Inestabilidad de la horquilla de replicación provocada por los intermediarios de la ruta de reparación por escisión de bases

Inestabilidad de la horquilla de replicación provocada por los intermediarios de la ruta de reparación por escisión de bases Tesis doctoral María José Peña Gómez Departamento de Genética Facultad de Biología Inestabilidad de la horquilla de replicación provocada por los intermediarios de la ruta de reparación por escisión de bases Tesis doctoral presentada por María José Peña Gómez, graduada en Biomedicina Básica y Experimental y con un máster en Fisiología y Neurociencia, para optar al grado de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla Director de Tesis: Iván Valle Rosado Sevilla, 2024 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) Iván Valle Rosado, profesor contratado doctor del departamento de Genética, Facultad de Biología, de la Universidad de Sevilla e investigador principal del grupo “Replicación y daño endógeno en el ADN” en CABIMER, certifica que la presente memoria titulada “Inestabilidad de la horquilla de replicación provocada por los intermediarios de la ruta de reparación por escisión de bases” ha sido realizada por María José Peña Gómez bajo la dirección de quien suscribe, y cumple la condiciones exigidas para optar al título de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla. Iván Valle Rosado FINANCIACIÓN El trabajo de investigación descrito en esta memoria ha sido realizado en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) y en el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER). Para su ejecución, el trabajo de investigación ha contado con la colaboración de los siguientes Programas de Investigación: - Financiación adicional para la contratación laboral de Doctores por Centro de Investigación y Desarrollo (Actuación Ramón y Cajal) del Ministerio de Ciencia y Universidades (RYC-2015-18670) - Plan Estatal 2017-2020 Retos - Proyectos I+D+i del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-100692-B-I00) - Proyectos de Investigación en Salud de la Junta de Andalucía (Consejería de Salud) (PI-0005-2018) - PAIDI 2018: Proyectos I+D+i de la Junta de Andalucía (Consejería de Economía y Conocimiento) (P18-RT-1271) - Proyectos I+D+i FEDER Andalucía 2014-2020 de la Junta de Andalucía (Consejería de Economía, Conocimiento, Empresas y Universidad) (US-1381081) - Plan Estatal 2021-2023 - Proyectos Investigación Orientada del Ministerio de Ciencia e Innovación (PID2021-128988OB-I00) María José Peña Gómez ha disfrutado de un contrato como Titulado Superior conforme a la Ley 12/2001 de 9 de julio (BOE de 10 de julio) especialmente por su Disposición adicional séptima, por la Ley 14/2011 de 23 de diciembre, y real Decreto 2.720/1998 de 18 de diciembre (BOE de 8 de enero), a cargo de los proyectos RYC-2015-18670, RTI2018100692-B-I00 y P18-RT-1271, y de una ayuda predoctoral financiada por el proyecto de Contratación de Personal Investigador en Formación (Convocatoria 2021) de la Junta de Andalucía (Consejería de Transformación Económica, Industria, Conocimiento y Universidades), con nº de expediente PREDOC_00505. AGRADECIMIENTOS Después de 7 años es difícil empezar. En primer lugar, quiero agradecer a Iván su confianza, por apostar por aquella muchacha que llegó a su laboratorio sin ninguna expericiencia, solo con ganas de hacer ciencia y aprender. Gracias por apostar por mí, por ver mi potencial y explotarlo al máximo, ya que gracias a eso has hecho que sea capaz de difundir ciencia a través de los diferentes congresos a los que hemos asistido, a ver mundo y conocer a personas relevantes en nuestro campo. Gracias por enseñarme a ser mejor científica. Gracias mamá, papá y hermana por todo vuestro apoyo en estos años. A pesar de no entender mi trabajo, de no entender las horas y los días que pasaba delante del ordenador, de los festivos y fines de semana yendo al laboratorio porque tenía un experimento importante, siempre habéis estado ahí dándome fuerza para no abandonar el camino, y al final lo he conseguido. Gracias por no haberme dejado caer cuando me han faltado fuerzas para continuar, sobre todo durante el último año. Siempre habéis estado para darme el abrazo que necesitaba. Sin vuestra ayuda esto no hubiera sido posible. Andrés, mi fiel compañero que ha sufrido esta tesis conmigo más que ninguno. Gracias por no abandonar el barco, gracias por haber seguido ahí a pesar de lo abandonado que has estado por mi, porque a pesar de los “mañana sábado/domingo tengo que ir” u “hoy era un experimento largo y voy a llegar tarde”, siempre has estado para darme la fuerza que muchos días me ha faltado y por levantarme cada vez que ha habido un problema, o ser el primer abrazo que he dado después de haber publicado un artículo o haber sido seleccionada para poder asistir a un congreso. Gracias y mil gracias por haber estado, estar y sé que siempre estarás. Hemos llegado al final y sin ti no hubiera podido hacerlo. Mis amigos… Mi trabajo y mis células un mundo para ellos. Un trabajo “muy abstracto que no se ve”, pero siempre han estado para sacarme una sonrisa y darme palabras de apoyo cada vez que he estado bastante agobiada. Durante estos años habéis celebrado conmigo cada artículo publicado o cada congreso al que he asistido como si fuera un logro vuestro. Habéis estado presentes en cada aventura de mis viajes a los congresos, preocupados por mi llegada y mi vuelta, porque también podría escribir un libro con cada una de las anécdotas que he sufrido. Gracias por ser mis amigos y una parte de esta tesis os la dedico a vosotros. Sé que me quedo corta con lo que pongo, todas las personas que han estado ahí contribuyendo a que esta tesis haya sido posible se merecen mucho más, pero ellos saben lo que les quiero y lo importante que ha sido tenerlos a mi lado durante estos años. Compañeros de laboratorio, tanto del IBiS como de CABIMER. Clara, gracias por enseñarme todo lo que sé. Fuiste la primera que me acogió cuando llegué al grupo y siempre has estado ahí para cada duda que he tenido. Gracias por todos los consejos que me has dado y por todo tu conocimiento. Fernando, Diana, Espe, Joaquín, Carmen y José, con vosotros empezó esta aventura en el laboratorio 212 y me siento muy orgullosa de ver como finalmente todos estamos terminando esta etapa y hemos logrado nuestro objetivo. Gracias por todos los lab meetings, que a pesar de empezar con miedo y con mi “chuleta” delante de las diapositivas, habéis sido muy importantes en todos los pasos que he dado durante este tiempo y me habéis ayudado mucho. A las personas que he conocido en CABIMER y especialmente al laboratorio CT4, habéis sido parte del final de esta tesis y siempre vais a tener un espacio especial en mi. Irene, gracias por cada charla que hemos tenido al final de largos días de experimentos, he sentido tu apoyo durante estos años y te agradezco los AGRADECIMIENTOS consejos y las palabras de ánimo que me has dado. Yaiza y Marta, llegásteis al grupo al final de esta etapa, pero habéis sido un gran apoyo en este tiempo. Gracias por las comidas en “La Manuela”, por las organizaciones de la campana de cultivo para poder cuadrarnos las 3, y, sobre todo, por haberme acompañado en esta última etapa, no me he sentido sola y eso os lo agradezco. Laura, Mercedes y Paula, con vosotras empezó todo aquel año 2013 cuando empezamos la carrera y no sabíamos qué nos iba a deparar el futuro, y a pesar de la distancia, habéis estado ahí. He sido la última en conseguirlo, pero al final “HABEMUS TESIS”. GRACIAS, GRACIAS Y MIL GRACIAS. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………... 29 1.1. La replicación del ADN y el estrés replicativo…………………………….. 31 1.1.1. Replicación del ADN………………………………………………... 31 1.1.2. Estrés replicativo……………………………………………………. 34 1.1.2.1. Síntesis de translesión (TLS)……………………………..... 36 1.1.2.2. Reversión de la horquilla de replicación…………………… 36 1.1.2.3. Recebado o repriming……………………………………... 37 1.2. Los mecanismos de reparación del ADN………………………………….. 38 1.2.1 El papel de la ruta de reparación Anemia de Fanconi (AF) para la eliminación de los ICLs……………………………………………………. 39 1.2.2. El papel de la ruta de reparación por escisión de bases (BER) en la eliminación de bases de ADN modificadas………………………………… 41 1.2.3. Los mecanismos de reparación de DSBs…………………………….. 44 1.2.3.1. La ruta de reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ)……………………………………………………………... 44 1.2.3.2. La ruta de reparación por recombinación homóloga (HR)…. 45 1.3. Factores que estabilizan la horquilla de replicación frente al estrés replicativo……………………………………………………………………… 47 1.3.1. Componentes de la ruta de reparación AF que presentan un papel en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación…………... 47 1.3.2. Componentes de la ruta de reparación BER que tienen funciones relacionadas con el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación…………………………………………………………………. 50 1.4. La presencia de huecos de ssDNA como fuente de daño en el ADN………. 52 1.5. HMCES, un factor protector de los sitios AP……………………………… 54 1.6. La presencia de bases de ADN modificadas en el genoma puede causar estrés replicativo…………………………………………………………… 56 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………… 59 3. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………... 63 3.1. Procedimientos cultivos celulares…………………………………………. 65 3.1.1. Líneas celulares……………………………………………………... 65 3.1.2. Cultivo celular………………………………………………………. 65 3.2. Técnicas de biología celular……………………………………………….. 65 3.2.1. Transfección con ARN pequeño de interferencia (siRNA; del inglés small interfering RNA)……………………………………………………... 65 3.2.2. Transfección con plásmidos…………………………………………. 66 3.2.3. Generación de líneas celulares mutantes mediante la técnica CRISPR-Cas9……………………………………………………………… 66 3.2.4. Reacción celular Click-iT……………………………………………. 68 3.2.5. Análisis del ciclo celular…………………………………………….. 68 3.2.6. Inmunofluorescencia………………………………………………... 68 3.2.7. Detección de células BrdU+ mediante inmunofluorescencia……….... 69 3.2.8. SIRF (in situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks)……………………………………………………………………… 69 3.2.9. Ensayo de aberraciones cromosómicas……………………………… 71 3.2.10. Ensayo de intercambio de cromátidas hermanas (SCEs)…………… 72 3.2.11. Ensayo de viabilidad MTT…………………………………………. 72 3.2.12. Ensayo de clonogenicidad………………………………………….. 73 3.3. Técnicas de biología molecular……………………………………………. 73 3.3.1. Western Blot…………………………………………………………. 73 ÍNDICE 3.3.2. iPOND (Isolation of Proteins on Nascent DNA)…………………….. 74 3.3.3. Ensayo de retención en cromatina…………………………………… 75 3.3.4. Ensayo de fibras de ADN……………………………………………. 76 3.3.5. Ensayo de cometas en condiciones alcalinas………………………… 77 3.3.6. Microscopía electrónica……………………………………………... 77 3.4. Análisis estadísticos……………………………………………………….. 79 3.5. Tabla de materiales………………………………………………………... 79 3.5.1. Líneas celulares……………………………………………………... 79 3.5.2. siRNA……………………………………………………………….. 80 3.5.3. Plásmidos……………………………………………………………. 81 3.5.4. Antibióticos de selección……………………………………………. 81 3.5.5. Reactivos……………………………………………………………. 82 3.5.6. Anticuerpos………………………………………………………….. 83 4. RESULTADOS………………………………………………………………… 85 4.1. CAPÍTULO 1: XRCC1 previene la inestabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación errónea de la base de ADN modificada 5hmdU…………………………………………………………………………. 87 4.1.1. La exposición a 5hmdC o a 5fdC desencadena la activación de la ruta BER en la línea celular humana U2OS……………………………………... 89 4.1.2. XRCC1 mantiene la estabilidad genómica y la supervivencia celular tras la exposición a 5hmdC………………………………………………… 93 4.1.3. XRCC1 mantiene la estabilidad de la horquilla de replicación durante la eliminación de la 5hmdC………………………………………………… 96 4.1.4. El reclutamiento de PARP1 a la cromatina exacerba el daño en el ADN mediado por la 5hmdC en ausencia de XRCC1……………………… 97 4.1.5. El tratamiento con 5hmdU recapitula los fenotipos de inestabilidad genómica y de arresto/bloqueo de la horquilla de replicación mediados por 5hmdC en ausencia de XRCC1…………………………………………….. 100 4.2. CAPÍTULO 2: FANCD2 mantiene la estabilidad del genoma durante la incorporación errónea de la base hidroximetilada 5hmdU……………………... 105 4.2.1. El tratamiento con 5hmdC desencadena la DDR en las células deficientes en FANCD2……………………………………………………. 107 4.2.2. La 5hmdC se desamina a 5hmdU in vivo y se incorpora durante la replicación del ADN……………………………………………………….. 114 4.2.3. La incorporación de la 5hmdU provoca daño en el ADN asociado a la fase S del ciclo celular y bloquea la progresión de la horquilla de replicación…………………………………………………………………. 116 4.2.4. La 5hmdU induce la degradación nucleolítica del ADN naciente tras el bloqueo de la horquilla de replicación…………………………………… 121 4.2.5. El incremento de PARP1 unido a cromatina exacerba los fenotipos observados en ausencia de FANCD2 tras la incorporación de la 5hmdU…... 125 4.2.6. La incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN induce la activación de la ruta de reparación HR…………………………… 128 4.3. CAPÍTULO 3: Inestabilidad de la horquilla de replicación inducida por los intermediarios de la ruta de reparación BER en ausencia de FANCD2………… 131 4.3.1.Los huecos de ssDNA que surgen por las actividades coordinadas de SMUG1 y APEX1/2 durante la eliminación de la 5hmdU del ADN naciente son responsables de los fenotipos de inestabilidad de la horquilla de replicación…………………………………………………………………. 133 ÍNDICE 4.3.2. La persistencia de los SSBs en la horquilla de replicación exacerba la letalidad celular en la línea celular Fancd2-/-…………………………….. 142 4.4. CAPÍTULO 4: HMCES perturba la estabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación errónea de la 5hmdU…………………….. 147 4.4.1. La unión de HMCES con los sitios AP en la cadena naciente, generados tras la eliminación de la 5hmdU, es responsable de la formación de los huecos de ssDNA en las células deficientes en FANCD2…………… 149 4.4.2. PRIMPOL es responsable de la generación de un subconjunto de huecos de ssDNA tras la incorporación de la 5hmdU………………………. 159 5. DISCUSIÓN……………………………………………………………………. 165 6. CONCLUSIONES……………………………………………………………... 183 7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………. 187 8. APÉNDICES…………………………………………………………………… 199 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS Figura I1. Esquema simplificado de la síntesis de la hebra continua y la hebra rezagada durante la replicación del ADN…………………………………………. 32 Figura I2. Proceso de replicación del ADN………………………………………. 34 Figura I3. Lesiones generadas por fuentes endógenas y exógenas que causan estrés replicativo………………………………………………………………….. 35 Figura I4. Mecanismos de DDT………………………………………………….. 38 Figura I5. Esquema simplificado del mecanismo de reparación de un ICL por la ruta de reparación AF……………………………………………………………... 41 Figura I6. Modelo de la ruta de reparación BER………………………………….. 43 Figura I7. Mecanismo de acción de la ruta de reparación NHEJ………………….. 45 Figura I8. Esquema simplificado del mecanismo de reparación HR……………... 46 Figura I9. Mecanismo de acción de los PARPi…………………………………… 53 Figura I10. Mecanismo de protección de los sitios AP en ssDNA por la unión covalente de HMCES……………………………………………………………... 55 Figura I11. Estructura química de los diferentes derivados de la citosina………… 57 Figura M1. Representación de la localización de los guías de ARN elegidos para la generación de mutantes mediante la técnica CRISPR-Cas9…………………….. 67 Figura M2. Secuenciación del plásmido PX458 tras la inserción de los guías de ARN para la realización de la técnica CRISPR-Cas9……………………………... 67 Figura M3. Esquema de la técnica SIRF para detectar la asociación de proteínas con el ADN naciente……………………………………………………………… 70 Figura C1.1. La ruta de reparación BER………………………………………….. 89 Figura C1.2. Ensayo de retención en cromatina de XRCC1-RFP (X1-RFP)……... 90 Figura C1.3. La incorporación errónea de la 5hmdC y la 5fdC induce el reclutamiento de XRCC1-RFP a la cromatina y un incremento de los niveles nucleares de PAR…………………………………………………………………. 91 Figura C1.4. La incorporación errónea de la 5hmdC y la 5fdC induce un incremento de los niveles nucleares de γH2AX concomitante al reclutamiento de XRCC1-RFP a cromatina…………………………………………………………. 92 Figura C1.5. La retención en cromatina de XRCC1-RFP ocurre principalmente en células en fase S………………………………………………………………... 93 Figura C1.6. Las células Xrcc1-/- son sensibles a MMS, a 5hmdC y en menor medida a 5fdC…………………………………………………………………….. 94 Figura C1.7. La exposición a 5hmdC incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX en las células Xrcc1-/-……………………………………………………... 95 Figura C1.8. La exposición a 5hmdC incrementa la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en XRCC1……………………………… 96 Figura C1.9. La incorporación de la 5hmdC altera la estabilidad de la horquilla de replicación en las células deficientes en XRCC1………………………………. 97 Figura C1.10. La incorporación de la 5hmdC provoca el reclutamiento de PARP1 a la cromatina……………………………………………………………………... 98 Figura C1.11. El tratamiento combinado de 5hmdC y olaparib exacerba el reclutamiento de PARP1 a la cromatina y los niveles nucleares de γH2AX………. 99 Figura C1.12. La combinación de olaparib y 5hmdC incrementa la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad celular de las células Xrcc1-/-…………. 100 Figura C1.13. El tratamiento con 5hmdU disminuye la viabilidad celular, incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX y la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en XRCC1……………………………… 101 ÍNDICE Figura C1.14. La incorporación de la 5hmdU impacta en la progresión de la horquilla de replicación e induce la degradación nucleolítica del ADN en las células Xrcc1-/-……………………………………………………………………. 102 Figura C1.15. El tratamiento con 5hmdU promueve el reclutamiento de PARP1 a la cromatina……………………………………………………………………... 102 Figura C1.16. El tratamiento combinado de olaparib y 5hmdU exacerba los niveles nucleares de γH2AX, la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad celular de las células Xrcc1-/-…………………………………………….. 103 Figura C1.17. Modelo propuesto para la función de XRCC1 durante la eliminación de la base de ADN hidroximetilada 5hmdU………………………….. 104 Figura C2.1. Las células Fancd2-/- exhiben sensibilidad tras la exposición a cisplatino y a 5hmdC……………………………………………………………… 108 Figura C2.2. Generación de la línea celular eHAP deficiente en FANCD2………. 109 Figura C2.3. Las células eHAP FANCD2son sensibles a cisplatino y a 5hmdC… 110 Figura C2.4. Incremento de la letalidad celular de la línea celular MDA-MB-436 tras la exposición a 5hmdC………………………………………………………... 110 Figura C2.5. El tratamiento con 5hmdC incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX en las células Fancd2-/-…………………………………………………. 111 Figura C2.6. Incremento de la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en FANCD2 tras la exposición a 5hmdC……………………… 112 Figura C2.7. Arresto del ciclo celular en la fase G2/M y activación del punto de control de fase S tras la exposición a 5hmdC……………………………………… 113 Figura C2.8. La depleción de DCTD rescata la viabilidad celular tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-…………………………………….... 115 Figura C2.9. La depleción de DCK rescata la viabilidad celular tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-………………………………………………….. 115 Figura C2.10. La incorporación de la 5hmdU incrementa los niveles nucleares de PAR principalmente en las células en fase S………………………………………. 116 Figura C2.11. El tratamiento con 5hmdC induce la co-precipitación de EdU (ADN naciente) junto con γH2AX en las células deficientes en FANCD2………... 117 Figura C2.12. La exposición a 5hmdC incrementa el número de focos EdU-PAR en las células Fancd2-/-……………………………………………………………. 118 Figura C2.13. El tratamiento con 5hmdC incrementa la frecuencia de SSBs en las células Fancd2-/-………………………………………………………………....... 119 Figura C2.14. La incorporación de la 5hmdU altera la progresión de la horquilla de replicación e incrementa el índice de asimetría en las células Fancd2-/-………... 120 Figura C2.15. La exposición a 5hmdC durante 3h no activa el punto de control de fase S…………………………………………………………………………... 121 Figura C2.16. La incorporación de la 5hmdU induce la degradación nucleolítica del ADN…………………………………………………………………………... 122 Figura C2.17. La exposición a 5hmdC incrementa la frecuencia de tramos de ssDNA en las células Fancd2-/-……………………………………………………. 123 Figura C2.18. La degradación nucleolítica del ADN naciente depende de la actividad de las nucleasas MRE11 y DNA2………………………………………. 124125 Figura C2.19. El tratamiento combinado de olaparib y 5hmdC exacerba el defecto en la progresión de la horquilla de replicación observado en las células Fancd2-/-. 126 Figura C2.20. La combinación de olaparib con la 5hmdC exacerba el incremento del número de focos de γH2AX y la frecuencia de aberraciones cromosómicas observadas en las células Fancd2-/- ……………………………………………….. 127 ÍNDICE Figura C2.21. El tratamiento combinado de olaparib y 5hmdC incrementa de forma sinergística la letalidad celular observada en las células Fancd2-/-…………. 127 Figura C2.22. La exposición a 5hmdC incrementa la frecuencia de SCEs, la cual se exacerba tras el tratamiento combinado con olaparib…………………………... 129 Figura C3.1. Actividad de la ruta de reparacion BER asociada a la horquilla de replicación………………………………………………………………………… 133 Figura C3.2. Depleción de la glicosilasa de ADN SMUG1………………………. 134 Figura C3.3. La depleción de SMUG1 disminuye los niveles nucleares de PAR asociados a fase S y el número de focos EdU-PAR inducidos por la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-……………………………………………………. 135 Figura C3.4. La depleción de SMUG1 disminuye la frecuencia de SSBs tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-……………………………………… 136 Figura C3.5. La depleción de SMUG1 rescata la inestabilidad de la horquilla de replicación y la viabilidad celular de las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC……. 137 Figura C3.6. Depleción de la endonucleasa APEX1……………………………... 137 Figura C3.7. La depleción de APEX1 disminuye los niveles nucleares de PAR asociados a fase S y el número de focos EdU-PAR en las células Fancd2-/- tras la exposición a 5hmdC………………………………………………………………. 138 Figura C3.8. La depleción de APEX1 disminuye la formación de SSBs debida a la incorporación de la 5hmdU en las células Fancd2-/-…………………………….. 139 Figura C3.9. La depleción de APEX1 rescata de forma parcial la inestabilidad de la horquilla de replicación y la viabilidad de las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC…………………………………………………………………………….. 140 Figura C3.10. La co-depleción de APEX1 y APEX2 suprime los niveles nucleares de PAR asociados a fase S y la formación de focos EdU-PAR en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC……………………………………………... 141 Figura C3.11. La co-depleción de APEX1 y APEX2 suprime la formación de SSBs y la letalidad celular dependientes de la incorporación de la 5hmdU en las células Fancd2-/- ………………………………………………………………….. 142 Figura C3.12. Esquema representativo de la acumulación de SSBs tras la pérdida de PARP1 o XRCC1……………………………………………………………… 143 Figura C3.13. Los niveles nucleares de PAR asociados a la replicación son dependientes de PARP1 y la depleción de PARP1 exacerba la letalidad observada en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC……………………………………….. 144 Figura C3.14. La depleción de XRCC1 exacerba los niveles nucleares de PAR asociados a la replicación mediados por la incorporación errónea de la 5hmdU en las células deficientes en FANCD2……………………………………………….. 145 Figura C3.15. La depleción de XRCC1 exacerba la letalidad celular mediada por el tratamiento con 5hmdC, pero no impacta en la estabilidad de la horquilla de replicación en las células Fancd2-/-………………………………………………... 146 Figura C4.1. Generación de las líneas celulares que sobreexpresan la construcción MmHMCES-FLAG………………………………………………… 149 Figura C4.2. HMCES-FLAG se recluta a cromatina tras la incorporación errónea de la 5hmdU………………………………………………………………………. 150 Figura C4.3. La incorporación de la 5hmdU induce el reclutamiento de HMCES a la cromatina……………………………………………………………………... 151 Figura C4.4. La depleción de APEX1 disminue el reclutamiento de HMCESFLAG a la cromatina……………………………………………………………… 152 ÍNDICE Figura C4.5. La depleción de HMCES disminuye los niveles nucleares de PAR y el número de focos EdU-PAR observados en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC…………………………………………………………………………….. 153 Figura C4.6. La depleción de HMCES incrementa los niveles nucleares de γH2AX en condiciones sin tratamiento, permaneciendo sin cambios tras la exposición a 5hmdC………………………………………………………………. 154 Figura C4.7. La depleción de HMCES suprime la formación de SSBs causada por la exposición a 5hmdC en las células deficientes en FANCD2………………... 155 Figura C4.8. La depleción de HMCES restaura la estabilidad de la horquilla de replicación tras la incorporación de la 5hmdU en las células Fancd2-/-……………. 156 Figura C4.9. La depleción de HMCES disminuye la frecuencia de aberraciones cromosómicas e incrementa la supervivencia celular en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC………………………………………………………………... 157 Figura C4.10. La depleción de HMCES incrementa la viabilidad celular de las células BRCA2-/- tras la exposición a 5hmdC……………………………………… 158 Figura C4.11. La co-depleción de HMCES con APEX1 o con APEX2 disminuye de forma epistática los niveles nucleares de PAR asociados a fase S y la letalidad celular en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC……………………………….. 159 Figura C4.12. La depleción de PRIMPOL disminuye parcialmente los niveles nucleares de PAR dependientes del procesamiento de la 5hmdU en las células Fancd2-/-…………………………………………………………………………... 160 Figura C4.13. La depleción de PRIMPOL suprime parcialmente la formación de focos EdU-PAR y de SSBs en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC………….. 161 Figura C4.14. La depleción de PRIMPOL rescata parcialmente la viabilidad celular de las células deficientes en FANCD2 expuestas a 5hmdC………………... 162 Figura C4.15. La co-depleción de PRIMPOL y HMCES disminuye de forma epistática el incremento de la frecuencia de SCEs mediado por la incorporación de la 5hmdU en las células deficientes en FANCD2………………………………. 163 Figura C4.16. Modelo de trabajo propuesto para la función de HMCES durante la eliminación de la 5hmdU incorporada de forma errónea durante la síntesis de ADN por la ruta de reparación BER………………………………………………. 164 ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN 31 En cada célula, el genoma está expuesto constantemente a factores endógenos o exógenos que pueden alterar su integridad. El mantenimiento de la estabilidad genómica es esencial para la supervivencia y la transmisión fidedigna de la información genética a lo largo de las generaciones. Esta transmisión de la información genética está en un constante balance selectivo entre el mantenimiento de la estabilidad genética o la eliminación de los cambios debidos a mutaciones y pérdida del potencial evolutivo. Se estima que el ADN sufre más de 105 lesiones al día, principalmente generadas por los propios procesos celulares, como por ejemplo fallos durante la replicación o la presencia de metabolitos generados durante diferentes actividades fisiológicas 1. Entre las fuentes endógenas de daño destacan la incorporación errónea de ribonucleótidos al ADN durante la replicación o las modificaciones en las bases del ADN generadas por procesos como la desaminación, la adición de grupos alquilos por agentes alquilantes o las oxidaciones causadas por las especies reactivas de oxígeno (ROS; del inglés radical oxygen species). Las fuentes exógenas que pueden inducir daño en la estructura del ADN pueden ser tanto físicas (radiación ionizante, UV, etc.) como químicas (quimioterápicos, químicos industriales, etc.). La exposición a estos factores puede generar desde cortes de cadena sencilla o cortes de cadena doble, hasta uniones covalentes entre las bases de ambas hebras de ADN. Estas lesiones pueden alterar la estructura de la doble hélice, afectando a los procesos de replicación y transcripción. Si estas lesiones permanecen sin reparar, se pueden generar mutaciones que podrían ser transmitidas a las células hijas, lo que puede tener consecuencias deletéreas para la salud 1–3. Para evitar la persistencia de estas lesiones en el ADN, las células han desarrollado un complejo sistema de reparación compuesto por numerosos mecanismos que protegen al genoma de estas lesiones genotóxicas. Estos mecanismos no solo reparan las lesiones presentes en el ADN, sino que también controlan la replicación para evitar errores durante la síntesis de ADN. Por tanto, debe existir una gran coordinación entre los procesos de síntesis y reparación del ADN junto con el proceso de división celular, para mantener la integridad del genoma y prevenir mutaciones y reestructuraciones del ADN. Este conjunto de rutas de reparación del ADN y puntos de control del ciclo celular que actúan de forma coordinada para reparar el daño en el ADN es lo que se conoce como respuesta al daño en el ADN (DDR; del inglés DNA damage response) 1,4. Fallos durante la progresión del ciclo celular, durante la replicación del ADN o durante la DDR, pueden inducir inestabilidad genómica, lo que desencadenaría el desarrollo de enfermedades 3,4. 1.1. La replicación del ADN y el estrés replicativo 1.1.1. Replicación del ADN Las células tienen como principal objetivo duplicar el genoma y transmitir la información genética de forma fidedigna a las células hijas. Este objetivo requiere una eficiente y rigurosa síntesis de ADN, esencial para el mantenimiento de la estabilidad genómica y la correcta ejecución de los programas de desarrollo y diferenciación celular 5,6. Sin embargo, durante el proceso de replicación, el ADN es más vulnerable, debido a la posible presencia de obstáculos que pueden alterar la progresión de la horquilla de replicación, por lo que la integridad del genoma debe estar constantemente controlada para evitar el bloqueo de la horquilla de replicación y la generación de roturas en el ADN 7. INTRODUCCIÓN 32 El proceso de replicación es un proceso semiconservativo, en el cual una de las cadenas se sintetiza de forma directa, en la dirección en la que se desplaza la horquilla de replicación (denominada hebra continua o leading strand), mientras que la cadena opuesta se sintetiza de forma discontinua, debido a que su síntesis va en la dirección opuesta a la horquilla de replicación (denominada hebra rezagada o lagging strand). La hebra continua se sintetiza por la polimerasa de ADN ε (POLε), mientras que la síntesis de la hebra rezagada se lleva a cabo por un complejo formado por la polimerasa de ADN α (POLα) y una primasa de ARN, y posteriormente, este complejo es sustituido por la polimerasa de ADN δ (POLδ). El complejo primasa-POLα sintetiza un pequeño cebador de ARN, de unos 7-14 nucleótidos, que extiende con un pequeño tramo de ADN, de unos 10-20 nucleótidos. Una vez sintetizado este cebador de ARN-ADN, este complejo es reemplazado por la polimerasa POLδ, la cual extiende estos cebadores de ARN-ADN en pequeños fragmentos de ADN denominados fragmentos de Okazaki. A medida que se desplaza la horquilla de replicación, los fragmentos de Okazaki que se van sintetizando y conforman la hebra rezagada, deben ser unidos para finalizar la síntesis completa de esta cadena. Todo este proceso se conoce como maduración de los fragmentos de Okazaki (OFM; del inglés Okazaki fragment maturation), en el cual debe existir una gran coordinación entre las reacciones secuenciales que se suceden entre las polimerasas, nucleasas y ligasas de ADN8,9. Figura I1. Esquema simplificado de la síntesis de la hebra continua y la hebra rezagada durante la replicación del ADN. La replicación comienza con el ensamblaje del replisoma, un complejo multiproteico que se une a la doble hélice para su desenrollamiento y así permitir la entrada de las polimerasas de ADN que copian la información en las cadenas de nueva síntesis. La actividad del replisoma está regulada estrictamente durante todo el ciclo celular por múltiples pasos. El proceso de replicación se inicia durante la fase G1 del ciclo celular, en la cual los orígenes de replicación se “licencian”, proceso por el cual la helicasa replicativa se une a ellos para iniciar la replicación. Esta unión depende de la acción de los componentes del complejo de pre-replicación, el cual se forma mediante el ensamblaje secuencial de varios factores. En primer lugar, el complejo de reconocimiento del origen 1-6 (ORC1-6) junto con el factor del ciclo de división celular 6 (CDC6), reclutan a la helicasa de ADN replicativa MCM2-7 (del inglés mini-chromosome maintenance 2-7), para formar un complejo con el factor transcrito dependiente de Cdc10 1 (CDT1). Posteriormente, un INTRODUCCIÓN 33 segundo complejo MCM2-7 – CDT1 es reclutado al ADN, y estos 2 anillos hexaméricos enfrentados conforman un hexámero doble simétrico que rodea a la doble hélice. Este doble hexámero está inactivo y su activación ocurre durante la transición entre las fases G1 y S, en la cual se suceden una serie de eventos de fosforilación por parte de quinasas dependientes de Dbf4 (DDK) y dependientes de ciclina (CDK). Estos eventos de fosforilación permiten el reclutamiento secuencial de los factores CDC45 y GINS1-4 al doble hexámero, constituyendo el complejo CMG, la forma activa de la helicasa replicativa. Además, estas quinasas también fosforilan a otros factores adicionales que se unen a la helicasa CMG, formando así el complejo de pre-iniciación. El complejo de pre-iniciación junto a MCM10 induce el desenrollamiento de la doble hélice, dando lugar a tramos de ADN de cadena sencilla (ssDNA; del inglés single-stranded DNA) que son cubiertos por la proteína RPA (del inglés replication protein A). Además, se establecen dos replisomas bidireccionales, que sintetizarán ADN naciente a través de las cadenas moldes en dirección 3’-5’, permitiendo la síntesis de ADN por parte de las polimerasas replicativas POLε y POLδ 6,9–11. Para evitar que un segmento del genoma sea replicado una vez más antes de pasar a la fase de mitosis, se inhibe un nuevo reclutamiento de la helicasa MCM a los orígenes de replicación durante las fases S y G2 del ciclo celular, garantizando que cada parte del genoma se replica una única vez por cada ciclo celular, preservando así la integridad del genoma 10. Los componentes de la maquinaria de replicación RFC1-5 (del inglés replication factor C1-5) y CTF18 (del inglés chromosome transmission fidelity 18)-RFC2-5, son responsables de la carga de PCNA (del inglés proliferating cell nuclear antigen) en el ADN. PCNA es un anillo trimérico que rodea las intersecciones de ssDNA y de ADN de cadena doble (dsDNA; del inglés double-stranded DNA), necesario para promover la síntesis eficiente de las hebras de ADN naciente, ya que favorece la procesividad de las polimerasas 6,12. El proceso de terminación de la replicación se produce tras la convergencia de dos horquillas de replicación, la cual desencadena la ubiquitinación y posterior desensamblaje de la helicasa CMG del ADN, y la ligación de los productos finales generados 6,9. INTRODUCCIÓN 34 Figura I2. Proceso de replicación del ADN. A) Formación del complejo de pre-replicación en el origen de replicación mediante el ensamblaje secuencial de ORC1-6, CDC6, MCM2-7 y CDT1. B) Activación de los complejos MCM2-7 – CDT1 durante la transición entre las fases G1 y S mediante eventos de fosforilación por DDK y CDK, que permiten el reclutamiento de CDC45 y GINS para formar complejo CMG, la forma activa de la helicasa replicativa. C) Desenrollamiento de la doble hélice e inicio de la replicación mediante las polimerasas replicativas POLε y POLδ. Imagen adaptada de Petropoulos M et al, 2019 10. 1.1.2. Estrés replicativo Durante el proceso de síntesis de ADN, las horquillas de replicación pueden encontrar lesiones en la molécula de ADN, originadas por factores endógenos o exógenos, que pueden obstaculizar su progresión, induciendo estrés replicativo. Se define como estrés replicativo el enlentecimiento transitorio o la aceleración aberrante de la horquilla de replicación, que pueden conducir a su bloqueo, en respuesta a los obstáculos presentes en el ADN 5,10,13–15. El estrés replicativo implica un grave problema para la estabilidad del genoma, ya que, si se prolonga en el tiempo, puede dar lugar a roturas irreversibles de la horquilla de replicación y al colapso de la misma, provocando inestabilidad genómica y el desarrollo de enfermedades, siendo la más común el cáncer 5,10,14. Entre las lesiones más comunes que pueden inducir estrés replicativo se encuentran la presencia de sitios abásicos (AP; del inglés apurinic/apyrimidinic site), las uniones covalentes entre el ADN y proteínas (DPC; del inglés DNA-protein crosslink), las modificaciones de las bases, las uniones covalentes entre las bases de las dos hebras del ADN (ICL; del inglés interstrand crosslink), los conflictos replicación-transcripción, los huecos de ssDNA, la presencia de estructuras secundarias de ADN, la reducción en los niveles de nucleótidos, etc. Estos obstáculos provocan el desacoplamiento físico entre la helicasa CMG y las polimerasas, ya que la helicasa replicativa continúa desenrollando la doble hélice mientras que la polimerasa se queda detenida por la lesión, dando lugar a la formación de tramos de ssDNA 10,13,14. INTRODUCCIÓN 35 Figura I3. Lesiones generadas por fuentes endógenas y exógenas que causan estrés replicativo. Sitios AP, DPCs, incorporación de ribonucleótidos, estructuras secundarias de ADN, ICLs, bases dañadas por agentes químicos, huecos de ssDNA, etc. Imagen adaptada de Cybulla E and Vindigni A, 2023 13. Para minimizar los efectos deletéreos del estrés replicativo, las células presentan diversos mecanismos moleculares para estabilizar, reparar y reiniciar las horquillas de replicación bloqueadas. Sin embargo, las células cancerígenas también usan estos mecanismos de estabilización de las horquillas de replicación, disminuyendo la efectividad de los agentes citotóxicos que inducen estrés replicativo para provocar su muerte. Conocer más a fondo los mecanismos por los cuales las células estabilizan y reparan las horquillas de replicación que se han bloqueado podría llevar al desarrollo de nuevas estrategias para combatir la resistencia de las células cancerígenas a los tratamientos convencionales 5. Las horquillas de replicación muestran una destacada plasticidad para adaptarse al estrés replicativo, siendo capaces de restaurar su integridad y reiniciar la síntesis de ADN rápidamente. Tras la generación de tramos de ssDNA por el desacoplamiento entre la helicasa replicativa y las polimerasas, estos tramos se recubren por la proteína de unión a ssDNA RPA, la cual sirve de plataforma para reclutar a ATR (del inglés ataxia telangiectasia and Rad3-related), la principal quinasa de respuesta ante el estrés replicativo, a través de la proteína de interacción ATRIP. ATR fosforila diferentes sustratos que ayudan a la supervivencia celular y a completar de forma fidedigna la replicación del ADN. La principal diana que fosforila ATR es la quinasa de punto de control 1 (CHK1; del inglés checkpoint kinase 1), la cual se activa y desencadena el enlentecimiento de la progresión del ciclo celular, impidiendo la progresión de la fase G2 a la fase de mitosis y el inicio de la replicación en otros orígenes, lo que permite la resolución del daño que ha causado estrés replicativo. Además de estos efectos globales, ATR también presenta efectos más locales, ayudando a proteger a las horquillas dañadas para facilitar su recuperación y continuar la replicación, regulando la actividad de nucleasas y factores de remodelación que estabilizan a las horquillas bloqueadas 5,10,11,14,16,17. Ante la presencia de lesiones que causan estrés replicativo, las células activan una respuesta denominada tolerancia al daño en el ADN (DDT; del inglés DNA damage tolerance), la cual permite a las células continuar la replicación, previniendo un bloqueo persistente de la horquilla de replicación. La respuesta de DDT se compone de los procesos de síntesis de translesión (TLS; del inglés translesion DNA synthesis), reversión de la horquilla de replicación (RFR; del inglés replication fork reversal), que forma parte del intercambio de molde (TS; del inglés template switching), y del proceso de recebado o repriming 11,13,17. INTRODUCCIÓN 36 1.1.2.1. Síntesis de translesión (TLS) La síntesis de translesión (TLS) se produce por la acción de polimerasas que sintetizan ADN naciente usando ADN molde dañado, ya que son capaces de sobrepasar la lesión, introduciendo nucleótidos en la cadena de nueva síntesis, independientemente de las bases dañadas. Se caracterizan por ser polimerasas que carecen de actividad de corrección 3’-5’, con tasas de error elevadas (1 por cada 10 nucleótidos), a diferencia de las polimerasas replicativas que tienen unas tasas de error de 1 por cada 1010 nucleótidos. Por esta razón, las polimerasas de TLS se consideran polimerasas mutagénicas. Estos eventos mutagénicos pueden contribuir a la tumorogénesis. El reclutamiento de las polimerasas de TLS está mediado por la ubiquitinación de PCNA en la lisina 164 mediante el complejo ubiquitin-ligasa E2-E3 RAD6-RAD18. Además, la polimerasa REV1, perteneciente a la familia Y de polimerasas de TLS, sirve como proteína de andamiaje para facilitar el reclutamiento de otras polimerasas de TLS, como POLζ (REV3L-REV7), POLη, POLι, POLκ… 11,13 1.1.2.2. Reversión de la horquilla de replicación El mecanismo de reversión de la horquilla de replicación es un mecanismo de protección de la estructura replicativa, complementario a la acción de las polimerasas de TLS. Este mecanismo convierte la estructura regular de 3 brazos de la horquilla de replicación en una estructura de 4 brazos, ya que se produce el alineamiento coordinado de las dos hebras de ADN naciente detrás de la horquilla, formando un brazo central que está constituido por las dos hebras de nueva síntesis. Este brazo de ADN de nueva síntesis se protege por factores proteicos que evitan su degradación por endonucleasas 5,11,13,17,18. El alineamiento de las dos hebras de ADN naciente está mediado por la recombinasa RAD51, la cual, a través de su actividad de intercambio de hebras, genera un dúplex de ADN, en el que ambas hebras están cara a cara detrás de la helicasa CMG. Esta estructura sirve de sustrato para las translocasas de ADN que catalizan la reversión de la horquilla de replicación. Tras la formación de esta estructura, la helicasa CMG queda delante para iniciar de forma inmediata la síntesis de ADN una vez que la lesión en el ADN se ha reparado 11. Este alineamiento tiene un efecto protector, ya que permite la reparación de la lesión, así como sobrepasarla y sintetizar la nueva hebra de ADN usando como molde la otra cadena de ADN naciente. Además, permite establecer un modo “durmiente” hasta que el estrés replicativo se haya resuelto. Sin embargo, esta forma de alineamiento deja a las cadenas de nueva síntesis más susceptibles a ser degradadas por nucleasas, pudiendo dar lugar a inestabilidad genómica. Por ello, las hebras de ADN naciente son protegidas mediante su recubrimiento por nucleofilamentos de RAD51, que se recluta principalmente por las proteínas BRCA1/2 (del inglés breast cancer type 1/2 susceptibility protein) y algunos componentes de la ruta de reparación Anemia de Fanconi (AF) 15. Este proceso está regulado, al menos en parte, por la translocasas de ADN de la familia SNF2 SMARCAL1 (del inglés SWI/SNF-related, matrix-associated, actin-dependent, regulator of chromatin, and subfamily A-like 1), ZRANB3 (del inglés zinc finger, RANbinding domain containing 3) y HLTF (del inglés helicase-like transcription factor) 11,18. Otros factores descritos como posibles mediadores de la generación de esta estructura de reversión son las helicasas BLM (del inglés Bloom’s syndrome RecQ helicase-like protein), INTRODUCCIÓN 37 WRN (del inglés Werner syndrome ATP-dependent helicase), FANCM o FBH1 (del inglés F-box DNA helicase 1) 5. La resolución de esta estructura se lleva a cabo por la helicasa RECQ1, cuya actividad se regula por la enzima polimerasa de poli(ADP)-ribosa 1 (PARP1; del inglés poly(ADP-ribose) polymerase 1), la cual suprime la actividad de RECQ1 hasta que el daño se repara 17. Para el correcto reinicio de la síntesis de ADN, es necesaria una degradación controlada de esta estructura de reversión de la horquilla de replicación, mediada por nucleasas como DNA2 o MRE11. Sin embargo, la degradación nucleolítica excesiva del ADN naciente puede tener consecuencias genotóxicas que den lugar a aberraciones cromosómicas o a la muerte celular 5,11. 1.1.2.3 Recebado o repriming Es una respuesta al estrés replicativo muy conservada. Está mediada por la proteína PRIMPOL, una polimerasa de TLS que tiene actividad primasa, capaz de reiniciar la síntesis de ADN aguas abajo al sitio de la lesión, siendo particularmente relevante durante la síntesis de la hebra continua 10,11,13. Tras el bloqueo de la horquilla de replicación, PRIMPOL genera un cebador de ADN mediante su actividad primasa, aguas abajo al sitio de la lesión, el cual extiende mediante su actividad polimerasa, evitando así la lesión. Sin embargo, el reinicio de la síntesis deja huecos de ssDNA detrás de la horquilla de replicación que necesitan ser reparados de forma post-replicativa 11,13,17. Esta reparación post-replicativa se realiza posteriormente por los mecanismos de TLS o por intercambio de molde, los cuales pueden contribuir a la generación de mutaciones, debido a la acción de las polimerasas de TLS, o a reordenamientos cromosómicos o intercambios de cromátidas hermanas (SCEs; del inglés sister chromatid exchanges), por la acción de los mecanismos de intercambio de molde. Fallos en la reparación de estos huecos de ssDNA hacen que persistan en el tiempo y sean susceptibles al corte endonucleolítico por MRE11, generando cortes de cadena doble (DSBs; del inglés double strand breaks), como se ha sugerido recientemente 13,17,19. INTRODUCCIÓN 38 Figura I4. Mecanismos de DDT. Reversión de la horquilla de replicación, intercambio de molde, repriming y TLS. Imagen adaptada de Saldanha J et al, 2023 11. El balance riguroso entre las distintas vías de DDT es necesario para superar los obstáculos que han detenido la replicación, asegurando que la síntesis de ADN se complete en tiempo, además de proteger la integridad de la horquilla de replicación. La elección de una vía u otra está regulada principalmente por la naturaleza y la localización de la lesión, aunque también depende de la magnitud del bloqueo de la horquilla de replicación o del fondo genético de las células 11. Un factor clave en el proceso de elección de la vía de DDT a usar es PCNA y sus modificaciones post-traduccionales 11,17. 1.2. Los mecanismos de reparación del ADN Para contrarrestar el daño generado en el ADN y evitar la desestabilización de la horquilla de replicación, las células han desarrollado mecanismos de reparación específicos que actúan ante las diferentes lesiones que pueden estar presentes en la molécula de ADN, previniendo el estrés replicativo. Dependiendo del tipo de daño que se encuentre en la molécula de ADN, la ruta de reparación que actúa es diferente. En el caso de un emparejamiento erróneo entre las bases del ADN, la ruta de reparación que actúa es la ruta de reparación de emparejamientos erróneos (MMR; del inglés mismatch repair), mientras que la presencia de pequeñas modificaciones químicas en las bases de ADN es reparada por la ruta de reparación por escisión de bases (BER; del inglés base excision repair). Para lesiones más complejas, como los dímeros de pirimidina o la unión covalente entre bases de una misma hebra del ADN, actúa la ruta de reparación por escisión de nucleótidos (NER; del inglés nucleotide excision repair), mientras que los ICLs son reparados por la ruta de reparación AF. Los cortes de cadena sencilla (SSBs; del inglés single strand breaks) son INTRODUCCIÓN 39 reparados por la ruta de reparación de SSBs (SSBR; del inglés single-strand break repair) y los DSBs pueden ser reparados por la ruta de reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ; del inglés non-homologous end joining) o por la ruta de reparación recombinación homóloga (HR; del inglés homologous recombination) 1. Debido a la gran extensión de este campo de investigación, en esta introducción, solo se detallan los mecanismos de reparación más relevantes que han sido objeto de nuestro estudio de investigación durante el desarrollo de esta tesis doctoral. 1.2.1. El papel de la ruta de reparación Anemia de Fanconi (AF) para la eliminación de los ICLs Una de las lesiones más deletéreas que supone uno de los principales desafíos para la supervivencia celular son los ICLs, los cuales impiden procesos esenciales como la replicación o la transcripción, debido a que la unión covalente entre las hebras del ADN no permite desenrollar la doble hélice para iniciar estos procesos 20–22. Factores exógenos como los quimioterápicos (cisplatino o mitomicina C), o agentes endógenos como los aldehídos generados por los procesos metabólicos celulares (por ejemplo, acetaldehído o formaldehído), inducen este tipo de uniones 20,22,23. La falta de reparación de esta lesión puede conllevar a la rotura del ADN y a reordenamientos cromosómicos, que pueden promover a largo plazo el desarrollo de enfermedades como el cáncer. Para reparar los ICLs, las células han desarrollado una ruta específica denominada Anemia de Fanconi (AF)20. Se han identificado al menos 22 genes pertenecientes a esta ruta de reparación: FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1 (BRCA2), FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ (BRIP1), FANCL, FANCM, FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C), FANCP (SLX4), FANCQ (ERCC4), FANCR (RAD51), FANCS (BRCA1), FANCT (UBE2T), FANCU (XRCC2), FANCV (REV7) y FANCW (RFWD3). Basado en las actividades bioquímicas y en sus funciones, los genes AF se pueden dividir en 3 grupos:  Grupo I: complejo central AF (FANCA, B, C, E, F, G, L, M, T y las proteínas asociadas FAAP20, FAAP24 y FAAP100). Es un complejo ubiquitin-ligasa E3.  Grupo II: complejo heterodimérico FANCD2-FANCI (ID2).  Grupo III: factores de reparación como nucleasas (FANCP (SLX4) y FANCQ (ERCC4)), polimerasas de TLS (FANCV (REV7) y POLζ) y factores de HR (FANCD1 (BRCA2), FANCJ (BRIP1), FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C), FANCR (RAD51), FANCS (BRCA1), FANCU (XRCC2) y FANCW (RFWD3)). Muchos de estos genes pertenecen a la ruta de reparación HR, como BRCA1/2 (FANCD1/S) o RAD51 (FANCR), y son considerados como “genes similares a AF” debido a que la falta de alguno de estos genes tiene una correlación genotipo-fenotipo con la enfermedad. La pérdida bialélica de alguno de los genes que forman parte de la ruta AF da lugar al desarrollo de una enfermedad rara denominada con el mismo nombre 24. La AF es una enfermedad autosómica recesiva que se caracteriza por el desarrollo de anomalías congénitas (por ejemplo, anomalías en el desarrollo de las extremidades o en la pigmentación de la piel), progresión de fallo medular, infertilidad y alta susceptibilidad de desarrollo de tumores sólidos, especialmente cáncer de cabeza y cuello, y leucemia. La mayoría de las mutaciones presentes en los pacientes de AF se encuentran en los genes que INTRODUCCIÓN 40 codifican las proteínas FANCA (60%), FANCC (15%) y FANCG (10%), aunque también se han encontrado mutaciones en otros genes que codifican para el resto de proteínas que conforman esta ruta, haciendo que esta enfermedad sea genéticamente muy heterogénea, lo que dificulta la búsqueda de tratamientos efectivos contra ella 24,25. Los fenotipos más característicos que presentan las células de los pacientes de AF son la hipersensibilidad a agentes que inducen ICLs, como la mitomicina C, el cisplatino o el diepoxibutano 25,26. El principal agente endógeno que induce la pérdida de células madre hematopoyéticas, fallo medular y predisposición a cáncer en ausencia de la ruta AF es el formaldehído 27–30. El formaldehído induce múltiples tipos de lesiones, y aún no se ha dilucidado cuál de ellas es la que causa la letalidad en las células deficientes en la ruta AF 31. Las células deficientes en la ruta AF muestran hipersensibilidad ante la exposición a los agentes formadores de ICLs como consecuencia del incremento de inestabilidad cromosómica intrínseco de estas células. Esta inestabilidad cromosómica se caracteriza por la acumulación de cromosomas radiales, estructuras cromosómicas formadas por la fusión de dos o más cromosomas metafásicos que no presentan homología entre ellos. Esta fusión está mediada por la ruta de reparación NHEJ 25,32,33. Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la formación de cromosomas radiales ante la ausencia de la ruta AF es dependiente de la polimerasa de ADN POLθ y de la ruta de reparación alternativa de unión de extremos (alt-EJ, del inglés alternative end-joining) 26. La presencia de aberraciones cromosómicas es la prueba molecular estándar usada para el diagnóstico inequívoco de la enfermedad AF, ya que las células de los pacientes de AF presentan niveles de roturas del ADN 10 veces más elevados, y una mayor proporción de cromosomas radiales, en comparación con las células control, tras el tratamiento con un agente formador de ICLs25,26. Los ICLs se reparan por sistemas de reparación distintos dependiendo de la fase del ciclo celular. En las fases G1, G2 y M, la principal ruta de reparación que actúa para reparar los ICLs es la ruta por escisión de nucleótidos asociada a la transcripción (TC-NER, del inglés transcription-coupled nucleotide excision repair), junto con las polimerasas de TLS. En la fase S, la ruta AF es la principal ruta que repara esta lesión 21,34. Los factores pertenecientes a la ruta coordinan la acción de diferentes procesos de reparación, como la actividad de las nucleasas que inducen el corte del ICL y otros procesos nucleolíticos para su reparación. Además, también actúan las polimerasas de TLS para la adición de la base a la hebra de ADN, y la ruta de reparación HR, para reparar el DSB generado en la hebra opuesta, recuperando así la información perdida 23,24,34,35. La reparación del ICL comienza cuando dos horquillas de replicación colisionan con un ICL. Tras la colisión, BRCA1, mediante su actividad ubiquitin-ligasa, promueve el desensamblaje de la helicasa CMG, permitiendo que la polimerasa de ADN POLε se acerque al ICL. Este proceso genera tramos de ssDNA que son recubiertos por RAD51 para proteger la horquilla. A continuación, FANCM interactúa con FAAP24 y MHF1/2 para reconocer la lesión y regular su posterior reparación. Una vez que el complejo FANCMFAAP24-MHF1/2 reconoce el ICL, activa la cascada de señalización de ATR y promueve el reclutamiento del complejo central AF. En el complejo central AF cabe destacar el subcomplejo FANCB-FANCL-FAAP100, que junto a FANCT (UBET2; enzima con actividad ubiquitin-ligasa E2), lleva a cabo la monoubiquitinación del heterodímero FANCD2-FANCI (ID2) en las lisinas 561 y 523 respectivamente. El heterodímero ID2 INTRODUCCIÓN 47 1.3. Factores que estabilizan la horquilla de replicación frente al estrés replicativo Múltiples mecanismos cooperan para preservar la integridad del genoma de las lesiones que pueden perturbar la replicación del ADN, alterando la transmisión fidedigna de la información genética 4,52. La capacidad de estabilizar y reiniciar las horquillas de replicación bloqueadas es esencial para la estabilidad genómica y la supervivencia celular. El bloqueo de la horquilla de replicación por lesiones presentes en la molécula de ADN, desencadena el reclutamiento de múltiples factores que estabilizan las horquillas bloqueadas, reparan las lesiones presentes en el ADN y reinician la replicación. Si no se produce el bloqueo de las horquillas de replicación ante la presencia de daños en el ADN o se producen fallos en el reinicio de la replicación una vez que la lesión se ha reparado, se puede inducir inestabilidad genómica y muerte celular. Por ello, múltiples factores, además de su función canónica en reparar lesiones específicas que ocurren en el ADN, juegan un papel importante en la estabilización de las horquillas de replicación para limitar el estrés replicativo 52. 1.3.1. Componentes de la ruta de reparación AF que presentan un papel en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación La ruta AF tiene un papel relevante en el mantenimiento de la estabilización de la horquilla de replicación. Las funciones de la ruta AF con respecto al rescate de las horquillas de replicación bloqueadas, pueden dividirse en 3 niveles: protección de la horquilla de replicación de la degradación nucleolítica, reinicio de la replicación y supresión de la activación de nuevos orígenes de replicación 53. La ruta AF se activa rápidamente tras la exposición a hidroxiurea (HU) o a afidicolina, las cuales inducen un bloqueo de la horquilla de replicación debido a la inhibición de la enzima ribonucleótido reductasa que causa la depleción del pool de dNTPs, o por la inhibición de la actividad de las polimerasas de ADN POLα, POLδ y POLε, respectivamente, sin generar ICLs 53,54. En células deficientes en la ruta AF se ha observado un incremento en la inestabilidad cromosómica tras el estrés replicativo inducido por HU, atribuido a la falta de estabilización de las horquillas de replicación bloqueadas. Sin embargo, aunque la desprotección de la horquilla de replicación provoca un incremento en la inestabilidad cromosómica, las células deficientes en la ruta AF no son especialmente sensibles a la exposición a agentes que bloquean la replicación, como HU, camptotecina o gemcitabina. Estos datos sugieren la existencia de rutas redundantes que aseguran la viabilidad celular a expensas de un incremento en la inestabilidad cromosómica 53,55. Durante el proceso de reversión de la horquilla de replicación, BRCA2 (FANCD1) protege las horquillas de replicación bloqueadas de la degradación excesiva mediada por las nucleasas MRE11 o DNA2, mediante la estabilización del nucleofilamento de RAD51 (FANCR), el cual protege el ADN naciente 56. La estabilización del nucleofilamento de RAD51 es esencial para mantener la estabilidad de las horquillas de replicación. La unión de RAD51 a ssDNA depende de la acción de BRCA2, que desplaza a RPA y promueve la formación del nucleofilamento para proteger el brazo central de la estructura de reversión formado por las cadenas de ADN naciente. Adicionalmente a RPA, otro factor capaz de unirse a ssDNA en el contexto de la replicación es RADX, el cual interacciona con RAD51, INTRODUCCIÓN 48 controlando la formación del nucleofilamento. En presencia de RADX, RAD51 no puede cargarse en el ssDNA y, por tanto, no puede generar el nucleofilamento que protege el ADN naciente. Mediante la inhibición de la formación del nucleofilamento de RAD51, RADX evita la formación de la estructura de reversión en ausencia de estrés replicativo, presentando un papel relevante en la protección de la horquilla de replicación. Además de desplazar a RPA del ssDNA, BRCA2, mediante sus dominios BRC, es capaz de contrarrestar la actividad inhibitoria de RADX sobre RAD51, permitiendo la formación del nucleofilamento de RAD51 para proteger la horquilla de replicación 57. Adicionalmente a BRCA2, FANCD2 forma un heterodímero con FANCI, el cual abraza al ADN y forma largos filamentos que ayudan a estabilizar el nucleofilamento de RAD51 ante un bloqueo de la horquilla de replicación, para proteger el ADN naciente de la degradación nucleolítica excesiva, y facilitar el reinicio de la replicación una vez que la lesión que ha causado el bloqueo se ha reparado 24,52,55. FANCD2 y BRCA2 presentan funciones redundantes para proteger a las horquillas de replicación bloqueadas de la acción de MRE11 52,58. Células tumorales deficientes en BRCA1/2 presentan un incremento compensatorio de la expresión y actividad de FANCD2. FANCD2 se recluta a las horquillas de replicación bloqueadas para promover su protección y reinicio, favoreciendo la supervivencia celular ante la falta de BRCA1/2. Este incremento en la supervivencia de las células deficientes en BRCA1/2 podría deberse al reclutamiento de POLθ y CtIP a las horquillas de replicación por FANCD2, para promover la reparación mediante la ruta de reparación alt-EJ. Esta ruta de reparación puede ser la encargada de reparar los DSBs generados en las horquillas de replicación bloqueadas. La expresión de FANCD2 correlaciona con la expresión de POLθ, la cual también presenta un incremento en las células deficientes en BRCA1/2. FANCD2 y POLθ colocalizan en sitios de roturas en el ADN, y CtIP interacciona físicamente con FANCD2. Por tanto, FANCD2 podría ser considerado un factor fundamental para el mantenimiento de la viabilidad de células tumorales deficientes en BRCA1/2, debido a su posible actuación en la ruta de reparación alt-EJ, aguas arriba de POLθ y CtIP, para regular su reclutamiento a los DSBs generados en las horquillas de replicación 52. La depleción conjunta de BRCA2 y FANCD2 provoca una degradación mayor del ADN naciente en comparación con la depleción de ambos genes de forma independiente, indicando que estos dos factores protegen a las horquillas de replicación bloqueadas mediante mecanismos distintos. Adicionalmente al incremento de degradación del ADN naciente, se ha observado un mayor defecto en el reinicio de las horquillas bloqueadas en ausencia de ambos genes, en comparación con la falta de cada gen independiente, indicando que FANCD2 y BRCA2 tienen funciones independientes con respecto al reinicio de la replicación tras el bloqueo de la síntesis de ADN. Además, se ha observado un incremento de aberraciones cromosómicas y de la fosforilación en la serina 139 de la variante de histona H2AX (γH2AX) en células deficientes en BRCA2 y FANCD2, lo que sugiere que FANCD2 es necesario para prevenir la inestabilidad genómica en células deficientes en BRCA2 24,58. Estos defectos revelan una relación sintético letal entre ambos genes, ya que la deficiencia combinada en ambos genes provoca la muerte de células tumorales, tanto in vivo como in vitro, sugiriendo que FANCD2 actúa como una ruta alternativa en la estabilidad de la horquilla de replicación en ausencia de los factores BRCA 24,52,58. INTRODUCCIÓN 49 Además del estrés replicativo inducido por agentes que bloquean la replicación como HU, las células deficientes en BRCA2 muestran altos niveles de estrés replicativo endógeno. Ante estas condiciones de estrés replicativo asociado a la inactivación de BRCA2, se ha demostrado que FANCD2 limita la síntesis de ADN, suprimiendo la activación de orígenes de replicación durmientes, para evitar una replicación incontrolada 58. Las proteínas de la ruta AF pueden interaccionar físicamente con el replisoma para regular la replicación, mediante la activación de ATR, la cual fosforila a componentes del replisoma y a otros factores que mantienen la estabilidad de la horquilla de replicación para controlar su progresión. Tras el bloqueo de la horquilla de replicación a causa de la depleción del pool de dNTPs por la exposición a HU, ATR fosforila a FANCD2, el cual es reclutado al ADN de nueva síntesis. La fosforilación de FANCD2 promueve su asociación con MCM2-7, que también es fosforilada por ATR en respuesta al arresto de la replicación. Esta interacción enlentece la síntesis de ADN, previene la formación de tramos de ssDNA y minimiza la resección del ADN naciente dependiente de MRE11 y la inestabilidad genómica. Además, FANCD2 interactúa con MCM2-7 independientemente de su monoubiquitinación, ya que la mutación puntual FANCD2-K561R, la cual provoca que FANCD2 no se ubiquitine, no impide la interacción con MCM2-7 11,17,35,53. FANCI también se recluta al ADN naciente tras el bloqueo de la horquilla de replicación y promueve que los orígenes de replicación durmientes se “licencien” por MCM2-7, facilitando el reinicio de la replicación. Sin embargo, ante condiciones extremas de estrés replicativo, ATR fosforila a FANCI para inhibir la activación de los orígenes de replicación durmientes, proporcionando suficiente tiempo para la reparación del daño 17,53. Con respecto a la ubiquitinación de FANCD2, se ha descrito que la pérdida de FANCA o la presencia de la mutación puntual que impide la ubiquitinación de FANCD2 (FANCD2K561R), conducen a la degradación de la horquilla de replicación bloqueada tras el tratamiento con HU. Estos datos sugieren que la estabilización de la horquilla de replicación necesita la activación de la ruta AF dependiente de la monoubiquitinación de FANCD2. Por tanto, los factores de la ruta que actúan aguas arriba de la ubiquitinación de FANCD2 están involucrados en la protección de la horquilla de replicación 53,55. Se ha descrito recientemente que los componentes del complejo central AF y FANCD2 protegen diferentes tipos de horquillas de replicación. Dependiendo de las helicasas que generen la estructura de reversión de la horquilla de replicación, existen dos mecanismos de protección de la degradación del ADN naciente. FANCD2 protege el ADN naciente de su degradación si la reversión se ha producido por la acción de las helicasas SMARCAL1/ZRANB3/HLTF. Sin embargo, si la estructura de reversión se ha generado por la helicasa FBH1, los factores protectores son, entre otros, FANCA, FANCC o FANCG, componentes del complejo central AF 59. Por tanto, componentes de la misma ruta de reparación protegen horquillas de replicación diferentes. Adicionalmente a su papel en la prevención de la resección nucleolítica perjudicial del ADN naciente en las horquillas de replicación bloqueadas, algunas proteínas de la ruta AF tienen funciones adicionales para contrarrestar el estrés replicativo. La monoubiquitinación de FANCD2 promueve el reclutamiento de otros factores asociados a la ruta AF como la helicasa de ADN BLM, la nucleasa FAN1 (del inglés Fanconi-associated nuclease 1), la helicasa FANCJ o BRCA2, los cuales intervienen en el reinicio de la replicación y la estabilidad genómica 23. Tras el bloqueo de la horquilla de replicación, la helicasa BLM INTRODUCCIÓN 50 coopera con FANCD2, formando un complejo que se une a la cromatina para facilitar el reinicio de la replicación y suprimir la activación de nuevos orígenes de replicación 53. La nucleasa FAN1 interactúa directamente con el complejo FANCD2-BLM para contribuir al reinicio de la replicación. El acceso de FAN1 a la cromatina está regulado por FANCD2, la cual previene la degradación descontrolada del ADN naciente detrás de la horquilla mediada por FAN1 y por MRE11 53,60. FANCD2 presenta actividad chaperona, esencial para la reparación de los ICLs. Sin embargo, esta actividad chaperona también se requiere para evitar la degradación nucleolítica de la horquilla de replicación que ha sido revertida. Se ha descrito que la metiltransferasa de lisinas SETD1A, la cual promueve la metilación de la lisina en posición 4 de la histona H3, actúa junto con los factores protectores de la horquilla de replicación BODL1 y FANCD2. Esta interacción favorece la actividad chaperona de FANCD2, la cual previene la degradación nucleolítica del ADN naciente dependiente de la nucleasa DNA2 mediante la estabilización del nucleofilamento de RAD51. Por tanto, el remodelado de las histonas dependiente de FANCD2 protege a las horquillas de replicación de un proceso de degradación descontrolado, manteniendo la estabilidad del genoma 61. Recientemente se ha descrito que RFWD3 (FANCW) tiene un papel en el reclutamiento de la helicasa ZRANB3 para promover el proceso de reversión de la horquilla de replicación62. Este reclutamiento depende de su actividad ubiquitin-ligasa. La pérdida de RFWD3 previene la degradación nucleolítica del ADN naciente o la sensibilidad a HU en células deficientes en BRCA2, al igual que ocurre tras la pérdida de la helicasa ZRANB3 o del resto de helicasas pertenecientes a la familia SNF2 en este mismo fondo genético 63. Además, RFWD3 promueve la ubiquitinación de PCNA y su interacción con ZRANB3, revelando una nueva función de RFWD3 en la protección de la horquilla de replicación 62. Todos estos datos demuestran el papel de múltiples factores de la ruta AF que participan en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación. 1.3.2. Componentes de la ruta de reparación BER que tienen funciones relacionadas con el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación Adicionalmente a la ruta AF/BRCA/RAD51, se ha descrito que factores pertenecientes a otras rutas de reparación presentan un papel en el mantenimiento de la horquilla de replicación. Estos factores pueden ser dependientes o independientes de la actividad de RAD51 15. En esta sección nos centramos en aquellos factores de la ruta BER que tienen un papel protector de la horquilla de replicación. Uno de estos factores es PARP1, el cual presenta múltiples funciones durante la replicación del ADN. Tras el bloqueo de la horquilla de replicación y la formación de la estructura de reversión, la persistencia de las lesiones u obstáculos que han desencadenado el bloqueo, puede provocar el colapso o rotura de las horquillas de replicación, generando DSBs de un solo extremo (one-ended double strand breaks), los cuales activan a PARP1 para iniciar la reparación. Una de las funciones de PARP1 en este tipo de lesiones es evitar la unión tóxica de factores de NHEJ, como el complejo KU o 53BP1, y promover la unión de factores de HR para su reparación apropiada 64. Además, PARP1 también regula el reclutamiento y la actividad de la nucleasa MRE11 en las horquillas de replicación bloqueadas, mediante la interacción física entre MRE11 y los polímeros de PAR. Una vez reclutada a la horquilla INTRODUCCIÓN 51 de replicación, MRE11 facilita la resección de los extremos 5’ del DSB para generar un extremo 3’ de ssDNA, en el cual RAD51 es capaz de cargarse para facilitar el mecanismo de intercambio de molde y reiniciar la síntesis de ADN 5,64,65. Sin embargo, el reclutamiento de MRE11 mediado por PARP1 puede ser perjudicial en células deficientes en BRCA1/2, ya que puede inducir una degradación excesiva del ADN naciente, dando lugar a inestabilidad genómica en estas células 5,66. PARP1 también puede regular el tiempo que la horquilla de replicación permanece en reversión mediante la inhibición de la helicasa RECQ1, hasta que la lesión que ha causado el bloqueo se ha reparado. RECQ1 es capaz de devolver a la horquilla de replicación a su estructura original independientemente si la lesión se ha resuelto o no, teniendo un efecto negativo en la reparación de la horquilla bloqueada, siendo de gran relevancia su regulación por PARP1 64,66. Dado las múltiples funciones que presenta PARP1 tras el daño inducido por factores exógenos, es importante identificar las fuentes endógenas que desencadenan la señalización de PARP1. La mayor parte de la señalización de los polímeros de PAR que se detecta en las células que no son expuestas a daño exógeno, se localiza principalmente en células que están en fase S, específicamente cerca o en los sitios donde el ADN se está replicando. Pero esta señalización no se debe ni al daño estocástico que ocurre durante el ciclo celular, ni por inducción de estrés replicativo, si no que se produce cuando los fragmentos de Okazaki no se ligan adecuadamente. Algunos de los millones de fragmentos de Okazaki que se generan durante la síntesis de la hebra rezagada, pueden escapar del procesamiento canónico para su ligación. La señalización por PARP1 de aquellos fragmentos que no se han procesado completamente, regula el reclutamiento de XRCC1 para iniciar la actividad de la maquinaria de reparación de los SSBs y así completar su ligación. Por tanto, huecos de ssDNA en las cadenas nacientes de ADN pueden ser señalizados por PARP1 para completar su ligación y así mantener la estabilidad del genoma 67. Otro factor de BER que presenta un papel en la estabilización de la horquilla de replicación es XRCC1. Se ha descrito que en ausencia de BRCA2, XRCC1 se recluta a la horquilla de replicación bloqueada junto a factores que forman parte de la ruta de reparación de unión de extremos por microhomología (MMEJ; del inglés microhomology-mediated end joining). Este reclutamiento promueve la finalización de la replicación del ADN, a expensas de un incremento en la inestabilidad genómica, ya que induce la resección del ADN naciente para dar lugar al reinicio de la replicación. En condiciones de estrés replicativo tras la exposición a HU o a inhibidores de ATR, los cuales generan DSBs, XRCC1 forma focos que colocalizan con factores de MMEJ como PARP1, MRE11 o POLθ, sugiriendo que XRCC1 podría tener un papel en la reparación de los DSBs formados en respuesta al estrés replicativo promoviendo la activación de la ruta de MMEJ 68. Además, se ha descrito que BRCA2 y XRCC1 presentan una relación sintético letal 68,69, ya que la pérdida de XRCC1 en células deficientes en BRCA2 incrementa la citotoxicidad a HU y a la inhibición de ATR de forma significativa, provocando una acumulación de DSBs. Estos datos sugieren que XRCC1 juega un papel importante en la reparación de los DSBs generados durante el proceso de estrés replicativo observado en células deficientes en BRCA2 68. BRCA2 y XRCC1 participan en dos rutas distintas para reiniciar las horquillas de replicación. La depleción de XRCC1 evita la degradación del ADN naciente en células INTRODUCCIÓN 52 deficientes en BRCA2, previniendo el incremento de aberraciones cromosómicas inducidas por estrés replicativo, de manera similar a lo observado cuando se inhibe la actividad exonucleolítica de MRE11. Estos datos sugieren que MRE11 y XRCC1 participan en la misma vía responsable de degradar el ADN naciente tras el bloqueo de la replicación en las células deficientes en BRCA2. Por tanto, XRCC1 presenta funciones específicas que ayudan a mantener un equilibrio entre la degradación de la horquilla de replicación y el reinicio de la síntesis de ADN para promover la supervivencia celular a expensas de la formación de aberraciones cromosómicas en ausencia de BRCA2. Además, los tumores deficientes en la ruta de reparación HR presentan una expresión elevada de XRCC1 y MRE11, lo que implica peor supervivencia debido al incremento de la inestabilidad genómica o resistencia a las terapias por el incremento en el reinicio de la progresión de la horquilla de replicación y la reparación del ADN 68. Además del reclutamiento de XRCC1 mediado por PARP1 a los SSBs, XRCC1 también se recluta a las horquillas de replicación bloqueadas, para desencadenar la reparación de la lesión y el reinicio de las mismas de forma eficiente. PARP1 colabora con DNA-PKcs, factor implicado en la ruta de reparación NHEJ, en el reclutamiento de XRCC1 a las horquillas de replicación bloqueadas, sugiriendo así un papel de la maquinaria de NHEJ en la protección de las horquillas de replicación 5,70. 1.4. La presencia de huecos de ssDNA como fuente de daño en el ADN Debido a la relevante función de PARP1 en el mantenimiento de la horquilla de replicación, una de las aproximaciones terapéuticas que se lleva a cabo para el tratamiento de tumores deficientes en la ruta HR, es el uso de inhibidores de PARPs (PARPi). Los PARPi inducen letalidad sintética en ausencia de la ruta HR, debido a que esta ruta es esencial para el mantenimiento de la integridad genómica durante la replicación. PARP1 presenta una función importante en proteger la replicación, evitando la duplicación aberrante del genoma y la muerte celular ante la falta de función de la ruta HR 64. Por ello, el desarrollo de terapias basadas en PARPi ha mejorado de forma significativa la supervivencia en pacientes con tumores deficientes en HR 13. Sin embargo, el mecanismo molecular que subyace la letalidad sintética de estos inhibidores en células deficientes en BRCA permanece sin dilucidar. Uno de los mecanismos propuestos que presenta mayor relevancia para explicar la hipersensibilidad de las células deficientes en BRCA a los PARPi, es la formación aberrante de huecos de ssDNA durante la replicación. Originalmente, la toxicidad de los PARPi se relacionaba con la formación de DSBs tóxicos, ya que además de inhibir la actividad catalítica de PARP1, estos inhibidores inducen su atrapamiento en la cromatina en aquellos lugares donde se ha producido un SSB, generándose una unión muy fuerte entre PARP1 y el ADN, que puede bloquear la replicación o interferir con la reparación del SSB. Este bloqueo de la horquilla de replicación por la persistencia de esta unión entre PARP1 y el ADN o por la elevada acumulación de SSBs sin reparar, podría inducir el colapso de la horquilla de replicación, necesitando de la función de la ruta HR para evitar la formación de DSBs citotóxicos y proteger a la horquilla de replicación 13,71–75. INTRODUCCIÓN 53 Figura I9. Mecanismo de acción de los PARPi. Los PARPi inhiben la actividad catalítica de PARP1 e inducen el atrapamiento de PARP1 en la cromatina, lo que impide la reparación del SSB y conduce a la formación de DSBs, que pueden causar el colapso de la horquilla de replicación en células deficientes en la ruta HR, conduciendo a la muerte celular. Imagen adaptada de Parisi A et al, 2023 76. Datos recientes muestran que la pérdida de la glicosilasa de ADN SMUG1 (del inglés single-strand-selective monofunctional uracil DNA glycosylase 1) en células deficientes en HR, induce resistencia al tratamiento con olaparib. Esto sugiere que tras la escisión de la base modificada de ADN 5-hidroximetil-2’-desoxiuridina (5hmdU) del genoma por SMUG1, los PARPi producen el atrapamiento de PARP1 en la cromatina que puede causar el colapso de la horquilla de replicación y la formación de DSBs, provocando la muerte celular en las células deficientes en BRCA 77. Además, se ha descrito que las células tumorales deficientes en BRCA1/2 que sufren mutaciones secundarias que restauran la funcionalidad de las proteínas BRCA1/2, recuperan la actividad de reparación por HR y muestran resistencia al tratamiento con los PARPi 78. Sin embargo, recientemente se ha descrito que la inhibición de la actividad de PARP1 puede inducir la formación aberrante de huecos de ssDNA. Estos huecos de ssDNA pueden originarse por defectos en la síntesis de la hebra rezagada o por la acción de PRIMPOL durante la síntesis de la hebra continua 13,74,75. Ante un bloqueo de la replicación por la presencia de una lesión en la cadena molde durante la síntesis de la hebra continua, la inhibición de PARP1 impide la formación de la estructura de reversión de la horquilla de replicación, desencadenando la actividad de PRIMPOL, que reinicia la síntesis de ADN aguas abajo del sitio de la lesión, a expensas de la formación de huecos de ssDNA 13,75. Durante la síntesis de la hebra rezagada, los PARPi interfieren en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki, impidiendo que estos se liguen correctamente, lo que genera huecos de ssDNA en la hebra rezagada 74,75,79. Ante un proceso de OFM alterado, la inhibición de PARP incrementa de forma significativa la presencia de huecos de ssDNA post-replicativos detrás de la horquilla de replicación, indicando que los fragmentos de INTRODUCCIÓN 54 Okazaki son una fuente endógena de la genotoxicidad inducida por los PARPi en las células tumorales deficientes en BRCA 74,79. Este modelo de acumulación de huecos de ssDNA tras el uso de PARPi, sugiere la posibilidad de investigar como posibles dianas terapéuticas los mecanismos que rellenan estos huecos, especialmente en el contexto de la quimiorresistencia a los PARPi que pueden desarrollar estos tipos de cáncer deficientes en BRCA 13. 1.5. HMCES, un factor protector de los sitios AP Los sitios AP son una de las lesiones más frecuentes que ocurren en el ADN, generándose 1-5·104 sitios AP al día por célula. La mayoría de los sitios AP son eliminados cuando se localizan en dsDNA por la ruta de reparación BER 37. Sin embargo, algunos sitios AP pueden escapar de su procesamiento por la ruta BER y durante la replicación, se localizan en ssDNA, pudiendo bloquear a las horquillas de replicación en progreso. Estos sitios AP también pueden formarse por la acción de enzimas que desaminan las citosinas localizadas en la hebra molde en ssDNA durante el proceso de replicación, como las enzimas AID/APOBEC3, formando uracilos. Estos uracilos presentes en el ADN son reconocidos por glicosilasas de ADN específicas, generándose sitios AP en la cadena molde. Estos sitios AP localizados en la cadena molde en ssDNA, pueden ser reparados de forma postreplicativa por las polimerasas de TLS (POLζ o POLκ), las cuales pueden sintetizar a través de ellos, aumentando la probabilidad de la generación de mutaciones. Además, estos sitios AP en ssDNA son más susceptibles de sufrir reacciones de eliminación β 37 o de ser escindidos por la actividad de endonucleasas generando DSBs 80,81. Se ha descrito que HMCES (del inglés 5-hydroxymethylcytosine binding, ES-cell-specific), es un factor que sensa y protege los sitios AP en ssDNA en las horquillas de replicación80,81. Originalmente, HMCES se describió como un factor específico de reconocimiento de la base de ADN derivada del proceso de desmetilación de la citosina 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en células madre embrionarias de ratón (mESC; del inglés mouse embryonic stem cells). HMCES y sus ortólogos están relacionados genéticamente por la conservación del dominio SRAP (del inglés SOS response associated peptidase), asociado a la DDR. El dominio SRAP es un dominio de autoproteólisis, implicado en la eliminación del residuo de metionina 1 para posibilitar la formación del DPC mediante el residuo de cisteína 2, y también tiene actividad nucleasa, la cual escinde las bases derivadas de la oxidación de la 5-metilcitosina (5mC) del ADN 82,83. HMCES presenta altos niveles de expresión durante la fase S del ciclo celular, siendo reclutada específicamente durante la fase S a la cromatina tras la generación de daño en el ADN. Además, interacciona con PCNA mediante el dominio PIP (del inglés PCNA interacting peptide), para su reclutamiento a la horquilla de replicación 80,84. El dominio SRAP contiene un residuo conservado de cisteína 2 en el extremo amino, el cual permite la unión covalente a los sitios AP localizados en ssDNA, mediante un enlace tiazolidínico 80,81,85. Los residuos de arginina 98 y 212 del dominio SRAP se encuentran conservados y son imprescindibles para la unión de HMCES al ADN, y preferentemente a ssDNA con respecto a dsDNA 80,86. HMCES reacciona con los sitios AP localizados en una intersección ssDNA-dsDNA que contiene un extremo 3’ libre, estructura similar a la formada cuando una horquilla de replicación se bloquea ante un sitio AP localizado en la INTRODUCCIÓN 55 cadena molde 81,85. Debido a su naturaleza inestable, los sitios AP pueden encontrarse en dos estados: anillo de furanosa cerrado o anillo abierto con un grupo aldehído libre altamente reactivo. Esta alta reactividad hace de los sitios AP una fuente química muy reactiva que forma ICLs o DPCs 37. HMCES reacciona con el sitio AP en conformación abierta a través del residuo de cisteína 2, el cual reacciona con el grupo aldehído del sitio AP formando un DPC 80,87. La formación de HMCES-DPCs lleva a cabo dos funciones moleculares. En primer lugar, previene el corte mediado por la endonucleasa APEX1, evitando la formación de DSBs. De este modo, HMCES protege a los sitios AP de un procesamiento aberrante para mantener la integridad del genoma. En segundo lugar, impide la acción de las polimerasas de TLS tras el bloqueo de la horquilla de replicación ante la presencia de un sitio AP en la cadena molde, evitando una progresión aberrante de la horquilla de replicación y la generación de mutaciones 80,81. Figura I10. Mecanismo de protección de los sitios AP en ssDNA por la unión covalente de HMCES. La unión covalente de HMCES a los sitios AP localizados en ssDNA previene el corte endonucleolítico de APEX1, impidiendo la formación de DSBs, y la acción de las polimerasas de TLS, evitando la generación de mutaciones. Imagen adaptada de Nowotny M, 2019 88. Los HMCES-DPCs resultan en una lesión voluminosa que podría interferir con los procesos de replicación y transcripción, por lo que deben ser eliminados. HMCES puede eliminarse del genoma mediante 3 mecanismos. Uno de ellos es la eliminación de este intermediario HMCES-DPC mediante la proteólisis llevada a cabo por el proteasoma mediada por ubiquitinación, sugiriendo que HMCES es una “enzima suicida” 80. Además de la eliminación por el proteasoma, uno de los mecanismos mejor descritos para la eliminación de DPCs es la proteólisis mediada por la proteasa SPRTN asociada a la replicación. Esta ruta de reparación no genera DSBs y es crítica para la viabilidad celular y la supresión de enfermedades. La helicasa FANCJ coopera con SPRTN para eliminar los HMCES-DPC. FANCJ es la encargada de desnaturalizar la proteína que conforma el DPC, INTRODUCCIÓN 56 permitiendo que SPRTN pueda realizar el corte del DPC para eliminarlo 89. Adicionalmente a los mecanismos descritos anteriormente, existe un mecanismo no dependiente de proteólisis para eliminar los HMCES-DPCs. Se ha descrito que HMCES puede autorevertir su unión covalente con el sitio AP a través del residuo ácido glutámico 127, y parcialmente por la histidina 210, cuando el HMCES-DPC se localiza en dsDNA. Estos residuos permiten que HMCES sea capaz de autoliberarse, manteniendo la capacidad de formar enlaces covalentes ante la presencia de otros sitios AP que se encuentren en ssDNA o en una intersección ssDNA-dsDNA. Esto demuestra que el HMCES-DPC es reversible 87,90. Hasta la fecha, el papel de HMCES ha sido descrito asociado a la hebra molde. Ante la presencia de sitios AP en la hebra molde, generados por la exposición a agentes genotóxicos o por la actividad de las glicosilasas de ADN, HMCES se une covalentemente a ellos para su protección. Sin embargo, los HMCES-DPC también se generan como intermediarios de reparación. Los sitios AP en su conformación abierta pueden reaccionar con los aminos exocíclicos de las bases de la cadena opuesta generando un ICL. Estos AP-ICLs son reparados por la glicosilasa de ADN NEIL3 (del inglés nei endonuclease VIII-like family 3). Tras la acción de NEIL3, el sitio AP queda libre en una de las cadenas, pudiendo ser sobrepasado por la helicasa replicativa CMG y a continuación, HMCES es capaz de reaccionar con él formando un DPC, que es degradado posteriormente por SPRTN. Por tanto, este HMCES-DPC participa como intermediario de la reparación del ADN, suprimiendo la formación de DSBs, ralentizando el mecanismo de TLS y promoviendo la inserción de una desoxiguanosina enfrente del sitio AP 91. 1.6. La presencia de bases de ADN modificadas en el genoma puede causar estrés replicativo La presencia de bases de ADN que presentan pequeñas modificaciones químicas, puede afectar a la progresión de la horquilla de replicación que está en progreso. Una de las modificaciones de las bases de ADN que se mantiene estable en el genoma es la 5mC, la cual se forma mediante la transferencia enzimática de un grupo metilo a la posición N5 del anillo de citosina 92–94. La 5mC es una marca epigenética que tiene funciones relevantes, como el control de diversos procesos celulares (control de la actividad transcripcional, la impronta genómica o la inactivación del cromosoma X), así como la regulación de la supresión de los elementos de transposición o la modulación de la estructura de la cromatina. Un balance entre los procesos de metilación y desmetilación para mantener el estado de metilación, es crucial para el desarrollo. La perturbación de este balance puede llevar a patrones de metilación aberrantes que pueden inducir el desarrollo de enfermedades, como el cáncer 93,95,96. La principal función de la 5mC presente en el genoma es la regulación de la expresión génica, teniendo un papel represivo de la transcripción, ya que impide la unión de ciertos factores de transcripción o recluta enzimas que modifican la estructura de la cromatina, haciéndola más compacta, lo que impide el inicio de la transcripción 92. El grupo metilo añadido a la citosina es biológicamente muy estable, pero esta adición es reversible, pudiendo ser eliminado mediante diferentes mecanismos 92,96. El mecanismo más relevante es la oxidación enzimática secuencial que es llevada a cabo por las enzimas dioxigenasas TET. Estas enzimas catalizan la transferencia de una molécula de oxígeno al 3. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 65 3.1. Procedimientos de cultivos celulares 3.1.1. Líneas celulares Todas las líneas celulares que se han usado para llevar a cabo los principales experimentos descritos en esta tesis doctoral son fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, del inglés mouse embryonic fibroblasts) (Tabla 3.5.1). También se han usado líneas celulares de origen humano para la realización de experimentos complementarios (Tabla 3.5.1). 3.1.2. Cultivo celular La línea celular MEF y la línea celular humana U2OS fueron cultivadas en Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Biowest/Corning), suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal y 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina. La línea celular humana eHAP fue cultivada en Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) (Biowest), suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina. Las líneas celulares humanas MDA-MB-231 y MDA-MB-436 fueron cultivadas en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Biowest), suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina. Las líneas celulares humanas DLD-1 silvestre y deficiente en BRCA2 fueron cultivadas en RPMI 1640, suplementado con 2mM de glutamina, 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Las células DLD-1 BRCA2-/- se mantuvieron en cultivo añadiendo al medio higromicina B a una concentración final de 0.1mg/mL. Todas las líneas celulares fueron mantenidas en un incubador con una temperatura constante de 37ºC y una atmósfera de CO2 al 5%. Para los diferentes ensayos que se han llevado a cabo durante la realización de esta tesis doctoral, se han usado diferentes tipos de placas de cultivo, de las cuales se describe a continuación el volumen final en el que se realiza la siembra de las células: Placa cultivo celular Volumen final 96 pocillos 100 µL 24 pocillos 500 µL 12 pocillos 1 mL 6 pocillos 2 mL 10cm 8 mL 3.2. Técnicas de biología celular 3.2.1. Transfección con ARN pequeño de interferencia (siRNA; del inglés small interfering RNA) Para llevar a cabo el silenciamiento de genes, utilizamos siRNAs, los cuales permiten silenciar genes mediante la degradación del ARN mensajero y, por tanto, la supresión de la síntesis de proteínas. Los siRNA usados para llevar a cabo el silenciamiento de los genes de interés, están compuestos por un pool de 4 secuencias diana distintas contra el mismo MATERIALES Y MÉTODOS 66 gen (Dharmacon siGENOMETM siRNA pool), proporcionados por la empresa Horizon. Los siRNA que se han utilizado para realizar los ensayos presentados en esta tesis doctoral se han detallado en la Tabla 3.5.2. Se siembran 3·105 células en placas de 6 pocillos y al día siguiente, se realiza la transfección usando el agente de transfección Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Scientific), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante, con algunas modificaciones para su optimización: - Preparación de una solución A con medio libre de suero (Optimem; Gibco) junto con lipofectamina. Pipetear bien la mezcla. - Preparación de una solución B con medio libre de suero y la cantidad correspondiente de siRNA (3µL del stock 20µM). Pipetear bien la mezcla. - Mezclar ambas soluciones e incubar 15 minutos a temperatura ambiente. - Añadir gota a gota a cada pocillo. Tras 30h desde que se realizó la transfección, se retira el medio de transfección y se lleva a cabo la siembra de los diferentes ensayos moleculares para analizar el silenciamiento del gen de interés y examinar las consecuencias genéticas. 3.2.2. Transfección con plásmidos Para la sobreexpresión de diferentes genes de interés, se llevó a cabo la transfección de los plásmidos que contiene el ADN complementario (cDNA) del gen de interés. Los plásmidos utilizados para la realización de este ensayo están descritos en la Tabla 3.5.3. Se siembran 4·105 células en placas de 6 pocillos y una vez adheridas, se realiza el protocolo de transfección. Se prepara una primera mezcla con 4µg de ADN + 400µL de medio Optimem, se agita mediante vórtex, y posteriormente se añaden 6µL del agente de transfección TurboFectTM (Thermo Scientific), previamente agitado por vórtex. Toda la solución se mezcla mediante vórtex y se añade gota a gota. Tras 16h-18h, se retira el medio de transfección, reemplazándolo por medio fresco. 24h después, se añade la droga de selección (descritas en la Tabla 3.5.4) para obtener una línea celular homogénea que sobreexprese de forma estable nuestro gen de interés. 3.2.3. Generación de líneas celulares mutantes mediante la técnica CRISPR-Cas9 Para la generación de líneas celulares mutantes en un gen de interés, llevamos a cabo la técnica CRISPR-Cas9, que consiste en la utilización de una molécula guía de ARN, la cual permite que la nucleasa Cas9 reconozca la secuencia del gen de interés y se una a ella. El ARN guía contiene una secuencia PAM necesaria para que Cas9 pueda introducir cortes en la secuencia del gen diana. Los ARN guías específicos contra el gen de interés se diseñaron a través de la aplicación CRISPR Search (https://wge.stemcell.sanger.ac.uk/find_crisprs). En ella, se seleccionaron dos secuencias de 20 nucleótidos correspondientes al exón 2 del gen humano FANCD2 (la secuencia PAM subrayada): - 950056454 (sgFD2-4) 5’-TACTGGAGGCATCTTCTGTCAGG-3’ - 950056455 (sgFD2-5) 5’-AATGACTAGATACTTACTGGAGG-3’ MATERIALES Y MÉTODOS 67 Figura M.1. Representación de la localización de los guías de ARN elegidos para la generación de mutantes mediante la técnica CRISPR-Cas9. Estos guías fueron seleccionados por tener una menor frecuencia de unión a secuencias no específicas. Una vez que se eligieron las secuencias de los ARN guías, se modificaron sus extremos para añadirles la secuencia diana de la enzima de restricción BbsI/BpiI, y así facilitar su clonaje en el plásmido pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458, Addgene plasmid #48138), el cual es digerido por dicha enzima. Se realiza la ligación de los guías al plásmido digerido y se transforman bacterias E. Coli DH5α para su amplificación. Se seleccionaron diferentes colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico y mediante secuenciación Sanger, se verificó que el plásmido contenía las secuencias de los ARN guías. Figura M.2. Secuenciación del plásmido PX458 tras la inserción de los guías de ARN para la realización de la técnica CRISPR-Cas9. En la imagen superior se observa la secuencia del ARN guía sgFD2-4 y en la imagen inferior se observa la secuencia del ARN guía sgFD2-5. Una vez que obtenido el plásmido PX458 con los ARN guías, se transfectan las células siguiendo el protocolo explicado en el apartado 3.2.2. Debido a que el plásmido PX458 expresa la proteína fluorescente GFP, seleccionamos las células que han adquirido el plásmido mediante citometría de flujo y se siembra a razón de 1 célula por pocillo en placa de 96 pocillos, para dejar crecer clones independientes. A medida que los clones iban creciendo, se diluyeron en pocillos de mayor tamaño hasta tener un número suficiente de células que permitió la comprobación de la falta de expresión proteica mediante Western Blot y la extracción de ADN para secuenciar y comprobar las mutaciones que han sido introducidas. Mediante estas dos técnicas, se seleccionaron aquellos clones candidatos positivos para ser mutantes en el gen FANCD2. MATERIALES Y MÉTODOS 68 3.2.4. Reacción celular Click-iT Para la detección de células en fase S mediante microscopía o citometría de flujo, se utilizó el análogo de la timidina 5-etinil-2’-desoxiuridina (EdU), el cual se añade a una concentración final de 10µM durante la última hora del tratamiento. La detección de EdU se basa en una reacción química covalente catalizada por cobre entre una azida y un grupo alquino (reacción Click-iT). Las células se incuban durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Los reactivos deben ser añadidos a la mezcla en el siguiente orden:  100mM Tris-HCl pH 8.5  1mM CuSO4  1µM Azida Alexa Fluor 488  H2O milliQ  100mM ácido ascórbico Tras esta incubación, los pasos que se suceden difieren dependiendo si las muestras son para inmunofluorescencia o para citometría de flujo. 3.2.5. Análisis del ciclo celular Para examinar el perfil de ciclo celular, se siembran 2·105 células en placas de 6 pocillos y una vez adheridas, son tratadas con la droga de interés y el tiempo de incubación que se requiera. Durante las dos últimas horas del tratamiento, se añade EdU a una concentración final de 10µM para el marcaje de las células en fase S. Una vez pasado el tiempo de incubación con el tratamiento, se recogen las células con tripsina, se lavan con PBS y se fijan con etanol 70% frío, gota a gota y agitando mediante vórtex. Las muestras se guardan a 4ºC, durante mínimo 4h, antes de realizar la tinción. Para llevar a cabo la tinción, se obtiene el pellet de células y se permeabiliza con PBS+0.1%Tritón X-100. A continuación, se obtiene el pellet celular y se resuspende en solución de bloqueo (PBS+0.3%Tween20+3%BSA), incubándolo durante 30 min. Tras el bloqueo, se obtiene el pellet y se lleva a cabo la reacción celular Click-iT, incubando las células durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Tras la reacción Click-iT, se obtiene el pellet y se realiza un lavado con solución de bloqueo. Se vuelve a obtener el pellet y se resuspende en solución de tinción (0.01mg/mL Ioduro de Propidio + 0.2mg/mL RNAsa A, diluidos en PBS), incubando las células durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Finalmente, se vuelven a lavar las células en solución de bloqueo, se filtran y son pasadas por el citómetro LSRFortessa X-20. El análisis de los datos se lleva a cabo con el software FlowJo 9.0. 3.2.6. Inmunofluorescencia Para la detección de proteínas a través de microscopía, se siembran 7.5·104 células en cubreobjetos de vidrio estériles (VWR) colocados en placas de 24 pocillos. Una vez que las células se han adherido, se añade el tratamiento correspondiente durante el tiempo estimado. Tras la incubación con el tratamiento, se lavan las células con PBS y se realiza un paso de pre-extracción celular, mediante la adición de 0.25/0.5% Tritón X-100+PBS frío durante 2 minutos en hielo, seguido de un proceso de fijación celular con 4% formaldehído+PBS frío durante 15 min en hielo. Tras la fijación, se realiza un lavado con MATERIALES Y MÉTODOS 69 PBS para eliminar los restos de solución de fijación que puedan quedar y se procede al bloqueo de las células con PBS+0.3%Tween20+3%BSA, durante 20-30 minutos en agitación y a temperatura ambiente. La incubación con el anticuerpo primario se lleva a cabo mediante la dilución del mismo en solución de bloqueo, durante 16-18h a 4ºC y en condiciones de humedad. Al día siguiente, se realizan 3 lavados en agitación con PBS+0.3%Tween20 de 5 minutos. Posteriormente, el correspondiente anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo se diluye en la solución de lavado, junto con 0.1mg/mL de DAPI (4’6-diamidine-2phenylindole dihydrochloride; permite la tinción del núcleo), y se incuban durante 1h en oscuridad, a temperatura ambiente y en condiciones de humedad. Finalmente, se realizan 3 lavados con PBS+0.3%Tween20, los cubreobjetos de vidrio se dejan secar durante 5 minutos y se montan en un portaobjetos usando el medio de montaje anti-decoloración ProLong™ Gold (Invitrogen). Las imágenes son tomadas en el microscopio Leica Thunder imager DMi8 con el objetivo 40X. La cuantificación de la intensidad de señal nuclear y la representación gráfica de los resultados se realizó usando los softwares Fiji y GraphPad Prism 9.0 respectivamente. Los anticuerpos primarios usados para los ensayos de inmunofluorescencia reportados en esta tesis doctoral están descritos en la Tabla 3.5.6. Para la detección de células en fase S, se añade en la última hora del tratamiento 10µM de EdU. A continuación, permeabilizamos y fijamos de la misma forma explicada previamente y tras la fijación, bloqueamos con PBS+0.3%Tween20+3%BSA durante 1h en agitación y a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, se realizan dos lavados de 5 min en agitación con PBS+1%BSA y se lleva a cabo la reacción celular Click-iT, incubando las células durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Tras esta incubación, se realizan dos lavados con PBS+0.3%Tween20 de 5 min en agitación y se vuelve a bloquear durante 20-30 min en agitación. A continuación, se procede a la incubación del anticuerpo primario y secundario de la misma forma que se ha explicado previamente. 3.2.7. Detección de células BrdU+ mediante inmunofluorescencia Para determinar el porcentaje de células BrdU+ tras un proceso de resección del ADN naciente, el análogo de la timidina 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) se añade durante 2 ciclos celulares y se realiza el protocolo de inmunofluorescencia explicado en el apartado 3.2.6. 3.2.8. SIRF (in situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks) Para la detección de proteínas que se encuentran próximas (< 40nm) a la horquilla de replicación, llevamos a cabo este ensayo descrito por Roy S and Schlacher K, 2019 107, con algunas modificaciones. La horquilla de replicación se etiqueta mediante un pequeño pulso de EdU, y a continuación, se añade el tratamiento, para detectar aquellas proteínas que se reclutan a la horquilla de replicación tras el daño inducido por el tratamiento. Se lleva a cabo la reacción celular Click-iT para biotinilar la EdU que se ha incorporado al ADN naciente y después se realiza la incubación con los anticuerpos contra la biotina, para identificar la EdU, y contra la proteína de interés. Tras esta incubación se realiza la MATERIALES Y MÉTODOS 70 amplificación de la señal mediante PLA (del inglés Proximity Ligation Assay), lo que permitirá la visualización de la proteína de interés que se localiza a una distancia < 40nm del ADN recién sintetizado. Figura M3. Esquema de la técnica SIRF para detectar la asociación de proteínas con el ADN naciente. Imagen adaptada de Taglialatela A et al, 2017 63. Se siembran 105 células en cubreobjetos de vidrio en placa de 24 pocillos. Al día siguiente, se da un pulso con 125µM de EdU durante 8 min, para etiquetar el ADN que se está sintetizando. A continuación, se retira el medio rápidamente y se dan 2 lavados con PBS, para añadir el tratamiento estimado durante el tiempo requerido. Una vez finalizado el tratamiento, llevamos a cabo la permeabilización de las células con 0.5%TritónX-100+PBS frío durante 2 min y tras la permeabilización, fijamos las células con 2%formaldehído+PBS frío durante 15 min. Se realizan 2 lavados con PBS de 5 min y se lleva a cabo la reacción Click-iT durante 1h a temperatura ambiente, en condiciones de humedad y oscuridad:  2mM CuSO4  1µM Azida Alexa Fluor 488 (nos permite visualizar la fase del ciclo celular y seleccionar solo aquellas células que están en fase S)  9µM biotin-PEG3-azide (para biotilinar EdU que se ha incorporado al ADN naciente)  PBS  100mM ácido ascórbico Tras la reacción Click-iT, se dan dos lavados con PBS de 5 min y se incuban las muestras con la solución de bloqueo, durante 1h a temperatura ambiente, en condiciones de humedad y oscuridad. A continuación, se realiza la incubación con los anticuerpos primarios, diluidos en la solución de bloqueo, durante 16h a 4ºC y en condiciones de humedad. Los anticuerpos primarios usados para la realización de este ensayo se describen en la Tabla 3.5.6. Al día siguiente, se lleva a cabo el ensayo PLA. Se realizan 3 lavados con la solución de lavado A (10mM Tris-HCl pH 7.5 + 150mM NaCl + 0.05%Tween20) durante 5 min en agitación y a continuación se lleva a cabo la incubación con las sondas (Duolink® In Situ PLA® Probe anti-mouse MINUS y anti-rabbit PLUS) diluidas 1:5 en solución de bloqueo durante 1h a 37ºC en condiciones de humedad y oscuridad. Tras la incubación con las sondas, se realizan 3 lavados con solución de lavado A durante 5 min en agitación y se incuban las muestras con la ligasa en solución de ligación (diluidas 1:5 y 1:40 MATERIALES Y MÉTODOS 71 respectivamente en H2O milliQ; Duolink® In Situ Detection Reagents Orange) durante 30 min a 37ºC en condiciones de humedad y oscuridad. Una vez finalizada la incubación con la ligasa, se realizan 2 lavados de 2 min con la solución de lavado A y se procede a la incubación con la polimerasa de círculo rodante en solución de amplificación (diluidas 1:5 y 1:80 respectivamente en H2O milliQ; Duolink® In Situ Detection Reagents Orange) durante 100 min a 37ºC y en condiciones de humedad y oscuridad. Tras la reacción de amplificación, se realizan 3 lavados de 10 min con la solución de lavado B (200mM Tris-HCl pH 7.5 + 100mM NaCl) en agitación y un lavado de 1 min con una dilución 0.01X de la solución de lavado B en H2O milliQ. Tras estos lavados, se lleva a cabo la tinción con DAPI, diluido 1:1000 en PBS durante 5 min en condiciones de oscuridad y humedad. Una vez finalizada la tinción con DAPI, se realizan 2 lavados de 5 min con PBS y se procede al montaje en portaobjetos usando el medio de montaje antidecoloración ProLong™ Gold. Las imágenes son tomadas en el microscopio Leica Thunder imager DMi8 con el objetivo 63X con aceite de inmersión. La cuantificación de los focos por célula y la representación gráfica de los resultados se realizó usando los softwares Fiji y GraphPad Prism 9.0 respectivamente. 3.2.9. Ensayo de aberraciones cromosómicas Para determinar la presencia de aberraciones cromosómicas, se siembran 2.5·105 células en placas de 10 cm y una vez adheridas, se añade el tratamiento durante 2 ciclos celulares. Una hora y media antes de finalizar el segundo ciclo, se añade la solución KaryoMAX colcemid (Gibco) a una concentración final de 0.05µg/mL. Esta solución permite detener las células en metafase para el estudio posterior de los cromosomas, ya que impide la formación del huso mitótico durante la mitosis. Una vez finalizado el segundo ciclo celular, se recogen tanto las células como el medio y se obtiene el pellet celular, el cual se resuspende en una solución hipotónica (75mM KCl), previamente atemperada a 37ºC, durante 50 min en un baño a 37ºC. Esta solución hipotónica permite dar un choque osmótico a las células para facilitar la rotura de las membranas celulares. A continuación, se obtiene el pellet celular que se fija con la solución de fijación (metanol:ácido acétido (3:1)) fría, añadiéndola gota a gota y en continua agitación manual. Este paso se repite en dos ocasiones más, disminuyendo el volumen de solución de fijación. En el último lavado, las células se concentran y se procede a la extensión de las metafases en un portaobjetos. Para ello, se tiran 3 gotas de células por portaobjeto a una distancia de 45-50 cm. Los portaobjetos se dejan secar a 50ºC durante 30 min y se procede a la tinción de los mismos. Los portaobjetos se sumergen en una solución compuesta por Giemsa diluida 1:10 en H2O milliQ y se incuban durante 30 min. Tras este tiempo, los portaobjetos se lavan con agua destilada y se dejan secar a 37ºC durante 30 min. Por último, se montan los portaobjetos con un cubreobjetos usando el medio de montaje EntellanR Nuevo (AP Medical). Al día siguiente, se contabilizan las aberraciones cromosómicas, usando el microscopio óptico Leica DM6000, con el objetivo de magnificación 100X con aceite de inmersión, y para el análisis de las imágenes se usa el software LAS AF Leica. MATERIALES Y MÉTODOS 72 3.2.10. Ensayo de intercambio de cromátidas hermanas (SCEs) Este ensayo consiste en la extensión de metafases para la contabilización de procesos de recombinación homóloga que ocurren en las células de forma espontánea o inducida por un tratamiento. Se siembran 2.5·105 células en placa de 10 cm y se añade 10µM de BrdU durante 2 ciclos celulares completos, para la tinción diferencial de las cromátidas hermanas. De la misma forma, el tratamiento es añadido durante dos ciclos celulares completos o durante las últimas 12h del segundo ciclo celular para cerciorarnos que el daño ocurre en la cadena de ADN naciente y durante el ciclo celular que está en progreso. Para la extensión de las metafases una vez finalizado el tratamiento, se lleva a cabo el mismo protocolo explicado en el apartado 3.2.9. Una vez que se han extendido las metafases en los portaobjetos, se procede a la tinción. Se sumergen los portaobjetos en una solución de bisbenzimidazol (Hoechst 33442), diluido 10µg/mL, en tampón fosfato (0.2M NaH2PO4 + 0.2M Na2HPO4, pH 6.8), durante 25 min en oscuridad. A continuación, se hace un lavado con solución McIlvaine (164mM Na2HPO4 + 15mM ácido cítrico, pH 7), se coloca un cubreobjetos y se exponen los portaobjetos a radiación UV durante 35 min. Tras esta exposición, se retiran los cubreobjetos y se incuban los portaobjetos en solución 2XSSC (300mM NaCl + 30mM citrato de sodio, pH 7) durante 1h en un baño a 62ºC (la solución 2XSSC es previamente atemperada). Tras este tiempo de incubación, se tiñen los portaobjetos con la solución de tinción, compuesta por Leishman (3g/L, diluido en metanol), diluido 1:4 en tampón fosfato, que se filtra, y se añade Tween20 a una concentración final de 0.05%. La tinción se realiza durante 3 min y después, los portaobjetos se lavan con agua destilada y se dejan secar a 50ºC durante 30 min. Por último, se montan los portaobjetos con un cubreobjetos usando el medio de montaje EntellanR Nuevo (AP Medical). Al día siguiente, se contabilizan los intercambios de cromátidas hermanas, usando el microscopio óptico Leica DM6000, con el objetivo de magnificación 100X con aceite de inmersión, y para el análisis de las imágenes se usa el software LAS AF Leica. 3.2.11. Ensayo de viabilidad MTT Para estudiar la viabilidad celular tras la exposición a diferentes compuestos, se usó un ensayo colorimétrico que mide la actividad metabólica celular como indicador de la viabilidad celular. Se basa en la formación de cristales de formazán de color morado, tras la reducción de una sal de tetrazolio de color amarilla (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio o MTT) por las células metabólicamente activas. Estos cristales de formazán insolubles se disuelven en una solución de solubilización. De esta manera, la cantidad de sal reducida en el medio de cultivo tras la incubación correlaciona con el número de células metabólicamente activas. Para llevar a cabo este ensayo, se siembran 2.5·103 células en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, se añade el tratamiento a diferentes concentraciones y se incuba durante 72h. Tras este periodo de incubación, se añaden 10µL de Thiazolyl Blue Tetrazolium (resuspendido en H2O milliQ a una solubilidad de 5mg/mL) y se incuba, como mínimo, durante 4h a 37ºC. Pasado este tiempo, se añaden 100µL de la solución de solubilización (10% de SDS + 0.01M HCl), el cual se incuba 16-18h. Tras este tiempo, se realiza la lectura de la placa en un espectofotómetro multipocillos (Varioskan; Thermo), el cual nos da el MATERIALES Y MÉTODOS 79 pH8+900mM NaCl y se eluye el ADN con 600µL de 10mM Tris-HCl pH8+1M NaCl+1.8% cafeína. Para la purificación final del ADN, se añade todo el volumen de ADN eluido a los tubos Amicon Ultra-0.5 Centrifugar Filter Unit with Ultracel-100 (Millipore, UFC510096), los cuales se centrifugan durante 10min a 2400g a temperatura ambiente. La membrana se lava dos veces con TE 1X, centrifugando 10min a 10000g, y, por último, se recupera el ADN concentrado dándole la vuelta a los tubos que contienen la membrana y centrifugando de nuevo durante 10min a 10000g. Una vez purificado el ADN, se envían las muestras al laboratorio del Dr. Vincenzo Constanzo, donde realizan el protocolo descrito en Hanthi YW et al, 2024 109, para visualizar las muestras mediante microscopía electrónica y cuantificar la frecuencia de horquillas de replicación rotas. 3.4. Análisis estadísticos El número de cada réplica experimental (R) y el número de células cuantificadas (n) se indica en la leyenda de las figuras. La cuantificación de la intensidad media de la señal nuclear o el número de focos dentro del núcleo se representa en un gráfico de puntos, donde se muestra la mediana o la media junto con la desviación estándar (s.d.), indicado en la leyenda de las figuras. Para la representación de la proporción IdU/CldU del ensayo de fibras de ADN, se utiliza el diagrama de caja y bigotes, en el cual la caja representa el percentil 25-75, mientras que los bigotes representan el percentil 10-90, y el centro de la caja es el valor de la mediana. Para determinar la significancia estadística de los datos representados, se han usado los test Mann-Whitney (no paramétrico), t de Student o One-way ANOVA (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). El análisis de los datos se ha realizado con el software GraphPad Prism 9. 3.5. Tablas de materiales 3.5.1. Líneas celulares Línea celular Genotipo Referencia DLD1 BRCA2-/- Línea celular DLD1 deficiente en BRCA2 Cedida por Dr. Andrés Aguilera (Universidad de Sevilla/CABIMER) DLD1 BRCA2+/+ Línea celular humana de adenocarcinoma colorrectal derivada de paciente Cedida por Dr. Andrés Aguilera (Universidad de Sevilla/CABIMER) eHAP (Fully-haploid engineered HAP1 cell) Línea celular humana haploide Cedida por el Dr. Gerry Crossan (LMB-MRC, Cambridge, UK) eHAP FANCD2Línea celular humana haploide deficiente en el gen FANCD2 Línea celular generada durante esta tesis MDA-MB-231 Línea celular humana silvestre Cedida por Dr. Pablo Huertas (Universidad de Sevilla/CABIMER) MATERIALES Y MÉTODOS 80 MDA-MB-436 Línea celular humana deficiente en BRCA1 Cedida por Dr. Pablo Huertas (Universidad de Sevilla/CABIMER) MEFs Fancd2-/- Fibroblastos embrionarios de ratón, con fondo genético híbrido C57/BL6 y sv129 deficientes en el gen Fancd2 Línea generada en el laboratorio por Clara B. García Calderón MEFs silvestres Fibroblastos embrionarios de ratón, con fondo genético híbrido C57/BL6 y sv129 silvestres Línea generada en el laboratorio por Clara B. García Calderón MEFs silvestres Fibroblastos embrionarios de ratón silvestres Cedidos por Dr. Keith W. Caldecott (Universidad de Sussex, UK) MEFs Xrcc1-/- Fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en el gen Xrcc1 Cedidos por Dr. Keith W. Caldecott (Universidad de Sussex, UK) U2OS Línea celular obtenida de un osteosarcoma humano Cedida por Dr. Fernando Gómez Herreros (Universidad de Sevilla/ IBiS) 3.5.2. siRNA Gen diana Secuencia diana (5’-3’) Referencia Apex1 CAAUGUGGCUCAUGAAGAA GGACUUACAUGAUGAAUGC CAACACUGCUUACGCUUAC UGGAAUACCGACAGCGUUG M-042935-01 Apex2 GGUUAUAACUCCUAUUUCA GGGCGUAAGUGGAUGGAUG GUACUGCCCUCACGCGGAU ACAUAGGGCUCUUCAUGGA M-050966-00 Dck GAAGAGCGGUGGAAAUGUU GAAACAGAGUGGACCAUAU CGAGAAAUGCUUAAACAGA AGUCAACGUUUGUGAAUAU M-055649-01 Dctd CCAAAUGGGUGCAGUGAUG GUGAAGGGCUGCAGCAUGU GAUCAAUAGCCGACCGAGU UGAGUUUCGUCUCGUUAAA M-058063-02 Hmces GCAGAUGGAUUCUACGAGU CAUCAGAUCGGAUAAUUAU GUGAACAAUUCCCGAAACA UGUCGUAGUGAUACCAUAA M-062972-00 HMCES GCGAACAUCCUGUCACUUA GUGAACAACUCGCGAAACA GGGAAGACGCUGUGUCGUU CACGAGAGCUUGCGCCUAC M-020333-01 MATERIALES Y MÉTODOS 81 Non-targeting UAGCGACUAAACACAUCAA UAAGGCUAUGAAGAGAUAC AUGUAUUGGCCUGUAUUAG AUGAACGUGAAUUGCUCAA D-001206-13 Parp1 GGAGGAAGGUGUCAACAAA UAAAGAAGCUGACGGUGAA CAAAGUAUCCCAAGAAGUU GAAAUAUCCUACCUCAAGA M-040023-00 Primpol CGGAAGAAUUACUGGUUUA GGGAAAUGGACAACGUAUU GUUUAUAGCAACCGUUCUA CAUCUCAGACUAAACGAAA M-067173-00 Smug1 GUAACUAUGUGACUCGCUA GGAUGAGGGUUCAGCCAGA GCGGACAGCCUCAAGUCUU GGAUUAUGCUUGGGAGCCA M-041546-01 Xrcc1 GCGCUGGGACCGUGUUAAA CGCCAUACGGCCUGAGUUU AUGGCGAGCUCGAGGACUA GAGGCCGGAUUGUGCGUAA M-046270-00 3.5.3. Plásmidos Plásmido Descripción Referencia pCAG-MmHMCESFLAG Plásmido que contiene el cDNA para la sobreexpresión de la proteína HMCES de ratón, fusionada con el epítopo FLAG Plásmido generado en el laboratorio por Yaiza Rodríguez Martín pRFP-HsXRCC1 Plásmido que contiene el cDNA para la sobreexpresión de la proteína XRCC1 humana, fusionada a la proteína fluorescente RFP Cedido por Dr. Keith W. Caldecott (Universidad de Sussex, UK) pSp-Cas9-GFP (Px458) Plásmido que contiene Cas9 para la realización de la técnica CRISPR Cedido por Dr. Feng Zhang (Addgene #48138) 3.5.4. Antibióticos de selección Antibiótico de selección Concentración usada Blasticidina 4µg/mL Higromicina 0.1mg/mL Neomicina (G418) 250µg/mL MATERIALES Y MÉTODOS 82 3.5.5. Reactivos Reactivo Descripción Referencia 5cadC 5-carboxi-2’- desoxicitidina Berry & Associates (PY 7593) 5dC 2’-desoxicitidina Sigma-Aldrich (D3897) 5fdC 5-formil-2’-desoxicitidina Berry & Associates (PY 7589) 5hmdC 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina Berry & Associates (PY 7588) Jena Bioscience (N-1070) 5hmdU 5-hidroximetil-2’- desoxiuridina Byosynth (ND08018) 5mdC 5-metil-2’-desoxicitidina Berry & Associates (PY 7635) AZD-7762 Inhibidor de CHK1 que bloquea su actividad quinasa Sigma (SML0350) Azida Alexa Fluor 488 Azida fluorescente que reacciona con un grupo alquino terminal mediante reacción celular Click-iT Invitrogen (A10266) Benzonase® Nuclease Nucleasa capaz de eliminar los ácidos nucleicos para potenciar la pureza y la calidad de las muestras proteicas Sigma (E1014) Biotin-PEG3-azide Azida que reacciona con un grupo alquino terminal mediante reacción celular Click-iT y permite la adición de una biotina Baseclick (BCFA-021-5) BrdU 5-bromo-2’-desoxiuridina Sigma-Aldrich (B5002) CldU 5-cloro-2’-desoxiuridina Santa Cruz Biotechnology (sc-221018) Duolink® In Situ Detection Reagents Orange Ligasa, solución de ligación, polimerasa de círculo rodante y solución de amplificación para la detección de la señal PLA Sigma (DUO92007) Duolink® In Situ PLA® Probe anti-mouse MINUS Sonda que reconoce el anticuerpo contra ratón para la amplificación de la señal mediante PLA Sigma (DUO92004) Duolink® In Situ PLA® Probe anti-rabbit PLUS Sonda que reconoce el anticuerpo contra conejo para la amplificación de la señal mediante PLA Sigma (DUO92002) EdU 5-etinil-2’-desoxiuridina Baseclick (BCN-001-100) MATERIALES Y MÉTODOS 83 IdU 5-iodo-2’-desoxiuridina Santa Cruz Biotechnology (sc-205720) Inhibidor C5 Inhibidor de la actividad catalítica de DNA2 GLPBIO (GC38207) MG-132 Inhibidor del proteasoma Sigma (474790) Mirina Inhibidor de la actividad exonucleolítica de MRE11 Sigma (M9948) MMS Metanosulfonato de metilo Sigma (129925) Olaparib Inhibidor de PARP1 Selleckchem (S1060) Proteinasa K Enzima proteolítica que elimina las proteínas de las preparaciones de ácidos nucleicos Roche (03115801001) RNAsa A Degradación del ARN Sigma (R6513) UCN-01 Inhibidor de CHK1 que anula el punto de control G2/M Santa Cruz Biotechnology (sc-202376) 3.5.6. Anticuerpos Diana Origen Aplicación (dilución) Referencia APEX1 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) ABclonal (A1117) Biotina Mouse SIRF (1:100 en solución de bloqueo) Sigma (B7653) BrdU Mouse Ensayo de fibras de ADN (1:250 en PBS+0.1% Tritón X-100+3% BSA) Inmunofluorescencia (1:1000 en PBS+0.3%Tween20+ 3%BSA) BD Bioscience (347580) BrdU Rat Ensayo de fibras de ADN (1:250 en PBS+0.1% Tritón X-100+3% BSA) Abcam (Ab6326) CHK1 Mouse Western Blot (1:2000 en TTBS+ 5%leche) Santa Cruz Biotechnology (sc-8408) DCK Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) ABclonal (A1794) DCTD Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Proteintech (16784-1-AP) ERCC1 Mouse Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Santa Cruz Biotechnology (sc-17809) FANCD2 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5% leche) Abcam (EPR2302) FLAG Mouse Inmunofluorescencia (1:25 en PBS+ 0.3%Tween20+ 3%BSA) Sigma (F1804) HISTONA H3 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Invitrogen (PA516183) MATERIALES Y MÉTODOS 84 HMCES Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 1%BSA) Novus (NBP214410) IdU Mouse Ensayo de fibras de ADN (1:250 en PBS+0.1% Tritón X-100+3% BSA) Sigma (SAB3701448) LAMIN A/C Mouse Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Santa Cruz Biotechnology (sc-376248) PARP1 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Cell Signalling (46D11) PCNA Mouse Western Blot (1:2000 en TTBS+ 5%leche) Santa Cruz Biotechnology (sc-56) Phospho CHK1 (ser345) Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 3%BSA) Cell Signalling (133D3) Phospho H2A.X (ser139) Mouse Inmunofluorescencia (1:1000 en PBS+ 0.3%Tween20+ 3%BSA) Western Blot (1:2000 en TTBS+ 5%leche) Millipore (05636) Phospho H2A.X (ser139) Rabbit Inmunofluorescencia (1:2000 en PBS+ 0.3%Tween20+ 3%BSA) Cell Signalling (20E3) Poly(ADP)- ribose (PAR) Rabbit Inmunofluorescencia/SIRF (1:1000 en PBS+ 0.3%Tween20 +3%BSA) Millipore (MABE1016) PRIMPOL Rabbit Western Blot (1:500 en TTBS+ 5%leche) Anticuerpo purificado por el Dr. Raimundo Freire (Universidad de La Laguna) RAD51 Rabbit Western Blot (1:500 en TTBS+ 5%BSA) Cell Signaling (D4B10) Ser33-RPA32 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 3%BSA) Cell Signaling (E9N1T) Ser4/ser8RPA32 Rabbit Inmunofluorescencia (1:2000 en PBS+ 0.3%Tween20+ 5%BSA) BioNova (A300245A) SMUG1 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) Cell Signaling (E7P4I) XRCC1 Mouse Inmunofluorescencia (1:500 en PBS+0.3%Tween20+3%BSA) Invitrogen (MA512071) XRCC1 Rabbit Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) ABclonal (A0442) α-TUBULINA Mouse Western Blot (1:1000 en TTBS+ 5%leche) GeneTex (GTX628802) 4. RESULTADOS 4.1. CAPÍTULO 1: XRCC1 previene la inestabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación errónea de la base de ADN modificada 5hmdU RESULTADOS 95 Figura C1.7. La exposición a 5hmdC incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX en las células Xrcc1-/-. A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y de γH2AX (verde) de las líneas celulares silvestre y deficiente en XRCC1 tras la exposición a 5hmdC (5µM y 10µM) durante 3h. B) Cuantificación de la intensidad nuclear media de PAR por célula (n=150) tras el tratamiento con 5hmdC (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). C) Cuantificación de la intensidad nuclear media de γH2AX por célula (n=150) tras el tratamiento con 5hmdC (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). Ya que la detección de γH2AX es una medida indirecta de los DSBs, determinamos la presencia de DSBs de manera directa mediante el ensayo de aberraciones cromosómicas. Mientras que la exposición a 5hmdC no incrementó la frecuencia de aberraciones cromosómicas de forma significativa en las células silvestres, en las células Xrcc1-/- se observó un incremento significativo y dosis-dependiente de la frecuencia de huecos, roturas y cromosomas radiales tras el tratamiento con 5hmdC (Figura C1.8 A y B). Estos datos sugieren en las células Xrcc1-/- la incorporación errónea de la 5hmdC durante la replicación genera SSBs que se transforman en DSBs. RESULTADOS 96 Figura C1.8. La exposición a 5hmdC incrementa la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en XRCC1. A) Imágenes representativas de metafases de células silvestres y Xrcc1-/- para la cuantificación de aberraciones cromosómicas tras el tratamiento con 5hmdC (1.25 µM y 2.5µM durante 2 ciclos celulares). B) Cuantificación del número de los diferentes tipos de aberraciones cromosómicas por metafase (n=50 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). Estos datos sugieren que la incorporación errónea de la 5hmdC durante la replicación incrementa los niveles nucleares de PAR y de γH2AX, la inestabilidad genómica y la letalidad celular en ausencia de XRCC1. 4.1.3. XRCC1 mantiene la estabilidad de la horquilla de replicación durante la eliminación de la 5hmdC Además de su papel durante la ruta BER, se ha descrito que XRCC1 actúa junto con DNAPKcs en la estabilización de las horquillas de replicación pausadas o bloqueadas por el tratamiento con HU 70. Además, en ausencia de BRCA2, XRCC1 promueve la degradación del ADN naciente por la nucleasa MRE11 durante el reinicio de la horquilla de replicación68. Por tanto, quisimos examinar si XRCC1 presentaba un papel en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación tras la incorporación de la 5hmdC durante la síntesis de ADN. Para ello, llevamos a cabo la técnica de las fibras de ADN, la cual permite monitorizar la incorporación de los análogos de la timidina 5-cloro2’-desoxiuridina (CldU) y 5-iodo-2’-desoxiuridina (IdU) durante la síntesis de ADN y permite el cálculo de la proporción IdU/CldU. Para estudiar el arresto o bloqueo de la horquilla de replicación, la 5hmdC se añadió junto con la IdU durante 30 min. En células silvestres, la adición de 5hmdC no modificó la proporción IdU/CldU (Figura C1.9 A). Sin embargo, la exposición a 5hmdC en las células deficientes en XRCC1 disminuyó de forma significativa y dosis-dependiente la proporción IdU/CldU (Figura C1.9 A), sugiriendo que XRCC1 es necesaria para el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación tras la incorporación de la 5hmdC durante la síntesis de ADN. Ante la presencia de lesiones en la cadena de ADN molde, la horquilla de replicación puede enlentecer su velocidad o incluso detenerse para permitir que la lesión que ha obstaculizado su progresión se resuelva. Como consecuencia, en algunos casos se produce la formación de la estructura de reversión y nucleasas tales como MRE11 o DNA2, degradan el ADN RESULTADOS 97 naciente de una forma controlada, para promover el reinicio de la replicación. Sin embargo, si no hay un proceso de reparación adecuado, las nucleasas pueden degradar de forma descontrolada el ADN naciente, dando lugar a inestabilidad genómica 18. Por ello evaluamos si XRCC1 protege al ADN naciente de la degradación por las nucleasas tras el arresto o bloqueo de la horquilla de replicación provocado por la incorporación errónea de la 5hmdC. Para el estudio de la degradación del ADN naciente, la 5hmdC se añade durante 3h tras la adición secuencial de CldU e IdU y se determina la proporción IdU/CldU. Como se observa en la Figura C1.9 B, las células deficientes en XRCC1 mostraron una disminución significativa de la proporción IdU/CldU en comparación con las células silvestres, sugiriendo que XRCC1 se requiere para evitar la degradación del ADN naciente tras la incorporación errónea de la 5hmdC. Figura C1.9. La incorporación de la 5hmdC altera la estabilidad de la horquilla de replicación en las células deficientes en XRCC1. A) Panel izquierdo, esquema de la técnica de las fibras de ADN para el estudio del arresto/bloqueo de la horquilla de replicación, e imágenes representativas de las fibras de ADN de células silvestres y deficientes en XRCC1 tras el tratamiento con 5hmdC a las dosis indicadas durante 30min. Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). B) Panel izquierdo, esquema representativo de la técnica de las fibras de ADN para el estudio de la degradación del ADN naciente e imágenes representativas de las fibras de ADN de células silvestres y deficientes en XRCC1 tras el tratamiento con 5hmdC a las dosis indicadas durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). 4.1.4. El reclutamiento de PARP1 a la cromatina exacerba el daño en el ADN mediado por la 5hmdC en ausencia de XRCC1 Tras el procesamiento de la 5hmdC por las glicosilasas de ADN, el sitio AP se procesa por la actividad de las endonucleasas APEX1 y APEX2, las cuales generan un SSB que induce la activación de PARP1. PARP1 actúa como sensor del SSB y mediante la adición de los polímeros de PAR a ciertos sustratos, facilita el reclutamiento del complejo de preligación XRCC1/POLβ/LIG3α para reparar el SSB. Se ha descrito que XRCC1 es necesario para la liberación de PARP1 del SSB generado tras el tratamiento con MMS. En ausencia de XRCC1, PARP1 persiste en el SSB, impidiendo el reclutamiento posterior del complejo de preligación XRCC1/POLβ/LIG3α. Sin embargo, la eliminación de PARP1 suprime completamente la letalidad mediada por MMS en las células deficientes en XRCC1 45. Por ello, determinamos si el procesamiento de la 5hmdC por la ruta de reparación BER, inducía el reclutamiento de PARP1 a la cromatina. Realizamos un ensayo de retención en cromatina, en el cual se obtienen tanto la fracción proteica soluble como la cromatínica de las líneas celulares de interés, y posteriormente, los niveles de PARP1 se determinan mediante Western Blot. Como control de la técnica usamos MMS, el cual provocó el RESULTADOS 98 reclutamiento de PARP1 en cromatina en ambas líneas celulares (Figura C1.10 A). Sorprendentemente, la exposición a 5hmdC durante 3h provocó el reclutamiento a la cromatina de PARP1 de manera dosis-dependiente en ambas líneas celulares (Figura C1.10 A). Como el reclutamiento se observó en ambas líneas celulares, decidimos realizar una cinética temporal a dosis constante de 5hmdC (80µM durante 15 min, 30 min y 1h). Observamos que tras 1h de tratamiento con 5hmdC, el reclutamiento en cromatina de PARP1 era mayor en las células Xrcc1-/- que en las células silvestres (Figura C1.10 B), sugiriendo que, en ausencia de XRCC1, PARP1 se acumula en cromatina. Estos resultados sugieren que la eliminación de la 5hmdC por la ruta de reparación BER induce el reclutamiento de PARP1 a la cromatina, el cual necesita de XRCC1 para su liberación posterior. Figura C1.10. La incorporación de la 5hmdC provoca el reclutamiento de PARP1 a la cromatina. A) Western Blot de los niveles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en cromatina y en la fracción soluble tras el tratamiento con 5hmdC (20µM y 40µM) durante 3h en células silvestres y Xrcc1-/-. Como control de la técnica se usó MMS. B) Western Blot de los niveles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en cromatina y en la fracción soluble tras el tratamiento con 5hmdC (80µM) durante 15 min, 30 min y 1h en células silvestres y Xrcc1-/-. Como control de la técnica se usó MMS. Tras la incorporación errónea de la 5hmdC y su eliminación mediante la ruta BER, PARP1 se acumula en la cromatina. Por tanto, decidimos examinar si la persistencia de PARP1 en la cromatina podría ser la causa de la inestabilidad genómica observada en la línea celular deficiente en XRCC1 tras el tratamiento con 5hmdC. Para ello, llevamos a cabo un tratamiento combinado de 5hmdC y olaparib, el cual inhibe la actividad enzimática de PARP1 e induce su atrapamiento en la cromatina 78,111. Los niveles de PARP1 en cromatina mediante Western Blot indicaron que en ausencia de XRCC1, la combinación de 5hmdC y olaparib exacerbó el reclutamiento de PARP1 a la cromatina en comparación con los tratamientos simples de ambos compuestos (Figura C1.11 A). Para examinar si la acumulación de PARP1 en cromatina inducía daño en el ADN, medimos los niveles de γH2AX. Usamos dosis bajas de 5hmdC (1.25µM) y olaparib (7.5nM) para evitar la saturación de la señal. En la línea celular silvestre, el tratamiento combinado no provocó un incremento significativo de los niveles de γH2AX. Sin embargo, la combinación de ambos compuestos mostró un efecto sinérgico en la línea celular Xrcc1-/-, mientras que los tratamientos simples no aumentaron los niveles de γH2AX de forma significativa (Figura C1.11 B). Estos datos sugieren que el incremento de PARP1 atrapado en cromatina por olaparib tras el daño provocado por la 5hmdC, causa inestabilidad genómica en ausencia de XRCC1. RESULTADOS 99 Figura C1.11. El tratamiento combinado de 5hmdC y olaparib exacerba el reclutamiento de PARP1 a la cromatina y los niveles nucleares de γH2AX. A) Western Blot de los niveles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en cromatina y en la fracción soluble, tras el tratamiento con olaparib (0.5µM), 5hmdC (20µM) o 5hmdC combinado con olaparib durante 3h. B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de γH2AX tras el tratamiento con olaparib (7.5nM), 5hmdC (1.25µM) o 5hmdC combinado con olaparib durante 3h, en células silvestres y Xrcc1-/-. Panel derecho, cuantificación de la intensidad nuclear media de γH2AX por célula (n=150) tras el tratamiento con olaparib, 5hmdC o 5hmdC combinado con olaparib (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). Para investigar si el incremento de PARP1 atrapado en cromatina inducía inestabilidad de la horquilla de replicación en ausencia de XRCC1, llevamos a cabo un ensayo de fibras de ADN en presencia de olaparib (0.5µM) añadido 1h antes de la adición de los nucleótidos CldU e IdU y del tratamiento con 5hmdC. Para este ensayo, usamos una dosis de 5hmdC (10µM) que no provoca un arresto significativo de la replicación por sí sola (Figura C1.9 A). Observamos que los tratamientos simples de 5hmdC y de olaparib no provocaron un bloqueo de la progresión de la horquilla de replicación, ya que la proporción IdU/CldU no se alteró de forma significativa con respecto a la condición sin tratamiento (Figura C1.12 A). Sin embargo, la combinación de 5hmdC y olaparib provocó una marcada reducción de la progresión de la horquilla de replicación en ausencia de XRCC1, y en menor medida, en la línea celular silvestre (Figura C1.12 A). Además, las células deficientes en XRCC1 mostraron un descenso de la viabilidad celular en presencia del tratamiento combinado de 5hmdC con olaparib (Figura C1.12 B). Estos resultados sugieren que la incorporación errónea de la 5hmdC durante la síntesis de ADN produce la retención excesiva de PARP1 en la cromatina, la cual requiere de XRCC1 para su liberación y prevenir el incremento de la inestabilidad de la horquilla de replicación y la consecuente muerte celular. RESULTADOS 100 Figura C1.12. La combinación de olaparib y 5hmdC incrementa la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad celular de las células Xrcc1-/-. A) Panel izquierdo, esquema representativo del ensayo de fibras de ADN para el estudio del arresto/bloqueo de la horquilla de replicación, e imágenes representativas de las fibras de ADN de las células silvestres y deficientes en XRCC1 tras el tratamiento con olaparib (0.5µM), 5hmdC (10µM) o 5hmdC y olaparib. Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 3 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). B) Ensayo de viabilidad celular MTT de las líneas silvestre y Xrcc1-/- tras el tratamiento con olaparib a las dosis indicadas o combinado con una dosis fija de 5hmdC (0.3µM) durante 72h (R=3, media ± s.d.). 4.1.5. El tratamiento con 5hmdU recapitula los fenotipos de inestabilidad genómica y de arresto/bloqueo de la horquilla de replicación mediados por 5hmdC en ausencia de XRCC1 Se ha descrito recientemente que la 5hmdC suplementada en el medio de cultivo, se transporta activamente al citoplasma celular, en el cual se desamina a 5hmdU por la acción de la enzima desaminasa de citosina DCTD, y se incorpora posteriormente por las polimerasas replicativas de ADN durante la replicación. Tras su incorporación, la 5hmdU se reconoce y escinde por la glicosilasa de ADN de la ruta BER SMUG1. SMUG1 genera un sitio AP, el cual puede ser escindido posteriormente por las endonucleasas APEX1/2, la cuales generan un SSB reconocido por PARP1. Por tanto, es probable que la 5hmdU derivada de la desaminación de la 5hmdC, y no la 5hmdC propiamente dicha, pueda ser la fuente de inestabilidad genómica en ausencia de XRCC1, como se ha demostrado recientemente 77. Para estudiar si la incorporación de la 5hmdU puede ser responsable de los fenotipos observados en las células Xrcc1-/- por la exposición a 5hmdC, llevamos a cabo experimentos de inestabilidad genética y supervivencia como los descritos en los apartados 4.1.2, 4.1.3 y 4.1.4 tras el tratamiento con 5hmdU. Como se observa en la Figura C1.13 A, los experimentos de supervivencia MTT mostraron una mayor letalidad de las células deficientes en XRCC1 tras la exposición a 5hmdU en comparación con la línea celular silvestre. Además, el tratamiento con 5hmdU incrementó de forma significativa los niveles nucleares tanto de PAR como de γH2AX en las células Xrcc1-/- (Figura C1.13 B). A la misma dosis (5µM durante 3h), tanto los niveles nucleares de PAR como los de γH2AX fueron estadísticamente más elevados tras el tratamiento con 5hmdU que con 5hmdC (Figura C1.13 B), sugiriendo que la 5hmdU es más citotóxica que la 5hmdC. Este incremento en el daño en el ADN tras la exposición a 5hmdU, medido como los niveles nucleares de PAR y γH2AX, provocó un aumento significativo en la frecuencia de aberraciones cromosómicas en ausencia de XRCC1 (Figura C1.13 C). RESULTADOS 101 Figura C1.13. El tratamiento con 5hmdU disminuye la viabilidad celular, incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX y la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en XRCC1. A) Ensayo de viabilidad MTT de las células silvestres y Xrcc1-/- tras el tratamiento con 5hmdU a las dosis indicadas durante 72h (R=3, media ± s.d.). B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y γH2AX (verde) de las células silvestres y Xrcc1-/- tras el tratamiento con 5hmdC o 5hmdU (5µM) durante 3h. Panel derecho superior, cuantificación de la intensidad nuclear media de PAR por célula (n=150) tras el tratamiento con 5hmdC o 5hmdU (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). Panel derecho inferior, cuantificación de la intensidad nuclear media de γH2AX por célula (n=150) tras el tratamiento con 5hmdC o 5hmdU (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). C) Panel superior, imágenes representativas de metafases de células silvestres y Xrcc1-/- para la cuantificación de aberraciones cromosómicas tras el tratamiento con 5hmdU (0.3µM durante 2 ciclos celulares). Panel inferior, cuantificación del número de los diferentes tipos de aberraciones cromosómicas por metafase (n=50 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). Para examinar si la incorporación errónea de la 5hmdU provocaba un arresto o bloqueo de la progresión de la horquilla de replicación, similar al observado con el tratamiento con 5hmdC, llevamos a cabo el ensayo de fibras de ADN. Este ensayo mostró que la exposición a 5hmdU disminuyó significativamente y de manera dosis-dependiente la proporción IdU/CldU en las células Xrcc1-/-, no llegando a ser estadísticamente significativo en las células silvestres (Figura C1.14 A). Además, el ensayo de fibras de ADN determinó que el tratamiento con 5hmdU provocaba la resección excesiva del ADN naciente en ausencia de XRCC1 (Figura C1.14 B). Estos resultados sugieren que XRCC1 mantiene la estabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN, y previene su degradación extensiva tras el arresto de la horquilla de replicación. Además, apuntan a que la incorporación de la 5hmdU y no de la 5hmdC es la causante de los fenotipos descritos hasta este momento en esta tesis doctoral. RESULTADOS 102 Figura C1.14. La incorporación de la 5hmdU impacta en la progresión de la horquilla de replicación e induce la degradación nucleolítica del ADN en las células Xrcc1-/-. A) Panel izquierdo, esquema representativo del ensayo de fibras de ADN para el estudio del arresto de la horquilla de replicación, e imágenes representativas de las fibras de ADN de las células silvestres y Xrcc1-/- expuestas a 5hmdU (10µM y 20µM) durante 30 min. Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 3 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). B) Panel izquierdo, esquema representativo del ensayo de fibras de ADN para el estudio de la resección extensiva del ADN naciente, e imágenes representativas de las fibras de ADN de las células silvestres y Xrcc1-/- tras la exposición a 5hmdU (10µM y 20µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). Similar a lo observado tras el tratamiento con 5hmdC, la exposición a 5hmdU también provocó el reclutamiento de PARP1 a la cromatina en ambas líneas celulares, tanto de forma dosis-dependiente (Figura C1.15 A) como en cinética temporal a dosis constante (Figura C1.15 B), observándose un mayor reclutamiento de PARP1 a la cromatina en las células Xrcc1-/- a los 15 min de tratamiento. Figura C1.15. El tratamiento con 5hmdU promueve el reclutamiento de PARP1 a la cromatina. A) Western Blot de los niveles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en cromatina y en la fracción soluble tras el tratamiento con 5hmdU (20µM y 40µM) durante 3h de las líneas celulares silvestre y Xrcc1-/-. Como control de la técnica se usó MMS. B) Western Blot de los niveles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en cromatina y en la fracción soluble tras el tratamiento con 5hmdU (40µM) durante 15 min, 30 min y 1h de las líneas celulares silvestre y Xrcc1-/-. Como control de la técnica se usó MMS. En ausencia de XRCC1, la combinación de 5hmdU y olaparib (1.25µM y 7.5nM respectivamente) incrementó de forma significativa los niveles nucleares de γH2AX en comparación con los tratamientos simples (Figura C1.16 A). Además, el ensayo de fibras de ADN para estudiar el arresto o bloqueo de la horquilla de replicación mostró que el tratamiento combinado de olaparib y 5hmdU provocó una disminución significativa de la proporción IdU/CldU en comparación con los tratamientos simples (Figura C1.16 B), y significativamente mayor a la causada por la combinación de 5hmdC y olaparib (IdU/CldU 5hmdC+olaparib 0.8795, IdU/CldU 5hmdU+olaparib 0.7838). Finalmente, la adición RESULTADOS 103 conjunta de olaparib y 5hmdU provocó una mayor mortalidad de las células deficientes en XRCC1 (Figura C1.16 C). Figura C1.16. El tratamiento combinado de olaparib y 5hmdU exacerba los niveles nucleares de γH2AX, la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad celular de las células Xrcc1-/-. A) Panel superior, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de γH2AX de las líneas celulares silvestre y deficiente en XRCC1 tras el tratamiento con 5hmdC (1.25µM), 5hmdU (1.25µM) o 5hmdC/5hmdU combinado con olaparib (7.5nM) durante 3h. Panel inferior, cuantificación de la intensidad media nuclear de γH2AX por célula (n=150) tras el tratamiento con olaparib, 5hmdC, 5hmdU o sus combinaciones (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). B) Panel izquierdo, esquema representativo del ensayo de fibras de ADN para el estudio del arresto/bloqueo de la horquilla de replicación e imágenes representativas de las fibras de las líneas celulares silvestre y deficiente en XRCC1 tras el tratamiento con 5hmdC (10µM), 5hmdU (10µM) o 5hmdC/5hmdU combinado con olaparib (0.5µM). Panel derecho, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=150 de 3 réplicas biológicas independientes; test estadístico Mann-Whitney). C) Ensayo de viabilidad celular por MTT de las células silvestres y Xrcc1-/- tras el tratamiento con olaparib a las dosis indicadas, o combinado con 5hmdU a una dosis fija (0.3µM) durante 72h (R=3, media ± s.d.). Estos resultados nos permiten proponer un modelo de trabajo que sugiere que la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN activa a la ruta BER, cuya actividad provoca un aumento de los niveles de PARP1 en cromatina, los cuales en ausencia de XRCC1, inducen inestabilidad de la horquilla de replicación y letalidad celular (Figura C1.17). RESULTADOS 104 Figura C1.17. Modelo propuesto para la función de XRCC1 durante la eliminación de la base de ADN hidroximetilada 5hmdU. Tras la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN, se produce la activación de la ruta de reparación BER para su eliminación. Tras la acción de la glicosilasa de ADN y la posterior incisión de las endonucleasas en el esqueleto ribosa-fosfato, se produce un SSB que puede ser potencialmente tóxico para la progresión de la horquilla de replicación. PARP1 se une al SSB y promueve el reclutamiento de XRCC1 junto con POLβ y LIG3α para finalizar el proceso de reparación. En ausencia de XRCC1, la persistencia de PARP1 en los SSBs generados durante la eliminación de la 5hmdU dificulta la progresión de la horquilla de replicación, lo que conlleva a inestabilidad genómica. RESULTADOS 111 Para analizar si la exposición a 5hmdC causaba la activación de la DDR en las células deficientes en FANCD2, determinamos los niveles nucleares de PAR y γH2AX como marcadores subrogados de la presencia de SSBs y DSBs respectivamente. A diferencia del resto de derivados de la citosina, el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 16h) produjo un incremento significativo de los niveles nucleares de PAR en las células deficientes en FANCD2 (Figura C2.5 A), probablemente debido a la actividad de PARP1 durante la reparación de los SSBs generados por la ruta BER. Además, la exposición a 5hmdC incrementó de manera concomitante la formación de focos de γH2AX en las células Fancd2-/- (Figura C2.5 B), sugiriendo que la exposición prolongada a 5hmdC puede generar SSBs que, en caso de no ser reparados eficientemente, desencadenan DSBs. Notablemente, la exposición a 5fdC incrementó de forma significativa los niveles de PAR y la formación de focos de γH2AX en la línea celular silvestre, pero no en la línea celular deficiente en FANCD2 (Figura C2.5 A y B), aunque el mecanismo molecular por el cual la deficiencia en la ruta AF suprime estos marcadores de daño tras la exposición a 5fdC se desconoce hasta la fecha. Figura C2.5. El tratamiento con 5hmdC incrementa los niveles nucleares de PAR y γH2AX en las células Fancd2-/-. A) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR en las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 16h). Panel derecho, cuantificación de la intensidad media por célula (n=200) de PAR tras el tratamiento con 5dC, 5mdC, 5hmdC, 5fdC o 5cadC (10µM) durante 16h (R=3; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la mediana). B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de γH2AX en las líneas celulares silvestre y deficiente en FANCD2 tras el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 16h). Panel derecho, cuantificación del número de focos de γH2AX por célula (n=200) tras el tratamiento con 5dC, 5mdC, 5hmdC, 5fdC o 5cadC (10µM) durante 16h (R=3; test estadístico t de Student; la línea central representa el valor de la media ± s.d.). Para determinar de manera directa si el tratamiento con 5hmdC provoca la formación de DSBs, llevamos a cabo un ensayo de aberraciones cromosómicas. En la Figura C2.6 se puede observar que la exposición a 5hmdC produce un incremento significativo de la frecuencia de aberraciones cromosómicas en la línea celular Fancd2-/-, principalmente cromosomas radiales, sugiriendo que la exposición a 5hmdC genera inestabilidad cromosómica en ausencia de la ruta de mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación FA/BRCA. RESULTADOS 112 Figura C2.6. Incremento de la frecuencia de aberraciones cromosómicas en las células deficientes en FANCD2 tras la exposición a 5hmdC. Panel izquierdo, imágenes representativas de metafases de células silvestres y Fancd2-/- para la cuantificación de aberraciones cromosómicas tras el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 2 ciclos celulares). Panel derecho, cuantificación del número de los diferentes tipos de aberraciones cromosómicas por metafase (n=50 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). La presencia de daño en el ADN activa el punto de control del ciclo celular, caracterizado por la activación de la quinasa ATR, la cual fosforila distintos sustratos para bloquear la progesión del ciclo celular. Ante la presencia de un impedimento que altere la progresión de la horquilla de replicación, la quinasa ATR fosforila a CHK1 en la serina 345, la cual se activa y promueve la fosforilación de otros factores, conduciendo a un enlentecimiento del ciclo celular para permitir la reparación del daño presente en el ADN 16. Para dilucidar si la exposición a 5hmdC provocaba la activación del punto de control de fase S, llevamos a cabo un ensayo de ciclo celular. El tratamiento con 5dC, 5mdC o 5hmdC a la dosis de 10µM durante 16h, no provocó ningún cambio significativo en el perfil de ciclo celular ni en las células silvestres ni Fancd2-/- (Figura C2.7 A). Sin embargo, cuando modificamos el tiempo de los tratamientos a 1h, 4h, 8h y 12h, observamos un incremento del porcentaje de células en fase S a las 4h, que se suprime en los siguientes tiempos de medición (8h y 12h) (Figura C2.7 B). Esto sugiere que una exposición corta a nucleósidos derivados de la citidina altera momentáneamente la progresión del ciclo celular, que se rescata a lo largo del tiempo de exposición a los mismos. Para determinar si la incorporación de 5hmdC provocaba daño en el ADN suficiente como para activar el punto de control de fase S, realizamos un tratamiento agudo de 30 min con una dosis más elevada (100µM) y analizamos el perfil de ciclo celular 48h después del tratamiento. Sorprendentemente y a diferencia de lo que ocurre con 5dC y 5mdC, la exposición a 5hmdC produjo un arresto del ciclo celular en la fase G2/M en las células Fancd2-/-, el cual no se observa en células silvestres (Figura C2.7 C), sugiriendo que la exposición a 5hmdC provoca daño en el ADN y activación del punto de control de fase S, el cual detiene el ciclo en fase G2 e impide la entrada en mitosis. Ya que la activación del punto de control de fase S activa a ATR, la cual fosforila a CHK1, decidimos determinar los niveles de fosforilación en la serina 345 de CHK1 (ser345-CHK1) como marcador subrogado de la activación del punto de control de fase S. Observamos que el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 16h incrementó la señal ser345-CHK1 (Figura C2.7 D). A diferencia de lo que observamos mediante el análisis del perfil de ciclo celular, una exposición prolongada a 5hmdC induce la fosforilación de CHK1, indicando una activación del punto de control de fase S. Sin embargo, no se observan cambios en el perfil del ciclo celular. Este incremento en la fosforilación de ser345-CHK1 fue concomitante con un incremento en los niveles de RESULTADOS 113 γH2AX (Figura C2.7 D), lo que sugiere la formación de DSBs durante la fase S en condiciones de estrés replicativo. Para examinar si el arresto en fase G2/M por el tratamiento agudo con 5hmdC en las células Fancd2-/- depende de CHK1, utilizamos los inhibidores de CHK1 AZD-7762 o UCN-01 combinados con 5hmdC. Observamos un rescate del arresto en fase G2/M en las células deficientes en FANCD2 (Figura C2.7 E), indicando que el arresto del ciclo celular en fase G2/M es dependiente de la activación de CHK1. La exposición a 5hmdC también provocó la ubiquitinación de FANCD2 en la línea celular silvestre eHAP de una forma dosis dependiente (Figura C2.7 F), indicando la activación de la ruta AF tras el tratamiento con 5hmdC. Figura C2.7. Arresto del ciclo celular en la fase G2/M y activación del punto de control de fase S tras la exposición a 5hmdC. A) Porcentaje de células silvestres y Fancd2-/- en fase G1, S y G2 tras la exposición a 5dC, 5mdC o 5hmdC (10µM) durante 16h (R=3; test estadístico t de Student; las barras representan la media RESULTADOS 114 ± s.d.). B) Porcentaje de células silvestres y Fancd2-/- en fase G1, S y G2 tras la exposición a 5dC, 5mdC o 5hmdC (10µM) durante 1h, 4h, 8h o 12h (R=4; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). U1 y U12 indican los puntos de control sin tratamiento tras 1h o 12h. C) Porcentaje de células silvestres y Fancd2-/- en fase G1, S y G2 tras la exposición a 5dC, 5mdC o 5hmdC (100µM) durante 30 min y analizado tras 48h en cultivo (R=3; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). D) Western Blot de extractos obtenidos de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- para detectar γH2AX, ser345CHK1, CHK1 y PCNA tras la exposición a 5dC, 5mdC, 5hmdC, 5fdC y 5cadC (10µM) durante 16h. E) Porcentaje de células silvestres y Fancd2-/- en fase G1, S y G2 tras la exposición a 5hmdC (100µM) durante 30 min, en combinación con AZD-7762 (10nM) o UCN-01 (10nM), y analizado tras 48h en cultivo. AZD7762 o UCN-01 se añadieron durante las últimas 24h (R=3; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). F) Western Blot de extractos proteicos de la línea celular eHAP silvestre para detectar los niveles de FANCD2 monoubiquitinado (FANCD2-Ub) tras la exposición a 5hmdC (20µM y 40µM durante 16h). PCNA se usó como control de carga y el tratamiento con cisplatino se usó como control de la técnica. Tras la obtención de estos resultados, podemos proponer que la 5hmdC se incorpora por las células y activa las rutas BER y AF. En ausencia de la ruta AF, se desencadena la respuesta clásica al daño en el ADN que provoca un incremento de SSBs y DSBs, dando lugar a la inestabilidad cromosómica y a la letalidad celular. Todos estos resultados indican que la ruta AF presenta un papel en el mantenimiento de la integridad del genoma y en la supervivencia durante la reparación del daño provocado por la exposición a 5hmdC. 4.2.2. La 5hmdC se desamina a 5hmdU in vivo y se incorpora durante la replicación del ADN La 5hmdC es un nucleósido derivado de la citidina que presenta un grupo hidroximetilo en el carbono 5 de la base pirimidínica. Se ha descrito que las bases que presentan pequeñas modificaciones no distorsionantes de la doble hélice son capaces de incorporarse al ADN naciente por las polimerasas replicativas. Por tanto, quisimos estudiar si tras la suplementación de la 5hmdC al medio de cultivo, esta se incorporaba durante la síntesis de ADN. Para ello, en colaboración con el Dr. Saulius Klimašauskas (Universidad de Vilnius, Lituania), se llevó una determinación cuantitativa de las diferentes bases modificadas presentes en el ADN genómico mediante HPLC. Los resultados descritos en Peña-Gómez MJ et al, 2022 116 y en la tesis de la Dr. Paula Moreno Gordillo, muestran que la 5hmdC suplementada al medio de cultivo se incorpora al ADN genómico durante la replicación celular. Estos estudios también mostraron una acumulación de 5hmdU-D3 en el ADN genómico de las células silvestres y Fancd2-/-, superior a la acumulación de la 5hmdC, sugiriendo que la 5hmdC es desaminada in vivo a 5hmdU 116. Para determinar si los fenotipos observados en la línea celular Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC se deben a la incorporación errónea de la 5hmdU durante la replicación, llevamos a cabo la depleción de algunos de los genes responsables de la ruta citoplásmica de desaminación de la 5hmdC (Figura C2.8 A). Mediante la técnica de siRNA, deplecionamos el producto del gen Dctd, que codifica la desaminasa de citosina que lleva a cabo la desaminación de la 5hmdC monofosfato a la 5hmdU monofosfato en el pool de nucleótidos 77. En primer lugar, validamos la falta de expresión proteica mediante Western Blot (Figura C2.8 B). A continuación, examinamos la sensibilidad a 5hmdC tras la pérdida de DCTD en ambas líneas celulares y observamos que la depleción de DCTD suprimió significativamente la letalidad provocada por la 5hmdC en las células Fancd2-/- (Figura C2.8 C), sugiriendo que la letalidad celular observada tras la exposición a 5hmdC es mediada por la incorporación de la 5hmdU. RESULTADOS 115 Figura C2.8. La depleción de DCTD rescata la viabilidad celular tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-. A) Esquema representativo de la ruta de desaminación de la 5hmdC a 5hmdU en el citoplasma. B) Western Blot de extractos proteicos de células silvestres y deficientes en FANCD2 para la detección de los niveles de DCTD tras su depleción mediante siRNA. C) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de DCTD, tratadas con 5hmdC a las dosis indicadas durante 72h (R=3, media ± s.d.). Adicionalmente, llevamos a cabo la depleción del producto génico Dck, enzima quinasa responsable de la conversión de 5hmdC a 5hmdC monofosfato 77. Como se observa en la Figura C2.9 C, la pérdida de DCK (Figura C2.9 B) también suprimió completamente la letalidad provocada por la exposición a 5hmdC en la línea celular Fancd2-/-. Figura C2.9. La depleción de DCK rescata la viabilidad celular tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-. A) Esquema representativo de la ruta de desaminación de la 5hmdC a 5hmdU en el citoplasma. B) Western Blot de extractos proteicos de células silvestres y deficientes en FANCD2 para la detección de los niveles de DCK tras su depleción mediante siRNA. C) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de DCK, tratadas con 5hmdC a las dosis indicadas durante 72h (R=3, media ± s.d.). Estos resultados demuestran que la letalidad observada en las células Fancd2-/- por el tratamiento con 5hmdC, y probablemente los fenotipos de inestabilidad genómica, se deben a la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN. La 5hmdC es una RESULTADOS 116 molécula más estable que la 5hmdU, y se han obtenido resultados más reproducibles tras la exposición a 5hmdC que tras la exposición a 5hmdU. Por ello, todos los resultados que se muestran a continuación en esta tesis doctoral, se han llevado a cabo tras la exposición a 5hmdC, teniendo en cuenta que los fenotipos que se observan son debidos a la incorporación errónea de la 5hmdU durante la replicación. 4.2.3. La incorporación de la 5hmdU provoca daño en el ADN asociado a la fase S del ciclo celular y bloquea la progresión de la horquilla de replicación La 5hmdU derivada de la desaminación de la 5hmdC se incorpora en el ADN genómico durante la replicación 77,116. Para examinar si el daño en el ADN causado por el tratamiento con 5hmdC en las células deficientes en FANCD2 se asocia a la fase S del ciclo celular, determinamos el daño en el ADN específicamente en las células en fase S. Para ello, las células en fase S se marcaron mediante la adición del análogo de la timidina EdU, el cual no es genotóxico, y determinamos los niveles nucleares de PAR. En la Figura C2.10 A se observa que el tratamiento de las células deficientes en FANCD2 con 5hmdC (10µM durante 16h) incrementó los niveles nucleares de PAR de forma significativa principalmente en las células en fase S (72% de células PAR+ con respecto al total de células EdU+), y en un 27% de células silvestres PAR+ con respecto al total de células EdU+, sugiriendo que el daño mediado por la 5hmdU se asocia a la fase S del ciclo celular, durante su incorporación. Para cerciorarnos que el daño inducido por la incorporación errónea de la 5hmdU ocurre en el ADN naciente del ciclo celular en curso, y no en ciclos posteriores, decidimos acortar los tiempos de tratamiento. Por ello, realizamos el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 3h y determinamos los niveles nucleares de PAR mediante inmunofluorescencia. El tratamiento con 5hmdC durante 3h también incrementó los niveles nucleares de PAR de forma significativa en las células Fancd2-/- en fase S (62% de células PAR+ con respecto al total de células EdU+) (Figura C2.10 B), lo que sugiere que el daño mediado por la 5hmdU se asocia a su incorporación errónea en la hebra de ADN naciente en el ciclo celular actual. Figura C2.10. La incorporación de la 5hmdU incrementa los niveles nucleares de PAR principalmente en las células en fase S. A) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 16h. Panel derecho, porcentaje de células PAR+ con respecto al total de células EdU+ (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC durante 16h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; las barras representan la media ± s.d.). B) Porcentaje de células PAR+ con respecto al total de RESULTADOS 117 células EdU+ (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 3h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; las barras representan la media ± s.d.). Para determinar si la incorporación errónea de la 5hmdU durante la replicación provoca daño en las horquillas de replicación, llevamos a cabo la técnica iPOND (del inglés isolation of Proteins On Nascent DNA), la cual permite examinar el reclutamiento de proteínas, como γH2AX, o modificaciones post-traduccionales de proteínas asociadas al ADN recién sintetizado 108,117. El ADN recién sintetizado se marca con EdU y posteriormente, se realiza el tratamiento con el agente que induce estrés replicativo. A continuación, se precipita el ADN naciente y se analizan aquellas proteínas que interaccionan con él tras el daño. Como control de la técnica se usó HU, un agente que inhibe la enzima ribonucleótido reductasa, causando la depleción del pool de dNTPs y por tanto el bloqueo de la horquilla de replicación. Tras el tratamiento con HU se puede observar que la precipitación del ADN naciente conteniendo EdU co-precipitaba γH2AX en ambas líneas celulares, indicando que γH2AX se asocia a la horquilla de replicación (Figura C2.11). Sorprendentemente, tras el tratamiento con 5hmdC (160µM durante 3h), la co-precipitación de EdU junto con γH2AX se enriqueció principalmente en la línea celular Fancd2-/- en comparación con la línea celular silvestre (Figura C2.11). Este resultado sugiere que los DSBs inducidos por el tratamiento con 5hmdC en las células deficientes en FANCD2 se asociarían a las horquillas de replicación que se encuentran bloqueadas. Figura C2.11. El tratamiento con 5hmdC induce la co-precipitación de EdU (ADN naciente) junto con γH2AX en las células deficientes en FANCD2. Western Blot de los extractos proteicos de la muestra total (2.25%) y de la co-precipitación de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (160µM) o HU (1mM) durante 3h, para detectar los niveles de γH2AX, PCNA y RAD51. La técnica iPOND permite detectar la interacción de proteínas con el ADN recién sintetizado, pero el resultado obtenido es el promedio de miles de horquillas de replicación y de células. Para poder realizar un análisis más exhaustivo a nivel de una única célula y obtener más información, como el estado del ciclo celular (detectar las células en fase S), realizamos el ensayo de detección de la interacción de proteínas in situ con el ADN naciente en las horquillas de replicación (SIRF; del inglés in situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks) 107. Este ensayo identifica factores que se localizan próximos a la horquilla de replicación, específicamente a una distancia de < 40nm del ADN recién sintetizado, que es etiquetado mediante la adición del análogo de la timidina EdU. En nuestro caso, detectamos los niveles de PAR asociados a la horquilla de replicación mediante la cuantificación de focos EdU-PAR. En la Figura C2.12 se observa que el tratamiento con 5hmdC (10µM o 40µM) durante 3h provocó un aumento significativo dosis-dependiente del número de focos EdU-PAR en la línea celular Fancd2-/-, mientras que en la línea celular silvestre solo la dosis de 40µM indujo un incremento RESULTADOS 118 estadísticamente significativo. Ya que los niveles nucleares de PAR son un marcador subrogado de la presencia de SSBs, estos resultados sugieren que la 5hmdU genera SSBs inmediatamente tras ser incorporada durante la replicación, afectando a la progresión de la horquilla de replicación. Figura C2.12. La exposición a 5hmdC incrementa el número de focos EdU-PAR en las células Fancd2-/-. A) Imágenes representativas de los focos EdU-PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las células silvestres y Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (10µM o 40µM) durante 3h. B) Cuantificación del número de focos EdU-PAR por célula EdU+ (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=3, test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). Para determinar de forma directa si la exposición a 5hmdC induce la formación de SSBs, llevamos a cabo un ensayo de cometas en condiciones alcalinas. La unidad de medida que usamos es el momento de la cola del cometa, que es el producto del tamaño de la cola del cometa y la fracción del total de ADN en la cola del cometa (momento de la cola = longitud de la cola del cometa x porcentaje de ADN presente en la cola del cometa). Como control positivo de la técnica se usó MMS (0.5mM durante 30 min), el cual indujo una acumulación significativa de SSBs tanto en las células silvestres como deficientes en FANCD2 (Figura C2.13 B). Tras la exposición a 5hmdC (10µM durante 3h), se observó un incremento de SSBs estadísticamente significativo en la línea celular Fancd2-/-, mientras que la línea celular silvestre no se vio alterada (Figura C2.13), sugiriendo que la incorporación errónea de la 5hmdU en las cadenas de ADN naciente durante la replicación produce SSBs, posiblemente debido a su procesamiento por la ruta BER. RESULTADOS 119 Figura C2.13. El tratamiento con 5hmdC incrementa la frecuencia de SSBs en las células Fancd2-/-. A) Imágenes representativas del ensayo de cometas en condiciones alcalinas de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 3h. B) Cuantificación del momento de la cola por célula (n=300) tras el tratamiento con MMS (0.5mM durante 30min) o 5hmdC (10µM durante 3h) (R=4; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). Ya que la incorporación errónea de la 5hmdU durante la replicación induce un incremento de los niveles nucleares de PAR asociados a la horquilla de replicación, principalmente en las células que están en fase S, llevamos a cabo la técnica de las fibras de ADN, que permite medir la progresión de las horquillas de replicación. Mediante la suplementación secuencial de los análogos de la timidina CldU e IdU, podemos monitorizar la progresión de la horquilla de replicación mediante marcaje inmunofluorescente diferencial. Como control de la técnica, utilizamos HU, la cual provoca un bloqueo de la progresión de la horquilla de replicación por la depleción del pool de dNTPs 56. Como se observa en la Figura C2.14 A, el tratamiento con HU provocó un acortamiento del tramo marcado con IdU y, por tanto, disminuyó la proporción IdU/CldU, indicando un bloqueo de la progresión de la horquilla de replicación y valida la optimización de la técnica. A continuación, medimos la dinámica de las horquillas de replicación tras el tratamiento con 5hmdC (40µM durante 30 min). Como se observa en la Figura C2.14 A, el tratamiento con 5hmdC provocó una disminución estadísticamente significativa de la proporción IdU/CldU en las células deficientes en FANCD2, mientras que la adición de 5hmdC en las células silvestres no afectó a la proporción IdU/CldU. Este resultado sugiere que la incorporación errónea de la 5hmdU en las cadenas de ADN naciente altera la progresión de la horquilla de replicación en ausencia del factor de la ruta AF FANCD2. Además, determinamos el índice de asimetría mediante la medición de la proporción de los dos tramos marcados con el análogo IdU en las fibras bidireccionales. La simetría de la horquilla de replicación permite monitorizar la progresión sincronizada de dos horquillas de replicación que inician la síntesis desde un mismo origen de replicación en direcciones opuestas. Esta simetría de las horquillas de replicación se detecta mediante la cuantificación RESULTADOS 120 de los dos tramos marcados con el análogo de tidimina IdU de las fibras bidireccionales. Si una de las horquillas sufre un enlentecimiento de la progresión o un bloqueo, el tramo marcado con el análogo IdU será más corto y la proporción entre ambos será mayor de 1, indicando asimetría. Observamos que la línea celular Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC presentó un índice de asimetría significativamente mayor con respecto a la línea celular silvestre (Figura C2.14 B), indicando que el defecto en la progresión de la horquilla de replicación se debe a la presencia de una lesión física en algunas regiones del ADN y no a un enlentecimiento global de la replicación. Figura C2.14. La incorporación de la 5hmdU altera la progresión de la horquilla de replicación e incremeta el índice de asimetría en las células Fancd2-/-. A) Panel superior, imágenes representativas de las fibras de las células deficientes en FANCD2 tras el tratamiento con HU (0.5mM) o 5hmdC (40µM) durante 30 min. Panel inferior, cuantificación de la proporción IdU/CldU (n=200 de 4 réplicas biológicas independientes; test estadístico One-way ANOVA). B) Panel superior, esquema representativo del origen de asimetría de la horquilla de replicación e imágenes representativas de fibras asimétricas de las células deficientes en FANCD2 tras el tratamiento con 5hmdC (40µM) durante 30 min. Panel inferior, cuantificación del índice de asimetría (test estadístico One-way ANOVA). La exposición a 5hmdC produjo un incremento en el índice de asimetría de las fibras bidireccionales de las células Fancd2-/-, lo que sugiere que la incorporación de la 5hmdU no provoca un enlentecimiento global de la replicación para iniciar la reparación del daño. Para determinar si el tratamiento con 5hmdC a tiempos cortos produce la activación del punto de control de fase S, examinamos la fosforilación en la serina 345 de CHK1 (ser345CHK1) y en la serina 33 de RPA (ser33-RPA32) mediante Western Blot. A diferencia de lo que ocurre con el tratamiento prolongado de 5hmdC durante 16h (Figura C2.7 D), el tratamiento con 5hmdC durante 3h no induce la fosforilación de CHK1 en la serina 345 ni RESULTADOS 127 mediante la ruta de reparación BER, PARP1 se recluta de forma persistente a la cromatina, impidiendo la reparación de los SSBs y como consecuencia, incrementa la formación de DSBs y de aberraciones cromosómicas. Figura C2.20. La combinación de olaparib con la 5hmdC exacerba el incremento del número de focos de γH2AX y la frecuencia de aberraciones cromosómicas observadas en las células Fancd2-/-. A) Cuantificación del número de focos por célula (n=200) de γH2AX tras el tratamiento con 5hmdC (2µM), olaparib (7.5nM) o combinados durante 16h (R=2; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa la media ± s.d.). B) Panel izquierdo, imágenes representativas de metafases de células silvestres y Fancd2-/- para la cuantificación de aberraciones cromosómicas tras el tratamiento con 5hmdC (2µM), olaparib (7.5nM) o combinados durante 2 ciclos celulares. Panel derecho, cuantificación del número de los diferentes tipos de aberraciones cromosómicas por metafase tras el tratamiento con 5hmdC, olaparib o combinados (n=50 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico t de Student; las barras representan la media ± s.d.). La persistencia de PARP1 unido a cromatina por el uso de olaparib exacerbó la letalidad celular observada en las células deficientes en FANCD2 tras la exposición a 5hmdC. Tanto la combinación de una dosis fija de olaparib con dosis crecientes de 5hmdC (Figura C2.21 A), como la combinación de una dosis fija de 5hmdC junto con dosis crecientes de olaparib (Figura C2.21 B), incrementó de forma sinergística la letalidad celular en las células Fancd2-/- sin tener ningún impacto en la viabilidad celular de las células silvestres. Figura C2.21. El tratamiento combinado de olaparib y 5hmdC incrementa de forma sinergística la letalidad celular observada en las células Fancd2-/-. A) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento simple con 5hmdC a las dosis indicadas o combinado con una dosis fija de olaparib (15nM) durante 72h (R=4, media ± s.d.). B) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras el tratamiento simple con olaparib a las dosis indicadas o combinado con una dosis fija de 5hmdC (1.25µM) durante 72h (R=4, media ± s.d.). RESULTADOS 128 Estos resultados sugieren que la incorporación errónea de la 5hmdU durante la fase S produce SSBs, los cuales provocan la retención excesiva de PARP1 en la cromatina, resultando en la acumulación de defectos en la horquilla de replicación y aberraciones cromosómicas que conducen a la muerte celular en ausencia de FANCD2. 4.2.6. La incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN induce la activación de la ruta de reparación HR Durante las lesiones en el ADN que perjudican la integridad de la horquilla de replicación, se ha descrito que la ruta de reparación AF mantiene y restablece la función del replisoma a través de un mecanismo de escisión acoplado a la replicación que desencadena SCEs. Se ha descrito que en ausencia de FANCC, la exposición a 1-óxido de 4-nitroquinolina (4NQO), agente que produce aductos en el ADN, induce la formación de SCEs, mientras que la exposición a agentes que generan ICLs (MMC o cisplatino) no 122,123. Ya que la 5hmdU es una base modificada que se incorpora durante la síntesis de ADN causando el bloqueo de la horquilla de replicación en ausencia de FANCD2, quisimos dilucidar si se producían eventos de recombinación en respuesta a la incorporación de la 5hmdU. Para ello, llevamos a cabo el ensayo de SCEs, en el cual se realiza la tinción diferencial de una de las cromátidas hermanas a través de la adición durante dos ciclos celulares de BrdU, lo que permite contabilizar los eventos de recombinación homóloga que ocurren. Como se observa en la Figura C2.22 A, la exposición a 5hmdC incrementó de forma significativa la frecuencia de SCEs en las células deficientes en FANCD2, mientras que en la línea celular silvestre no se inducen SCEs. Estos datos sugieren que la línea celular Fancd2-/- es capaz de activar la ruta HR asociada a la horquilla de replicación tras la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN. Como se ha observado en las Figuras C2.19 y C2.21, la persistencia de PARP1 en la cromatina exacerbó la inestabilidad de la horquilla de replicación y la muerte celular en ausencia de FANCD2. Por ello quisimos estudiar si la retención excesiva de PARP1 en la cromatina mediante el uso de olaparib, exacerbaba la frecuencia de SCEs mediados por la incorporación errónea de la 5hmdU. Como se observa en la Figura C2.22 B, el tratamiento simple con olaparib no provocó un incremento de SCEs en ninguna de las líneas celulares. Sin embargo, la frecuencia de SCEs incrementó de forma significativa tras la exposición combinada de 5hmdC y olaparib en la línea celular Fancd2-/-, y en menor medida en la línea celular silvestre. RESULTADOS 129 Figura C2.22. La exposición a 5hmdC incrementa la frecuencia de SCEs, la cual se exacerba tras el tratamiento combinado con olaparib. A) Panel izquierdo, imágenes representativas de metafases de células silvestres y Fancd2-/- para la cuantificación de SCEs tras el tratamiento con 5hmdC (2µM durante 2 ciclos celulares). Panel derecho, cuantificación de la frecuencia de SCEs por cromosoma (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC (R=2; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la media ± s.e.m.). B) Panel superior, imágenes representativas de metafases de células silvestres y Fancd2-/- para la cuantificación de SCEs tras el tratamiento con 5hmdC (2µM), olaparib (7.5nM) o 5hmdC+olaparib durante 2 ciclos celulares. Panel inferior, cuantificación de la frecuencia de SCEs por cromosoma (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC, olaparib o 5hmdC+olaparib (R=2; test estadístico Mann-Whitney; la línea central representa el valor de la media ± s.e.m). Estos datos sugieren que FANCD2, la ruta HR y PARP1 funcionan de forma independiente para mantener la estabilidad de la horquilla de replicación tras la incorporación de la 5hmdU durante la replicación, evitando el colapso del replisoma y el incremento de la inestabilidad genómica. 4.3. CAPÍTULO 3: Inestabilidad de la horquilla de replicación inducida por los intermediarios de la ruta de reparación BER en ausencia de FANCD2 RESULTADOS 133 4.3.1. Los huecos de ssDNA que surgen por las actividades coordinadas de SMUG1 y APEX1/2 durante la eliminación de la 5hmdU del ADN naciente son responsables de los fenotipos de inestabilidad de la horquilla de replicación La incorporación errónea de bases modificadas durante la síntesis de ADN, como guaninas oxidadas, análogos de la timina o derivados de la desaminación de la citosina, son las lesiones más comunes que ocurren de forma espontánea en el ADN 124. La principal ruta encargada de eliminar del ADN estas bases modificadas es la ruta BER. Como se ha descrito anteriormente en esta tesis doctoral, la 5hmdU se incorpora de forma errónea durante la síntesis de ADN, incrementando la frecuencia de huecos de ssDNA o SSBs (Figura C2.12 y C2.13), así como la frecuencia de aberraciones cromosómicas (Figura C2.6), que afectan a la progresión de la horquilla de replicación (Figura C2.14) y a la viabilidad celular (Figura C2.1) de las células deficientes en FANCD2. Esta incorporación errónea de la 5hmdU activa la acción coordinada de las rutas BER y AF. Tras la incorporación de la 5hmdU, la glicosilasa de ADN SMUG1 reconoce la base y la escinde generando un sitio AP, el cual es procesado por las endonucleasas APEX1/2 generando un SSB. PARP1 se recluta al SSB, se activa y promueve el reclutamiento del complejo de preligación XRCC1/POLβ/LIG3α para la eficiente adición de la nueva base y la ligación de los extremos del corte en el esqueleto ribosa-fosfato (Figura C3.1). Figura C3.1. Actividad de la ruta de reparación BER asociada a la horquilla de replicación. Esquema simplificado de la ruta de reparación BER durante la eliminación de la 5hmdU en la horquilla de replicación tras su incorporación errónea durante la síntesis de ADN. Durante la eliminación de las bases modificadas incorporadas durante la replicación, los intermediarios de reparación generados por la ruta BER, como los sitios AP o los SSBs, podrían persistir, perturbando la maquinaria de replicación que está en acción, causando estrés replicativo. Recientes publicaciones han descrito que la letalidad observada en las líneas celulares deficientes en la ruta de reparación HR tras el tratamiento con PARPi es debida a la acumulación de huecos de ssDNA detrás de la horquilla de replicación 13. Quisimos dilucidar si la actividad de BER asociada a la horquilla de replicación tras la RESULTADOS 134 incorporación de la 5hmdU durante la síntesis de ADN podría ser la responsable de la formación de huecos de ssDNA en la cadena naciente y consecuentemente, ser la causa de la letalidad de las células deficientes en FANCD2. Para llevar a cabo esta aproximación, decidimos deplecionar genéticamente los diferentes factores de la ruta BER para esclarecer cuál de los intermediarios de BER es el responsable de los fenotipos de inestabilidad genética asociada a la horquilla de replicación en ausencia de la ruta AF. Las glicosilasas de ADN que son capaces de eliminar uracilos presentes en el ADN son UNG1/2, SMUG1, TDG y MBD4 39, pero la que presenta un papel principal en eliminar la 5hmdU del ADN es SMUG1, actuando como ruta alternativa para la eliminación del uracilo presente en el ADN ante la deficiencia de UNG 104,125. Para inhibir el primer paso de la ruta BER aguas arriba a la formación del sitio AP llevamos a cabo la depleción de SMUG1 (Figura C3.2 A). En primer lugar, tras la realización de la técnica de siRNA para deplecionar SMUG1, se comprobó la falta de expresión proteica mediante Western Blot (Figura C3.2 B). Figura C3.2. Depleción de la glicosilasa de ADN SMUG1. A) Esquema representativo de la acción de la glicosilasa de ADN SMUG1 para eliminar la 5hmdU del ADN naciente, generando un sitio AP. B) Western Blot de extractos proteicos de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- para la detección de SMUG1 tras su depleción mediante siRNA. La pérdida de SMUG1 impediría la formación de sitios AP en el ADN, con la consecuente acumulación de la 5hmdU en el ADN genómico. Para estudiar las consecuencias genéticas de la pérdida de SMUG1 en las células Fancd2-/- tras la incorporación de la 5hmdU, determinamos los niveles nucleares de PAR como marcador subrogado de la presencia de SSBs en las células en fase S (EdU+). Como se observa en la Figura C3.3 A, la depleción de SMUG1 en las células Fancd2-/- EdU+ disminuyó los niveles nucleares de PAR de forma significativa tras la exposición a 5hmdC, sin tener un impacto significativo en las células silvestres. Estos datos sugieren que la acumulación de SSBs observada en las células deficientes en FANCD2 tras la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN se debe principalmente a la actividad de SMUG1. A continuación, analizamos los niveles de PAR asociados a la horquilla de replicación en progreso mediante la técnica SIRF. Como se observa en la Figura C3.3 B, la depleción de SMUG1 en la línea celular Fancd2-/- provocó un descenso significativo del número de focos EdU-PAR tras la exposición a 5hmdC, alcanzando el número de focos EdU-PAR que se producen de forma espontánea en la condición sin tratamiento. Estos resultados sugieren que la señalización de PAR asociada a la horquilla de replicación en curso tras el tratamiento con 5hmdC, es dependiente de la actividad de SMUG1. Por tanto, evitar la RESULTADOS 135 formación del sitio AP tras la pérdida de SMUG1 impide la generación del SSB, que es señalizado por PAR. Figura C3.3. La depleción de SMUG1 disminuye los niveles nucleares de PAR asociados a fase S y el número de focos EdU-PAR inducidos por la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-. A) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de SMUG1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la intensidad media por célula EdU+ (n=200) de PAR tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa el valor de la mediana). B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los focos EdU-PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de SMUG1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación del número de focos EdU-PAR por célula EdU+ (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=2; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). El descenso observado en la señalización de PAR asociada a la replicación por la pérdida de SMUG1, podría indicar la ausencia de formación de SSBs observados en las células Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC. Para determinar si la depleción de SMUG1 impacta en la formación de SSBs, determinamos la frecuencia de SSBs de forma directa mediante el ensayo de cometas en condiciones alcalinas. El tratamiento con 5hmdC en la línea celular Fancd2-/- incrementó de forma significativa la frecuencia de SSBs, los cuales fueron completamente suprimidos por la depleción de SMUG1 (Figura C3.4). Estos resultados sugieren que la formación de SSBs o huecos de ssDNA provocados por la incorporación errónea de la 5hmdU durante la síntesis de ADN depende de la actividad de SMUG1 sobre la 5hmdU. RESULTADOS 136 Figura C3.4. La depleción de SMUG1 disminuye la frecuencia de SSBs tras la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-. A) Imágenes representativas del ensayo de cometas en condiciones alcalinas de las células silvestres y deficientes en FANCD2 tras la depleción de SMUG1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. B) Cuantificación del momento de la cola por célula (n=300) tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=2; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). Ya que la pérdida de SMUG1 disminuyó significativamente la formación de SSBs o huecos de ssDNA dependientes de la incorporación de la 5hmdU durante la replicación, examinamos si la pérdida de SMUG1 impacta en la progresión de la horquilla de replicación. Como se observa en la Figura C3.5 A, la depleción de SMUG1 suprimió completamente el arresto de la horquilla de replicación observado en la línea celular Fancd2-/- tras la exposición a 5hmdC. Este resultado sugiere que la generación del sitio AP y posiblemente la consecuente formación del SSB, y no la persistencia de la 5hmdU en el ADN naciente, altera la progresión de la horquilla de replicación. La supresión de la formación de SSBs y del bloqueo de la horquilla de replicación, dependientes del tratamiento con 5hmdC tras la depleción de SMUG1 en la línea celular Fancd2-/-, tuvo un impacto en la viabilidad celular, la cual incrementó hasta alcanzar los niveles observados en la línea celular silvestre (Figura C3.5 B). Todos estos datos sugieren que evitar la formación de los sitios AP a causa de la pérdida de SMUG1, suprime la acumulación de sitios AP y huecos de ssDNA, la inestabilidad de la horquilla de replicación y la letalidad dependientes de la incorporación errónea de la 5hmdU en las células Fancd2-/-. RESULTADOS 143 Figura C3.12. Esquema representativo de la acumulación de SSBs tras la pérdida de PARP1 o XRCC1. La presencia del SSB tras el corte en el esqueleto ribosa-fosfato mediado por las endonucleasas APEX1/2, conduce al reclutamiento de PARP1, la cual se activa para reclutar al complejo de preligación, que añade la base correcta y promueve la ligación de los extremos del SSB para restaurar la continuidad de la hebra de ADN. PARP1 actúa como sensor de los SSBs para su posterior reparación, por lo que hipotetizamos que la pérdida de PARP1 conduciría a una acumulación de SSBs no reparados. Para estudiar el efecto de la acumulación de SSBs no reparados, decidimos llevar a cabo la depleción de PARP1 mediante siRNA. En primer lugar, comprobamos los niveles de expresión proteica mediante Western Blot (Figura C3.13 A). A continuación, detectamos los niveles nucleares de PAR tanto en fase S como asociados a la horquilla de replicación mediante la técnica SIRF, y observamos que la pérdida de PARP1 en las células Fancd2-/- EdU+ disminuyó de forma significativa el incremento de los niveles nucleares de PAR y del número de focos EdU-PAR provocados por la exposición a 5hmdC (Figura C3.13 B y C), indicando que la señalización nuclear de PAR depende principalmente de PARP1. Sin embargo, el número de focos EdU-PAR tras el tratamiento con 5hmdC en las células Fancd2-/- deplecionadas de PARP1 no alcanzó el número de focos EdU-PAR observado en la condición sin tratamiento (Figura C3.13 C). Este resultado indica que una proporción de la señalización de PAR asociada a la horquilla de replicación tras el tratamiento con 5hmdC puede ser independiente de PARP1, o es consecuencia de la cantidad restante de PARP1 tras la depleción. La depleción de PARP1 exacerbó la muerte celular de las células deficientes en FANCD2 tras la exposición a 5hmdC (Figura C3.13 D), sugiriendo que la continua presencia de huecos de ssDNA debida a una ineficiente reparación de los mismos, es la responsable de la letalidad celular durante la eliminación de la 5hmdU en ausencia de FANCD2. RESULTADOS 144 Figura C3.13. Los niveles nucleares de PAR asociados a la replicación son dependientes de PARP1 y la depleción de PARP1 exacerba la letalidad observada en las células Fancd2-/- expuestas a 5hmdC. A) Western Blot de extractos proteicos obtenidos de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- para medir los niveles de PARP1 tras su depleción mediante siRNA. B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de PARP1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la intensidad media por célula EdU+ (n=200) de PAR tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa el valor de la mediana). C) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los focos EdU-PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde), de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de PARP1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación del número de focos EdU-PAR por célula EdU+ (n=200) tras la exposición a 5hmdC durante 3h (R=2; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). D) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de PARP1, expuestas a las dosis indicadas de 5hmdC durante 72h (R=5, media ± s.d.). La ruta de reparación BER concluye con la incorporación de la base correcta y la ligación de los extremos del corte mediante el complejo de preligación XRCC1/POLβ/LIG3α. En el apartado 4.1 de esta tesis doctoral, se caracterizó la sensibilidad y la DDR de la línea celular deficiente en XRCC1 tras la exposición a 5hmdC o a 5hmdU. En este caso, con la finalidad de realizar el estudio en el mismo fondo genético, llevamos a cabo la depleción de XRCC1 en la línea celular deficiente en FANCD2 para estudiar su interacción genética. RESULTADOS 145 La depleción de XRCC1 (Figura C.14 A), a pesar de no ser completa, produjo un incremento significativo en los niveles nucleares de PAR en las células en fase S (Figura C.14 B), así como del número de focos EdU-PAR (Figura C.14 C) en la línea celular Fancd2-/- tras el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 3h). En menor medida, la depleción de XRCC1 también incrementó de forma significativa el número de focos EdU-PAR en la línea celular silvestre después de la exposición a 5hmdC (Figura C.14 C), correlacionando con los resultados obtenidos con la línea celular deficiente en XRCC1 mostrados en el apartado 4.1.2 de esta tesis doctoral. Estos resultados sugieren que los SSBs asociados a la horquilla de replicación, originados durante la eliminación de la 5hmdU por la ruta BER, persisten más tiempo o se acumulan en mayor proporción tras la pérdida de XRCC1 en ausencia de la ruta AF. Además, como se ha descrito que XRCC1 es el factor encargado de eliminar a PARP1 del SSB 45, posiblemente la pérdida de XRCC1 incremente la persistencia de PARP1 en los SSBs, impactando en los niveles detectados de PAR asociados al ADN recién sintetizado. RESULTADOS 146 Figura C3.14. La depleción de XRCC1 exacerba los niveles nucleares de PAR asociados a la replicación mediados por la incorporación errónea de la 5hmdU en las células deficientes en FANCD2. A) Western Blot de extractos proteicos obtenidos de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- para la detección de los niveles de XRCC1 tras su depleción mediante siRNA. B) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los niveles nucleares de PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde), de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de XRCC1, expuestas a 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la intensidad media por célula EdU+ (n=200) de los niveles nucleares de PAR tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa el valor de la mediana). C) Panel izquierdo, imágenes representativas de inmunofluorescencia de los focos EdU-PAR (rojo) y las células en fase S (EdU+; verde) de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de XRCC1, tras el tratamiento con 5hmdC (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación del número de focos EdU-PAR por célula EdU+ (n=200) tras el tratamiento con 5hmdC durante 3h (R=3; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa la media ± s.d.). La depleción de XRCC1 también exacerbó la letalidad provocada por la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/- (Figura C3.15 A), sugiriendo que la acumulación de SSBs que permanecen sin reparar impacta en la viabilidad celular de las células Fancd2-/-. Sin embargo, la depleción de XRCC1 no incrementó los defectos en la horquilla de replicación inducidos por el tratamiento con 5hmdC en la línea celular Fancd2-/- (Figura C3.15 B). Figura C3.15. La depleción de XRCC1 exacerba la letalidad celular mediada por el tratamiento con 5hmdC, pero no impacta en la estabilidad de la horquilla de replicación en las células Fancd2-/-. A) Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de XRCC1 expuestas a las dosis indicadas de 5hmdC durante 72h (R=9; media ± s.d.). B) Cuantificación de la proporción IdU/CldU del ensayo de fibras de ADN para la detección del bloqueo de la horquilla de replicación, de las líneas celulares silvestre y deficiente en FANCD2 deplecionadas de XRCC1, tras la exposición a 5hmdC (40µM) durante 30 min (n=200 de 2 réplicas biológicas independientes; test estadístico One-way ANOVA). Globalmente, todos estos resultados nos permiten proponer un modelo de trabajo que sugiere que la reparación defectuosa de los SSBs generados tras la incorporación errónea de la 5hmdU y su posterior procesamiento por la ruta de reparación BER, resulta en un incremento de SSBs y de citotoxicidad en las células Fancd2-/-. 4.4. CAPÍTULO 4: HMCES perturba la estabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación errónea de la 5hmdU RESULTADOS 149 4.4.1. La unión de HMCES a los sitios AP en la cadena naciente, generados tras la eliminación de la 5hmdU, es responsable de la formación de los huecos de ssDNA en las células deficientes en FANCD2 La 5hmdU se incorpora a la cadena de ADN naciente durante la replicación, y es reconocida y eliminada por las glicosilasas de ADN durante la ruta de reparación BER, generando sitios AP u otros intermediarios que pueden obstaculizar la progresión de la horquilla de replicación. En ciertas condiciones, los sitios AP localizados en ssDNA son protegidos por la proteína HMCES. HMCES, a través de la cisteína 2, reacciona covalentemente con el grupo aldehído del sitio AP en conformación abierta, formando un DPC. Este HMCESDPC previene el corte endonucleolítico del sitio AP por APEX1, evitando la formación de DSBs en la horquilla de replicación 80,81. Ya que durante el proceso de eliminación de la 5hmdU, la glicosilasa de ADN SMUG1 genera sitios AP en la cadena de ADN naciente, decidimos investigar si HMCES tiene la capacidad de reaccionar con estos sitios AP para protegerlos. Para determinar si HMCES reacciona con los sitios AP derivados del procesamiento de la 5hmdU, llevamos a cabo la generación de líneas celulares silvestres y Fancd2-/- que sobreexpresan de forma estable la proteína HMCES fusionada traduccionalmente al epítopo FLAG. El epítopo FLAG permite la identificación de las células que expresan la construcción y la detección del reclutamiento de HMCES en cromatina. Para obtener una población celular homogénea, las células se seleccionaron en medio de cultivo con blasticidina. Para determinar el porcentaje de células que sobreexpresan la construcción HMCES-FLAG, realizamos un ensayo de inmunofluorescencia y analizamos la expresión de la construcción HMCES-FLAG. En este ensayo de inmunofluorescencia, realizamos un paso de fijación celular previo al paso de permeabilización (Figura C4.1). Figura C4.1. Generación de las líneas celulares que sobreexpresan la construcción MmHMCES-FLAG. Esquema de la generación de la línea celular silvestre y Fancd2-/- que sobreexpresa la construcción MmHMCES-FLAG, e imágenes representativas de inmunofluorescencia para detectar la expresión de la construcción MmHMCES-FLAG en ambas líneas celulares tras un paso de fijación seguido de un paso de permeabilización (imagen superior) o tras un paso de permeabilización seguido de un paso de fijación (imagen inferior). Una vez obtenida la línea celular silvestre y Fancd2-/- que expresa la construcción HMCESFLAG de forma estable, examinamos la funcionalidad de la fusión traduccional mediante un ensayo de retención en cromatina por inmunofluorescencia. En condiciones sin tratamiento, observamos que las células Fancd2-/- presentaron una mayor proporción de RESULTADOS 150 núcleos positivos HMCES-FLAG en comparación con la línea celular silvestre (Figura C4.2 B), sugiriendo que las células deficientes en FANCD2 presentan una elevada proporción de sitios AP a los que se une HMCES. Como control de la técnica se usó MMS, agente alquilante que modifica las bases de ambas hebras de ADN, por lo que, tras la acción de las glicosilasas de ADN, se producen sitios AP tanto en la cadena molde como en la cadena de ADN naciente. Como se observa en la Figura C4.2 C, el tratamiento con MMS (0.5mM durante 30 min) produjo el reclutamiento de HMCES-FLAG a la cromatina en ambas líneas celulares, aunque la señal nuclear de HMCES-FLAG fue significativamente más intensa en las células Fancd2-/-. A continuación, examinamos si el tratamiento con dosis crecientes de 5hmdC (40µM, 80µM y 160µM durante 3h) inducía la unión de HCMES-FLAG a la cromatina. Como se observa en la Figura C4.2 C, el tratamiento con 5hmdC incrementó significativamente y de manera dosis-dependiente la intensidad nuclear de HMCES-FLAG en las células Fancd2-/-, sin observarse un incremento significativo en las células silvestres. Estos datos sugieren que el procesamiento de la 5hmdU por la ruta BER, genera sitios AP en la cadena de ADN naciente que son reconocidos por HMCES. Figura C4.2. HMCES-FLAG se recluta a cromatina tras la incorporación errónea de la 5hmdU. A) Esquema de la generación de la línea celular silvestre y Fancd2-/- HMCES-FLAG y del ensayo de retención en cromatina tras el daño en el ADN. B) Panel izquierdo, imágenes representativas del ensayo de retención en cromatina de HMCES-FLAG mediante inmunofluorescencia, de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- en condiciones sin tratamiento. Panel derecho, porcentaje de células HMCES-FLAG+ en condiciones sin tratamiento (R=3; test estadístico t de Student; la barra representa la media ± s.d.). C) Panel izquierdo, imágenes representativas del ensayo de retención en cromatina de HMCES-FLAG mediante inmunofluorescencia. Las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- fueron expuestas a 5hmdC (160µM) durante 3h, seguido del tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG-132 (10µM) durante 3h. Panel derecho, cuantificación de la intensidad media por célula (n=200) de la señal nuclear de HMCES-FLAG tras el tratamiento con 5hmdC (40µM, 80µM o 160µM durante 3h) o MMS (0.5mM durante 30 min), seguido del tratamiento con MG-132 (R=3; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa el valor de la mediana). Para confirmar los resultados obtenidos mediante inmunofluorescencia, realizamos un subfraccionamiento celular, en el cual obtuvimos la fracción soluble y cromatínica de las células silvestres y Fancd2-/- expuestas a 5hmdC (40µM, 80µM y 160µM durante 3h). RESULTADOS 151 Mediante Western Blot analizamos los niveles de proteína en cada una de las fracciones. Como control de la técnica usamos MMS, el cual provocó el reclutamiento de HMCES en cromatina en ambas líneas celulares, aunque el reclutamiento fue mayor en las células Fancd2-/- (Figura C4.3). El tratamiento con 5hmdC provocó el reclutamiento de HMCES en cromatina en mayor medida en las células deficientes en FANCD2, en comparación con las células silvestres (Figura C4.3) Estos datos sugieren que HMCES se recluta a la cromatina, probablemente a los sitios AP generados tras la eliminación de la 5hmdU por la ruta BER. Figura C4.3. La incorporación de la 5hmdU induce el reclutamiento de HMCES a la cromatina. A) Western Blot de los niveles en cromatina y en la fracción soluble de HMCES, HISTONA H3 y α-TUBULINA tras el tratamiento con 5hmdC (40µM, 80µM o 160µM durante 3h) o MMS (0.5mM durante 30 min), seguido del tratamiento con MG-132 (10µM) durante 3h, de la línea celular silvestre. B) Western Blot de los niveles en cromatina y en la fracción soluble de HMCES, HISTONA H3 y α-TUBULINA tras el tratamiento con 5hmdC (40µM, 80µM o 160µM durante 3h) o MMS (0.5mM durante 30 min), seguido del tratamiento con MG-132 (10µM) durante 3h, de la línea celular Fancd2-/-. HMCES se une preferentemente a los sitios AP generados por la glicosilasa de ADN SMUG1, solo cuando estos se encuentran en ssDNA, ya que en dsDNA los sitios AP se procesan por la endonucleasa APEX1. Ya que los sitios AP generados por SMUG1 estarían localizados en dsDNA, quisimos determinar si la incisión por APEX1 es necesaria para la unión de HMCES al sitio AP generado tras la eliminación de la 5hmdU. Para ello, llevamos a cabo la depleción de APEX1 en las células que sobreexpresan la construcción HMCESFLAG y realizamos un ensayo de retención en cromatina mediante inmunofluorescencia. Como se observa en la Figura C4.4, la depleción de APEX1 disminuyó de forma significativa la retención de HMCES en cromatina en las células Fancd2-/- tras la exposición a 5hmdC. Estos datos sugieren que el corte generado por APEX1 es necesario para promover la unión de HMCES a los sitios AP derivados de la eliminación de la 5hmdU. Además, la depleción de APEX1 disminuyó de forma significativa la señal nuclear de HMCES-FLAG en condiciones sin tratamiento, tanto en las células silvestres como en las células Fancd2-/- (Figura C4.4), sugiriendo que APEX1 podría procesar los sitios AP que se forman durante reacciones de BER no asociadas a la incorporación de la 5hmdU, que conducen a la unión de HMCES. RESULTADOS 152 Figura C4.4. La depleción de APEX1 dismuye el reclutamiento de HMCES-FLAG a la cromatina. Cuantificación de la intensidad media por célula (n=200) de la señal nuclear de HMCES-FLAG tras el tratamiento con 5hmdC (160µM durante 3h) o MMS (0.5mM durante 30 min), seguido del tratamiento con MG-132 (10µM), de las líneas celulares silvestre y Fancd2-/- tras la depleción de APEX1 (R=2; test estadístico One-way ANOVA; la línea central representa el valor de la mediana). Estos resultados sugieren que HMCES se une a los sitios AP generados tras el procesamiento de la 5hmdU por la ruta de reparación BER. Si HMCES es un factor protector de sitios AP, la pérdida de función de HMCES evitaría la formación de HMCESDPCs, incrementando la frecuencia de sitios AP desprotegidos. Estos sitios AP serían procesados por APEX1, generándose mayor cantidad de huecos de ssDNA citotóxicos en la cadena naciente, lo que podría resultar en un aumento de la letalidad de las células deficientes en FANCD2. Por tanto, predecimos que la pérdida de función de HMCES en las células Fancd2-/- incrementaría la inestabilidad genética, dando lugar a un fenotipo sintético letal. Para evaluar esta hipótesis, llevamos a cabo la depleción de HMCES en las líneas celulares silvestre y Fancd2-/-. En primer lugar, comprobamos la falta de expresión proteica mediante Western Blot (Figura C4.5 A). Como medida indirecta de la presencia de huecos de ssDNA o SSBs, determinamos tanto los niveles nucleares de PAR en células en fase S, como la proximidad de los polímeros PAR a la horquilla de replicación mediante la técnica SIRF. Sorprendentemente, la depleción de HMCES disminuyó de forma significativa la señalización nuclear de PAR asociada a fase S (Figura C4.5 B) y el número de focos EdU-PAR (Figura C4.5 C) inducidos por el tratamiento con 5hmdC (10µM durante 3h) en las células Fancd2-/- EdU+. Estos resultados sugieren que la unión de HMCES a los sitios AP localizados en la cadena de ADN naciente, generados durante la eliminación de la 5hmdU mediante la ruta BER, es responsable del incremento de los huecos de ssDNA en las células deficientes en FANCD2. Science Advances Manuscript Template Page 27 of 52 Figure 4: XRCC1 depletion exacerbate 5hmdC-induced genomic instability and lethality of 886 HRD cells. 887 A. Left, representative PAR (red) immunofluorescence images of XRCC1-depleted wild type or 888 Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA and EdU (green) 889 stains S-phase cells. Right, plot depicting PAR mean intensity signal per nucleus. B. Left, 890 representative images of EdU-PAR foci (red) by SIRF assay of XRCC1-depleted wild type or 891 Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA and EdU (green) 892 stains S-phase cells. Right, plot depicting EdU-PAR foci per nucleus. C. Top, MTT cell 893 proliferation assay of wild type or Fancd2-/- cells lacking XRCC1 exposed to the indicated dose of 894 5hmdC for 3 days (n=9, mean ± s.d.). Bottom, MTT cell proliferation assay of wild type, siPARP1, 895 Fancd2-/- and Fancd2-/- siPARP1 cells, exposed to the indicated dose of 5hmdC for 3 days (n=5, 896 mean ± s.d.). D. Top left, scheme of DNA fiber assay. Bottom left, representative images of DNA 897 fibers from Fancd2-/- and Fancd2-/- siXRCC1 cells untreated or exposed to 5hmdC (40µM) for 898 30min. Right, box plot of the frequency of IdU/CldU ratio of XRCC1-depleted wild type or Fancd2899 /- cells upon 5hmdC treatment (n=200 of each 2 biological replicates). E. Top left, scheme of the 900 SCE assay. Right, bar plot of SCE/chromosome per metaphase from SMUG1-, APEX1-, XRCC1901 or PARP1-depleted Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 12h (n=50 of each of 2 biological 902 replicates; bar represents mean ± s.d.). 903 904 905 Science Advances Manuscript Template Page 28 of 52 906 Science Advances Manuscript Template Page 29 of 52 Figure 5. HMCES accumulates in nuclei and is responsible for 5hmdC-mediated genomic 907 instability observed in HRD cells 908 A. Left, representative immunofluorescence images of Flag-tagged HMCES (green) positive nuclei 909 from wild type or Fancd2-/- cells. Right, percentage of HMCES-FLAG+ wild type and Fancd2-/- 910 cells. B. Left, representative immunofluorescence images of HMCES positive nuclei from wild type 911 or Fancd2-/- cells upon combined 5hmdC (160µM) and MG-132 (10µM) treatments for 3h. Right, 912 HMCES-FLAG mean intensity signal per nucleus from wild type and Fancd2-/- cells upon 5hmdC 913 (3h) or MMS (0.5mM, 30min). Treatments were combined with MG-132 (10µM). C. Left, images 914 of FLAG-tagged HMCES positive nuclei from Fancd2-/- cells, expressing MmHMCES-WT915 FLAG, MmHMCES-C2A-FLAG or MmHMCES-R212E-FLAG upon 5hmdC exposure (160µM, 916 3h). Right, plot depicting HMCES-FLAG mean intensity signal per nucleus from wild type or 917 Fancd2-/- cells expressing MmHMCES-WT-FLAG, MmHMCES-C2A-FLAG or MmHMCES918 R212E-FLAG upon 5hmdC (indicated dose for 3h) or MMS (0.5mM). Treatments were combined 919 with MG-132 (10µM). D. Left, representative images of EdU-PAR foci by SIRF assay from 920 HMCES-depleted wild type or Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains 921 nuclear DNA. EdU (green) stains S-phase cells. Right, plot depicting EdU-PAR foci per nucleus. 922 E. Left, representative images of alkaline comet assay from HMCES-depleted wild type or Fancd2923 /- cells following 5hmdC treatment (10µM) for 3h. Right, plot depicting comet tail moment per cell. 924 925 926 Science Advances Manuscript Template Page 30 of 52 927 928 929 Science Advances Manuscript Template Page 31 of 52 Figure 6. HMCES depletion rescues 5hmdC-induced replication fork defects and ssDNA gap 930 accumulation in HRD cells. 931 A. Top, scheme of DNA fiber assay and representative images of DNA fibers from Fancd2-/- and 932 Fancd2-/- siHMCES cells untreated or exposed to 5hmdC (40µM) for 30min. Bottom, box plot of 933 the frequency of IdU/CldU ratios of HMCES-deficient wild type or Fancd2-/- cells upon 5hmdC 934 treatment (n=200). B. Top, scheme of DNA fiber assay and representative images of bidirectional 935 fibers from Fancd2-/- and Fancd2-/- siHMCES cells untreated or exposed to 5hmdC (40µM) for 936 30min. Bottom, DNA fiber asymmetry index from HMCES-depleted wild type or Fancd2-/- cells 937 upon 5hmdC treatment. C. Top, chromosome aberrations from HMCESKD Fancd2-/- cells 938 following 5hmdC treatment (10µM for 40h). Right, plot depicting chromosome 939 aberrations/metaphase (n=50 of each of 2 biological replicates; bar represents mean ± s.d.). D. MTT 940 cell proliferation assay of HMCES-depleted wild type or Fancd2-/- cells, exposed to the indicated 941 dose of 5hmdC for 3 days (n=5, mean ± s.d.). E. Left, HMCES protein depletion examined by 942 western blots of DLD-1 or BRCA2-/- cells extracts. Right, MTT cell proliferation assay of HMCES943 deficient wild type and BRCA2-/- cells, exposed to the indicated dose of 5hmdC for 6 days (n=6; 944 mean ± s.d.). F. Left, representative EM image of a broken replication fork from 5hmdC-exposed 945 Fancd2-/- cells (10µM for 3h). Rectangle shows fork junction magnification. Red arrows indicate 946 ssDNA gaps. Right, percentage of broken forks in HMCESKD Fancd2-/- cells following 5hmdC 947 treatment. 100 forks were scored for each condition (n=2). G. Overall survival plot of breast cancer 948 cohort of the TCGA repository. 949 950 951 Science Advances Manuscript Template Page 32 of 52 952 953 954 955 Figure 7. HMCES, APEX1 and APEX2 function in a common BER genetic pathway during 956 5hmdU removal 957 A. Left, representative PAR (red) immunofluorescence images from Fancd2-/- cells upon depletion 958 of HMCES, APEX1 or their combinations exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains 959 nuclear DNA and EdU (green) stains S-phase nuclei. Right, plot depicting PAR mean intensity 960 signal per nucleus. B. Left, representative PAR (red) immunofluorescence images from Fancd2-/- 961 cells upon depletion of HMCES, APEX2 or their combinations exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. 962 DAPI (blue) stains nuclear DNA and EdU (green) stains S-phase cells. Right, plot depicting PAR 963 mean intensity signal per nucleus. C. MTT cell proliferation assay of HMCES-, APEX1or 964 HMCES APEX1-depleted wild type or Fancd2-/- cells, exposed to the indicated dose of 5hmdC for 965 3 days (n=5, mean ± s.d.). D. MTT cell proliferation assay of HMCES-, APEX2or HMCES 966 APEX2-depleted wild type or Fancd2-/- cells, exposed to the indicated dose of 5hmdC for 3 days. 967 968 969 Science Advances Manuscript Template Page 33 of 52 970 971 Science Advances Manuscript Template Page 34 of 52 Figure 8. HMCES is responsible for PRIMPOL-dependent ssDNA gap accumulation. 972 A. Left, representative images of EdU-PAR foci (red) by SIRF assay from wild type, siPRIMPOL, 973 Fancd2-/-and Fancd2-/- siPRIMPOL cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains 974 nuclear DNA. EdU (green) stains S-phase cells. Right, plot depicting EdU-PAR foci per nucleus. 975 B. Plot depicting comet tail moment per cell from PRIMPOL-depleted wild type or Fancd2-/- cells 976 following 5hmdC treatment (10μM) for 3h. C. Top, MTT cell proliferation assay of wild type, si 977 APEX1, siPRIMPOL, siAPEX1 siPRIMPOL, Fancd2-/-, Fancd2-/- si APEX1, Fancd2-/- 978 siPRIMPOL and Fancd2-/- siPRIMPOL siAPEX1 cells exposed to the indicated dose of 5hmdC for 979 3 days. Bottom, MTT cell proliferation assay of wild type, siHMCES, siPRIMPOL, 980 siHMCES/siPRIMPOL, Fancd2-/-, Fancd2-/- siHMCES, Fancd2-/- siPRIMPOL and Fancd2-/- 981 siHMCES/siPRIMPOL cells exposed to the indicated dose of 5hmdC for 3 days. D. Left, 982 representative images of SCEs from Fancd2-/-, Fancd2-/- siHMCES, Fancd2-/- siPRIMPOL and 983 Fancd2-/- siHMCES/siPRIMPOL cells exposed to 5hmdC (10µM) for 12h. Top right, scheme of 984 SCE assay. Bottom right, bar plot of SCE/chromosome per metaphase (n=50 of each of 2 biological 985 replicates; bar represents mean ± s.d.). E. Working model depicting the mechanism of replication 986 fork instability by HMCES during removal of 5hmdU in the absence of the replication fork 987 maintenance FA pathway. 988 989 990 Science Advances Manuscript Template Page 35 of 52 Supplementary Materials 991 992 993 994 995 Supplementary figure 1: DCTD, DCK, SMUG1, APEX1, XRCC1, PARP1, HMCES or 996 PRIMPOL siRNA-mediated protein depletions in wild type and Fancd2-/- cell extracts examined 997 by western blots. ERCC1, LMNA/C or PCNA were used as loading controls. 998 999 1000 1001 Science Advances Manuscript Template Page 36 of 52 1002 1003 Supplementary figure 2. Nuclear PAR levels upon PARP1, SMUG1, APEX1 and XRCC1, 1004 PARP1 depletion of wild type and Fancd2-/- cells. 1005 A. Left, representative total PARylation (red) immunofluorescence images of PARP1-depleted wild 1006 type and Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA. Right, 1007 plot depicting PAR mean intensity signal per nucleus. B. Left, representative total PARylation (red) 1008 immunofluorescence images of SMUG1-depleted wild type or Fancd2-/- cells and exposed to 1009 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA. Right, plot depicting PAR mean intensity 1010 signal per nucleus. C. Left, representative total PARylation (red) immunofluorescence images of 1011 APEX1-depleted wild type or Fancd2-/- cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains 1012 nuclear DNA. Right, plot depicting PAR mean intensity signal per nucleus. D. Left, representative 1013 total PARylation (red) immunofluorescence images of XRCC1-depleted wild type or Fancd2-/- cells 1014 Science Advances Manuscript Template Page 43 of 52 1071 1072 Supplementary figure 7. HMCES depletion suppresses nuclear PARylation but increases 1073 ser139-H2AX 1074 A. Left, representative immunofluorescence images of total PARylation (red) in wild type, Fancd21075 /-, siHMCES and Fancd2-/- siHMCES cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains 1076 nuclear DNA. Right, plot depicting PAR mean intensity signal per nucleus. B. Left, representative 1077 PAR (red) immunofluorescence images of HMCES-depleted wild type or Fancd2-/- EdU+ cells 1078 exposed to 5hmdC (10μM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA. EdU (green) stains S-phase 1079 cells. Right, PAR mean intensity signal per nucleus. C. Left, representative ser139-H2AX (green) 1080 Science Advances Manuscript Template Page 44 of 52 immunofluorescence images of HMCES-depleted wild type or Fancd2-/- cells after 5hmdC 1081 treatment (10µM 3h). Middle, plot depicting ser139-H2AX mean intensity signal of wild type or 1082 Fancd2-/- cells. Right, plot depicting ser139-H2AX mean intensity signal of wild type or Fancd2-/- 1083 cells exposed to 5hmdC (10µM) for 3h. 1084 1085 1086 Science Advances Manuscript Template Page 45 of 52 1087 1088 Supplementary figure 8. HMCESKD suppresses 5hmdC-induced chromosome aberrations 1089 Bar plot of different types of chromosome aberrations (Radial, gaps and breaks) from HMCESKD 1090 wild type or Fancd2-/- cells following 5hmdC treatment (10µM) for 40h. (n=50 of each of 2 1091 biological replicates; bar represents mean ± s.d.). 1092 1093 1094 Science Advances Manuscript Template Page 46 of 52 1095 1096 1097 1098 Supplementary figure 9. Independent siRNAs against HMCES recapitulates viability rescue 1099 and nuclear PARylation observed by pooled siRNA in Fancd2-/- cells 1100 Science Advances Manuscript Template Page 47 of 52 A. Western blot of HMCES-depleted wild type and Fancd2-/- cell extracts by pooled (P) or 1101 independent (#1 to #4) siRNAs. LAMIN A/C was used as loading control. B. MTT cell proliferation 1102 assay of HMCES-depleted (pooled or independent siRNAs) wild type and Fancd2-/- cells exposed 1103 to the indicated dose of 5hmdC for 3 days. C. Plot depicting PAR mean intensity signal per nucleus 1104 from HMCES-depleted (pooled or independent siRNAs) Fancd2-/- EdU+ cells exposed to 5hmdC 1105 (10M) for 3h. D. Table of predicted off-target genes of independent siRNAs against HMCES. 1106 1107 1108 Science Advances Manuscript Template Page 48 of 52 1109 1110 Supplementary figure 10. Representative EM images of replication forks of Fancd2-/- cells 1111 upon 5hmdC treatment and ssDNA gap quantification. 1112 A. Representative EM images of replication fork-containing genomic DNA from HMCES KD 1113 Fancd2-/- cells treated as indicated (10M 5hmdC for 3h). HMCES silencing (siHMCES) is 1114 indicated. Bar represents 500 nucleotides (nt). Numbers (white) represents arm lenght (nt). For each 1115 image, rectangle shows fork junction magnification. Red arrows indicate ssDNA gaps. B. Plot 1116 showing the number, the size and the distribution of ssDNA gaps. No significant differences were 1117 Science Advances Manuscript Template Page 49 of 52 found in any condition. Up to 80 intermediates pooled from two independent experiments were 1118 scored for each condition. ns=non-significant differences assessed by one-way ANOVA. 1119 1120 1121 Science Advances Manuscript Template Page 50 of 52 1122 1123 Science Advances Manuscript Template Page 51 of 52 1124 Supplementary figure 11. Independent siRNAs against HMCES recapitulates viability rescue 1125 and nuclear PARylation observed by pooled siRNA in Fancd2-/- cells 1126 A. Sanger sequencing of HMCES-, FANCD2or HMCES FANCD2 CRISPR knockout RPE-1 1127 TP53-/- clones. B. Western blot of clones obtained by CRISPR-CAS9-mediated mutagenesis. 1128 Clones 9, 7, 3 and 12 were selected as wild type, HMCES-/-, FANCD2-/- and HMCES-/-FANCD2-/- 1129 DKO respectively for S1 nuclease assay. C. Dot plot of IdU track length of wild type, FANCD2-/- 1130 (FD2-/-), HMCES-/- (HM-/-) or FANCD2-/- HMCES-/- (DKO) cells upon 5hmdC treatment (10μM) 1131 for 30 min. S1 treatment was carried out for 30 min. (n=200 of each 2 biological replicates). D. 1132 Levels of HMCES mRNA and overall survival in a breast tumour cohort. 1133 1134 1135 Science Advances Manuscript Template Page 52 of 52 1136 1137 1138 Supplementary figure 12. A. Left, representative immunofluorescence images of nuclear 1139 PARylation (red) in EdU+ wild type, Fancd2-/-, siHMCES and Fancd2-/- siHMCES cells upon 1140 exposure to 5hmdC (10µM) for 3h. DAPI (blue) stains nuclear DNA and EdU (green) stains S1141 phase cells. Plot depicting PAR mean intensity signal in PRIMPOL-depleted wild type or Fancd21142 /- EdU+ cells exposed to 5hmdC (10µM). 1143