteres de esteroles, Tg: triglicéridos, Ah(n): n-serie de alcoholes, F(n): ésteres del ácido ferúlico con una serie de n-alcoholes, ω-F(n): ésteres del ácido ferúlico con una serie de ω-hidroxiácidos, pc-C(n): serie de cumaratos con una serie de n-alcoholes y pc-ω-C(n): serie de cumaratos con una serie de ω-hidroxiácidos; n: número de átomos de carbono; 3: estigmastan-3,5,7-trieno, 4: campesterol, 5: estigmasterol, 7: sitosterol, 9: cicloartenona, 10: 24-metiléncicloartanona, 15: estigmastano-3,6-diona, y 16: 7-oxositosterol. 4. Resultados y discusión 110 Entre los esteroles se identificaron sitosterol, estigmasterol, campesterol, 7-oxositosterol, 7-oxocampesterol, cicloartenol, 24-metiléncicloartanol y cicloeucalenol, siendo el más abundante el sitosterol seguido del estigmasterol. La mayoría de estos esteroles están también presentes en otras especies de la familia de las musáceas como Musa sapientum L (Knapp y Nicholas, 1969) y Musa paradisiaca (Banerji et al., 1982). Algunos de estos esteroles se encontraron esterificados con ácidos grasos y su estructura se confirmó por sus espectros de masas. La zona donde eluyen los ésteres de esteroles en la fracción A de SPE se encuentra ampliada en la Figura 68. En esta figura se muestran también los cromatogramas de los iones característicos correspondientes a los diversos esteroles esterificados observándose la presencia de ésteres de campesterol (m/z 382), estigmasterol (m/z 394), sitosterol (m/z 396), cicloartenol (m/z 408) y 24- metiléncicloartanol (m/z 422). Para una caracterización más detallada de los ésteres de esteroles se recurrió a la saponificación de la fracción SPE enriquecida en ésteres de esteroles (fracción A), obteniéndose una fracción neutra que contenía los esteroles y una fracción ácida que contenía los ácidos grasos. En la Tabla 7 se muestra la composición relativa en porcentajes de los ácidos grasos y los esteroles liberados después de la saponificación. Los esteroles esterificados identificados fueron sitosterol, estigmasterol, campesterol, 24-metiléncicloartanol y cicloartenol, siendo los más abundantes los ésteres de 24-metiléncicloartanol y sitosterol. La serie de ácidos grasos esterificados varía de C14 a C28, siendo los mayoritarios los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico. Por otra parte, también se detectaron glicósidos esteroidales (campesteril, estigmasteril y sitosteril 3β-D-glucopiranósidos) en el extracto lipídico, siendo el sitosteril 3β-D-glucopiranósido el mayoritario. También se identificaron diversas cetonas esteroidales, como estigmasta-3,5-dien-7-ona, estigmast-4-en-3-ona, estigmast-4-en-3,6-diona, estigmastano-3,6-diona, cicloartenona y 24-metilén- cicloartanona, así como hidrocarburos esteroidales, como estigmasta-3,5,7-trieno, ergosta-3,5,7-trieno y estigmasta-3,5-dieno. En el caso de la fibras de abacá, al igual que ocurrió en las fibras de sisal, y a diferencia de las fibras de tallos estudiadas (lino, cáñamo, kenaf y yute), no se detectaron compuestos triterpenoidales. 4. Resultados y discusión 111 Figura 68. Cromatograma parcial de la fracción A de SPE del abacá mostrando la serie de ésteres de esteroles y cromatogramas reconstruidos de los iones característicos de las diferentes series de ésteres de esteroles, m/z 382 campesterol, m/z 394 estigmasterol, m/z 396 sitosterol, m/z 408 cicloartenol y m/z 422 24-metiléncicloartanol. Tiempo de retención (min) RIC 20 21 22 23 24 25 m/z 382 m/z 396 m/z 394 m/z 408 m/z 422 Ac 16 Ac 18:0- 2 Ac 16 Ac 18:0- 2 Ac 18:0- 2 Ac 16 Ac 16 Ac 16 Ac 18:0- 2 Ac 18:0- 2 20 21 22 23 24 25 4. Resultados y discusión 112 Tabla 7. Composición relativa (%) de los ácidos grasos y los esteroles liberados después de la saponificación de la fracción enriquecida en ésteres de esteroles (fracción A) del extracto de las fibras de abacá. Fracción A (SPE) Abundancia (%) Esteroles campesterol 19 estigmasterol 17 sitosterol 26 cicloartenol 10 24-metiléncicloartanol 28 n-Ácidos grasos ácido n-tetradecanoico 6 ácido n-pentadecanoico 5 ácido n-hexadecanoico 28 ácido n-heptadecanoico 3 ácido 9,12-octadecadienoico 9 ácido 9-octadecenoico 11 ácido n-octadecanoico 27 ácido n-nonadecanoico 1 ácido n-eicosanoico 2 ácido n-heneicosanoico <0,5 ácido n-docosanoico 2 ácido n-tricosanoico 1 ácido n-tetracosanoico 2 ácido n-pentacosanoico 1 ácido n-hexacosanoico 1 ácido n-heptacosanoico <0,5 ácido n-octacosanoico <0,5 Como se menciona anteriormente, en el extracto de las fibras de abacá se identificaron también series de ésteres de ácidos hidroxicinámicos, principalmente de ácido trans-ferúlico y cantidades menores del ácido trans-p-cumárico. Estos ácidos se encuentran unidos a alcoholes grasos y a ω-hidroxiácidos de cadena larga. Los ésteres del ácido ferúlico se identificaron en las fibras de sisal y abacá, mientras los ésteres del ácido trans-p-cumárico, sólo se han podido detectar en las de abacá. Los ácidos hidroxicinámicos esterificados con n-alcoholes grasos y con ω-hidroxiácidos eluyeron en las fracciones C y D de la SPE, respectivamente (Figura 67). La zona del cromatograma donde eluyen se encuentra ampliada en la Figura 69. 4. Resultados y discusión 113 Tiempo de retención (min) Figura 69. Cromatograma parcial de las fracciones C (a) y D (b) de la SPE del extracto de abacá. F(n):n-serie de ésteres de alquilferulato, ω-F(n): ésteres de carboxialquilferulatos, pc-C(n): serie de n-alquilcumaratos y pc-ω-C(n): serie de n-carboxialquilcumaratos; n: número de átomos de carbono. F22 F24 F20 F21 F26 F23 pc-C24 pc-C22 F25 (a) 17 18 19 20 21 ω-F26 ω-F28 ω-F24 ω-F22 ω-F23 ω-F25 ω-F27 pc-ω-C24 pc-ω-C26 pc-ω-C28 (b) F22 F24 F20 F21 F26 F23 pc-C24 pc-C22 F25 (a) 17 18 19 20 21 ω-F26 ω-F28 ω-F24 ω-F22 ω-F23 ω-F25 ω-F27 pc-ω-C24 pc-ω-C26 pc-ω-C28 (b) 4. Resultados y discusión 114 La distribución de las series de ésteres de los ácidos ferúlico y p-cumárico se muestra en la Figura 70. La serie de los ferulatos de n-alquilo se identificó en el abacá desde C20 a C28, siendo los mayoritarios C22 y C24, mientras que los feruloil ésteres unidos a ω-hidroxiácidos se encontraron desde C22 a C28, siendo los máximos C26, C28 y C24. En ambas series hay un fuerte predominio de los homólogos de cadena par. Por otra parte, la serie de trans-p-cumaratos de n-alquilo se encuentra en muy baja proporción incluyendo compuestos de C22 a C24, con la única presencia de los homólogos de cadena par. La serie de p-cumaroil ésteres de ω-hidroxiácidos se identificó en cantidades menores. Esta serie está presente en el rango de C24 a C28, con la única presencia de los homólogos pares, siendo la primera vez que se describe su presencia en plantas. Se puede observar que la distribución de las series de alcoholes grasos y de ω-hidroxiácidos esterificados con el ácido ferúlico y el ácido p-cumárico es similar a los encontrados en forma libre. La serie de ésteres del ácido ferúlico y cumárico aparecen en forma trans. También aparecen cantidades menores correspondientes a los isómeros cis probablemente formadas durante la extracción y/o análisis. Además de esterificados, el ácido ferúlico y el ácido p-cumárico se encuentran en forma libre en el extracto de abacá (Figura 65). Ferulatos de n-alquilo Ferulatos de ω -hidroxiácidos p -Cumaratos de n-alquilo p -Cumaratos de ω -hidroxiácidos C C CC C C CCC mg/100 g 1 0.25 0.75 0.50 Figura 70. Distribución de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos. El eje de ordenadas muestra la abundancia de los compuestos (mg/100 g). 20 21 22 23 24 25 26 27 28 4. Resultados y discusión 115 En las fibras de abacá, a diferencia del resto de fibras seleccionadas, se identificaron triglicéridos aunque en baja abundancia. Los triglicéridos identificados son 1,2-dioleoilpalmitina (O2P), trioleína (O3) y 1,2-dipalmitoiloleína (P2O). También se identificaron monoglicéridos y diglicéridos en proporciones menores. Los monoglicéridos varían de C14 a C30, siendo los mayoritarios C28 y C26. En el caso de los diglicéridos el rango varía de C16 a C18 siendo el más abundante el octadecanoato de 2-octadecanoiloxi-3-hidroxipropilo [St2 (l,2)]. En ambas series se observa un predominio de los compuestos con número par de átomos de carbono. Los monoglicéridos están sustituidos en la posición 1 mientras que los diglicéridos están sustituidos en las posiciones 1,2 y 1,3. Por otro lado, es necesario destacar que algunas zonas de las fibras de abacá presentaban una coloración más oscura que el resto de las fibras (Figura 71), por lo que se analizó por separado estas zonas para averiguar el origen de la coloración. Figura 71. Fotografía de las fibras de abacá (a) y los correspondientes perfiles cromatográficos de sus extractos (b) y (c). 1: ácido p-cumárico, 3: estigmastan-3,5,7-trieno, 4: campesterol, 7: sitosterol, 9: cicloartenona, 12: estigmast-4-en-3-ona, 16: 7-oxositosterol y X: compuesto desconocido que provoca la coloración de las fibras. 51015202530 Ee 16 9 4 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 13 7 12 F24 F22 Ac 18 Tiempo de retención (min) 51015202530 Ee 16 9 4 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 13 7 12 F24 F22 Ac 18 5101520253051015202530 Ee 16 9 4 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 13 7 12 F24 F22 Ac 18 Tiempo de retención (min) Ee 51015202530 Tiempo de retención (min) Tg Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 1 3 4 7 1216 F24 F22 X 9 Ee 51015202530 Tiempo de retención (min) Tg Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 1 3 4 7 1216 F24 F22 X Ee 51015202530 Tiempo de retención (min) Tg Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 1 3 4 7 1216 F24 F22 Ee 5101520253051015202530 Tiempo de retención (min) Tg Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 1 3 4 7 1216 F24 F22 X 9 (c) (b) (a) 4. Resultados y discusión 116 En la Figura 71 se muestran los correspondientes perfiles cromatográficos de los extractos de cada una de las partes. La composición química del extracto de las fibras de tonalidad clara y oscura fue similar, si bien se detectaron una serie de compuestos en muy alta abundancia en las fibras de pigmentación oscura que no aparecían en las fibras más claras. El cromatograma correspondiente a los extractos de la parte oscura se encuentra dominado por un compuesto (compuesto X) que no se detectó en el cromatograma del extracto de las fibras más claras, por lo que se dedujo que puede ser el responsable de esta tonalidad. Este compuesto mayoritario en las fibras oscuras se concentró en la fracción C de SPE, lo que indica que es un alcohol. La derivatización con BSTFA introdujo dos grupos TMSi, indicando que tiene dos grupos hidroxilos. En la Figura 72 se muestran los espectros de masas sin derivatizar y el derivado TMSi éter de este compuesto. (a) (b) Figura 72. Espectros de masas del compuesto X sin derivatizar (a) y silanizado (b). 229 100% 50 100 150 200 250 300 350 m/z 51 77 91 115 139 181 197211 273 289 306 400 m/z 100 200 300 400 500 73 91 139 165 189 215 253 341 373 420 450 100% 4. Resultados y discusión 117 El espectro de masas sin derivatizar (Figura 72a) se caracteriza por un abundante ión molecular, que es el pico base, a m/z 306 mientras que el espectro de masas del derivado silanizado (Figura 72b) muestra un ión molecular a m/z 450, debido a la presencia de dos grupos TMSi. Estos espectros de masas no se correspondían con ningún compuesto conocido, ni estaban presentes en las librerías de espectros, ni en la bibliografía, por lo que para la determinación de su estructura se recurrió a la técnica de NMR. Para ello se concentró y purificó el compuesto mediante TLC (el compuesto aparecía con un Rf de 0.16) y se llevaron a cabo diferentes registros de espectros NMR para elucidar su estructura molecular. Se obtuvieron NMR monodimensionales de 1H, 13C y bidimensionales homonuclear (COSY, NOESY) y heteronuclear (HSQC, HSQC-TOCSY y HMBC). El espectro de 1H-NMR del compuesto X se muestra en la Figura 73. En la Tabla 8 se muestran los desplazamientos químicos de 1H-NMR para dicho compuesto. Figura 73. Espectro de 1H-NMR del compuesto X. 4. Resultados y discusión 118 Dicho espectro muestra señales correspondientes a dos protones aromáticos acoplados en orto (δ 6,89, d, J=8,5 Hz); (δ 7,44, d, J=8,5 Hz), cinco protones aromáticos de un anillo fenilo monosustituido (δ 6,90, dd, J=7,0, 1,0 Hz; δ 7,08, ddd, J=7,0, 7,0, 1,0 Hz; δ 7,13, dd, J=7,0, 7,0 Hz) y un protón aromático de un anillo aromático pentasustituido (δ 6,98). Del análisis del espectro de 1H-NMR se deduce que la molécula contiene 18 protones. Tabla 8. Desplazamientos químicos de 1H-NMR del compuesto X (500 MHz, CDCl3). Los valores de J (Hz) se encuentran entre paréntesis. H δ 1 4,74 dd (4,0, 2,5 ) 2a 2,12 dddd (13,0, 13,0, 4,0, 4,0) 2e 2,23 dddd (13,0, 4,0, 2,5, 2,5) 3a 2,44 ddd (16,0, 13,0. 4,0) 3e 2,84 ddd (16,0, 4,0, 2,5) 5 6,89 d (8,5) 6 7,44 d (8,5) 7 6,98 s 2’, 6’ 6,90 dd (7,0, 1,0) 4’ 7,08 ddd (7,0, 7,0, 1,0) 3’, 5’ 7,13 dd (7,0, 7,0) -OCH3 3,90 s -OH 5,80 s -OH 4,65 bs En la Figura 74 se muestra el espectro de 13C-NMR del compuesto X y en la Tabla 9 los correspondientes desplazamientos químicos. Del análisis de este espectro se deduce que el número total de carbonos existentes en la molécula es 20. Una vez estimado el número de C e H se determinó el número de insaturaciones. Dicho parámetro da una idea bastante aproximada del producto estudiado. El número de insaturaciones (N.I) se calculó aplicando la siguiente fórmula matemática: N.I: = [(2*nºC -nºH +nºN)/2] + 1. En el presente caso N.I: = [(2*20 -18)/2] + 1= 12 insaturaciones. 4. Resultados y discusión 125 1997; Kamo et al., 2000) y por lo tanto, su presencia aumenta en respuesta a la invasión microbiana. Entre los agentes patógenos a los cuales dan respuesta están los hongos Mycosphaerella fijiensis y Fusarium oxysporum (causante de la denominada enfermedad de Panamá), que atacan a las hojas de la banana (Musa acuminata) (Luis et al., 1994). En el presente caso, la presencia de este compuesto en las hojas de abacá (Musáceas) podría deberse al igual que en los casos anteriores, a la respuesta de la planta frente a invasiones microbianas. 4.2.3. Modificación estructural de los lípidos de las fibras durante la cocción a la sosa/AQ La caracterización química de las materias primas utilizadas para la fabricación de pasta de papel, así como el estudio de las modificaciones y los cambios estructurales sufridos por los diferentes lípidos durante el pasteado, constituyen requisitos fundamentales para llegar a identificar los compuestos que originan los problemas de “pitch”, diseñar estrategias adecuadas para su control y optimizar los procesos de eliminación de los extraíbles presentes en las pastas. Los compuestos lipofílicos que sobreviven a la cocción reaccionarán de distinta forma dependiendo de su estructura y del agente de blanqueo utilizado, pudiendo dar lugar a problemas de “pitch”. La necesidad de buscar formas más respetuosas con el medio ambiente ha conducido a la industria de pasta y papel en una primera fase a la sustitución del cloro elemental por dióxido de cloro con la intención de producir pastas ECF, y en una segunda fase, a la sustitución total de los derivados del cloro para producir pastas TCF y así reducir o eliminar las emisiones de AOX en los efluentes. La novedad de las secuencias de blanqueo TCF ha obligado al sector papelero a solucionar los nuevos problemas que surgen con estas secuencias y que no se daban al utilizar reactivos más agresivos (aunque también más contaminantes). Entre los problemas causados por este tipo de compuestos ocupa un lugar importante la formación de depósitos de "pitch" tanto en las máquinas como en las pastas (Allen, 1980; Hillis y Sumimoto, 1989). Como se ha mencionado anteriormente, estos depósitos se forman por la acumulación de compuestos lipídicos y reducen drásticamente la calidad del producto final. El cierre de los circuitos cada vez mayor ha ocasionado un aumento en la concentración de estos compuestos en el sistema con el consiguiente agravamiento de los problemas de "pitch". Para determinar las modificaciones y los cambios estructurales sufridos por los diferentes lípidos durante la cocción alcalina, se estudió la composición de diversas pastas alcalinas obtenidas por el proceso sosa/AQ con distintos contenidos en lignina (estimadas como índice kappa). Entre éstas se seleccionaron dos pastas de 4. Resultados y discusión 126 lino de kappa 28 y kappa 6 y una de pasta de kenaf de kappa 6. Estas pastas se obtuvieron mediante cocción con distintas concentraciones de álcali. Los extractos lipídicos de las pastas de lino (kappa 28 y kappa 6) son 0,5 y 0,3%, respectivamente. En la Figura 80 se muestran los cromatogramas de los extractos lipídicos de dichas pastas, así como el cromatograma de las fibras de lino para su comparación. La composición química detallada de los lípidos identificados en las pastas de lino se muestra en la Tabla 10. La composición lipídica de la pasta de lino de kappa 28 (Figura 80b) es muy similar a la de las fibras de lino, con un predominio de ceras (44%) y la presencia de series de n-alcoholes (18%), n-alcanos (17%) y n-ácidos grasos (16%). La principal diferencia en la composición lipídica de la pasta de lino de kappa 28 con respecto a la fibra es la cantidad de aldehídos presentes, los cuales disminuyen notablemente en la pasta mientras la cantidad de alcoholes de los correspondientes homólogos muestra un incremento paralelo, debido a la hidrólisis parcial de las ceras. En el caso de la pasta de lino de kappa 6 (Figura 80c) los lípidos predominantes son n-alcoholes (50%), n-alcanos (20%) y n-ácidos grasos (18%) y cantidades menores de aldehídos, ceras, esteroles y triterpenoles. Las principales diferencias en la composición lipídica de la pasta de lino de kappa 6 con respecto a la fibra son la fuerte disminución en la cantidad de ceras y el alto contenido en nalcoholes libres debido a la liberación de los alcoholes que se encontraban esterificados formando las ceras. Tal y como ocurre en la pasta de lino de kappa 28, en la pasta de lino de kappa 6 se observa una fuerte disminución en la cantidad de aldehídos. Por otra parte, se ha estudiado también la composición de los lípidos de una pasta de kenaf de kappa 6. El extracto lipídico de dicha pasta es de 0,1%. El cromatograma del extracto lipídico de la pasta de kenaf se muestra en la Figura 81, así como el de la fibra de kenaf para su comparación. La composición detallada de los lípidos identificados en la pasta de kenaf se muestra en la Tabla 10. Los lípidos predominantes en la pasta de kenaf de kappa 6 son n-alcanos (40%), n-ácidos grasos (26%) y n-alcoholes (24%) y cantidades menores de n-ceras, esteroles y triterpenoles. La principal diferencia en la composición lipídica de la pasta de kenaf de kappa 6 con respecto a la fibra es la cantidad de ceras, la cual muestra un fuerte descenso con respecto a la fibra, como ocurría en la pasta de lino de kappa 6. Por otra parte, las series de n-alcanos y n-alcoholes, y los compuestos pertenecientes a las familias de esteroles y triterpenoles sobreviven a las condiciones de cocción permaneciendo en la pasta de kenaf. 4. Resultados y discusión 127 Ah28 C46 C44 C48 C42 Ac16 Ac18 Al25 Ac22 Al27 Al29 + Ah26 Ad28 Ad30 10 20515 25 C46 C44 C48 C50 C52C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al27 Ad26 Al29 + Ah26Ad28 Ah28 Ad30 Al25 (a) (b) Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Al27 Al29 + Ah26 Ah28 Ad30 Al25 Ac22 C40C42 C44C46 C48 C50C52C54C56 * (c) 30 Ah28 C46 C44 C48 C42 Ac16 Ac18 Al25 Ac22 Al27 Al29 + Ah26 Ad28 Ad30 10 20515 25 C46 C44 C48 C50 C52C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al27 Ad26 Al29 + Ah26Ad28 Ah28 Ad30 Al25 (a) (b) Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Al27 Al29 + Ah26 Ah28 Ad30 Al25 Ac22 C40C42 C44C46 C48 C50C52C54C56 * (c) Ah28 C46 C44 C48 C42 Ac16 Ac18 Al25 Ac22 Al27 Al29 + Ah26 Ad28 Ad30 Ah28 C46 C44 C48 C42 Ac16 Ac18 Al25 Ac22 Al27 Al29 + Ah26 Ad28 Ad30 C46 C44 C48 C42 Ac16 Ac18 Al25 Ac22 Al27 Al29 + Ah26 Ad28 Ad30 10 20515 25 C46 C44 C48 C50 C52C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al27 Ad26 Al29 + Ah26Ad28 Ah28 Ad30 Al25 (a) (b) Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Al27 Al29 + Ah26 Ah28 Ad30 Al25 Ac22 C40C42 C44C46 C48 C50C52C54C56 * (c) 10 20515 25 10 20515 25 C46 C44 C48 C50 C52C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al27 Ad26 Al29 + Ah26Ad28 Ah28 Ad30 Al25 C46 C44 C48 C50 C52C54C56 C42 C40 Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al27 Ad26 Al29 + Ah26Ad28 Ah28 Ad30 Al25 (a) (b) Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Al27 Al29 + Ah26 Ah28 Ad30 Al25 Ac22 C40C42 C44C46 C48 C50C52C54C56 *Ac16 Ac18 Ac18:1 + Ac18:2 Al27 Al29 + Ah26 Ah28 Ad30 Al25 Ac22 C40C42 C44C46 C48 C50C52C54C56 * (c) 30 Tiempo de retención (min) Figura 80. Cromatogramas de los extractos lipídicos (sin derivatizar) de las fibras de lino (a), pasta de lino de kappa 28 (b) y pasta de lino de kappa 6 (c). Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, Ad(n): n-aldehídos, Ah(n): serie de n-alcoholes, C(n): serie de n-ceras y * antraquinona; n: número de átomos de carbono. 4. Resultados y discusión 128 Tiempo de retención (min) Figura 81. Cromatogramas de los extractos lipídicos (sin derivatizar) de las fibras de kenaf (a) y pasta de kenaf de kappa 6 (b). Ac(n): serie de n-ácidos grasos, Al(n): serie de n-alcanos, C(n): serie de n-ceras, 4: campesterol, 7: sitosterol, 12: estigmast-4-en-3-ona, 13: glutinol, 15: estigmastano-3,6-diona, * antraquinona y ** contaminantes; n: número de átomos de carbono. 10 20515 25 (a) Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Ac20Ac22 Al27 Al29 Al31 Al33 C48 C46 C44 C42 C50 C52 7 12 13 15 4 (b) C48 C46 C44 C42 C40 Al31 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al29 Al33 ** * Al27 ** ** 415 13 7 10 20515 25 10 20515 25 (a) Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Ac20Ac22 Al27 Al29 Al31 Al33 C48 C46 C44 C42 C50 C52 7 12 13 15 4 (a) Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Ac20Ac22 Al27 Al29 Al31 Al33 C48 C46 C44 C42 C50 C52 7 12 13 15 4 (a) Ac16:1 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Ac20Ac22 Al27 Al29 Al31 Al33 C48 C46 C44 C42 C50 C52 7 12 13 15 4 (b) C48 C46 C44 C42 C40 Al31 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al29 Al33 ** * Al27 ** ** 415 13 7 (b) C48 C46 C44 C42 C40 Al31 Ac16 Ac18:1 + Ac18:2 Ac18 Al29 Al33 ** * Al27 ** ** 415 13 7 30 4. Resultados y discusión 129 Tabla 10. Composición de los lípidos (mg/100 g) de las pastas de lino y kenaf. Pastas de lino Pasta de kenaf Compuestos kappa 28 kappa 6 kappa 6 n-Alcanos 84,20 48,20 20,67 n-heneicosano 2,88 0,51 3,36 n-tricosano 1,09 0,35 0,96 n-pentacosano 5,52 3,34 1,54 n-hexacosano 4,43 3,23 0,29 n-heptacosano 12,70 7,93 0,56 n-octacosano 5,82 4,30 0,31 n-nonacosano 44,10 22,00 1,03 n-triacontano 1,94 1,48 0,24 n-hentriacontano 5,70 5,03 11,20 n-tritriacontano <0,01 <0,01 1,18 n-Ácidos grasos 77,00 44,10 13,60 ácido n-tetradecanoico 0,47 0,36 0,34 ácido n-pentadecanoico 0,27 0,21 0,22 ácido 9-hexadecenoico 0,58 0,10 - ácido n-hexadecanoico 26,50 20,70 5,59 ácido n-heptadecanoico 0,55 0,32 0,18 ácido 9,12-octadecadienoico 3,72 0,42 1,17 ácido 9-octadecenoico 15,70 2,09 2,53 ácido n-octadecanoico 18,00 15,70 1,60 ácido n-eicosanoico 2,61 1,50 1,13 ácido n-docosanoico 2,03 0,68 0,46 ácido n-tetracosanoico 1,94 0,72 0,17 ácido n-hexacosanoico 1,35 0,31 0,08 ácido n-octacosanoico 2,80 0,91 0,10 ácido n-triacontanoico 0,52 0,09 0,03 ácido n-dotriacontanoico - - - n-Alcoholes alifáticos 86,70 124,00 12,35 n-hexadecanol 1,95 1,31 0,58 n-octadecanol 1,82 3,44 1,80 n-eicosanol 2,66 4,28 1,44 n-docosanol 0,70 1,65 1,09 n-tetracosanol 1,04 1,97 0,07 n-hexacosanol 15,40 23,50 0,90 n-octacosanol 48,20 70,90 5,36 n-triacontanol 14,20 16,10 1,58 n-dotriacontanol 0,74 0,66 0,11 n-Aldehídos 6,91 7,93 0,04 n-heneicosanal - - - n-docosanal - - - (Cont.) 4. Resultados y discusión 130 Pastas de lino Pasta de kenaf Compuestos kappa 28 kappa 6 kappa 6 n-tricosanal - 0,06 - n-tetracosanal 0,15 0,11 - n-pentacosanal - - - n-hexacosanal 1,29 1,24 - n-heptacosanal - - - n-octacosanal 4,13 5,42 0,04 n-nonacosanal - - - n-triacontanal 1,34 1,10 - n-dotriacontanal - - - Hidrocarburos esteroidales 5,34 3,06 0,93 ergosta-3,5,7-trieno 0,21 0,23 0,08 ergosta-3,5-dieno 0,48 0,61 0,03 estigmastatetraeno 0,68 0,32 0,22 estigmasteno 0,33 0,19 0,04 estigmasta-3,5,7-trieno 3,41 1,47 0,43 estigmasta-3,5-dieno 0,23 0,24 0,13 Esteroles/Triterpenoles 5,47 2,02 0,55 campesterol 0,50 <0,01 <0,01 estigmasterol 0,04 <0,01 <0,01 sitosterol 1,49 0,25 0,05 estigmastanol 0,26 0,04 0,01 motiol - - - glutinol - - 0,19 β-amirina 2,98 1,57 0,15 α-amirina 0,21 0,15 0,15 α-Tocoferol 0,33 0,21 0,01 Cetonas esteroidales/triterpenoidales 6,08 3,27 0,63 estigmastan-3-ona 0,15 0,10 0,04 estigmasta-7,22-dien-3-ona 0,91 0,56 0,12 estigmasta-3,5-dien-7-ona 0,84 0,27 0,09 estigmast-4-en-3-ona 1,46 0,43 0,14 estigmastadienona (isómero) 0,78 0,36 0,18 estigmast-4-en-3,6-diona 0,08 0,01 0,02 estigmastano-3,6-diona 0,09 0,03 0,03 β-amirenona 1,60 1,21 0,04 α-amirenona 0,16 0,29 0,02 Glicósidos esteroidales 1,10 0,41 0,21 campesteril 3β-D-glucopiranósido 0,18 0,06 0,02 estigmasteril 3β-D-glucopiranósido 0,15 0,06 0,04 sitosteril 3β-D-glucopiranósido 0,77 0,29 0,15 (Cont.) 4. Resultados y discusión 131 Pastas de lino Pasta de kenaf Compuestos kappa 28 kappa 6 kappa 6 Ceras 213,00 11,40 3,21 C40 0,55 0,16 - C42 8,51 0,80 0,28 C44 67,60 4,37 0,85 C45 0,55 - - C46 109,10 4,63 1,16 C48 23,90 1,04 0,78 C50 1,85 0,39 0,14 C52 0,73 - - Ésteres de esteroles/triterpenoles 0,09 - - ésteres de sitosterol 0,03 - - ésteres de β-amirina 0,06 - - ésteres de glutinol - - - - No detectados. El estudio de la composición de los lípidos presentes en las pastas reveló que las diferentes clases de lípidos presentes en las fibras tienen distintos comportamientos durante la cocción. Como se mencionó anteriormente, la principal diferencia de la composición lipídica de las pastas con respecto a las fibras radica en la cantidad de ceras. Este bajo contenido en ceras se debe a la mayor concentración de álcali y/o a la temperatura más elevada utilizada para obtener estas pastas, que da lugar a la hidrólisis de las ceras. La liberación de los alcoholes esterificados hace que aumente la cantidad de los alcoholes libres en las pastas con respecto a las fibras. También se observa cómo tras el tratamiento alcalino la cantidad de aldehídos disminuye notablemente en las pastas, siendo especialmente notable en el caso del lino, donde los aldehídos son muy abundantes. Esto puede ser debido a una oxidación de los aldehídos a ácidos, que son posteriormente disueltos por el álcali. En general, los lípidos presentes en las fibras pueden ser clasificados en dos grupos atendiendo a su comportamiento en el medio acuoso, ácidos y compuestos neutros, incluyendo entre estos últimos ceras, alcoholes, alcanos, aldehídos, esteroles y triterpenoles. A un pH suficientemente alto (como el que existe en la cocción alcalina), los ácidos grasos se disocian y pueden solubilizarse formando jabones. Sin embargo, los compuestos neutros tienen muy baja solubilidad en agua. Entre éstos, las ceras, y especialmente algunos ésteres de esteroles y triterpenoles, son difíciles de hidrolizar completamente incluso en procesos alcalinos fuertes. Cuando no se hidrolizan completamente durante la cocción, como ocurre en la pasta de kappa 28, tienden a permanecer intactos en las pastas y pueden ser difíciles de eliminar incluso en el lavado y en las etapas de blanqueo (Ekman y 4. Resultados y discusión 132 Holmbom, 2000). Del mismo modo, los esteroles y los triterpenoles libres no forman jabones bajo las condiciones de la cocción alcalina y por lo tanto, tienen tendencia a depositarse y están en el origen de la formación de los depósitos de “pitch” (del Río et al., 1998a; del Río et al., 2000; Ström, 2000). Otros derivados de esteroles tales como los glicósidos esteroidales, juegan también un papel importante en la formación de estos depósitos de “pitch” ya que parte de ellos sobrevive a la cocción y se encuentran intactos en las pastas (Gutiérrez y del Río, 2001), incluso en las que tienen números de kappa bajos, como se muestra en la Tabla 10. Esto se debe a que estos compuestos tienen puntos de fusión altos y baja solubilidad en agua, álcali y disolventes orgánicos. Debido a estas propiedades forman una especie de capa sobre la pasta que dificulta la penetración de los agentes de cocción y blanqueo impidiendo, por tanto, la eliminación de los lípidos durante la cocción y el blanqueo químico (Nilvebrant y Byström, 1995). Por otra parte, los jabones de ácidos grasos actúan como agentes solubilizantes y facilitan la eliminación de las sustancias neutras solubles de las pastas. Sin embargo, el bajo contenido en ácidos grasos (sólo el 12% de los lípidos totales en el lino y el 28% en el kenaf) comparado con las sustancias neutras (88% y 72%, respectivamente) en estas fibras, hace que la cantidad de jabones de ácidos grasos formados durante la cocción no sean suficientes para arrastrar los compuestos menos polares. De hecho, la gran concentración de compuestos insaponificables con respecto a los saponificables, es la causa principal de los problemas de “pitch” en las pastas kraft de algunas maderas usadas en la industria de pasta y papel, como chopo y eucalipto (Swan, 1967; Allen et al., 1988; Dunlop-Jones et al., 1991; Chen et al., 1995; Leone and Breuil, 1998; Gutiérrez et al., 2001a,b,c). Por tanto, se ha sugerido la relación entre los compuestos saponificables e insaponificables como un índice mejor para predecir los problemas de “pitch” que el total de la cantidad de lípidos de la madera o fibra (Ekman y Holmbom, 2000; Gutiérrez y del Río, 2003a, b). En conclusión, este estudio demuestra cómo algunos de los compuestos lipofílicos presentes en las fibras sobreviven a la cocción y están presentes en la pasta sin blanquear, mientras que las ceras (lípidos muy abundantes en las fibras de lino y kenaf) pueden ser hidrolizadas eficientemente durante cocciones alcalinas con gran carga de álcali y/o temperatura. La selección final de las condiciones de cocción para minimizar el contenido de lípidos en las pastas debe de ser un compromiso entre el óptimo de eliminación de lípidos y la mínima disminución del rendimiento, así como la conservación de las propiedades de la pasta. El conocimiento de los cambios estructurales y el comportamiento de los diferentes lípidos durante la cocción serán útiles para el mejor aprovechamiento de estas fibras en la industria. 4. Resultados y discusión 133 4.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA LIGNINA El análisis de la composición química de la lignina de las fibras y su modificación estructural durante la cocción alcalina se llevó a cabo mediante pirólisis analítica (en ausencia y en presencia de TMAH) acoplada a GC/MS. La pirólisis analítica es un método degradativo de gran interés para el estudio de las sustancias orgánicas macromoleculares y da lugar a una rotura térmica del polímero de lignina y los compuestos monoméricos liberados se analizan posteriormente por GC/MS. Mediante esta técnica no sólo se rompen los enlaces éster y éter sino también distintas uniones C-C. Se lleva a cabo en condiciones de atmósfera inerte, a elevadas temperaturas (500º-700ºC) y durante un corto espacio de tiempo (4-10 s) (Chen, 1992). Las técnicas pirolíticas presentan diversas ventajas sobre otros métodos degradativos en el estudio de las macromoléculas. Junto con su rapidez, el análisis por Py-GC/MS se caracteriza por la pequeña cantidad de muestra requerida y permite el análisis de la lignina “in situ”, frente a los métodos clásicos que requieren su extracción de la madera o la fibra. Se han publicado numerosos estudios sobre pirólisis de materiales lignocelulósicos incluyendo madera (Pouwels et al., 1987; Saiz-Jiménez et al., 1987; Elder, 1991; Yokoi et al., 1999; del Río et al., 2001a, 2002, 2005), fibras de plantas no madereras (Serés-Aspax et al., 1985; Niemann et al., 1992; Morrison y Archibald, 1998; Kuroda et al., 2001, 2002a; Gutiérrez et al., 2004) y pasta de papel (Kleen y Gellerstedt, 1991; Galleti et al., 1997; del Río et al., 2001b; Choi et al., 2002; Gutiérrez et al., 2004) así como sus constituyentes químicos principales, hidratos de carbono (Shulten y Gortz, 1978; Pouwels et al., 1989) y lignina (Martín et al., 1979; Camarero et al., 1999). 4.3.1. Composición química de la lignina de las fibras 4.3.1.1. Análisis por Py-GC/MS Con el fin de estudiar la composición química de la lignina de estas fibras se llevó a cabo la pirólisis analítica de las mismas y los productos originados a partir de las unidades H, G y S se analizaron por GC/MS. Los pirogramas de las distintas fibras seleccionadas para este estudio se muestran en la Figura 82. La relación de los compuestos liberados por Py-GC/MS en las distintas muestras y su abundancia relativa se detallan en la Tabla 11. 4. Resultados y discusión 134 5 101520253035 (a) (d) (f) (c) (b) (e) 33 23 126 13 16 19 29 3134 38 44 54 4 811 26 79 1 2 6 19 24 31 35 34 38 39 44 54 5861 64 67 78 50 4 811 16 29 13 124 6 13 16 1719 40 48 58 67 64 63 61 5455 50 46 39 70 71 78 79 80 313435 8 510 11 24 23 26 38 44 68 74 77 81 1 2 6 10 13 1617 19 24 293134 35 38 39 40 46 44 48 50 54 58 61 64 67 70 71 78 79 77 481 1 2 6 13 17 19 24 26 30 3538 39 40 46 48 50 54 58 61 63 64 67 71 78 79 77 74 434 81 63 1613 19 31 40 42 58 67 417 54 16 24 25 3839 48 61 64 7879 81 5 101520253035 (a) (d) (f) (c) (b) (e) 5 1015202530355 101520253035 (a) (d) (f) (c) (b) (e) (a) (d) (f) (c) (b) (e) 33 23 126 13 16 19 29 3134 38 44 54 4 811 26 79 1 2 6 19 24 31 35 34 38 39 44 54 5861 64 67 78 50 4 811 16 29 13 124 6 13 16 1719 40 48 58 67 64 63 61 5455 50 46 39 70 71 78 79 80 313435 8 510 11 24 23 26 38 44 68 74 77 81 1 2 6 10 13 1617 19 24 293134 35 38 39 40 46 44 48 50 54 58 61 64 67 70 71 78 79 77 481 1 2 6 13 17 19 24 26 30 3538 39 40 46 48 50 54 58 61 63 64 67 71 78 79 77 74 434 81 63 1613 19 31 40 42 58 67 417 54 16 24 25 3839 48 61 64 7879 81 23 126 13 16 19 29 3134 38 44 54 4 811 26 23 126 13 16 19 29 3134 38 44 54 4 811 26 79 1 2 6 19 24 31 35 34 38 39 44 54 5861 64 67 78 50 4 811 16 29 13 79 1 2 6 19 24 31 35 34 38 39 44 54 5861 64 67 78 50 4 811 16 29 13 124 6 13 16 1719 40 48 58 67 64 63 61 5455 50 46 39 70 71 78 79 80 313435 8 510 11 24 23 26 38 44 68 74 77 81 124 6 13 16 1719 40 48 58 67 64 63 61 5455 50 46 39 70 71 78 79 80 313435 8 510 11 24 23 26 38 44 68 74 77 81 1 2 6 10 13 1617 19 24 293134 35 38 39 40 46 44 48 50 54 58 61 64 67 70 71 78 79 77 481 1 2 6 10 13 1617 19 24 293134 35 38 39 40 46 44 48 50 54 58 61 64 67 70 71 78 79 77 481 1 2 6 13 17 19 24 26 30 3538 39 40 46 48 50 54 58 61 63 64 67 71 78 79 77 74 434 81 1 2 6 13 17 19 24 26 30 3538 39 40 46 48 50 54 58 61 63 64 67 71 78 79 77 74 434 81 63 1613 19 31 40 42 58 67 417 54 16 24 25 3839 48 61 64 7879 8163 1613 19 31 40 42 58 67 417 54 16 24 25 3839 48 61 64 7879 81 Tiempo de retención (min) Figura 82. Pirogramas de las fibras de lino (a), cáñamo (b), kenaf (c), yute (d), sisal (e) y abacá (f). Los números de los picos corresponden a los compuestos listados en la Tabla 11.