Interfaces electrónicos neuronales para su aplicación en Lab-on-chip

Equation Chapter 1 Section 1 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Autora: Paula Roldán García Tutor: José Manuel Quero Reboul Dep. Ingeniería Electrónica Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 III Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Autora: Paula Roldán García Tutor: José Manuel Quero Reboul Profesor titular Dep. Ingeniería Electrónica Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 V Trabajo Fin de Grado: Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Autora: Paula Roldán García Tutor: José Manuel Quero Reboul El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2016 El Secretario del Tribunal VII Agradecimientos Este proyecto no hubiera sido posible llevarlo a cabo sin el apoyo y confianza de mi tutor D. José Manuel Quero Reboul. Quiero agradecer también a cada uno de los miembros del equipo la ayuda que me han prestado en todo momento, resolviendo dudas y aportando ideas para los problemas planteados, en especial a Miguel Cabello Valverde por su disponibilidad en todo momento y por hacer que tantas horas de trabajo hayan parecido nada. Asimismo, me gustaría mencionar a los profesores del Grado de Ingeniería de Tecnología de Telecominicación de la Universidad de Sevilla que me han instruido a lo largo de estos años, no solo contribuyendo a mi formación académica sino enseñándome que el mundo de las tecnologías es algo apasionante. Han sido muchas las personas que me han acompañado a lo largo de la carrera, con las que he compartido muchos momentos y muchas noches de estudio, gracias por contribuir a que todo esto sea real. Nuestro camino no termina aquí. Y, por último, agradecer a mi familia. Gracias por animarme en cada momento de caída, por ayudarme a superarme y eliminar cada una de mis limitaciones. Paula Roldán García Sevilla, 2016 IX Resumen En este Trabajo Fin de Grado se detalla el proceso de diseño y verificación de una interfaz electrónica que permita la comunicación electrónico-neuronal. Esta interfaz forma parte de un proyecto multidisciplinar llamado BIOLOP. El documento comenzará con una descripción del proyecto general dando unos conocimientos generales de su funcionamiento para comprender las conexiones de los distintos módulos y como afectan a la interfaz electrónica. Después se detallará el diseño y realización de cada uno de los bloques que hacen posible la comunicación con las células. Circuitos de potencia para alimentación e iluminación, sistemas de estimulación, circuitos de adaptación de medidas y amplificación de las señales neuronales de entrada utilizando un INA333 queriendo conseguir una ganancia 10.000 para poder trabajar mejor con las señales. Por último se detallará el diseño de la interfaz electrónica integrando todos los bloques mencionados anteriormente y verificando el correcto funcionamiento del conjunto. El mayor problama que se encontrará en el proyecto es el ruido inducido en los circuitos de amplificación, por lo que se espera que gracias a la integración en la interfaz electrónica este ruido se vea reducido. Figura 5-6: Pruebas de las pruebas de iluminación de los leds en la interfaz electrónica 34 Figura 5-7: Captura de los dipolos antes y después de la amplificación en la interfaz electrónica 35 Figura 5-8: Respuesta de la interfaz electrónica con una entrada de 72,5Hz y amplitud 70mVpp 35 Figura A-1: Módulo de cultivo y conexiones con la interfaz electrónica 39 Figura B-1: Esquema del modelo 1 en TINA-TI 43 Figura B-2: Esquema del modelo 2 en TINA-TI 43 Figura B-3: Esquema del modelo 3 en TINA-TI 43 Figura B-4: Simulaciones modelo 2 con amplitud de 50µV (a), 200µV (b), 350µV (c) y 500µV (d) 44 Figura B-5: Simulaciones modelo 3 con amplitud de 50µV (a), 200µV (b), 350µV (c) y 500µV (d) 45 Figura C-1: Captura del esquema implementado en Altium Designer 47 XVII Acrónimos AC ADC ASIC BioMEMS CNN CMOS DAQ DC ENG FFT INA LED MEA NTC PBS PCB PDMS PWM Alternating current Analog Digital Converter Application-specific integrated circuit Biomedical or Biological microelectromechanical systems Center for Network Neuroscience Complementary metal-oxide-semiconductor Data Acquisition Direct Current Electroneugrama Fast Fourier Transform Instrumentation Amplifier Light-emitting diode Microelectrode array Negative Temperature Coefficient Phosphate Buffered Saline Printed Circuit Board Polidimetilsiloxano Pulse Width Modulation SNR Signal to noise ratio SPICE FPGA Simulation Program with Integrated Circuits Emphasis Field Programmable Gate Array 1 1 INTRODUCCIÓN 1.1 Objetivos En el Departamento de Electrónica de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería se está llevando a cabo un proyecto multidisciplinar del plan nacional llamado “BIOLOP”, cuyo objetivo es la realización de una interfaz que permita interactuar con neuronas in vitro. Para ello, se realiza un cultivo celular que garantice el crecimiento y mantenimiento de dichas células y que permita estimularlas y recoger sus señales. Este Trabajo Fin de Grado se encuadra dentro de BIOLOP y se centra en el diseño y puesta en marcha de una interfaz electrónica encargada de diversas funciones como son generar estímulos de control, integrar circuitos de adaptación, conectar diferentes módulos del proyecto y procesar las señales generadas por las células. Debe cumplir con la necesidad de un bajo consumo de energía, trabajar en un bajo rango de frecuencia, conseguir una cancelación del ruido, manejar señales de amplitud pequeña e integrar la electrónica en un espacio reducido debido a los requisitos del proyecto global. 1.2 Motivación del proyecto El cerebro humano es el órgano más complejo conocido, consta de 100 mil millones de neuronas capaces de generar impulsos nerviosos y transmitirlos a sus neuronas vecinas. Aunque a día de hoy disponemos de grandes avances en la investigación cerebral, sabemos poco acerca de la generación de patrones y casi nada de como los procesa. El rápido avance de la tecnología y los BioMEMS ha favorecido al desarrollo de sistemas compactos e innovadores para la investigación neurobiológica, surgiendo de esta forma estudios enfocados en la ingeniería neural, rehabilitación y ciencia del cerebro, pero no entenderemos como este órgano procesa la información hasta que no comprendamos el procesamiento de patrones en pequeñas redes de células nerviosas. Estos sistemas avanzados están compuestos por circuitos electrónicos con diversas funcionalidades y una matriz de electrodos biocompatibles con una alta densidad de registro (MEA) [1] [2] [3] [4], de esta forma se puede depositar el preparado de células a estudiar en el MEA y registrar masivamente datos de la dinámica interna de las redes celulares mediante la electrónica. La empresa líder en el mercado mundial en este campo es Multichannel Systems con 20 años de experiencia [5], su objetivo es el desarrollo de instrumentación de medición precisa para el campo de la electrofisiología en universidades y en la industria farmacéutica. El CNNs en la Universidad del Norte de Texas es una organización orientada al estudio de los mecanismos fundamentales del sistema nervioso, centrándose en pequeñas redes cultivadas en MEA que ofrecen sistemas de análisis y detección de productos químicos y toxinas [6] [7] [8]. Se ha establecido que estas redes son farmacológicamente muy similares al tejido primario, lo que permite aplicaciones en los campos de la toxicología industrial y ambiental, desarrollo de fármacos, y biosensores basados en tejidos. Dado el enorme progreso en los últimos años, las células nerviosas in vitro ya no pueden ser consideradas diferentes de las células nerviosas in vivo, al menos farmacológicamente [9]. Con un mayor avance, redes in vitro serán aceptadas como entidades funcionales y dinámicas que pueden proporcionar información única y útil en un amplio rango de aplicaciones. Introducción 2 1.3 Estructura del documento En esta memoria se describirá el trabajo realizado, apoyando el texto con imágenes, gráficas y tablas, siempre que sea conveniente. En este capítulo se introduce el proyecto, sin entrar en demasiados detalles, dejando la descripción del proyecto BIOLOP y el alcance de la interfaz electrónica a diseñar para el segundo capítulo. En el tercer y cuarto capítulos, se describirá con más detalle cada uno de los bloques que componen la interfaz electrónica, mostrando los cálculos teóricos, simulaciones y pruebas realizadas en cada uno de ellos. En el quinto capítulo se recogerán las restricciones y decisiones de diseño que se han adoptado para la interfaz electrónica, los recursos software y hardware que han sido necesarios a la hora de implementar este proyecto y los resultados obtenidos a través de las pruebas. En el sexto capítulo, para finalizar, se comentarán los resultados generales y conclusiones que se pueden obtener de las pruebas, así como las posibles mejoras y las futuras líneas de trabajo. Se han incluido unos índices de figuras y tablas y un listado de acrónimos para facilitar la lectura. En cuanto a las referencias en las que se apoya el documento se especifican en el texto si hay correspondencia directa, es decir, cuando el texto escrito es resultado de una sola fuente o si se trata de una entidad se muestran varias referencias de los estudios que llevan a cabo. En el caso de no ser así y que varias fuentes contribuyan de forma equitativa, éstas se incluirán al final del documento para hacer más legible el texto escrito. 3 2 PROYECTO BIOLOP 2.1 Marco de trabajo La necesidad de reducir el tiempo, coste y número de animales utilizados en los ensayos de toxicidad ha contribuido a la disminución progresiva de los ensayos in vivo 1 aumentando el uso de ensayos in vitro 2 , modelos celulares y especies alternativas, al mismo tiempo que se incluyen métodos computacionales de cálculo de predicción que incorporan conocimientos sobre las vías de toxicidad. Es posible abordar el estudio mediante un sistema in vitro y posteriormente extrapolarlo a un in vivo. Los dispositivos MEA permiten registrar la actividad eléctrica extracelular de un gran número de tejidos eléctricamente activos en lugares individuales. Se usan tejidos biológicos excitables como puede ser tejido cardíaco, cultivos primarios de tejido del sistema nervioso de diversas regiones o retinas. Estos dispositivos consisten en láminas de vidrio o “chip” con una matriz de microelectrodos biocompatibles integrados aislados entre sí y fabricados o recubiertos con materiales conductores como puede ser paladio, óxido de indio y estaño u oro. Los microelectrodos son dispuestos en cuadrícula ocupando un área 0,2–2 mm2 variando el número, tamaño y disposición de ellos según el criterio de diseño y la aplicación que vaya a tener, quizás interese recoger un mayor número de señales en una zona determinada. En cuanto a su forma, deben ser planos para permitir el cultivo de una capa de células o tener una disposición tridimensional que permita la penetración de los electrodos a través de las capas externas de las células. El terminal opuesto de cada electrodo hace contacto con un amplificador externo, que retransmite las señales eléctricas a un ordenador para la conversión analógica–digital, filtrado, detección de señal, almacenamiento y análisis. El patrón espacio–temporal de la actividad eléctrica es crucial ya que proporciona información importante respecto a la estructura y función de la red difícil de obtener con técnicas electrofisiológicas. En muchos casos, la actividad registrada es espontánea, sin embargo es posible utilizar sistemas que generen impulsos utilizando los electrodos como electrodos de estimulación [10]. Esto permite el registro de la modificación del potencial eléctrico producido por el sistema nervioso en respuesta a una estimulación externa (potencial evocado) y hace posible el estudio de la plasticidad sináptica – propiedad que emerge de la naturaleza y funcionamiento de las neuronas cuando establecen comunicación y modula la percepción de los estímulos del medio, tanto los de salida como los de entrada [11] –. Las primeras pruebas grabadas por los MEA son las tensiones extracelulares donde se puede analizar independientemente cada forma de onda viendo los cambios en amplitud y duración. Sin embargo, con el aspecto espacio–temporal podemos obtener más información de la actividad obtenida como puede ser el aumento general de la red, las tasas de ráfagas o la tasa de potencial de acción “spikes” y los grupos de potencial de acción “bursts” grabados en cada electrodo. El potencial de acción (o impulso eléctrico) es la onda de descarga eléctrica que viaja a lo largo de la membrana celular modificando su distribución de carga eléctrica. Se utiliza en las células del sistema nervioso para comunicarse entre ellas o para enviar mensajes desde células nerviosas a otros tejidos corporales. 1 Caracterización y análisis de biomoléculas y sistemas biológicos en organismos intactos. 2 Manipulación de organismos, tejidos, células y biomoléculas en ambientes artificiales y controlados. Proyecto Biolop 4 Otros parámetros calculables mediante software pueden ser la duración de las ráfagas y el número o porcentaje de picos en una ráfaga. También pueden incluirse medidas más complejas de la red como autocorrelograma, correlograma cruzado o modelos probabilísticos sofisticados de conectividad de red [9]. En conclusión, un MEA es una plataforma de alto contenido que puede proporcionar información detallada con respecto a los cambios en el funcionamiento de redes neuronales expuestas a ensayos. 2.2 Descripción del sistema BIOLOP se crea con el objetivo de interactuar con neuronas in vitro mediante una interfaz electrónica, para ello se diseña un dispositivo que permita cultivar las neuronas y al mismo tiempo estimularlas y recibir las señales emitidas. Debido a la complejidad de dichas células se trabaja inicialmente con retinas de ratones RD10 estudiando la retinitis pigmentaria 3 y se intenta frenar la degeneración mediante la estimulación de los fotorreceptores. Una vez el diseño haya sido verificado con retinas y se haya comprobado que el sistema funciona según lo esperado se realizarán pequeñas modificaciones y será posible el estudio con neuronas. Con el fin de llevar a cabo el cultivo celular y asegurar la supervivencia de las células durante un tiempo prolongado, se aplica un flujo continuo de medio 4 garantizando el aporte de nutrientes a las celulas a la vez que se retiran los desechos producidos. El medio se inyecta mediante una bomba de jeringa, recorre el cultivo y se desecha a la salida. De no ser así se agotarían los nutrientes y se acumularían los desechos, teniendo que eliminar el medio mediante aspiración y reemplazarlo por uno fresco constantemente, con la consiguiente pérdida de autonomía. Para poder estudiar el comportamiento de las células frente a distintos estimulos, se dispondrá de una placa de circuito impreso adaptada que integra cuatro cavidades a las que llegará el medio uniformemente en las condiciones adecuadas. La estimulación se realizará a elección del usuario mediante la electrónica y las señales emitidas por las neuronas serán recogidas y procesadas en esta misma electrónica. Se necesitan competencias en varios campos de estudio como es biomedicina, microfluídica o electrónica. Para conseguirlas se constituye un grupo multidisciplinar, donde el estudio del medio y las técnicas de cultivo son llevados a cabo por la compañera de biomedicina. Debido a la magnitud del proyecto es necesario desacoplarlo en módulos más sencillos e independientes (Figura 2-1) facilitando la depuración de errores y aumentando el ritmo de trabajo. 3 Degeneración progresiva de la retina que produce la pérdida de las principales células que la forman: los conos y los bastones 4 Solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables, el crecimiento de virus, microorganismos, células o tejidos vegetales. Figura 2-1: Diagrama de bloques del proyecto BIOLOP 5 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Se dará una breve descripción de los distintos módulos que componen el proyecto y se hará hincapié en las conexiones entre ellos (Figura 2-2). Se terminará el capítulo explicando con más detalle la interfaz electrónica a diseñar en este Trabajo Fin de Grado. Todos los módulos están unidos entre sí mediante tornillos para evitar cualquier fuga y como método de alineación. 2.2.1 Módulo de adaptación El primer módulo se encarga de preparar el medio en las condiciones adecuadas y hacerlo llegar al cultivo conectándose con el módulo de microfluídica (apartado 2.1.2) mediante unos tubos dimensionados. Como se opta por un flujo continuo, el medio desechado a la salida volverá a este módulo dando la posibilidad de comparar las condiciones del medio en la entrada y salida, conociendo así el estado de las células. Gracias a un mezclador se combinan las sustancias de entrada produciendo el medio necesario y se llevan por un microcanal sobre un microcalentador y un sensor de temperatura que realizan el control térmico. Ya que el medio se estudia previamente para que las células dispongan de los nutrientes necesarios, el único parámetro a controlar es la temperatura, manteniéndola a 37±1ºC se cumplirán todos los requisitos. Este módulo está conectado con la electrónica (apartado 2.1.4), recibiendo la alimentación necesaria para el microcalentador. A su vez, el módulo de electrónica tendrá los circuitos de adaptación para las medidas y servirá como interfaz frente a la monotorización. En la figura 2-2-a, no se representa este módulo para mostrar de forma más clara las capas del proyecto. Figura 2-2: a) Vista transversal b) Vista superior del proyecto BIOLOP a) b) Proyecto Biolop 6 2.2.2 Módulo de microfluídica Este segundo módulo se encarga de recibir el medio desde el módulo de adaptación, llevarlo uniformemente a las células que se encuentran en el módulo de cultivo (apartado 2.1.3) y devolverlo al módulo de adaptación. La conexión con el módulo de cultivo se hace depositando una membrana Millicell entre ambos, gracias a la porosidad de la misma las células podrán alimentarse. Constará de un circuito microfluído fabricado en PDMS que distribuya el medio de manera uniforme por el microcanal y una pieza de metacrilato con una hélice ferromagnética integrada. Si se sitúa un motor giratorio con un imán fuera del dispositivo, se logrará recircular el medio haciendo que llegue a todas las cavidades y evitando el estancamiento. El flujo será continuo y se fijará un caudal de entrada suficiente para mantener con vida a las neuronas. 2.2.3 Módulo de cultivo Las células se depositarán en este módulo estando en contacto con el medio a través de la membrana y con los electrodos encargados de estimularlas y recibir sus señales. También estarán en contacto con el microscopio para realizar el estudio pertinente. El objetivo de este módulo es integrar electrodos en una placa de circuito impreso con cuatro cavidades de PDMS sobre las que se encontrarán las células. Los electrodos se realizarán con un proceso de wire-bonding entre las cavidades y los pads de conexión con el módulo de electrónica (apartado 2.1.4), estos hilos de oro de 25µm de diámetro estarán embutidos en PDMS. Para verificar que el medio sigue en las condiciones adecuadas y rectificar si se ha producido una variación en el recorrido, se realizará un control térmico incluyendo microcalentadores y un sensor de temperatura. 2.2.4 Módulo de electrónica y monitorización En este tercer módulo se implementará la electrónica necesaria para el proyecto dividiéndola en bloques según las aplicaciones. En la figura 2-3 se puede ver un esquema con las partes que componen la electrónica y sus conexiones con los módulos del proyecto, a continuación se hará una breve descripción de dichos bloques.  Estimulación: Será el encargado de estimular las células. Dado que el proyecto comienza trabajando con retinas, se estimulará tanto por tensión o corriente como por luz. Cuando se pase a trabajar con neuronas la estimulación se realizará sólo por corriente.  Electrónica de potencia: Integra la electrónica necesaria para controlar la estimulación por luz y la electrónica encargada de alimentar los microcalentadores de los módulos de adaptación y cultivo. Como observación, requiere potencia y habrá que alejarlo del resto de la electrónica.  Circuitos de adaptación: Electrónica necesaria para adaptar las medidas de temperatura realizadas mediante un termistor NTC en los módulos de adaptación y cultivo y otros circuitos requeridos por la interfaz.  Adaptación de señal: Gracias a los electrodos del módulo de cultivo, se recibirán las señales extracelulares de baja amplitud. Se necesitarán circuitos de adaptación y amplificación de señal. Todos los bloques que componen la electrónica estarán conectados al módulo de monitorización para realizar la labor de control. En los siguientes puntos de esta memoria se detallarán cada uno de ellos haciendo referencia al diseño y simulación. 7 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip El módulo de monitorización consiste en dos tarjetas de adquisición de datos (DAQ) de National Instruments, modelo NI USB-6211 y NI USB-6009 conectadas a un ordenador con el entorno de desarrollo LabView facilitando la visualización y codificación de los sistemas de control. Estas tarjetas se encuentran en la Escuela Tecnica Superior de Ingeniería a disposición de BIOLOP. El módulo USB-6211 ofrece un muestreo más rápido, medidas más precisas y permite transferencia de datos bidireccional a alta velocidad. Tiene una velocidad de muestreo de 250kS/s, disparo digital y dos contadores/temporizadores. [12] El módulo USB-6009 ofrece una funicionalidad DAQ básica para aplicaciones como registro de datos simple, medidas portátiles y experimentos académicos de laboratorio. [13] Tabla 2-1: Pinout de los dispositibos Modelo Entradas analógicas Salidas analógicas E/S Digitales USB-6211 16 2 8 USB-6009 8 2 11 Además ambos dispositivos incluyen un pin de +5V teniendo una limitación en corriente de 50mA el modelo USB-6211 y de 200mA el modelo USB-6009. También incorporan salida analógica de 5V, salida analógica de 2,5V y referencia a tierra. En el caso del modelo USB-6211 encontramos referencia a tierra digital destinada a las E/S digitales, referencia a tierra analógica de salida para las señales de salida analógica y una referencia a tierra analógica de entrada destina a la realización de medidas. Las tres referencias a tierra se encuentran conectadas en el dispositivo. Las conexiones del módulo de electrónica con el módulo de monitorización pueden verse de forma más detallada en el Anexo A. Figura 2-3: Partes del módulo de electrónica y sus conexiones Amplificación y Estimulación 14 3.2 Diseño 3.2.1 INA333 Las señales ENG recogidas por los electrodos del módulo de cultivo (apartado 2.2.3) deben ser amplificadas eliminando el mayor ruido posible y el nivel de DC offset. Se opta por el uso de un amplificador de instrumentación, siendo implementado el encapsulado INA333 ajustando la ganancia a la máxima ofrecida. El INA333 es un amplificador de instrumentación de baja potencia, alta precisión y ganancia ajustable (3.4). Su pequeño tamaño y bajo consumo de energía hace este integrado ideal para aplicaciones portátiles. 100 1 g k GR   (3.4) Algunas de las características que convierten en interesante a este integrado para el proyecto son:  CMRR mínimo de 100dB.  Tensión offset máxima de 25µV.  Corriente de polarización de ±70pA.  Corriente de polarización máxima de 200pA.  Bajo ruido 50nV Hz .  Impedancia de entrada aproximada de 100GΩ.  Trabaja con una fuente de alimentación de 1,8–5,5V.  Reducido ruido en baja frecuencia de 1µVpp gracias a una técnica de auto-calibrado.  Se ajusta la ganancia (3.4) mediante una resistencia externa g R conectada a los terminales 1 y 8 en la figura 3-2. Figura 3-2: Esquema y pinout de INA333 15 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip La salida del amplificador de instrumentación está referenciada por el terminal REF (pin 5 en la figura 3-2) normalmente conectado a tierra. Si se quiere ajustar el nivel de offset se aplicará una tensión en dicho terminal. La alimentación del dispositivo también depende de esta referencia. Si alimentamos el dispositivo a 5V, la tensión aplicada a REF debe ser la mitad de la suministrada, si por el contrario no se quiere aplicar ninguna tensión en REF, se alimentará el integrado con ±2,7V. Por las prestaciones de las tarjetas de National Instruments (apartado 2.2.4) se opta por alimentar a 5V y poner una tensión de referencia (VREF) en REF de 2,5V, ya que ambas tensiones son suminstradas por puertos de estas tarjetas. Por este mismo motivo, los cuatro pocillos que componen el módulo de cultivo se encuentran polarizados a 2,5V consiguiendo así que todo el conjunto tenga la misma tensión de refencia. 3.2.2 Circuito de amplificación Como se ha visto en el apartado 2.3, cada pocillo tiene asignado cinco electrodos distribuidos asimétricamente para adqusición de señal. Cada electrodo detectará una señal celular distinta, por este motivo se integrarán tantos circuitos de amplificación como electrodos haya para dicha tarea. Se proponen 3 esquemas para amplificar las señales celulares. Cada uno de ellos será estudiado mediante simulación y pruebas.  El primer modelo emplea un INA333 para amplificar la señal detectada en el electrodo del módulo de cultivo respecto a VREF, ya que es a la tensión a la que se encuentra polarizado el cultivo (figura 3-3). Ambas entradas se conectarán al amplificador mediante resistencias de 100kΩ.  El segundo modelo propuesto parte del primero e integra dos capacidades de acoplamiento en serie con las resistencias ubicadas en la entrada. Dichas capacidades eliminan el nivel DC que contengan las señales a amplificar (apartado 3.1.2) consiguiendo que la estructura sea menos sensible a VREF. Las entradas siguen siendo la señal detectada en el electrodo frente VREF (figura 3-4). El valor de las capacidades a integrar está definido por su reactancia capacitiva 6 ( Xc ) según la función 1 2 c XfC   (3.5) donde f representa la frecuencia de la señal AC en hercios y C la capacidad en faradios. Como se trabajará con frecuencias del orden de decenas de hercios, las capacidades deben tener un valor pequeño filtrando una parte de la señal continua pero dejando pasar casi todas las señales restantes. Se escogen capacidades de 220nF. 6 Oposición ofrecida al paso de corriente alterna por el condensador, unidad ohmio (Ω) Figura 3-4: Modelo amplificación 2 Figura 3-3: Model amplificación 1 Amplificación y Estimulación 16 Figura 3-5: Modelo amplificación 3  El tercer modelo no difiere de los anteriores en efecto funcional pero su estructura es más próxima a la realidad. Se realiza una medida diferencial entre dos electrodos del pocillo en lugar de emplear un electrodo y VREF (figura 3-5). Asimismo, se emplean dos capacidades en la entrada para filtrar el nivel de DC y dos resistencias formando un filtro paso alto en cada una de las entradas del INA333. Este filtro se conectará a VREF ya que es la tensión de polarización del cultivo. De este modo, se consigue una estructura completamente simétrica con la consiguiente cancelación de ruido en el bucle, lo cual no era posible en los anteriores modelos. La frecuencia de corte del filtro paso alto ( fc ) ocurre cuando la resistencia y la reactancia capacitiva tienen el mismo valor. Empleando la ecuación (3.5) se dimensionan las capacidades y resistencias para que fc sea próxima a 10Hz y evitar así la amplificación de señales fuera del rango de estudio de este proyecto. Para optimizar los electrodos disponibles y tener en todos los amplificadores una señal de referencia común, se utiliza un electrodo de cada pocillo como señal común para amplificar g V tal como se adelantó en al figura 2-4, variando la otra entrada del amplificador por el electrodo correspondiente a su amplificación. En los tres modelos se añade una capacidad de desacoplo con valor de 0,1µF entre alimentación y tierra para reducir la susceptibilidad a las interferencias electromagnéticas (EMI). Las señales se registrarán en el módulo de monitorización facilitando el filtrado digital y el análisis de las señales. Ya que vamos a trabajar con señales comprendidas en el rango 5–500µV nos interesa tener la mayor ganancia posible en el encapsulado, en este caso el INA333 nos ofrece una ganancia máxima de 1.000, pero vamos a intentar conseguir una ganacia de 10.000 dando un valor a g R de 10 . 3.2.3 Estimulación El objetivo de este proyecto es la interacción con neuronas, para ello necesitamos un módulo de estimulación. Tal como se ha visto en el apartado 2.2.4 se realizará estimulación tanto por tensión o corriente como por luz en el caso de la retina y sólo estimulación por corriente para las neuronas. Para estimular la retina mediante luz se emplearán cuatro leds colocados en la zona de la interfaz electrónica más cercana a la zona de cultivo cada uno de ellos orientado a un pocillo. Se utilizarán 50 pulsos de 50ms de duración y con intervalos intermedios de 1500ms. En cuanto a la estimulación por corriente o tensión, tal como se ha visto en el estudio previo no hay ningún protocolo establecido para su realización. Se llevarán a cabo pruebas estimulando las células desde un valor bajo de corriente o tensión, y aumentando con una alta precisión sin superar los valores máximos alcanzados en otros proyectos para no dañar a las células. No se sabe si en el medio en el que se van a cultivar las células puede ocurrir electrolisis. Se realizarán pruebas aplicando distintas corrientes y tensiones mediante los electrodos del módulo de cultivo y se estudiará la reacción en la disolución. 17 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip c) d) a) b) El diseño a implementar son simples conexiones entre la monitorización y el módulo de cultivo garantizando que no hay corriente de fuga o en su defecto, que es la menor possible. 3.2.4 Simulaciones Para comprobar los diseños de amplificación se utiliza el simulador de circuitos TINA-TI de Texas Instruments basado en SPICE. Proporciona análisis en DC, AC, transitorio y en el dominio de las frecuencias. Se utiliza una librería con el INA333 para que la simulación sea lo más real posible. Se simularán los spikes producido por las células con una señal de tren de pulsos de pequeña amplitud, duración 1ms y un tiempo entre pulsos de 30ms. Los esquemas de los circuitos implementados en TINA-TI se pueden ver en el Anexo B. Se comienza simulando el primer modelo. La señal detectada por en el electrodo se reproduce conectando el tren de pulso entre una de las entradas y VREF, ya que en la práctica el pocillo donde se genera esta señal se encuentra polarizado a dicha tensión. Se simula el circuito variando la amplitud de los pulsos en el rango 10–500µV. En la figura 3-6 se muestra el tren de pulsos empleado en la entrada del circuito de amplificación y la salida obtenida referenciada por VREF. Figura 3-6: Simulaciones modelo 1 con amplitud de 50µV (a), 200µV (b), 350µV (c) y 500µV (d) en la señal de entrada y duración de pulso 10ms Amplificación y Estimulación 18 Como se puede ver en la figura 3-6, el circuito es capaz de detectar pulsos de muy baja amplitud como es el caso de 50µV. En la tabla 3-1 se encuentran los valores de tensión y amplitud medidos en las simulaciones y las ganancias obtenidas para cada una de las entradas. Tabla 3-1: Relación señal entrada/salida de las simulaciones del modelo 1 Amplitud de entrada Valores de salida Amplitud de salida Ganancia 50µV 2,50-2,61 V 110 mV 2200 200µV 2,50-2,94 V 440 mV 2200 250µV 2,50-3,04 V 540 mV 2160 350µV 2,50-3,27 V 770 mV 2200 500µV 2,50-3,59 V 1,09 V 2180 La ganancia del circuito está fijada en 10.000 por Rg como se ha visto en el apartado 3.2.2 pero en las simulaciones realizadas no conseguimos una ganancia mayor a 2.200. Esto se debe a la duración del pulso de entrada. La respuesta del INA333 varía en función de la ganancia fijada. Ya que la ganancia de los modelos propuestos es superior incluso a la máxima aconsejada para este integrado, el circuito será lento y tendrá un mayor tiempo de establecimiento como se puede ver en la figura 3-7 y figura 3-8. Se plantea disminuir la ganancia para estar en un mejor entorno de funcionamiento, pero conseguir amplitudes altas a la salida con las que poder trabajar es un requisito indispensable. Se hace una nueva simulación con el objetivo de ver si el circuito es capaz de alcanzar la ganancia esperada de 10.000. Se utilizará la entrada de menor amplitud simulada anteriormente, es decir 50µV, y una duración de 25ms. Tal como puede verse en la figura 3-9, dando una mayor duración al pulso el amplificador es capaz de responder y llegar a la amplitud esperada de 500mV. Estos aspectos habrá que tenerlos en cuenta a la hora de hacer las pruebas y comprobar si el comportamiento es similar con diferentes entradas y duraciones. Figura 3-8: Relación ganancia-tiempo de establecimiento en INA333 Figura 3-7: Relación ganancia-frecuencia en INA333 19 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Si los pulsos a la entrada tienen una amplitud mayor de 500µV la señal de salida satura en 5V ya que el amplificador de instrumentación se encuentra alimentado a esta tensión y no se puede obtener una salida con tensiones mayores. Aún así seremos capaces de detectar los spikes y de saber su duración como se puede ver en la figura 3-10. Se realizan estas mismas simulaciones tanto con el modelo 2 y el modelo 3. Se obtienen unos valores prácticamente iguales como se pueden apreciar en la tabla 3-2 y tabla 3-3. Para consultar las gráficas acudir al Anexo B ya que al ser similares a las obtenidas en la simulación del modelo 1 no se ha considerado indispensable plasmarlas aquí. Tabla 3-2: Relación señal entrada/salida de las simulaciones del modelo 2 Amplitud de entrada Valores de salida Amplitud de salida Ganancia 50µV 2,50-2,61 V 110 mV 2200 200µV 2,50-2,93 V 430 mV 2150 250µV 2,50-3,04 V 540 mV 2160 350µV 2,50-3,26 V 760 mV 2170 500µV 2,50-3,59 V 1,09 V 2180 Tabla 3-3: Relación señal entrada/salida de las simulaciones del modelo 3 Amplitud de entrada Valores de salida Amplitud de salida Ganancia 50µV 2,48-2,60 V 120 mV 2400 200µV 2,44-2,90 V 460 mV 2300 250µV 2,42-2,98 V 560 mV 2300 350µV 2,39-3,19 V 800 mV 2280 500µV 2,35-3,50 V 1,15 V 2300 Figura 3-10: Simulación modelo 1 con amplitud de entrada 1,50mV y duración de pulso 1ms Figura 3-9: Simulación modelo 1 con amplitud de entrada 50µV y duración de pulso 25ms Amplificación y Estimulación 20 Se realiza un análisis AC para conseguir la función característica en el rango de frecuencias de 10–100kHz. El tercer modelo es el único que tiene la respuesta esperada, tal como podemos ver al comparar la figura 3-11 con la figura 3-8 dada por el fabricante. 3.3 Pruebas realizadas Una vez están las simulaciones realizadas, se llevan a cabo una serie de pruebas para identificar cual es el mejor modelo de los tres propuestos. Se diseña una placa de circuito impreso (PCB) para realizar las pruebas. Se decide implementar el segundo modelo, ya que tan solo difiere del primero en las capacidades de entrada. Una vez se tenga el PCB se pueden cortocircuitar los pads de las capacidades en lugar de soldar estos componentes y se estará trabajando con el primer modelo de amplificación propuesto. Se integran dos filtros a la salida del INA333, un filtro paso alto y un filtro paso bajo. La máscara necesaria para el PCB se diseña mediante el software Altium Designer. Es una herramienta enfocada en el trazado y producción de sistemas electrónicos, con proyectos desde circuitos integrados a diseños de PCBs. Una vez que la máscara está lista, se procede a revelar dos placas con el mismo circuito de amplificación. Los componentes a soldar para esta primera prueba será el INA333, dos resistencias de 100kΩ de entrada, resistencia para la ganancia de 10Ω, capacidad de desacoplo con valor 0,1µF y los filtros mencionados anteriormente con capacidades 220nF y resistencias de 10kΩ. Se utilizará una versión de prueba del módulo de cultivo con electrodos embutidos en PDMS. Sobre la zona donde se colocarán las células, se aplica buffer de fosfato salino (PBS). El PBS es una solución acuosa y salina empleada en la investigación biológica y bioquímica formada por cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Es muy similar al líquido extracelular de los mamíferos y biocompatible con sus células. La polarización del medio, en este caso formado por PBS, se realizará mediante un electrodo fijando una tensión de 2,5V tal como se ha visto en el diseño. Figura 3-11: Bode modelo 3 21 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Para simular el dipolo generado por las células a depositar en el pocillo, se emplea un generador de onda con salida senoidal a la que se variará su amplitud y frecuencia. Se utiliza un cable BNC a dos pinzas cocodrilo, en las pinzas se colocan dos cables pequeños que serán sumergidos en el PBS generando así el dipolo. 3.3.1 Pruebas de estimulación Se deposita una pequeña cantidad de PBS en el pocillo y se sumergen los cables con el estímulo. Tras un tiempo de estimulación, se produce electrolisis en el medio como se sospechaba en el diseño previo. Aunque puede ser producido por los cables sumergidos y no por la tensión aplicada, debido a que el pocillo es un área reducida y los cables tienen un gran diámetro. Se elimina el PBS corrompido y se realiza una nueva prueba donde la estimulación se produce mediante dos electrodos del módulo de cultivo. De esta forma se intenta verificar tanto la estimulación y amplificación como la técnica de wire-bonding para crear los electrodos. Dejando el módulo de cultivo sin medio y estimulando mediante los electrodos, se puede detectar en el extremo superior del electrodo la señal introducida por el pad conectado al extremo inferior. Quedan verificados los electrodos. Se deposita de nuevo una pequeña cantidad de PBS y se realiza la estimulación con tensiones y corrientes variables. En este caso no se produce electrolisis, por lo que el esquema de estimulación queda verificado. Aunque este segundo esquema de estimulación sea el que se va a llevar a cabo en la interfaz electrónica, va a dificultar las pruebas del circuito de amplificación. No podrá simularse una situación real en la que las células estén depositadas sobre los electrodos de adquisición de datos. El dipolo celular simulado se entrega mediante los electrodos de estimulación, propagándose por el medio y de este modo llegando a los electrodos de adquisición. Las señales sufrirán más ruido y como se desconoce la resistividad del medio no se sabrá realmente que es lo que está recibiendo el amplificador. Sólo se sabe que es una señal relacionada con la originada en el generador de ondas. 3.3.2 Pruebas de amplificación Se verificará en primer lugar el correcto funcionamiento del modelo 1. Para ello se conecta un electrodo del módulo de cultivo a la entrada del circuito, la otra entrada se conectará a VREF como ocurre en el esquema simulado. Se alimenta el INA333 empleando 5V y 2,5V de referencia Se encuentra una primera limitación en el generador de ondas, para amplitudes inferiores a 200mVpp sólo se genera ruido. Además al estar trabajando con cables largos es mayor el ruido inducido, este problema se resolverá en la interfaz electrónica donde los componentes se encontrarán lo más próximo posibles y el conjunto del proyecto estará ubicado en una caja apantallada. Se comprueba que con esta topología de entrada el circuito no es capaz de amplificar nada más que ruido. Se disponen las señales de entrada igual que en el modelo 3, conectando ambas entradas del amplificador a electrodos del módulo de cultivo. Se sueldan capacidades de valor 220nF en la entrada y se verifica el funcionamiendo del modelo 2. Para realizar la medida se mantienen las conexiones de la prueba anterior, teniendo a la entrada del amplificador la señal recibida por dos de los electrodos del módulo de cultivo. Los resultados son satisfactorios. Se aprecia que al ubicar las capacidades en la entrada del circuito ha disminuido el ruido en la salida del amplificador. Se utilizan dos PCBs del modelo 2 para verificar su comportamiento en paralelo, ya que en la intefaz electrónica se llevará a cabo 16 amplificaciones paralelamente. (Figura 3-12) Amplificación y Estimulación 22 Como puede verse en la figura 3-13, utilizando una señal de entrada de 400mVpp con frecuencia 150Hz, se obtiene una señal de salida con amplitud aproximada 1,4Vpp. Es decir, conseguimos 3,5 de ganancia, la cual está completamente fuera de lo esperado, sobre todo teniendo en cuenta que las señales reales a amplificar tendrán una amplitud menor a la utilizada en la prueba. Para simular el tercer modelo, se utiliza el mismo PCB de la prueba anterior pero adaptándolo para ubicar las resistencias del filtro paso alto en una placa de prueba. De esta forma se pueden probar con mayor facilidad distintos valores de resistencias y ver cual es el valor que da mejores resultados. (Figura 3-14) Tras realizar varias pruebas, se fijan las resistencias a la entrada del circuito a un valor de 100kΩ y las capacidades a 220nF. Con este modelo sí obtenemos los resultados esperados y de forma muy satisfactoria. Al igual que ocurrió en la anterior prueba, no se pudo reducir la amplitud de la señal de entrada a más de 200mVpp, siendo un valor elevado en relación a los transimitidos por las células. Aun así, se obtiene a la salida una señal amplificada con ganancia 25 de la producida por el generador de ondas. (Figura 3-15) La señal teórica esperada a la salida, debería tener una amplitud de 2.000V por la ganancia 10.000. Como sabemos eso no es posible, entre otros factores porque la salida del amplificador satura en 5V como se ha visto en el apartado 3.2.4. Para comprobar si la señal que se está recibiendo a la salida es realmente la señal de entrada amplificada, se procede a hacer un análisis en frecuencias aplicando la Transformada Rápida de Fourier. (Figura 3-15) Figura 3-12: Montaje prueba modelo 2 Figura 3-13: Salida amplificada con entrada de 400mVpp frecuencia 50Hz, modelo 2 Figura 3-14: Montaje prueba modelo 3 23 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Mediante esta técnica se pudo observar en el osciloscopio como la componente de la señal de entrada variaba al modificar la frecuencia de dicha señal. De esta forma, aún trabajando un entorno, se podrá detectar con claridad la frecuencia de la señal transmitida. Por otro lado, los filtros paso alto y paso bajo integrados en el PCB no aportan señales de calidad para el estudio, luego el fitlrado de las señales se realizará en la interfaz gráfica de LabView. Como conclusión de las pruebas realizadas, se ha comprobado que el tercer modelo tiene un comportamiento superior al resto, por lo tanto será el circuito a implementar en la intefaz electrónica. Figura 3-16: Análisis en frecuencias, FFT Figura 3-15: Salida amplificada con entrada 200mVpp frecuencia 150Hz, modelo 3 Interfaz Electrónica 30 5.1.2 Diseño esquemático Altium Designer ofrece la posibilidad de crear un documento esquemático de un circuito y después exportarlo como documento PCB. Es una forma fácil de verificar en un proyecto de esta magnitud que todas las conexiones están hechas adecuadamente y no se ha olvidado ninguna señal a conectar en el PCB por el camino. El primer paso es crear la huella de los componentes que se van a utilizar siguiendo las especificaciones de los fabricantes. INA333, transistores, conector USB para la batería externa necesaria en la electrónica de potencia, LEDs, conectores para el módulo de monitorización, resistencias y capacidades de su correspondiente encapsulado y conectores para el módulo de adaptación. Se añade la figura 3D de cada componente para poder hacer una valoración final del PCB antes de fabricarlo. Los conectores de batería empleados para la conexión con el módulo de cultivo, tienen cuatro conexiones por encapsulado, necesitando un total de 12 conectores. Para ahorrar tiempo en colocar cada encapsulado en su correspondiente posición en el PCB, se diseña un solo componente que integre todos los conectores en la forma en la que se vayan a ubicar en el PCB. Todo esto se planifica con el compañero del módulo de cultivo para evitar cualquier descoordinación entre ambos módulos. Se dibujan los circuitos a integrar en la interfaz electrónica utilizando los componentes diseñados. En el conector del módulo de monitorización se dibujan cada una de las señales que entran o salen de la interfaz electrónica en el terminal correspondiente. Así se podrá saber en todo momento si falta alguna señal por conectar. Estas conexiones pueden consultarse en el Anexo A. Después se realizan las conexiones de estas señales con los circuitos electrónicos y las señales internas entre los distintos bloques. Las conexiones y los distintos módulos pueden encontrarse en el Anexo C. Se dibuja el esquemático del sistema de amplificación. En cada pocillo hay 5 electrodos destinados a amplificación donde uno de ellos es el electrodo común de referencia, se harán cuatro sistemas de amplificación por pocillo, un total de 16 en la interfaz electrónica. Se añade un jumper para seleccionar la tensión de polarización del medio, siendo posible VREF o tierra. Las tarjetas de National Instruments ofrecen distintas tierras según su aplicación pero todas conectadas en el dispositivo.  AIGND: Tierra analógica de entrada. Se utilizará en los circuitos donde se vaya a realizar medidas, es decir, en los circuitos de adaptación del NTC y circuitos de amplificación.  AOGND: Tierra analógica de salida. Se utilizará en el circuito de acondicionamiento de VREF.  DGND: Tierra digital. Está destinada a las entradas y salidas digitales. Se utilizará para la electrónica de potencia. 31 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip 5.1.3 Diseño PCB Cuando el documento esquemático está compilado y todas las conexiones están verificadas, se exporta a un documento PCB donde se encontrarán las huellas de los componentes de cada circuito implementado. El PCB tendrá componentes tanto en la cara inferior como superior y constará de dos planos internos, uno de alimentación 5V y otro para AIGND. Esto facilitará las conexiones. El primer paso es fijar las dimensiones del PCB a las medidas de la caja. Después se realiza la cavidad necesaria para que el módulo de microfluídica no interactue con la electrónica. Su ubicación será en el lado superior para facilitar la conexión con el módulo de adaptación. Los conectores para el módulo de cultivo se encontrarán en la cara inferior del PCB y el resto de la electrónica en la cara superior para evitar interferencias en la adquisción de datos. Los circuitos de amplificación se situan lo más cerca posible a los conectores, a su vez los componentes que los forman deben estar próximos entre ellos, para evitar cualquier tipo de interferencias. Se ubican las conexiones con el módulo de monitorización en la esquina inferior izquierda, situando dos en el lateral izquierdo y otros dos en el lado inferior. Mecanizando el lateral izquierdo de la caja, podrán acceder los cables a las tarjetas de National Instruments. La conexión con el módulo de adaptación se sitúa en el lado superior, ya que es donde se ubica el módulo para realizar su conexión con la microfluídica. Por otro lado, el conector USB para la electrónica de potencia debe situarse en la zona superior del lateral izquierdo por el mecanizado de la caja, por lo tanto la electrónica de potencia se situará en la esquina superior izquierda estando cerca de la conexión con el módulo de adaptación, facilitando así la conexión del microcalentador. Además esa zona está alejada de los circuitos de amplificación para evitar interferencias innecesarias. Los módulos de adaptación de medidas se situarán lo más cerca posible de sus respectivos módulos y los circuitos de acondicionamiento de VREF donde sea más sencillo realizar el rutado. Una vez todos los componentes están situados, se comienza a rutar cada circuito independientemente. Después se realizan las conexiones de esos circuitos con sus respectivos módulos y por último las conexiones con el módulo de monitorización, ya que son las más complejas y requieren más espacio en el PCB. Las conexiones de los circuitos de potencia con los LEDs y los microcalentadores del módulo de cultivo, se realizarán afectando lo menos posible a la amplificación. Se añaden 6 huecos para colocar tornillos, dos de ellos empleados para alineación con el módulo de cultivo y los cuatro restantes para alineación el resto del proyecto. Una vez el PCB esté listo, se compila el proyecto, que contiene tanto el documento esquemático como el PCB para comprobar que ambos son iguales. Se realiza un análisis DRC (design rule check) para comprobar que todo es correcto y que se cumplen los requisitos del fabricante. Interfaz Electrónica 32 Figura 5-1: Captura del PCB de la interfaz electrónica 33 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip 5.2 Pruebas Cuando la placa está fabricada, se prueban cada uno de los bloques de la interfaz electrónica por separado. Se sueldan los componentes de los circuitos de adaptación y los circuitos de potencia. Para probar la adquisción de datos se va a trabajar en un solo pocillo, se soldarán dos de los cuatro circuitos de amplificación correspondientes a este pocillo, para verificar el correcto funcionamiento de este circuito y saber si se puede adquirir datos de forma paralela. Las pruebas de la interfaz electrónica se realizan de la misma forma que se probó el circuito de amplificación (apartado 3.3). Se conecta la interfaz electrónica al módulo de cultivo, se deposita PBS en el pocillo correspondiente a los amplificadores que se van a probar y se simula el dipolo mediante un generador de ondas haciéndolo llegar al pocillo mediante los electrodos de estimulación. En la figura 5-3 se puede ver una foto del montaje utilizado en las pruebas. Se utiliza una señal senoidal como entrada. Se varía su amplitud desde los 500mVpp a los 10mVpp y la frecuencia entre 80Hz y 1kHz. Los resultados son mejores de los obtenidos en las pruebas individuales de amplificación, la señal a la salida de los amplificadores es clara a pesar del ruido de la señal de entrada. En todas las pruebas realizadas se obtienen las señales a la salida saturadas, esto se debe a que los valores de entrada son superiores a los teóricos para los que ha sido diseñado el circuito, luego al estar pidiendo una ganancia de 10.000, la salida será mayor a 5V, de ahí la saturación. Por problemas con los equipos utilizados, la menor amplitud conseguida para la estimulación ha sido de 10mVpp, se puede apreciar en la figura 5-4 la buena respuesta que tiene el sistema utilizando una frecuencia de 210Hz. Se realizan pruebas con otro generador de ondas y al probar con frecuencias inferiores, el generador de ondas no nos da la señal tan limpia como sería necesaria, introduciendo mucho ruido que dificulta el filtrado y amplificación de la señal. Aun así el circuito de amplificación es capaz de detectar la señal con frecuencia de 28Hz y amplitud de 500mVpp, la mínima que ofrece este generador de ondas tal como puede verse en la figura 5-5. Para frecuencias inferiores si se hace un análisis FFT se ve como el circuito es capaz de detectar la componente en frecuencia de la señal amplificada, tal como se muestra en la figura 5-6. Figura 5-3: Salida amplificada con entrada 10mVpp frecuencia 210Hz, interfaz electrónica Figura 5-2: Montaje de la prueba realizada con la interfaz electrónica Interfaz Electrónica 34 En las siguientes pruebas se comprobará el correcto funcionamiento de los bloques de potencia utilizando el entorno de desarrollo LabView. Los LEDs se activarán mediante una variable booleana eligiendo su estado encendido o apagado. Como se puede ver en la figura 5-7 se obtiene el comportamiento esperado. En cuanto a los calentadores, se realizarán las pruebas de forma similar. Se fijará una temperatura máxima y una temperatura mínima, dado que la medida de temperatura del medio se realiza constantemente, utilizando una modulación PWM se activarán los calentadores a distintas frecuencias según el punto en el que se encuentre la temperatura medida respecto al rango fijado. Se independizan los microcalentadores del módulo de cultivo y los del módulo de adaptación. Si la temperatura del medio se encuentra por debajo del nivel superior, se mantendrán los calentadores activos durante más tiempo. Si por el contrario la temperatura es superior al nivel máximo establecido, los calentadores se activarán durante un tiempo mucho menor consiguiendo que la temperatura se mantenga constante en un valor medio entre ambos niveles. No se volverá al primer tiempo de funcionamiento hasta que la temperatura sea menor que el valor mínimo establecido. Figura 5-5: Análisis FFT con frecuencia de 16Hz de la señal de entrada Figura 5-4: Salida amplificada entrada 500mVpp frecuencia 28Hz, interfaz electrónica Figura 5-6: Pruebas de las pruebas de iluminación de los leds en la interfaz electrónica 35 Interfaces Electrónicos Neuronales para su Aplicación en Lab-on-chip Tras las pruebas realizadas, los microcalentadores funcionan según lo esperado manteniendo una temperatura constante en 37º ± 0,5. Para hacer las pruebas de los circuitos de amplificación el dipolo se generará por la interfaz de LabView y pudiéndose seleccionar la frecuencia y amplitud de trabajo desde la interfaz. De igual forma las salidas amplificadas también se recogerán en LabView siendo almacenadas para realizar estudios sobre el comportamiento de las neuronas a lo largo del tiempo o estudiar la información que puedan proporcionar. Estas pruebas se realizan con los conectores de batería utilizados para la conexión con el módulo de cultivo soldados, así se asegura el estudio en las condiciones reales de ruido. En la figura 5-8 se puede ver la respuesta de la interfaz electrónica ante una entrada de 742Hz con amplitud 0,17Vpp y una entrada de 138Hz con amplitud 0,10Vpp. Como conclusión, con la interfaz LabView se pueden capturar las señales obteniendo señales más estables y con menor interferencia de ruido. Aun así, trabajando con una ampplitud de entrada menor a 80mVpp el ruido de las tarjetas de National Instruments interfieren en los circuitos de amplificación introduciendo ruido. Al hacer las pruebas fuera de la caja apantallada pueden ser otros factores los que estén aportando ruido. Se comprueba que los microcalentarores, los leds y la adquisición de señal pueden trabajar en paralelo. Figura 5-7: Captura de los dipolos antes y después de la amplificación en la interfaz electrónica Figura 5-8: Respuesta de la interfaz electrónica con una entrada de 72,5Hz y amplitud 70mVpp Interfaz Electrónica 36 37 6 CONCLUSIONES Tal como se ha ido detallando a lo largo de la memoria, se han llevado a cabo una serie de tareas que recogen desde documentación de cultivos celulares in vitro, hasta el diseño y verificación de circuitos electrónicos. La tarea más difícil de realizar en esta interfaz electrónica es trabajar con señales tan débiles como son las celulares. Para solucionar este problema se han diseñado varios modelos de amplificación, obteniendo los mejores resultados al realizar una medida completamente diferencial donde las señales de entrada del amplificador se adquieren directamente de los electrodos de cultivo, consiguiendo un ruido menor en la señal a amplificar y una buena ganancia. Además se han diseñado circuitos complementarios para adaptación de medidas y acondicionamiento de señales y los circuitos de potencia necesaria para los microcalentadores y la estimulación por luz. Todo ello se ha integrado en una sola interfaz electrónica, teniendo siempre presentes los requisitos del proyecto global, como ha sido el tamaño y ubicación de los distintos bloques. Se integran los circuitos de potencia interfiriendo lo menos posible con el resto de electrónica. Tras soldar los componentes en la interfaz electrónica, se realizan pruebas tanto con el equipo de laboratorio como con el entorno de desarrollo LabView, donde se verifica el control de temperatura, la iluminación de los LEDs, la estimulación y la adquisición de datos y amplificación. Como conclusión, debido a las limitaciones de los equipos utilizados y el ruido introducido por las tarjetas de adquisición, la señal de menor amplitud utilizada ha sido de 10mVpp, obteniendo una amplificación perfecta. De igual modo, el circuito responde bien a los cambios en frecuencia y amplitud. Se ha conseguido el objetivo de crear una interfaz electrónica que permita la comunicación electróniconeuronal para su aplicación en Lab-on-chip. Desde un punto de vista personal, la realización de este proyecto ha contribuido a asentar y ampliar mis conocimientos de electrónica. He mejorado mis habilidades de diseño, ampliado mis conocimientos de trabajo con equipos de laboratorio y he aprendido a realizar una buena toma de decisión en cuanto a componentes electrónicos. Además, este proyecto me ha ayudado a aprender más sobre campos con los que no había estado en contacto, como es la microfluídica o la biomedicina. Incluso el poder trabajar con materiales como el PDMS que no había tenido oportunidad de ver con anterioridad. Debido a la necesidad de diseñar y simular los circuitos electrónicos, he tenido la posibilidad de aprender y trabajar con un nuevo software de diseño como es Altium Designer o TINA-TI. 6.1 Posibles mejoras Como posible ampliación y continuación del trabajo realizado en este proyecto, se estudia la posibilidad de incluir sensores de Ph en el módulo de adaptación para verificar el estado de las células, obteniendo así mayor información sobre ellas. Los circuitos de adaptación necesarios para estas medidas se integrarán en la interfaz electrónica. También se podría incluir un conjunto de resistencias con interruptor de selección o un potenciómetro que sustituyan la resistencia de ganancia en los amplificadores de instrumentación. De esta forma se ofrece un cambio fácil de ganancia del circuito sin la necesidad de estar desoldando la capacidad de ganancia fijada. Por otro lado, sería interesante la activación de los LEDs por LabView utilizando una señal a la frecuencia establecida para la estimulación por luz. Conclusiones 38 Se plantea cambiar el módulo de cultivo, ya que la técnica de wire-bonding empleada para hacer los electrodos es costosa e implica una pausa en la cadena de fabricación del Lab-on-chip. Es importante tener en cuenta que la separación entre los electrodos de estimulación y adquisición debe ser de unos cientos de micras para reducir el acoplamiento a través del tejido y las vías de corriente parásita. Para una versión mejorada, sería de interés integrar una FPGA que realice todo el estudio de las señales y control de los parámetros del experimento, independizando así el Lab-on-chip de la necesidad de utilización de un ordenador. 39 E3 A3 AC A4 E4 E1 A1 P A2 E2 C1 E1 A1 AC A2 E2 E3 A3 P A4 E4 C1 N C A E P E A A E A E A 2 1 1 2 2 3 3 C 4 4 A E A E A A E P E A C N 1 1 C 2 2 3 3 4 4 2 Figura A-1: Módulo de cultivo y conexiones con la interfaz electrónica ANEXO A: CONEXIONES INTERFACES Conexiones de la interfaz electrónica con el módulo de cultivo  AC: Electrodo de referencia para amplificación.  P: Electrodo para la polarización del medio.  N: Electrodo de conexión para el termistor NTC.  E[x]: Electrodo destinado a la estimulación.  A[x]: Electrodo destinado a amplificación.  C[x]: Electrodos de conexión para los calentadores 1 y 2.  P[x]: Pocillo número x. Para la estimulación se utilizan 8 señales de estímulos. Los estímulos 0, 1, 2 y 3 se conectarán al pocillo 1 y pocillo 3. Los estímulo 4, 5, 6 y 7 se conectarán al pocillo 2 y pocillo 3. Conexiones de la interfaz electrónica con LabView Para realizar las conexiones con LabView se utilizan dos tarjetas de adquisición de datos de National Instruments, NI USB 6211 y NI USB 6009 utilizando cuatro IDC para realizar las conexiones. En la siguiente tabla se muestran las conexiones de la electrónica con los IDC y con LabView P1 P2 P3 P4 Anexo B: Simulaciones 46 47 ANEXO C: CIRCUITO ESQUEMÁTICO Figura C-1: Captura del esquema implementado en Altium Designer Anexo C: Circuito Esquemático 48 49 REFERENCIAS [1] M. H. Zarifi, J. F. S. Farshchi y J. W. Judy, «A Low-Power, Low-Noise Neural-Signal Amplifier Circuit in 90-nm,» de 30th Annual International IEEE EMBS Conference, Vancouver, 2008. [2] Yoonkey Nam y Bruce C. Wheeler, «In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural,» Critical Reviews™ in Biomedical Engineering, pp. 39:45-62, 2011. 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