Cambios en los perfiles de expresión génica en condiciones fisiológicas versus patológicas en el sistema hematopoyético

Universidad de Sevilla Departamento de Fisiología Médica y Biofísica TESIS DOCTORAL Cambios en los perfiles de expresión génica en condiciones fisiológicas versus patológicas en el sistema hematopoyético Alicia Báez Palomo 2014 La presente tesis doctoral corresponde a un compendio de 3 trabajos previamente publicados y 1 sometido a proceso de publicación que se especifican a continuación: 1. The Granulocyte colony-stimulating factor produces long-term changes in gene and microRNA expression profiles in CD34+ cells from healthy donors. Alicia Báez 1 , Beatriz Martín-Antonio 2 , José I. Piruat 1 , Concepción Prats 1 , Isabel ÁlvarezLaderas 1 , Maria Victoria Barbado 1 , Magdalena Carmona 1 , Álvaro Urbano-Ispizua 2,3 y Jose Antonio Pérez-Simón 1 1 Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen del Rocio, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), CSIC, Universidad de Sevilla. 2 Departmento of Hematología, Hospital Clínic, IDIBAPS, Barcelona. 3 Instituto de Investigación Josep Carreras, Universidad de Barcelona. Haematologica. 2014 Feb;99(2):243-51. doi: 10.3324/haematol.2013.086959 2. Gene and miRNA expression profiles of hematopoietic progenitor cells vary depending on their origin. Alicia Báez 1 , Beatriz Martín-Antonio 2 , José I. Piruat 1 , Maria Victoria Barbado 1 , Concepción Prats 1 , Isabel Álvarez-Laderas 1 ,Magdalena Carmona 1 , Jose Antonio PérezSimón 1 yÁlvaro Urbano-Ispizua 2,3 1 Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen del Rocio, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), CSIC, Universidad de Sevilla. 2 Departmento of Hematología, Hospital Clínic, IDIBAPS, Barcelona. 3 Instituto de Investigación Josep Carreras, Universidad de Barcelona. Biol Blood Marrow Transplant. 2014 May;20(5):630-9. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.01.022. 3. The CD27 + memory B cells display changes in the gene expression pattern in elderly individuals. Alicia Báez, Isabel Álvarez-Laderas, José I. Piruat, Teresa Caballero-Velázquez, M.Victoria Barbado, África Millán-Uclés, Mayte Medrano, Estefanía García-Guerrero, LI Sánchez-Abarca and José Antonio Pérez-Simón. Hematology Department; Institute of Biomedicine of Seville (IBIS); University Hospital Virgendel Rocio/CSIC/University of Seville; Seville; Spain. Immunology. 2014 Sep 6.doi: 10.1111/imm.12381. [Epub ahead of print] 4. Myelomatousplasma cells display an aberrantgene expression patternsimilar to that observed in normal memory B cells Alicia Báez, José I Piruat, Teresa Caballero-Velázquez, LI Sánchez-Abarca, Isabel Álvarez-Laderas, M Victoria Barbado, África Millán-Uclés, Jesús Martín-Sánchez, Estefanía García-Guerrero, Mayte Medrano and José Antonio Pérez-Simón. Hematology Department, University Hospital Virgen del Rocío / Institute of Biomedicine of Seville (IBIS) / CSIC / Universidad de Sevilla, Seville, Spain. A Javi. A mi familia. A los grandes amigos. Nunca consideres el estudio como una obligación, sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber. (Albert Einstein) Todos somos científicos cuando somos niños, pero al crecer, solo algunos conservan un poco de esa curiosidad que es la madre de la ciencia. (Juan Aguilar M) Los genes, al igual que los diamantes, son para siempre. (Richard Dawkins) Agradecimientos Índice PREÁMBULO...........................................................................................................................1 INTRODUCCIÓN 1. Células progenitoras hematopoyéticas....................................................................................5 1.1. Trasplante de progenitores hematopoyéticos................................................................6 1.2. Fuentes de progenitores hematopoyéticos....................................................................7 1.3. El nicho hematopoyético...............................................................................................9 1.4. Movilización de progenitores hematopoyéticos..........................................................11 1.4.1. Agentes movilizadores........................................................................................12 1.4.2. Mecanismo y efectos del G-CSF........................................................................13 2. Linfocitos B..........................................................................................................................15 2.1. Desarrollo del linfocito B...........................................................................................15 2.1.1. Etapa antígeno-independiente............................................................................15 2.1.2. Etapa antígeno-dependiente...............................................................................18 3. Mieloma Múltiple.................................................................................................................22 3.1. De la gammapatía monoclonal al mieloma múltiple..................................................22 3.2. Alteraciones moleculares, genéticas y epigenéticas en el mieloma múltiple.............23 3.2.1. Traslocaciones primarias (IgH)...........................................................................24 3.2.2. Traslocaciones secundarias (Ig)..........................................................................25 3.2.3. Variaciones en el número de copias....................................................................25 3.2.4. Desregulación de rutas y procesos de señalización.............................................27 3.2.5. Cambios epigenéticos..........................................................................................30 3.3. Origen de la célula stem mielomatosa.........................................................................32 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis....................................................................................................................................37 Objetivos...................................................................................................................................38 RESULTADOS Artículo 1. Los perfiles de expresión génica y de miRNAs de las células progenitoras hematopoyéticas varían dependiendo de su origen...................................................................41 Artículo 2. El factor estimulador de colonias granulocíticas produce cambios a largo plazo en los perfiles de expresión génica y de miRNAs de las células CD34+ de donantes sanos........53 Artículo 3. Las células B de memoria muestran cambios en los patrones de expresión génica de individuos de edad avanzada...............................................................................................64 Artículo 4. Las células plasmáticas mielomatosas muestran un patrón de expresión génica similar al observado en las células B de memoria normales.....................................................76 DISCUSIÓN............................................................................................................................99 CONCLUSIONES................................................................................................................105 BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................109 PREÁMBULO 1 PREÁMBULO El trabajo realizado en esta tesis doctoral consiste en el estudio de los cambios en la expresión génica que sufren las células hematopoyéticas ante la modificación de las condiciones “fisiológicas” en las que se hallen, por ejemplo en función de su localización o de la edad, y de perturbaciones no fisiológicas, como puede ocurrir tras exposición a fármacos. Así mismo, los estudios realizados persiguen comprobar si estas modificaciones pueden tener alguna similitud con los cambios de expresión génica que ocurren en situaciones patológicas, por ejemplo, en el contexto de la transformación neoplásica. Las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) empleadas actualmente en el trasplante presentan diferentes propiedades biológicas en función de su origen: médula ósea (MO), cordón umbilical (CU), o sangre periférica (SP), lo que se traduce en una evolución diferente de los pacientes tras el trasplante según sea la fuente de progenitores utilizada. Esto puede deberse, al menos en parte, a diferencias en los perfiles de expresión génica entre las CPH obtenidas a partir de las distintas fuentes, hecho que pudimos confirmar en el primero de los artículos publicados e incluidos en el presente proyecto de tesis. Tras comprobar que las CPH de SP movilizadas con el factor estimulador de colonias granulocíticas (G-CSF) presentan un patrón de expresión génica distinto respecto a las CPH obtenidas de MO o CU, nos planteamos estudiar los efectos a corto, medio y largo plazo del G-CSF. De este modo pudimos observar cómo su patrón de expresión génica puede modificarse a largo plazo tras exposición a dicho factor. Por otra parte, quisimos comprobar si los linfocitos B de memoria (LBM), uno de los subtipos celulares más “longevos” dentro del sistema hematopoyético junto con las CPH, podrían sufrir modificaciones en su expresión génica a lo largo del tiempo, con el envejecimiento del individuo. En primer lugar confirmamos que los LBM presentan un perfil de expresión génica muy diferente en sujetos añosos frente a sujetos jóvenes, cosa que no ocurre en otras subpoblaciones de linfocitos B de vida más corta, como los linfocitos B naive (LBN). Teniendo en cuenta que el mieloma múltiple es una enfermedad asociada al envejecimiento caracterizada por la acumulación de células plasmáticas (CP) que presentan anomalías en los mecanismos celulares de apoptosis y/o supervivencia celular, nos planteamos que las CP mielomatosas (CPm) podrían tener un patrón de expresión génica similar al de un LBM, y que las modificaciones observadas en la expresión génica en los LBM del anciano podríansubyacer a los procesos de mielomagénesis. En este sentido, Alicia Báez Palomo confirmamos que el perfil de expresión génica de las CPm es más parecido al de los LBM que al de las CP normales de individuos sanos. Precisamente, algunos de los genes que se expresan de manera “asincrónica” en las CPm (esto es, que normalmente se expresan en LBM pero que en condiciones normales dejan de hacerlo cuando éste madura a CP) son genes relacionados con longevidad celular que, en cierto modo, confieren a los LBM (y por ende a las CPm) características propias de una célula stem. En resumen, en este trabajo de tesis hemos comprobado que diferentes condiciones fisiológicas (como el envejecimiento), el tratamiento con factores de crecimiento, o bien condiciones patológicas, se asocian a modificaciones en el perfil de expresión génica que subyacen a las propiedades biológicas de los diferentes compartimentos celulares analizados. Nuestras observaciones indican que es necesario un estricto control de estos procesos, especialmente en puntos concretos de la diferenciación hematopoyética (a nivel de CPH o de LBM) en los que tienen lugar procesos que regulan la diferenciación versus el mantenimiento de las propiedades biológicas que confieren a una célula longevidad, quiescencia o división asimétrica (esto es “stemness”). Introducción INTRODUCCIÓN 5 1. CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS En términos generales se define a una célula madre como una célula progenitora con capacidad de auto-renovación y de diferenciación 1 . La auto-renovación es la capacidad de una célula para dividirse y dar lugar a dos células hijas con un patrón de expresión génica idéntico a ella; mientras que la diferenciación es la secuencia genéticamente programada de fenómenos mediante los cuales una célula origina células hijas que experimentan ganancia selectiva de funciones específicas a expensas de perder su capacidad de auto-renovación. En los animales superiores, las células madre se han clasificado en dos grandes grupos, según su tejido de origen: -Células madre embrionarias: derivan de la masa celular interna del embrión en estadio de blastocisto (7-14 días), y son capaces de generar todos los diferentes tipos celulares del cuerpo. Por ello también se denominan células pluripotenciales 2 . -Células madre específicas de tejido o células madre adultas: se encuentran en la mayoría de los tejidos de un individuo, y son capaces de originar las células de un órgano o tejido concreto tanto en el embrión, como en el adulto 3 , incluso de distintas capas embrionarias (endodermo, ectodermo o mesodermo). También se denominan células multipotenciales. En la actualidad, se han conseguido aislar células madre adultas a partir de la sangre, piel, grasa subcutánea, músculo cardíaco y esquelético, cerebro, retina, páncreas, etc 4,5 ; y se han podido cultivar tanto in vitro (en el laboratorio), como in vivo (en modelo animal) 6 . El ejemplo más paradigmático de células madre, es el de las células progenitoras hematopoyéticas (CPH), capaces de generar las distintas estirpes celulares del sistema sanguíneo y sistema inmune mediante un proceso llamado hematopoyesis, que tiene lugar fundamentalmente en la médula ósea (MO). Durante la hematopoyesis, las CPH se diferencian hacia un progenitor mieloide común o un progenitor linfoide común, los cuales, mediante los procesos de mielopoyesis y linfopoyesis van a diferenciarse hacia los diferentes subtipos celulares presentes en la sangre periférica (SP) (Figura 1). Alicia Báez Palomo Ambos son procesos opuestos regulados por la interacción de citocinas, quimiocinasy proteasas (Figura 5). La movilización de las CPH se caracteriza por la disminución de moléculas de adhesión celular, principalmente del eje CXCR4/CXCL12. Por el contrario, el proceso de retorno a la MO requiere la regulación positiva de moléculas de adhesión celular y la activación de la vía de señalización CXCR4/CXCL12. Este proceso de retorno es un requisito indispensable para la proliferación de las CPH y de una importancia fundamental durante el desarrollo fetal y la homeostasis de las CPH en la edad adulta. 1.4.1. Agentes movilizadores de progenitores hematopoyéticos Sabemos que la mayoría de las CPH adultas se dividen infrecuentemente y, en su mayoría, se mantienen en el nicho hematopoyético en un estado de quiescencia; sin embargo, en respuesta a estrés o tras la administración de factores estimuladores de colonias son capaces de proliferar, y retornar a su estado latente tras la desaparición del estímulo. La movilización de CPH mediante factores estimuladores de colonias se lleva a cabo desde los años 80 33-36 , y en la actualidad se emplea en el TPH para tratar diversas enfermedades hematológicas. Las CPH circulan en la SP en números muy bajos (0,010,05%), por lo que la movilización es necesaria para aumentar el número de CPH en la circulación periférica, hasta 100 veces. Aunque existen diversos factores movilizadores como el GM-CSF, AMD3100, SCF, Gro-β o Gro-βT, la citoquina más comúnmente usada en la clínica para la movilización de CPH es el factor estimulador de colonias granulocíticas o G-CSF. Figura 6. Estructura molecular del factor estimulador de colonias granulocíticas (G-CSF) humano. INTRODUCCIÓN 13 El G-CSF es una glicoproteína de 174 aminoácidos, con un peso molecular de 18-22 kD (Figura 6) que es sintetizado de manera endógena principalmente en la MO, aunque también en pequeñas cantidades, por células formadoras de hueso u osteoblatos, monocitos, macrófagos, células vasculares endoteliales, fibroblastos, células mesoteliales y células del estroma de la MO, y circula en SP aunque en muy pequeñas cantidades; en suero puede ser detectado en un rango de <30-163 pg/mL. 1.4.2. Mecanismos de acción del G-CSF En la actualidad aún se desconocen muchos de los mecanismos moleculares a través de los cuales el G-CSF ejerce su efecto movilizador sobre las CPH. Entre ellos la modificación en la expresión de moléculas de adhesión y sus ligandos, que es clave en el proceso de movilización 37-39 . Durante este proceso, el G-CSF provoca un aumento de la expresión del gen CXCR4 por las CPH y una disminución de la expresión del gen SDF-1 en el estroma medular 37 . Esto induce la liberación de enzimas proteolíticas (elastasas, catepsinas y metaloproteinasas) por los neutrófilos al compartimento extravascular de la MO, que degradan e inactivan las adhesiones quimio-tácticas e interacciones responsables de anclar las CPH en el estroma medular (Figura 7). De este modo, las CPH se liberan a la SP. Figura 7. Mecanismo de movilización de las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) inducido por el factor estimulador de colonias granulocíticas (G-CSF). El G-CSF se emplea en todo el mundo en miles de pacientes y donantes todos los años y se considera un proceso seguro, como demuestran numerosos estudios donde los donantes tuvieron un seguimiento de hasta 10 años 40 . Aunque la inmensa mayoría de los donantes consideran que su estado general es bueno durante el período de seguimiento, se pueden Alicia Báez Palomo producir efectos secundarios tanto a corto como a largo plazo tras la administración del GCSF. Una proporción de donantes suele sufrir dolores óseos (>60%), dolores de cabeza (>20%), fiebre (3-4%), nauseas (2-10%) y sudores nocturnos, que suelen desaparecen en poco tiempo 40 . A largo plazoalgunos estudios han descrito un incremento en la incidencia de algunas hemopatías 41,42 . Sin embargo, estos datos no han sido corroborados por otros grupos 43,44 . Actualmente, la pregunta más importante, esto es, si la administración del G-CSF podría favorecer a largo plazo el desarrollo de hemopatías a través de alteraciones genéticas o epigenéticas, no puede ser contestada con certeza, si bien algunos estudios con un seguimiento >10 años ofrecen tranquilidad en este sentido. A pesar de ello, se ha demostrado que el G-CSF se comporta como una proteína anti-apoptótica 45 , porque las células tratadas con este factor de crecimiento poseen una vida media más prolongada. Se han identificado además mutaciones en el receptor del G-CSF en pacientes con neutropenia congénita severa 46 que provocan una excesiva proliferación celular tras estimulación con G-CSF, lo que puede contribuir al desarrollo de leucemia. Por otro lado, Nagler et al. 47 han descrito alteraciones epigenéticas y genéticas en linfocitos, y cambios en los patrones de expresión génica y de microRNAs (miRNAs) en las células mononucleadas y desestabilización del ADN tras la movilización con G-CSF. Estos hallazgos han generado cierta preocupación por la seguridad de los donantes. Sin embargo, como se ha mencionado, varios estudios publicados por distintos grupos 48-50 no describen una mayor incidencia de hemopatías. A pesar de todos los estudios publicados, hasta la fecha no se conocen los efectos que puede producir el G-CSF en los patrones de expresión génica de las CPH de donantes sanos y sus potenciales consecuencias a largo plazo. INTRODUCCIÓN 15 2. LINFOCITOS B Los linfocitos B (LB) son las células responsables de la secreción de anticuerpos proporcionando inmunidad humoral frente a infecciones. También desempeñan otras funciones como la presentación de Ag a los LT, regulación negativa de las respuestas inflamatorias y regulación de las respuestas frente a auto-antígenos. Los linfocitos maduros producen anticuerpos de distintos isotipos que se distribuyen y localizan en distintos compartimentos de nuestro organismo y desencadenan distintas funciones efectoras como la activación del complemento, y diversas respuestas celulares, como la fagocitosis de microorganismos e inmunocomplejos y la exocitosis de mediadores y citotoxinas. 2.1. Desarrollo del linfocito B El desarrollo de los LB tiene lugar en dos etapas que se localizan en diferentes tejidos: -Etapa antígeno-independiente: tiene lugar principalmente en el hígado fetal y en la MO fetal y adulta 51 . En ella se produce la diferenciación de los progenitoresde las células B (pro-B) en linfocitos B maduros naive (LBN). -Etapa antígeno-dependiente: tiene lugar en los órganos linfoides secundarios (gánglios linfáticos, bazo y tejido linfoide asociado a las mucosas) 52,53 . En ella se produce la activación de los LBN mediada por Ag, y su diferenciación a LB de memoria (LBM) y/o a linfocitos efectores. El tráfico de los distintos subtipos de células B entre los tejidos linfoides primarios y secundarios refleja el estado inmunede un individuo, así como los trastornos en el desarrollo de células B, auto-inmunidad, y enfermedades linfoproliferativas relacionadas con la biología y homeostasis de las células B. 2.1.1. Etapa antígeno-independiente: La marca característica del desarrollo de los LB medulares es el reordenamiento organizado de los segmentos génicos que codifican la porción variable de la molécula de inmunoglobulina (Ig). La Ig de superficie celular consiste en dos cadenas pesadas (µ, δ, γ, α o ε) y dos cadenas ligeras (κ o λ) unidas covalentemente mediante puentes disulfuro intracatenarios (Figura 8). Alicia Báez Palomo Figura 8. Estructura molecular de la inmunoglobulina de superficie celular Las Ig de superficie funcionan como receptores para Ag de las células B (BCR). La unión del Ag a estos receptores desencadenan la respuesta inmune antígeno-específica al iniciar el proceso de activación celular que permitirá la diferenciación de los LB en células plasmáticas (CP) secretoras de anticuerpos. Basándose en el estado génico de las cadenas del BCR y la expresión de una gran variedad de proteínas de superficie e intracelulares, se han identificado cinco fases principales en esta etapa: pro-B, pre-BI, pre-B-II, LB inmaduro y naive 54 (Figura 6). Figura 6. Fases del proceso de diferenciación de los linfocitos B humanos en los distintos tejidos, médula ósea (MO), sangre periférica (SP), y tejidos linfoides. INTRODUCCIÓN 17 Durante las primeras fases en la diferenciación de las células B, las células pro-B comprometidas establecen interacciones VLA-4/VCAM-1 y c-kit/SCF con las células del estroma medular 55 . Las células pro-B no son totalmente precursoras del linaje B hasta que migran a un nicho diferente que contiene células que expresan interleuquina-7 (IL-7) 56 . La interacción de IL-7 con su receptor CD127, expresado por las células pro-B, promueve la síntesis de varios factores de transcripción (PAX-5, PU.1, EBF-1, E2A) que a su vez inducen la síntesis de la enzima deoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) y de las recombinasas Rag1 y Rag2, necesarias para iniciar la recombinación somática entre los segmentos génicos de diversidad (D) y de unión (J) de la cadena pesada de la Ig (IgH) 57 . Una vez que el proceso de recombinación somática ha tenido lugar, las células pro-B pasan a ser células pre-BI. En estas células se completa el reordenamiento de la IgH con la unión a D-J de un segmento de la región variable (V) 58 (Figura 7). Este mecanismo de reordenamiento génico combinatorio permite la generación de un BCR específico y distinto en cada LB individual, generándose así una población de LB con receptores muy diversos, lo que permite reconocer a una amplia variedad de Ag. Las células pre-BI que realizan un reordenamiento productivo de los genes de la IgH pasan a ser células pre-BII. Estas células consiguen generar un exón VDJ funcional que se transcribe y da lugar a la generación de una proteína que será la cadena pesada del BCR. Figura 7. Esquema del proceso de reordenamiento y transcripción de los genes de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Alicia Báez Palomo En este momento, se intercala el primer punto de control. Se activan una serie de genes, (λ5 y Vpreβ) que codifican una “pseudocadena ligera”, cuyo cometido es comprobar si la IgH generada será capaz de acoplarse con una cadena ligera verdadera. Si no se supera este punto de control, la célula puede emprender varías vías: intentar un nuevo reordenamiento con el otro alelo, o bien la muerte celular programada por apoptosis 59 . Cuando se produce el acoplamiento de la IgH y la pseudocadena ligera, el complejo formado se expresa como un pre-receptor en la membrana celular. A continuación, las células pre-BII proliferan e inician el proceso de recombinación somática entre los segmentos V y J de la cadena ligera de la Ig (IgL), del mismo modo que en la IgH (a excepción de la recombinación con el segmento D, puesto que las IgL no poseen). Aquí encontramos el segundo punto de control. Si la IgL generada es capaz de asociarse a la IgH, la célula detiene los reordenamientos; pero si no es capaz de asociarse, se producen sucesivos reordenamientos VJ con el mismo alelo. Si el fallo persiste, se producen reordenamientos en el otro alelo. En el momento que la célula expresa una molécula completa de IgM en su membrana, pasa a ser una célula B inmadura 60 . En este momento se establece el tercer punto de control del proceso de diferenciación. Las células que producen BCR funcionales y no auto-reactivos (no reaccionan con los Ag presentes en la MO) son seleccionadas y se convierten en LBN, mientras que las células que no los producen son eliminadas o reprogramadas 58,61 . 2.1.2. Etapa antígeno-dependiente: Los LBN dejan la MO y circulan a través de los vasos sanguíneos hasta la zona de LT de los tejidos linfoides 62 . Si no encuentran un Ag, salen del tejido linfoide a través de los vasos linfáticos, y se quedan recirculando entre la SP y los tejidos linfoides hasta que mueren en pocos días. Sin embargo, si encuentran su Ag específico presentado por las células dendríticas, los LBN se activan y migran a un centro germinal (CG), formado por la zona oscura (donde residen los centroblastos) y la zona clara (ocupada mayoritariamente por centrocitos). En la zona oscura, los LBN activados experimentan una rápida proliferación, expansión clonal, hipermutación somática de las regiones V de la Ig y recombinación de cambio de clase de isotipo de la IgH. Aquellas células B que no completan bien este proceso entran en apoptosis, el resto van a la zona clara del CG donde aumentan la afinidad del BCR con su Ag (Figura 8). INTRODUCCIÓN 19 Figura 8. Esquema representativo del proceso de diferenciación de una célula B en el centro germinal. Cuando el LBN maduro y activado abandona el CG, puede diferenciarse en dos direcciones, hacia LBM o bien hacia CP. La propiedad fundamental del LBM es reconocer y recordar un Ag si este reaparece, mientras que la CP tiene una alta capacidad de secreción, pudiendo producir mil millones de moléculas de BCR en una hora. En la diferenciación a LBM, los LBN maduros adquieren una gran afinidad de unión al Ag 53 , a la vez que modifican el patrón de expresión de numerosos genes. Aunque los LBN y LBM circulan por la SP, muchos de los LBM residen también en lugares de drenaje de Ag, como la zona marginal del bazo y los folículos linfoides, el epitelio de las mucosas y las amígdalas, mientras que los LBN recirculan constantemente entre los diferentes tejidos linfoides 63,64 . En la SP, los LBN comprenden aproximadamente el 60-70% de las células B circulantes, carecen de mutaciones somáticas en la región IgV, y coexpresan simultáneamente IgM e IgD 64,65 . Por el contrario, los LBM constituyen del 20-30% de todas las células B de SP, han sufrido fenómenos de hipermutación somática y muestran una región IgV mutada; además, aproximadamente la mitad de ellos han sufrido el cambio de isotipo de IgH, reflejado por la expresión de IgA e IgG en el 23±10% y el 21±9% de los LBM circulantes del adulto, respectivamente 66 . La otra mitad de los LBM coexpresan IgM e IgD (52±15% de las células de memoria). A diferencia de los LBN, de vida más corta, los LBM tienen una larga vida media, y son capaces de permanecer viables en estado no proliferativo durante años, por ello Alicia Báez Palomo expresan genes implicados en supervivencia celular y factores anti-apoptóticos, mientras que reprimen la expresión de genes relacionados con proliferación y con activación del ciclo celular. Los LBN expresan niveles elevados de factores de transcripción importantes en el mantenimiento de la quiescencia, como PLKZ, KLF4, KLF9, p21 y FOXO1A 67 , mientras que los LBM expresan niveles elevados de factores anti-apoptóticos como Bcl-2, A1 y Mcl-1 implicados en la longevidad celular 68 (Figura 9). Por otro lado, en la SP de adultos sanos se detecta la presencia de un pequeño número de células con características morfológicas, fenotípicas y funcionales similares a las de las CP 69,70 que representa aproximadamente el 1-3% de todas las células B de SP. Se cree que la mayoría de estas células son plasmablastos (PB) que han pasado a la SP desde los tejidos linfoides secundarios, dirigiéndose a un nicho de MO, tejido linfoide asociado a mucosas o a tejidos inflamados. Además de estos PB circulantes, en condiciones de activación inmune, también podrían detectarse en la sangre CP maduras que han abandonado la MO y las mucosas. Al contrario que las CP de MO que son Ig negativas, más del 75% de los PB/CP circulantes expresan Ig de forma débil 71 . Las CP secretoras de Ig representan el estadio final de la transformación antigénica de las células B. Entre los factores que inducen el paso de LBN a CP se encuentran los ligandos de CD27 y la IL-10. Las CP pierden la expresión de Ig de superficie, siendo por tanto incapaces de reconocer Ag, limitándose sólo a producir más o menos cantidad de anticuerpos solubles. El factor inductor de una mayor o menor producción de Ig es el microambiente combinado con mediadores solubles presentes en la MO. Durante la diferenciación a CP, estas células modifican su patrón de expresión génica, incrementándose la expresión de genes relacionados con proliferación celular y activación del ciclo celular, y disminuyendo la de genes relacionados con supervivencia y factores anti-apoptóticos (justo lo contrario que el LBM). La diferenciación a CP es iniciada por la inducción del gen BLIMP-1, un represor transcripcional que promueve el desarrollo de estas células 72 reprimiendo la expresión de los genes responsables de la “identidad” de las células B, como PAX-5, BCL6 y Spi-B (Figura 9). Por otro lado, el gen XBP-1, inducido en respuesta a estrés en el retículo endoplasmático, se expresa a niveles elevados en las CP 73 y es esencial para la inducción del fenotipo secretor de estas células. Recientemente, IRF-4 también ha sido identificado como uno de los genes esenciales para la diferenciación de CP 74 . INTRODUCCIÓN 21 Figura 9. Regulación de la expresión génica durante el proceso de diferenciación de un linfocito B de memoria a una célula plasmática. Alicia Báez Palomo los pacientes diagnosticados de MM albergan una mutación en el gen BRAF. Este gen codifica una serina/treonina proteína quinasa mutada en muchos tipos de cáncer 105 . Este hallazgo tiene una especial relevancia clínica, ya que los pacientes de MM con mutaciones en el gen BRAF podrían beneficiarse del desarrollo de nuevas drogas basadas en inhibidores de BRAF, que en algunos casos han demostrado tener una buena eficiencia clínica 106 . JAK-STAT: la vía de señalización JAK-STAT se encuentra activada en el 50% de los casos de MM, así como en una proporción de células estromales de la MO circundantes 107 . La principal inductora de esta vía es IL-6, una citoquina clave en el proceso de mielomagénesis 108 . Una de las principales consecuencias de la activación de esta vía es la hiperactividad de STAT3, un factor de transcripción de la familia STAT que resulta de la sobreexpresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL 109 , correlacionada con la quimiorresistencia en pacientes con MM. La inhibición del gen STAT3 con diversos compuestos y el inhibidor de la quinasa JAK2, están asociados con la inhibición in vitro de la supervivencia de las CPm inducida por IL-6 110,111 . PI3K: la IL-6 e IGF-1 actúan sobre receptores de tirosina quinasa que activan la vía de señalización de PI3K, que conduce a la fosforilación de la quinasa AKT, la cual activa posteriormente varias vías como mTOR, GSK-3B y FKHR, que participan en muchos procesos celulares, incluyendo proliferación celular y resistencia a la apoptosis. La desregulación de la vía PI3K a través de la fosforilación de AKT fosforilada 112 , se observa en aproximadamente el 50% de los casos de MM. Sin embargo, a diferencia de la vía MAPK, la vía PI3K ese encuentra rara vez mutada en el MM. Sin embargo, es la vía más conocida y de más interés dentro de la investigación de la patogénesis de la enfermedad. Desregulación del ciclo celular: junto a la sobreexpresión de los genes de ciclina D en el MM, la pérdida de la función de genes reguladores del ciclo celular también resulta ser un evento clave que desestabiliza la regulación del ciclo celular. La represión del gen CDKN2C o la inactivación de CDKN2A a través de cambios en la metilación del ADN pueden desregular la transición de las fases G1/S, ya que estos genes codifican inhibidores de quinasa dependientes de ciclina 113 . INTRODUCCIÓN 29 Reparación del ADN defectuoso: la inestabilidad cromosómica es un evento muy característico del MM y contribuye a la acumulación de aberraciones genéticas durante la progresión de la enfermedad. A pesar de ello, no se han demostrado mutaciones en genes de reparación del ADN, como PARP1. Sin embargo se están evaluando inhibidores de PARP en algunos ensayos clínicos 114 . Esta actividad es especialmente prominente en los cánceres con recombinación homóloga defectuosa mediada por mecanismos de reparación del ADN. Edición defectuosa del ARN: un estudio reciente reveló que cerca de la mitad de 38 casos de MM estudiados contenían mutaciones en genes implicados en el procesamiento del ARN, la traducción de proteínas y la respuesta de las proteínas mal plegadas. Cuatro mutaciones diferentes de DIS3, un gen que codifica una exonucleasa que actúa como el componente catalítico del complejo exosoma involucrado en la regulación de la abundancia de especies de ARN 115 , fueron observadas en 11% de las muestras de pacientes. Varios estudios han demostrado que el exosoma juega un papel vital en la regulación del pool de ARN mensajero (ARNm) disponible para la traducción 116 , e indican que la pérdida de la actividad del gen DIS3 podría contribuir al proceso de mielomagénesis a través de la desregulación de la traducción de proteínas. Respuesta a proteínas mal plegadas (UPR): es un evento esencial para la homeostasis celular de las CP, dada la ingente producción de Igs que llevan a cabo. Un 8% de las mutaciones de UPR corresponden al gen LRRK2, una serina/treonina quinasa responsable de la fosforilación de la proteína de unión 1 del factor de iniciación de la traducción eucariótica 4E (EIF4EBP1). También se han visto mutaciones, aunque a una frecuencia más baja (3%), en el gen XBP1. Varios estudios sugieren que cuando XBP1 se encuentra sobreexpresado induce un síndrome parecido al MM 117 , mientras que cuando está reprimido las células B son capaces de proliferar y construir centros germinales, sin embargo son incapaces de diferenciarse en CP secretoras de Ig 118 . Diferenciación anómala de las CP: el gen IRF4 está implicado en la regulación de la transcripción del interferón, mientras que también desempeña un papel importante en la proliferación y diferenciación de las células B. Curiosamente, un estudio reciente reveló que IRF4 es necesario para la supervivencia de las líneas celulares de MM 119 . IRF4 Alicia Báez Palomo también actúa como factor de transcripción de BLIMP1, un gen que desempeña un papel clave en la diferenciación de las CP. Algunos estudios sugieren que la pérdida de función de alguno de estos dos genes podría tener una gran relevancia en la patogénesis del MM, ya que se conoce en otras enfermedades hematológicas como el linfoma difuso de células B 120 . 3.2.5. Cambios epigenéticos El estudio de la epigenética es un campo emergente en el MM y está demostrando una influencia cada vez mayor en la patogénesis de la enfermedad 121 . Existen tres grandes áreas principales en la regulación epigenética (Figura 14): Figura 14. Mecanismos principales de regulación epigenética: ARN de interferencia, modificaciónde las histonas y metilación del ADN. Círculo rosa=grupo acetilo, círculo morado=grupo fosfato, círculo rojo=grupo metilo, círculo azul= grupo carboxilo, círculo verde=ubiquitina, círculo naranja=extremo amino terminal, k=lisina, E=ácidoglutámico, S=serina, H2A=histona2A, H2B= histona 2B, H3=histona 3, H4=histona4 (modificada de Steven M. Prideaux, Adv Hematol 2014). Metilación del ADN: los cambios de metilación del ADN se producen en las “islas” CpG que se encuentran generalmente con mayor frecuencia en las regiones promotoras, INTRODUCCIÓN 31 secuencias repetidas y elementos trasponibles. Por tanto, estos cambios de metilación actúan regulando la expresión génica, contribuyendo al desarrollo y a la diferenciación celular, así como a la progresión de muchos tipos de cáncer. El genoma del MM, sigue con frecuencia un patrón conocido de metilación formado por ADN global hipometilado y genes específicos hipermetilados, el cuál va sufriendo cambios con la progresión de la enfermedad 122 . Los cambios más significativos en la metilación del ADN que influyen en la supervivencia celular, progresión del ciclo celular y reparación del ADN, se han observado en tumores con t(4;14) 123 , en relación con la sobreexpresión del gen MMSET. Modificación de las histonas: Otros genes implicados en la metilación y modificación de la cromatina también se encuentran desregulados en el MM, incluyendo HOXA9, KDM6A y MLL. HOXA9 está regulado principalmente por una histona metiltransferasa y codifica un factor de transcripción de unión al ADN que contribuye a la regulación de la expresión génica, la morfogénesis y la diferenciación celular. En este sentido, varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de HOXA9 produce mutaciones en varios genes: MLL, MLL2, MLL3 y MMSET 124 . Estos hallazgos indican que la expresión de HOXA9 tiene un papel en la patogénesis del MM y que los cambios epigenéticos en este gen pueden representar nuevas dianas terapéuticas en la enfermedad. Cambios en miRNAs: Los miRNAs son un grupo de pequeñas moléculas de ARN no codificantes, de tamaño entre 19-22 nucleótidos, productos del procesamiento secuencial de transcritos de la ARN polimerasa II mediados por 2 enzimas endonucleasas ARNasaIII, llamadas Drosha y Dicer. Los miRNAs regulan la expresión génica a un nivel postranscripcional; a partir de su unión a la región 3’ UTR del ARNm diana, pueden llevar a la inhibición de la traducción del gen o la degradación proteica en función de su complementariedad (Figura 15). De este modo los miRNAs están involucrados en muchos procesos biológicos incluyendo desarrollo, diferenciación, proliferación y muerte celular 125 . Varios estudios han demostrado que los miRNAs pueden actuar tanto como supresores de tumores como oncogenes en diversos tipos de cáncer, incluyendo el MM, donde se han podido identificar varios miRNAs expresados diferencialmente 126,127 , así como qué cambios en los miRNAs pueden desregular genes y vías relevantes en la patogénesis de la enfermedad, incluyendo genes implicados en la progresión del ciclo celular como TP53 y MYC 128,129 . Todos estos datos apuntan a que la desregulación de los Alicia Báez Palomo miRNAs podría contribuir a la represión o inducción de genes implicados en la patogenicidad del MM. Figura 15. Regulación del ARNm mediada por microRNAs (modificada de Discover Magazine, 2009) 3.3. Origen de la célula stem mielomatosa Actualmente no se conoce la verdadera naturaleza y fenotipode la célula stem mielomatosa y además existe mucha controversia al respecto.La identificación precisa de ésta célula puede permitir el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que inhiban el crecimiento tumoral, retrasar la recaída de los pacientes, y a largo plazo mejorar la supervivencia global. A pesar de la utilización de nuevos fármacos altamente eficaces especialmente en cuanto a la tasa de respuestas alcanzada, la práctica totalidad de los pacientes termina por recaer, lo que se debería a la persistencia de una célula stem mielomatosa quiescente resistente al tratamiento convencional e incluso al trasplante. La secuenciación del gen V de IgH ha mostrado que las CPm son células post-germinales 130 , que han completado el proceso de hipermutación somática y han sufrido el cambio de isotipo, y que circulan por la SP migrando finalmente a la MO, donde bajo la influencia del micromedioambiente medular se produce su diferenciación a CP madura 131 . Lo que podría corresponderse con un LBM. Del mismo modo, basado enla expresión de antígenos tales como CD19, CD27 o CD138, algunos autores han sugeridoque el clon neoplásico se originaa partir de un LBM 132 . De hecho,estudios in vivo han demostrado que las células B clonotípicas CD138 - aisladas de un INTRODUCCIÓN 33 paciente con MM avanzado pueden generar enfermedad en ratones NOD/SCID 133 , mientras que las CP CD138 + son incapaces de producir un crecimiento clonogénico significativo 134,135 . Sin embargo, hasta la fecha estos datos no han sido verificados por otros grupos 136 , algunos de los cuales sugieren incluso un origen más inmaduro como la célula pro-B 137 , ni se han realizado estudios de expresión génica comparando los patrones de expresión de una CPm con un LBM, con el fin de determinar el posible origen de la célula stem mielomatosa. Hipótesis y Objetivos HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 37 HIPÓTESIS En relación a las CPH: 1. Las CPH empleadas en el TPH tienen distintas características biológicas según su origen (CU, MO o SP movilizada) que pueden relacionarse con diferencias a nivel de expresión génica y de miRNAs. La identificación de diferentes patrones de expresión entre las distintas fuentes de CPH podría tener implicaciones clínicas y explicar, al menos en parte, las diferencias observadas en la evolución de los pacientes tras trasplante. 2. El G-CSF puede modificar los perfiles de expresión génica y de los miRNAs de las CPH movilizadas a largo plazo, dando lugar a cambios que podrían afectar a sus características biológicas de forma persistente. En relación a las células B: 3. Dada la larga vida media de los LBM, éstos podrían ser más susceptibles al desarrollo de modificaciones en su perfil de expresión génica relacionadas con la edad en comparación con otras células de vida más corta como los LBN. 4. La CPm podrían mantener un perfil de expresión génica “asincrónica”similar, al menos en parte, a un LBM, lo que contribuiría a su supervivencia a largo plazo pero, al mismo tiempo, adquirirían características funcionales, fenotípicas y genéticas de una CP en términos de activación. subcutaneous G-CSF administration (Filgrastim 10 m g/kg, once daily) (G-PB). CB samples were obtained from umbilical cord units not used for HSCT from the Gynecology and Obstetrics Departmentof the University Hospital Virgen del Rocío, Seville. Samples from BM, PB, and G-PB were collected from donors included in the allogeneic HSCT program at the hospital’s Hematology Department. The hospital’s Ethics Committee provided Institutional Review Board approval for this study, and informed consent was obtained from all donors in accordance with the Declaration of Helsinki. Isolation of HPCs Mononuclear cells were collected from all samples by density-gradient centrifugation with Ficoll-Paque solution (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). The CD34 þ cells were isolated in an AutoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) by positive immunomagnetic selection using the CD34 MACS microbead Human Kit (Miltenyi Biotec). Further, for higher-purity isolation, CD34 þ cells were sorted by flow cytometry (MoFlo, Beckman Coulter, Brea, CA). For this purpose, cells were incubated with the monoclonal antibodies CD34-PE and CD45-FITC (BD Figure 1. miRNA expression by HPC source. Unsupervised hierarchical cluster analysis performed with the miRNAs differentially expressed in HPCs from G-PB, BM, and CB. Each numbered column represents an individual sample, and each row represents a single miRNA. Red and green indicate miRNA expression levels in logarithmic scale. Statistical analysis was performed using the nonparametric Kruskal-Wallis test. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639 631 Biosciences, San Jose, CA) for 20 minutes in darkness and at room temperature. Populations were selected based on the intensity of antibodies, as well as forward-scatter and side-scatter components. Dead cells were discarded before separation. The purity of the isolated CD34 þ cells exceeded 95% in all cases. RNA Extraction Total RNA was extracted by TRIsure (Bioline, Luckenwalde, Germany) in all samples. RNA quality and integrity were verified with the Bioanalyzer 2100 system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A RNA integrity number >7.5 was required for further analyses of gene expression profiling. miRNA Expression The expression profiles of 384 miRNAs were analyzed in samples of CD34 þ cells from CB, BM, and PB/G-PB. Total RNA (150 ng) was reversetranscribed using the miRNA TaqMan Reverse-Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). cDNA was loaded on to the TaqMan Human MicroRNA v2.0 Arrays (Applied Biosystems), which were subsequently analyzed on a 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). SDS 2.3 and RQ Manager 1.2 software (both from Applied Biosystems) were used for the array analyses. Undetectable miRNAs were excluded for further analyses. Data were normalized using the average of the endogenous smallnucleolar RNU48 and the noncoding small nuclear U6, both included in the array. The CD34 þ cell samples from PB served as the control group. miRNA expression levels were obtained by the 2  DD CT method. Gene Expression We analyzed the whole genome expression profile in the same samples using the Whole Human Genome Oligo Microarray Kit 4 44K (Agilent Technologies). Total RNA (200 ng) was reverse-transcribed to cRNA and labeled with the two-color Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies). cRNA quality and integrity were verified with the Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies). Each analyzed sample was labeled with cyanine 5 and hybridized against a pool of cyanine 3elabeled RNA of CD34 þ cells from PB as the reference group. The microarrays were scanned in a GenePix Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Validation of Significant Genes The expression of significant genes was validated by quantitative realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR) using Quantitec Primer Assays and the Quantitec SYBR green Kit (both from Qiagen, Hilden, Germany) in a 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Data were normalized to the housekeeping gene b -ACTIN, and the same group of samples of CD34 þ cells from PB used for the hybridization experiments served as a control. The relative gene expression levels were calculated using the 2  DD CT method. Engraftment Data Data on platelet and neutrophil recovery after HSCT with G-PB and BM were obtained from the recipients’clinical flow charts. Data on engraftment after HSCT with CB were obtained from a series of 6 patients undergoing CB transplantation at our institution in the same time period as those undergoing G-PB and BM transplantations. None of the CB samples analyzed for gene and miRNA expression in the present study was used for clinical purposes. Day of platelet engraftment was defined as the first day with a stable count >20 10e9/L without transfusion and neutrophil engraftment was defined as the first day with a stable count >0.5 10e9/L. Statistical Analysis Unsupervised hierarchical clustering of miRNA and gene expression data were performed using average linkage and Euclidean distance. miRNAs and genes differentially expressed among the different HPC sources were identified using the nonparametric Kruskal-Wallis test. To obtain positive and negative expression values, data were transformed to logarithmic scale. All analyses were performed using MultiExperimentViewer 4.7.1. Functions of the miRNAs and genes of interest were determined from various online databases (http://www.targetscan.org,http://www.mirbase.org,http:// www.geneontology.org, and http://www.ingenuity.com). Intragroup differences in gene expression determined by qRT-PCR and in kinetics of engraftment based on clinical parameters were assessed by ANOVA with Bonferroni post hoc adjustment. Western Blot Analysis For protein preparation, CD34 þ cells from G-PB, BM, and CB were homogenized in ice-cold 20 mM Tris buffer (pH 7.3), containing 2 mM Dithiothreitol,1% Amidosulfobetaine,1% nonyl phenoxypolyethoxylethanol, 150 mM NaCl, 1 mM Na 3 VO 4 , 10 mM NaF (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) and 10% protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany). Homogenized samples were incubated at 4  C for 30 minutes and then centrifuged at high speed in a microcentrifuge, after which protein-containing supernatant was collected. Protein concentration was determined using the Pierce BCA Protein Assay KiteReducing Agent Compatible (Thermo Scientific, Rockford, IL). From each sample, 15 m g of protein was separated by electrophoresis on sodium dodecyl sulfateepolyacrylamide gels and electroblotted onto polyvinylidene fluoride membranes. Blots were incubated in TTBS blocking solution (2% BSA in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20), followed by overnight cold incubation with the following antibodies: anti-HSPA1A (ab5439; Abcam, Cambridge, UK), anti-CRLF3 (ab103540; Abcam) and antie b -actin (ab6276; Abcam). The membranes were then washed with TTBS and incubated with either a horseradish peroxidase (HRP)-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody (711-035-152; Jackson ImmunoResearch, Baltimore, MD) or HRP-conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (715035-150; Jackson ImmunoResearch). Antibody detection was performed with an enhanced chemiluminescence reaction (Western Blot Luminol Reagent; sc-2048; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). RESULTS miRNA Expression in HPCs from BM, CB, and G-PB miRNA expression profiles were determined in CD34 þ cells from PB, G-PB, BM, and CB. Out of 384 miRNAs, 72 were undetectable across all samples and were excluded from further analysis. We performed unsupervised hierarchical clustering comparing the miRNA expression of HPCs from BM, CB, and G-PB with respect to the PB samples. The obtained cluster identified 2 groups, 1 group comprising the GPB samples and the other group comprising the BM and CB samples, suggesting that HPCs from BM and CB have similar Table 1 miRNA Expression Levels miRNA Relative Expression (Log Ratio) PValue G-PB CB BM hsa-miR-517c 3.31 2.59 6.00 .002 hsa-miR-130a 2.28 7.59 10.92 .004 hsa-let-7g 0.91 4.13 1.07 .004 hsa-miR-222 0.75 9.34 7.79 .002 hsa-miR-142-3p 0.64 9.95 11.09 .006 hsa-miR-125a-3p 0.58 4.38 7.72 .007 hsa-miR-93 0.54 1.85 2.14 .007 hsa-miR-10a 0.22 8.39 7.70 .003 hsa-miR-92a 0.18 14.00 13.45 .002 hsa-miR-125a-5p 0.04 5.55 6.16 .003 hsa-miR-129-3p 0.10 1.15 7.03 .003 hsa-miR-519d 0.10 5.87 3.02 .003 hsa-miR-105 0.10 6.25 7.64 .002 hsa-miR-133b 0.10 6.43 6.11 .004 hsa-miR-127-5p 0.10 7.73 4.63 .002 hsa-miR-10b 0.10 8.12 9.01 .003 hsa-miR-9 0.10 9.65 11.07 .002 hsa-miR-22 0.10 16.75 17.46 .003 hsa-miR-106b 0.11 5.21 7.00 .001 hsa-miR-20a 0.13 2.20 0.05 .008 hsa-miR-532-5p 0.20 3.67 1.25 .008 hsa-miR-221 0.21 7.41 10.75 .002 hsa-miR-106a 0.30 15.68 19.02 .002 hsa-miR-323 0.35 12.85 12.96 .003 hsa-miR-126 0.62 7.52 5.71 .001 hsa-miR-142-5p 0.69 4.43 5.90 .003 hsa-miR-411 0.77 5.11 2.43 .001 hsa-miR-335 1.10 2.95 0.98 .006 hsa-miR-140-5p 1.23 3.70 1.39 .005 hsa-miR-141 1.35 9.18 10.28 .002 hsa-miR-107 1.38 9.08 10.72 .001 hsa-miR-27a 1.56 1.14 0.29 .009 hsa-miR-320 1.56 11.11 9.50 .002 hsa-miR-103 1.73 3.86 2.00 .003 hsa-miR-143 2.23 5.83 7.28 .002 hsa-miR-128 3.95 0.32 3.02 .007 Statistical significance: P<.01. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639632 miRNA expression patterns that differ from the pattern seen in HPCs from G-PB. miRNAs differentially expressed in the different HPC sources were identified using the nonparametric KruskalWallis test. All miRNAs with a Pvalue <.01 were considered significant. Figure 1 shows unsupervised hierarchical clusters including only the differentially expressed miRNAs. We identified 36 miRNAs with expression levels varying among the different sources. Among these, 25 miRNAs were overexpressed and 9 were underexpressed in HPCs from GPB, whereas 18 miRNAs were overexpressed and 18 were underexpressed in HPCs from BM and CB. Moreover, HPCs from BM and CB displayed no significant differences in the expression pattern for 30 miRNAs (Table 1). Among the miRNAs differentially expressed in HPCs from G-PB, miR103, miR106a, miR125a-5p, miR126, miR140-5p, miR20a, miR221, and miR320 were overexpressed, whereas these miRNAs appeared underexpressed in both BM and CB. In contrast, miR93 was underexpressed in HPCs from G-PB and overexpressed in the other 2 HPC sources. All of these Table 2 Gene Expression Levels Gene Relative Expression (Log Ratio) PValue G-PB CB BM MPO 2.44 1.31 0.24 .009 BIRC5 1.31 0.52 1.29 .003 IGLL1 1.31 1.21 0.80 .008 KIAA0101 1.10 0.30 1.13 .006 ZWINT 0.89 0.47 1.25 .005 PHIP 0.66 0.44 0.90 .005 TYMS 0.61 0.59 1.52 .004 TUBB2A 0.53 0.09 0.42 .003 ZFP91 0.48 1.05 0.87 .007 SVOPL 0.39 1.16 0.43 .009 PDE4B 0.36 1.64 1.09 .007 ABCB9 0.32 2.63 1.07 .007 GHDC 0.06 0.66 0.27 .006 ZNF776 0.13 0.92 0.63 .009 IDS 0.38 0.63 1.24 .004 DPYSL3 0.68 0.25 0.55 .007 NR1H3 0.69 0.60 0.96 .007 GABRA1 0.70 0.69 0.09 .008 HSP90AA2 0.77 0.41 0.17 .005 AHNAK 0.82 0.25 1.68 .001 CIRBP 0.82 0.02 1.12 .003 TPM2 0.86 0.13 0.67 .006 HIST2H2BE 0.92 0.52 0.77 .003 LMNA 0.93 0.92 0.60 .003 HOXA9 0.94 0.01 0.87 .007 SIPA1L1 1.05 0.53 0.51 .003 CCR3 1.11 0.67 0.64 .008 NKG7 1.15 1.29 0.45 .008 NEAT1 1.17 0.71 0.49 .006 TMX3 1.18 0.92 0.10 .006 ACAA1 1.19 1.17 0.97 .003 CRLF3 1.19 1.37 0.22 .004 ZBTB20 1.31 0.44 0.39 .008 NACAD 1.35 0.66 0.49 .003 COL12A1 1.38 0.06 1.45 .002 NKX2-1 1.43 0.13 0.93 .003 VNN2 1.89 0.33 0.40 .004 HIST2H2AA3 1.97 0.74 0.18 .003 ATP10D 2.13 0.46 0.43 .009 HIST1H2AC 2.58 0.58 0.63 .006 MIAT 2.65 0.18 0.22 .003 VMP1 2.74 0.90 0.28 .003 HSPA1A 4.30 0.12 1.18 .002 Statistical significance: P<.01. Figure 2. Gene expression by HPC source. Unsupervised hierarchical cluster analysis performed with the genes differentially expressed in HPCs from G-PB, BM, and CB. Each numbered column represents an individual sample, and each row represents a single gene. Red and green indicate gene expression levels in logarithmic scale. Statistical analysis was performed using the nonparametric Kruskal-Wallis test. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639 633 miRNAs are involved in control of the cell cycle, apoptosis, cell proliferation, differentiation, and immune response. Gene Expression in HPCs from BM, CB, and G-PB We performed high-throughput gene expression analysis of the same samples by microarray technology. Unsupervised hierarchical clustering comparing samples from G-PB, BM, and CB with PB samples identified 2 clusters,1 including G-PB samples and the other comprising BM and CB samples. This finding suggests that HPCs from BM and CB have similar gene expression profiles, whereas HPCs from G-PB have a different expression pattern. Genes differentially expressed among the different HPC sources were identified using the nonparametric KruskalWallis test. Differences in expression with P<.01 were considered significant. We identified 43 genes differentially expressed among the 3 sources (Figure 2). In HPCs obtained from G-PB, 30 genes were up-regulated and 13 were downregulated; in HPCs from CB, 25 genes were up-regulated and 18 were down-regulated; and in HPCs from BM, 18 genes were up-regulated and 25 were down-regulated (Table 2). Moreover, in HPCs from BM and CB, 28 genes exhibited the same expression pattern. Among the genes differentially expressed in G-PB were down-regulated genes GHDC,IGLL1,KIAA0101,PDE4B,PHIP, SVOPL,TUBB2A,TYMS,ZFP91, and ZWINT and up-regulated genes AHNAK,DPYSL3,GABRA1,HIST2H2BE,HOXA9,HSPA1A, IDS,LMNA,NACAD,NEAT1,NKX2-1,NR1H3,TPM2, and ZBTB20. Most of these genes are involved in regulation of the cell cycle, cell growth and proliferation, cell death and survival, cell differentiation, and immune response. Finally, to validate the high-throughput screening, we confirmed the expression of 6 genes (CRLF3,ZWINT,HSPA1A, VMP1,VNN2, and TMX3) out of the 43 differentially expressed Figure 3. Validation of significant genes. Expression levels of genes differentially expressed in HPCs from G-PB, BM, and CB relative to HPCs from PB as determined by qRT-PCR. Statistical analysis was performed with ANOVA. *P<.01. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639634 genes by qRT-PCR. A group of CD34 þ cell samples from PB served as a control. These genes were selected because each is representative of the different biological processes found in this study and because, according to online databases (http://www.targetscan.org and http://www.mirbase.org), all are targets of the differentially expressed miRNAs identified in this study. Our results verify that HPCs from G-PB had a different gene expression profile compared with HPCs from BM and CB. Expression of the genes up-regulated in HPCs from G-PB (CRLF3,HSPA1A,VMP1,VNN2, and TMX3) was higher compared with that of genes up-regulated in HPCs from BM and CB. In addition, a gene down-regulated in HCPs from G-PB (ZWINT) appeared to be up-regulated in HPCs from BM and CB (Figure 3). miRNA and Gene Expression Pattern in HPCs from G-PB We further analyzed the differences between HPCs from G-PB and HPCs from BM and CB through paired unsupervised analysis. We compared gene and miRNA expression profiles in CD34 þ cells from PB versus CB, BM, and G-PB using the nonparametric Mann-Whitney test. The differences in gene and miRNA expression with P<.01 were considered significant. Regarding gene expression profiles, we found no significant differences between HPCs from PB and HSCs from G-PB, BM, or CB (Figure 4A-C); however, we found more similarities in miRNA expression pattern of HPCs between PB and G-PB than between PB and BM or between PB and CB (Figure 5A-C). These results suggest that the differences in miRNA expression pattern of HPCs from GPB compared with HPCs from BM and CB might not be attributable to a direct effect of G-CSF on HPCs, but rather could be related to G-CSF’s effect on the detachment of HPCs from the hematopoietic niche. Protein Synthesis in HPCs from BM, CB, and G-PB We analyzed the expression of some proteins toverify the results observed in gene expression data by microarray technology and qRT-PCR. We performed Western blot analyses comparing the expression of CRLF3 and HSPA1A proteins in HPCs from G-PB, BM, and CB with respect to expression of b -actin. We chose these 2 proteins because their encoding genes were overexpressed in HPCs from G-PB compared with HPCs from the other 2 sources. Remarkably, both proteins had higher expression levels in HPCs from GPB than in HPCs from BM or CB (Figure 6A). These protein analyses were performed in replicate; expression levels are shown in Figure 6B and C. Engraftment To correlate the data for gene, miRNA and protein expression with the kinetics of engraftment, we evaluated the recovery of neutrophils and platelets in patients who underwent HSCT using the HPCs from BM and G-PB used in the gene and miRNA expression molecular analyses, as well as HPCs from CB (Table 3). In the case of CB, the clinical parameters were obtained from patients who underwent HSCT Figure 4. Gene expression pattern by HPC source versus PB. Unsupervised hierarchical cluster analysis was performed with the genes differentially expressed in G-PB versus PB (A), CB versus PB (B), and BM versus PB (C). Each numbered column represents an individual sample, and each row represents a single gene. Red and green indicate gene expression levels in logarithmic scale. Statistical analysis was performed using the nonparametric Mann-Whitney test. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639 635 with samples other than those used in the molecular experiments, because in this group of samples, the entire umbilical cord was used for RNA and protein preparation. As expected, patients who received HPCs from G-PB had significantly shorter median times to neutrophil and platelet recovery significantly shorter compared with patients who received HPCs from BM and CB (Table 4). DISCUSSION Previous studies have examined the biological properties of HPCs obtained from the 3 sources currently available for transplantation: BM, CB and G-PB [15,16]. Those studies focused on cloning efficiency, proliferation and response to cytokine stimulation, progeny, and recovery after HSCT, and reported a faster rate of recovery with the use of HPCs from G-PB; however, their data do not fully explain the different engraftment outcomes in the recipients of transplants of HPCs from these different sources. Although gene and miRNA expression profiles have been studied in hematologic cell lineages and in HPCs [17-21], the relationship between gene and miRNA expression and the properties of the HPCs obtained from the currently available Figure 5. miRNA expression pattern in HPC sources versus PB. Unsupervised hierarchical cluster analysis was performed with the miRNAs differentially expressed in G-PB versus PB (A), CB versus PB (B), and BM versus PB (C). Each numbered column represents an individual sample, and each row represents a single miRNA. Red and green indicate gene expression levels in logarithmic scale. Statistical analysis was performed using the nonparametric Mann-Whitney test. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639636 sources remains largely unknown. In this regard, we hypothesized that different patterns of gene and miRNA expression of HPCs in the G-PB, BM, and CB might have clinical implications and could explain, at least in part, the differing kinetics of engraftment observed after HSCT with these 3 types of HPCs. We found that gene and miRNA expression profiles of HPCs differ depending on their source: G-PB, BM, or CB. We observed that the gene and miRNA expression patterns of HPCs are similar in BM and CB, whereas HPCs fromG-PB have a unique expression profile. Of note, most of the differentially expressed genes and miRNAs are involved in the cell cycle and proliferation, which might explain the differing kinetics of engraftment observed after transplantation of HPCs from the 3 different sources. We first identified 36 miRNAs differentially expressed in the 3 sources of HPCs, most of which appeared to be overexpressed in HPCs from G-PB. Among these, 8 miRNAs were overexpressed only in HPCs from G-PB (miR103, miR106a, miR125a-5p, miR126, miR140-5p, miR20a, miR221, and miR320). Of note, these 8 miRNAs are involved in control of the cell cycle, decreasing apoptosis and promoting cell proliferation and differentiation [22-25]. In contrast, in HPCs from BM and CB, the same number of miRNAs were overexpressed and underexpressed, with similar expression patterns in both. We then identified 43 genes differentially expressed among the 3 sources of HPCs and again we found more differences in HPCs from G-PB compared with HPS from BM and CB. We identified 10 down-regulated genes (GHDC,IGLL1, KIAA0101,PDE4B,PHIP,SVOPL,TUBB2A,TYMS,ZFP91, and ZWINT) and 14 up-regulated genes (AHNAK,DPYSL3,GABRA1, HIST2H2BE,HOXA9,HSPA1A,IDS,LMNA,NACAD,NEAT1, NKX2-1,NR1H3,TPM2, and ZBTB20) only in HPCs from G-PB. The majority of these genes are related to the cell cycle, promoting cell proliferation, hematopoiesis, and the inmune response. Remarkably, 20 of these 43 differentially expressed genes are targets of the 36 miRNAs also differentially expressed in this study, based on information in the aforementioned databases (Table 5). Interestingly, the direction of the change in the expression of these target genes was opposite of that in the expression of miRNAs. Five of these target genes were upregulated only in HPCs from G-PB. AHNAK and HIST2H2BE are known to promote cell proliferation [26,27], whereas IDS participates in cellular secretion [28].HSPA1A and GABRA1 have important roles in inhibiting the apoptotic process when up-regulated [29,30]. In contrast, 8 target genes appeared to be down-regulated in HPCs from G-PB compared with HPCs from BM and CB. The down-regulation of KIAA010, ZWINT,PDE4B,ZFP91,TYMS, and IGLL1 could affect the cell cycle, cell proliferation, apoptosis, cell signaling and hematopoiesis [31-36], and the low expression of PHIP and GHDC could lead to defects in gene expression and the transcription process [37]. Figure 6. Protein expression by HPC source. (A) Western blot analysis of HSPA1A and CRLF3 proteins comparing HPCs from G-PB, BM, and CB. (B and C) Protein levels of HSPA1A (B) and CRLF3 (C) in HPCs from G-PB, BM, and CB normalized with respect to b -actin (n ¼2). Table 3 Graft Characteristics HPC Source Graft Characteristics CD3 þ T cells (10 6 /kg) CD34 þ cells (10 6 /kg) G-PB 245.3 7.71 6.2 0.57 BM 33.27 3.37 3.48 0.52 CB 13 1.48 0.2 0.06 Statistical analysis performed using ANOVA; P<.01 in all comparisons between groups. Table 4 Engraftment Data HPC Source Time to Recovery after HSCT, d Neutrophils >500 Platelets >20,000 Platelets >50,000 G-PB 16.0 0.84 11.8 0.37 14.8 0.86 BM 18.67 2.28 17.0 1.70 31.75 4.15 CB 21.3 2.5 29.7 2.67*39.5 2.5 Median time of neutrophil and platelet recovery in 6 patients after HSCT. Statistical analysis performed with ANOVA. * P<.01, CB versus G-PB or BM. Table 5 Target Genes Target gene Source miRNAs CRLF3 G-PB, BM, and CB miR10a, miR92a HSP90AA2 G-PB, BM, and CB miR130a VMP1 G-PB, BM, and CB miR103a, miR92a VNN2 G-PB, BM, and CB miR10a, miR125a-3p KIAA0101 BM and CB miR103, miR106a, miR20a, miR320 PHIP BM and CB miR103, miR126, miR320 ZWINT BM and CB miR106a, miR320 PDE4B BM and CB miR103, miR106a, miR20a, miR320 ZFP91 BM and CB miR103, miR106a, miR126, miR140-5p, miR20a, miR221, miR320 GHDC BM and CB miR103, miR221 TYMS BM and CB miR140-5p, miR20a IGLL1 BM and CB miR106a y miR221 TMX3 G-PB and CB miR106a IDS G-PB miR93 AHNAK G-PB miR93 BIRC5 BM miR519d ABCB9 CB miR27a HSPA1A G-PB miR93 HIST2H2BE G-PB miR93 GABRA1 G-PB miR93 Listed are differentially expressed genes among the different HPC sources regulated by the differentially expressed miRNAs. A. Báez et al. / Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 630e639 637 Overall, ourdata suggest that the genes expressed in HPCs from G-PB are involved in the cell cycle, promoting cell differentiation and proliferation. This may help explain the faster engraftment of G-PB HPCs after HSCT compared with HPCs from BM and CB. Validation of some of these target genes (CRLF3, ZWINT, HSPA1A, VMP1, VNN2 TMX3) by qRT-PCR indicates that HPCs from BM and CB have a similar gene expression pattern with respect to HPCs from G-PB. Most of the genes up-regulated in HPCs from G-PB had lower expression levels in HPCs from BM and CB. In addition, 1 gene, ZWINT, that was downregulated after mobilization appeared to be up-regulated in HPCs from BM and CB compared with HPCs from PB. Moreover, analysis of expression levels of the proteins encoded by 2 of these validated genes (HSPA1A and CRLF3) confirmed a different expression pattern in HPCs from G-PB compared with that in HPCs from BM and CB, as observed in gene and miRNA studies. In addition, to examine the differences between HPCs from G-PB and HPCs from BM and CB, we compared gene and miRNA expression profiles of HPCs from PB and HPCs from all 3 sources. We found no statistically significant differences in gene expression profile between HPCs from PB and HPCs from the G-PB, BM, or CB; however, the miRNA expression profile of HPCs from PB was closer to that of HPCs from G-PB than to that of HPCs from BM or from CB. This finding may suggest that the detachment of HPCs from BM stroma induced by G-CSF can alter their miRNA expression profile, up-regulating or down-regulating miRNAs not expressed in this manner in BM and CB. Finally, to correlate gene, miRNA, and protein expression data and clinical outcomes, we compared the kinetic of engraftment among patients undergoing HSCT with HPCs from G-PB, BM, or CB. As expected, neutrophil and platelet recovery was faster in the patients receiving G-PB HPCs. Although most of the difference in recovery has been attributed to the differing amounts of HPCs infused from each source, our data also suggest that these varying outcomes are a question not just of quantity but also of quality; that is, HPCs from different sources have differing biological properties, as demonstrated by the individual gene expression patterns. In summary, we have demonstrated significant differences in gene and miRNA expression profiles in HSCs from the different sources currently used in HSCT. The expression profile of HPCs from G-PB differs from that of HPCs from BM and from CB, which seem to have similar expression patterns. Future studies of specific genes and miRNA from the data generated in this study may provide insight into the biological processes that contribute to posttransplantation outcomes. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank the Gynecology and Obstetrics Department of the University Hospital Virgen del Rocío from Seville and Blanca Miranda from Biobank of Andalusian Public Health System for supply CB samples. Special thanks to Francisco Márquez, Ricardo Pardal and M. José Castro for the technical assistance provided. Financial disclosure: This work was supported by a grant from the Consejería de Salud (PI0079) of Junta de Andalucía. Conflict of interest statement: There are no conflicts of interest to report. REFERENCES 1. Brunstein CG. Umbilical cord blood transplantation for the treatment of hematologic malignancies. Cancer Control. 2011;18:222-236. 2. Pelus LM, Fukuda S. Chemokine-mobilized adult stem cells; defining a better hematopoietic graft. Leukemia. 2008;22:466-473. 3. 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El factor estimulador de colonias granulocíticas produce cambios a largo plazo en los perfiles de expresión génica y de miRNAs de las células CD34 + de donantes sanos. El G-CSF es actualmente la citoquina más utilizada en la movilización de las CPH y aunque su administración se considera un proceso seguro y se emplea en todo el mundo en miles de pacientes y donantes cada año, no se conocen sus efectos a largo plazo, especialmente sobre las CPH. En este sentido, nos planteamos analizar si el G-CSF podía producir cambios en los perfiles de expresión génica y de miRNAs de las CPH de donantes sanos, y en ese caso si persistían a largo plazo. Se aislaron células progenitoras CD34+ de SP de 6 donantes sanos: antes de la movilización con G-CSF y a los 5, 30 y 365 días después de la movilización. Del mismo modo que en el artículo 1, se obtuvieron las células mononucleadas mediante centrifugación por gradiente de densidad, y se aislaron las células CD34+ mediante separación inmunomagnética. Para obtener una mayor pureza las células se incubaron con los anticuerpos monoclonales CD34-PE y CD45-FITC y se sortearon por citometría de flujo (las células muertas fueron descartadas antes de la separación). La pureza del aislamiento de las células CD34+ fue en todos los casos superior al 95%. A continuación se extrajo el ARN de todas las muestras y se analizó la expresión de 384 miRNAs usando las tarjetas microfluídicas TaqMan Human MicroRNA Arrays v2.0, y la expresión de todo el genoma usando los arrays Whole Human Genome 4x44K oligo microarray kit. Los valores de expresión génica y de los miRNAs se obtuvieron por el método 2 - ∆∆ CT . Con los datos de expresión se realizaron análisis jerárquicos no supervisados empleando el método de la distancia Euclídea. Para identificar los genes y miRNAs expresados diferencialmente antes y a los distintos tiempos tras la administración del G-CSF se aplicó el test estadístico no paramétrico U de Mann Whitney. Se consideraron significativos los genes y miRNAs con un valor p < 0.05. Todos los análisis se realizaron con el programa Multiexperiment Viewer 4.7.1 y la funcionalidad de los miRNAs y genes expresados diferencialmente se determinó a partir de distintas bases de datos disponibles en internet. Al realizar el análisis jerárquico no supervisado comparando los niveles de expresión génica y de miRNAs de las células CD34+ antes y a los 5, 30 y 365 días de la movilización con G-CSF, se identificaron claramente dos grupos, uno formado por las CD34+ no movilizadas y otro que incluía las muestras de CD34+ obtenidas a los distintos tiempos tras la administración de la droga. En el caso de los miRNAs, al aplicar el análisis estadístico U de RESULTADOS 64 Artículo 3. Las células B de memoria CD27 + muestran cambios en los patrones de expresión génica en función de la edad del sujeto Los LBM constituyen una de las estirpes celulares de más larga vida media, permaneciendo viables en estado no proliferativo durante años, a diferencia de otras células de vida más corta como los LBN. Los individuos de edad avanzada poseen menor cantidad de LBM y producen menos anticuerpos; como consecuencia, su sistema inmune se vuelve menos eficiente. Debido a su longevidad, el LBM podría ser clave para el estudio de numerosas hemopatías relacionadas con la edad. Con estos antecedentes, quisimos analizar los patrones de expresión génica de LBM frente a LBN tanto en sujetos jóvenes como mayores, con el fin de identificar genes relacionados con la longevidad de los LBM que pudieran alterarse en la población añosa y relacionarse con un mayor riesgo de desarrollar determinadas neoplasias linfoides. A partir de 14 buffy coats de donantes sanos: 7 jóvenes (20-25 años) y 7 de edad más avanzada (60-70 años), se obtuvieron células mononucleadas mediante centrifugación por gradiente de densidad, y a partir de ellas se aislaron LBN CD27 - y LBM CD27 + mediante separación inmunomagnética. Para inmufenotipar todas las muestras por citometría de flujo antes y después del aislamiento de las células B, se incubaron con los anticuerpos monoclonales IgG-FITC, IgG/IgA-PE, CD19-PERCP, CD10/CD25-PECy7, CD27-APC, CD38–APCH7, CD20/CD45-PACB, CD45-PACO. Las células muertas fueron descartadas del análisis, el cual se realizó con el programa Infinicit 1.7. La pureza del aislamiento de los LBN y LBM fue en todos los casos superior al 95%. A continuación se extrajo el ARN de todas las muestras de LBN CD27 - y LBM CD27 + , y se analizó la expresión de todo el genoma usando los arrays Whole Human Genome 4x44K oligo microarray kit. Los valores de expresión génica se obtuvieron por el método 2 - ∆∆ CT . Con los datos de expresión se realizaron análisis jerárquicos no supervisados empleando el método de la distancia Euclídea y para identificar los genes expresados diferencialmente entre los distintos grupos experimentales de células B se aplicó el test estadístico no paramétrico U de Mann Whitney. Se consideraron significativos los genes con un valor p < 0.05. Todos los análisis se realizaron con el programa Multiexperiment Viewer 4.7.1 y la funcionalidad de los genes de interés se determinó a partir de distintas bases de datos disponibles en internet. Al comparar los inmunofenotipos de las muestras de SP de donantes jóvenes frente a los de edad avanzada, observamos diferencias significativas en la proporción de células inmaduras, LBN, LBM y PB entre los dos grupos de edad. Sin embargo, cuando estudiamos Alicia Báez Palomo las posibles diferencias en las Ig de superficie (IgM, IgA, and IgG) entre los LBM aislados de jóvenes y mayores no observamos diferencias significativas; lo mismo ocurría con las Ig de superficie (IgA e IgG) en los LBN aislados de los dos grupos de edad. Para poder identificar genes implicados en la longevidad de los LBM, comparamos los perfiles de expresión de los LBM y LBN. En los donantes jóvenes se identificaron 3037 genes expresados diferencialmente entre ambas subpoblaciones, y en mayores 1567. Por otro lado, para evaluar el efecto de la edad sobre las dos poblaciones linfocitarias, comparamos los patrones de expresión de ambos grupos de edad en LBM y LBN. Curiosamente, en la población de LBN no se encontraron diferencias significativas entre sujetos jóvenes y añosos, mientras que en LBM se identificaron 925 genes expresados diferencialmente entre los donantes jóvenes y los de edad más avanzada. Finalmente, se buscaron genes expresados diferencialmente en LBM de donantes de mayor edad respecto a jóvenes y LBN de mayor edad. En este caso encontraron 193 genes que participan en rutas relacionadas con señalización de IL-8, HMGB1 y PEDF, y activación de NF-ΚB, entre otros. De los 193 genes identificados, validamos algunos de interés por qRT-PCR y por Western Blot. De este modo pudimos confirmar que existen diferencias significativas en la expresión génica de LBM y LBN, y además identificamos algunos genes expresados diferencialmente en LBM en sujetos de edad avanzada. The CD27 + memory B cells display changes in the gene expression pattern in elderly individuals Alicia B aez, Isabel  Alvarez-Laderas, Jos e I. Piruat, Teresa CaballeroVel azquez, Mar ıa Victoria Barbado,  Africa Mill an-Ucl es, Mayte Medrano, Estefan ıa Garc ıa-Guerrero, Luis Ignacio S anchez-Abarca and Jos e Antonio P erez-Sim on Haematology Department, Institute of Biomedicine of Seville (IBIS), University Hospital Virgen del Rocio/CSIC/University of Seville, Seville, Spain doi:10.1111/imm.12381 Received 3 June 2014; revised 30 July 2014; accepted 27 August 2014. Correspondence: Dr Jos e Antonio P erezSimon, Hospital Universitario Virgen del Roc ıo, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS)/CSIC/Universidad de Sevilla, Avenida de Manuel Siurot s/n 41013 Sevilla, Spain. Email: josea.perez.simon.sspa@ juntadeandalucia.es Senior author: Jos e Antonio P erez-Sim on Summary Memory B cells (MBCs) have a long lifespan compared with naive B cells (NBCs), remaining viable for years. This could predispose them to suffer misbalances in the gene expression pattern in the long term, which might be involved in the development of age-related B-cell disorders. In order to identify genes whose expression might change during life, we analysed the gene expression patterns of CD27  NBCs versus CD27 + MBCs in young and old subjects. Using microarray assays we observed that the expression pattern of CD27  NBCs versus CD27 + MBCs is significantly different. Furthermore, to evaluate the age effect, we compared the gene expression pattern of young versus aged subjects in both cell populations. Interestingly, we did not find significant differences in the CD27  NBC population between young and aged individuals, whereas we found 925 genes differentially expressed in CD27 + MBCs. Among these genes, 193 were also differentially expressed in CD27 + MBCs compared with CD27  NBCs, most of them involved in cell survival, cell growth and proliferation, cellular development and gene expression. We conclude that gene expression profiles of CD27  NBCs and CD27 + MBCs are different. Moreover, whereas the gene expression pattern of CD27 + MBCs varies with age, the same does not happen in CD27  NBCs. This suggests that MBCs undergo time-dependent changes, which could underlie a higher susceptibility to dysfunction with age. Keywords: B-cell disorders; cell survival; longevity Introduction Long-term humoral immunity is provided by long-lived antibody-secreting plasma cells that reside mainly in the bone marrow, and memory B cells (MBCs) that reside in secondary lymphoid organs. 1 MBCs remain viable as non-proliferating cells for long periods of time, indicating that they have enhanced mechanisms of survival compared with naive B cells (NBCs). 2 Factors supporting MBCs survival remain poorly characterized. In this regard, members of the tumour necrosis factor family, specifically BAFF (B-cell-activating factor of the tumour necrosis factor family) and APRIL (a proliferation-inducing ligand), have been implicated in MBCs survival, but their precise role in supporting post-germinal centre B-cell differentiation and survival is still unresolved. 3 MBCs also express higher levels of anti-apoptotic factors such as Bcl-2, A1 and Mcl-1, compared with NBCs. 2 At the molecular level, microarray assays of human B cells have identified some differences in the gene expression patterns between NBCs and MBCs. 4–6 On the other hand, defects in haematopoietic stem cell biology involving B lymphopoiesis have been described during aging, including failures in telomere maintenance, 7,8 abnormal epigenetic modifications 9 and impaired ability to generate a naive young-like B-cell repertoire. 10 Both total and relative amount of mature B cells significantly decrease in peripheral blood with age. The same holds for immunoglobulin class switch in human B cells. 11,12 As a consequence, there is a collapse in B-cell Abbreviations: MBCs, memory B cells; MM, multiple myeloma; NBCs, naive B cells; qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction ª2014 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 1 IMMUNOLOGY ORIGINAL ARTICLE diversity in the elderly population, which might correlate with poor health status. 13 In addition, in vitro studies have described that B cells from aged individuals produce lower amounts of antibody in response to seasonal influenza vaccines compared with B cells from young adults, and antibodies from aged individuals are relatively ineffective in neutralizing influenza virus. 14 Hence, in aged individuals episodes of immunization become less efficient in terms of quantity and quality. 15 Studies in mice have also shown that impaired B-cell generation in aged individuals is associated with reduced B-cell progenitor frequencies, 16 diminished proliferative potential, 17 decreased interleukin-7 production 18 and impaired V-DJ rearrangement. 19 Furthermore, several haematological malignancies involving B-cell lineage, such as non-Hodgkin lymphomas, chronic lymphocytic leukaemia or multiple myeloma (MM), are increasingly common in the aging population. Accordingly, it would be of paramount importance to identify genes that are differentially expressed in B cells in young versus elderly individuals. Moreover, considering the long-term viability of MBCs, this subset of cells could present misbalances or suffer from abnormalities that might be involved in the development of age-related diseases, including B-cell malignancies, to a greater extent than other short-lived subpopulations. For this reason, in the current study we have analysed the different gene expression pattern of CD27  NBCs versus CD27 + MBCs in both young and elderly people in an attempt to identify factors involved in age related B-cell memory performance. Material and methods Samples Total B cells were isolated from buffy coats of 14 volunteer healthy donors, seven young donors (age range: 20– 25 years) and seven elderly donors (age range: 60– 65 years). All samples were obtained from the regional centre of blood donation of the University Hospital Virgen del Roc ıo (Seville, Spain). The local ethics committee provided institutional review board approval for this study, and informed consent was obtained from all donors in accordance with the Declaration of Helsinki. Isolation of B cells Peripheral blood mononuclear cells from buffy coats were isolated by density gradient centrifugation using Ficoll– Paque solution (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). The isolation of CD27  NBCs and CD27 + MBCs was performed in a two-step procedure by immunomagnetic sorting in an AutoMACS pro separator using the Memory B-cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). First, magnetic labelling of non-B cells with Biotin-Antibody Cocktail (CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 and CD235a) was performed and the negative fraction containing all B cells was retained. In a second step, direct magnetic labelling of this negative fraction with anti-CD27 conjugated MicroBeads was performed to obtain the positive fraction containing CD27 + MBCs. From this step a CD27-negative fraction containing most of the NBCs was also obtained. The purity of the isolated CD27  NBCs and CD27 + MBCs samples was >90% in all cases as demonstrated by flow cytometry in Figs S1 and S2 (see Supporting information). Flow cytometry Samples before and after B-cell isolation were incubated with the monoclonal antibodies IgG-FITC, IgG/IgA-PE, CD19-PERCP, CD10/CD25-PECy7, CD27-APC, CD38– APCH7, CD20/CD45-PACB, CD45-PACO (Becton Dickinson, San Jose, CA) for 15 min in darkness and at room temperature. Populations were selected based on the intensity of antibodies as well as forward and side scattered components. Dead cells were discarded for further analyses. Flow cytometric analysis was performed with a FACScanto II cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) using FACSDIVA 6.1 (BD Biosciences, San Jose, CA). For data analysis INFINICIT 1.7 (Cytognos SL, Salamanca, Spain) software was used. RNA extraction Total RNA was extracted in CD27  NBCs and CD27 + MBCs samples using the AllPrep DNA/RNA mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The quality and integrity of the RNA was verified by a Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). An RNA integrity number >75 was required for further analyses of gene expression profiling. Gene expression We analysed the expression profile of the whole genome in CD27  NBCs and CD27 + MBCs samples using the Whole Human Genome Oligo microarray kit 4 944K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Total RNA (200 ng) was transcribed into cRNA and labelled with the Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies). The quality and integrity of the cRNA was verified by a Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Every experimental sample was cyanine 5-labelled and hybridized against a pool of samples using cyanine 3-labelled CD27  NBCs as reference group. Microarrays were scanned in a GenePix reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). ª2014 John Wiley & Sons Ltd, Immunology2 A. B aez et al. Validation of significant genes The expression of significant genes was validated by quantitative real-time (qRT-) PCR in the same samples of CD27  NBCs and CD27 + MBCs used in microarrays and in different samples: three CD27  NBC samples from old donors, three CD27 + MBC samples from young donors and three CD27 + MBC samples from elderly donors. The qRT-PCR were performed in a 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) using Quantitec Primer Assays and the Quantitec SYBR green Kit (both from Qiagen). Data were normalized to the housekeeping gene b-ACTIN. The relative gene expression levels were calculated by the 2 DDCT method. Western blot For protein preparation, CD27 + MBCs samples from young donors and elderly donors and CD27  NBCs samples from old donors were homogenized in ice-cold 20 mMTris–HCl buffer (pH 73), containing 2 mMdithiothreitol, 1% amidosulphobetaine, 1% nonidet P-40, 150 mMNaCl, 1 mMNa 3 VO 4 ,10mMNaF (Sigma Aldrich, St Louis, MO) and 10% protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany). Homogenized samples were incubated at 4°for 30 min and then centrifuged at high speed in a microcentrifuge. Protein-containing supernatant was collected. Protein concentration was determined using a bicinchoninic acid protein assay protein kit (reducing agent compatible; Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). From each sample, 15 lg of protein was separated by electrophoresis on SDS–polyacrylamide gels and electroblotted onto PVDF membranes. Blots were incubated in TTBS blocking solution (2% BSA, in Tris-buffered saline, 01% Tween-20), followed by overnight incubation at 4°with the following antibodies: anti-Akt (9272; Cell Signaling, Danvers, MA), anti-Mapk1/Mapk2 (ab4819; Abcam, Cambridge, UK) and anti-b-Actin (ab6276; Abcam). The membranes were then washed with TTBS and incubated with either a horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody (711-035-152; Jackson Immuno Research, Baltimore, MD) or horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (715-035-150; Jackson Immuno Research, Baltimore, MD). Antibody detection was performed with an enhanced chemiluminescence reaction (Western blotting Luminol Reagent; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc-2048). Statistical analysis Microarray background subtraction and data normalization were carried out by the normexp method and Loess algorithm, respectively by using the Rversion 3.1.0 software package (Revolution Analytics Limited Europe, London, UK). Unsupervised hierarchical clusters of samples based on the gene expression data were performed using the average linkage and the Euclidean distance methods in the MULTI-EXPERIMENT VIEWER 4.7.1 software (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA). To identify differentially expressed genes between experimental groups we applied non-parametric Mann–Whitney U-test. Those genes with a P-value <005 were considered significant. Expression values are indicated as the logarithm of the ratio between the two fluorescent signals. The functional analysis of the genes of interest was performed with the INGENUITY PATHWAYS ANALYSIS (http://www.ingenuity. com) and GENE ONTOLOGY (http://www.geneontology.org/) software. Results Immunophenotype of B cells from the experimental groups To assess the representation of immature and mature B cells in every sample from young and old individuals we immunophenotyped them by flow cytometry before the separation of CD27  naive and CD27 + memory populations. Since MBCs are a heterogeneous population, we selected the CD27 + subset of MBCs. We observed significant differences between immature (CD10 + CD20 + CD27  CD38  ), CD27  naive (CD10  CD20 + CD27  CD38  ) and CD27 + memory B (CD10  CD20 + CD27 + CD38  ) cells of both age groups. Interestingly, older individuals seem to have a greater number of MBCs than young donors (see Supporting information, Fig. S1). Furthermore, with the aim of testing possible differences in surface immunoglobulins between groups, we labelled the isolated CD27 + MBCs (CD19 + CD10  CD20 + CD27 + CD38  ) with anti-immunoglobulin heavy chain antibodies (IgM, IgA and IgG). We did not observe significant differences in the proportion of each immunoglobulin-expressing CD27 + MBCs between young and old individuals (see Supporting information, Fig. S2). Likewise, we also studied the proportion of IgA and IgG in all CD27 – NBCs samples (CD19 + CD10  CD20 + CD27  CD38  ) from young and elderly individuals. As in CD27 + MBCs, we observed in all samples higher expression levels of IgG than IgA, and did not find significant differences between both age groups (see Supporting information, Fig. S3). Gene expression of CD27  naive versus CD27 + memory B cells To identify genes that might be involved in the longevity of MBCs, a high-throughput gene expression analysis was performed comparing CD27  NBCs versus CD27 + MBCs from peripheral blood of healthy donors. For this purª2014 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 3 Gene expression in elderly CD27 + memory B cells pose, we performed microarray hybridization of total RNA. Unsupervised hierarchical clustering of samples based on the individual gene expression profiles clearly identified two differentiated groups, irrespective of donor age, corresponding to the CD27  NBCs and the CD27 + MBCs, respectively. To identify differentially expressed genes a non-parametric Mann–Whitney U-test was applied. Those genes with a P-value <005 were considered significant. Two differentiated groups, corresponding to CD27  NBCs versus CD27 + MBCs, were also identified when samples were studied separately in young (3037 genes differentially expressed) and old healthy donors (1567 genes differentially expressed). These results are shown in Fig. 1(a,b) respectively. In both age groups we could find the marker CD80 among the differentially expressed genes between CD27  NBCs and CD27 + MBCs, which appeared induced in CD27 + MBCs (032 012 and 021 009, in old and young donors, respectively) with respect to CD27  NBCs (014 011 and 009 006, in old and young donors, respectively). Effect of age on CD27  naive and CD27 + memory B cells To evaluate the effect of age on these two subpopulations of B cells, we analysed gene expression patterns of both CD27  NBCs and CD27 + MBCs separately, in young versus aged individuals. Remarkably, unsupervised paired hierarchical clustering comparing CD27  NBCs obtained from young versus aged individuals did not identify different subgroups (data not shown). In contrast, when we analysed the gene expression pattern of CD27 + MBCs from young and aged population, two clusters were clearly differentiated in unsupervised analysis, one including CD27 + MBCs obtained from young and the other from aged individuals. Upon comparing both subpopulations, 925 genes were differentially expressed (Fig. 2) using a non-parametric Mann–Whitney test. Next, we searched among those genes differentially expressed in CD27 + MBCs from aged donors that were also differentially expressed compared with CD27  NBCs from the same age group. With this approach, we identified 193 genes (see Supporting information, Table S1) which were subsequently analysed in INGENUITY PATHWAYS ANALYSIS software (http://www.ingenuity.com). These 193 genes are involved in several biological processes, such as cellular growth and proliferation, cellular development and movement, gene expression, as well as pathophysiological phenomena such as cancer, haematological diseases and normal haematological system development and function (Table 1). In addition, these 193 genes participate in several canonical pathways, the most significant being: molecular mechanism of cancer, interleukin-8 signalling, highmobility group box-1 signalling, pigment epitheliumderived factor signalling and nuclear factor-jB activation (Table 2). Validation of significant genes To validate our high-throughput screening, we confirmed by qRT-PCR the expression of several of the identified genes, AKT1,BCL2,HRAS,ITGB2,ITGB3,JUN,MAPK1 and NFKB1. All of these genes were chosen because they are representative of the canonical pathways that are differentially expressed in CD27 + MBCs from elderly individuals compared with CD27 + MBCs from young donors and CD27  NBCs from old donors. Among them, AKT1,BCL2 and HRAS displayed an up-regulation in their expression in old individuals (Fig. 3a). On the other hand, ITGB2, JUN,MAPK1 and NFKB1 showed a down-regulation in CD27 + MBCs from old donors compared with young donors and CD27  NBC (Fig. 3b). Finally, ITGB3 showed strong repression in CD27 + MBCs compared with CD27  NBCs regardless of the age of the donors. We analysed the expression of two proteins to verify the results observed in gene expression at mRNA level. For this purpose we performed Western blot analyses comparing the expression of AKT1 and mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1) proteins among CD27 + MBCs from young and old individuals, and CD27  NBCs from old donors. We chose these proteins because their encoding genes were differentially and inversely expressed in CD27 + MBCs from old donors compared with young donors and CD27  NBCs from old individuals. Remarkably, AKT1 protein had a higher level of expression in CD27 + MBCs from old donors than young donors or CD27  NBCs, whereas MAPK1 protein showed lower expression level in elderly CD27 + MBCs (Fig. 4). These protein analyses were performed in triplicate and expression levels are shown in Fig. 4(b,c). Discussion Considering that MBCs remain viable for many years in steady-state conditions, this cell subset may offer a unique opportunity to identify genes and pathways that are physiologically involved in long-term cell survival. Furthermore, they might also allow us to evaluate the effect of age on these pathways, which might, in turn, underlie the higher incidence of humoral immune dysfunctions or even neoplasias of B-cell lineage in the elderly population. Remarkably, the expansion of the tumour compartment in several B-cell malignancies is mostly a result of a misbalance between pro-apoptotic and anti-apoptotic factors in favour of the latter, leading to an abnormal cell accumulation, rather than to an increased cell proliferation. Hence, pathways that are physiologically involved in long ª2014 John Wiley & Sons Ltd, Immunology4 A. B aez et al. RESULTADOS 76 Artículo 4. Las células plasmáticas mielomatosas muestran un patrón de expresión génica similar al observado en las células B de memoria normales (under review) Los LBM permanecen viables en estado no proliferativo durante años; ello se debe a que expresan genes implicados en supervivencia celular y factores anti-apoptóticos, mientras que reprimen la expresión de genes reguladores del ciclo celular. Durante su diferenciación a CP, desarrollan un patrón de expresión génica opuesto, con una mayor expresión de genes de proliferación y activación celular, y menor expresión de genes de supervivencia. Sin embargo, en el MM las CP se acumulan en la MO debido a fallos en la apoptosis, a la vez que adquieren un patrón de activación y proliferación celular. Con estos datos en mente, en el presente estudio nos planteamos analizar los patrones de expresión génica de CP y LBM de donantes sanos y de CPm con el fin de determinar si éstas presentan un perfil de expresión génica intermedio entre el LBM y la CP. Los LBM se obtuvieron mediante separación inmunomagnética a partir de 5 buffy coats de donantes sanos de edad avanzada (60-70 años). Así mismo, se aislaron CP a partir de MO de 6 donantes sanos y CPm de 6 pacientes diagnosticados de MM. Para ello se obtuvieron previamente las células mononucleadas mediante gradiente de densidad, en el caso de los LBM y mediante lisis celular, en el caso de las CP y CPm. La pureza del aislamiento de los todas las poblaciones celulares fue superior al 95%. A continuación se extrajo el ARN de todas las muestras, y se analizó la expresión de todo el genoma usando los arrays Whole Human Genome 4x44K oligo microarray kit. Se utilizó como control un pool de muestras de LBN. Los valores de expresión génica se obtuvieron por el método 2 - ∆∆ CT . Con los datos de expresión se realizaron análisis jerárquicos no supervisados empleando el método de la distancia Euclídea y para identificar los genes expresados diferencialmente entre los distintos grupos experimentales de células B se aplicaron los test estadísticos no paramétricos U de Mann Whitney y Kruskal Wallis. Se consideraron significativos los genes con un valor p < 0.05. Todos los análisis se realizaron con el programa Multiexperiment Viewer 4.7.1 y la funcionalidad de los genes de interés se determinó a partir de distintas bases de datos disponibles en internet. A partir del análisis no supervisado obtenido se identificaron claramente dos grupos, uno formado por las muestras de CP y otro que incluía las muestras de CPm y LBM. Curiosamente, las CPm se situaban en medio de ambos tipos celulares. Con el fin de identificar genes característicos de una CPm que no se expresen en una CP normal, Alicia Báez Palomo comparamos los perfiles de expresión génica de CP y CPm, y encontramos 5159 genes expresados diferencialmente. Entre estos, se buscaron aquellos genes expresados diferencialmente en las CPm que tuviesen niveles de expresión similares a los observados en los LBM. En este caso se identificaron 3455 genes, la mayoría implicados en procesos de muerte y supervivencia celular, crecimiento y proliferación celular, síntesis de proteínas y expresión génica y regulación post-transcripcional del ARN, desarrollo y estructura del tejido linfoide y morfología de tumores. Además, estos genes juegan un papel importante en las vías de señalización de EIF2, mTOR, eIF4 y p70S6K, mitocondriales y de presentación de antígenos. Finalmente, se validaron algunos genes implicados en estas vías mediante qRTPCR y pudimos confirmar que las CPm presentan un patrón de expresión génica “asincrónica” que se asemeja más al de un LBM que al de una CP normal. 78 Myelomatous plasma cells display an aberrant gene expression pattern similar to that observed in normal memory B cells Alicia Báez, José I Piruat, Teresa Caballero-Velázquez, LI Sánchez-Abarca, Isabel ÁlvarezLaderas, M Victoria Barbado, África Millán-Uclés, Jesús Martín-Sánchez, Estefanía GarcíaGuerrero, Mayte Medrano and José Antonio Pérez-Simón. Hematology Department, University Hospital Virgen del Rocío / Institute of Biomedicine of Seville (IBIS) / CSIC / Universidad de Sevilla, Seville, Spain. Corresponding author: Dr. Jose Antonio Pérez-Simón Head of Department of Hematology Hospital Universitario Virgen del Rocío, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) / CSIC / Universidad de Sevilla, Avenida de Manuel Siurot s/n 41013, Seville, Spain. e-mail: [email protected] FAX: +34 955 013 265 / Telephone: +34 955 013 260 Abstract Memory B cells (MBCs) remain in a quiescent state for years, expressing pro-survival and anti-apoptotic factors while repressing cell proliferation and activation genes. During their differentiation into plasma cells (PCs), their expression pattern is reversed, with a higher expression of genes related to cell proliferation and activation, and a lower expression of prosurvival genes. To determine whether myelomatous plasma cells (mPCs) share characteristics with normal PCs and MBCs and to identify genes involved in the pathophysiology of multiple myeloma, we compared gene expression patterns in these three cell sub-types. Using microarray high-throughput techniques we analyzed the expression of whole genome in 6 samples of PCs, 6 of mPCS and 5 of MBCs. We observed that mPCs had features intermediate between those of MBCs and normal PCs, and identified 3455 genes differentially expressed in myelomatous relative to normal PCs but with a similar expression pattern to that in MBCs. Most of these genes are involved in cell death and survival, cell growth and proliferation and protein synthesis. According to our findings, mPCs have a gene expression pattern closer to a MBC than a normal PC with a high expression of genes involved in cell survival. These genes should be physiologically inactivated in the transit from MBC to PC, but remain overexpressed in mPCs and thus may play a role in the pathophysiology of the disease. Introduction B-cell differentiation into antibodysecreting cells constitutes the basis of the humoral adaptive immune system. Upon encountering a foreign antigen, naive B cells are activated and differentiated into antibody-secreting plasma cells (PCs) that mediate the primary humoral immune responses. In addition, some of them differentiate into memory B cells (MBCs) that drive the secondary humoral immune response upon re-exposure to the same antigen [1,2]. Accordingly, during the differentiation from naive B cells to MBCs, B lymphocytes acquire a higher antigen binding affinity and, at the same time, change the expression patterns of multiple surface receptors and intracellular factors that contribute to increase their responsiveness [3]. Whereas PCs are terminally differentiated, MBCs are capable of undergoing consecutive phases of stimulation, expansion and generation of PCs [4-7]. Moreover, their detection more than 50 years after vaccination demonstrates that MBCs can remain viable in a non-proliferative state for decades [8]. In this regard, MBCs express high levels of genes involved in long-term survival, such as the transcription factors BCL6 and PAX5, which induce the expression of B-cell lineage genes [9], and anti-apoptotic factors, such as Bcl-2, A1 and Mcl-1, which promote cell survival [10]. These cells express low levels of genes associated with cell cycle regulation, including members of the Krüppel-like factor family, which endows them with the ability to enter quickly into division, thus facilitating enhanced secondary responses [11]. During the process of differentiation into PCs, several morphological, phenotypic and molecular changes occur. In this regard, the gene expression pattern of PCs is very different from that observed in MBCs. Among others, higher levels of expression of genes related to cell proliferation, such as PRDM1 and XBP1 [12,13] and interferon regulatory factor IRF4, are apparent [14]. Multiple myeloma (MM) is characterized by the monoclonal expansion of malignant myelomatous PCs (mPCs) [15,16]. Remarkably, these mPCs share characteristics of both MBCs and normal PCs. On one hand, they accumulate in bone marrow (BM) due either to failure in the mechanisms involved in apoptosis and/or to the abnormal overexpression of mechanisms responsible for long-term 80 viability (similar to what occurs in MBCs). On the other hand, mPCs also show characteristics indicative of activated cell proliferation. In this regard, several reports have suggested that the mPC might be an abnormal MBC [17-19]. However, these findings have not been confirmed in other studies [20]. In fact, both hypotheses might be valid, i.e., mPCs could maintain features similar to MBCs. In turn, this would bestow long-term survival on this cell, which, at the same time, would acquire the functional, phenotypic and genetic characteristics of a PC in terms of activation. In the current study we compared the gene expression patterns of PCs and MBCs from healthy donors with that of mPCs with the dual aim of determining whether mPCs has an gene expression pattern intermediate between those of MBCs and PCs, and of identifying genes that may be associated with the physiopathology of the disease. Material and Methods Samples MBCs were isolated from 5 buffy coats from volunteer healthy donors. PCs were isolated from BM of 6 healthy donors and mPCS from BM of 6 patients diagnosed with MM. The local ethics committee of the University Hospital Virgen del Rocío provided institutional review board-approval for this study. Informed consent was obtained from all donors in accordance with the Declaration of Helsinki. Isolation of MBCs Peripheral blood mononuclear cells from buffy coats were isolated by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque solution (Amersham Biosciences, Uppsala). The isolation of MBCs was performed in a two-step procedure by immunomagnetic separation in an AutoMACS pro separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) using the Memory B cell isolation kit human (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). MBCs were isolated by depletion of non-B cells and subsequent positive selection with anti-CD27 conjugated MicroBeads. Firstly, we performed an indirect magnetic labeling of non-B cells with Biotin-Antibody Cocktail and Anti-Biotin MicroBeads and we retained the negative fraction. The second step was a direct magnetic labeling of CD27+ MBCs with CD27 MicroBeads. The purity of the isolated MBCs was higher than 95% in all cases as demonstrated by flow cytometry. Isolation of PCs and mPCs Mononuclear cells were isloated from BM using ammonium chloride. The CD138+ cells from both healthy donors and patients were isolated in AutoMACS pro separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) by positive inmunomagnetic selection using the CD138 MACS microbead Human Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). The purity of the isolated CD138+ cells was higher than 95% in all cases. RNA extraction Total RNA was extracted using the AllPrep DNA/RNA mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The quality and integrity of the RNA was verified by a Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A RNA integrity number (RIN) higher than 7.5 was required for further analyses of gene expression profiling. Gene expression We analyzed the expression profile of whole genome in each sample using the Whole Human Genome Oligo microarray kit 4x44K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Total RNA (200 ng) was transcribed into cRNA and labeled with the Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The quality and integrity of the cRNA was verified by a Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). All experimental samples were hybridized with a pool of samples of B cells as reference sample. Microarrays were scanned in a GenePix reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Validation of significant genes The expression of significant genes was validated by quantitative real-time PCR using Quantitec Primer Assays and the Quantitec SYBR green Kit (both from Qiagen, Hilden, Germany) in a 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Data were normalized to the housekeeping gene GAPDH. The relative gene expression levels were calculated by the 2 -∆∆CT method. Statistical analysis Unsupervised hierarchical clustering of gene expression data was performed using the average linkage and the Euclidean distance. To identify differentially expressed genes between 82 experimental groups we applied a non parametric Mann-Whitney test. The differences in expression with a p value < 0.05 were considered significant. To obtain positive and negative expression values data were transformed to logarithmic scale. All analyses were performed using the Multi-experiment Viewer 4.7.1 software. The functional analysis of the genes of interest was performed with the Ingenuity Pathways Analysis (http://www.ingenuity.com) and Gene Ontology (http://www.geneontology.org/) software. Results Gene expression in PCs, mPCs and MBCs The unsupervised hierarchical clustering of the expression data from all the samples clearly identified two groups, one including normal PCs samples and the other containing the mPC and MBC samples (Figure 1). Interestingly, mPCs were not only grouped with MBCs, but also clustered and located closer to the PC samples, implying that mPCs display an intermediate gene expression pattern between MBCs and normal PCs, although with a profile closer to that of MBCs. The Mann-Whitney test identified 5159 genes significantly differentially expressed in mPCs compared with normal PCs (p < 0.05). Of these, we were able to select 3455 genes with a similar (i.e., not significantly different) expression level to that observed in MBCs (Figure 2). Of this subset of genes, 1349 displayed a greater than 1.5-fold difference in their expression levels with respect to normal PCs, comprising 1062 upregulated and 287 downregulated genes in mPCs. The functional analysis using Ingenuity Pathway Analysis software showed these genes to be involved in several biological processes such as cell death and survival, cellular growth and proliferation, protein synthesis, and RNA post-transcriptional modification. Likewise, these genes appear to be involved in the development and function of various physiological systems, such as lymphoid tissue structure and development, and tumor morphology (Table 1). The functional analysis showed that some of these 1349 differentially expressed genes play a precise role in several canonical pathways, the most significant being EIF2 signaling, mTOR signaling, regulation of eIF4 and p70S6K signaling, mitochondrial dysfunction and the antigen presentation pathway (Table 2). Figure 1. Gene expression pattern of mPCs versus normal PCs and MBCs. Unsupervised hierarchical cluster analysis performed with samples of myelomatous plasma cells (mPCs), normal plasma cells (PCs) and memory B cells (MBCs). Each numbered column represents an individual sample and each row represents a single gene. The panel contains a representative portion of the respective sets of genes. Red and green colors indicate gene expression levels on a logarithmic scale. 84 Figure 2. Flow-chart of analysis. Diagram of the method used to compare gene expression between the grouped samples. The number of genes from myelomatous plasma cells (mPCs) with different expression levels from those of normal plasma cells (PCs) and similar levels to those of memory B cells (MBCs) are shown. For more details see the methods section. Table 1. Biological processes involving genes differentially expressed in myelomatous plasma cells (mPCs). Top Biological Functions Molecules Molecular and cellular functions Cell death and survival Cellular growth and proliferation Protein synthesis Cellular compromise RNA post-transcriptional modification 384 360 155 59 56 Physiological system development and functions Lymphoid tissue structure and development Tumor morphology Embryonic development Organ development Connective tissue development and function 106 83 83 73 73 Validation of significant genes To validate our high-throughput screening, we confirmed the expression of several of the identified genes, analyzing AKT1, BMI1, CAV1, COX5A, GTF2I, HNRNPA3, IRF2BP2, NDUFA1, PCNA1, RPS15, RPS27, SDHD and SF3B1. Most of these genes were chosen because they are representative of the canonical pathways that are differentially expressed in mPCs and MBCs compared with PCs. AKT1, RPS15 and RPS27 are involved in EIF2 signaling, Table 2. Most significantly affected pathways in myelomatous plasma cells (mPCS). Canonical Pathways p Ratio* Genes EIF2 signaling 2E-09 62/201 (0.308) AKT1, EIF1, EIF5, EIF1AX, EIF2AK2, EIF3A, EIF3C, EIF4A1, EIF4A2, EIF4G2, FAU, GSK3B, PABPC1, PPP1CC, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL8, RPL10, RPL14, RPL15, RPL17, RPL19, RPL21, RPL23, RPL24, RPL27, RPL29, RPL32, RPL34, RPL35, RPL39, RPL10A, RPL23A, RPL27A, RPL35A, RPL36A, RPL36AL, RPL37A, RPL7A, RPLP0, RPLP1, RPS3, RPS6, RPS7, RPS10, RPS13, RPS15, RPS16, RPS18, RPS19, RPS20, RPS24, RPS25, RPS27, RPS28, RPS3A, RPS4X, RPSA, RRAS, UBA52 mTOR signaling 2.22E -09 36/213 (0.169) AKT1, ARHGAP8, DDIT4, EIF3A, EIF3C, EIF4A1, EIF4A2, EIF4B, EIF4G2, FAU, HMOX1, MAPKAP1, PPP2R1B, PRKCD, RAC1, RHOA, RHOC, RPS3, RPS6, RPS7, RPS10, RPS13, RPS15, RPS16, RPS18, RPS19, RPS20, RPS24, RPS25, RPS27, RPS28, RPS3A, RPS4X, RPSA, RRAS, ULK1 Regulation of eIF4 and p70S6K signaling 8.34E -09 30/175 (0.171) AKT1, EIF1, EIF1AX, EIF3A, EIF3C, EIF4A1, EIF4A2, EIF4EBP2, EIF4G2, FAU, PABPC1, PPP2R1B, RPS3, RPS6, RPS7, RPS10, RPS13, RPS15, RPS16, RPS18, RPS19, RPS20, RPS24, RPS25, RPS27, RPS28, RPS3A, RPS4X, RPSA, RRAS Mitochondrial dysfunction 3.25E-06 26/201 (0.129) ATP5A1, ATP5B, ATP5D, ATP5E, CASP3, CASP8, COX5A, COX5B, COX6A2, COX6C, COX7A2L, MT-COI, NDUFA1, NDUFA4, NDUFA9, NDUFA11, NDUFA12, NDUFB7, NDUFB8, NDUFB10, NDUFV1, PRDX5, SDHD, UQCR11, UQCRH, VPS9D1 Antigen presentation pathway 1.03E-05 11/42 (0.262) B2M, CANX, CIITA, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-F, NLRC5, PDIA3, TAP1, TAPBP * The ratio is of the number of molecules affected in the study to the total number of molecules involved in the pathway. 92 synthesis in plasma cell differentiation. 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Nosotros encontramos que las CPH poseen distintos perfiles de expresión génica y de miRNAs según su origen y, especialmente, observamos que las CPH movilizadas con G-CSF muestran un patrón de expresión muy diferenciado respecto al de las otras fuentes. Identificamos 36 miRNAs expresados diferencialmente entre las CPH de las tres fuentes, y la mayoría se encontraban sobreexpresados en las CPH movilizadas con G-CSF. De entre ellos, 8 miRNAs (miR103, miR106a, miR125a-5p, miR126, miR140-5p, miR20a, miR221 y miR320) aparecían sobreexpresados solamente en las CPH movilizadas. Estos miRNAs estan implicados en el control del ciclo celular, reprimiendo el proceso de apoptosis y promoviendo la proliferación y diferenciación celular 138-141 . Por el contrario, en las CPH de MO y CU encontramos el mismo número de miRNAs infra y sobreexpresados con un patrón de expresión muy similar. También pudimos identificar 43 genes diferencialmente expresados entre las CPH de las distintas fuentes, y volvimos a encontrar más diferencias en las CPH movilizadas con respecto a las CPH de las otras dos fuentes. De todos esos genes identificamos 10 genes reprimidos (GHDC, IGLL1, KIAA0101, PDE4B, PHIP, SVOPL, TUBB2A, TYMS, ZFP91 yZWINT) y 14 inducidos (AHNAK, DPYSL3, GABRA1, HIST2H2BE, HOXA9, HSPA1A, IDS, LMNA, NACAD, NEAT1, NKX2-1, NR1H3, TPM2 yZBTB20) en las CPH movilizadas con G-CSF. La mayoría de estos genes se encuentran involucrados en el ciclo celular, promoviendo la proliferación celular, la hematopoyesis y la respuesta inmune. 142-145 Además observamos que curiosamente 20 de estos genes son diana de los 36 miRNAs también identificados en este estudio; sus niveles de expresión son opuestos a los niveles de expresión de los miRNAs que actúan sobre ellos. Validamos los genes diana más interesantes mediante qRT-PCR y Western Blot y comprobamos de nuevo que las CPH de MO y CU tenían un patrón de expresión más parecido mientras que las CPH movilizadas tenían un perfil génico y proteico diferente. Todos estos resultados sugieren que en las CPH movilizadas con el G-CSF se produce una desregulación génica y de miRNAs que promueve la activación de numerosos genes implicados en proliferación y diferenciación celular, y la represión de algunos genes apoptóticos lo que, junto con las diferencias cuantitativas de CPH y otras poblaciones Alicia Báez Palomo celulares presentes en el inóculo en cada uno de los diferentes tipos de trasplante, podría explicar que las CPH movilizadas posean una mayor rapidez de injerto tras el trasplante. Estos datos nos hicieron plantearnos si el G-CSF era el causante de esa desregulación génica y de miRNAs en las CPH movilizadas, y si esos cambios podían perdurar a largo plazo. La administración del G-CSF se considera un proceso seguro de acuerdo a numerosos estudios con miles de donantes y seguimientos de hasta 10 años, en los que no se describe un mayor riesgo de desarrollar enfermedades hematológicas 146 . Sin embargo, no se conocían los efectos del G-CSF a largo plazo en la expresión génica y de miRNAs de las CPH movilizadas. En nuestro estudio hemos demostrado que, aunque el G-CSF produce la máxima movilización de CPH al quinto día tras su administración, sus efectos sobre los CPH son duraderos. En este sentido, pudimos comprobar que el G-CSF produce la activación de numerosos miRNAs en las CPH tras su administracióna los distintos tiempos analizados en este estudio. Seis de estos miRNAs (miR182, miR21, miR339-3p, miR483-5p, miR500 y miR576-3p) permanecían activados desde el día 5 hasta un año después del tratamiento con la droga, algunos de los cuales actúan como onco-miRNAs inhibiendo la expresión de numerosos genes supresores de tumores 147,148 . Algunos de ellos como miR21, miR182 y miR339-3p están involucrados en los procesos de ciclo celular, proliferación, angiogénesis y apoptosis y también se encuentran inducidos en varios tipos de cáncer y enfermedades hematológicas 149,150 . Estos datos nos plantearon la cuestión de si la sobreexpresión de estos miRNAs por el G-CSF podría dar lugar a modificaciones en cualquiera de estos procesos biológicos y si podría tener alguna implicación clínica. Igualmente, observamos que, el GCSF produce cambios en la expresión de muchos genes que, también perduran al menos hasta un año después de la movilización y que están implicados en procesos como síntesis de proteínas, metabolismo de ácidos nucleicos, crecimiento y proliferación celular, muerte y supervivencia celular. Pudimos identificar 2424 genes alterados que mantenían sus niveles de expresión en las CPH desde día 5 hasta un año tras la administración del G-CSF. Entre ellos encontramos algunos genes interesantes (AXL, BCR, CASP3, CXCL2, EGR1, EIF2AK2, FOS, HIF1A, HOXA9, MAP4K1, NFKBIA, NPM1, NUP98 y TXNIP) que están relacionados con el desarrollo de enfermedades hematológicas 151,152 . Además encontramos que 109 de todos estos genes son diana de los 6 miRNAs sobreexpresados desde el día 5 hasta un año tras la movilización identificados en este estudio. De este modo es concebible pensar que la represión de estos 109 genes podría estar relacionado con la sobreexpresión de sus correspondientes miRNAs reguladores. Tras validar por qRT-PCR algunos de estos genes confirmamos que el G-CSF produce cambios en la expresión génica de las CPH y observamos DISCUSIÓN 101 interesantemente, que algunos de estos cambios son incluso mayores un año después de la movilización.Todos estos datos sugieren que el G-CSF puede alterar diversos procesos biológicos, por lo que sería conveniente un seguimiento más exhaustivo y prolongado de los donantes. A continuación nos centramos en otra de las poblaciones celulares hematopoyéticas que, junto con las CPH, tiene una vida media más larga, como son los LBM. Considerando la longevidad de esta subpoblación linfocitaria, nos planteamos que podrían acumular alteraciones en el patrón de expresión génica vinculadas al envejecimiento, alguna de los cuáles podría estar relacionado con el desarrollo de enfermedades cuya frecuencia aumenta con la edad, como linfoma no-Hodking, leucemia linfoblástica crónica o MM. Por esta razón nos planteamos en primer lugar identificar genes expresados diferencialmente en los LBM de individuos de edad avanzada frente a individuos jóvenes y frente a LBN. Al contrario que otros grupos 153 , encontramos que existen diferencias significativas entre los perfiles de expresión de los LBM y LBN independientemente de la edad, lo que podría explicar las diferencias existentes en las propiedades biológicas de ambos subtipos celulares, incluyendo la vida media de ambas subpoblaciones. Cuando comparamos los perfiles de expresión de donantes mayores frente a jóvenes, no encontramos diferencias significativas en los LBN pero si en los LBM. En concreto, este estudio nos permitió identificar 193 genes expresados diferencialmente en los LBM de individuos de edad avanzada frente a jóvenes y a LBN relacionados con crecimiento y proliferación celular, expresión génica, cáncer y ciertas enfermedades hematológicas. Además estos genes están implicados en importantes rutas de señalización, la mayoría relacionadas con supervivencia celular, como las rutas de IL-8, HMGB1, PEDF y NF-ΚB. Cuando validamos algunos de estos genes de interés (AKT1, BCL2, HRAS, ITGB2, ITGB3, JUN, MAPK1 and NFKB1) por qRT-PCR y por Western blot pudimos confirmar que existen diferencias significativas en la expresión génica de los LBM frente a los LBN, y además pudimos identificar algunos genes propios de LBM asociados con una edad avanzada, algunos de ellos ya descritos en varias enfermedades hematológicas que curiosamente padecen individuos añosos 154-158 . Estos datos sugieren que los LBM, debido a su larga supervivencia parecen ser más susceptibles a desarrollar determinadas neoplasias linfoides asociadas a la edad. Una vez identificado este patrón de expresión génica en los LBM de sujetos añosos, nos planteamos si las CPm podrían mantener similitudes con los LBM, que justificasen su elevada supervivencia y resistencia a la apoptosis. Así, cuando comparamos los perfiles de expresión BIBLIOGRAFÍA 109 1. 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